ES2542337T3 - Direccionamiento y seguimiento de antígenos en células vivas - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia, cantidad o localización subcelular de una estructura antigénica de interés en una célula viva, que comprende las etapas de: (a) (i) expresar una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés en dicha célula o (ii) introducir una proteína de fusión dirigida a la estructura antigénica de interés y acoplada a un (poli)péptido capaz de transducirse en dicha célula; en el que dicha proteína de fusión comprende una primera secuencia (poli)peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae y una segunda secuencia (poli)peptídica, que es un (poli)péptido detectable, preferentemente de una proteína fluorescente o cromófora, en la que dicha 1. primera secuencia (poli)peptídica está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o codificada por una secuencia de ácido nucleico con al menos 70% de identidad de secuencia con la misma; y 2. segunda secuencia (poli)peptídica es una proteína detectable; preferentemente a. la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; b. la proteína roja fluorescente de Discosoma (DsRed) codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 9, o un mutante o fragmento fluorescente de la misma; o c. un homólogo funcional de (a) o (b) con al menos 80% de identidad de secuencia que conserva la actividad fluorescente de la proteína fluorescente; (b) revelar la presencia, cantidad o localización subcelular de dicha estructura antigénica de interés, si la hubiera, en dicha célula por medio de dicha proteína detectable: en el que dicha primera secuencia (poli)peptídica está localizada en posición N-terminal de dicha segunda secuencia (poli)peptídica, estando dichas secuencias opcionalmente separadas por un enlazador de al menos un resto de un aminoácido, en el que dicho método no es un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.
Description
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También se han descrito varios mutantes de la proteína roja fluorescente DsRed de longitud de onda más larga, y de forma similar, pueden emplearse en la generación de los fragmentos de reconocimiento de antígenos fluorescentes de la invención. Por ejemplo, pueden emplearse mutantes de DsRed descritos recientemente con espectros de emisión desplazados más hacia el rojo en la práctica de la invención (Wiehler et al., 2001, FEBS Letters 487: 384-389; Terskikh et al., 2000, Science 290:1585-1588; Baird et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989).
Se ha descrito recientemente un número crecientemente mayor de otras proteínas fluorescentes de diversas formas de vida oceánicas, y el banco de datos de proteínas enumera en la actualidad varias estructuras cristalinas de GFP y mutantes de GFP, así como las estructuras cristalinas de diversos análogos de GFP. Se han descrito proteínas fluorescentes relacionadas con estructuras que se ha inferido que son similares a GFP, de corales, pennatuláceos, ascidias y anémonas de mar y pueden usarse en la generación de los fragmentos de reconocimiento de antígenos fluorescentes de la invención (para revisiones véase, Zimmer, 2002, Chem Rev. 102:759-781; Zhang et al., 2002, Nature Reviews 3:906-918).
También se han presentado proteínas fluorescentes de Anemonia majano, Zoanthus sp., Discosoma striata, Discosoma sp, y Clavularia sp. (Matz et al., mencionado anteriormente). Se ha indicado que una proteína fluorescente clonada a partir de la especie de coral pétreo, Trachyphyllia geoffroyi, emite luz verde, amarilla y roja y convierte la emisión de luz verde en luz roja tras su exposición a luz ultravioleta (Ando et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:12651-12656). Las proteínas fluorescentes recientemente descritas de anémonas de mar incluyen proteínas verdes y naranja fluorescentes clonadas de Anemonia sulcata (Wiedenmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14091-14096), una proteína verde fluorescente potenciada de forma natural, clonada a partir de los tentáculos de Heteractis magnifica (Hongbin et al., 2003, Biochem. Biophys. Res Commun. 301:879-885), y una cromoproteína púrpura generalmente no fluorescente que presenta fluorescencia roja débil clonada de Anemonia sulcata y un mutante de la misma que presenta espectro de emisión de desplazamiento al rojo lejano (595 nm) (Lukyanov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 2587925882).
Adicionalmente, se ha descrito otra clase de proteínas relacionadas con GFP que tienen propiedades cromóforas y fluorescentes. Uno de dichos grupos de proteínas derivadas de coral, la pociloporinas, muestra una serie amplia de características espectrales y fluorescentes (Dove y Hoegh-Guldberg, 1999, Solicitud PCT WO 00146233; Dove et al., 2001, Coral Reefs 19:197-204). Recientemente, se ha descrito la purificación y cristalización de la pociloporina Rtms5 del coral constructor de arrecifes Montipora efflorescens (Beddoe et al., 2003, Acta Cryst. D59: 597-599). Rtms5 es de color azul oscuro, pero es débilmente fluorescente. Sin embargo, se ha indicado que Rtms5, así como otras cromoproteínas con homología de secuencia con Rtms5, puede interconvertirse en una proteína fluorescente de rojo lejano mediante sustituciones de un solo aminoácido (Beddoe et al., 2003, mencionado anteriormente; Bulina et al., 2002, BMC Biochem. 3: 7; Lukyanov et al., 2000, mencionado anteriormente).
También se conocen otras diversas cromoproteínas derivadas de corales cercanamente relacionadas con las pociloporinas (véase, por ejemplo, Lukyanov et al. 2000, J. Biol Chem 275:25879-82; Gurskaya et al., 2001, FEBS Letters 507:16-20). Puede usarse cualquiera de las proteínas fluorescentes o cromóforas o fragmentos fluorescentes o cromóforos de las mismas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Son ejemplos adicionales de proteínas fluorescentes GFP de Renilla reniformis, mKO de Fungia concinna, verde Azami de Galaxeidae o cOFP de Cerianthus. Los fragmentos de la proteína fluorescente o cromófora son preferentemente fragmentos funcionales.
Las proteínas fluorescentes, cromóforas o fosforescentes pertenecen al grupo denominado “proteínas detectables” y “(poli)péptidos detectables” y “(poli)péptidos marcadores detectables”. En general, estas expresiones se refieren a (poli)péptidos que, tras su excitación, dan como resultado la emisión de energía detectable. Son ejemplos de proteínas detectables proteínas fluorescentes, proteínas cromóforas o “fosforescente”, “fluorescente” y “fosforescente” se usan de forma intercambiable. Esto significa por ejemplo que, cuando una realización se refiere a “fluorescente”, esta realización comprende “…fosforescente”, “…fluorescente” y “…fosforescente“.
La expresión “la región codificante de la primera molécula de ácido nucleico se localiza en 5' de la región codificante de la segunda molécula de ácido nucleico” se refiere a la disposición de regiones codificantes correspondientes en el nivel de ADN o ARNm e indica que los restos codificados por la primera secuencia de ácido nucleico son los restos Nterminales de la proteína de fusión, mientras que los restos codificados por la segunda secuencia de ácido nucleico son los restos C-terminales de la proteína de fusión.
La expresión “fragmento funcional” u “homólogo funcional”, como se usa a lo largo de la memoria descriptiva, se refiere a fragmentos de las proteínas de fusión, en las que estos fragmentos conservan la actividad de unión a antígeno completa o al menos una parcial y/o conservan una actividad detectable, por ejemplo fluorescente o cromófora, de la proteína de fusión. La expresión “al menos una actividad de unión a antígeno parcial” significa una actividad que está reducida a no más de preferentemente el 10%, más preferentemente el 1% en comparación con la proteína de fusión de longitud completa. Una medida conveniente para determinar la actividad de unión a antígeno es la Kd para el par de
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epítopo de 15 kDa inducido en Lama pacos frente a la proteína verde fluorescente (GFP). Como se muestra en el presente documento, la parte de unión a epítopo (VHH) puede fusionarse por ejemplo con la versión monomérica de la proteína roja fluorescente (mRFP1). Este “cromocuerpo” anti-GFP puede expresarse de forma estable en células de mamífero en las que reconoce su epítopo en diferentes compartimentos y estructuras celulares. Con microscopía de lapso de tiempo, los inventores demuestran que el cromocuerpo localiza eficazmente cambios dinámicos de proteínas diana a lo largo del ciclo celular en células vivas. Como se usa en el presente documento, el término “cromocuerpo” se entiende como un dominio de reconocimiento de antígenos fusionado con una proteína fluorófora o cromogénica.
Los resultados descritos en el presente documento son sorprendentes, en particular porque un enfoque más o menos similar que implicaba proteínas de fusión basado en los mismos dominios funcionales (domino variable y GFP) no consiguió proporcionar ninguna herramienta útil (véase documento WO 03/091415A2 y Zeytun et al., Nature Biotechnology 2003, Vol. 21, 12: 1473-1479) y tuvo que ser retirado por los autores (Zeytun et al., Nature Biotechnology 2004, Vol. 22, 5: 601). En este trabajo, Zeytun et al. describieron la inserción de diversos bucles de unión a anticuerpo en los cuatro bucles expuestos en un extremo de la proteína verde fluorescente (GFP). En más detalle, el bucle de unión a anticuerpo derivado de la región de complementariedad 3 de la cadena pesada se insertó en uno de los cuatro bucles de GFP, que conectan las cadenas de la estructura en lámina . Las construcciones resultantes se llamaron fluorocuerpos. Se seleccionaron fluorocuerpos específicos que reconocían varios antígenos por presentación de fagos. La competencia por reconocimiento de antígenos de los diferentes fluorocuerpos se ensayó por diversos métodos incluyendo experimentos de desplazamiento de banda e inmunofluorescencia. Este enfoque habría sido una combinación interesante de un dominio de reconocimiento de antígenos y las propiedades fluorescentes de las proteínas verdes fluorescentes. Resulta interesante, sin embargo, que los propios autores retiraron su manuscrito porque los resultados inicialmente presentados no eran reproducibles. En la retractación (Zeytun et al., 2004, Nature Biotechnology Vol. 22, 5: 601), los autores indicaron que la secuenciación de los ácidos nucleicos que codificaban las construcciones descritas revelaron los llamados “mutantes fuera de fase”. En otras palabras, ninguno de los fluorocuerpos inicialmente descritos por Zeytun et al. tiene la supuesto secuencia de aminoácidos deducida o el ácido nucleico codificanteo. Además, Zeytun et al., declararon que el fenómeno biológico observado no puede explicarse. En este caso, la combinación del dominio de reconocimiento de antígenos y una proteína fluorescente no funcionó.
