FR3084365A1 - Anticorps a domaine unique qui se lient a la proteine g alpha - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FR1 à FR4) selon la formule (I) suivante : FR1-CDR1-FR2-CDR2 -FR3-CDR3-FR4 (I) et présentant avantageusement une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure à 100 nM.
Description
Anticorps à domaine unique qui se lient à la protéine G alpha
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine des anticorps et notamment le domaine des anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lient à la protéine G alpha. Les sdAb selon l'invention sont particulièrement adaptés pour une utilisation en FRET, par exemple sous la forme d'anticorps à chaîne lourde (HcAbs) couplés à une molécule permettant leur détection.
ARRIERE-PLAN TECHNIQUE
Les récepteurs couplés aux protéines G, ou RCPG, sont les récepteurs membranaires les plus représentés chez les mammifères. Ils sont à l'origine d'une grande variété de réponses cellulaires liées à divers processus physiologiques (ex. vision, olfaction, médiation de l’action de nombreuses hormones, de neuropeptides, etc.). Ils peuvent être activés par des ligands de natures très diverses comme par exemple les photons, les ions, les molécules olfactives, les molécules gustatives, les acides aminés, les acides nucléiques, les lipides, les molécules exogènes telles que les cannabinoïdes, les chimiokines, ou encore les hormones.
Ces récepteurs, possèdent sept régions transmembranaires en forme d'hélices alpha comprenant chacune entre 22 et 24 acides aminés. Les RCPG peuvent être classés chez l'homme en 5 familles principales appelées rhodopsine, adhérence, sécrétine, glutamate, Frizzled / Taste2 (Fredriksson et al., 2003). Les RCPG changent d'état de conformation fonctionnelle selon leur niveau d'activation par un ligand par rapport à un état conformationnel basal. Lorsque le RCPG est activé par la liaison d'un ligand spécifique, le changement de conformation du complexe agoniste-récepteur, permet l'activation de la protéine G hétérotrimérique.
Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques qui transduisent un signal d'activation du RCPG en initiant des cascades de réactions biochimiques ayant pour finalité la transduction du signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule. Les protéines G sont situées sur la face interne de la membrane plasmique et sont formées de trois sousunités (ο, β, γ). La sous-unité alpha est capable de se lier aux nucléotides guanyliques, soit le GDP, soit le GTP.
Le mécanisme d'action du RCPG et de la protéine G communément décrit est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous-unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ;
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous-unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes : 1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée « forme vide ». Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous-unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous unité alpha ;
- la sous unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire ;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous unité bêta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif).
Il existe au moins 17 différentes sous-unités alpha : Galpha il, Galpha i2, Galpha i3, Galpha ol, Galpha o2, Galpha q, Galpha 12, Galpha 13, Galpha s, Galpha z, Galpha tl, Galpha t2, Galpha 11, Galpha 14, Galpha 15, Galpha 16 ou encore Galpha gus.
Etant donné l'implication des RCPG dans de nombreuses voies de signalisation des outils ont été générés dans l'art antérieur pour étudier leur activité, avec souvent pour objectif l'identification de nouveaux ligands de ces récepteurs ayant une potentielle activité thérapeutique. On peut citer à titre d'exemple de ces outils, l'utilisation d'un dérivé radioactif non hydrolysable ou lentement hydrolysable du GTP, notamment le GTP-gamma-S, qui se fixe sur la protéine G alpha lorsque le récepteur est activé. Il existe également des systèmes recombinants basés sur la mesure d'une activité enzymatique telle que la luciférase dont l'expression est contrôlée par les seconds messagers produits par l'activation du récepteur. Des anticorps ont également étés synthétisés pour détecter l'activation des RCPG au niveau de la surface cellulaire (Damien Maurel. Oligomérisation des récepteurs couplés aux protéines G: deux ou plus? Application des technologies de FRET en temps résolu au cas du récepteur GABAB. Biologie cellulaire. Université Montpellier I, 2006. Français). On peut également faire référence au brevet EP2723764 B1 qui propose des nano-anticorps qui se lient à l'interface entre la protéine G alpha et la protéine G bêta/gamma, permettant de stabiliser le complexe RCPG/protéine G.
En revanche aucun des outils de l'art antérieur ne permet de détecter de façon spécifique la sous-unité alpha de la protéine G, et encore moins un sdAb qui se lie à la protéine G alpha, en particulier pour une utilisation en FRET. Ainsi, la présente invention propose avantageusement, des anticorps à domaine unique (sdAb), par exemple des anticorps à chaîne lourde (HcAb) qui se lient à la protéine G alpha (protéine G alpha).
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha.
Un premier objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) ledit anticorps présentant une constante de dissociation (Kd) pour la protéine G alpha pleine mesurée en FRET inférieure à 100 nM.
Un deuxième objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) dans laquelle :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
Un troisième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant pour l'anticorps à domaine unique (sdAb) selon l'invention.
Un quatrième objet de la présente invention concerne un vecteur recombinant comprenant la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
Un cinquième objet de la présente invention concerne une cellule comprenant le vecteur selon l'invention ou la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
Sans indication contraire, les termes « anticorps selon l'invention », « anticorps de l'invention », « sdAb selon l'invention » ou « sdAb de l'invention » font référence à la fois au au premier objet selon l'invention et au deuxième objet selon l'invention.
Les objets de la présente invention sont décrits plus précisément ci-après.
FIGURES
Figure 1 : Représente le mécanisme d'activation d'un RCPG et les différents stades d'activation de la protéine G alpha, à savoir la forme inactivée (protéine G alpha liée au GDP) et la forme activée (protéine Galpha liée au GTP).
Figure 2 : Principe de l'essai HTRF (TR-FRET) pour la détermination de l'affinité (Kd) des domaines variables de chaîne lourde (VH), mis en œuvre dans les figures 3 à 11.
Figure 3 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F9 par essai TR-FRET. Le principe de l'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10pM). Un Kd de 32nM est obtenu pour l'interaction VH F9 / protéine Galphail.
Figure 4 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH Fil par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10pM). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction VH Fil / protéine Galphail.
Figure 5 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH Bll par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10pM). Un Kd de lnM est obtenu pour l'interaction VH Bll / protéine Galphail.
Figure 6 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F4 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10pM). Un Kd de 31nM est obtenu pour l'interaction VH F4 / protéine Galphail.
Figure 7 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH G6 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10pM). Un Kd de 95nM est obtenu pour l'interaction VH G6 / protéine Galphail.
Figure 8 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH A10 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (10pM). Un Kd de 15nM est obtenu pour l'interaction VH A10 / protéine Galphail.
Figure 9 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH G7 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (10pM). Un Kd de 31nM est obtenu pour l'interaction VH G7 / protéine Galphail.
