CN107924164A - 定量的基于fret的相互作用测定 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种基于FRET的蛋白质相互作用测定，所述测定能够确定两种蛋白质之间的相互作用的解离常数，即使是存在蛋白质污染物。

Description

定量的基于FRET的相互作用测定
对相关申请的交叉引用
本申请依照35U.S.C.§119要求2015年6月22日提交的临时申请序列号62/183,179的优先权，该临时申请的公开内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开提供了一种基于FRET的测定，所述测定能够确定两种蛋白质之间的相互作用的蛋白质相互作用解离常数(Kd)或其它生化参数，如Kcat、Km、以及Ki，即使是存在蛋白质污染物或未纯化的蛋白质或其它生物分子。
背景技术
蛋白质-蛋白质相互作用在大部分的生理过程中具有关键的作用。在后基因组时代，蛋白质-蛋白质相互作用和结构的全基因组研究已经有效地鉴定了针对各种人类疾病的物理上相互作用的参与者和潜在的药物靶标。用于描述蛋白质-蛋白质相互作用亲和力的最重要的参数之一是解离常数Kd。Kd已经通过许多技术来确定，包括表面等离子体共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、以及放射性配体结合测定。
发明内容
本公开提供了一种创新性的定量的基于福斯特共振能量传递(ForesterResonance Energy Transfer，FRET)的蛋白质相互作用测定以在细胞环境和全细胞系统中在多种污染蛋白质存在下确定两种蛋白质之间的解离常数(Kd)。
本公开提供了一种基于福斯特共振能量传递(FRET)的分子相互作用方法以在一种或多种污染物分子存在下确定两种分子之间的解离常数(Kd)。所述方法包括提供混合物，所述混合物包含含有FRET供体的工程化的第一分子和含有FRET接受体的工程化的第二分子，其中所述混合物可以进一步包含一种或多种污染物分子；确定绝对FRET发射信号值(EmFRET)；通过使用非线性回归和测量通过激发FRET对、来自固定浓度的FRET供体/第一分子和不同浓度的FRET接受体/第二分子的发射，来确定由FRET接受体/第二分子结合的FRET供体/第一分子的最大量(EMFRET最大)；以及通过使用非线性回归和下式确定第一分子和第二分子的Kd：
其中A是FRET供体/第一分子的总浓度，并且X是FRET接受体/第二分子的总浓度。在一个实施方案中，可以使用下式确定EMFRET：
EmFRET＝FLDA-α*FLDD-β*FLAA
其中FLDA是在FRET供体被第一波长的光激发并且向FRET接受体传递能量时所测量的荧光发射，FLDD是在被第二波长的光激发时FRET供体/第一分子的荧光发射，并且FLAA是在被第三波长的光激发时FRET接受体/第二分子的荧光发射，α是通过使用游离的FRET供体/第一分子确定的常数，并且β是通过使用游离的FRET接受体/第二分子所确定的常数。在另一个实施方案中，所述FRET供体是CyPet。在又另一个或进一步的实施方案中，所述FRET接受体是YPet。在任一前述实施方案的另一个实施方案中，所述第一分子和第二分子独立地选自由以下各项组成的组：肽、多肽、蛋白质、核酸分子、脂质以及多糖。举例来说，在一个实施方案中，所述第一分子和第二分子可以各自是肽、多肽或蛋白质。在又另一个实施例中，所述第一分子可以包含核酸并且所述第二分子可以包含DNA结合蛋白。在另一个实施例中，所述第一分子可以是酶并且所述第二分子可以是碳水化合物、脂质或脂蛋白。在另一个实施方案中，所述第一分子和第二分子分别是酶和它的底物。在另一个实施方案中，所述第一分子和第二分子分别是受体和它的配体。在又另一个实施方案中，第一分子和第二分子分别是抗体和它的抗原。在又另一个实施方案中，光的第一波长是400nm至800nm。在一个实施方案中，包含FRET供体的第一分子包括融合蛋白。在另一个或进一步的实施方案中，包含FRET接受体的第二分子包括融合蛋白。在另一个实施方案中，所述第一分子和第二分子在同一细胞中表达。在又另一个实施方案中，在完整细胞中确定Kd。在再另一个实施方案中，在破裂的细胞制备物中确定Kd。在另一个实施方案中，所述第一分子和第二分子被表达和分离并且与污染物分子混合。在另一个实施方案中，包含FRET供体的第一分子包括工程蛋白。在另一个实施方案中，包含FRET接受体的第二分子包括工程蛋白。在再另一个实施方案中，所述第一分子或第二分子包含DNA。在另一个实施方案中，所述第一分子或第二分子包含脂质。在又另一个实施方案中，所述第一分子或第二分子包含多糖。
附图说明
图1A-B提供了用于在竞争剂和/或污染物存在下，确定蛋白质相互作用解离常数Kd的基于FRET的测定的示意图。(A)在其它蛋白质/污染物存在下，相互作用蛋白质CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的荧光激发和发射信号的示意图。(B)通过FRET和荧光信号确定Kd的公式。
图2A-B呈现了荧光信号分析和FRET信号的滴定。(A)用递增浓度的YPetUbc9进行FRET信号滴定。(B)FRET和荧光信号的分级分离。
图3A-D呈现了在存在或不存在其它蛋白质的情况下，在不同浓度的纯化的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9下的EmFRET。(A)在纯化的YPetUbc9的浓度递增的情况下，在0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM的纯化的CyPetRanGAP1c下EmFRET的图表。(B)在1μg BSA存在下、在纯化的YPetUbc9的浓度递增的情况下，在0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM的纯化的CyPetRanGAP1c下EmFRET的图表。(C)在1μg、3μg、10μg的细菌蛋白质提取物存在下、在纯化的YPetUbc9的浓度递增的情况下，在0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM的纯化的CyPetRanGAP1c下EmFRET的图表。(D)在来自粗制细菌提取物的未纯化的YPetUbc9的浓度递增的情况下，在0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM的未纯化的CyPetRanGAP1c下EmFRET的图表。
图4A-C呈现了在FRET测定中蛋白质混合物的考马斯(commassie)染色的SDS-PAGE凝胶。(A)泳道1：0.2μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9；泳道2：0.2μM CyPetRanGAP1c+1μMYPetUbc9+1μg BSA；泳道3：0.2μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+3μg BSA；泳道4：0.5μMCyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9；泳道5：0.5μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+1μg BSA；泳道6：0.5μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+3μg BSA；泳道7：1.0μM CyPetRanGAP1c+1μMYPetUbc9；泳道8：1.0μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+1μg BSA；泳道9：1.0μMCyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+3μg BSA；(B)泳道1：CyPetRanGAP1c；泳道2：YPetUbc9；泳道3：0.2μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+1μg大肠杆菌上清液；泳道4：0.2μMCyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+3μg大肠杆菌上清液；泳道5：0.2μM CyPetRanGAP1c+1μMYPetUbc9+10μg大肠杆菌上清液；泳道6：0.5μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+1μg大肠杆菌上清液；泳道7：0.5μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+3μg大肠杆菌上清液；泳道8：0.5μMCyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+10μg大肠杆菌上清液；泳道9：1.0μM CyPetRanGAP1c+1μMYPetUbc9+1μg大肠杆菌上清液；泳道10：1.0μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+3μg大肠杆菌上清液；泳道11：1.0μM CyPetRanGAP1c+1μM YPetUbc9+10μg大肠杆菌上清液；(C)泳道1：0.2μM CyPetRanGAP1c上清液(未纯化)；泳道2：0.5μM CyPetRanGAP1c上清液(未纯化)；泳道3：1.0μM CyPetRanGAP1c上清液(未纯化)；泳道4：0.2μM YPetUbc9上清液(未纯化)；泳道5：0.5μM YPetUbc9上清液(未纯化)；泳道6：1.0μM YPetUbc9上清液(未纯化)；泳道7：0.2μMCyPetRanGAP1c上清液(未纯化)+1.0μM YPetUbc9上清液(未纯化)；泳道8：0.5μMCyPetRanGAP1c上清液(未纯化)+1.0μM YPetUbc9上清液(未纯化)；以及泳道9：1.0μMCyPetRanGAP1c上清液(未纯化)+1.0μM YPetUbc9上清液(未纯化)。
