JP7216638B2 - 増強された蛍光のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本開示は、蛍光色素の分野に関し、具体的には、蛍光シグナルを増加させ、そして蛍光消光を減少させるための組成物および方法に関する。
蛍光標識された生体分子は、定量アッセイおよび細胞イメージングに関連するものを含む様々な方法において広く使用されている。抗体、抗原、DNA、およびRNAなどの生体分子は蛍光標識されており、免疫蛍光(IFC)、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別(FACS)、免疫組織化学(IHC)、ウエスタンブロッティング、薬物結合試験、酵素反応速度論、HCAを含むイメージング(免疫細胞化学ICC)、インビボイメージングなどの用途において、および核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用される。蛍光色素は、使用しやすく、特異的かつ高感度であるだけでなく、多重化の選択肢も提供するので、これらの用途に引き続き選ばれている。しかしながら、全ての用途が蛍光標識化に適しているわけではない。例えば、多くの用途において、増加した量の蛍光標識(高い色素対タンパク質比)が生体分子に付加されるにつれて、蛍光の強度は減少し得る(消光)。さらに、蛍光はまた、生体分子の蛍光標識化によって引き起こされる立体障害を通して減少し得る。増強されたシグナル強度を示す蛍光標識およびコンジュゲーション方法が必要とされている。
本明細書に開示されているのは、例えば修飾リンカー、化学物質、および特定のプロトコールを介して生体分子にコンジュゲートした蛍光色素の強度を増加させるための組成物および方法である。したがって、本発明の一態様は、色素の性能を向上させることである。蛍光強度は、色素単独で作られた対応するコンジュゲートと比較して、生体分子が色素とスペーサー分子の両方で標識されているときに増加し得ることが見出された。これらのスペーサー分子を用いて作製したコンジュゲートは、ウエスタンブロッティング、ドットブロットアッセイ、プレートアッセイ、フローサイトメトリー、およびイムノアッセイ用途(例えば、免疫蛍光イメージング用途)において蛍光増強を示す。
(a)蛍光標識1個あたりに基づいて0.5以上の蛍光比、
(b)少なくとも4つの蛍光標識を抗体にコンジュゲートすること、
(c)抗体の全蛍光が、非コンジュゲート蛍光分子の蛍光より少なくとも20パーセント大きい、および/または
(d)各抗体分子に結合した平均約3~約80個の蛍光標識、のうちの1つ以上を含む。
(図2)本発明のいくつかの実施形態の概略図を示す。この実施形態では、抗体を、50mMホウ酸緩衝液(pH8.5)中でNHS蛍光色素およびメチル-PEG-NHS-エステルスペーサーとコンジュゲートさせる。この実施形態で使用されるスペーサーは、MS(PEG)4、MS(PEG)8およびMS(PEG)12である。
(図3)イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、NHSアセテートまたはMS(PEG)4スペーサーおよびDYLIGHT(商標)488蛍光色素(表1において略称「DYLIGHT(商標)488」)で共標識したGAM抗体を用いて試験した。NHSアセテートまたはMS(PEG)4を用いて作製されたDYLIGHT(商標)488-GAMコンジュゲートは、(スペーサーなしで作製された)基本コンジュゲートに対して1.2~1.8倍の範囲の蛍光強度の1.2~1.8倍の改善をもたらした。この図のレーンは次の通りである。
(表1)
(図4)ドットブロット-マウスIgGのDYLIGHT(商標)488-GAM検出、様々なモル過剰の色素で、基本コンジュゲートに比べてNHSアセテート(2.5×、5×)またはMS(PEG)4(3.75×)の改善倍率。この図は、イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、NHSアセテートまたはMS(PEG)4スペーサーおよびDYLIGHT(商標)488蛍光色素で共標識したGAM抗体を用いるアッセイによって試験した。これらのデータは、抗体についての別の供給源を用いて図3からの結果を確認した。NHSアセテートとMS(PEG)4スペーサーの両方が、抗体-色素コンジュゲート単独と比較して蛍光シグナル強度において顕著な改善(約2.6倍程度の増加)をもたらした。
(図5)ドットブロット-DYLIGHT(商標)550-2×PEG-GARを用いたマウスIgGの検出。様々なモル過剰で、基本コンジュゲートに比べてNHSアセテート(2.5×、5×)またはMS(PEG)4(3.75×)からのシグナル/バックグランドの改善倍率。これは、イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、NHSアセテートまたはMS(PEG)4スペーサーおよびDYLIGHT(商標)550蛍光色素で共標識したDYLIGHT(商標)550-GAM抗体を用いて試験した。マウスIgGを1000ng/ドットから1:1で段階希釈した。全てのDYLIGHT(商標)550-2×PEG-GAR二次抗体を、1mg/mlストックの1/5000に希釈した。コンジュゲーション混合物に付加されたNHSアセテートまたはMS(PEG)4は、各々のそれぞれの色素のモル過剰での基本コンジュゲートと比較して、シグナル強度の改善(約1.6程度の増加)をもたらした。改善は1.2~1.6倍の範囲であり、特に、以下のGAM-DYLIGHT(商標)550-2×PEG:10×色素+5×アセテート、15×色素+3.75×MS(PEG)4、20×色素+5×アセテート、および20×+3.75×MS(PEG)4は、それぞれの基本コンジュゲートに対して1.3倍を超える改善を示した。
(図6)ドットブロット-マウスIgGのDyLight650-4×PEG-GAM検出、各々の色素のモル過剰での基本コンジュゲートに対するNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、10×)での改善倍率。この図は、イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、NHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×)およびDYLIGHT(商標)650-4×PEG(表2において略称「DYLIGHT(商標)650」)(10×~20×)で共標識したGAM抗体を用いて試験した。マウスIgGを1000ng/ドットから1:1で段階希釈した。全てのDYLIGHT(商標)650-4×PEG-GAR二次抗体を、1mg/mlストックの1/10,000に希釈した。高度の色素の置換を有するコンジュゲートは、ドットブロットおよびウエスタンブロッティングなどの用途においてよりよく機能する傾向がある。NHSアセテートと(MS)PEG4の両方は、初期の基本コンジュゲートよりも感度およびシグナル/バックグラウンド(約2.2程度の増加)において顕著な改善をもたらす。2.5×モル過剰でGAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEG-15×に付加されたNHSアセテートは、強度を1.7倍改善した。NHSアセテートによってもたらされた改善は、最高モル過剰(20×)で調製されたコンジュゲートを用いた場合よりも1.3倍優れた性能を示した。GAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEG-15×コンジュゲーションに付加された全てのMS(PEG)4は、蛍光強度を1.8~2.2倍改善し、対応する最高基本コンジュゲートGAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEG-20×よりも良好に機能した。この図のレーンは次の通りである。
(表2)
(図7)ドットブロット-各々のモル過剰での基本コンジュゲートに対するNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、10×)でのDYLIGHT(商標)880-4×PEGコンジュゲートの改善倍率。この図は、蛍光ドットブロットアッセイでの、GAM-DYLIGHT(商標)800-4×PEG(表3において略称「DYLIGHT(商標)800」)の検出可能な蛍光レベルに対するNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、10×)の付加の効果を実証する。マウスIgGを1000ng/ドットから1:2に段階希釈した。全てのDYLIGHT(商標)800-4×PEG-GAR二次抗体を、1mg/mlストックの1/20,000に希釈した。このドットブロット用途は、MS(PEG)4(3.75×および5×)およびNHSアセテート(5×)の付加が、基本のDYLIGHT(商標)800-4×PEGコンジュゲートの蛍光強度および感度を1.5~6倍で顕著に増強したことを示す。この図のレーンは次の通りである。
(表3)
(図8)5×~20×の範囲の色素のモル過剰で抗体にコンジュゲートしたGAR-DYLIGHT(商標)488の蛍光検出レベルに対する、NHSアセテート(2.5×、5×、および10×モル過剰)またはMS(PEG)4(3.75×モル過剰)の付加の効果を示すウエスタンブロットアッセイ。A431細胞溶解物を1μg/ウェルから3倍に希釈した。使用したウサギ一次抗体は、1mg/mlから1/5000に希釈した抗Hsp90および1mg/mlから1/5000に希釈した抗シクロフィリンBであった。全てのDYLIGHT(商標)二次抗体を、1mg/mlストックから1/5000に希釈した。これらの結果は、ウエスタンブロット用途において、NHSアセテートまたはMS(PEG)4の付加とコンジュゲートしたDYLIGHT(商標)488-GARについて7.5×~20×までの各色素モル過剰において、基本コンジュゲート(スペーサーを含まず作製)を超える蛍光強度の顕著な増加があることを示す。
(図9)ウエスタンブロットでのGAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEG-GAR(7.5×モル過剰の色素で)に対するNHSアセテート(5×)またはMS(PEG)4(5×)の効果を示す。HeLa細胞溶解物を0.5μg/ウェルから4倍に希釈した。一次抗体マウス抗PDIを1mg/mlの1/5000に希釈した。全てのDYLIGHT(商標)二次抗体を、1mg/mlストックの1/5000に希釈した。5×モル過剰でGAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEG-7.5×コンジュゲートに付加されたNHSアセテートは、強度を1.5倍改善した。3.75×モル過剰でGAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEG-7.5×コンジュゲートに付加されたNHSアセテートは、強度を1.4倍改善した。
(図10)GAR-DYLIGHT(商標)800-4×PEG(表4において略称「DYLIGHT(商標)800」)の検出可能な蛍光レベルに対するNHSアセテート(2.5×、5×)またはMS(PEG)4の効果を試験するウエスタンブロットアッセイの結果を示す。A431細胞溶解物を1:1で段階希釈した。一次抗体ウサギ抗Hsp90と抗シクロフィリンBを両方とも1/5000に希釈した。全てのDYLIGHT(商標)二次抗体を、1mg/mlストックの1/20,000に希釈した。このウエスタンブロッティング用途で、MS(PEG)4(3.75×と5×)およびNHSアセテート(2.5~5×)の付加は、異なるモル過剰の色素で、基本DYLIGHT(商標)800-4×PEGコンジュゲートの蛍光強度と感度を20~100%顕著に増強した。この図のレーンは次の通りである。
(表4)