Figure 10 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F2 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (10pM). Un Kd de 14nM est obtenu pour l'interaction VH F2 / protéine Galphail.
Figure 11 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH E2 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (ΙΟμΜ). Un Kd de 72nM est obtenu pour l'interaction VH E2 / protéine Galphail.
Figure 12 : Principe de l'essai TR-FRET (HTRF) pour la détermination de l'affinité (Kd) des 5 HcAb de type VH (HcAb VH), mis en œuvre pour les figures 13 à 16.
Figure 13 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-Bll par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (ΙΟμΜ). Un Kd de lnM est obtenu pour l'interaction HcAb-Bll / protéine Galphail.
Figure 14 : Détermination de l'affinité (Kd) du HCAb-F9 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (ΙΟμΜ). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction HcAb-F9 / protéine Galphail.
Figure 15 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-G7 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (ΙΟμΜ). Un Kd de 5nM est obtenu pour l'interaction HcAb-G7 / protéine Galphail.
Figure 16 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-A10 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (ΙΟμΜ). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction HcAb-A10 / protéine Galphail.
Figure 17 : Schéma de différentes formes possibles d'anticorps sdAb selon l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les Demandeurs ont mis au point des anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lient à la protéine G alpha avec une bonne affinité pour la protéine G alpha pleine. Ces sdAb constituent des outils particulièrement performants comme agent thérapeutique, comme agent de diagnostic et/ou comme agent de détection de la protéine G alpha, en particulier comme agent de détection de la protéine G alpha dans un procédé de type FRET.
Définitions
Les termes « anticorps anti-protéine G alpha », « anticorps qui se lie à la protéine G alpha » et « anticorps qui se lie spécifiquement à la protéine G alpha » sont interchangeables et désignent un anticorps qui se lie à la protéine G alpha avec une affinité suffisante pour que l’anticorps soit utile comme agent de détection (ex. pour la mise en œuvre d'un FRET), de diagnostic et/ou thérapeutique en ciblant la protéine G alpha.
On entend par « anticorps » un polypeptide codé par un gène d’immunoglobuline capable de se lier à un antigène. Le terme « anticorps » est utilisé ici dans son sens le plus large et englobe diverses structures d’anticorps qui présentent l’activité de liaison à l’antigène souhaité, y compris, mais sans s’y limiter, les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les anticorps multispécifiques (par exemple, des anticorps bispécifiques) et des fragments d’anticorps. Les anticorps « conventionnels », c'est le cas par exemple des immunoglobulines de type G (IgG) chez l'homme, se présentent sous la forme d'un tétramère comprenant deux paires de chaînes polypeptidiques identiques dites chaînes légères et deux chaînes polypeptidiques identiques dites chaînes lourdes. Un domaine variable se situe au niveau de l’extrémité N-terminale de chacune des chaînes (« VH » pour les chaînes lourdes et « VL » pour les chaînes légères) et les deux domaines variables VH et VL permettent la reconnaissance de l'antigène. Chaque domaine variable comprend généralement 4 « régions charnières » (appelées FRI, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l'antigène, dites « CDR » (appelées CDR1, CDR2, CDR3). En général, chaque domaine variable se présente sous la forme suivante: FR1-CDR1FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Généralement, c'est le cas par exemple des IgG chez l'homme, la liaison à l'antigène est effectuée par un couple de deux domaines variables (Le. un domaine variable de chaîne légère VL et un domaine variable de chaîne lourde VH), c'est-à-dire que 6 CDRs sont impliqués dans la formation d'un site de liaison à l'antigène.
A l'inverse, pour les anticorps à domaine unique, seulement 3 CDRs sont impliqués dans la formation d'un site de liaison à l'antigène. Ainsi, le site de liaison à l'antigène d'un anticorps à domaine unique est formé par 3 CDRs. Ainsi, les termes « anticorps à domaine unique », « Single domain Antibody » et « sdAb » sont interchangeables et font référence à un anticorps dans lequel la liaison à l'antigène est effectuée par un seul domaine variable. Un sdAb peut être i) un anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne lourde (VH) ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à l’antigène indépendamment de tout autre domaine variable, ii) un anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne légère (VL) ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à l’antigène indépendamment de tout autre domaine variable, ou ii) un anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne lourde de type VhH (VhH) ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à l’antigène indépendamment de tout autre domaine variable.
On entend par « anticorps à chaîne lourde de type VH » ou « HcAb VH », un anticorps constitué de deux chaînes lourdes comprenant chacune un domaine variable de type VH. En particulier, chaque chaîne lourde est constituée des fragments CH2 et CH3, et dudit domaine variable de type VH.
On entend par « anticorps à chaîne lourde de type VhH » ou « HcAb VhH », un anticorps constitué de deux chaînes lourdes comprenant chacune un domaine variable de type VHH. En particulier, chaque chaîne lourde est constituée des fragments CH2 et CH3, et dudit domaine variable de type VhH.
Au sens de l'invention, les termes « Protéine Galpha pleine » ou « forme pleine de la protéine G alpha » désignent une protéine Galpha liée au GTP, au GDP ou à un analogue de ceux-ci, par exemple au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable. Ces termes désignent donc la protéine Galpha liée au GDP ou à un analogue du GDP (« Protéine Galpha liée au GDP ») ou la protéine Galpha liée au GTP ou à un analogue du GTP, par exemple au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (« Protéine Galpha liée au GTP »). La protéine Galpha pleine (protéine Galpha liée au GDP ou protéine Galpha liée au GTP) est représentée à la Figure 1.
Le terme « GDP » désigne la guanosine diphosphate.
Le terme « GTP » désigne la guanosine triphosphate.
Le terme « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable » désigne un analogue du GTP qui n'est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par exemple le GTPgammaS (connu également sous les acronymes « GTPgS » et « GTPyS ») (CAS no. 37589-80-3), le GppNHp (CAS no. 148892-91-5) ou le GppCp (CAS no. 10470-57-2).
Au sens de l'invention, les termes « Protéine Galpha vide » ou « forme vide de la protéine G alpha » désignent une protéine Galpha qui n'est pas liée au GTP ou au GDP. La protéine Galpha vide est décrite dans la littérature comme un état transitoire entre la protéine Galpha liée au GDP et la protéine Galpha liée au GTP. La protéine Galpha vide est représentée à la Figure 1.
Le terme affinité fait référence à la force de l'ensemble des interactions non-covalentes entre une molécule, par exemple un sdAb et son partenaire, par exemple un antigène tel que la protéine G alpha pleine. L'affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET ou en SPR.
