KR20060129078A - 하이드록시알킬 스타치와 단백질의 컨쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 컨쥬게이트가 하이드록시알킬 스타치 또는 하이드록시알킬 스타치의 유도체와 단백질 간의 공유 결합에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 하이드록시알킬 스타치와 단백질의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 컨쥬게이트를 제조하는 방법 및 이들 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.

Description

하이드록시알킬 스타치와 단백질의 컨쥬게이트{CONJUGATES OF HYDROXYALKYL STARCH AND A PROTEIN}
본 발명은 하이드록시알킬 스타치 또는 하이드록시알킬 스타치의 유도체와 단백질 간의 공유결합에 의해 형성되는 하이드록시알킬 스타치와 단백질의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 컨쥬게이트의 제조방법 및 이들 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 단백질이 폴리머 분자에 커플링되면 단백질의 안정성은 향상될 수 있고 이들 단백질에 대한 면역 반응은 감소되는 것으로 인정되고 있다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 의해 변성된 생리학적 활성 단백질은 감소된 면역원성 및 항원성을 나타내고, 컨쥬게이션되지 않은 단백질보다 혈류내에서 상당히 오랫동안 순환하는, 즉, 감소된 클리언스 레이트(clearance rate)를 갖는 것이 WO 94/28024호 공보에 개시되어 있다.
WO 02/09766호 공보는 특히 생체적합성 폴리머 유도체와 생물학적 활성 단백질의 컨쥬게이션에 의해 생성된 생체적합성 단백질-폴리머 화합물을 개시하고 있다. 사용된 생체적합성 폴리머는 높은 반응성의 분기쇄 폴리머이고, 얻어진 컨쥬 게이트는 폴리머 유도체와 단백질 간의 긴 연결자를 함유한다. 생체적합성 폴리머로서, 화학식 (P-OCH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A 의 폴리머가 개시되어 있으며, 여기에서 P 및 Q 는 폴리머성 잔기이며, k는 1 또는 0이다. P 및 Q에 대해서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산 및 그의 유도체, 폴리아미노산, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리(L-리신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리아크릴 아마이드 및 덱스트란 또는 다당류와 같은 수용성 폴리머가 언급되어 있다. 단백질로서는 특히 알파, 베타 및 감마 인터페론, 혈액 인자, 인터루킨과 같은 사이토카인, G-CSF, GM-CSF 등이 언급되어 있다. WO 02/09766호 공보의 실시예에서는 모노-, 디- 및 트리-폴리에틸렌글리콜 유도체가 인터페론 및 표피 성장 인자 및 인간 성장 호르몬에 배타적으로 결합된 것만이 개시되어 있다.
WO 94/01483호 공보에는 생물학적 불활성 폴리머 또는 폴리머 유도체와 약제학적으로 순수한, 합성된 친수성 폴리머를 화학적 결합의 특정 유형을 통해 공유결합에 의해 형성된 생체적합성 폴리머 컨쥬게이트가 개시되어 있다. 천연적으로 발생된 폴리머 및 그의 유도체로서는, 히알루론산과 같은 다당류, 콘드로이틴 설페이트 A, B 및 C와 같은 프로테오글리칸, 키틴, 헤파린, 헤파린 설페이트, 사이클로덱스트란, 히드로옥시에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르 및 스타치(starch)와 같은 덱스트란, 트리글리세라이드 및 포스포리피드와 같은 지질이 개시되어 있다. 합성 폴리머로서는 특히 폴리에틸렌 및 그의 유도체가 약 100 내지 약 100,000의 평균 분자량을 가진다고 개시되어 있다. 폴리머 또는 폴리머 유도체에 결합된 단 백질로서는, 인터페론, 종양 괴사 인자, 인터루킨, 콜로니 자극 인자, 골원성 인자 추출, 표피 성장 인자, 전환 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자, 산성 섬유모세포 성장인자와 같은 성장 인자 등을 포함하는 사이토카인 및 성장 인자가 개시되어 있다. WO 94/01483호 공보의 모든 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜 유도체가 폴리머로서 사용되었다.
WO 96/11953호 공보에는 N-말단 화학 변성 단백질 화합물 및 그의 생산 방법이 개시되어 있다. 구체적으로, 수용성 폴리머를 G-CSF의 N 말단에 커플링시키는 G-CSF 조성물이 개시되어있다. WO 96/11953호 공보의 본문에, 수용성 폴리머와 N-말단 커플링된 교감 인터페론이 개시되어있다. 또, 다양한 수(물) 폴리머가 WO 96/11953호 공보에 개시되어 있는 한편(예를 들어, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수 공중합체, 폴리아미노산(단독 중합체 또는 랜덤 공중합체 중 어느 한쪽), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체 또는 폴리프로필렌화 폴리올), PEG화 G-CSF 또는 교감 IFN 조성물만이 WO 96/11953호 공보의 실시예에 개시되어 있다.
WO 97/30148호 공보는 2개 이상의 폴리펩티드 분자와 커플링된 폴리머성 담체 분자를 함유한 감소된 알레르기항원성을 지닌 폴리펩티드 컨쥬게이트에 관한것이다. 이들 컨쥬게이트는 바람직하게는 개인 캐어(care) 시장에서 사용되는 조성물의 부분이다. 상기 컨쥬게이트는 폴리머성 담체 분자를 활성화시키고, 활성화 된 폴리머성 담체 분자를 2개 이상의 폴리펩티드 분자와 반응시키고, 컨쥬게이트 상에 잔류 활성기를 블로킹시킴으로써 생산된다. 폴리머성 담체 분자로서는, 폴리올, 폴리아민, 폴리카복실산 및 적어도 두 개의 다른 부착기를 함유하는 헤테로폴리머와 같은 천연 또는 합성 단독 중합체와 같은 다른 군의 화합물을 포함해서 다양한 것이 WO 97/30148호 공보에 개시되어 있다. 예를 들어, 스타(star) PEG, 분지된 PEG, 폴리비닐 알코올, 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리-D, L-아미노산을 포함한 것이 제시되어 있다. 특히 카복시메틸 덱스트란과 같은 덱스트란, 하이드록시에틸 셀룰로오스 또는 하이드록시프로필 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스, 키토산의 가수분해물, 하이드록시에틸 스타치 또는 하이드록시프로필 스타치와 같은 전분, 글리코겐, 아가로스, 구아 고무, 이눌린, 풀루란, 잔탄 고무, 카라기닌, 펙틴, 알긴산 등이 개시되어 있다. 폴리펩티드로서는, 일부 효소만이 명백하게 개시되어 있을 뿐이다.
Baldwin, J. E. 등의 "Tetrahedron, vol. 27 (1981), pp. 1723-1726"에는 덱스트란 및 하이드록시에틸 스타치의 화학적 변성으로 헤모글로빈과 반응하여 용해성 폴리머-결합 헤모글로빈의 부여를 허용하는 알데하이드 치환된 폴리머를 제공하는 것이 개시되어 있다. 이들은 산소에 결합하는 능력을 보여주고 있으나, 심장 관류 실험은 폴리머-결합 헤모글로빈이 혈액 치환체로서의 사용에 적합하지 않다는 것을 명백하게 지시하고 있다.
WO 99/49897호 공보에는 덱스트란 또는 하이드록시에틸 스타치와 같은 다당류를 헤모글로빈의 아미노기와 반응시킴으로써 형성된 헤모글로빈의 컨쥬게이트를 개시하고 있다. 다당류의 작용기로서, 산화성 당 개환(saccharide ring-opening)에 의해 형성된 알데하이드기가 사용된다. 사용되는 바람직한 환원제로서는, 보란 디메틸아민이 개시되어 있다. 게다가, WO 99/49897호 공보에는 헤모글로빈으로 오로지 제한되어 있다.
WO 03/074087호 공보는 단백질을 스타치-유래 변성 다당류에 커플링시키는 방법에 관한 것이다. 단백질과 다당류인 하이드록시알킬 스타치간의 결합 작용은 말단 알데하이드기 또는 하이드록시 알킬 스타치 분자의 상기 말단 알데하이드기의 화학적 변성으로 초래된 작용기와 단백질 작용기간에 형성되는 공유 결합이다. 단백질의 반응기로서, 아미노기, 티오기 및 카복시기가 개시되어 있으나, 단백질의 알데하이드기는 언급되어 있지 않다. 게다가, 다른 결합의 매우 다양한 가능이 다른 작용기, 이론적으로 적합한 다른 결합 분자 및 다른 화학적 과정을 포함해서 많은 리스트 형태에 주어지는 반면에, 실시예는 단지 두 개의 대안책을 기술할 뿐이다: 첫번째로 산화된 하이드록시에틸 스타치를 사용하고, 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드(EDC) 활성을 이용해서 단백질에 직접 커플링시키거나, 또는 비산화성 하이드록시에틸 스타치를 사용하여 시프 염기를 형성하는 단백질에 직접 커플링시키고, 계속해서 각각의 아민에 대해서 환원시킨다. 따라서, WO 03/074087호 공보의 실시예는 단백질의 티오기나 카복시기를 통해 커플링된 단일의 컨쥬게이트를 개시하고 있지도 않고, 또한 하이드록시에틸 스타치, 단백질 및 하나 이상의 결합 분자를 포함한 컨쥬게이트도 개시하고 있지 않다.
폴리머를 단백질에 커플링시키는 기술에 관한 완비된 문헌은 거의 PEG화 방 법 및 PEG화 단백질(예를 들어, 인터페론 알파, 인터페론 베타)을 개시하고 있다. 커플링 방법의 진행 및 다작용성 PEG-분자의 이용에도 불구하고, PEG화 약물의 일반적인 결점은 비천연적인 폴리머로서의 PEG의 신진대사경로는 상세히 공지되어 있지 않다는 점이다.
일부의 특허는 아미노산의 치환, 글리코실화의 증가 혹은 다합체(multimer)의 형성에 의한 인터페론의 변성을 개시하고 있다. 이들 방법은 높은 기술적 노력(재조합 기법)을 필요로 하며, 천연 단백질(예를 들어 인터페론)과는 현저하게 다르고 상이한 성질을 발현할 수 있는 새로운 실체로 될 수 있다.
게다가, 종래의 기술에서는 IFN-베타와 다당류간의 금속 착화를 통한 착물을 형성하는 것이 개시되어 있다. 그러나, 착물은 공유결합 컨쥬게이트처럼 안정하지 않고, 원치않는 부작용을 지닐 수도 있는 금속 이온(예를 들어, Zn2 +)을 함유한다.
따라서, 본 발명의 목적은 이들 컨쥬게이션 기법의 상기 결점을 극복하고, 단백질에 공유결합적으로 커플링된 충분히 정의된 생분해성 수용해성 폴리머에 의거한 인터페론 베타 컨쥬게이트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이들 컨쥬게이션 기법의 상기 결점을 극복하고, 단백질에 공유결합적으로 커플링된 충분히 정의된 생분해성 수용해성 폴리머에 의거한 인터페론 알파 컨쥬게이트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이들 컨쥬게이션 기법의 상기 결점을 극복하고, 단백질에 공유결합적으로 커플링된 충분히 정의된 생분해성 수용해성 폴리머에 의거한 AT III 컨쥬게이트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이들 컨쥬게이션 기법의 상기 결점을 극복하고, 단백질에 공유결합적으로 커플링된 충분히 정의된 생분해성 수용해성 폴리머에 의거한 GM-CSF 컨쥬게이트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이들 컨쥬게이션 기법의 상기 결점을 극복하고, 단백질에 공유결합적으로 커플링된 충분히 정의된 생분해성 수용해성 폴리머에 의거한 A1AT 및/또는 tPA 및/또는 APC 및/또는 인자 VII 및/또는 인자 VIII 및/또는 인자 IX 컨쥬게이트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이들 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
따라서, 본 발명은 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체의 적어도 하나의 작용기 A를 단백질의 적어도 하나의 작용기 Z와 반응시켜 공유결합을 형성하는 것을 포함하며, 여기에서 Z는 아미노기, 티올기, 알데하이드기 및 케토기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
- Z가 알데하이드기 또는 케토기인 경우에, A는 Z와 상기 결합을 형성하는 아미노기를 포함하고, 단백질은 IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되며,
- Z가 아미노기일 경우에, A는 반응성 카복시기 및 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되며,
-- A가 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기인 경우,
--- 하나의 작용기는 폴리머와 반응시키고 적어도 하나의 다른 작용기는 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈이거나, 혹은 추가로 화학적으로 변성되어 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기를 제공하는 작용기인 적어도 이작용성(bifunctional) 화합물과 상기 폴리머를 반응시킴으로써, 혹은
--- 폴리머를 산화시켜 적어도 하나의, 특히 적어도 두 개의 알데하이드기를 얻음으로써,
A를 상기 폴리머에 도입하여 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하거나, 또는,
-- A가 반응성 카복시기인 경우,
--- 폴리머를 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화시켜 생성된 카복시기를 활성시킴으로써, 혹은
--- 폴리머를 그의 비산화된 환원성 말단에서 탄산 디에스테르와 반응시킴으로써,
A를 상기 폴리머에 도입하여 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하거나, 또는
- Z가 티올기인 경우, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, tPA, A1AT, APC, 인자 VII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되고, A는 Z와 상기 결합을 형성하는 말레이미도기 또는 할로겐아세틸기를 포함하는 것인, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하는 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 얻어질 수 있는 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명에 따라 컨쥬게이트될 수 있는 단백질은 다음과 같이 특징화될 수 있다:
인터페론은 바이러스성 감염 및 기타 생물학적 유발인자에 반응해서 항바이러스성, 항증식성 및 면역 조절 활성을 매개하는 사이토카인이다. IFN 알파에 대해서, IFN 베타는 높은 종특이적(species-specific)이다. IFN 베타에는 IFN 베타 Ia와 IFN 베타 Ib의 두 가지 아류형(subtype)이 있다. 공업적 제조에 들어가는 경우 IFN 베타 Ia와 IFN 베타 Ib 간의 주된 차이는 아미노산의 개수와 글리코실화의 결과를 가져오는 그들의 생산에 이용되는 각 세포계이다. IFN 베타 Ia는 포유동물 세포에 의해 생산되고, 그의 아미노산 서열이 천연적으로 생성되는 인터페론 베타의 것과 동일하기 때문에 Ia라 칭해진다. IFN 베타 Ib는 세균에 의해 생산된다. 대부분의 다른 포유동물 단백질과 마찬가지로 인터페론은 글리코실화에 의해 번역후 수식된다. 그러나, 세균은 글리코실레이트 단백질이 결여되어 있으므로, IFN 베타 Ib는 천연 물질에서 발견되는 탄수화물 측쇄를 포함하지 않는다. IFN 베타 Ia는 166개의 아미노산을 지니고 분자량은 약 22,500 D이며, IFN 베타 Ib는 세균에 의한 생산방법에 연유한 글리코실화뿐만 아니라 IFN 베타 Ib에 있어서 N-말단 메티오닌이 결여되어 있기 때문에 165개의 아미노산을 지니고 분자량은 약 18,500 D이다. 인간 인터페론 베타의 아미노산 서열은 예를 들어 EP 0 218 825 Al에 개시되어 있다. 인터페론 베타의 결정 구조는 "Proc . Natl . Acad. Sci . USA 94 (1997) pp 11813-11818, Biochemistry, Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, Goelz S"에 보고되어 있다. 인터페론 베타의 시판용 제제는 Betaseron(IFN 베타 Ib), Avonex 및 Rebif(IFN 베타 Ia)이다. 인터페론 베타 Ib는 인간 인터페론 베타ser17의 유전자를 함유하는 유전공학적 플라스미드를 담지하는 대장균 균주의 세균 발효에 의해 제조된다. 본래의 유전자는 인간 섬유모세포로부터 얻어졌고, 17번 위치에서 발견되는 시스테인 잔기를 세린으로 치환하는 방식으로 변경되었다. 인터페론 베타 Ia는 인간 인터페론 베타 유전자가 도입되어 있는 유전공학적으로 제조된 CHO(Chinese Hamster Ovary) 유전자 세포를 이용해서 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. IFN 베타 Ia의 아미노산 서열은 천연의 섬유모세포 유래 인간 인터페론 베타의 것과 동일하다. 천연의 인터페론 베타 및 인터페론 베타 Ia는 글리코실화되어 각각 Asn80에서 단일의 N-결합된 착체 탄수화물 부분을 함유한다. 인터페론 베타 약물은 다발 경화증의 재발완화 처치용으로 표시되어있다. 그러나, 인터페론 베타 약물 제품의 투여와 관련된 많은 심각한 부작용이 있다. 또한, 이들은 주사(근육내 또는 피하)에 의해 투여되어 추가의 위험을 초래한다. 많은 개발 작업이 수행되어 IFN 베타의 특성을 개선하는 이유로 인해 부작용을 감소시키고 투여를 보다 용이하게 하고 있다(예를 들어 빈도를 감소). 단백질의 폴리머 변성(혹은 수식)은 단백질의 특성을 향상시키기 위해 적용되는 기법이다. 주로 사용되는 기법은 PEG화로서 알려진 폴리에틸렌 글리콜에 의한 인터페론의 변성이다.
IFN 알파 형태는 단핵구/대식세포, 림포블라스티노이드, 섬유모세포 및 이하의 바이러스, 핵산, 글루코코르티코이드, 호르몬 및 기타 유발인자에 의한 수많은 상이한 세포 유형에 의해 천연적으로 생성된다. 적어도 23개의 상이한 IFN 알파 변형체가 공지되어 있다. 개별의 단백질은 19 내지 26 kD의 분자질량을 지니고, 156 내지 166개 또는 172개의 아미노산의 길이를 지닌 단백질로 이루어져 있다. AU IFN 알파 아류형은 115 내지 151번 위치의 아미노산 사이의 공통의 보존 서열 영역을 소유하는 한편, 아미노-말단은 가변적이다. 많은 IFN 알파 아류형은 하나 또는 두 위치에서만 그들의 서열이 다르다. 디설파이드 결합은 1/98 및 29/138번 위치의 시스테인 사이에 형성되어 있다. 디설파이드 결합 29/138은 생물학적 활성에 대해서 중요한 한편, 1/98 결합은 생물학적 활성에 영향을 미치는 일없이 감소될 수 있다. 모든 IFN 알파 형태는 잠재적인 글리코실화 부위를 포함하지만 대부분의 아류형은 글리코실화되어 있지 않다. IFN 감마에 대해서는, IFN 알파 단백질은 pH 2에서 안정하다. IFN 알파의 공업적 생산은 유전자 변형된 대장균을 이용해서 수행된다. 세균은 단백질을 글리코실화하는 능력이 결여되어 있기 때문에, 승인된 약물 제품에서 사용되는 IFN 알파(IFN 알파 2a 및 IFN 알파 2b)의 두 변이체는 양쪽 모두 비글리코실화되어 있다. 종래의 IFN 알파의 주요 결점은 부작용이다. C형 간염치료용으로 표시되어 있어 인터페론 알파 약물의 개선에 대해 많은 연구가 행해져 왔다. 단백질의 폴리머 변성은 단백질의 특성을 개선하는 데 적용되는 기법이다. 주로 사용되는 기법은 PEG화로서 알려진 폴리에틸렌 글리콜에 의한 인터페론의 변성이다. IFN-알파의 두 개의 시판의 PEG화 변이체는 PEGIntron®(SP사 제품) 및 페가시스®(Pegasys®)(Roche사 제품)이다.
항트롬빈 III(AT III)은 트롬빈 및 인자 Xa를 저해하는 세린 프로테아제 저해재이다(Travis, Annu. Rev. Biochem. 52: 655, 1983). 인자 IXa, XIa, XIIa, tPA, 유로키나제, 트립신, 플라스민 및 칼리크레인도 더욱 낮은 정도까지 억제된다(Menache, Semin. Hematol. 28:1, 1991; Menache, Transfusion 32:580, 1992; Lahiri, Arch . Biochem . Biophys . 175:737, 1976). 인간 AT III은 대략 58.000 D의 분자량(MW)을 지니는 432개의 아미노산의 단일쇄 당단백질로서 간에서 합성된다. 그의 정상의 혈장 농도는 14 내지 20 mg/dL의 범위내이다(Rosenberg, Rev. Hematol. 2:351, 1986; Murano, Thromb. Res. 18:259, 1980). 상기 단백질은 3개의 디설파이드 가교(Cys 8-128, Cys 21-95, Cys 247-430)와 4개의 N-결합 탄수화물 사슬(Asn 96, -135, -155, -192)을 총 질량의 15%로 지닌다(Franzen, J. Biol. Chem. 255:5090, 1980; Peterson, The Physiological Inhibitions of blood coagulation and Fibrinolysis, Elsevier/ North-Holland Biomedical Press 1979, p 43). 항트롬빈은 혈액 응고의 억제에 있어서 중대한 세린형의 세린 단백분해효소 저해제이다. AT III은 인간 혈장에서 순환하는 가장 풍부한 내인성 항응고제이며 생리적 상태와 병적 상태 모두에 있어서 응고의 조절에 관여한다(Opal, Crit. Care Med. 2002, 30:325). 또한, 낮은 트롬빈 저해능을 지닌 두 가지 형태로 순환한다(Pike, J. Biol . Chem. 272:19562, 1997; Ersdal-Badju, Fed . Proc . 44:404, 1985) (4개의 비안테나리(biantennary), 모노- 및 디-시알릴화 올리고당 사슬을 지닌 알파 아이소형(isoform)이 85 내지 95%이고, 5-15%는 Asn 135, 2 내지 6 말단 시알산 결합에서의 글리코실화가 결여된 높은 헤파린 친화성 베타 아이소형임). 순환중인 AT III의 소분획은 혈관 내피세포의 표면상에 프로테오글리칸에 정상적으로 결합되어 있다. 이들 프로테오글리칸은 주로 헤파린과 마찬가지 방식으로 트롬빈의 저해를 촉매할 수 있는 헤파린과 구조적으로 유사한 분자인 헤파린 설페이트이다. 헤파린의 충분히 정의되어 있는 오당류에 결합하는 AT III은 단백질의 입체형태 변경을 초래한다(Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116:492, 1983; Olson, J. Biol . Chem. 266:6353, 1991; Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991; Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997). 이 결합은 트롬빈 및 인자 Xa를 향한 AT III 저해 활성의 100배 증대를 촉매한다(Rosenberg, Fed . Proc . 44:404,1985; Bjork, 항트롬빈 and related inhibitors of coagulation proteinases in Barett, Salvesen (eds.): Proteinase Inhibitors, vol 17, Amsterdam, The Netherlands Elsevier Science Publishers (Biomedical Devision) 1986 p 489; Olson, J. Biol . Chem. 267:12528, 1992). 내인 응고 캐스케이드의 효소가 통상 생성되는 내피면 상의 AT의 분획의 이 편재화는 이들 지혈성 효소를 신속하게 중화시켜 혈전 형성에 대항해서 자연 그대로의 표면을 보호할 수 있다. 따라서, 항혈전 결과의 예방시 AT III의 주요 특성은 촉매 헤파린을 결합하고, 그의 저해 특성을 변화시키는 입체 형태 변경을 받아서 트롬빈 또는 인자 Xa를 비가역적으로 결합함으로써 그들의 활성을 저해하는 것이 그의 능력이다. AT III은 응고 캐스케이드시 그의 작용으로부터 초래되는 몇몇 항염증성도 지닌다(Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657). 활성화 인자 X 및 트롬빈과 같은 활성화 응고 단백분해효소는 예를 들어 염증전 매개인자의 방출에 의해 염증에 기여한다. AT III에 의한 이들 단백분해효소의 저해는 세포와의 그들의 특이적 상호작용 및 후속의 반응을 예방한다(Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657). 응고와는 독립적으로 AT III의 항염증성은 예를 들어 프로스타사이클린의 방출을 가져오는 세포와의 직접적인 상호작용을 포함한다. 최근 확인된 세포 수용체인 신데칸-4에 대한 AT III의 결합은 지질 다당류와 같은 매개체에 의해 유기된 세포간 신호에 의한 간섭을 초래하고, 이에 의해, 염증 반응의 하향 조절을 가져온다(Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13:657). 프리(free) AT III 구조의 분석 외에, AT III의 생리적 기능을 위해 헤파린-AT III 착물의 중요성에 연유한 헤파린의 올리고당 단위의 착화 부위를 평가하는 많은 연구가 행해져 왔다(Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. Res. Cominun. 116:492, 1983; Olson, J. Biol . Chem. 266:6353, 1991; Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991; Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997). AT III이 생산되고 나서 후속의 고전적인 인간 혈장 분할 기법을 수행할 수 있다. 바이러스 불활성을 위한 열처리에 이어 AT III에 대한 헤파린의 높은 친화성을 이용한 친화 크로마토그래피(헤파린-세파로스)는 혈장과는 별도로 사용된다. AT III의 생산에 이용가능한 보다 최근의 대체법은 이 치료적 단백질에 대해 더욱 안전한 접근을 제공하는 재조합 생산 기법이다(Levi, Semin Thromb Hemost 27: 405, 2001). ATryn ™은 유전 형질 전환 염소에 있어서 Genzyme Transgenics Corp.(GTC)에 의해 생산된 재조합 인간 AT III(rh AT III)이다. 자세한 연구는 혈장 유래 AT III(ph AT III)와 rh AT III의 양쪽의 구조적 및 기능적 성질을 비교해서 행하였다(Edmunds, Blood, 91:4561, 1998). 이 실험에 의거하면, rh AT III은 글리코실화를 제외하고 ph AT III과 구조적으로 동일하다. 올리고만노스 구조는 유전자 형질전환으로 형성된 물질의 Asn 155상에서 발견되는 한편, 착체 구조는 혈장 유래 단백질의 경우에 있어서 검출된다. pd AT III의 갈락토오스 단위의 일부는 rh AT III에서 GalNac 단위에 의해 치환된다. rh AT III에서의 높은 정도의 푸코실화는 다른 차이점이다. 최후로 양쪽 모두의 단백질의 시알릴화 패턴은 두가지 방법에 있어서 다르다. 즉, rh AT III은 덜 시알릴화되어, N-아세틸-뿐만 아니라 N-글리콜릴뉴라민산을 함유한다. 두 분자 모두의 두 탄수화물 부분 간의 이 구조적 차이는 생화학적 특성의 차이를 초래한다. 다음의 AT III 약물, 즉 Kybernin(Aventis Behring), AT III(Baxter, Grifols), Atenativ(Pharmacia), Aclotine(LFB), Grifols(Anbin)는 유럽 병원시장에서 시판중이다(출처: IMS-ATC group 2001).
인자 VII은 단백분해효소의 고유 혈액 응고 캐스케이드에 관여하고, 응고 캐스케이드의 외적 경로를 활성화시킴으로써 지혈을 촉진시킨다. F VII은 인자 Xa, 인자 XIIa3 인자 IXa에 의해 인자 VIIa로, 또는 소량의 단백질 분해에 의해 트롬빈으로 전환된다. 조직 인자 및 칼슘 이온의 존재하에, 인자 VIla는 인자 X를 제한된 단백질 분해에 의해 인자 Xa로 전환한다. 인자 VIla도 조직 인자와 칼슘의 존재하여 인자 IX를 인자 IXa로 전환시킬 것이다. 인자 VII은 406개의 아미노산 잔기(MW 50 K Dalton)로 이루어진 비타민 K-의존성 당단백질이다. 인자 VII은 부여된 인간 혈장으로부터 통상의 추출에 의해, 또는 더욱 최근에는 재조합 시스템을 이용해서 생산된다. Novo Nordisk는 NovoSeven®의 생산용의 BHK(Baby hamster kidney)를 이용한다. 공칭 분자량 55 kDa를 지닌 406개의 아미노산의 단일쇄 단백질로서 발현된다(Thim, L. 등의 Biochemistry 27: 7785-7793(1988) 참조). 분자는 4개의 탄화수소 측쇄, 즉, Ser 52, 60에서의 두 개의 O-결합된 탄수화물 측쇄 및 Asn 145, 322에서의 두 개의 N-결합된 탄수화물 측쇄를 담지한다(Thim, L. 등의 Biochemistry 27: 7785-7793(1988) 참조).
인자 VIII은 단백분해효소의 고유 혈액 응고 캐스케이드에 관여하고, 인자 X를 활성 형태로 전환하는 인자 IXa의 반응시 보조인자로서 기능하며, 인자 Xa는 궁극적으로 섬유소응괴의 형성을 초래한다. 인자 VIII의 결여 혹은 불안정은 혈우병인 통상의 열성 x-결합 응고 장애를 가져온다. A형 혈우병의 빈도는 모든 인종 집단에 있어서 웅성 10,000 마리 출생시 1 내지 2마리이다. 환자는 정상치보다 충분히 낮은 레벨의 인자 VIII을 발현하거나, 혹은 그들의 혈장에서 상당량의 인자 VIII(정상적으로는 적어도 30%)을 지니는 소위 crm(cross-reacting material) 양성 환자(환자의 거의 5%) 군에 속하지만, 단백질은 비작용성이다. 모든 환자의 약 50%는 정상의 1% 미만의 인자 VIII 활성을 지닌 중증의 A형 혈우병을 지니며, 이들은 접합부, 근육 및 내부 기관 속으로의 빈번한 자발 출혈을 지닌다. 환자의 30 내지 40%에서 일어나는 가벼운 증상의 A형 혈우병은 정상의 5 내지 30%의 활성과 관련된다. 출혈은 상당한 외상 혹은 수술 후에만 일어난다. 제법 중증의 A형 혈우병은 환자의 약 10%에서 일어난다; 여기서, 인자 VIII 활성은 정상의 2 내지 5%이고, 출혈은 이미 경증의 외상후 일어난다. 인자 VIII의 인간 생체내 반감기는 통상 10 내지 15시간이지만, 방출, 안정성 및 분해 역학이 다른 인자인 폰 빌레브란트 인자에 의해서도 영향받는 것에 주의할 필요가 있다.
인자 VIII은 부여된 인간 혈장으로부터 통상의 추출에 의해, 또는 더욱 최근에는 재조합 시스템을 이용해서 생산된다. 바이엘사는 Kogenate 생산용의 BHK(Baby hamster kidney) 세포를 사용하는 한편, 박스터(Baxter)사는 공칭 분자량 267 kDa를 지닌 2351개의 아미노산의 완전 단일쇄 단백질(Toole et al., 1984, Nature 312: 342)로서 혹은 그의 변이체에 있어서 그의 제품 Recombinate를 위해 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 이용하며, 여기서, 더욱 안정하고 더 높은 생산 수율을 부여하는 제품을 지니도록 그의 일부 혹은 전체 B-영역이 결실되어 있다(Bhattacharyya 등, 2003, CRIPS 4/3: 2-8). 전구체 산물은 200 및 80 kDa의 두 폴리펩타이드 사슬 속으로 진행되어, 두 금속이온(들)에 의해 함께 유지된 두 사슬이 혈액 속에서 발현된다(Kaufman 등, 1988, J. Biol . Chem., 263: 6352).
응혈성(procoagulant) 작용은 더욱 트롬빈 분열을 요하여 54kDa 및 44 kDa의 무거운 사슬(haeavy chain: 중쇄) 분획 + 72 kDa의 가벼운 사슬(light chain: "경쇄") 분획을 얻는다(AIy 등, 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA: 4933). 따라서, 인간 혈장 유래의 인자 VIII 농축물에 있어서, 몇몇 분획된 충분히 활성인 인자 VIII 형태가 설명되어 있다(Anderson 등, 1986, Proc . Natl . Acad , Sci . 83: 2979).
혈장 또는 재조합 인자 VIII의 투여의 통상의 부작용은 많은 환자(30%까지)에게 있어서의 면역 반응이며, 이것은 치료적 가치를 잃게 된다. 종래, 내성의 경구 도입에 의해 환자에게 내성을 부여하는 각종 시도가 시작되었으나, 결과는 반드시 너무 조장되는 것은 아니었다. 내성을 유발하는 새로운 유전학적 수단이 제안되었으나, 아직 광범위한 용도를 발견한 것은 아니다. 헤실레이트화(hesylated) 단백질은 낮은 정도의 면역성을 지닐 것으로 기대되어, 이 병발증을 저감시킬 수 있다.
인자 VIII은 리신 잔기에 있어서 매우 풍부하고(전체 2350개의 아미노산중 220개 이상; 첨부 1 참조), 이것은 활성 환원성 아민화 접근에 이용될 수 있다.
인자 IX는 Ca(2+) 이온, 인지질 및 인자 VIlla의 존재하에 인자 X를 그의 활성 형태로 변환시킴으로써 혈액 응고의 고유 경로에 관여하는 비타민 K-의존성 혈장 단백질이다. 인자 IX는 단일 사슬에서 415개의 아미노산으로 구성되는 대략 55,000 Da의 분자량을 지니는 당단백질이다(Yoshitake S. 등, Biochemistry 24:3736-3750(1985)). 인자 IX는 부여된 인간 혈장으로부터 통상의 추출에 의해 또는 더욱 최근에는 재조합 시스템을 이용해서 생산된다. Wyeth는 BeneFIX® 생산을 위해 CHO(Chinese hamster ovary)를 이용한다. 이것은 혈장-유래 인자 IX의 Ala 148 대립 형태와 동일한 일차 아미노산을 지니고, 내인성 인자 IX와 유사한 구조적 및 기능적 특성을 지닌다. 단백질은 8개의 탄수화물 측쇄, 즉, Ser 53, 61 및 트레오닌 159, 169, 172, 179에서의 6개의 O-결합 탄수화물 측쇄와, Asn 157, 167에서의 2개의 N-결합 탄수화물 측쇄를 지닌다(Yoshitake S. 등, Biochemistry 24:3736-3750(1985); Balland A. 등, Eur J Biochem. 1988; 172(3): 565-72).
hGM-CSF(human granulocyte macrophage colony stimulating factor)는 성숙한 세포 모집단의 기능 활성화를 자극하기 위해서뿐만 아니라 조혈 전구 세포의 조절 및 차별화를 위해서 중요한 초기의 작용 인자이다. 이것은 효모, 세균, 곤충, 식물 및 포유동물 세포에서 무성생식되어 발현되며, 그 결과 생체내에서의 구조, 조성, 혈청 반감기 및 기능을 변화시키는 단백질로 된다(Donahue, R. E.; Wang, E. A.; Kaufman, R. J.; Foutch, L.; Leary, A. C; Witek-Giannetti, J. S.; Metzeger, M.; Hewick, R. M.; Steinbrink, D. R.; Shaw, G.; Kamen, R.; Clark, S. C. Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986, 51, pp. 685-692). 천연 및 포유동물 세포-유래의 hGM-CSF는 127개의 아미노산 단백질로, N- 및 O-글리칸을 함유한다. 이것은 하나 또는 두 N-글리코실화 부위 및 O-글리코실화 부위(들)가 점유하는 상이한 상태로 인해 고도로 불균질하다(Cebon, J.; Nicola, N.; Ward, M.; Gardner, L; Dempsey, P.; Layton, J.; Durhrsen, U.; Burgess, A.; Nice, E.; Morstyn, G. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity. J. Biol . Chem. 1990, 265, 4483-4491; Kaushansky, K.; O'Hara, P. J.; Hart, C. E.; Forstran, J. W.; Hagen, F. S. Role of carbohydrate in the function of human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor. Biochemistry 1987, 26, pp. 4861-4867; Armitage, J. O.; Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1998, 92, pp. 4491-4508). 이 림포카인은 면역결핍으로 고생하거나 질환 또는 방사선 및/또는 화학요법에 의해 억제되고 있는 환자에게 과립구 및 대식세포 생성을 자극하기 위하여 골수 백혈병의 치료 및 그의 능력의 잠재성으로 인해 임상에서 주목받고 있다(reviewed by Moonen, P.; Mermod, J.J.; Ernst, J.F.; Hirschi, M.; DeLamarter, J.F. Increased biological activity of deglycosylated recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells. Proc . Natl . Acad . Sci . US. 1987, 84, pp. 4428-4431). 각종 연구는 N-결합 탄수화물이 결여된 hGM-CSF가 자연 그대로의 재조합 사이토카인과 비교할 때 생체내에서 상당히 높은 특이적 활성을 지니는 것을 제안하고 있다(Armitage, J. O.; Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1998, 92, pp. 4491-4508; Okamoto, M.; Nakai, M.; Nakayama, C; Yanagi, H.; Matsui, H.; Noguchi, H.; Namiki, M.; Sakai, J.; Kadota, K.; Fukui, M.; Hara, H. Purification and characterization of three forms of differently glycosylated recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor. Arch . Biochem . Biophys . 1991, 286, pp. 562-568; Hovgaard, D.; Mortensen, B. T.; Schifter, S.; Nissen, N. I. Clinical pharmacokinetic studies of a human haemopoietic growth factor, GM-CSF. Eur . J. Clin . Inv . 1992, 22, pp. 45-49). 그러나, 약동학(Cebon, J.; Nicola, N.; Ward, M.; Gardner, L; Dempsey, P.; Layton, J.; Durhrsen, U.; Burgess, A.; Nice, E.; Morstyn, G. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity. J. Biol . Chem . 1990, 265, pp. 4483-4491; Hovgaard, D.; Mortensen, B. T.; Schifter, S.; Nissen, N. I. Clinical pharmacokinetic studies of a 인간 haemopoietic growth factor, GM-CSF. Eur . J. Clin . Inv . 1992, 22, pp. 45-49; Denzlinger, C; Tetzloff, W.; Gerhartz, H. H., Pokorny, R.; Sagebiel, S.; Haberl, C; Wilmanns, W. Differential activation of the endogenous leukotriene biosynthesis by two different preparations of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating factor In healthy volunteers. Blood 1993, 81, pp. 2007-2013), 독성(Denzlinger, C; Tetzloff, W.; Gerhartz, H. H., Pokorny, R.; Sagebiel, S.; Haberl, C; Wilmanns, W. Differential activation of the endogenous leukotriene biosynthesis by two different preparations of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating 인자 In healthy volunteers. Blood 1993, 81, pp. 2007-2013) 및 면역원성(Donahue, R. E.; Wang, E. A.; Kaufman, R. J.; Foutch, L.; Leary, A. C; Witek-Giannetti, J. S.; Metzeger, M.; Hewick, R. M.; Steinbrink, D. R.; Shaw, G.; Kamen, R.; Clark, S. C. Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986, 51, pp. 685-692; Revoltella, R.; Laricchia-Robbio, L.; Moscato, S.; Genua, A.; Liberati, A Natural and therapy-induced anti-GM-CSF and anti-G-CSF antibodies in human serum. Leukemia and Lymphoma 1997, 26, pp. 29-34; Ragnhammar, P.; Friesen, H-J.; Frodin, J-E.; Lefvert, A-K.; Hassan, M.; Osterborg, A.; Mellstedt, H. Induction of anti-recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (Escherichia coli-derived) antibodies and clinical effects in nonimmunocompromised patients. Blood 1994, 84, pp. 4078-4087; Wadhwa, M.; Hjelm Skog, A-L.; Bird, C; Ragnhammar, P.; Lilljefors, M.; Gaines-Das, R.; Mellstedt, H.; Thorpe, R. Immunogenicity of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) products in patients undergoing combination therapy with GM-CSF. Clinical Cancer Research 1999, 5, pp. 1351-1361; Gribben, J.G.; Devereix, S.; Thomas, N. S. B.; Keim, M.; Jones, H. M.; Goldsto?e, A. H.; Linch, D. C. Development of antibodies to unprotected glycosylation sites on recombinant GM-CSF. Lancet 1990, 335, pp. 434-437)과 같은 hGM-CSF에 있어서 탄소화물 사슬의 주된 역할을 지지하는 많은 증거가 있다. 대장균으로부터 그리고 효모로부터의 GM-CSF에 대해 빈번하게 보고되어 있는 항원성의 관점에서, 화학적 변성 전략은 비포유동물성 발현 시스템으로부터 제조된 것을 포함하는 이 제품에 대한 기대되는 접근법을 나타내는 것으로 제기되어 있다. GM-CSF 제제는 "Leukine"(Immunex사 제품) 및 "Leucomax"(Novartis사 제품)라는 상품명하에 시판되고 있다. GM-CSF는 골수 이식, 골수 이식 접목실패 또는 지연, 기동 후, 자가이식 말초 혈액 전구 세포의 이식 후, 그리고 급성 골수 백혈병을 지닌 노인에서의 유도화학요법 후의 골수 재구성에 이용된다.
알파 l-항트립신(A1AT, "알파 1-단백분해효소 저해제"라고도 칭함)은 중성구 엘라스타제, 트롬빈, 인자 Xa 및 XIa를 포함하는 실질적으로 모든 포유동물의 세린 단백분해효소를 저해하는 것으로 나타나있는 단백분해효소 저해제이다(Travis Ann . Rev . Biochem . 52 (1983) p. 655). A1AT는 394개의 아미노산과 53 kD의 분자량을 지닌 간에서 합성된 단일쇄 당단백질이다. 혈장 농도는 1 내지 1.3 g/ℓ의 범위이다. 전체 단백질 중의 단지 하나의 시스테인의 존재는 분자내 디설파이드 가교의 형성을 허용하지 않는다. 상기 분자는 분자량의 12%를 나타내는 3개의 탄수화물 측쇄(Asn 46, 83, 247)를 지닌다(Mega J Biol . Chem . 255 (1980) p. 4057; Mega J. Biol . Chem . 255 (1980) p. 4053; Carell FEBS Letters 135 (1981) p. 301; Hodges Biochemistry 21 (1982) p. 2805). 2종류의 탄수화물 사슬이 각각 비안테나리 또는 트리안테나리 구조를 지니는 것으로 발견되었다(Hodges J Biol. Chem. 254 (1979) p. 8208). 인간 A1AT는 일반적인 모집단에 있어서 적어도 12개의 상이한 형태로 생성된다. 이 미세 불균일성은 2종의 탄수화물 사슬의 다양한 양의 결과이다. 주된 기능은 중성구 엘라스타제의 활성 제어이다(Travis Ann . Rev . Biochem . 52 (1983) p. 655). 엘라스타제의 미제어 활성은 상피 조직에 대한 공격을 초래하여 회복할 수 없는 손상의 결과를 가져온다. 불활성화 프로세스 동안, A1AT는 이 복합체 형성에 의해 그 결과로서 불활성화된 단백질분해효소의 활성 중심에 결합되는 엘라스타제용의 기질로서 작용한다. A1AT의 결함은 예를 들어 폐의 상피세포의 손상과 관련된 폐기종을 초래한다. A1AT의 3개의 N-글리코실화 부위에 대한 A1AT의 2종의 탄수화물 측쇄의 분포는 A1AT의 각 아이소형마다 다르다. A1AT의 고전적인 생산은 상이한 친화 크로마토그래피 단계를 이용해서 인간 혈장 분획법에서 수행된다. 그러나, A1AT를 생산하는 더욱 최근의 방식은 재조합 기법의 이용이다. PPL 치료법은 유전자 변형된 양의 우유로부터 재조합 인간 A1AT(rHA1AT)를 회수하는 것을 허용하는 프로세스를 개발시켰다(Olman Biochem. Soc . Symp . 63 (1998) p. 141; Tebbutt Curr . Opin. MoI . Then 2 (2000) p. 199; Carver Cytotechnology 9 (1992) p. 77; Wright Biotechnology (NY) 9 (1991) p. 830). 분자의 단백질 부분에 대해서, rhA1AT는 pdA1AT와 비교해서 동일한 구조를 보인다. 그러나, - 다른 재조합 생산 인간 단백질의 경우와 마찬가지로 - 탄수화물 측쇄에 있어서, 특히 시알산 잔기의 양과 관련해서 차이가 발생한다.
조직플라스미노겐활성제(tPA)는 응괴 용해시 중요한 세린 단백분해효소와 유사한 티로신이다. 섬유소 응괴의 존재시, tPA는 플라스미노겐을 플라스민으로 변환시켜 섬유소를 분해한다. TPA는 섬유서의 존재시 증강된 활성을 발현하고, 그 결과, 섬유소-특이적 플라스미노겐활성을 일으킨다(M. W. Spellman, LJ. Basa, CK. Leonard, J.A. Chakel, J. V. O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100). 플라스민은 섬유소를 가용화시켜, 섬유소 분해 산물을 수득한다. 양성 피드백 기전을 통해서, 섬유소는 tPA 매개화된 플라스미노겐 활성화를 자극시킴으로써 그 자체의 분해를 증진시킨다(RJ. Stewart et.al. The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp. 10112-10120). htPA는 섬유소 용해의 생리학적 활성자이며 상이한 종류의 조직에 존재한다. 이것은 대략 68 kD의 분자량을 지니는 당단백질이다. 자연 그대로의 형태에 있어서, tPA는 하나의 사슬 형태(single-chain tissue-type plasminogen activator, sctPA)이며, 펩타이드 결합 Arg 275-Ile 276에서의 플라스민의 분해에 의해 두 개의 사슬 구조(two-chain tissue-type plasminogen activator, tctPA)로 전환될 수 있다. 이것은 섬유소 용해 처치를 위해서 재조합 rtPA(recombinant tissue-type plasminogen activator)를 생성한다. 상이한 유형의 tPA는 탄수화물 구조에 있어서 상이한 구조차를 보인다. I 타입 tPA는 아미노산 Asnll7, Asnl84 및 Asn448에서 N-결합 올리고당을 지닌다. II 타입 tPA는 Asnl l7 및 Asn448에서 글리코실화된다. 상기 두 타입은 Thr61에서 O-결합 푸코오스 잔기를 함유한다(K. Mori et.al. The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) pp. 3261-3267). CHO-세포에서 발현된 tPA의 탄수화물 구조는 당 사슬의 각종의 디-, 트리 및 테트라안테나리 구조를 보이는 것으로 연구되었다(M. W. Spellman, LJ. Basa, CK. Leonard, J.A. Chakel, J.V. O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100). tPA의 일차 구조는 83번 부위에서 프리 시스테인 잔기가 플러스된 가교로 되는 것으로 여겨지는 수개의 시스테인을 포함하며, 이것은 다른 tPA와 상호작용하여 이량체를 형성할 수 있다. 수개의 결과는 tPA의 생체내 제거가 탄수화물 구조에 의해, 특히 Asn ll7 부위에 부착된 높은 만노오스 올리고당에 의해 영향받는 것을 나타낸다. 다른 제안된 제거 기전은 간세포 상의 높은 친화성 수용체에 의한 Thr61에서의 O-결합 푸코오스 잔기의 인식을 포함한다. 이 잔기는 Cys83에 가깝다. 생체공학적 tPA(TNK-tPA)는 반감기를 연장시키도록 개발되었다. 117번 위치에서의 글리코실화 부위는 117번 부위에서의 아스파라긴을 글루타민으로, 103번 부위의 트레오닌을 아스파라긴으로 치환함으로써 103번 위치로 변위된다. TNK-tPA는 단백질 분해효소 영역에서의 테트라-알라닌 치환 때문에 플라스미노겐 활성자 저해제 1에 의해 불활성화에 대한 내성을 지닌다(RJ. Stewart et.al. The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp. 10112-10120). TNK-tpA는 Tenecteplase®(베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)사 제품)로서 시판되고 있고, 1회의 정맥내 알약으로서 투여될 수 있는 한편, tPA는 알약으로서 투여후 주입할 필요가 있다.
