CN113195516A - 由特异性结合物识别的表位标签 - Google Patents

由特异性结合物识别的表位标签 Download PDF

Info

Publication number
CN113195516A
CN113195516A CN201980074346.7A CN201980074346A CN113195516A CN 113195516 A CN113195516 A CN 113195516A CN 201980074346 A CN201980074346 A CN 201980074346A CN 113195516 A CN113195516 A CN 113195516A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
antibody
fusion protein
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980074346.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·弗雷
H·格茨戈
D·L·F·奥帕索
P·E·G·斯滕马克
C·M·马丁内兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanotec Biotechnology
Original Assignee
Nanotec Biotechnology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanotec Biotechnology filed Critical Nanotec Biotechnology
Publication of CN113195516A publication Critical patent/CN113195516A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K16/2854—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72 against selectins, e.g. CD62
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/80—Immunoglobulins specific features remaining in the (producing) cell, i.e. intracellular antibodies or intrabodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Abstract

本发明提供可用作表位标签的肽以及特异性结合这些肽的抗体，所述肽可与目标多肽融合。所述肽和/或抗体可用于检测、固定、分离或纯化与这种肽和/或抗体偶联的分子。

Description

由特异性结合物识别的表位标签
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年9月11日提交的欧洲专利申请No.18193663.4和于2019年3月4日提交的欧洲专利申请No.19160485.9的优先权权益，其内容在此全文引入作为参考。
发明领域
本发明提供可用作表位标签的肽以及特异性结合这些肽的抗体，所述肽可与目标多肽融合。所述肽和/或抗体可用于检测、固定、分离或纯化与所述肽和/或抗体偶联的分子。
背景技术
表位标签实际上在生命科学的各个方面都起着重要的作用。例如，它们用于生物技术应用中，以便于重组蛋白的表达和纯化(Waugh,D.S.Making the most of affinitytags.Trends Biotechnol 23,316-320(2005))。在细胞生物学中，表位标签通常用于监测给定目的蛋白(POI)的生物发生或拓扑结构(Nooh,M.M.&Bhaouth,S.W.Visualization andquantification of GPCR trafficking in mammalian cells by confocalmicroscopy.Methods Cell Biol.142,67-78(2017)；Kocaoglu,O.&Carlson,E.E.Progessand prospects for small-molecule probes of bacterial imaging.Nat Chem Biol12,472-478(2016))。标签还有助于待借助质谱技术研究的蛋白质复合物的免疫沉淀(Shi,Y.等人.A stragety for dissecting the architctures of native macromolecularassemblies.Nat Methods 12,1135-1138(2015)；Smits,A.H.&Vermeulen,M.Characterizing Protein-Protein Interactions Using Mass Spectrometry:Challenges and Opportunities.Trends Biotechnol 34,825-834(2016))。多年来，至少有十几种不同的标签开发出来，为研究人员提供了多种用于最严谨方案的工具(Waugh,D.S.Making the most of affinity tags.Trends Biotechnol 23,316-320(2005)；Brizzard,B.Epitope tagging.BioTechniques 44,693-695(2008))。然而，一种给定的标签在特定应用中可能会表现得非常好，在其它应用中则完全失败。结果，大多数研究人员依赖于各种标签以覆盖所需应用的范围。
似乎迄今为止还没有一种真正通用的标签。一个解释可能是这样的事实，即大多数标签是在筛选抗天然存在的蛋白质的结合物(通常是单克隆抗体)时作为副产物被发现的。例如，c-myc-标签(Evan,G.I.，Lewis,G.K.,Ramsay,G.&Bishop,J.M.Isolation ofmonoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product.MolCell Biol 5,3610-3616(1985))、HA-标签(Field,J.等人.Purification of a RAS-responsive adenylyl cyclase complex from Saccharomyces cerevisiae by use ofan epitope addition method.Mol Cell Biol 8,2159-2165(1988))或Spot-标签
Figure BDA0003060971240000021
(Virant,D.等人.A peptide tag-specific nanobody enables high-quality labelingfor dSTORM imaging.Nat Commun 1-14(2018).doi:10.1038/s41467-018-03191-2，Braun,M.B.等人.Peptides in headlock-a novel high-affinity and versattlepeptide-binding nanobody for proteomics and microscopy.Sci Rep 6,19211(2016))就属于这种情况。典型地，标签因此默认为是被相应的结合物有效识别的最小肽。结果，这些标签的性质主要随机地取决于所选择的结合物，并且它们通常不能被重新调整以适应特定的实验需求或条件。或者，一些标签也被理性地设计用于一个特定的应用。例如，His-标签理想地适用于重组表达的蛋白在金属离子螯合树脂上的粗略的初始纯化，这正是该标签开发的目的(Hochuli,E.,
Figure BDA0003060971240000022
H.&Schacher,A.New metal chelate adsorbentselective for proteins and peptides containing neighbouring histidineresidues.J.Chromatogr.411,177-184(1987))。然而，由于缺乏高亲和力的结合物，His-标签迄今为止还没有被广泛用于在细胞生物学中的显微应用。
本发明的目的是提供改进的表位标签及其特异性结合分子。
发明概述
本发明涉及融合蛋白，包含：(a)一种包含X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：01)的肽，其中X1是G或S或T或P，X2是R或G或A或E或P，X3是L或V，X4是E或Q，X5是E或Q，X6是E或Q，X7是L或I或V，X8是R或A或Q或E，X9是R或A或Q或E，X12是S或T或D或E或P或A或无氨基酸，并且其中X13是E或K或P或S或A或D或无氨基酸；和(b)一种多肽。
本发明还涉及特异性结合包含在本发明所述融合蛋白中的所述肽的抗体。
本发明还涉及包含本发明所述抗体结合的肽的融合蛋白。
本发明还涉及包含本发明所述融合蛋白和本发明所述抗体的复合物。
本发明还涉及编码本发明所述融合蛋白或本发明所述抗体的核酸。
本发明还涉及包含本发明所述核酸的载体。
本发明还涉及包含本发明所述核酸或本发明所述载体的宿主细胞，或表达本发明所述融合蛋白或本发明所述抗体的宿主细胞。
本发明还涉及本发明所述抗体用于检测、固定、分离或纯化本发明所述融合蛋白的用途。
本发明还涉及检测本发明所述融合蛋白的方法，包括使所述融合蛋白与本发明所述抗体接触。
本发明还涉及分离本发明所述融合蛋白的方法，包括使所述融合蛋白与本发明所述抗体接触。当本发明所述融合蛋白包含抗体部分时，本发明还涉及分离所述抗体部分的特异性靶标的方法。
本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒包含编码包含在本发明所述融合蛋白中的肽和任选的本发明所述抗体的核酸或核酸表达构建体。
附图说明
图1：ALFAST和ALFAPE与NbALFAST的相互作用
A，用于ALFA结合测定的蛋白质示意图。在该图中，用于shGFP2融合体(fusion)的ALFA标签可以是ALFAST(SEQ ID NO：05-07)，也可以是ALFAPE(SEQ ID NO：33)。B，20μl呈递NbALFAST(SEQ ID NO：133)的ALFA SelectorST树脂用在不同位置(内部(左)；N-末端(中间)或C-末端(右))与ALFAST或ALFAPE融合的GFP变体(shGFP2，Frey和
Figure BDA0003060971240000031
Cell.2018年6月28日；174(1):202-217.e9.doi：10.1016/j.cell.2018.05.045)饱和。用PBS洗涤4次后，将珠子悬浮在10倍过量的含有200μM ALFAST肽(乙酰基-PSRLEEELRRRLTEP-酰胺，SEQ ID NO：179)的PBS中，并在室温下温和地混合。在指定的时间点，利用释放到上清液中的GFP荧光定量从珠子的特定洗脱。示出的是平行进行的三个独立实验的平均荧光值和每个时间点的标准偏差。在室温下20-30分钟后已经观察到ALFAPE融合体的有效肽洗脱。相比之下，与AFFAST融合的所有GFP变体都保持与树脂紧密结合。值得注意的是，洗脱动力学在很大程度上与融合蛋白中相应ALFA标签变体的位置无关。C，将10μl用ALFAST-shGFP2(顶排)或ALFAPE-shGFP2(底排)饱和的ALFA SelectorST树脂转移到8孔PCR条带中。除去剩余液体后，在室温下将珠子与100μl所示物质孵育60分钟。在珠子沉降之后拍摄照片。星号(*)表示已知导致GFP荧光部分或全部损失的条件。
图2：使用ALFA SelectorST从复杂(complex)裂解物中下拉带ALFA标签的靶蛋白和蛋白复合物。
A，shGFP2以N-末端融合到ALFAST(SEQ ID NO：07；ALFAST-sfGFP2，左)或ALFAPE(SEQID NO：33；ALFAPE-GFP，右)。蛋白质在大肠杆菌中过表达，并通过借助其C-末端的His6-标签的镍亲和层析、然后在Superdex 75尺寸排阻柱上的凝胶过滤进行纯化。B+C，为获得用于使用ALFA Selector ST的一步亲和纯化的限定的input材料，将大肠杆菌(B)或HeLa(C)模拟提取物与3μM的相应底物混合。模拟裂解物用作特异性对照。1mL每种裂解物/底物混合物与25μl包含NbALFAST(SEQ ID NO：133)的ALFA-Selector ST在4℃下孵育1小时。用1mL PBS洗涤4次后，将结合的蛋白在室温下用25μl 200μM ALFAST肽(SEQ ID NO：179)的PBS溶液洗脱2次10分钟。随后，保留在珠子上的蛋白用SDS样品缓冲液洗脱。0.5μl(B)或1.5μl(C)的input原料和未结合部分经SDS-PAGE(12％)和考马氏染色分析。所示的洗脱液流份对应于从1μlALFA Selector ST树脂上洗脱的物质。值得注意的是，带ALFAST标签或ALFAPE标签的蛋白用ALFA Selector ST可以在自然条件下被特异性地下拉。与ALFAPE标签融合的蛋白质的高效和特异性洗脱可以在自然条件下通过与游离ALFA ST肽竞争来实现。还值得注意的是，与通过常规两步色谱法纯化的相应底物蛋白相比，使用ALFA Selector ST树脂从两种中任一裂解物纯化的蛋白质含有明显更少的杂质。
D，左：YfgM-PpiD复合物的示意图。右：未带标签的(-)(SEQ ID NO：198)或C-末端带ALFAPE标签的YfgM(+)(SEQ ID NO：197)在yfgGM缺失株中被表达。使用1％DDM从总裂解物中溶解膜蛋白复合物。含YfgM-ALFAPE的复合物使用包含SEQ ID NO：133的纳米抗体的ALFASelector ST亲和树脂一步法纯化。抗YfgM-PpiD复合物的血清识别input部分中的PpiD和YfgM两者。ALFA SelectorST特异性免疫沉淀YfgM-ALFAPE的天然蛋白复合物及其相互作用配偶体PpiD。
图3：免疫荧光应用中带ALFAST标签的蛋白质的基于纳米抗体的检测
A：与ALFAST标签(左)或ALFAPE标签(右)结合的NbALFAST的示意图。给出的是用于在不同位置进行标签标记的ALFA标签序列(N-末端ALFAST标签：SEQ ID NO：05，中间ALFAST标签：SEQ ID NO：06，C-末端ALFAST标签：SEQ ID NO：07)
B：NbALFAST的序列(NbALFA克隆1G5；SEQ ID NO：133)。灰框表示CDR 1-3(AbM定义，SEQ ID NO：115-117)。
C：Tom70-EGFP-ALFAST(上排)或Tom70-EGFP-ALFAPE(下排)转染的COS-7细胞用4％多聚甲醛固定。在透化之后，用与AbberiorStar635P(FluoTag-X2抗-ALFAAbberiorStar635P)偶联的NbALFAST进行染色。第一列：FluoTag-X2抗-ALFA；第二列：采用固有EGFP荧光的靶标检测；第三列：覆盖层加入DAPI染色；第四列：被荧光标记的NbALFAST检测到的靶蛋白的示意图。全部刻度条：20μM。
D：在用4％多聚甲醛(PFA)、2％戊二醛(GA)或100％甲醇(MEOH)固定后，N-末端带ALFAST标签的波形蛋白(上排)或带ALFAPE标签的波形蛋白(下排)用FluoTag-X2抗-ALFAAbberiorStar635P检测。右列：被荧光标记的NbALFAST检测到的带ALFA标签的波形蛋白的示意图。
E：带ALFAST标签的蛋白的基于胞内抗体的检测。用NbALFA ST-mScarlet-I融合体和带ALFA ST标签的靶蛋白共转染COS-7细胞。靶蛋白通过EGFP荧光(对TOM70-EGFP-ALFAST)或通过使用FluoTag抗-ALFA AbberiorStar635P的免疫荧光(对ALFAST-FLAG-波形蛋白)检测。平行地，NbALFAST-mScarlet-I通过红色mScarlet-I荧光检测。值得注意的是靶蛋白(左列)和mScarlet-I信号(中列)之间的良好共定位。
图4：带ALFA标签的蛋白质可通过荧光标记的NbALFAST来检测，与ALFA在融合蛋白中的位置无关。
COS-7细胞用编码与ALFA标签融合的蛋白的构建体转染，其中ALFA标签在蛋白的N-末端融合(ALFAST-FLAG-波形蛋白或ALFAPE-FLAG-波形蛋白；A)或在单独的蛋白质结构域中融合(EGFP-ALFAST-myc-TM；B)。细胞用4％PFA固定并如所示染色。对于A和B，细胞用0.1％TritonX-100透化；对于C，细胞在非透化条件下染色。TM：跨膜结构域。示意图表明了底物的拓扑结构和被荧光标记的NbALFAST(FluoTag-X2抗-ALFA)检测。
图5：与N-或C-末端ALFAST标签融合的GFP显示正常的细胞内定位
用带有N-或C-末端ALFAST标签的EGFP融合体瞬时转染3T3细胞。来自pEGFP-N1的未带标签的EGFP用作对照。对每种构建体，基于6-7幅单独图像分析各个EGFP变体的定位。每种构建体共拍摄120-130个细胞，并分析EGFP的定位。通常，每种EGFP构建体显示出跨胞质溶胶和细胞核的分布。根据观察到的EGFP的核质定位，将细胞分成三组(“轻微核定位”，“均匀的”和“其它的”)。从各个图像获得的值推导出标准偏差。带标签的和未带标签的EGFP变体的定位之间的差异在统计学上不显著(Student’s t-检验)。
图6：使用荧光标记的NbALFAST(FluoTag-X2抗-ALFA)对带ALFA标签的靶蛋白的蛋白质印迹(Western-blot)和斑点印迹(dot-blot)检测
A，用ALFA ST-FLAG-波形蛋白或ALFAPE-FLAG-波形蛋白转染的COS-7细胞在SDS缓冲液中裂解。用无关质粒转染的细胞用作对照。通过SDS-PAGE和Western-Blot分析对应于相同数量细胞的裂解物。波形蛋白融合蛋白用与IRDye800(FluoTag-X2抗-ALFA IRDye800)偶联的NbALFAST可视化。微管蛋白作为负载对照，并通过小鼠抗微管蛋白及随后的与IRDye680偶联的FluoTag-X2抗小鼠进行检测。完整的泳道在图7A中示出。
B，用于C和D所示的实验的带有多个表位标签(FLAG、HA、myc和ALFAST)的重组大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)的示意图。
C，B中所示蛋白质的稀释系列点样到硝酸纤维素膜上。已有的单克隆抗体(抗-FLAG M2-Sigma#F1804，抗-myc 9E10-SynapticSystems#343 011，抗-HA F-7-SantaCrus#sc-7392)与第二抗小鼠IgG IRDye800CW(Li-Cor#925-32210，1:1000稀释)合用以分别检测FLAG、myc和HA-标签。ALFAST标签使用直接与IRDye800CW偶联的FluoTag-X2抗-ALFA检测。所述纳米抗体和所有一级抗体以2.7nM的终浓度使用，该浓度完全在供应商推荐的范围内。包括内部对照的完整实验在图7B中示出。
D，在C中获得的信号的定量，以双对数图显示。线条表示对所获得的值的线性拟合。即使信号没有经第二抗体放大，通过NbALFAST获得的信号也是通过已有识别表位标签的试剂的信号的3倍至＞10倍那么强。同时，利用NbALFAST的检测灵敏度是10倍高，并且显示出超过～3个数量级的良好的线性。
图7：使用荧光标记的NbALFAST(FluoTag-X2抗ALFA)对带ALFA标签的靶蛋白的高灵敏蛋白质印迹和斑点印迹检测
A，与图6A所示的相同实验。然而，这里示出了完整的泳道。应注意的是，在不存在任何编码带ALFAST标签的蛋白的载体的情况下，用荧光标记的NbALFA(FluoTag-X2抗ALFA)只能检测到非常小的条带(*)。
B，与图6C所示的相同实验。除了图6C所示的数据外，通过识别MBP的兔多克隆血清(SynapticSystems)和抗兔IgG IRDye680RD(Li-Cor#925-68071)的组合对MBP的检测显示为内部负载对照。覆盖层显示MBP信号为红色而对应于表位标签的信号为绿色。
图8：带ALFAST标签的蛋白质与ALFA SelectorST和ALFA SelectorPE树脂的相互作用。
A；与shGFP2-ALFAST结合的ALFA Selector树脂的示意图。在该示意图中，所述ALFASelector树脂可以是ALFA SelectorST或ALFA SelectorPE。
B和C；从NbALFA偶联的亲和树脂的肽洗脱。使与NbALFAST(SEQ ID NO：133；ALFASelectorST，左)或NbALFAPE突变体(SEQ ID NO：134；ALFA SelectorPE，右)偶联的琼脂糖基树脂负载上带有C-末端ALFAST标签的shGFP2。为了评估解离速率(off-rate)，将树脂悬浮在含有过量游离ALFAST肽的PBS中，并在25℃下孵育。在没有肽的情况下进行对照反应。在所示的时间点，对从树脂释放的shGFP2进行定量。B显示三个实验的平均荧光读数以及每个时间点的标准偏差。线条表示对单个指数的拟合。在室温下15-20分钟后就已观察到shGFP2-ALFAST从ALFA SelectorPE有效的肽洗脱。相比之下，即使在长时间孵育后，肽从ALFASelectorST的洗脱也是低效的。在洗脱过程中不存在游离ALFAST肽的情况下，带ALFAST标签的靶蛋白与两种树脂都保持紧密结合。洗脱3小时后，在UV照射下拍摄照片(C)。
D；对严格洗涤步骤的耐性。使B中所述的ALFA Selector变体负载上ALFAST-shGFP2或shGFP2-ALFAST并在25℃下用所述物质的10倍体积振摇孵育1h。不经进一步的洗涤步骤，在珠子沉降之后在UV照射下拍摄照片。
E；对非生理pH的耐性。与D相似。但是此处在指定的pH下孵育30分钟后，洗涤树脂以除去未结合的物质。在PBS中重新平衡以使GFP荧光恢复之后拍摄照片。
图9：使用ALFA SelectorST和ALFA SelectorPE从复杂裂解物中下拉带ALFAST标签的靶蛋白和蛋白复合物。
A；(B和C中)所述的用于实验的input蛋白。
B和C；采用ALFA Selector树脂的一步亲和纯化。与3μM纯化的带ALFAST标签的shGFP2(A)共混的大肠杆菌(A)或HeLa(B)裂解物与ALFA SelectorST树脂、ALFA SelectorPE树脂或不含被固定的sdAb的类似树脂(对照Selector)孵育。用PBS洗涤后，将所述树脂与200μM ALFAST肽孵育20分钟。保留在珠子上的蛋白质用SDS样品缓冲液洗脱。所示的流分通过SDS-PAGE和考马氏染色进行分析。所示的洗脱液流份对应于从1μl树脂洗脱下来的物质。
D；采用ALFA SelectorPE下拉天然大肠杆菌YfgM-PpiD内膜蛋白复合物。左：YfgM-PpiD膜蛋白复合物的示意图。右：用从低拷贝载体表达的C-末端带ALFAST标签(左侧图)或未带标签的YfgM(右侧图；对照反应)补充yfgM缺失菌株。使用DDM将膜蛋白复合物从总裂解物中溶解出来。含有YfgM-ALFAST的复合物利用ALFA SelectorPE亲和树脂一步纯化并在自然条件下用200μM ALFAST肽洗脱。对应于input和未结合材料的1/800或洗脱液流份的1/80的样品用SDS page分解并用Western-blot分析。抗YfgM-PpiD复合物的兔血清(
Figure BDA0003060971240000081
等人.YfgM is an ancillary subunit of the SecYEG translocon in Escherichia coli.JBiol Chem 289,19089-19097(2014))识别input部分中的PpiD和YfgM两者。ALFASelectorPE特异性免疫沉淀包含带ALFAST标签的YfgM及其相互作用配偶体PpiD的天然蛋白复合物。在对照反应中(在YfgFGM上没有ALFAST标签)，两种蛋白在洗脱液中均不存在。
图10：从ALFA Selector树脂的带ALFAST标签的GFP的肽洗脱。
使20μl ALFA SelectorST(呈递NbALFAST，SEQ ID NO：133)或ALFA SelectorPE(呈递NbALFAPE，SEQ ID NO：134)负载上shGFP2-ALFAST(A)、bdSUMO-ALFAST-shGFP2(B)或ALFAST-shGFP2(C)。在用PBS洗涤之后，将珠子悬浮在10倍过量的含有200μM游离ALFAST肽的PBS中，并在25℃下温和地混合。进行没有肽的对照反应。在所示的时间点，利用释放到上清液中的GFP荧光定量从珠子的特定洗脱。显示的是三个实验的平均荧光读数以及每个时间点的标准偏差。线条表示对单个指数的拟合。仅给出从ALFA SelectorPE的肽洗脱的一半用时。对于所有底物蛋白，即使在延长孵育后，从ALFA SelectorST的肽洗脱也是低效的。在没有ALFAST肽的情况下，带ALFAST标签的靶蛋白与两种树脂都保持紧密结合。图10A重复图8B所示的数据，并在此重复以允许直接比较。左图：示出实验设置的示意图。所述ALFA Selector树脂可以是ALFA SelectorST或ALFA SelectorPE；中图：用ALFA SelectorST进行的实验；右图：用ALFA SelectorPE进行的实验。
图11：与ALFAST肽结合的NbALFAST的X射线结构
A-C；NbALFAST-ALFAST肽结构的视图。A，ALFAST肽的N-末端的视图；B，ALFAST肽的侧视图；C，ALFAST肽的C-末端的视图。NbALFAST用浅灰色表示，侧链用线表示。接触ALFAST肽的残基用棒表示。ALFAST肽用深灰色描绘，侧链用棒显示。采用的是N-末端乙酰化和C-末端酰胺化的ALFAST肽(SEQ ID NO：179)。
D；NbALFAST的序列(SEQ ID NO：133)。如图3B所示，方框表示CDR 1-3(SEQ ID NO：115-117)。直接接触ALFAST肽的残基用方框框出。填充框中的残基发生突变以降低对ALFAST肽的亲和力。
图12：使用识别CD62L的带ALFA标签的纳米抗体分离幼稚淋巴细胞。
总人PBMC未做处理(分选前)或用负载带ALFA标签的抗人CD62L纳米抗体的ALFASelectorPE树脂分离(分选后)。亲和纯化策略的示意图在(a)中示出。细胞用抗CD62L抗体染色，并通过流式细胞术进行分析(b)。与(b)中相同的细胞用针对CD3、CD19和CD62L的抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分析(c)。在所有分析中，在淋巴细胞上设置前向散射/侧向散射门。
具体实施方式
为了克服现有技术中的一些缺点，本申请的发明人创建了被高亲和力纳米抗体识别的小表位标签。这样的系统可以允许在多个方面分析蛋白质的功能，包括但不限于分析其定位、通过从裂解物纯化分析其相互作用配偶体或体内操作，所述体内操作包括使用最小集的重组构建体和细胞系诱导的蛋白质错位或耗竭，而不会无意地干扰靶蛋白质的生理功能。
鉴于当前表位标签的限制，本申请的发明人决定解决该问题并发现理想的表位标签系统应该具有的特征。真正通用的标签应当很小，以使潜在的副作用最小化(Kocaoglu,O.和Carlson,E.E.Progress and Prospects for small-molecule probes of bacterialimaging.Nat Chem Biol 12,472-478(2016))。它优选是单体的，以便使带标签的蛋白质的人为寡聚化最小化。它也应当是电中性的，以避免给带标签的蛋白质增加净电荷；同时它应当是可溶的(Esposito,D.和Chatterjee,D.K.Enhancement of soluble proteinexpression through the use of fusion tags.Curr.Opin.Biotechnol.17,353-358(2006))。理想的标签不应影响带有该标签的蛋白的天然结构、拓扑结构或定位(Stadler,C.等人.Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show highcorrelation for protein localization in mammalian cells.Nat Methods 10,315-323(2013)；Hoffmann,C.等人.A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells.Nat Methods 2,171-176(2005))。此外，所述标签应当在真核和原核宿主中良好地被表达，并且应当抗蛋白水解降解。理想地，它应当耐固定，并且它的序列应当在普通的模型生物体中不存在，以避免对内源性宿主蛋白的无意检测。
与理想的表位标签相似，其相应的结合物也应当具有几个特性，以使标签检测完美。例如，结合物应当很小，以便易于接近拥挤的区域，并为不同的应用提供最佳的结合亲和力。当前复杂的应用(例如活体内成像)需要对标签具有高亲和力的特异性和遗传可获得的探针，其应当能够在各种宿主生物体内自主折叠。然而，对于生物化学应用，优选的结合物应当优先具有中间亲和力，以便允许在天然条件下竞争性洗脱免疫沉淀物质。当评估迄今为止已有的常用表位标签时，应用现有技术的本领域技术人员将最终需要牺牲至少一个所提及的特征(参见下表1)。为了制备具有满足所有所述边界条件的最终通用性的表位标签，本申请的发明人已经认识到最直接的方法是重新设计它。
表1：通用表位标签系统的性质
Figure BDA0003060971240000101
Figure BDA0003060971240000111
n.a.：不适用
n.d.：没有可用的数据
mAb：单克隆抗体
sdAb：单结构域抗体
1为了达到最优性能，通常多个标签串联使用(Hernan,R.,Heuermann,K.和Brizzard,B.Multiple epitope tagging of expressed proteins for enhanceddetection.BioTechniques 28,789–793(2000)；Ross-Macdonald,P.,Sheehan,A.,Roeder,G.S.和Snyder,M.A multipurpose transposon system for analyzing proteinproduction,localization,and function in Saccharomyces cerevisiae.Proc NatlAcad Sci USA 94,190-195(1997)；Sharrock,R.A.和Clack,T.Heterodimerization oftype II phytochromes in Arabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA 101,11500–11505(2004)；Graumann,J.等人.Applicability of tandem affinity purification MudPITto pathway proteomics in yeast.Mol.Cell Proteomics 3,226–237(2004))
2结合物还识别生物素化的蛋白质
3结合物识别具有多个可及组氨酸的内源性蛋白质。
4依赖于所用的螯合物和聚组氨酸标签
5结合物还识别内源性β-联蛋白
6结合物需要二聚化以适于高清成像应用(Virant,D.等人.A peptide tag-specific nanobody enables high-quality labeling for dSTORM imaging.Nat Commun1–14(2018).doi:10.1038/s41467-018-03191-2)
7用胺反应性固定剂和交联剂固定；由序列推导出的
8Schmidt,T.G.M.等人.Development of the
Figure BDA0003060971240000121
and itsapplication for purification of recombinant proteins from cell culturesupernatants.Protein Expr.Purif.92,54–61(2013)
9Porath,J.,Carlsson,J.,Olsson,I.和Belfrage,G.Metal chelate affinitychromatography,a new approach to protein fractionation.Nature 258,598–599(1975)；Hochuli,E.,
Figure BDA0003060971240000122
H.和Schacher,A.New metal chelate adsorbent selectivefor proteins and peptides containing neighbouring histidineresidues.J.Chromatogr.411,177–184(1987)
10Hopp,T.P.等人.A Short Polypeptide Marker Sequence Useful forRecombinant Protein Identification and Purification.Nat Biotechnol 6,1204–1210(1988)
11Wilson,I.A.等人.The structure of an antigenic determinant in aprotein.Cell 37,767-778(1984)
12Evan,G.I.,Lewis,G.K.,Ramsay,G.和Bishop,J.M.Isolation of monoclonalantibodies specific for human c-myc proto-oncogene product.Mol Cell Biol 5,3610–3616(1985)
13Virant,D.等人.A peptide tag-specific nanobody enables high-qualitylabeling for dSTORM imaging.Nat Commun 1–14(2018).doi:10.1038/s41467-018-03191-2；Braun,M.B.等人.Peptides in headlock-a novel high-affinity andversatile peptide-binding nanobody for proteomics and microscopy.Sci Rep 6,19211(2016)
14Petukhov,M.等人.Design of stable alpha-helices using global sequenceoptimization.J.Pept.Sci.15,359–365(2009)
15Hunter,M.R.,Grimsey,N.L.和Glass,M.Sulfation of the FLAG epitope isaffected by co-expression of G protein-coupled receptors in a mammalian cellmodel.Sci Rep 6,27316(2016)
16Schembri,L.等人.The HA tag is cleaved and loses immunoreactivityduring apoptosis.Nat Methods 4,107–108(2007)
17 https://www.iba-lifesciences.com/tl_files/ProteinProductionAssays/5- Immobilization/DynamicBiosensors-Application-Note-StrepTactinXT- switchSENSE.pdf
18N：N-末端；M：在两个折叠的结构域之间；C：C-末端。
有了这样明确的目标，本申请的发明人设计了本文所述的表位标签。本发明的表位标签优选由约8-25个氨基酸组成，共同称作ALFA标签。
本申请的发明人决定采用一种全新的方法生成新的表位标签。根据本发明的表位标签是小的单体表位标签，优选具有≤15aa的最小尺寸。该序列优选在生理pH下是不带电的和亲水性的，并且最优选地，它没有易于被胺反应性固定剂和交联剂修饰的残基。所述尺寸与较大的标签(例如FLAG标签三聚体，其通常以3x串联形式被使用以便增加亲和力)或甚至更大的荧光蛋白形成对照。此外，本发明的表位标签在真核或原核序列数据库中没有对应物，这使与天然结构交叉结合的风险最小化。该特点与例如WO 2017/085086 A1中描述的
Figure BDA0003060971240000131
形成对照。
本发明的表位标签的另一个优点是，与例如Myc标签不同，它与普通的胺反应性固定剂(多聚甲醛(PFA)、戊二醛(GA))相容。它也与甲醇固定相容。本发明的表位标签的另一个优点是，它在定位上不受限制(N、C或蛋白质之间)，这与WO 2011/147890 A1中描述的EPEA标签不同。
不希望受理论的约束，据信根据本发明的表位标签形成稳定的α-螺旋结构。稳定的螺旋的形成被认为优于不同地折叠的、非折叠的或非稳定地折叠的结构，因为某些抗体，例如单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体被认为更倾向于确定的三维表面以进行结合。过去，很难产生与天然未折叠肽结合的单结构域抗体，这导致sbAb仅具有弱至中等的结合亲和力。因此，本申请的发明人致力于提供据信形成在溶液中稳定折叠的小α-螺旋的表位标签，因为这样的结构是作为单体形成稳定的二级结构的最小实体。不希望受理论的约束，据信即使在暴露于苛刻的化学处理之后，所述α-螺旋结构也有效地和自发地再折叠。此外，据信由于其螺旋结构，所述标签比大多数非结构化的线性表位标签小。此外，本发明的表位标签可以被放置在靶蛋白的N-或C-末端，或者甚至被放置在两个折叠的蛋白结构域之间，而不损害靶蛋白的正确靶向和折叠。
然而，发现理想的结合物被证明是有挑战的。虽然普通抗体确实能够满足大多数要求，但是它们的大尺寸使得它们对于当前的超分辨率显微技术来说不是最佳的(Fornasiero,E.F.和Opazo,F.Super-resolution imaging for cell biologists:Concepts,applications,current challenges and developments.Bioessays 37,436–451(2015)；Mikhaylova,M.等人.Resolving bundled microtubules using anti-tubulinnanobodies.Nat Commun 6,7933(2015))，并且其不能被基因编码以靶向活细胞中的细胞内靶标。因此，本申请的发明人选择开发满足设定的条件的骆驼(camelid)单结构域抗体(sdAb，也称作纳米抗体(Muyldermans,S.Nanobodies:Natural Single-DomainAntibodies.Annu Rev Biochem(2013).doi:10.1146/annurev-biochem-063011-092449)。为此，被称作“Celline”的新的内部选择方法使得发明人以非常省时的方式产生具有极高亲和力的来自羊驼的saAb。本发明的抗体与本发明的表位标签结合被证明非常适合用于成像和细胞内检测带ALFA ST标签的靶蛋白并允许非常有效和干净的免疫沉淀。
本发明还提供了本发明的表位标签的高亲和力抗体。一些抗体是单价sdAb基结合物。单价结合与被普通抗体结合的表位标签形成对照。虽然
Figure BDA0003060971240000141
被sdAb结合，为了增加亲和力，该结合
Figure BDA0003060971240000143
的sdAb在
Figure BDA0003060971240000142
的一些应用中作为二聚体来使用。单价抗体的使用具有可防止簇形成的优点。还据信，由于所述表位标签的α-螺旋结构，本发明的发明人能够产生以在约10pM的范围内的Kd结合本发明所述表位标签的单结构域抗体，该亲和力是可比较的表位标签/sdAb体系(如WO 2017/085086 A1或WO 2011/147890 A1中所述)的约～1000倍高。
对于本发明的一些表位标签，例如SEQ ID NO：05-07，实际上不可能在自然条件下有效地将包含SEQ ID NO：133序列的抗体与标签相分离。在一些情况下，这可能限制SEQ IDNO：05-07应用于纯化天然蛋白及其相互作用配偶体。解析SEQ ID NO：133的抗体和SEQ IDNO：179的肽的高亲和力复合物的晶体结构允许发明人详细地绘制相互作用决定簇，并设计允许在自然条件下竞争性洗脱带ALFA ST标签的靶蛋白和相互作用配偶体的新型单结构域抗体。为此目的的示例性抗体包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列。
本文中提供的表位标签和抗体系统适用于从生物技术到细胞生物学的非常广范围的应用。因此，单个标签可以同时取代很多种传统的表位标签。