Le terme « FRET » (de l'anglais « Fluorescence Resonance Energy Transfer ») désigne le transfert d’énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Forster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis. Dans le cadre de la présente invention, la constante de dissociation (Kd) est mesurée par FRET, par exemple comme décrit dans les exemples.
Au sens de la présente invention, l'« homologie » est calculée en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison. L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) communes aux deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions communes est ensuite divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage d'homologie. La détermination du pourcentage d'homologie de séquence peut être effectuée manuellement ou en utilisant des programmes informatiques bien connus.
Par purifié et isolé, on entend, en se référant à un anticorps selon l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme purifié tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en poids, plus préférablement au moins 85% en poids, encore plus préférablement au moins 95% en poids, et le plus préférablement au moins 98% en poids d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules présentes.
Anticorps sdAb
Un premier objet de l'invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions déterminantes complémentaires dites « CDRs » (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières dites « FRs » (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) dont la constante de dissociation (Kd) pour la protéine G alpha pleine mesurée en FRET est inférieure à 100 nM.
Selon le premier objet, le sdAb se lie à la protéine G alpha pleine (soit la protéine G alpha liée au GTP ou un de ses analogue soit la protéine G alpha liée au GDP ou un de ses analogues) avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure à 100 nM, par exemple une constante d'affinité inférieure à 75 nM, inférieure à 50 nM, inférieure à 25 nM ou encore inférieure à 10 nM, par exemple entre 1 et 10 nM, entre 10 et 100 nM, entre 10 et 75 nM ou entre 10 et 50 nM.
Selon le premier objet, le sdAb peut être obtenu par immunisation d'un camélidé comprenant l'administration d'une protéine G alpha pleine, seule ou en combinaison avec un adjuvant tel que par exemple, un sel d'aluminium, l'adjuvant de Freund ou une huile minérale. L'administration peut être faite par voie sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire ou intra-péritonéale, de préférence par voie sous-cutanée à raison d'une dose comprise entre 10 pg et 10 mg. Ladite administration peut être renouvelée plusieurs fois, chaque administration pouvant être espacée d'un ou plusieurs jours afin d'obtenir une réponse immunitaire optimale. Les anticorps générés peuvent alors être récupérés à partir des cellules mononuclées du sang périphérique via des techniques de purification classiques connues de l'homme du métier, par exemple en procédant à une transcription inverse (RT-PCR) des
ARNm codant pour cet anticorps afin d'obtenir des ADNc qui vont ensuite être clonés au sein d'un vecteur avant d'être sélectionnés par « phage display library » en utilisant la protéine G alpha pleine fixée sur une plaque d'ELISA.
En particulier, les anticorps selon l'invention peuvent être obtenus par la mise en œuvre du protocole décrit dans l'Exemple 1.
Dans un mode de réalisation particulier du premier objet de l'invention :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
Les séquences d'acides aminés des CDR1, CDR2 et CDR3 peuvent facilement être combinées les unes avec les autres pour répondre à la formule (I). L'homme du métier sait déterminer sans difficulté dans quelle mesure ces séquences peuvent être combinées de façon à obtenir des sdAb selon l'invention présentant la constante de dissociation (Kd) souhaitée.
Un second objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) dans laquelle :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
La protéine G alpha peut être d'origine humaine ou animale. Avantageusement, le sdAb selon l'invention se lie à la protéine Galphai (Gai), par exemple la protéine Galphail, la protéine Galphai2 ou la protéine Galphai3. La protéine Galphail d'origine humaine porte l'identifiant UniProt P63096-1 pour l'isoforme 1 et l'identifiant UniProt P63096-2 pour l'isoforme 2. Le gène codant pour la protéine Galphail d'origine humaine est connu sous le nom de « GNAI1 » (Gene ID : 2770, NCBI).
Le sdAb selon l'invention peut se présenter sous différentes formes. Il peut s'agir par exemple d'un domaine variable de chaîne lourde (VH), d'un domaine variable de chaîne lourde de type VhH (VhH), d'un anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH), d'un anticorps à chaîne lourde de type VhH (HcAb VhH), d'un anticorps à chaîne lourde IgG antinouveaux récepteurs d’antigène d’immunoglobuline dérivés des poissons cartilagineux (Ig NAR) ou encore d'un domaine variable d'Ig NAR (V-NAR). Des exemples de structures d'anticorps selon l'invention sont présentés à la Figure 17.
Dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon l'invention :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 1, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 2 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 3 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 9, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 10 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 11 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 17, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 18 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 19 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 25, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 26 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 27 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 33, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 34 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 35 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 41, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 42 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 43 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 49, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 50 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 51 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 57, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 58 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 59 ; ou
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 65, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 66 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 67.
Dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon l'invention :
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 28 SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 60 et SEQ ID NO : 68 ;
- FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 13, SEQ ID
NO : 21, SEQ ID NO : 29 SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 61 et SEQ ID NO : 69; et
- FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 30 SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 62 et SEQ ID NO : 70 ; et
- FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 63 et SEQ ID NO : 71.
Avantageusement, dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon l'invention :
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 5, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 6, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 7 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 8;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 12, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 13, FR3, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 14 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 15;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 20, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 21, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 22 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 23;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 28, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 29, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 30 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 31;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 36, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 37, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 38 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 39;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 44, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 45, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 46 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 47;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 52, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 53, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 54 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins
97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 55;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 60, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 61, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 62 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 63; ou
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec un SEQ ID NO : 68, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 69, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 70 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 71.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'anticorps selon l'invention, la séquence d'acides aminés de formule (I) présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO : 72.
L'anticorps selon l'invention peut se lier à la protéine Galpha sous une forme isolée et/ou présente dans un environnement membranaire, par exemple il peut se lier à une protéine Galpha présente dans une préparation de membranes portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéines G alpha.
Etant donné que l'anticorps selon l'invention se lie à la protéine, il n'est pas nécessaire que la protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que l'anticorps selon l'invention puisse se lier à la protéine G.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'anticorps selon l'invention a une meilleure affinité pour la protéine Galpha pleine par rapport à la protéine Galpha vide, en particulier une meilleure affinité pour la protéine Galpha liée au GTP gamma S. Ainsi, le rapport « Kd pour la protéine Galpha vide/Kd pour la protéine Galpha pleine » mesuré en FRET de l'anticorps de l'invention est au moins égal à 2, par exemple au moins égal à 2,5, au moins égal à 5, au moins égal à 10, et :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une des séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34 ; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35.
Dans un second mode de réalisation particulier, l'anticorps selon l'invention a une meilleure affinité pour la la protéine Galpha vide par rapport à la protéine Galpha pleine. Ainsi, le rapport « Kd pour la protéine Galpha pleine/Kd pour la protéine Galpha vide » mesuré en
FRET de l'anticorps de l'invention est au moins égal à 5, par exemple au moins égal à 10, au moins égal à 20, au moins égal à 50, et :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une des séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 66 ; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 67.