활성화 단백질 C(APC: Activated Protein C)는 중증의 패혈증과 관련된 응고 및 염증의 조정자이다. 활성화 단백질 C는 그의 불활성 전구체(단백질 C)로부터 트롬보모듈린에 결합된 트롬빈에 의해 변환된다. 이 복합체는 단백질 C의 무거운 사슬로부터 짧은 N-말단의 활성화 펩타이드를 분할해서 활성화 단백질 C로 된다. 트로트레코긴 알파(활성화됨)는 혈장 유래 활성화 단백질 C와 동일한 아미노산 서열을 지니는 동시에 마찬가지 성질을 지니는 재조합 인간 활성화 단백질 C(rhAPC)이다. 활성화 단백질 C는 Xigris®로서 Eli Lilly사에 의해 시판되고 있다. 이것은 단백질 C 발현 벡터가 도입되어 있는 인간 세포 라인(HEK293)에서 생산된다. 이 특정 세포라인은 작용적 활성이 요구되는 정확한 시리즈의 복합체 후-유전체 변형을 수행하도록 그의 능력에 의해 사용되었다. 재조합 인간 활성화 단백질 C는 4개의 N-글리코실화 부위 및 12개의 디설파이드 결합을 함유하는 2-사슬 당단백질이다. 무거운 사슬은 250개의 아미노산을 함유하고, 그중 7개의 잔기는 시스테인이고, 이것은 3개의 N-결합 글리코실화 부위(Asn-248, Asn-313 및 Asn-329)를 지닌다. 7개의 시스테인 잔기는 무거운 사슬 내에 3개의 디설파이드 결합과 사슬 사이에 1개의 디설파이드 결합을 형성한다. 가벼운 사슬은 하나의 N-결합된 글리코실화 부위(Asn-97) 및 17개의 시스테인 잔기를 함유하고, 이것은 가벼운 사슬 내에 8개의 디설파이드 결합 그리고 무거운 사슬에 대해서 1개의 디설파이드 결합을 형성한다. 가벼운 사슬 상의 첫번째 9개의 글루탐산은 감마 카복실화되고(GIa) 아스파르트산 71은 베타 하이드록실화된다. rhAPC는 인간 혈장 유래의 활성화 단백질 C와 동일한 아미노산 서열을 지니지만 그의 글리코실화 패턴은 후자와 상이하다. 활성화 단백질 C는 세린 단백분해효소족에 속하는 단백분해효소로, 응고의 조절시 중요한 역할을 한다. 활성화 단백질 C의 항혈전 기능에 대한 기초는 트롬빈 기능을 억제하는 그의 능력이다. 또한, 활성화 단백질 C는 중증의 패혈증과 관련된 염증의 중요한 조정자이다. 내인성 세린 단백분해효소 저해제는 활성화 단백질 C에 의해 생체내에서 매우 짧은 순환활성 반감기(30분 미만)를 초래하는 활성화 단백질 C5용의 천연 저해제이다. 순환으로부터의 활성화 단백질 C의 제거는 내인성 단백분해효소 저해제에 의한 활성화 단백질 C의 효소활성의 저해, 간 및 신장 등의 기관에 의한 활성화 단백질 C 및/또는 활성화 단백질 C-세린 단백분해효소 저해제 복합체의 제거, 및 순환 혹은 조직 단백분해효소에 의한 활성화 단백질 C 및/또는 활성화 단백질 C-세린 단백분해효소 저해제 복합체의 분해를 포함하는 적어도 3가지 프로세스의 조합에 의해 매개된다. 24 ㎍/kg/h에서의 24시간 주입에 의한 제 1상 임상시험(Phase Ⅰ clinical study)은 70 ng/㎖의 항정 혈장 농도로 된다. 주입의 말기에 측정된 rhAPC의 반감기는 0.5 내지 1.9시간이었다. 혈장 rhAPC 농도는 주입의 종료 후 2시간 내에 10 ng/㎖의 검출한계 이하로 떨어진다. 그의 짧은 생리학적 및 약동학적 반감기로 인해, 활성화 단백질 C는 패혈증 처치시의 임상 용도에 있어서 소망의 혈장 농도를 유지하도록 소정 속도로 연속적으로 주입된다. 일부의 노력은 활성화 단백질 C의 약동학 프로필을 개선시켰다. 예를 들어, D.T. Berg et. al. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 100 (2003) pp. 4423-4428에는 연장된 반감기를 지닌 활성화 단백질 C의 공학적 변이체가 개시되어 있다.
본 발명의 본문에서, 용어 "하이드록시알킬 스타치(HAS)"는 적어도 하나의 하이드록시알킬기에 의해 치환된 스타치 유도체를 의미한다. 본 발명의 바람직한 하이드록시알킬 스타치는 화학식(I)에 따른 구성을 가진다:
Figure 112006072272527-PCT00001
여기에서 스타치 분자의 환원된 말단은 비-산화된 형태로 보여지고, 말단 당류 단위는 아세탈 형태로 보여지나, 예를 들어 용매에 따라 알데하이드 형태와 평형상태를 이룰 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 하이드록시알킬 스타치는 말단 탄수화물 부분이 화학식(I)에서 간략화를 위해 묘사된 하이드록시알킬기 R1, R2, 및/또는 R3를 포함하는 화합물에 제한되지 않고, 말단 탄수화물 부분 및/또는 스타치 분자의 나머지 부분 중 어느 곳이든지 적어도 하나의 하이드록시기가 존재하는 화합물을 의미하며, HAS' 는 하이드록시알킬기 R1, R2, 또는 R3에 의해 치환된다.
두 개 이상의 다른 하이드록시알킬기를 포함하는 하이드록시알킬 스타치도 가능하다.
HAS 중에 포함되는 적어도 하나의 하이드록시알킬기는 두 개 이상의 하이드록시기를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에 의하면, HAS 중에 포함된 적어도 하나의 하이드록시기는 하나의 하이드록시기를 함유한다.
"하이드록시알킬 스타치"란 표현도 알킬기가 모노- 또는 다 치환된 유도체를 포함한다. 본 명세서에서, 알킬기는 할로겐, 특히 불소에 의해, 또는 아릴기에 의해 치환된 것이 바람직하다. 또한, 하이드록시알킬기의 말단 하이드록시기는 에스테르화되거나 에테르화될 수 있다.
또, 알킬 대신에, 직쇄 또는 분쇄의 치환되거나 무치환된 알켄기가 사용될 수 있다.
하이드록시알킬 스타치는 스타치의 에테르 유도체이다. 상기 에테르 유도체 이외에, 다른 스타치 유도체도 본 발명의 명세세에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 유도체는 에스테르화된 하이드록시기를 포함한 것이 유용하다. 이들 유도체는 예를 들어, 탄소 원자수 2 내지 12를 지닌 무치환된 모노- 또는 디카복실산의 유도체이거나, 또는 그의 치환된 유도체일 수 있다. 특히 2 내지 6개의 탄소 원자를 가진 무치환된 모노카복실산의 유도체가 유용하고, 특별히 아세트산의 유도체이다. 본 명세서에서, 아세틸 스타치, 부티릴 스타치 및 프로필 스타치가 바람직하다.
또한, 2 내지 6개의 탄소 원자를 가진 무치환된 디카복실산이 바람직하다.
디카복실산 유도체의 경우, 디카복실산의 제 2 카복시기도 에스테르된 것이 유용하다. 또, 디카복실산의 모노 알킬 에스테르 유도체도 본 발명의 본문에서 적합하다.
치환된 모노-또는 디카복실산에서, 치환기는 바람직하게는 치환된 알킬 잔기에 대해 상기에서 언급한 것과 동일하다.
스타치의 에스테르화에 대한 기술은 당업계에 공지되어 있다[예를 들어, Klemm D. 등, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, 특히 chapter 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9 참고].
본 발명의 바람직한 구체예에 의하면, 화학식(I)에 따른 하이드록시알킬 스타치가 이용된다.
화학식(I)에서, HAS'으로 표시된 잔기와 간단하게 묘사된 당류는 함께 바람직한 하이드록시알킬 스타치 분자를 나타낸다. HAS'에 포함된 다른 당류 고리 구조는 설명적으로 묘사된 당류 고리와 같거나 다를 수 있다.
화학식 (I)에 따른 잔기 R1, R2, 및 R3에 관해서는, 특별한 제한은 없다. 바람직한 구체예에 의하면, R1, R2, 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 각각 알킬 잔기에서 2 내지 10개의 탄소 원자를 가진 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기 또는 (CH2CH2O)n-H(식중, n은 정수, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6임)이다. 수소 및 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시 알킬기가 바람직하다. 더 바람직하게는 하이드록시알킬기는 2 내지 6개의 탄소 원자, 더욱더 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소원자를 갖는다. 그러므로 "하이드록시알킬 스타치"는 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치, 하이드록시프로필 스타치 및 하이드록시부틸 스타치를 포함하며, 여기에서 하이드록시에틸 스타치 및 하이드록시프로필 스타치가 특히 바람직하며, 하이드록시에틸 스타치가 가장 바람직하다.
알킬, 아릴, 아르알킬 및/또는 알크아릴기는 직쇄이거나 분기쇄 및 임의로 적당히 치환된 것일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 R1, R2, 및 R3가 독립적으로 수소이거나 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 지닌 직쇄 또는 분기쇄의 하이드록시알킬기인 상기 설명된 방법에 관한 것이다.
따라서, R1, R2 및 R3는 바람직하게는 하이드록시헥실, 하이드록시펜틸, 하이드록시부틸, 2-하이드록시프로필, 3-하이드록시프로필, 2-하이드록시이소프로필과 같은 하이드록시프로필, 2-하이드록시에틸과 같은 하이드록시에틸일 수 있으며, 수소 및 2-하이드록시에틸기가 특히 바람직하다.
그러므로, 본 발명은 또한 R1, R2, 및 R3가 독립적으로 수소 또는 2-하이드록시에틸기이고, 하나의 구체예에서, 적어도 하나의 잔기 R1, R2, 및 R3가 2-하이드록시에틸기인 상기 기술된 것과 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
하이드록시에틸 스타치(HES)는 본 발명의 모든 구체예에서 가장 바람직하다.
그러므로 본 발명은 폴리머가 하이드록시에틸 스타치이고 그 폴리머 유도체가 하이드록시에틸 스타치 유도체인, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
하이드록시에틸 스타치(HES)는 천연적으로 발생하는 아밀로펙틴의 유도체이고, 체내의 알파-아밀라아제에 의해 분해된다. HES는 탄수화물 폴리머 아밀로펙틴의 치환된 유도체이고, 이것은 95 중량% 까지의 농도로 옥수수 전분에 존재한다. HES는 유리한 생물학적 성질을 나타내며 혈관 용적 대체제(replacement agent)로서 임상중 혈액희석 치료에 사용된다[Sommermeyer 등, 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; and Weidler 등, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41,494-498].
아밀로펙틴은 글루코스 부분으로 이루어지고, 여기에서 주 쇄 중 알파-1,4-글루코시드 결합이 존재하고 분기된 부분에서 알파-1,6-글루코시드 결합이 형성된다. 이 분자의 물리적-화학적 성질은 글리코시드 결합의 유형에 의해 주로 결정된다. 눈금간 알파-1,4-글루코시드 결합 때문에, 1회전(turn)당 약 6개의 글루코오스-단량체를 지닌 나선 구조가 생성된다. 폴리머의 생화학적 성질 및 물리-화학적 성질은 치환을 통해 변성될 수 있다. 하이드록시에틸기의 도입은 알칼리성 하이드록시에틸화를 통해 성취될 수 있다. 반응 조건을 적합화함으로써, 하이드록시에틸화에 관해 무치환된 글루코오스 단량체 중 각각의 하이드록시기의 상이한 반응성을 활용하는 것이 가능하다. 이러한 사실로 인하여, 당업자는 제한된 범위 내에서 치환 패턴에 영향을 줄 수 있다.
HES는 주로 분자량 분포 및 치환도에 의해 특징 지워진다. 치환 정도를 기술하는 두 가지 가능성이 있다:
1. 치환도는 모든 글루코오스 부분에 관해서 치환된 글루코오스 단량체의 부분에 대해 상대적으로 설명될 수 있다.
2. 치환도는 몰 치환으로서 기술될 수 있으며, 여기서 글루코오스 부분당 하이드록시에틸기의 개수가 기술된다.
본 발명의 명세서에서, 치환도는 DS로 표시되며, 상기 기술한 바와 같이 몰 치환에 관한 것이다(전술한 바와 같은 Sommermeyer 등, 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278, 특히 273페이지 참조).
HES 용액은 다분산 조성물로서 존재하며, 여기에서 각 분자는 폴리머화된 정도, 분지된 부분의 수와 패턴, 및 치환 패턴에 관하여 다른 것과는 다르다. 따라서, HES는 다른 분자량을 가진 화합물의 혼합물이다. 결과적으로, 특정 HES 용액은 통계적 수단을 이용하여 평균 분자량에 의해 결정된다. 본 명세서에서, Mn은 분자 수에 의존하는 산술 평균으로서 계산된다. 또는, Mw(또는 MW), 중량 평균은 HES의 질량에 의존하는 단위를 나타낸다.
본 발명의 명세서에서, 하이드록시에틸 스타치는 바람직하게는 1 내지 300 kD의 평균 분자량(중량 평균)을 가질 수 있다. 하이드록시에틸 스타치는 또한 바람직한 몰 치환도 0.1 내지 3, 바람직하게는 0.1 내지 2, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.1 내지 0.8을 나타낼 수 있고, 하이드록시에틸기에 관하여 2 내지 20의 범위에서 C2 :C6 치환 간의 바람직한 비율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용된 바와 같은 용어"평균 분자량"이란 Sommermeyer 등, 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; 및 Weidler 등, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498에 기재된 바와 같이 LALLS(large angle laser light scatering)-GPC 방법에 따라 결정된 중량을 의미한다. 또한, 10 kD 이하의 평균분자량에 대해서, LALLS-GPC에 의해 미리 정량화된 표준에 따라 검정을 행하였다.
본 발명의 바람직한 구체예에 의하면, 이용된 하이드록시에틸 스타치의 평균 분자량은 1 내지 300 kD, 더 바람직하게는 2 내지 200 kD, 더욱더 바람직하게는 3 내지 100 kD, 더 바람직하게는 4 내지 70 kD이다.
약 130 kD의 평균 분자량을 지닌 HES의 예로는 Fresenius사 제품인 Voluven®이 있다. Voluven®은 예를 들어 혈량 저하증(hypovolaemia)의 치료 및 예방에 대한 치료적 지시에 사용되는 용적 치환을 위해 이용되는 인공 콜로이드이다. Voluven®의 특징은 평균 분자량 130,000 +/-20,000 D, 몰 치환 0.4, C2:C6비 약 9:1이다.
그러므로, 본 발명은 또한 하이드록시알킬 스타치가 4 내지 100 kD, 바람직하게는 4 내지 70 kD의 평균 분자량을 갖는 하이드록시에틸 스타치인 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
바람직한 평균분자량의 범위는 예를 들어, 4 내지 70 kD 또는 10 내지 70 kD 또는 12 내지 70 kD 또는 18 내지 70 kD 또는 50 내지 70 kD 또는 4 내지 50 kD 또는 10 내지 50 kD 또는 12 내지 50 kD 또는 18 내지 50 kD 또는 4 내지 18 kD 또는 10 내지 18 kD 또는 12 내지 18 kD 또는 4 내지 12 kD 또는 10 내지 12 kD 또는 4 내지 10 kD이 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 의하면, 이용된 하이드록시에틸 스타치의 평균분자량은 약 10 kD, 또는 9 내지 10 kD 또는 10 내지 11 kD 또는 9 내지 11 kD, 또는 약 12 kD, 또는 11 내지 12 kD 또는 12 내지 13 kD 또는 11 내지 13 kD 또는 약 18 kD, 또는 17 내지 18 kD 또는 18 내지 19 kD 또는 17 내지 19 kD 또는 약 30 kD, 또는 29 내지 30 kD 또는 30 내지 31 kD의 범위, 약 50 kD, 또는 49 내지 50 kD 또는 50 내지 51 kD 등의 4 kD 이상 및 70 kD 이하일 수 있다.
몰 치환도(DS)의 상한에 대해서, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0 등의 3.0까지의 값도 가능하고, 2.0 이하의 값 바람직며, 1.5이하의 값이 더욱 바람직하고, 0.7, 0.8 또는 0.9 등의 1.0 이하의 값이 더욱더 바람직하다.
따라서, 몰 치환도의 바람직한 범위는 0.1 내지 2 또는 0.1 내지 1.5 또는 0.1 내지 1.0 또는 0.1 내지 0.9 또는 0.1 내지 0.8이다. 몰 치환도의 더욱 바람직한 범위는 0.2 내지 2 또는 0.2 내지 1.5 또는 0.2 내지 1.0 또는 0.2 내지 0.9 또는 0.2 내지 0.8이다. 몰 치환도의 더욱더 바람직한 범위는 0.3 내지 2 또는 0.3 내지 1.5 또는 0.3 내지 1.0 또는 0.3 내지 0.9 또는 0.3 내지 0.8이다. 몰 치환도의 더더욱 바람직한 범위는 0.4 내지 2 또는 0.4 내지 1.5 또는 0.4 내지 1.0 또는 0.4 내지 0.9 또는 0.4 내지 0.8이다.
치환도(DS)에 관해서는, DS는 바람직하게는 적어도 0.1, 더욱 바람직하게는 적어도 0.2, 더욱더 바람직하게는 적어도 0.4이다. 바람직한 DS의 범위는 0.1 내지 0.8, 더 바람직하게는 0.2 내지 0.8, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 0.8, 더욱더 바람직하게는 0.4 내지 0.8, 더더욱 바람직하게는 0.4 내지 0.7, 가장 바람직하게는 0.2 내지 0.7, 더 바람직하게는 0.3 내지 0.7, 더욱더 바람직하게는 0.4 내지 0.7이다. 특히 바람직한 DS 값은 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8이고, 더 바람직하게는 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8이며, 더욱 바람직하게는 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8이고, 더욱더 바람직하게는 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8이고, 예를 들어, 0.4 및 0.7이 특히 바람직하다.
본 발명의 명세서에 있어서, 0.8과 같은 주어진 값의 치환도는 정확한 값일 수 있거나 또는 0.75 내지 0.84의 범위인 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 주어진 값 0.1은 정확한 값 0.1일 수 있거나 또는 0.05 내지 0.14의 범위일 수 있고, 주어진 값 0.4는 정확한 값 0.4일 수 있거나 또는 0.35 내지 0.44의 범위일 수 있고, 또는 주어진 값 0.7은 정확한 값 0.7일 수 있거나 또는 0.65 내지 0.74의 범위일 수 있다.
하이드록시알킬 스타치, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치의 분자량 및 치환도 DS의 특히 바람직한 조합은 예를 들어, 10 kD 및 0.4; 또는 lO kD 및 0.7; 또는 12 kD 및 0.4; 또는 12 kD 및 0.7; 또는 18 kD 및 0.4; 또는 18 kD 및 0.7; 또는 30 kD 및 0.4; 또는 30 kD 및 0.7; 또는 50 kD 및 0.4; 또는 50 kD 및 0.7; 또는 100 kD 및 0.7이다.
C2:C6 치환 비율에 관해서, 상기 치환은 바람직하게는 2 내지 20, 더 바람직하게는 2 내지 15, 더욱더 바람직하게는 3 내지 12이다.
본 발명의 추가의 구체예에 의하면, 하이드록시에틸 스타치의 혼합물은 또한 다른 평균분자량 및/또는 다른 치환도 및/또는 다른 C2:C6 치환 비율을 가진 것을 이용할 수 있다. 그러므로 하이드록시에틸 스타치의 혼합물은 다른 평균분자량 및 다른 치환도 및 다른 C2:C6 치환 비율을 가진 것을 적용하거나, 다른 평균분자량 및 다른 치환도 및 같거나 유사한 C2:C6 치환 비율을 가진 것을 적용하거나, 다른 수평균분자량 및 같거나 유사한 치환 정도 및 다른 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 같거나 유사한 평균분자량 및 다른 치환도 및 다른 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 다른 평균분자량 및 같거나 유사한 치환도 및 같거나 유사한 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 같거나 유사한 평균분자량 및 다른 치환도 및 같거나 유사한 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 같거나 유사한 평균분자량 및 같거나 유사한 치환도 및 다른 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용하거나, 대략 같은 평균분자량 및 대략 같은 치환 정도 및 대략 같은 C2:C6 치환의 비율을 가진 것을 적용할 수 있다.
본 발명에 의한 다른 컨쥬게이트 및/또는 다른 방법에서, 다른 하이드록시 스타치, 바람직하게는 다른 하이드록시에틸 스타치 및/또는 다른 하이드록시알킬 스타치 혼합물, 바람직하게는 다른 하이드록시에틸 스타치 혼합물이 적용될 수 있다.
본 발명의 일구체예에 따르면, 단백질의 작용기 Z는 알데하이드기 또는 케토기이다. 그러므로, 본 발명은 단백질의 작용기 Z가 알데하이드기 또는 케토기인 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
단백질 내의 알데하이드 또는 케토기의 위치는 일반적으로 제한되지 않지만, 본 발명의 바람직한 하나의 구체예에 의하면, 알데하이드 또는 케토기는 단백질의 탄수화물 측쇄에 위치한다. 그러므로 본 명세서의 구체예에서, 글리코실화된 단백질이 적용된다.
글리코실화된 단백질로서는, 천연의 인간 IFN 베타 또는 IFN 베타 Ia 등의 IFN 베타, N- 및 O-글리칸의 양쪽 모두를 함유하는 천연의 또는 진핵세포 유래의 hGM-CSF, 4개의 N-글리코실화 부위를 함유하는 2-사슬 당단백질인 재조합 인간 활성화 단백질 C(rhAPC), 아미노산 Asnl l7, Asnl84 및 Asn448에서 N-결합 올리고당을 지닌 I형 tPA 또는 Asnl l7 및 Asn 448에서 글리코실화되어 있는 II형 tPA 등의 인간 tPA (htPA) 또는 재조합 인간 tPA(rhtPA), 혈장 유래 A1AT 또는 재조합 인간 A1AT(pdA1AT 또는 rhAl AT), 재조합 인간 AT III(rhAT III), 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX 등의 글리코실화 형태가 바람직하다.
IFN 베타, AT III 및 GM-CSF의 글리코실화된 형태가 특히 바람직하다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "글리코실화 단백질", 즉, "탄수화물 측쇄"란 하이드록시알데하이드 또는 하이드록시케톤 및 그의 화학적 변형체 등의 탄수화물 부분을 포함하는 단백질을 의미한다(Rompp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Germany, 9th edition 1990, Volume 9, pages 2281-2285 및 여기에서 인용된 참고 문헌 참고). 또한, 갈락토오스, N-아세틸네우람산 및 N-아세틸갈락토오스아민 등과 같은 천연적으로 발생하는 탄수화물 부분의 유도체도 의미한다.
더 바람직한 구체예에서, 알데하이드기 또는 케토기는 탄수화물 측쇄의 갈락토오스 잔기의 일부분이다. 이 갈락토오스 잔기를 이용해서 이하에서 설명하는 바와 같이 말단 시알산을 제거한 후, 산화시켜 폴리머 또는 폴리머 유도체에 포함된 작용기 A와 반응시킬 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 작용기 A를 포함하는 폴리머 또는 폴리머 유도체는 탄수화물 측쇄의 시알산 잔기, 바람직하게는 탄수화물 측쇄의 말단 시알 산 잔기에 결합된다.
말단 탄수화물 부분의 산화는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다.
폴리펩티드의 탄수화물 부분의 화학적 산화 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 과옥산염의 처리를 포함한다(Chamow, 1992, J. Biol . Chem., 267, 15916-15922).
화학적 산화에 의해, 말단에 위치되거나 말단에 위치되지 않은 어떤 탄수화물 부분을 산화시키는 것이 원칙적으로 가능하다. 그러나, 온화한 반응 조건을 선택하여, 탄수화물 측쇄의 말단 시알산을 산화시켜 알데하이드기 또는 케토기를 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 온화한 반응 조건은 과옥소산염 농도가 바람직하게는 1 내지 50 mM, 더 바람직하게는 1 내지 25 mM, 특히 바람직하게는 약 1 mM과 같은 1 내지 10 mM 인 적당한 과옥소산염 수용액과 단백질을 바람직하게는 0 내지 40℃, 특히 바람직하게는 약 0℃와 같은 0 내지 21℃인 반응 온도에서, 바람직하게는 5 분 내지 5 시간, 특히 바람직하게는 10 분 내지 2 시간, 특히 바람직하게는 약 1시간과 같은 10분 내지 1 시간의 반응 시간으로 반응시키는 것을 의미한다. 바람직한 과옥소산염:단백질의 몰 비율은 1:200 내지 1:1이고 더 바람직하게는 약 15:1과 같은 1:50 내지 1:5이다.
그러므로, 본 발명은 또한 단백질 및 폴리머 또는 폴리머 유도체의 반응 전에, 글리코실화된 단백질을 과옥소산염 용액과 반응시켜 산화된 탄수화물 측쇄에 위치한 알데하이드기 또는 케토기를 지닌 단백질을 제공하는 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 명세서에서 이용되고 있는 바와 같은 용어 "온화한 반응조건"이란 예를 들어 10mM 과옥소산염 용액, 20 내지 25℃의 반응온도 등의 엄한 조건에 대해서 1mM 과옥소산염 용액, 0℃의 반응온도를 의미한다.
대안적으로, 탄수화물 측쇄는 효소적으로 산화될 수 있다. 각 탄수화물 측쇄의 산화에 대한 효소는 당업계에 공지되었으며, 예를 들어, 갈락토오스의 경우, 효소는 갈락토오스 산화효소이다. 말단의 갈락토오스 부분을 산화시키려는 의도인 경우, 만약 폴리펩티드가 탄수화물 쇄에 시알산을 부착시키는 능력을 지닌 세포내에서, 예를 들어, 포유류 세포 또는 탄수화물 쇄에 시알산을 부착시킬 수 있도록 유전적으로 변형된 세포 내에서 생산되었다면, 결과적으로 말단의 시알산을 (부분적으로 혹은 완전히) 제거할 필요가 있을 것이다. 시알산의 제거에 대한 화학적 또는 효소적 방법은 당업계에 공지되어 있다[Chaplin 및 Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, 특히 Chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, pages 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)].
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 알데하이드기 또는 케토기는 단백질의 N 말단에 위치할 수 있고, 알맞은 산화에 의해 얻기 쉽다. 하이드록시기-함유 아미노산이 트레오닌 또는 세린처럼 단백질의 N 말단의 위치 -1에 존재하는 경우, 상기 N-말단 아미노산의 산화는 상기 케토기 또는 알데하이드기, 바람직하게는 알데하이드기에서 수행될 수 있다. 적당한 N-말단 아미노산의 화학적 산화 방법으로서, 상정가능한 어떠한 방법이라도 적용될 수 있고, 이에는 과옥소산염에의한 산화가 바람직하고, 또한 온화한 산화조건이 특히 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 의하면, 상기 온화한 반응 조건은 과옥소산염 농도가 바람직하게는 1 내지 50 mM, 더 바람직하게는 1 내지 25 mM, 특히 바람직하게는 약 1 mM과 같은 1 내지 10 mM 인 적당한 과옥소산염 수용액과 단백질을 바람직하게는 0 내지 40℃, 특히 바람직하게는 약 0℃와 같은 0 내지 21℃인 반응 온도에서, 바람직하게는 5 분 내지 5 시간, 더 바람직하게는 10 분 내지 2 시간, 가장 바람직하게는 약 1시간과 같은 10분 내지 1 시간의 반응 시간으로 반응시키는 것을 의미한다. 바람직한 과옥소산염:단백질의 몰 비율은 1:200 내지 1:1이고 더 바람직하게는 약 15:1과 같은 1:50 내지 1:5이다.
그러므로, 본 발명은 또한 알데하이드기 또는 케토기가 단백질의 탄수화물 측쇄 및/또는 단백질의 N-말단기에 위치하는 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 번역 후 글리코실화된 진핵 세포에서 생산된 단백질의 올리고당 패턴은 인간에서 유래된 단백질과 동일하지 않다. 게다가, 많은 글리코실화된 단백질은 갈락토오스 잔기와 같은 또 다른 탄수화물 부분을 은폐하는 바람직한 개수의 말단 시알산 잔기를 가지지 않는다. 그러나, 갈락토오스 잔기와 같은 이들 또 다른 탄수화물 부분은 만약 은폐되어 있지 않았다면, 약으로서 단백질의 가능한 용도에 있어서 단백질의 더 짧은 혈장내 반감기와 같은 불이익을 초래할 수 있다. 예를 들어 이하에서 개시된 것과 같은 옥심 결합을 통해, 단백질의 탄수화물 측쇄의 탄수화물 부분에 직접 또는 하나 또는 두 개의 링커 화합물과 같은 적어도 하나의 링커 화합물을 통해 공유결합으로 연결된 하이드록시알킬 스타치 폴리머, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 폴리머에 의해 형성된 단백질 컨쥬게이트를 제공하여, 적어도 상기 언급된 불이익을 극복할 수 있다는 것을 본 발명자들은 발견하였다. 그래서, 하이드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체를 적어도 하나의 글리코실화된 단백질의 탄수화물 측쇄에 커플링시킴으로써, 탄수화물 측쇄에 위치한 적당한 말단 탄수화물 잔기의 결여가 보상되는 것으로 여겨진다. 본 발명의 다른 측면에 의하면, 전술한 바와 같이 산화된 탄수화물 부분과 커플링된 하이드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체는 상기 불이익을 보상할 뿐만 아니라, 각각 천연적으로 발생하는 단백질보다 바람직한 용도면에 있어서, 더 나은 특성을 가진 단백질 컨쥬게이트를 제공한다. 그러므로, 본 발명에 따른 각각의 컨쥬게이트는 상보적이고, 심지어 단백질에 대한 상승 효과도 가진다. 인간 단백질과 동일하거나 인간 단백질인 단백질도 천연적으로 발생하는 탄수화물 부분에서 시알산 잔기와 같은 원하는 개수의 적당히 은폐된 말단 탄수화물 잔기를 갖지 않는다. 이들 경우에 있어서, 전술한 바와 같이 산화된 탄수화물 부분과 커플링된 하이드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체와의 각각의 컨쥬게이트의 제공은 인공적으로 합성된 단백질의 불이익을 극복하고 보상할 뿐만 아니라, 천연적으로 발생한 단백질의 특성을 향상시킨다. 단백질의 산화된 탄수화물 부분의 알데하이드기 또는 케토기와 커플링되는 하이드록시알킬 스타치 폴리머 또는 그의 유도체, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 폴리머 또는 그의 유도체의 작용기에 대해, 참고문헌은 작용기 A를 이하에서 개시된 바로 제조한다. 이 일반적인 개념은 글리코실화된 G-CSF에 적용가능할 뿐만 아니라, 말단의 탄수화물 잔기의 상기 결여를 지닌 모든 글리코실화된 단백질에 원칙적으로 적용될 수 있다. 특히, 적혈구생성인자(EPO), 인터페론 베타 1a (IFN 베타 la), ATIII, 인자 VIII, 알파1-항트립신(A1AT), htPA, 또는 GM-CSF 등이 언급될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 적어도 하나의 케토 또는 알데하이드기를 지닌 단백질의 적어도 하나의 산화된 탄수화물 부분에 대해 상기 스타치 또는 그의 유도체와 공유적으로 커플링시켜, 자연적으로 발생하거나 번역 후 부착된 단백질의 탄수화물 부분 중 말단 탄수화물 잔기, 바람직하게는 시알산 잔기의 결여를 보상하기 위한 하이드록시알킬 스타치, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 또는 그의 유도체의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 케토 또는 알데하이드기를 지닌 단백질의 적어도 하나의 산화된 탄수화물 부분에 대해 하이드록시알킬 스타치, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 또는 그의 유도체와 공유적으로 커플링시켜, 바람직하게는 옥심 결합을 통해, 자연적으로 발생하거나 번역 후에 부착된 단백질의 탄수화물 부분 중 말단 탄수화물 잔기, 바람직하게는 시알산 잔기의 결여를 보상하기 위한 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 케토 또는 알데하이드기를 지닌 단백질의 적어도 하나의 산화된 탄수화물 부분에 대해 하이드록시알킬 스타치, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 또는 그의 유도체와 공유적으로 커플링시켜 형성된 컨쥬게이트에 관련된 것이며, 상기 단백질은 천연 공급원에서 분리되거나 포유류, 곤충 또는 효모 세포와 같은 진핵 세포에서 발현되어 생산되며, 컨쥬게이트는 원하는 용도, 바람직하게는 의약 용도 면에서, 각각의 미변성된 단백질과 동일하거나 더 나은 특성을 갖는 것을 특징으로 한다.
단백질의 작용기 Z가 알데하이드기 또는 케토기인 경우, 폴리머 또는 그의 유도체의 작용기 A는 구조 -NH-에 따른 아미노기를 포함한다.
그러므로, 본 발명은 임의로 산화된 환원성 폴리머 말단과 반응할 수 있는 작용기 A가 구조 -NH-에 따른 아미노산을 포함하는 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관련된 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 구체예에 따르면, 이 작용기 A는 구조 R'-NH-를 지닌 기이고, 여기에서 R'은 수소, 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기이며, 이때, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 NH기와 직접 결합될 수 있거나, 다른 구체예에 따르면, NH기에 산소 결합으로 결합될 수 있다. 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴, 또는 사이클로알킬아릴 잔기가 적절히 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로서, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시기이고, 수소, 및 무치환된 알킬 및 알콕시기가 보다 더욱 바람직하다.
알킬 및 알콕시기 가운데, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 C 원자를 가진 기가 바람직하다. 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로폭시기가 더욱 바람직하다. 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시가 특히 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 메틸 또는 메톡시이다.
따라서, 본 발명은 또한 R'이 수소, 또는 메틸 또는 메톡시기인 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 A는 구조 R'-NH-R"를 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH- 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 포함하며, 이때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조단위 -SO2-를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 R"는 하기 기로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00002
상기 식 중, G가 2가지로 존재한다면, 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 아미노기 -NH2를 포함하는 바람직한 작용기 A로는 예를 들어, 하기 구조식을 들 수 있다:
Figure 112006072272527-PCT00003
상기 식중, G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이다.
아미노기를 포함하는 특히 바람직한 작용기 A는 이하의 아미노옥시기이고:
Figure 112006072272527-PCT00004
H2N-O-가 특별히 바람직하고, 하기 히드라지도기도 바람직하다:
Figure 112006072272527-PCT00005
상기 식 중, G는 바람직하게는 O이다.
따라서, 본 발명은 또한 단백질의 작용기 Z는 알데하이드기 또는 케토기이고, 작용기 A는 아미노옥시기 또는 히드라지도기인 전술한 바와 같은 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, A는 아미노옥시기이다.
폴리머 또는 폴리머 유도체의 아미노옥시기를 단백질의 알데하이드기 또는 케토기와 반응시키면, 옥심 결합이 형성된다.
따라서, 본 발명은 단백질과 폴리머 또는 폴리머 유도체 간의 공유 결합은 단백질의 작용기 Z와 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용기 A와의 반응에 의해 형성되는 옥심 결합이고, 상기 작용기 Z는 알데하이드기 또는 케토기이며, 상기 작용기 A는 아미노옥시기인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다.
폴리머 또는 폴리머 유도체의 히드라지도기를 단백질의 알데하이드기 또는 케토기와 반응시키면, 히드라존 결합이 형성된다.
따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질과 폴리머 또는 폴리머 유도체 간의 공유 결합은 단백질의 작용기 Z와 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용기 A와의 반응에 의해 형성된 히드라존 결합이고, 이때 상기 작용기 Z는 알데하이드기 또는 케토기이며, 상기 작용기 A는 히드라지도기이다.
작용기 A를 폴리머에 도입하기 위해서, 폴리머 유도체가 작용기 A를 포함하도록 하는 데는 특이적 제한이 존재하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 A는 폴리머를 적어도 이작용성 화합물과 반응시킴으로써 폴리머에 도입되며, 여기에서 하나의 작용기는 폴리머의 적어도 하나의 작용기와 반응할 수 있고, 적어도 이작용성 화합물의 적어도 하나의 다른 작용기는 작용기 A이거나 화학적으로 변성되어 작용기 A를 부여할 수 있는 것이다.
더욱 추가적 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머가 그의 임의로 산화된 환원성 말단에서 적어도 이작용성 화합물과 반응한다.
폴리머가 그것의 비산화된 환원성 말단과 반응하는 경우, 폴리머는 바람직하게는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다:
Figure 112006072272527-PCT00006
화학식 (I) 중, 비산화된 환원성 말단의 알데하이드 형태가 포함된다.
폴리머가 그의 산화된 환원성 말단과 반응하는 경우, 폴리머는 바람직하게는 이하의 화학식(IIa) 및/또는 화학식(IIb)에 따른 구조를 갖는다:
Figure 112006072272527-PCT00007
Figure 112006072272527-PCT00008
폴리머, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치의 환원성 말단의 산화가 상기 언급된 구조 (IIa) 및/또는 (IIb)를 갖는 화합물을 제조하는 각 방법 또는 방법의 결합에 따라 수행될 수 있다.
산화가 모든 적절한 방법 또는 하이드록시알킬 스타치의 산화된 환원성 말단을 제공하는 방법에 따라 수행될 수 있지만, 예를 들어, 본원의 참고문헌으로 포함되는 DE 196 28 705 Al (제 9 컬럼의 6 내지 24행의 실시예 A)에 기재된 바와 같은 알칼리성 요오드 용액을 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 적어도 이작용성 화합물의 작용기로서, 각 작용기는 하이드록시알킬 스타치의 임의로 산화된 환원성 말단과 화학적 결합을 형성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 이 작용기는 화학 구조 -NH-를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 적어도 이작용성 화합물의 작용기, 즉 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 결합할 수 있는 상기 작용기는 구조 -NH-를 포함하는 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물의 이 작용기는 구조 R'-NH-를 갖는 기로, 여기에서 R'은 수소 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기이고, 이때 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 NH기에 직접 결합될 수 있거나, 또는 다른 구체예에 따르면, NH기에 산소 결합으로 결합될 수 있다. 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴, 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로서, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시기이고, 보다 더 바람직하게는 수소 및 비치환된 알킬 및 알콕시기이다.
알킬 및 알콕시기 중에서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 C 원자를 가진 기가 바람직하다. 더 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로폭시기이다. 특히 바람직하게는 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시이고, 메틸 또는 메톡시가 더욱 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 R'가 수소 또는 메틸 또는 메톡시기인 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물의 작용기가 구조 R'-NH-R"-을 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH- 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 가지며, 이때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조 단위 -S02-이다. 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 R"는 하기 기로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00009
상기 식 중, G가 2가지로 존재할 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한 적어도 이작용성 화합물의 작용기, 즉 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 상기 작용기가 하기 기로부터 선택되는 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00010
상기 식 중, G는 O 또는 S이고, 만일 2가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이고, R'는 메틸이다.
본 발명의 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물의 작용기, 즉 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있고 아미노기를 포함하는 상기 작용기는 하기 아미노옥시기이고:
Figure 112006072272527-PCT00011
H2N-O-가 특별히 바람직하고, 또는 하기 히드라지도기가 바람직하다:
Figure 112006072272527-PCT00012
상기 식 중, G는 바람직하게는 O이다.
따라서, 본 발명은 또한 단백질의 작용기 Z는 알데하이드기 또는 케토기이고, 적어도 이작용성 화합물의 작용기인, 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 상기 작용기는 아미노옥시기 또는 히드라지도기이며, 바람직하게는 아미노옥시기인 전술한 바와 같은 방법에 관한 것이다
그러므로, 본 발명은 또한 단백질의 작용기 Z는 알데하이드기 또는 케토기이고, 적어도 이작용성 화합물의 작용기인, 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 상기 작용기는 아미노옥시기 또는 히드라지도기이며, 바람직하게는 아미노옥시기인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물은 비산화된 환원성 말단에서 폴리머와 반응한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응하는 적어도 이작용성 화합물은 작용기 A를 포함한다.
적어도 이작용성 화합물은 우선 폴리머와 반응하여 폴리머 유도체를 제조하고, 그 후에 작용기 A를 통하여 단백질과 반응한다. 또한 적어도 이작용성 화합물은 우선 작용기 A를 통하여 단백질과 반응하여 단백질 유도체를 제조하고, 그 후에 단백질 유도체에 포함된 적어도 이작용성 화합물의 작용기 잔기의 적어도 하나를 통하여 폴리머와 반응할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물은 우선 폴리머와 반응한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, 상기 방법은 A를 포함하는 폴리머 유도체와 Z를 포함하는 단백질이 반응하기 전에, 폴리머가 비산화된 환원성 말단에서 폴리머의 비산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 작용기 및 기 A를 포함하는 적어도 이작용성의 연결용 화합물과 반응하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 명세서에서 이용되고 있는 바와 같은 용어 "폴리머(또는 HAS)가 환원성 말단을 통하여 반응하는" 또는 "폴리머(또는 HAS)가 선택적으로 산화된 환원성 말단을 통하여 반응하는"이란 폴리머(또는 HAS)가 그의 (선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 주로 반응하는 프로세스를 의미한다.
상기 표현 "그의 (선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 주로"란, 폴리머(또는 HAS) 분자당 적어도 하나의 (선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 주어진 반응에 이용되는 하이드록시알킬 스타치 분자의 통계학적으로 50 % 이상, 바람직하게는 적어도 55 %, 더욱 바람직하게는 적어도 60 %, 더욱 바람직하게는 적어도 65 %, 더욱 바람직하게는 적어도 70 %, 더욱 바람직하게는 적어도 75 %, 더욱 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 85 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 더더욱 바람직하게는 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 등의 적어도 95 % 가 반응하는 프로세스를 의미하며, 여기서, 적어도 하나의 환원성 말단을 통하여 반응되는 주어진 폴리머(또는 HAS) 분자는 상기 폴리머(또는 HAS) 분자에 포함되지만 환원성 말단이 아닌 적어도 하나의 또 다른 적당한 작용기를 통하여 동일한 주어진 반응에서 반응할 수 있다. 1개 이상의 폴리머(또는 HAS) 분자(들)이 이(이들) 폴리머(또는 HAS) 분자(들)에 포함되지만 환원성 말단이 아닌 적어도 하나의 또 다른 적당한 작용기를 통하여 동시에 적어도 1개의 환원성 말단을 통하여 반응할 경우, 이들 폴리머(또는 HAS) 분자들의 모든 반응되는 작용기(이들 작용기는 환원성 말단을 포함함)의 통계학적으로 바람직하게는 50 % 이상, 바람직하게는 적어도 55 %, 더욱 바람직하게는 적어도 60 %, 더욱 바람직하게는 적어도 65 %, 더욱 바람직하게는 적어도 70 %, 더욱 바람직하게는 적어도 75 %, 더욱 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 85 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, and still 더욱 바람직하게는 적어도 95 % such as 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 등과 같이 적어도 95%는 환원성 말단이다.
본 발명의 명세서에서 이용되고 있는 바와 같은 용어 "환원성 말단"이란 알데하이드기로서 및/또는 대응하는 아세탈 형태로서 존재할 수 있는 폴리머(또는 HAS) 분자의 말단 알데하이드기에 관한 것이다. 환원성 말단이 산화될 경우, 알데하이드 또는 아세탈기는 카복시기 및/또는 대응하는 락톤의 형태이다.
폴리머와 반응하는 적어도 이작용성의 연결용 화합물의 작용기, 및 단백질의 작용기 Z와 반응하는 적어도 이작용성의 연결용 화합물의 작용기 A는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 특히, 스페이서는 임의로 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식의 탄화수소 잔기일 수 있다. 일반적으로, 탄화수소 잔기는 탄소원자를 60개까지, 바람직하게는 40까지, 더욱 바람직하게는 20개까지, 더욱더 바람직하게는 10개까지, 더더욱 바람직하게는 6개까지, 특히 바람직하게는 4개까지 지닌다. 헤테로원자가 존재할 경우, 분리 기(separating group)는 일반적으로 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 더욱 바람직하게는 1 내지 6개, 더더욱 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로원자로서는 O가 바람직하다. 탄화수소 잔기는 예를 들어 5 내지 7개의 탄소원자를 지닌 임의로 분기된 알킬 사슬 또는 아릴기 또는 사이클로알킬기를 포함할 수 있고, 또는 아르알킬기이고, 이 아르알킬기의 알킬 부분은 직쇄 및/또는 환식 알킬기일 수 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에 의하면, 작용기는 탄소원자를 4개 지닌 직쇄형 탄화수소 사슬에 의해 분리된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 의하면, 작용기는 4개의 탄소원자와, 적어도 하나, 바람직하게는 하나의 헤테로원자, 특히 바람직하게는 산소원자에 의해 분리된다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성의 연결용 화합물은 동종 이작용성(homobifunctional) 연결용 화합물이다. 따라서, 본 발명은 또한 전술한 바와 같은 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 적어도 이작용성의 연결용 화합물은 동종 이작용성 화합물이다.
따라서, 연결용 화합물의 상기 언급된 바람직한 작용기에 관하여, 상기 동종 이작용성의 연결용 화합물은 바람직하게는 두 개의 아미노옥시기 H2N-O- 또는 두 개의 아미노옥시기 R'-O-NH- 또는 두 개의 히드라지도기 H2N-NH-(C=G)- 중 하나를 포함하고, 여기에서 상기 아미노옥시기 H2N-O- 및 히드라지도기 H2N-NH-(C=O)-가 바람직하며, 아미노옥시기 H2N-O-가 특히 바람직하다.
두 개의 히드라지도기 H2N-NH-(C=O)-를 포함하는 모든 상정가능한 동종 이작용성 화합물 가운데, 히드라지드가 바람직하고, 여기에서 두 개의 히드라지도기가 탄소 원자를 60개까지, 바람직하게는 40개까지, 더 바람직하게는 20개까지, 더 바람직하게는 10개까지, 더 바람직하게는 6개까지, 특히 바람직하게는 4개까지 갖는 탄수화물 잔기에 의해 분리된다. 더 바람직하게는, 탄수화물 잔기는 탄소 원자수 1, 2, 3, 또는 4와 같이 탄소 원자수가 1 내지 4이다. 가장 바람직하게는, 탄수화물 잔기의 탄소 원자수는 4이다. 따라서, 하기 화학식에 따른 동종 이작용성 화합물이 바람직하다:
Figure 112006072272527-PCT00013
2개의 히드라지도기 H2N-NH-(C=O)-를 포함하는 화합물과 반응하는 상기 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치는, 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치이다. 또 가능한 것으로는, 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에 의하면, 이작용성의 연결용 화합물은 하기의 카보히드라지드이다:
Figure 112006072272527-PCT00014
단백질의 알데하이드기 또는 케토기가 카보히드라지드기와 반응하는 상기 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치는, 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치이다. 또 가능한 것으로는, 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 또한 적어도 이작용성의 연결용 화합물이 동종 이작용성 화합물이고, 두 개의 아미노옥시기를 포함하는 전술한 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 적어도 이작용성의 연결용 화합물은 동종 이작용성 화합물이고 두 개의 아미노옥시기 H2N-O-를 포함하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
상기 기재된 바와 같이, 폴리머는 바람직하게는 이작용성의 연결용 화합물과 반응하기 전에 산화되지 않은 그의 환원성 말단에서 반응한다. 따라서, 두 개의 아미노옥시기 H2N-O-를 포함하는 바람직한 동종 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응은 옥심 결합을 포함하는 폴리머 유도체를 형성한다.
따라서, 단백질의 작용기 Z는 바람직하게는 폴리머 유도체의 아미노옥시기와 반응하는 알데하이드 또는 케토기이기 때문에, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같이 컨쥬게이트에 관한 것으로, 상기 컨쥬게이트는 폴리머 및 단백질을 포함하고, 각각은 옥심 또는 환식 아미날(aminal) 결합에 의해 연결용 화합물에 공유 결합되고 있다.