(図11)蛍光のウエスタンブロットおよびドットブロットアッセイでの、GAM-DYLIGHT(商標)550-2×PEG(12.5×モル過剰の色素で)へのNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(5×)およびMS(PEG)8(5×)の付加の効果を示す。HeLa細胞溶解物を0.5μg/ウェルから4倍に希釈し、1mg/mlの1/5000に希釈した抗PDI一次抗体で染色した。全てのDYLIGHT(商標)二次抗体を、1mg/mlストックの1/5000に希釈した。ウエスタンブロッティングおよびドットブロットアッセイは、MS(PEG)4(5×)およびNHSアセテート(2.5×および5×)を付加すると、DYLIGHT(商標)550-2×PEGコンジュゲートの蛍光強度と感度が少なくとも2倍、顕著に増強したことを示した。長鎖MS(PEG)8によって調製されたコンジュゲートは、基本コンジュゲートを超えて顕著な改善を示さなかった。
(図12)ウエスタンブロットおよびドットブロットアッセイでは、GAM-DYLIGHT(商標)680-4×PEG-GAR(10倍モル過剰での色素)に対するNHSアセテート(2.5×、5×)またはMS(PEG)4(5×)の効果を示す。ウエスタンブロットのために、HeLa細胞溶解物を0.5μg/ウェルから4倍に希釈し、抗PDI一次抗体を1mg/mlの1/5000に希釈した。ドットブロットのために、マウスIgGを1000ng/ドットから1:2に段階希釈した。全てのDYLIGHT(商標)680-4×PEG-GAR二次抗体を、1mg/mlストックの1/20000に希釈した。ウエスタンブロッティングとドットブロットアッセイの両方は、MS(PEG)4(5×)およびNHSアセテート(2.5×および5×)を付加すると、DYLIGHT(商標)680-4×PEGコンジュゲートの蛍光強度と感度が3~4倍、顕著に増強したことを示した。
(図13A)(DYLIGHT(商標)488-GAM4μg/mlによるIFC。様々なモル過剰で、基本コンジュゲートに比べてNHSアセテート(2.5×、5×)またはMS(PEG)4(3.75×)からのシグナル/バックグランドの改善倍率、そして図13B(IFC-DYLIGHT(商標)488-GAR4μg/mlによるPDIの検出。様々なモル過剰で、基本コンジュゲートに比べてNHSアセテート(2.5×、5×)またはMS(PEG)4(3.75×)の倍率でシグナル/バックグランドの向上)は、細胞イメージングアッセイでの7.5×~20×モル過剰の色素でのGAM-DYLIGHT(商標)488(13A)およびGAR-DYLIGHT(商標)488(13B)の蛍光に対するNHSアセテート(2.5×および5×)またはMS(PEG)4細胞(3.75×)の付加の効果を実証する。図13A:A549細胞を、1mg/mlストックの1/1000に希釈したpH2A×一次抗体で染色した。全てのDYLIGHT(商標)488二次抗体を1mg/mlストックの1/250に希釈した。NHSアセテート修飾コンジュゲートは、15×の色素モル過剰で基本コンジュゲートと比較してシグナル/バックグラウンドの1.4~1.5倍(GAM)および1.1~1.6倍(GAR)の範囲での改善をもたらした。GAMコンジュゲートについては、5×でのNHSアセテートおよび3.75×でのGARコンジュゲートについてのMS(PEG)4で最も顕著な改善が観察され、2.5×でのNHSアセテートおよび3.75×でのMS(PEG)4でより顕著な改善が観察された。
(図13B)図13Bは、A549細胞をpH2A×一次抗体で染色した同様の実験を示す。
(図14)DYLIGHT(商標)550-2×PEG(7.5×~20×)4μg/mlによるPDIのIFC検出。各々の色素モル過剰での基本コンジュゲートに対するNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、10×)の付加からの改善倍率。この図は、蛍光細胞イメージングアッセイでの、GAM-DYLIGHT(商標)550-2×PEG-GAM(7.5×~20×モル過剰の色素での)へのNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、および10×)の付加の効果を示す。U2OS細胞を、1mg/mlストックの1/100に希釈した抗PDI一次抗体で染色した。全てのDYLIGHT(商標)550-2×PEG-GAM二次抗体(表5において略称「DYLIGHT(商標)550」)を1mg/mlストックの1/250に希釈した。この細胞イメージング用途において、5×NHSアセテートの付加は、12.5×色素モル過剰のDYLIGHT(商標)550-2×PEG GAMコンジュゲートについての基本コンジュゲート(付加なしで作られた)と比較して約50%の改善をもたらし、3.75×MS(PEG)4の付加は、20倍の色素モル過剰で、基本コンジュゲートに対して約50%の改善をもたらした。この図のレーンは次の通りである。
(表5)
(図15)DYLIGHT(商標)650-4×PEG(7.5×~20×)4μg/mlによるPDIのIFC検出。各々の色素モル過剰での基本コンジュゲートに対するNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、10×)の付加からの改善倍率。この図は、蛍光細胞イメージングアッセイのGAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEGでの、GAM-DYLIGHT(商標)650-4×PEGに対するNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、10×)付加の効果を示す。U2OS細胞を、1mg/mlストックの1/100に希釈した抗PDI一次抗体で染色した。全てのDYLIGHT(商標)650-4×PEG-GAM二次抗体(表6において略称「DYLIGHT(商標)650」)を1mg/mlストックの1/250に希釈した。この用途において、NHSアセテート-5×の付加は、20×モル過剰のDYLIGHT(商標)650-4×PEG GAMコンジュゲートについての基本コンジュゲート(付加なしで作られた)と比較して約70%の改善をもたらし、MS(PEG)4-3.75×の付加は、20倍のモル過剰で、基本コンジュゲートに対して約90%の改善を示した。この図のレーンは次の通りである。
(表6)
(図16)IFC-DYLIGHT(商標)680-4×PEG、各々のモル過剰での基本コンジュゲートに対するNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.75×、5×、10×)での改善倍率。この図は、細胞イメージングアッセイでの、GAM-DYLIGHT(商標)680-4×PEG)へのNHSアセテート(2.5×、5×、および10×)またはMS(PEG)4(3.3.75×、5×、10×)の付加の効果を示す。U2OS細胞を、1mg/mlストックの1/100に希釈したマウス抗PDI一次抗体で染色した。全てのDYLIGHT(商標)680-4×PEG-GAM二次抗体(表7において略称「DYLIGHT(商標)680」)を1mg/mlストックの1/250に希釈し、この細胞イメージング用途では、NHSアセテート-5×の付加は、DYLIGHT(商標)680-4×PEGの基本コンジュゲート(付加なしで作製)と比較して、7.5×と10×の両方で色素コンジュゲートの約70%の改善をもたらした。15×モル過剰のモル過剰でのGAMコンジュゲートとMS(PEG)4-3.75×は、15×モル過剰での基本コンジュゲートよりも約80%の改善を示した。この図のレーンは次の通りである。
(表7)
(図17)ベタイン有りまたはなしのTAMRA-GAM共コンジュゲート。この図は、ベタイン有りまたはなしの、TAMRA-ヤギ抗マウス抗体(GAM)コンジュゲートの様々な色素/タンパク質モル比で観察された蛍光レベルを例示する。抗体のモル数と比較して、2.5、5、および10×モル過剰でベタインのレベルを試験した。NHS-ローダミン(TAMRA)で標識し、様々なNHS-ベタイン濃度(ベタイン2.5×、ベタイン5×、ベタイン10×モル過剰の色素)とコンジュゲートしたこれらの抗体は、抗体をスペーサー剤としてのベタインとコンジュゲートするときに全蛍光の増加を示した。
(図18)蛍光標識を含む分岐鎖PEG分子の生成および抗体分子への結合の概略図を示す。ステップ1では、反応性基および蛍光標識を分岐鎖PEG分子上のNH2基に結合させる。ステップ2において、付着部位が抗体分子に付加される。ステップ3では、蛍光標識された分岐鎖PEG分子を抗体分子に共有結合させる。
(図19)シングルアームコネクター(アミロースなど)とマルチアームコネクター(デキストラン)の各々の一例を示す図である。BMは生体分子を表し、APは結合点を表し、これは蛍光標識がその点に結合されることを意味する。
(図20)スターポリマーの種々の種類といくつかのスターポリマーの成分の例およびスターポリマーの製造方法の例である。図20Aは、コア(黒丸)および複数のアーム(黒線)を有するスターポリマーの図である。スターはアームに共有結合した蛍光標識を表す。いくつかのアームは蛍光標識されておらず、標識が完了しなかったことを示している。図20Bは、アームが2つの異なる種類(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリビニルアルコール)であり、異なるアームの種類が実線および破線で表される、同様のスターポリマーの図である。図20Cの左側は、他の化学物質を結合するため、または重合のための開始剤として作用するために使用することができる反応性基(灰色のバー)を有するコア(黒い半円)の部分図を示す。コアは反応性基に結合したアダプター(黒い実線)を有して中心に表される。ポリマーアームは、アダプターに結合した右側(黒い破線)に示され、そして蛍光分子(スター)で標識されている。
(図21)本発明の実施において使用することができる種類の例示的なポリリジン分子を示す。R1およびR2基は標識なしとして示されている。これらの基は、蛍光標識のためのおよび生体分子(例えば、抗体)へのコンジュゲートのための結合点として使用することができる。
(図22)AF647分岐鎖PEGコンストラクトとコンジュゲートしたSK3マウス抗ヒトCD4抗体。SK3マウス抗ヒトCD4抗体(5.5mg/mL)を、抗体に対して10倍モル過剰エステルでのALEXA FLUOR(登録商標)647スクシンイミジルエステルで修飾した(破線)。抗体に対して10倍過剰のアジド-SEでタグ化されたSK3を、1mg/mLのアジド-SK3抗体で100μMのAF647-HG20K8 PEG-sDIBOに25℃で20時間クリックコンジュゲートし、5mMのNaN3でクエンチし、コンジュゲートをMillipore AMICON(商標)Ultra-2 100kDa遠心分離フィルターで精製した(点線)。抗体に対して20倍過剰のアジド-SEでタグ化されたSK3を、3mg/mLのアジド-SK3抗体で600μMのAF647-HG20K8 PEG-sDIBOに37℃で3時間クリックコンジュゲートし、5mMのNaN3でクエンチし、コンジュゲートをMillipore AMICON(商標)Ultra-2 100kDa遠心分離フィルターで精製した(実線)。96ウェルプレート中の100万個のFicollで単離されたPBMC/ウェルを、1μg~0.015μgの抗体の7点滴定を用いてSK3コンジュゲートで染色した。染色された細胞の分析は、ATTUNE(商標)NxTフローサイトメーターを用いて実施された。