L'anticorps selon l'invention est particulièrement avantageux dans la mise en œuvre d'un FRET, notamment pour détecter une protéine Galpha pleine ou une protéine Galpha vide.
L'anticorps selon l'invention, peut être ainsi couplé à une molécule permettant sa détection. Il peut s'agir d'un tag peptidique, par exemple le tag 6XHis. Il peut également s'agir d'une enzyme capable de générer un signal détectable par colorimétrie, fluorescence ou luminescence lorsqu'elle est en présence de son substrat, par exemple la β-galactosidase, la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort. Il peut également s'agir d'un radionucléide, d'un composé fluorescent, d'un composé luminescent ou d'un colorant. Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est couplé à un membre d'un couple de partenaires de FRET. Couples de partenaires de FRET
Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie.
Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Forster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, et que le composé donneur est excité à une longueur d'onde correspondant à un de ses pics d'absorption, un transfert d'énergie aura lieu, provoquant une diminution de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission du donneur, et une augmentation de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur.
La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l’homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l’ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition, Kluwer academic/plenum publishers, NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer.
Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise dans la gamme 0,5-6 ms), en particulier les chélates ou cryptâtes de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET en s'affranchissant du phénomène d'autofluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptâtes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés.
De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
Des exemples de chélates ou cryptâtes de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont :
• Les cryptâtes de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptâtes de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptâtes de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptâtes d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
TrisBiPy-Eu
Py-BiPy-Eu
TrisBiPy-tetraacide-Eu Py-BiPy-tetraacide-Eu • Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481,
US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets
EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer.
· Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo, peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/010580.
• Les cryptâtes de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables.
• Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89).
• Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays.
• Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NOS) :
• Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine).
• Le chélate de terbium DTPA-CS124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
• Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et a! (Journal of
Luminescence 1997, 75: 149-169) :
NCS
Tb-W14016
De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de 10 terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptâtes d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
Le composé fluorescent accepteur doit posséder un spectre d'absorption qui recouvre le spectre d'émission du donneur (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39(9):1953-1959) et peut être choisi dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Atto-tec ; les composés « DY» sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines ou de la fluorescéine sont préférés comme composés fluorescents accepteurs.
Marquage des anticorps par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie
Les anticorps selon l'invention peuvent être marqués par les fluorophores de manière directe (covalente) ou indirecte. De manière préférée, au moins un des partenaires de FRET est lié de manière covalente au premier ou au second anticorps, et de manière encore plus préférée, les deux partenaires de FRET sont respectivement liés de manière covalente au premier et au second anticorps.
Le marquage direct d'un anticorps selon l'invention par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme « fonctionnalisée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, l'anticorps selon l'invention.
Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous :
| Groupe électrophile | Groupe nucléophile | Type de liaison |
| acrylamide | thiol | thioéther |
| halogénure d'acyle | amine/aniline | carboxamide |
| aldéhyde | amine/aniline | imine |
| aldéhyde ou cétone | hydrazine | hydrazone |
| aldéhyde ou cétone | hydroxylamine | oxime |
| alkyl sulfonate | thiol | thioéther |
| anhydride | amine/aniline | carboxamide |
| halogénure d'aryle | thiol | thiophénol |
| halogénure d'aryle | amine | arylamine |
| aziridine | thiol | thioéther |
| carbodiimide | acide carboxylique | N-acylurée ou anhydride |
| ester activé* | amine/aniline | carboxamide |
| haloacétamide | thiol | thioéther |
| halotriazine | amine/aniline | aminotriazine |
| imido ester | amine/aniline | amidine |
| isocyanate | amine/aniline | Urée |
| isothiocyanate | amine/aniline | thiourée |
| maléimide | thiol | thioéther |
| sulfonate ester | amine/aniline | alkylamine |
| halogénure de sulfonyle | amine/aniline | sulfonamide |
* : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est :
• un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-OC4H4NO2), sulfosuccinimidyloxy (-OC4H3NO2-SO3H) ;
• un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ;
• un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride OCORa ou -OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyle en CrC6, perfluoroalkyle en CrC6, alkoxy en CrC6, cyclohexyle ;
• le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle.
Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les anticorps marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le nombre moyen de molécules de marqueur greffés à l'anticorps selon l'invention.
Il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les anticorps selon l'invention : le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
Une autre approche pour le marquage d'un anticorps selon l'invention par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans l'anticorps, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente.
Il est important de vérifier que l'anticorps selon l'invention marqué conserve une affinité suffisante pour la protéine Galpha ; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité de l'anticorps selon l'invention marqué pour la protéine Galpha.
L'anticorps selon l'invention peut également être marqué par un composé fluorescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu d'incubation un anticorps dit « secondaire », lui-même lié de manière covalente à un composé fluorescent, cet anticorps reconnaissant de manière spécifique l'anticorps selon l'invention ou bien un haptène présent sur cet anticorps selon l'invention (tel qu'un groupe dinitrophényle, dogoxigénine, la fluorescéine, les étiquettes FLAG, c-myc, 6-HIS). L'anticorps secondaire peut être un anticorps anti-espèce.
Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur l'anticorps selon l'invention à marquer, puis d'incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un fluorophore. Le marquage de l'anticorps selon l'invention par la biotine relève des connaissances générales de l'homme du métier, et la société Cisbio
Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec le fluorophore dont la dénomination commerciale est « d2 » (réf 610SADLA).
Mesure du signa! de TR-FRET
La mesure du signal de TR-FRET est effectuée après excitation du milieu de mesure par une source pulsée dans une bande d'excitation du composé donneur, de préférence après un délai de 1 à 500 microsecondes (ps) et pendant une durée de 10 à 2000 ps. De manière encore plus préférée, le délai est de 50 ps (temps résolu).
Le signal de TR-FRET peut être constitué par l'intensité de la luminescence mesurée, soit par sa durée de vie.
L'anticorps selon l'invention peut être compris dans un polypeptide. Il peut également être immobilisé sur un support solide.
Un autre aspect de l'invention concerne un complexe comprenant un anticorps selon l'invention, par exemple un complexe comprenant un anticorps selon l'invention et une protéine G alpha.
L'anticorps selon l'invention peut être une version « humanisé », obtenue par exemple en remplaçant un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence d’acides aminés de l'anticorps (et en particulier dans les FRs) par un ou plusieurs acides aminés apparaissant à la ou aux position(s) correspondante(s) dans un anticorps conventionnel tétramérique humain. Plusieurs techniques d'humanisation sont décrites dans la littérature et l'Homme du métier n'aura aucune difficulté à les mettre en œuvre pour préparer les anticorps selon l'invention.
