CN114561423B - 一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。该方法基于荧光素酶互补原理用来验证蛋白质相互作用，将Gateway载体技术融合在内构建融合表达载体，利用体外蛋白表达系统翻译迅速得到蛋白溶液，最后用酶联检测分析仪快速检测互作信号。相比烟草瞬转系统，能够更加简单、快速、高效地检测蛋白质之间的互作关系。

Description

一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。
背景技术
目前应用于蛋白质互作的检测技术有酵母双杂交技术(Yeast Two Hybrid,Y2H)、GST融合标签的Pull-down技术、Co-IP(免疫共沉淀技术)、荧光共振能量转移技术(FRET)等等。
酵母双杂交系统(Y2H)利用酵母当中一个Gal转录因子的激活作用通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。GST融合标签的Pull-down沉降技术，利用基因重组将带有GST标签的载体插入到目标蛋白A上，谷胱甘肽包裹的磁珠与目标融合蛋白结合，加入细胞裂解液后，具有相互作用的蛋白被融合蛋白吸附的原理，检测蛋白之间的互相作用。免疫共沉淀是基于抗原抗体的反应原理，基于两个蛋白之间会发生相互作用，如果用蛋白A的抗体免疫沉淀A也可能将蛋白B沉淀下来，B的这种免疫沉淀被称为免疫共沉淀。荧光能量共振转移(FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象。可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。
在技术不断发展下，前人根据双分子荧光互补技术的原理，提出了一种新的方法，可以检测两种蛋白的互作情况，称为LCI技术(Huamin Chen,et al.,Firefly LuciferaseComplementation Imaging Assay for Protein-Protein interaction in Plants.PlantPhysiology.2008),当验证两种目标蛋白是否互作时，将荧光素酶分成没有催化作用的两段，一端为N端2～416，为Nluc，另一端为C端398～550，为Cluc，将编码N端片段和C端片段分别克隆重组到不同的表达载体上，然后在N端载体上加上一种目的待测蛋白的基因构成N端验证载体，在C端载体上加上另外一个目标蛋白的基因得到C端验证载体。将N端验证载体和C端验证载体的表达产物混在一起，目标蛋白上融合的报告蛋白不会自发地组装，但是仅当两部分融合蛋白的目的蛋白之间有互作关系时，由于报告基因的两端在空间上距离足够近，因此才能正确组装而发挥荧光素酶的活性，加入其发光底物以后，可以通过相关的仪器来检测其化学发光的有无，若发光，则证明待验证目的蛋白之间存在互作；反之亦然。LCI技术可以利用原生质体表达系统，也可以利用农杆菌介导的瞬时转化表达系统来完成蛋白互作的检验或验证。由于LCI检测的时群体细胞之间的作用，而非单一细胞，所以有效避免了由于单个细胞所造成的假象，排除了细胞自发荧光的干扰。
前期LCI表达载体其多克隆酶切位点单一，当进行蛋白的互作验证时，待测定基因克隆到表达载体有诸多局限性，而且仅仅能应用于2个蛋白之间的互作验证，不便于实现高通量的蛋白质互作筛选。
Gateway技术(Invitrogen):能够克隆一个或多个基因进入到不同的蛋白表达系统，并且大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，去除了冗长的亚克隆步骤，同时还能实现高效的克隆效率。另外，基因在目的载体之间快速简便转移时，还可以保证正确的方向和阅读框，因此Gateway技术被许多研究者应用。
前人将Gateway技术与LCI技术相结合，利用农杆菌侵染的烟草瞬时转化技术，得到了理论上可以大量验证蛋白互作的方法(Zhaoyang Zhou et al.,LuciferaseComplementation Assay for Protein-Protein Interactions in Plants.CurrentProtocols in Plant Biology.2018)。但是其操作步骤较为繁琐；培育烟草幼苗周期过长(4周)，瞬时转化也需要3～4天，便利度不够高；若要实现高通量，需要大批量培育烟草幼苗，工作量大。
Wheat Germ Extract Systerm：Wheat Germ Extract System(麦胚提取物转录/翻译偶联系统)为研究者提供了一个可应用于真核生物的无细胞蛋白表达方法，它是一个转录/翻译偶联的、在一个试管中即可完成实验的系统。/>提取物系统大大简化了体外翻译过程，缩短了获得翻译结果所需的时间。
