CN110759999A - 一种gfp抗体制备方法及其载体 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种GFP抗体的制备方法及其载体。所述制备方法包括：对羊驼进行GFP免疫；通过免疫后的羊驼的外周血淋巴细胞，构建噬菌体文库；从所述噬菌体文库中筛选对应的GFP抗体基因序列；表达纯化所述GFP抗体基因序列。该制备方法采用了噬菌体展示方法筛选得到的抗体基因序列在毕氏酵母中进行表达纯化。使得整个抗体制备过程可以被标准化和批次化，制备抗体的批次间差异小，稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及一种GFP抗体的制备方法及其载体。
背景技术
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一种最初在水母中发现的，在蓝色波长范围内照射会发出绿色荧光的一种蛋白质。基于其受激发后发光的特性，GFP成为了生物技术上非常常用的工具。
GFP作为一种最早发现并被广泛应用的荧光蛋白，在生物学研究中作为报告基因和标签工具被广泛地使用，用以实现抗体定量检测等功能。当GFP被当作标签工具使用时，通常需要使用GFP的抗体来对连接GFP标签的目标分子进行分离和纯化。
传统GFP抗体为典型的Y字形复杂结构。如图1所示，该Y字形结构的抗体由两个重链和两个轻链组成，具有与抗原特异性结合的可变区。而这些传统的GFP抗体通常是由动物血清或者杂交瘤细胞表达制备获得。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术中存在如下的技术问题：由于传统GFP抗体的分子量大，结构复杂。因此，其使用条件较为苛刻，抗体耐受性差，构成反应体系的缓冲液也受到限制。
另外，利用动物血清或者杂交瘤细胞表达制备获得的抗体在不同的制作批次之间会具有很大的不稳定性，影响了实验的效果。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种GFP抗体的制备方法及其载体，旨在解决现有技术中GFP抗体的使用条件苛刻、耐受性较差，容易出现重链或者轻链污染的问题。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：一种GFP抗体的制备方法。
所述制备方法包括如下步骤：
对羊驼进行GFP免疫；通过免疫后的羊驼的外周血淋巴细胞，构建噬菌体文库；从所述噬菌体文库中筛选对应的GFP抗体基因序列；表达纯化所述 GFP抗体基因序列。
所述的制备方法，其中，所述对羊驼进行GFP免疫具体包括：
使用大肠杆菌重组表达的带His标签的GFP蛋白作为抗原；使用 GERBU-LQ与所述抗原混合乳化后作为免疫原，注射到羊驼中进行免疫。
所述的制备方法，其中，所述构建噬菌体文库具体包括：
分离制备羊驼免疫后的外周血淋巴细胞；提取所述外周血淋巴细胞的RNA；反转录所述RNA为cDNA；使用PCR特异性扩增所述cDNA的抗体片段；将扩增后的抗体片段克隆至噬菌体质粒中；将克隆有所述抗体片段的噬菌体质粒转入感受态细胞；通过所述感受态细胞，扩增和纯化所述噬菌体文库。
所述的制备方法，其中，所述从所述噬菌体文库中筛选对应的GFP抗体基因序列，具体包括：
A、包被免疫管；B、封闭免疫管及噬菌体文库；C、在免疫管中孵育抗原和噬菌体；D、清洗孵育后的免疫管若干次；E、洗脱筛选。
所述的制备方法，其中，所述洗脱筛选具体包括：向孵育后的免疫管中加入1mL100mM Trimethymime，并室温孵育10分钟；室温孵育10分钟后，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime并洗脱；将洗脱噬菌体转移到新的离心管中；
洗脱后的噬菌体重新进行扩增和纯化；
在噬菌体扩增和纯化后，重复所述步骤A到步骤E两次，逐次将包被免疫管的抗体量减半，获得目标洗脱噬菌体。
所述的制备方法，其中，所述清洗孵育后的免疫管若干次，具体包括：
用含有0.01％吐温的PBS清洗所述孵育后的免疫管20次；每次清洗时间为5分钟。
所述的制备方法，其中，包被免疫管具体包括：
将100ug GFP抗体加入到2mL PBS中；将所述混合物加入到免疫管中，在4摄氏度下，过夜孵育。
本发明实施例还提供了一种载体。所述载体包含如上所述的制备方法获得 GFP抗体基因序列。
所述的载体，其中，所述载体为用于表达所述GFP抗体基因序列的表达载体。
有益效果：本发明提供的技术方案中提供了一种抗GFP的抗体制备方法。该制备方法采用了噬菌体展示方法筛选得到的抗体基因序列在毕氏酵母中进行表达纯化。使得整个抗体制备过程可以被标准化和批次化，制备抗体的批次间差异小，稳定性高。