因此，本发明涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)一种包含X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：01)的肽，其中X1是G或S或T或P，X2是R或G或A或E或P，X3是为L或V，X4是E或Q，X5是E或Q，X6是E或Q，X7是L或I或V，X8是R或A或Q或E，X9是R或A或Q或E，X12是S或T或D或E或P或A或无氨基酸，并且其中X13是E或K或P或S或A或D或无氨基酸；和(b)一种多肽。在本发明的融合蛋白中，所述肽可用作表位标签。
本文所用术语“肽”是指相互连接的一系列线性氨基酸，优选通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接。本文所用术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物，优选成蛋白质性氨基酸。“成蛋白质性氨基酸”是一种在翻译过程中可生物合成地掺入蛋白质中的氨基酸。目前，有22个已知的遗传编码(成蛋白质性)氨基酸，20个在标准遗传密码中，另外2个可通过特殊翻译机制掺入。本文所用的“肽”优选包含不超过约50个氨基酸。
本文所用术语“多肽”通常是指具有至少约30、至少约40或至少约50个氨基酸的肽。本文所用术语“蛋白质”包含一个或多个多肽。
本文所用术语“融合蛋白”是指包含两个或更多个亚单位的多肽或蛋白质。至少一个所述亚单位优选为蛋白质或多肽，至少一个所述亚单位优选为肽。在所述融合蛋白中，这些亚单位可以通过共价键或非共价键连接。优选地，所述融合蛋白是两个或更多个亚单位之间的翻译融合体。所述翻译融合体可以通过将阅读框中一个亚单位的编码核苷酸序列与另一个亚单位的编码核苷酸序列进行基因工程而产生。亚单位可以夹杂接头。
如果一个或多个所述亚单位是由多于一个多肽链组成的蛋白质(复合物)的一部分，术语“融合蛋白”也可以是指包含所述蛋白质(复合物)的融合序列和所有其它多肽链的蛋白质。
如本文所用的，“表位标签”是指能够产生特异性抗体或具有抗体样功能的蛋白质性(proteinaceous)分子的一段氨基酸。这样的表位标签可以允许特异性地识别和/或跟踪可存在于活的生物体或培养的细胞中的带标签的多肽或蛋白质。带标签的分子的检测可以使用多种不同的技术来实现。这些技术的例子包括：免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、电子显微术、ELISA、蛋白质印迹(“WesternBlot”)和亲和层析。所述表位标签在受试多肽上添加已知的表位(抗体结合位点)，以供已知的且通常具有高亲和力的抗体结合。表位标签也可用于分离和/或纯化带标签的分子，例如通过下拉应用。
在本发明的所述融合蛋白中，所述肽，即所述表位标签，可以位于所述融合蛋白的任何位置。所述肽可以融合到所述多肽的N-末端或C-末端。或者，所述肽可以在所述多肽的N-末端和C-末端之间的位置与该多肽融合。作为一个说明性的例子，所述肽可以融合到所述多肽的两个结构域之间。
包含在所述融合蛋白中的所述多肽可以具有与所述肽的存在与否无关的稳定折叠。这意味着所述肽优选不改变或干扰所述多肽的天然结构。
所述肽本身优选具有α-螺旋结构。已解析与包含乙酰基-PSRLEEELRRRLTEP-酰胺序列(SEQ ID NO：179)的ALFAST肽复合的具有SEQ ID NO：133序列的抗体的晶体结构，显示所述表位标签以稳定折叠的α螺旋与该纳米抗体结合。据信该结构解释了异常紧密的结合。本文所用的“α-螺旋结构”是指α-螺旋形式的二级结构。所述肽的α螺旋二级结构优选独立于融合配偶体。这意味着如果肽是分离的肽的形式，并且如果肽是融合蛋白的一部分，则该肽优选能够在生理缓冲液中形成α-螺旋二级结构。
所述肽可以被包含CDR序列GVTISALNAMAMG(SEQ ID NO：115)、AVSERGNAM(SEQ IDNO：116)和LEDRVDSFHDY(SEQ ID NO：117)的骆驼VHH结构域特异性识别。所述肽可进一步被本文所述的其它抗体特异性识别。
在本发明的所述融合蛋白中，所述肽可以通过直接融合或通过接头与所述多肽融合。本文所用的“接头”将本文所述的融合蛋白的两个或更多个亚单位连接在一起。所述连接可以是共价的。优选的共价连接是通过肽键，例如氨基酸之间的肽键。优选的接头是肽接头。所述接头优选包含一个或多个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。优选的肽接头包括甘氨酸-丝氨酸(GS)接头、糖基化GS接头和脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)接头。GS接头可以是如SEQ ID NO：159所述的(G4S)3接头。
包含在本发明所述融合蛋白中的多肽可以包含至少一个蛋白质结构域。本文所用的“蛋白质结构域”是指给定蛋白质序列和(三级)结构的一部分，其可独立于蛋白质链的其余部分起作用和/或存在。所述蛋白质结构域优选形成牢固的三维结构，并且通常可以独立地稳定和折叠。蛋白质结构域可进一步形成功能单元。包含在所述融合蛋白中的多肽可以包含多于一个蛋白质结构域，例如2个、3个、4个或甚至更多个蛋白质结构域。肽的优选位置可以在蛋白质结构域之外。这可以是所述多肽的至少一个蛋白质结构域的N-末端或C-末端，或者在所述多肽的两个蛋白质结构域之间。包含在本发明所述融合蛋白中的多肽可以是球形蛋白、膜蛋白、纤维蛋白或天然未折叠蛋白，或所述球形蛋白、膜蛋白、纤维蛋白或天然未折叠蛋白的亚单位或结构域。
包含在本发明所述融合蛋白中的肽可以具有约8至约25个氨基酸、优选约10至约18个氨基酸、优选约12至约17个氨基酸、优选12至15个氨基酸的长度。包含在本发明所述融合蛋白中的多肽可以具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸的长度。所述多肽可以是天然存在于表达本发明所述融合蛋白的细胞中的多肽或蛋白。
本发明的所述融合蛋白可以包含含有X1-X2-L-E-X5-E-X7-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：02)的肽，其中X1是G或S或P或T，X2是R或G或P，X5是E或Q，X7是L或I，X12是S或T或P或A或D或E，并且其中X13是P或A或S或A或D或E或无氨基酸。该序列定义了所述肽的核心结构，并且还可以在N末端包含最多两个附加的氨基酸，在C末端包含最多两个附加的氨基酸。肽核心结构末端的这种附加氨基酸通常不必然影响肽的二级结构或肽与肽特异性抗体的特异性结合，但可用作融合蛋白中的接头结构。因此，所述附加氨基酸的类型和数量可以取决于肽在融合蛋白中的位置，并且可根据肽是位于多肽的N-末端还是C-末端，或者还是位于多肽的N-末端和C-末端之间的某个位置而变化。包含SEQ ID NO：02序列的肽从包含SEQ ID NO：133序列的单结构域抗体解离的T1/2，例如当用实施例1中基本描述的测定测量时，可以为至少约2分钟。所述肽与包含SEQ ID NO：133序列的单结构域抗体的结合可以具有约30nM或更小的Kd。
包含在本发明所述融合蛋白中的所述肽可以包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是D或S或G或M或P或无氨基酸，Xb是S或D或P或M或R或G或无氨基酸。
包含在本发明所述融合蛋白中的所述肽可以包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或S或P或D或A或E或K或非氨基酸，Xz是S或P或无氨基酸。
本发明所述融合蛋白可以包含含有作为核心结构的X1-X2-L-E-X5-E-L-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：03)的肽，其中X1是S或T，X2是R或G，X5是E或Q，X12是T或D或E，并且其中X13是A或D或E或无氨基酸。这样的肽从包含SEQ ID NO：133序列的单结构域抗体解离的T1/2，例如当用实施例1中基本描述的测定测量时，可以为至少约100分钟。所述肽与包含SEQ ID NO：133序列的单结构域抗体的结合可以具有约1nM或更小的Kd。这样的肽可以包含S-R-L-E-E-E-L-R-R-R-L-T-E的序列(SEQ ID NO：04)或其变体，其中所述变体与(SEQID NO：04)相比具有1至5个突变，所述突变选自：S1→T、R2→G、E5→Q、T12→D，和T12→E、E13→A、E13→D，和E13的缺失。所述变体与SEQ ID NO：04相比可具有以下突变：(a)S1→T和E13→A；(b)R2→G；(c)R2→G和E5→Q；(d)R2→G、E5→Q和E13→A；(e)R2→G、E5→Q和T12→D，和E13→A；(f)R2→G、E5→Q和T12→E，和E13→A；(g)T12→D和E13→A；(h)T12→E和E13→A；(i)和E13→A；(j)和E13→D；或(k)E13的缺失。
一种包含作为核心结构的序列SEQ ID NO：03的肽可以包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是S或G或M或P或无氨基酸，Xb是R或G或S或P或M或无氨基酸。Xa-Xb可以选自P、M-P、G-R、P-G、P-S、S-P、G-P、S-P、M和M-S，优选P或M-P。这样的肽也可以包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中是P或D或A或无氨基酸，Xz是P或S或无氨基酸。Xy-Xz可以选自无氨基酸、P、D-P、A和A-S，优选无氨基酸或P。所述肽可以包含Xa-Xb和Xy-Xz的组合，所述组合选自：(a)M-P和P；(b)P和P；和(c)P和无氨基酸。
包含在本发明所述融合蛋白中的所述肽可以具有SEQ ID NO：03的核心结构，并且可以包含选自以下的序列：
(a)MPSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：05)；
(b)PSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：06)；
(c)PSRLEEELRRRLTE(SEQ ID NO：07)；
(d)GRSRLEEELRRRLTA(SEQ ID NO：08)；
(e)PGSRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：09)；
(f)PSTRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：10)；
(g)SPSRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：11)；
(h)SPSRLEEELRRRLDAP(SEQ ID NO：12)；
(i)SPSRLEEELRRRLEAP(SEQ ID NO：13)；
(j)SPSRLEEELRRRLTDP(SEQ ID NO：14)；
(k)SPSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：15)；
(l)SPSRLEEELRRRLTADP(SEQ ID NO：16)；
(m)SPSGLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：17)；
(n)GPSRLEEELRRRLT(SEQ ID NO：18)；
(o)GPSRLEEELRRRLTA(SEQ ID NO：19)；
(p)GPSRLEEELRRRLTAA(SEQ ID NO：20)；
(q)GPSRLEEELRRRLTAAS(SEQ ID NO：21)；
(r)SPSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：22)；
(s)SPSGLEQELRRRLDAP(SEQ ID NO：23)；
(t)SPSGLEQELRRRLEAP(SEQ ID NO：24)；
(u)SPSGLEQELRRRLTEP(SEQ ID NO：25)；
(v)GPSRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：26)；
(w)GPSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：27)；
(x)GPSRLEEELRRRLTE(SEQ ID NO：28)；
(y)MSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：29)；和
(z)MSSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：30)。
本发明所述融合蛋白可以包含含有作为核心结构的X1-X2-L-E-X5-E-X7-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：31)的肽，其中X1是G或S或P，X2是R或G，X5是E或Q，X7是L或I，X12是S或T或P或A，并且X13是P或A或S或无氨基酸。这样的肽从包含SEQ ID NO：133序列的单结构域抗体解离的T1/2，例如当用实施例1中基本描述的测定测量时，可以为约2.5分钟至约30分钟。所述肽与包含SEQ ID NO：133序列的单结构域抗体的结合可以具有约3-40nM或更小的Kd。
这样的肽可以包含G-R-L-E-E-E-L-R-R-R-L-S的序列(SEQ ID NO：32)或其变体，其中所述变体与(SEQ ID NO：32)相比具有1至6个突变，所述突变选自：G1→S、G1→P、R2→G、E5→Q、L7→I、S12→T、S12→P，和S12→A、P13的添加、A13的添加和S13的添加。所述变体与SEQ ID NO：32相比可具有以下突变：(a)G1→S、R2→G、E5→Q和P13的添加；(b)R2→G、E5→Q、S12→T和A13的添加；(c)G1→P、R2→G、E5→Q、S12→T和A13的添加；(d)G1→S、R2→G、E5→Q、S12→T和P13的添加；(e)G1→S、R2→G、S12→T和A13的添加；(f)G1→S、R2→G、E5→Q和S12→T；(g)G1→S、R2→G、E5→Q、S12→T和A13的添加；(h)G1→S和S12→P，以及P13的添加；(i)G1→S、R2→G、E5→Q、S12→T和P13的添加；(J)E5→Q、L7→I和P13的添加；(k)P13的添加；或(I)S12→A。
一种包含作为核心结构的序列SEQ ID NO：31的肽可以包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是M或S或P或D或G或无氨基酸，Xb是S或D或P或无氨基酸。Xa-Xb可以选自M-S、S-D、P-D、P-S、D-S、S-P和G-P，优选M-S。这样的肽也可以包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或P或A或E或K或S或无氨基酸，Xz是P或S或无氨基酸。Xy-Xz可以选自无氨基酸、G、P、A、E-P、A-S、K和S，优选无氨基酸。所述肽可以包含Xa-Vb和Xy-Xz的组合，所述组合是M-S和无氨基酸。
包含在本发明所述融合蛋白中的肽可以具有SEQ ID NO：31的核心结构，并且可以包含选自以下的序列：
(a)GRLEEELRRRLS(SEQ ID NO：32)；
(b)MSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：33)；
(c)SDSGLEQELRRRLSPG(SEQ ID NO：34)；
(d)PDGGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：35)；
(e)PSGGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：36)；
(f)DSPGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：37)；
(g)PDSGLEQELRRRLTPA(SEQ ID NO：38)；
(h)SPSGLEEELRRRLTAEP(SEQ ID NO：39)；
(i)GPSGLEQELRRRLT(SEQ ID NO：40)；
(j)GPSGLEQELRRRLTAAS(SEQ ID NO：41)；
(k)SPSRLEEELRRRLPSK(SEQ ID NO：42)；
(l)SPSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：43)；
(m)SPGRLEQEIRRRLSPS(SEQ ID NO：44)；
(n)PSGRLEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：45)；
(o)PSGRLEEELRRRLS(SEQ ID NO：46)；
(p)PSGRLEEELRRRLA(SEQ ID NO：47)；和
(q)PSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：48)。
本发明所述融合蛋白可以包含含有作为核心结构的X1-X2-L-E-X5-E-L-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：49)的肽，其中X1是S或G或P，X2是R或G或P，X5是E或Q，X12是S或T或D或E，X13是P或A或D或无氨基酸。这样的肽从包含SEQ ID NO:133序列的单结构域抗体解离的T1/2，例如当用基本如实施例1中描述的测定测量时，可以是约20分钟至约100分钟。所述肽与包含SEQ ID NO:133序列的单结构域抗体结合的Kd可以是约1-5nM或更小。
一种包含作为核心结构的序列SEQ ID NO：49的肽可以包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是P或D或S或G或无氨基酸，Xb是D或S或P或无氨基酸。这样的肽也可以包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或P或E或D或S或无氨基酸，Xz是P或无氨基酸。
包含在本发明所述融合蛋白中的肽可以具有SEQ ID NO：49的核心结构，并且可以包含选自以下的序列：
(a)PDSGLEQELRRRLSPG(SEQ ID NO：50)；
(b)PDSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：51)；
(c)PSSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：52)；
(d)DPSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：53)；
(e)DSGPLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：54)；
(f)SPSRLEEELRRRLTAEP(SEQ ID NO：55)；
(g)SPSGLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：56)；
(h)SPSGLEEELRRRLDAP(SEQ ID NO：57)；
(i)SPSGLEEELRRRLEAP(SEQ ID NO：58)；
(j)SPSGLEEELRRRLTDP(SEQ ID NO：59)；
(k)SPSGLEEELRRRLTADP(SEQ ID NO：60)；
(l)GPSGLEQELRRRLTA(SEQ ID NO：169)；
(m)SPSGLEQELRRRLTDP(SEQ ID NO：170)；
(n)SPSGLEQELRRRLTADP(SEQ ID NO：171)；
(o)SPSGLEQELRRRLTAEP(SEQ ID NO：172)；
(p)DSPGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：173)；；和
(q)SPSGLEQELRRRLSPS(SEQ ID NO：174)。
本发明所述融合蛋白可以包含含有作为核心结构的X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：61)的肽，其中X1是G或S，X2是R或G或A或E，X3是L或V，X4是E或Q，X5是E或Q，X6是E或Q，X7是L或I或V，X8是R或A或Q或E，X9是R或A或Q或E，X12是S或T或L或无氨基酸，X13是K或P或S或无氨基酸。这样的肽从包含SEQ ID NO:133序列的单结构域抗体解离的T1/2，例如当用基本如实施例1中描述的测定测量时，可以是约2分钟至约10分钟。所述肽与包含SEQ ID NO:133序列的单结构域抗体结合的Kd可以是约10-50nM或更小。
一种包含作为核心结构的序列SEQ ID NO：61的肽可以包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是D或S或G或M或无氨基酸，Xb是S或D或P或M或无氨基酸。这样的肽也可以包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或S或P或无氨基酸，Xz是S或无氨基酸。
包含在本发明所述融合蛋白中的肽可以具有SEQ ID NO：61的核心结构，并且可以包含选自以下的序列：
(a)GRLEEELRRRLS(SEQ ID NO：32)；
(b)MSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：33)；
(c)DSGRLEEELRRRLSKG(SEQ ID NO：62)；
(d)DSGRLEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：63)；
(e)SDSGLEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：64)；
(f)SDSGVEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：65)；
(g)SDSAVEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：66)；
(h)SDSGLQEELRRRLSPG(SEQ ID NO：67)；
(i)SDSGLEEQLRRRLSPG(SEQ ID NO：68)；
(j)SDSGLEEEIRRRLSPG(SEQ ID NO：69)；
(k)SDSGLEEEVRRRLSPG(SEQ ID NO：70)；
(l)DSGELEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：71)；
(m)DSGRLEQELRRRLSPG(SEQ ID NO：72)；
(n)DSGRLEEEIRRRLSPG(SEQ ID NO：73)；
(o)DSGRLEQEIRRRLSPG(SEQ ID NO：74)；
(p)DSGRLEQEIARRLSPG(SEQ ID NO：75)；
(q)DSGRLEQEIQRRLSPG(SEQ ID NO：76)；
(r)DSGRLEQEIERRLSPG(SEQ ID NO：77)；
(w)DSGRLEQEIRARLSPG(SEQ ID NO：78)；
(t)DSGRLEQEIRQRLSPG(SEQ ID NO：79)；
(u)DSGRLEQEIRERLSPG(SEQ ID NO：80)；
(v)GPSRLEEELRRRL(SEQ ID NO：81)；
(w)MSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：82)；
(x)MSGRLEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：83)；
(y)SPSAVEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：84)；
(z)GPSAVEEELRRRLS(SEQ ID NO：85)；
(aa)MPSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：86)；
(bb)MSSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：87)；
(cc)MPSGRLEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：88)；
(dd)MSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：89)。
本发明所述的融合蛋白可以与特异性结合包含在所述融合蛋白中的所述肽的结合配偶体复合。这种特异性结合配偶体可以是本文公开的抗体。
本发明所述的融合蛋白可以包含抗体部分。所述抗体部分可以是单结构域抗体。这样的抗体部分可以特异性地结合靶标。这样的靶标可以是细胞。例如，所述特异性靶标可以包含或是细胞表面上的结构，例如细胞表面受体。优选的靶标是CD62L。
本发明进一步提供特异性结合包含在本发明所述融合蛋白中的所述肽的抗体。这样的抗体可以是单价抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗体包含骆驼VHH结构域或由骆驼VHH结构域组成。在优选的实施方案中，本发明的抗体是一种单结构域抗体，如骆驼单结构域抗体。
术语“抗体”通常是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子。抗体的典型例子是但不限于免疫球蛋白，以及其仍保留结合特异性的衍生物或功能片段。用于生产抗体的技术在本领域中是众所周知的。术语“抗体”还包括不同种类(即IgA、IgG、IgM、IgD、IgE、IgY等)和亚类(例如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig类)，即使是使用本领域技术人员已知的技术在外来宿主中重组生产的。抗体的说明性例子是全长免疫球蛋白、Fab片段、F(ab')2、FV片段、单链FV片段(scFV)、双抗体(diabody)或结构域抗体(Holt LJ等人，TrendsBiotechnol.21(11),2003,484-490)。结构域抗体可以是单结构域抗体、单可变结构域抗体或仅具有一个可变结构域(可以是VH或VL)的免疫球蛋白单可变结构域，所述结构域特异性结合抗原或表位而不依赖于其它V区或结构域。特别优选的单结构域抗体是仅重链的抗体的VHH结构域。这样的免疫球蛋白单可变结构域不仅可以包含分离的抗体单可变结构域多肽，而且可以包含更大的多肽，所述更大的多肽包含抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体或由所述一个或多个单体组成。可以理解，单结构域抗体可以包含VHH结构域和融合配偶体，例如蛋白质或肽标签。因此，术语“抗体”的定义还包括例如嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体的实施方案。术语“抗体”也可以包括抗体片段。
单结构域抗体是这样一种抗体，其互补决定区是单结构域多肽的一部分。实例包括但不限于重链抗体、天然无轻链的抗体、衍生自常规4-链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和非衍生自抗体的那些的单结构域支架(scaffold)。单结构域抗体可以是任何本领域现有的或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔或牛。根据本发明，本文所用的单结构域抗体优选衍生自天然存在的被称作无轻链的重链抗体的抗体。这样的单结构域抗体例如在WO 94/04678中公开。出于清楚的原因，该衍生自天然无轻链的重链抗体的可变结构域在本文中被称作VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这样的VHH分子可以衍生自在骆驼科(Camelidae)物种中产生的抗体，例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、小羊驼、羊驼和原驼。除骆驼科以外的其它物种也可以产生天然无轻链的重链抗体。作为说明性例子，已知鲨鱼产生天然无轻链的重链抗体(通常命名为IgNAR)，其也包含VHH结构域。此外，VHH可以从合成库中获得。所有这样的VHH都在本发明的范围内。
VHH，根据本发明，如本领域技术人员已知的，优选衍生自天然无轻链的免疫球蛋白的重链可变结构域，如WO 94/04678中所述的衍生自骆驼科的那些(以下称作VHH结构域或纳米抗体)。VHH分子是IgG分子的约10倍小。它们是单一多肽，并且非常稳定，耐极端pH和温度条件。而且，它们对蛋白酶的作用具有高度抗性，而常规抗体不是这样。此外，VHH的体外表达或在适于重组蛋白表达的原核或真核生物体中的表达产生产率高、正确折叠的功能性VHH。应当理解，根据本发明的单结构域抗体优选为VHH。
根据本发明的抗体可以携带一个或多个结构域，所述结构域具有的序列与天然无轻链的免疫球蛋白的相应天然存在的结构域具有至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在这点上应注意到，本文使用的术语“约用的术语的相是指在给定值或范围的20％的偏差内，例如在10％的或在5％的偏差内。
本文公开的有关氨基酸序列的“序列同一性百分数(％)”被定义为：在为获得最大序列同一性百分比而比对序列和引入间隙(如有必要)，并且不将任何保守取代认为是序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考序列(即本公开的抗体分子)中氨基酸残基成对相同的氨基酸残基的百分数。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可通过本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于测量比对的适当参数，包括实现在被比较序列的全长上的最大比对所需的任何算法。本文所公开的核苷酸序列也是如此。
术语“可变的”是指免疫球蛋白结构域的部分，该部分在其序列中表现出可变性并且涉及确定特定抗体的特异性和结合亲和力(即“可变结构域”)。可变性在抗体的可变结构域中不是均匀分布的；它集中在每个重链和轻链可变区的亚结构域中。这些亚结构域被称作“高可变区”、“HVR”、或“HV”、或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即，非高可变)部分被称作“框架”区(FR)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包括四个主要采用β-片构型的FR区域，它们由三个高可变区连接，从而形成连接β-片结构的环，并且在一些情况下形成β-片结构的一部分。每条链中的高可变区通过FR紧密地结合在一起，并且与来自另一条链的高可变区一起形成抗原结合位点(参见Kabat等人，见下文)。通常，天然存在的免疫球蛋白包括六个CDR(见下文)；VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3)。在天然存在的免疫球蛋白中，H3和L3显示出六个CDR中最大的多样性，特别是H3被认为在赋予免疫球蛋白良好的特异性方面发挥独特的作用。然而，天然无轻链的免疫球蛋白包括VHH区中的三个CDR。恒定结构域不直接参与抗原结合，而是表现出各种效应子功能，例如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体活化。
每个VHH，VH和VL具有三个CDR和四个FR，从氨基末端(N-末端)到羧基末端(C-末端)按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和/或轻链的可变区包含与抗原表位相互作用的结合结构域。术语“免疫球蛋白”可以是指可以没有轻链的两条重链的蛋白质，例如无轻链的抗体，或其抗原结合部分。免疫球蛋白还可以包括通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。
当用于本文时，免疫球蛋白可以是由两条重链组成的二聚糖基化蛋白，例如仅有骆驼重链的IgG(hcIgG)或鲨鱼IgNAR。本文所用的免疫球蛋白也可以是四聚糖基化蛋白，其由两条各约25kDa的轻链(L)和两条各约50kDa的重链(H)组成。
当用于蛋白质或肽时，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有本领域公认定义的α-氨基羧酸，例如选自L-丙氨酸(Ala或A)、L-精氨酸(Arg或R)、L-天冬酰胺(Asn或N)、L-天冬氨酸(Asp或D)、L-半胱氨酸(Cys或C)、L-谷氨酰胺(Gln或Q)、L-谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、L-组氨酸(His或H)、L-异亮氨酸(Ile或I)、L-亮氨酸(Leu或L)、L-赖氨酸(Lys或K)、L-蛋氨酸(Met或M)、L-苯丙氨酸(Phe或F)、L-脯氨酸(Pro或P)、L-丝氨酸(Ser或S)、L-苏氨酸(Thr或T)、L-色氨酸(Trp或W)、L-酪氨酸(Tyr或Y)和L-缬氨酸(Val或V)的氨基酸，虽然可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸，例如牛磺酸、鸟氨酸、硒代半胱氨酸、高胱氨酸、羟基脯氨酸、硫代脯氨酸、碘代酪氨酸、3-硝基酪氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、5-羟基色氨酸、肌肽、环亮氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸、脯氨醇、烯丙基甘氨酸或乙酰替丁-2-羧酸。通常，氨基酸可以被分为具有非极性侧链(例如，Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)、带负电的侧链(例如Asp、Glu)、带正电荷的侧链(例如Arg、His、Lys)、或不带电的极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
根据本发明的靶标是本发明的抗体能够直接或间接检测的任何生物或化学来源的物质。靶标可以是例如蛋白质、肽、核酸、寡核酸、糖、多糖、糖蛋白。实例包括但不限于治疗性靶标、诊断性靶标、受体、受体配体、病毒外壳蛋白、免疫系统蛋白、激素、酶、抗原、细胞信号传导蛋白或其片段。靶标可以是天然蛋白质或其片段、其同源序列、其功能部分或同源序列的功能部分。
术语“表位”，也称作“抗原决定簇”，是指抗体特异性结合由此形成复合物的抗原部分。因此，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何分子或蛋白质决定簇。本文所述抗体分子的结合位点(抗体决定簇)可特异性地与构象或连续表位结合/相互作用，所述构象或连续表位对于靶标结构是独特的。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位决定簇可包括分子的化学活性表面基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。对于多肽抗原，构象或不连续表位的特征在于存在两个或更多个离散氨基酸残基，其在一级序列中是分开的，但是当多肽折叠成天然蛋白/抗原时，在分子表面组装成连续的结构(Sela,M.，Science(1969)166,1365-1374；Laver,W.G.,等人.Cell(1990)61,553-556)。所述构成该表位的两个或更多个离散氨基酸残基可以存在于一个或多个多肽链的分开区段上。当多肽链折叠成三维结构以构成表位时，这些残基在分子表面聚集在一起。相比之下，连续或线性表位由两个或更多个离散氨基酸残基组成，其存在于多肽链的单一线性区段中。作为说明性例子，“背景依赖性”CD3表位是指所述表位的构象。这种位于CD3的ε链上的背景依赖性表位，只有当它嵌入到ε链的其余部分中并通过ε链与CD3的γ链或δ链的异二聚化而保持在正确的位置时，才能形成它的正确构象。与此相比，非背景依赖性CD3表位可以是CD3ε的N末端1-27个氨基酸残基多肽或其功能片段。通常，表位可以是天然线性的或可以是不连续的表位。因此，本文所用术语“构象表位”是指由抗原的氨基酸之间的空间关系形成的不连续表位，而不是未断开的一系列氨基酸。术语“表位”还包括半抗原的抗原决定簇，其被认为是小分子，该小分子可通过在与较大物质如较大分子例如蛋白质结合时显示一个或多个免疫学识别的表位而用作抗原。
当抗体或抗体分子/片段在蛋白质和/或大分子的复合混合物中识别其靶抗原时，则称抗体或抗体分子/片段“特异性(地)”与抗原结合。通常，抗体能够特异性地与其靶标相互作用和/或结合，但基本上不与另一个表位或抗原结合。如果抗体交叉竞争使得在给定的时间点只有一种抗体能够与表位结合，即一种抗体阻止另一种抗体的结合或调节作用，则称抗体“与同一表位结合”。
通常，被认为是特异性的结合也可以具有高亲和力，例如，当结合亲和力高于10-6M(以Kd表示)。特别地，结合亲和力可以是约10-8至10-11M(Kd)，或约10-9至10-11M或甚至更高。因此，亲和力在皮摩尔范围内的抗体分子(Kd为9.9×10-10M至10-12M)也包含在本发明中。如果需要，通过改变结合条件可以减少结合位点的非特异性结合而基本上不影响特异性结合。
根据本发明的抗体可以是分离的抗体分子。本文所用术语“据本发明的抗体可是指已经从其自然环境组分中鉴定和分离和/或回收的抗体分子。其自然环境的污染组分是干扰抗体应用的物质，可以包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在一些实施方案中，抗体分子纯化至经劳里法(Lowry method)测定基于抗体重量大于95％，例如基于重量大于99％。在一些实施方案中，抗体分子纯化至足以通过使用旋杯测序仪获得N-末端或中间氨基酸序列的至少15个残基的程度。在一些实施方案中，抗体纯化至通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马氏蓝或优选银染判断为同质。在一些实施方案中，分离的抗体分子可以与所述抗体的自然环境不存在的一种或多种组分一起在外来宿主细胞中存在。通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
除非另有说明，本公开的所示CDR序列遵循牛津分子AbM抗体建模软件(OxfordMolecular’s AbM antibody modelling software)采用的由AbM给出的定义。通常参见，例如，《抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析》(Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains)，收录在：《抗体工程实验室手册》(AntibodyEngineering Lab Manual)(编辑：Duebel,S.和Kontermann,R.,斯普林格-维拉格,海德堡)中。还有其它用于定义CDR的标准，例如根据Maass 2007的定义(Journal ofImmunological Methods 324(2007)13-25)。另一个标准是根据Kabat CDRs的定义，如《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of immunological Interest)，美国卫生与人类服务部(1991)(编辑：Kabat等人)中所述的。用于表征抗原结合位点的另一个标准是指如Chothia所描述的高可变环(参见，例如Chothia等人(1992)；J.Mol.Biol.227:799-817；和Tomlinson等人.(1995)EMBO J.14:4628-4638)。应该理解，用AbM的CDR定义所描述的实施方案可以可选地使用类似的所描述的关系来实现，例如Maass、Kabat或Chothia的定义。
抗体的效价通常表示为任何给定抗体的一个分子的抗原结合位点的数目或任何给定抗原的抗体结合位点的数目。大多数抗体分子，以及属于IgG、IgA、IgD和IgE免疫球蛋白类的那些，每分子具有两个抗原结合位点。通常，单价抗体包含单一抗原结合位点。单价抗体的例子是单结构域抗体、VHH结构域、单Fab片段、Fv片段、scFv片段或单VH或VL结构域。
术语“Fab”、“Fab区”、“Fab部分”或“Fab片段”被理解为定义一种包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以是指单独的该区域，或在根据本发明的抗体分子的背景中的该区域，以及全长免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。通常Fab区包含抗体的整条轻链。Fab区可以被用来定义免疫球蛋白分子的“一条臂”。它含有该Ig的表位结合部分。天然存在的免疫球蛋白的Fab区可以通过部分木瓜蛋白酶消化作为蛋白水解片段获得。“F(ab')2部分”是部分胃蛋白酶消化的免疫球蛋白的蛋白水解片段。“Fab'部分”是由还原F(ab')2部分的二硫键得到的产物。本文所用术语“Fab”、“Fab区”、“Fab部分”或“Fab片段”可进一步包括限定抗体臂C末端的铰链区(参见上文)。该铰链区对应于在全长免疫球蛋白中见于CH1结构域C-末端的铰接区，在该全长免疫球蛋白中抗体分子的臂可被放在一起形成“Y”。在本领域中使用铰链区这个术语，因为免疫球蛋白在该区域具有一定的弹性。