En el presente documento se describe una nueva técnica que permite dirigir y localizar antígenos en células vivas. La enseñanza de la presente invención se ilustra mediante los ejemplos, que implican cromocuerpos generados por inducción de anticuerpos de domino único contra GFP, laminina Dm0 de Drosophila, y citoqueratina-8 en Lama pacos, Camelus dromedarius respectivo, y fusionando la parte de unión al epítopo de VHH con mRFP1. Como ejemplo se muestra claramente que el cromocuerpo anti-GFP puede expresarse de forma estable en células como un monómero activo y tiene acceso a todos los compartimentos y estructuras subcelulares ensayados. No se detectaron agregados, como se describe para un gran número de intracuerpos expresados de forma intracelular como scFVs26. Esta funcionalidad intracelular del dominio VHH derivado de llama sugiere que su estabilidad intrínseca (G = 30 kJ/mol)27 incluso en ausencia del enlace disulfuro C22-C92 conservado es suficientemente alta para plegarse de forma apropiada. La ausencia de un par extra de cisteínas en las CDR en el dominio de unión a epítopos de HCAb derivados de llama podría ser por lo tanto una ventaja natural frente a dominios VHH de dromedarios, en los que es esencial un enlace disulfuro entre bucles de aparición frecuente para el reconocimiento de antígenos9, 28. Otro ejemplo describe un cromocuerpo de GFP, en el que una de las cisteínas conservadas en la región VHH se ha mutado a serina. El ejemplo muestra claramente no solamente una mayor estabilidad del cromocuerpo resultante, sino sorprendentemente también una mejor accesibilidad de la molécula dentro de la célula.
Además la viabilidad de esta técnica se demuestra con cromocuerpos inducidos contra dos proteínas endógenas: citoqueratina-8 y laminina. Este nuevo enfoque que emplea cromocuerpos expande de forma drástica las posibilidades de, por ejemplo, la microscopía de células en vivo puesto que prácticamente cualquier componente o estructura potencialmente antigénica puede marcarse como objetivo y localizarse dentro de células vivas. El hecho de que puedan seleccionarse cromocuerpos específicos de bibliotecas recombinantes y su afinidad pueda mejorarse adicionalmente por ciclos de mutagénesis, reducirá en el futuro, posiblemente eliminará, la necesidad de inmunización animal 29. No obstante, los VHH recuperados de “bibliotecas inmunes” se benefician de la maduración de afinidad y especificidad de antígeno inherente que se produce durante la inmunización. Las proteínas de fusión/cromocuerpos generados de acuerdo con la presente invención, pueden usarse, por ejemplo, para aplicaciones de anticuerpos convencionales ya que la parte fluorescente, la proteína roja fluorescente (mRFP1) en este estudio, puede reemplazarse fácilmente por cualquier otra proteína fluorescente, enzima cromogénica o puede por ejemplo acoplarse con colorantes fluorescentes y puntos cuánticos. Son ejemplos de dichas enzimas cromogénicas peroxidasa de rábano rusticano (HRP), fosfatasa alcalina o -galactosidasa.
La proteína de fusión o la primera secuencia polipeptídica que comprende el dominio variable de anticuerpos de Camelidae como se describe en la presente invención, también puede acoplarse con fluorocromos no proteicos. Los fluorocromos están disponibles como N-Hidroxisuccinimidiléster (NHS-éster) y pueden acoplarse con proteínas, por
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ejemplo, los dominios variables (VHH) como se describen en la presente invención, mediante grupos amino primarios de dicha proteína. Los fluorocromos habitualmente disponibles muestran máximos de extinción en diferentes regiones de longitud de onda. Son ejemplos colorantes de Cy (por ejemplo Cy3, Cy5), Dy549, Oyster556, colorantes de Alexa o Tamra. El acoplamiento y la aplicación exitosos de la proteína de fusión de la invención se ilustran en los ejemplos.
Como cualquier otra herramienta, los cromocuerpos también necesitarán controles cuidadosos. Como la fusión de proteínas con GFP, también la unión de cromocuerpos con sus dianas puede afectar a su actividad y regulación especialmente evitando la interacción con otros componentes celulares. Sin embargo, la facilidad de seleccionar y desarrollar fragmentos de anticuerpo específicos producirá regularmente un conjunto de agentes de unión con diferentes dominios de las proteínas diana. Por lo tanto pueden seleccionarse agentes de unión que pueden estar mejor adaptados para localización o para interferencia funcional dependiendo de sus sitios de unión.
En resumen, se ha demostrado que la proteína de fusión aplicada en el método de la invención y en particular el cromocuerpo presentado en el presente documento es adecuado para la dirección y localización de antígenos en todos los compartimentos y estructuras subcelulares ensayados. Incluso los antígenos de partes centrales de la maquinaria de replicación así como antígenos incluidos en profundidad en la cromatina pudieron localizarse a lo largo de la fase S y mitosis lo que demuestra la idoneidad de los cromocuerpos para el estudio de células en vivo.
En una realización preferida de la presente invención, la etapa (b) comprende (a) exponer la célula a la luz correspondiente a la longitud de onda de excitación de la proteína de fusión; (b) detectar la energía emitida desde la célula y/o detectar la distribución subcelular de la energía emitida; (c) comparar la energía detectada en la etapa (b) con:
- (i)
- la energía detectada en una célula de referencia que contiene una cantidad de referencia de dicha estructura antigénica de interés; o expresa una proteína de fusión de referencia para la que no se expresa compañero de unión en la célula; o (ii) un control de datos y (d) concluir, a partir de una energía diferente, el estado de salud de un individuo o evaluar la presencia de la estructura antigénica de interés; en la que una energía mayor detectada en la etapa (b) en comparación con la de la etapa (c) es indicativa de la presencia de dicho antígeno; y/o concluir, a partir de la cantidad y/o localización/distribución subcelular de la energía emitida, la cantidad o localización/distribución subcelular de la estructura antigénica de interés.
La presente invención se refiere preferentemente a un método en el que la proteína de fusión que comprende una primera secuencia (poli)peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae y una segunda secuencia (poli)peptídica de una proteína fluorescente o cromófora, en la que dicha (a) primera secuencia (poli)peptídica está codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o codificada por una secuencia de un ácido nucleico con al menos el 70% de identidad de secuencia con la misma: y (b) segunda secuencia (poli)peptídica es
- (i)
- la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 7, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; (ii) la proteína roja fluorescente de Discosoma (DsRed) codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 9, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; o (iii) un homólogo funcional de (i) o (ii) con al menos el 80% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 85%, aún más preferentemente al menos el 90%, aún más preferentemente al menos el 95% y más preferentemente con al menos el 98% de identidad de secuencia, que conserva la actividad fluorescente de la proteína de fusión, en la que dicha primera secuencia (poli)peptídica se localiza en posición N-terminal de dicha segunda secuencia (poli)peptídica, separándose opcionalmente dichas secuencias por un enlazador o al menos un resto de aminoácido. El término “fragmento” se refiere a fragmentos funcionales capaces de unirse específicamente al antígeno.
En una realización preferida de la presente invención dicha región variable comprende marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3, y está codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o está codificada por una secuencia de un ácido nucleico con al menos el 70%, más preferentemente el 80%, más preferentemente al menos el 85%, aún más preferentemente al menos el 90%, aún más preferentemente al menos el 95% y más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia o un fragmento de la misma. La “unión específica” puede describirse, por ejemplo, con respecto a la reactividad cruzada. Preferentemente, los agentes de unión específicos son proteínas (proteínas de fusión o fragmentos de las mismas) que tienen una constante de disociación o KD de menos de 10-9 M. En una realización preferida de la presente invención, la secuencia de (a) CDR1 consiste en los restos mostrados en SEQ ID NO: 3; (b) CDR2 consiste en los restos mostrados en SEQ ID NO: 4; y (c) CDR3 consiste en los restos mostrados en SEQ ID NO: 5.
En una realización más preferida de la presente invención, dicha primera secuencia (poli)peptídica de dicha proteína de fusión o el (poli)péptido que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae tiene una secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 10, 30, 12 o 14 o está codificada por una secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 11, 31, 13 o 15.
En una realización más preferida de la presente invención, dicha segunda secuencia (poli)peptídica comprende los restos 1 a 239 de SEQ ID NO: 6 o 1 a 226 de SEQ ID NO: 8 o un mutante fluorescente o fragmento del mismo.
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En otra realización preferida de la presente invención, dicho mutante de la proteína roja fluorescente es mRFP1 codificado por SEQ ID NO: 17 o cualquiera de los mutantes de DsRed fluorescentes codificados por cualquiera de SEQ ID NO: 17 y 24 a 27 o por un fragmento de las mismas. mRFP es la proteína roja fluorescente monomérica derivada de DsRed y con frecuencia también se denomina mRFP1 (Campbell et al., (2002) PNAS, 99: 7877-7882, secuencia codificante: número de referencia: AF506027.1 (SEQ ID NO: 17)). Se han generado entre tanto varios otros derivados monoméricos de DsRed, incluyendo mRFPmars (secuencia codificante: número de referencia: AY679163.1 (SEQ ID NO: 24)), publicado por Fischer et al., (2004) FEBS Letters, 577: 227 -232, mCherry (secuencia codificante: número de referencia: AY678264 (SEQ ID NO: 25)), publicado por Shaner, N.C. et al., (2004) Nat. Biotech., 22: 1567 -1572), mRaspberry (secuencia codificante: número de referencia: AY86536 (SEQ ID NO: 26)), publicado por Wang, L. et al., (2004) PNAS, 22: 1567 -1572, mPlum (secuencia codificante: número de referencia: AY86537.1 (SEQ ID NO: 27)), publicado por Wang, L. et al., (2004) PNAS, 22: 1567 -1572. Cualquiera de estos mutantes fluorescentes derivados de DsRed puede usarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. En particular, las proteínas de fusión generadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención pueden comprender una segunda secuencia (poli)peptídica fluorescente que comprende cualquiera de los mutantes de DsRed anteriormente mencionados o mutantes fluorescentes o fragmentos de los mismos.