进一步地，应用该方法制备获得的GFP抗体为驼类单域抗体，具有分子量小，结构简单的特性，可以有效的减少纯化后的下游应用中重链和轻链的污染，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为典型抗体的结构示意图。
图2为本发明实施例提供的GFP抗体制备方法的方法流程图。
图3为本发明实施例提供的步骤120的方法流程图。
图4为本发明实施例2使用的载体的结构示意图。
图5为本发明实施例6的电泳结果示意图。
SEQ ID 1为本发明实施例的GFP抗体的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明提供一种GFP抗体的制备方法及其载体。为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
本发明实施例提供了一种GFP抗体的制备方法。该制备方法通过噬菌体展示方法筛选获得目标的抗体基因片段，并进一步将该目标基因片段在毕氏酵母中表达纯化，使得整个GFP抗体的制备过程可以被标准化和批次化，有效的减少了不同生产批次之间抗体的差异，保证了生物实验的一致性。
图2为本发明实施例提供的GFP抗体的制备方法的方法流程图。如图2 所示，所述方法包括如下步骤：
110、对羊驼进行GFP免疫。
通过向羊驼注射相应的GFP免疫原可以刺激羊驼产生相应的抗GFP抗体。具体免疫的过程可以根据实际情况或者常规实验结果得出。
具体的，所述GFP免疫过程具体包括：
首先，使用大肠杆菌重组表达的带His标签的GFP蛋白作为抗原。然后，使用GERBU-LQ与所述抗原混合乳化后作为免疫原，注射到羊驼中进行免疫。
120、通过免疫后的羊驼的外周血淋巴细胞，构建噬菌体文库。
基于免疫完成以后的羊驼的外周血淋巴细胞可以通过反转录等方式，构建相应的噬菌体文库，用以作为筛选的基础。
噬菌体文库的构建是本制备方法的重要步骤，噬菌体文库直接影响到后续的筛选过程。在一些实施例中，如图3所示，所述构建噬菌体文库的方法具体可以包括如下步骤：
121、分离制备羊驼免疫后的外周血淋巴细胞。
122、提取所述外周血淋巴细胞的RNA。
123、反转录所述RNA为cDNA。
124、使用PCR特异性扩增所述cDNA的抗体片段。
125、将扩增后的抗体片段克隆至噬菌体质粒中。
126、将克隆有所述抗体片段的噬菌体质粒转入感受态细胞。
127、通过所述感受态细胞，扩增和纯化所述噬菌体文库。
所述感受态细胞具体可以采用合适的方式实现转化。具体的，该感受态细胞可以采用SS320感受态细胞。
130、从所述噬菌体文库中筛选对应的GFP抗体基因序列。
所述筛选的过程具体可以通过如下依次序执行的步骤完成，获得最终的目标基因序列(抗GFP抗体的基因)：A、包被免疫管。B、封闭免疫管及噬菌体文库。C、在免疫管中孵育抗原和噬菌体。D、清洗孵育后的免疫管若干次。 E、洗脱筛选。
140、表达纯化所述GFP抗体基因序列。
获得的GFP抗体基因序列在与表达载体连接后，可以在酵母表达体系中，通过毕氏酵母等进行表达，从而大量的制备所需要的GFP抗体。
基于图2和图3所示的制备方法，本发明实施例还进一步提供了一种载体，该载体与目标的GFP抗体基因连接，可以用作表达载体或者扩展载体，进行 GFP抗体的制备。
以下结合具体实施例，详细描述该GFP抗体的制备过程。
实施例1(羊驼免疫)：
11、使用大肠杆菌重组表达的带His标签的GFP蛋白作为抗原，与 GERBU-LQ(Gerbu，货号3030.0100)混合乳化后作为免疫原。
12、使用上述处理后的免疫原对2只羊驼每2周进行一次免疫，每次使用乳化后的免疫原2mg注射羊驼颈部淋巴节附近。分别在第4、5、6次免疫后 3-4天由羊驼颈动脉抽血20ml至抗凝管中，完成羊驼免疫处理。
实施例2(构建噬菌体文库)：
13、将从免疫羊驼中抽取的血液和白细胞分离液按1:1比例混合后，在室温下，400g离心30分钟，并用移液枪将中间棉状层上层免疫细胞吸出。
14、向吸出的免疫细胞加入PBS缓冲液直至10mL后，在室温下，200g 离心20分钟去上清后，再次加入PBS缓冲液5mL，在室温下，200g离心20 分钟去上清。
15、清洗干净后的免疫细胞加入1mL Trizol后混匀，得到免疫羊驼的外周血淋巴细胞并保存在-20度冰箱中备用。
16、将提取获得的外周血淋巴细胞转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿混匀后，在室温下静置5分钟，然后4摄氏度下，12000g低温离心15 分钟。
17、离心后的上清液转移到新的离心管并向该离心管中加入0.5-1倍体积的异丙醇。加入异丙醇室温静置10分钟后，在4摄氏度下，12000g低温离心 10分钟。