“Fv”或“Fv片段”仅由免疫球蛋白的“单臂”的VL和VH结构域构成。因此，“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。“双链”Fv片段由紧密、非共价结合的一条重链的和一条轻链的可变结构域的二聚体组成。单链Fv类(scFv)包括免疫球蛋白的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链中，在该多肽链中它们通过柔性肽接头彼此共价连接。典型地，在scFv片段中，轻链和重链的可变结构域以类似于双链Fv类的二聚体结构缔合。在单链Fv片段中，或者可以将轻链可变结构域设置在所述单多肽链的N-末端，随后是接头和设置在多肽链的C-末端的重链可变结构域，或者相反地，将重链可变结构域设置在N-末端，轻链可变结构域设置在C-末端而肽接头设置在中间。肽接头可以是本领域已知的任何柔性接头，例如，由甘氨酸和丝氨酸残基组成的接头。还可以通过将二硫键引入保守的框架区进一步稳定连接VH和VL结构域之间的结构域连接(参见Reiter等人.Stabilization of theFv fragments in recombinant immunotoxins by disulfide bonds engineered intoconserved framework regions,Biochemistry 1994,33,6551-5459)。这些scFv片段也被称作二硫化稳定的scFv片段(ds-scFv)。
本文使用术语“Fc区域”或“Fc片段”来定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然序列Fc区域和变体Fc区域。Fc部分介导抗体的效应子功能，例如补体系统和具有Fc-受体的免疫效应子细胞(例如NK细胞)的活化。在人IgG分子中，Fc区域通过木瓜蛋白酶在N-末端Cys226切割而产生。尽管免疫球蛋白重链的Fc区域的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区域通常被限定为从Cys226位的氨基酸残基或从Pro230延伸到其羧基末端。Fc区域的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的447残基)可以被除去，例如，在抗体分子的制备或纯化过程中被除去，或者通过重组工程化编码抗体分子的重链的核酸而被除去。因此，完整抗体的组成可以包括除去所有K447残基的抗体群、没有除去K447残基的抗体群以及包括含有或不含有K447残基的抗体混合物的抗体群。用于本发明抗体的适合的天然序列Fc区域包括哺乳动物(例如人或鼠)的IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。所述Fc区域包含两个或三个恒定结构域，这取决于抗体的种类。在免疫球蛋白是IgG的实施方案中，Fc区域具有CH2结构域和CH3结构域。
根据本发明的抗体可以使用任何已知和已充分建立的表达系统和重组细胞培养技术来生产，例如通过在细菌宿主(原核系统)或真核系统如酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达。本发明的抗体分子可在转基因生物如山羊或植物中生产。抗体也可以通过化学合成生产。
本发明的抗体可包含CDR1序列GVTISALNAMAMG(SEQ ID NO：115)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AVSERGNAM(SEQ ID NO：116)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY(SEQ ID NO：117)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。本发明的抗体可包含CDR1序列GVTISALNAMAMG(SEQ ID NO：118)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AVSSRGNAM(SEQ ID NO：119)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列。本发明的抗体可包含CDR1序列GVTVSALNAMAMG(SEQID NO：121)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AVSERGNAM(SEQ ID NO：122)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY(SEQ ID NO：123)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。应当理解，这样的抗体优选包含骆驼VHH结构域(例如单结构域抗体)或天然无轻链的抗体或由所述骆驼VHH结构域或天然无轻链的抗体组成。还应当理解，其中1个或2个突变被引入一个、两个或者所有三个CDR序列的抗体仍然能够特异性结合包含在本发明融合蛋白中的肽，特别是具有SEQ ID NO：3的核心结构的肽，例如SEQ ID NO：05-07中任一个的肽。在本发明的这种抗体中，CDR2的氨基酸位置4的E或S可以突变为G、A、L、I、S、T、V、C、M、D、N、E、Q、F、Y、H、W、K、R或P，优选D、N或H。本发明的这种抗体可包含FR1序列EVQLX1ESGGGLVX2PGGSX3RLSCTAS，其中X1是Q、V、E或L，X2是Q或P，X3是L或M(SEQ ID NO：124)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR1序列EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(SEQ ID NO：125)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR2序列WYRQX1PGEX2RVMVA，其中X1是A或R，X2是R或E(SEQ ID NO：126)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR2序列WYRQAPGERRVMVA(SEQ ID NO：127)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR2序列WYRQAPGEERVMVA(SEQ ID NO：128)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR3序列YRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLX1PEDX2AVYYCHV，其中X1是K或Q，X2是T或M(SEQ ID NO：129)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR3序列YRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHV(SEQ ID NO：130)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR4序列WGQGX1QVTVSS，其中X1是T或I(SEQ ID NO：131)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR4序列WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：132)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
本发明的抗体可包含选自以下的VHH序列或由所述VHH序列组成：
(a)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：133)；
(b)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGEERVMVAAVSSRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：134)；
(c)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGEERVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：135)；
(d)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSSRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：136)；
(e)EVQLVESGGGLVPPGGSMRLSCTASGVTVSALNAMAMGWYRQRPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLQPEDMAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGIQVTVSS(SEQ ID NO：137)；
(f)EVQLVESGGGLVPPGGSMRLSCTAPGVTVSALNAMAMGWYRQRPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLQPEDMAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGIQVTVSS(SEQ ID NO：138)；
(g)EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：139)；
(h)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：140)；
(i)EVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：141)；
(j)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：142)；
(k)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSDRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：175)；
(l)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSNRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：176)；或
(m)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSHRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：177)；
或与所述序列中任一个具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
本发明的抗体可包含CDR1序列GTMSAINALN(SEQ ID NO：143)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AITDNGNAH(SEQ ID NO：144)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEEEKLGVWVDY(SEQ ID NO：145)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。本发明的抗体可包含CDR1序列GTMSAINALN(SEQ ID NO：146)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AITDNGNAH(SEQ ID NO：147)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEEKLGAWVDY(SEQ ID NO：148)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。本发明的抗体可包含CDR1序列GTMSAINALN(SEQ ID NO：149)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AITDNGNAH(SEQ ID NO：150)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，和CDR3序列LEKEKLGVWVDY(SEQ ID NO：151)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。应当理解，这样的抗体优选包含骆驼VHH结构域(例如单结构域抗体)或天然无轻链的抗体或由所述骆驼VHH结构域或天然无轻链的抗体组成。还应当理解，其中1个或2个突变被引入一个、两个或者所有三个CDR序列的抗体仍然能够特异性结合包含在本发明融合蛋白中的肽，特别是具有SEQ ID NO：3的核心结构的肽，例如SEQ ID NO：05-07中任一个的肽。本发明的这种抗体可以包含FR1序列EVQLX1ESGGGLVQPGGSLTLSCAAS，其中X1是V或L(SEQ ID NO：152)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR2序列WYRQX1PGKERKMVA，其中X1是P或A(SEQ ID NO：153)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR3序列YADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLX1PDDTAVYYCHY，其中X1是K或E(SEQ ID NO：154)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。本发明的这种抗体可包含FR4序列WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：155)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
本发明的抗体可包含选自以下的VHH序列或由所述VHH序列组成：
(a)EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGTMSAINALNWYRQPPGKERKMVAAITDNGNAHYADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLKPDDTAVYYCHYLEEEKLGVWVDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：156)；
(b)EVQLLESGGGLVQPGGSLTLSCAASGTMSAINALNWYRQAPGKERKMVAAITDNGNAHYADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLEPDDTAVYYCHYLEEKLGAWVDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：157)；或
(c)EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGTMSAINALNWYRQPPGKERKMVAAITDNGNAHYADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLKPDDTAVYYCHYLEKEKLGVWVDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：158)；
或与所述序列中任一个具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
本发明的抗体可以与可检测标记偶联。通常，这样的“可检测标记”可以是任何适合的化学物质或酶，其在化学、物理、光学或酶促反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。例如，荧光或放射性标记可以与抗体偶联以产生作为可检测信号的荧光或X射线。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是酶标记(同时是光学标记)的例子，其催化显色反应产物形成。在一个优选的实施方案中，可检测标记是指可用于在显微术、免疫组织化学或流式细胞术中检测目标靶标的可检测实体。优选地，所述标记不会对标记所偶联的抗体的特性产生不利影响。标记的例子是荧光标记，仅举几个例子，例如藻红蛋白、别藻蓝蛋白(APC)、亮紫罗兰421、Alexa Fluor 488、香豆素或罗丹明。可检测标记类型很多，包括荧光标记、发色团标记、同位素标记或金属标记，优选荧光标记。本发明融合蛋白的存在可以通过使所述融合蛋白与偶联可检测标记的本发明抗体接触并检测可检测标记的信号来检测。对于荧光标记，这意味着通过激发荧光标记而检测发射出的光。适合的荧光标记的非穷举例子是“绿光”发射体(Atto488、Alexa488、Cy2等)、“橙光”发射体(Atto542、alexa555、Cy3等)、“红光-远红光”发射体(Alexa633、Atto 647N、Cy5等)、红外线发射体(Atto700、LiCor IRDye700、LiCor IRDye 800等)、紫外吸收荧光染料(Atto390或Alexa405)。荧光标记也可以是荧光蛋白，例如GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry或近红外荧光蛋白。合适的发色团标记的非穷举例子是暴露于TMB(3,3',5,5'四甲基联苯胺)、DAB(3,3',4,4'二氨基联苯胺)和4CN(4-氯-1-萘酚)的碱性磷酸酶或过氧化物酶。ABTS(2,2'-叠氮基-二[3-乙基-苯并噻唑啉]磺酸盐)、OPD(邻苯二胺)和BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/硝基蓝四唑)。同位素标记的非穷举例子是碳13、氮15、氟19、铝27、硼11、碘127或不同的镧系同位素。金属标记的非穷举例子是金、钯、铅、铂、银、汞和锇。所述标记可以是直接标记，即直接可检测的标记。可选地，所述标记可以是间接标记，即一种标记，其是可特异性地被与另一可检测标记(例如荧光或发色团标记)偶联的另一特异性结合配偶体结合的亲和标签(或表位标签)。适合的表位标签的例子包括但不限于FLAG-标签(序列：DYKDDDDK，SEQ ID NO：160)、Strep-标签(序列：WSHPQFEK，SEQ ID NO：178)、Myc-标签(序列：EQKLISEEDL，SEQ IDNO：161)、HA-标签(序列：YPYDVPDYA，SEQ ID NO：162)、VSV-G-标签(序列：YTDIEMNRLGK，SEQID NO：163)、HSV-标签(序列：QPELAPEDPED，SEQ ID NO：164)、V5-标签(序列：GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO：165)、SPOT-标签(序列：PDRVRAVSHWSS，SEQ ID NO：166)、BC2标签(序列：PDRKAAVSHWQQ，SEQ ID NO：167)和EPEA标签(序列：EPEA，SEQ ID NO：168)。抗原也可以是蛋白质，例如，作为抗原的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)或硫氧还蛋白。可检测标记还可以是核酸，例如具有识别序列的寡核苷酸。这样的识别序列可以是随机序列。该随机序列可以是已经掺入核酸分子中的条形码序列，并且可以用于识别已经与所述核酸偶联的靶分子。“本发明的抗体可以与可检测标记偶联”也可以意味着抗体本身是可检测的标记。这可能暗示所述抗体是亲和靶标，其可被特异性结合所述抗体的另一特异性结合配偶体特异性识别。例如，这样的特异性结合配偶体可以是特异性识别骆驼VHH结构域的抗体。这样的特异性结合配偶体还可以与可检测标记(例如荧光标记)偶联。
本发明的抗体可以偶联到固体支持物。术语“固体支持物”或在本发明的上下文中是指可用于固定亲和配体如抗体或其部分的任何类型的载体材料，并且它可以是指颗粒状(例如珠子或颗粒，通常用于萃取柱)或片状(例如，膜或滤片、玻璃或塑料片、微量滴定板、浸量尺、毛细管填充装置等)的材料，其可以是扁平的、褶皱的或中空的纤维或管。非穷举的适合且众所周知的基质是：二氧化硅(多孔无定形二氧化硅)、琼脂糖或聚丙烯酰胺载体或大孔聚合物。实例包括葡聚糖、胶原蛋白、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、纤维素、藻酸钙、控制孔玻璃、铝、钛和多孔陶瓷、合成聚合物和共聚物、胶乳、二氧化硅、琼脂糖、金属、玻璃和碳。或者，固体表面可以包括质量相关传感器的一部分，例如表面等离子体共振检测器。便利地，提供了一种阵列，其包含结合或固定到固体表面的多个单独的亲和配体，例如抗体或抗体片段，所述亲和配体能够特异性地结合本发明的表位标签。该阵列可用于捕获包含在溶液中的带标签的多肽，只要该溶液与固定化亲和配体如抗体或抗体片段接触。所述固体支持物也可以是磁珠或聚合物珠或色谱固定相。
本发明的抗体可以与它特异性结合的表位复合。这样的表位可以是包含在本发明融合蛋白中的肽。因此，本发明的抗体可以与本发明的融合蛋白复合。因此，本发明涵盖包含本发明抗体特异性结合的肽的融合蛋白。
本发明还涉及包含(a)融合蛋白和(b)抗体的复合物，其中所述融合蛋白是本发明的融合蛋白和/或其中所述抗体是本发明的抗体。
本发明还涉及包含编码本文所述的本发明融合蛋白或本文所述的本发明抗体的序列的核酸分子。核酸分子可以是DNA或RNA分子。本发明的核酸分子可以是载体的一部分或任何其它种类的克隆或表达载体，例如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体。所述核酸分子可以允许融合蛋白或抗体的表达。它可以包括含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且这样的序列可以“可操作地连接到”编码该蛋白质的核苷酸序列。可操作的连接是这样一种连接，其中调节序列元件和要表达的序列以能够实现基因表达的方式连接。基因表达所需的调控区的精确性质可以因物种不同而变化，但是通常这些区域包括启动子，该启动子在原核生物中既包含启动子本身，即指导转录起始的DNA元件，也包含DNA元件，当转录成RNA时，该DNA元件将发出翻译起始的信号。这样的启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5’非编码序列，例如原核生物中的-35/-10框和Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA框、CAAT序列和5’-封端元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏子元件以及用于将天然蛋白靶向宿主细胞的特定区室的翻译信号和前导序列。
本文所述的这种载体可以包括：除了本文所述的调节序列和编码本文所述肽或蛋白的核酸序列外，衍生自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及赋予被转化或转染细胞可选择表型的选择标志物。大量适合的克隆载体是本领域已知的，并且是商业上可获得的。因此，本发明还涉及包含本发明核酸分子的载体。
本发明的核酸分子或载体的克隆或表达可至少部分地在体内使用宿主细胞进行，所述宿主细胞经所述核酸或载体转化，或已通过包括转导或转染在内的其它手段将所述核酸分子或载体转移其内。DNA的转移可以使用标准技术进行。因此，本发明还涉及包含本文公开的核酸分子或载体的宿主细胞。
本公开的肽可用于多个应用。这些细胞应用可能有一个共同点，即肽被用作表位标签。肽在其中发挥作用的应用的非限制性例子包括但不限于检测、固定、分离或纯化本发明的融合蛋白。类似地，本发明的抗体也可用于包括特异性结合表位标签的所有应用。本发明的抗体可用于例如检测、固定、分离或纯化本发明的融合蛋白。
本发明还涉及检测本发明融合蛋白的方法。检测可以是光学检测、同位素检测或电子显微术检测。该方法包括使融合蛋白与本发明的抗体接触，优选在允许包含在融合蛋白中的肽与抗体之间形成复合物的条件下进行接触。本发明的抗体优选携带如本文所定义的可检测标记。当可检测标记是附着于抗体的荧光标记、发色团标记、同位素标记或金属标记时，应当理解抗体优选具有附着于其的确定数目的标记。所述方法可以包括检测可检测标记的步骤。所述方法可以包括在使融合蛋白与抗体接触之前表达本发明的融合蛋白。
本文所用术语“检测”既包括直接检测靶标(即，其中所述靶标通过来源于靶标的信号来检测)，也包括间接检测靶标(即，其中所述靶标通过不直接来源于所述靶标的信号来检测，例如通过来源于附着于所述靶标的另一分子的信号来检测)。本文所用术语“检测”还既包括定性检测也包括定量检测。术语“检测”可以是指测定给定分子或结构(如本发明的融合蛋白)的存在、亚细胞定位或量。待定性、定位和/或定量的融合蛋白可以在其位于宿主细胞中的细胞内位置被检测，例如在细胞核中、在细胞膜或另一细胞区室中。待定性和/或待定量的融合蛋白也可以在包含带标签的多肽或蛋白的溶液中被检测，例如从宿主细胞或包含所述宿主细胞的组织获得的细胞裂解物。
本文所用术语“光学的”优选是指可见光，但通常不限于此。所述术语还可以是指红外线、紫外线和电磁光谱的其它区域。
本文所用术语“同位素检测”涉及检测其中一个或多个原子被通常具有可检测变异的另一同位素取代(即“另标记另)的分子。同位素标记可以通过多种手段检测，例如通过它们的质量(例如，通过质谱、基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)、解吸电喷雾电离(DESI)、激光烧蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)或二次离子质谱(SIMS)、振动模式(例如，通过红外光谱法)、旋磁比(例如，通过核磁共振)或放射性衰变(例如电离室或凝胶放射自显影)。
电子显微术涉及使用电子显微镜的检测方法。电子显微镜的类型包括透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、反射电子显微镜(REM)、扫描透射电子显微镜(STEM)和光电关联显微镜(CLEM)。
检测方法的第一步中，特异性结合包含在本发明融合蛋白中的肽的抗体可以与包含所述融合蛋白的样品接触。所述样品可以是宿主细胞、组织、包含宿主细胞的细胞裂解物的溶液或包含所述融合蛋白的任何其它样品，如包含所述宿主细胞的液体离心后获得的上清液，其中宿主细胞能够将目标多肽分泌到液体或其它样本(如体液)中。
该接触步骤优选在允许所述抗体和与其特异性结合的肽特异性相互作用的条件下进行。这些条件对于本领域技术人员是众所周知的。洗涤步骤通常在抗体与其抗原的接触步骤之后，并且本领域技术人员知道如何和何时应用所述洗涤步骤。当与样品接触时，抗体将与所述融合蛋白特异性相互作用。通过测量或观察从可检测标记获得的报告信号，可以检测、监测和定量这种相互作用。例如，如果可检测标记是荧光标记，则可以在激发时测量和观察荧光。
如果可检测标记是亲和标签(或表位标签)，其可以被与另一个可检测标记(例如荧光或发色团标记)偶联的另一个特异性结合配偶体特异性结合。在这种情况下，检测附着于本发明抗体的可检测标记可以通过使所述抗体与特异性结合可检测标记的特异性结合配偶体接触来进行，所述可检测标记与本发明所述抗体偶联。所述特异性结合配偶体可以被另外的可检测标记所标记，所述另外的可检测标记优选能够与所述第一可检测标记区分开，例如荧光或发色团标记。然而，所述特异性结合配偶体可以是可被另一个特异性(标记的)结合剂识别的结构。例如，与偶联到本发明抗体的可检测标记结合的特异性结合配偶体可以是(一级)抗体，它可以被(二级)抗体特异性识别，所述二级抗体携带可检测标记，所述可检测标记优选区别于第一可检测标记，如荧光标记。因此，检测本发明融合蛋白的方法可以包括使所述融合蛋白和抗体与包含于抗体中的所述可检测标记的特异性结合配偶体接触的步骤。在存在第二可检测标记的情况下，所述方法可以包括检测第一和/或第二可检测标记的步骤。
根据其中与本发明抗体偶联的可检测标记是亲和标签的方法，所述检测融合蛋白的方法可包括，第一步，使本发明的抗体与包含或怀疑包含本发明的融合蛋白的样品接触。第二步中，(第二)特异性结合配偶体可以与包含结合到本发明抗体的融合蛋白的样品接触。在所述(第二)特异性结合配偶体不与可检测标记偶联或可检测标记是亲和标签的情况下，所述方法可进一步包括接触另一特异性结合配偶体(如特异性结合所述(第二)特异性结合配偶体或其可检测标记的另一抗体)的步骤。所述另一特异性结合配偶体可包含可检测标记，例如可用于检测所述融合蛋白的荧光标记。所述带标签的多肽或蛋白质的存在、量和/或定位可通过测量或观察从包含在所述(第二)特异性结合配偶体或其它特异性结合配偶体中的可检测标记获得的报告者信号来检测或确定。
使用两种类型的结合配偶体的两步检测方法的一个优点是标签特异性相互作用与实际检测步骤分开。这使得本发明的抗体保持原状，因为它不需要包含另外的可检测部分。在一些情况下，与包含另外的可检测标记的抗体相比，这可以增强其特异性或亲和力，因为所述可检测标记在一些情况下会影响包含在本发明融合蛋白中的肽与本发明抗体的相互作用。因此，在一些情况下，可以提高所述检测方法的可靠性和效率。而且，如果仅确定融合蛋白的存在和量，本发明的抗体仅用作捕获抗体而不用作捕获和检测抗体，会使分离捕获与检测步骤分开。因此，使用本发明抗体的第一步之后可以是分离或富集步骤，从而得到捕获的目标融合蛋白。然后可以对分离的和/或富集的融合蛋白进行检测步骤，从而提高获得的定量的可靠性，并且使检测步骤更容易操作。
用于定性检测表位标签/抗体相互作用的合适的生理或生物分子检测方法包括本领域已知的任何适合的方法。这些方法包括但不限于用于定性或定量测定的方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT测定、Western Blot或免疫测定。这些方法包括例如光学、放射性或层析方法，优选当使用任何上述标记、标志物或接头时，更优选荧光检测方法、放射性检测方法、考马氏蓝染色、银染色或其它蛋白染色方法、电子显微术方法、通过免疫组织化学或通过直接或间接免疫荧光对组织切片进行染色的方法等。这些方法可以与抗体一起应用，或者可以涉及使用特异性结合融合蛋白、抗体或复合物的一部分的其它工具(例如使用第二结合配偶体)。
在一些实施方案中，也可以确定带标签的目标多肽或蛋白的亚细胞定位。例如，不同亚细胞结构(诸如中间丝状网络或复制机制的核心部分)可以被可视化和监测。
融合蛋白的检测也可以使用本发明的抗体即胞内抗体进行。本文所用的“胞内抗体”是指位于细胞内以结合细胞内蛋白质的抗体。由于缺乏将抗体从细胞外环境带入活细胞的可靠机制，通常需要在靶细胞内表达所述抗体。表达后，抗体可以保留在细胞质中，或者它可以具有核定位信号，或者它可以经过跨膜的共翻译易位进入内质网的内腔，条件是它通过KDEL序列被保留在那个区室中。与胞内抗体偶联的可检测标记可以是蛋白质性标记，其可以与胞内抗体以融合蛋白的形式表达。理想地，这样的标记可以是光学例如通过荧光可检测的。因此，所述可检测标记可以是荧光蛋白。
本发明还涉及分离本发明融合蛋白的方法。这种方法包括使融合蛋白与本发明的抗体接触，优选在允许抗体和包含在所述融合蛋白中的肽之间形成复合物的条件下。由此，能够实现融合蛋白与抗体结合。该接触步骤，也称作捕获步骤，可以通过使包含所述融合蛋白的样品(例如溶液)与所述抗体接触来进行。
与标签特异性抗体接触的样品可以是包含本发明融合蛋白的任何类型的样品，并且可以被处理以分离所述多肽。优选地，所述样品是溶液，例如包含本发明的融合蛋白的宿主细胞裂解物或体液，或上清液，例如可通过离心包含含有或能够表达本发明融合蛋白的宿主细胞的液体获得的上清液，其中所述宿主细胞能够分泌或以其它方式将本发明融合蛋白转运到液体中。
在本发明方法中用来分离和/或纯化的抗体可以在溶液中或固定后使用。为固定所述抗体，所述抗体可以结合到样品载体、固体支持物或基质。该固定步骤可以在抗体与包含在融合蛋白中的肽结合之前或之后进行。用于固定抗体及其部分的方法是本领域技术人员公知的，并且可以采用任何允许固定而不损害结合性能的方法。
如果本发明的抗体不固定到固体支持物，则所述方法还可以包括分离复合物的步骤，例如，通过使用复合物的特异性结合配偶体如第二抗体，所述第二抗体对例如所述复合物或所述抗体或与所述抗体偶联的可检测标记(例如亲和标签)具有特异性。所述第二结合配偶体可以是在溶液中或者可以是被固定或可固定到固体支持物。
在捕获步骤之后的任选的进一步的步骤中，洗涤包含与所述融合蛋白结合的固定化抗体的固体支持物，以除去未结合和未特异性结合的组成成分。
任选地，在进一步的步骤中，可以洗脱融合蛋白以获得分离的融合蛋白。结合于固定化抗体的融合蛋白的洗脱可通过本领域已知的方法实现。例如，融合蛋白可以通过与分离形式的本文所述的表位肽竞争洗脱来洗脱。然后，该分离的表位肽将与融合蛋白竞争结合固定的标签特异性抗体。如果所述分离的肽以过量浓度加入，结合的反应平衡将转向固定化抗体与所述分离的表位标签的结合。这导致所述融合蛋白的释放。用于洗脱的表位肽可以是与融合蛋白中包含的表位肽相同的肽。用于洗脱的表位肽也可以是与融合蛋白中包含的表位肽不同的肽。如果用于洗脱的表位肽是不同的表位肽，优选用于洗脱的表位肽与融合蛋白中包含的表位肽相比对抗体具有更高的结合亲和力。可任选地增加用于进一步纯化释放的多肽的其它步骤，例如本领域技术人员熟知的方法步骤。
所述融合蛋白也可以保持固定到固体支持物，如(磁性)珠，并在下游应用如质谱分析中进一步处理，而无需洗脱步骤。
所述融合蛋白可以包含具有切割位点的接头，该切割位点可以用适当的方法例如蛋白酶切割以除去肽。由此，融合蛋白的多肽可以从固定化抗体释放，并且所述多肽可以以其天然形式获得。对于该实施方案，编码所述融合蛋白的核酸序列应当不仅包含编码所述表位标签的序列，而且还包含编码具有可断裂位点(例如蛋白酶识别的切割位点)的接头的序列。酶切释放步骤可以代替或跟随所述洗脱步骤。
当本发明的融合蛋白包含抗体部分时，本发明还设想了分离本发明抗体部分的靶标的方法。原则上，该方法可以按上述用于分离融合蛋白进行。该方法可以包括使融合蛋白与包含在融合蛋白中的抗体部分的特异性靶标接触的附加步骤。该接触步骤可以在使融合蛋白与结合融合蛋白中包含的肽标签的抗体接触之前或之后进行，优选后者。在优选的方法中，首先将对肽标签特异性的抗体固定在固体支持物上，然后通过与对肽标签特异性的抗体的结合固定融合蛋白，随后将融合蛋白的抗体部分的靶标结合到融合蛋白上。洗脱可以按上述进行。所述特异性靶标可以是细胞。例如，细胞上的细胞表面受体，如CD62L。融合蛋白的所述抗体部分可以对细胞上的结构如CD62L特异。融合蛋白的所述抗体部分可以是单结构域抗体。
本发明还设想可以将本发明融合蛋白的检测和分离组合起来。因此，本发明设想了一种检测和分离本发明融合蛋白的方法，包括本发明的检测方法和本发明的分离和/或纯化方法。
两种方法的组合因此可以通过使用一种偶联到可检测标记的抗体用于检测，和另一种偶联到固体支持物的抗体用于分离相同的融合蛋白来进行。两种抗体可以是本发明的任何抗体。这种组合的优点可以是只需产生一种带标签的融合蛋白，并且用相同的转基因构建体/细胞进行检测和分离。有时，可能希望两种抗体具有相同的序列或至少一个相同的抗原结合位点。例如，两种抗体可包含SEQ ID NO：115-117所示的CDR 1-3序列，或可包含SEQ ID NO：133所示的序列或与SEQ ID NO：133具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。有时，可能希望两种抗体具有不同的序列或不同的抗原结合位点。使用不同的抗体可能具有以下优点：强结合剂，例如对融合蛋白中包含的肽具有高亲和力(例如，约1pM至约1nM)的抗体可用于检测，而温和结合剂，即具有中等亲和力的抗体(例如，约1nM至约500nM)可用于分离所述融合蛋白。例如，其中一种抗体可包含SEQ ID NO：115-117所示的CDR 1-3序列或可包含SEQ ID NO：133所示的序列或与SEQ ID NO：133具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列，而另一种抗体可包含SEQ ID NO：118-120所示的CDR 1-3序列或可包含SEQ ID NO：134所示的序列或与SEQ ID NO：134具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。所述融合蛋白中包含的肽可以是具有如本文所述的SEQ ID NO：3或4的核心序列的肽。
两种方法的组合也可以通过使用相同的抗体和两种不同的肽进行检测和纯化来进行。这样的优点是，只需制备一种抗体，根据应用该抗体可偶联到可检测标记或固体支持物。当使用两种不同的肽时，优选肽对抗体具有不同的结合亲和力。用于检测的肽可以具有例如约1pM至1nM的高结合亲和力，而用于分离的肽可以具有约1nM至500nM的温和结合亲和力。使用具有不同结合亲和力的肽可能具有以下优点：如果在融合蛋白中包含温和亲和力肽用于分离，则高亲和力肽可用于洗脱融合蛋白。因此，一种肽可以是具有本文所述的SEQID NO：3或4的核心序列的肽，而另一种肽可以是具有本文所述的SEQ ID NO：31或32的核心序列的肽。抗体可以是本发明的任何抗体，例如，所述抗体可包含SEQ ID NO：115-117所示的CDR 1-3序列，或可包含SEQ ID NO：133所示的序列或与SEQ ID NO：133具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
两种方法的组合也可通过使用两种肽和两种抗体来进行。目标融合蛋白可包含对给定抗体具有高亲和力的肽。例如，所述肽可以是具有如本文所述的SEQ ID NO：3或4的核心序列的肽。用于检测的抗体可包含SEQ ID NO：115-117所示的CDR 1-3序列，或可包含SEQID NO：133所示的序列或与SEQ ID NO：133具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。用于分离/纯化的抗体可包含SEQ ID NO：118-120所示的CDR 1-3序列，或可包含SEQID NO：134所示的序列或与SEQ ID NO：134具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。用于洗脱的肽可以是与包含在融合蛋白中的肽相比对用于洗脱的抗体具有更高亲和力的肽，例如本文所述的另一种肽。
本发明还涉及一种包含一个肽标签和两个抗体或两个肽标签和一个抗体或两个肽标签和两个抗体的系统，所述肽标签和抗体如本文所述。
本发明还涉及一种试剂盒。该试剂盒可以包括实施本发明方法所需的组分。一种用于检测或纯化融合蛋白的试剂盒可包含编码本文所定义的肽/表位标签的核酸或核酸表达构建体，所述肽/表位标签可存在于所述融合蛋白中。所述核酸可包含促进多肽与所述肽/表位标签遗传融合的位点，例如切割或重组位点。编码所述肽/表位标签的核酸序列可以可操作地连接到包含有关转录和/或翻译调节的信息的序列元件。
所述试剂盒还可包含本发明的抗体，其任选地偶联至本文所述的可检测标记，优选光学可检测标记或亲和标签。可选地或附加地，所述试剂盒可包含可与本发明所述抗体偶联的可检测部分。
所述试剂盒还可以包括本发明的分离/纯化和/或检测方法所需的缓冲液和试剂。
试剂盒还可以包括将包含在试剂盒中的核酸或核酸表达构建体导入宿主细胞所需的缓冲液和试剂。
所述试剂盒还可包括至少一种如本文所述的(第二)特异性结合配偶体或如本文所述的特异性结合所述(第二)特异性结合配偶体的(另一种)特异性结合配偶体。
所述试剂盒还可以包括固体支持物，其包含固定或附着于其的本发明抗体。所述试剂盒还可包括本文所述的分离的肽，其适用于竞争性洗脱结合于本发明抗体的融合蛋白，或其它用于洗脱融合蛋白的手段，例如蛋白酶。
除非另有说明，术语“至少”在一系列要素之前应理解为是指该系列中的每个要素。本领域的技术人员将认识到，或者能够使用不超过常规实验来确定与本文所述的本发明的特定实施方案相当的很多等同方案。这些等同方案意欲包括在本发明中。
本文中无论何处使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其它组合”的意思。
本文所用术语“约”或“近似”是指给定值或范围的20％以内，优选10％以内，更优选5％以内。然而，它还包括确定的数值，例如约20包括20。
除非上下文另有要求，在整个说明书和所附权利要求书中，词汇“包含(comprise)”和其变形例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为意味着包括所述整数或步骤或整数组或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或整数组或步骤组。当在本文使用时，术语“包含(comprising)”可以用术语“含有(containing)”或“包括(including)”或者有时当在本文使用时用术语“具有(having)”代替。
