JPWO2019216345A1 - ドレブリンに特異的に結合するペプチド、及びそのペプチドを用いたドレブリンの検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕以下の(1)若しくは(2)に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするドレブリン結合ペプチド又はその機能性断片。
(1)配列番号16〜24のいずれかで示されるアミノ酸配列;
(2)配列番号16〜24のいずれかで示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列;
〔2〕マーカータンパク質及び/若しくはペプチドタグを融合したことを特徴とする上記〔1〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔3〕マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、ペプチドタグがFlagであることを特徴とする上記〔2〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔4〕検出可能な標識を付加したことを特徴とする上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
〔5〕標識が、酵素、蛍光物質、ジゴキシゲニン、若しくはビオチンであることを特徴とする上記〔4〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔6〕細胞内移行ペプチドを付加したことを特徴とする上記〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
〔7〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片に、IgG−Fc領域を融合させたことを特徴とする抗体。
〔8〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔7〕に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔9〕配列番号8〜11のいずれかで示される塩基配列を含むか、又は配列番号8〜11のいずれかで示される塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする上記〔7〕に記載のポリヌクレオチド。
〔10〕上記〔8〕又は〔9〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔11〕上記〔8〕又は〔9〕に記載のポリヌクレオチド、或いは上記〔10〕に記載のベクターが導入されたことを特徴とする、上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔7〕に記載の抗体を発現する細胞。
〔12〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔7〕に記載の抗体を用いた、被検試料中のドレブリンの検出方法であって、前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加又は導入する工程を含む方法。
〔13〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔7〕に記載の抗体を、発色又は発光により検出する工程をさらに含むことを特徴とする上記〔12〕に記載の方法。
〔14〕検出する工程が、発光に基づく画像解析法であることを特徴とする上記〔13〕に記載の方法。
本発明に係るペプチドはシングルドメイン構造であるため、マーカータンパク質、ペプチドタグ、及び抗体のFc領域等の他の分子を結合させることが容易に行える。
本発明に係るペプチドは低分子量であり、細胞内で効率よく発現させることができるので、ドレブリンの細胞内イメージングにも応用可能である。
(1)配列番号16〜24のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(2)配列番号16〜24のいずれかで示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチド;
ここで、機能性断片とは、ドレブリン結合能を失わない範囲で、ペプチドのN末端側及び/又はC末端側のアミノ酸残基を除去して得られたペプチドをいう。
例えば、アミノ酸変異は部位特異的変異導入法や、Error prone PCR法等のランダム変異導入法により導入することができる。また、変異導入された配列を有するペプチドがドレブリン結合能を有していることは、ELISA、ウェスタンブロットやアフィニティクロマトグラフィー等の方法で確認できる。変異が導入される部位は抗体におけるフレームワーク領域(FR)に相当する領域でもよいし、相補性決定領域(以下、CDRという)に相当する領域でもよい。CDRに相当する領域における変異が結合性を増加させる場合もある。
また、前記抗体は二量体化させることも可能である。
本発明の第六の態様に係るIgG−Fc領域を融合させた抗体及びその二量体化抗体は、後述の実施例のようにして作製することができる。