En otra realización preferida de la presente invención, la proteína de fusión comprende además una secuencia de dirección seleccionada del grupo que consiste en señal de localización nuclear (NLS), secuencia de importación al retículo endoplásmico, secuencia de importación a la mitocondria. Un ejemplo de una NLS es la secuencia peptídica PKKKRKV (señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40, D. Kalderon et al., 1984, Cell 39: 499) que es capaz de dirigir proteínas heterólogas al núcleo. Un ejemplo de la “Secuencia de Importación al Retículo Endoplásmico” es el péptido MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLTRCVFQ (señal de localización de RE de cadena ligera de inmunogobulina, Blobel G. y Dobberstein B., 1975 J. Cell. Biol. 67: 835 -851) que es capaz de dirigir las proteínas heterólogas al lumen del RE. Un ejemplo de una “Secuencia de Importación a Mitocondrias” es el péptido MLSLRQSIRFFRPATRTLCSSRYLL (Neupert W. 1997 Annu. Rev. Biochem. 66: 863-917) que es capaz de dirigir proteínas heterólogas a la mitocondria.
En otra realización preferida de la presente invención, la proteína de fusión tiene una secuencia de SEQ ID NO: 18, 32, 20 o 22 o está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende unasecuencia cualquiera de SEQ ID NO: 19, 33, 21 o 23.
En una realización preferida de la presente invención, la célula es una célula obtenida de un individuo.
En otra realización preferida de la presente invención dicha estructura antigénica de interés se detecta dentro de una célula. En una realización más preferida de la presente invención dicha célula es una célula viva. En otra realización preferida de la presente invención, dicha célula es una célula dentro de un organismo eucariota vivo, preferentemente dentro de un mamífero.
En una realización preferida de la presente invención dicha estructura antigénica se selecciona de proteína, modificación de proteína, cofactor, compuesto molecular pequeño, ADN y ARN.
En una realización preferida el (poli)péptido capaz de transducir se selecciona del grupo de (poli)péptidos básicos que comprenden péptido TAT, poli-arginina y poli-lisina.
En una realización más preferida de la presente invención, la proteína es una proteína citoplásmica, nuclear o nucleolar.
La identidad de secuencia puede determinarse usando el programa Bestfit® (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit® usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)). Cuando se usa Bestfit® o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, el 95% idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y que se permitan huecos de homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. La identidad entre una primera secuencia y una segunda secuencia, también denominada alineamiento de secuencia global, se determina usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y colaboradores (Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). En un alineamiento de secuencia las secuencias de consulta y objeto son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse convirtiendo U a T. El resultado de dicho alineamiento de secuencia global está en porcentaje de identidad. Son parámetros preferidos usados en un alineamiento FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad: Matriz=Unitaria, k-tuple=4, Penalización de Emparejamiento Erróneo=1, Penalización de Unión=30, longitud de Grupo de Selección Aleatoria=0, Puntuación de Corte=1, Penalización de Hueco=5, Penalización
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de Tamaño de Hueco 0,05, Tamaño de Ventana=500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos objeto, la que sea más corta.
El fragmento de proteína que comprende la secuencia VHH aplicada en la presente invención puede producirse con una célula productora de anticuerpos, que puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL). Pueden obtenerse linfocitos de sangre periférica de sangre de un camello inmunizado. La técnica más habitual para separar leucocitos es mezclar sangre con un compuesto que agrega los eritrocitos, aumentando de este modo su tasa de sedimentación. La sedimentación de leucocitos se ve afectada solo ligeramente y puede recogerse de la parte superior del tubo cuando los eritrocitos se han sedimentado (Thorsby E. & Bratilie A., 1970, Histocompatibility Testing 1970, ed. P.I. Terasaki, p.655 Munksgaard, Copenhague). Se prefiere un procedimiento convencional de acuerdo con un protocolo proporcionado, por ejemplo, por AXIS-SHIELD PoC AS (Oslo, Noruega) usando Lymphoprep™.
Los PBL pueden exponerse a un antígeno para el que es específica la región variable de la inmunoglobulina. Dicha exposición puede realizarse in vitro (es decir, por ejemplo en el cultivo celular) o in vivo (en un animal). Existen diversos protocolos en la técnica, para exponer PBL a antígenos (véase por ejemplo Harlow, E. y Lane, D. 1988 Antibodies, A Laboratory Manual, capítulo 5, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Además, la proteína de fusión aplicada en la presente invención puede alterarse. El método de la presente invención comprende además la etapa adicional de modificar la primera molécula de ácido nucleico que codifica la región variable dentro de CDR1, CDR2 y/o CDR3. Esto puede hacerse con la intención de conservar la especificidad pero mejorar la afinidad, por ejemplo. Como alternativa, puede cambiarse la especificidad. El término “modificar” significa mutagenizar o cambiar la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable. Las primeras secuencias mutantes pueden contener una o más deleciones, sustituciones o adiciones como se ha indicado anteriormente.
CDR1, CDR2 y/o CDR3 pueden modificarse por mutagénesis aleatoria de la primera molécula de ácido nucleico. La complejidad de las bibliotecas de fagos se ha limitado con frecuencia a 108 por la baja eficacia de la transformación de ADN en bacterias. Por lo tanto una biblioteca comprende solamente un número muy pequeño de todas las posibles secuencias. Esta es una de las principales razones por la que los ligandos seleccionados de bibliotecas de fragmentos de anticuerpos aleatorias son con frecuencia de baja afinidad. Un modo eficaz de superar esta limitación e identificar ligandos con propiedades mejoradas es a través de un proceso de “maduración de epítopos”. Las secuencias de CDR que reconocen antígenos seleccionadas de la biblioteca inicial se mutan parcialmente para generar una población de variantes. La exploración de esta biblioteca presentando un antígeno permite identificar ligandos que son mejores que la secuencia candidata original. Esto puede realizarse por ejemplo por mutagénesis dirigida que intercambia nucleótidos únicos en las regiones CDR (referencia Clackson T. y Lowman H.B., 2004, Phage Display: A practical Approach, Oxford University Press Inc., Nueva York). Otras técnicas son sintetizar las regiones CDR para intercambiar nucleótidos únicos que conducen a sustitución de un único aminoácido. Las CDR sintetizadas artificiales se insertarían en el armazón del fragmento de anticuerpo en las posiciones particulares por ligación usando restricción clásica o “corte y empalme de dos caras por extensión solapante” descrito en Horton R. et al., 1989, Gene 77:61-68. Además, se prefiere usar mutagénesis aleatoria. Esto pude realizarse mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótido descrita por Zoller, M.J. 1992, Curr. Opinion in Biotechnology 3:348-354. Se describe un desarrollo adicional usando trinucleótido fosforamiditas en una síntesis de ADN de fase sólida en Virnekas T. et al., 1994, Nucl. Acids Res. 22, 5600-5607.
La primera molécula de ácido nucleico que codifica la región variable se selecciona poniendo en contacto la región variable con un compañero de unión (un antígeno). Se puede realizar selección, y en particular detección del dominio variable basándose en la proteína de fusión que comprende el (poli)péptido fluorescente o cromóforo. Como alternativa, también puede realizarse selección de regiones variables particulares en ausencia del (poli)péptido fluorescente o cromóforo. Por ejemplo, antes o después de fusión, puede ensayarse un grupo de regiones variables con respecto a su especificidad o afinidad por un antígeno particular. Los ensayos adecuados incluyen FACS, ELISA, RIA, EIA; MS-MALDI etc.
En muchos casos la región variable se expresará en una biblioteca de expresión como se describe en el presente documento posteriormente en detalle. Se conocen bien por los expertos en la materia métodos para explorar bibliotecas. Las bibliotecas se exploran típicamente usando un antígeno, o molécula de interés, para el que es deseable seleccionar un compañero de unión. Típicamente, el antígeno se une a una superficie sólida o un marcador específico, tal como biotina. El antígeno (o molécula de interés) se incuba con una biblioteca de la invención. Los polipéptidos o miembros de biblioteca que se unen al antígeno se separan después de los que no, usando cualquiera de varios métodos diferentes. Estos métodos implican etapas de lavado, seguidas de etapas de elución. El lavado puede realizarse, por ejemplo, con PBS, o tampones que contienen detergente. La elución puede realizarse con varios agentes, dependiendo del tipo de biblioteca. Por ejemplo, puede usarse un ácido, una base, bacterias o una proteasa cuando la biblioteca es una biblioteca de presentación de fagos.
Para facilitar la identificación y aislamiento del fragmento de reconocimiento de antígenos fluorescente o unido a
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También puede realizarse selección en una biblioteca de presentación de fagos.