18、使用与Trizol保存的外周血淋巴细胞等体积的75％乙醇清洗离心管中的沉淀，并在4摄氏度下，7500g低温离心5分钟后，将沉淀溶解于适量的无 RNA酶的水中，完成外周血淋巴细胞的RNA提取。
19、在RNA提取完毕后，使用反转录试剂盒，将提取到的外周血淋巴细胞的RNA反转录为cDNA。
20、通过PCR从反转录的cNDA中扩增特定的抗体基因片段。
在本实施例中，该PCR反应体系为：cDNA模板2ul，ALPVH-C引物2ul， CALL002引物2ul，10X TaqBuffer 5ul，dNTP 4ul，Taq(HS)0.25ul，ddH2O 补足到50ul。
PCR的反应条件为：98摄氏度3分钟；95摄氏度30秒，57摄氏度30 秒，68摄氏度40秒，每个循环增加2秒，重复22个循环；68摄氏度5分钟。
21、将得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳的结果显示：PCR扩增产物形成长度为1.0kb左右和0.7kb左右的两条条带。在琼脂糖凝胶电泳后，使用DNA纯化试剂盒，对0.7kb大小的条带切胶回收。
22、继续对回收后DNA片段中再次进行PCR，扩增特定的抗体片段。
本次PCR扩增的反应体系为：DNA模板2ul，Rvhh-FP引物2ul，Rvhh-RP 引物2ul，10XTaq Buffer 5ul，dNTP 4ul，Taq(HS)0.25ul，ddH2O补足到50ul。
PCR的反应条件为：98摄氏度3分钟；95摄氏度50秒，55摄氏度30 秒，72摄氏度40秒，重复12个循环；72摄氏度10分钟。
23、将PCR扩增产物再次使用DNA纯化回收试剂盒进行DNA回收。
24、扩增得到的抗体基因序列和pADL-10b使用BglI酶切。
酶切体系为：扩增基因12ug或者pADL-10b载体3ug，10X BglI Buffer 3ul, BglI4.5ul,补足水到30ul。酶切反应条件为：在37摄氏度下，反应3-4小时。
图4为本发明实施例使用的载体质粒的结构示意图。如图4所示，扩增基因和载体可以在酶切以后连接形成表达载体。
25、酶切后使用DNA纯化回收试剂盒回收酶切完成的载体和扩增抗体基因。
26、对回収后的载体和扩增抗体基因进行连接反应(4摄氏度下过夜反应) 并回収连接产物。连接产物使用超纯水进行溶解。
在本实施例中，连接反应体系为：pADL-10b载体200ng，扩增抗体基因 80ng，Takara T4连接酶2ul，10X连接缓冲液5ul，加水直至50ul。
27、将电转杯置于冰上预冷，待SS320感受态细胞融化后加入1ul连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的Bacteria转化程序电击转化。
28、电转后立即往电转杯中加入1mL SOC培养基，将细胞37度复苏60 分钟后涂在含有四环素和氨苄抗性的LB培养板上过夜生长。
29、将在培养板上的细胞用LB培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20％的甘油后保存在-80摄氏度下备用。
30、进行细胞计数，将数目约为10^9个转化细胞转移到100mL预先加入四环素和氨苄抗生素的2XYT培养液中，37度220rpm培养直至OD600达到 0.5。
31、以细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后，继续37摄氏度下培养30分钟。加入终浓度为的卡那霉素和0.2mM的IPTG，30摄氏度下过夜培养。
32、将过夜培养的细胞在4摄氏度下，13000rpm低温离心5分钟后，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的5X PEG8000/NaCl并在冰上孵育30分钟。
33、孵育后，在4摄氏度下，13000rpm离心10分钟去除上清后加入1mL PBS缓冲液溶解沉淀。
34、继续加入250ul 5X PEG8000/NaCl并在冰上孵育10分钟，4摄氏度下，16000g离心15分钟后去除上清并将沉淀溶解在1mLPBS中，制备获得噬菌体库。
实施例3(筛选目标片段)：
35、向每个免疫管中加入100ug GFP抗体以及2mL PBS，4摄氏度下过夜孵育以包被免疫管。
36、扩增和纯化噬菌体文库后的噬菌体500ul加入到1mL 3％BSA中，室温旋转孵育2h。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3％BSA，室温旋转孵育2h。