두 개의 아미노옥시기 H2N-O-를 포함하는 모든 생각할 수 있는 동종 이작용성 화합물 가운데, 이작용성 화합물은 두 개의 아미노옥시기가 탄소 원자수를 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더 바람직하게는 1 내지 20개, 더 바람직하게는 1 내지 10개, 더 바람직하게는 1 내지 6개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개 지닌 탄수화물 잔기에 의해 분리되는 경우에 바람직하다. 더 바람직하게는, 탄수화물 잔기의 탄소 원자수는 1, 2, 3, 또는 4개와 같이 탄소 원자수가 1 내지 4개이다. 가장 바람직하게는, 탄수화물 잔기는 탄소 원자수가 4개이다. 보다 더 바람직하게는, 탄수화물 잔기는 적어도 하나의 헤테로 원자, 더 바람직하게는 하나의 헤테로 원자, 가장 바람직하게는 하나의 산소 원자를 가진다. 하기 화학식에 따른 화합물 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]하이드록실 아민이 특히 바람직하다:
Figure 112006072272527-PCT00015
따라서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같이 컨쥬게이트에 관한 것으로, 상기 컨쥬게이트는 하기 화학식에 따른 구조를 갖는다"
Figure 112006072272527-PCT00016
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00017
상기 식 중, HAS'는 바람직하게는 HES'이다. 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치는, 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
단백질의 알데하이드기 또는 케토기가 폴리머 또는 폴리머유도체의 하이드록시아미노기와 반응하는 상기 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치는 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
단백질로서는, 글리코실화 IFN 베타, 글리코실화 AT III 및 글리코실화 GM-CSF가 특히 바람직하다. 따라서, 하이드록시알킬 스타치가 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치인 경우, 본 발명은 다음과 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00018
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00019
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00020
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00021
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00022
및/또는
HES'는 특히 바람직하게는, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 및/또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 및/또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 및/또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 및/또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
특히 상기 연결용 화합물이 두 개의 아미노옥시기 H2N-O-를 포함하는 동종 이작용성의 연결용 화합물인 경우, 비산화된 환원성 말단에서 폴리머의 연결용 화합물과의 반응은 바람직하게는 수계에서 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "수계"란 내포된 용매의 중량을 기준으로 해서, 물을 적어도 10 중량% 범위, 바람직하게는 적어도 50 중량%, 더 바람직하게는 적어도 80 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90 중량% 또는 100 중량%까지 포함하는 용매 또는 용매의 혼합물을 의미한다. 바람직한 반응 매질은 물이다.
다른 구체예에 따르면, 적어도 하나의 다른 용매는 HAS, 바람직하게는 HES가 가용성인 것을 사용할 수 있다. 이들 용매의 예는 예를 들어, DMF, 디메틸아세트아마이드 또는 DMSO이다.
반응 동안 적용되는 온도에 관한 한, 원하는 폴리머 유도체를 제공하는 반응을 일으킨다면 특정 제한은 없다.
폴리머가 두 개의 아미노옥시기 H2N-O-, 바람직하게는 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]하이드록실 아민을 포함하는 동종 이작용성의 연결용 화합물과 반응하는 경우, 온도는 바람직하게는 5 내지 45 ℃ 범위, 더 바람직하게는 10 내지 30 ℃ 범위, 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃ 범위이다.
폴리머와 두 개의 아미노옥시기 H2N-O-, 바람직하게는 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]하이드록실 아민을 포함하는 동종 이작용성의 연결용 화합물과의 반응에서 반응 시간은, 특정 요구에 적합할 수 있고, 일반적으로 1 시간 내지 7 일 범위, 바람직하게는 1 시간 내지 3 일 범위, 더 바람직하게는 2 시간 내지 48 시간 범위이다.
상기 언급된 반응 상태의 특정 예는 예를 들어 반응온도 약 25 ℃, pH 약 5.5이다.
반응 혼합물의 적절한 pH 값은 적어도 하나의 적절한 버퍼를 첨가하여 조절될 수 있다. 바람직한 버퍼 중에, 아세트산 나트륨 버퍼, 인산 또는 붕산 버퍼가 언급될 수 있다.
폴리머 및 거기에 연결되는 이작용성의 연결용 화합물을 포함하는 폴리머 유도체가 일단 형성되면, 그것은 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 분리되기 전에 침전될 수 있다.
폴리머 유도체가 우선 침전되면, 예를 들어, 반응 혼합물을 적절한 온도에서 반응 혼합물에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물, 예를 들면 아세톤/에탄올 혼합물과, -20℃ 내지 50℃ 도는 0℃ 내지 25℃ 등의 적절한 온도에서 접촉시키는 것이 가능하다. 수성 매질, 바람직하게는 물이 용매로서 사용되는 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃ 범위, 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃ 범위의 온도에서, 2-프로판올과 접촉시킨다.
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머 유도체는 첫째로 원심분리 또는 여과와 같은 적절한 방법에 의해 반응 혼합물 또는 예를 들어, 수성 2-프로판올 혼합물을 가진 반응 혼합물의 혼합물에서 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 등의 더욱 추가적 처치를 가할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 분리된 폴리머 유도체는 첫째로 바람직하게는 물에 대해서 투석되고, 그 후, 생성물의 원하는 사양에 따라 반응 생성물의 용매 함량이 충분히 낮을 때까지 냉동건조시킨다. 냉동건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
이와 같이 해서 분리된 폴리머 유도체는 단백질의 작용기 Z와, 작용기 A를 통하여 더욱 반응하고, 여기에서 Z는 알데하이드기 또는 케토기이다. A가 아미노옥시기 H2N-O-이어서 폴리머 유도체와 단백질 간에 옥심 결합을 형성하는 특히 바람직한 경우에, 반응은 바람직하게는 수성 매질, 바람직하게는 물 중에서, 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 4 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃의 바람직한 온도에서 수행된다. 반응 매질의 pH 값은 바람직하게는 4 내지 10, 더 바람직하게는 5 내지 9, 특히 바람직하게는 5 내지 7 범위이다. 반응 시간은 바람직하게는 1 내지 72 시간, 더 바람직하게는 1 내지 48 시간, 특히 바람직하게는 4 내지 24 시간의 범위이다.
컨쥬게이트에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 등의 추가적 처치를 가할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 단백질의 작용기 Z는 아미노기이고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 단백질의 작용기 Z는 아미노기이고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 아미노기인 작용기 Z와 반응된는 작용기 A는 반응성 카복시기이다. 따라서, 본 발명은 또한 작용기 Z가 아미노기이고, 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용기 A는 반응성 카복시기인 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 첫번째 바람직한 구체예에 따르면, 반응성 카복시기는 그의 환원성 말단에서 폴리머를 선택적으로 산화시켜 폴리머에 도입된다.
따라서, 반응성 카복시기가 도입되는 폴리머는 바람직하게는 하기 화학식(IIa) 및/또는 화학식 (IIb)에 따른 구조를 가진다:
Figure 112006072272527-PCT00024
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00025
.
하기 화학식(I)에 따른 폴리머의 환원성 말단, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치의 산화는 상기 언급된 구조 (IIa) 및/또는 (IIb)를 갖는 화합물을 형성하는 각 방법 또는 방법의 결합에 따라 수행될 수 있다:
Figure 112006072272527-PCT00026
.
비록 산화가 모든 적절한 방법 또는 하이드록시알킬 스타치의 산화된 환원성 말단을 제공하는 방법에 따라 수행될 수 있지만, 예를 들어, 본원의 참고문헌으로 통합되어 개시된 DE 196 28 705 Al(제 9컬럼 6 내지 24행의 실시예 A 참조)에 기재된 알칼리성 요오드 용액을 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
반응성 카복시기를 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머에 도입하는 것은 모든 생각할 수 있는 방법에 의해 수행될 수 있다.
산화된 폴리머는 알칼리 금속염, 바람직하게는 나트륨 및/또는 칼륨염과 같은 염으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 방법에 따르면, 환원성 말단에서 선택적으로 산화되는 폴리머는 산화된 환원성 말단에서 적어도 하나의 알코올, 바람직하게는 적어도 하나의 산성 알코올과 반응한다. 더욱 바람직하게는 25 ℃에서, 6 내지 12, 더욱더 바람직하게는 7 내지 11 범위의 pKA 값을 갖는 산성 알콜이다. 산성 알코올의 분자량은 바람직하게는 80 내지 500 g/몰, 더 바람직하게는 90 내지 300g/몰, 특히 바람직하게는 100 내지 200 g/몰이다.
적절한 산성 알코올은 산성 프로톤을 갖는 모든 알코올 H-O-RA이고, 산화된 폴리머와 반응해서 바람직하게는 하기 화학식:
Figure 112006072272527-PCT00027
더욱 바람직하게는 하기 화학식:
Figure 112006072272527-PCT00028
에 따른 각각의 반응성 폴리머 에스테르를 제조할 수 있다.
바람직한 알코올은 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드 등의 N-하이드록시 숙신이미드; p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀 등의 적절히 치환된 페놀; 또는 하이드록시 벤조트리아졸 등의 하이드록시아졸이다. 특히 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드이고, 특히 N-하이드록시 숙신이미드 및 설포-N-하이드록시 숙신이미드가 바람직하다. 모든 알코올이 단독 또는 그의 둘 이상의 적절한 결합으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에서, 예를 들어 카르본산의 디에스테르를 가함으로써, 각각의 알코올을 방출하는 화합물을 이용하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명은 또한 환원성 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 폴리머를 산성 알코올과, 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드 및/또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 반응시킴으로써 활성화시키는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 환원성 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원성 말단에서 적어도 하나의 탄산 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC와 반응하고, 여기에서 RB 및 RC는 같거나 다를 수 있다. 바람직하게는, 이 방법은 하기 화학식에 따른 반응성 폴리머를 제공한다:
Figure 112006072272527-PCT00029
상기 식 중, HAS'는 바람직하게는 HES'이다.
적절한 탄산 디에스테르 화합물로서, 알코올 성분이 독립적으로 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 같은 N-하이드록시 숙신이미드류,p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 하이드록시 벤조트리아졸과 같은 하이드록시아졸인 화합물이 사용될 수 있다. 특히 바람직하게는 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이고, N,N'-디숙신이미딜 카보네이트가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 폴리머를 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시켜 활성화된다.
산성 알코올은 산성 알코올:폴리머의 몰비 바람직하게는 5:1 내지 50:1, 더 바람직하게는 8:1 내지 20:1이고, 바람직한 반응 온도 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 10 내지 30 ℃, 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃에서 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 반응시킨다. 반응 시간은 바람직하게는 1 내지 10 시간, 더 바람직하게는 2 내지 5 시간, 더 바람직하게는 2 내지 4 시간 및 특히 2 내지 3 시간 범위이다.
탄산 디에스테르 화합물은 디에스테르 화합물: 폴리머의 몰비 바람직하게는 1 : 1 내지 3: 1, 더 바람직하게는 1 : 1 내지 1.5 : 1에서, 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 반응한다. 반응 시간은 바람직하게는 0.1 내지 12 시간, 더 바람직하게는 0.2 내지 6 시간, 더 바람직하게는 0.5 내지 2 시간 및 특히 0.75 내지 1.25 시간이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 산화된 폴리머의 산성 알코올 및/또는 탄산 디에스테르와의 반응은 적어도 하나의 비양자성(aprotic) 용매에서, 특히 바람직하게는 0.5 중량 퍼센트 이하, 바람직하게는 0.1 중량 퍼센트 이하의 물 함량을 지닌 무수 비양자성 용매에서 수행된다. 특히 적절한 용매는 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다. 반응 온도는 바람직하게는 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 10 내지 30 ℃이다.
산화된 폴리머를 적어도 하나의 산성 알코올과 반응시키기 위해, 적어도 하나의 추가의 활성화제가 사용된다.
적절한 활성화제는 특히 카보닐디이미다졸, 디이소프로필 카보디이미드(DIC), 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 등의 카보디이미드이고, 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 환원성 말단에서 산화된 폴리머는 추가의 활성화제의 존재 하에서 산성 알코올과 반응하여 반응성 폴리머 에스테르를 제공하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 산화된 폴리머의 탄산 디에스테르 및/또는 산성 알코올과의 반응은 낮은 염기 활성에서 수행되며, 여기에서 저염기 활성은 반응 혼합물에 대한 물의 부피비가 10:1이 되도록 반응 혼합물을 물에 가하여 측정할 수 있다. 첨가에 앞서, 버퍼를 필수적으로 포함하지 않는 물은 25℃에서 pH 값이 7이다. 반응 혼합물의 첨가 후 및 pH 값을 측정함으로써, 반응 혼합물의 염기활성은 바람직하게는 9.0 이하, 더 바람직하게는 8.0 이하, 특히 바람직하게는 7.5 이하의 값을 지니도록 얻어진다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 산화된 폴리머는 EDC를 가지고 물이 없는 건조 DMA 중에서 N-하이드록시 숙신이미드와 반응하여, 하기 화학식에 따른 폴리머 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르를 선택적으로 제공한다:
Figure 112006072272527-PCT00030
상기 식 중, 더 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
놀랍게도, 이 반응은 HES의 OH기를 가진 EDC의 반응으로부터 부산물을 생성하지 않고, EDC에 의해 형성된 O-아실 아이소우레아 및 각각의 N-아실 우레아에 대한 산화된 폴리머의 재배열 반응이 놀랍게도 억제된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 산화된 폴리머는 무수 DMF 중에서, 활성화제 없이, N,N'-디숙신이미딜 카보네이트와 반응하여 하기 화학식에 따른 폴리머 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르를 선택적으로 제공한다:
Figure 112006072272527-PCT00031
상기 식 중, 더 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
상기 기재된 바와 같은 반응성 폴리머는 단백질의 적어도 하나의 아미노기와 주로 더욱 반응하여 아마이드 결합을 형성한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 반응성 폴리머는 단백질의 하나의 아미노기와 반응한다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식에 따른 구조를 가진 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00032
상기 식에서, 아마이드 결합의 N 원자는 더 바람직하게는 HAS'가 HES'인 단백질의 아미노기로부터 유래되고, 하이드록시에틸 스타치는 바람직하게는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
상기 아마아드 결합을 통해 하이드록시알킬 스타치, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치와 커플링된 특히 바람직한 단백질은 AT III이다. 따라서, 본 발명은 하기 식의 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00033
식 중, 아마이드 결합의 N 원자는 AT III로부터 유래되고, 여기서, HAS'는 HES'이고, 더욱 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치는 분자량 약 10 KD, DS값 약 0.4를 지닌다.
상기 아마아드 결합을 통해 하이드록시알킬 스타치, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치와 커플링된 특히 바람직한 단백질은 IFN 알파이다. 따라서, 본 발명은 하기 식의 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00034
식 중, 아마이드 결합의 N 원자는 IFN 알파로부터 유래되고, 여기서, HAS'는 HES'이고, 더욱 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치는 분자량 약 18 KD, DS값 약 0.8을 지닌다.
단백질의 아미노기가 폴리머 또는 폴리머 유도체의 반응성 카복시기와 반응하는 상기 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치는 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.8인 하이드록시에틸 스타치이다. 또 가능한 것으로는, 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
반응성 폴리머의 단백질과의 반응은, 반응성 폴리머를 분리하는 일없이, 예를 들어, 반응성 폴리머를 적어도 10 중량%, 더 바람직하게는 적어도 30 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50 중량% 포함하는 해당 반응성 폴리머 제제의 반응 혼합물을 단백질의 수용액과 배합함으로써 수행할 수 있다. 단백질의 바람직한 수용액은 바람직하게는 pH 5.0 내지 9.0, 더 바람직하게는 6.0 내지 9.0, 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5에서 단백질을 0.05 내지 10 중량%, 더 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%, 특히 바람직하게는 0.5 내지 2 중량% 포함한다.
본 발명에 따르면, 또한 무수 에탄올, 이소프로판올 및/또는 아세톤과 같은 적어도 하나의 적절한 침전제로 적어도 1회, 바람직하게는 다수회 침전시켜 반응성 폴리머를 정제하여 반응성 폴리머를 적어도 10 중량%, 더 바람직하게는 적어도 30 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50 중량% 포함하는 고형물을 제공할 수 있다.
정제된 반응성 폴리머는 단백질의 수용액에 첨가될 수 있다. 또한 단백질의 수용액에 정제된 반응성 폴리머의 용액을 첨가하는 것도 가능하다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 아마이드 결합을 부여하기 위한 반응성 폴리머의 단백질과의 반응은 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 5 내지 35 ℃ 및 특히 10 내지 30 ℃의 온도에서; 7.0 내지 9.0, 바람직하게는 7.5 내지 9.0, 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 바람직한 pH에서; 0.1 내지 12 시간, 더 바람직하게는 0.5 내지 5 시간, 더 바람직하게는 0.5 내지 3 시간, 보다 더 바람직하게는 0.5 내지 2 시간, 특히 바람직하게는 0.5 내지 1 시간의 바람직한 반응 시간에서; 반응성 폴리머 에스테르:단백질의 몰비가 바람직하게는 1:1 내지 70:1, 더 바람직하게는 5:1 내지 50:1, 특히 바람직하게는 10:1 내지 50:1인 조건에서 수행된다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 환원성 말단에서 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원성 말단에서 카보닐 디이미다졸 또는 카보닐 디벤즈이미다졸과 같은 아졸리드와 반응시켜, 반응성 카복시기를 갖는 폴리머를 제공한다. 카보닐디이미다졸의 경우, 하기 화학식에 따른 반응성 폴리머 유도체가 생성된다:
Figure 112006072272527-PCT00035
식 중, HAS'는 바람직하게는 HES'이다. 폴리머의 아졸리드와의 반응으로부터 얻어지는 아미다졸리드는 단백질의 아미노기와 주로 반응해서 아마이드 결합을 제공한다. 존재한다면 단백질의 하이드록시와의 반응에 의해 에스테르 결합을 제공하거나, 또는 단백질의 티오기와의 반응에 의해 티오에스테르 결합을 제공하거나, 또는 존재한다면 단백질의 카복시기와의 반응에 의해 -(C=O)-O-(C=O)-결합을 형성하는 반응이 가능하다.
아졸리드기가 폴리머 또는 폴리머 유도체 중에 반응성 카복시기를 도입하는 데 이용되는 상기 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치로는 예를 들어, 바람직하게는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 폴리머의 선택적으로 산화된 환원성 말단의 상기 언급된 화합물 중 하나, 바람직하게는 적어도 하나의 산성 알코올 및/또는 적어도 하나의 탄산 디에스테르 화합물과의 반응으로부터 생성된 반응성 카복시기 A를 갖는 폴리머는 적어도 하나의 링커 화합물을 통하여 단백질의 작용기 Z에 연결될 수 있다. 링커 화합물이 사용되는 경우, 상기 화합물은 폴리머 유도체의 작용기 A와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기 F1, 및 단백질의 작용기 Z와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기 F2, 또는 화학적으로 변성되어 단백질의 작용기 Z와 반응할 수 있는 작용기 F2를 갖는 적어도 이작용성 화합물이다. 화학적 변성은 예를 들어, 작용기 F2의 추가적 링커 화합물의 작용기 F3와의 반응 또는 적절한 작용기 F2의 산화 또는 환원일 수 있다. 적어도 하나의 링커 화합물이 사용되는 경우, 반응은 단백질의 아미노기에 제한되는 것은 아니나, 링커 화합물의 작용기 또는 링커 화합물의 화학적 특성에 따라, 카복시기, 반응성 카복시기, 알데하이드기, 케토기, 티오기, 아미노기 또는 하이드록시기 등의 단백질의 각각의 적절한 작용기와 결합을 형성하는 데 이용될 수 있다. 두 개의 링커 화합물이 사용되는 경우, 첫번째 링커 화합물은 아미노기, 티오기, 하이드록시기 또는 카복시기와 같은 폴리머의 반응성 카복시기와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기 F1을 가진 것이 사용된다. 또한, 첫번째 링커 화합물은 두번째 링커 화합물의 적어도 하나의 작용기 F3와 반응할 수 있는 적어도 하나의 다른 작용기 F2를 가진다. 작용기 F2로서는, 특히 하기 작용기가 언급된다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티올기 또는 하이드록시기;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노알코올;
- 1,2-아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 아미노기 -NH2 또는 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기, 또는 알크아릴아미노기 등의 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노기의 유도체;
- 하이드록실아미노기 -O-NH2, 또는 하이드록실알킬아미노기, 하이드록실아릴아미노기, 하이드록실아르알킬아미노기, 또는 하이드록살알크아릴아미노기 등의 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 하이드록실아미노기의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노기, 아릴옥시아미노기, 아르알킬옥시아미노기 또는 알크아릴옥시아미노기;
- 카보닐기, -Q-C(=G)-M을 가진 잔기(여기에서 G는 O 또는 S이고, M은 예를 들어,
-- OH 또는 -SH;
-- 알콕시기, 아릴옥시기, 아르알킬옥시기 또는 알크아릴옥시기;
-- 알킬티오기, 아릴티오기, 아르알킬티오기 또는 알크아릴티오기;
-- 알킬카보닐옥시기, 아릴카보닐옥시기, 아르알킬카보닐옥시기, 알크아릴카보닐옥시기;
-- N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기에서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않음)을 가지는 히드록실아민의 에스테르 등의 활성화 에스테르이고; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자이며;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- N02;
- 니트릴기;
- 알데하이드기 또는 케토기와 같은 카보닐기;
- 카복시기;
- -N=C=O기 또는 -N=C=S기;
- 요오드화 비닐 또는 브롬화 비닐기 또는 트리플레이트와 같은 비닐 할라이드기;
- -C≡C-H ;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
- -(C=O)-CH2-Hal기(여기에서 Hal은 Cl, Br, 또는 I임);
- -CH=CH-S02-;
- -S-S-구조를 포함하는 디설파이드기;
-
Figure 112006072272527-PCT00036
기
-
Figure 112006072272527-PCT00037
기
여기서, F3는 상기 언급된 기 중 하나와 화학 결합을 형성할 수 있는 기이고, 바람직하게는 상기 언급된 기로부터 선택된다. 더욱이, 두번째 링커 화합물은 단백질의 작용기 Z와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기, 예를 들어, 아미노기, 티오기, 카복시기, 반응성 카복시기, 알데하이드기, 케토기 또는 하이드록시기를 갖는다. 하나의 연결용 화합물이 폴리머 및 단백질과 공유 결합하는 경우, 폴리머는 연결용 화합물과 반응할 수 있고 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나, 또는 단백질은 연결용 화합물과 반응할 수 있고 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응한다. 두 개의 연결용 화합물 L1 및 L2가 사용되는 경우, 폴리머는 L1과 반응하고, 생성된 폴리머 유도체는 L2와 반응하며, 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나; 또는 단백질은 L2와 반응하고, 생성된 단백질 유도체는 Ll과 반응하며, 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응할 수 있다. 또한, 폴리머가 L1과 반응하고 단백질이 L2 와 반응하며 폴리머 유도체가 단백질 유도체와 반응할 수 있다. 또, Ll이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 폴리머와 반응하며 생성된 폴리머 유도체가 단백질과 반응할 수 있다. 또한, L1이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 단백질과 반응하며 생성된 단백질 유도체가 폴리머와 반응할 수 있다.
링커 화합물이 산성 알코올 및/또는 디에스테르 카보네이트 및/또는 아졸리드기와 조합해서 사용되는 전술한 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치로는 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
반응성 카복시기의 폴리머로의 도입과 관련된 본 발명의 두번째 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기를 탄산 디에스테르와 반응시킴으로써 반응성 카복시기를 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머에 도입시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 A가 반응성 카복시기이고, 이때, 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기를 적어도 하나의 탄산 디에스테르 탄산 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC(여기에서, RB 및 RC는 같거나 다를 수 있음)와 반응시킴으로써, A를 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머에 도입시키는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머를 적어도 하나의 하이드록시기에서 카보닐디이미다졸, 카보닐-디-(1,2,4-트리아졸) 또는 카보닐 디벤즈이미다졸과 같은 아졸리드와 반응시켜 반응성 카복시기를 지니는 폴리머를 제공한다.
적절한 탄산 디에스테르 화합물로서, 알코올 성분이 독립적으로 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 같은 N-하이드록시 숙신이미드; p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀 등의 적절히 치환된 페놀; 또는 하이드록시 벤조트리아졸과 같은 하이드록시아졸인 화합물이 사용될 수 있다.
대칭성 탄산 디에스테르 화합물이 특히 바람직하며, 따라서, RB 및 RC는 동일하다. 탄산 디에스테르의 알코올 성분은 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드, 설폰화 N-하이드록시 숙신이미드, N-하이드록시 벤조트리아졸, 및 니트로- 및 할로겐-치환된 페놀로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 니트로페놀, 디니트로페놀, 트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀 및 펜타플루오로페놀 등이 바람직하다. 특히 바람직하게는 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이고, N,N'-디숙신이미딜 카보네이트가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 하이드록시알킬 스타치 유도체 및 하이드록시알킬 스타치 유도체, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 적어도 하나의 하이드록시기, 바람직하게는 상기 스타치의 적어도 두 개의 하이드록시기가 탄산 디에스테르 화합물과 반응하여 각각의 반응성 에스테르를 형성한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 탄산 디에스테르 화합물과의 반응은 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 10 내지 30 ℃ 및 특히 15 내지 25 ℃의 온도에서, 0.5 내지 5 시간, 더 바람직하게는 1 내지 3 시간, 특히 바람직하게는 2 내지 3 시간의 바람직한 반응 시간 동안 수행된다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머를 적어도 하나의 하이드록시기에서 카보닐디이미다졸, 카보닐-디-(1,2,4-트리아졸) 또는 카보닐 디벤즈이미다졸과 같은 아졸리드와 반응시켜 반응성 카복시기를 지니는 폴리머를 제공한다.
탄산 디에스테르 및/또는 아졸리드의 몰비, 바람직하게는 탄산 디에스테르 화합물:폴리머는 미반응 폴리머에 존재하는 하이드록시기의 수에 대한 탄산 디에스테르 화합물과 반응하는 하이드록시기의 수에 관한 폴리머의 치환 정도에 의존한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 탄산 디에스테르 화합물:폴리머의 몰비는 1:2 내지 1:1000, 더 바람직하게는 1:3 내지 1:100, 특히 바람직하게는 1:10 내지 1:50의 범위로, 0.5 내지 0.001, 바람직하게는 0.33 내지 0.01, 특히 바람직하게는 0.1 내지 0.02 범위의 치환도를 제공한다. 치환도는 UV 분광기에 의해 결정된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머의 탄산 디에스테르와의 반응은 적어도 하나의 비양자성 용매, 특히 바람직하게는 0.5 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하의 물 함량을 갖는 무수 비양자성 용매에서 수행된다. 다른 적절한 용매는 특히 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
따라서, 본 발명은 또한 반응성 에스테르기 A를 제공하기 위한 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기의 탄산 디에스테르와의 반응은 무수 비양자성 극성 용매에서 수행되고, 이때, 상기 용매는 바람직하게는 디메틸 아세트아마이드, 디메틸 포름아마이드 또는 그의 혼합물인 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
적어도 하나의 아마이드 결합, 바람직하게는 적어도 두 개의 아마이드결합을 형성하기 위한, 적어도 하나의 반응성 에스테르기, 바람직하게는 적어도 두 개의 반응성 에스테르기를 포함하는 반응성 폴리머의 단백질과의 반응은 반응성 폴리머의 분리 없이 해당 반응성 폴리머를 적어도 5 중량%, 더 바람직하게는 적어도 10 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 15 중량% 포함하는 반응성 폴리머 제제의 반응혼합물을, 단백질의 수성액과 함께 배합함으로써 수행될 수 있다. 단백질의 바람직한 수용액은 단백질을 0.05 내지 10 중량%, 더 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%, 특히 바람직하게는 0.5 내지 2 중량% 포함하고, 이때의 pH는 7.0 내지 9, 더 바람직하게는 7.5 내지 9, 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5이다.
본 발명에 의하면, 또한 무수 에탄올, 이소프로판올 및/또는 아세톤과 같은 적어도 하나의 적절한 침전제로 적어도 1회, 바람직하게는 다수회 침전시켜 반응성 폴리머를 정제하여 반응성 폴리머를 적어도 20 중량%, 더 바람직하게는 적어도 50 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 80 중량% 포함하는 고형물을 제공할 수 있다.
정제된 반응성 폴리머는 단백질의 수용액에 가해질 수 있다. 또한, 정제된 반응성 폴리머의 용액을 단백질의 수용액에 가하는 것도 가능하다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두 개의 아마이드 결합을 형성하기 위한 반응성 폴리머의 단백질과의 반응은 2 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 5 내지 35 ℃ 및 특히 10 내지 30 ℃의 온도에서; 7.5 내지 9.0, 바람직하게는 7.5 내지 9, 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 바람직한 pH에서; 0.5 내지 5 시간, 더 바람직하게는 0.5 내지 3 시간, 특히 바람직하게는 0.5 내지 1 시간의 바람직한 반응 시간에서; 반응성 폴리머 에스테르:단백질의 몰비가 바람직하게는 1:1 내지 70:1, 더 바람직하게는 5:1 내지 50:1, 특히 바람직하게는 10:1 내지 50:1인 조건에서 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 올리고- 또는 멀티단백질-치환된 폴리머가 수득되고, 여기에서 단백질 분자는 아마이드 결합을 통하여 폴리머에 결합된다.
PDS는 0.001 내지 1, 바람직하게는 0.005 내지 0.5, 더 바람직하게는 0.005 내지 0.2 범위이다.
적어도 하나의 반응성 카복시기는 폴리머 또는 폴리머 유도체의 적어도 하나의 하이드록시기와의 반응에 의해 폴리머 또는 폴리머 유도체에 도입되는 상기 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치로는 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기의 상기 언급된 화합물 중 하나, 바람직하게는 적어도 하나의 탄산 디에스테르 화합물과의 반응으로부터 생성된 반응성 카복시기 A를 갖는 폴리머는 적어도 하나의 링커 화합물을 통하여 단백질의 작용기 Z에 결합될 수 있다. 링커 화합물이 사용되는 경우, 상기 화합물은 폴리머 유도체의 작용기 A와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기 F1 및 단백질의 작용기 Z와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기 F2, 또는 화학적으로 변성되어 단백질의 작용기 Z와 반응하게 될 수 있는 작용기 F2를 갖는 적어도 이작용성 화합물이다. 화학적 변성은 예를 들어, 작용기 F2의 또 다른 링커 화합물의 작용기 F3와의 반응 또는 적절한 작용기 F2의 산화 또는 환원일 수 있다. 적어도 하나의 링커 화합물이 사용되는 경우, 반응은 단백질의 아미노기에 제한되는 것은 아니나, 링커 화합물 또는 또는 링커 화합물들의 작용기의 화학적 특성에 따라, 카복시기, 반응성 카복시기, 알데하이드기, 케토기, 티오기, 아미노기 또는 하이드록시기와 같은 단백질의 각각의 적절한 작용기와 결합을 형성할 수 있다. 두 개의 링커 화합물이 사용되는 경우, 첫번째 링커 화합물은 아미노기, 티오기, 하이드록시기, 또는 카복시기와 같은 폴리머의 반응성 카복시기와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기 F1을 가진 것을 사용한다. 또한, 첫번째 링커 화합물 두번째 링커 화합물의 적어도 하나의 작용기 F3와 반응할 수 있는 적어도 하나의 다른 작용기 F2를 가진다. 작용기 F2로서는, 특히 하기 작용기가 언급된다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티올기 또는 하이드록시기;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노알코올;
- 아지드;
- 1,2-아미노-티오알코올;
- 아미노기 -NH2 또는 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기, 또는 알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노기의 유도체;
- 하이드록실아미노기 -O-NH2, 또는 하이드록실알킬아미노기, 하이드록실아릴아미노기, 하이드록실아르알킬아미노기, 또는 하이드록살알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 하이드록실아미노기의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노기, 아릴옥시아미노기, 아르알킬옥시아미노기 또는 알크아릴옥시아미노기;
- 카보닐기, -Q-C(=G)-M을 갖는 잔기(여기에서 G는 O 또는 S이고, M은 예를 들어,
-- OH 또는 -SH;
-- 알콕시기, 아릴옥시기, 아르알킬옥시기 또는 알크아릴옥시기;
-- 알킬티오기, 아릴티오기, 아르알킬티오기 또는 알크아릴티오기;
-- 알킬카보닐옥시기, 아릴카보닐옥시기, 아르알킬카보닐옥시기, 알크아릴카보닐옥시기;
-- N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기에서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않음)을 가지는 히드록실아민의 에스테르 등의 활성화 에스테르이고; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자이며;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- N02;
- 니트릴기;
- 알데하이드기 또는 케토기와 같은 카보닐기;
- 카복시기;
- -N=C=O기 또는 -N=C=S기;
- 요오드화 비닐 또는 브롬화 비닐 또는 트리플레이트와 같은 비닐 할라이드기;
- -C≡C-H ;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
- -(C=O)-CH2-Hal기(여기에서 Hal은 Cl, Br 또는 I임);
- -CH=CH-S02-;
- 구조-S-S-을 포함하는 디설파이드기;
-
Figure 112006072272527-PCT00038
기
-
Figure 112006072272527-PCT00039
기.
여기서, F3는 상기 언급된 기 중 하나와 화학 결합을 형성할 수 있는 기이고, 바람직하게는 상기 언급된 기로부터 선택된다. 더욱이, 두번째 링커 화합물은 단백질의 작용기 Z와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기, 예를 들어, 아미노기, 티오기, 카복시기, 반응성 카복시기, 알데하이드기, 케토기, 또는 하이드록시기를 갖는다. 하나의 연결용 화합물이 폴리머 및 단백질과 공유 결합하는 경우, 폴리머는 연결용 화합물과 반응할 수 있고 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나, 또는 단백질은 연결용 화합물과 반응할 수 있고 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응한다. 두 개의 연결용 화합물 L1 및 L2가 사용되는 경우, 폴리머는 L1과 반응하고, 생성된 폴리머 유도체는 L2와 반응하며, 생성된 폴리머 유도체는 단백질과 반응하거나; 또는 단백질은 L2와 반응하고, 생성된 단백질 유도체는 Ll과 반응하며, 생성된 단백질 유도체는 폴리머와 반응할 수 있다. 또한, 폴리머가 L1과 반응하고 단백질이 L2와 반응하며 폴리머 유도체가 단백질 유도체와 반응할 수 있다. 또, Ll이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 폴리머와 반응하며, 생성된 폴리머 유도체가 단백질과 반응할 수 있다. 또한, L1이 L2와 반응하고, 생성된 화합물이 단백질과 반응하며, 생성된 단백질 유도체가 폴리머와 반응할 수 있다.
링커 화합물이 사용되는 전술한 구체예에 있어서, 특히 바람직한 하이드록시에틸 스타치로는 예를 들어, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 아미노기인 단백질의 작용기 Z와 반응하는 작용기 A는 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기이다. 따라서, 본 발명은 그 작용기 Z가 아미노기이고, 작용기 A는 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기이며, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 Z 및 작용기 A는 환원성 아민화 반응을 통하여 반응한다.
폴리머 또는 폴리머 유도체가 적어도 하나의 알데하이드기를 통하여 단백질의 적어도 하나의 아미노기에 공유 결합하는 본 발명에 따른 환원성 아민화 반응은 바람직하게는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 37 ℃, 더욱더 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 4 내지 21 ℃의 온도, 가장 바람직하게는 20 내지 21℃에서 수행된다. 반응 시간은 바람직하게는 0.5 내지 72 시간, 더 바람직하게는 2 내지 48 시간, 특히 바람직하게는 4 내지 7 시간의 범위이다. 반응 용매로서는, 수성 매질이 바람직하다.
이와 같이 해서, 본 발명은 또한 환원성 아민화가 4 내지 21 ℃, 특히 바람직하게는 0 내지 21 ℃의 온도에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 환원성 아민화가 수성 매질 중에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
그러므로, 본 발명은 또한 환원성 아민화가 4 내지 21 ℃ 온도, 특히 바람직하게는 0 내지 21 ℃에서 수성 매질 중에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되고 있는 바와 같은 용어 "수성 매질"은 함유된 용매의 중량을 기준으로 해서, 적어도 10 중량%, 더 바람직하게는 적어도 20 중량%, 더 바람직하게는 적어도 30 중량%, 더 바람직하게는 적어도 40 중량%, 더 바람직하게는 적어도 50 중량%, 더 바람직하게는 적어도 60 중량%, 더 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더 바람직하게는 적어도 80 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90 중량% 또는 100 중량%까지 범위의 물을 포함하는 용매 또는 용매의 혼합물에 관한 것이다. 바람직한 반응 매질은 물이다.
반응 매질의 pH 값은 일반적으로 4 내지 9 또는 4 내지 8 또는 4 내지 7.3의 범위이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 환원성 아민화 반응이 수행되는 pH는 10 미만, 바람직하게는 7.4 미만, 더 바람직하게는 7.3 미만, 더욱더 바람직하게는 7 이하, 가장 바람직하게는 7 미만, 즉, 산성 범위이다. 따라서, 바람직한 범위는 3 내지 7 미만, 더 바람직하게는 3.5 내지 6.5, 보다 더 바람직하게는 4 내지 6, 보다 더 바람직하게는 4.5 내지 5.5, 특히 바람직하게는 약 5.0, 즉, 4.6 또는 4.7 또는 4.8 또는 4.9 또는 5.0, 또는 5.1 또는 5.2 또는 5.3 또는 5.4이다. 바람직한 범위는 3 내지 6.9 또는 3 내지 6.5 또는 3 내지 6 또는 3 내지 5.5 또는 3 내지 5 또는 3 내지 4.5 또는 3 내지 4 또는 3 내지 3.5 또는 3.5 내지 6.9 또는 3.5 내지 6.5 또는 3.5 내지 6 또는 3.5 내지 5.5 또는 3.5 내지 5 또는 3.5 내지 4.5 또는 3.5 내지 4 또는 4 내지 6.9 또는 4 내지 6.5 또는 4 내지 6 또는 4 내지 5.5 또는 4 내지 5 또는 4 내지 4.5 또는 4.5 내지 6.9 또는 4.5 내지 6.5 또는 4.5 내지 6 또는 4.5 내지 5.5 또는 4.5 내지 5 또는 5 내지 6.9 또는 5 내지 6.5 또는 5 내지 6 또는 5 내지 5.5 또는 5.5 내지 6.9 또는 5.5 내지 6.5 또는 5.5 내지 6 또는 6 내지 6.9 또는 6 내지 6.5 또는 6.5 내지 6.9 등이다.
따라서, 본 발명은 또한 환원성 아민화가 pH 7 이하, 더 바람직하게는 pH 6 이하에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
그래서, 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 환원성 아민화는 온도 0 내지 21℃, 바람직하게는 4 내지 21 ℃, pH 7.5 이하, 바람직하게는 7 이하, 더욱 바람직하게는 6 이하에서 수행된다.
그러므로, 본 발명은 환원성 아민화가 수성 매질 중에서 pH 7 이하, 바람직하게는 6 이하에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
이와 같이 해서, 본 발명은 환원성 아민화가 온도 4 내지 21 ℃에서, 수성 매질 중 pH 7 이하, 바람직하게는 6 이하에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
반응에 사용되는 폴리머 유도체:단백질의 몰비는 바람직하게는 200:1 내지 5:1, 더 바람직하게는 100:1 내지 10:1, 특히 바람직하게는 75:1 내지 20: 1 범위이다.
특히 상기 주어진 바람직한 pH 범위에서, 특히 7 미만 및 4 이상의 pH에서, 폴리머 유도체가 단백질의 N 말단에 위치한 아미노기와 주로 반응하는 것이 가능하다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 본 명세서에 사용된 용어 "주로(predominantly)"란 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 85 %의 유효한 N-말단 아미노기가 환원성 아민화를 통해 반응하는 구체예를 의미한다. 또한 적어도 90 % 또는 적어도 95 % 또는 적어도 95 %, 적어도 96 % 또는 적어도 97 % 또는 적어도 98 % 또는 적어도 99 %의 유효한 N-말단 아미노기가 반응할 수 있다. N-말단 아미노기 이외의 아미노기에 커플링하는 것이 완전히 배제될 수는 없지만, 7 이하, 바람직하게는 6 이하의 pH에서, 본 발명에 따른 환원성 아민화를 통한 커플링은 N-말단 아미노기에서 주로 선택적으로 발생한다고 여겨진다. 특히, 이들 반응 조건은 이들 조건에서 안정한 단백질에 대해 바람직하다. 단백질이 예를 들어 알파-항트립신과 같이 산에 불안정한 것이면, 적절한 반응조건, 특히 7.5 미만 내지 5 초과의 pH를 선택하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 단백질이 N-말단 아미노기 및 적어도 하나의 추가적 아미노기를 포함하고, 상기 컨쥬게이트는 N-말단 아미노기에 주로 커플링된 폴리머를 포함하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 알데하이드 또는 케토 또는 헤미아세탈기능성 하이드록시알킬 스타치 또는 알데하이드 또는 케토 또는 헤미아세탈기능성 하이드록시알킬 스타치 유도체를 단백질의 N-말단 아미노기에 주로 결합시키는 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 방법은 pH 7 이하, 바람직하게는 6 이하에서, 상기 하이드록시알킬 스타치 또는 그의 유도체를 환원성 아민화 반응시키는 것을 포함하고, 상기 환원성 아민화 반응은 바람직하게는 수성 매질 중에서 수행된다.
본 발명에 따르면, 알데하이드 기능성 하이드록시알킬 스타치 또는 알데하이드 기능성 하이드록시알킬 스타치 유도체가 바람직하다.
보다 추가적인 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 알데하이드 또는 케토 또는 헤미아세탈기능성 하이드록시에틸 스타치 또는 알데하이드 또는 케토 또는 헤미아세탈기능성 하이드록시에틸 스타치 유도체를 단백질의 N-말단 아미노기에 선택적으로 결합시키는 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 방법은 pH 7 이하, 바람직하게는 6 이하에서, 상기 하이드록시알킬 스타치 또는 그의 유도체를 환원성 아민화 반응시키는 것을 포함하고, 상기 환원성 아민화 반응은 바람직하게는 수성 매질 중에서 수행되며, 상기 하이드록시에틸 스타치는 바람직하게는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
반응에 사용되는 폴리머 유도체:단백질의 몰비는 바람직하게는 200:1 내지 10:1, 더 바람직하게는 100:1 내지 10:1, 특히 바람직하게는 75:1 내지 20:1이다.
따라서, 본 발명은 또한 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 알데하이드기를 포함하는 폴리머 또는 폴리머유도체를 수성 매질 중에서 환성제의 존재하에 단백질의 아미노기와 반응하는 것을 포함하고, 상기 환원제는 바람직하게는 NaCNBH3이다.
본 발명의 첫번째 바람직한 구체예에 따르면, 개환 산화 반응에 의해 폴리머가 해당 폴리머에 도입되는 적어도 두 개의 알데하이드기를 포함함에 따라, 폴리머는 바람직하게는 하기 화학식에 따른 적어도 하나의 구조를 포함한다:
Figure 112006072272527-PCT00040
.
본 발명의 이 구체예에 따르면, 폴리머의 적어도 하나의 단당류 환을 산화시킬 수 있는 각 산화제 또는 산화제의 배합물이 사용되어 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두 개의 알데하이드기를 가지는 개방 단당류 환을 제공한다. 이 반응은 산화된 폴리머의 단당류 환을 나타낸 하기 반응식으로 예시되어 두 개의 알데하이드기를 갖는 개방 환을 제공한다:
Figure 112006072272527-PCT00041
적절한 산화제는 특히 알칼리성 금속 과옥소산염 또는 그의 둘 이상의 혼합물과 같은 과옥소산염이며, 바람직하게는 과옥소산 나트륨 및 과옥소산 칼륨이다.
따라서, 본 발명은 폴리머가 과옥소산염을 사용하여 개환 산화 반응되어 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두 개의 알데하이드기를 갖는 폴리머 유도체를 형성하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
이 산화 반응에서, 폴리머는 산화된 형태 또는 비-산화된 형태 중 하나의 형태로, 그의 환원성 말단으로 사용되고, 이때 비-산화된 형태가 바람직하다.
따라서, 본 발명은 폴리머가 비-산화된 형태로 그의 환원성 말단으로 사용되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
반응 온도는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 0 내지 5 ℃의 범위가 바람직하다. 반응 시간은 1 분 내지 5 시간, 특히 바람직하게는 10 분 내지 4 시간의 범위가 바람직하다. 산화의 원하는 정도에 따라, 즉, 산화 반응으로부터 제공되는 알데하이드기의 수에 따라, 과옥소산염:폴리머의 몰비가 적절하게 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 개환 산화 반응이 0 내지 5 ℃의 온도에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
폴리머의 과옥소산염과의 산화 반응은 바람직하게는 수성 매질, 가장 바람직하게는 물 중에서 수행된다.
따라서, 본 발명은 개환 산화 반응이 수성 매질 중에서 수행되는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다. 반응 혼합물의 적절한 pH 값은 적어도 하나의 적절한 버퍼를 가하여 조절할 수 있다. 바람직한 버퍼로서, 아세트산 나트륨 버퍼, 인산 또는 붕산 버퍼를 들 수 있다.
상기 개환 산화 반응되는 하이드록시에틸 스타치는 바람직하게는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
생성된 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 정제될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 분리하기 전에 침전시킬 수 있다.
만일 폴리머 유도체가 먼저 침전된다면, 예를 들어, 반응 혼합물이 적절한 온도에서 반응 혼합물 중에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 수성 매질, 바람직하게는 물이 용매로서 사용되는 경우, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃, 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃ 범위의 온도에서, 2-프로판올 또는 아세톤과 에탄올의 혼합물, 바람직하게는 상기 화합물의 동일한 부피를 나타내는 1:1 혼합물(v/v)과 접촉시킨다.
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머 유도체는 첫째로 원심분리 또는 여과와 같은 적절한 방법에 의해, 예를 들어, 수성 2-프로판올 혼합물을 지닌 반응 혼합물 또는 반응 혼합물의 혼합물로부터 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 등의 추가적 처치를 가할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 분리된 폴리머 유도체는 먼저, 바람직하게는 물에 대해서 투석되고, 그 후, 생성물의 원하는 사양에 따라 반응 생성물의 용매 함량이 충분히 낮을 때까지 냉동건조시킨다. 냉동건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행된다.
바람직한 구체예에 따르면, 산화 반응으로부터 생성된 산화된 폴리머는 예를 들어, 원하지 않는 저분자량 염 및 폴리머 성분을 제거하고, 이에 따라 산화된 폴리머의 분자량 범위를 조절하는 수단을 제공하기 위해, 한외 여과 및/또는 투석과 같은 적어도 하나의 적절한 방법을 사용하여 정제된다.
산화된 폴리머는 단백질과의 반응에 직접 사용되거나, 또는 예를 들어 냉동건조에 의해, 첫번째 단계에서 적절히 제거되고, 두번째 단계에서, 단백질에 대한 콘쥬게이션을 위해 물에서 재용출시킬 수 있다. 환원성 아민화에 의한 단백질의 적어도 하나의 아미노기와 폴리머의 적어도 하나의 알데하이드기와의 커플링에 대해서는, pH 또는 온도와 같은 환원성 아민화 반응의 특이적 반응 파라미터에 관한 전술한 상세한 기재를 참조하면 된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 의하면, 환원성 아민화는 온도 약 4℃와 같은 0 내지 5℃, pH 약 5.0과 같은 약 4.5 내지 5.5, 반응시간 약 24시간과 같은 약 20 내지 30 시간에서 수행되는 것이 바람직하다.
두번째 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머는 폴리머와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기 M; 및 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기이고, 환원성 아민화에 의해 단백질의 아미노기와 반응하는 적어도 하나의 작용기 Q를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응한다.
알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기와 별도로, 적어도 하나의 카복시기 또는 적어도 하나의 반응성 카복시기, 바람직하게는 하나의 카복시기 또는 하나의 반응성 카복시기를 가지는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기 및 카복시기 또는 반응성 카복시기는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 특히, 스페이서는 임의로 치환된, 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더 바람직하게는 1 내지 20개, 더 바람직하게는 2 내지 10개, 더 바람직하게는 2 내지 6개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개이다. 헤테로 원자가 존재한다면, 분리 기는 통상 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7개인 임의로 분기된 알킬 쇄 또는 아릴기 또는 사이클로알킬기를 포함하거나, 또는 알킬 부분이 직쇄 및/또는 환식 알킬기일 수 있는 아르알킬기, 알크아릴기일 수 있다.