(図23)AF647分岐鎖PEGコンストラクトとコンジュゲートしたSK3マウス抗ヒトCD4抗体。SK3マウス抗ヒトCD4抗体(5.5mg/mL)を、抗体に対して10倍モル過剰エステルでのALEXA FLUOR(登録商標)647スクシンイミジルエステルで修飾した(AF)。抗体に対して20倍過剰のアジド-SEでタグ化されたSK3を、3mg/mLのアジド-SK3抗体で600μMのAF647-HG20K8 PEG-sDIBOに37℃で3時間クリックコンジュゲートし、5mMのNaN3でクエンチし、コンジュゲートをMillipore AMICON(商標)Ultra-2 100kDa遠心分離フィルターで精製した(B1)。抗体に対して10倍過剰のアジド-SEでタグ化されたSK3を、1mg/mLのアジド-SK3抗体で100μMのAF647-HG20K8 PEG-sDIBOに25℃で20時間クリックコンジュゲートし、5mMのNaN3でクエンチし、コンジュゲートをMillipore AMICON(商標)Ultra-2 100kDa遠心分離フィルターで精製した(B2)。96ウェルプレート中の100万個のFicollで単離されたPBMC/ウェルを、1μg~0.015μgの抗体の7点滴定を用いてSK3コンジュゲートで染色した。染色された細胞の分析は、ATTUNE(商標)NxTフローサイトメーターを用いて実施し、アロフィコシアニン(APC)(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号MHCD0405)と比較された。
蛍光標識は、タンパク質および核酸を含む生体分子の直接的、定量的、特異的、および高感度の検出をもたらすので、イメージングに広く用いられている。スルホン化および/またはPEG修飾されている修飾蛍光標識は、塩基性の未修飾色素と比較して感度が高い。しかしながら、これらの修飾蛍光標識でさえも、特定の色素対タンパク質(D/P)比で蛍光消光を示す。
B=Φ×ε×N
したがって、遊離の蛍光標識の明度の標識された分子の明度に対する比を用いて、全蛍光増強を記載することができる。
本明細書および例示的な実施形態は、限定的なものとして捉えられるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的において、別途示されない限り、数量、割合、または比率を表す全ての数、ならびに明細書および特許請求の範囲に使用される他の数値は、全ての場合において、それらが修正されすぎない程度まで「約」という用語によって修正されているものとして理解されるべきである。したがって、反対が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得ようとする所望の特性によって変化し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲に対する均等の原則の適用を限定することを企図しないように、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数に照らしてかつ通常の四捨五入の技術を適用することによって解釈されるべきである。
いくつかの実施形態において、スペーサー剤をも含む複数の蛍光標識で検出可能に標識されている生体分子が本明細書に開示されている。
スペーサーは、生体分子にコンジュゲートしたときに、独立して生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識の励起から生じる蛍光発光を増強することができる任意の分子であり得る。これは蛍光標識の蛍光消光の低減によるものと考えられる。
本明細書に記載の蛍光色素は、アミン基またはチオール基を非限定的に含む、タンパク質上の官能基へのコンジュゲーションの結果として直接的または間接的に検出可能なシグナルを試料に与えるレポーター分子として機能する。これは、一般に試料の全タンパク質のサブセットの検出と組み合わせて、試料中の全タンパク質を検出する能力をもたらす。そのような場合、全タンパク質標識は、試料中の全タンパク質のサブセットを標識する色素とは区別して識別可能である。
本明細書に開示される組成物および方法において使用され得る生体分子は、分子生物学的用途において有用である任意の生体分子を含む。
典型的には励起波長が少なくとも580nmである場合、所望のスペクトル特性を有する適切な色素を選択した後、当該技術分野で周知の方法を用いて色素を標的担体分子にコンジュゲートさせることができる(Haugland,MOLECULAR PROBES HANDBOOK,上述(2002))。多くの場合、共有結合を形成するためのコンジュゲーションは、反応性化合物とコンジュゲートされるスペーサー分子の両方が可溶性である適切な溶媒中で本発明の反応性化合物を単に混合することからなる。多くの場合、反応は試薬を添加することなく、室温以下で自然に進行する。光活性化されているそれらの反応性化合物については、反応性化合物を活性化するための反応混合物の照射によってコンジュゲーションが促進される。所望の化合物-コンジュゲートを調製し得るような非水溶性物質の化学修飾は、多くの場合、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、酢酸エチル、トルエン、またはクロロホルムなどの非プロトン性溶媒中で実施される。水溶性物質の同様の修飾は、本反応性化合物を使用してそれらを有機溶媒中により容易に溶解させることによって容易に達成される。
ε=タンパク質のモル吸光係数(例えば、IgGのモル吸光係数は約210,000M-1cm-1である)
A最大=色素分子についての最大波長(λmax)で測定された色素溶液の吸光度(A)
CF=補正係数、色素によって引き起こされる280nmの吸光度の量を調整する(表8参照)
希釈率=タンパク質:色素試料を吸光度測定のために希釈した程度(もし希釈していれば)
いくつかの実施形態において、スペーサー分子は、本明細書の実施例に記載されているNHS-エステル化学を用いて生体分子にコンジュゲートされ、他の化学、例えばマレイミド、ピリジルジスルフィド、およびヒドラジド、ならびにアジド/アルキンを含むSITECLICK(商標)技術もまた、このコンジュゲーション戦略のために使用され得る。
抗体に関して、本発明は以下の特徴のうちの1つ以上を含む抗体を含む。
-抗体分子上の平均2~10個の異なる位置で結合(例えば、共有結合)した蛍光標識ポリマー。
-各抗体分子に結合した平均3~80個の蛍光標識。
-蛍光標識された抗体分子の抗原結合親和性(KD)は、標識されていない形態の抗体と比較して、2桁以下(例えば、約0.5~約2.0、約1.0~約2.0、約0.5~約1.5、約0.75~約1.5など)減少する。
-抗体分子に結合した蛍光標識あたりに基づいて、平均蛍光発光量は、遊離の蛍光標識の少なくとも60%(例えば、約60%~約98%、約70%~約98%、約80%~約98%、約85%~約98%、約80%~約93%など)である。
本発明は、部分的には、3つの成分:生体分子、蛍光標識、およびスペーサーの組み合わせに基づく。タンパク質(例えば、抗体)に関して、特にタンパク質が変性していないとき、蛍光標識およびスペーサーのための結合部位として使用され得る基は、常に結合のためにアクセス可能であるとは限らない。さらに、多くの場合、タンパク質を未変性形態に維持することが望ましいであろう。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、緩衝液中に1つ以上のスペーサー、1つ以上の蛍光標識を含む。本明細書に開示されている蛍光分子およびスペーサー分子のいずれも、当該技術分野において既知の任意の緩衝剤と一緒に使用することができる。
本発明は、基礎研究、ハイスループットスクリーニング、免疫組織化学、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)、マイクロアレイ技術、診断学、および医学療法において有用な用途を有する。本発明は、微生物学、免疫学、血液学および輸血、組織病理学、法医学的病理学、および獣医学的病理学の分野における診断用途のための様々なアッセイ形式で使用することができる。
本発明の組成物は、様々なアッセイの実施を容易にするキットに組み込むことができる。キットは、乾燥形態の組成物または溶液中の組成物と共に包装されてもよい。キットは、アッセイを実施するための、典型的には水溶液として存在する1つ以上の緩衝剤、試料調製試薬、追加の検出試薬、有機溶媒、他の蛍光検出プローブ、標準物質、ミクロスフェア、特定の細胞株、抗体および/または取扱説明書をさらに含み得る。追加の任意の剤は、化合物と共に他の細胞機能を試験するための成分を含む。
a)NHS活性化蛍光色素およびスルホNHS-アセテート/NHS-アセテートおよびNHS-MS(PEG)4、NHS-MS(PEG)8およびNHS-MS(PEG)12を用いた抗体標識化。
DYLIGHT(商標)650-4×PEGなどのNHS活性化蛍光色素をジメチルホルムアミド(DMF)中に10mg /mlで再構成した。NHS-アセテートをジメチルホルムアミド(DMF)中に1mg/mlで新たに調製した。NHS-MS(PEG)4(カタログ番号22341(Thermo Fisher Scientific)、NHS-MS(PEG)8(カタログ番号22509(Thermo Fisher Scientific))、NHS-MS(PEG)12(カタログ番号22686(Thermo Fisher Scientific))をDMF中に100mg/mlで再構成した。使用直前に、PEG試薬をDMF中で1mg/mlにさらに希釈した。ホウ酸緩衝液50mM(カタログ番号28384(Thermo Fisher Scientific)、pH8.5)中7~10mg/mlの1mgのヤギ抗マウス(GAM)およびヤギ抗ウサギ(GAR)抗体を、様々なモル過剰での、蛍光色素または各蛍光色素の混合物と、NHS-アセテート、NHS-MS(PEG)4、NHS-MS(PEG)8、またはNHS-MS(PEG)12から選択されるスペーサーと共に、標識した。標識化反応は、室温(RT)で約1時間インキュベートした。NHS活性化色素およびNHS活性化スペーサー剤は、両方の反応が同時に起こるように抗体に添加する前に組み合わせ、色素置換およびスペーサーのランダムな間隔を可能にした。pH4.7の100mM MES緩衝液を各試料に添加して、pHを8.5から約7.2に下げた。この時点で、コンジュゲートの濃度を、保存緩衝液中の最終希釈物を収容するために約6mg/mlに調整した。Dye Removal Resin(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 22858)および5μmのHarvardカラム(Harvard Apparatus、カタログ番号74-3820)を用いて遊離の色素を除去した。タンパク質1mgあたり0.2mlの50%精製樹脂スラリーを使用した。コンジュゲートを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2(PBS)で1:50に希釈し、UV Cary分光光度計を使用してスキャンした。ODスキャン(252nm~900nm)を用いてコンジュゲートの濃度を決定し、色素モル/タンパク質モルの比(D/P)を計算した。最後に、長期保存のためにコンジュゲートをSTABILZYME(登録商標)NOBLE Storage Buffer(Surmodics、カタログ番号SZ04)で1mg/mlに希釈した。
段階希釈(1:1)マウスまたはウサギIgGを選択されたストック濃度から作製した。20μLの12チャンネルマルチピペットを用いて、希釈液を最高から最低まで96ウェルプレートに入れた。11の段階希釈液のうち1または2μLをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。膜を一晩乾燥させ、次いでTBST中の2%BSAブロッキング緩衝液でブロックした。膜を室温で1時間撹拌しながらインキュベートした。ブロッキング溶液を容器からデカントした。二次抗体コンジュゲートをTBSまたはブロッキング緩衝液で希釈した。二次抗体コンジュゲート希釈物は、コンジュゲートされた標識に応じて変動した:1:5,000(DYLIGHT(商標)488および550-2×PEGコンジュゲート);1:10,000(DYLIGHT(商標)650-4×PEGコンジュゲート);ならびに1:20,000(DYLIGHT(商標)680-4×PEGおよびDYLIGHT(商標)800-4×PEGコンジュゲート)。膜を適切な二次抗体コンジュゲートと共に撹拌しながら30~60分間インキュベートした。膜をTBST緩衝液で5分間5回洗浄した。膜を適切な画像装置、例えばChemiDoc MP(488、550、650、680nm)およびLiCOR Odyssey CLx(650、680、800nm)で画像化した。