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、サザンブロット法におけるハイブリダイゼーション後の洗浄に使用される条件が挙げられ、具体的には、0.1×SSCの塩濃度及び摂氏60度の温度で洗浄を行う条件が挙げられる。
ベクターは、必要に応じて、宿主細胞における発現のためのプロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列等を含んでもよい。
例えば、免疫組織染色法により検出を行う態様として、前記ペプチド又は抗体を含む溶液を適当な倍率に希釈し、被検試料である組織切片や固定化培養細胞に添加する態様が挙げられる。
また、ウェスタンブロット法により検出を行う態様として、前記被検試料であるタンパク質抽出液を用いてゲル電気泳動等でタンパク質を分離し、分離されたタンパク質に対して前記ペプチド又は抗体を含む溶液を適当な倍率に希釈して添加する態様が挙げられる。
前記ペプチド又は抗体を細胞内に導入するには、マイクロインジェクション等で直接細胞内に注入してもよいが、前記ペプチド又は抗体をコードするポリヌクレオチドを、ベクター等を用いて細胞内に導入し、前記ペプチド又は抗体を細胞内で発現させることによって導入してもよい。発現は一過的な発現でも恒常的な発現でもよい。
前記ペプチドが蛍光タンパク質と融合されている場合は、前記ペプチドが被検試料中のドレブリンと結合することで、被検試料中のドレブリンの量に依存した蛍光が発せられるので、当該蛍光強度に基づいて被検試料中のドレブリンを検出し、定量することができる。特に、前記ペプチドを細胞内に導入する態様においては、蛍光タンパク質と融合されている前記ペプチドを用いることで細胞内のドレブリンの挙動を検出することができる。
定量の際は、例えば、予め既知の濃度の試料で検量線(標準曲線)を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中のドレブリン濃度を算出することができる。
この態様においては、前記ペプチド又は抗体が蛍光タンパク質との融合タンパク質として細胞内に導入されるので、前記ペプチド又は抗体が細胞内の内在性ドレブリンと結合することで、蛍光タンパク質が発する蛍光を画像解析することにより内在性ドレブリンの挙動をリアルタイムでモニターすることができる。内在性ドレブリンの挙動としては、ドレブリンの細胞内局在性、細胞内での量の変動等が挙げられる。内在性ドレブリンの挙動をリアルタイムでモニターすることにより、シナプスの作動メカニズムを解明することができ、神経細胞の成熟におけるドレブリンの役割を詳細に知ることができる。
(A)VHH抗体提示ファージライブラリーの調製
実施例2及び3に用いたドレブリン結合ペプチドを以下の手順で作成した。
市販されているプラスミドpUC119(例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能)由来のVector1に、制限酵素SfiI切断サイトを挿入し、制限酵素SfiIによりVector1を処理し、ベクターの断片を得た。制限酵素SfiI切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC(配列番号6)又はGGCCTCTGCGGCC(配列番号7)により表されるDNA配列からなる。
ドレブリン(群馬大学神経薬理学分野から入手)をリン酸緩衝生理食塩水(以下、PBSという)と混合し、ドレブリン溶液を調製した。ドレブリンの濃度は1μg/mLであった。3mLのドレブリン溶液を、イムノチューブ(Nunc社より購入)に注入し、ドレブリン溶液をイムノチューブ内で摂氏4度の温度で一晩静置することで、イムノチューブ内部にドレブリンを固定した。
VHH抗体を提示するファージのライブラリ(濃度:およそ10E+11/mL)を、3mLの3%スキムミルク含有PBSと混合し、混合液を調製した。この混合液を、ドレブリン抗原を固定化したイムノチューブに注入した。
96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific社より購入、商品名:Maxisorp(登録商標))の各ウェルに、1μg/mLの濃度を有するドレブリン溶液を抗原として50μLずつ添加した。96ウェルプレートを、摂氏4度の温度で一晩静置し、ドレブリン抗原を各ウェルに固定した。
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市販されているpET22b(+)(Merck Millipore株式会社より入手可能)由来のプラスミドVector2に、制限酵素SfiI切断サイトと3xFlagタグを挿入し、Vector2を制限酵素SfiIで処理した。制限酵素SfiI切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC(配列番号6)若しくはGGCCTCTGCGGCC(配列番号7)により表されるDNA配列からなる。