L'anticorps selon l’invention peut être produit par toute technique connue dans l’art, telle que, sans limitation, toute technique chimique, biologique, génétique ou enzymatique, seule ou en combinaison.
Lorsque la séquence d’acides aminés de l'anticorps désiré est connue, l'Homme de l'art peut facilement produire ledit anticorps par des techniques conventionnelles pour la production de polypeptides. Par exemple, l'anticorps selon l'invention peut être synthétisé en utilisant une méthode en phase solide bien connue, de préférence en utilisant un appareil de synthèse de polypeptides disponible dans le commerce (tel que celui fabriqué par Applied Biosystems, Foster City, Californie) et en suivant les instructions du fabricant. En variante, l'anticorps selon l'invention peut être synthétisé par des techniques d’ADN recombinant connues dans la littérature. Par exemple, l'anticorps selon l'invention peut être obtenu en exprimant une séquence d'acides nucléiques codant ledit anticorps après incorporation de ladite séquence nucléique dans un ou plusieurs vecteurs d’expression et introduction de tels vecteurs dans une cellule hôte appropriée qui exprimera l'anticorps désiré.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est purifié (ou isolé), par exemple à partir du surnageant de culture de cellules hôtes exprimant l'anticorps désiré, en mettant en œuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et/ou d'affinité.
Autres objets
Un troisième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant pour un anticorps selon l'invention.
Un quatrième objet de la présente invention concerne un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Tout type de vecteur adapté à la production d'anticorps peut être utilisé dans le cadre de l'invention. Le vecteur comprendra les séquences nucléiques nécessaires pour produire l'anticorps selon l'invention, par exemple des séquences promotrices, des séquences régulatrices, etc. La préparation d'un vecteur approprié est largement décrite dans la littérature.
Un cinquième objet de l'invention concerne une cellule comprenant un vecteur selon l'invention ou une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. La cellule selon l'invention peut être obtenue par des méthodes largement décrites dans la littérature, par exemple en transfectant un clone cellulaire avec un vecteur selon l'invention ou une séquence d'acides nucléiques. L'invention n'est pas limitée à un type cellulaire particulier. Toute cellule capable de produire des anticorps peut être utilisée dans le cadre de l'invention. Il peut s'agir de cellules eucaryotes, telles que les cellules de mammifères, par exemple les cellules humaines ou de souris ou de cellules procaryotes, par exemple les bactéries ou encore les levures.
L’invention sera davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l’invention.
LISTAGE DE SEQUENCES
| Nom | SEQ ID NO : | SEQUENCE |
| Fil CDR1 | 1 | GFAFSDTW |
| Fil CDR2 | 2 | ITRGDQNT |
| Fil CDR3 | 3 | AKEGPIGPPDY |
| Fil FRI | 5 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEAS |
| Fil FR2 | 6 | MYWVRQAPGKGLEWVAT |
| Fil FR3 | 7 | YYTESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYC |
| Fil FR4 | 8 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| Fil | 4 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFAFSDTWMYWVRQAPGKGLEWVATIT RGDQNTYYTESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKEGPIGPP DYWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS |
| Bll CDR1 | 9 | GFTFNDYW |
| Bll CDR2 | 10 | INTGGSST |
| Bll CDR3 | 11 | AKEGPVGPPDY |
| Bll FRI | 12 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS |
| Bll FR2 | 13 | MYWVRQAPGKGLEWVSS |
| Bll FR3 | 14 | YYSDSVKGRFTTARDNAKNSLYLQLNSLRPEDTAVYYC |
| Bll FR4 | 15 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| Bll | 16 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN DYWMYWVRQAPG KG LEWVSSIN TGGSSTYYSDSVKGRFTTARDNAKNSLYLQLNSLRPEDTAVYYCAKEGPVGPP DYWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS |
| F9 CDR1 | 17 | GFTFDDYA |
| F9 CDR2 | 18 | ISSRGITT |
| F9 CDR3 | 19 | ATDPSTWYRGTAH |
| F9 FRI | 20 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS |
| F9 FR2 | 21 | MNWVRQAAGKGPEWVAS |
| F9 FR3 | 22 | DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYC |
| F9 FR4 | 23 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| F9 | 24 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMNWVRQAAGKGPEWVASIS SRG11 1DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYCATDPSTWY RGTAHWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS |
| G6 CDR1 | 25 | GFTFSTYR |
| G6 CDR2 | 26 | ISSRGITT |
| G6 CDR3 | 27 | ATDPSTWYRGTAH |
| G6 FRI | 28 | EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAAS |
| G6 FR2 | 29 | MNWVRQAPGKGLEWVAS |
| G6 FR3 | 30 | DYAHPVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYC |
| G6 FR4 | 31 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| G6 | 32 | EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGF1 FS 1 YRMNWVRQAPGKGLEWVASIS SRG11 1DYAHPVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPDDAAVYYCATDPSTWY RGTAHWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS |
| F4 CDR1 | 33 | GFTFSSYY |
| F4 CDR2 | 34 | IYNGDGDT |
| F4 CDR3 | 35 | NAYDGTLLRDY |
| F4 FRI | 36 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS |
| F4 FR2 | 37 | MNWVRQAPGKGLEWVSS |
| F4 FR3 | 38 | DYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLEMSDLKVQDTAIYYC |
| F4 FR4 | 39 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| F4 | 40 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSSIY NGDGDTDYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLEMSDLKVQDTAIYYCNAYDGTLLR DYWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS |
| A10 CDR1 | 41 | GLTYSDYA |
| A1O CDR2 | 42 | ISSRGITT |
| A1O CDR3 | 43 | TTVSYWRYEY |
| A1O FRI | 44 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS |
| A1O FR2 | 45 | MSWVRQAAGKGPEWVAS |
| A1O FR3 | 46 | DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYC |
| A1O FR4 | 47 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| A1O | 48 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTYSDYAMSWVRQAAGKGPEWVASIS SRG11 1DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCTTVSYWRYE YWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| F2 CDR1 | 49 | GFTFSSYA |
| F2 CDR2 | 50 | ISSRGITT |
| F2 CDR3 | 51 | VKGWMPTG |
| F2 FRI | 52 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS |
| F2 FR2 | 53 | MSWVRQAAGKGPEWVAS |
| F2 FR3 | 54 | DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPEDTALYYC |
| F2 FR4 | 55 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| F2 | 56 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAAGKGPEWVASIS SRG11 1DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCVKGWMPTG WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| E2 CDR1 | 57 | GYTFSSYA |
| E2 CDR2 | 58 | ISSRGITT |
| E2 CDR3 | 59 | TRVLWYENGLYSLNDF |
| E2 FRI | 60 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIGS |
| E2 FR2 | 61 | MAWVRQASGKGPEWVAS |
| E2 FR3 | 62 | DYAHSVKGRFTISRDNAKNTLYLHMNNLKPEDTALYYC |
| E2 FR4 | 63 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| E2 | 64 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIGSGYTFSSYAMAWVRQASGKGPEWVASISS RGITTDYAHSVKGRFTISRDNAKNTLYLHMNNLKPEDTALYYCTRVLWYENGL YSLNDFWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS |
| G7 CDR1 | 65 | GFTFSWYG |
| G7 CDR2 | 66 | ISSRGITT |
| G7 CDR3 | 67 | TRVLWYDSGAYSLNDF |
| G7 FRI | 68 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS |
| G7 FR2 | 69 | MSWVRQAPGKGPEWVAS |
| G7 FR3 | 70 | DYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPEDTGVYYC |
| G7 FR4 | 71 | WGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAH HH HH HGS |
| G7 | 72 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYGMSWVRQAPGKGPEWVASI SSRGITTDYAHSVKGRFTVSRDNTKNTLYLQMNSLKPEDTGVYYCTRVLWYDS GAYSLNDFWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHHGS |
EXEMPLES
Exemple 1 : Immunisation de lamas et construction d'une bibliothèque de sdAb
Deux lamas (Lama glama) ont été immunisés par voie sous-cutanée avec la protéine TSTGalphail humaine recombinante (protéine Galphail de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) liée au GDP ou au GTPgS. La construction d'une bibliothèque de VH / VHH a été réalisées dans la souche E. coli TGI comme décrit précédemment dans (Alvarez-Rueda, Behar et al., 2007, Behar Chames et al. 2009). La diversité des bibliothèques obtenue était supérieure à 108 clones.