NA=付加なし
NA=付加なし
NA=付加なし
プレートを調製するために、10μg/mlから始まるマウスまたはウサギIgGの11の(1:1)段階希釈物を調製した。300μLの12チャンネルマルチピペットを使用して、100μLの各希釈液を96ウェルプレートの対応するウェルの最高から最低までの1~11の間で入れ、PBSを最後のカラムに加えた(#12;陰性対照)。これを列AからHまで繰り返した。プレートを一晩インキュベートした後、以下の通りに、ブロッキングし、SUPERBLOCK(商標)Blocking Buffer(Thermo Fisher、カタログ番号37515)でインキュベートした:200μLで5分間を2回、続いて200μLで10分間を1回。プレートを乾燥させ、次いで4℃で乾燥して保存した。
方法1:-80℃で保存した凍結U2OS細胞プレートを50℃で30分間解凍した。保存緩衝液(PBS)を除去し、細胞を1×PBS緩衝液中の0.1%Triton-X100で15分間(100μl/ウェル)透過処理した。プレートを2%BSA/PBS-0.1%Triton-X100ブロッカーで30分間ブロッキングした。2%BSA/PBS-0.1%のTriton-X100で希釈した一次抗体マウス抗PDIまたはウサギ抗HDAC2(10μg/ml)(カタログ番号PA1-861、Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)を、プレートに加え、室温で1時間インキュベートした。陰性対照は2%のBSA/PBS-0.1%Triton-X100ブロッカーのみを含む。インキュベーション後、一次抗体溶液をプレートから除去し、プレートを100μl/ウェルPBSTで3回および100μl/ウェルPBSで1回洗浄した。次に、種々のモル過剰の色素で標識されたGAMまたはGAR二次抗体をPBS中で4μg/mlに希釈し、そして室温で1時間インキュベートした。プレートを100μl/ウェルPBSTおよび1×100μl/ウェルPBSで3回洗浄し、Hoechst33342(カタログ番号62249、Thermo Scientific,Waltham,MA)(PBS中0.1μg/mlに希釈)を各ウェル(100μl/ウェル)に加えた。プレートをARRAYSCAN(商標)Plate Reader VTI3、20×対物レンズでスキャンした。
NA=付加なし
NA=付加なし
NA=付加なし
NA=付加なし
NA=付加なし
NHS-アセテート、NHS-MS(PEG)、およびNHS-ベタインなどのスペーサー剤の使用は、蛍光シグナル感度および強度を、典型的には消光をもたらす最適D/Pレベルを超えて増加させた。これは、ヤギ抗マウス(GAM)およびヤギ抗ウサギ(GAR)二次抗体を、NHS-アセテートならびにNHS-MS(PEG)4、NHS-MS(PEG)8およびNHS-MS(PEG)12を含むがこれらに限定されないスペーサー剤と組み合わせて、NHS-DYLIGHT(商標)488、NHS-DYLIGHT(商標)550 2×PEG、NHS-DYLIGHT(商標)650 4×PEG、NHS-DYLIGHT(商標)680 4×PEG、NHS-DYLIGHT(商標)800 4×PEGで標識化することによって実証された。色素コンジュゲーションおよび精製後のD/P値の我々による計算は、スペーサー剤の付加がD/P比に顕著な差を生じさせなかったことを実証したが、これは、これらの試薬およびフルオロフォアが抗体上の異なる第1級アミンを標識したことを示す(すなわち、それらは同一の第1級アミンについて競合しなかった)。
TAMRA-SEを秤量して無水DMSO中10mg/mLの原液として調製し、ベタイン-SEを秤量して無水DMSO中4mg/mLのストックとして調製した。次いで、DMSO溶液を反応バイアルに移し、TAMRA-SE+/-ベタイン-SEを、IgGに対する5、10、または20倍の色素のIgGに対するモル比に基づいて測定してバイアルに入れ、ベタイン-SEのIgGに対するモル比0または10の当量もまたバイアルに添加した。
AF488-SEを秤量して無水DMSO中10mg/mLの原液として調製し、プロパン-スルトンを秤量してE-PureH2O中1mg/mLのストックとして調製した。
「AF647-SE」と略されるALEXA FLUOR(登録商標)647 NHS/スクシンイミジルエステル(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号A37573)を秤量し、無水DMSO(Thermo Fisher Scientific、D12345)中32mMの原液として調製した。CLICK-IT(商標)SDPエステルsDIBOアルキン(sDIBO)(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号C20025)を無水DMSO中9mg/mLの原液として調製した。以下の構造を有し、「20K8 PEG」と称される、8アームPEGアミン(ヘキサグリセロール)、HCl塩(JenKem,Plano,TX 75024,カタログ番号8ARM-NH2HCl)
を秤量し、無水DMSO中40mg/mLの原液として調製した。
量子収量測定用の試料を調製するために、AF647分岐鎖PEGコンストラクト(AF647-2K4、AF647-10K4、AF647-10K8、およびAF647-20K8)の溶液を脱イオン水中0.16μMの最終色素濃度に希釈した。量子収率(Φ)は、Hamamatsu Absolute PL Quantum Yield Spectrometerを用いて測定した。分岐鎖PEGコンストラクトについての量子収率を遊離色素のものと比較して、最終コンストラクトにおける消光度を決定した。さらに、分岐鎖PEGスペーサーを用いて達成される蛍光増強を決定するために明度を決定した。最小のコンストラクト、AF647-2K4(4つのアームを有する2,000分子量の分岐鎖PEG)は最大の消光(20%の遊離色素のQY、0.2の蛍光比)を示し、そして全蛍光における全体的な改善が最も低かった。89%までの蛍光量子収率が遊離色素(蛍光比0.9)で保持されている4つまたは8つのアーム(AF647-10K4およびAF647-20K8)のいずれかを有する高分子量コンストラクトについて最大の蛍光増強が見られ、そして5.8倍までの明度の改善が見られた。
新たに採取した抗凝固全血(ヒト)を、ACK溶解緩衝液を用いて室温で20分間溶解した。白血球を遠心分離(400×g、5分)により単離し、そして1%ウシ血清アルブミン/PBS(1%BSA/PBS)中で2回洗浄した。単離後、COUNTESS(登録商標)自動細胞計数器を用いて白血球の全数を決定し、次いで1mLあたり1000万細胞に希釈した。96ウェルプレート中の100万個の細胞/ウェルを、1μg~0.015μgの抗体の7点滴定を用いてAF647-20K8 PEG-SK3コンジュゲートで染色した。染色細胞を1%BSA/PBSで2回洗浄した。染色された細胞の分析は、ATTUNE(商標)NxTフローサイトメーターを用いて実施し、APC(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号MHCD0405)、ALEXA FLUOR(登録商標)488(Invitrogen、カタログ番号MHCD0420)、FITC(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号MA1-81103)およびBRILLIANT VIOLET(商標)605(BioLegend,San Diego、CA、カタログ番号300555)CD4コンジュゲートと比較された。
70kDのアミノデキストランAF488足場の調製:10mgのアミノデキストラン(70,000MW、20個のアミノ基;Thermo Fisher Scientific、カタログ番号D1862)を1.0μlのDIEAを含む1.2mlの乾燥DMSOに溶解した。0.9mgのALEXA FLUOR(登録商標)488スクシンイミジルエステルリチウム塩(643MF; Thermo Fisher Scientific、カタログ番号A20000)を溶液に添加し、混合物を周囲温度で3.5時間撹拌した。溶液を12mLの酢酸エチルで希釈し、得られた懸濁液を遠心分離した。上清を廃棄し、そして固形物を10mLの新たな酢酸エチルと共に振盪し、そして遠心分離した。この洗浄を10mLの新たな酢酸エチルでさらに3回繰り返し、得られた沈殿物を真空中で乾燥させた。固体を0.5mlの水に再溶解し、そして溶液を両側から切り取った10cmのSpectra/Por Dialysis膜(Spectrum Labs、MWCO12-14,000、平坦、幅10mm)中に入れた。透析膜を1Lの水中で1週間ゆっくり撹拌した。水は1日に2回交換した。透析膜を一端から開け、溶液を凍結乾燥してアミノデキストランALEXA FLUOR(登録商標)足場を得た。測定されたDOLは9.7であり、相対QYは0.6である(ALEXA FLUOR(登録商標)488のQYを基準とする)。
スペーサー分子が、
スルホ-NHS-アセテート;
(PEG)n(式中、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される);
MS-(PEG)n(式中、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される);
アルカノイル、アルケノイル、またはアルキノイル(-C(O)CnHm)(式中、nが1~20個の原子であり、m>nであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および/または三重結合で互いに結合し得る);あるいは
-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR(式中、xが1~20であり、yが1~6であり、RがHもしくはC1~6アルキルである)によってさらに置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であって、またはアルキル、アルケニル、および/もしくはアルキニル基がアンモニウム(-NH3 +)、第4級アンモニウム((-NR3 +)基でさらに置換され、式中、RがC1~6アルキルである、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基
のうちの1つ以上を含む、項1~22に記載の組成物。
(a)スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、
(b)生体分子に蛍光標識をコンジュゲートすることと、を含み、
ステップ(a)および(b)は同時にまたは任意の順序で行うことができ、
スペーサーと蛍光標識は互いにコンジュゲートしていない、方法。
(a)生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識とは独立して、スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、
(b)生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識に加えてスペーサー分子の存在が複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるかどうかを試験することと、
(c)スペーサー分子を、生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識に加えてスペーサー分子の存在が複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるときにタンパク質にコンジュゲートした蛍光標識の消光を減少させるものとして同定することと、を含む、方法。