바람직한 구체예에 의하면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 2 내지 6개, 바람직하게는 2 내지 4개를 지닌 알킬기이다. 또, 알데하이드기 또는 케토기와 카복시기 사이에는 탄소원자가 존재하지 않는 것도 가능하다. 대안적으로는, 탄화수소 잔기는 탄소원자수 3 내지 11개, 바람직하게는 3 내지 6개 또는 3 내지 5개를 지닌 치환 또는 무치환의 환식 탄화수소기일 수 있다. 환식 탄화수소기가 치환되어 있을 경우, 치환체는 치환 혹은 무치환의 아미노 또는 알콕시기로 이루어 진 군으로부터 선택될 수 있다. 치환체의 수는 존재한다면 1 내지 3개가 바람직하다. 또한, 알킬 및/또는 환식 탄화수소기는 1개 이상의 헤테로원자, 예를 들어 O 또는 S, 특히 O를 함유할 수 있다. 이 경우, 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 1 또는 2개의 헤테로원자가 존재한다. 본 명세서에 있어서의 바람직한 화합물은 이하의 화합물군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00042
보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 5 내지 7개, 바람직하게는 탄소 원자수 6개인 아릴 잔기이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 벤젠 잔기이다. 본 바람직한 구체예에 따르면, 카복시기 및 알데하이드기는 벤젠 환의 1,4-위치, 1,3-위치 또는 1,2-위치에 위치할 수 있으며, 1,4-위치가 바람직하다.
반응성 카복시기로서, 반응성 에스테르, 이소티오시아네이트 또는 이소시아네이트가 언급될 수 있다. 바람직한 반응성 에스테르는 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 같은 N-하이드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 하이드록시 벤조트리아졸과 같은 하이드록시아졸로부터 유도된다. 특히 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드류로, N-하이드록시 숙신이미드 및 설포-N-하이드록시 숙신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올이 단독 또는 그의 둘 이상의 적절한 결합으로서 사용될 수 있다. 반응성 에스테르로서는, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르가 특히 바람직하다.
반응성 카복시기를 얻기 위해 반응될 수 있는 카복시기를 포함하는 적어도 이작용성 화합물의 구체예는 전술한 리스트에 있는 예시 화합물 1 내지 11을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, "카복시기"란 락톤 및 디카복실산화합물의 내부 무수물을 의미한다.
그래서, 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 폴리머가 포르밀벤조산과 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 폴리머가 포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르와 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 폴리머가 포르밀벤조산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 폴리머가 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부티르산과 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
바람직하게는 카복시기 또는 반응성 카복시기인 M; 및 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기인 Q를 포함하는 화합물과 반응하는 하이드록시에틸 스타치는 가장 바람직하게는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치이다. 가능한 것으로는, 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
특히 바람직하게는, 하이드록시알킬 스타치 및 보다 더 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치가 산화된 형태로 그의 환원성 말단으로 사용된다.
알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 가지는 생성된 폴리머 유도체는 이어서 환원성 아민화를 통하여 단백질의 아미노기와 반응한다. 환원성 아민화에 의한 단백질의 적어도 하나의 아미노기와 폴리머의 적어도 하나의 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기와의 커플링에 대해서는, pH 또는 온도와 같은 환원성 아민화 반응의 특이적 반응 파라미터에 관한 상기 상세한 기재를 참조하면 된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 단백질의 아미노기와의 반응은 바람직하게는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 4 내지 21 ℃의 온도에서 수행된다. 반응 시간은 바람직하게는 30 분 내지 72 시간, 더 바람직하게는 2 내지 48 시간, 특히 바람직하게는 4 시간 내지 17 시간의 범위이다. 반응 용매로서는, 수성 매질이 바람직하다. 반응 매질의 pH 값은 바람직하게는 4 내지 9, 더 바람직하게는 4 내지 8, 특히 바람직하게는 4.5 내지 5.5 범위이다.
세번째 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머는 임의적인 산화된 환원성 말단에서, 아미노기 M 및 작용기 Q를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응하고, 여기에서 상기 아미노기 M은 폴리머의 임의적인 산화된 환원성 말단과 반응하며, 작용기 Q는 화학적으로 변성되어 환원성 아민화에 의해 단백질의 아미노기와 반응하는 알데하이드 기능성 폴리머 유도체를 제공한다.
작용기 Q로서는 특히 이하의 작용기 등이 언급된다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티올기 또는 하이드록시기;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 1,2-아미노알코올;
- 아미노기 -NH2 또는 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기, 또는 알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노기의 유도체;
- 하이드록실아미노기 -O-NH2, 또는 하이드록실알킬아미노기, 하이드록실아릴아미노기, 하이드록실아르알킬아미노기, 또는 하이드록살알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 하이드록실아미노기의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노기, 아릴옥시아미노기, 아르알킬옥시아미노기 또는 알크아릴옥시아미노기;
- 카보닐기, -Q-C(=G)-M을 가지는 잔기,
(여기에서 G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- OH 또는 -SH;
-- 알콕시기, 아릴옥시기, 아르알킬옥시기 또는 알크아릴옥시기;
-- 알킬티오기, 아릴티오기, 아르알킬티오기 또는 알크아릴티오기;
-- 알킬카보닐옥시기, 아릴카보닐옥시기, 아르알킬카보닐옥시기, 알크아릴카보닐옥시기;
-- N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기에서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않음)을 가지는 히드록실아민의 에스테르 등의 활성화 에스테르이고; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자이며;
Q가 존재하지 않거나 NH 또는 헤테로원자, 예로서 S 또는 O인 경우;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- N02;
- 니트릴기;
- 알데하이드기 또는 케토기와 같은 카보닐기;
- 카복시기;
- -N=C=O기 또는 -N=C=S기;
- 요오드화 비닐 또는 브롬화 비닐 또는 트리플레이트와 같은 비닐 할라이드기;
- -C≡C-H ;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
-기 -(C=O)-CH2-Hal(여기에서 Hal은 Cl, Br, 또는 I임);
- -CH=CH-S02-;
- 구조 -S-S-를 포함하는 디설파이드기;
-
Figure 112006072272527-PCT00043
기 ;
-
Figure 112006072272527-PCT00044
기.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 용어 "작용기 Q"는 화학 구조 -NH-를 포함하는 작용기 Q에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 M은 구조 R'-NH-를 갖는 기이고, 여기에서 R'은 수소 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기이며, 이때, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 다른 구체예에 따르면 NH기에 직접 결합하거나, NH기에 산소 결합에 의해 결합될 수 있다. 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로서, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시기이고, 보다 더 바람직하게는 수소 및 비치환된 알킬 및 알콕시기이다.
알킬 및 알콕시기 가운데, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 C 원자를 가진 기가 바람직하다. 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로폭시기가 더욱 바람직하다. 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시가 특히 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 메틸 또는 메톡시이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 M은 구조 R'-NH-R"를 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 포함하며, 이때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조단위 -SO2-이다. 작용기 R"의 구체예는 다음과 같다:
Figure 112006072272527-PCT00045
상기 식에서, G가 두 가지로 존재할 경우, 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기서 작용기 M은 이하의 기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00046
상기 식에서 G는 O 또는 S이고, 만일 두 가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 M은 아미노기 -NH2이다.
용어 "아미노기 Q"는 화학 구조 -NH-를 포함하는 작용기 Q와 관련된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 Q는 구조 R'-NH-를 포함하는기로, 여기에서 R'는 수소 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기이고, 이때, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 다른 구체예에 따르면 NH기에 직접 결합하거나, 또는 NH기에 산소 결합에 의해 결합될 수 있다. 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환기로서는, F, Cl 또는 Br과 같은 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시기이고, 보다 더 바람직하게는 수소 및 무치환된 알킬 및 알콕시기이다.
알킬 및 알콕시기 가운데, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 C 원자를 가진 기가 바람직하다. 또, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 및 이소프로폭시기가 더욱 바람직하다. 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시가 특히 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 메틸 또는 메톡시이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 Q는 구조 R'-NH-R"를 가지고, 여기에서 R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH 및/또는 구조단위 -(C=G)-를 포함하며, 이때 G는 O 또는 S, 및/또는 구조단위 -SO2-이다. 보다 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 R"은 이하의 기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00047
상기 식에서, G가 두 가지로 존재할 경우, 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서 작용기 Q는 이하의 기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00048
상기 식에서 G는 O 또는 S이고, 만일 두 가지로 존재하면, 독립적으로 O 또는 S이며, R'은 메틸이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 Q는 아미노기 -NH2이다.
본 발명의 보다 추가적인 바람직한 구체예에 따르면, M 및 Q 모두는 아미노기 -NH-를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, M 및 Q 모두는 아미노기 -NH2이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, M 및 Q를 포함하는 화합물은 동종 이작용성 화합물이고, 더 바람직하게는 작용기 M 및 Q로서, 가장 바람직하게는 아미노기-NH2, 또는 다른 구체예에 따르면, 하이드록실아미노기 -O-NH2 또는 하기 기를 포함하는 동종 이작용성 화합물이다:
Figure 112006072272527-PCT00049
상기 식에서, G는 바람직하게는 O이다. M 및 Q를 포함하는 이들 화합물의 구체예는 하기와 같다:
Figure 112006072272527-PCT00050
M이 바람직하게는 아미노기 -NH- 및 더 바람직하게는 아미노기 -NH2이고, 더 바람직하게는 M 및 Q 모두가 아미노기 -NH-를 포함하고, 특히 바람직하게는 M 및 Q 모두가 아미노기 -NH2을 포함하는, M을 포함하는 화합물과 반응하는 하이드록시에틸 스타치는 바람직하게는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치이다. 가능한 것으로는, 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 18 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 30 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치 또는 평균분자량이 약 100 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록시에틸 스타치가 있다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
M 및 Q 모두가 아미노기 -NH2인 경우, M 및 Q는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 스페이서는 임의로 치환된, 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더 바람직하게는 1 내지 20개, 더 바람직하게는 2 내지 10개, 더 바람직하게는 2 내지 6개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개이다. 헤테로 원자가 존재하면, 분리 기는 통상 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7개인 임의로 분기된 알킬 쇄 또는 아릴기 또는 사이클로알킬기를 포함하거나, 아르알킬기, 알크아릴기일 수 있고, 여기에서 알킬 부분은 직쇄 및/또는 환식 알킬기일 수 있다. 본 발명의 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 더 바람직하게는 2 내지 6개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개인 알킬 쇄이다.
따라서, 본 발명은 폴리머가 1,4-디아미노부탄, 1,3-디아미노프로판 또는 1,2-디아미노에탄과 반응하여 폴리머 유도체를 제공하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
두번째 변형예에 따르면, 아미노기 NH2인 작용기 M은 환원성 아민화를 통해서 폴리머의 비산화된 환원성 말단과 반응하여 아미노기를 형성하고, 이것은 이어서 바람직하게는 수소첨가되어 아미노기를 제공한다. 여기서, 이미노기 및 아미노기는 각각 폴리머와 M 및 Q를 포함하는 화합물을 연결한다. 이 경우, 작용기 Q는 아미노기인 것이 가능하다. 얻어진 폴리머 유도체가 후술하는 바와 같이 카복시기 또는 반응성 카복시기를 통해서 적어도 이작용성 화합물, 또는 아미노기와 반응하게 될 적어도 이작용성 화합물의 다른 기와 후속반응될 경우, M 및 Q를 포함하는 화합물은 작용기로서 오직 1개의 아미노기를 함유하는 일차 아민인 것이 바람직하다. 이 특정 경우에 있어서, 화합물은 단지 1개의 작용기를 함유하지만, 폴리머의 환원성 말단과의 환원성 아민화되는 화합물에 함유된 아미노기인 M과, 환원성 아민화 및 후속의 수소첨가에 의해 얻어지는 2차 아미노기인 Q를 포함하는 이작용성 화합물로서 간주된다.
세번째 변형예에 의하면, 폴리머의 비산화된 환원성 말단은 환원성 아민화를 통해 암모니아와 반응해서 폴리머의 말단 이미노기를 형성하고, 이어서 수소첨가되어 폴리머의 말단 아미노기, 따라서, 말단의 일차 아미노기를 제공한다. 이 특정 경우에 있어서, 암모니아는 M 및 Q를 포함하는 이작용성 화합물로서 간주되며, 여기서, M은 이용된 암모니아에 포함된 NH2이고, Q는 환원성 아민화에 이은 수소첨가에 의해 얻어지는 일차 아미노기이다.
M 및 Q를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응은 바람직하게는 바람직하게는 온도 0 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 4 내지 80℃, 특히 바람직하게는 20 내지 80℃에서 수행되고; 반응시간은 바람직하게는 4시간 내지 7일, 더욱 바람직하게는 10시간 내지 5일, 특히 바람직하게는 17 내지 4시간의 범위이다. 적어도 이작용성 화합물:폴리머의 몰비는 바람직하게는 10 내지 200, 특히 50 내지 100의 범위이다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응로서, 적어도 하나의 비양자성 용매, 특히 바람직하게는 0.5 중량 퍼센트 이하, 바람직하게는 0.1 중량 퍼센트 이하의 물 함량을 가지는 무수 비양자성 용매가 바람직하다. 적절한 용매는 특히 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응 용매로서, 또한 수성 매질이 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 폴리머 및 적어도 이작용성 화합물을 포함하는 폴리머 유도체는 자유 작용기 Q에서 화학적으로 변성되어 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 포함하는 폴리머 유도체를 제공한다. 이 구체예에 따르면, 폴리머 유도체를 작용기 Q와 반응할 수 있는 작용기 및 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 포함하는 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시키는 것이 바람직하다.
적어도 이작용성 화합물로서, 각 화합물은 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기 및 폴리머 유도체의 작용기 Q와 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 갖는 것이 적절하다. 적어도 하나의 작용기는 Q와 동일한 작용기 풀로부터 선택되고, Q과 반응할 수 있는 것이 선정된다. Q가 아미노기 -NH2인 바람직한 경우에 있어서, 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기와 별도로, 적어도 하나의 카복시기 또는 적어도 하나의 반응성 카복시기, 바람직하게는 하나의 카복시기 또는 하나의 반응성 카복시기를 지니는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기 및 카복시기 또는 반응성 카복시기는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 특히, 스페이서는 임의로 치환된, 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더 바람직하게는 1 내지 20개, 더 바람직하게는 2 내지 10개, 더 바람직하게는 2 내지 6개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개이다. 헤테로 원자가 존재한다면, 분리 기는 통상 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7개인 임의로 분기된 알킬 쇄 또는 아릴기 또는 사이클로알킬기를 포함하거나, 또는 알킬 부분이 직쇄 및/또는 환식 알킬기일 수 있는 아르알킬기, 알크아릴기일 수 있다.
바람직한 구체예에 의하면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 2 내지 6개, 바람직하게는 2 내지 4개를 지닌 알킬기이다. 또, 알데하이드기 또는 케토기와 카복시기 사이에는 탄소원자가 존재하지 않는 것도 가능하다. 대안적으로는, 탄화수소 잔기는 탄소원자수 3 내지 11개, 바람직하게는 3 내지 6개 또는 3 내지 5개를 지닌 치환 또는 무치환의 환식 탄화수소기일 수 있다. 환식 탄화수소기가 치환되어 있을 경우, 치환체는 치환 혹은 무치환의 아미노 또는 알콕시기로 이루어 진 군으로부터 선택될 수 있다. 치환체의 수는 존재한다면 1 내지 3개가 바람직하다. 또한, 알킬 및/또는 환식 탄화수소기는 1개 이상의 헤테로원자, 예를 들어 O 또는 S, 특히 O를 함유할 수 있다. 이 경우, 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 1 또는 2개의 헤테로원자가 존재한다. 본 명세서에 있어서의 바람직한 화합물은 이하의 화합물군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00051
보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 5 내지 7개, 바람직하게는 탄소 원자수 6개인 아릴 잔기이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 잔기는 벤젠 잔기이다. 본 바람직한 구체예에 따르면, 카복시기 및 알데하이드기는 벤젠 환의 1,4-위치, 1,3-위치 또는 1,2-위치에 위치할 수 있으며, 1,4-위치가 바람직하다.
반응성 카복시기로서, 반응성 에스테르, 이소티오시아네이트 또는 이소시아네이트가 언급될 수 있다. 바람직한 반응성 에스테르는 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 같은 N-하이드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀, 또는 하이드록시 벤조트리아졸과 같은 하이드록시아졸로부터 유도된다. 특히 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드류로, N-하이드록시 숙신이미드 및 설포-N-하이드록시 숙신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올이 단독 또는 그의 둘 이상의 적절한 결합으로서 사용될 수 있다. 반응성 에스테르로서는, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르가 특히 바람직하다.
구체예에 의하면, 작용기 Q와 화학 결합을 형성할 수 있는 작용기는 반응성 카복시기이며, 이때, Q는 바람직하게는 NH2 또는 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기 혹은 알크아릴아미노기 등의 구조단위 -NH-를 포함하는 아미노기의 유도체, 특히 NH2이다.
이 경우, 작용기 Q와 화학 결합을 형성할 수 있는 카복시기인 작용기는 적절하게 반응해서 전술한 바와 같은 반응성 카복시기를 형성한다. 따라서, 카복시기와 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 포함하는적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물을 반응시켜, 카복시기를 반응성 카복시기로 변환시키고, 얻어진 적어도 하나의 이작용성 화합물을 정제하고 폴리머 유도체의 작용기 Q와 반응시키는 것이 바람직하다.
반응성 카복시기를 얻기 위해 반응될 수 있는 카복시기를 포함하는 적어도 이작용성 화합물의 구체예는 전술한 리스트에 있는 예시 화합물 1 내지 11을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, "카복시기"란 락톤 및 디카복실산화합물의 내부 무수물을 의미한다.
그래서, 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 아미노기 -NH2인 Q를 포함하는 폴리머 유도체가 포르밀벤조산과 추가로 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 아미노기인 Q를 포함하는 폴리머 유도체가 포르밀벤조산 펜타플루오로페닐 에스테르와 더욱 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 아미노기인 Q를 포함하는 폴리머 유도체가 포르밀벤조산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 더욱 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 아미노기인 Q를 포함하는 폴리머 유도체가 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부틸산과 더욱 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 아미노기인 Q를 포함하는 폴리머 유도체는 알파-케토 카복실산, 시알산 또는 그의 유도체와 인산 피리독살로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 화합물인 이작용성 화합물과 더욱 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
알파-케토 카복실산에 대해서는, 아미노산으로부터 유도된 알파-케토 카복실산이 바람직하고, 대부분의 경우 인체에서 발견될 수 있다. 아미노기로부터 유래되는 바람직한 알파-케토 카복실산은 케토-발린, 케토-로이신, 케토-이소로이신 및 케토-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 알파-케토 카복실산의 카복시기는 아미노기인 폴리머의 기 Q와 반응한다. 따라서 아미도기가 형성된다. 다음에, 알파-케토 카복실산의 나머지 유리 케토기는 단백질의 작용기, 특히 아미노기와 반응할 수 있다. 이와 같이 이미노기가 형성되어 수소첨가될 수 있다.
따라서, 본 발명은 아미노기인 Q를 포함하는 폴리머 유도체가 알파-케토 카복실산과 더욱 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
시알산 또는 그의 유도체에 관해서는, 생체적합성, 특히 인체에서 발견되는 당으로 N- 및/또는 O-아세틸화되어 있는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 네우람산 또는 시알산은 N-아세틸 네우람산이다. 이들 화합물은 스페이서로서의 기능을 수행하기 위해서 피라노스구조이기 때문에 소망의 강직성을 나타낸다. 한편, 선택적인 산화를 통해 이들 화합물에 알데하이드기를 도입하는 것도 가능하다. 시알산은 인체에서, 예를 들어 글리코실화 단백질의 글리칸사슬에서 말단 단당류로서 발견된다.
바람직한 구체예에 있어서, 시알산은 알데하이드기로 선택적으로 산화될 수 있다.
시알산 또는 네우람산을 선택적으로 산화시키는 방법은 예를 들어 L.W. Jaques, B.F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21 - 32 and T. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669 - 673으로부터 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는 시알산의 산화는 아미노기인 Q를 함유하는 폴리머와의 반응전에 수행될 수 있다.
이어서, 임의로 산화된 시알산은 카복실산기를 통해서 폴리머의 아미노기와 반응할 수 있다.
얻어진 화합물은 알데하이드기를 함유하고, 더욱 단백질의 아미노기에 의한 환원성 아민하에 의해 반응될 수 있다.
따라서, 본 발명은 아미노기인 Q를 포함하는 폴리머 유도체가 임의로 산화된 시알산과 더욱 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
인산 피리독살(PyP)에 관해서는, 이것은 고도로 생체적합성인 이작용성 화합물로 비타민 B6라고도 칭한다. PyP는 아미노전이반응, 탈카복실화, 라세미화 및 아미노산 측쇄의 많은 변성에 관여하는 보조효소이다. 모든 효소를 필요로 하는 PyP는 아미노산과 보조효소간의 시프(Schiff) 염기의 형성을 통해 작용한다.
PyP의 인산염기는 폴리머, 바람직하게는 하이드록시알킬 스타치, 특히 하이드록시에틸 스타치와 반응해서 포스포르아마이드를 형성한다. PyP의 알데하이드기는 단백질의 아미노기와 반응해서 쉬프염기를 형성하고, 이어서 환원될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 컨쥬게이트의 구조는 HES-NH-P(O)2-O-(피리독살)-CH-NH-단백질이다.
PyP의 경우, 폴리머의 작용기 Q는 바람직하게는 전술한 바와 같은 디-아미노화합물을 이용해서 폴리머에 도입된다.
따라서, 본 발명은 아미노기인 Q를 포함하는 폴리머 유도체가 더욱 인산 피리독살과 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
아미노기를 포함하는 폴리머 유도체와, 예를 들어, 포르밀벤조산과의 반응 용매로서는, 적어도 하나의 비양자성 용매 또는 적어도 하나의 극성 용매가 바람직하다.
적절한 용매는 특히, 물, 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
아미노기를 포함하는 폴리머 유도체와 카복시기를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과의 반응용의 용매로서는, 수성 매질을 사용하는 것도 가능하다. 본 명세서에 사용되고 있는 바와 같은 용어 "수성 매질"은 함유된 용매의 중량을 기준으로 해서, 적어도 10 중량%, 더 바람직하게는 적어도 20 중량%, 더 바람직하게는 적어도 30 중량%, 더 바람직하게는 적어도 40 중량%, 더 바람직하게는 적어도 50 중량%, 더 바람직하게는 적어도 60 중량%, 더 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더 바람직하게는 적어도 80 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90 중량% 또는 100 중량%까지 범위의 물을 포함하는 용매 또는 용매의 혼합물에 관한 것이다.
상기 반응은 바람직하게는 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 15 내지 25 ℃ 온도에서, 바람직하게는 0.5 내지 24 시간, 특히 바람직하게는 1 내지 17 시간의 반응 시간 동안 수행된다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 반응은 활성화제의 존재 하에서 수행된다. 적절한 활성화제는 디이소프로필 카보디이미드(DIC), 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)와 같은 카보디이미드이고, 디이소프로필 카보디이미드(DIC)가 특히 바람직하다.
생성된 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 정제될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적절한 방법에 의해 분리하기 전에 침전시킬 수 있다.
만일 폴리머 유도체가 먼저 침전된다면, 예를 들어, 반응 혼합물이 적절한 온도에서 반응 혼합물 중에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 수성 매질, 바람직하게는 물이 용매로 사용되는 경우, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃, 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃ 범위의 온도에서, 2-프로판올 또는 아세톤과 에탄올의 혼합물, 바람직하게는 상기 화합물의 동일한 부피를 나타내는 1:1 혼합물(v/v)과 접촉시킨다.
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머 유도체는 첫째로 원심분리 또는 여과와 같은 적절한 방법에 의해, 예를 들어, 수성 2-프로판올 혼합물을 가진 반응 혼합물 또는 반응 혼합물의 혼합물로부터 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체에 투석, 원심여과 또는 가압여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 냉동건조와 같은 후-처리 등의 추가적인 처리를 가할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 분리된 폴리머 유도체는 먼저 바람직하게는 물에 대해서 투석되고, 그 후, 생성물의 원하는 사항에 따라 반응 생성물의 용매 함량이 충분히 낮을 때까지 냉동건조시킨다. 냉동건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행된다.
알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 가지는 생성된 폴리머 유도체는 이어서 환원성 아민화를 통하여 단백질 아미노기와 반응한다. 환원성 아민화에 의한, 단백질의 적어도 하나의 아미노기와 폴리머의 적어도 하나의 알데하이드기와의 커플링에 대해서는, pH 또는 온도와 같은 환원성 아민화 반응의 특이적 반응 파라미터에 관한 상기 상세한 기재를 참조하면 된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 환원성 아민화는 1 내지 8 ℃와 같은 0 내지 10 ℃ 또는 약 4 ℃와 같은 2 내지 6 ℃의 온도, 약 5.0과 같은 약 4.5 내지 5.5의 pH에서 수행된다. 반응 시간은 12 내지 19 시간과 같은 약 10 내지 20 시간, 또는 약 17 시간과 같은 14 내지 18 시간, 또는 약 24 시간과 같은 약 20 내지 30 시간이다.
그래서, 상기 언급된 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머가 그의 산화된 환원성 말단을 통하여 반응하는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식에 따른 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00052
.
상기 기재된 바와 같이, 특히 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머는 하이드록시에틸 스타치, 즉, HAS'는 HES'이고, n = 2, 3, 또는 4이며, 가장 바람직하게는 4이다. 따라서, 폴리머가 그의 산화된 환원성 말단을 통하여 반응하는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식에 따른 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00053
.
다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 폴리머가 그의 산화된 환원성 말단을 통하여 반응하는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식에 따른 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00054
상기 식에서, n = 2, 3 또는 4이고, R4는 독립적으로 수소 또는 메톡시기이며, R4가 수소인 경우 m = 0이고, R4가 메톡시인 경우 m = 1이며, HAS는 바람직하게는 HES'이다.
상기 각 화학식에서, 단백질에 부착된 질소는 단백질의 아미노기로부터 유도되고, 이때 폴리머 유도체는 알데하이드기를 통하여 결합된다.
작용기 M 및 Q가 아미노기 -NH2를 포함함에 따라 상기 언급된 구체예에 관하여, M은 아미노기 -NH2이고, Q는 베타 하이드록시 아미노기 -CH(OH)-CH2-NH2를 포함하며, 바람직하게는 베타 하이드록시 아미노기일 수 있다
따라서, 본 발명은 또한 두 개의 아미노기 M 및 Q를 포함하는 화합물의 아미노기 Q는 베타 하이드록시 아미노기 -CH(OH)-CH2-NH2인 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
이 경우에, M 및 Q는 임의의 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 스페이서는 임의로 치환된, 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기 등일 수 있다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더 바람직하게는 1 내지 20개, 더 바람직하게는 2 내지 10개, 더 바람직하게는 1 내지 6개, 특히 바람직하게는 1 내지 2개이다. 헤테로 원자가 존재한다면, 분리 기는 통상 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예를 들어, 탄소 원자수 5 내지 7개인 임의로 측쇄 알킬쇄 또는 아릴기 또는 시클로알킬기를 포함하거나, 또는 알킬 부분이 직쇄 및/또는 환식 알킬기일 수 있는 아르알킬기, 알크아릴기일 수 있다. 보다 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개, 더 바람직하게는 1 내지 6개, 더 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 1 내지 2개인 알킬쇄이다. 보다 더 바람직하게는, M 및 Q는 메틸렌기에 의해 분리된다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머가 1,3-디아미노-2-하이드록시프로판과 반응하는 상기 기재된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
폴리머가 그의 산화된 환원성 말단을 통하여 반응하는 경우, 하기 화학식에 따른 폴리머 유도체가 제공된다:
Figure 112006072272527-PCT00055
상기 식에서, 바람직하게는 HAS' = HES'이다.
M 및 Q, 특히 바람직하게는 1,3-디아미노-2-하이드록시프로판을 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응은 바람직하게는 40 내지 120 ℃, 보다 바람직하게는 40 내지 90 ℃, 가장 바람직하게는 60 내지 80 ℃의 온도에서 수행된다. 반응 시간은 바람직하게는 17 내지 168 시간, 보다 바람직하게는 17 내지 96 시간, 가장 바람직하게는 48 내지 96 시간이다. 적어도 이작용성 화합물:폴리머의 몰비는 바람직하게는 200:1 내지 10:1이고, 특히 50:1 내지 100:1이다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머의 반응 용매로서, 적어도 하나의 비양자성 용매, 바람직하게는 물 함량이 0.5 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하인 무수 비양자성 용매가 바람직하다. 안정한 용매는 특히 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
폴리머 유도체의 베타 하이드록시 아미노기 Q는 일반적으로 Q와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 포함하고 추가적으로 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기인 적어도 하나의 작용기 또는 변성되어 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 제공할 수 있는 작용기를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 베타 하이드록시 아미노기는 화학적 산화에 의해 직접 변성되어 알데하이드기를 제공한다.
이 산화는 베타 하이드록시 아미노기를 알데하이드기로 전환시킬 수 있는 모든 적합한 산화제를 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 산화제는 알칼리 금속 과옥소산과 같은 과옥소산이다. 특히 바람직한 것은 과옥소산 나트륨이고, 바람직하게는 수용액으로서 사용된다. 이 용액은 바람직하게는 1 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 1 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 1 내지 10 mM의 옥소산 농도를 가진다. 산화는 0 내지 40 ℃, 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 4 내지 20 ℃의 온도에서 수행된다..
얻어진 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적합한 방법에 의해 반응 혼합물로부터 정제될 수 있다. 필요하다면, 폴리머 유도체는 적어도 하나의 적합한 방법에 의해 분리되기 전에 침전될 수 있다.
먼저 폴리머 유도체가 침전되면, 예를 들어 반응 혼합물을 적합한 온도에서 반응 혼합물에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물과 다른 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉시키는 것이 가능하다. 수성 매질 바람직하게는 물이 용매로서 사용되는 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 반응 혼합물은 바람직하게는 -20 내지 +50 ℃, 특히 바람직하게는 -20 내지 25 ℃ 범위의 온도에서, 2-프로판올 또는 아세톤과 에탄올의 혼합물, 바람직하게는 상기 화합물의 동일한 부피를 나타내는 1:1 혼합물(v/v)과 접촉시킨다.
폴리머 유도체의 분리는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 폴리머 유도체는 먼저 반응 혼합물 또는 반응 혼합물과 예를 들어 수성 2-프로판올 혼합물의 혼합물로부터 원심분리 또는 여과와 같은 적합한 방법에 의해 분리된다. 두번째 단계에서, 분리된 폴리머 유도체는 투석, 원심분리 여과 또는 압력 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조와 같은 후-처리 등의 추가의 처리가 수행될 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서, 분리된 폴리머 유도체는 먼저 바람직하게는 물에 대해서 투석된 후, 반응 생성물의 용매 함량이 생성물의 바람직한 설명에 따라 충분히 낮아질 때까지 동결건조된다. 동결건조는 20 내지 35 ℃, 바람직하게는 20 내지 30 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 과옥소산염을 이용하여 베타 하이드록시 아미노기 Q의 산화가 수행되는 전술한 바와 같은 방법 및 콘쥬케이트에 관한 것이다.
그러므로, 본 발명은 또한 폴리머가 산화된 환원성 말단을 가지는 경우에 베타 하이드록시 아미노기를 가지는 폴리머 유도체, 바람직하게는 하기 화학식:
Figure 112006072272527-PCT00056
(상기 식에서, 바람직하게는 HAS' = HES'임)의 화합물을 바람직하게는 과옥소산에 의해, 알데하이드기를 가지는 폴리머 유도체, 특히 바람직하게는 하기 화학식의 화합물:
Figure 112006072272527-PCT00057
(상기 식에서, 바람직하게는 HAS' = HES'임)을 지닌 폴리머로 산화시켜 콘쥬케이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 전술한 카복시기 또는 반응성 카복시기 및 알데하이드, 케토 혹은 아세탈기를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 상기 표시한 1-아미노 2-하이드록시 구조를 포함하는 화합물을 반응시켜, 폴리머 유도체를 얻고, 단백질의 아미노기에 의해 환원성 아민화를 행할 수 있다.
그 후, 형성된 알데하이드기 A를 가지는 폴리머 유도체를 단백질과 반응시킨다. 따라서, 본 발명은 또한 폴리머가 산화된 환원성 말단을 가지는 경우에 베타 하이드록시 아미노기를 가지는 폴리머 유도체, 바람직하게는 하기 화학식의 화합물을 단백질의 아미노기와 반응시키는 것을 포함하는 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00058
상기 식에서, 특히 HAS' = HES'이다.
이어서, 얻어진 알데하이드기를 가지는 폴리머 유도체를 환원성 아민화에 의해 단백질의 아미노기와 반응시킨다. 환원성 아민화에 의한 단백질의 적어도 하나의 아미노기와 폴리머의 적어도 하나의 알데하이드기의 커플링에 관해서는 상기 상세히 설명한 내요을 참조하면 된다.
따라서, 상기 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머가 산화된 환원성 말단을 가지는 경우, 본 발명은 또한 하기 화학식의 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00059
(상기 식에서, 특히 HAS' = HES'임). 상기 식에서, 단백질에 부착된 질소는 알데하이드기를 통해 폴리머 유도체에 연결된 단백질의 아미노기로부터 유래된다.
본 발명의 추가적인 구체예에서, 폴리머는 먼저 적합한 화합물과 반응하여 적어도 하나의 반응성 카복시기를 포함하는 제 1 폴리머 유도체를 제공한다. 상기 제 1 폴리머 유도체는 그 후 추가적으로 그의 적어도 하나의 작용기가 폴리머 유도체의 적어도 하나의 반응성 카복시기와 반응하고, 적어도 하나의 다른 작용기가 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기, 또는 화학적으로 변성되어 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 제공하는 작용기인 적어도 이작용성 화합물과 반응하고, 얻어진 상기 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 포함하는 폴리머 유도체는 상술한 환원성 아민화를 통해서 단백질의 적어도 하나의 아미노기와 반응한다. 각 화합물 간의 반응 순서는 변경될 수도 있다.
상기 추가적 구체예의 제 1 변형예에 따르면, 적어도 하나의 반응성 카복시기를 포함하는 폴리머는 그의 환원성 말단에서 선택적으로 환원되고, 이어서 하기 화학식(IIa)의 락톤 및/또는 하기 화학식(IIb)의 카복실산, 또는 알칼리 금속염, 바람직하게는 나트륨 및/또는 칼륨염과 같은 상기 카복실산의 적합한 염인 산화된 폴리머를 적합한 화합물과 반응시켜 적어도 하나의 반응성 카복시기를 포함하는 폴리머를 제공한다:
Figure 112006072272527-PCT00060
Figure 112006072272527-PCT00061
상기 식에서, 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
폴리머, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치의 산화는 상기 구조 (IIa) 및/또는 (IIb)를 갖는 화합물을 야기하는 각 방법 또는 조합된 방법에 따라 수행될 수 있다.
산화가 하이드록시 알킬 스타치의 산화된 환원성 말단을 형성하는 모든 적합한 방법(들)에 따라 수행될 수 있지만, 예를 들어 DE 196 28 705 A1에 기재된 알칼리성 요오드 용액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하고, 상기 문헌의 내용(제 9 컬럼 6 내지 24행의 실시예 A)은 참고로서 여기에 편입되어 있다.
그의 환원성 말단이 선택적으로 산화된 폴리머에 반응성 카복시기를 도입하는 것은 생각할 수 있는 모든 방법 및 적합한 모든 화합물에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 특별한 방법에 따르면, 그의 환원성 말단이 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원성 말단에서 적어도 하나의 알코올, 바람직하게는 25 ℃에서 6 내지 12, 또는 7 내지 11 범위의 pKA 값을 가지는 산성 알코올과 같은 적어도 하나의 산성 알코올과 반응한다. 산성 알코올의 분자량은 90 내지 300 g/몰 또는, 100 내지 200 g/몰과 같이 80 내지 500g/몰의 범위일 수 있다.
안정한 산성 알코올은 산성 양성자를 가지는 모든 알코올 H-O-RA이고 산화된 폴리머와 반응하여 각각의 반응성 폴리머 에스테르, 바람직하게는 하기 식의 반응성 폴리머 에스테르:
Figure 112006072272527-PCT00062
보다 바람직하게는 하기 식:
Figure 112006072272527-PCT00063
의 반응성 폴리머 에스테르를 제공할 수 있다.
바람직한 알코올은 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 같은 N-하이드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀류, 또는 하이드록시 벤조트리아졸과 같은 하이드록시아졸류이다. 특히 바람직한 것은 N-하이드록시 숙신이미드류이고, N-하이드록시숙신이미드 및 설포-N-하이드록시숙신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올은 단독으로 사용되거나 그의 둘 이상의 적합한 조합으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에서, 예를 들어 탄산 디에스테르의 첨가와 같이 각각의 알코올을 방출하는 화합물을 사용하는 것도 또한 가능하다.
그러므로, 본 발명은 또한 산화된 폴리머와 산성 알코올, 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드 및/또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 반응시킴으로써 그의 환원성 말단이 선택적으로 산화된 폴리머를 활성화시키는 상기 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 그의 환원성 말단이 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원성 말단에서 RB 및 RC가 같거나 다를 수 있는 적어도 하나의 탄산 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC와 반응한다. 바람직하게는, 이 방법은 하기 식에 따른 반응성 폴리머를 제공한다:
Figure 112006072272527-PCT00064
상기 식에서, HAS'는 바람직하게는 HES'이다.
적합한 탄산 디에스테르 화합물로서, 그의 알코올 성분이 독립적으로 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 같은 N-하이드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀류, 또는 하이드록시 벤조트리아졸과 같은 하이드록시아졸류인 화합물이 사용될 수 있다. 특히, 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이고, 보다 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이다.
그러므로, 본 발명은 또한 산화된 폴리머를 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시킴으로써 그의 환원성 말단이 선택적으로 산화된 폴리머를 활성화시키는 상기 방법에 관한 것이다.
산성 알코올은 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 바람직하게는 5:1 내지 50:1, 보다 바람직하게는 8:1 내지 20:1의 산성 알코올:폴리머의 몰비로, 바람직하게는 2 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ℃, 가장 바람직하게는 15 내지 25 ℃의 반응 온도에서 반응한다. 반응시간은 바람직하게는 1 내지 10 시간, 보다 바람직하게는 2 내지 5 시간, 보다 바람직하게는 2 내지 4 시간이고, 특히 2 내지 3 시간의 범위이다.
탄산 디에스테르 화합물은 산화된 폴리머 또는 산화된 폴리머의 염과 일반적으로 디에스테르 화합물:폴리머의 몰비 1:1 내지 1.5:1과 같이 1:1 내지 3:1로 반응한다. 반응시간은 일반적으로 0.2 내지 6 시간 또는 0.5 내지 2 시간 또는 0.75 내지 1.25 시간과 같이 0.1 내지 12 시간이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 산화된 폴리머와 산성 알코올 및/또는 탄산 디에스테르의 반응은 물 함량이 0.5 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하인 무수 비양자성 용매와 같은 적어도 하나의 비양자성 용매 내에서 수행된다. 안정한 용매는 특히 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다. 반응 온도는 바람직하게는 2 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ℃의 범위이다.
산화된 폴리머와 적어도 하나의 산성 알코올의 반응을 위해, 추가적으로 적어도 하나의 활성화제가 사용된다.
적합한 활성화제는 특히 카보닐디이미다졸, 디이소프로필 카보디이미드(DIC), 디시클로헥실 카보이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드(EDC)와 같은 카보이미드류이고, 보다 바람직한 것은 디시클로헥실 카보이미드(DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드(EDC)이다.
그러므로, 본 발명은 또한 그의 환원성 말단이 산화된 폴리머를 추가적인 활성화제의 존재하에 산성 알코올과 반응시켜 반응성 폴리머 에스테르를 제공하는 상기 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 산화된 폴리머와 탄산 디에스테르 및/또는 산성 알코올의 반응은 물 대 반응 혼합물의 부피비가 10:1이 되도록 물에 반응 혼합물에 첨가함으로써 결정될 수 있는 낮은 염기 활성에서 수행된다. 첨가 전, 본질적으로 완충액을 포함하지 않는 물은 25 ℃에서 pH 값이 7이다. 반응 혼합물을 첨가하고 pH를 측정함으로써 반응 혼합물의 염기 활성을 얻으며, 바람직하게는 9.0 이하, 보다 바람직하게는 8.0 이하, 가장 바람직하게는 7.5 이하의 값을 가진다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 산화된 폴리머는 EDC를 지닌 물의 부재하에 드라이 DMA 내에서 N-하이드록시 숙신이미드와 반응하여 하기 식의 폴리머 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르를 선택적으로 제공한다:
Figure 112006072272527-PCT00065
식 중, 보다 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
놀랍게도, 이 반응은 EDC와 HES의 OH기와의 반응으로부터 야기되는 부산물을 제공하지 않고, EDC 및 산화된 폴리머에 의해 형성된 O-아실 이소우레아의 각각의 N-아실 우레아로의 자리옮김(rearrangement)을 현저히 억제한다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 산화된 폴리머는 물 및 활성화제의 부재하에 드라이 DMF 내에서 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트와 반응하여 선택적으로 하기 화학식의 폴리머 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르를 제공한다.
Figure 112006072272527-PCT00066
식 중, 보다 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 그의 환원성 말단이 선택적으로 산화된 폴리머는 산화된 환원성 말단에서 카보닐디이미다졸 또는 카보닐디벤지이미다졸과 같은 아졸리드와 반응하여 반응성 카복시기를 가지는 폴리머를 제공한다. 카보닐디이미다졸의 경우에, 하기 화학식의 반응성 이미다졸리드 폴리머 유도체가 형성된다:
Figure 112006072272527-PCT00067
식 중, 보다 바람직하게는 HAS'는 HES'이다.
폴리머에 적어도 하나의 반응성 카복시기를 도입하는 것과 관련된 본 발명의 추가적인 별도의 2번째 구체예에 따르면, 폴리머 중 적어도 하나의 하이드록시기와 탄산 디에스테르를 반응시킴으로써 반응성 카복시기가 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머에 도입된다.
그러므로, 본 발명은 또한 폴리머 중의 적어도 하나의 하이드록시기와 적어도 하나의 탄산 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC(식 중, RB 및 RC는 같거나 다를 수 있음)를 반응시킴으로써 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머에 반응성 카복시기를 도입하는 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머는 적어도 하나의 하이드록시기에서 카보닐디이미다졸, 카보닐-디-(1,2,4-트리아졸) 또는 카보닐 디벤즈이미다졸과 같은 아졸리드와 반응하여 반응성 카복시기를 가지는 폴리머를 제공한다.
적합한 탄산 디에스테르 화합물로서, 그의 알코올 성분이 독립적으로 N-하이드록시 숙신이미드 또는 설포-N-하이드록시 숙신이미드와 같은 N-하이드록시 숙신이미드류, p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀과 같은 트리클로로페놀, 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀과 같은 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀과 같은 적절히 치환된 페놀류, 또는 하이드록시 벤조트리아졸과 같은 하이드록시아졸류인 화합물이 사용될 수 있다.
특히 바람직한 것은 RB 및 RC가 같은 대칭 탄산 디에스테르 화합물이다. 탄산 디에스테르의 알코올 성분은 바람직하게는 N-하이드록시 숙신이미드, 설폰화된 N-하이드록시 숙신이미드, N-하이드록시 벤조트리아졸, 및 니트로- 및 할로겐-치환된 페놀로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 니트로페놀, 디니트로페놀, 트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀 및 펜타플루오로페놀이 바람직하다. 특히 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 및 설포-N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이고, 보다 바람직한 것은 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트이다.
그러므로, 본 발명은 또한 하이드록시알킬 스타치 중의 적어도 하나의 하이드록시기, 바람직하게는 적어도 2개의 하이드록시기가 탄산 디에스테르 화합물과 반응하여 각각의 반응성 에스테르를 제공하는 하이드록시알킬 스타치 유도체, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머와 적어도 하나의 탄산 디에스테르 화합물과의 반응은 2 내지 40 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ℃, 가장 바람직하게는 15 내지 25 ℃의 온도에서 수행된다. 바람직한 반응시간은 0.5 내지 5 시간, 보다 바람직하게는 1 내지 3 시간, 가장 바람직하게는 2 내지 3 시간이다.
탄산 디에스테르 화합물:폴리머의 몰비는 미반응 폴리머 내에 존재하는 하이드록시기의 수에 대해 상대적인 탄산 디에스테르 화합물과 반응하는 하이드록시기의 수와 관련된 폴리머의 치환도에 의존한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 탄산 디에스테르 화합물:폴리머의 무수글루코오스 유닛의 몰비는 1:2 내지 1:1000, 보다 바람직하게는 1:3 내지 1:100, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1:50의 범위 내에 있고, 0.5 내지 0.001, 바람직하게는 0.33 내지 0.01 및 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.02의 범위 내의 치환도를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머와 탄산 디에스테르의 반응은 적어도 하나의 비양자성 용매, 특히 바람직하게는 0.5 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하의 물 함량을 가지는 무수 비양자성 용매 내에서 수행된다. 적합한 용매는 특히 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다.
그러므로, 본 발명은 또한 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기와 탄산 디에스테르를 반응시켜 반응성 카복시기를 제공하는 것이 무수 비양자성 극성 용매, 바람직하게는 디메틸 아세트아마이드, 디메틸 포름아마이드 또는 그의 혼합물인 용매 중에서 수행되는 전술한 바와 같은 방법에 관한 것이다.
적어도 하나의 반응성 카복시기, 바람직하게는 상술한 바와 같이 폴리머와 산성 알코올, 카보네이트 및/또는 아졸리드의 반응으로부터 얻어진 적어도 하나의 반응성 카복시기를 포함하는 반응성 폴리머 유도체는 적어도 하나의 작용기 F1이 폴리머 유도체의 적어도 하나의 반응성 카복시기와 반응하는 추가적인 적어도 이작용성 화합물과 추가로 반응한다. 추가적인 화합물의 적어도 하나의 작용기 F1은 폴리머 중의 적어도 하나의 카복시기와의 반응이 가능한 이상 특별히 제한은 없다. 바람직한 작용기 F1은, 예를 들어, 아미노기 또는 하이드록시기 또는 티오기 또는 카복시기이다.
추가적인 적어도 이작용성 화합물은 알데하이드기 또는 화학적으로 변성되어 알데하이드기를 제공할 수 있는 적어도 하나의 다른 작용기 F2를 포함한다. 화학적 변성은 예를 들어 작용기 F2와 작용기 F3인 추가적인 링커 화합물과의 반응 또는 적합한 작용기 F2의 산화 또는 환원일 수 있다.
F2가 추가적 화합물인 작용기 F3와 반응하는 경우, 작용기 F2는 특히 다음의 기로부터 선택될 수 있다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티오 기 또는 하이드록시기;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노알코올;
- 1,2-아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 아미노기 -NH2 또는, 예로서, 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기 또는 알크아릴아미노기 등의 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노기 유도체;
- 하이드록실아미노기 -O-NH2, 또는 하이드록실알킬아미노기, 하이드록실아릴아미노기, 하이드록실아르알킬아미노기 또는 하이드록살알크아릴아미노기 등의 구조 단위 -0-NH-를 포함하는 하이드록실아미노기 유도체;
- 각각 구조 단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노기, 아릴옥시아미노기, 아르알킬옥시아미노기 또는 알크아릴옥시아미노기;
- 카보닐기, -Q-C(=G)-M을 갖는 잔기
(여기에서, G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시기, 아릴옥시기, 아르알킬옥시기 또는 알크아릴옥시기;
-- 알킬티오기, 아릴티오기, 아르알킬티오기 또는 알크아릴티오기;
-- 알킬카보닐옥시기, 아릴카보닐옥시기, 아르알킬카보닐옥시기, 알크아릴카보닐옥시기;
-- N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기에서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않음)을 가지는 히드록실아민의 에스테르 등의 활성화 에스테르이고; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자이며;
Q가 존재하지 않거나 NH, 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자인 경우;
- -NH-NH2 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 기;
- 알데하이드기 또는 케토기 등의 카보닐기;
- 카복시기;
- -N=C=O 기 또는 -N=C=S 기;
- 요오드화 비닐 또는 브롬화 비닐기 또는 트리플레이트 등의 비닐 할라이드기;
- -C≡C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬
- -(C=O)-CH2-Hal기(여기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I임);
- -CH=CH-SO2-;
- -S-S-구조를 갖는 디설파이드기;
-
Figure 112006072272527-PCT00068
기;
-
Figure 112006072272527-PCT00069
기.