图5A-C呈现了在不存在和存在其它蛋白质的情况下，在不同浓度的供体CyPetRanGAP1c下的EmFRET最大。(A)最大FRET发射与测定中CyPetRanGAP1c的量成比例。(B)在不同浓度的CyPetRanGAP1c下EmFRET最大的条形图。(C)在不同浓度的CyPetRanGAP1c下Kd的条形图。
图6A-B提供了通过表面等离子体共振确定相互作用亲和力Kd。(A)确定融合蛋白CyPetRanGAP1c与YPetUbc9之间相互作用的Kd。Kd是0.182μM。(B)确定Aos1与Uba2之间的Kd，0.097μM。
具体实施方式
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指代对象。因此，举例来说，提到“一种测定”时，包括多种这样的测定，并且提到“所述蛋白质”时，包括提到本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质或其等同物，诸如此类。
此外，除非另外说明，否则使用“或”意指“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”以及“包括(including)”是可互换的并且不意图具限制性。
应当进一步了解的是，在对各种实施方案的说明使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员应当了解，在一些特定情况下，可以替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述一个实施方案。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语所具有的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。尽管在实施所公开的方法和组合物时可以使用与本文所述的方法和试剂相似或等同的许多方法和试剂，但现在描述了示例性方法和材料。
本文所提到的所有出版物均以引用的方式整体并入本文以实现描述和公开可能结合本文中的说明使用的方法的目的。提供上文以及贯穿全文所论述的出版物仅仅是因为其在本申请的申请日之前公开。本文的任何信息并不被理解为承认本申请的发明人无权因在先的公开而先于所述公开。此外，对于在出版物中存在的与在本公开中已经明确定义的术语相似或相同的任何术语，在所有方面将以如在本公开中所明确提供的术语的定义为准。
在细胞或生物系统中分子相互作用对于生物活性和生命来说起到了关键的作用。举例来说，核酸与调节基因表达的DNA结合蛋白之间的相互作用、酶与底物之间的相互作用、细胞受体与它的配体之间的相互作用、脂质与受体之间的相互作用等。确定这样的相互作用的特征有助于了解这样的分子的生物作用以及调节和操纵它们的相互作用的方法。
举例来说，蛋白质在健康或疾病系统中的细胞过程中起到了关键的作用。实际上，蛋白质很少具有单一功能；基本上所有的细胞功能都涉及蛋白质-蛋白质相互作用。方法学已经成为研究蛋白质相互作用的核心组成部分，它旨在定义蛋白质功能。蛋白质相互作用在本质上是动态的，并且稳定的相互作用和瞬时的相互作用的复杂混合物，甚至是污染蛋白常常共存并且可影响Kd。因此，研究蛋白质相互作用并非毫无困难。
用于鉴定相互作用的基于亲和力的方法已经发展到涵盖具有研究不同生物系统的能力的多种技术。解离常数Kd通常用于确定形成非共价键的蛋白质之间的相互作用。用于确定Kd的经典方法，如SPR、ITC、放射性配体结合以及超速离心法具有它们的优势。但是这些方法通常需要繁重的程序和昂贵的仪器，并且此外，限于表征两种纯化的蛋白质之间的相互作用。
解离常数Kd可以通过许多不同的方法来确定，包括荧光测定法、表面等离子体共振(SPR)、ITC、放射性标记以及超速离心法等。这些方法提供了实验方便，但是也具有一些缺点。它们常常需要环境不友好的标记或昂贵的仪器。此外，在测试样品包含破裂的细胞系统、全细胞、细胞级分或污染蛋白质时，这些方法不可靠。等温滴定量热法(ITC)需要相对大量(即微摩尔范围)的样品并且因此可能不适用于高亲和力结合(即约5nM的Kd)。它也需要一件相对昂贵的专用设备。超速离心法可能干扰结合蛋白质与游离蛋白质之间的平衡，特别是如果解离速率较快的话，并且因此，使用这样的方法确定的Kd值可能不代表真实的平衡常数。最后，外周蛋白可以在高速离心期间非特异性吸附在试管壁上。内源荧光法需要在蛋白质结合表面附近存在色氨酸部分，并且因此，色氨酸荧光变化可能不定量地反映蛋白质结合的程度。所述方法的相对低的灵敏度需要使用微摩尔蛋白质浓度来进行测定。
福斯特共振能量传递(FRET)方法一般比内源荧光测量更灵敏并且在测定设计方面提供更大的灵活性。尽管FRET方法与内源荧光测量在缺点上共有一定的相似性，但是使用荧光蛋白可以减轻这些问题。FRET对的选择允许调控测定的灵敏度。
本文所公开的方法利用高灵敏度的FRET对。另外的考虑因素是FRET对不会不利地影响标记分子的活性。示例性FRET对包括例如CyPet和YPet。这些FRET对不会在任何显著的程度上不利地影响标记分子。其它FRET对和荧光分子是本领域已知的，描述于本文中并且可以用于本公开的方法和组合物中。
如本文所用的术语“荧光蛋白”指的是当被适当的电磁辐射激发时能够发荧光的任何蛋白质。这包括氨基酸序列是天然的或被工程化的荧光蛋白。许多刺胞动物使用绿色荧光蛋白(“GFP”)作为生物发光中的能量传递接受体。如本文所用的绿色荧光蛋白是发绿光的蛋白质，并且蓝色荧光蛋白是发蓝光的蛋白质等。GFP已经从太平洋西北地区水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)、海肾(Renilla reniformis)、以及Phialidiumgregarium中分离。来自这些生物体的蛋白质已经被克隆、测序和工程化并且是本领域公知的，包括它们的一级序列和三级序列。举例来说，具有有用的激发和发射光谱的多种多管水母属(Aequorea)相关GFP已经通过修饰来自维多利亚多管发光水母的天然存在的GFP的氨基酸序列而被工程化。(Prasher等,Gene,111:229-233(1992)；Heim等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:12501-04(1994)；1994年11月10日提交的美国专利号5,625,048；1995年11月10日提交的国际申请PCT/US95/14692)。
本公开提供了至少一对分子(例如合成或重组多肽)，其包括第一荧光部分和第二荧光部分，在适用于FRET的所述对分子的每一个分子上有一个。荧光部分可以包括染料、荧光氨基酸、荧光蛋白等。所述分子对可以是经历相互作用(例如肽-肽、多肽-肽、蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-脂质、蛋白质-碳水化合物、核酸-核酸等)的任何分子。在一些实施方案中，标记包含荧光蛋白，所述荧光蛋白作为融合构建体(例如融合蛋白)的一部分被并入所述分子中。荧光蛋白可以包括绿色荧光蛋白(例如GFP、eGFP、AcGFP、TurboGFP、Emerald、Azami Green、以及ZsGreen)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、Sapphire、以及T-Sapphire)、蓝绿色荧光蛋白(例如ECFP、mCFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、以及MidoriishiCyan)、黄色荧光蛋白(例如EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellow1、以及mBanana)、以及橙色和红色荧光蛋白(例如Kusabira Orange、mOrange、dTomato、dTomato-Tandem、DsRed、DsRed2、DsRed-Express(T1)、DsREd-Monomer、mTangerine、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRed1、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlum以及AQ143)。其它荧光蛋白描述于本领域中(Tsien,R.Y.,Annual.Rev.Biochem.67:509-544(1998)；Shaner等,Nat.Methods,2(12):905-909,增刊(2005)；以及Lippincott-Schwartz等,Science300:87-91(2003))。如上所述，所述分子可以是融合构建体，如融合多肽，它包括在所关注的蛋白质或多肽的N末端或C末端处偶联的荧光部分(例如荧光蛋白)。荧光部分可以经由如本领域所述的肽接头来偶联(美国专利号6,448,087；Wurth等,J.Mol.Biol.319:1279-1290(2002)；以及Kim等,J.Biol.Chem.280:35059-35076(2005)，这些参考文献以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，合适的接头可以具有约8个-12个氨基酸的长度。