La construcción de bibliotecas de presentación de fagos aprovecha la capacidad del bacteriófago para presentar péptidos y proteínas en sus superficies, es decir, en sus cápsidas. Con frecuencia, se usan fagos filamentosos tales como M13, fd o f1. El fago filamentoso contiene ADN monocatenario rodeado de múltiples copias de genes que codifican proteínas de la cubierta mayores y menores, por ejemplo, plll. Las proteínas de cubierta se presentan en la superficie externa de la cápsida. Se transcriben conjuntamente secuencias de ADN insertadas en fase con genes de proteínas de la cápsida para generar proteínas de fusión o fragmentos de proteínas presentados en la superficie del fago. Las bibliotecas de fagos pueden presentar por lo tanto péptidos representativos de la diversidad de las secuencias insertadas. Significativamente, estos péptidos pueden presentarse en conformaciones plegadas “de forma natural”. Los fragmentos de reconocimiento de antígenos fluorescentes expresados en bibliotecas de presentación de fagos pueden unirse después a moléculas diana, es decir, pueden interaccionar específicamente con moléculas compañeras de unión tales como antígenos, por ejemplo, (Petersen, 1995, Mol. Gen. Genet. 249: 425-31), receptores de superficie celular (Kay, 1993, Gene 12859-65), y proteínas extracelulares e intracelulares (Gram, 1993, J. Immunol. Methods, 161: 16976).
El concepto de usar fagos filamentosos, tales como M13 o fd, para presentar péptidos en superficies de cápsida de fagos se introdujo por primera vez por Smith, 1985, Science 228:1315-1317. Se han presentado péptidos en superficies de fagos para identificar muchos ligandos potenciales (véase, por ejemplo, Cwirla, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382). Hay numerosos sistemas y métodos para generar bibliotecas de presentación de fagos descritos en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, Molecule Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 18, 2001; Phage, Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, 1996; Crameri, 1994, Eur J. Biochem. 226:53-58; de Kruif, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:3938-3942; McGregor, 1996, Mol Biotecnol, 6:155-162; Jacobsson, 1996, Biotechniques, 20: 1070-1076; Jespers, 1996, Gene, 173:179-181; Jacobsson, 1997, Microbiol Res., 152:121-128; Fack, 1997, J. lmmunol. Methods, 206:43-52; Rossenu, 1997, J. Protein Chem., 16:499-503; Katz, 1997, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26: 27-45; Rader, 1997, Curr. Opin. Bioltechnol., 8:503-508; Griffiths, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9:102-108.
Típicamente, se insertan ácidos nucleicos exógenos que codifican las secuencias proteicas para presentar en un gen de proteína de cubierta, por ejemplo gen III o gen VIII del fago. Las proteínas de fusión resultantes se presentan en la superficie de la cápsida. La proteína VIII está presente en aproximadamente 2700 copias por fago, en comparación con de 3 a 5 copias para la proteína III (Jacobsson (1996), mencionado anteriormente). Pueden usarse vectores de expresión multivalentes, tales como fagémidos, para manipulación de las secuencias de ácido nucleico que codifican la biblioteca de fragmentos de reconocimiento de antígenos fluorescentes y producción de partículas de fagos en bacterias (véase, por ejemplo, Felici, 1991, J. Mol. Biol., 222:301-310).
Con frecuencia se emplean vectores fagémidos para construir la biblioteca de fagos. Estos vectores incluyen el origen de replicación de ADN del genoma de un bacteriófago filamentoso monocatenario, por ejemplo, M13 o f1 y requieren la aportación de las otras proteínas de fagos para crear un fago. Este se proporciona habitualmente por un fago auxiliar que es menos eficaz en empaquetamiento en partículas de fago. Puede usarse un fagémido del mismo modo que un vector plasmídico ortodoxo, pero también pueden usarse para producir partículas de bacteriófagos filamentosas que contengan copias monocatenarias de segmentos clonados de ADN.
No es necesario que la proteína o el fragmento proteico presentado sea una proteína de fusión entre el (poli)péptido que comprende la región variable y la proteína del sistema de presentación. Por ejemplo, el (poli)péptido que comprende la región variable (es decir, el fragmento de reconocimiento del antígenos fluorescente) puede unirse a una proteína de cubierta debido a una interacción no covalente, por ejemplo, una interacción de unión de superenrollamiento, tal como una unión jun/fos, o una interacción covalente mediada por cisteínas (véase, por ejemplo, Crameri et al., 1994, Eur. J. Biochem., 22653-58) con o sin interacciones no covalentes adicionales. Morphosys ha descrito un sistema de presentación en el que se pone una cisteína en el extremo C-terminal del scFv o Fab, y se pone otra en el extremo Nterminal de g3p. Los dos se ensamblan en el periplasma y se produce presentación sin un gen o proteína de fusión.
No es necesario que la proteína de cubierta sea endógena. Por ejemplo, pueden incorporarse proteínas de unión a ADN en el genoma de fago/fagémido (véase, por ejemplo, McGregor y Robins, 2001, Anal. Biochem., 294:108-117,). Cuando la secuencia reconocida por dichas proteínas también está presente en el genoma, la proteína de unión a ADN se incorpora en el fago/fagémido. Esta puede actuar como una proteína de vector de presentación. En algunos casos se ha mostrado que la incorporación de proteínas de unión de ADN en la cubierta del fago puede producirse independientemente de la presencia de la señal de ADN reconocida.
También puede usarse otro fago. Por ejemplo, pueden emplearse vectores T7, vector T4, vectores T2 o vectores lambda en los que el producto presentado en la partícula de fago madura se libera por lisis celular.
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Otra metodología es la tecnología del fago infeccioso selectivo (SIP), que posibilita la selección in vivo de pares de proteína-ligando de interacción. Un “fago infeccioso selectivo” consiste en dos componentes independientes. Por ejemplo, una partícula de fago filamentoso recombinante se hace no infecciosa reemplazando sus dominios Nterminales de proteína del gen 3 (g3p) con una proteína de interés, por ejemplo, un antígeno. El ácido nucleico que codifica el antígeno puede insertarse de modo que se exprese. El segundo componente es una molécula “adaptadora” en la que el fragmento de reconocimiento de antígeno fluorescente se une a los dominios N-terminales de g3p que están ausentes en la partícula de fago. Se restaura la infecciosidad cuando la proteína presentada (por ejemplo, un fragmento de reconocimiento de antígenos fluorescente) se une al antígeno. Esta interacción une los dominios N-terminales ausentes de g3p con la partícula de presentación de fagos. La propagación de fagos se hace estrictamente dependiente de la interacción proteína-ligando. Véase, por ejemplo, Spada, 1997, J. Biol. Chem. 378:445-456; Pedrazzi, 1997, FEBS Lett. 41 5:289-293; Hennecke, 1998, Protein Eng. 11:405-410.
La presente memoria descriptiva también describe una proteína de fusión que comprende una primera secuencia (poli)peptídica que comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae (incluyendo cualquier camello o dromedario) y una segunda secuencia (poli)peptídica, que es una proteína detectable, preferentemente de una proteína detectable, por ejemplo fluorescente, cromófora o fosforescente, en la que dicha (a) primera secuencia (poli)peptídica está codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 11, 31, 13 o 15 o codificada por una secuencia de un ácido nucleico con al menos el 70% de identidad de secuencia y (b) segunda secuencia (poli)peptídica, si es de una proteína fluorescente o cromófora, es (i) la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 7, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; (ii) la proteína roja fluorescente de Discosoma (DsRed) codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 9, o un mutante fluorescente o fragmento del mismo; o (iii) un homólogo funcional de (i) o (ii) con al menos el 80% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 85%, aún más preferentemente al menos el 90%, aún más preferentemente al menos el 95% y más preferentemente con al menos el 98% de identidad de secuencia que conserva la actividad fluorescente de la proteína de fusión; en el que dicha primera secuencia (poli)peptídica está localizada en dirección N-terminal de dicha segunda secuencia (poli)peptídica, estando separadas opcionalmente dichas secuencias por un enlazador de al menos un resto de aminoácido. El término “fragmento” se refiere a fragmentos funcionales capaces de unirse específicamente con el antígeno.
Las proteínas de fusión son proteínas quiméricas que consisten en secuencias derivadas de al menos dos moléculas diferentes. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, la región codificante que codifica la región variable de una inmunoglobulina está fusionada en fase con la región codificante que codifica uno o más (poli)péptidos detectables, tales como (poli)péptidos fluorescentes. Puede realizarse fusión por cualquier técnica conocida por el experto en la materia, siempre que dé como resultado la fusión en fase de dichas regiones codificantes. Convencionalmente, la generación de una proteína de fusión de dos proteínas o dominios separados se basa en el “corte y empalme de dos caras por extensión solapante” descrito en Horton R., et al., 1989, Gene 77:61-68. Los fragmentos que codifican los dominios únicos o proteínas se generan en dos reacciones de PCR primarias separadas. Los cebadores internos para las reacciones de PCR primarias contienen una región complementaria significativa, de aproximadamente 20 pb, que permite la fusión de los dos fragmentos de dominio en la segunda PCR. Como alternativa, las regiones codificantes pueden fusionarse haciendo uso de sitios de restricción que puede ser de origen natural o introducirse por tecnología de ADN recombinante.
La presente memoria descriptiva también describe que la secuencia del segundo (poli)péptido de la proteína de fusión puede comprender los restos 1 a 239 de SEQ ID NO: 6 o 1 a 226 de SEQ ID NO: 8 o un mutante fluorescente o fragmento del mismo.
La presente memoria descriptiva de la invención también describe que el mutante de la proteína roja fluorescente puede ser mRFP1 como se muestra en SEQ ID NO: 17 o una proteína o (poli)péptido codificado por la secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 17 y 24 a 27.
La presente memoria descriptiva de la invención también describe que la proteína de fusión puede tener la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 32, 20 o 22 o está codificada por un ácido nucleico idéntico a o que comprende la secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 19, 33, 21 o 23.