目前尚未见到将Wheat Germ Extract System与LCI技术相结合的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。提供了一种简单、快捷、高效的蛋白互作筛选和验证的方法以及相应的LCI表达载体的试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种检测蛋白互作的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P-Nluc-G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的C端载体P-Cluc-G；
2)构建含待测蛋白A编码基因的入门表达载体1、含待测蛋白B编码基因的入门表达载体2和含GFP基因的入门表达载体3；
3)构建融合表达载体：通过LR反应将入门载体1的待测蛋白A编码基因重组克隆到P-Cluc-G中多肽片段Cluc的C端，得到融合表达载体P-Cluc-A；将入门表达载体2中的待测蛋白B编码基因重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端，得到融合表达载体P-Nluc-B；
通过LR反应分别将GFP基因重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端、P-Cluc-G中多肽片段Cluc的N端，获得对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP；
4)利用Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte Lysate System/Reticulocyte Lysate System分别对N端融合表达载体P-Nluc-B、C端融合表达载体P-Cluc-A、对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP进行体外翻译，然后将表达GFP、蛋白A和蛋白B中的蛋白两两混合，获得表达A/B、A/GFP、B/GFP蛋白的混合液，加入荧光素酶底物，检测信号强度，根据检测信号判定待测蛋白A和待测蛋白B是否存在互作关系。
一些实施方案中，所述步骤1)包括：
用限制性内切酶SacⅠ和HindⅢ对表达载体pIX-Halo进行酶切，回收线性载体片段pIX-M；以pIX-Halo载体为模板扩增获得AttR片段；分别以载体pCAMBIA1300-nLUC和pCAMBIA1300-cLUC为模板扩增获得Nluc和Cluc片段；通过Clone Enzyme重组酶将pIX-M、Nluc片段和AttR片段按顺序重组，获得P-Nluc-G载体；将pIX-M、AttR片段和Cluc片段按顺序重组获得P-Cluc-G载体。
一些实施方案中，所述步骤2)包括：
采用带有attB重组位点的引物分别扩增待测蛋白A的编码基因和待测蛋白B的编码基因，获得BP反应重组PCR产物1和PCR产物2；
将所述PCR产物1和PCR产物2分别连接至pDONR载体中，获得入门载体1和入门载体2。
本发明步骤4)中，所述室温孵育的时间为20分钟。
本发明步骤4)中，所述荧光素底物为D-Luciferin钾盐。
本发明步骤4)中，采用酶联检测分析仪系统检测信号，所述判定方法为：
将表达蛋白A/B的混合液的信号值记为F，将表达蛋白A/GFP混合液和B/GFP混合液的信号值分别记为F1、F2；
若F≥1.4×F1，且F≥1.4×F2，则待测蛋白A和待测蛋白B存在互作关系；
若F＜1.4×F1或S＜1.4×F2，则待测蛋白A和待测蛋白B不存在互作关系。
采用酶联检测分析仪系统检测信号时，机器本底会有一个信号值，因此，在判定结果时，为了消除本底信号的影响，本发明将两种待测蛋白的混合物，与对照组的蛋白混合物(表达其中一种待测蛋白和GFP蛋白)进行比较，判定两种蛋白的互作关系。
本发明步骤4)中，所述Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte LysateSystem/Reticulocyte Lysate System的体外翻译体系包括：
C端或N端LCI融合表达载体60ng。
其中，所述体外翻译的条件为：30℃孵育2小时。
本发明还提供一种用于检测蛋白互作的试剂盒，包括表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P-Nluc-G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的P-Cluc-G荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的C端载体P-Nluc-G、待测蛋白A编码基因的入门表达载体1，以及含待测蛋白B编码基因的入门表达载体2以及Wheat Germ Extract体外蛋白表达系统。
本发明还提供一种筛选目的蛋白的互作蛋白的方法，包括：
1)构建表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P-Nluc-G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的C端载体P-Cluc-G；
2)构建含目标蛋白C的编码基因的入门表达载体M，以及含候选蛋白的编码基因的入门表达载体N和含GFP基因的入门表达载体3；
3)构建融合表达载体：通过LR反应将入门载体M中的目标蛋白C的编码基因重组克隆到P-Cluc-G中多肽片段Cluc的C端，得到融合表达载体P-Cluc-C；
将入门表达载体2中的候选蛋白S的编码基因分别重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端，得到融合表达载体P-Nluc-B；所述候选蛋白S的数量≥2；
通过LR反应分别将GFP基因重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端、P-Cluc-G中多肽片段Cluc的N端，获得对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP；
4)利用Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte Lysate System/Reticulocyte Lysate System分别对N端融合表达载体P-Nluc-S、C端融合表达载体P-Cluc-C、对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP进行体外翻译，然后将蛋白C分别与其中一种蛋白S的表达产物混合，将GFP蛋白和蛋白C的表达产物混合，获得表达C/S、A/GFP、B/GFP蛋白的混合液，加入荧光素酶底物，检测信号强度，根据检测信号筛选出目标蛋白C和候选蛋白B中存在互作关系的蛋白。
其中，步骤(4)中，根据检测信号筛选出候选蛋白S中与目标蛋白C存在互作关系的蛋白，筛选的标准参照本发明上文所述的检测蛋白互作的方法中的判定方法：若目标蛋白C和候选蛋白S的混合液的信号值大于等于对照组蛋白的信号值的1.4倍，则该候选蛋白S和目标蛋白C存在互作关系；若信号值接小于对照蛋白信号值的1.4倍，只要小于其中一个对照蛋白信号值的1.4倍，则判定该候选蛋白S和目标蛋白C不存在互作关系。
本发明首次将LCI技术与体外蛋白表达系统(麦胚提取物转录/翻译偶联系统)结合起来，引入了目前实验室广泛使用的Gateway技术，构建成了适用于LCI技术Gateway载体，利用体外表达蛋白系统进行体外翻译，大大缩短需要用烟草瞬时转化系统所需要的时间，能够更加快速、简便、准确地检测两个蛋白之间的互作关系。
在一个具体实施例中，本发明利用以上方法对HvSGT1蛋白和HvRAR1蛋白的互作关系进行检测，其中，待测蛋白A为HvSGT1蛋白，待测蛋白B为HvRAR1蛋白，结果显示，实验组P-Cluc-HvSGT1/P-Nluc-HvRAR1的信号明显大于对照组P-Cluc-GFP/P-Nluc-HvRAR1和P-Cluc-HvSGT1/P-Nluc-GFP，与预期结果相同。这表明利用Gateway载体和体外蛋白翻译系统可以很好的适用于LCI技术来检测蛋白之间的互作关系，检测结果准确、可靠。
由以上结果可知，本发明基于LCI技术与体外蛋白表达系统(麦胚提取物转录/翻译偶联系统)的检测蛋白互作的方法能够快速、简便、准确地检测两个蛋白之间的互作关系，具有广泛的应用价值和前景。
附图说明
图1.P-Nluc载体示意图；
图2.P-Cluc载体示意图；
图3.piX-HALO载体示意图；
图4.pCAMBIA1300-nLUC；
图5.piX-HALO载体E-S酶切验证图；M:DNA Marker III(自下而上300、500、800、1500、2000、3000、5000bp)；P:未进行酶切的质粒；E-S：用EcoRⅤ和SacⅠ进行双酶切piX-HALO载体；
图6.P-Nluc筛菌验证图；1、2、3：阳性克隆；M：DNA Marker Ⅲ。
图7.pCAMBIA1300-cLUC；
图8.piX-HALO载体E-H酶切验证图；1、2：用EcoRⅤ和HindⅢ进行双酶切piX-HALO载体；P:未酶切质粒；M:DNA Marker Ⅲ；
图9：P-Cluc筛菌验证图；1、2、3：阳性克隆；M：DNA Marker Ⅲ；
图10.HvSGT1入门载体的测序验证示意图；
图11.HvRAR1入门载体的测序验证示意图；
图12.GFP入门载体的测序验证示意图；
图13.P-Nluc-G和P-Cluc-G载体的验证图；
图14.融合表达蛋白Western Blot电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中涉及的专业术语解释：
LR反应：指将含目的蛋白基因的入门载体(具有attL重组位点)与Gateway最终表达载体(具有attR重组位点,如本发明中的P-Nluc-G/P-Cluc-G)在LR ClonaseTM IIenzyme mix的作用下进行重组反应的过程。最终将目的蛋白基因转入最终表达载体中(详见Invitrogen Gateway Clone Technology)。执行LR反应的前提是，实验者已经有了含待测蛋白基因的入门载体。
入门载体：通过BP反应(attB重组位点与attP重组位点发生重组)获得两端含有特异重组位点attB的目的基因入门载体(详见Invitrogen Gateway Clone Technology)。
生物材料发放声明：
本发明所用的以下生物材料均为现有技术中有记载或可以商城购买得到的，本实验室也有保存，申请人保证自申请日起20年内可向公众发放用于验证试验。
pCAMBIA1300-nLUC/pCAMBIA1300-cLUC,为已知载体，记载于Huamin Chen,et al,Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay for Protein-Proteininteraction inPlants.PlantPhysiology.2008。
DB3.1感受态细胞，可耐ccdB基因：购于庄盟(Catalog no.ZC109-2)。
BP/LR ClonaseTM II Enzyme Mix：Invitrogen(Cat.No.11789020/11791020)。
CE重组酶： Ultra One Step Cloning Kit.诺唯赞(Cat.NoC115-02)。
荧光素底物：D-Luciferin钾盐(D-Luciferin,potassium salt)购于Promega/普洛麦格(Cat.No.E1601)
麦胚提取物转录/翻译偶联系统/TNT SP6Coupled Reticulocyte LysateSystem：购于Promaga/普洛麦格(Cat.No.L4140/Cat.No.L4600)
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
实施例1LCI技术Gateway载体的构建：(Nluc位于重组位点的N-端)
1.1.P-Nluc(图1)的构建
步骤1.用限制性内切酶EcoRⅤ-HindⅢ消化piX-HALO(图3)，获得线性载体pIX-M，回收大片段(5.0Kb)(图5)，以备后续使用。
步骤2.利用Nluc正反向引物从pCAMBIA1300-nLUC(图4)克隆出Nluc片段，回收，以备后续使用。
步骤3.利用ATTR-N正反向引物从piX-HALO(图3)中克隆出ATTR-N片段，回收，以备后续使用。
步骤4.利用CE重组酶将步骤1、步骤2和步骤3中的三个片段依次通过重组反应进行连接，连接产物转化DB3.1感受态细胞(庄盟，可耐ccdB基因)。利用羧苄抗性进行筛选阳性克隆并验证，验证图片见图6，验证无误的即为最终的P-Nluc-G载体。
1.2.P-Cluc-G(图2)的构建
P-Cluc-G的构建：(Cluc位于重组位点的C-端)
步骤1.用限制性内切酶EcoRⅤ和HindⅢ消化piX-HALO(图3)，得到大片段(3.1Kb)(图8)，以备后续使用。
步骤2.利用ATTR-C正反向引物从piX-HALO(图3)中克隆出ATTR-C片段，回收，以备后续使用。
步骤2.利用Cluc正反向引物从pCAMBIA1300-cLUC(图4)克隆出Cluc片段，回收，以备后续使用。
步骤3.利用CE重组酶将步骤1、步骤2和步骤3中的三个片段依次通过重组反应进行连接，连接产物转化DB3.1感受态细胞(庄盟，可耐ccdB基因)。利用羧苄抗性进行筛选阳性克隆并验证，验证图片见图9，验证无误的即为最终的P-Cluc-G载体。
注：本发明中所使用到的酶试剂的使用均依照试剂说明书中建议的进行。
实施例2.融合载体的构建以及体外蛋白的表达
LCI技术Gateway载体体外蛋白表达系统用于检验蛋白质基因HvSGT1与HvRAR1之间的互作构建融合载体，并进行体外蛋白的表达。
目的：验证HvSGT1与HvRAR1之间的互作，以HvSGT1与GFP的互作为负对照。
以原有报道过的蛋白互作组合为对照，验证本P-Nluc-G和P-Cluc-G载体体外蛋白表达系统在LCI技术上的适用性。
步骤1.构建目的基因的入门载体(详见invitrogen Catalog nos.12535-019说明书)
HvSGT1基因、HvRAR1基因、GFP基因的入门载体构建过程：
(1)带attB重组位点目的基因的PCR扩增
通过采用带有attB重组位点的引物扩增待测基因，使目的基因带有attB重组位点以便于进行BP反应。
本实验以已知载体质粒(本实验室提供)为模板，以下带有attB重组位点(斜体下划线部分)的引物进行PCR扩增得到用于构建入门载体的目的基因。
HvSGT1基因的登录号为AF439974.1，HvRAR1基因的登录号为:AF192261.1。其中，HvSGT1基因的CDS序列长1122bp，具体序列如下：
ATGGCCGCCGCCGCCGCGTCGGATCTGGAGAGCAAGGCCAAGGAGGCCTTCGTCGACGACGACTTCGAGCTAGCCGCCGAGCTCTACACCCAGGCCATCGAGGCTGGCCCAGCCACCGCGGAGCTCTACGCCGACCGAGCCCAGGCTCACATCAAGCTGGGCAGTTACACTGAGGCTGTAGCTGATGCCAACAAAGCAATTGAACTTGATCCCTCGATGCACAAAGCGTACCTTCGGAAGGGTTCTGCTTGCATCAAGCTGGAGGAATACCAAACTGCAAAGGCTGCTCTTGAAGTTGGTTCTTCCTATGCATCTGGTGACTCAAGGTTTACTCGTCTTATGAAGGAGTGTGATGATCGTATTGCTGAGGAGGCTAGCCAGGCGCCAGTAAAGAATGCCGCTGCGGCTGTTGCTCCTGCTACATCTTCCGGGGCTACAACTGTGGTTACTGAAGCTGAGGACCAGGATGGTGAAAATATGGAGAATGCACAGCCAACGGTAGAAGTGCCAAGCAAGCCCAAATACAGGCATGACTACTACAATACTCCTACAGAAGTGGTACTGACTATATTTGCTAAGGGTGTTCCAGCTGACAGCGTGGTTGTTGACTTTGGTGAACAGATGCTGAGTGTCTCAATTGAACTTCCTGGTGAGGAACCATACCATTTCCAGCCTCGTCTGTTTTCAAAGATCGTCCCAGATAAGTGCAAGTATACTGTATTGTCTACAAAGGTCGAAATACGCCTGGCAAAAGCTGAGCCAGTAACTTGGACATCACTGGATTATACTGGTAAACCAAAGGCTCCTCAGAAGATAAATGTACCAGCTGAATCAGCCCAGAGGCCATCTTATCCTTCATCAAAATCCAAAAAGGACTGGGATAAGCTTGAGGCTGAAGTGAAAAAACAGGAGAAGGATGAGAAACTTGACGGTGATGCTGCATTGAACAAGTTTTTCCGTGAAATTTACAGTGATGCTGATGAAGATATGCGTAGAGCAATGATGAAGTCTTTTGTGGAGTCTAATGGAACCGTTCTCTCAACCAACTGGAAAGATGTCGGGAAAAAGACGGTTGAAGGAAGCCCTCCTGATGGAATGGAGCTCAAGAAGTGGGAGTATTAA。
HvRAR1基因的CDS序列长699bp，具体序列如下：
ATGTCGGCGGAGACGGAGAGGAGCGCCGCCGCGCCCGCGCCCGCGCCCATGCGGTGCCAGCGCATAGGCTGCGACGCCATGTTCACCGACGACGACAACCCCGATGGCTCCTGCCACTACCACCCCTCCGGACCTCTGTTTCATGATGGCATGAAAGAGTGGAGCTGTTGCAAGCAAAGAAGCCATGATTTTAGCTTATTTTTGGCTATTCCTGGATGTGCCACAGGGAAGCATACAACTGAGAAACCAGTCACAAAAGCTGTTTCTCTTAACTCCTCAAAGGCAACCCCACCAAAGTCAGCTCCAGTCCAGTCTTCTAAGCAGGGTGTGGAAACTGAGGCCTGCTCAAGGTGCCGTCAGGGTTTCTTTTGTTCTGACCATGGATCACAGCCCAAGGCACAAAAACCAGTTGCTGTAAATGGTACAAATACGGAATCTGTCCAGAAATCCTCAGTTCCAGAGCCCAAGAAAAAGGTTGTTGATATAAATGAACCTAGGGTTTGTAAGAATAAAGGATGTGGCAAAACGTACAAGGAGAAGGATAACCATGATGCTGCATGCGATTACCATCCAGGTCCTGCAGTTTTCCATGACAGAAATAGAGGGTGGAAGTGTTGTGATGTCCATGTCAAGGAGTTTGACGAATTTATGGAGATACCTCCATGCACAAAGGGGTGGCACAATGCTGATGCTGTGTGA。
GFP基因的CDS序列长720bp，序列为：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA。
各引物序列见表1：
表1
(2)BP反应重组PCR产物进入pDONR载体，形成目的基因的入门载体BP反应步骤(参见InvitrogenBP ClonaseTM II Enzyme Mix,Cat.No.11789-020)：
①在1个0.2ml的PCR管中加入下列成分，并混合均匀(室温)；
②混匀短暂离心；
③25℃孵育1小时；
④取连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞(庄盟)，筛选阳性克隆并测序验证，从测序结果看，HvSGT1(图10)、HvRAR1(图11)、GFP(图12)基因的入门载体都是正确的。
步骤2.构建融合表达载体：
经LR反应将入门载体中的HvSGT1基因(cDNA序列见Seq ID NO：1)重组融合到P-Cluc-G的C端，形成P-Cluc-HvSGT1融合表达载体；
经LR反应将入门载体中的HvRAR1基因(cDNA序列见Seq ID NO：2)重组融合到P-Nluc-G的N端，形成P-Nluc-HvRAR1融合表达载体；
经LR反应将入门载体中的GFP基因(cDNA序列见Seq ID NO：3)分别重组融合到P-Nluc-G的N端，形成P-Nluc-GFP融合表达载体，用同样的方法构建P-Cluc-GFP融合表达载体；
其中LR反应步骤和条件参见Invitrogen LR ClonaseTM II Enzyme Mix(Cat.NO.11791-020)，具体如下：
①在1个0.2ml的PCR管中加入下列成分，并混合均匀(室温)；
②混匀短暂离心；
③25℃孵育1小时；
④取连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞(庄盟)，筛选阳性克隆并测序验证，从测序结果看，HvSGT1(图10)、HvRAR1(图11)、GFP(图12)基因的融合表达载体都是正确的。
步骤3.N端/C端融合表达载体的体外翻译：
①按照麦胚提取物转录/翻译偶联系统的体系，加入下列成分：
上述溶液混匀离心；
30℃孵育2小时；
HvRAR1和GFP质粒按上述方法进行翻译；
按照1：1的比例混合蛋白溶液，P-Cluc-HvSGT1/P-Nluc-HvRAR1、P-Cluc-GFP/P-Nluc-HvRAR1、P-Cluc-HvSGT1/P-Nluc-GFP混合，形成两组混合物。
室温孵育30分钟；
步骤4.蛋白互作结果的检测。
向每个蛋白混合物中，加入荧光素酶底物，混匀，静置1分钟，放入酶标仪中，采集信号，根据信号大小来判断互作关系。
结果显示：如图13可以看出，实验组P-Cluc-HvSGT1/P-Nluc-HvRAR1的信号明显大于对照组P-Cluc-GFP/P-Nluc-HvRAR1和P-Cluc-HvSGT1/P-Nluc-GFP，与预期结果相同。这表明利用Gateway载体和体外蛋白翻译系统可以很好的适用于LCI技术来检测蛋白之间的互作关系。信号值相比对照越大，表示互作关系越强，反之则互作关系越弱。而且WesternBlot实验可以看到正确大小的蛋白表达(图14)
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测蛋白互作的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P-Nluc-G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的C端载体P-Cluc-G；
2)构建含待测蛋白A编码基因的入门表达载体1、含待测蛋白B编码基因的入门表达载体2和含GFP基因的入门表达载体3；
3)构建融合表达载体：通过LR反应将入门载体1的待测蛋白A编码基因重组克隆到P-Cluc-G中多肽片段Cluc的C端，得到融合表达载体P-Cluc-A；将入门表达载体2中的待测蛋白B编码基因重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端，得到融合表达载体P-Nluc-B；
通过LR反应分别将GFP基因重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端、P-Cluc-G中多肽片段Cluc的N端，获得对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP；
4)利用Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte Lysate System/Reticulocyte Lysate System分别对N端融合表达载体P-Nluc-B、C端融合表达载体P-Cluc-A、对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP进行体外翻译，然后将表达GFP、蛋白A和蛋白B中的蛋白两两混合，获得表达A/B、A/GFP、B/GFP蛋白的混合液，加入荧光素酶底物，检测信号强度，根据检测信号判定待测蛋白A和待测蛋白B是否存在互作关系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括：
用限制性内切酶SacⅠ和HindⅢ对表达载体pIX-Halo进行酶切，回收线性载体片段pIX-M；以pIX-Halo载体为模板扩增获得AttR片段；分别以载体pCAMBIA1300-nLUC和pCAMBIA1300-cLUC为模板扩增获得Nluc和Cluc片段；通过Clone Enzyme重组酶将pIX-M、Nluc片段和AttR片段按顺序重组，获得P-Nluc-G载体；将pIX-M、AttR片段和Cluc片段按顺序重组获得P-Cluc-G载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：
采用带有attB重组位点的引物分别扩增待测蛋白A的编码基因和待测蛋白B的编码基因，获得BP反应重组的PCR产物1和PCR产物2；
将所述PCR产物1和PCR产物2分别连接至pDONR载体中，获得入门载体1和入门载体2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述室温孵育的时间为20分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述荧光素底物为D-Luciferin钾盐。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述判定方法为：
将表达蛋白A/B的混合液的信号值记为F，将表达蛋白A/GFP混合液和B/GFP混合液的信号值分别记为F1、F2；
若F≥1.4×S1，且F≥1.4×F2，则待测蛋白A和待测蛋白B存在互作关系；
若F＜1.4×F1或F＜1.4×F2，则待测蛋白A和待测蛋白B不存在互作关系。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte Lysate System/Reticulocyte Lysate System的体外翻译体系包括：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体外翻译的条件为：30℃孵育2小时。
9.用于检测蛋白互作的试剂盒，其特征在于，包括表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P-Nluc-G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的P-Cluc-G荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的C端载体P-Nluc-G、待测蛋白A编码基因的入门表达载体1，以及含待测蛋白B编码基因的入门表达载体2以及Wheat Germ Extract体外蛋白表达系统。
10.一种筛选目的蛋白的互作蛋白的方法，其特征在于，包括：
1)构建表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P-Nluc-G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的C端载体P-Cluc-G；
2)构建含目标蛋白C的编码基因的入门表达载体M，以及含候选蛋白的编码基因的入门表达载体N和含GFP基因的入门表达载体3；
3)构建融合表达载体：通过LR反应将入门载体M中的目标蛋白C的编码基因重组克隆到P-Cluc-G中多肽片段Cluc的C端，得到融合表达载体P-Cluc-C；
将入门表达载体2中的候选蛋白S的编码基因分别重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端，得到融合表达载体P-Nluc-B；所述候选蛋白S的数量≥2；
通过LR反应分别将GFP基因重组克隆到P-Nluc-G中多肽片段Nluc的N端、P-Cluc-G中多肽片段Cluc的N端，获得对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP；
4)利用Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte Lysate System/Reticulocyte Lysate System分别对N端融合表达载体P-Nluc-S、C端融合表达载体P-Cluc-C、对照融合表达载体P-Nluc-GFP和P-Cluc-GFP进行体外翻译，然后将蛋白C分别与其中一种蛋白S的表达产物混合，将GFP蛋白和蛋白C的表达产物混合，获得表达C/S、A/GFP、B/GFP蛋白的混合液，加入荧光素酶底物，检测信号强度，根据检测信号筛选出目标蛋白C和候选蛋白B中存在互作关系的蛋白。
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