Production de particules de phage-VH / VHH
Cinquante mL de 2YTA (2YT contenant 100 pg/mL d'ampicilline) ont été inoculés avec 50 pL de la bibliothèque de bactéries et incubés à 37°C sous agitation (250 tr/min) jusqu'à une D060o comprise entre 0,4 et 0,6. Les bactéries ont été infectées par le phage KM 13 en utilisant une multiplicité d'infection de 20, pendant 30 min à 37°C sans agitation. La culture a été centrifugée pendant 10 minutes à 3000 g, et le culot bactérien a été remis en suspension dans 250 ml de 2YTA contenant 50 pg/ml de kanamycine pour produire les phages-VH pendant une nuit à 30°C sous agitation. La culture a été divisée en 10 tubes et centrifugée pendant 20 minutes à 3000 g à 4 °C. Pour chaque tube, 5 mL de 20% de PEG 8000, 2,5 mM de NaCI ont été ajoutés au surnageant dans un nouveau tube propre et incubés pendant 1 h sur de la glace pour induire la précipitation des particules phagiques. La solution a été centrifugée pendant 15 min à 3000 g à 4°C et le culot contenant les phages a été remis en suspension dans 1 ml de PBS. Une autre étape de centrifugation (2 min, 16000 g) a été réalisée pour éliminer les contaminants bactériens et 200 pL de PEG 8000 NaCI ont été ajoutés aux surnageants dans un nouveau tube. Après 30 min sur de la glace et une dernière centrifugation (5 min, 16000 g), le culot contenant le phage a été remis en suspension dans 1 mL de PBS pour obtenir un phage-VH prêt à l'emploi pour les sélections.
Sélection de VH / VHH par phage display
Après une étape de déplétion de la bibliothèque de phage sur plaque contenant de la StrepTactin immobilisée (IBA #2-4101-001) pour éviter la sélection de VH anti-Strep-Tactin, un premier cycle de sélection a été effectué sur une plaque Strep-Tactin contenant la Galphail recombinante humaine fusionnée à un Twin-Strep-tag et pré-chargée avec 10 pM de GDP pendant 2h à 37 °C et saturé avec 2% de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. Après 2 heures d'incubation à température ambiante, les plaques ont été lavées avec du Tween PBS à 0,1% et du PBS. Les phages liés ont été élues en utilisant une solution de trypsine à 1 mg/ml (Sigma) pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation. Les phages ont été récupérés et amplifiés par infection de la souche bactérienne TGI. Un second cycle de sélection a été effectué de manière similaire sur Galphail pré-chargée avec 10 pM de GTP. Une seconde stratégie a consisté en deux tours de sélection contre la Galphail en absence de nucléotides. Une troisième stratégie visant à favoriser la sélection de VH spécifiques de la conformation active (GTP) de Galphai a consisté en deux cycles de sélection sur Galphail Twin-Strep-tag préchargée de GTPgS 10 pM, suite à une étape de déplétion réalisée sur plaque recouverte de Galphail Twin-Strep-tag préchargée par 10 pM de GDP. Des colonies individuelles de TGI ont été cultivées dans des plaques 96 deep well dans 400 ul de 2YTA contenant 2% de glucose. Après une croissance d'une nuit, la culture a été congelée à -80°C dans du glycérol à 20% et le reste de la culture a été utilisé pour la production de VH soluble induite par l'isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside (IPTG) dans du 2YTA. Les surnageants contenant les VH ont été utilisés pour les tests de criblage.
Production et purification de VH.
Pour la production de VH à grande échelle, les phagemides positifs ont été transformés dans la souche E. coli BL21 DE3. Les bactéries transformées ont été cultivées dans 400 ml de 2YTA jusqu'à une valeur de D06oo de 0,7 et induites avec 100 pM d'IPTG pour une croissance pendant une nuit à 30°C sous agitation. Les bactéries ont été récupérées par centrifugation et lysées en utilisant le réactif Bug buster™ (Novagen). Après centrifugation pendant 20 minutes à 3000 g, les VH ont été purifiés à partir du surnageant en utilisant une Chromatographie d'affinité TALON® SuperflowTM (GE Healthcare) selon les instructions du fabricant.
Production des HcAb-VH
Les gènes des VH ont été clonés dans le vecteur pHLsec (Aricescu AR, Lu W, Jones EY. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Oct;62(Pt 10):1243-50) en fusion avec le gène codant pour les domaines CH2 et CH3 d'une IgGl humaine, suivi d'une étiquette ôhistidines, par synthèse de gêne (Genecust). Le plasmide correspondant a été utilisé pour transfecter la lignée HEK293 adaptée à la suspension, et les cellules ont été incubées sous agitation suivant les instructions du fabricant (Freestyle 293 Expression System, Thermofisher). Après 5 jours, les surnageants ont été récupérés et directement utilisés pour purifier les HcAb par chromatographie d’affinité TALON® SuperflowTM selon les instructions du fabricant.