여기에서, F3는 상기 기 중 하나와 화학적 연결, 즉 결합을 형성할 수 있는 기이고, 바람직하게는 상기 기로부터 선택된다. 또한, 두번째 링커 화합물은 바람직하게는 환원성 아민화를 통해서 단백질의 아미노기와 반응할 수 있는 적어도 하나의 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 갖는다.
작용기 F1 및 폴리머와 반응하는 적어도 이작용성 연결용 화합물의 알데하이드 또는 케토기 또는 헤미아세탈기, 및/또는 폴리머와 반응하는 적어도 이작용성 연결용 화합물의 작용기 F1 및 F2, 및/또는 작용기 F3 및 추가적인 적어도 이작용성 연결용 화합물의 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기는 임의의 적합한 스페이서에 의해 독립적으로 분리될 수 있다. 특히, 스페이서는 임의로 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 지방족 및/또는 방향족 탄화수소 잔기이다. 일반적으로, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 60개까지, 바람직하게는 40개까지, 보다 바람직하게는 20개까지, 보다 바람직하게는 10개까지이다. 헤테로원자가 존재하면, 분리 기는 일반적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 8, 보다 바람직하게는 1 내지 6, 보다 바람직하게는 1 내지 4, 특히 바람직하게는 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로원자로는 O가 바람직하다. 탄화수소 잔기는 임의로 예를 들어 탄소 원자수 5 내지 7개인 분기된 알킬 사슬 또는 아릴기 또는 사이클로알킬기이거나, 알킬 부분이 직쇄 및/또는 환식 알킬기인 아르알킬기, 알크아릴기일 수 있다.
작용기 F1 및 F2를 가진 화합물의 예는 예를 들어 탄소 원자수 2 내지 20개인 임의로 치환된 디아미노알칸이고, 특히 바람직하게는 1,2-디아미노에탄, 1,3-디아미노프로판 및 1,4-디아미노부탄이다. 작용기 F3 및 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 가진 화합물의 바람직한 예는 예를 들어 포르밀벤조산, 4-포르밀벤조산 펜타플루오르페닐 에스테르, 4-포르밀벤조산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 및 4-(4-포밀-3,5-디메톡시페녹시)부티르산이다.
그러므로, 본 발명은 또한 폴리머, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치를 그의 임의로 산화된 환원성 말단에서 산성 알코올, 탄산 디에스테르 및 아졸리드로 구성된 군에서 선택된 화합물과 반응시켜, 적어도 하나의 반응성 카복시기를 함유하는 폴리머 유도체를 제공하고, 상기 폴리머 유도체를 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기 또는 화학적으로 변성되어 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 제공할 수 있는 작용기를 포함하는 폴리머 유도체를 제공하며, 임의로 상기 작용기를 화학적으로 변성시켜 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 함유하는 폴리머 유도체를 제공하고, 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 함유하는 상기 폴리머 유도체를 환원성 아민화를 통해 단백질의 아미노기와 반응시키는 것을 포함하는 콘쥬케이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은, 폴리머를 그의 임의로 산화된 환원성 말단에서 산성 알코올, 탄산 디에스테르 및 아졸리드로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물과 반응시켜 적어도 하나의 반응성 카복시기를 포함하는 폴리머 유도체를 수득하고, 폴리머 유도체를 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 알데하이드기 또는 케토기 또는헤미아세탈기, 또는 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 제공하기 위하여 화학적으로 변성될 수 있는 작용기를 포함하는 폴리머 유도체를 수득하고, 임의로 상기 작용기를 화학적으로 변성시켜 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 포함하는 폴리머 유도체를 수득하고, 알데하이드기 또는 케토기 또는 헤미아세탈기를 포함하는 폴리머 유도체를 환원성 아민화에 의해 단백질의 아미노기와 반응시키는 것을 포함하는, 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 의해 수득될 수 있는, 폴리머, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치, 및 서로 공유결합된 단백질을 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다.
작용기 F1 및 알데하이드기를 제공하도록 산화되는 작용기 F2를 갖는 화합물의 특정 일례로서는, F1로서의 아미노기와 F2로서의 베타 하이드록시 아미노기를 포함하는 화합물을 포함한다. 특히 바람직한 예로 1,3-디아미노-2-하이드록시프로판이다. 베타 하이드록시 아미노기를 알데하이드기로 전환시킬 수 있는 모든 적절한 산화제를 사용하여 산화 반응이 수행될 수 있다. 바람직한 산화제는 페리오데이트, 예로서, 알칼리 금속 과옥소산염이다. 특히 수용액으로서 사용할 수 있는 과옥소산 나트륨이 바람직하다. 이 용액의 바람직한 요오드산염 농도는 1 내지 50 mM, 더욱 바람직하게는 1 내지 25 mM, 특히 바람직하게는 1 내지 10 mM이다. 0 내지 40℃, 바람직하게는 0 내지 25℃, 특히 바람직하게는 4 내지 20℃의 온도에서 산화를 수행한다.
적어도 적절한 하나의 방법에 의해, 생성된 폴리머 유도체를 반응 혼합물로부터 정제할 수 있다. 필요한 경우, 적어도 적절한 하나의 방법에 의해 분리하기 전에 폴리머 유도체를 침전시킬 수 있다.
폴리머 유도체가 먼저 침전되는 경우, 예를 들면, 적절한 온도에서 반응 혼합물을 해당 반응 혼합물에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물과 접촉시킬 수 있다. 수성 매질, 바람직하게는 물을 용매로서 사용하는 특히 바람직한 본 발명의 일구체예에 따르면, 바람직하게는 -20℃ 내지 +50℃ 범위, 바람직하게는 -20 내지 25℃ 범위의 온도에서 반응 혼합물을 2-프로판올과 접촉시키거나 아세톤 및 에탄올 혼합물, 바람직하게는 동일 체적의 화합물을 나타내는 1:1 혼합물(v/v)과 접촉시킨다.
하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 적절한 과정에 의해 폴리머 유도체의 분리를 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일구체예에 따르면, 폴리머 유도체는 먼저 원심분리 또는 여과 등의 적절한 방법에 의해 반응 혼합물 또는 반응 혼합물의 혼합물을 예를 들어, 수성 2-프로판올 혼합에 의해 분리된다. 제 2단계에서, 분리된 폴리머 유도체를 투석, 원심분리 여과 또는 가압 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조 등의 후처리로 추가로 처리할 수 있다. 더욱더 바람직한 일구체예에 따르면, 분리된 폴리머 유도체를 먼저 바람직하게는 물에 대하여 투석시킨 후, 생성물의 바람직한 사양에 따라 반응 생성물의 용매 함량이 충분히 낮아질 때까지 동결건조시킨다. 동결건조는 20 내지 35℃, 바람직하게는, 20 내지 30℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일구체예에 따르면, 폴리머 또는 폴리머 유도체의 작용기 A와 반응하는 단백질의 작용기 Z는 티올기이고, 여기서 상기 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된다.
티올기는 그 자체로서 단백질에 존재할 수 있다. 또한, 적절한 방법에 따라 단백질 속으로 티올기를 도입할 수 있다. 특히, 화학적 방법을 들 수 있다. 디설파이드 가교가 단백질내에 존재하는 경우, -S-S-구조를 환원시켜 티올기를 얻을 수 있다. 아미노기를 통해 폴리펩티드를 적어도 2개의 상이한 작용기(여기에서, 이중 하나는 아미노기와 반응할 수 있고, 나머지 하나는 SH 기 또는 SH 기의 전구체임)을 갖는 화합물과의 반응에 의해 폴리펩티드에 존재하는 아미노기를 SH기로 전환시킬 수 있다. 시스테인 또는 적절한 SH 작용성 아미노산을 단백질내로 도입하거나, 시스테인을 단백질로부터 제거하여 단백질 중의 또 다른 시스테인을 무력화시켜 디설파이드 가교를 형성하는 등의 단백질의 돌연변이에 의해 SH 기를 도입시키는 것도 가능하다.
가장 바람직하게는, 폴리머는 단백질의 유리 시스테인, 특히 바람직하게는 IFN 베타의 17번 위치의 유리 시스테인(17번 위치에서 시스테인을 지닌 변이체인 경우), IFN 알파의 1 및/또는 98번 위치의 시스테인에 결합된다.
제 1 구체예에 따르면, 단백질의 작용기 Z는 티올기이고, 폴리머의 작용기 A는 할로겐아세틸기이고, 여기서, A는 폴리머를 그의 임의로 산화된 환원성 말단에서 각각 아미노기를 포함하는 적어도 2개의 작용기를 갖는 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 아미노기를 포함하는 적어도 하나의 작용기를 갖는 폴리머 유도체를 제공하고, 이 폴리머 유도체를 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응시킴으로써 도입된다.
각각 아미노기를 포함하는 적어도 2개의 작용기를 갖는 적어도 이작용성 화합물과 관련하여, 폴리머의 임의의 환원성 말단에서 반응하여 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응할 수 있는 아미노기를 포함하는 폴리머 유도체를 제공하는 모든 화합물을 고려할 수 있다.
바람직한 구체예에 의하면, 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는, 적어도 이작용성 화합물중 하나의 작용기는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00070
(상기 식에서, G는 O 또는 S이고, 2개가 존재하는 경우, 독립적으로 O 또는 S이고, R'은 메틸임).
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물중 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 작용기는 아미노기 -NH2이다. 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 이 작용성 기, 가장 바람직하게는, 아미노기는 폴리머의 산화된 환원성 말단과 반응한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물중 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응하는 작용기는 아미노기 -NH2이다.
적어도 작용성 화합물 중의, 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단, 바람직하게는 산화된 환원성 말단과 반응하는 아미노기 -NH2 및 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체인 두 작용기는 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 특히 스페이서는 임의로 치환된, 직쇄, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기일 수 있다. 적절한 치환체는 특히 알킬, 아릴, 아르알킬, 알크아릴, 할로겐, 카보닐, 아실, 카복시, 카복시에스테르, 하이드록시, 티오, 알콕시 및/또는 알킬티오기이다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 더욱 바람직하게는 2 내지 10개, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개이다. 헤테로원자가 존재하는 경우, 분리 기는 일반적으로 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는다. 탄화수소 잔기는 예를 들어 5 내지 7개의 탄소원자를 지닌 임의의 분기된 알킬쇄 또는 아릴기 또는 사이클로알킬기를 포함할 수 있거나, 알킬 부분이 직쇄및/또는 환식 알킬기일 수 있는 아르알킬기, 알크아릴기일 수 있다. 더욱더 바람직한 구체예에 따르면, 탄화수소 잔기의 탄소 원자수는 1 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 8인 알킬 쇄이다. 따라서, 바람직한 적어도 이작용성 화합물은 이작용성 아미노 화합물, 특히 바람직하게는 1,8-디아미노 옥탄, 1,7-디아미노 헵탄, 1,6-디아미노 헥산, 1,5-디아미노 펜탄, 1,4-디아미노 부탄, 1,3-디아미노 프로판 및 1,2-디아미노 에탄이다. 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물은 디아미노폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 하기 식:
H 2 N -( CH 2 - CH 2 -O) m - CH 2 - CH 2 - NH 2
(여기에서, m은 정수이고, m은 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4임)에 의한 디아미노폴리에틸렌글리콜이다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머를 그의 산화된 환원성 말단에서 1,8-디아미노옥탄, 1,7-디아미노헵탄, 1,6-디아미노헥산, 1,5-디아미노펜탄, 1,4-디아미노부탄, 1,3-디아미노프로판 및 1,2-디아미노에탄과 반응시켜 하기 식에 의한 폴리머 유도체를 형성하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00071
여기에서, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머를 그의 산화된 환원성 말단에서 H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(여기에서, m은 1, 2, 3 또는 4임)과 반응시켜 하기 식에 의한 폴리머 유도체를 형성하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이며:
Figure 112006072272527-PCT00072
여기에서, m은 1, 2, 3, 또는 4이고, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다.
폴리머, 바람직하게는 하이드록시에틸 스타치의 환원성 말단의 산화는 각 방법에 따라 또는 이들 방법을 조합해서 수행하여 하기 구조식(IIa) 및/또는 (IIb)의 화합물을 수득할 수 있다:
Figure 112006072272527-PCT00073
Figure 112006072272527-PCT00074
.
하이드록시알킬 스타치의 산화된 환원성 말단을 형성하는 모든 적절한 방법 또는 방법들에 따라 산화를 수행할 수 있지만, 예로서 DE 196 28 705 A1(제 9 컬럼 6 내지 24행의 실시예 A; 각 내용은 본 명세서에서 참고 문헌으로서 병합됨)에 기술된 바와 같은 알칼리성 요오드 용액을 사용하여 바람직하게 수행된다.
적어도 이작용성 화합물과 폴리머와의 반응으로부터 얻어지는 폴리머 유도체는 추가로 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응시킨다.
모노할로겐-치환된 아세트산 또는 반응성 산으로서는, Cl-치환된, Br-치환된 및 I-치환된 아세트산이 바람직하다.
할로겐-치환된 산을 그 자체로서 사용하는 경우, 활성제의 존재하에 산을 폴리머 유도체와 반응시키는 것이 바람직하다. 적절한 활성제는 특히 디이소프로필 카보디이미드(DIC), 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 등의 카보디이미드이고, 특히 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)가 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머, 바람직하게는 HES를 디아미노 화합물, 바람직하게는 디아미노알칸을 2 내지 8개의 탄소 원자 또는 H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(여기에서, m = 1, 2, 3 또는 4임)와 반응시키고 얻어진 폴리머 유도체를 활성제, 바람직하게는 EDC의 존재하에 Br-치환된 및 I-치환된 아세트산과 반응시키는, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 식에 의한 폴리머 유도체에 관한 것이며:
Figure 112006072272527-PCT00075
(여기에서, X =Cl, Br 또는 I이고, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이며, 상기 폴리머는 HES인 것이 특히 바람직하고, 또는 하기 식에 의한 폴리머 유도체에 관한 것이며:
Figure 112006072272527-PCT00076
여기에서, X =Cl, Br 또는 I이고, m =1, 2, 3 또는 4이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다.
폴리머 유도체와 할로겐-치환된 아세트산과의 반응은 바람직하게는 수계, 바람직하게는 물 중, 바람직한 pH 3.5 내지 5.5, 더욱 바람직하게는 4.0 내지 5.0, 특히 바람직하게는 4.5 내지 5.0, 바람직한 반응온도 4 내지 30℃, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 20 내지 25℃에서; 바람직한 반응시간 1 내지 8 시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 6시간, 특히 3 내지 5 시간 동안 수행한다.
단백질과의 반응을 위해 폴리머를 포함하는 폴리머 유도체, 적어도 이작용성 화합물 및 할로겐-치환된 아세트산을 포함하는 반응 혼합물을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 폴리머 유도체를 바람직하게는 한외 여과, 후속의 침전, 임의의 세척 및 진공에서의 건조에 의해 반응 혼합물로부터 분리시킨다.
단백질과 폴리머 유도체의 반응은 바람직하게는 6.5 내지 8.5, 더욱 바람직하게는 7.0 내지 8.5, 특히 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 pH: 및 바람직하게는 4 내지 30℃, 더욱 바람직하게는 15 내지 25, 특히 바람직하게는 20 내지 25℃의 반응 온도에서; 바람직하게는 0.5 내지 8 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 6 시간, 특히 2 내지 5 시간의 반응 시간 동안 수행된다.
단백질의 티올기와 폴리머 유도체와의 반응에 의하면 폴리머 유도체와 단백질 간에 티오에테르 결합이 형성된다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머, 바람직하게는 HES를 디아미노 화합물, 바람직하게는 탄소원자수 2 내지 8개를 지닌 디아미노알칸 또는 H2N-(CH2-CH2-O)m-CH2-CH2-NH2(여기에서, m = 1, 2, 3 또는 4임)와 반응시키고, 얻어진 폴리머 유도체를 활성제, 바람직하게는 EDC의 존재하에 Br-치환된 및 I-치환된 아세트산과 반응시키고, 생성된 폴리머 유도체를 단백질의 티올기와 반응시켜 폴리머 유도체 및 단백질 사이의 티오에테르 결합을 포함하는 컨쥬게이트를 형성하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 식에 따른 컨쥬게이트:
Figure 112006072272527-PCT00077
(여기에서, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, tPA 또는 A1AT이고, 바람직하게는 AIFN 알파 또는 IFN 베타이며, S원자는 IFN 베타 1a의 17번 위치의 유리 시스테인 또는 시판의 유리 시스테인으로부터 유래되거나, 또는 하기 식에 따른 컨쥬게이트:
Figure 112006072272527-PCT00078
(여기에서, m =1, 2, 3 또는 4임)에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, tPA, A1AT 또는 APC이고, 바람직하게는 AIFN 알파 또는 IFN 베타이며, S원자는 예를 들어 IFN 베타 1a의 17번 위치의 유리 시스테인으로부터 유래된다.
하이드록시에틸 스타치는 바람직하게는 평균 분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 10 kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 12 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 12kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 18kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 18kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 30kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 30kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 50 kD이고 DS가 약 0.4인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 50kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량이 약 100kD이고 DS가 약 0.7인 하이드록스에틸 스타치이다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
제 2 구체예에 따르면, 단백질의 작용기 Z는 티올기이고 폴리머의 작용기 A는 말레이미도기를 포함한다.
이 구체예에 따르면, 컨쥬게이트를 생산하는 수개의 가능성이 존재한다. 일반적으로 폴리머를 그의 임의로 산화된 환원성 말단에서 적어도 하나의 적어도 이작용성 화합물과 반응시키되, 이 적어도 이작용성 화합물은 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 하나의 작용기, 및 말레이미도기 또는 화학적으로 변성되어 말레이미도기를 포함하는 폴리머 유도체를 제공하는 적어도 하나의 작용기를 포함한다. 바람직한 구체예에 따르면, 상기 작용기는 말레이미도기를 포함하는 폴리머 유도체를 제공하기 위하여 작용기는 화학적으로 변성된다.
따라서, 본 발명은 임의로 산화된 환원성 말단에서 폴리머를 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 작용기 U를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응시키되, 적어도 이작용성 화합물은 추가로 화학적으로 변성될 수 있는 작용기 W를 포함하여 말레이미도기를 형성하고, 추가로 작용기 W를 화학적으로 변성시켜 말레이미도기를 형성하는 것을 포함하는, 말레이미도기를 포함하는 폴리머 유도체를 단백질의 티올기와 반응시킴으로써, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
작용기 U와 관련하여, 폴리머의 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 각 작용기를 고려할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 U는 화학 구조 -NH-를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 작용기 U는 화학 구조 -NH-를 포함하는 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 U는 구조식 R'-NH-(여기에서, R'은 수소, 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기이고, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬,아릴사이클로알킬, 알크아릴 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 NH 기에 직접 결합할 수 있거나, 또다른 구체예에 따르면, NH 기에 산소 가교에 의해 결합할 수 있다)를 갖는 기이다. 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알크아릴, 또는 사이클로알킬아릴 잔기는 적절하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환체로서, 할로겐, F, Cl 또는 Br 등의 할로겐이 언급될 수 있다. 특히 바람직한 잔기 R'은 수소, 알킬 및 알콕시기이고, 더욱더 바람직하게는 수소 및 비치환된 알킬 및 알콕시기이다.
알킬 및 알콕시기중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 C 원자를 갖는 기가 바람직하다. 더 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로폭시기이다. 특히 바람직하게는 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시이고 특히 바람직하게는 메틸 또는 메톡시이다.
따라서, 본 발명은 또한 R'이 수소 또는 메틸 또는 메톡시기인 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 U는 구조식 R'-NH-R"-(여기에서, R"은 바람직하게는 구조 단위 -NH- 및/또는 구조 단위 -(C=G)-(여기에서, G는 O 또는 S임) 및/또는 구조 단위 -S02-를 포함함)를 갖는다. 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 작용기 R"은 하기 구조로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00079
(상기 식에서, G가 2개 존재하는 경우, 독립적으로 0 또는 S임).
따라서, 본 발명은 또한 작용기 U가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00080
(상기 식에서, G는 O 또는 S이고, 2개가 존재하는 경우, 독립적으로 O 또는 S이고, R'은 메틸임).
본 발명의 더욱더 바람직한 구체예에 따르면, U는 아미노기 -NH2를 포함한다.
본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 이작용성 화합물의 작용기 W는, W를 포함하는 폴리머 유도체를 W와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고 추가로 말레이미도기를 포함하는 추가의 적어도 이작용성 화합물과 반응시킴으로써 화학적으로 변성된다.
작용기 W 및 W와 반응할 수 있는 추가의 적어도 이작용성 화합물의 작용기에 대해서는, 특히 이하의 작용기를 들 수 있다:
-C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
-티오 기 또는 하이드록시기;
-알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
-1,2-디올;
-1,2-아미노알코올;
-1,2-아미노-티오알코올;
-아지드;
-아미노기 -NH2, 또는 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기 또는 알크아릴아미노기 등의 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노기 유도체;
-하이드록실아미노기 -O-NH2, 또는 하이드록실알킬아미노기, 하이드록실아릴아미노기, 하이드록실아르알킬아미노기 또는 하이드록살알크아릴아미노기 등의 구조 단위 -0-NH-를 포함하는 하이드록실아미노기 유도체;
-각각 구조 단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노기, 아릴옥시아미노기, 아르알킬옥시아미노기 또는 알크아릴옥시아미노기;
-카보닐기, -Q-C(=G)-M을 갖는 잔기
(여기에서, G는 O 또는 S이고, M은 예로서,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시기, 아릴옥시기, 아르알킬옥시기 또는 알크아릴옥시기;
-- 알킬티오기, 아릴티오기, 아르알킬티오기 또는 알크아릴티오기;
-- 알킬카보닐옥시기, 아릴카보닐옥시기, 아르알킬카보닐옥시기, 알크아릴카보닐옥시기;
-- N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기에서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않음)을 가지는 히드록실아민의 에스테르 등의 활성화 에스테르이고; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자이며;
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 기;
- 알데하이드기 또는 케토기 등의 카보닐기;
- 카복시기;
- -N=C=O 기 또는 -N=C=S 기;
- 요오드화 비닐 또는 브롬화 비닐기 또는 트리플레이트 등의 비닐 할라이드기;
- -C≡C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬
- -(C=O)-CH2-Hal기(여기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I임);
- -CH=CH-SO2-;
- 구조식 -S-S-를 갖는 디설파이드기;
- 기;
-
Figure 112006072272527-PCT00082
기이고,
여기에서, W 및 추가의 적어도 이작용성 화합물의 작용기는 각각 상기 언급한 기중 하나와 화학 결합을 형성할 수 있는 기이다.
본 발명의 더욱더 바람직한 구체예에 따르면, W는 아미노기 -NH2를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, W 및 다른 작용기 둘 모두는 상기 기 리스트로부터의 기이다.
본 발명의 구체예에 따르면, 이들 작용기중 하나는 티오기이다. 특정 일례에서, 다른 작용기는 바람직하게는 하기 구조로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112006072272527-PCT00083
(상기 식에서, Hal은 Cl, Br 또는 I, 바람직하게는 Br 또는 I임).
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 이들 작용기중 하나는 반응성 에스테르로 임의적으로 형질변환되는 카복시기, 또는 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같은 치환된 아릴 잔기를 갖는 아릴옥시 화합물이거나, N이 헤테로아릴 화합물의 일부인 구조 단위 O-N을 갖거나, N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조를 갖는 하이드록실아민의 에스테르와 같은 반응성 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 특정 경우에 있어서, 다른 작용기는 화학 구조 -NH-를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, W는 구조식 -NH-를 포함하고 추가의 적어도 이작용성 화합물은 반응성 에스테르 및 말레이미도기를 포함한다.
구조식 -NH-를 포함하는 작용기 W에 대해서는, 상기 기술된 바와 같은 작용기를 참조할 수 있고, 여기서 W는 U와 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, U 및 W는 동일하다. 더욱 바람직하게는, U 및 W는 둘 모두 아미노기를 포함한다. 특히 바람직하게는, U 및 W 둘 모두는 아미노기 -NH2이다.
본 발명의 구체예에 따르면, 폴리머는 수성 매질중 그의 비-산화된 환원성 말단에서 U 및 W를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응할 수 있다. U 및 W가 아미노기인 바람직한 구체예에 따르면, 산화된 형태로, 적어도 하나의 비양자성 용매, 특히 바람직하게는 물 함량이 0.5중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 이하인 무수 양자성 용매중에서 환원성 말단을 포함하는 폴리머를 사용하여 반응을 수행한다. 적절한 용매는 특히 디메틸 설폭사이드(DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아마이드(DMA), 디메틸 포름아마이드(DMF) 및 2개 이상의 혼합물을 들 수 있다.
특히, U 및 W가 아미노기 -NH2인 경우, U 및 W는 적절한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 특히, 스페이서는 임의로 치환된 직쇄, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기일 수 있다. 적절한 치환체는 특히 알킬, 아릴, 아르알킬, 알크아릴, 할로겐, 카보닐, 아실, 카복시, 카복시에스테르, 하이드록시, 티오, 알콕시 및/또는 알킬티오기이다. 일반적으로 탄화수소 잔기는 탄소 원자수가 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 더욱 바람직하게는 2 내지 10개, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개이다. 헤테로원자가 존재하는 경우, 분리 기는 일반적으로 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. 탄화수소 잔기는 예로서, 탄소 원자수 5 내지 7개인 임의의 분지형 알킬쇄 또는 아릴기 또는 사이클로알킬기를 포함할 수 있거나, 아르알킬기, 알크아릴기(여기에서, 알킬기부는 선형일 수 있다) 및/또는 환식 알킬기를 포함할 수 있다. 더욱더 바람직한 일면에서, 탄화수소 잔기는 탄소 원자수 1 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개인 알킬 쇄이다.
따라서, 본 발명은 또한 폴리머를 그의 산화된 환원성 말단에서 1,4-디아미노부탄, 1,3-디아미노프로판 또는 1,2-디아미노에탄과 반응시켜 하기 화학식에 따른 폴리머 유도체를 형성하는, 상기 기술된 바와 같은 방법 및 컨쥬게이트에 관한 것이며, 상기 폴리머는 HES인 것인 특히 바람직하다:
Figure 112006072272527-PCT00084
(상기 식에서, n = 2, 3, 또는 4임).
상기 언급된 바람직한 구체예에 따르면, 아미노기를 함유하는 폴리머 유도체를 반응성 에스테르기 및 말레이미도기를 함유하는 적어도 이작용성 화합물과 추가로 반응시킨다. 반응성 에스테르기 및 말레이미도기는 적합한 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 이 스페이서에 대해서는 작용기 U 및 W 간의 스페이서를 참조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 반응성 에스테르기 및 말레이미도기는 탄소원자수 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 8, 더 바람직하게는 1 내지 6, 보다 더 바람직하게는 1 내지 4, 더욱더 바람직하게는 1 내지 2, 특히 바람직하게는 1개를 지닌 탄화수소 사슬에 의해 분리된다. 다른 바람직한 구체예에 따르면, 반응성 에스테르는 숙신이미드 에스테르이고, 특히 바람직한 구체예에 따르면, 말레이미도기 및 반응성 에스테르기를 함유하는 적어도 이작용성 화합물은 N-(알파-말레이미도아세톡시)숙신이미드 에스테르이다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 화학식의 폴리머 유도체에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00085
상기 식에서, n = 2, 3 또는 4이고, 폴리머는 바람직하게는 HES이다.
말레이미도기를 함유하는 폴리머 유도체를 단백질의 티올기와 추가로 반응시켜 티오에테르기를 통해 단백질에 결합된 폴리머 유도체를 함유하는 컨쥬게이트를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 단백질과 폴리머를 포함하는 하기 화학식에 의한 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00086
상기 식에서, n = 2, 3 또는 4, 바람직하게는 4이고, 폴리머는 바람직하게는 HES이며, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, tPA 또는 A1AT, 바람직하게는 IFN 알파 또는 IFN 베타이며, 상기 식 중의 S 원자는 예를 들어, IFN 베타 1a의 Cysl7로부터 유래된다.
하이드록시에틸 스타치는 바람직하게는 평균 분자량 약 10 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 10 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 12 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 12 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 18 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 18 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 30 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 30 kD이고 DS 약 0.7이고 또는 평균 분자량 약 50 kD이고 DS 약 0.4인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 50 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치 또는 평균 분자량 약 100 kD이고 DS 약 0.7인 히드록스에틸 스타치이다.
평균분자량 및 DS의 이들 조합의 각각에 대해서는, DS의 값이 약 0.8인 것이 바람직하다.
말레이미도기를 함유하는 폴리머 유도체와 단백질의 티올기의 반응은 바람직하게는 완충 수계에서 5.5 내지 8.5, 더 바람직하게는 6 내지 8, 특히 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 바람직한 pH 그리고 0 내지 40 ℃, 더 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 4 내지 21 ℃의 바람직한 반응 온도에서, 0.5 내지 24 시간, 더 바람직하게는 1 내지 20 시간 및 특히 2 내지 17 시간의 바람직한 반응 시간 동안 수행된다. 반응 혼합물의 적합한 pH 값은 적어도 하나의 적합한 버퍼를 첨가하여 조정할 수 있다. 바람직한 버퍼로는, 0 내지 8 M, 보다 바람직하게는 2 내지 8 M, 특히 바람직하게는 4 내지 8 M의 바람직한 농도로 우레아를 함유하고/하거나 0 내지 1% (w/v), 보다 바람직하게는 0.4 내지 1% (w/v), 특히 바람직하게는 0.8 내지 1% (w/v)의 바람직한 농도로 SDS를 함유하는 아세트산 나트륨 버퍼, 인산 또는 붕산 버퍼를 들 수 있다.
컨쥬게이트는 투석, 원심 여과 또는 압력 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조 등의 후처리와 같은 처리로 추가로 처리될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법에서의 전환율은 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 특히 적어도 98% 또는 99% 등의 95% 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00087
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00088
식 중, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소원자를 지니는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 0이며,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 임의로 적절히 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기, 바람직하게는 2 내지 60개의 탄소원자를 지니는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬 잔기이다.
본 발명은 -L-이 -(CH2)n-(여기서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 더욱 바람직하게는 2, 3, 4, 특히 바람직하게는 4인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하며, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00089
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00090
식 중, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소원자를 지니는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 0이다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00091
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00092
식 중, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소원자를 지니는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 임의로 적절히 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기, 바람직하게는 2 내지 60개의 탄소원자를 지니는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬 잔기이다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-이다:
상기 식에서,
Ra, Rb, Rc, Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고;
G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 0이고;
m은 1, 2, 3 또는 4이고, 여기에서, m개의 CRaRb기에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고;
n은 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 가장 바람직하게는 1 또는 2이고;
o는 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 가장 바람직하게는 1 또는 2이고, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있으며;
또한 정수 n 및 o는 상기 식에서 퍼옥시 부분이 없도록, 즉, n 및 o가 동시에 0이 아닌 방식으로 선택된다.
본 발명은 Ra, Rb, Rc, Rd가 수소이고, m = 2, n = 1, o = 2인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00093
식 중, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소원자를 지니는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00094
식 중, 연결구조 -O-(C=O)-는 카복시기 또는 반응성 카복시와 HAS 분자의 하이드록시기와의 반응에 의해 형성되었다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00095
및/또는
Figure 112006072272527-PCT00096
식 중, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소원자를 지니는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는, 탄소원자수 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더 바람직하게는 1 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱더 바람직하게는 1 내지 6개, 더더욱 바람직하게는 1 내지 2개, 특히 1개를 지니는 임의로 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기이고, L은 특히 CH2이다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00097
식 중, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소원자를 지니는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는, 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬 및/또는 헤테로아르알킬 부분을 포함하는 임의로 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기이고, 상기 잔기는 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 더 바람직하게는 1 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소원자를 지니며;
D는 결합이며, 바람직하게는 L1에 연결된 적절한 작용기 F2와 L2에 연결된 적절한 작용기 F3에 의해 형성되는 공유결합이다.
본 발명은 L1이 -(CH2)n-이고, 여기서 n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 더 바람직하게는 2, 3, 4, 특히 바람직하게는 4인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 L2가 임의로 적절히 치환된 아릴 부분, 바람직하게는 6개의 탄소 원자를 함유하는 아릴 부분을 포함하고, L2는 특히 바람직하게는 C6H4인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 이하의 기로 이루어진 군으로부터 선택된 기를 포함하는 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다:
- C-C- 이중 결합 또는 C-C- 삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티오기 또는 하이드록시기;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 1,2-아미노알코올;
- 아미노기 -NH2, 또는 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기 또는 알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노기의 유도체;
- 히드록실아미노기 -0-NH2, 또는 히드록실알킬아미노기, 히드록실아릴아미노기, 히드록실아르알킬아미노기 또는 하이드록살알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 히드록실아미노기의 유도체;
- 각각 구조단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노기, 아릴옥시아미노기, 아르알킬옥시아미노기 또는 알크아릴옥시아미노기;
- 카보닐기를 가지는 잔기, -Q-C(=G)-M, 여기에서, G는 O 또는 S, M은 예를 들어
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시기, 아릴옥시기, 아르알킬옥시기 또는 알크아릴옥시기;
-- 알킬티오기, 아릴티오기, 아르알킬티오기 또는 알크아릴티오기;
-- 알킬카보닐옥시기, 아릴카보닐옥시기, 아르알킬카보닐옥시기, 알크아릴카보닐옥시기;
-- N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기에서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않음)을 가지는 히드록실아민의 에스테르 등의 활성화 에스테르이고; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자이며;
- -NH-NH2 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 기;
- 알데하이드기 또는 케토기 등의 카보닐기;
- 카복시기;
- -N=C=O기 또는 -N=C=S기;
- 들어 요오드화 비닐 또는 브롬화 비닐기 또는 트리플레이트 등의 비닐 할라이드기;
- -C≡C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬
- -(C=O)-CH2-Hal기(여기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I임);
- -CH=CH-S02-;
- -S-S-구조를 갖는 디설파이드기;
-
Figure 112006072272527-PCT00098
기
-
Figure 112006072272527-PCT00099
기
상기에서, F3는 F2와 함께 화학 결합을 형성할 수 있는 작용기이고, 바람직하게는 상기 언급된 기 중에서 선택되고, F2는 바람직하게는 -NH- 부분을 포함하며, 보다 바람직하게는 아미노기를 포함하고, F3는 바람직하게는 -(C=G)- 부분, 보다 바람직하게는 -(C=O)-, 더욱 바람직하게는 -(C=G)-G- 부분, 보다 더 바람직하게는 -(C=O)-G-, 특히 바람직하게는 -(C=O)-O를 포함하고, D는 특히 바람직하게는 아마이드 결합이다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00100
상기 식에서, -CH2-N2- 부분의 탄소 원자는 개환 산화 반응에 의해 폴리머에 도입되는 알데하이드기로부터 유래되고, 질소원자는 단백질의 아미노기로부터 유래되고, HAS"는 반응에 내포된 상기 알데하이드기의 탄소원자가 없는 HAS를 의미한다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00101
상기 식에서, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소 또는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기(1 내지 10개의 탄소 원자를 가진다), 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸 기이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬 및/또는 헤테로아르알킬 부분을 함유하는 탄소 원자수 2 내지 60, 바람직하게는 2 내지 40, 더 바람직하게는 2 내지 20, 보다 더 바람직하게는 2 내지 10의 임의로 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기이고,
황 원자는 단백질의 시스테인 잔기 또는 디설파이드기로부터 유도된다.
본 발명은 또한 상술된 컨쥬게이트에 관한 것으로, 여기에서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-의 구조를 가진다:
상기 식에서, Ra, Rb, Rc, Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고,
G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 0이고,
m은 1, 2, 3 또는 4, 가장 바람직하게는 2이고, 여기에서, m개의 CRaRb기에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고,
n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4이고,
o는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2이고, 가장 바람직하게는 1이고, 여기에서, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있거나,
또는
n은 0이고,
o는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 또한, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 상기 폴리머가 하이드록시알킬 스타치(HAS)이고, 상기 단백질이 IFN 알파, IFN 베타, tPA, A1AT, 인자 VII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 하기 화학식에 따른 구조를 지니는 컨쥬게이트에 관한 것이다:
Figure 112006072272527-PCT00102
상기 식에서, R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 탄소 원자수 1 내지 10개를 지닌 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬 및/또는 헤테로아르알킬 부분을 함유하는 탄소 원자수 2 내지 60개, 바람직하게는 2 내지 40개, 더 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 10개의 임의로 치환된 직쇄, 분기쇄 및/또는 환식 탄화수소 잔기이고,
황 원자는 단백질의 시스테인 잔기 또는 디설파이드기로부터 유래된다.
본 발명은 -L-이 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다:
상기 식에서, Ra, Rb, Rc, Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고,
G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 0이고,
m은 1, 2, 3 또는 4, 가장 바람직하게는 2이고, 여기에서, m개의 CRaRb기에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고,
n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4이고,
o는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2이고, 가장 바람직하게는 1이고, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있거나,
또는
n은 0이고,
o는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 하이드록시알킬 스타치가 하이드록시에틸 스타치인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명은 하이드록시알킬 스타치의 분자량이 2 내지 200 kD, 바람직하게는 4 내지 130 kD, 더 바람직하게는 4 내지 70 kD인 전술한 바와 같은 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 인간 또는 동물 체내의 치료방법에 사용하기 위한 전술한 바와 같은 방법에 의해 얻어질 수 있는 상술된 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 순도가 저어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 특히 적어도 95% 혹은 적어도 99%를 지닐 수 있다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 컨쥬게이트의 순도는 100%일 수 있고, 즉, 다른 부산물이 존재하지 않는 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트(들)를 포함할 수 있는 조성물에 관한 것이며, 여기서, 컨쥬게이트(들)의 양은 적어도 50 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더욱더 바람직하게는 적어도 90 중량%, 특히 적어도 95 중량% 또는 적어도 99 중량%일 수 있다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 조성물은 컨쥬게이트(들)로 이루어질 수 있고, 즉, 컨쥬게이트(들)의 양은 100 중량%이다.
또, 본 발명은 전술한 방법에 의해 수득될 수 있는 치료적 유효량의 상기 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 모든 단백질-HAS 컨쥬게이트는 바람직하게는 예를 들어 정맥내(i.v.), 피하내(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 경로에 의해 투여되는 장관, 비경구 또는 폐를 통한 방법 등의 적절한 방법에 의해 투여된다. 선택된 특정 경로는 치료중인 상태에 따라 좌우된다. 바람직하게는, 컨쥬게이트는 당업계에 있어 공지된 바와 같은 적절한 캐리어(예를 들어, 부형제로서 제 1세대/무변성 생명약학에서의 알부민-무함유 또는 알부민을 함유해서 사용됨), 정맥내, 근육내 혹은 피하내 적용용의 멸균 용액 등의 적절한 희석제와 함께 투여된다. 필요한 투여량은 처치중인 상태의 중증도, 개별 환자의 반응, 사용된 투여방법 등에 따라 달라질 것이다. 당업자라면 그의 일반적인 지식에 의거해서 정확한 용량을 설정할 수 있다.
다른 측면에 의하면, 본 발명은 단백질이 인자 VIII이고, A형 혈우병의 치료 약물을 제조하기 위한 전술한 바와 같은 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트 또는 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에 의하면, 본 발명은 AT III 유전적 결핍증, 정맥폐쇄병, 화상 및 CABG(coronary arterial bypass Graft: 심장동맥우회로이식) 수술시의 헤파린 내성, 외상 또는 위장 수술로 인한 배변 천공; 환기치료와 관련된 미소응혈 형성의 방지뿐만 아니라 파종혈관내응고(DIC) 및/또는 패혈증의 치료 약물의 제조를 위한 전술한 바와 같은 HAS-AT III 컨쥬게이트 또는 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 HAS-단백질 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 HAS-AT III 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 이들 목적에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 단백질은 A1AT이고, 폐기종, 낭성 섬유증, 아토피 피부염 및/또는 기관지염의 치료용 약제의 제조를 위한 전술한 바와 같은 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트 또는 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 HAS-A1AT-컨쥬게이트를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 이들 목적에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 단백질이 tPA이고, 심근경색증(심장 기능상실), 혈전증, 혈전색전증 또는 폐쇄성 질환, 특히 폐쇄성 동맥 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 전술한 바와 같은 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트 또는 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 단백질이 APC이고, 중증 패혈증, 혈전증, 혈전색전증 또는 폐쇄성 질환, 특히 폐쇄성 동맥 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 전술한 바와 같은 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트 또는 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 단백질이 IFN 알파이고, 예를 들어 모발상 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 다발골수종과 같은 백혈병, 소포림프종, 카르시노이드 종양, 악성 흑색종과 같은 암 및 만성 B형 간염, 만성 C형 간염과 같은 간염의 치료용의 약물의 제조를 위한 전술한 바와 같은 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트 또는 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 단백질이 IFN 베타이고, 다발 경화증, 바람직하게는 다발 경화증의 재발형태의 치료용 약제의 제조를 위한 전술한 바와 같은 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트 또는 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 HAS-, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 급성 골수 백혈병을 지닌 노인의 골수 이식 또는 유도 화학요법, 골수이식접목 실패 혹은 지연, 기동(mobilization) 후, 그리고 자가이식 말초 혈액 전구 세포의 이식후의 골수 재구성용의 약제의 제조를 위한 전술한 바와 같은 GM-CSF-HAS 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 안자 VIII 또는 인자 IX에 대한 억제제를 지닌 A형 또는 B형 혈우병에서의 발작의 치료용의 약제의 제조를 위한 HAS-인자 VII 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 수술 환경에서의 출혈의 억제 및 예방을 포함하는, B형 혈우병(예를 들어, 선천 인자 IX 결함 또는 크리스마스병)을 지닌 환자에서의 출혈 발작의 억제 및 예방용의 약제의 제조를 위한 HAS-인자 IX 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
또, 본 발명은 결코 본 발명의 범위를 제한하기 위해 의도된 것이 아니 이하의 도면, 표 및 실시예에 의해 더욱 설명된다.
도 1은 실시예 1.2에 따라 제조된 HES-IFN 베타 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼(running buffer)와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품). 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 2.1(a)에 개시된 바와 같이 HES와 G-CSF(Neupogen®)의 컨쥬게이트 후의 조 생성물.
레인 C: G-CSF 출발물질.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품). 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 1.1(a)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물(Crude product).
레인 C: 실시예 1.1(b)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 D: 실시예 1.1(c)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 E: 실시예 1.1(d)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 F: 실시예 1.1(e)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 G: 실시예 1.1(f)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 H: 실시예 1.1(g)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 I: 실시예 1.1(h)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 J: 실시예 1.1(i)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 K:실시예 1.2(a)에서와 같이 제조된 산화된 IFN 베타.
도 2는 실시예 1.4에 따라 제조된 HES-IFN 베타 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다. 15 ㎕보다 많은 체적의 샘플이 이 체적으로 진공에서 농축되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 H: 실시예 1.3(a)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 IFN-베타의 컨쥬게이션.
레인 I: 실시예 1.3(b)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 IFN-베타의 컨쥬게이션.
레인 J: 대조: 알데히도HES 없이 보로수소화 나트륨으로 처리한 실시예 3.3에 따른 IFN-베타.
도 3은 실시예 2.2에 따라 제조된 HES-IFN 베타 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지 시에 따라 사용되었다. 15 ㎕보다 많은 체적의 샘플이 이 체적으로 진공에서 농축되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품). 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD5 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 E: 실시예 2.1(a)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 IFN-알파의 컨쥬게이션.
레인 F: 실시예 2.l(b)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 IFN-알파의 컨쥬게이션.
레인 G: 알데히도HES 없이 보로수소화 나트륨으로 처리한 실시예 3.3에 따른 IFN-알파.
도 4는 실시예 3.2에 따라 제조된 HES-AT III 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석결과를 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, NuPage 3-8% Tris-아세테이트 겔이 Tris-아세테이트 SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 3.1(a)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 C: 실시예 3.1(b)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 D: 실시예 3.1(c)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 E: 실시예 3.1(d)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 F: 실시예 3.1(e)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 G: 실시예 3.1(f)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 H: 실시예 3.1(g)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 I: 실시예 3.1(h)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 ATIII의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 K: 실시예 3.2에 따른 산화된 ATIII GlycoThera.
도 5는 실시예 3.4에 따라 제조된 HES-AT III 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 3-8% Tris-아세테이트 겔이 Tris-아세테이트 SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 3.3(a)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 AT III의 컨쥬게이션.
레인 C: 실시예 3.3(b)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 AT III의 컨쥬게이션.
레인 D: 대조: 알데히도HES 없이 보로수소화 나트륨으로 처리한 실시예 3.3에 따른 AT III.
도 6은 실시예 3.5에 따른 글리세롤로부터 정제된 AT III에 대한 HPGPC(High-Performance Gel Permeation Chromatography) 크로마토그램을 표시한 도면(UV 및 MALLS 검출기는 단일 크로마토그램으로 되고, x축은 시간/분에 대한 것임).
이하의 파라미터가 HPGPC 분석에 이용되었다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300 × 10 mm LD.(Pharmacia)
용리액: 27.38 mM Na2HPO4; 12.62 mM NaH2PO4; 0.2 M NaCl; 0.005 % NaN3
유량: 탈염수 1 ℓ 중 0.24 ㎖/h
검출기 1 : MALLS 검출기
검출기 2: UV(280 nm)
검출기 3: RI(굴절률 검출기)
도 7은 실시예 3.5에 따른 AT III 컨쥬게이트에 대한 HPGPC 크로마토그램을 표시한 도면(MALLS 검출기는 상부 크로마토그램이고, UV는 하부 크로마토그램이며, x축은 시간/분에 대한 것임)
이하의 파라미터가 HPGPC 분석에 이용되었다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300 × 10 mm LD.(Pharmacia)
용리액: 탈염수 1 ℓ 중 27.38 mM Na2HPO4; 12.62 mM NaH2PO4; 0.2 MNaCl; 0.005 % NaN3
유량: 0.24 ㎖/h
검출기 1 : MALLS 검출기
검출기 2: UV(280 nm)
검출기 3: RI(굴절률 검출기)
도 8은 실시예 4.2에 따라 제조된 HES-GM-CSF 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석을 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
레인 B: 실시예 4.1(a)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 C: 실시예 4.1(b)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 D: 실시예 4.1(c)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 E: 실시예 4.1(d)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 F: 실시예 4.1(e)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 G: 실시예 4.1(f)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM- CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 H: 실시예 4.l(g)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 I: 실시예 4.1(g)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 J: 실시예 4.1(h)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 GM-CSF의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 K: 실시예 4.2에 따른 산화된 GM-CSF.
도 9는 실시예 4.4에 따라 제조된 HES-GM-CSF 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석결과를 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다. 15 ㎕보다 많은 체적의 샘플이 이 체적으로 진공에서 농축되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue,®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 KD, 3 kD.
레인 H: 실시예 4.3(a)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 GM-CSF의 컨쥬게이션.
레인 I: 실시예 4.3(b)에 기재된 바와 같이 합성된 알데히도-HES와 GM-CSF의 컨쥬게이션.
레인 J: 대조: 알데히도HES 없이 보로수소화 나트륨으로 처리한 실시예 4.4에 따른 GM-CSF.