(a)生体試料を組成物、抗体と接触させることであって、2つ以上の蛍光標識と2つ以上のスペーサー分子が抗体と共有結合し、蛍光体とスペーサー分子が互いに共有結合していない、接触させることと、
(b)複数の蛍光標識によって発光される蛍光を検出することと、
(c)複数の蛍光標識によって発光された蛍光が検出されるときに、生体試料中の所望の標的の存在を決定することと、を含む、方法。
(a)蛍光標識1個あたりに基づいて0.5以上の蛍光比、
(b)少なくとも4つの蛍光標識を抗体にコンジュゲートすること、および/または
(c)抗体の全蛍光が、非コンジュゲート蛍光分子の蛍光より少なくとも20パーセント大きい、のうちの1つ以上を含む、コンジュゲート抗体。
(a)ポリエチレングリコール、
(b)多糖類、および
(c)ポリペプチド
からなる群から選択される種類の化学物質から構成される、項113~117に記載のコンジュゲート抗体。
(a)反応性基および2つ以上の蛍光標識をスペーサー分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識されたスペーサー分子を形成することと、
(b)蛍光標識されたスペーサー分子を生体分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識された生体分子を形成することと、を含み、
蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識1個あたりに基づいて0.5以上の蛍光比を有する、方法。
(a)生体分子にコンジュゲートした蛍光標識を励起する光に蛍光標識された生体分子を曝露することと、
(b)生体分子にコンジュゲートした蛍光標識によって生成された発光を検出することと、を含み、
蛍光標識された生体分子が、4つ以上の蛍光標識にコンジュゲートし、
蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識1個あたりに基づいて0.7以上の蛍光比を有する、方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕第1の抗体を含む組成物であって、
2つ以上の蛍光標識および2つ以上のスペーサー分子が前記第1の抗体に共有結合し、 前記蛍光標識およびスペーサー分子が互いに共有結合していない、組成物。
〔2〕前記第1の抗体が、等量の蛍光標識を用いて調製されたが前記スペーサー分子を含まない第2の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示す、前記〔1〕に記載の組成物。
〔3〕前記第1の抗体が第2の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示し、前記第1の抗体および前記第2の抗体がそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、前記第2の抗体が共有結合したスペーサー分子を有さない、前記〔1〕に記載の組成物。
〔4〕前記スペーサー分子が、前記蛍光標識の消光を、前記スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、前記〔1〕に記載の組成物。
〔5〕前記スペーサー分子が、反応性基に対して前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔1〕に記載の組成物。
〔6〕前記反応性基がアミン基である、前記〔5〕に記載の組成物。
〔7〕前記アミン基がリジン残基上にある、前記〔6〕に記載の組成物。
〔8〕前記蛍光標識がコンジュゲーション分子によって前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔1〕に記載の組成物。
〔9〕前記蛍光標識が正に荷電している、前記〔1〕に記載の組成物。
〔10〕前記蛍光標識がALEXA FLUOR(登録商標)色素またはDYLIGHT(商標)色素である、前記〔1〕に記載の組成物。
〔11〕前記蛍光標識が、ALEXA FLUOR(登録商標)350、ALEXA FLUOR(登録商標)405、ALEXA FLUOR(登録商標)430、ALEXA FLUOR(登録商標)488、ALEXA FLUOR(登録商標)500、ALEXA FLUOR(登録商標)514、ALEXA FLUOR(登録商標)532、ALEXA FLUOR(登録商標)546、ALEXA FLUOR(登録商標)555、ALEXA FLUOR(登録商標)568、ALEXA FLUOR(登録商標)594、ALEXA FLUOR(登録商標)610-X、ALEXA FLUOR(登録商標)633、ALEXA FLUOR(登録商標)647、ALEXA FLUOR(登録商標)660、ALEXA FLUOR(登録商標)680、ALEXA FLUOR(登録商標)700、ALEXA FLUOR(登録商標)750、ALEXA FLUOR(登録商標)790、AMCA-X、BODIPY(登録商標)630/650、BODIPY(登録商標)650/665、BODIPY(登録商標)FL、BODIPY(登録商標)TMR、BODIPY(登録商標)TR、BODIPY(登録商標)TR-X、CASCADE BLUE(登録商標)、ジニトロフェニル、フルオレセイン、HEX、JOE、MARINA BLUE(登録商標)、OREGON GREEN(登録商標)488、OREGON GREEN(登録商標)514、PACIFIC BLUE(商標)、PACIFIC ORANGE(商標)、RHODAMINE GREEN(商標)、QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35、ROX、RHODAMINE RED(商標)、TET、TAMRA、テトラメチルローダミン、FAM、TEXAS RED(登録商標)、または7-ヒドロキシ-9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン)スクシンイミジルエステル(DDAO-SE)からなる群から選択される色素である、前記〔1〕に記載の組成物。
〔12〕前記蛍光標識が、DYLIGHT(商標)350、DYLIGHT(商標)405、DYLIGHT(商標)488、DYLIGHT(商標)550、DYLIGHT(商標)594、DYLIGHT(商標)633、DYLIGHT(商標)650、DYLIGHT(商標)680、DYLIGHT(商標)755、およびDYLIGHT(商標)800からなる群から選択される色素である、前記〔1〕に記載の組成物。
〔13〕前記スペーサー分子が負に荷電しているか中性である、前記〔1〕に記載の組成物。
〔14〕前記スペーサー分子が、アセテートおよびポリエチレングリコール(PEG)から選択される、前記〔1〕に記載の組成物。
〔15〕前記スペーサー分子がアセチル基を含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔16〕前記スペーサー分子がアセテート分子を含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔17〕前記アセテート分子がスルホ-NHS-アセテートである、前記〔1〕に記載の組成物。
〔18〕前記スペーサー分子が(PEG)nを含むかまたはそれからなり、式中、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される、前記〔1〕に記載の組成物。
〔19〕前記スペーサー分子がMS-(PEG)nを含み、式中、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される、前記〔1〕に記載の組成物。
〔20〕前記スペーサー分子が、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル(-C(O)C n H m )から選択される基を含むか、またはそれらからなり、式中、nが1~20個の原子であり、m>nであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および/または三重結合によって互いに結合し得る、前記〔1〕に記載の組成物。
〔21〕前記アルキル、アルケニル、および/またはアルキニル基が、-(OCH 2 CH 2 O) x -(CH 2 ) y -ORによってさらに置換され、式中、xが1~20であり、yが1~6であり、RがHまたはC 1~6 アルキルである、前記〔1〕に記載の組成物。
〔22〕前記アルキル、アルケニル、および/またはアルキニル基が、アンモニウム(-NH 3 + )、第4級アンモニウム(-NR 3 + )基でさらに置換され、式中、RがC 1~6 アルキルである、前記〔21〕に記載の組成物。
〔23〕前記蛍光色素が、1つ以上のALEXA FLUOR(登録商標)350、ALEXA FLUOR(登録商標)405、ALEXA FLUOR(登録商標)430、ALEXA FLUOR(登録商標)488、ALEXA FLUOR(登録商標)500、ALEXA FLUOR(登録商標)514、ALEXA FLUOR(登録商標)532、ALEXA FLUOR(登録商標)546、ALEXA FLUOR(登録商標)555、ALEXA FLUOR(登録商標)568、ALEXA FLUOR(登録商標)594、ALEXA FLUOR(登録商標)610-X、ALEXA FLUOR(登録商標)633、ALEXA FLUOR(登録商標)647、ALEXA FLUOR(登録商標)660、ALEXA FLUOR(登録商標)680、ALEXA FLUOR(登録商標)700、ALEXA FLUOR(登録商標)750、ALEXA FLUOR(登録商標)790、AMCA-X、BODIPY(登録商標)630/650、BODIPY(登録商標)650/665、BODIPY(登録商標)FL、BODIPY(登録商標)TMR、BODIPY(登録商標)TR、BODIPY(登録商標)TR-X、CASCADE BLUE(登録商標)、ジトロフェニル、フルオレセイン、HEX、JOE、MARINA BLUE(登録商標)、OREGON GREEN(登録商標)488、OREGON GREEN(登録商標)514、PACIFIC BLUE(商標)、PACIFIC ORANGE(商標)、RHODAMINE GREEN(商標)、QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35、ROX、RHODAMINE RED(商標)、TET、TAMRA、テトラメチルローダミン、FAM、TEXAS RED(登録商標)、または7-ヒドロキシ-9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン)スクシンイミジルエステル(DDAO-SE)、ならびにDYLIGHT(商標)350、DYLIGHT(商標)405、DYLIGHT(商標)488、DYLIGHT(商標)550、DYLIGHT(商標)594、DYLIGHT(商標)633、DYLIGHT(商標)650、DYLIGHT(商標)680、DYLIGHT(商標)755、およびDYLIGHT(商標)80からなる群からのものを含み、
前記スペーサー分子が、
スルホ-NHS-アセテート;
(PEG)n(式中、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される);
MS-(PEG)n(式中、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される);
アルカノイル、アルケノイル、またはアルキノイル(-C(O)C n H m )(式中、nが1~20個の原子であり、m>nであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および/または三重結合で互いに結合し得る);あるいは
-(OCH 2 CH 2 O) x -(CH 2 ) y -OR(式中、xが1~20であり、yが1~6であり、RがHもしくはC 1~6 アルキルである)によってさらに置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であって、または前記アルキル、アルケニル、および/もしくはアルキニル基がアンモニウム(-NH 3 + )、第4級アンモニウム((-NR 3 + )基でさらに置換され、式中、RがC 1~6 アルキルである、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基
のうちの1つ以上を含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔24〕前記アルキル、アルケニル、および/またはアルキニル基が、ホスホニウム基(-PQ 3 + )によってさらに置換され、式中、Qがアリール、置換されたアリール、またはC 1~6 アルキルである、前記〔23〕に記載の組成物。
〔25〕蛍光標識の抗体に対する比が1~50である、前記〔1〕に記載の組成物。
〔26〕蛍光標識の抗体に対する前記比が5~30である、前記〔25〕に記載の組成物。
〔27〕蛍光標識の抗体に対する前記比が1~20である、前記〔25〕に記載の組成物。
〔28〕前記スペーサー分子の抗体に対する比が1~50である、前記〔1〕に記載の組成物。
〔29〕前記スペーサー分子の抗体に対する前記比が5~30である、前記〔28〕に記載の組成物。
〔30〕前記スペーサー分子の抗体に対する前記比が5~30である、前記〔28〕に記載の組成物。
〔31〕前記スペーサー分子の抗体に対する前記比が1~20である、前記〔28〕に記載の組成物。
〔32〕前記スペーサー分子が、0.1~25倍、1~15倍、または2.5~10倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔1〕に記載の組成物。
〔33〕前記スペーサー分子が、2.5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔32〕に記載の組成物。
〔34〕前記スペーサー分子が、5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔33〕に記載の組成物。
〔35〕前記スペーサー分子が、7.5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔33〕に記載の組成物。
〔36〕前記スペーサー分子が、10倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔33〕に記載の組成物。
〔37〕前記複数の蛍光標識によって占有されている前記抗体上の結合部位の割合が1%~99%である、前記〔33〕に記載の組成物。
〔38〕前記スペーサー分子の存在が、前記蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%、または少なくとも500%増加させる、前記〔1〕に記載の組成物。
〔39〕蛍光標識された生体分子の蛍光を増加させる方法であって、
(a)スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、
(b)前記生体分子に蛍光標識をコンジュゲートすることと、を含み、
ステップ(a)および(b)は同時にまたは任意の順序で行うことができ、
前記スペーサーと蛍光標識は互いにコンジュゲートされていない、方法。
〔40〕前記スペーサー分子が、前記蛍光標識の消光を、前記スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、前記〔39〕に記載の方法。
〔41〕前記スペーサー分子が、反応性基に対して前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔39〕に記載の方法。
〔42〕前記反応性基がアミン基である、前記〔41〕に記載の方法。
〔43〕前記アミン基がリジン残基上にある、前記〔42〕に記載の方法。
〔44〕前記蛍光標識が正に荷電している、前記〔39〕に記載の方法。
〔45〕前記蛍光色素がALEXA FLUOR(登録商標)およびDYLIGHT(商標)から選択される、前記〔39〕に記載の方法。
〔46〕前記蛍光標識が、ALEXA FLUOR(登録商標)350、ALEXA FLUOR(登録商標)405、ALEXA FLUOR(登録商標)430、ALEXA FLUOR(登録商標)488、ALEXA FLUOR(登録商標)500、ALEXA FLUOR(登録商標)514、ALEXA FLUOR(登録商標)532、ALEXA FLUOR(登録商標)546、ALEXA FLUOR(登録商標)555、ALEXA FLUOR(登録商標)568、ALEXA FLUOR(登録商標)594、ALEXA FLUOR(登録商標)610-X、ALEXA FLUOR(登録商標)633、ALEXA FLUOR(登録商標)647、ALEXA FLUOR(登録商標)660、ALEXA FLUOR(登録商標)680、ALEXA FLUOR(登録商標)700、ALEXA FLUOR(登録商標)750、ALEXA FLUOR(登録商標)790、AMCA-X、BODIPY(登録商標)630/650、BODIPY(登録商標)650/665、BODIPY(登録商標)FL、BODIPY(登録商標)TMR、BODIPY(登録商標)TR、BODIPY(登録商標)TR-X、CASCADE BLUE(登録商標)、ジニトロフェニル、フルオレセイン、HEX、JOE、MARINA BLUE(登録商標)、OREGON GREEN(登録商標)488、OREGON GREEN(登録商標)514、PACIFIC BLUE(商標)、PACIFIC ORANGE(商標)、RHODAMINE GREEN(商標)、QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35、ROX、RHODAMINE RED(商標)、TET、TAMRA、テトラメチルローダミン、FAM、TEXAS RED(登録商標)、および7-ヒドロキシ-9H-(l,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン)スクシンイミジルエステル(DDAO-SE)からなる群から選択される、前記〔39〕に記載の方法。
〔47〕前記蛍光標識が、DYLIGHT(商標)350、DYLIGHT(商標)405、DYLIGHT(商標)488、DYLIGHT(商標)550、DYLIGHT(商標)594、DYLIGHT(商標)633、DYLIGHT(商標)650、DYLIGHT(商標)680、DYLIGHT(商標)755、およびDYLIGHT(商標)800からなる群から選択される、前記〔39〕に記載の方法。
〔48〕前記スペーサー分子が負に荷電しているか中性である、前記〔39〕に記載の方法。
〔49〕前記スペーサー分子が、アセテートおよびポリエチレングリコール(PEG)から選択される、前記〔39〕に記載の方法。
〔50〕前記スペーサー分子がアセチル基を含む、前記〔39〕に記載の方法。
〔51〕前記スペーサー分子がアセテート分子を含む、前記〔39〕に記載の方法。
〔52〕前記アセテート分子がスルホ-NHS-アセテートである、前記〔39〕に記載の方法。
〔53〕前記スペーサー分子が(PEG)nを含み、式中、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される、前記〔39〕に記載の方法。
〔54〕前記スペーサー分子がMS-(PEG)nを含み、式中、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15から選択される、前記〔39〕に記載の方法。
〔55〕前記スペーサー分子が、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル(-C(O)C n H m から選択される基を含み、式中、nが1~20個の原子であり、m>nであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および/または三重結合によって互いに結合し得る、前記〔39〕に記載の方法。
〔56〕前記アルキル、アルケニル、および/またはアルキニル基が、-(OCH 2 CH 2 O) x -(CH 2 ) y -ORによってさらに置換され、式中、xが1~20であり、yが1~6であり、RがHまたはC 1~6 アルキルである、前記〔55〕に記載の方法。
〔57〕前記アルキル、アルケニル、および/またはアルキニル基が、アンモニウム((-NH 3 + )、第4級アンモニウム(-NR 3 + )基でさらに置換され、式中、RがC 1~6 アルキルである、前記〔55〕に記載の方法。
〔58〕前記アルキル、アルケニル、および/またはアルキニル基が、ホスホニウム基(-PQ 3 + )によってさらに置換され、式中、Qがアリール、置換されたアリール、またはC 1~6 アルキルである、前記〔55〕に記載の方法。
〔59〕蛍光標識の抗体に対する比が1~50である、前記〔39〕に記載の方法。
〔60〕蛍光標識の抗体に対する前記比が5~30である、前記〔59〕に記載の方法。
〔61〕蛍光標識の抗体に対する前記比が1~20である、前記〔59〕に記載の方法。
〔62〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する比が1~50である、前記〔39〕に記載の方法。
〔63〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が5~30である、前記〔62〕に記載の方法。
〔64〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が5~30である、前記〔62〕に記載の方法。
〔65〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が1~20である、前記〔62〕に記載の方法。
〔66〕前記スペーサー分子が、0.1~25倍、1~15倍、または2.5~10倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔39〕に記載の方法。
〔67〕前記スペーサー分子が、2.5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔66〕に記載の方法。
〔68〕前記スペーサー分子が、5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔66〕に記載の方法。
〔69〕前記スペーサー分子が、7.5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔66〕に記載の方法。
〔70〕前記スペーサー分子が、10倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔66〕に記載の方法。
〔71〕前記複数の蛍光標識によって占有されている前記抗体上の結合部位の割合が1%~99%である、前記〔39〕に記載の方法。
〔72〕前記スペーサー分子の存在が、前記蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%、または少なくとも500%増加させる、前記〔39〕に記載の方法。
〔73〕蛍光標識された生体分子の蛍光発光を増強することができるスペーサー分子を同定する方法であって、
(a)生体分子にコンジュゲートされた複数の蛍光標識とは独立して、スペーサー分子を前記生体分子にコンジュゲートすることと、
(b)前記生体分子にコンジュゲートされた前記複数の蛍光標識に加えて前記スペーサー分子の存在が前記複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるかどうかを試験することと、