市販されているpcDNA3.1(+)(例えば、Thermo Fisher Scientific株式会社より入手可能)由来のプラスミドVector3に、制限酵素SfiI切断サイトとヒトIgG−Fc領域を挿入し、Vector3を制限酵素SfiIにより処理した。制限酵素SfiI切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC(配列番号6)若しくはGGCCTCTGCGGCC(配列番号7)により表されるDNA配列からなる。また、このヒトIgG−Fc領域は、N末端側がヒンジ領域の一部をなしており、このヒンジ領域の一部がVHHと結合する。
図1は、Myc−drebrin A(エピトープタグであるMycが融合したドレブリン、以下同じ)を発現しているHEK293細胞抽出物についてのウェスタンブロット法によるドレブリン検出の結果を示している。なお、マーカーの単位はkDa(キロダルトン)である。HEK293細胞抽出物のSDS−PAGEを行い、アクリルアミドゲルからPVDF膜へタンパク質の転写を行った後、各種抗体又はペプチドを用いてドリブレンを検出した。
第1レーン:抗Myc抗体(抗Myc)
第2、5、6レーン:抗ドレブリンモノクローナル抗体(M2F6、株式会社医学生物学研究所より入手)
第3レーン:配列番号1のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド(#1、以下#1ペプチドという)
第4、7、8レーン:#1ペプチドをヒトのIgG抗体のFc領域と融合したドレブリン結合ペプチド−ヒトIgG Fc融合抗体(#1Fc、以下#1Fc抗体という)
図2は、実施例2と同様に、Myc−drebrin Aを発現しているHEK293細胞抽出物についてウェスタンブロット法によりドレブリン検出を行った結果を示している。なお、マーカーの単位はkDa(キロダルトン)である。HEK293細胞抽出物のSDS−PAGEを行い、アクリルアミドゲルからPVDF膜へタンパク質の転写を行った後、各種抗体又はペプチドを用いてドリブレンを検出した。
第1レーン:抗Myc抗体(抗Myc)
第2レーン:抗ドレブリンモノクローナル抗体(M2F6)
第3レーン:配列番号2のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド(#2、以下#2ペプチドという)
第4レーン:配列番号3のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド(#3、以下#3ペプチドという)
第5レーン:配列番号4のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド(#4、以下#4ペプチドという)
第6レーン:#2ペプチドをヒトのIgG抗体のFc領域と融合した抗体(#2Fc、以下#2Fc抗体という)
第7レーン:#3ペプチドをヒトのIgG抗体のFc領域と融合した抗体(#3Fc、以下#3Fc抗体という)
第8レーン:#4ペプチドをヒトのIgG抗体のFc領域と融合した抗体(#4Fc、以下#4Fc抗体という)
固定後の初代培養海馬神経細胞にドレブリン結合ペプチド(#4Fc)を特異的に結合させ、ヒト抗体を認識する二次抗体(蛍光標識:画像上では白で表示)を使って本ペプチドの分布を同定した(図3左)。蛍光がスパインに局在していることから本ペプチドがドレブリンに特異的に結合していることがわかる。このことよりドレブリンの局在の検出法として、現在市販のマウスモノクローナル抗体M2F6(図3右)と比べて、同等であることがわかる。
初代培養海馬神経細胞に、N末端にGFPを融合したGFP・Fc−融合ドレブリン結合ペプチド(GFP−#4Fc)を強制発現させた。図4の蛍光画像により、発現したペプチドの集積部位(Aの矢印)とマウスモノクローナル抗体M2F6により明らかとされた内在性ドレブリンの集積部位(Bの矢印)が一致していることがわかる。
pEGFP−C1ベクター(GenBank Accession #: U55763 Clontech社より入手)のマルチクローニングサイトに存在するBglII、EcoRIサイトを制限酵素で切断後、アガロースゲルで電気泳動を行い、クローニングベクターの精製を行った。また、当該ペプチド#4Fcをコードする、配列番号11で示される配列を含む核酸フラグメントをBglII、EcoRIサイトを有するプライマーを用いたPCRで増幅し、同様に制限酵素処理及びアガロースゲル電気泳動を行い、挿入核酸の精製を行った。上記のクローニングベクターと挿入核酸のライゲーションを行い、目的のGFP融合ペプチド発現ベクターを作製した。
実施例1で得られたドレブリン結合ペプチド遺伝子に対するランダム変異により、ドレブリン結合ペプチドのスクリーニングを行った。
配列番号19(配列番号4から、C末端側Fcヒンジ領域を除去したもの)のドレブリン結合ペプチドをコードする配列番号11の遺伝子に対してError Prone PCRを行ってランダム変異を挿入し、ファージミドベクターへと連結させた。作製したファージミドベクターを大腸菌へと形質転換することで約1.0×108の多様性を有するランダム変異ライブラリを構築した。
実施例1(C)に記載の方法により、2ラウンドのパニングを行った。単離した86クローンの結合活性を配列番号19のドレブリン結合ペプチドと比較するため、実施例1(D)に記載の方法によりELISAを行ったところ、ほぼ全てのクローンで結合活性の上昇が確認できた。特に結合活性の高かった10クローン(Z01〜Z10)の結合活性を図5に示す。10クローンのうち、Z02〜Z10の9クローンは独立していた。