当在本文中使用时，“由……组成(consisting of)”不包括任何不在权利要求书中限定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成(consistingessentially of)”并不排除对权利要求的基本和新颖性特征没有实质性影响的材料或步骤。
在本文的每种情况下，术语“包含(comprising)”、“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“由……组成(consisting of)”中的任何一个可以用另外两个术语中的任一个代替。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，并且会有所变化。本文使用的术语仅是为了描述特定的实施方案，而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
在本说明书的整个文本中引用的所有出版物(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)在此以其全文引入作为参考。这里的任何内容都不应被解释为是对本发明由于现有发明而没有资格先于这种公开的认可。在引入作为参考的材料与本说明书相矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。
实施例
实施例1：系统
为了寻找新的表位标签/结合物系统，我们设计了SEQ ID NO：05-07的肽，其在溶液中形成稳定的α-螺旋，共同被称作“ALFAST标签”。这些肽在任何真核模型系统中都没有已知的对应物，它们在生理pH下几乎是中性的，并且不含任何可能是普通固定剂的靶标的伯胺。核心ALFA标签序列(图3A，蓝色的氨基酸)包括一条据报道在溶液中形成稳定的α-螺旋的人工肽(Petukhov,M.等人.Design of stable alpha-helices using global sequenceoptimization.J.Pept.Sci.15,359–365(2009))。它是基于以下性质选择的：序列i)在任何真核模型系统中没有已知的对应物，ii)它在生理pH下是中性的，和iii)不含有任何可能是普通胺反应性固定剂和交联剂的靶标的伯胺。
抗ALFAST的高亲和力纳米抗体在羊驼体内产生，并通过“Celline”进行选择，“Celline”是一种采用抗原特异性富集B细胞的新型纳米抗体选择方法。为了制备选择性亲和树脂，优选的纳米抗体(NbALFAST，克隆1G5，SEQ ID NO：133)通过柔性接头位点特异性地与具有低非特异性蛋白质结合特性的琼脂糖基树脂偶联。得到的ALFA SelctorST树脂高效下拉来自大肠杆菌提取物的ALFAST-shGFP2融合蛋白。然而，令人吃惊的是，在天然条件下通过与ALFAST肽(SEQ ID NO：179所示的乙酰基-PSRLEEELRRRLTEP-酰胺)竞争洗脱所述结合的蛋白的所有方法都失败了。即使在与10个柱体积的200μM肽竞争90分钟后，仍有>95％的ALFAST-shGFP2蛋白保留在树脂上(图1B，中间图，灰色线)。因此，我们假设ALFAST融合蛋白结合到树脂上的解离速率太低以致不能使肽进行有效的竞争。因此，我们进行了系统合理的诱变以便鉴别ALFAST突变体，该ALFAST突变体与NbALFAST的结合足够强以允许靶蛋白的有效下拉，但是在另一个方面又可以使用ALFA ST肽从纳米抗体被洗脱下来。分析过的肽示于表2。
表2：
Figure BDA0003060971240000451
Figure BDA0003060971240000461
Figure BDA0003060971240000471
Figure BDA0003060971240000481
Figure BDA0003060971240000491
n.d.：未确定
位置：N：N-末端；M：在两个折叠的结构域之间；C：C-末端
粗略估计，其基于2×105(1/(M×秒))的估计的结合速率(on-rate)，且通常对于sdAb观察到，＜2分钟的t1/2对应于＞约30nM的Kd，2-30分钟的t1/2对应于约2-30nM的Kd，20-100分钟的t1/2对应于约0.6-3nM的Kd，超过100分钟的t1/2对应于约1nM或更低的Kd。
我们发现了一种满足这些标准的ALFA突变体(ALFAPE，PE代表可洗脱的肽(PeptideElutable))(SEQ ID NO：33)。与ALFAPE融合的蛋白有效地结合到ALFA SelectorST。该结合甚至能耐严苛的洗涤步骤(例如高达3M NaCl、1M MgSO4、4M尿素、1％TX-100或甚至100mMDTT，图1C)。然而，在天然条件下的有效洗脱可以在室温下通过与200μM的ALFAST肽(SEQ IDNO：179)竞争在15-20分钟内完成(图1B)。令人感兴趣的是，两种ALFA标签变体(ALFAST和ALFAPE)可用于靶蛋白的任一末端或甚至在两个蛋白结构域之间，而对与NbALFAST的结合只有轻微的影响(图1B)。
实施例2：NbALFAST用于下拉带ALFA标签的靶蛋白的应用
为解决ALFA SelectorST的特异性，我们在生理条件下进行了复杂裂解物的下拉实验。为此，将3μM的N-末端带ALFAST或ALFAPE标签的shGFP2(Frey,S.等人.SurfaceProperties Determining Passage Rates of Proteins through Nuclear Pores.Cell174,202–217.e9(2018))掺入到在PBS中制备的大肠杆菌或HeLa裂解物，该shGFP2在大肠杆菌中表达并通过镍螯合层析后接尺寸排阻层析进行纯化。纯化的input蛋白如图2A所示。从所有裂解物中，两种融合蛋白都有效地结合到ALFA SelectorST(图2B和图2C)。正如根据我们以前的实验所预期的(图1)，带ALFAPE标签的GFP在天然条件下使用200μM的ALFAST肽在20分钟内可有效洗脱，而带ALFAST标签的靶蛋白需要更苛刻(变性)的条件才能有效洗脱。令人惊奇的是，两种裂解物的下拉都是高度特异性的。即使在用SDS缓冲液洗脱之后，源自裂解物蛋白的可检测杂质的数量和强度也很低。当ALFAPE-GFP融合蛋白使用ALFAST肽洗脱时，在从两种裂解物获得的洗脱液流分中，基本上所有可检测的条带都是相同的。因此，这些条带可归因于由靶蛋白本身产生的伪影(例如成熟带或DTT抗性二聚体)。令人感兴趣的是，特别是在肽洗脱之后，洗脱液流分比用作input材料的底物(其已经用两个连续的层析步骤纯化；图2A)含有明显更少的污染蛋白。
实施例3：使用带ALFAPE标签的靶蛋白和ALFA SelectorST的共免疫沉淀
为了了解ALFA系统是否也可用于更精细的共免疫沉淀实验，我们尝试在天然条件下下拉二元大肠杆菌YfgM-PpiD内膜蛋白复合物(
Figure BDA0003060971240000501
H.等人.YfgM is an ancillarysubunit of the SecYEG translocon in Escherichia coli.J Biol Chem 289,19089–19097(2014))。为此目的，野生型YfgM或YfgM-ALFAPE在YfgMΔ菌株中表达。为了确保接近生理表达水平，两种YfgM变体都在内源性启动子的控制下从低拷贝质粒表达。当使用在温和的非离子洗涤剂DDM存在下制备的含YfgM-ALFAPE的总裂解物作为input时，ALFASelectorST能够以特定和耐洗涤剂的方式下拉YfgM-PpiD复合物。这表明ALFAPE标签与该不稳定膜复合物的形成相容。重要的是，所述天然的和未修饰的膜蛋白复合物可以使用200μMALFAST肽在生理条件下在20分钟内从ALFA SelectorST树脂回收。YfgM及其相互作用配偶体PpiD通过存在于(周质)YfgM的C-末端上的ALFAPE标签与ALFA SelectorST特异性连接，因为该复合物不能从表达未带标签的YfgM的对照裂解物中被纯化。因此，ALFAPE标签连同ALFASelectorST树脂不仅可用于纯化来自各种来源的蛋白质，还适用于具有挑战性的(膜)蛋白质复合物的天然下拉。
实施例4：通过直接免疫荧光检测带ALFAST标签的蛋白质
我们首先测试荧光标记的NbALFAST是否可用于PFA固定样品中带ALFA标签的蛋白的免疫检测。实际上，使用与两个荧光团(Fluo Tag-X2抗-ALFA AbberiorStar635P)偶联的NbALFAST(SEQ ID NO：133)，可以获得特定的染色模式，而与ALFAST标签或ALFAPE标签在哺乳动物细胞中靶蛋白上的定位无关。更具体地说，我们成功测试了ALFA标签被置于C-末端(Tom70-EGFP-ALFAST，图3C；Tom70-EGFP-ALFAPE，图3C)、N-末端(ALFAST-FLAG-波形蛋白，图3D和图4A；ALFAPE-FLAG-波形蛋白，图4A)或在折叠的结构域和跨膜结构域之间(EGFP-ALFAST-TM，图4B)的靶蛋白。
实施例5：带ALFAST标签的蛋白质显示正常的折叠、靶向和多聚状态
重要的是，所有测试的靶蛋白都显示出其特征性定位(Tom70-EGFP-ALFA：线粒体外膜；ALFA-波形蛋白：特征性丝状结构；EGFP-ALFAST-TM：质膜)，这表明ALFF标签不干扰带标签的蛋白的一般折叠或正确靶向。ALFAST-波形蛋白和ALFAPE-波形蛋白正确进入特征性中间丝状结构(图3D和图4A)还提示ALFA-标签不干扰正确的丝状组装。
为更灵敏地解决ALFAST标签是否影响目标融合蛋白的细胞内定位，我们统计分析了转染到哺乳动物细胞中的携带N-或C-末端ALFAST标签的胞质EGFP的定位(图5)。在该测定中，在任一末端带ALFAST标签的EGFP的核质分布与未带标签的EGFP不可区分。重要的是，我们没有观察到所分析的ALFAST融合蛋白非典型关联到细胞区室(例如膜或细胞器)的任何迹象。此外，重组带ALFAST标签的EGFP变体的凝胶过滤证实了它们的单体状态，表明ALFAST标签不诱导多聚化。因此，我们得出结论：ALFAST标签通常不会损害靶蛋白的行为。然而，我们注意到(如同对于任何其它标签)，对给定靶蛋白的特定影响必须在蛋白质-蛋白质的基础上分析。
实施例6：ALFA标签与普通固定条件相容
免疫荧光(IF)应用通常需要优化固定条件。这可能是复杂的，特别是如果要将需要不同固定条件的蛋白质定位在同一样本中时。此外，已有的表位标签通常包含使其对胺反应性固定剂的修饰潜在敏感的赖氨酸(表1)。相比之下，ALFA标签不含赖氨酸。出于这些考虑，ALFAST标签和ALFAPE标签可以在用4％多聚甲醛(PFA)标准固定或用100％甲醇沉淀固定后进行检测，且甚至耐2％戊二醛固定(图3D)。因此，两种ALFA标签都与大多数标准固定方法相容，甚至可以证明在电镜应用中是有用的，在电镜应用中因为能够在纳米级上保持结构，因此优选戊二醛。
实施例7：体内检测带ALFAST标签的蛋白质
我们接下来想知道NbALFAST是否也可用作胞内抗体。这种在靶细胞的细胞质(或其它区室)中原位表达的纳米抗体通常用于在活细胞中定位或操纵靶蛋白(Caussinus,E.,Kanca,O.&Affolter,M.Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFPnanobody.Nat Struct Mol Biol 19,117–121(2012)；Kirchhofer,A.等人.Modulation ofprotein properties in living cells using nanobodies.Nat Struct Mol Biol 17,133–138(2010))。这样的应用取决于给定纳米抗体在真核宿主细胞的细胞质还原环境中的稳定性和功能性。为了在这样的条件下测试我们的纳米抗体，我们将带ALFAST标签的靶蛋白(ALFAST-波形蛋白或Tom70-EGFP-ALFAST)和与mScarlet-I(Bindels,D.S.等人.mScarlet:abright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.Nat Methods 11,121–122(2016))融合的NbALFAST共表达。实际上，在用两种构建体共转染的细胞中，mScarlet-I信号与相应的带ALFA ST标签的靶蛋白牢固地共定位(图3E)。
实施例8：蛋白质印迹
为了测试ALFA标签是否可以被采用荧光标记的NbALFAST的蛋白质印迹检测，我们分析了带ALFAST标签的波形蛋白(图6A和图7A)或带ALFAPE标签的波形蛋白(图6A)转染的COS-7细胞的裂解物。非相关质粒转染的细胞的裂解液用作对照。在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western-blotting)之后，可以用IRDye800CW(FluoTag-X2抗-ALFA IRDye800CW)标记的NbALFAST特异性检测带ALFA标签的波形蛋白。在缺乏带ALFA标签的蛋白的对照裂解物中只能检测到少量次要非特异性条带(图7A)。
为直接比较NbALFAST和常用的识别表位标签的单克隆工具的性能，我们制备了与多个表位标签(HA、myc、FLAG和ALFAST，图6B)融合的麦芽糖结合蛋白(MBP)。用相同浓度的一级抗体(或纳米抗体)单独检测每个表位标签显示出信号强度和灵敏度的显著差异(图6C，图7B)。使用荧光标记的NbALFST获得的ALFAST标签的检测信号相比所有其它表位标签获得的信号总体上是3-10倍强。这一结果尤其引人注目，因为单克隆抗体(抗FLAG M2、抗HAF-7、抗myc 9E10)的检测由于使用多克隆二级抗体而包括了信号放大，而ALFAST标签的检测完全依赖于直接标记的NbALFST。在不进一步优化检测条件的情况下，NbALFST产生了至少三个数量级的显著线性信号(图6D)，并且能够检测低至100pg的靶蛋白量。因此，检测限是对所有其他表位标签观察到～10倍那么低。
实施例9：利用ALFA Selector树脂捕获带ALFAST标签的靶蛋白
接下来，我们将NbALFAST通过亲水性和柔性接头位点特异性地固定在具有超低背景的琼脂糖基树脂上。用带ALFAST标签的GFP变体(shGFP2；Frey,S.等人.SurfaceProperties Determining Passage Rates of Proteins through Nuclear Pores.Cell174,202–217.e9(2018)；图8A、B)分析与纳米抗体偶联树脂的结合。如所预料的，shGFP2-ALFAST有效且紧密地结合到所得树脂。然而，结合太强以致于即使当使用显著过量的游离ALFAST肽时也不能从树脂竞争性地洗脱肽(图8A，黑色实线)。甚至在与10个柱体积的200μM肽竞争60分钟后，＞95％shGFP2-ALFAST蛋白质仍保留在树脂上。因此我们称NbALFAST负载的树脂为“ALFA SelectorST”(ST表示超级紧密(Super-Tight))。基于NbALFAST-ALFAST复合物的结构，我们遵循合理的诱变方法来鉴别较弱的NbALFAST突变体，其允许有效的肽洗脱，同时在不存在游离的ALFAST肽的情况下与带ALFAST标签的蛋白稳定结合。我们发现了一种NbALFA突变体，NbALFAPE(PE表示肽洗脱(Peptide Elution))满足这些标准：负载固定化NbALFAPE的琼脂糖树脂(ALFA SelectorPE)紧密结合shGFP2-ALFAST。即使洗涤＞1小时，靶蛋白也仍然稳定地结合在树脂上。然而，在自然条件下，室温下，经与游离的ALFAST竞争，它在～15-20分钟(t1/2～3分钟)内就被有效释放(图8B和图10A，黑色实线)。当ALFAST标签被置于两个折叠的结构域之间时，观察到了类似的洗脱动力学(图10B)，而N-末端带ALFAST标签的shGFP2从ALFA SeclectorPE的洗脱稍快(t1/2～50秒；图10C)。值得注意的是，在没有竞争肽的情况下，所有靶蛋白从ALFA SeclectorST和ALFA SeclectorPE上的自发洗脱都是不显著的(图8B和图10，虚灰线)。
实施例10：带ALFA标签的蛋白与ALFA Seclector的相互作用与严格洗涤相容。
我们决定进一步分析两种ALFA Selector树脂的生物化学性质。为此，两种树脂负载ALFAST-shGFP2或shGFP2-ALFAST，并进行严格的洗涤步骤(图8D)。对于所有树脂和底物的组合，该相互作用甚至耐包括高达3M NaCl、1M MgSO4、2M盐酸胍或1％非变性洗涤剂(如TX-100、DDM或脱氧胆酸钠)的严苛洗涤步骤。即使在室温下与100mM DTT孵育后也没有观察到解离。在变性条件下观察到不同树脂/底物组合之间的轻微差异：在用4M或6M尿素洗涤时观察到部分ALFAST-shGFP2以及更少程度的shGFP2-ALFAST从ALFA SeclectorPE释放，而相同条件下两种靶蛋白都保持与ALFA SeclectorST紧密结合。在与0.1％SDS孵育后观察到令人惊奇的差异，因为在与树脂保持结合的同时，附着至ALFA SeclectorPE的ALFAST-shGFP2部分失去其荧光。树脂和底物的任何其它组合都没有观察到这种效果。
实施例11：pH耐性
在类似的测定中，用调节到不同pH的缓冲液洗涤负载的ALFA Selector树脂(图8E)。相互作用耐pH7.5-9.5，而在pH4.5时只受轻微的影响。然而，当用pH2.2 100mM甘氨酸洗涤，即使在中和之后，两种ALFA Selector树脂都依然完全无荧光。相比之下，被洗脱下的物质在中性pH下成功地恢复了其荧光(未示出)，这表明用pH2.2甘氨酸甚至可以从紧密结合的ALFA SelectorST进行酸性洗脱。
实施例12：亲和力估测
shGFP2-ALFAST对NbALFAST和NbALFAPE的亲和力在溶液中通过微量热泳(MST)测定。该技术证明NbALFAPE解离常数为～15nM，而NbALFAST结合shGFP2-ALFAST的Kd值为～10pM，该值是该装置的检测下限。当假定结合速率为～2×105/M×秒(该速率在纳米抗体-靶相互作用中常见)，这些值与肽洗脱过程中观察到的解离动力学很好地一致(图8B)。
实施例13：从复杂裂解物中下拉带ALFAST标签的靶蛋白
为了解决我们的ALFA Selector树脂的特异性，我们在生理条件下进行了复杂裂解物的下拉实验(图9A-C)。为此，将3μM重组纯化的ALFAST-shGFP2掺入到在PBS中制备的大肠杆菌或HeLa裂解物(图9A)。融合蛋白特异性结合两钟ALFA Selector，但不结合没有偶联纳米抗体的对照树脂(“Selector对照”)。正如基于我们以前的实验所预期的，在天然条件下使用200μM的ALFAST肽将ALFAST-shGFP2从ALFA SelectorPE有效洗脱。相比之下，仅在用SDS样品缓冲液处理后才观察到从ALFA SelectorST的成功洗脱。令人惊奇的是，从大肠杆菌和HeLa裂解物两者的下拉都是高度特异性的(图9B和C)。从ALFA SelectorPE洗脱肽后，基本上所有可见的条带都可归因于input蛋白，并且即使在SDS洗脱液中，源自裂解物蛋白的可检测杂质的数量和强度也很低。实际上，ALFA SelectorPE经肽洗脱一步得到的ALFAST-shGFP2与用于掺入input裂解物的蛋白质相比，含有明显更少的污染物(图9A)。由于input蛋白质是经两个连续的层析步骤纯化的，所以这种观察结果特别引人注目。
实施例14：采用ALFA SelectorPE树脂的共免疫沉淀
为了了解ALFA系统是否也可应用于更精细的共免疫沉淀实验，我们尝试在天然条件下下拉二元大肠杆菌YfgM-PpiD内膜蛋白复合物(
Figure BDA0003060971240000541
H.等人YfgM is anancillary subunit of the SecYEG translocon in Escherichia coli.J Biol Chem289,19089–19097(2014))(图9D)。为此目的，野生型YfgM或YfgM-ALFAST在yfgMΔ菌株中表达。为了确保接近生理表达水平，两种YfgM变体都在内源性启动子的控制下从低拷贝质粒表达。当使用在温和的非离子洗涤剂DDM存在下制备的含YfgM-ALFAST的总裂解物作为input时，ALFA SelectorPE能够以特定和耐洗涤剂的方式下拉YfgM-PpiD复合物。这表明ALFAST标签与该不稳定膜复合物的形成相容。重要的是，所述天然的和未修饰的膜蛋白复合物可以使用200μM ALFAST肽在生理条件下在20分钟内从ALFA SelectorPE树脂回收。YfgM及其相互作用配偶体PpiD通过存在于(周质)YfgM的C-末端上的AlfAST标签与ALFA SelectorPE特异性连接，因为该复合物不能从表达未带标签的YfgM的对照裂解物中纯化。因此，ALFAST标签连同ALFA SelectorPE树脂不仅可用于纯化各种来源的蛋白质，还适用于具有挑战性的(膜)蛋白质复合物的天然下拉。
实施例15：活淋巴细胞的分离
ALFA SelectorPE的一种设想应用是在生理条件下的细胞特异性富集。这对于例如产生嵌合抗原受体修饰的T(CAR-T)细胞是特别有意义的，所述CAR-T细胞的前体通常从血液中获得(Tokarew,N.等人.Teaching an old dog new tricks:next-generation CAR Tcells.Br.J.Cancer(2018).doi:10.1038/s41416-018-0325-1)。为了考察ALFA系统是否可用于富集活的血细胞，使人外周血单核细胞(PBMC)通过预先负载识别CD62L的带ALFA标签的纳米抗体的ALFA SelectorPE柱，CD62L是典型地存在于未成熟T细胞上的表面标志物(
Figure BDA0003060971240000551
L.Development,trafficking,and function of memory T-cellsubsets.Immunological Reviews(2006).doi:10.1111/j.0105-2896.2006.00393.x)(图12a)。洗涤后，结合的细胞用ALFAST肽洗脱，用识别CD62L、全T细胞标志物CD3和全B细胞标志物CD19的抗体染色，并用FACS分析(图12)。总PBMC用作对照。使用该策略，CD62L+淋巴细胞的富集由71.8％变为97.7％(图12B)。此外，我们证实了大多数ALFA肽洗脱的细胞是CD3阳性T细胞，而B细胞代表分离的细胞的少数群体(图12C)。
讨论
我们报告了ALFA系统的发展和初始特征。该系统包括ALFAST标签(一种新的高度通用的表位标签)、其突变变体(ALFAPE标签)和一组分别以极高或中等亲和力识别ALFAST标签的相关单结构域抗体(纳米抗体)。重要的是，所选择的合理方法允许我们为ALFA系统配备对于其一般适用性至关重要的特征。当选择ALFA标签序列时，优选标签是小的，不含赖氨酸，不携带任何净电荷而是亲水性的，并且不存在于相关模型生物体的蛋白质组中，但是该标签将在溶液中采用稳定的折叠。结果，ALFA标签优选为通过设计高度特异性的，对胺反应性固定剂不敏感，通常被带标签的靶蛋白很好地耐受且在变性后可容易地再折叠。
作为结合物，我们优选纳米抗体，因为与常规抗体相比，它们是小的、单价的和耐用的探针，它们可以易于通过遗传手段修饰并在各种表达系统中重组生产。因此，可以位点特异性地固定纳米抗体或定量引入荧光标记(Pleiner,T.等人.Nanobodies:site-specific labeling for super-resolution imaging,rapid epitope-mapping andnative protein complex isolation.Elife 4,(2015))。NbALFAST是我们优选的识别ALFAST标签的高亲和力纳米抗体，因此可以方便地用于例如直接免疫荧光。由于纳米抗体尺寸小(直径～3-4nm)，附着的染料的数量和位置确定，荧光标记的NbAlFAST是高分辨率或定量成像的理想工具。我们可以证明NbALFAST确实与在哺乳动物细胞中表达的各种带ALFAST标签的靶蛋白相互作用。重要的是，NbALFAST甚至可以在真核细胞的细胞质中折叠，因此可以作为“为可以在真用于体内检测或操纵带ALFA标签的靶蛋白(Rothbauer,U.等人.Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.NatMethods 3,887–889(2006)；Kirchhofer,A.等人.Modulation of protein properties inliving cells using nanobodies.Nat Struct Mol Biol 17,133–138(2010)；
Figure BDA0003060971240000561
R.等人.Intracellular Delivery of Nanobodies for Imaging of Target Proteins inLive Cells.Pharm.Res.(2016).doi:10.1007/s11095-016-2052-8)。该发现与我们的生物化学证据一致，该证据表明NbALFAST在室温下至少耐受100mM DTT，并且提示所有纳米抗体共有的保守的内部二硫键对于与ALFAST标签的可靠相互作用在很大程度上是非必要的。对于胞内抗体的应用，我们发现在CMV或PGK启动子控制下的融合到荧光报告分子的NbALFAST和靶蛋白的表达都取得低本底的良好结果。对于最优结果或检测低丰度带ALFAST标签的靶蛋白，可能需要对相对表达水平的更精密滴定。
通常，大多数纳米抗体识别其靶蛋白表面上的三维表位，因此不识别变性蛋白(例如在蛋白质印迹中)。我们能证明NbALFAST是这一规则的一个例外，因为它也可用于蛋白质印迹应用中的高度灵敏的靶蛋白检测。这一事实提示ALFAST和ALFAPE标签在转移到膜上并除去SDS之后可以有效地重新折叠。直接比较显示——尽管其采用单价结合模式——在绝对信号强度和检测限方面，NbALFAST显著优于已有的单克隆抗表位标签工具。我们设想在其它需要高灵敏度的应用如ELISA或微阵列分析中也具有类似的优点。由于对胺反应性固定剂的耐性，我们相信在将来也有可能使ALFA系统适用于免疫EM应用。
NbALFAST对ALFAST标签的亲和力非常高。虽然这对于高剖面成像(profileimaging)应用和高灵敏度检测是理想的，但是它妨碍了在合理的时间框内在生理条件下的洗脱，因此其在生化应用上受限。因此，我们旨在降低纳米抗体对其底物的亲和力而不影响其特异性。我们通过两种不同的方法进行了研究：1)为降低结合强度我们筛选了大量的ALFA肽。这种方法找到了ALFAPE肽，其有效结合NbALFAST，但是可以通过与游离的ALFAST肽竞争而有效地被洗脱。2)基于与ALFAST肽复合的NbALFAST的晶体结构，我们在NbALFAST中引入了特异性突变，其成功地将解离速率提高到允许在生理条件下有效洗脱肽的水平。当固定到具有低本底结合的琼脂糖树脂时，所述突变体纳米抗体(NbALFAPE)被证明理想地适用于在生理条件下从各种裂解物中天然纯化蛋白质和蛋白质复合物。继而，在需要用高达6M的尿素或高达0.1％SDS进行严苛洗涤的特殊应用中，或者当需要从稀裂解物中除去极低丰度的蛋白质时，显示出野生型高亲和力纳米抗体(NbALFAST)的ALFA SelectorST可具有优势。然而，从ALFA SelectorST洗脱要求剧烈变性或酸性洗脱(例如1％SDS或甘氨酸pH2.2)，这通常与天然靶蛋白构象不相容。
NbALFAST与ALFAST肽结合的结构表明NbALFAST识别ALFAST肽的α-螺旋构象。为了使相邻二级结构对ALFAST标签构象的潜在影响最小化，我们将核心ALFAST序列(SRLEEELRRRLTE，SEQ ID NO：04)设置在两个脯氨酸之间用作“绝缘体”。使用这种方法，NbALFAST与ALFAST标签的相互作用很大程度独立于标签在蛋白质中的定位，即NbALFAST与NbALFAPE两者均识别位于靶蛋白的N-和C-末端或者甚至位于两个蛋白结构域内的ALFAST标签。
综上所述，我们在此提供了一种具有特别广泛适用性的新型表位标签系统。使用所述ALFA系统，携带带ALFAST标签的靶蛋白的单转基因细胞系或生物体足以用于大量不同的应用，包括(超分辨率)成像、蛋白质体内操作、通过蛋白质印迹的体外检测或者甚至是旨在检测特异性相互作用配偶体的天然下拉应用。ALFA SelectorPE甚至可用于从PBMC制品中选择性富集CD62L-阳性淋巴细胞(图12)。我们相信，该技术可以容易地转移到目前用于细胞分离方法和类似目的的已充分证实有效的重组Fab和scFv片段(Mohr,F.等人.Minimallymanipulated murine regulatory T cells purified by reversible Fab Multimersare potent suppressors for adoptive T-cell therapy.Eur.J.Immunol.(2017).doi:10.1002/eji.201747137)，或转移到识别表面标志物的新颖纳米抗体，所述表面标志物可以容易地装配ALFA标签。因此，我们的新技术可以有助于生物医学研究和治疗的最近进展，包括CAR-T技术(Tokarew,N.等人.Teaching an old dog new tricks:next-generationCAR T cells.Br.J.Cancer(2018).doi:10.1038/s41416-018-0325-1)。我们非常相信，由于应用范围广，ALFA系统是将显著刺激科学界的重要贡献。
材料和方法
3T3和COS-7细胞的转染
对于免疫荧光实验，依据制造商的建议，采用Polyjet转染试剂盒(SignaGen)，用表3中列出的合适质粒瞬时转染3T3或COS-7细胞。简而言之，对于每个实验，将细胞接种在12孔板上。根据孔的尺寸调节体积。1μg的各质粒与38μl无血清培养基预混合，随后补充在38μl无血清培养基中稀释的Polyjet转染试剂。将悬浮液在室温下孵育15分钟，然后滴加到细胞中。细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时。对于共表达实验，质粒DNA以1:1的比例预混合，并按上述方法进一步处理。
COS-7细胞的固定和染色
瞬时转染的细胞在转染后24小时在室温下在4％多聚甲醛(PFA)(w/v)或2％戊二醛(GA)(v/v)中固定30分钟。或者，在-20℃下在冰冷甲醇中固定15分钟。在室温下，细胞在含有10％正常山羊血清(v/v)和0.1％Triton-X 10(v/v)的PBS中阻断和透化15分钟。荧光标记的NbALFAST(Fluo Tag-X2抗ALFA AbberiorStar635P，NanoTag BiotechnologiesN1502-Ab635P-L)在含有3％正常山羊血清和0.1％Triton-X 100(v/v)的PBS中1:500稀释。所述细胞在该染色溶液中在室温下孵育1小时，随后用PBS洗涤3次，5min。为了使核染色，在一个PBS洗涤步骤中加入DAPI(0.4μg/ml)。用MOWIOL溶液将盖玻片安装在载玻片上，在37℃下干燥，并使用配备有20×镜头的落射式荧光(epifluorescence)显微镜(Axio，Zeiss)成像。将在细胞表面表达的构建体与在含有3％正常山羊血清和0.1％Triton-X 100(v/v)的PBS中分别1:1000和1:5000稀释的抗FLAG M2(一级抗体，Sigma，F1804)和Fluo Tag-X2抗小鼠IgG Atto488(二级纳米抗体，NanoTag，N1202-At488-L)共转染。
ALFA标签对EGFP定位的影响
用配备有40×1.3油镜的落射式荧光显微镜(Axio，Zeiss)对瞬时转染的3T3细胞成像。对于用pCMV ALFAST-EGFP、pCMV EGFP-ALFAST或pEGFP-N1转染的细胞，107-133个细胞在总共6-7张单独的图像上成像。对于每个单独的图像，根据EGFP的定位(“轻微核定位”、“均匀分布的”、“其它的”)对细胞进行分组和计数。用Student's t检验统计分析各组中细胞的部分。
用COS-7裂解物的蛋白质印迹
来自汇合的10cm皮氏培养皿的转染的细胞用PBS洗涤，并在2ml SDS样品缓冲液中裂解。裂解物用SDS-PAGE分解并转移到硝酸纤维素膜上。在TBS-T中用5％奶粉封闭后，将膜与小鼠抗微管蛋白孵育(SYSY#302 211；1:1000稀释)，随后用FluoTag-X2抗小鼠IgGIRDye680(NanoTag Biotechnologies#N1202；1:1000稀释)和FluoTag-X2抗ALFA IRDye800(NanoTag Biotechnologies#1502；1:1000稀释)孵育。用Odyssey CLx(Li-COR)扫描膜。
灵敏度测定
用pH7.4含0.lμg/mL BSA的PBS制备与FLAG、HA、myc和ALFAST标签融合的MBP的系列稀释液。将1μl每种稀释液点在硝酸纤维素膜上。
将膜用含5％奶粉的TBS-T封闭并洗涤。将现有的单克隆抗体(抗FLAG M2-Signa#F1804、抗myc 9E10-SynapticSystems#343 011、抗HA F-7-SantaCrus#sc-7392)与二级山羊抗小鼠IgG IRDye800CW(Li-COR#925-32210，1:500稀释)组合使用来分别检测FLAG、myc和HA标签。ALFAST标签用直接与IRDye800CW偶联的FluoTag-X2抗ALFA(NanoTagBiotechnologies#N1502)检测。所有一级抗体和纳米抗体的使用终浓度为2.7nM。用识别MBP的兔多克隆血清(SynapticSystem)检测MBP，并且抗兔IgG IRDye680RD(Li-COR#925-68071)用作内部负载对照。用Odyssey CLx(Li-COR)扫描膜。使用ImageStudioLight(Li-COR)进行定量。
解离速率测定
20μl ALFA SelectorST或ALFA SelectorPE(NanoTag Biotechnologies)用各自的重组靶蛋白饱和。用PBS洗涤4次之后，将珠子悬浮在含有200μM游离ALFAST肽的10倍过量的PBS中，并在25℃下混合。在没有肽的情况下进行对照反应。在指定的时间点，通过释放到上清液中的GFP荧光定量从珠子的特异性洗脱(Q-Bit 3.0；Thermo-Fischer Scientific)。平行进行三个独立的实验。使用Graphpad Prism 5.0计算平均值、标准偏差和指数拟合。使用配备有105mm微距镜头的Nikon D700(Nikon)在UV照射下拍摄照片。
对严格洗涤和pH的耐性
根据实验，10-15μl被所示的带ALFA标签的shGFP2融合蛋白饱和的ALFASelectorST或ALFA SelectorPE用PBS洗涤，并在室温下与100μl所示物质孵育60分钟。珠子沉降后，在UV照射下拍摄照片。为了测定pH耐性，在室温下将相同的珠子与缓冲至不同pH(100mM甘氨酸-盐酸，pH2.2；100mM乙酸钠pH4.5；100mM Tris-盐酸pH7.5；100mM碳酸盐pH9.5)的150mM NaCl在室温下孵育30分钟。用相同的缓冲液洗涤树脂两次。用PBS平衡数次后拍摄照片。
使用ALFA Selector树脂的一步亲和纯化。
为了从大肠杆菌或HeLa裂解物获得用于下拉实验的确定的input材料，将相应的模拟裂解物与3μM所示纯化的带ALFA标签的shGFP2变体混合。将1mL每种裂解物/底物混合物与25μl ALFA SelectorST或ALFA SelectorPE在4℃下孵育1小时。根据实验设置，没有固定化的sdAb(Selector对照)的类似树脂或没有靶蛋白的模拟裂解物用作特异性对照。用600μL PBS洗涤3次后，将树脂转移到MiniSpin柱(NanoTag Biotechnologies)中。通过离心(3000×g，30sek)除去过量的缓冲液，然后在室温下用PBS中的200μM ALFAST肽孵育两次10分钟，每次50μl。然后用SDS样品缓冲液洗脱保留在珠子上的蛋白。0.5μL(大肠杆菌)或5μL(HeLa)input和未结合部分通过SDS-PAGE(12％)和考马氏染色进行分离。所示的洗脱液流分与从1μl各树脂洗脱的物质对应。
使用ALFA SelectorPE下拉YfgM
用在内源性启动子的控制下从基于pSC的低拷贝载体表达的C-末端带ALFAST标签的或未带标签的YfgM补充yfgM缺失菌株。在冰上，使用1％DDM在1小时内将膜蛋白复合物从用缓冲液LS(50mM Tris pH7.5，300mM NaCl，5mM MgCl2)制备的总裂解物中溶解出来(Maddalo,G.等人.Systematic analysis of native membrane protein complexes inEscherichia coli.J Proteome Res 10,1848–1859(2011))。将两种裂解物与20μl的ALFASelectorPE树脂在转鼓上在4℃下孵育1小时。在PBS+0.3％DDM中洗涤后，经过用50μl含200μM ALFAST肽的PBS依次孵育两次，结合的蛋白在天然条件下被洗脱下来。对应于input和未结合材料的1/800或洗脱液流分的1/80的样品用SDS-PAGE分离。采用针对YfgM-PpiD复合物的多克隆兔抗血清(
Figure BDA0003060971240000601
H.等人.YfgM is an ancillary subunit of the SecYEGtranslocon in Escherichia coli.J Biol Chem 289,19089–19097(2014))后接HRP-偶联的山羊抗兔IgG(Dianova)，通过蛋白质印迹进行分析。采用Western Lighning Plus-ECL试剂盒(Perkin Elmer)发展印迹，并使用LAS 4000微型发光成像仪(Fuji Film)成像。
使用ALFA SelectorST下拉YfgM
用在内源性启动子的控制下从基于pSC的低拷贝载体表达的C-末端带ALFAPE标签的或未带标签的YfgM补充yfgM缺失菌株。在冰上，使用1％DDM在1小时内将膜蛋白复合物从用缓冲液LS(50mM Tris pH7.5，300mM NaCl，5mM MgCl2)制备的总裂解物中溶解出来(Maddalo,G.等人.Systematic analysis of native membrane protein complexes inEscherichia coli.J Proteome Res 10,1848–1859(2011))。将两种裂解物与20μl的ALFASelectorST树脂在转鼓上在4℃下孵育1小时。在PBS+0.3％DDM中洗涤后，经用50μl含200μMALFAST肽的PBS依次孵育两次，结合的蛋白在天然条件下被洗脱下来。对应于input和未结合材料的1/800或洗脱液流分的1/80的样品用SDS-PAGE分离。采用针对YfgM-PpiD复合物的多克隆兔抗血清(
Figure BDA0003060971240000612
H.等人.YfgM is an ancillary subunit of the SecYEGtranslocon in Escherichia coli.J Biol Chem 289,19089–19097(2014))后接HRP-偶联的山羊抗兔IgG(Dianova)，通过蛋白质印迹进行分析。采用Western Lighning Plus-ECL试剂盒(Perkin Elmer)发展印迹，并使用LAS 4000微型发光成像仪(Fuji Film)成像。
表3：质粒
Figure BDA0003060971240000611
Figure BDA0003060971240000621
(a)
Figure BDA0003060971240000623
H.等人.YfgM is an ancillary subunit of the SecYEG transloconin Escherichia coli.J Biol Chem 289,19089–19097(2014)
大肠杆菌菌株
大肠杆菌MC4100ΔyfgMΔppiD(
Figure BDA0003060971240000624
H.等人.YfgM is an ancillary subunitof the SecYEG translocon in Escherichia coli.J Biol Chem 289,19089–19097(2014))
表4抗体
Figure BDA0003060971240000622
Figure BDA0003060971240000631
(a)
Figure BDA0003060971240000633
H.等人.YfgM is an ancillary subunit of the SecYEG transloconin Escherichia coli.J Biol Chem 289,19089–19097(2014)
表5融合蛋白
Figure BDA0003060971240000632
Figure BDA0003060971240000641
Figure BDA0003060971240000651
Figure BDA0003060971240000661
Figure BDA0003060971240000671
Figure BDA0003060971240000681
Figure BDA0003060971240000691
Figure BDA0003060971240000701
蛋白质表达和纯化