37、将步骤35封闭好后的免疫管用含有0.01％吐温的PBS洗3次，每次 5分钟。然后，将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1h。
38、将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.01％吐温的PBS洗20次，每次5分钟。
39、往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入 1M Tris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。
40、洗脱的噬菌体重新进行扩增和纯化噬菌体文库的步骤。在扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗体量，最终获得3次筛选后的洗脱噬菌体。
在筛选获得包含目标基因片段的洗脱噬菌体以后，可以采用ELISA鉴定和NativeSDS-PAGE胶鉴定两种不同的方法，在不同的分子层次对筛选结果进行鉴定。
实施例4(ELISA鉴定)：
首先，将筛选得到的噬菌体稀释10^6倍后，取100ul加入到OD600为0.5 的SS320菌液中，37摄氏度培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2XYT 培养板上，37摄氏度过夜培养第二天得到单克隆菌落。
然后，挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2XYT培养液的 96孔细胞培养板上，37摄氏度培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1 的辅助噬菌体，30度过夜培养，并在第二天将过夜培养后的细胞液离心，获得上清液。
然后，将过夜包被GFP抗原和用3％BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步骤获得的上清液，室温孵育1h。孵育后用含有0.05％吐温的PBS清洗3次，使用anti-fd-Bacteriophage抗体(SIGMA，货号B7786-.2ML)作为一抗，用偶连HRP的anti-Rabbit抗体(CWBIO，货号CW0103S)作为二抗，当 TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。
最后，选取吸光值读数最高的SS320菌落作为样本进行DNA测序，鉴定获得GFP抗体的基因序列。
实施例5(Native SDS-PAGE胶鉴定)：
首先，挑取上述实施例1中的SS320菌落接种于3mL含有四环素和氨苄霉素的2XYT培养液，37摄氏度培养直至OD600达到0.6。
然后，加入0.2uM IPTG继续培养3-6小时后，离心收集菌体沉淀并加入 100ul裂解液，在室温下静置10分钟后，离心取上清。取制备获得的18ul上清液与1ul GFP蛋白孵育20分钟。
最后，将孵育后的混合液进行Native SDS-PAGE电泳，取1ul GFP蛋白作为对照。图5为电泳胶的结果示意图。在图5中，泳道1为GFP对照蛋白条带，泳道2为GFP与本发明实施例提供的GFP抗体结合后的条带。图5的电泳结果显示：表面本抗体能够与GFP抗原结合。
基于上述制备方法实施例制备的GFP抗体是一种抗GFP的抗体，能够特异性的与GFP结合，用以连接GFP标签的目标分子进行分离和纯化。
所述GFP抗体是驼类单域抗体，其具有较为简单的单链结构，只含有一条重链，分子量在15KD左右。
这样的抗体结构简单而且分子量小，可以使抗体很好的适用于各种不同的使用条件，并且纯化后的下游应用不会出现典型Y型抗体的重链和轻链污染，简化了生物技术实验的操作流程，提高了实验的准确性。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳市康体生命科技有限公司
<120> GFP抗体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 1
Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Val Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Asp Met Gly Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Ser Ile Thr Ser Gly Lys Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Leu Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Arg Thr