通常，包含荧光部分(FRET对)的分子是彼此的配体或彼此的同源物(例如蛋白质受体和配体、抗体和抗原、核酸和结合蛋白、脂质和受体等)。
包含FRET对的供体部分或接受体部分的本公开的分子可以使用例如肽或核酸合成仪来化学合成或可以使用本领域已知的技术重组产生。这样的技术包括克隆多核苷酸序列，所述多核苷酸序列例如编码所关注的多肽以使得它与荧光部分(例如荧光蛋白)可操作地连接。
术语“多核苷酸”或“核酸”指的是核苷酸的聚合形式。“分离的多核苷酸”意指与其在所来源生物体的天然存在基因组中所紧邻的两个编码序列(一个在5'末端并且一个在3'末端)不再紧邻的多核苷酸。因而，术语“分离的多核苷酸”包括例如重组DNA，它可以被并入载体中，包括自主复制的质粒或病毒；或并入到原核或真核细胞或生物体的基因组DNA中；或作为独立于其它序列的单独的分子(例如CDNA)存在。本公开的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式，并且多核苷酸可以是单链的或双链的。
术语“可操作地连接/操作性地连接”指的是其中如此描述的组分处于容许它们以它们预期的方式起作用的关系中的并置。对于可操作地连接的核酸，每一个不同的核酸分子以这样的方式连接以编码对于预期目的来说具有功能性的多肽。举例来说，与编码序列可操作地连接的表达控制序列被连接以使得编码序列的表达在与表达控制序列相容的条件下实现。
如本文所用的术语“表达控制元件”指的是核酸，所述核酸调节与它可操作地连接的多核苷酸的表达。当表达控制元件控制和调节核酸的转录和在适当时翻译时，所述表达控制元件与所述核酸可操作地连接。因此，表达控制元件可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白质编码核酸序列前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以容许mRNA的正确翻译、以及终止密码子。术语“控制结构域”意图至少包括其存在可以影响表达的组分，并且也可以包括其存在是有利的另外的组分，例如前导序列和嵌合配偶体序列。
“肽”、“多肽”或“蛋白质”一般指包含氨基酸的聚合物。“肽”指的是具有约2个-30个氨基酸的长度的氨基酸的聚合物。“多肽”指的是在长度上包含约51个至几千个氨基酸的聚合物并且可以呈一级线性形式，包括二级结构或三级结构并且可以包括各种生物调节因子(例如辅因子)。“蛋白质”一般指包含氨基酸的聚合物并且具有二级形式、三级形式或杂聚物形式的蛋白质材料，其中任一种可以包括辅因子。
术语“启动子”指的是足以引导转录的最小序列。在本公开中还包括足以使启动子依赖性基因表达可控以具有细胞类型特异性、组织特异性、或由外部信号或试剂可诱导的那些启动子元件；这样的元件可以位于基因的5'区域或3'区域中。在本公开中包括组成型启动子和诱导型启动子这两者(参见例如Bitter等,1987,Methods in Enzymology(《酶学方法》),153:516544)。举例来说，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，如噬菌体-γ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自于哺乳动物病毒的启动子(例如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子；CMV启动子)。也可以使用由重组DNA或合成技术产生的启动子以提供本公开的核酸序列的转录。
“转化”意指在掺入新的DNA(即细胞外源性DNA)之后在细胞中诱导的永久的或瞬时的遗传变化。在所述细胞是哺乳动物细胞的情况下，永久的遗传变化一般通过将DNA引入到细胞的基因组中来实现。
“转化的细胞”意指如下的细胞，在所述细胞中已经借助于重组DNA技术引入了编码包含荧光部分的融合多肽或其它构建体的DNA分子(或在所述细胞的祖代中已经引入了所述DNA分子)。
用重组DNA转化宿主细胞可以通过本领域技术人员公知的常规技术来进行。在宿主是原核生物，如大肠杆菌的情况下，能够摄取DNA的感受态细胞可以由在指数生长期之后收获并且随后通过CaCl2方法，通过本领域公知的程序处理的细胞来制备。或者，可以使用MgCl2或RbCl。也可以在形成宿主细胞的原生质体之后或通过电穿孔进行转化。
当宿主是真核生物时，可以使用诸如磷酸钙共沉淀、常规的机械程序例如显微注射、电穿孔、插入被包裹在脂质体中的质粒、或病毒载体这样的DNA转染方法。真核细胞也可以用编码本公开的嵌合多肽的DNA序列和编码选择性表型的第二外源DNA分子(例如单纯性疱疹胸苷激酶基因)共转染。另一种方法是使用真核病毒载体，如猿猴病毒40(SV40)腺病毒、牛痘病毒、或牛乳头状瘤病毒以瞬时感染或转化真核细胞并且表达蛋白质。(Eukaryotic Viral Vectors(《真核病毒载体》),冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory),Gluzman编著,1982)。稳定转移(意指外源DNA在宿主中持续维持)的方法是本领域已知的。
真核系统和哺乳动物表达系统允许发生所表达的哺乳动物蛋白质的正确的翻译后修饰。具有用于正确加工初级转录物、糖基化、磷酸化以及分泌基因产物的细胞机制的真核细胞应用作用于表达荧光指示剂的宿主细胞。这样的宿主细胞系可以包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293、以及WI38。
利用重组病毒或病毒元件以引导表达的哺乳动物细胞系统可以被工程化。举例来说，当使用腺病毒表达载体时，编码本公开的荧光构建体的核酸序列可以与腺病毒转录/翻译控制复合物连接，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该核酸序列插入腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必要区域(例如区域E1或E3)中将产生活的并且能够在受感染的宿主中表达荧光指示剂的重组病毒(参见例如Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3655 3659,1984)。或者，可以使用牛痘病毒7.5K启动子(参见例如Mackett等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:7415 7419,1982；Mackett等,J.Virol.49:857 864,1984；Panicali等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:4927 4931,1982)。特别关注的是具有作为染色体外元件复制的能力的基于牛乳头状瘤病毒的载体(Sarver等,Mol.Cell.Biol.1:486,1981)。在该DNA进入到小鼠细胞中之后不久，质粒复制到每个细胞约100个至200个拷贝。所插入的cDNA的转录不需要质粒整合到宿主的染色体中，从而产生高表达水平。这些载体可以通过在质粒中包括选择性标记，例如neo基因而用于稳定表达。或者，逆转录病毒基因组可以被修饰以用作能够在宿主细胞中引入和引导荧光多肽表达的载体(Cone和Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6349 6353,1984)。高水平的表达也可以使用诱导型启动子来实现，包括但不限于金属硫蛋白IIA启动子和热激启动子。