도 10은 실시예 5.2에 따라 제조된 IFN 베타 컨쥬게이트의 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 12% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품)와 함께 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 단백질 표지자 SeeBlue®Plus2(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 188 kD, 98 fcD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 fcD, 14 kD, 6 fcD, 3 kD.
레인 B: 실시예 l.l(c)에 기재된 바와 같이 제조된 하이드록시아미노HES 유도체와 산화된 IFN 베타의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 C: 산화된 IFN 베타.
도 11은 RP-HPLC 정제된 HAS-변성 IFN-β(CHO 세포)의 SDS-PAGE 겔을 표시한 도면으로, 화살표는 말단의 시알산 유도체가 결여된 형태로 인해 추측컨대 비변성 IFN-β의 이동 위치를 표시하는 한편, HAS 변성 IFN-β는 35 Kda 내지 120 Kda의 분자량에 걸친 브로드한 확산으로서 쿠마시(Coomassie) 염색된 영역을 검출하였다.
도 12는 HAS 변성 IFN-β으로부터 효소적으로 해리된 N-결합 올리고당의 HPAEC-PAD 분석결과를 표시한 도면.
도 13은 HAS 변성 IFN-β으로부터 제조된 경미한 가수분해 후의 N-결합 올리고당의 HPAEC-PAD 분석결과를 표시한 도면.
도 14A는 항트롬빈 III: 1 = 미처리 AT III; 2 = 과옥소산 처리된 AT III; 3 = HAS 변성 AT HII의 SDS-PAGE 분석결과를 표시한 도면으로; 각각 10 ㎍을 10% 폴리아마이드 겔에 적용하였다.
도 14B는 항트롬빈 III: 1 = 미처리 AT III; 2 = 과옥소산 처리된 AT III; 3 = HAS 변성 AT HII의 SDS-PAGE 분석결과를 표시한 도면으로; 각각 10 ㎍을 10% 폴리아마이드 겔에 적용하였다. 1+, 2+ 및 3+는 폴리펩타이드 N-글리코시다제에 의한 탈-N-글리코실화 후의 AT III 샘플을 나타낸다.
도 15는 실시예 8.6.b)에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드-N-글리코시다제 처 리 후에 얻어진 AT III 샘플의 N-결합 글리칸의 HPAEC-PAD 분석결과를 표시한 도면. 1 = 미처리 AT III으로부터의 N-글리칸; 2 = 경미한 과옥소산 처리된 AT III로부터의 N-글리칸; 3 = HAS-변성 AT III으로부터의 N-글리칸. A = 올리고만노-시딕 글리칸을 포함하는 천연의 올리고당(6 내지 9 개의 만노오스 잔기를 지님)의 용출 면적. B = 모노시알릴화된 N-글리칸의 용출 면적; C = 디시알릴화된 N-글리칸의 용출 면적; D = 트리시알릴화된 N-글리칸의 용출 면적. HAS-변성 N-글리칸의 용출은 흔적(trace) 번호 3에 표시되어 있다.
도 16은 폴리펩타이드-N-글리코시다제 처리 후의 AT III 샘플(실시예 8.6.b))로부터 얻어진 탈시알릴화된 N-글리칸(실시예 8.6.c) 처리된 온화한 산으로부터)의 HPAEC-PAD 분석결과를 표시한 도면. 1 = 미처리 AT III으로부터의 N-글리칸; 2 = 경미한 과옥소산 처리된 AT III로부터의 N-글리칸; 3 = HAS-변성 AT로부터의 N-글리칸. 흔적 번호 l에서, 16분에서의 용출 피크는 N-아세틸네우람산을 나타내고, 38 분에서의 피크는 N-글리콜릴네우람산을 나타낸다. 19 분에서의 주된 피크는 al-6-결합 푸코오스에 인접한 디안테나리 구조를 나타낸다. 나머지 피크는 푸코오스 없는 디안테나리, 디안테나리 - 1 갈락토오스 및 주로 6 내지 9개의 만노오스 잔기를 지닌 올리고만노스산 구조이다. HAS-변성 시알산 유도체의 용출 위치는 흔적 번호 3에 표시되어 있다.
도 17은 HAS(IOKda)-변성 GM-CSF의 SDS-PAGE 분석 결과를 표시한 도면.
1 = RP-HPLC 용리액; 2 = 재조합 인간 GM-CSF 출발물질. 사각 괄호는 C = 단지 O-글리코실화 및 비글리코실화된 형태; B = 단일의 N-글리코실화 부위가 차지하는 GM-CSF 형태; A = 탄수화물이 차지하는 2 N-글리코실화 부위를 지닌 GM-CSF의 이동 위치를 나타낸다(Forno et al., 2004 참조).
도 18은 HAS(1OKda)-변성(1OKda) GM-CSF의 SDS-PAGE 분석 결과를 표시한 도면.
1 = RP-HPLC 용리액; 2 = 폴리펩타이드 N-글리코시다제에 의한 분해 후의 RP-HPLC 용리액; 3 = 경미한 산 처리 후의 RP-HPLC 용리액. 사각 괄호는 O-글리칸에 부착된 과옥소산 산화된 시알산 잔기에서 HAS 변성된 것으로 추측되는 GM-CSF를 나타낸다.
도 19은 GM-CSF으로부터의 N-글리칸의 SDS-PAGE 분석 결과를 표시한 도면.
흔적 1 = 미처리 단백질; 흔적 2 = 경미한 과옥소산 산화된 GM-CSF; 3 = RP-HPLC에 의한 정제 후의 HAS(lOKda)-변성 GM-CSF. 화살표 A 내지 E는 아시알로(asialo), 모노-, 디-, 트리- 및 테트라시알로 올리고당의 용출 위치를 나타낸다. 출발물질의 올리고당 조성물은 주로 참조문헌 Forno et al. 2004에 기재된 바와 마찬가지였다.
도 20은 실시예 9.3에 따라 HES 유도체를 지닌 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물의 전기영동 겔을 표시한 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, NuPage 3-8% Tris-아세테이트 겔이 Tris-아세테이트 SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다. 이 겔은 제조사의 지시에 따라 Roti-Blue(독일의 칼스루에시에 소재한Carl Roth GmbH + Co. KG 제품)로 염색하였다.
레인 A: 단백질 표지자 Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD.
레인 B: 실시예 9.1(a)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물
레인 C: 실시예 9.1(b)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 D: 실시예 9.1(c)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 E: 실시예 9.1(d)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 F: 실시예 9.1(e)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 G: 실시예 9.1(f)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 H: 실시예 9.1(g)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 K: 반응 대조군.
도 21은 실시예 9.4에 따라 제조한 AT III 컨쥬게이트의 전기영동 겔을 표시한 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, NuPage 3-8% Tris-아세테이트 겔이 Tris-아세테이트 SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다. 이 겔은 제조사의 지시에 따라 Roti-Blue(독일의 칼스루에시에 소재한Carl Roth GmbH + Co. KG 제품)로 염색하였다.
레인 A: 단백질 표지자 Roti-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD.
레인 B: 실시예 9.2(b)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 C: 실시예 9.2(d)에 기재된 바와 같이 제조된 HES 유도체와 산화된 AT III의 컨쥬게이션 후의 조제의 생성물.
레인 D: 반응 대조군.
레인 E: 단백질 표지자 Roti-Mark STANDARD.
도 22는 실시예 10.3에 따른 활성화된 알돈산을 통해 결합된 IFN-알파-HES의 SEC를 표시한 도면. MALLS 및 UV-검출은 반응시 IFN-알파의 전환율이 높은 정도임을 입증하였다.
도 23은 NIH 표준 IFN-알파 2a와 비교한 인트론® A(Intron® A)의 활성을 표시한 도면(실시예 11.1 참조)
도 24는 인트론® A(왼쪽 컬럼)와 비교한 IFN-알파-HES(오른쪽 컬럼)의 시험관내 상대 활성을 나타낸 도면(실시예 11.2 참조).
도 25는 실시예 12.2의 결과를 표시한 도면(삼각형은 IFN-알파 출발물질을 나타내고, 사각형은 HES-변성 IFN 알파를 나타내고; 혈청 시료의 희석은 바이러스성 감염 대 마우스에서의 30 ㎍/kg의 정맥내 투여 후의 시간에 대한 MDBK 세포의 50% 보호를 얻는 데 필요하였다). 비변성 출발물질에 의해 처치된 마우스로부터의 혈청은 매우 낮은 항바이러스성 효과를 지닌다. HES를 지닌 IFN-알파의 변성은 실질적으로 혈청의 항바이러스성 효과를 연장시킨다.
도 26은 실시예 13의 결과를 표시한 도면(겔 전기영동에 의해 실시예 13.5에 기재된 바와 같이 제조된 조제의 알파 1 AT-HES 컨쥬게이트의 분석결과)으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Power Pac 200 전원(독일의 뮌헨시에 소재한 Bio-Rad사 제품)이 사용되었고, 3-8% Tris-아세테이트 겔이 Tris-아세테이트 SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 비염색 SDS PAGE 단백질 표지자 6.5-200KDa(SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD, 29 KD, 21 KD, 14.3 KD, 6.5 KD;
레인 B: 실시예 13.5에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션;
레인 C: 실시예 13.6에 기재된 바와 같은 HES에 대한 컨쥬게이션.
도 27은 실시예 13의 결과를 표시한 도면(이온교환 크로마토그래피 후 회수한 분획 B1-C6의 분석)(실시예 13.7 참조). 겔 전기영동에 대한 조건은 도 26을 참조한다.
레인 A: 비염색 SDS PAGE 단백질 표지자 6.5-200KDa(SERVA Elektroplioresis GmbH, Heidelberg, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD5 29 KD, 21 KD, 14.3 KD, 6.5 KD;
레인 B: 분획 Bl 레인 C: 분획 Cl 레인 D: 분획 C2
레인 E: 분획 C3 레인 F: 분획 C4 레인 G: 분획 C5
레인 H: 분획 C6 레인 I : A1AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A)
도 28은 Prolastin® HS(독일의 레베르쿠젠에 소재한 Bayer Vital GmbH사 제품, 로트 번호 PR4HA43), A1AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A) 및 실시예 13.5에 기재된 바와 같이 합성된 HES-A1AT-컨쥬게이트의 잔류효소활성 대 농도 플롯을 표시한 도면.
도 29는 실시예 14.3.1의 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 겔 전기영동에 의한 분석결과를 표시한 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 10% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 X: RotKD-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 119 KD, 88 KD5 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD;
레인 A: 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES10/0.4에 대한 컨쥬 게이션, 엔트리 A;
레인 B : 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES10/0.7에 대한 컨쥬게이션, 엔트리 B ;
레인 C: 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES30/0.4에 대한 컨쥬게이션, 엔트리 C;
레인 D: 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES30/0.7에 대한 컨쥬게이션, 엔트리 D;
레인 E: 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES50/0.4에 대한 컨쥬게이션, 엔트리 E;
레인 F: 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES50/0.7에 대한 컨쥬게이션, 엔트리 F;
레인 G: 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES 없는 반응 대조군, 엔트리 G;
레인 I: 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 알데히도HES도 없고 NaCNBH3도 없는 반응 대조군, 엔트리 I;
레인 J: 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같은 HES 10/0.4를 지닌 반응 대조군, 엔트리 J;
레인 K: 반응 대조군, 실시예 14.3.1에 기재된 바와 같이 NaCNBH3는 없지만 HES10/0.4를 지닌 반응 대조군, 엔트리 K.
도 30은 실시예 14.3.2의 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 겔 전기영동에 의한 분석결과를 표시한 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 10% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 X: Roti®-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD;
레인 A: 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션 엔트리 A;
레인 B: 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션 엔트리 B;
레인 C: 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션 엔트리 C;
레인 D: 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션 엔트리 D;
레인 E: 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션 엔트리 E;
레인 F: 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션 엔트리 F;
레인 G: 반응 대조군, 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같은 HES에 의한 반응 대조군 엔트리 G.
도 30으로부터 명백한 바와 같이, 반응 대조군 G에 대해서는 어떠한 반응도 관찰되지 않았다.
도 31은 실시예 14.3.3의 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 겔 전기영동에 의한 분석결과를 표시한 도면.
겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 10% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
겔 전기영동에 의한 조제의 IFNα-HES 컨쥬게이트의 분석
레인 A: Roti®-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD;
레인 B: 14.3.3에 기재된 바와 같은 알데히도HES130/0.8에 대한 IFNα의 컨쥬게이션;
레인 C: 14.3.3에 기재된 바와 같은 알데히도HES130/0.7에 대한 IFNα의 컨쥬게이션;
레인 D: 14.3.3에 기재된 바와 같은 HES10/0.4 나트륨에 대한 IFNα의 컨쥬게이션(반응 대조군).
도 32는 실시예 14.3.4의 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 겔 전기영동에 의한 분석결과를 표시한 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E143 전원(CONSORTnv, Turnout, B)이 사용되었고, 10% Bis-Tris 겔이 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 X: Roti®-Mark STANDARD(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD
레인 A: 실시예 14.3.4에 기재된 바와 같은 알데히도-HES에 대한 컨쥬게이션;
레인 B: 반응 대조군; 실시예 14.3.4에 기재된 바와 같은 HES에 대한 컨쥬게이션.
도 32로부터 명백한 바와 같이, 반응 대조군 B에 대해서는 어떠한 반응도 관찰되지 않았다.
도 33은 실시예 15.1에 따른 NIH 표준 rhIFN-알파 2a와 비교한 인트론® A의 증식활성을 표시한 도면 .
도 34는 실시예 15.2에 의한 비변성 IFN-알파 출발물질과 비교한 모의 배양된 IFN-알파-HES의 시험관내 상대 활성을 표시한 도면.
도 35는 실시예 15.3에 의한 비변성 IFN-알파 출발물질, 인트론® A 및 페가시스®와 각각 비교한 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 시험관내 상대 활성을 표시한 도면.
도 36은 실시예 15.4에 의한 인트론®과 비교한 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 시험관내 상대 활성을 표시한 도면.
도 37은 실시예 15.5의 결과를 표시한 그래프(IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 항바이러스 활성)
도 38은 바이러스성 감염 대 마우스에서의 30 ㎍/kg의 정맥내 투여 후의 시간에 대한 MDBK 세포의 50% 보호를 얻는 데 필요한 혈청 샘플의 희석을 나타낸 도면. 비변성 출발물질에 의해 처치된 마우스로부터의 혈청은 매우 낮은 항바이러스성 효과를 지닌다. HES를 지닌 IFN-알파의 변성은 실질적으로 혈청의 항바이러 스성 효과를 연장시킨다. 반감기는 IFN-알파의 변성에 사용된 HES의 분자량에 따라 증가한다(실시예 16 참조).
도 39는 실시예 16.3의 결과를 표시한 그래프(IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 항바이러스 활성)
도 40은 실시예 17에 따른 토끼에서의 PK-연구로부터의 데이터를 표시한 도면. IFN-알파-HES는 IFN-알파 출발물질과 비교해서 현저하게 연장된 반감기를 보인다. > 24 시간(대략 < 1000 pCi/㎖)에 대해서, 비변성 물질의 곡선은 레벨이 떨어져 활성의 더 이상의 감소는 관찰될 수 없다.
도 41은 실시예 17에 따른 토끼에서의 PK-연구 데이터를 표시한 도면. 데이터는 4시간과 24시간 사이의 기간에서 평가되었다. IFN-알파-HES는 비변성 IFN-알파 출발물질과 비교해서 현저하게 연장된 반감기를 보인다.
도 42는 실시예 17에 따른 PK-연구(12 시간까지의 기간을 표시함)의 통계학적 평가를 표시한 도면. 비변성 출발물질의 경우(도 42(a) 참조), 농도는 처음 두신간 동안 거의 0으로 떨어졌지만, IFN 알파-HES는 현저하게 연장된 반감기를 보인다(도 42 (b)).
도 43은 실시예 18.5에 기재된 바와 같이 제조된 조제의 알파 1 AT-HES 컨쥬게이트의 SDS-PAGE 분석결과를 표시한 도면으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Power Pac 200 전원(독일의 뮌헨시에 소재한 Bio-Rad사 제품)이 사용되었고, 3-8% Tris-아세테이트 겔이 Tris-아세테이트 SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 A: 비염색 SDS PAGE 단백질 표지자 6.5-200KDa(SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD, 29 KD5 21 KD, 14.3 KD, 6.5 KD;
레인 B: 알파1AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A);
레인 C: 실시예 18.5에 기재된 바와 같은 말레이미도HES에 대한 컨쥬게이션;
레인 D: 실시예 18.5에 기재된 바와 같은 말레이미도HES에 대한 컨쥬게이션(2배 농도).
도 44는 이온교환 크로마토그래피후 회수한 분획 A, B 및 C의 분석결과를 표시한 도면(실시예 18.7 참조)으로, 겔 전기영동의 경우, XCell Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Power Pac 200 전원(독일의 뮌헨시에 소재한 Bio-Rad사 제품)이 사용되었고, 3-8% Tris-아세테이트 겔이 Tris-아세테이트 SDS 러닝 버퍼와 함께(둘 다 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 환원 조건에서 제조사의 지시에 따라 사용되었다.
레인 1 : 비염색 SDS PAGE 단백질 표지자 Markl2® 2.5-200KDa(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 상단에서 하단까지의 분자량 표지자: 200 KD, 116 KD, 97 KD, 66 KD, 55 KD, 36 KD, 31 KD, 21 KD; 14 KD, 4KD.
레인 2: 분획 A.
레인 3: 분획 B.
레인 4: 분획 C.
레인 5: 알파 1 AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A).
실시예 1: IFN 베타 컨쥬게이트의 합성
실시예 1.1 하이드록시아미노 작용화된 하이드록시에틸 스타치 유도체의 합성
실시예 l.l(a) 하이드록실아미노HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 17 ㎖에 용해시키고, 20 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22 ℃에서 19시간 진탕시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙(dialysis tubing), 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본(Bonn)시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 l.l(b) 하이드록실아미노HESlO /0.7의 합성
HES10/0.7(MW = 10000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 18 ㎖에 용해시키고, 20 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22 ℃에서 19시간 진탕시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 10500 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 l.l(c) 하이드록실아미노HES5O /0.7의 합성
HES50/0.7(MW = 50000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 20 ㎖에 용해시키고, 4 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22 ℃에서 19시간 진탕시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES50/0.7의 분자량은 47000 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 l.l(d) 하이드록실아미노HES5O /0.4의 합성
HES50/0.4(MW = 50000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 20 ㎖에 용해시키고, 4 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22 ℃에서 17.5시간 진탕시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 70 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 0℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 30 ㎖로 세척하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 19.5시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES50/0.4의 분자량은 56000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 l.l(e) 하이드록실아미노HESl8 /0.4의 합성
산화된 HES는 DE 196 28 705 Al에 기재된 바와 같이 제조하였다. 산화된 HES18/0.4(MW = 18000 D, DS = 0.4) 200 ㎎을 진공 중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시(Taufkirchen)에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 65℃에서 5일간 배양 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖로 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES18/0.4의 분자량은 18000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 l.l(f) 히드라지도HESlO /0.4의 합성
산화된 HES는 DE 196 28 705 Al에 기재된 바와 같이 제조하였다. 산화된 HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 ㎎을 진공 중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시(Taufkirchen)에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 아디프산 디히드라지드(독일의 프랑크프르트/마인에 소재한 Lancaster Synthesis GmbH사 제품)를 첨가하였다. 65℃에서 5일간 배양 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖로 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 11000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 l.l(g) 카보히드라지도HESlO /0.4의 합성
산화된 HES는 DE 196 28 705 Al에 기재된 바와 같이 제조되었다. 산화된 HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 ㎎을 진공 중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시(Taufkirchen)에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 카보히드라지드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)를 첨가하였다. 65℃에서 5일간 배양 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖로 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 11000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 l.l(h) 히드라지도HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 ㎎을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 아디프산 디히드라지드(독일의 프랑크프르트/마인에 소재한 Lancaster Synthesis GmbH사 제품)를 첨가하였다. 22 ℃에서 19시간 진탕시킨 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 21 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이 었다.
실시예 l.l(i) 카보히드라지도HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 ㎎을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 카보히드라지드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)를 첨가하였다. 22 ℃에서 19시간 진탕시킨 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 21 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 1.2 IFN 베타 컨쥬게이트의 합성
실시예 1.2(a) IFN 베타의 산화
시판 제품 AVONEX™(BIOGEN) 및 Rebif(Serono)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 인터페론 베타-Ia는 (Dittmar et al., 1989)에 기재된 바와 같이 트랜스펙션되고 실시예 6.1에 기재된 바와 같이 정제된 CHO 세포 라인으로부터 발현되었다. 산화는 실시예 6.2에 기재된 바와 같이 주로 수행되고 나서, 실시예 6.3에 기재된 바와 같이 버퍼교환이 수행되었다.
실시예 1.2(b) 실시예 1.2(a)의 산화된 IFN -베타와 실시예 l.l(a) - l.l(i)의 HES 유도체와의 반응
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 산화된 IFN-베타의 용액 25.9 ㎕에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 HES-유도체의 용액 5.27 ㎕를 첨가하고, 이 용액을 22℃에서 16.5시간 배양하였다. 이하의 농도를 이용하였다:
(i) 실시예 l.l(a), l.l(b), 1.1(f), l.l(g), l.l(h) 및 1.l(j)에 따라 제조된 HES 유도체 78.9 mg/㎖
(ii) 실시예 1.1(c) 및 1.1(d)에 따라 제조된 HES 유도체 395 mg/㎖
(iii) 실시예 1.1(e)에 따라 제조된 HES 유도체 142 mg/㎖
각 반응 혼합물은 겔 전기 영동에 의해 분석하였다(도 1 참조).
실시예 1.3 알데하이드 작용화된 하이드록시에틸 스타치 유도체의 합성
실시예 1.3(a) 아미노- HESlO /0.4 및 4-포르밀벤 조산으로부터의 알데히도 -HESlO/0.4의 합성
옥소-HESlO/0.4(MW = 10 kD, DS = 0.4)는 DE 196 28 705 Al에 따라 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사에서 제조되었다. LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 14500 D였고, DS는 0.41이었다.
5.1 g(0.51 mmol)의 옥소-HES10/0.4를 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO, 독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 15 ㎖에 용해시키고, 질소하에 무수 디메틸 설폭사이드 10 ㎖ 중의 1,4-디아미노부탄 5.1 ㎖(51 mmol)의 용액에 적하하고, 40℃에서 19시간 교반하였다. 이 반응 혼합물을 에탄올 80 ㎖ 및 아세톤 80 ㎖의 혼합물에 첨가하였다. 얻어진 석출물을 원심분리에 의해 회수하고, 에탄올 20 ㎖ 및 아세톤 20 ㎖의 혼합물로 세척하고, 물 80 ㎖에 재용해시켰다. 이 용액을 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품), 이어서 동결건조시켰다. 아미노-HES10/0.4의 수율은 67 %(3.4 g)였다.
4-포르밀벤조산 150 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 230 mg(둘 모두 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 10 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 204 ㎕를 첨가하였다. 21℃에서 30분간 배양한 후, 아미노-HES 10/0.4 1g을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 84 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙(dialysis tubing), 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품), 동결건조시켰다.
실시예 1.3(b) 환원성 말단에서 산화된 HESl0 /0.4의 과옥소산염 산화에 의한 알데히도 - HESlO /0.4의 합성
옥소-HES10/0.4(MW = 10 kD, DS = 0.4)는 DE 196 28 705 Al에 따라 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사에 의해 제조되었다. LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
300 mg의 옥소-HES10/0.4를 20 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.2) 15 ㎖에 용해시켰다. 과옥소산 나트륨(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 64.2 mg을 동일한 버퍼 15 ㎖에 용해시켰다. 두 용액을 혼합하고, 21 ℃에서 30분간 배양하고, 글리세롤 2 ㎖를 첨가하고 반응혼합물을 21℃에서 10분간 배양하였다. 이 반응 혼합물을 물에 대해서 24시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
실시예 1.4 실시예 1.3(a) 및 1.3(b)에 따라 합성된 알데하이드 작용화된 하이드록시에틸 스타치와의 환원성 아민화에 의한 IFN 베타 컨쥬게이트의 합성
시판 제품 AVONEX™(BIOGEN) 및 Rebif(Serono)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 인터페론 베타-Ia는 (Dittmar et al., 1989)에 기재된 바와 같이 트랜스펙션되고 실시예 6.1에 기재된 바와 같이 정제된 CHO 세포 라인으로부터 발현되었다.
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0, 0.5 mg/㎖) 중 IFN 베타의 용액 40 ㎕에, 동일한 버퍼(200 mg/㎖) 중의 HES-유도체(실시예 1.3(a) 또는 1.3(b)에 기재된 바와 같이 합성됨)의 용액 5 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 4℃까지 냉각하고, 동일한 버퍼 중 나트륨 시아노보로하이드라이드의 120 mM 용액 9 ㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 4℃에서 24시간 배양하였다. 조제의 반응 혼합물은 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 단백질 밴드가 고분자량으로 이동한 것을 나타내었으므로(도 2 참조), 성공적인 컨쥬게이션이 관찰되었다. 증대된 밴드폭은 사용된 HES 유도체의 분자량 분포와 단백질에 결합된 HES 유도체의 수에 의거한다.
실시예 1.5 IFN 베타 항바이러스 활성 생물학적 에세이( bioassay )의 설명- 총괄적 견해
유럽 약전에 있어서, 현재 인터페론-α 및 인터페론-γ의 활성의 결정에 대해서는 에세이만이 제공된다. 그러나, 인터페론-α의 항바이러스성 잠재성은 2001(chapter 5.6)에 기재된 바와 같이 시험관내 세포병변효과(CPE) 생물학적 에세이를 이용해서 이들 시험에서 측정되고, 날짜가 승인된 IFN-β 약물제품에 대해 적용되므로, 항바이러스 활성은 인터페론-α에 대한 상사성으로 시험될 수 있다.
IFN-β의 항바이러스 활성은 예를 들어 폐암종 세포(A549) 및 EMCV(encephalomyo-carditis virus)에 의해 특이적인 시험관내 세포병변효과 생물학적 에세이를 이용해서 시험될 수 있다. 인터페론의 항바이러스 활성의 결정에 사용될 수 있는 기타 가능한 조합은 WISH 세포 라인이나 MDBK(Madin-Darby bovine kidney) 세포 라인 및 VSV(vesicular stomatis virus)이다.
인터페론 항바이러스성 에세이 - 개요
제 1단계에 있어서, HES-IFN-베타-컨쥬게이트의 시험관내 항바이러스 활성을 비변성 IFN-베타와 비교하였다.
CPE 에세이(MDBK/VSV)에 있어서, 표준 인터페론 및 HES-IFN-베타-컨쥬게이트의 희석액을 비교하였다. 세포들을 세균과 접촉시키기 전에 시험 샘플로 48시간 동안 전처리하였다.
배양기간(대략 22시간) 후, 바이러스 세포병변효과에 대한 인터페론의 방어효과를 추정하였다.
인터페론 항바이러스성 에세이 - 실험의 상세
이하의 공정을 수행하였다:
-인터페론 용액을 MDBK 세포용의 세포 배지에서 미리 희석하였다(1:10). 이들 용액을 순차 1:2 - 1:2,097,152(=1:221)로 희석하였다.
- 4번 복제(각 웰마다 100 ㎕ )
- 신선한 트립신화 MDBK 세포를 첨가하였다(50 ㎕ 중 5,000 세포개수/웰)
- 배양: 37℃에서 48시간
- 미리 희석된 VSV 용액 50 ㎕를 첨가하였다(250 바이러스개수/웰)
- 배양: 37℃에서 22 시간
- 바이러스 세포병변효과에 대한 인터페론의 방어 효과를 구함
- Spearman-Karber의 방법을 이용해서 인터페론 역가를 산출
대조군:
인터페론-용액을 지니고 바이러스는 없는 (음성 대조군)
인터페론은 지니지 않고 바이러스는 지닌 MDBK-세포(양성 대조군)
결과:
2개의 인터페론 베타 샘플과 각각의 HES-컨쥬게이트에 대해 2개의 상이한 희석액을 이용해서 CPE 에세이로 시험하였다(어림해서 1,000,000 IU/㎖ 및 200,000 IU/㎖).
인터페론 역가는 Spearman 및 Karber의 식에 따라 산출되었다. 상이한 샘플의 활성의 비를 산출하였다. 샘플의 추정된 비활성도(specific activity)를 고려해서, 바이러스 배양에 대해 세포의 50%가 보호된 EC50 농도를 계산하고 비교하였다(데이터는 표시생략).
변성 IFN-베타는 대 생물 활성(bioactivity)이 유지되었다.
실시예 2 IFN 알파 컨쥬게이트의 합성
실시예 2.1(a) 아미노- HESlO /0.4 및 4- 포르밀벤조산로부터의 알데히도 - HESlO/0.4의 합성
알데히도-HES10/0.4는 실시예 1.3(a)에 따라 제조하였다.
실시예 2.1(b) 아미노- HESlO /0.4 및 4-포르밀벤 조산으로부터의 알데히도-HESlO/0.4의 합성
알데히도-HES 10/0.4는 실시예 13(b)에 따라 제조하였다.
실시예 2.2 실시예 2.1(a) 및 2.1(b)에 따라 합성된 알데하이드 작용화된 하이드록시에틸 스타치와의 환원성 아민화에 의한 IFN 알파 컨쥬게이트의 합성
시판의 rhIFN 알파를 이용하였다(독일의 함부르크에 소재한 Strathmann Biotec사 제품, 제품 코드 hIFNa).
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(1 mg/㎖) pH 5.0 중 IFN 베타의 용액 40 ㎕에, 동일한 버퍼(200 mg/㎖) 중의 HES-유도체(실시예 2.1(a) 또는 2.1(b)에 기재된 바와 같이 합성됨)의 용액 3.91 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 4℃까지 냉각하고, 동일한 버퍼 중 나트륨 시아노보로하이드라이드의 120 mM 용액 3.78 ㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 4℃에서 24시간 배양하였다. 조제의 반응 혼합물은 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 단백질 밴드가 고분자량으로 이동한 것을 나타내었으므로(도 3 참조), 성공적인 컨쥬게이션이 관찰되었다. 증대된 밴드폭은 사용된 HES 유도체의 분자량 분포와 단백질에 결합된 HES 유도체의 수에 의거한다.
실시예 3 AT III 컨쥬게이트의 합성
실시예 3.1 하이드록시아미노 작용화된 하이드록시에틸 스타치 유도체의 합성
실시예 3.1(a) 하이드록시아미노HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 17 ㎖에 용해시키고, 20 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 3.1(b) 하이드록실아미노HESlO /0.7의 합성
HES10/0.7(MW = 10000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 18 ㎖에 용해시키고, 20 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 10500 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 3.1(c) 하이드록시아미노HES5O /0.7의 합성
HES50/0.7(MW = 50000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 20 ㎖에 용해시키고, 4 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 47000 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 3.1(d) 하이드록실아미노HESl8 /0.4의 합성
산화된 HES는 DE 196 28 705 Al에 기재된 바와 같이 제조하였다. 산화된 HES18/0.4(MW = 18000 D, DS = 0.4) 200 mg을 진공중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 65 ℃에서 5일간 배양 후, 반응혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES18/0.4의 분자량은 18000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 3.1(e) 히드라지도HESlO /0.4의 합성
산화된 HES는 주로 DE 19628705A1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 산화된 HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 진공 중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 아디프산 디히드라지드(독일의 프랑크프르트/마인에 소재한 Lancaster Synthesis GmbH사 제품)를 첨가하였다. 65℃에서 5일간 배양후 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시 간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 11000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 3.1(f) 카보히드라지도HESlO /0.4의 합성
산화된 HES는 주로 DE 19628705Al에 기재된 바와 제조하였다. 산화된 HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 진공중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 카보히드라지드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)를 첨가하였다. 65 ℃에서 5일간 배양 후, 반응혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 11000 D였고, DS는 0.41 이었다.
실시예 3.1(g) 히드라지도HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 아디프산 디히드라지드(독일의 프랑크프르트/마인에 소재한 Lancaster Synthesis GmbH사 제품)를 첨가하였다. 22℃에서 19 시간 교반한 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 2 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 3.1(h) 카보히드라지도HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 카보히드라지드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)를 첨가하였다. 22 ℃에서 19시간 배양 후, 반응혼합물을 빙냉 2-프로판올 21 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 3.2 AT III 컨쥬게이트의 합성
실시예 3.2(a) AT III 의 산화
사용된 AT III는 재조합 인간 AT III(ATryn®; GTC Biotherapeutics사 제품)이었다. 산화는 주로 실시예 7.2에 기재된 바와 같이 수행하고, 이어서, 실시예 7.3에 기재된 바와 같이 버퍼 교환을 수행하였다.
실시예 3.2(b) 실시예 3.1(a) - 3.1(h)의 HES 유도체를 지닌 실시예 3.2(a)의 산화된 AT III 의 반응
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 산화된 AT III의 용액 4 ㎕에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 HES-유도체의 용액 3 ㎕를 첨가하고, 이 용액을 22℃에서 16.5시간 배양하였다. 이하의 농도를 이용하였다:
(i) 실시예 3.1(a), 3.1(b), 3.1(e), 3.1(f), 3.1(g) 및 3.1(h)에 따라 제조 된 HES 유도체 57 mg/㎖
(ii) 실시예 3.1(c)에 따라 제조된 HES 유도체 287 mg/㎖
(iii) 실시예 3.1(d)에 따라 제조된 HES 유도체 103 mg/㎖.
반응 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 분석하였다(도 4 참조).
실시예 3.3 AT III 컨쥬게이트의 합성
실시예 3.3(a) 아미노- HESlO /0.4 및 4-포르밀벤 조산으로부터의 알데히도 -HESlO/0.4의 합성
알데히도-HES10/0.4는 실시예 1.3(a)에 따라 제조하였다.
실시예 3.3(b) 아미노- HESlO /0.4 및 4-포르밀벤 조산으로부터의 알데히도-HESlO/0.4의 합성
알데히도-HES10/0.4는 실시예 1.3(b)에 따라 제조하였다.
실시예 3.4 실시예 3.3(a) 및 3.3(b)에 따라 합성된 알데하이드 작용화된 하이드록시에틸 스타치와의 환원성 아민화에 의한 AT III 컨쥬게이트의 합성
사용된 AT III는 재조합 인간 AT III(ATryn®; GTC Biotherapeutics사 제품)이었다.
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(3 mg/㎖) pH 5.0 중 AT III의 용액 6.67 ㎕에, 동일한 버퍼(200 mg/㎖) 중의 HES-유도체(실시예 3.3(a) 또는 3.3(b)에 기재된 바 와 같이 합성됨)의 용액 1.73 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 4℃까지 냉각하고, 동일한 버퍼 중 나트륨 시아노보로하이드라이드의 120 mM 용액 1.68 ㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 4℃에서 24시간 배양하였다. 조제의 반응 혼합물은 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 단백질 밴드가 고분자량으로 이동한 것을 나타내었으므로(도 5 참조), 성공적인 컨쥬게이션이 관찰되었다. 증대된 밴드폭은 사용된 HES 유도체의 분자량 분포와 단백질에 결합된 HES 유도체의 수에 의거한다.
실시예 3.5 반응성 에스테르기를 지닌 하이드록시에틸 스타치와 AT III 와의 반응에 의한 AT III 컨쥬게이트의 합성
5 mM 시트르산 나트륨 버퍼, 66 mM 글리세롤, 67 mM NaCl(pH 약 7) 중에서 약 25 mg/㎖의 농도를 지닌 AT III 용액을 이 실시예에서 사용하였다.
사용된 AT III은 재조합 인간 AT III(ATryn®; GTC Biotherapeutics사 제품)이었다.
AT III은 인산 버퍼(pH 7.2) 및 10 kD의 컷 오프를 지닌 멤브레인에 의한 한외 여과에 의해 원치 않는 글리세롤로부터 유리하였다. 얻어진 정제 용액의 최종 농도는 약 25 mg/1.25 ㎖였다. 단백질의 양은 HPGPC 분석에 의해 제어하였다(도 6 참조).
HPGPC 분석에 이하의 파라미터가 이용되었다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300 × 10 mm LD.(Pharmacia)
용리액: 탈염수 1 ℓ 중 27.38 mM Na2HPO4; 12.62 mM NaH2PO4; 0.2 M NaCl; 0.005% NaN3
유량: 0.24 ㎖/h
검출기 1 : MALLS 검출기
검출기 2: UV(280 nm)
검출기 3: RI
옥소-HESlO/0.4(MW = 10,559 D, DS = 0.4)는 DE 196 28 705 Al에 따라 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사에서 제조되었다. 옥소-HES의 산화도는 95 %였다.
52 mg의 옥소-HES 10/0.4를 무수 DMF 0.2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트 2.6 ㎎를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하였다.
1 M 중탄산 나트륨 용액 0.5 ㎖를 AT III 용액 0.5 ㎖에 첨가하여 약 10 mg/㎖ AT III(pH 8.2)의 농도를 지닌 용액을 얻었다. 이 용액에, 상기와 같이 제조된 반응성 옥소-HES를 함유하는 용액을, 약 30분 후 반응이 종료될 때까지 50 ㎕씩 첨가하였다. 다음에, 이 혼합물의 pH를 0.1N HCl을 이용해서 7로 조정하고, HPGPC(High-Performance Gel Permeation Chromatography) 분석결과 약 60% 컨쥬게이트의 수율을 제공할 때까지 -18℃에서 동결시켰다. 이 결과는 도 7에 표시한 다.
이하의 파라미터가 HPGPC 분석에 이용되었다:
컬럼: Superose 12 HR 10/30 300 × 10 mm LD.(Pharmacia)
용리액: 탈염수 1 ℓ 중 27.38 mM Na2HPO4; 12.62 mM NaH2PO4; 0.2 M NaCl; 0.005% NaN3
유량: 0.24 ㎖/h
검출기 1 : MALLS 검출기
검출기 2: UV(280 nm)
검출기 3: RI
실시예 4 GM- CSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 4.1 하이드록시아미노 작용화된 하이드록시에틸 스타치 유도체의 합성
실시예 4.1(a) 하이드록실아미노HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 17 ㎖에 용해시키고, 20 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 4.1(b) 하이드록실아미노HESlO /0.7의 합성
HES10/0.7(MW = 10000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 18 ㎖에 용해시키고, 20 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 10500 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 4.1(c) 하이드록실아미노HES5O /0.7의 합성
HES50/0.7(MW = 50000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 20 ㎖에 용해시키고, 4 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 47000 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 4.1(d) 하이드록실아미노HES5O /0.4의 합성
HES50/0.4(MW = 50000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 20 ㎖에 용해시키고, 4 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 17.5시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 70 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 0℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 30 ㎖로 세척하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 19.5시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES50/0.4의 분자량은 56000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 4.1(e) 하이드록실아미노HESl8 /0.4의 합성
산화된 HES는 DE 196 28 705 Al에 기재된 바와 같이 제조되었다. 산화된 HES 18/0.4(MW = 18000 D, DS = 0.4) 200 mg을 진공중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 65 ℃에서 5일간 배양 후, 반응혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES18/0.4의 분자량은 18000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 4.1(f) 히드라지도HESlO /0.4의 합성
산화된 HES는 주로 DE 19628705Al에 기재된 바와 같이 제조하였다. 산화된 HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 진공 중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 아디프산 디히드라지드(독일의 프랑크프르트/마인에 소재한 Lancaster Synthesis GmbH사 제품)를 첨가하였다. 65 ℃에서 5일간 배양 후, 반응혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 11000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 4.1(g) 카보히드라지도HESlO /0. 4 의 합성
산화된 HES는 DE 196 28 705 Al에 기재된 바와 같이 제조되었다. 산화된 HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 진공 중 80℃에서 17시간 가열하고, 건조 DMSO(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖를 첨가하였다. 이 용액에 2 mmol 카보히드라지드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)를 첨가하였다. 65 ℃에서 5일간 배양 후, 반응혼합물을 빙냉 2-프로판올 20 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품)하고, 동결건조하였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 11000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 4.1(h) 히드라지도HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 아디프산 디히드라지드(독일의 프랑크프르트/마인에 소재한 Lancaster Synthesis GmbH사 제품)를 첨가하였다. 22℃에서 19시간 교반 후, 반응 혼합물을 냉 2-프로판올 21 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 4.1(i) 카보히드라지도 HES10 /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 200 mg을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 2 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 2 mmol 카보히드라지드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)를 첨가하였다. 22℃에서 19시간 교반 후, 반응 혼합물을 냉 2-프로판올 21 ㎖에 첨가하고, -20℃에서 1시간 배양하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 42 ㎖로 세척하고, 물 10 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 27시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 4.2 GM - CSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 4.2(a) GM - CSF 의 산화
GM-CSF는 실시예 8.1에 기재된 바와 같이 정제하였다. 산화는 주로 실시예 8.2에 기재된 바와 같이 행하고 나서, 실시예 8.3에 기재된 바와 같이 버퍼교환을 행하였다.
실시예 4.2(b) 실시예 4.2(a)의 산화된 GM - CSF 와 실시예 4.1(a) - 4.1(i)의 HES 유도체와의 반응
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 산화된 GM-CSF의 용액 27 ㎕에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 HES-유도체의 용액 3.81 ㎕를 첨가하고, 이 용액을 22℃에서 16.5시간 배양하였다. 이하의 농도를 이용하였다:
(i) 실시예 4.1(a), 4.1(b), 4.1(f), 4.1(g), 4.1(h) 및 4.1(i)에 따라 제조된 HES 유도체 78.9 mg/㎖
(ii) 실시예 4.1(c) 및 4.1(d)에 따라 제조된 HES 유도체 395 mg/㎖
(iii) 실시예 4.1(e)에 따라 제조된 HES 유도체 142 mg/㎖.
반응 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 분석하였다(도 8 참조).
실시예 4.3 GM - CSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 4.3(a) 아미노- HESlO /0.4 및 4-포르밀벤 조산으로부터 알데히도 -HESlO/0.4의 합성
알데히도-HES10/0.4는 실시예 1.3(a)에 따라 제조하였다.
실시예 4.3(b) 아미노- HESlO /0.4 및 4- 포르밀벤조산으로부터의 알데히도 -HESlO/0.4의 합성
알데히도-HES10/0.4는 실시예 1.3(b)에 따라 제조하였다.
실시예 4.4 실시예 4.3(a) 및 4.3(b)에 따라 합성된 알데하이드 작용화된 하이드록시에틸 스타치와의 환원성 아민화에 의한 GM - CSF 컨쥬게이트의 합성
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(1 mg/㎖) pH 5.0 중 GM-CSF의 용액 20 ㎕에, 동일한 버퍼(200 mg/㎖) 중의 HES-유도체(실시예 3.3(a) 또는 3.3(b)에 기재된 바와 같이 합성됨)의 용액 1.91 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 4℃까지 냉각하고, 동일한 버퍼 중 나트륨 시아노보로하이드라이드의 120 mM 용액 4.38 ㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 4℃에서 24시간 배양하였다. 조제의 반응 혼합물은 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 단백질 밴드가 고분자량으로 이동한 것을 나타내었으므로(도 9 참조), 성공적인 컨쥬게이션이 관찰되었다. 증대된 밴드폭은 사용된 HES 유도체의 분자량 분포와 단백질에 결합된 HES 유도체의 수에 의거한다.
실시예 5 하이드록실아미노 작용화된 하이드록시에틸 스타치를 지닌 AT III, IFN 베타 및 GM - CSF 컨쥬게이트의 합성
실시예 5.1 하이드록실아미노 작용화된 하이드록시에틸 스타치의 합성
(a) 하이드록실아미노HES10/0.4은 상기 실시예 1.1(a)에 기재된 바와 같이 합성하였다.
(b) 하이드록실아미노HES50/0.7은 상기 실시예 1.1(c)에 기재된 바와 같이 합성하였다.
실시예 5.2 실시예 5.1(b)에 따른 하이드록실아미노HES 50/0. 7와의 IFN 베타 컨쥬게이트의 합성
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 산화된 IFN 베타(실시예 6.3의 단계 후 얻어짐) 용액 1190 ㎕에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 200 ㎕ 중의 하이드록시아미노HES 50/0.7 81.4 mg의 용액을 첨가하고, 이 용액을 22℃에서 19시간 배양하였다.
반응 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 분석하였다(도 10 참조).
실시예 5.3 실시예 5.1(a)에 의한 하이드록실아미노HES 10/0.4와의 AT III 컨쥬게이트의 합성
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 산화된 AT III(실시예 7.3의 단계 후 얻어짐) 용액 500 ㎕에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 1500 ㎕ 중의 하이드록실아미노HES 10/0.4 (21.6 mg)의 용액을 첨가하고, 이 용액을 22℃에서 20.5시간 배양하였다.
실시예 5.4 실시예 5.1(a)에 따른 하이드록실아미노HES 10/0.4와의 GM - CSF 컨쥬게이트의 합성
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 산화된 GM-CSF(실시예 8.3의 단계 후 얻어짐) 용액 720 ㎕에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 180 ㎕ 중의 하이드록실아미노HES 10/0.4 (14.0 mg)의 용액을 첨가하고, 이 용액을 22℃에서 18시간 배양하였다.
실시예 6 IFN -베타 la의 컨쥬게이트의 또 따른 특징화
실시예 6.1(a) 인간 재조합 인터페론 베타의 정제 및 분석
시판 제품 AVONEX™(BIOGEN) 및 Rebif(Serono)와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 인터페론 베타-Ia는 (Dittmar et al., 1989)에 기재된 바와 같이 트랜스펙션된 CHO 세포 라인으로부터 발현되었다. IFN-β는 Blue 세파로스(Sepharose) 상에서의 배양 상청액의 흡착, 0.7 M NaCl +60% 에틸렌 글리콜을 포함하는 0.05 M Na-포스페이트 버퍼(pH 7.0)에서의 용출(혹은 용리) 및 주위 온도에서 10 ㎖ FF Zn-킬레이트 컬럼 상에서의 크로마토그래피를 포함하는 3가지 단계에 의해 정제되었다. 상기 컬럼은 30 ㎖의 20 mM Na-포스페이트 버퍼, 0.3M NaCl, pH 7.4로 미리 평형화시켰다. 샘플은 15㎖의 20 mM Na-포스페이트(pH 7.2-7.5)으로 1:2 희석후 적용하였다. 다음에, 컬럼을 25 ㎖의 20 mM Na-포스페이트, 0.3M NaCl(pH 7.4)로 세척하고 나서, 용리액 I(20 ㎖ 0.1 M Na-아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 5.9) 및 용리액 II(15 ㎖ 0.1 M Na-아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 4.7)으로 세척하였다. 최종 정제는 용매 B(0.1% TFA 중 80% 아세토니트릴)의 0 내지 100% 구배(혹은 그래디언트: gradient)를 이용해서 0.1% TFA(용매 A) 중에서 평형화시킨 Vydac C4 컬럼상에서의 RP-HPLC에 의해 수행하였다.
실시예 6.1(b)
사용된 IFN-베타 1a는 > 95% 순도(SDS-PAGE 분석 및 RP-HPLC에 의거함)였고, 다이머를 < 5% 함유하였다(비환원성 조건). 제제의 탄수화물 구조는 주로 AVONEX™의 것과 마찬가지였고, 디안테나리 구조 42 %, 디안테나리 - 인접 푸코오스 16%, 트리안테나리 12%, 테트라안테나리 7% 및 1 N-아세틸락토사민 반복단위를 지닌 트리안테나리 9%가 존재하는 것을 나타내었다(나머지 12 %는 갈락토구조와 말단 푸코오스를 지닌 소량의 사슬이었다). HPAEC-PAD 응답에 의거해서, 올리고당 약 14%가 아시알로였고, 21 %가 모노시알로였으며, 35 %가 디시알로, 19%가 트리시알로였다. 소량의 테트라시알로 구조가 존재하였다. 방대한 양의 시알산이 N-아세틸네우람산으로서 발견되었고, 제제 중에 N-글리콜릴네우람산 < 5%가 존재하였기 때문에 사용된 제제는 Rebif(Serono product)가 N-글리콜릴네우람산을 >15% 함유하므로 시판품 AVONEX™ 이상으로 유사하다(데이터는 표시생략함).