El cromocuerpo anti-GFP puede expresarse de forma estable en células como un monómero activo y tiene acceso a todos los compartimentos y estructuras subcelulares ensayados. No se detectaron agregados, como se describe para un gran número de intracuerpos expresados de forma intracelular como scFv26. Esta funcionalidad intracelular del dominio VHH derivado de llama sugiere que su estabilidad intrínseca (G = 30 kJ/mol)27 incluso en ausencia del enlace disulfuro C22-C92 conservado es suficientemente alta para plegarse de forma apropiada. La ausencia de un par extra de cisteínas en las CDR en el dominio de unión a epítopo de HCAb derivados de llama podría ser por lo tanto una
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ventaja natural frente a dominios VHH de dromedarios, cuando sea esencial un enlace disulfuro entre bucles de aparición frecuente para el reconocimiento de antígenos9,28. El cromocuerpo de GFP, en el que una de las cisteínas conservadas en la región VHH se han mutado a serina muestra no solo una mayor estabilidad de la molécula, sino sorprendentemente también una mejor accesibilidad de la molécula dentro de la célula.
La presente memoria descriptiva de la invención también describe que la proteína de fusión puede comprender además una secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en señal de localización nuclear (NLS), secuencia de importación al retículo endoplásmico, secuencia de importación a la mitocondria. Un ejemplo de una NLS es la secuencia de péptidos PKKKRKV (señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40, D. Kalderon et al., 1984, Cell 39:499) que es capaz de dirigir las proteínas heterólogas al núcleo. Un ejemplo de la “secuencia de importación al retículo endoplásmico” es el péptido MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLTRCVFQ (señal de localización en RE de cadena ligera de inmunoglobulina, Blobel G. & B. Dobberstein, 1975 J.Cell.Biol. 67:835-851) que es capaz de dirigir proteínas heterólogas al lumen del RE. Un ejemplo de una “secuencia de importación mitocondrial” es el péptido MLSLRQSIRFFRPATRTLCSSRYLL (Neupert W. 1997 Annu. Rev. Biochem. 66:863-917) que es capaz de dirigir proteínas heterólogas a la mitocondria.
La presente memoria descriptiva también describe un fragmento de la proteína de fusión capaz de unirse específicamente a su epítopo, comprendiendo dicho fragmento marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3, codificado por la molécula de ácido nucleico cualquiera de SEQ ID NO: 11, 13, 15 o codificado por una molécula de ácido nucleico con al menos el 70%, más preferentemente el 80%, más preferentemente al menos el 85%, aún más preferentemente al menos el 90%, aún más preferentemente al menos el 95% y más preferentemente al menos el 98% de identidad de secuencia. Se prefiere que los cambios con respecto a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1 se localicen fuera de las CDR. Sin embargo, se pueden introducir mutaciones particulares en al menos una posición de la CDR para modular la afinidad del fragmento por GFP. “Modular la afinidad” significa aumentar o reducir la constante de disociación KD del complejo de GFP y fragmento.
Como se ilustra en el Ejemplo 6 de la presente invención, dicho fragmento es particularmente eficaz en inmunoprecipitación de GFP. Los resultados descritos en el presente documento son bastante sorprendentes puesto que este fragmento, aunque no contiene la parte Fc de los anticuerpos convencionales, aún es capaz de asociarse con la proteína A. Los experimentos mostrados en el presente documento demuestran que este fragmento es altamente eficaz en ensayos de inmunoprecipitación convencionales. Además este fragmento no solamente inmunoprecipita su antígeno (como se demuestra en la Figura 7B) sino también proteínas de interacción (como se muestra en la Figura 8). El bajo peso molecular y el estado monomérico de este fragmento de anticuerpo permite una manipulación sencilla en enfoques bioquímicos, comenzando con la expresión de alto rendimiento en una célula hospedadora como E. coli y una purificación de una etapa (mostrada en la Figura 6A). A diferencia de los anticuerpos convencionales este fragmento de anticuerpo, debido a su naturaleza, no interfiere en aplicaciones como SDS-PAGE y/o una transferencia de western. Los anticuerpos convencionales muestran una cadena ligera y pesada desnaturalizada, que con frecuencia interfiere con la detección del antígeno y/o proteínas coprecipitadas por inmunodetección o análisis de espectrometría de masas.
La presente memoria descriptiva también describe que la proteína de la presente invención puede comprender además
(a) un marcador seleccionado del grupo que consiste en el marcador His, el marcador Myc, el marcador GST, el marcador Strep, el sitio de reconocimiento para biotinilación y opcionalmente (b) el sitio de reconocimiento para una proteasa. Hablando en general, puede usarse cualquier epítopo con un anticuerpo de alta afinidad correspondiente como un marcador. Se prefieren particularmente el marcador myc (véase, por ejemplo, Kieke, 1997, Protein Eng. 10: 1303-1310), marcador His (Pharmacia) o el marcador GST (Pharmacia) o el marcador Strep (véase por ejemplo Skerra & Schmidt (1999) Biomolecular Engineering 16: 79-86). Uno de los enfoques más habitualmente usados es marcar la proteína recombinante en uno de los extremos con la enzima glutatión S-transferasa (GST) o un fragmento de la misma, que tiene alta afinidad por su ligando natural glutatión (que es el tripéptido -glutamilcisteinilglicina, habitualmente abreviado GSH). La proteína se purifica usando una resina con GSH unida covalentemente. Después de la elución de las proteínas contaminantes con tampón, la proteína marcada se eluye con una solución de GSH. Otro método popular es marcar la proteína en uno de los extremos con 6-10 restos de His que confieren a la proteína recombinante la capacidad de unirse con una resina de Ni2+. Después de la elución de proteínas contaminantes con tampón, la proteína marcada se separa por competencia de la columna Ni2+ con una solución de tampón que contiene imidazol (recuérdese que la cadena lateral de His contiene un anillo de imidazol).
La presente memoria descriptiva también describe una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. Dicha molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ARN o ADN.
La presente memoria descriptiva también describe un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico. El vector de expresión puede ser un vector de expresión eucariota o procariota, preferentemente un vector de expresión de mamífero.
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Un vector de expresión de mamífero típico contiene el elemento promotor, que media en el inicio de la transcripción del ARNm, la secuencia codificante de proteína y señales requeridas para la terminación de la transcripción y poliadenilación del transcrito. Además, también pueden incluirse elementos tales como origen de replicación, gen de resistencia a fármacos, reguladores (como parte de un promotor inducible). El promotor lac es un promotor inducible típico, útil para células procariotas, que puede inducirse usando el análogo de lactosa isopropiltiol-b-D-galactósido. (“IPTG”). Para expresión recombinante, el fragmento de anticuerpo puede ligarse entre por ejemplo la señal líder de PelB, que dirige la proteína recombinante en el periplasma y el gen III en un fagémido llamado pHEN4 (descrito en Ghahroudi et al, 1997, FEBS Letters 414521-526). Los elementos adicionales podrían incluir potenciadores, secuencias Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donadores y aceptores para corte y empalme de ARN. Puede conseguirse transcripción altamente eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, VIHI, y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también pueden usarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humano). Los vectores de expresión adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12Ml (ATCC 67109). Las células hospedadoras de mamífero que podrían usarse incluyen células Hela, 293, H9 y Jurkat humanas, células NIH3T3 y C127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CV1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO). Como alternativa, el (poli) péptido recombinante puede expresarse en líneas celulares estables que contienen la construcción génica integrada en un cromosoma. La cotransfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas. El ácido nucleico transfectado también puede amplificarse para expresar grandes cantidades del (poli) péptido codificado. El marcador de DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que porten varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy et al. 1991, Biochem J. 227: 277-279; Bebbington et al. 1992, Bio/Technology 10: 169-175). Usando estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio selectivo y se seleccionan las células con mayor resistencia. Como se ha indicado anteriormente, los vectores de expresión preferentemente incluirán al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, G418 o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen, pero sin limitación, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, 293 y melanoma de Bowes; y células vegetales. Se conocen en la técnica medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospedadoras anteriormente descritas.
El polipéptido expresado de forma recombinante puede contener restos de aminoácidos adicionales para aumentar la estabilidad o para modificar la dirección de la proteína. Por ejemplo, puede añadirse una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación, o durante la manipulación y almacenamiento posteriores. Además, pueden añadirse restos peptídicos al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones pueden retirarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos peptídicos a polipéptidos para inducir secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otros, son técnicas familiares y rutinarias en este campo. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para estabilizar y purificar proteínas. Por ejemplo, el documento EP-A-0 464 533 (homólogo Canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas partes de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte de Fc en una proteína de fusión es verdaderamente ventajosa para su uso en terapia y diagnóstico y por lo tanto da como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (documento EP-A 0 232262). Por otro lado, para algunos usos sería deseable poder suprimir la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado de la manera ventajosa descrita. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas, tales como hIL-5, con partes Fc para el fin de realizar ensayos de exploración de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58 (1995) y K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270: 94599471 (1995). Las proteínas de fusión pueden recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad y/o cromatografía de hidroxiapatita. Más preferentemente, se usa cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) para purificación, sin embargo, también puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (“HPLC”) para purificación.
La presente memoria descriptiva también describe una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico y/o el vector de expresión. La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora eucariota o procariota. Preferentemente las células hospedadoras para usar para expresión del (poli) péptido, proteína o proteína de fusión se seleccionan del grupo que consiste en células bacterianas incluyendo E. coli: XI1 blue, BL21, JM 109; células eucariotas
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inferiores incluyendo levadura Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris; o cualquier célula o cepa descrita en Sambrook y Russel, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Apéndice 3.
También se describen en el presente documento proteínas de fusión, que pueden obtenerse de la célula hospedadora o del método de la presente invención. La proteína recombinante puede recuperarse de células o sobrenadante de cultivo celular por cualquier método adecuado conocido por el experto en la materia. Se describen métodos típicos en Bollag,
D.M. y Edelstein, S.J., 1991 (véase Protein Methods Wiley-Liss, Nueva York, Methods in Enzymology, 1990, Guide to Protein Purification, Vol. 182, Academic Press, Nueva York).
La presente memoria descriptiva también describe un método para generar una biblioteca de proteínas detectables, tales como fluorescentes, capaces de unión a antígeno, que comprende las etapas del método como se ha descrito anteriormente. También se describe una biblioteca generada por este método. Dichas bibliotecas permiten una exploración directa y rápida de nuevas proteínas detectables, tales como fluorescentes, capaces de unión a antígeno. Puede evitarse el enfoque caro y que requiere mucho tiempo que implica la inmunización animal tradicional. Además, se necesita menos antígeno y pueden evitarse los efectos adversos de antígenos biológicos durante la inmunización. Estas nuevas proteínas capaces de unión a antígeno están inmediatamente listas para su uso, sin ningún procedimiento experimental adicional como reticulación química con, por ejemplo, fluoróforos o enzimas cromogénicas o estructuras moleculares para detección o cuantificación. Los fragmentos de anticuerpo fluorescentes (cromocuerpos) identificados en la exploración inicial pueden mejorarse adicionalmente en su especificidad y afinidad por mutagénesis posterior y ciclos de selección adicionales.
Se describe también en el presente documento un método para purificar la proteína o proteína de fusión, que comprende (a) poner en contacto una solución que comprende la proteína con un compuesto capaz de unirse específicamente a la proteína, en la que antes o después de la unión, el compuesto se une a un soporte sólido; (b) lavar el soporte sólido de la etapa (a) para retirar constituyentes unidos de forma no específica; (c) eluir la proteína de fusión.
Un “compuesto capaz de unirse específicamente a la proteína” puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o un antígeno para el que es específica la proteína de fusión. Los soportes sólidos que pueden emplearse de acuerdo con la invención incluyen material de filtro, microplacas, obleas, placas de microtitulación y perlas, por nombrar algunas. La unión significa unión covalente o no covalente. Las proteínas y proteínas de fusión pueden solubilizarse en tampones de proteínas convencionales tales como PBS. 1xPBS con un pH de 7,5 es el tampón preferido, pero también pueden usarse otros tampones (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Apéndice A1.2, 2001). Estos otros tampones pueden seleccionarse por el experto en la materia usando métodos convencionales conocidos en la técnica. La etapa de lavado puede realizarse a diferente concentración salina para modificar o modular la especificidad de la unión proteica. Por ejemplo en 1xPBS que contiene NaCl o KCl 150 mM -1 M. El procedimiento completo se basa en un protocolo convencional para, por ejemplo, inmunoprecipitación conjunta proporcionada por el Kit de Inmunoprecipitación Conjunta ProFoundTM Pierce, Rockford, Estados Unidos. También puede usarse cualquier otro protocolo descrito para purificación proteica o identificación de interacciones proteicas y purificación proteica usando anticuerpos (Referencias: Methods in Enzymology, 1990, Guide to Protein Purification, Vol. 182, Academic Press, Nueva York; Harlow, E. y Lane, D. 1988 Antibodies, A Laboratory Manual, Capítulo 11, Cold Spring Harbor, Nueva York; Hermanson, G.T.,1992, Immobilized Affinity Ligands Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook y Russel, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Apéndice A1.2). La proteína de fusión puede contener una secuencia marcadora como se ha definido anteriormente. Por ejemplo puede usarse cualquier epítopo con un anticuerpo de alta afinidad correspondiente como un marcador, por ejemplo, un marcador myc (véase, por ejemplo, Kieke, 1997, Protein Eng. 10: 1303-1310) o un marcador His (Pharmacia). Véase también Maier, 1998, Anal. Biochem. 259: 68-73; Muller, 1998, Anal. Biochem. 259: 54-61. Dicho compuesto capaz de unirse específicamente a la proteína de fusión puede ser un compuesto que se une específicamente a la secuencia marcadora. Se han descrito varios marcadores en la memoria descriptiva de la presente invención, todos estos marcadores pueden emplearse.
También se describe en el presente documento un método para identificar una proteína detectable, tal como fluorescente, capaz de unirse específicamente con un antígeno, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una biblioteca creada con el método descrito anteriormente; (b) explorar la biblioteca con un antígeno; (c) seleccionar un miembro de la biblioteca que se una al antígeno. La exploración de la biblioteca puede realizarse por cualquiera de los métodos de exploración descritos en el presente documento. Preferentemente la biblioteca se explora por presentación de fagos (referencia y protocolo: Clackson T. y Lowman H.B., 2004, Phage Display: A Practical Approach, Oxford University Press Inc., Nueva York).
La presente memoria descriptiva también describe un método para detectar la presencia, cantidad o localización subcelular de una estructura antigénica de interés en una célula, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la célula con la proteína de fusión como se ha descrito anteriormente en condiciones que permitan que la proteína de
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El término “purificar” como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva resume técnicas usadas para aislar una estructura antigénica. El término comprende, pero sin limitación, purificación por inmunoprecipitación, cromatografía de exclusión por tamaño o afinidad, y similares y cualquier combinación de las mismas.
5 Dicha región variable comprende marco 1, CDR1, marco 2, CDR2, marco 3 y CDR3, y está codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO: 2 o está codificada por una secuencia de ácido nucleico con al menos el 70%, más preferentemente el 80%, más preferentemente al menos el 85 %, aún más preferentemente al menos el 90%, aún más preferentemente al menos el 95% y más preferentemente al menos el 98 % de identidad de secuencia de la misma. La
10 “unión específica” puede describirse, por ejemplo, con respecto a reactividad cruzada. Preferentemente, los agentes de unión específicos son proteínas (proteínas de fusión o fragmentos de las mismas) que tienen una constante de disociación o KD de menos de 10-12 M en particular 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M y 10-15 M.
La secuencia de (a) CDR1 puede consistir en los restos mostrados en SEQ ID NO: 3; (b) CDR2 consiste en los restos 15 mostrados en SEQ ID NO: 4; y (c) CDR3 consiste en los restos mostrados en SEQ ID NO: 5.
Dicha primera secuencia (poli)peptídica de dicha proteína de fusión o el (poli)péptido puede comprender la región variable de un anticuerpo de cadena pesada de Camelidae y tiene la secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 10, 30, 12 o 14 o está codificada por la secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 11, 31, 13 o 15.
20 Dicha segunda secuencia (poli)peptídica puede comprender los restos de 1 a 239 de SEQ ID NO: 6 o 1 a 226 de SEQ ID NO: 8 o un mutante fluorescente o fragmento del mismo.
Dicho mutante de la proteína roja fluorescente puede ser mRFP1 codificada por SEQ ID NO: 17 o cualquiera de los
25 mutantes fluorescentes de DsRed codificados por una cualquiera de SEQ ID NO: 17 y 24 a 27 o por un fragmento de los mismos. Puede usarse cualquier mutante fluorescente derivado de DsRed de acuerdo con las enseñanzas de la presente memoria descriptiva. En particular, las proteínas de fusión generadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente memoria descriptiva pueden comprender una segunda secuencia (poli)peptídica fluorescente que comprende cualquiera de los mutantes de DsRed anteriormente mencionados o mutantes fluorescentes o fragmentos de los
30 mismos.
La proteína de fusión puede comprender además una secuencia de dirección seleccionada del grupo que consiste en señal de localización nuclear (NLS), secuencia de importación al retículo endoplásmico, secuencia de importación mitocondrial.
35 La presente memoria descriptiva describe una proteína de fusión que tiene la secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20 o 22 o que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 o 23.
40 También se describe un método para detectar o precipitar específicamente GFP o una proteína marcada con GFP u otros antígenos celulares en una muestra, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con el cromocuerpo anti-GFP que es específico para GFP (SEQ ID NO: 18 y 32) o un fragmento del mismo. Dicho fragmento puede comprender o consistir en los restos de aminoácidos como se muestran en SEQ ID NO: 10 o 30.
45 El cromocuerpo anti-GFP comprende además un marcador seleccionado del grupo que consiste en marcador de His, marcador de Strep, sitio de reconocimiento para biotinilación; y opcionalmente el sitio de reconocimiento para una proteasa.
Se pueden extraer (es decir precipitarse) GFP o una proteína marcada con GFP u otros antígenos celulares y proteínas
50 de interacción poniendo en contacto una muestra con la proteína purificada o un fragmento unido a un soporte sólido. Las proteínas precipitadas conjuntamente pueden después analizarse por métodos convencionales incluyendo análisis de espectrometría de masas.
La proteína de fusión o fragmento se puede unir a un soporte sólido.
55 Dicho soporte sólido puede ser proteína A. La proteína A en sí misma puede acoplarse a resinas habituales tales como sefarosa.
Dicha proteína de fusión o fragmento se puede unir a dicho soporte sólido. La expresión “unido a” comprende acoplado 60 covalentemente. En general, las proteínas pueden acoplarse a matrices mediante grupos amino primarios.
Dicho soporte sólido puede ser sefarosa. Las matrices o soportes sólidos son por ejemplo Sepharose 4 activada por
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NHS (Amersham), medio de afinidad activado por Affi-Gel 10 o Affi-Gel 15 (BIO-RAD) o Gel de Acoplamiento AminoLink Plus (Pierce). También se describe en el presente documento un kit que comprende la proteína y/o la molécula de ácido nucleico y/o el vector de expresión de la presente invención y/o la célula hospedadora de la presente invención y/o la biblioteca de la presente invención y opcionalmente instrucciones para su uso.
5 Las Figuras muestran:
Figura 1: Perfil esquemático de un anticuerpo IgG convencional en comparación con un anticuerpo IgG de cadena pesada derivado de llama (adaptado de ref. 11). Los dominios de unión a antígeno de un IgG 10 convencional (a) están compuestos de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) variables. Por el contrario, en anticuerpo IgG de cadena pesada (b) de Camelidae está desprovisto de la cadena ligera (VL & CL) y carece también del dominio CH1. La unión a antígenos se lleva a cabo por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) localizadas en el dominio variable de la cadena pesada (VHH). Para generar un cromocuerpo fluorescente el VHH de pequeño tamaño se fusiona con una
15 proteína roja fluorescente monomérica (mRFP1) y se expresa en células de mamífero. (c) La estructura potencial del cromocuerpo se modeló basándose en las estructuras cristalinas conocidas de un VHH11 de llama y el mRFP131. Dentro de esta estructura CDR1 se muestra en amarillo, CDR2 en cian, CDR3 en verde, mRFP1 en rojo y el enlazador flexible de 24 aminoácidos se muestra como una línea de puntos negra.
20 Figura 2: Alineamiento de siete secuencias VHH derivadas de llama (líneas 1-4) y camello (líneas 5-7). Desde arriba a abajo: cAb-GFP4 (cAb de llama alpaca inducido contra GFP, este trabajo); RR6-R2 (cAb de llama inducido contra colorante rojo RR632); RR6-R9 (cAb de llama inducido contra colorante rojo RR633); hCG-H14 (cAb de llama inducido contra hCG34); cAb-Lys3 (cAb de camello inducido contra
25 lisozima28); cAb-TT1 (cAb de camello inducido contra toxoide del tétanos12), AMYL-D10 (cAb de camello inducido contra amilasa porcina35). Los restos de CDR están coloreados en amarillo, cian y verde para CDR 1 (H1), 2 y 3 respectivamente. Las sustituciones de aminoácidos de VHH de camélido características en marco 2 están destacadas en azul. Las cisteínas se muestran en negrita. La numeración es de acuerdo con Kabat y Wu18. Debajo se indican los restos de aminoácidos idénticos
30 (*), muy similares (:) y similares (.).
Figura 3: El cromocuerpo anti-GFP se expresa como una proteína monomérica estable en células de mamífero.
(a) representación esquemática del cromocuerpo anti-GFP. (b) Se prepararon extractos celulares totales de células 293T que expresaban el cromocuerpo anti-GFP o células tratadas con simulación, 35 72 horas después de la transfección. Se analizaron cantidades crecientes de proteína por transferencia de western y detección con antisuero anti-mRFP1. Carril 1; 30 g de extracto proteico de células transfectadas con la simulación, carril 2-4, 10, 20 y 30 g de extracto proteico de células que expresan cromocuerpo anti-GFP. El tamaño predicho de la proteína quimérica es 41 kDa (panel superior). Como control de carga, la transferencia se volvió a incubar con un anticuerpo contra PCNA 40 (panel inferior). (c) Análisis de filtración en gel de extractos de células de mamífero que expresan el cromocuerpo. Se lisaron 1x107 células 293T que expresaban el cromocuerpo anti-GFP en presencia de NP-40 0,5% y se sometieron a filtración en gel en una columna de Superose-12. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y en la transferencia de western se usó un anticuerpo contra mRFP1. El cromocuerpo anti-GFP se eluye de la columna en fracciones pico correspondientes a una masa
45 molecular aparente de ~40 kDa. Las flechas indican la elución de patrones de calibración. (d) La expresión del cromocuerpo anti-GFP en células HeLa en ausencia de cualquier antígeno muestra una distribución difusa de la proteína por todo el citoplasma y el núcleo (panel superior), que es comparable a la distribución de mRFP1 no fusionada en el mismo tipo celular (panel inferior).
50 Figura 4: Dirección del cromocuerpo anti-GFP a sitios de unión de proteínas de fusión de GFP en diferentes compartimentos y estructuras celulares en células vivas. (a) Representación esquemática de las proteínas de fusión. (b-e) Se transfectaron de forma transitoria células HeLa con las construcciones de fusión de GFP indicadas y el plásmido de expresión del cromocuerpo anti-GFP (con la excepción de
(e) en el que se usaron células HeLa que expresaban de forma estable H2B-GFP). Se muestran
55 imágenes representativas de células vivas. (b) Los cromocuerpos anti-GFP se colocalizan con GFP-actina en filamentos de actina citoesqueléticos. (c) Los cromocuerpos anti-GFP entran en el núcleo y se unen a GFP-laminina B1 incorporada en la lámina nuclear. (d) Los cromocuerpos anti-GFP se unen a una proteína regulada por ciclo celular, GFP-PCNA, en focos de replicación. Se tomó una serie de lapso de tiempo de una célula que atravesaba la fase S. Se muestra una imagen de la célula en mitad
60 de la fase S. (e) Los cromocuerpos anti-GFP se unen a la histona H2B-GFP incorporada en cromatina. La célula transfectada con el cromocuerpo anti-GFP está en prometafase y son visibles los
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- cromosomas separados. Las flechas indican células no transfectadas en meta e interfase que no expresan el cromocuerpo. La ausencia de fluorescencia roja confirma que no hay escape inespecífico
- a través del canal de GFP. Barras de escala, 5 m.
- 5 10
- Figura 5: Localización de antígenos con cromocuerpos. (a) Localización de una proteína de cromatina a lo largo de la mitosis. Imagen de lapso de tiempo de una célula HeLa que expresa de forma estable la histona H2B-GFP transfectada con el cromocuerpo anti-GFP. Se muestran fotogramas seleccionados de esta serie temporal. En el momento en que se inició la captura de imágenes (0 horas), esta célula estaba en fase G2 tardía. (b) Rastreo de un componente de la maquinaria de replicación a lo largo de la fase S hasta G2. Imágenes de lapso de tiempo de células HeLa cotransfectadas que expresan GFP-PCNA
- y el cromocuerpo anti-GFP. Se muestran fotogramas seleccionados de esta serie. Al comienzo de la captura de imágenes (0 horas) las células estaban en fase S temprana a media. Barras de escala, 5
- m.
- 15
- Figura 6: Purificación de cAb-GFP4-His6 recombinante
- 20
- (A). El fragmento de anticuerpo cAb-GFP4 recombinante expresado puede purificarse en una etapa de cromatografía. Se resuspendieron 5 ml de extracto de proteína de E. coli soluble en tampón de unión (1x PBS, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) y se cargó en una columna que contenía 1 ml de resina NiNTA. Después de lavado exhaustivo, la proteína unida se eluyó añadiendo por etapas 1 ml de
- tampón de elución (1x PBS, NaCl 500 mM, imidazol 200 mM). Se sometieron 2% de sobrenadante, sedimento después de centrifugación, flujo continuo y fracción de elución a SDS-PAGE y se tiñeron con azul brillante de coomassie. La fracción principal de cAb-GFP4 eluye en las fracciones 2 y 3, que
- se agruparon y dializaron frente a 1x PBS y se ajustaron a una concentración de 1 g/l.
- 25
- 30
- (B) Análisis de filtración en gel del fragmento de anticuerpo cAb-GFP purificado. Se sometieron 10 g de cAb-GFP4 purificado a filtración en gel en una columna de Superose-12. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y en la transferencia de western se usó un anticuerpo contra el marcador de histidina C-terminal (His6). El fragmento de anticuerpo cAb-GFP4 eluye desde la columna en fracciones pico correspondientes a una masa molecular aparente de ~15 kDa. Las flechas indican la elución de patrones de calibración.
- 35
- Figura 7: Inmunoprecipitación de proteínas marcadas con GFP usando el fragmento de anticuerpo cAb-GFP4 purificado
- (A) representación esquemática de las proteínas de fusión. (B) Se lisaron Células 293T tratadas con simulación o que expresaban la construcción de fusión de GFP en presencia de NP-40 0,5%. Los extractos de proteína soluble se sometieron a
- inmunoprecipitación añadiendo respectivamente 20 g o 10 g de cAb-GFP4 purificado acoplado con
- 40
- perlas de agarosa de proteína A. Las fracciones únicas que contenían entrada, flujo continuo, lavado y sedimento de perlas se analizaron por SDS-PAGE seguido de tinción con coomassie o análisis de
- 45
- inmunotransferencia. Las proteínas sobre-expresadas eran parcialmente detectables en la fracción de entrada. En la fracción de perlas las proteínas precipitadas eran detectables como una banda clara junto con el fragmento de anticuerpo cAb-GFP4 (indicado con flechas). Para confirmar que estas bandas eran las proteínas de fusión con GFP esperadas, respectivamente el fragmento de anticuerpo, los geles se transfirieron y se incubaron con anticuerpos contra GFP y el marcador de histidina Cterminal (His6). Las señales de los anticuerpos revelan la precipitación casi cuantitativa del antígeno, mientras que no aparecen bandas proteicas no específicas en el gel que muestra las células tratadas con simulación. Como control para la especificidad de la immunoprecipitación, las manchas de
- 50
- transferencia se volvieron a explorar con un anticuerpo contra -actina. Solo aparecen señales
- correspondientes en los carriles de entrada y flujo continuo, lo que demuestra que el cAb-GFP4 precipita su antígeno con una alta especificidad.
- 55
- Figura 8: Análisis de inmunoprecipitación conjunta. Para confirmar que el fragmento de anticuerpo cAb-GFP4 no solo arrastra a su epítopo sino que también proteínas que interaccionan, se realizó análisis de inmunoprecipitación conjunta expresando un dominio marcado con GFP de Dnmt1 (aa 158-629), que se sabe que interacciona con PCNA. Se llevó a cabo inmunoprecipitación como se ha descrito y la inmunotransferencia se analizó con anticuerpos contra GFP y PCNA. Aunque el GFP-Dnmt1(158-629) precipitado es claramente visible como
- 60
- una banda fuerte en el peso molecular correspondiente, se precipitó conjuntamente también una fracción significativa del PCNA endógeno.
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Figura 9: Reconocimiento de estructuras subcelulares por cromocuerpos inducidos contra epítopos endógenos.
(A) Se transfectaron transitoriamente células de mioblasto murino (C2C12) con el plásmido de
5 expresión del cromocuerpo anti-citoqueratina 8. Después de cinco horas las células se sometieron a microscopía de células vivas. Para obtener una mayor resolución las células se fijaron, se tiñeron con DAPI para detectar ADN y se analizaron mediante microscopía confocal. Se muestra una imagen representativa de un lapso de tiempo de células vivas. La fluorescencia roja en filamentos citoplasmáticos indica el reconocimiento de fibras de citoqueratina.
10 (B) Se transfectaron transitoriamente células HeLa con el plásmido de expresión del cromocuerpo antilaminina. Como se describe en 9 (A) las células que expresaban cromocuerpo anti-laminina se analizaron por microscopía confocal. La fluorescencia roja del cromocuerpo muestra una clara estructura circundante del núcleo, lo que indica la tinción de la lámina nuclear. Barras de escala, 5 m.
15 Figura 10: Comparación de la capacidad de precipitación del agente de unión de GFP con anticuerpos de GFP mono y policlonales. Se incubaron extractos de células 293T productoras de GFP con 1 g de agente de unión de GFP (cAbGFP4) o 2 g de anticuerpos de GFP mono o policlonales y se precipitaron inmunocomplejos con proteína A/G sepharose. Se separaron las alícuotas de entrada (I), flujo continuo
(F) y fracción unida (B) por SDS-PAGE seguido de tinción con coomassie (parte superior) o análisis de
20 inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-GFP (parte inferior). Están marcados con flechas el precipitado GFP, cadenas ligera (lc) y pesada (hc) desnaturalizadas de los IgG y el agente de unión de GFP (cAbGFP4).
Figura 11: Purificación basada en columna de GFP.
25 Se cargaron extractos proteicos de células 293T productoras de GFP en una columna que contenía el agente de unión de GFP (cAbGFP4) acoplado directamente con Sepharose 10. Se eluyeron las proteínas unidas y se separaron alícuotas de entrada (I), flujo continuo (F) y fracción unida (B) por SDS-PAGE y se tiñeron con coomassie.
30 Figura 12: Comparación de la expresión de cAbGFP4 y cAbGFP4 (Cys92 Ser) en células de mamífero Panel superior: detección de la distribución intracelular de cAbGFP4 (original) y cAbGFP4 (Cys 92 Ser) en células 293T humanas en ausencia de antígeno. Panel inferior: detección de la funcionalidad en células 293T humanas
(a) señal de PCNA marcado con GFP 35 (b) señal de cAbGFP4 (original) (panel superior) y cAbGFP4 (Cys 92 Ser) (panel inferior)
(c) la fusión de ambas señales indica accesibilidad mucho mejor de cAbGFP4 (Cys 92 Ser) al núcleo.
Figura 13: Actividad y detección intracelular del agente de unión a GFP recombinante (cAbGFP4) acoplado a Cy5.
40 Inmunotinción de células HeLa que expresan GFP-PCNA con un dominio VHH específico de GFP (cAbGPF4, agente de unión a GFP) acoplado con Cy5-NHS (Amersham). Las células se fijaron con paraformaldehído 3,7. Barra de escala 5 m.
(a) señal de GFP-PCNA
(b) señal de Cy5 acoplado al agente de unión de GFP 45 (c) tinción con DAPI
(d) fusión de (a) y (b)
Los ejemplos ilustran la invención:
50 Ejemplo 1: Identificación y caracterización de un VHH específico de GFP
Para ensayar la viabilidad de crear anticuerpos fluorescentes que puedan expresarse y localizarse en células vivas, los inventores eligieron GFP como la molécula diana. GFP ya se ha fusionado con una diversidad de proteínas con localización subcelular y movilidad bien caracterizadas y por lo tanto proporciona un antígeno bien conocido y “visible”
55 que puede compararse directamente con anticuerpos fluorescentes. La diversidad de fusiones de GFP disponibles permite a los inventores ensayar este enfoque en varios compartimientos subcelulares.
Se aislaron linfocitos de una Ilama alpaca (Lama pacos) inmunizada con GFP recombinante purificada. El repertorio de las regiones variables de la cadena pesada se amplificó por PCR y se clonó en un vector de presentación de fagos. Se 60 obtuvo una biblioteca de VHH de 106 clones individuales en células TG1 de Escherichia coli a partir de las que se recuperó un VHH con especificidad por GFP (cAb-GFP4) después de la presentación de fagos y tres ciclos de selección.
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en el citoplasma incluso cuando es parte de estructuras altamente organizadas.
Para analizar el acceso y actividad del cromocuerpo específico de GFP en otros compartimentos subcelulares, los inventores realizaron estudios de distribución y colocalización usando un componente marcado con GFP de la envoltura nuclear, GFP-laminina B1, como un epítopo. Las lamininas son un componente principal de la lámina nuclear, una estructura fibrosa que reviste la superficie nucleoplasmática de la membrana nuclear. Estudios recientes han mostrado el ensamblaje correcto de GFP-laminina B1 en la lámina nuclear de células de mamífero21. Las células HeLa transfectadas dobles mostraron una clara colocalización de GFP-laminina B1 con cromocuerpo anti-GFP (Figura 4C) lo que demuestra que el cromocuerpo puede entrar en el núcleo, permanece en una conformación funcional y reconoce eficazmente y se une a su antígeno específico. Para investigar la unión de antígeno dentro del nucleoplasma los inventores eligieron el antígeno nuclear de células proliferativas fusionado con GFP (GFP-PCNA). PCNA es un componente central de la maquinaria de replicación de ADN22. GFP-PCNA, de forma similar a su homólogo endógeno, se localiza en sitios de replicación de ADN23,24. Como se ha descrito anteriormente los inventores coexpresaron GFP-PCNA y el cromocuerpo anti-GFP en células HeLa. La sección media confocal mostrada en la Figura 4d revela una tinción conjunta clara de un patrón de replicación de fase S medio en una célula HeLa por GFP-PCNA y el cromocuerpo anti-GFP.
Finalmente, los inventores investigaron la unión del cromocuerpo anti-GFP con una proteína de cromatina marcada con GFP. Para este fin los inventores eligieron una línea celular HeLa estable que expresaba una versión verde fluorescente de la histona H2B (H2B-GFP). Se sabe que esta proteína de fusión se ensambla en nucleosomas como la H2B natural en sí misma25. Después de la transfección y expresión del cromocuerpo anti-GFP los inventores detectaron la colocalización del cromocuerpo rojo con su epítopo verde en una célula en profase (Figura 4e). Las células no transfectadas de esta imagen actúan como un control negativo y muestran que en estas condiciones experimentales no se produce escape de fluorescencia entre el canal verde y el rojo.
Estos resultados muestran que la eficacia de unión del cromocuerpo anti-GFP parece ser independiente del contexto estructural y la localización subcelular del epítopo. Para cuantificar el grado de colocalización se calculó un coeficiente de solapamiento usando el programa adicional de colocalización del software ImageJ que produce de media un solapamiento del 90% -97% de las intensidades de fluorescencia del antígeno y el cromocuerpo. A este respecto, los inventores no pueden distinguir si la unión con el antígeno se produce ya en el citoplasma o justo después de que el epítopo entre en su posición apropiada. Sin embargo los datos de los inventores muestran que las proteínas marcadas con GFP observadas se clasifican correctamente y se integran en las estructuras celulares en presencia del cromocuerpo. Juntos estos datos demuestran que el cromocuerpo anti-GFP reconoce eficazmente y se une su epítopo en el citoplasma así como en compartimientos subnucleares.
Ejemplo 4: El cromocuerpo anti-GFP fluorescente localiza su epítopo a lo largo de diferentes etapas del ciclo celular
A continuación, los inventores investigaron si el cromocuerpo anti-GFP puede usarse para localizar proteínas cuya localización cambia a lo largo del ciclo celular y realizar análisis de lapso de tiempo que localiza dos proteínas nucleares diferentes, la proteína histona H2B y la proteína de replicación PCNA. Como se ha descrito anteriormente, H2B-GFP se ensambla en nucleosomas sin afectar al ciclo celular y permite captura de imágenes de alta resolución de cromosomas mitóticos y cromatina de interfase, revelando diversos estados de condensación de cromatina en las células vivas25. Los inventores transfectaron células HeLa H2B-GFP con el vector de expresión codificante del cromocuerpo anti-GFP y siguieron las células transfectadas y no transfectadas a lo largo del ciclo celular. El análisis mediante lapso de tiempo (Figura 5a) mostró la colocalización del cromocuerpo anti-GFP con H2B-GFP persistente a lo largo de la mitosis. Estos resultados muestran que la expresión del cromocuerpo anti-GFP no afecta a la incorporación de H2B-GFP en cromatina ni a la progresión del ciclo celular.
Como una segunda diana los inventores seleccionaron PCNA, que constituye un reto especial para microscopía de células vivas ya que es un componente esencial y central de la maquinaria de replicación. GFP-PCNA, como el PCNA endógeno en sí mismo, se concentra en focos de replicación en el núcleo durante la fase S temprana a tardía y muestra un patrón difuso en G1 y G223,24. Los inventores siguieron las células que expresaban GFP-PCNA y el cromocuerpo anti-GFP desde la fase S temprana hasta G2 tomando grupos de imágenes tridimensionales confocales cada 20 minutos. Los resultados se resumen en la Figura 5b y se muestran completamente en la información complementaria, en el video en línea. Tanto GFP-PCNA como el cromocuerpo mostraron cambios idénticos en su distribución subnuclear a lo largo de las fases S y G2. A partir de la asociación altamente específica del cromocuerpo anti-GFP con GFP-PCNA y la colocalización observada a lo largo de la fase S los inventores concluyeron que el cromocuerpo anti-GFP localiza GFP-PCNA en el núcleo a lo largo del ciclo celular sin alterar la replicación de ADN y progresión a fase S.
Estos análisis de lapso de tiempo muestran que pueden localizarse componentes de cromatina integrales como H2B así como componentes esenciales de la maquinaria de replicación por un cromocuerpo específico sin afectar a la progresión y viabilidad del ciclo celular.
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