115 120
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 2
atggccgacg tgcagctgca ggagtccggc ggcggcctgg tgcagcccgg cggctccctg 60
cgcctgtcct gcgccgcctc cggcatcgtg ttctccatct acgacatggg ctggcaccgc 120
caggcccccg gcaagcagcg cgagctggtg gcctccatca catccggcaa gaacacaaac 180
tacgccgact ccgtgctggg ccgcctgaca atctcccgcg acaactccaa gaacacagtg 240
tacctgcaga tgaactccct gaagcccgag gacacagccg tgtactactg caacgcccgc 300
tccctgctgt acgactactg gggccagggc acacaggtga cagtgtcctc cggccgcaca 360
Claims (9)
1.一种GFP抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
对羊驼进行GFP免疫；
通过免疫后的羊驼的外周血淋巴细胞，构建噬菌体文库；
从所述噬菌体文库中筛选对应的GFP抗体基因序列；
表达纯化所述GFP抗体基因序列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述对羊驼进行GFP免疫具体包括：
使用大肠杆菌重组表达的带His标签的GFP蛋白作为抗原；
使用GERBU-LQ与所述抗原混合乳化后作为免疫原，注射到羊驼中进行免疫。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述构建噬菌体文库具体包括：
分离制备羊驼免疫后的外周血淋巴细胞；
提取所述外周血淋巴细胞的RNA；
反转录所述RNA为cDNA；
使用PCR特异性扩增所述cDNA的抗体片段；
将扩增后的抗体片段克隆至噬菌体质粒中；
将克隆有所述抗体片段的噬菌体质粒转入感受态细胞；
通过所述感受态细胞，扩增和纯化所述噬菌体文库。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述从所述噬菌体文库中筛选对应的GFP抗体基因序列，具体包括：
A、包被免疫管；
B、封闭免疫管及噬菌体文库；
C、在免疫管中孵育抗原和噬菌体；
D、清洗孵育后的免疫管若干次；
E、洗脱筛选。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱筛选具体包括：
向孵育后的免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，并室温孵育10分钟；
室温孵育10分钟后，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime并洗脱；
将洗脱噬菌体转移到新的离心管中；
洗脱后的噬菌体重新进行扩增和纯化；
在噬菌体扩增和纯化后，重复所述步骤A到步骤E两次，逐次将包被免疫管的抗体量减半，获得目标洗脱噬菌体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述清洗孵育后的免疫管若干次，具体包括：
用含有0.01％吐温的PBS清洗所述孵育后的免疫管20次；每次清洗时间为5分钟。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包被免疫管具体包括：
将100ug GFP抗体加入到2mL PBS中；
将所述混合物加入到免疫管中，在4摄氏度下，过夜孵育。
8.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1-7任一所述的制备方法获得GFP抗体基因序列。
9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于，所述载体为用于表达所述GFP抗体基因序列的表达载体。
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2018
- 2018-07-27 CN CN201810839333.1A patent/CN110759999A/zh active Pending
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