Exemple 2 : Détermination de la constante d'affinité (Kd) d'anticorps à domaine unique (sdAbl selon l'invention en FRET (HTRF1
Matériel :
La protéine TST-Galphail recombinantes (protéine Galphail de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) a été produite dans des cellules d'insectes Sf9 (infection par Baculovirus) puis purifiée sur une colonne d'affinité via le tag TwinStreptag (TST) (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalogue : 2-1208-002)).
Un anticorps anti-TST (anti Twin-Strep-Tag, référence catalogue 2-1517-001 chez IBA) a été marqué avec la sonde fluorescente donneur Lumi4®Tb, compatible pour une détection TRFRET avec l'accepteur d2. L'anticorps ainsi obtenu a été appelé « anticorps anti TSTLumi4Tb ».
Pour la production des neuf domaines variables de chaîne lourde (VH) (F9 : SEQ ID No : 24, F4 : SEQ ID No : 40, Bll : SEQ ID No : 16, Fil : SEQ ID No : 4, G6 : SEQ ID No : 32, A10 : SEQ ID No : 48, E2 : SEQ ID No : 64, F2 : SEQ ID No : 56 et G7 : SEQ ID No : 72) à grande échelle, les phagemides codant lesdits VH ont été transformés dans la souche E. coli BL21 DE3. Les bactéries transformées ont été cultivées dans 400 ml de 2YTA jusqu'à une valeur de D060o de 0,7 et induites avec 100 pM d'IPTG pour une croissance pendant une nuit à 30°C sous agitation. Les bactéries ont été récupérées par centrifugation et lysées en utilisant le réactif Bugbuster™ (Novagen). Après centrifugation pendant 20 minutes à 3000g, les VH ont été purifiés à partir du surnageant en utilisant une Chromatographie d’affinité TALON® SuperflowTM (GE Healthcare) selon les instructions du fabricant.
Pour la production des anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb-VH), les gènes les VH ont été clonés dans le vecteur pHLsec (Aricescu AR, Lu W, Jones EY. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Oct;62(Pt 10):1243-50) en fusion avec le gène codant pour les domaines CH2 et CH3 d'une IgGl humaine, suivi d'une étiquette ôhistidines, par synthèse de gène (Genecust). Le plasmide correspondant a été utilisé pour transfecter la lignée HEK293 adaptée à la suspension, et les cellules ont été incubées sous agitation suivant les instructions du fabricant (Freestyle 293 Expression System, Thermofîsher). Après 5 jours, les surnageants ont été récupérés et directement utilisés pour purifier les HcAb-VH par chromatographie d’affinité TALON® SuperflowTM selon les instructions du fabricant.
Les sdAb obtenus (VH ou HcAb-VH) ont été marqués avec la sonde fluorescente accepteur d2, compatible pour une détection TR-FRET avec le donneur Lumi4Tb qui a été utilisé pour marquer l'anticorps anti-TST. Les anticorps marqués ont été appelés « anticorps anti Galphai-d2 ».
Les nucléotides GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G7127 et G8634).
Les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
Méthode :
1) Préparation des réactifs :
Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, NaCI lOmM, BSA 0,1%. La protéine recombinante TST-Galphail a été préparée 4X pour une utilisation à lnM en concentration finale dans le puits (hormis autres spécifications). Les nucléotides GDP ou GTPyS ont été préparés 4X pour une utilisation à 10 μΜ en concentration finale dans le puits. L'anticorps anti TST-Lumi4Tb a été préparé 4X pour une utilisation à 0.25nM en concentration finale dans le puits. Les différents anticorps anti Galphai-d2 ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits indiquées sur les graphiques, allant jusqu'à 200 nM.
2) Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits :
- Protéine TST-Galphail : 5pL
- Nucléotides (GDP ou GTPgS) : 5pL
- Anticorps anti TST-Lumi4Tb (donneur) : 5pL
- Anticorps anti Galphai-d2 (accepteur) : 5pL
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits ne contenant que les deux réactifs de détection (marqués avec le donneur et l'accepteur), c'està-dire l'anticorps anti TST-Lumi4Tb (donneur) et l'anticorps anti Galphai-d2 (accepteur), les autres composants ayant été remplacés par leur tampon de dilution.
3) Lecture du signal HTRF :
Les plaques ont été incubées à 21°C pendant 20h puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar de chez BMG Labtech, avec la configuration suivante :
- Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm)
- Excitation : laser, 40 flashs
- Fenêtre de lecture : délais : 60ps - Intégration : 400ps
4) Traitement du signal :
A partir des signaux bruts à 665nm et 620nm, le ratio HTRF a été calculé selon la formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm / Signal à 620nm * 10,000
5) Principe de l'essai TR-FRET (HTRF) pour la détermination de l'affinité (Kd) des domaines variables de chaîne lourde VH
Le test TR-FRET (HTRF) a permis de déterminer l'affinité (Kd) des différents anticorps pour la protéine Galphail, la Figure 2 illustre le principe de ce test. Une concentration fixe (lnM) de la protéine Galphail recombinante purifiée et tagguée avec TST (Protéine TST-Galphail) a été mise en présence d'un excès de nucléotide (GDP ou GTPgS) (10pM), d'une concentration fixe (0.5nM) d'anticorps anti TST marqué avec le donneur Lumi4Tb (Anticorps anti TST-Lumi4Tb) et de concentrations croissantes d'anticorps à domaine unique de type VH marqués avec l'accepteur d2 (Anticorps VH anti Galphai-d2). Le signal HTRF total a été alors obtenu.
En parallèle, une condition sans protéine Galphail a été réalisée pour déterminer le signal HTRF non spécifique.
Le signal HTRF spécifique de l'interaction entre l'anticorps et la protéine Galphail a alors été calculé par soustraction du signal non spécifique au signal total. Les données du signal HTRF spécifique ont ensuite été analysées sur le logiciel GraphPad Prism7 par l'utilisation d'un fit « One site specific binding ». La constante de dissociation (Kd) de l'anticorps pour la protéine Galphail a alors été déterminée. Les résultats qui ont été obtenus avec les anticorps qui se lient à la protéine Galpha liée au GTP gamma S et avec les anticorps qui se lient à la protéine Galpha liée au GDP sont indiqués dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessous.