実施例1(F)に記載の方法により、Z02〜Z10を有するドレブリン結合ペプチド−ヒトIgG Fc融合抗体発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションし、ドレブリン結合ペプチド−ヒトIgG Fc融合抗体を一過性に培養上清中に発現させ、ELISAで結合活性を評価した。
上記実施例6(C)で得られた各クローンについて、pEGFP−N1ベクター(GenBank Accession #: U55762 Clontech社より入手)に組み入れてC末端側にGFPを融合したコンストラクトを作製し、実施例5と同様の方法により初代培養海馬神経細胞にGFP・Fc−融合ドレブリン結合ペプチドを発現させ、蛍光画像を取得した。また、ヒトのIgG抗体のFc領域と融合していないドレブリン結合ペプチドについても、同様の方法でC末端側にGFPを融合したコンストラクトを作製し、実施例5と同様の方法により初代培養海馬神経細胞にGFP−融合ドレブリン結合ペプチドを発現させ、蛍光画像を取得した。
実施例7で、内在性ドレブリンの集積部位を検出することができた5クローンのアミノ酸配列を決定した。得られた配列を以下に示す。なお、下線は配列番号19からの変異箇所である。
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EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRLAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS(配列番号22)
Z08
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYAVSVKGRFTTSRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS(配列番号23)
Z09
EVQLVESGGGLVQAGGSVRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS(配列番号24)
Claims (14)
- 以下の(1)若しくは(2)に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするドレブリン結合ペプチド又はその機能性断片。
(1)配列番号16〜24のいずれかで示されるアミノ酸配列;
(2)配列番号16〜24のいずれかで示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列; - マーカータンパク質及び/若しくはペプチドタグを融合したことを特徴とする請求項1に記載のペプチド又はその機能性断片。
- マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、ペプチドタグがFlagであることを特徴とする請求項2に記載のペプチド又はその機能性断片。
- 検出可能な標識を付加したことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
- 標識が、酵素、蛍光物質、ジゴキシゲニン、若しくはビオチンであることを特徴とする請求項4に記載のペプチド又はその機能性断片。
- 細胞内移行ペプチドを付加したことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片に、IgG−Fc領域を融合させたことを特徴とする抗体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項7に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号8〜11のいずれかで示される塩基配列を含むか、又は配列番号8〜11のいずれかで示される塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項8又は9に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項8又は9に記載のポリヌクレオチド、或いは請求項10に記載のベクターが導入されたことを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項7に記載の抗体を発現する細胞。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項7に記載の抗体を用いた、被検試料中のドレブリンの検出方法であって、前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加又は導入する工程を含む方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは請求項7に記載の抗体を、発色又は発光により検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 検出する工程が、発光に基づく画像解析法であることを特徴とする請求項13に記載の方法。
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