실시예 6.2 CHO 세포로부터 IFN -β la 의 경미한 과옥소산염 처리에 의한 N-아세틸네우람산 잔기의 과옥소산염 산화
IFN-β(미리 0℃로 냉각되어 유지된 O.1M Na-아세테이트 버퍼(pH 5.5 중))의 500 ㎍/㎖ 용액에 1OmM 나트륨-메타-과옥소산의 빙냉 용액을 첨가하여 1mM 나트륨-메타-과옥소산의 최종농도를 얻었다.. 이 혼합물을 어두운 곳에서 빙욕 중 0℃에서 1시간 동안 배양하고, 이 반응은 글리세롤 20㎕의 첨가에 의해 종결되었고 더욱 5분간 배양하였다. 이어서, IFN-β 샘플을 이하에 기재한 바와 같이 Vivaspin 농 축기 유닛을 이용해서 농축시켰다.
실시예 6.3 후속의 HES 화를 위한 과옥소산염 산화된 IFN -β la 의 버퍼 교환
버퍼 교환은 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 및 10 Kda 컷 오프를 지닌 0.5 ㎖ Vivaspin 2 농축기 유닛(독일 하노버시에 소재한 Vivaspin AG사 제품)을 이용해서 행하였다. 먼저, 농축기 유닛을 0.1 M Na-아세테이트 버퍼(pH 5.5) 0.5 ㎖의 첨가에 의해 세척하고, Megafuge 1.0R(독일의 오스테로데(Osterode)시에 소재한 Kendro Laboratory Equipment사 제품) 중 6℃에서 4000 rpm에서 원심분리하였다. 이어서, 과옥소산 산화된 IFN-β 용액 0.5 ㎖를 상기 농축기 유닛에 첨가하고, 적어도 5배 농도가 얻어질 때까지 4000 rpm에서 25분간 원심분리하였다. 0.1 M Na-아세테이트 버퍼(pH 5.5)를 최종 체적 0.5 ㎖로 될 때까지 상기 농축액에 첨가하고 전술한 바와 같이 원심분리하였다. 원심분리 사이클을 3회 반복하고, 최종 농축액을 제거하여, 2㎖ 플라스틱 병(Eppendorff, Germany)으로 옮기고 HAS-변성 반응에 더욱 사용될 때까지 얼음 위에서 유지하였다.
실시예 6.4 HAS 및 IFN -β의 컨쥬게이트의 합성
합성은 상기 실시예 5.2에 기재된 바와 같이 행하였다.
실시예 6.5 하이드록실아미노 - HES 50/0.7을 지닌 과옥소산염 -산화된 단백질의 배양으로부터의 HES 화 IFN -β 및 과잉의 HAS 유도체의 분리.
요약: RP-HPLC 런은 AKTA 익스플로러(explorer) 10 장비를 이용해서 유량 1.25 ㎖/min에서 실온에서 수행하였다. IFN-β 400 ㎍을 함유하는 배양 혼합물의 일정 부분을 11% 용매 B(0.1 % TFA, 90% 아세토니트릴) 및 89% 용매 A(0.1%. TFA)의 1.25 CV에 의해 평형을 이룬 250 mm × 10 mm C18-상 컬럼상에 적용하였다. 이어서, 샘플(약 1.25 ㎖)을 주입하고, 이 샘플 루프를 11% 용매 B 11 ㎖로 세척하였다. 컬럼을 11% 용매 B 0.2 CV로 세척하고 나서, 2 CV에 걸쳐 11% 내지 90% 용매 B의 직선 구배를 적용하였다. 컬럼의 용출은 90% 용매 B 0.8 CV를 이용해서 계속하였고, 최종적으로 컬럼을 11% 용매 B 1.0 CV로 재평형을 이루었다.
IFN-β 단백질을 62% 용매 B의 농도에서 7.5 ㎖ 체적으로 용출시켰다. 단백질의 회수는 동일한 장비를 이용해서 C4-위상 컬럼 상에서 표준 IFN-β 제제에 의해 얻어진 790 mAU × ㎖ × mg-1의 특정 피크 영역에 의거해서 60%(HES IFN-β CHO)였다.
실시예 6.5에 대한 재료 및 방법
장비 및 재료
장비: AKTA 익스플로러 10(Amersham Pharmacia Biotech사 제품),
펌프 P-903
믹서 M-925(0.6 ㎖ 챔버를 지님)
모니터 UV-900(10 mm 플로우 셀을 지님)
모니터 pH/C-900
분획 콜렉터 Frac-900
샘플 루프 2 ㎖
소프트웨어 유니콘 버전 3.21
컬럼: 250 mm × 10 mm, Macherey-Nagel 250-l/2"-10 Nucleosil 7 C18, Cat. No. 715002, Lot-No. 4020854
컬럼 체적: 20 ㎖
유량: 1.25 ㎖/min
용매 A: HPLC-물 중 0.1% TFA
용매 B: 90% 아세토니트릴; HPLC-물 중 0.1% TFA
실시예 6.5의 RP - HPLC 런 방법
Figure 112006072272527-PCT00103
검출: A 280 nm
A 221 nm
A 206 nm
전도도
분획화: 1.25 ㎖ / 분획
실시예 6.6 분석 실험:
실시예 6.6(a) 재조합 폴리펩타이드 N-글리코시다제(독일 펜츠버그에 소재한 Roche 사 제품)에 의한 N-결합 올리고당의 유리
50 mM Na-포스페이트 버퍼(pH 7.2) 중의 천연의 과옥소산염 산화된 또는 HAS-변성 IFN-BIa 100 내지 120 ㎍에 재조합 폴리펩타이드 N-글리코시다제(독일의 펜츠버그에 소재한 Roche사 제품; 250 유닛/250 ㎕ 로트: 101610420) 25 ㎕를 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 12 내지 18 시간 배양하고 N-글리코사이드결합 올리고당의 해리는 환원조건하에서 단백질 3 내지 5 ㎍의 SDS-PAGE 분석에 이어서, 쿠마시 블루(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH 사 제품)에 의한 단백질 밴드의 염색과 IFN-베타 단백질 밴드의 탈-N-글리코실화 형태의 이동 위치로의 특이적 이동의 검출에 의해 검사하였다.
실시예 6.6(b)
해리된 N-글리칸은 -2O℃에서 100 % 에탄올 3 체적의 첨가에 의해 폴리펩타이드로부터 분리하고, -20℃에서의 배양은 적어도 2시간 수행하였다. 석출된 단백질은 40℃, 13,000 rpm에서 10분간의 원심분리에 의해 제거하였다. 다음에, 펠릿을 빙냉 70% 에탄올 500 ㎕로 2회 추가 세척하였다. 저류된 상청액 중의 올리고당을 진공 원심분리기(Speed Vac 농축기(concentrator), 미국 Savant Instruments Inc.사 제품)에서 건조하였다. 글리칸 샘플은 다음과 같이 Hypercarb 카트리지(100 또는 200 mg)를 이용해서 탈염하였다: 사용 전에, 카트리지를 0.1%(v/v) TFA 중의 80%(v/v) 아세토니트릴 500 ㎕로 3회 세척하고 나서, 물 500 ㎕로 3회 세척하였다. 샘플을 카트리지에 장전하기 전에 적어도 300 ㎕의 최종 체적으로 물로 희석하였다. 이들을 물로 엄격하게 세척하였다. 올리고당을 0.1%(v/v) TFA를 함유하는 25% 아세토니트릴 1.2 ㎖로 용출하였다. 용출된 올리고당을 2 M NH4OH로 중화시키고, Speed Vac 농축기에서 건조시켰다. 이들은 H2O 중 -20℃에서 보존하였다.
실시예 6.6(c) 경미한 산 가수분해
올리고당의 경미한 산 가수분해(N-글리칸으로부터 시알산 및 HAS-변성 시알산 유도체의 유리)를 다음과 같이 수행하였다: 탈염된 올리고당 또는 HAS-변성 올리고당의 일정 부분을 1OmM H2SO4의 동일 체적과 혼합하고, 80℃에서 90분간 배양하였다. 50 mM NaOH에 의한 중화 후, 데시알릴화 글리칸 혼합물을 Speed-Vac 농축 기로 건조하고, HPAEC-PAD(펄스화 전류측정검파에 의한 하이-pH-음이온교환 크로마토그래피: high-pH-anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection)에서의 분석을 위해 적절한 농도로 조정하였다. 후속의 MALDI/TOF MS 분석을 위해, 200㎕ 피펫 선단에 흑연화 카본 25 내지 40 ㎕를 첨가해서 제조한 스몰 Hypercarb 컬럼을 이용해서 중성의 올리고당 샘플(0.05 내지 1 nmol)을 탈염처리하였다.
실시예 6.6(d) HPAEC - PAD ( 펄스화 전류측정 검파에 의한 하이 - pH -음이온교환 크로마토그래피)에 의한 올리고당 맵핑
AS50 오토샘플러, AS50 써멀 컴파트먼트(Thermal Compartment), ED50 전기화학 검출기, GS50 그래디언트 펌프(Gradient Pump), 소프트웨어 크로멜레온 크로마토그래피 매니지먼트 시스템(Software Chromeleon Chromatography Management System)으로 이루어진 BioLC 시스템(Dionex, Sunnyvale)을 CarboPac PA-100 분리 컬럼(4 ×250 mm) 및 CarboPac PA-100 프레-컬럼(4 ×50 mm)과 함께 이용하였다. 두 개의 상이한 모드를 올리고당의 맵핑 및 정량화에 이용하였다.
I) 아시알로 - 모드 :
중성의 올리고당에 이하의 표에 표시한 바와 같은 용매 A(200 mM NaOH) 및 용매 B(200 mM NaOH + 600 mM Na-아세테이트)의 그래디언트를 이용한 HPAEC-PAD 맵핑을 실시하였다:
표: 천연 올리고당의 맵핑용의 그래디언트
Figure 112006072272527-PCT00104
전기화학적 검출기용의 검출기 전위는 다음 표와 같았다:
표: 올리고당용의 검출기-전위
Figure 112006072272527-PCT00105
II ) 올리고스 - 모드 :
천연의 올리고당에 다음 표에 표시한 바와 같은 용매 C(100 mM NaOH) 및 용매 D(100 mM NaOH + 600 mM Na-아세테이트)의 그래디언트를 이용한 HPAEC-PAD 맵핑을 실시하였다:
표: 천연의( 시알릴화 ) 올리고당의 그래디언트 맵핑
Figure 112006072272527-PCT00106
전기화학적 검출기용의 검출기 전위는 다음 표와 같았다:
표: 올리고당용의 검출기-전위
Figure 112006072272527-PCT00107
비피크면적(specific peak area)(nC × min × nmol-1)을, N-아세틸락토스아민 반복을 지니거나 지니지 않은 정의된 올리고당 표준(디시알릴화 디안테나리, 트리시알릴화 트리안테나리 및 테트라시알릴화 테트라안테나리 구조)에 의해 얻어지 는 응답 인자를 이용해서 산출하였다(Nimtz et al, 1993, Schroeter et al., 1999, Grabenhorst et al, 1999).
HAS -변성 IFN -β에 대한 결과
C-18 위상 HAS-변성 IFN-β에 대한 RP-HPLC에서 분획 32-37의 검출을 행하였다. HAS-IFN-β의 회수율을 산출하였다.
도 11에 있어서의 화살표는 말단의 시알산 유도체가 결여된 형태로 인해 추측컨대 비변성 IFN-β의 이동 위치를 표시하는 한편, HAS 변성 IFN-β는 35 Kda 내지 120 Kda의 분자량에 걸친 브로드한 확산으로서 쿠마시 염색된 영역을 검출하였다.
RP-HPLC 용리액으로부터의 분획 32-37을 저류시키고 speed Vac 농축기에 농축시켰다. 전형적으로는, IFN-β 샘플의 100 - 200 ㎍ 부분을 건조하고, 50 mM Na-포스페이트(pH 7.2) + 0.05 % Tween-20 중에 용해시키고, 폴리펩타이드 N-글리코시다제에 의해 37℃에서 20 내지 30분간 배양하였다. 얻어진 올리고당은 경미한 산처리 전후에 HPAEC-PAD 분석(실시예 6.6d)을 실시하였다.
도 12에 표시한 바와 같이, HAS-변성 IFN-β로부터의 올리고당 물질을 아시알로, 모노-, 디- 및 트리시알릴화가 각각 16 내지 20 분, 21 내지 26 분, 28 내지 33 분 및 34 내지 38 분에 검출되는 조건하에 컬럼으로부터 52분 후에 용출시켰다. 시알산의 완전한 해리가 얻어지는 조건하에 올리고당 샘플의 경미한 산처리가 수행된 후, 예상된 IFN-β의 중성의 복합체형 N-글리칸이 HPAEC-PAD 프로파일에서 검출되었고, 해리된 HAS-유도체는 46 내지 49 분(그래디언트 아실알로-모드를 이용함, 실시예 6.6 dI 참조)의 보유시간에서 검출되었고, 이것은, 예상되는 바와 같이 산 불안정 결합을 통해 IFN-β의 N-결합 올리고당에 HAS가 부착된 것을 나타낸다(도 13).
실시예 7 AT III의 컨쥬게이트의 또 다른 특징화
실시예 7.1 인간 AT III
사용된 AT III은 재조합 human AT III(GTC Biotherapeutics사로부터의 ATryn®)였다.
실시예 7.2 AT III 의 경미한 과옥소산염 처리에 의한 N- 아세틸네우람산 잔기의 과옥소산염 산화
과옥소산염 산화는 주로 실시예 6.2에 있어서의 IFN-베타에 대해 설명한 것과 마찬가지로 수행하였다.
실시예 7.3 후속의 HES 화용의 과옥소산염 산화된 AT III 의 버퍼 교환
버퍼 교환은 주로 실시예 6.3에 있어서의 IFN-베타에 대해 설명한 것과 마찬 가지로 수행하였다.
실시예 7.4 HAS 및 AT III 의 컨쥬게이트의 합성
합성은 상기 실시예 5.3에 기재된 바와 마찬가지였다.
실시예 7.5 과잉의 HAS -시약으로부터 HAS -변성 AT III 의 분리용의 AT III 이온교환 크로마토그래피
7.5.1. 이온-교환 크로마토그래피에 의한 후속의 정제용의 항트롬빈 III 샘플의 버퍼 교환은 Vivaspin 농축기(10.000 MW CO PES, Vivascience Cat. No. VS0602, Lot-No. 03VS0633)를 이용해서 수행하였다. HAS-변성 반응으로부터의 샘플(1.6 ㎖ 중 AT III 2mg)을 버퍼 A(20 mM N-모폴리오-프로판 설폰산이 NaOH에 의해 pH 8.0으로 조정. MOPS)에 의해서 5㎖까지 희석하였다. 샘플을 대략 0.4 내지 0.6 ㎖까지 제조자의 권장사양에 따라 스핀 다운하고, 희석/농축 단계를 2회 반복하였다. 최종적으로 단백질 샘플을 농축기 유닛으로부터 세척하였다.
7.5.2. AT III 샘플의 정제는 펌프 P-903, 0.6 ㎖ 챔버를 지닌 믹서 M-925, 10 mm 플로 셀과 함께 사용되는 모니터 UV-900, 모니터 pH/C-900, 샘플 펌프 P-950 및 5 ㎖ 샘플 루프로 이루어진 AKTA 익스플로러 10 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용해서 주위 온도에서 수행하였다. AKTA 시스템을 소프트웨어 유니콘버전(Software Unicorn Version) 3.21하에 가동하였다. 버퍼 A(20 mM MOPS, pH 8.0) 중의 배양 혼합물을 버퍼 A 6 CV에 의해 평형을 이룬 2 ㎖ Q-세파로스 패스트 플로(Q-Sepharose Fast Flow)(Amersham, 코드 번호 17-0510-01, 로트 번호 254665) 컬럼(Amersham Biosciences사 제품; C 10/10)을 포함하는 컬럼에 0.6 ㎖/min의 유량으로 적용하였다. 컬럼을 0.8 ㎖/min의 유량으로 버퍼 A의 6 CV에 의해 세척하고, 버퍼 B(20 mM Na-포스페이트 중 0.5 M NaCl, pH 6.5) 4CV를 0.6 ㎖/min의 유량으로 사용함으로써 용출을 수행하였다. 버퍼 C(20 mM Na-포스페이트 중 1.5 M NaCl, pH 6.5) 4 CV를 0.6 ㎖/min의 유량으로 이용해서 컬럼을 재생하고 버퍼 A에 의해 재평형화를 행하였다. AT III 단백질을 대략 4 ㎖의 체적의 컬럼으로부터 용출시켰다.
방법
Figure 112006072272527-PCT00108
버퍼 A: 20 mM MOPS/NaOH pH 8.0; 버퍼 B: 20 mM Na-포스페이트, 0.5 M NaCl, pH 6.5; 버퍼 C: 20 mM Na-포스페이트, 1.5 M NaCl, pH 6.5. 단백질 용출은 A280 nm에서 검출되었고, 1 ㎖ 분획이 회수되었다.
실시예 7.6 분석 실험:
실시예 7.6(a) 재조합을 위한 비변성된 과옥소산염 산화 HAS 변성 AT III 샘플로부터의 N- 글리칸의 유리
AT III 샘플 300-600 ㎍을 0.6% SDS의 존재 중 pH 8.1에서 90℃에서 10분간 5 mM 디티오에리트레이톨의 존재하에 환원시키고, 그 후, 최종 농도 0.6%가 되도록 NP 40을 첨가하였다. 50 mM Na-포스페이트 버퍼(pH 7.2) 중의 천연의 과옥소산염 산화된 혹은 HAS-변성 AT III 0.3-0.6 mg에 재조합 폴리펩타이드 N-글리코시다제(독일의 펜츠버그에 소재한 Roche사 제품; 250 유닛/250 ㎕ 로트: 101610420) 40 ㎕를 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 12 내지 18 시간 배양하고 N-글리코사이드결합 올리고당의 해리는 환원조건하에서 단백질 5 내지 10 ㎍의 SDS-PAGE 분석에 이어서, 쿠마시 블루(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH 사 제품)에 의한 단백질 밴드의 염색과 AT IIII 단백질 밴드의 탈-N-글리코실화 형태의 이동 위치로의 특이적 이동의 검출에 의해 검사하였다.
실시예 7.6(b)
해리된 N-글리칸은 -2O℃에서 100 % 에탄올 3 체적의 첨가에 의해 폴리펩타이드로부터 분리하고, -20℃에서의 배양은 적어도 2시간 수행하였다. 석출된 단 백질은 4℃, 13,000 rpm에서 10분간의 원심분리에 의해 제거하였다. 다음에, 펠릿을 빙냉 70% 에탄올 500 ㎕로 2회 추가 세척하였다. 저류된 상청액 중의 올리고당을 진공 원심분리기(Speed Vac 농축기, 미국 Savant Instruments Inc.사 제품)에서 건조하였다. 글리칸 샘플은 다음과 같이 Hypercarb 카트리지(100 또는 200 mg)를 이용해서 탈염하였다: 사용 전에, 카트리지를 0.1%(v/v) TFA 중의 80%(v/v) 아세토니트릴 500 ㎕로 3회 세척하고 나서, 물 500 ㎕로 3회 세척하였다. 샘플을 카트리지에 장전하기 전에 적어도 300 ㎕의 최종 체적으로 물로 희석하였다. 이들을 물로 엄격하게 세척하였다. 올리고당을 0.1%(v/v) TFA를 함유하는 25% 아세토니트릴 1.2 ㎖로 용출하였다. 용출된 올리고당을 2 M NH4OH로 중화시키고, Speed Vac 농축기에서 건조시켰다. 이들은 H2O 중 -20℃에서 보존하였다.
실시예 7.6(c) 경미한 산 가수분해
올리고당의 경미한 산 가수분해(N-글리칸으로부터 시알산 및 HAS-변성 시알산 유도체의 유리)를 다음과 같이 수행하였다: 탈염된 올리고당 또는 HAS-변성 올리고당의 일정 부분을 1OmM H2SO4의 동일 체적과 혼합하고, 80℃에서 90분간 배양하였다. 50 mM NaOH에 의한 중화 후, 데시알릴화 글리칸 혼합물을 Speed-Vac 농축기로 건조하고, HPAEC-PAD(펄스화 전류측정검파에 의한 하이-pH-음이온교환 크로마토그래피)에서의 분석을 위해 적절한 농도로 조정하였다. 후속의 MALDI/TOF MS 분석을 위해, 200㎕ 피펫 선단에 흑연화 카본 25-40 ㎕를 첨가해서 제조한 스몰 Hypercarb 컬럼을 이용해서 중성의 올리고당 샘플(0.05-1 nmol)을 탈염처리하였다.
실시예 7.6(d) HPAEC - PAD ( 펄스화 전류측정 검파에 의한 하이 - pH -음이온교환 크로마토그래피)에 의한 올리고당 맵핑
AS50 오토샘플러, AS50 써멀 컴파트먼트, ED50 전기화학 검출기, GS50 그래디언트 펌프, 소프트웨어 크로멜레온 크로마토그래피 매니지먼트 시스템으로 이루어진 BioLC 시스템(Dionex, Sunnyvale)을 CarboPac PA-100 분리 컬럼(4 ×250 mm) 및 CarboPac PA-100 프레-컬럼(4 ×50 mm)과 함께 이용하였다. 두 개의 상이한 모드를 올리고당의 맵핑 및 정량화에 이용하였다.
I) 아시알로 - 모드 :
중성의 올리고당에 이하의 표에 표시한 바와 같은 용매 A(200 mM NaOH) 및 용매 B(200 mM NaOH + 600 mM Na-아세테이트)의 그래디언트를 이용한 HPAEC-PAD 맵핑을 실시하였다:
표: 천연 올리고당의 맵핑용의 그래디언트
Figure 112006072272527-PCT00109
전기화학적 검출기용의 검출기 전위는 다음 표와 같았다:
표: 올리고당용의 검출기-전위
Figure 112006072272527-PCT00110
II ) 올리고스 - 모드 :
천연의 올리고당에 다음 표에 표시한 바와 같은 용매 C(100 mM NaOH) 및 용매 D(100 mM NaOH + 600 mM Na-아세테이트)의 그래디언트를 이용한 HPAEC-PAD 맵핑을 실시하였다:
표: 천연의( 시알릴화 ) 올리고당의 그래디언트 맵핑
Figure 112006072272527-PCT00111
전기화학적 검출기용의 검출기 전위는 다음 표와 같았다:
표: 올리고당용의 검출기-전위
Figure 112006072272527-PCT00112
비피크면적(nC × min × nmol-1)을, 인접 프럭토오스를 함유하는 N-아세틸락토스아민 반복을 지니거나 지니지 않은 정의된 올리고당 표준(디시알릴화 디안테나리, 트리시알릴화 트리안테나리 및 테트라시알릴화 테트라안테나리 구조)에 의해 얻어지는 응답 인자를 이용해서 산출하였다(Nimtz et al, 1993, Schroeter et al., 1999, Grabenhorst et al, 1999).
결과
AT III의 HAS 변성은 HAS의 단백질에의 공유결합 부착을 나타내는 SDS-PAGE에서의 상당한 분자량 이동을 초래하였다(도 14a 참조)
HAS 변성을 실시한 AT III의 이온교환 크로마토그래피는 AT III 분획(미처리 AT IIII와의 비교에 의거해서 회수율이 > 85 %임)을 제공하였다.
Q-세파로스에 대한 음이온 교환 후에 얻어진 미처리 AT III, 과옥소산 처리된 AT IIII 및 HAS-변성 AT-III의 탈-N-글리코실화는 도 14B에 표시한 바와 같이 SDS-PAGE에 있어서 견줄만한 분자량 이동을 초래하였다.
AT III 샘플의 유리 N-글리칸을 Hypercarb 카트리지에의 흡착과 해당 카트리지로부터의 용출에 의해 분리하고 HPAEC-PAD 분석을 행하였다. HAS-변성 AT III으로부터의 천연의 N-글리칸은 대조 샘플에서 검출된 모든 중성의 올리고당 피크의 존재를 나타내었다(도 15의 흔적 1 참조). 경미한 산처리 하에, 3개의 N-글리칸 제제 모두 올리고당의 시알산 유도체에서의 HAS-변성과 견줄만한 HAS-변성의 산 불안정 성질을 나타내는 중성의 올리고당의 매우 유사한 패턴을 보였다(도 16 참조). 데시알릴화 구조의 공통점은 MALDI/TOF 분석에 의해 확인되었다(데이퍼 표시 생략 ).
실시예 8 GM- CSF 의 컨쥬게이트의 또 다른 특징화
실시예 8.1 GM - CSF 의 설명
인간 재조합 GM-CSF는 Forno 등의 2004년도 문헌(Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz(2004) N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line; Eur J Biochem, 271 (5), 907-919)에 기재된 바와 같이 주로 CHO K1 세포로부터 발현 후에 제조되었고, 상기 문헌에 개시된 탄수화물 구조를 지녔다.
재조합 GM-CSF는 또한 예를 들어 문헌 "Okamoto, M., Nakai, M., Nakayama, C, Yanagi, H., Matsui, H., Noguchi, H., Namiki, M., Sakai, J., Kadota, K., Fukui, M. & Hara, H. (1991) Purification and characterization of three forms of differently glycosylated recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Archives of Biochemistry and Biophysics 286, 562-568"에 기재된 바와 같이 통상의 크로마토그래피 단계에 의해 정제될 수 있다.
이 연구에서 사용된 인간 GM-CSF의 아미노산 서열은 다음과 같았다:
1APA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE127(상기 Forno 등에 의한 참조문헌에 의거함).
실시예 8.2 재조합 GM - CSF 의 경미한 과옥소산염 처리에 의한 N- 아세틸네우람산의 과옥소산염 산화
0℃로 유지된 0.1M Na-아세테이트(pH 5.5) 중의 GM-CSF의 용액 0.80mg/㎖에 1OmM 나트륨-메타과옥소산의 빙냉 용액을 첨가하여 1mM 나트륨-메타과옥소산의 최종 농도를 얻었다. 이 혼합물을 빙욕중 어두운 곳에서 0℃에서 1시간 배양하고 글리세롤 20㎕의 첨가에 의해 반응을 종결시키고 더욱 1분간 배양하였다.
실시예 8.3 후속의 HAS -변성을 위한 과옥소산염 산화된 GM - CSF 의 버퍼 교환
버퍼 교환은 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인을 지닌 5 ㎖ Vivaspin 6 농축기 유닛(독일 하노버시에 소재한 Vivaspin AG사 제품)을 이용해서 행하였다. 먼저, 농축기 유닛을 0.1 M Na-아세테이트 버퍼(pH 5.5) 5 ㎖의 첨가에 의해 세척하고, Megafuge 1.0R(독일의 오스테로데시에 소재한 Kendro Laboratory Equipment사 제품) 중 6℃에서 4000 rpm에서 원심분리하였다. 이어서, 과옥소산 산화된 GM-CSF 용액 1 내지 5 ㎖를 상기 농축기 유닛에 첨가하고, 5배 농도가 얻어질 때까지 4000 rpm에서 25분간 원심분리하였다. 0.1 M Na-아세테이트 버퍼(pH 5.5)를 전술한 바와 같이 원심분리된 농축액에 첨가하였다. 원심분리 사이클을 3회 반복하고, 최종 농축액을 제거하여, 2.0㎖ 플라스틱 병으로 옮기고, 농축기 유닛을 각각 Na-아세테이트 버퍼(pH 5.5) 150 ㎕에 의해 2회 세척하고 나서, 단백질의 체적을 Na-아세테이트 버퍼(pH 5.5)에 의해 조정하였다.
실시예 8.4 HAS 와 GM - CSF 의 컨쥬게이트의 합성
합성은 상기 실시예 5.4에 기재된 바와 마찬가지였다.
실시예 8.5 HAS -변성 후의 GM - CSF 의 정제
하이드록실아미노-HES 10/0.7을 지닌 과옥소산-산화된 단백질의 배양으로부터 과잉의 활성화된 HES 유도체로부터의 HAS-변성 GM-CSF의 분리.
요약: AKTA 익스플로러 10 장비를 이용해서 유량 1.25 ㎖/min에서 실온에서 가동을 수행하였다. IFN-β 400 ㎍을 함유하는 배양 혼합물의 일정 부분을 11% 용리액 B(0.1 % TFA, 90% 아세토니트릴) 및 89% 용리액 A(0.1%. TFA)의 1.25 CV에 의해 평형을 이룬 250 mm × 10 mm C18-상 컬럼상에 적용하였다. 이어서, 샘플(약 1.25 ㎖)을 주입하고, 이 샘플 루프를 11% 용리액 B 11 ㎖로 세척하였다. 컬럼을 11% 용리액 B 0.2 CV로 세척하고 나서, 2 CV에 걸쳐 11% 내지 90% 용리액 B의 직선 구배를 적용하였다. 컬럼의 용출은 90% 용리액 B 0.8 CV를 이용해서 계속하였고, 최종적으로 컬럼을 11% 용리액 B 1.0 CV로 재평형을 이루었다.
GM-CSF 단백질을 % 용리액 B의 농도에서 7.5 ㎖ 체적으로 용출시켰다. 단백질의 회수는 동일한 장비를 이용해서 상기 컬럼 상에서 표준 GM-CSF 제제에 의거해서 60%(HES GM-CSF)였다.
실시예 8.5에 대한 재료 및 방법
장비 및 재료
장비: AKTA 익스플로러 10(Amersham Pharmacia Biotech),
펌프 P-903
믹서 M-925(0.6 ㎖ 챔버를 지님)
모니터 UV-900(10 mm 플로우 셀을 지님)
모니터 pH/C-900
분획 콜렉터 Frac-900
샘플 루프 2 ㎖
소프트웨어 유니콘 버전 3.21
컬럼: 250 mm × 10 mm, Macherey-Nagel 250-l/2"-10 Nucleosil 7 C18, Cat. No. 715002, Lot-No. 4020854
컬럼 체적: 20 ㎖
유량: 1.25 ㎖/min
용매 A: HPLC-물 중 0.1% TFA
용매 B: 90% 아세토니트릴; HPLC-물 중 0.1% TFA
실시예 8.5의 RP - HPLC 런 방법.
Figure 112006072272527-PCT00113
검출: 280 nm
221 nm
206 nm
전도도
분획 체적: 1.25 ㎖ / 분획
실시예 8.5로부터의 결과
과잉의 HAS(10Kda)-유도체로부터의 GM-CSF(실시예 8.5)의 RP-HPLC 분리는 컬럼으로부터 용출하는 HAS-변성 GM-CSF 모두를 포함하는 분획 26 내지 32를 제공하였다. HAS 변성 후의 단백질의 SDS-PAGE 패턴은 35 내지 90 Kda 사이의 분자량 영역에 있어서 브로드한 확산 밴드를 나타낸 반면, 변성 GM-CSF는 비글리코실화, 모노-N-글리코실화 및 디-N-글리코실화 형태의 패턴을 나타내었다(도 17, 문헌 Forno et. al., 2004 참조).
실시예 8.6 분석 실험
a) 재조합 폴리펩타이드 N- 글리코시다제에 의한 N-결합 올리고당의 유리
50 mM Na-포스페이트 버퍼(pH 7.2) 중의 천연의 과옥소산염 산화된 또는 HAS-변성 IFN-BIa 200 ㎍ 내지 1 ㎎에 재조합 폴리펩타이드 N-글리코시다제(독일의 펜츠버그에 소재한 Roche사 제품; 250 유닛/250 ㎕ 로트: 101610420) 25 ㎕를 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 12 내지 18 시간 배양하고 N-글리코사이드결합 올리고당의 해리는 환원조건하에서 단백질 5 내지 10 ㎍의 SDS-PAGE 분석에 이어서, 쿠마시 블루(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH 사 제품)에 의한 단백질 밴드의 염색과 GM-CSF 단백질 밴드의 탈-N-글리코실화 형태의 이동 위치로의 특이적 이동의 검출에 의해 검사하였다(도 18 참조).
b) 효소적으로 해리된 N- 글리칸 및 HAS -변성 N- 글리칸의 분리 및 탈염화
해리된 N-글리칸은 냉 100 % 에탄올 3 체적의 첨가에 의해 폴리펩타이드로부터 분리하고, -20℃에서의 배양은 적어도 2시간 수행하였다. 석출된 단백질은 40 ℃, 13,000 rpm에서 10분간의 원심분리에 의해 제거하였다. 다음에, 펠릿을 빙냉 70% 에탄올 500 ㎕로 2회 추가 세척하였다. 저류된 상청액 중의 올리고당을 진공 원심분리기(Speed Vac 농축기, 미국 Savant Instruments Inc.사 제품)에서 건조하였다. 글리칸 샘플은 다음과 같이 Hypercarb 카트리지(100 또는 200 mg)를 이용해서 탈염하였다: 사용 전에, 카트리지를 0.1%(v/v) TFA 중의 80%(v/v) 아세토니트릴 500 ㎕로 3회 세척하고 나서, 물 500 ㎕로 3회 세척하였다. 샘플을 카트리지에 장전하기 전에 적어도 300 ㎕의 최종 체적으로 물로 희석하였다. 이들을 물로 엄격하게 세척하였다. 다음에, 올리고당을 0.1%(v/v) TFA를 함유하는 25% 아세토니트릴 1.2 ㎖로 용출하였다. 용출된 올리고당을 2 M NH4OH로 중화시키고, Speed Vac 농축기에서 건조시켰다. 이들은 H2O 중 -20℃에서 보존하였다.
c) 올리고당의 경미한 산 가수분해(올리고당으로부터 시알산 및 HAS -변성 시알산의 제거)
탈염된 올리고당의 일정 부분을 1OmM H2SO4의 동일 체적과 혼합하고, 80℃에서 90분간 배양하였다. 50 mM NaOH에 의한 중화 후, 데시알릴화 글리칸 혼합물을 Speed-Vac에서 건조하고, HPAEC-PAD(펄스화 전류측정검파에 의한 하이-pH-음이온교환 크로마토그래피)에서의 분석을 위해 적절한 농도로 조정하였다. MALDI/TOF MS 분석을 위해, 흡착용의 20 내지 30 ㎕ Hypercarb 재료를 함유하는 피펫을 이용하고, H2O 중 0.1% 트리플루오로 아세트산 중의 25% 아세토니트릴로 세정 및 용출해서 중성의 N-글리칸을 탈염처리하였다.
d) HPAEC - PAD ( 펄스화 전류측정 검파에 의한 하이 - pH -음이온교환 크로마토그래피)에 의한 올리고당 맵핑
주로 실시예 7.6.d)에 설명된 바와 같이 올리고당의 맵핑 및 정량화에 이용하였다.
결과
실시예 8.5로부터의 RP-HPLC 정제 물질은 산화된 시알산을 통해 HAS-유도체를 지닌 단백질의 그의 탄수화물 사슬에서의 변성을 설명하는 데 이용되었다. 그들의 트립메틸시알릴화 유도체의 가스 크로마토그래피 분석에 의한 단당류 조성 분석결과는, 글루코오스와 모노- 및 디-하이드록시에틸화 글루코오스 유도체뿐만 아니라, 만노오스, 갈락토오스 및 N-아세틸글루코사민, 그리고 소량의 N-아세틸갈락토사민의 존재를 나타내었다.
HAS-변성 GM-CSF로부터 유리된 천연의 올리고당의 HPAEC-PAD 분석은 복합체형 올리고당의 HAS 변성에 대응하는 피크를 나타내었다(도 19 참조).
경미한 산처리시, GM-CSF의 중성 N-글리칸을 47 내지 49분에서 용출하는 HAS-변성 단백질 및 변성 HAS-유도체의 샘플에서 검출하였다.
실시예 9 ATIII - 컨쥬게이트의 합성
실시예 9.1 하이드록실아미노 - HES 유도체의 합성
실시예 9.1(a) 하이드록실아미노HESlO /0.4의 합성
HES10/0.4(MW = 10000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 0.8 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 8 ㎖에 용해시키고, 8 mmol 0-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 -20℃에서 2-프로판올 40 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 45시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 73%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 8500 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 9.1(b) 하이드록실아미노HESlO /0.7의 합성
HES10/0.7(MW = 10000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 1.06 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 10 ㎖에 용해시키고, 10.9 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 -20℃에서 2-프로판올 40 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 45시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 60%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 10500 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 9.1(c) 하이드록실아미노HES30 /0.4의 합성
HES30/0.4(MW = 30000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 18 ㎖에 용해시키고, 6.67 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 15.5시간 진탕후, 반응 혼합물을 -20℃에서 2-프로판올 80 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 45시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 83%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES30/0.4의 분자량은 33000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 9.1(d) 하이드록실아미노HES30 /0.7의 합성
HES30/0.7(MW = 30000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 18 ㎖에 용해시키고, 6.67 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록 실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 15시간 진탕후, 반응 혼합물을 -20℃에서 2-프로판올 80 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 45시간 물에 대해서 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 86%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.4의 분자량은 31000 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 9.1(e) 하이드록실아미노HES50 /0.4의 합성
HES50/0.4(MW = 50000 D, DS = 0.4, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 20㎖에 용해시키고, 4 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19.5시간 진탕후, 반응 혼합물을 -20℃에서 2-프로판올 80 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 45 시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 94%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES50/0.4의 분자량은 56000 D였고, DS는 0.41이었다.
실시예 9.1(f) 하이드록실아미노HES50 /0.7의 합성
HES50/0.7(MW = 50000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2.5 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 25 ㎖에 용해시키고, 5 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19.5시간 진탕후, 반응 혼합물을 -20℃에서 2-프로판올 80 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 45시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 85%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES50/0.7의 분자량은 47000 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 9.1(g) 하이드록실아미노HES10 /0.7의 합성
HES10/0.7(MW = 10000 D, DS = 0.7, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 2 g을 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.2) 18 ㎖ 중에 용해시키고, 20 mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 100㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 21시간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 구하지 않았다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 10500 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 9.2 알데히도 - HES 유도체의 합성
실시예 9.2(a) 아미노 HESlO /0.7의 합성
옥소-HES10/0.7(MW = 10000 D, DS = 0.7, DE 196 28 705 Al에 따라 제조된독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 6.02 g을 질소하에 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 32 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 6.03 ㎖를 첨가하였다. 40℃에서 17시간 교반한 후, 이 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 150 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 40 ㎖로 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품)하고, 동결건조하였다. 분리된 생성물의 수율은 52%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES10/0.7의 분자량은 15000 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 9.2(b) 알데히도HESlO /0.7의 합성
4-포르밀벤조산 150 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 230 mg(둘 모두 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 10 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 204 ㎕를 첨가하였다. 21℃에서 30분간 배양한 후, 아미노-HES 10/0.7 1g(9.2(a)에 기재된 바와 같이 합성됨)을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 84 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙(dialysis tubing), 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 83%였다.
실시예 9.2(c) 아미노 HES50 /0.7의 합성
옥소-HES 50/0.7(MW = 50000 D, DS = 0.7, 성분의 몰비를 채택해서 DE 198 26 705 Al에 따라 제조된 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 6.09 g을 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 32 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 1.22 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 150 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물 을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 40 ㎖로 세척하고 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품)하고, 동결건조하였다. 분리된 생성물의 수율은 67%였다.
LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES50/0.7의 분자량은 57000 D였고, DS는 0.76이었다.
실시예 9.2(d) 알데히도HES50 /0.7의 합성
4-포르밀벤조산 124 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 174 mg(둘 모두 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 38 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드 155 ㎕를 첨가하였다. 21℃에서 30분간 배양한 후, 아미노-HES 50/0.7 3.8g을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 160 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, N,N-디메틸포름아마이드 20 ㎖에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 80 ㎖에 의해 석출시켰다. 원심분리후, 석출물을 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙(dialysis tubing), 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품), 동결건조시켰다. 분리한 생성물의 수율은 77%였다.
실시예 9.3 글리칸 전략에 의한 AT III - 컨쥬게이트의 합성
실시예 9.3(a) 산화된 AT III 과 실시예 9.1(a) - 9.1(g)의 반응생성물과의 반응
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5)(GlycoThera, B52 perj-ox STM LJ2-366, 4.375 mg/㎖, 실시예 3.2 참조) 중의 산화된 AT III의 용액 685 ㎕에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 814 ㎕ 및 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5) 중의 HES-유도체의 용액 1.5 ㎖를 첨가하고, 이 용액을 22℃에서 26시간 배양하였다. 이하의 최종 HES 농도를 이용하였다:
실시예 9.1(a) 및 9.1(b)에 따라 제조된 HES 유도체 0.46 mg/㎖.
실시예 9.1(c) 및 9.1(d)에 따라 제조된 HES 유도체 1.38 mg/㎖
9.1(e)에 따라 제조된 HES 유도체 9.1 mg/㎖
9.1(f)에 따라 제조된 HES 유도체 10.5 mg/㎖
9.1(g)에 따라 제조된 HES 유도체 17.25 mg/㎖
반응 대조군으로서의 9 mg/㎖ HES50/0.7(독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품). LALLS-GPC에 의해 측정한 바 HES50/0.7의 분자량은 47000 D였고, DS는 0.76이었다.
각 반응 혼합물은 겔 전기 영동에 의해 분석하였다(도 20 참조).
실시예 9.4 환원성 아민화에 의한 ATIII - 컨쥬게이트의 합성
실시예 9.4(a) 버퍼 교환:
AT III(Atryn, 미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics사 제품)를 물 10 ㎖에 용해시켜 5 mM 시트르산 나트륨, 67 mM 글리신 및 68 mM 염화 나트륨(pH 7.0) 중의 25 mg/㎖ ATIII의 용액을 얻었다. 이 용액 1 ㎖를 냉 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0)로 희석하고, Vivaspin 20 ㎖ 농축기(VS2001, IOKD MWCO, PES 멤브레인, 독일의 하노버에 소재한 Vivascience AG사 제품)에 의해 4℃에서 투석여과에 의해 4 ㎖로 농축하고, 버퍼에 의해 20 ㎖까지 희석하였다. 이 투석여과를 2회 반복하였다. 최후의 투석여과 단계에서의 최종 농도는 3 mg/㎖였다.
실시예 9.4(b) ATIII 의 실시예 9.2(b) 및 9.2(d)의 반응 생성물과의 반응:
0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0)로의 버퍼 교환 후 AT III 용액 1 ㎖에, 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0) 중의 HES-유도체의 용액 1 ㎖ 및 동일 버퍼 중의 나트륨 시아노보로하이드라이드의 60 mM 용액 1 ㎖를 첨가하고, 이 용액을 4℃에서 15.5시간 배양하였다. 이 용액 모두를 혼합 전에 0℃까지 냉각하였다.
이하의 최종 HES 농도를 이용하였다:
9.2(b)에 따라 제조된 HES 유도체 13 mg/㎖.
9.2(d)에 따라 제조된 HES 유도체 64.7 mg/㎖.
반응 대조군으로서의 HES50/0.7(독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 64.7 mg/㎖.
각 반응 혼합물은 겔 전기 영동에 의해 분석하였다.
실시예 10 활성화 알돈산을 통한 IFN -알파 컨쥬게이트의 합성
사용된 IFN-알파는 대장균(Escherichia coli)(E. coli)을 이용해서 재조합 DNA 수법에 의해 제조된 재조합 인간 인터페론 알파-2b이었다. 이것은 165개의 아미노산으로 이루어지고 천연의 인간 인터페론 알파 2b(hIFN-알파 2b)와 동일한 아미노산 서열을 제시하였다.
실시예 10.1 산화된 HES (옥소- HES )의 합성
산화된 HES는 DE 196 28 705 Al에 따라 HES(MW = 57 kD, DS = 0.76, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품)로부터 제조되었다.
실시예 10.2 NHS -활성화 옥소- HES 의 합성
실시예 10.1에서 제조된 바와 같은 옥스-HES 50/0.7 4.81 g을 밤새 80℃에서 오븐에서 건조하였다. 옥스-HES는 건조 DMF 중 80℃에서 용해시키고 실온까지 냉각하였다.
1 ㎖ 건조 DMF 중의 N,N'-디숙신이미딜카보네이트(Aldrich사 제품) 102.1 mg의 용액으로부터, 교반된 반응용기로 400 ㎖를 적하하고, 실온에서 2시간 교반하였 다. 반응 혼합물을 건조 아세톤 50 ㎖에 적가하고, 석출된 생성물을 원심분 리에 의해 회수하고, 건조 아세톤 4 ×50 ㎖로 세척하고, 여기서 재현탁된 생성물을 원심분리하였다. 잔류 용매를 진공중 실온에서 제거하였다.
실시예 10.3 활성화 알돈산(AAA)을 통한 IFN -알파 컨쥬게이트의 합성
단백질을 냉각된 원심분리기(4 ℃) 중의 Amicon Ultra filtration modules 4(5 kDa 분자량 컷 오프(MWCO))를 이용해서 최종 농도 10 mg/㎖로 농축하였다. 이 절차 동안 버퍼를 등장성 인산 버퍼(pH 8)로 교환하였다. 커플링을 위해, 단백질 용액 9 ㎎을 실온에서 2시간 동안 실시예 10.1의 NHS 활성화된 옥스-HES의 20배 몰량으로 배양하였다. 반응 혼합물을 냉각된 원심분리기(4 ℃) 중의 Amicon Ultra filtration modules 4(5 kDa MWCO)를 이용해서 한외여과에 의해 NHS로부터 정제하였다. 이 절차 동안 버퍼를 pH 7.5에서 25 mM 인산 나트륨, 30 mM 염화 나트륨, 0.3 mM EDTA로 교환하였다.
실험의 반응 수율은 SEC에 의해 구한 바 > 90%였다(도 22 참조).
실시예 10.4 IFN -알파- HES 의 정제
샘플의 정제는 AKTA 익스플로러 10 장비를 이용해서 실온에서 수행하였다. 5 ㎖ Q-세파로스 패스트 플로를 함유하는 컬럼을 버퍼 Al(20 mM Tris/HCl, pH 8.0) 5 CV에 의해 평형화하였다. 샘플을 버퍼 A에 의해 1:16으로 희석하고, 6 ㎖/min의 유량으로 샘플 펌프를 이용해서 적용하였다. 버퍼 Al 20 ㎖에 의해 샘플 펌프의 세척 후, 컬럼을 1.0 ㎖/min의 유량으로 버퍼 Al 15 ㎖에 의해 더욱 세척하였다.
0.8 ㎖/min의 유량으로 37.5 분에 걸친 버퍼 Bl(20 mM Tris/HCl 중의 0.3 M, pH 8.0) 및 12.5분에 걸친 버퍼 B에 의한 아이소크래틱 런의 0 내지 100%의 선형 구배를 이용해서 용출을 수행하였다. 0.8 ㎖/min의 유량으로 버퍼 B2(20 mM Tris/HCl 중 1.5 M NaCl, pH 8.0) 15 ㎖에 이어 버퍼 B 5 ㎖를 이용해서 컬럼을 재생하였다. 다음 런의 재평형화는 버퍼 Al 25 ㎖를 사용해서 1.0 ㎖/min의 유량으로 수행하였다.