6) Principe de l'essai HTRF (TR-FRET) pour la détermination de l'affinité (Kd) des anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH)
La Figure 12 illustre le principe de l'essai TR-FRET (HTRF) qui a été mis en œuvre pour déterminer l'affinité (Kd) des différents HcAb-VH pour la protéine Galphail. Une concentration fixe (lnM) de la protéine Galphail recombinante purifiée et tagguée avec TST (Protéine TST-Galphail) est mise en présence d'un excès de nucléotide (GDP ou GTPgS) (ΙΟμΜ), d'une concentration fixe (0.5nM) d'anticorps anti TST marqué avec le donneur Lumi4Tb (Ac anti Tag-Donneur), d'une concentration fixe (50nM) d'anticorps anti 6HIS marqué à l'accepteur d2 (Anticorps anti 6HIS-accepteur, Cisbio Bioassays #61HISDLF et de concentrations croissantes d'un anticorps HcAb-VH taggué au 6HIS (6HIS-Fc-sdAb). Le signal HTRF total a alors été obtenu.
En parallèle, une condition sans protéine Galphail est réalisée pour déterminer le signal HTRF non spécifique.
Le signal HTRF spécifique de l'interaction entre le HcAb-VH et la protéine Galphail a alors été calculé par soustraction du signal non spécifique au signal total. Les données du signal HTRF spécifique ont ensuite été analysées sur le logiciel GraphPad Prism7 par l'utilisation d'un fit « One site specific binding ». La constante de dissociation (Kd) du HcAb-VH pour la protéine Galphail a alors été déterminée. Les résultats obtenus avec les anticorps HCAbBll, HCAb-F9, HCAb-G7, HCAb-A10 sont indiqués dans le tableau 3 ci-dessous.
Résultats :
Les Figures 3 à 11 présentent les courbes de saturation obtenues pour les VH.
Les VH (F9, Fil, Bll, F4 et G6) ont une affinité élevée pour la protéine G alpha liée au GTP gamma S, avec une constante de dissociation (Kd) inférieure à 100 nM allant jusqu'à lnM par exemple pour l'anticorps Bll.
| Anticorps testé | Affinité (moyenne Kd en nM) pour la protéine G alpha liée au GTPgS | Affinité (moyenne Kd en nM) pour la protéine G alpha vide |
| F9 | 32 nM | > 200 nM |
| Fil | 3 nM | 17 |
| Bll | 1 nM | 17 |
| F4 | 31 nM | 83 |
| G6 | 95 nM | >150 nM |
Tableau 1 : Affinité (Kd en nM) des VH_pour la protéine G alphail liée au GTPgammaS et pour la protéine G alphail vide
Les VH (A10, G7, F2 et E2) présentent une affinité élevée pour la protéine G alpha liée au GDP, avec une constante de dissociation (Kd) inférieure à 100 nM allant jusqu'à 14nM par exemple pour l'anticorps F2.
| Anticorps testé | Affinité (moyenne Kd en nM) pour la protéine G alpha liée au GDP | Affinité (moyenne Kd en nM) pour la protéine G alpha vide |
| A10 | 15 nM | 1 |
| G7 | 31 nM | 5 |
| F2 | 14 nM | 1 |
| E2 | 72 nM | 2 |
Tableau 2 : Affinité (Kd en nM) des VH pour la protéine G alphail liée au GDP et pour la protéine G alphail vide
Les Figures 13 à 16 présentent les courbes de saturation obtenues pour les HcAb VH.
Les anticorps HcAb-Bll, HcAb-F9, HcAb-G7 et HcAb-A10 présentent une affinité élevée pour la protéine G alpha liée au GDP ou au GTP gamma S, avec une constante de dissociation 10 (Kd) inférieure à 10 nM allant jusqu'à lnM par exemple pour l'anticorps HCAb-Bll qui se lie à la protéine Galpha liée au GTP gamma S.
| Anticorps testé | Affinité (moyenne Kd en nM) pour la protéine G alpha pleine (liée au GDP ou GTPgammaS) |
| HcAb-Bll | 1 nM pour GTPgammaS |
| HcAb-F9 | 3 nM pour GTPgammaS |
| HcAb-G7 | 5 nM pour GDP |
| HcAb-A10 | 3 nM pour GDP |
Tableau 3 : Affinité (Kd en nM) des HcAb-VH pour la protéine G alphail liée au GDP ou au GTPgammaS
Claims (14)
- REVENDICATIONS1. Anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) ledit anticorps présentant une constante de dissociation (Kd) pour la protéine G alpha pleine mesurée en FRET inférieure à 100 nM.
- 2. Anticorps selon la revendication 1, dans lequel :CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; etCDR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
- 3. Anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) dans laquelle :- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;- CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26,SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et- CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
- 4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel :- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 1, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 2 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 3 ;- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 9, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 10 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 11 ;- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 17, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 18 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 19 ;- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 25, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 26 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 27 ;- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 33, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 34 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 35 ;- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 41, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 42 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 43 ;- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 49, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 50 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 51 ;- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 57, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 58 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 59 ; ou- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec un SEQ ID NO : 65, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 66 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 67.
- 5. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel :- FRI présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 28 SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 60 et SEQ ID NO : 68 ;- FR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 29 SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 61 et SEQ ID NO : 69; et- FR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 30 SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 62 et SEQ ID NO : 70 ; et- FR4 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 63 et SEQ ID NO : 71.
- 6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel :- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 5, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 6 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 7 ;- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 12, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 13 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 14 ;- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 20, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 21 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 22 ;- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 28, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 29 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 30 ;- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 36, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 37 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 38 ;- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 44, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 45 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 46 ;- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 52, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 53 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 54 ;- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 60, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 61 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 62 ; ou- FRI présente au moins 80% d'homologie avec un SEQ ID NO : 68, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 69 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 70.
- 7. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ladite séquence d'acides aminés de formule (I) a au moins 80% d'homologie avec une séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO : 72.
- 8. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ladite séquence d'acides aminés de formule (I) a 100% d'homologie avec une séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO : 72.
- 9. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit anticorps étant choisi parmi un domaine variable de chaîne lourde (VH), un domaine variable de chaîne lourde de type VhH (VhH), un anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH), d'un anticorps à chaîne lourde de type VhH (HcAb VhH), un anticorps à chaîne lourde IgG anti-nouveaux récepteurs d’antigène d’immunoglobuline dérivés des poissons cartilagineux (Ig NAR) ou un domaine variable d'Ig NAR (V-NAR).
- 10. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit anticorps étant couplé à une molécule permettant la détection dudit anticorps.
- 11. Anticorps selon la revendication 10, ladite molécule étant choisie parmi un tag peptidique, une enzyme, un radionucléide, un composé fluorescent, un composé luminescent, un colorant, avantageusement un membre d'un couple de partenaires de FRET.5
- 12. Séquence d'acides nucléiques codant pour un anticorps à domaine unique (sdAb) selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
- 13. Vecteur recombinant comprenant la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 12.
- 14. Cellule comprenant le vecteur selon la revendication 13 ou la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 12.
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