(c)前記スペーサー分子を、前記生体分子にコンジュゲートされた前記複数の蛍光標識に加えて前記スペーサー分子の存在が前記複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるときに、前記タンパク質にコンジュゲートされた前記蛍光標識の消光を減少させるものとして同定することと、を含む、方法。
〔74〕前記スペーサー分子が、前記生体分子上に存在する最初のリジン側鎖で前記生体分子にコンジュゲートされている、前記〔73〕に記載の方法。
〔75〕前記生体分子が抗体または抗体断片である、前記〔73〕に記載の方法。
〔76〕前記複数の蛍光標識が正に荷電している、前記〔73〕に記載の方法。
〔77〕前記スペーサー分子が正に荷電している、前記〔73〕に記載の方法。
〔78〕前記複数の蛍光標識が負に荷電している、前記〔73〕に記載の方法。
〔79〕前記スペーサー分子が負に荷電している、前記〔73〕に記載の方法。
〔80〕前記複数の蛍光標識がALEXA FLUOR(登録商標)およびDYLIGHT(商標)分子から選択される色素である、前記〔73〕に記載の方法。
〔81〕前記複数の蛍光標識が、ALEXA FLUOR(登録商標)350、ALEXA FLUOR(登録商標)405、ALEXA FLUOR(登録商標)430、ALEXA FLUOR(登録商標)488、ALEXA FLUOR(登録商標)500、ALEXA FLUOR(登録商標)514、ALEXA FLUOR(登録商標)532、ALEXA FLUOR(登録商標)546、ALEXA FLUOR(登録商標)555、ALEXA FLUOR(登録商標)568、ALEXA FLUOR(登録商標)594、ALEXA FLUOR(登録商標)610-X、ALEXA FLUOR(登録商標)633、ALEXA FLUOR(登録商標)647、ALEXA FLUOR(登録商標)660、ALEXA FLUOR(登録商標)680、ALEXA FLUOR(登録商標)700、ALEXA FLUOR(登録商標)750、ALEXA FLUOR(登録商標)790、AMCA-X、BODIPY(登録商標)630/650、BODIPY(登録商標)650/665、BODIPY(登録商標)FL、BODIPY(登録商標)TMR、BODIPY(登録商標)TR、BODIPY(登録商標)TR-X、CASCADE BLUE(登録商標)、ジニトロフェニル、フルオレセイン、HEX、JOE、MARINA BLUE(登録商標)、OREGON GREEN(登録商標)488、OREGON GREEN(登録商標)514、PACIFIC BLUE(商標)、PACIFIC ORANGE(商標)、RHODAMINE GREEN(商標)、QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35、ROX、RHODAMINE RED(商標)、TET、TAMRA、テトラメチルローダミン、FAM、TEXAS RED(登録商標)、および7-ヒドロキシ-9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン)スクシンイミジルエステル(DDAO-SE)から選択される、前記〔73〕に記載の方法。
〔82〕前記複数の蛍光標識が、DYLIGHT(商標)350、DYLIGHT(商標)405、DYLIGHT(商標)488、DYLIGHT(商標)550、DYLIGHT(商標)594、DYLIGHT(商標)633、DYLIGHT(商標)650、DYLIGHT(商標)680、DYLIGHT(商標)755、およびDYLIGHT(商標)800から選択される、前記〔73〕に記載の方法。
〔83〕前記スペーサー分子が、アセテートおよびPEGから選択される、前記〔73〕に記載の方法。
〔84〕前記複数の蛍光標識がコンジュゲーション分子によって前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔73〕に記載の方法。
〔85〕前記複数の蛍光標識が最初のリジン側鎖で前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔73〕に記載の方法。
〔86〕前記スペーサー分子が、最初のリジン側鎖で前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔73〕に記載の方法。
〔87〕前記抗体への前記複数の蛍光標識の、前記色素とタンパク質の比が1~50である、前記〔73〕に記載の方法。
〔88〕前記抗体への前記複数の蛍光標識の、前記色素とタンパク質の前記比が5~30である、前記〔87〕に記載の方法。
〔89〕前記抗体への複数の蛍光標識の、前記色素とタンパク質の前記比が1~20である、前記〔87〕に記載の方法。
〔90〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する比が1~50である、前記〔73〕に記載の方法。
〔91〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が5~30である、前記〔90〕に記載の方法。
〔92〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が5~30である、前記〔90〕に記載の方法。
〔93〕前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が1~20である、前記〔90〕に記載の方法。
〔94〕前記スペーサー分子が、0.1~25倍、1~15倍、または2.5~10倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔73〕に記載の方法。
〔95〕前記スペーサー分子が、2.5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔94〕に記載の方法。
〔96〕前記スペーサー分子が、5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔94〕に記載の方法。
〔97〕前記スペーサー分子が、7.5倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔94〕に記載の方法。
〔98〕前記スペーサー分子が、10倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、前記〔94〕に記載の方法。
〔99〕前記複数の蛍光標識によって占有されている前記抗体上の結合部位の割合が1%~99%である、前記〔73〕に記載の方法。
〔100〕前記スペーサー分子の存在が、前記蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%、または少なくとも500%増加させる、前記〔99〕に記載の方法。
〔101〕生体試料中の所望の標的の存在を決定する方法であって、
(a)前記生体試料を組成物、抗体と接触させることであって、2つ以上の蛍光標識と2つ以上のスペーサー分子が前記抗体と共有結合し、前記蛍光体とスペーサー分子が互いに共有結合していない、接触させることと、
(b)前記複数の蛍光標識によって発光される蛍光を検出することと、
(c)前記複数の蛍光標識によって発光された蛍光が検出されるときに、前記生体試料中の前記所望の標的の存在を決定することと、を含む、方法。
〔102〕前記生体試料が細胞溶解物を含む、前記〔101〕に記載の方法。
〔103〕前記生体試料が無傷の細胞を含む、前記〔101〕に記載の方法。
〔104〕前記生体試料が単離されたタンパク質を含む、前記〔101〕に記載の方法。
〔105〕前記生体試料が組換えタンパク質を含む、前記〔101〕に記載の方法。
〔106〕前記生体試料が固体支持体上に固定化されている、前記〔101〕に記載の方法。
〔107〕前記生体試料が流体中の無傷の細胞を含む、前記〔101〕に記載の方法。
〔108〕前記生体試料が生きている動物である、前記〔101〕に記載の方法。
〔109〕前記生きている動物が哺乳動物である、前記〔108〕に記載の方法。
〔110〕第1の核酸分子を含む組成物であって、
2つ以上の蛍光標識および2つ以上のスペーサー分子が前記第1の核酸分子に共有結合し、
前記蛍光体およびスペーサー分子が互いに共有結合していない、組成物。
〔111〕前記第1の核酸分子が、等量の蛍光標識を用いて調製されたが前記スペーサー分子を含まない第2の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示す、前記〔110〕に記載の組成物。
〔112〕前記第1の核酸分子が第2の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示し、前記第1の核酸分子および前記第2の核酸分子がそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、前記第2の核酸分子が、共有結合したスペーサー分子を有さない、前記〔110〕に記載の組成物。
〔113〕複数の蛍光標識にコンジュゲートされた抗体を含むコンジュゲート抗体であって、以下の特徴、
(a)蛍光標識1個あたりに基づいて0.5以上の蛍光比、
(b)少なくとも4つの蛍光標識を前記抗体にコンジュゲートすること、および/または
(c)前記抗体の全蛍光が、非コンジュゲート蛍光分子の蛍光より少なくとも20パーセント大きい、のうちの1つ以上を含む、コンジュゲート抗体。
〔114〕前記蛍光標識が1つ以上のマルチアームポリマーによって前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔113〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔115〕前記蛍光標識が1つのマルチアームポリマーによって前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔114〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔116〕前記蛍光標識が2~10のマルチアームポリマーによって前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔114〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔117〕2つ以上の蛍光標識が前記抗体にコンジュゲートされている、前記〔116〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔118〕前記マルチアームポリマーのアームが、
(a)ポリエチレングリコール、
(b)多糖類、および
(c)ポリペプチド