所有重组蛋白在Tac-启动子的控制下从赋予卡那霉素抗性的具有ColE1起始的表达载体表达。
携带多个表位标签的MBP融合蛋白，ALFAST-shGFP2、ALFAPE-shGFP2和TwinStrepTag-bdNEDD8-ALFAmin表达为N-末端His14-bdSUMO融合体。对于蛋白表达，大肠杆菌在补充0.3mM IPTG的Terrific broth(TB)中于23℃下培养14-16小时。收获后，将大肠杆菌细胞用补充有15mM咪唑/HCl pH7.5和10mM DTT的LS缓冲液(50mM Tris/HCl pH7.5、300mM NaCl)裂解，并通过与Ni(II)螯合珠子结合纯化。在充分洗涤后，如前所述蛋白质用bdSENP1通过柱上切割洗脱(Frey,S.和
Figure BDA0003060971240000702
D.A new set of highly efficient,tag-cleaving proteases for purifying recombinant proteins.J Chromatogr A 1337,95–105(2014)；Frey,S.和
Figure BDA0003060971240000703
D.Purification of protein complexes of definedsubunit stoichiometry using a set of orthogonal,tag-cleaving proteases.JChromatogr A 1337,106–115(2014))。
ALFAST-shGFP2-His6、ALFAPE-shGFP2-His6、His14-bdSUMO-ALFAST-shsfGFP和His14-bdSUMO-ALFAPE-shsfGFP以类似的方式表达和纯化；然而，洗脱使用在缓冲液LS中250mM咪唑进行。
对于来自复杂裂解物的亲和力测定和结合研究，底物蛋白另外通过Superdex20010/30柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻层析纯化。
通过B细胞“Celline”亲和纯化选择特异性sdAb克隆
1mL的T-Catch树脂(IBA Lifesciences)用B细胞分离缓冲液(PBS pH7.4、1％BSA、1mM EDTA)洗涤，并用饱和量的TwinStrepTag-bdNEDD8-ALFAmin融合蛋白在室温下滚动孵育30min。通过用B细胞分离缓冲液充分洗涤，从过量的饵料蛋白(bait protein)中清除树脂。从用ALFA肽融合体免疫的羊驼中取出100mL血样，立即与5000IU/ml肝素(Sigma)孵育以防止凝血。使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)从新鲜血液(取样后4小时内)中分离PBMC。为了除去残留的血清，PBMC用B细胞分离缓冲液连续洗涤三次。用10个柱体积的B细胞分离缓冲液洗涤树脂之前，PBMC在负载的T-Catch树脂上通过三次。通过在室温下孵育2μMNEDP1(Frey,S.和
Figure BDA0003060971240000711
D.A new set of highly efficient,tag-cleaving proteasesfor purifying recombinant proteins.J Chromatogr A1337,95–105(2014)；Frey,S.和
Figure BDA0003060971240000712
D.Purification of protein complexes of defined subunit stoichiometryusing a set of orthogonal,tag-cleaving proteases.J Chromatogr A1337,106–115(2014))30分钟，从树脂洗脱结合的B细胞。通过多步巢式RT-PCR从洗脱的B细胞扩增出sdAb特异性cDNA库，并克隆到细菌表达载体中。通过ELISA测试了96个单克隆的ALFA反应性sdAb的表达。
人PBMC的制备
使用标准密度梯度离心从新鲜血液中获得人外周血单核细胞(PBMC)。简言之，60mL新鲜血液用40mL补充有1mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，并将其置于50mLLEUCOSEP管(Greiner Bio-One)中放在CELLPURE Roti-Sep 1077(Carl Roth)上层，在室温下以800×g离心20分钟。随后，收集含PBMC的层，并在冷PBS+EDTA中洗涤5次以除去血小板。
CD62L-阳性淋巴细胞的分离
约2×107个PBMC借助重力流通过负载有带ALFA标签的抗人CD62L纳米抗体的ALFASelectorPE树脂，然后用补充有1mM EDTA 1和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS充分洗涤。随后，在含有200μM ALFA肽的相同缓冲液中洗脱结合的细胞。
本文中说明性描述的本发明可以在缺少未在本文中具体公开的一个或多个要素、一种或多种限制的情况下被适当地实施。另外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述的术语，而不是用作限制的术语，并且在使用这样的术语和措辞时并不意味着排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而是应该认识到各种改进可以在所要求保护的本发明的范围内。因此，应当理解，尽管本发明已经由示例性实施方案和可选的特征具体公开，但本领域技术人员可以对本文公开的在其中实施的发明进行改进和变形，并且这种改进和变形被认为是在本发明的范围内。
本发明在此被大体上和一般性地描述。属于通用披露内容的较狭义类型和亚属组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括本发明的通用说明，其限制条件或负面限制是从所述属中移除任何主题，无论所删除的材料是否在本文中特定叙述。
其它实施方案在所附权利要求书的范围内。此外，当本发明的特征或方面以马库什组来描述时，本领域技术人员将认识到，本发明也由此以马库什组的任何单独成员或成员亚组来描述。
序列表
<110> 纳诺泰克生物技术公司
<120> 由特异性结合物识别的表位标签
<130> LC21310006P
<150> EP18193663.4
<151> 2018-09-11
<150> EP19160485.9
<151> 2019-03-04
<160> 199
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Xaa Xaa
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是G或S或P或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或G或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是S或T或P或A或D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是P或A或S或A或D或E或无氨基酸
<400> 2
Xaa Xaa Leu Glu Xaa Glu Xaa Arg Arg Arg Leu Xaa Xaa
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S或T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是T或D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是A或D或E或无氨基酸
<400> 3
Xaa Xaa Leu Glu Xaa Glu Leu Arg Arg Arg Leu Xaa Xaa
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Met Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
1 5 10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Gly Arg Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Pro Gly Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Pro Ser Thr Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是G或S或T或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或G或A或E或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是L或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是L或I或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是R或A或Q或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是R或A或Q或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是S或T或D或E或P或A或无氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是E或K或P或S或A或D或无氨基酸
<400> 12
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Pro
1 5 10 15
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Asp Pro
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr
1 5 10
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala
1 5 10 15
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Ala
1 5 10 15
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Pro
1 5 10 15
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Met Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Met Ser Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是G或S或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是L或I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是S或T或P或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是P或A或S或无氨基酸
<400> 31
Xaa Xaa Leu Glu Xaa Glu Xaa Arg Arg Arg Leu Xaa Xaa
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Met Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro
1 5 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Ser Asp Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Pro Asp Gly Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Pro Ser Gly Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Asp Ser Pro Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Pro Asp Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Pro Ala
1 5 10 15
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Glu
1 5 10 15
Pro
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Gly Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr
1 5 10
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Gly Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Pro Ser Lys
1 5 10 15
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Pro Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Ser Pro Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Pro Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Pro Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
Pro Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
Pro Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro
1 5 10 15
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是S或G或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或G或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是S或T或D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是P或A或D或无氨基酸
<400> 49
Xaa Xaa Leu Glu Xaa Glu Leu Arg Arg Arg Leu Xaa Xaa
1 5 10
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
Pro Asp Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Pro Asp Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
Pro Ser Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
Asp Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 54
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
Asp Ser Gly Pro Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Glu
1 5 10 15
Pro
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Asp Ala Pro
1 5 10 15
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Asp Pro
1 5 10 15
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是G或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是R或G或A或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是L或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是L或I或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是R或A或Q或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是R或A或Q或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是S或T或L或无氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是K或P或S或无氨基酸
<400> 61
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu Xaa Xaa
1 5 10
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Lys Gly
1 5 10 15
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
Ser Asp Ser Gly Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Ser Asp Ser Gly Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 66
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Ser Asp Ser Ala Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Ser Asp Ser Gly Leu Gln Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
Ser Asp Ser Gly Leu Glu Glu Gln Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
Ser Asp Ser Gly Leu Glu Glu Glu Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
Ser Asp Ser Gly Leu Glu Glu Glu Val Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
Asp Ser Gly Glu Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 72
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 73
Gln Gln Asp Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Ile Arg Arg Arg Leu Ser
1 5 10 15
Pro Gly
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 75
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 76
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Gln Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 77
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Glu Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 78
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Ala Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 79
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 79
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Gln Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 80
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 80
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Glu Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 81
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 81
Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu
1 5 10
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
Met Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Pro Ser
1 5 10 15
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
Met Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 84
Ser Pro Ser Ala Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 85
Gly Pro Ser Ala Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 86
Met Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Pro Ser
1 5 10 15
<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 87
Met Ser Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Pro Ser
1 5 10 15
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 88
Met Pro Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ser
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 89
Met Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro
1 5 10 15
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 90
Asp Ser Met Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Lys Gly
1 5 10 15
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 91
Asp Ser Met Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 92
Ser Asp Ser Gly Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 93
Ser Asp Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 94
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 95
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Ser Pro Gly
1 5 10
<210> 96
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 96
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Ser Pro Gly
1 5 10
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 97
Ser Asp Ser Gly Leu Glu Glu Glu Ala Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 98
Ser Asp Ser Gly Ala Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 99
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 99
Asp Ser Gly Ala Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 100
Asp Ser Gly Ala Leu Glu Gln Glu Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 101
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Arg Ala Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 102
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 102
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 103
Asp Ser Gly Arg Leu Glu Gln Glu Ile Arg Arg Glu Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
<210> 104
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 104
Pro Asp Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Pro Thr Ala
1 5 10 15
<210> 105
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 105
Asp Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Pro Thr Ala
1 5 10 15
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 106
Asp Ser Pro Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Pro Thr Ala
1 5 10 15
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 107
Asp Ser Gly Pro Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Pro Thr Ala
1 5 10 15
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 108
Gly Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu
1 5 10
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 109
Met Ser Ala Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 110
Met Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Pro Ser
1 5 10 15
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 111
Met Ser Ala Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 112
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 112
Met Pro Ser Ala Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 113
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 113
Met Ser Ser Ala Val Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 114
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 114
Pro Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Pro
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 115
Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly
1 5 10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 116
Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met
1 5
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 117
Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 118
Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly
1 5 10
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 119
Ala Val Ser Ser Arg Gly Asn Ala Met
1 5
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 120
Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr
1 5 10
<210> 121
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 121
Gly Val Thr Val Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly
1 5 10
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 122
Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met
1 5
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 123
Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr
1 5 10
<210> 124
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Q、V、E或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是Q或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Xaa是L或M
<400> 124
Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Xaa Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Xaa Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 125
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<400> 125
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 126
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是A或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是R或E
<400> 126
Trp Tyr Arg Gln Xaa Pro Gly Glu Xaa Arg Val Met Val Ala
1 5 10
<210> 127
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<400> 127
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg Val Met Val Ala
1 5 10
<210> 128
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<400> 128
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg Val Met Val Ala
1 5 10
<210> 129
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是K或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是T或M
<400> 129
Tyr Arg Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr
1 5 10 15
Asn Lys Met Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Xaa Pro Glu Asp Xaa
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys His Val
35
<210> 130
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<400> 130
Tyr Arg Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr
1 5 10 15
Asn Lys Met Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys His Val
35
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是T或I
<400> 131
Trp Gly Gln Gly Xaa Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<400> 132
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 133
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 133
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 134
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Ser Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 135
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 136
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 136
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Ser Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 137
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 137
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Gln Pro Glu Asp Met Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 138
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Thr Ala Pro Gly Val Thr Val Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Gln Pro Glu Asp Met Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 139
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 139
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 140
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 141
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 141
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 142
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 142
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 143
Gly Thr Met Ser Ala Ile Asn Ala Leu Asn
1 5 10
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 144
Ala Ile Thr Asp Asn Gly Asn Ala His
1 5
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 145
Leu Glu Glu Glu Lys Leu Gly Val Trp Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 146
Gly Thr Met Ser Ala Ile Asn Ala Leu Asn
1 5 10
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 147
Ala Ile Thr Asp Asn Gly Asn Ala His
1 5
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 148
Leu Glu Glu Lys Leu Gly Ala Trp Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 149
Gly Thr Met Ser Ala Ile Asn Ala Leu Asn
1 5 10
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 150
Ala Ile Thr Asp Asn Gly Asn Ala His
1 5
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDR
<400> 151
Leu Glu Lys Glu Lys Leu Gly Val Trp Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 152
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是V或L
<400> 152
Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 153
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是P或A
<400> 153
Trp Tyr Arg Gln Xaa Pro Gly Lys Glu Arg Lys Met Val Ala
1 5 10
<210> 154
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是K或E
<400> 154
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Arg Asn Met Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys His Tyr
35
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体FR
<400> 155
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 156
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Met Ser Ala Ile Asn
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Lys Met Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Asp Asn Gly Asn Ala His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Met Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Tyr Leu Glu Glu Glu Lys Leu Gly Val Trp Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 157
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Met Ser Ala Ile Asn
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Lys Met Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Asp Asn Gly Asn Ala His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Met Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Tyr Leu Glu Glu Lys Leu Gly Ala Trp Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 158
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Met Ser Ala Ile Asn
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Lys Met Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Asp Asn Gly Asn Ala His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Met Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Tyr Leu Glu Lys Glu Lys Leu Gly Val Trp Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 159
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG-标签
<400> 160
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myc-标签
<400> 161
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-标签
<400> 162
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-G-标签
<400> 163
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 164
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSV-标签
<400> 164
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
1 5 10
<210> 165
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V5-标签
<400> 165
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SPOT-标签
<400> 166
Pro Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 167
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC2标签
<400> 167
Pro Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gln Gln
1 5 10
<210> 168
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPEA标签
<400> 168
Glu Pro Glu Ala
1
<210> 169
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 169
Gly Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala
1 5 10 15
<210> 170
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 170
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Asp Pro
1 5 10 15
<210> 171
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 171
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 172
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Glu
1 5 10 15
Pro
<210> 173
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 173
Asp Ser Pro Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
<210> 174
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 174
Ser Pro Ser Gly Leu Glu Gln Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
<210> 175
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 175
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Asp Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 176
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 176
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Asn Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 177
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼VHH结构域
<400> 177
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser His Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 178
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Strep-标签
<400> 178
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 179
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 酰胺化
<400> 179
Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 180
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 180
Met Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly Gly Ser Gly Thr Ser Ser Arg Pro
35 40 45
Ser Ser Asn Arg Ser Tyr Val Thr Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu
50 55 60
Gly Ser Ala Leu Arg Pro Ser Thr Ser Arg Ser Leu Tyr Ser Ser Ser
65 70 75 80
Pro Gly Gly Ala Tyr Val Thr Arg Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser
85 90 95
Ser Val Pro Gly Val Arg Leu Leu Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys
115 120 125
Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys
130 135 140
Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu
145 150 155 160
Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu
165 170 175
Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys
180 185 190
Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg
195 200 205
Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu
210 215 220
Ser Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala
225 230 235 240
Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala
245 250 255
Phe Leu Lys Lys Leu His Asp Glu Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln
260 265 270
Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp
275 280 285
Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala
290 295 300
Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala
305 310 315 320
Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala
325 330 335
Lys Gln Glu Ser Asn Glu Tyr Arg Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met
355 360 365
Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala Leu Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp
370 375 380
Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met
385 390 395 400
Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala
405 410 415
Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu
420 425 430
Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro Thr Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg
435 440 445
Glu Thr Asn Leu Glu Ser Leu Pro Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg
450 455 460
Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn
465 470 475 480
Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp Leu Glu
485 490
<210> 181
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 181
Met Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly Gly Ser Gly Thr Ser Ser Arg Pro Ser
35 40 45
Ser Asn Arg Ser Tyr Val Thr Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly
50 55 60
Ser Ala Leu Arg Pro Ser Thr Ser Arg Ser Leu Tyr Ser Ser Ser Pro
65 70 75 80
Gly Gly Ala Tyr Val Thr Arg Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser
85 90 95
Val Pro Gly Val Arg Leu Leu Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala
100 105 110
Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val
115 120 125
Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val
130 135 140
Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln
145 150 155 160
Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu
165 170 175
Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala
180 185 190
Arg Val Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu
195 200 205
Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Ser
210 215 220
Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg
225 230 235 240
Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala Phe
245 250 255
Leu Lys Lys Leu His Asp Glu Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile
260 265 270
Gln Glu Gln His Val Gln Ile Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu
275 280 285
Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala
290 295 300
Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp
305 310 315 320
Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys
325 330 335
Gln Glu Ser Asn Glu Tyr Arg Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu
340 345 350
Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg
355 360 365
Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala Leu Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr
370 375 380
Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala
385 390 395 400
Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu
405 410 415
Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser
420 425 430
Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro Thr Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu
435 440 445
Thr Asn Leu Glu Ser Leu Pro Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr
450 455 460
Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu
465 470 475 480
Thr Ser Gln His His Asp Asp Leu Glu
485
<210> 182
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 182
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Leu Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Asn Ser
20 25 30
Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val
35 40 45
Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe
50 55 60
Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr
65 70 75 80
Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr
85 90 95
Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro
100 105 110
Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly
115 120 125
Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys
130 135 140
Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile
145 150 155 160
Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp
180 185 190
Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile
195 200 205
Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro
210 215 220
Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr
225 230 235 240
Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val
245 250 255
Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu
260 265 270
Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg
275 280 285
Leu Thr Glu
290
<210> 183
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 183
Met Lys Ser Phe Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ala Ile Leu Ala Thr Val
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Ala Ile Gly Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Asn Ser
20 25 30
Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val
35 40 45
Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe
50 55 60
Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr
65 70 75 80
Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr
85 90 95
Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro
100 105 110
Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly
115 120 125
Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys
130 135 140
Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile
145 150 155 160
Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp
180 185 190
Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile
195 200 205
Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro
210 215 220
Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr
225 230 235 240
Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val
245 250 255
Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu
260 265 270
Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg
275 280 285
Leu Thr Glu
290
<210> 184
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 184
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Asn
20 25 30
Gly Thr Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
35 40 45
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
50 55 60
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
65 70 75 80
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
85 90 95
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
100 105 110
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
115 120 125
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
130 135 140
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
145 150 155 160
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
165 170 175
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
180 185 190
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
195 200 205
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
210 215 220
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
225 230 235 240
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe
245 250 255
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly
260 265 270
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
275 280 285
Gly Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly
290 295 300
Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys
305 310 315 320
Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile
325 330 335
Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
340 345 350
<210> 185
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 185
Met Gly Ser Gly Asp Ala Ser Asp Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr
20 25 30
Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly Trp
35 40 45
Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg Val Met Val Ala Ala Val Ser
50 55 60
Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr
65 70 75 80
Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met Val Ser Leu Gln Met Asp Asn
85 90 95
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu Glu Asp
100 105 110
Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Thr Ser Gly Ser Thr
130 135 140
Gly Glu Asn Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys
145 150 155 160
Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His
165 170 175
Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser
195 200 205
Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Ile
210 215 220
Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu
225 230 235 240
Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val
245 250 255
Thr Val Thr Gln Asp Thr Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys
260 265 270
Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln
275 280 285
Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu
290 295 300
Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp
305 310 315 320
Gly Gly Arg Tyr Leu Ala Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys
325 330 335
Pro Val Gln Met Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile
340 345 350
Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser
355 360 365
Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
370 375 380
<210> 186
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFP
<400> 186
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 187
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 187
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly
225 230 235 240
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
245 250 255
<210> 188
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 188
Met Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
20 25 30
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
35 40 45
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
50 55 60
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
65 70 75 80
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
85 90 95
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
100 105 110
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
115 120 125
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
130 135 140
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
145 150 155 160
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
165 170 175
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
180 185 190
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
195 200 205
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
210 215 220
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
225 230 235 240
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
245 250 255
<210> 189
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 189
Met Ser Lys His His His His Ser Asn His His Arg His Asn His His
1 5 10 15
His His Ser Gly Asn His His His Ser Gly Ser Ala Ala Gly Gly Glu
20 25 30
Glu Asp Lys Lys Pro Ala Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ala His Ile Asn
35 40 45
Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg Ile Lys
50 55 60
Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr Cys Asp Arg Gln
65 70 75 80
Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg Arg Leu
85 90 95
Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu Asp Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Gly Ala Ser Asp Tyr Lys Asp
115 120 125
Asp Asp Asp Lys Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
130 135 140
Tyr Ala Ser Asn Gly Thr Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp
145 150 155 160
Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys
165 170 175
Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys
180 185 190
Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp
195 200 205
Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly
210 215 220
Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr
225 230 235 240
Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr
245 250 255
Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu
260 265 270
Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu
275 280 285
Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro
290 295 300
Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys
305 310 315 320
Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala
325 330 335
Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys
340 345 350
His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn
355 360 365
Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn
370 375 380
Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe
385 390 395 400
Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile
405 410 415
Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn
420 425 430
Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro
435 440 445
Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp
450 455 460
Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met
465 470 475 480
Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala
485 490 495
Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys
500 505 510
Asp Ala Gln Thr Asn Gly Ser Val Ser Ala Gly Asp Glu Gln Lys Leu
515 520 525
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp Thr Ala Ser Thr
530 535 540
Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
545 550 555
<210> 190
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 190
Met Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Thr Val Pro Ile Lys Val Glu
20 25 30
Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly
35 40 45
Glu Gly Asp Ala Thr Glu Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr
65 70 75 80
Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His
85 90 95
Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr
100 105 110
Ile Glu Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys
115 120 125
Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Asn Asp
130 135 140
Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn His
145 150 155 160
Asn Ser His Asn Val Arg Ile Glu Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile
165 170 175
Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Gln Gln
180 185 190
Glu Ala Asp His Lys Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val
195 200 205
Arg Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Thr Leu Ser Lys
210 215 220
Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe Val Thr
225 230 235 240
Ala Ala Gly Ile Thr Lys Gly Glu Asp Glu Arg Asp Lys His His His
245 250 255
His His His
<210> 191
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 191
Met Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Thr Val Pro Ile Lys Val Glu Leu
20 25 30
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu
35 40 45
Gly Asp Ala Thr Glu Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr
65 70 75 80
Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp
85 90 95
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Glu Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
115 120 125
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Asn Asp Phe
130 135 140
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn His Asn
145 150 155 160
Ser His Asn Val Arg Ile Glu Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
165 170 175
Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Gln Gln Glu
180 185 190
Ala Asp His Lys Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Arg
195 200 205
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Thr Leu Ser Lys Asp
210 215 220
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe Val Thr Ala
225 230 235 240
Ala Gly Ile Thr Lys Gly Glu Asp Glu Arg Asp Lys His His His His
245 250 255
His His
<210> 192
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 192
Met Ser Lys His His His His Ser Asn His His Arg His Asn His His
1 5 10 15
His His Ser Gly Asn His His His Ser Gly Ser Ala Ala Gly Gly Glu
20 25 30
Glu Asp Lys Lys Pro Ala Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ala His Ile Asn
35 40 45
Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg Ile Lys
50 55 60
Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr Cys Asp Arg Gln
65 70 75 80
Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg Arg Leu
85 90 95
Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu Asp Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Gly Gly Ser Lys Gly Glu Glu
115 120 125
Leu Phe Thr Gly Thr Val Pro Ile Lys Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
130 135 140
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
145 150 155 160
Glu Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
165 170 175
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser
195 200 205
Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Glu Phe Lys Asp
210 215 220
Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
225 230 235 240
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Asn Asp Phe Lys Glu Asp Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn His Asn Ser His Asn Val
260 265 270
Arg Ile Glu Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys
275 280 285
Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Gln Gln Glu Ala Asp His Lys
290 295 300
Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Arg Leu Pro Asp Asn
305 310 315 320
His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Thr Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys
325 330 335
Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr
340 345 350
Lys Gly Glu Asp Glu Arg Asp Lys Gly Ser Gly Asn Ser Asp Gly Pro
355 360 365
Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
370 375 380
<210> 193
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 193
Met Ser Lys His His His His Ser Asn His His Arg His Asn His His
1 5 10 15
His His Ser Gly Asn His His His Ser Gly Ser Ala Ala Gly Gly Glu
20 25 30
Glu Asp Lys Lys Pro Ala Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ala His Ile Asn
35 40 45
Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg Ile Lys
50 55 60
Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr Cys Asp Arg Gln
65 70 75 80
Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg Arg Leu
85 90 95
Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu Asp Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Gly Gly Ser Lys Gly Glu Glu
115 120 125
Leu Phe Thr Gly Thr Val Pro Ile Lys Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
130 135 140
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
145 150 155 160
Glu Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
165 170 175
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser
195 200 205
Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Glu Phe Lys Asp
210 215 220
Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
225 230 235 240
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Asn Asp Phe Lys Glu Asp Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn His Asn Ser His Asn Val
260 265 270
Arg Ile Glu Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys
275 280 285
Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Gln Gln Glu Ala Asp His Lys
290 295 300
Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Arg Leu Pro Asp Asn
305 310 315 320
His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Thr Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys
325 330 335
Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr
340 345 350
Lys Gly Glu Asp Glu Arg Asp Lys Gly Ser Gly Asn Ser Asp Gly Met
355 360 365
Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro
370 375 380
<210> 194
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 194
Met Ser Lys His His His His Ser Asn His His Arg His Asn His His
1 5 10 15
His His Ser Gly Asn His His His Ser Gly Ser Ala Ala Gly Gly Glu
20 25 30
Glu Asp Lys Lys Pro Ala Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ala His Ile Asn
35 40 45
Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg Ile Lys
50 55 60
Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr Cys Asp Arg Gln
65 70 75 80
Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg Arg Leu
85 90 95
Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu Asp Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Asp
115 120 125
Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
130 135 140
Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Thr Val Pro Ile Lys Val Glu
145 150 155 160
Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly
165 170 175
Glu Gly Asp Ala Thr Glu Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr
180 185 190
Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His
210 215 220
Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr
225 230 235 240
Ile Glu Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys
245 250 255
Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Asn Asp
260 265 270
Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn His
275 280 285
Asn Ser His Asn Val Arg Ile Glu Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile
290 295 300
Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Gln Gln
305 310 315 320
Glu Ala Asp His Lys Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val
325 330 335
Arg Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Thr Leu Ser Lys
340 345 350
Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe Val Thr
355 360 365
Ala Ala Gly Ile Thr Lys Gly Glu Asp Glu Arg Asp Lys Ala
370 375 380
<210> 195
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 195
Met Ser Lys His His His His Ser Asn His His Arg His Asn His His
1 5 10 15
His His Ser Gly Asn His His His Ser Gly Ser Ala Ala Gly Gly Glu
20 25 30
Glu Asp Lys Lys Pro Ala Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ala His Ile Asn
35 40 45
Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg Ile Lys
50 55 60
Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr Cys Asp Arg Gln
65 70 75 80
Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg Arg Leu
85 90 95
Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu Asp Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Gly Ser Gly Asp Ala Ser Asp
115 120 125
Ser Met Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser Pro
130 135 140
Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Thr Val Pro Ile Lys Val Glu
145 150 155 160
Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly
165 170 175
Glu Gly Asp Ala Thr Glu Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr
180 185 190
Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His
210 215 220
Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr
225 230 235 240
Ile Glu Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys
245 250 255
Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Asn Asp
260 265 270
Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn His
275 280 285
Asn Ser His Asn Val Arg Ile Glu Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile
290 295 300
Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Gln Gln
305 310 315 320
Glu Ala Asp His Lys Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val
325 330 335
Arg Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Thr Leu Ser Lys
340 345 350
Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Lys Glu Phe Val Thr
355 360 365
Ala Ala Gly Ile Thr Lys Gly Glu Asp Glu Arg Asp Lys Ala
370 375 380
<210> 196
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 196
Met Glu Ile Tyr Glu Asn Glu Asn Asp Gln Val Glu Ala Val Lys Arg
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ala Val Gly Val Ile Leu Gly
20 25 30
Val Gly Ala Leu Ile Gly Trp Arg Tyr Trp Asn Ser His Gln Val Asp
35 40 45
Ser Ala Arg Ser Ala Ser Leu Ala Tyr Gln Asn Ala Val Thr Ala Val
50 55 60
Ser Glu Gly Lys Pro Asp Ser Ile Pro Ala Ala Glu Lys Phe Ala Ala
65 70 75 80
Glu Asn Lys Asn Thr Tyr Gly Ala Leu Ala Ser Leu Glu Leu Ala Gln
85 90 95
Gln Phe Val Asp Lys Asn Glu Leu Glu Lys Ala Ala Ala Gln Leu Gln
100 105 110
Gln Gly Leu Ala Asp Thr Ser Asp Glu Asn Leu Lys Ala Val Ile Asn
115 120 125
Leu Arg Leu Ala Arg Val Gln Val Gln Leu Lys Gln Ala Asp Ala Ala
130 135 140
Leu Lys Thr Leu Asp Thr Ile Lys Gly Glu Gly Trp Ala Ala Ile Val
145 150 155 160
Ala Asp Leu Arg Gly Glu Ala Leu Leu Ser Lys Gly Asp Lys Gln Gly
165 170 175
Ala Arg Ser Ala Trp Glu Ala Gly Val Lys Ser Asp Val Thr Pro Ala
180 185 190
Leu Ser Glu Met Met Gln Met Lys Ile Asn Asn Leu Ser Ile Gly Ser
195 200 205
Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
210 215 220
<210> 197
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 197
Met Glu Ile Tyr Glu Asn Glu Asn Asp Gln Val Glu Ala Val Lys Arg
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ala Val Gly Val Ile Leu Gly
20 25 30
Val Gly Ala Leu Ile Gly Trp Arg Tyr Trp Asn Ser His Gln Val Asp
35 40 45
Ser Ala Arg Ser Ala Ser Leu Ala Tyr Gln Asn Ala Val Thr Ala Val
50 55 60
Ser Glu Gly Lys Pro Asp Ser Ile Pro Ala Ala Glu Lys Phe Ala Ala
65 70 75 80
Glu Asn Lys Asn Thr Tyr Gly Ala Leu Ala Ser Leu Glu Leu Ala Gln
85 90 95
Gln Phe Val Asp Lys Asn Glu Leu Glu Lys Ala Ala Ala Gln Leu Gln
100 105 110
Gln Gly Leu Ala Asp Thr Ser Asp Glu Asn Leu Lys Ala Val Ile Asn
115 120 125
Leu Arg Leu Ala Arg Val Gln Val Gln Leu Lys Gln Ala Asp Ala Ala
130 135 140
Leu Lys Thr Leu Asp Thr Ile Lys Gly Glu Gly Trp Ala Ala Ile Val
145 150 155 160
Ala Asp Leu Arg Gly Glu Ala Leu Leu Ser Lys Gly Asp Lys Gln Gly
165 170 175
Ala Arg Ser Ala Trp Glu Ala Gly Val Lys Ser Asp Val Thr Pro Ala
180 185 190
Leu Ser Glu Met Met Gln Met Lys Ile Asn Asn Leu Ser Ile Gly Ser
195 200 205
Met Ser Gly Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Ser
210 215 220
<210> 198
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> YfgM
<400> 198
Met Glu Ile Tyr Glu Asn Glu Asn Asp Gln Val Glu Ala Val Lys Arg
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asn Gly Lys Ala Leu Ala Val Gly Val Ile Leu Gly
20 25 30
Val Gly Ala Leu Ile Gly Trp Arg Tyr Trp Asn Ser His Gln Val Asp
35 40 45
Ser Ala Arg Ser Ala Ser Leu Ala Tyr Gln Asn Ala Val Thr Ala Val
50 55 60
Ser Glu Gly Lys Pro Asp Ser Ile Pro Ala Ala Glu Lys Phe Ala Ala
65 70 75 80
Glu Asn Lys Asn Thr Tyr Gly Ala Leu Ala Ser Leu Glu Leu Ala Gln
85 90 95
Gln Phe Val Asp Lys Asn Glu Leu Glu Lys Ala Ala Ala Gln Leu Gln
100 105 110
Gln Gly Leu Ala Asp Thr Ser Asp Glu Asn Leu Lys Ala Val Ile Asn
115 120 125
Leu Arg Leu Ala Arg Val Gln Val Gln Leu Lys Gln Ala Asp Ala Ala
130 135 140
Leu Lys Thr Leu Asp Thr Ile Lys Gly Glu Gly Trp Ala Ala Ile Val
145 150 155 160
Ala Asp Leu Arg Gly Glu Ala Leu Leu Ser Lys Gly Asp Lys Gln Gly
165 170 175
Ala Arg Ser Ala Trp Glu Ala Gly Val Lys Ser Asp Val Thr Pro Ala
180 185 190
Leu Ser Glu Met Met Gln Met Lys Ile Asn Asn Leu Ser Ile
195 200 205
<210> 199
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 199
Met Ser Lys His His His His Ser Asn His His Arg His Asn His His
1 5 10 15
His His Ser Gly Asn His His His Ser Gly Ser Ala Ala Gly Gly Glu
20 25 30
Glu Asp Lys Lys Pro Ala Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ala His Ile Asn
35 40 45
Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg Ile Lys
50 55 60
Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr Cys Asp Arg Gln
65 70 75 80
Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg Arg Leu
85 90 95
Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu Asp Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Gly Ala Cys Ala Trp Ser His
115 120 125
Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
130 135 140
Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ser Gly Ser Ala Glu Ser
145 150 155 160
Glu Ala Ala Ser Ser Thr Met Ile Lys Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys
165 170 175
Glu Ile Glu Ile Asp Ile Glu Pro Thr Asp Thr Ile Asp Arg Ile Lys
180 185 190
Glu Arg Val Glu Glu Lys Glu Gly Ile Pro Pro Val Gln Gln Arg Leu
195 200 205
Ile Tyr Ala Gly Lys Gln Leu Ala Asp Asp Lys Thr Ala Lys Asp Tyr
210 215 220
Asn Ile Glu Gly Gly Ser Val Leu His Leu Val Leu Ala Leu Arg Gly
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Thr Ala Ser Thr Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg
245 250 255
Arg Leu Ala Ser
260

Claims (99)

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
(a)一种包含X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：01)的肽，其中X1是G或S或T或P，X2是R或G或A或E或P，X3是L或V，X4是E或Q，X5是E或Q，X6是E或Q，X7是L或I或V，X8是R或A或Q或E，X9是R或A或Q或E，X12是S或T或D或E或P或A或无氨基酸，并且其中X13是E或K或P或S或A或D或无氨基酸；
(b)和一种多肽。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肽与所述多肽的N-末端或C-末端融合或在所述多肽的N-末端和C-末端之间的位置融合。
3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述肽是表位标签。
4.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多肽具有与所述肽无关的稳定折叠。
5.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽具有α-螺旋二级结构。
6.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽特异性结合包含CDR序列GVTISALNAMAMG(SEQ ID NO：115)、AVSERGNAM(SEQ ID NO：116)和LEDRVDSFHDY(SEQ ID NO：117)的骆驼VHH结构域。
7.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含一个或多个连接所述肽和所述多肽的接头。
8.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多肽包含至少一个蛋白结构域。
9.权利要求8所述的融合蛋白，其中，所述肽在位于所述至少一个蛋白结构域之外的位置与所述多肽融合。
10.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多肽是球形蛋白、膜蛋白、纤维蛋白或天然未折叠蛋白，或是球形蛋白、膜蛋白、纤维蛋白或天然未折叠蛋白的亚单位。
11.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽具有8到25个氨基酸的长度。
12.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述多肽具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸的长度。
13.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1-X2-L-E-X5-E-X7-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：02)，其中X1是G或S或P或T，X2是R或G或P，X5是E或Q，X7是L或I，X12是S或T或P或A或D或E，并且其中X13是P或A或S或A或D或E或无氨基酸。
14.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是D或S或G或M或P或无氨基酸，Xb是S或D或P或M或R或G或无氨基酸。
15.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或S或P或D或A或E或K或无氨基酸，Xz是S或P或无氨基酸。
16.权利要求13或14所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或P或A或E或K或S或D或无氨基酸，Xz是P或S或无氨基酸。
17.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1-X2-L-E-X5-E-L-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：03)，其中X1是S或T，X2是R或G，X5是E或Q，X12是T或D或E，并且其中X13是A或D或E或无氨基酸。
18.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含S-R-L-E-E-E-L-R-R-R-L-T-E的序列(SEQ ID NO：04)或其变体，其中所述变体与(SEQ ID NO：04)相比具有1至5个突变，所述突变选自：S1→T、R2→G、E5→Q、T12→D、T12→E、E13→A、E13→D和E13的缺失。
19.权利要求18所述的融合蛋白，其中，所述变体与SEQ ID NO：04相比具有以下突变：
(a)S1→T和E13→A；
(b)R2→G；
(c)R2→G和E5→Q；
(d)R2→G、E5→Q和E13→A；
(e)R2→G、E5→Q、T12→D和E13→A；
(f)R2→G、E5→Q、T12→E和E13→A；
(g)T12→D和E13→A；
(h)T12→E和E13→A；
(i)和E13→A；
(j)和E13→D；或
(k)E13的缺失。
20.权利要求17-19中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是S或G或M或P或无氨基酸，Xb是R或G或S或P或M或无氨基酸。
21.权利要求20所述的融合蛋白，其中，Xa-Xb选自P、M-P、G-R、P-G、P-S、S-P、G-P、S-P、M和M-S，优选P或M-P。
22.权利要求17-21中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是P或D或A或无氨基酸，Xz是P或S或无氨基酸。
23.权利要求22所述的融合蛋白，其中，Xy-Xz选自无氨基酸、P、D-P、A和A-S，优选无氨基酸或P。
24.权利要求17-23中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包括Xa-Xb和Xy-Xz的组合，所述组合选自：
(a)M-P和P；
(b)P和P；和
(c)P和无氨基酸。
25.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含选自以下的序列：
(a)MPSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：05)；
(b)PSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：06)；