为了长期高产率产生重组蛋白，可以使用稳定的表达。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以使用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的编码本公开的荧光多肽的cDNA和选择性标记来转化宿主细胞。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性并且允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并且生长以形成灶，它们进而可以被克隆和扩增成细胞系。举例来说，在引入外源DNA之后，可以使工程细胞在富集培养基中生长1天-2天，然后转换成选择培养基。可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,Cell,11:223,1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026,1962)、以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等,Cell,22:817,1980)基因可以分别用于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中。此外，抗代谢物抗性可以用作针对以下各项进行选择的基础：dhfr基因，它赋予对甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性(Wigler等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567,1980；O'Hare等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:1527,1981)；gpt基因，它赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072,1981)；neo基因，它赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等,J.Mol.Biol.,150:1,1981)；以及hygro基因，它赋予对潮霉素(hygromycin)的抗性(Santerre等,Gene,30:147,1984)。最近，已经描述了另外的选择性基因，即trpB，它允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，它允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman和Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8047,1988)；以及ODC(鸟氨酸脱羧酶)，它赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性(McConlogue于Current Communicationsin Molecular Biology(《最新分子生物学通讯》),冷泉港实验室编著,1987)。
本公开提供了一种在非纯环境中确定两种分子(例如两种多肽)之间的解离常数的方法。“非纯”意指包含污染物，例如其它蛋白质、多肽、肽、脂质、碳水化合物、核酸、细胞器、任何前述物质的组合等的环境。所述方法可以在体内、原位或体外使用。在一个实施方案中，所述方法是在破裂的细胞制备物中进行的。在另一个实施方案中，所述方法是在其中引入多种不同的分子(例如蛋白质或多肽)的系统中进行的。在前述方法中的任一种中，第一分子包含供体荧光部分并且第二分子包含接受体荧光部分，其中所述第一分子和第二分子是结合配偶体或同源物并且其中所述荧光供体和荧光接受体可以进行FRET。
在一个实施方案中，第一融合构建体包含与结合对的第一分子同源物连接的FRET对的供体部分并且第二融合构建体包含与结合对的第二分子同源物连接的FRET对的接受体部分，所述第一融合构建体和所述第二融合构建体在细胞中表达。可以如本文所述测定完整或破裂的细胞的荧光和FRET并且计算它们的Kd。在另一个实施方案中，使包含与结合对的第一多肽同源物连接的FRET对的供体部分的第一融合蛋白表达并且将其分离。使包含与结合对的第二多肽同源物连接的FRET对的接受体部分的第二融合蛋白表达并且将其分离。在该后一个实施方案中，将第一融合蛋白和第二融合蛋白在包含一种或多种污染物(例如非结合蛋白、多肽、或肽；或竞争性结合剂)的系统中混合。然后计算第一融合蛋白和第二融合蛋白的Kd。将显而易见的是，可以使用Kd确定来计算Km。举例来说，解离常数是亲和力的量度，更高的值表明更低的亲和力：Km＝(k-1+k2)/k1和Kd＝k-1/k1。如果k2＝0，则Km＝Kd。由于对于大部分的酶来说，k2与k-1相比是相对小的，因此Km值常常接近Kd值。
为了实施基于FRET的技术以确定Kd，使用两个数据集。首先，计算数据集，所述数据集区分在激发波长处供体和接受体的FRET荧光信号和其它直接荧光信号并定量所述FRET荧光信号。其次，将荧光信号转换成结合的配偶体，即供体蛋白质和接受体蛋白质的相应浓度。
如果将分子(例如多肽)相互作用定义为：那么Kd可以被计算为：
它可以被重排成：
其中[接受体P2]结合最大是与供体P1浓度结合的理论最大接受体P2浓度，并且[接受体P2]游离是游离接受体P2浓度。[接受体P2]结合与结合的蛋白质的FRET信号成比例。所述方法然后将接受体发射信号分为三个部分：FRET发射(EmFRET)、接受体直接发射、以及当在供体激发波长处被激发时的供体直接发射：EmFRET＝(Em总)-供体P1(cont)-接受体P2(cont)。在接受体发射波长处的供体直接发射以比率因数α与它在供体发射波长处的发射波长成比例，而接受体在接受体发射波长处的直接发射以比率因数β与在接受体激发波长处被激发时它在接受体发射波长处的发射波长成比例。因此，所述方法可以包括通过确定比率常数α和β来确定绝对EmFRET。α和β是通过以下步骤确定的：制备供体荧光团标记的多肽的稀释系列；对于供体荧光部分和接受体荧光部分，在激发波长处激发并且在发射波长处测量；用供体荧光发射值(FLDD)除以在接受体波长处的发射以获得比率常数α。该常数是当在供体激发波长处激发时未猝灭的供体相对于在接受体波长处的总发射的估计值。在第二个系列的实验中，制备接受体荧光团的稀释系列。在供体波长和接受体波长处激发接受体之后，获得在发射波长处接受体的各发射。用在供体激发波长处激发时的荧光发射除以其在接受体激发波长处的发射(FLAA)以获得比率常数β。因此，EmFRET＝(Em总)-(α*FLDD)-(β*FLAA)，其中FLDD是在供体波长处被激发时供体的荧光信号并且FLAA是在接受体波长处被激发时接受体的荧光信号。
在计算在每一种特定的条件下EmFRET的强度之后，使用例如Prism5(GraphPad软件公司)拟合EmFRET的数据集和接受体P2的总浓度([接受体P2]总)以推导出EmFRET最大和Kd的值。将[接受体P2]总的值放入X系列中，并且将按一式三份在每一个[接受体P2]总下确定的EmFRET的强度放入Y系列中。选择非线性回归方法并且创建自定义方程式来拟合数据集：
参数EmFRET、Kd以及A的初始值被设定为1.0。默认约束EmFRET最大值必须大于0。A常数等于添加到系统中的浓度(例如0.05μM、0.1μM、0.5μM、以及1.0μM)。结果是以平均值±SD报告的。
因此，通过使用非线性回归和下式确定第一蛋白质和第二蛋白质的Kd：
其中A是FRET供体/第一蛋白质的总浓度，并且X是FRET接受体/第二蛋白质的总浓度。
使用小泛素相关修饰物来展示本公开的方法。小泛素相关修饰物(SUMO)是泛素样多肽，它们与靶蛋白共价缀合作为一种类型的主要蛋白质翻译后修饰。由SUMO家族的肽所产生的修饰调节许多重要的生物过程，如核转运、转录、DNA修复以及其它应激响应、细胞周期、以及细胞凋亡。SUMO缀合经由酶促级联发生，涉及E1激活酶、E2缀合酶以及E3蛋白质连接酶。SUMO E1激活酶由异二聚复合物Aos1和Uba2组成，并且通过用ATP和Mg2+将SUMO的C末端腺苷酸化来引发缀合过程。硫酯键在Uba2的活性位点半胱氨酸残基与SUMO的C末端甘氨酸残基之间形成。在该反应之后是SUMO与E2缀合酶Ubc9的半胱氨酸残基的酯交换。E3连接酶通过在生理条件下将E2～SUMO和底物募集到复合物中以促进体内特异性并且刺激SUMO与底物的赖氨酸残基的缀合物以在生理条件下促进大部分的SUMO化。已经描述了几种SUMOE3蛋白质连接酶。举例来说，Siz/PIAS家族的成员含有RING指样结构域(SP-RING结构域)。RanBP2具有被称作内部重复序列(IR)结构域的结构域。其它SUMO连接酶包括组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)、KRAB相关蛋白1(KPA1)、Pc2以及Topors。
本文公开了涉及单步定量FRET测定的方法，所述方法允许确定SUMO E2缀合酶Ubc9和底物RanGAP1c的解离常数Kd。本文公开的方法包括用以与RanGAP1c和Ubc9融合的非常高效的FRET对(例如CyPet和YPet)。使用本公开的方法所获得的结果表明Kd主要取决于来自标记蛋白的相互作用的荧光信号。本文公开的方法可以定量地确定RanGAP1c和Ubc9的相互作用亲和力，即使是在多种污染蛋白存在下。举例来说，在不存在BSA或大肠杆菌BL21裂解物的情况下，使用本公开的方法发现0.05μM至1.0μM范围的CyPet-RanGAP1c具有0.102±0.008μM的Kd值，而在BSA存在下，发现0.05μM至1.0μM范围的各种浓度的CyPet-RanGAP1c的Kd值是0.102±0.006μM；并且进一步在大肠杆菌BL21裂解物存在下，发现0.1μM至1μM范围的各种浓度的CyPet-RanGAP1c的Kd值是0.098±0.007μM。此外，根据来自大肠杆菌BL21裂解物的直接提取的CyPet-RanGAP1c蛋白质和YPetUbc9蛋白质，发现粗蛋白具有0.099±0.002μM的Kd值。结果是非常一致的并且与通过使用传统SPR方法所确定的Kd值(对于CyPet-RanGAP1c和YPet-Ubc9或RanGAP1c和Ubc9，分别是97nM和182nM)有良好的一致性。先前的ITC研究也证实了Ubc9与RanGAP1c之间的高亲和力相互作用(Kd约0.49μM)。
此外，通过使用SPR方法进一步验证了使用本公开的方法所获得的结果。来自SPR方法的结果与来自本文所公开的方法的结果一致。与SPR相比，本文所公开的基于FRET的方法能够更好地确定蛋白质-蛋白质相互作用，特别是如果涉及酶的话。SPR不是非常特别地非常适合研究蛋白质-蛋白质相互作用，这是因为始终存在与固定蛋白质以进行SPR测定相关的潜在取向问题。此外，动力学SPR数据由于包括质量传递效应、重新结合效应以及非特异性结合传感器芯片的各种影响而可能是相当复杂的，并且因此需要仔细的数学分析来获得有意义的参数。此外，当简单朗格缪尔型结合模型(simple Langmuir-type bindingmodel)不适用时，用于确定Kd的SPR方法可能不是有效的。当在SPR测定中通过凝血酶消化his标签时，发现另外的缺点。为了进行消化反应，反应温度必须维持在约16℃。然而，该温度不利地影响CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的活性。当使用BiacoreX100产生数据时，只能用一个浓度进行运行，并且相对蛋白质相互作用响应需要40分钟。因此如果将BiacoreX100用于许多样品或平行测定，那么总反应时间可能超过12小时。由于酶活性是不稳定的，因此结果可能是不一致的。或者，在使用本文公开的方法的情况下六个浓度和三次重复实验可以花费少于1小时。此外，因为方程式6(EQ.6)考虑了任何潜在的取向问题。
RanGAP1c和Ubc9的高亲和力相互作用可以解释Ubc9如何直接介导SUMO与RanGAP1c的缀合而无E3的帮助。结果进一步支持了以下假设，即Ubc9可以直接介导SUMO缀合。RanGAP1c-Ubc9的晶体结构证实了两个分子之间的相互作用，为识别RanGAP1cΨ-K-X-D/E共有基序提供了分子基础。界面可以分两部分来描述。一个在RanGAP1c螺旋H和F与主要源自于螺旋C的Ubc9表面之间。第二部分包括共有RanGAP1c SUMO化基序(-LKSE-)与包括催化性半胱氨酸、链6和7、以及螺旋C之前的环的Ubc9表面之间的相互作用。这些相互作用可能引起增加的结合和更有效的SUMO转移。本文所呈现的实验通过使用本文所公开的定量的基于FRET的方法证实了RanGAP1c-Ubc9的高亲和力相互作用。
在纳摩尔范围上Kd确定的一致亲和力结果不仅证实了本公开的方法不仅在相互作用的配偶体的各种浓度下是准确的和可靠的，而且在高亲和力纳摩尔水平下也是灵敏的。相反，确定Kd的传统放射性标记蛋白结合测定需要至少100倍标记配体的范围以预测最大结合。本文所教导的基于FRET的Kd确定方法以0.67-40倍的RanGAP1c-Ubc9的结合配偶体的比率准确地确定Kd。用于确定Kd的其它方法，例如SPR或等温滴定量热法，需要多个步骤和特殊的仪器并且常常给出大的变化。虽然FRET测定在生化和细胞生物学研究中已经变得更为普及，但是本文公开的定量FRET方法相对于现有技术是显著的进步，这是因为它允许在污染蛋白质存在下确定Kd，从而提供可靠的定量结果，而成本仅是标准FRET测定的一小部分。
因此，本文公开的方法可以高效地实时监测蛋白质相互作用，不论底物的尺寸如何。此外，本文公开的方法可以容易地被开发以使用高通量技术。
以下实施例意图说明，而不是限制本公开。虽然它们是可能使用的那些典型的程序，但是可以替代地使用本领域技术人员已知的其它程序。
实施例
DNA构建体：通过PCR，使用含有NheI-SalI位点的引物扩增CyPet和YPet的开放阅读框。PCR产物的大小分别是729bp和729bp。通过PCR，使用含有SalI-NotI位点的引物扩增RanGAP1c和Ubc9。将所有这四种基因均克隆到pCRII-TOPO载体(英杰公司(Invitrogen))中。在通过SalI-NotI消化之后提取编码RanGAP1c和Ubc9的片段并且将其插入已经通过用SalI和NotI切割而线性化的pCRII-CyPet或pCRII-YPet中。在通过测序确认序列之后，将编码CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的cDNA克隆到pET28(b)载体(Novagen公司)的NheI-NotI位点中。
蛋白质表达、纯化以及浓度测定：用编码CyPetRanGAP1c或YPetUbc9的pET28(b)载体转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。将转化的细菌平板接种到含有50μg/mL卡那霉素(kanamycin)的LB琼脂平板上，并且挑取单菌落并且接种在2×YT培养基中达到0.5-0.8的在600nm处的光密度。使用0.2mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导多聚组氨酸标记的重组蛋白的表达。通过以6,000rpm离心10分钟收集细菌细胞，将其重悬在结合缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl以及5mM咪唑)中，并且使用超声波液体处理器(Misonix公司)超声处理。通过以35,000g离心30分钟来使含有重组蛋白的细胞裂解物澄清。然后用Ni2+-NTA琼脂糖珠(快而精公司(QIAGEN))从细菌裂解物中纯化多聚组氨酸标记的重组蛋白，并且通过三种不同的洗涤缓冲液洗涤(洗涤缓冲液1含有20mM Tris-HCl(pH 7.4)、300mM NaCl；洗涤缓冲液2含有20mM Tris-HCl(pH7.4)、1.5M NaCl、以及5％Triton X-100；以及洗涤缓冲液3含有20mM Tris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl、以及20mM咪唑)。然后通过添加洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.4)、200mM NaCl、以及250mM咪唑)将产物洗脱。通过透析，使用透析缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.4)、50mM NaCl、以及1mM DTT)纯化蛋白质。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来确认蛋白质的纯度。通过使用考马斯加蛋白质测定(赛默科技公司(Thermo Scientific))确定浓度。
FRET测量：测量四种不同的混合物的蛋白质-蛋白质相互作用。混合物1：在60μL的总体积中，将重组CyPetRanGAP1c蛋白和YPetUbc9蛋白孵育并且在室温在Tris缓冲液(20mMTris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、DTT 1mM)中混合达到60μL的总体积。将CyPetRanGAP1c的最终浓度固定在0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM；YPetUbc9的最终浓度从0μM到4μM变动。
混合物2：在60μL的总体积中，将从野生型BL21(DE3)大肠杆菌中提取的污染蛋白质添加到包含CyPetRanGAP1c蛋白和YPetUbc9蛋白的混合物中。在Tris缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、以及DTT 1mM)中污染蛋白质的浓度是1.0μg、3.0μg、10.0μg。将CyPetRanGAP1c的最终浓度固定到0.1μM、0.5μM、1μM；YPetUbc9的最终浓度从0μM到4μM变动。
混合物3：在60μL的总体积中，将纯BSA添加到包含CyPetRanGAP1c蛋白和YPetUbc9蛋白的混合物中。在Tris缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、以及DTT 1mM)中BSA的浓度是1μg。将CyPetRanGAP1c的最终浓度固定到0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM；YPetUbc9的最终浓度从0μM到4μM变动。
混合物4：从BL21(DE3)大肠杆菌中提取CyPetRanGAP1c和YPetUbc9而不经纯化。通过荧光标准曲线测量CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的浓度。将CyPetRanGAP1c的最终浓度固定到0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM并且YPetUbc9的最终浓度从0μM到4μM变动。
在充分混合之后，用荧光多孔板读数器FlexstationII384(加利福尼亚州桑尼维尔的分子装置公司(Molecular Devices,Sunnyvale,CA))检查四种不同的混合物(混合物1-4)。使用455nm的截止滤光片在414nm的激发波长下收集475nm和530nm处的荧光发射信号。使用515nm的截止滤光片在495nm的激发波长下收集530nm处的另一个荧光发射信号。将实验重复三次，并且在每一种特定条件下记录荧光的平均值。
CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的标准曲线：在37℃将重组蛋白CyPetRanGAP1c和YPetUbc9在Tris缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、DTT 1mM)中孵育，然后添加(60μL)到384孔黑色/透明板的每一个孔中。在414nm处激发之后，对于含有从0μM到2μM变动的蛋白质的样品收集在475nm处CyPetRanGAP1c的发射信号。在475nm处激发之后，对于含有从0μM到2μM变动的蛋白质的样品收集在530mm处YPetUbc9的发射样品。为了测量原始CyPetRanGAP1c和YPetUbc9蛋白质浓度，使用BL21细菌裂解物作为对照。
FRET的荧光光谱分析：当在414nm处激发混合物时，获得了475nm处(FLDD)和530nm处(Em总)的发射峰(参见图2B)。当在495nm处激发混合物时，获得了530nm处的发射峰(FLAA)。当在414nm处激发CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的混合物时，几乎所有的在475nm处的发射强度均是CyPetRanGAP1c在向YPetUbc9进行能量传递之后的直接发射。530nm处的发射强度由三个组成部分组成：CyPetRanGAP1c的直接发射、YPetUbc9的敏化发射(EmFRET)、以及YPetUbc9的直接发射。由于EmFRET与和CyPetRanGAP1c结合的YPetUbc9的量成比例，因此EmFRET与YPetUbc9的结合浓度之间的关系是可推导出的。
为了确定绝对EmFRET，进行了两个系列的实验以鉴定比率常数α和β。第一个系列的实验是要确定比率常数α。以1.0μM、0.5μM、0.1μM以及0.05μM的浓度制备供体荧光团标记的多肽(例如CyPetRanGAP1c)的稀释系列。在414nm处激发之后，在475nm和530nm处测定供体多肽(例如CyPetRanGAP1c)的发射。用475nm荧光发射值(FLDD)除以530nm处的发射得到比率常数α。该常数是在414nm处激发时未猝灭的供体(例如CyPetRanGAP1c)相对于530nm处的总发射的估计值。在第二个系列的实验中，以4.0μM、3.0μM、2.0μM、1.0μM、0.5μM、以及0.2μM的浓度制备接受体荧光团(例如YPetUbc9)的稀释系列。在414nm或495nm处激发之后，在530nm处测定接受体(例如YPetUbc9)的发射。用在414nm处激发时在530nm处的荧光发射除以在495nm处激发时它在530nm处的发射(FLAA)得到比率常数β。
数据处理和Kd确定：在基于上文所述计算在每一种特定条件下EmFRET的强度之后，通过Prism 5(GraphPad软件公司)拟合EmFRET的数据集和YPetUbc9的总浓度([YPetUbc9]总)以推导出EmFRET最大和Kd的值。原则上，将[YPetUbc9]总的值放入X系列中，并且将按一式三份在每一个[YPetUbc9]总下确定的EmFRET强度放入Y系列中。选择非线性回归方法并且创建自定义方程式来拟合数据集：
参数EmFRET、Kd以及A的初始值被设定为1.0。默认约束EmFRET最大值必须大于0。A常数等于添加到系统中的浓度(0.05μM、0.1μM、0.5μM、以及1.0μM)。结果是以平均值±SD报告的。
通过SPR确定非共价RanGAP1c和Ubc9相互作用的Kd：将His标记的YPetUbc9和CyPetRanGAP1c或His标记的ubc9和RanGAP1c在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、50μMEDTA、0.005％Tween20(pH7.4))中透析过夜以确保所测试的条件是相同的。在配备有NTA传感器芯片的BIAcore X100系统(瑞典乌普萨拉的BIAcore AB公司(BIAcore AB,Uppsala,Sweden))上以30微升/分钟的流速进行对CyPetRanGAP1c与YPetUbc9、或RanGAP1c与Ubc9之间的相互作用的所有分析。为了固定蛋白质，用于运行缓冲液中的500μMNiCl2处理芯片1分钟。然后将纯化的YPetUbc9(100ng/mL)或纯化的Ubc9蛋白质(200ng/mL)注入120秒，并且稳定120秒。随后，将凝血酶消化的CyPetRanGAP1c蛋白质(50μg/mL-160μg/mL)或凝血酶消化的RanGAP1c蛋白质(10μg/mL-40μg/mL)注入120秒并且解离10分钟。为了连续监测样品与NTA表面的非特异性背景结合，将CyPetRanGAP1c蛋白和RanGAP1c蛋白注入到没有NiCl2处理和YPetUbc9/Ubc9蛋白质的对照流动池中。在测定CyPetRanGAP1c和YPetRanGAP1c、或RanGAP1c和RanGAP1c的浓度之后，通过添加再生缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、350mMEDTA、0.005％Tween 20，pH 8.3)来使NTA传感器芯片再生。在首先用NiCl2处理，并且将YPetUbc9或Ubc9固定到芯片上之后，测定另一浓度。在25℃在运行缓冲液中进行所有测量。使用BIAcore X100评价软件1.0版(BIAcore公司)分析数据。
用于在其它蛋白质存在下确定Ubc9-RanGAP相互作用的Kd的定量的基于FRET的方法的设计：为了在恶劣环境中获得解离常数Kd数据，选择RanGAP1c和Ubc9用于通过定量的基于FRET的方法来确定它们的解离常数。使用由Song等(Ann Biomed Eng 39(4):1224-34(2011))开发的FRET测定，通过跟踪EmFRET信号进行测量。通过将用RanGAP1c标记的CyPet和用Ubc9标记的YPet注入到384孔黑色/透明板中来测试EmFRET。将CyPetRanGAP1c的浓度固定并且滴定YPetUbc9的浓度直到EmFRET信号达到饱和量为止。当RanGAP1c和Ubc9彼此相互作用时，CyPet和YPet的距离适合荧光共振能量传递。如果在供体(CyPet)的激发波长414nm处激发混合物，那么在接受体(YPet)的发射波长530nm处有发射信号。该过程取决于CyPetRanGAP1c与YPetUbc9之间的相互作用，即使是在测定中存在不同种类的污染蛋白(参见图1A)。
在不同的污染蛋白存在的测定中，可以遵循方程式2通过简单的EmFRET信号来分析两种蛋白质的结合：
在分别用CyPet和YPet标记RanGAP1c和Ubc9之后，解离常数Kd可以根据方程式3如图1B中所示来定义：
方程式3可以重排成方程式4：
其中[YPetUbc9]结合最大是与CyPetRanGAP1c浓度结合的理论最大YPetUbc9浓度，并且[YPetUbc9]游离是游离YPetUbc9浓度。[YPetUbc9]结合与结合蛋白质的FRET信号成比例。(Eq.4)可以使用(Eq.5)中所表示的关系转换成(Eq.6)：
其中EmFRET是绝对FRET信号并且EmFRETm最a大x是在最大量的YPetUbc9由CyPetRanGAP1c结合时的绝对FRET信号。A是CyPetRanGAP1c的总浓度([CyPetRanGAP1c]总)，X是总YPetUbc9的浓度([YPetUbc9]总)。
YPetUbc9-CyPetRanGAP1c的FRET测定和在接受体发射波长处荧光信号的三部分分析：为了去除背景，首先在测量包含CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的蛋白质混合物的发射信号之前扫描板本身。在414nm处激发空白板，在475nm和530nm处收集发射信号；在495nm处激发空白板并且测定在530nm处的发射信号以确定背景值(参见下文)。当CyPetRanGAP1c的浓度固定时，FRET信号随着添加更多的YPetUbc9而增加(参见图2A)。
为了获得绝对FRET信号(EmFRET)以测量Kd，首先需要确定供体(CyPet)和接受体(YPet)在530nm处的直接发射并且从530nm处的总发射中排除。未猝灭的供体CyPet在530nm处的直接发射以比率因数α与在414nm处被激发时它在475nm处的发射成比例(α*FLDD，FLDD是在414nm处激发时CyPet在475nm处的荧光发射)，而YPet在530nm处的直接发射以比率因数β与在495nm处被激发时它在530nm处的发射成比例(β*FLAA，FLAA是在495nm处被激发时YPet在530nm处的荧光发射)(参见图2B)。因此，可以通过(Eq.7)确定YPet的FRET发射信号(EmFRET)：
EmFRET＝FLDA-α*FLDD-β*FLAA (EQ.7)其中比率常数α和β首先分别使用游离的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9通过实验确定为0.334±0.003和0.014±0.002。
530nm处的发射强度由三个组成部分组成：CyPet的直接发射、YPet的直接发射以及FRET信号的发射(EmFRET)(参见图2B)。在FRET测定中，在414nm处激发CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的混合物，并且测定475nm(FLDD)和530nm(FLDA)处的两个发射信号(参见图2B)。当在414nm处激发时，475nm处的荧光发射来自未猝灭的CyPet的发射(FLDD)和YPet在475nm处的直接发射(其是非常小的，<2.6％的CyPet发射并且因此可以被忽略)。当在414nm和495nm处激发时，分别测定CyPetRanGAP1c在475nm处和YPetUbc9在530nm处的发射。可以通过从530nm处的总发射中以比率α和β减去上述两个信号来计算YPetUbc9的FRET发射信号。
在我们先前的研究中，我们通过定量FRET测定分析了CyPet-SUMO1和YPetUbc9的蛋白质相互作用亲和力。基于FRET的Kd测量提供了可靠的Kd值并且相对于其它标准Kd测量方法，例如放射性标记配体结合测定、SPR或等温滴定量热法具有若干优势。SUMO底物和E2、RanGAP1c和Ubc9在SUMO化途径中是重要的。此外，SUMO化途径在体外在没有E3的情况下起作用。因此通过上述方法研究RanGAP1c与Ubc9之间的相互作用亲和力以了解为什么结合在没有E3的情况下发生的热力学。
以不同浓度的CyPetRanGAP1c测试FRET测定的灵敏度。图2A示出了来自一组实验的光谱(Ex＝414nm)，其中CyPetRanGAP1c浓度被固定到1μM。随着YPetUbc9的浓度从0μM逐渐增加到4μM，YPetUbc9与CyPetRanGAP1c的结合引起从CyPet到YPet的能量传递，并且530nm处的发射显著增加，而CyPetRanGAP1c在475nm处的直接发射减少。然后以四种不同浓度的CyPetRanGAP1c测定每一个组成部分的荧光发射。在这六组实验中，CyPetRanGAP1c的浓度被固定到0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM，并且在每一个测定中YPetUbc9的浓度从0μM增加到4μM。然后在414nm和495nm的激发波长处测定所有混合物的荧光发射光谱以排除CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的直接发射。在减去CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的直接发射之后，当在每一个浓度的CyPetRanGAP1c下添加更多的YPetUbc9时，绝对FRET发射(当Ex＝414nm时在530nm处)稳定增加(参见图3A)。
为了确定EmFRET最大和Kd，使用非线性回归在使用不同总浓度的CyPetRanGAP1c的每一组实验中应用方程式(6)。在使用上述计算确定CyPetRanGAP1c和YPetUbc9在530nm处的直接发射之后，通过从530nm处的总发射(FLDA)中减去CyPetRanGAP1c(α*FLDD)和YPetUbc9(β*FLAA)在530nm处的直接发射来获得FRET信号(EmFRET)。因此，从Prism 5中的非线性回归，对于0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM的CyPetRanGAP1c，EmFRET最大的估计值分别是(1.227±0.022)×104、(2.433±0.041)×104、(12.29±0.23)×104、以及(24.61±0.53)×104。在结合配偶体的该浓度范围内，EmFRET最大与3皮摩尔至60皮摩尔的CyPetRanGAP1c具有线性关系(R2＝1.000，参见图5A和5B以及表1)。该结果表明所述方法在CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的各种浓度比下准确和一致地预测了EmFRET最大。
表1：在不同条件下最大FRET发射EmFRET最大和Kd值的总结。
然后由非线性回归确定CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的解离常数。通过在Prism 5程序中用EmFRET和[YPetUbc9]总绘图(方程式6)，确定四个浓度的CyPetRanGAP1c(0.05μM、0.1μM、0.5μM、以及1.0μM)的Kd分别是0.098±0.014μM、0.096±0.013μM、0.101±0.016μM、以及0.114±0.021μM(参见表1)。从不同浓度的CyPet-RanGAP1c(从0.05μM到1.0μM的CyPetRanGAP1c)产生的非常接近的Kd以及CyPetRanGAP1c与YPetUbc9的小结合配偶体比率(从0.67倍到40倍)证实了本文公开的基于FRET的Kd测量方法是非常稳健的和可靠的。
在BSA和细菌提取蛋白质存在下确定EmFRET：为了验证以下假设，即本公开的基于FRET的Kd确定方法可以用于在第三种蛋白质存在下或在污染蛋白质存在下测量Kd，在BSA或细菌污染蛋白质存在下，在三个不同浓度的CyPetRanGAP1c中测定针对每一个组分部分的荧光发射。在这三组实验中，CyPetRanGAP1c的浓度被固定到0.05μM、0.1μM、0.5μM以及1.0μM；YPetUbc9的浓度从0μM增加到4μM；BSA的量是1μg；并且使用1μg、3μg、10μg的细菌污染蛋白质。
为了确定EmFRET最大和Kd，使用非线性回归在使用不同总浓度的CyPetRanGAP1c的每一组实验中应用(方程式6)。在使用上述计算确定CyPetRanGAP1c和YPetUbc9在530nm处的直接发射之后，通过从530nm处的总发射(FLDA)中减去CyPetRanGAP1c(α*FLDD)、YPetUbc9(β*FLAA)在530nm处的直接发射来获得FRET信号(EmFRET)。此外，确定和减去BSA和污染蛋白质背景。
由非线性回归确定在BSA存在下CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的解离常数。通过在Prism 5程序中用EmFRET和[YPetUbc9]总绘图(方程式6)，确定三个浓度的CyPetRanGAP1c(0.05、0.1、0.5、以及1.0)的Kd是0.098±0.022μM、0.092±0.024μM、0.105±0.025μM、0.102±0.028μM。平均Kd是0.099±0.006μM，相比之下，无BSA的Kd是0.102±0.008μM。结果只有少量的变化。
从三个浓度的CyPetRanGAP1c确定在细菌污染蛋白质存在下CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的解离常数Kd。当CyPetRanGAP1c的浓度被固定为0.1μM时，将1.0μg、3.0μg、10.0μg的细菌污染蛋白质添加到混合物中。Kd分别是0.092±0.022μM、0.092±0.023μM、0.096±0.031μM。当CyPetRanGAP1c的浓度被固定为0.5μM时，将1.0μg、3.0μg、10.0μg的细菌污染蛋白质添加到混合物中。Kd分别是0.100±0.027μM、0.108±0.025μM、0.090±0.035μM。当CyPetRanGAP1c的浓度被固定为1.0μM时，将1.0μg、3.0μg、10.0μg的细菌污染蛋白质添加到混合物中。Kd分别是0.093±0.031μM、0.109±0.037μM、0.103±0.040μM。在这两种条件下，EmFRET最大是非常稳定的(参见图5A-B；还参见表1)。
本文所呈现的非常一致的和准确的结果表明解离常数Kd可以通过定量FRET测定、使用本文所述的方法来计算，即使是在不存在或存在BSA和细菌污染蛋白质的情况下。
通过使用聚丙烯酰胺凝胶的考马斯蓝染色，确定了CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的分子量分别是47.4KDa和47.6KDa(参见图4B)。从凝胶中，图4B的泳道1和2是使用镍琼脂糖亲和色谱法从细菌裂解物中纯化的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9。泳道2、3、5、6、8以及9是添加有1μg或3μg的BSA的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的纯混合物(参见图4A)。从图4B的凝胶中，泳道1、2是纯的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9，泳道3-11是含有1μg、3μg或10μg细菌裂解物蛋白质的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的纯混合物(参见图4C)。
在其它蛋白质存在下确定EmFRET最大和Kd：对于0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM的CyPetRanGAP1c，在BSA存在下包含CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的混合物的EmFRET最大值分别是(1.260±0.036)×104、(2.523±0.080)×104、(12.71±0.38)×104以及(24.97±0.76)×104(参见表1)。EmFRET最大表现出线性关系并且曲线与在不存在BSA的情况下的曲线重叠。图表还显示在添加1μg BSA之后EmFRET最大是稳定的(参见图5A-B)。包含CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的混合物的EmFRET最大值在1μg大肠杆菌裂解物存在下分别是2.583±0.074、13.26±0.43、以及25.21±0.90；在添加3μg大肠杆菌裂解物时分别是2.572±0.079、13.02±0.39、以及25.19±0.99；并且在添加10μg大肠杆菌裂解物时分别是2.636±0.106、13.07±0.58、以及26.06±1.14(参见表1)。在比较时结果证实，尽管改变了蛋白质混合物，但是Kd或EmFRET最大的值没有显著的变化。举例来说，对于没有污染蛋白质的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的混合物、含有一种污染蛋白质的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的混合物、以及包含多种污染蛋白质的CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的混合物获得了相同的Kd和EmFRET最大的值。因此，本文所公开的基于FRET的方法可以用于从复杂的测定条件确定Kd。因此，本文所公开的方法允许研究迄今为止先前尚未研究过的蛋白质相互作用。
为了验证来自FRET测定的Kd确定值，通过SPR研究CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的相互作用解离常数。使His标记的YPetUbc9和CyPetRanGAP1c在细菌细胞中表达并且使用Ni-NTA琼脂糖珠纯化。在针对Biacore运行缓冲液透析之后，将His标记的YPetUbc9固定到SPRNTA传感器芯片上。直接通过凝血酶消化切割镍珠上的His标签以获得CyPetRanGAP1c。通过NTA传感器芯片的对照通道的响应信号减去CyPetRanGAP1c与NTA芯片的非特异性结合。通过结合动力学分析来研究结合的YPetUbc9对一系列浓度的CyPetRanGAP1c的注入的结合响应(参见图6A)。CyPetRanGAP1c以适度的动力学与YPetUbc9结合，计算的Kd是0.097μM。该Kd接近于通过上文所述的定量FRET方法所确定的这些Kd。为了进一步分析荧光标签对相互作用的可能的干扰，在SPR中使用未标记的蛋白质进行对照实验。分析RanGAP1c和Ubc9自身的相互作用。类似于上述实验，将His标记的Ubc9固定到NTA传感器芯片上并且RanGAP1c是流动相。结合的Ubc9对一系列不同RanGAP1c浓度的结合响应显示出与荧光蛋白质标记的融合蛋白相似的动力学(参见图6B)。计算RanGAP1c和Ubc9的相互作用的Kd为0.182μM，这与荧光蛋白标记的RanGAP1c和Ubc9的Kd是一致的。
在无纯化的细菌粗提物中的荧光蛋白确定Kd：CyPetRanGAP1c蛋白质和YPetUbc9蛋白质看起来是非常不纯的(参见图5C)。CyPetRanGAP1c和YPetUbc9这两者都容易辨别，这是因为它们的表达水平是高的。尽管在这些条件下难以使用其它方法来确定Kd，但是本公开的方法允许这样的确定。可以通过从标准曲线分别监测475nm和530nm处的荧光信号来确定粗提物中CyPetRanGAP1c和YPetUbc9的真实浓度。CyPetRanGAP1c的浓度被固定在0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM；YPetUbc9的浓度从0μM增加到4μM。发现Kd分别是0.102±0.024μM、0.100±0.024μM、0.096±0.023μM以及0.100±0.029μM。该结果是惊人地稳定的并且与使用纯蛋白质所获得的结果完全一致(参见表1)。EmFRET最大也仍然是线性的，即(1.308±0.041)×104、(2.447±0.075)×104、(13.57±0.39)×104以及(24.63±0.79)×104。当与来自纯蛋白质测定的结果相比较时，EmFRET最大和Kd这两者均没有变化。
在本文已经对多个实施方案作了描述。然而，应当了解的是，可以作出各种改动而不脱离本公开的精神和范围。因此，其它实施方案也落入以下权利要求书的范围内。

Claims (21)

1.一种用于在一种或多种污染物分子存在下确定两种分子之间的解离常数(Kd)的基于福斯特共振能量传递(FRET)的分子相互作用方法，所述方法包括：
提供包含含有FRET供体的第一分子和含有FRET接受体的第二分子的混合物，其中所述混合物可以进一步包含一种或多种污染物分子；
确定绝对FRET发射信号值(EmFRET)；
通过使用非线性回归和测量通过激发FRET对、来自固定浓度的FRET供体/第一分子和不同浓度的所述FRET接受体/第二分子的发射，确定由FRET接受体/第二分子结合的所述FRET供体/第一分子的最大量(EMFRET最大)；以及
通过使用非线性回归和下式确定所述第一分子和所述第二分子的Kd：
其中A是FRET供体/第一分子的总浓度，并且X是FRET接受体/第二分子的总浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中EMFRET能够使用下式来确定：
EmFRET＝FLDA-α*FLDD-β*FLAA
其中FLDA是在FRET供体被第一波长的光激发并且向所述FRET接受体传递能量时所测量的荧光发射，FLDD是在被第二波长的光激发时FRET供体/第一分子的荧光发射，并且FLAA是在被第三波长的光激发时FRET接受体/第二分子的荧光发射，α是通过使用游离的FRET供体/第一分子确定的常数，并且β是通过使用游离的FRET接受体/第二分子确定的常数。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述FRET供体是CyPet或其它FRET供体。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述FRET接受体是YPet或其它FRET接受体。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一分子和所述第二分子独立地选自由以下各项组成的组：肽、多肽、蛋白质、核酸分子、脂质、以及多糖。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一分子和所述第二分子是酶和它的底物。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一分子和所述第二分子是受体和它的配体。
8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一分子和所述第二分子是抗体和它的抗原。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一分子和所述第二分子是蛋白质和它的一种或多种相互作用配偶体。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述第一波长的光具有400nm至800nm的波长。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述含有FRET供体的第一分子包括融合蛋白。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述含有FRET接受体的第二分子包括融合蛋白。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分子和所述第二分子在同一细胞中表达。
14.如权利要求12所述的方法，其中在完整细胞中确定所述Kd。
15.如权利要求12所述的方法，其中在破裂的细胞制备物中确定所述Kd。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分子和所述第二分子被表达和分离并且与污染物分子混合。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述含有FRET供体的第一分子包括工程蛋白质。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述含有FRET接受体的第二分子包括工程蛋白质。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分子或所述第二分子包括DNA。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分子或所述第二分子包括脂质。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分子或所述第二分子包括多糖。
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