からなる群から選択される種類の化学物質から構成される、前記〔113〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔119〕前記蛍光標識間の平均ブラシ距離が200~800オングストロームである、前記〔113〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔120〕前記蛍光標識が少なくとも16の共有結合によって前記抗体から離れている、前記〔113〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔121〕前記蛍光標識が16~800の共有結合によって前記抗体から離れている、前記〔120〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔122〕前記蛍光標識が、ALEXA FLUOR(登録商標)350、ALEXA FLUOR(登録商標)405、ALEXA FLUOR(登録商標)430、ALEXA FLUOR(登録商標)488、ALEXA FLUOR(登録商標)500、ALEXA FLUOR(登録商標)514、ALEXA FLUOR(登録商標)532、ALEXA FLUOR(登録商標)546、ALEXA FLUOR(登録商標)555、ALEXA FLUOR(登録商標)568、ALEXA FLUOR(登録商標)594、ALEXA FLUOR(登録商標)610-X、ALEXA FLUOR(登録商標)633、ALEXA FLUOR(登録商標)647、ALEXA FLUOR(登録商標)660、ALEXA FLUOR(登録商標)680、ALEXA FLUOR(登録商標)700、ALEXA FLUOR(登録商標)750、ALEXA FLUOR(登録商標)790、AMCA-X、BODIPY(登録商標)630/650、BODIPY(登録商標)650/665、BODIPY(登録商標)FL、BODIPY(登録商標)TMR、BODIPY(登録商標)TR、BODIPY(登録商標)TR-X、CASCADE BLUE(登録商標)、ジニトロフェニル、フルオレセイン、HEX、JOE、MARINA BLUE(登録商標)、OREGON GREEN(登録商標)488、OREGON GREEN(登録商標)514、PACIFIC BLUE(商標)、PACIFIC ORANGE(商標)、RHODAMINE GREEN(商標)、QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)21、QSY(登録商標)35、ROX、RHODAMINE RED(商標)、TET、TAMRA、テトラメチルローダミン、FAM、TEXAS RED(登録商標)、または7-ヒドロキシ-9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン)スクシンイミジルエステル(DDAO-SE)からなる群から選択される色素、ならびにDYLIGHT(商標)350、DYLIGHT(商標)405、DYLIGHT(商標)488、DYLIGHT(商標)550、DYLIGHT(商標)594、DYLIGHT(商標)633、DYLIGHT(商標)650、DYLIGHT(商標)680、DYLIGHT(商標)755、およびDYLIGHT(商標)800、およびPEG化DYLIGHT(商標)色素からなる群からの蛍光標識である、前記〔120〕に記載のコンジュゲート抗体。
〔123〕蛍光標識された生体分子を調製する方法であって、
(a)反応性基および2つ以上の蛍光標識をスペーサー分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識されたスペーサー分子を形成することと、
(b)前記蛍光標識されたスペーサー分子を前記生体分子にコンジュゲートし、それによって前記蛍光標識された生体分子を形成することと、を含み、
前記蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識1個あたりに基づいて0.5以上の蛍光比を有する、方法。
〔124〕平均1~10個の蛍光標識されたスペーサー分子が各生体分子にコンジュゲートされている、前記〔123〕に記載の方法。
〔125〕平均3~10個の蛍光標識されたスペーサー分子が各生体分子にコンジュゲートされている、前記〔123〕に記載の方法。
〔126〕前記蛍光標識されたスペーサー分子がマルチアームポリマーである、前記〔123〕に記載の方法。
〔127〕マルチアームポリマーが分岐鎖ポリエチレングリコール分子である、前記〔126〕に記載の方法。
〔128〕前記マルチアームポリマーが4~10個の蛍光標識にコンジュゲートされている、前記〔126〕に記載の方法。
〔129〕前記マルチアームポリマーが、4,000~80,000ダルトンの分子量を有する、前記〔126〕に記載の方法。
〔130〕蛍光標識された生体分子を検出する方法であって、
(a)前記生体分子にコンジュゲートされた蛍光標識を励起する光に前記蛍光標識された生体分子を曝露することと、
(b)前記生体分子にコンジュゲートされた前記蛍光標識によって生成された発光を検出することと、を含み、
前記蛍光標識された生体分子が、4つ以上の蛍光標識にコンジュゲートされ、
前記蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識1個あたりに基づいて0.7以上の蛍光比を有する、方法。
〔131〕前記蛍光標識された生体分子が抗体である、前記〔130〕に記載の方法。
Claims (18)
- 第1の抗体を含む組成物であって、
2つ以上の蛍光標識および2つ以上のスペーサー分子が前記第1の抗体に共有結合し、 前記蛍光標識およびスペーサー分子が互いに共有結合しておらず、
前記第1の抗体は、前記蛍光標識を用いて検出され、
前記スペーサー分子が、
アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル(-C(O)C n H m )(式中、nは1~20個の原子であり、m>nであり、前記アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイルの炭素原子は、単結合、二重結合、および/または三重結合によって互いに結合することができ、また、前記アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイルのアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、ポリ(エチレン)グリコール部分、アンモニウム(-NH 3 + )、第4級アンモニウム(-NR 3 + )基(式中、RはC 1~6 アルキルである)、またはホスホニウム基(-PQ 3 + )(式中、Qはアリール、置換アリール、またはC 1~6 アルキルである)でさらに置換されていてもよい);
アルキル、アルケニル、およびアルキニル基(-C n H m )(式中、nは1~20個の原子であり、m>nであり、前記アルキル、アルケニル、およびアルキニル基の炭素原子は、単結合、二重結合、および/または三重結合によって互いに結合することができ、また、前記アルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、スルホネート基(-OSO 3 -)、カルボキシレート基(-CO 2 -)、ホスフェート基(-OPO 3 -)、ホスホネート基(-PO 3 -)、ポリ(エチレン)グリコール部分、アンモニウム(-NH 3 + )、第4級アンモニウム(-NR 3 + )基(式中、RはC 1~6 アルキルである)、またはホスホニウム基(-PQ 3 + )(式中、Qはアリール、置換アリール、またはC 1~6 アルキルである)でさらに置換されていてもよい);および
アセテート分子から選択されるか、または
前記スペーサー分子は、ポリエチレングリコール(PEG)、MS-PEG、またはベタインを含む、組成物。 - 前記第1の抗体が、等量の蛍光標識を用いて調製されたが前記スペーサー分子を含まない第2の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示す、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1の抗体が第2の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示し、前記第1の抗体および前記第2の抗体がそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、前記第2の抗体が共有結合したスペーサー分子を有さない、請求項1に記載の組成物。
- 前記スペーサー分子が、前記蛍光標識の消光を、前記スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、請求項1に記載の組成物。
- 前記スペーサー分子が、反応性基を介して前記抗体にコンジュゲートされている、請求項1に記載の組成物。
- 前記反応性基がアミン基である、請求項5に記載の組成物。
- 前記アミン基がリジン残基上にある、請求項6に記載の組成物。
- ポリ(エチレン)グリコール部分が、-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR(式中、xは1~20であり、yは1~6であり、そしてRはHまたはC1~6アルキルである)である、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記スペーサー分子が、アセテートおよびポリエチレングリコール(PEG)から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 蛍光標識の抗体に対する比が1~50である、請求項1に記載の組成物。
- 蛍光標識の抗体に対する前記比が5~30である、請求項10に記載の組成物。
- 蛍光標識された生体分子の蛍光を増加させる方法であって、
(a)スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、
(b)前記生体分子に蛍光標識をコンジュゲートすることと、を含み、
ステップ(a)および(b)は同時にまたは任意の順序で行うことができ、
前記スペーサー分子と蛍光標識は互いにコンジュゲートされておらず、
前記生体分子は、前記蛍光標識を用いて検出される、方法。 - 前記スペーサー分子が、前記蛍光標識の消光を、前記スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、請求項12に記載の方法。
- 前記スペーサー分子が、反応性基を介して前記生体分子にコンジュゲートされている、請求項12に記載の方法。
- 前記反応性基がアミン基である、請求項14に記載の方法。
- 前記アミン基がリジン残基上にある、請求項15に記載の方法。
- 前記スペーサー分子が、
アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル(-C(O)CnHm)(式中、nは1~20個の原子であり、m>nであり、前記アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイルの炭素原子は、単結合、二重結合、および/または三重結合によって互いに結合することができ、また、前記アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイルのアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、ポリ(エチレン)グリコール部分、アンモニウム(-NH3 +)、第4級アンモニウム(-NR3 +)基(式中、RはC1~6アルキルである)、またはホスホニウム基(-PQ3 +)(式中、Qはアリール、置換アリール、またはC1~6アルキルである)でさらに置換されていてもよい);
アルキル、アルケニル、およびアルキニル基(-CnHm)(式中、nは1~20個の原子であり、m>nであり、前記アルキル、アルケニル、およびアルキニル基の炭素原子は、単結合、二重結合、および/または三重結合によって互いに結合することができ、また、前記アルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、スルホネート基(-OSO3-)、カルボキシレート基(-CO2-)、ホスフェート基(-OPO3-)、ホスホネート基(-PO3-)、ポリ(エチレン)グリコール部分、アンモニウム(-NH3 +)、第4級アンモニウム(-NR3 +)基(式中、RはC1~6アルキルである)、またはホスホニウム基(-PQ3 +)(式中、Qはアリール、置換アリール、またはC1~6アルキルである)でさらに置換されていてもよい);および
アセテート分子から選択されるか、または
前記スペーサー分子は、ポリエチレングリコール(PEG)、MS-PEG、またはベタインを含む、請求項12~16のいずれか一項に記載の方法。 - ポリ(エチレン)グリコール部分が、-(OCH2CH2O)x-(CH2)y-OR(式中、xは1~20であり、yは1~6であり、そしてRはHまたはC1~6アルキルである)である、請求項17に記載の方法。
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