(c)PSRLEEELRRRLTE(SEQ ID NO：07)；
(d)GRSRLEEELRRRLTA(SEQ ID NO：08)；
(e)PGSRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：09)；
(f)PSTRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：10)；
(g)SPSRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：11)；
(h)SPSRLEEELRRRLDAP(SEQ ID NO：12)；
(i)SPSRLEEELRRRLEAP(SEQ ID NO：13)；
(j)SPSRLEEELRRRLTDP(SEQ ID NO：14)；
(k)SPSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：15)；
(l)SPSRLEEELRRRLTADP(SEQ ID NO：16)；
(m)SPSGLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：17)；
(n)GPSRLEEELRRRLT(SEQ ID NO：18)；
(o)GPSRLEEELRRRLTA(SEQ ID NO：19)；
(p)GPSRLEEELRRRLTAA(SEQ ID NO：20)；
(q)GPSRLEEELRRRLTAAS(SEQ ID NO：21)；
(r)SPSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：22)；
(s)SPSGLEQELRRRLDAP(SEQ ID NO：23)；
(t)SPSGLEQELRRRLEAP(SEQ ID NO：24)；
(u)SPSGLEQELRRRLTEP(SEQ ID NO：25)；
(v)GPSRLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：26)；
(w)GPSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：27)；
(x)GPSRLEEELRRRLTE(SEQ ID NO：28)；
(y)MSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：29)；和
(z)MSSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO：30)。
26.权利要求1-16中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1-X2-L-E-X5-E-X7-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：31)，其中X1是G或S或P，X2是R或G，X5是E或Q，X7是L或I，X12是S或T或P或A，X13是P或A或S或无氨基酸。
27.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含G-R-L-E-E-E-L-R-R-R-L-S的序列(SEQ ID NO：32)或其变体，其中所述变体与(SEQ ID NO：32)相比具有1至6个突变，所述突变选自：G1→S、G1→P、R2→G、E5→Q、L7→I、S12→T、S12→P、S12→A、P13的添加、A13的添加和S13的添加。
28.权利要求27所述的融合蛋白，其中，所述变体与SEQ ID NO：32相比具有以下突变：
(a)G1→S、R2→G、E5→Q和P13的添加；
(b)R2→G、E5→Q、S12→T和A13的添加；
(c)G1→P、R2→G、E5→Q、S12→T和A13的添加；
(d)G1→S、R2→G、E5→Q、S12→T和P13的添加；
(e)G1→S、R2→G、S12→T和A13的添加；
(f)G1→S、R2→G、E5→Q和S12→T；
(g)G1→S、R2→G、E5→Q、S12→T和A13的添加；
(h)G1→S和S12→P，以及P13的添加；
(i)G1→S、R2→G、E5→Q、S12→T和P13的添加；
(J)E5→Q、L7→I和P13的添加；
(k)P13的添加；或
(I)S12→A。
29.权利要求26-28中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是M或S或P或D或G或无氨基酸，Xb是S或D或P或无氨基酸。
30.权利要求29所述的融合蛋白，其中，Xa-Xb选自M-S、S-D、P-D、P-S、D-S、S-P和G-P，优选M-S。
31.权利要求26-30中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或P或A或E或K或S或无氨基酸，Xz是P或S或无氨基酸。
32.权利要求31所述的融合蛋白，其中，Xy-Xz选自无氨基酸、G、P、A、E-P、A-S、K和S，优选无氨基酸。
33.权利要求26-32中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含Xa-Xb和Xy-Xz的组合，所述组合是M-S和无氨基酸。
34.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含选自以下的序列：
(a)GRLEEELRRRLS(SEQ ID NO：32)；
(b)MSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：33)；
(c)SDSGLEQELRRRLSPG(SEQ ID NO：34)；
(d)PDGGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：35)；
(e)PSGGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：36)；
(f)DSPGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：37)；
(g)PDSGLEQELRRRLTPA(SEQ ID NO：38)；
(h)SPSGLEEELRRRLTAEP(SEQ ID NO：39)；
(i)GPSGLEQELRRRLT(SEQ ID NO：40)；
(j)GPSGLEQELRRRLTAAS(SEQ ID NO：41)；
(k)SPSRLEEELRRRLPSK(SEQ ID NO：42)；
(l)SPSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：43)；
(m)SPGRLEQEIRRRLSPS(SEQ ID NO：44)；
(n)PSGRLEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：45)；
(o)PSGRLEEELRRRLS(SEQ ID NO：46)；
(p)PSGRLEEELRRRLA(SEQ ID NO：47)；和
(q)PSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：48)。
35.权利要求1-16中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1-X2-L-E-X5-E-L-R-R-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：49)，其中X1是S或G或P，X2是R或G或P，X5是E或Q，X12是S或T或D或E，X13是P或A或D或无氨基酸。
36.权利要求35所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是P或D或S或G或无氨基酸，Xb是D或S或P或无氨基酸。
37.权利要求35或36所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或P或E或D或S或无氨基酸，Xz是P或无氨基酸。
38.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含选自以下的序列：
(a)PDSGLEQELRRRLSPG(SEQ ID NO：50)；
(b)PDSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：51)；
(c)PSSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：52)；
(d)DPSGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：53)；
(e)DSGPLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：54)；
(f)SPSRLEEELRRRLTAEP(SEQ ID NO：55)；
(g)SPSGLEEELRRRLTAP(SEQ ID NO：56)；
(h)SPSGLEEELRRRLDAP(SEQ ID NO：57)；
(i)SPSGLEEELRRRLEAP(SEQ ID NO：58)；
(j)SPSGLEEELRRRLTDP(SEQ ID NO：59)；
(k)SPSGLEEELRRRLTADP(SEQ ID NO：60)；
(l)GPSGLEQELRRRLTA(SEQ ID NO：169)；
(m)SPSGLEQELRRRLTDP(SEQ ID NO：170)；
(n)SPSGLEQELRRRLTADP(SEQ ID NO：171)；
(o)SPSGLEQELRRRLTAEP(SEQ ID NO：172)；
(p)DSPGLEQELRRRLTAP(SEQ ID NO：173)；和
(q)SPSGLEQELRRRLSPS(SEQ ID NO：174)。
39.权利要求1-16中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-R-L-X12-X13的序列(SEQ ID NO：61)，其中X1是G或S，X2是R或G或A或E，X3是L或V，X4是E或Q，X5是E或Q，X6是E或Q，X7是L或I或V，X8是R或A或Q或E，X9是R或A或Q或E，X12是S或T或L或无氨基酸，X13是K或P或S或无氨基酸。
40.权利要求39所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X1的N-末端氨基酸Xa-Xb，其中Xa是D或S或G或M或无氨基酸，Xb是S或D或P或M或无氨基酸。
41.权利要求39或40所述的融合蛋白，其中，所述肽包含X13的C-末端氨基酸Xy-Xz，其中Xy是G或S或P或无氨基酸，Xz是S或无氨基酸。
42.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述肽包含选自以下的序列：
(a)GRLEEELRRRLS(SEQ ID NO：32)；
(b)MSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：33)；
(c)DSGRLEEELRRRLSKG(SEQ ID NO：62)；
(d)DSGRLEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：63)；
(e)SDSGLEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：64)；
(f)SDSGVEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：65)；
(g)SDSAVEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：66)；
(h)SDSGLQEELRRRLSPG(SEQ ID NO：67)；
(i)SDSGLEEQLRRRLSPG(SEQ ID NO：68)；
(j)SDSGLEEEIRRRLSPG(SEQ ID NO：69)；
(k)SDSGLEEEVRRRLSPG(SEQ ID NO：70)；
(l)DSGELEEELRRRLSPG(SEQ ID NO：71)；
(m)DSGRLEQELRRRLSPG(SEQ ID NO：72)；
(n)DSGRLEEEIRRRLSPG(SEQ ID NO：73)；
(o)DSGRLEQEIRRRLSPG(SEQ ID NO：74)；
(p)DSGRLEQEIARRLSPG(SEQ ID NO：75)；
(q)DSGRLEQEIQRRLSPG(SEQ ID NO：76)；
(r)DSGRLEQEIERRLSPG(SEQ ID NO：77)；
(w)DSGRLEQEIRARLSPG(SEQ ID NO：78)；
(t)DSGRLEQEIRQRLSPG(SEQ ID NO：79)；
(u)DSGRLEQEIRERLSPG(SEQ ID NO：80)；
(v)GPSRLEEELRRRL(SEQ ID NO：81)；
(w)MSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：82)；
(x)MSGRLEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：83)；
(y)SPSAVEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：84)；
(z)GPSAVEEELRRRLS(SEQ ID NO：85)；
(aa)MPSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：86)；
(bb)MSSGLEQELRRRLTPS(SEQ ID NO：87)；
(cc)MPSGRLEEELRRRLSPS(SEQ ID NO：88)；
(dd)MSGRLEEELRRRLSP(SEQ ID NO：89)。
43.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白与特异性结合包含在所述融合蛋白中的所述肽的结合配偶体复合。
44.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含抗体。
45.一种抗体，其特异性结合包含在权利要求1-44中任一项所述融合蛋白中的所述肽。
46.权利要求45所述的抗体，其中，所述抗体是单价抗体。
47.权利要求45或46所述的抗体，其中，所述抗体是单结构域抗体。
48.权利要求45-47中任一项所述的抗体，其中，所述抗体包含骆驼VHH结构域。
49.权利要求45-48中任一项所述的抗体，所述抗体包含CDR1序列GVTISALNAMAMG(SEQID NO：115)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AVSERGNAM(SEQ ID NO：116)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY(SEQ ID NO：117)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。
50.权利要求45-48中任一项所述的抗体，所述抗体包含CDR1序列GVTISALNAMAMG(SEQID NO：118)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AVSSRGNAM(SEQ ID NO：119)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY(SEQ ID NO：120)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。
51.权利要求45-48中任一项所述的抗体，所述抗体包含CDR1序列GVTVSALNAMAMG(SEQID NO：121)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AVSERGNAM(SEQ ID NO：122)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY(SEQ ID NO：123)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。
52.权利要求49-51中任一项所述的抗体，其中，CDR2的氨基酸位置4的E或S突变为G、A、L、I、S、T、V、C、M、D、N、E、Q、F、Y、H、W、K、R或P，优选D、N或H。
53.权利要求49-52中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR1序列EVQLX1ESGGGLVX2PGGSX3RLSCTAS，其中X1是Q、V、E或L，X2是Q或P，X3是L或M(SEQ ID NO：124)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
54.权利要求49-52中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR1序列EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(SEQ ID NO：125)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
55.权利要求49-54中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR2序列WYRQX1PGEX2RVMVA，其中X1是A或R，X2是R或E(SEQ ID NO：126)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
56.权利要求49-54中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR2序列WYRQAPGERRVMVA(SEQID NO：127)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
57.权利要求49-54中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR2序列WYRQAPGEERVMVA(SEQID NO：128)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
58.权利要求49-57中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR3序列YRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLX1PEDX2AVYYCHV，其中X1是K或Q，X2是T或M(SEQ ID NO：129)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
59.权利要求49-57中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR3序列YRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHV(SEQ ID NO：130)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
60.权利要求49-59中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR4序列WGQGX1QVTVSS，其中X1是T或I(SEQ ID NO：131)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
61.权利要求49-59中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR4序列WGQGTQVTVSS(SEQ IDNO：132)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
62.权利要求49-61中任一项所述的抗体，所述抗体包含VHH序列：
(a)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：133)；
(b)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGEERVMVAAVSSRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：134)；
(c)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGEERVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：135)；
(d)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSSRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：136)；
(e)EVQLVESGGGLVPPGGSMRLSCTASGVTVSALNAMAMGWYRQRPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLQPEDMAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGIQVTVSS(SEQ ID NO：137)；
(f)EVQLVESGGGLVPPGGSMRLSCTAPGVTVSALNAMAMGWYRQRPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLQPEDMAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGIQVTVSS(SEQ ID NO：138)；
(g)EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：139)；
(h)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：140)；
(i)EVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：141)；
(j)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：142)；
(k)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSDRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：175)；
(l)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSNRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：176)；或
(m)EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSHRGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：177)；
或与所述序列中任一个具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
63.权利要求45-48中任一项所述的抗体，所述抗体包含CDR1序列GTMSAINALN(SEQ IDNO：143)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AITDNGNAH(SEQ ID NO：144)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEEEKLGVWVDY(SEQ ID NO：145)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。
64.权利要求45-48中任一项所述的抗体，所述抗体包含CDR1序列GTMSAINALN(SEQ IDNO：146)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AITDNGNAH(SEQ ID NO：147)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEEKLGAWVDY(SEQ ID NO：148)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。
65.权利要求45-48中任一项所述的抗体，所述抗体包含CDR1序列GTMSAINALN(SEQ IDNO：149)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，CDR2序列AITDNGNAH(SEQ ID NO：150)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列，以及CDR3序列LEKEKLGVWVDY(SEQ ID NO：151)或相对于所述序列具有1或2个突变的序列。
66.权利要求63-65中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR1序列EVQLX1ESGGGLVQPGGSLTLSCAAS，其中X1是V或L(SEQ ID NO：152)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
67.权利要求63-66中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR2序列WYRQX1PGKERKMVA，其中X1是P或A(SEQ ID NO：153)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
68.权利要求63-67中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR3序列YADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLX1PDDTAVYYCHY，其中X1是K或E(SEQ ID NO：154)，或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
69.权利要求63-68中任一项所述的抗体，所述抗体包含FR4序列WGQGTQVTVSS(SEQ IDNO：155)或与所述序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
70.权利要求63-69中任一项所述的抗体，所述抗体包含VHH序列：
(a)EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGTMSAINALNWYRQPPGKERKMVAAITDNGNAHYADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLKPDDTAVYYCHYLEEEKLGVWVDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：156)；
(b)EVQLLESGGGLVQPGGSLTLSCAASGTMSAINALNWYRQAPGKERKMVAAITDNGNAHYADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLEPDDTAVYYCHYLEEKLGAWVDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：157)；或
(c)EVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASGTMSAINALNWYRQPPGKERKMVAAITDNGNAHYADSVKGRFTISRDNARNMVFLQMNSLKPDDTAVYYCHYLEKEKLGVWVDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：158)；
或与所述序列中任一个具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
71.权利要求45-70中任一项所述的抗体，其中，所述抗体与可检测标记偶联。
72.权利要求71所述的抗体，其中，所述可检测标记是荧光标记。
73.权利要求71所述的抗体，其中，所述可检测标记是亲和标签。
74.权利要求71或73所述的抗体，其中，所述可检测标记选自FLAG-标签、Strep-标签、Myc-标签、His-标签、HA-标签、VSV-G-标签、HSV-标签、V5-标签、GST-标签、Spot-标签、BC2-标签、EPEA-标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、硫氧还蛋白和生物素。
75.权利要求45-74中任一项所述的抗体，其中，所述抗体被偶联到固体支持物。
76.权利要求45-75中任一项所述的抗体，其中，所述抗体与它特异性结合的表位复合。
77.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求45-76中任一项所述的抗体结合的肽。
78.一种复合物，所述复合物包含：
(a)融合蛋白；和
(b)抗体；
其中所述融合蛋白是权利要求1-44和77中任一项所述的融合蛋白和/或其中所述抗体是权利要求45-76中任一项所述的抗体。
79.一种核酸，所述核酸编码权利要求1-44和77中任一项所述的融合蛋白或权利要求45-76中任一项所述的抗体。
80.一种载体，所述载体包含权利要求79所述的核酸。
81.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求79所述的核酸或权利要求80所述的载体或表达权利要求1-44和77中任一项所述的融合蛋白或权利要求45-76中任一项所述的抗体。
82.如权利要求1-44和77中任一项所定义的肽作为表位标签的应用，或用于检测、固定、分离或纯化权利要求1-45和76中任一项所述的融合蛋白的应用。
83.权利要求45-76中任一项所述的肽用于检测、固定、分离或纯化权利要求1-44和77中任一项所述的融合蛋白的应用。
84.一种检测权利要求1-44和77中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括使所述融合蛋白与权利要求71-74中任一项所述的抗体接触。
85.权利要求84所述的方法，所述方法进一步包括使所述融合蛋白和所述抗体与包含在所述抗体中的所述可检测标记的特异性结合配偶体接触。
86.权利要求85所述的方法，其中，所述特异性结合配偶体与第二可检测标记偶联。
87.权利要求86所述的方法，其中，所述第二可检测标记是荧光标记。
88.权利要求84至87中任一项所述的方法，所述方法进一步包括检测所述可检测标记或所述第二可检测标记的步骤。
89.权利要求84-88中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在使所述融合蛋白与所述抗体接触之前表达所述融合蛋白。
90.权利要求84-89中任一项所述的方法，其中，检测所述融合蛋白包括测定所述融合蛋白的存在、亚细胞定位或量。
91.一种分离权利要求1-44和77中任一项所述的融合蛋白或包含在权利要求44所述的融合蛋白中的抗体部分的特异性靶标的方法，所述方法包括使所述融合蛋白与权利要求45-76中任一项所述的抗体接触。
92.权利要求91所述的方法，其中，所述抗体与所述融合蛋白结合之前、期间或之后被附着到固体支持物。
93.权利要求91或92所述的方法，所述方法进一步包括洗脱所述融合蛋白。
94.权利要求93所述的方法，其中，所述洗脱通过使所述融合蛋白和所述抗体的复合物与试剂接触来实施，所述试剂与所述融合蛋白竞争与所述抗体的结合。
95.权利要求94所述的方法，其中，所述试剂是如权利要求1-43或76中任一项所定义的肽。
96.权利要求91-95中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使权利要求44所述的融合蛋白和包含在所述融合蛋白中的抗体部分的特异性靶标接触。
97.权利要求96所述的方法，其中，所述特异性靶标包含细胞表面受体。
98.权利要求91至97中任一项所述的方法，所述方法进一步包括洗涤步骤。
99.一种试剂盒，所述试剂盒包含编码如权利要求1-44或77中任一项所定义的肽的核酸或核酸表达构建体，并且任选地包含权利要求45-76中任一项所述的抗体。
CN201980074346.7A 2018-09-11 2019-09-11 由特异性结合物识别的表位标签 Pending CN113195516A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18193663.4 2018-09-11
EP18193663 2018-09-11
EP19160485 2019-03-04
EP19160485.9 2019-03-04
PCT/EP2019/074153 WO2020053239A1 (en) 2018-09-11 2019-09-11 Epitope tags recognized by specific binders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113195516A true CN113195516A (zh) 2021-07-30

Family

ID=68138006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980074346.7A Pending CN113195516A (zh) 2018-09-11 2019-09-11 由特异性结合物识别的表位标签

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220048947A1 (zh)
EP (1) EP3849996A1 (zh)
JP (1) JP2022500076A (zh)
CN (1) CN113195516A (zh)
WO (1) WO2020053239A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023148275A1 (en) * 2022-02-02 2023-08-10 BioNTech SE Cyclic epitope tags
WO2023148277A1 (en) * 2022-02-02 2023-08-10 BioNTech SE Agents and methods for targeted delivery of nucleic acids to cells
WO2023148276A1 (en) * 2022-02-02 2023-08-10 BioNTech SE Agents and methods for targeted delivery to cells
WO2023222580A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Byondis B.V. Novel masked antibodies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994004678A1 (en) * 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
CN101835898A (zh) * 2007-07-25 2010-09-15 纳幕尔杜邦公司 用于生物活性肽表达和纯化的可溶性标记
CN102099057A (zh) * 2007-07-20 2011-06-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗cd4抗体和抗融合肽的缀合物
CN107406514A (zh) * 2014-11-03 2017-11-28 默克专利有限公司 可溶内含肽融合蛋白以及用于纯化生物分子的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040014955A1 (en) * 2001-12-17 2004-01-22 Carlos Zamudio Identification of essential genes of cryptococcus neoformans and methods of use
GB201008682D0 (en) 2010-05-25 2010-07-07 Vib Vzw Epitope tag for affinity based applications
EP3168306A1 (en) 2015-11-16 2017-05-17 ChromoTek GmbH Epitope tag and method for detection and/or purification of tagged polypeptides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994004678A1 (en) * 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
CN102099057A (zh) * 2007-07-20 2011-06-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗cd4抗体和抗融合肽的缀合物
CN101835898A (zh) * 2007-07-25 2010-09-15 纳幕尔杜邦公司 用于生物活性肽表达和纯化的可溶性标记
CN107406514A (zh) * 2014-11-03 2017-11-28 默克专利有限公司 可溶内含肽融合蛋白以及用于纯化生物分子的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020053239A1 (en) 2020-03-19
EP3849996A1 (en) 2021-07-21
US20220048947A1 (en) 2022-02-17
JP2022500076A (ja) 2022-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6165713B2 (ja) インスリン様増殖因子１に特異的に結合する抗体
CN113195516A (zh) 由特异性结合物识别的表位标签
EP3596464B1 (en) Target detection using a monovalent antibody
WO2015067768A1 (en) High-affinity monoclonal anti-strep-tag antibody
US11098081B2 (en) Epitope tag and method for detection and/or purification of tagged polypeptides
KR20210035249A (ko) Ns1 단백질의 결합 단백질
JP2023065484A (ja) 新規タウ種
US8975384B2 (en) Tag peptide and use thereof
JP2023139090A (ja) ドレブリンに特異的に結合するペプチド、及びそのペプチドを用いたドレブリンの検出方法
KR102080554B1 (ko) 세포의 자성 비드 부착을 통한 자성 기반 바이오 패닝 방법
US8481310B2 (en) Tag peptide having a protease recognition sequence and use thereof
US11505614B2 (en) Antibodies binding to soluble BCMA
CN114430747A (zh) 抗csf-1r抗体
JP2012500818A (ja) ヒトｅｐｏ受容体に対する抗体
WO2022050423A1 (ja) スタビロン改変体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
WO2023077172A2 (en) Novel anti-lilrb2 antibodies and derivative products
JP2024519333A (ja) Ｍｅｒｔｋペプチドおよびその使用
EP4337679A2 (en) Mertk peptides and uses thereof
CN115279795A (zh) 靶向抗cd19嵌合抗原受体的抗独特型抗体
CN111662359A (zh) 基于PrP的单克隆抗体的肿瘤细胞检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination