CN116148462A - 一种捕获法检测抗体的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种捕获法检测抗体的方法和应用，所述方法以形成抗Ig抗体‑待测抗体‑修饰抗原的形式完成检测。所述修饰抗原是通过甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类的修饰对抗原进行改性所得到，应用于免疫检测能够提高检测灵敏度，降低检测本底。

Description

一种捕获法检测抗体的方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种捕获法检测抗体的方法和应用。
背景技术
免疫检测是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测，利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行显示，常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位。其中，捕获法是检测抗体的常用方法，该方法将抗Ig抗体连接在固相载体上，形成固相抗Ig抗体，然后加入样本和特异性抗原-标记物，最终形成“抗Ig抗体-待测Ig抗体-特异性抗原-标记物”的复合物，然后借助一定的手段检测标记信号，从而得出最终的判定结果。捕获法是很多免疫检测抗体的首选方法。
发明内容
本发明基于捕获法，提供一种降低检测本底、提高检测灵敏度的检测方法。
一种捕获法检测抗体的方法，所述方法以形成抗Ig抗体-待测抗体-修饰抗原的形式完成检测，所述修饰抗原包括抗原及与所述抗原连接的修饰剂，所述修饰剂为甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类；
所述方法包括：
通过连接于固相载体的抗Ig抗体捕获样本中的待测抗体；
使待测抗体与所述修饰抗原结合；
所述修饰抗原与检测标记物直接和/或间接结合；
检测所述检测标记物。
本发明还提供了一种修饰抗原，包括抗原及与所述抗原连接的修饰剂，所述修饰剂为甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类。
本发明还提供了如上所述的修饰抗原在制备用于检测抗体的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括抗Ig抗体、如上所述的修饰抗原和检测标记物。
附图说明
图1本发明一实施例的免疫检测方法的原理示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的捕获法检测抗体的方法，该方法以形成抗Ig抗体-待测抗体-修饰抗原的形式完成检测，上述修饰抗原包括抗原及与该抗原连接的修饰剂，修饰剂为甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类；
所述方法包括：
通过连接于固相载体的抗Ig抗体捕获样本中的待测抗体；
使待测抗体与所述修饰抗原结合；
所述修饰抗原与检测标记物直接和/或间接结合；
检测所述检测标记物。
在一些实施方案中，所述修饰抗原与检测标记物直接结合，例如修饰抗原上直接标记有检测标记物，如直接标记有吖啶酯。
在一些实施方案中，所述修饰抗原与检测标记物间接结合。在一些实施方式中，所述修饰抗原通过第一桥连分子及第二桥连分子与检测标记物间接结合；和/或修饰抗原通过针对抗原的抗体与检测标记物间接结合。在一些实施方案中，上述第一桥连分子为生物素、碳水化合物或标签蛋白，第二桥连分子为亲和素、抗生物素抗体、凝集素或能够特异性结合所述标签蛋白的抗体。可以理解，第一桥连分子和第二桥连分子的具体种类不限于此，第一桥连分子和第二桥连分子构成一对桥连分子，可根据需要选择常见的具有亲和性能的一对桥连分子如受体-配体、抗体-抗原等。在一些实施方式中，第一桥连分子与抗原通过蛋白融合的方式连接；例如标签蛋白(如GST)与抗原融合。在一些实施方式中，第一桥连分子与抗原通过化学方式(如共价键，氢键等)连接。
在一些实施方式中，在一个反应体系内，所述修饰抗原直接结合检测标记物和间接结合检测标记物；例如在一个反应体系内，所述修饰抗原直接结合吖啶酯，并且所述修饰抗原间接结合吖啶酯。
在一些实施方式中，在一个反应体系内，所述修饰抗原同时采用两种及以上模式间接结合检测标记物；例如在一个反应体系内，所述修饰抗原通过生物素-亲和素间接结合吖啶酯，并且所述修饰抗原通过标签蛋白-抗体间接结合吖啶酯；例如在一个反应体系中，所述修饰抗原通过生物素-亲和素间接结合吖啶酯，并且所述修饰抗原通过针对抗原的抗体间接结合吖啶酯。例如在一个反应体系中，所述修饰抗原通过标签蛋白-抗体间接结合吖啶酯，并且所述修饰抗原通过针对抗原的抗体间接结合吖啶酯。例如在一个反应体系中，同时采用3种以上间接结合的模式检测标志物，所述修饰抗原通过标签蛋白-抗体间接结合吖啶酯，所述修饰抗原通过针对抗原的抗体间接结合吖啶酯，并且所述修饰抗原通过生物素-亲和素间接结合吖啶酯。
在一些实施方案中，上述方法还包括连接于固相载体的抗Ig抗体接触样本之后的洗涤步骤。可以理解，具体的加样模式可根据需要进行选择，例如可以先向样本中加入连接于固相载体的抗Ig抗体和修饰抗原，洗涤后再加入连接有检测标记物的第二桥连分子和连接有检测标记物的针对上述抗原的抗体；或者也可以先向样本中加入连接于固相载体的抗Ig抗体，洗涤后再加入修饰抗原、连接有检测标记物的第二桥连分子和连接有检测标记物的针对上述抗原的抗体等，在一些实施方案中，检测所述检测标记物前进行洗涤。可以理解，上述方法为修饰抗原应用于捕获法时的具体示例，其同样可应用于间接法或其他形式的免疫检测方法。
本发明中，接触是指样本与连接于固相载体的抗Ig抗体接触混匀并使得其中可能的组分发生免疫反应。
在一些实施方案中，检测标记物为金属粒子、荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记或酶标记，但不限于此。可以理解，根据检测标记物的不同，相应的检测方法可根据需要选择，例如荧光标记通过荧光检测方法进行测定，酶标记通过底物反应进行测定等。
在一些实施方案中，检测标记物为罗丹明、荧光素、量子点、地高辛标记探针、放射性同位素、放射性造影剂、超声造影剂、光敏剂、荧光微球、胶体金、吖啶酯、荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记。
在一些实施方案中，所述修饰剂为甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类。所述甜菜碱类例如包括磺基甜菜碱类、羧基甜菜碱类、磷酸酯甜菜碱类。可以理解，上述物质的衍生物同样能够发挥相当的功能作为替代物。这些电中性的修饰剂可以通过改善蛋白可溶性来降低蛋白用于免疫检测时本底高的问题。聚乙二醇类例如可以是聚乙二醇或聚乙二醇脂肪酸酯。优选地，聚乙二醇为直链聚乙二醇和/或支链聚乙二醇，分子量为100～3000。
在一些实施方案中，抗Ig抗体为抗人IgM抗体、抗人IgG抗体等，根据待测抗体的类型进行调整即可。进一步地，抗人IgM抗体可以是抗μ链抗体等。
本发明一实施例的修饰抗原，其包括抗原及分别与上述抗原连接的修饰剂，修饰剂为甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类。
在一些实施方案中，抗原为重组抗原或天然抗原。可选地，上述抗原为弓形虫抗原、风疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原、EB疱疹病毒抗原、细小病毒抗原或水痘-带状疱疹病毒抗原。可以理解，抗原的具体种类不限于此，可根据待测抗体的种类进行调整。
本发明一实施例的抗原偶联物，其包括上述修饰抗原和连接有检测标记物的第二桥连分子，第二桥连分子与第一桥连分子连接；或包括上述修饰抗原和固相载体，固相载体与抗原连接。
在一些实施方案中，固相载体为磁性颗粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片，但不限于此，可根据需要选择其他常规的固相载体。
本发明一实施例的如上所述的修饰抗原或如上所述的抗原偶联物在制备用于检测抗体的试剂盒中的应用。
本发明一实施例的试剂盒，包括抗Ig抗体，以及如上所述的修饰抗原或如上所述的抗原偶联物。
在一些实施方案中，试剂盒还包括固相载体、第一桥连分子、第二桥连分子、针对所述抗原的抗体和检测标记物中的一种或多种。
下面主要结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1弓形虫(TOX)IgM检测
1.IgM捕获抗体磁珠包被
将10mg Tosyl磁珠(粒径0.05μm～3μm)的溶液混匀，磁分离移除上清液，用0.02M的PB缓冲液清洗三次后重悬，加入0.5mg包被抗体，混匀，并在持续旋转混匀下，37℃孵育2～4h，磁分离去上清液用0.02M的PB缓冲液清洗三次后用20％赖氨酸进行封闭，磁分离去上清，使用储存液重悬磁珠，磁珠包被抗体浓度为5％，收集保存于2～8℃用于后续实验。
2.TOX抗原修饰及生物素化
PEG(n)-COOH和Bio-COOH基团活化
羧基基团按n(-COOH)：n(EDC)：n(NHS)＝1：1：3的分子比例进行活化，在DMSO溶剂中室温活化30min。活化的修饰基团及活化的生物素基团按设计的比例与TOX抗原混合，室温反应2h，用1M赖氨酸终止反应，室温反应30min。之后装脱盐柱，并用20mM PBS(pH7.4)洗脱纯化，收集修饰的抗原。
3.链霉亲和素AE标记
SA浓度用0.1M硼酸(pH5.5)+0.02％Tw20缓冲液调整至1mg/mL，用DMSO配制4mM的吖啶酯,然后按照n(SA)：n(AE)＝1:2的分子个数比例进行物料添加，混匀，避光反应半小时，之后装脱盐柱，并用0.01M硼酸(pH5.5)洗脱纯化，收集SA-吖啶酯结合物。
4.TOX抗体AE标记
TOX抗体浓度用20mM PB(pH7.4)缓冲液调整至2mg/mL，用DMSO配制4mM的吖啶酯，然后按照n(抗体)：n(AE)＝1:5的分子个数比例进行物料添加，混匀，避光反应半小时，之后装脱盐柱，并用20mM PB(pH7.4)洗脱纯化，收集抗体-吖啶酯结合物。
5.检测
(1)样本用样本处理液按1:100稀释，然后取100uL稀释后样本，50uL 0.1mg/mL捕获抗体磁珠工作液，混匀，37℃反应15min。用磁吸附板吸附磁珠，去上清。然后加入PBST洗液进行磁珠清洗，磁板吸附，去上清，重复此操作4次；
(2)加入50μL 2ug/mL TOXAg-Bio(修饰或非修饰)工作液，100μL 250ng/mL SA-AE(有无50ng/mL TOX抗体AE标记物)，混匀，37℃反应15min。用磁吸附板吸附磁珠，去上清。然后加入PBST洗液进行磁珠清洗，磁板吸附，去上清，重复此操作4次；
(3)加入100μL A发光激发液和100μL B发光激发液，用发光仪进行发光信号收集。
表1
Figure BDA0003367861730000061
Figure BDA0003367861730000071
注：A模式：MP-Ab1+IgM/Ag-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-抗原-检测标记物的复合物)
B模式：MP-Ab1+IgM/Ag+Ab2-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-抗原-针对抗原的抗体-检测标记物的复合物)
C模式：MP-Ab1+IgM/Ag-Bio+SA-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-抗原-第一桥连分子-第二桥连分子-检测标记物的复合物)
D模式：MP-Ab1+IgM/Ag(PEG)-Bio+SA-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-修饰抗原-第一桥连分子-第二桥连分子-检测标记物的复合物)
E模式：MP-Ab1+IgM/Ag(PEG)-Bio+SA-AE+Ab2-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-修饰抗原-(第一桥连分子-第二桥连分子-检测标记物)/(针对抗原的抗体-检测标记物)的复合物)
SD：测试空白
(MP-Ab1：磁珠抗μ链抗体；IgM：待测抗体；Ag(PEG)-Bio：生物素化PEG化TORCH抗原；SA-AE：链酶亲和素AE(吖啶酯)标记物；Ab2-AE：TORCH抗原抗体AE(吖啶酯)标记物)
根据表1的结果分析可知：
(1)A和B检测模式数据对比，B检测模式下，阴阳血清检测信号P/N值增大，阴阳血清有了一定的区分度，说明用抗体间接标记的方式可以提升检测灵敏度。
(2)B和C检测模式数据对比，阴阳样本的P/N值，C模式的比B模式的高，说明C模式的灵敏度要比B模式的高，SA/Bio模式可以提升检测灵敏度。
(3)C和D检测模式数据对比，阴阳样本的P/N值，D模式的比C模式的高，说明抗原的PEG恰当修饰可以提升检测灵敏度。
(4)D和E检测模式数据对比，阴阳样本的P/N值，E模式的比D模式的高，说明采用两种标记模式例如Ab2-AE和SA-AE可以联合提高检测灵敏度。
实施例2Rv IgM检测
参照实施例1的方法进行Rv IgM检测，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003367861730000081
注：A模式：MP-Ab1+IgM/Ag-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-抗原-检测标记物的复合物)
B模式：MP-Ab1+IgM/Ag+Ab2-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-抗原-针对抗原的抗体-检测标记物的复合物)
C模式：MP-Ab1+IgM/Ag-Bio+SA-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-抗原-第一桥连分子-第二桥连分子-检测标记物的复合物)
D模式：MP-Ab1+IgM/Ag(PEG)-Bio+SA-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-修饰抗原-第一桥连分子-第二桥连分子-检测标记物的复合物)
E模式：MP-Ab1+IgM/Ag(PEG)-Bio+SA-AE+Ab2-AE(即形成抗Ig抗体-待测抗体-修饰抗原-(第一桥连分子-第二桥连分子-检测标记物)/(针对抗原的抗体-检测标记物)的复合物)
SD：测试空白
(MP-Ab1：磁珠抗μ链抗体；IgM：待测抗体；Ag(PEG)-Bio：生物素化PEG化TORCH抗原；SA-AE：链酶亲和素AE(吖啶酯)标记物；Ab2-AE：TORCH抗原抗体AE(吖啶酯)标记物)
根据表3的结果分析可知：
(1)A和B检测模式数据对比，B检测模式下，阴阳血清检测信号P/N值增大，说明用抗体间接标记的方式可以提升检测灵敏度。
(2)B和C检测模式数据对比，阴阳样本的P/N值，C模式的比B模式的高，说明C模式的灵敏度要比B模式的高，SA/Bio模式可以提升检测灵敏度。
(3)C和D检测模式数据对比，阴阳样本的P/N值，D模式的比C模式的高，说明抗原的PEG恰当修饰可以提升检测灵敏度。
(4)D和E加测模式数据对比，阴阳样本的P/N值，E模式的比D模式的高，说明采用两种标记模式例如Ab2-AE和SA-AE可以联合提高检测灵敏度。
实施例3磺基甜菜碱修饰
N-丙磺基甜菜碱参照实施例1的方法进行羧基活化和抗原修饰，然后进行Rv IgM检测，结果证明E模式的MP-Ab1+IgM/Ag(NDSB)-Bio+SA-AE+Ab2-AE可以降低检测本底，提高检测灵敏度。
N-丙磺基甜菜碱参照实施例1的方法进行羧基活化和抗原修饰，然后进行Rv IgG检测，结果证明E模式的MP-Ab1+IgG/Ag(NDSB)-Bio+SA-AE+Ab2-AE可以降低检测本底，提高检测灵敏度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种捕获法检测抗体的方法，其特征在于，所述方法以形成抗Ig抗体-待测抗体-修饰抗原的形式完成检测，所述修饰抗原包括抗原及与所述抗原连接的修饰剂，所述修饰剂为甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类；
所述方法包括：
通过连接于固相载体的抗Ig抗体捕获样本中的待测抗体；
使待测抗体与所述修饰抗原结合；
所述修饰抗原与检测标记物直接和/或间接结合；
检测所述检测标记物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰抗原通过第一桥连分子及第二桥连分子与所述检测标记物间接结合；和/或所述修饰抗原通过针对所述抗原的抗体与所述检测标记物间接结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一桥连分子为生物素、碳水化合物或标签蛋白，所述第二桥连分子为亲和素、抗生物素抗体、凝集素或能够特异性结合所述标签蛋白的抗体。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括所述连接于固相载体的抗Ig抗体接触样本之后的洗涤步骤。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述检测标记物为金属粒子、荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记或酶标记。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述甜菜碱类包括磺基甜菜碱类、羧基甜菜碱类、磷酸酯甜菜碱类；
可选地，所述修饰剂包括聚乙二醇或聚乙二醇脂肪酸酯。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述抗Ig抗体为抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，例如可以是抗μ链抗体。
8.一种修饰抗原，其特征在于，包括抗原及与所述抗原连接的修饰剂，所述修饰剂为甜菜碱类、氧化叔胺类或聚乙二醇类；
可选地，所述甜菜碱类包括磺基甜菜碱类、羧基甜菜碱类、磷酸酯甜菜碱类；
可选地，所述修饰剂为聚乙二醇或聚乙二醇脂肪酸酯。
9.权利要求8所述的修饰抗原在制备用于检测抗体的试剂盒中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的抗Ig抗体、修饰抗原和检测标记物。
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