장비: AKTA 익스플로러 10(Amersham Pharmacia Biotech),
펌프 P-903
믹서 M-925(0.6 ㎖ 챔버를 지님)
모니터 UV-900(10 mm 플로우 셀을 지님)
모니터 pH/C-900
펌프 P-950 (샘플 펌프)
소프트웨어 유니콘 버전 3.21
컬럼: Amersham Bioscience C 10/10
컬럼 재료: Q-세파로스 패스트 플로, 로트 번호 OD 06453
컬럼 체적: 5 ㎖
프로그램: IFN-α주입 없이 Q Seph 5 ㎖
용리액 Al : 2OmM Tris/HCl, pH 8,0(PL0935)
용리액 Bl: 2OmM Tris/HCl 중의 0.3M NaCl, pH 8,0(PL0938)
용리액 B2: 2OmM Tris/HCl 중의 1.5MNaCl, pH 8,0(PL0937)
방법
Figure 112006072272527-PCT00114
검출 280 nm, 260 nm, 220 nm
pH
전도도
분획화 1 ㎖ 분획
실시예 11 IFN 알파 항바이러스 활성 생물학적 에세이의 설명
세포 배지에서의 시험 항목을 예비 희석한 후, 연속적인 2배 희석액을 제조하였다. 96 웰 마이크로티터 플레이트에 있어서, 희석된 인터페론을 새롭게 트립신화된 MDBK 세포(웰당 40,000개의 세포)에 -희석당 4배 복제로- 첨가하였다. 이 에세이는 37℃에서 24시간 동안 배양되었다(웰당 총 체적: 150 ㎕(실시예 11.1) 또는 175 ㎕(실시예 11.2)).
이어서, 희석된 VSV 원액 50 ㎕를 각 웰(양성 대조군의 웰 제외)에 첨가하여 감염 다중도를 0.1로 하였다.
이하의 대조군이 각 에세이에 포함되었다: 인터페론 대신에 바이러스 + 세포배지를 입수한 12개의 웰(음성 대조군) 및 인터페론 및 바이러스 대신에 세포 배지를 입수한 12개의 웰(양성 대조군).
에세이를 37℃에서 42시간 배양하였다.
배양기간의 말기에, 각 웰의 세포 배양 상청액을 MTT(세포 배지내 적어도 2 mg/㎖)의 용액 50 ㎕로 대체하였다. 세포를 3시간 배양하였다. 각 웰에 이소프로판올/HCl(40 mM HCl을 지닌 이소프로판올)의 100 ㎕ 용액을 첨가함으로써 증식 세포에 의해 형성된 보라색 포르마잔 염료를 가용화하였다. 이어서, 용액의 흡광도 수치를 마이크로티터 플레이트 리더에 의해 570/630 nm에서 측정하였다.
인터페론 및 VSV의 존재하에 증식된 MDBK 세포의 증식 활성을 다음과 같이 인터페론의 각 희석액에 대해 산출하였다:
[(4개의 인터페론 처리된 웰의 평균흡광도)-(음성 대조군의 평균 흡광도)] * 100/[(양성 대조군의 평균 흡광도)-(음성 대조군의 평균 흡광도)]
인터페론-알파의 항바이러스 활성을 각 시험 항목에 대해 4개의 별도의 에세이에 있어서 구하였다.
실시예 11.1 NIH 표준에 대한 인트론 ® A의 항바이러스 활성
모든 실험에 있어서, NIH-표준 rhIFN-알파 2a(NIAID, NIH, Bethesda, USA, GxaOl-901-535)에 대해서 검정을 행한 인트론® A(IFN-알파 2b, Schering-Plough)를 내부 실험실 기준으로서 사용하였다. NIH-표준의 비활성도(specific activity)는 9,000 IU/㎖였다. 내부 실험실 기준인 인트론® A는 실시예 11에 기재된 바와 같은 시험에 있어서 비활성도가 8,487,000 IU/㎖였다(도 23 참조).
실시예 11.2 인트론 ® A에 대한 IFN -알파- HES 의 항바이러스 활성
실시예 11에 기재된 분석 시스템에 있어서, 실시예 10.4로부터의 컨쥬게이트는 인트론® A와 비교해서 실험하였다. 두 물질의 CPE50 농도를 산출하였다. IFN-알파-HES는 인트론® A의 활성보다 25% 많았다(도 24 참조).
실시예 12 IFN -알파-HES의 생체내 생활성 (마우스에서의 PK 연구)
실시예 12.1 실시예 11에 기재된 바와 같은 에세이 시스템 1에 대한 마우스의 혈청의 영향
인터페론-알파의 희석액을 세포 배지(대조군) 및 마우스 혈청(1:40 희석 및 1:80 희석)에서 제조하였다. 에세이는 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다.
인터페론-알파의 항바이러스 활성은 대조군, 1:40 희석된 마우스 혈청뿐만 아니라 1:80 희석된 마우스 혈청에 대해 2개의 별개의 에세이로 구하였다. 그 결과는 1:40 희석 및 1:80 희석에서의 마우스 혈청이 인터페론-알파의 항바이러스 활성에 대한 생물학적 에세이에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
실시예 12.2 마우스에서의 생체내 연구
혼주 혈청의 항바이러스 활성을 항바이러스성 에세이에서 시험하였다. 혈청은 IFN-알파 또는 컨쥬게이트의 30㎍/kg(단백질 함량을 기준으로 함)의 정맥내 주사후 2시간, 4시간, 12시간 및 24시간에 희생한 각 시각에서의 2마리의 마우스(8주령의 암컷 BALB/c 마우스)로부터 회수하였다.
혈청 샘플을 해동하고 소용돌이 교반(vortexing)에 의해 철저히 균질화하였다. 연속한 2배의 희석액을 세포 배지에 준비하고, 인트론® A의 병을 해동하고 소용돌이 교반에 의해 철저히 균질화하였다. 연속한 2배 희석액을 세포배지에 준비하였다.
CPE-에세이에 있어서의 EC50-희석도를 실시예 11에 기재된 바와 같이 1:2 희석 연속물의 투여용량 응답 곡선으로부터 구하였다.
재료의 반감기는 비변성 출발물질 및 페가시스®와 비교해서 구하였다. 반감기는 EC50-희석 대 주입후 시간의 반대수(semi-logarithmic) 플롯으로부터 산출하였다(도 25 참조).
항바이러스 활성은 24 시간까지 IFN-알파-HES에 대해 검출되었다. HES를 지닌 IFN-알파의 유도화에 의한 반감기 증가가 관찰되었다(반감기 대략 5 시간). 비변성 IFN-알파에 대해서, 혈청의 항바이러스 활성은 너무 낮아 혈청 반감기를 산출할 수 없었다.
실시예 13 환원성 아민화를 통해 합성된 A1AT (α 1AT , 알파 1AT ) 컨쥬게이트
실시예 13.1 산화된 HES 로부터의 아미노- HES (A)의 합성
옥소-HES(MW = 57,000 D, DS = 0.76, DE 196 28 705 Al에 따라 제조된 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 6.09 g을 진공중 80℃에서 밤새 가열하고, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 32 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 1.22 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 150 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 40 ㎖로 세척하고 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 82 %였다.
실시예 13.2 실시예 13.1의 아미노- HES (A)로부터의 알데히도 - HES (A)의 합성
4-포르밀벤조산 125 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 174 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 38 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 155 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(A)(실시예 13.1에 기재된 바와 같이 제조됨) 3.8 g을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 160 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, N,N-디메틸포름아마이드 20 ㎖에 재용해시키고, 실시예 13.1에 기재된 바와 같이 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 80 ㎖에 의해 석출시켰다. 원심분리후, 석출물을 물 50 ㎖에 재용해시키 고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 77 %였다.
실시예 13.3 산화된 HES 로부터의 아미노- HES (B)의 합성
옥소-HES(MW = 57 kD, DS = 0.76, DE 196 28 705 Al에 따라 제조된 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 10 g을 진공중 80℃에서 밤새 가열하고, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 52 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 2 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH + Co. KG사 제품) 350 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 80 ㎖에 의해 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 85 %였다.
실시예 13.4 실시예 13.3의 아미노- HES (B)로부터의 알데히도 - HES (B)의 합성
4-포르밀벤조산 153 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 241 mg(둘다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 51 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 170 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(B)(실시예 13.3에 기재된 바와 같이 합성됨) 5.1 g을 첨가하였다. 22℃에서 16시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 360 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고 실시예 13.1에 기재된 바와 같이 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 360 ㎖에 의해 석출시켰다. 원심분리후 석출물을 물 50 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품)하고, 동결건조하였다. 분리된 생성물의 수율은 87 %였다.
실시예 13.5 환원성 아민화에 의한 알데히도 - HES (A) 및 (B)의 A1AT에 대한 컨쥬게이션
알데히도-HES(B)(실시예 13.4에 기재된 바와 같이 제조됨) 189 mg 및 알데히도-HES(A)(실시예 13.2에 기재된 바와 같이 제조됨) 172 mg의 혼합물을 반응 버퍼(0.1 M 인산 나트륨 버퍼, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.2) 2.88 ㎖ 중에 용해시켰다. 20 ℃에서, 동일한 버퍼 중 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 1.67 ㎖를 첨가하고 나서, A1AT 용액(0.1 M 인산 나트륨 버퍼, 150 mM 염화 나트륨 중 c(A1AT) = 11.0 mg/㎖, pH 7.2, A1AT= rh A1AT, 미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A) 0.455 ㎖를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 배양하였다. 17시간 후, 반응 버퍼 200 ㎕ 중에 용해된 추가의 나트륨 시아노보로하이드라이드 6.7 mg을 첨가하고, 이 혼합물을 동일 온도에서 추가로 24시간 배양하였다. 겔 전기 영동에 의해 총 배양 시간 25 시간 후 이 용액 10 ㎕를 분석하였다(도 26 참조).
실시예 13.6 환원성 아민화에 의한 HES 의 A1AT로의 컨쥬게이션 (반응 대조군)
HES(MW = 42 kD, DS = 0.41, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 362 mg을 반응 버퍼(0.1 M 인산 나트륨 버퍼, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.2) 2.88 ㎖에 용해시켰다. 20 ℃에서, 동일한 버퍼 중 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 1.67 ㎖를 첨가하고 나서, A1AT 용액(0.1 M 인산 나트륨 버퍼, 150 mM 염화 나트륨 중 c(A1AT) = 11.0 mg/㎖, pH 7.2, α1AT= rh α1AT, 미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A) 0.455 ㎖를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 배양하였다. 17시간 후, 반응 버퍼 200 ㎕ 중에 용해된 추가의 나트륨 시아노보로하이드라이드 6.7 mg을 첨가하고, 이 혼합물을 동일 온도에서 추가로 24시간 배양하였다. 겔 전기 영동에 의해 총 배양 시간 25 시간 후 이 용액 10 ㎕를 분석하였다(도 27 참조).
실시예 13.7 이온교환 크로마토그래피( IEC )에 의한 HES - A1AT 컨쥬게이트의 정제
A1AT의 컨쥬게이트는 AKTA-익스플로러 크로마토그래피 시스템(Explorer chromatography system)을 이용한 HiTrap Q HP 컬럼(둘 다 Amersham Biosciences사 제품) 상에서 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제는 문헌 "Chen, Hammond, Lang and Lebing, Purification of X1-Proteinase Inhibitor from Human Plasma Fraction IV-I by Ion Exchange Chromatography, VoxSanguinis 1998, 74, 232-241"에 기재된 바와 같이 인간 혈장으로부터의 A1AT의 분리에 따라 수행하였다.
샘플 제제: 용리액으로서 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 염화 나트륨(pH 8)을 이용해서 AKTA-익스플로러 크로마토그래피 시스템와 조합된 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(Desalting column)(Amersham Biosciences사 제품) 상에서의 버퍼 교환.
이하의 파라미터를 이용해서 조제의 반응 혼합물(실시예 13.5에 기재된 바와 같이 제조됨, 대략 5 ㎖)을 탈염수에 의해 최종 체적 10 ㎖로 희석한 후 버퍼 교환을 수행하였다:
컬럼: HiPrep 26/10 탈염
유량: 10 ㎖ / min
용리액: 20 mM 인산 나트륨,
20 mM 염화 나트륨,
pH 8
샘플 체적: 10 ㎖
용리액 분획화: 2.5 ㎖
평형화: 5 컬럼 체적
용리 길이: 2 컬럼 체적
용출액의 첫번째 14 ㎖를 저류시키고, 결합 버퍼를 첨가해서 최종 체적 20 ㎖를 얻었다. 단백질을 대략 5 ㎎ 함유하는 이 용액을 이하의 파라미터를 이용해서 IEC에 의해 정제하였다:
컬럼: HiTrap Q HP 1 ㎖
유량: 1 ㎖ / min
결합 버퍼(BB): 20 mM 인산 나트륨,
20 mM 염화 나트륨,
pH 8
용리 버퍼(EB): 20 mM 인산 나트륨,
1 M 염화 나트륨,
pH 8
샘플 체적: 20 ㎖
플로-쓰루(flow-through) 분획화: 2㎖
용리액 분획화: 1 ㎖
개시농도 EB: 0 %
평형화: 5 컬럼 체적
비결합 샘플 세척제거: 15 ㎖
목표 농도 EB: 15 %
그래디언트 길이: 20 ㎖
크로마토그래피 후에 회수된 분획은 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. HES-A1AT 컨쥬게이트를 함유하는 분획은 저류시켰다(분획 Bl 내지 C6에 대응하는 용출 체적 40 내지 47 ㎖, 도 27 참조). 저류된 분획의 일부에 있어서, 소량의 미처리 A1AT가 검출가능하였다. 기준 표준으로서 A1AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A)를 이용해서 BCA(Pierce Cat. No. 23225)에 의해 구한 크로마토그래피 후에 저류된 분획의 초기 농도는 170 ㎍/㎖였다. 희석 및 20 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨(pH 7.2)으로의 버퍼 교환 후, 얻어진 단백질 농도는 54.5 ㎍/㎖였다(BCA(참조 표준으로서 GTC로부터 A1AT를 피어싱함)). 이 최종 용액을 이용해서 컨쥬게이트의 저해 효능을 구하였다.
실시예 13.8 인간 과립구 엘라스타제용의 HES- A1AT 컨쥬게이트의 시험관내 저해 용량의 결정
컨쥬게이트의 엘라스타제 저해 활성 시험은 Tecan UV-VIS-Platereader Model Sunrise를 이용해서 Castillo et al, Anal . Biochem. 1979, 99, 53-64에 따라 수행하였다.
이 에세이는 엘라스타제에 의해 촉매화된 N-Met-O-숙시닐-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-알라닌으로부터 p-니트로알라닌의 해리에 의거한 것이다. 이 가수분해는 405 nm에서의 흡광도의 증가를 수반할 수 있다. 초기의 가수분해속도는 효소의 활성과 밀접한 상관이 있다. 이 에세이는 피시험 저해제의 상이한 농도의 존재 혹은 부재 중에 행하였다. 시험 물질의 저해 활성에 따른 효소 활성의 감소는 A405 대 시간 플롯의 기울기의 감소로 표현된다. 임의의 저해제 농도의 존재 중의 잔류하는 엘라스타제 활성은 비저해 곡선의 기울기로 나눈 저해된 곡선의 기울기에 의해 부여된다. 잔류 효소 활성과 저해제 농도 간에는 선형 상관이 있다. 선형 퇴행을 이용함으로써, 선형의 원활한 라인이 얻어질 수 있고, 주어진 저해제 농도의 잔류 효소 활성이 산출될 수 있다. 이와 같이 해서, 상이한 저해제의 동일한 농도의 저해활성(= 1 - 잔류효소활성)을 비교할 수 있다(도 28 참조).
이하의 파라미터를 사용하였다:
기질 농도: 1.5 mM
엘라스타제 활성: 7.5 mU
파장: 405 nm
온도: 20 ℃
시간 간격: 15 초
키네틱 사이클: 25
계측 모드: 센터
에세이 용액은 10 % DMSO를 함유하는 300 ㎕ 버퍼(0.1 M Hepes, 0.5 M NaCl5 l0.05 %(m/v) Triton X-100, pH 7.5), 1.5 mM N-Met-O-숙시닐-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO2-알라닌, 7.5 mU 엘라스타제로 이루어지고 저해제의 양을 변화시켰다.
엘라스타제는 독일 하이델베르크에 소재한 SERVA Electrophoresis GmbH사로부터 구입하였다. 기타 모든 물질은 독일 타우프키르첸시에 소재한 Sigma Aldrich사로부터 구입하였다.
실시예 13.5에 기재된 바와 같이 합성된 컨쥬게이트의 저해 활성은 컨쥬게이션용의 출발물질로서 A1AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A)를 지니고 기준으로서 Prolastin® HS(독일의 레베르쿠젠에 소재한 Bayer Vital GmbH사 제품, 로트 번호 PR4HA43)와 비교해서 시험하였다. 잔류 효소 활성 대 농도 플롯은 도 28에 제공된다. 모든 곡선에 대한 직선성은 R2 > 0.98이었다. 이하에 있어서, 기준과 관련한 출발물질 및 컨쥬게이트의 저해활성뿐만 아니라, (저해제) = 1 ㎍/㎖에 대한 IC50-수치 및 엘 라스타제 저해가 부여된다. 이하의 표에 요약된 데이터는 HES와의 컨쥬게이션 후에 A1AT 활성의 주요부가 남아 있는 것을 입증하였다.
실시예 13.8의 표
저해제 선형의 원활한 라인 방정식 IC50 [㎍/㎖] 엘라스타제 저해 c(저해제) = 1 ㎍/㎖ [%] Prolastin에 관한 저해 활성 [%]
Prolastin Y= -0.6754x + 0.9627 0.685 71.3
α1AT Y = -0.5046x + 0.9558 0.903 54.9 77.0
HES-A1AT-컨쥬게이트 Y = -0.3757x + 0.9627 1.232 41.3 57.9
실시예 13.9 rh 알파 1AT 및 혈장 유래 h 알파 1AT 와 비교한 HES-rh 알파 1AT 컨 쥬게 이트의 생체내 반감기의 결정
8 내지 10주령의 암컷 마우스(BALB/cOlaHsd, Harlan GmbH, Borchen, Germany)를 시험 유기체(42마리의 마우스, 샘플 당 14마리)로서 이용하였다. 각 동물의 "체중이다"는 상이한 샘플 용액의 투여 직전에 검출하였다. 버퍼 pH = 7.2(20 mmol 인산 나트륨, 150 mmol 염화 나트륨) 중 이하에 요약한 샘플의 50 ㎍/㎖ 용액의 100 ㎕는 마우스의 꼬리정맥에 정맥내 주입하였다.
샘플 1 : rh 알파1AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A)
샘플 2: 실시예 13.5에서 제조된 바와 같은 rh 알파1AT-HES 컨쥬게이트
샘플 3: 혈장 유래 h 알파1AT(독일 하이델베르크에 소재한 SERVA Electrophoresis GmbH사 제품)
주입 이후 1, 2, 4, 10, 24, 31.5 및 48시간에, 각 군의 두 마리의 마우스를 희생시키고, 그 동물의 심장으로부터 전체 혈액 샘플(~500㎕)을 회수하였다. 혈청은 Microvette® 500 Z-GeI(Sarstedt, Numbrecht, Germany)을 이용해서 제조하였다. 혈청 샘플은 알파1AT 농도 계측 개시 때까지 -80℃에서 보관하였다.
알파1AT 농도는 제조사의 지시에 따라 시판의 알파1AT-ELISA(독일의 벤샤임(Bensheim)에 소재한 Immundiagnostik사 제품)를 이용해서 검출하였다.
얻어진 결과는 비변성 rh 알파1AT 출발물질과 비교해서 rh 알파 1AT-HES 컨쥬게이트의 상당한 혈장내 반감기의 증가를 입증한다. 컨쥬게이트의 측정된 반감기는 이하의 표에 따른 혈장 유래의 h 알파1AT의 것과 동일한 범위에 있다.
실시예 13.9의 표 : 샘플 1 내지 3의 혈장내 반감기.
샘플번호 마우스에서의 혈장내 반감기
1 1.2
2 3.6
3 3.2
실시예 14 환원성 아민화를 통한 HES - IFN -알파 컨쥬게이트의 합성
사용된 IFN-α는 대장균(Escherichia coli)(E. coli)을 이용해서 재조합 DNA 수법에 의해 제조된 재조합 인간 인터페론 알파-2b였다. 이것은 165개의 아미노산으로 이루어지고 천연의 인간 인터페론 알파 2b(hIFN-알파 2b)와 동일한 아미노산 서열을 제시하였다.
실시예 14.1 옥소- HES 의 합성
DE 196 28 705 A1에 기재된 바와 같은 알칼리성 요오드 용액을 이용해서 HES로부터 후술하는 바와 같이 환원성 말단에서 산화된 HES(옥소-HES)를 제조하였고, 상기 문헌의 각각의 내용(제 9컬럼 6 내지 24행의 실시예 A)은 참조로 본 명세서에 병합된다.
실시예 14.2 HES 유도체의 합성
두 단계 절차에 있어서, 실시예 14.1의 옥소-HES를 그의 환원성 말단에서 아민에 의해 변성시키고, 알데히도기를 두번째 반응에서 도입하였다. 얻어진 알데히드-HES를 이용해서 실시예 14.3에 기재된 바와 같은 환원성 아민화를 통해 IFN-알파-HES 컨쥬게이트를 생성하였다.
실시예 14.2.1 실시예 14.1의 옥소- HES 로부터의 아미노- HES 의 합성
실시예 14.1의 옥소-HES(MW = 14.5 kD, DS = 0.41, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 5.12 g을 진공 중 80℃에서 하룻밤 가열하고, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 25 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 5.13 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 150 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심 분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 40 ㎖로 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 67 %였다.
실시예 14.2.2 실시예 14.2.1의 아미노- HES 로부터의 알데히도 - HES 의 합성
4-포르밀벤조산 105 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 135 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Cliemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 7 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 135 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(실시예 14.2.1에 기재된 바와 같이 합성됨) 0.7 g을 첨가하였다. 22℃에서 18시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 42 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, DMF 5 ㎖에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 에탄올/아세톤 42 ㎖에 의해 석출시켰다. 원심분리 후, 회수된 석출물을 물에 용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 95 %였다.
실시예 14.2.3 실시예 14.1의 옥소- HES 로부터의 아미노- HES 의 합성
실시예 14.1의 옥소-HES(MW = 14.7 kD, DS = 0.76, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 6.02 g을 진공중 80℃에서 하룻밤 가열하고, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 32 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 6.03 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 150 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 40 ㎖로 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 52 %였다.
실시예 14.2.4 실시예 14.2.3의 아미노- HES 로부터의 알데히도 - HES 의 합성
4-포르밀벤조산 150 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 230 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Cliemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 10 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 204 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(실시예 14.2.3에 기재된 바와 같이 합성됨) 1 g을 첨가하였다. 22℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올 84 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 83 %였다.
실시예 14.2.5 실시예 14.1의 옥소- HES 로부터의 아미노- HES 의 합성
실시예 14.1의 옥소-HES(MW = 28 kD, DS = 0.41, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 5 g을 진공중 80℃에서 하룻밤 가열하고, 이어서, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 28 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 1.67 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 175 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 40 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 구하지 않았다.
실시예 14.2.6 실시예 14.2.5의 아미노- HES 로부터의 알데히도 - HES 의 합성
4-포르밀벤조산 130 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 153 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 36 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 110 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(실시예 14.2.5에 기재된 바와 같이 합성됨) 2.61g을 첨가하였다. 22℃에서 22.5시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 160 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올(v/v)의 빙냉 1:1 혼합물에 의해 세척하였다. 원심분리 후, 석출물을 물 30 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 1일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 81 %였다.
실시예 14.2.7 실시예 14.1의 옥소- HES 로부터의 아미노- HES 의 합성
실시예 14.1의 옥소-HES(MW = 30.8 kD, DS = 0.76, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 5 g을 진공중 80℃에서 하룻밤 가열하고, 이어서, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 28 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 1.67 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세 톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 175 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 40 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 구하지 않았다.
실시예 14.2.8 실시예 14.2.7의 아미노-HES로부터의 알데히도 -HES의 합성
4-포르밀벤조산 122 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 144 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 both Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 34 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 103 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(실시예 14.2.7에 기재된 바와 같이 합성됨) 2.46 g을 첨가하였다. 22℃에서 22.5시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 160 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v)로 세척하였다. 원심분리후, 석출물을 물 30 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 87 %였다.
실시예 14.2.9 실시예 14.1의 옥소-HES로부터의 아미노-HES의 합성
옥소-HES(MW = 42.1 kD, DS = 0.41, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 10 g을 진공중 80℃에서 2일간 가열하고, 이어서 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 53 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 2.01 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH + Co. KG사 제품) 350 ㎖를 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 80 ㎖로 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 76 %였다.
실시예 14.2.10 실시예 14.2.9의 아미노-HES로부터의 알데히도 -HES의 합성
4-포르밀벤조산 900 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 1053 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 30 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 930 ㎕ 에 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(실시예 14.2.9에 기재된 바와 같이 합성되고, N,N-디메틸포름아마이드 20 ㎖에 용해됨) 3 g을 첨가하였다. 22 ℃에서 22.5시간 진탕한 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 210 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v)로 세척하였다. 원심분리 후, 석출물을 물 30 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 97 %였다.
실시예 14.2.11 실시예 14.1(A)의 옥소- HES 로부터의 아미노- HES 의 합성
옥소-HES(MW = 56.8 kD, DS = 0.76, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 6.09g을 진공중 80℃에서 하룻밤 가열하고, 이어서 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 32 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 1.22 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 150 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 40 ㎖로 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 4일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 82 %였다.
실시예 14.2.12 실시예 14.2.11의 아미노-HES로부터의 알데히도 -HES의 합성
4-포르밀벤조산 125 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 174 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 38 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 155 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노-HES(실시예 14.2.11에 기재된 바와 같이 제조됨) 3.8 g을 첨가하였다. 22 ℃에서 19시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 160 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, N,N-디메틸포름아마이드 20 ㎖에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 80 ㎖에 의해 석출시켰다. 원심분리 후, 석출물을 물 50 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 77 %였다.
실시예 14.2.13 실시예 14.1(B)의 옥소- HES 로부터의 아미노- HES 의 합성
옥소-HES(MW = 56.8 kD, DS = 0.76, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 10 g을 진공 중에서 하룻밤 80℃에서 가열하고, 이어서, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 53 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄 2 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 17시간 교반 후, 반응 혼합물을 빙냉 2-프로판올(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH + Co. KG사 제품) 350 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 빙냉 2-프로판올 80 ㎖로 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 조제의 생성물을 물 80 ㎖에 재용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 85 %였다.
실시예 14.2.14 실시예 14.2.13의 아미노- HES 로부터의 알데히도 - HES 의 합성
4-포르밀벤조산 153 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 241 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 51 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 170 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, 아미노HES(실시예 14.2.13에 기재된 바와 같이 제조됨) 5.1 g을 첨가하였다. 22 ℃에서 16시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 360 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 50 ㎖에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 아 세톤과 에탄올의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 360 ㎖에 의해 석출시켰다. 원심분리후 석출물을 물 50 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 87 %였다.
실시예 14.2.15 실시예 14.1의 옥소- HES 로부터의 아미노- HES 의 합성
옥소-HES(MW = 29.3 kD, DS = 0.86, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 5.0 g을 진공중 80℃에서 하룻밤 가열하고, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 20 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 1.67 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 30.5시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH + Co. KG사 제품)과 에탄올(독일의 브라운쉬바이크시에 소재한 Sonnenberg, DAB사 제품)의 빙냉 1:1 혼합물 175 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 120분 동안 원심분리에 의해 회수하고, 물 40 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 10 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품)하고, 동결건조하였다. 분리된 생성물의 수율은 87 %였다.
실시예 14.2.16 실시예 14.2.15의 아미노- HES 로부터의 알데히도 - HES 의 합성
4-포르밀벤조산 150 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 230 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 10 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 166 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, DMF 20 ㎖ 중의 아미노HES(실시예 14.2.15에 기재된 바와 같이 제조됨) 3.02 g의 용액을 첨가하였다. 22℃에서 16시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH + Co. KG사 제품)과 에탄올(독일의 브라운쉬바이크시에 소재한 Sonnenberg, DAB사 제품)의 빙냉 1:1 혼합물(v/v) 215 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 20 ㎖에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 아세톤/에탄올로 석출시켰다. 원심분리후 석출물을 물 30 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2.5일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 3.5 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품)하고, 동결건조하였다. 분리된 생성물의 수율은 87 %였다.
실시예 14.2.17 실시예 14.1의 옥소-HES로부터의 아미노-HES의 합성
옥소-HES(MW = 97.9 kD, DS = 0.76, 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사 제품) 5.0 g을 하룻밤 진공중 80℃에서 가열하고, 질소하 건조 디메틸 설폭사이드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 20 ㎖에 용해시키고, 1,4-디아미노부탄(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 0.50 ㎖를 첨가하였다. 4O℃에서 30.5시간 교반 후, 반응 혼합물을 아세톤(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH + Co. KG사 제품)과 에탄올(독일의 브라운쉬바이크시에 소재한 Sonnenberg, DAB사 제품)의 빙냉 1:1(v/v) 혼합물 175 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 120분간 원심분리에 의해 회수하고, 물 40 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 10 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사 제품)하고, 동결건조하였다. 분리된 생성물의 수율은 90 %였다.
실시예 14.2.18 실시예 14.2.17의 아미노- HES 로부터의 알데히도 - HES 의 합성
4-포르밀벤조산 73 mg 및 1-하이드록시-lH-벤조트리아졸 112 mg(둘 다 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품)을 N,N-디메틸포름아마이드(펩타이드 합성 등급, 네덜란드의 발켄스바아드(Valkenswaard)에 소재한 Biosolve사 제품) 10 ㎖에 용해시키고, N,N'-디이소프로필카보디이미드(독일 타우프키르첸시에 소재한 Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 81.3 ㎕를 첨가하였다. 21 ℃에서 30분간 배양 후, DMF 20 ㎖ 중의 아미노HES(실시예 14.2.17에 기재된 바와 같이 제조됨) 3.09 g의 용액을 첨가하였다. 22℃에서 16시간 진탕후, 반응 혼합물을 아세톤(독일의 칼스루에시에 소재한 Carl Roth GmbH + Co. KG사 제품)과 에탄올(독일의 브라운쉬바이크시에 소재한 Sonnenberg, DAB사 제품)의 빙냉 1:1 혼합물 215 ㎖에 첨가하였다. 석출된 생성물을 4℃에서 원심분리에 의해 회수하고, 물 20 ㎖에 재용해시키고, 전술한 바와 같이 아세톤/에탄올로 석출시켰다. 원심분리후 석출물을 물 30 ㎖에 용해시키고, 물에 대해서 2.5일간 투석하고(SnakeSkin 투석 튜빙, 10 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 분리된 생성물의 수율은 96 %였다.
실시예 14.3 환원성 아민화를 통한 IFN -알파 컨쥬게이트의 합성
실시예 14.3.1 20 ㎍ 규모에서의 IFN -알파의 컨쥬게이션
150 mM NaCl 및 0.3 mM EDTA를 함유하는 25 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.5) 0.375 ㎖ 중에 용해된 IFN-알파 0.675 mg에, 반응 버퍼(0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0)) 4 ㎖를 첨가하고, 이 용액을 Vivaspin 6 농축기(독일 하노버시에 소재한 Viva Science사 제품, 5 kD MWCO)에서 3939 × g에서 30분간 원심분리하였다. 잔류 용액을 반응버퍼에 의해 6 ㎖로 희석하고 전술한 바와 같이 원심분리를 행함으로써 세정 절차를 2회 반복하였다. 최종 IFN-알파 용액의 체적은, 2.86 mg/㎖ IFN-알파의 계산된 최종 농도에 대응하는 0.236 ㎖였다. 단백질 농도는 실험적으로 체크하지 않았다.
전술한 바와 같이 제조되어 0℃로 냉각된 IFN-알파 용액 7 ㎕에, 둘 모두 동일한 버퍼 중 0℃로 냉각된 각각의 알데히도-HES(이하의 표 참조) 용액 10 ㎕(50 당량) 및 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 11.3 ㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 17시간 배양하였다. 반응 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 분석하였 다. 이하의 농도의 알데히도-HES 용액을 이용하였다:
실시예 14.3.1의 표
Figure 112006072272527-PCT00115
컨쥬게이트의 SDS-PAGE 분석은 도 29에 표시되어 있다.
실시예 14.3.2 3 mg 규모에서의 IFN -알파에 대한 컨쥬게이션
25 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.5)에 용해되고, 150 mM NaCl 및 0.3 mM EDTA를 함유하는 IFN-알파 20 ㎎에, 반응 버퍼(0.1 M 아세트산 나트륨, 버퍼 pH 5.0) 8 ㎖를 첨가하고, 이 용액을 Vivaspin 6 농축기(독일 하노버시에 소재한 Viva Science사 제품, 5 kD MWCO)에서 3939 × g에서 99분간 원심분리하였다. 잔류 용액을 반 응버퍼에 의해 18 ㎖로 희석하고 전술한 바와 같이 원심분리를 행함으로써 세정 절차를 2회 반복하였다. 최종 IFN-알파 용액의 체적은, 3 mg/㎖ IFN-알파의 계산된 최종 농도에 대응하는 6.66 ㎖였다. 단백질 농도는 실험적으로 체크하지 않았다.
전술한 바와 같이 제조되어 0℃로 냉각된 IFN-알파 용액 1 ㎖에, 둘 모두 동일한 버퍼 중 0℃로 냉각된 알데히도-HES 1 ㎖(75 당량) 및 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 1 ㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 22시간 배양하였다. 반응 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 엔트리 G에 기재된 반응에 대해서, 대응하는 용액의 0.666 ㎕만이 이용되었다. 이하의 농도의 알데히도-HES 용액을 이용하였다:
실시예 14.3.2의 표
Figure 112006072272527-PCT00116
컨쥬게이트의 SDS-PAGE 분석은 도 30에 표시되어 있다.
실시예 14.3.3 3 mg 규모에서의 IFN -알파에 대한 컨쥬게이션
14.3.3.1 실시예 14.2.16에서 제조된 알데히도 HES의 환원성 아민화에 의한 IFNα에 대한 컨쥬게이션
25 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.5)에 용해되고, 150 mM NaCl 및 0.3 mM EDTA를 함유하는 IFN-α 10 ㎎에, 반응 버퍼(0.1 M 아세트산 나트륨, 버퍼 pH 5.0) 8 ㎖를 첨가하고, 이 용액을 Vivaspin 15R 농축기(독일 하노버시에 소재한 Viva Science사 제품, 5 kD MWCO)에서 3939 × g에서 30분간 원심분리하였다. 잔류 용액을 반응버퍼에 의해 18 ㎖로 희석하고 전술한 바와 같이 원심분리를 행함으로써 세정 절차를 2회 반복하였다. 최종 IFN-알파 용액의 체적은, 3 mg/㎖ IFN-알파의 계산된 최종 농도에 대응하는 3.33 ㎖였다. 단백질 농도는 실험적으로 체크하지 않았다.
전술한 바와 같이 제조되어 0℃로 냉각된 IFN-α 용액 1 ㎖에, 둘 모두 동일한 버퍼 중 0℃로 냉각된 알데히도HES 1 ㎖(75 당량, 352 mg/㎖) 및 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 1 ㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 22시간 배양하였다. 반응 혼합물은 겔 전기영동에 의한 분석 후에 정제하였다. 겔 전기 영동을 위해서, XCeIl Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E 143 전원(CONSORTnv, Turnhout, B)을 이용하였다. 환원 조건에서 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께 12 % Bis-Tris 겔(둘 모두 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품)을 제조사의 지시에 따라 이용하였다.
14.3.3.2 실시예 14.3.18에 기재된 바와 같이 제조된 알데히도HES 의 환원성 아민화에 의한 IFN α에 대한 컨쥬게이션
14.3.3.1에 기재된 바와 같이 제조되고 0℃까지 냉각된 IFN α 용액 1 ㎖에, 둘 모두 동일한 버퍼 중 0℃로 냉각된 실시예 14.3.18에서 제조된 바와 같은 알데히드HES 용액 2㎖(75 당량, 369 ㎎/㎖) 및 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 1.5 ㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 22시간 배양하였다. 반응 혼합물은 겔 전기영동에 의한 분석 후에 정제하였다. 겔 전기 영동을 위해서, XCeIl Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E 143 전원(CONSORTnv, Turnhout, B)을 이용하였다. 환원 조건에서 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께 12 % Bis-Tris 겔(둘 모두 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품)을 제조사의 지시에 따라 이용하였다.
14.3.3.3 반응 대조군: 환원성 아민화에 의한 HES10 /0.4(Mw 7.6 kD DS = 0.41)의 IFN α에 대한 컨쥬게이션
14.3.3.1에 기재된 바와 같이 제조되어 0℃까지 냉각된 IFN α 용액 1 ㎖에, 둘 모두 동일한 버퍼 중 0℃로 냉각된 HES10/0.4 용액 1 ㎖(75 당량, 117 mg/㎖) 및 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 1 ㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 22시간 배양하였다. 반응 혼합물은 겔 전기영동에 의한 분석 후에 정제하였다. 겔 전기 영동을 위해서, XCeIl Sure Lock Mini Cell(독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품) 및 Consort E 143 전원(CONSORTnv, Turnhout, B)을 이용하였다. 환원 조건에서 MOPS SDS 러닝 버퍼와 함께 12 % Bis-Tris 겔(둘 모 두 독일의 칼스루에시에 소재한 Invitrogen GmbH사 제품)을 제조사의 지시에 따라 이용하였다.
컨쥬게이트의 SDS-PAGE 분석결과는 도 31에 표시되어 있다.
실시예 14.3.4 16 mg 규모에서의 IFN -알파에 대한 컨쥬게이션
20 mg IFN-알파 용액의 버퍼는 실시예 14.3.2에 기재된 바와 같이 교환하였다. 최종의 IFN-알파 용액은 반응 버퍼에 의해 6.37 ㎖로 희석하여, 최종의 계산된 농도 3.14 mg/㎖ IFN-알파를 부여하였다. 이 용액 100 ㎕를 반응 버퍼 900 ㎕에 의해 희석하고, 단백질 농도는 분광측정법에 의해 279nm에서 구한 바, 몰소광계수 18000에 의거해서 3.01 mg/㎖였다. 단백질 농도 결정에 사용된 제료의 배합후, 최종 체적은 7.0 ㎖였고, 단백질 농도는 2.74 mg/ ㎖였다.
전술한 바와 같이 제조되어 0℃까지 냉각된 이 IFN-알파 용액 5.91 ㎖에, 반응 버퍼(아세트산 나트륨, pH 5.0) 5 ㎖중 0℃로 냉각된 실시예 14.2.14의 HES10/0.4의 3.152 g의 용액(75 당량) 및 동일한 버퍼(아세트산 나트륨, pH 5.0) 중 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 6 ㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 22시간 배양하였다(도 32, 라인 A 참조).
반응 대조군으로서, 미리 저류시킨 IFN-알파 용액(3 mg) 1.09 ㎖를, 둘 모두 동일한 반응 버퍼 중 0℃로 냉각된 비산화된 HES(Mw 7.6 kD, DS = 0.41) 122 mg 및 60 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액 1 ㎖와 혼합하였다(도 32, 라인 B 참조).
컨쥬게이트의 SDS-PAGE 분석결과는 도 32에 표시되어 있다.
실시예 14.4 IFN -알파- HES 컨쥬게이트의 정제
14.4.1 활성화 HES 유도체와 환원성 아민화된 단백질의 배양으로부터의 HES-IFN-α의 정제( HES -유도체로부터의 변성 및 비변성 단백질의 분리)
모든 샘플의 정제는 AKTA 익스플로러 10 장비를 이용해서 실온에서 행하였다. Q-세파로스 패스트 플로 3 ㎖를 함유하는 컬럼을 버퍼 A(20 mM Tris/HCl, pH 8.0) 10 CV에 의해 평형화하였다. 샘플은 버퍼 A에 의해 1:10으로 희석하고 샘플 펌프를 이용해서 유량 1 ㎖/min에서 적용하였다. 버퍼 A 10 ㎖에 의해 샘플 펌프를 세척하고 나서, 컬럼을 버퍼 A 6 CV에 의해 유량 1.0 ㎖/min에서 더욱 세척하였다. 버퍼 B(20 mM Tris/HCl 중 0.3 M NaCl, pH 8.0) 2 CV에 걸쳐서 0 내지 100%의 선형 구배를 이용하고, 또한, 버퍼 B 0.5 CV, 유량 0.8 ㎖/min에서의 아이소크래틱 런에 의해 용출을 행하였다. 컬럼은 버퍼 C(20 mM Tris/HCl 중 1.5 M NaCl, pH 8.0) 2 CV를 이용하고 나서 버퍼 B 0.5 CV를 이용해서 유량 0.8 ㎖/min에서 재생하였다. 다음 런의 재평형화는 버퍼 A 6 CV를 이용해서 유량 1.0 ㎖/min에서 수행하였다.
14.4.2 재료 및 방법
장비: AKTA 익스플로러 10(Amersham Pharmacia Biotech),
펌프 P-903
믹서 M-925(0.6 ㎖ 챔버를 지님)
모니터 UV-900(10 mm 플로우 셀을 지님)
모니터 pH/C-900
펌프 P-950(샘플 펌프)
소프트웨어 유니콘 버전 3.21
컬럼: Amersham Biosciences사 제품 C 10/10
컬럼 재료: Q-세파로스 패스트 플로, 코드 번호 17-0510-01, 로트 번호 OD 06453
컬럼 체적: 3 ㎖
버퍼 A: 20 mM Tris/HCl, pH 8.0, Lot-Nr. PL0746
버퍼 B: 20 mM Tris/HCl 중 0.3 MNaCl, pH 8.0, Lot-Nr. PL0747
버퍼 C: 20 mM Tris/HCl 중 1.5 M NaCl, pH 8.0, Lot-Nr. PL0748
방법
체적 단계 버퍼 유량
1 CV 평형화 100% 버퍼 A l.O ㎖/min
5-28 ㎖ 장전 샘플 버퍼 A중 샘플 1 :10 l.O ㎖/min
10 ㎖ 세척 샘플 펌프 100% 버퍼 A l.O ㎖/min
5 CV 비결합샘플 세척제거 100% 버퍼 A l.O ㎖/min
개시 분획화 100% 버퍼 A l.O ㎖/min
6 CV 용출, 선형구배 0-100% 버퍼 B 0.8 ㎖/min
2 CV 용출, 아이소크래틱 100 % 버퍼 B 0.8 ㎖/min
2 CV 재생 100% 버퍼 C 0.8 ㎖/min
0.5 CV 재생 100% 버퍼 B 0.8 ㎖/min
분획화 정지 100% 버퍼 B 0.8 ㎖/min
5 CV 재평형화 100% 버퍼 A l.O ㎖/min
검출: 280 nm, 260 ㎚, 220 nm
pH
전도도
분획화: 1 ㎖ 분획
14.4.3 결과
14.4.3.1 실시예 14에 따른 샘플
샘플 조성: 25 mM Na-포스페이트, 0.13 M NaCl 및 0.3 mM EDTA 중 1 ㎎ EP2001(rhIFN-a2b), pH 7.5 ± 0.2
출발 체적: 0.5 ㎖, 버퍼 A = 5 ㎖ 중 1:10 희석
플로-쓰루(flow-through)/워시 9.3 ㎖
런 일자: 2004-09-29
런 번호: QS24 D39(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.3.2 실시예 14.3.2에 따른 샘플(엔트리 A)
샘플 조성: 0.1 M Na-아세테이트, 20 mM Na-시아노보로하이드라이드 중 2.5 mg EP2001 + 97.5 mg 알데히도HES10/0.4(NZA256), pH 5.0
개시 체적: 2.5 ㎖, 버퍼 A = 25 ㎖ 중 희석 1:10
플로-쓰루/워시: 44 ㎖
런 일자: 2004-09-29
런 번호: QS25 D56(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.3.3 실시예 14.3.2에 따른 샘플(엔트리 B)
샘플 조성: 0.1 M Na-아세테이트, 20 mM Na-시아노보로하이드라이드 중 2.5 mg EP2001 + 97.5 mg 알데히도HES 10/0.7(NZA235A), pH 5.0
개시 체적: 2.5 ㎖, 버퍼 A = 25 ㎖ 중 희석 1 :10
플로-쓰루/워시: 41 ㎖
런 일자: 2004-09-30
런 번호: QS26 D57(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.3.4 실시예 14.3.2에 따른 샘플(엔트리 C)
샘플 조성: 0.1 M Na-아세테이트, 20 mM Na-시아노보로하이드라이드 중 2.5 mg EP2001 + 292 mg 알데히도HES30/0.4(NZA328), pH 5.0
개시 체적: 2.5 ㎖, 버퍼 A = 25 ㎖중 희석 1 : 10
플로-쓰루/워시: 42 ㎖
런 일자: 2004-09-30
런 번호: QS27 D58(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.3.5 실시예 14.3.2에 따른 샘플(엔트리 D)
샘플 조성: 0.1 M Na-아세테이트, 20 mM Na-시아노보로하이드라이드 중 2.5 mg EP2001 + 292 mg 알데히도HES30/0.7(NZA329), pH 5.0
개시 체적: 2.5 ㎖, 버퍼 A = 25 ㎖ 중 희석 1 : 10
플로-쓰루/워시: 40 ㎖
런 일자: 2004-09-30
런 번호: QS28 D59(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.3.6 실시예 14.3.2에 따른 샘플(엔트리 E)
샘플 조성: 0.1 M Na-아세테이트, 20 mM Na-시아노보로하이드라이드 중 2.5 mg EP2001 + 487 mg 알데히도HES50/0.4(NZA303), pH 5.0
개시 체적: 2.7 ㎖, 버퍼 A = 27 ㎖ 중 희석 1 : 10
플로-쓰루/워시: 50 ㎖
런 일자: 2004-09-30
런 번호 : QS29 D60(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.3.7 실시예 14.3.2에 따른 샘플(엔트리 F)
샘플 조성: 0.1 M Na-아세테이트, 20 mM Na-시아노보로하이드라이드 2.5 mg 중 EP2001 + 487 mg 알데히도HES50/0.7(NZA309), pH 5.0
개시 체적: 2.6 ㎖, 버퍼 A = 26 ㎖ 중 희석 1 : 10
플로-쓰루/워시: 50 ㎖
런 일자: 2004-09-30
런 번호: QS30 D61(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.3.8 실시예 14.3.2에 따른 샘플(엔트리 G)
샘플 조성: 0.1 M Na-아세테이트, 20 mM Na-시아노보로하이드라이드 중 1.7 mg EP2001 + 98 mg HES10/0.4(Supramol Lot. 407B), pH 5.0
개시 체적: 2.5 ㎖, 버퍼 A = 25 ㎖ 중 희석 1 : 10
플로-쓰루/워시: 42 ㎖
런 일자: 2004-10-01
런 번호: QS31 D62(실시예 14.4.4.1에 대한 표 참조)
14.4.4 결과의 비교
14.4.4.1 IFN -알파 용출 피크의 SDS - PAGE 분석
실시예 14.4.4.1에 대한 표: HES화 IFN-α의 Q-세파로스 크로마토그래피 동안 280 nm에서 검출된 피크 면적의 비교
런 번호 비변성 IFN-α의 산출된 적용량 용리액 면적(280 nm) [mAU × ㎖] 용리액 면적(280 nm)/비변성 단백질 [mAU × ㎖ × mg-1] 계산된 수율 총 단백질[㎎](280nm*에서의 HPLC-정량)
QS-24 D39 1.0 ㎎ 961 961 0.42
QS-25 D56 2.5 ㎎ 4370 1748 1.20
QS-26 D57 2.5 ㎎ 5669 2268 1.64
QS-27 D58 2.5 ㎎ 3350 1340 1.60
QS-28 D59 2.5 ㎎ 2854 1142 1.54
QS-29 D60 2.5 ㎎ 2255 902 1.52
QS-30 D61 2.5 ㎎ 9278 3711 3.44
QS-31 D62 1.7 ㎎ 1918 1128 1.40
* RP-HPLC-3으로부터 유래된 정량적 분석 데이터
실시예 15 IFN 알파 항바이러스 활성 생물학적 에세이의 설명
시험 절차의 설명: 인터페론-알파의 항바이러스 활성
세포 배지에서의 시험 항목을 미리 희석한 후, 연속적으로 2배 희석액을 준비하였다. 96 웰 마이크로티터 플레이트에 있어서, 희석된 인터페론을 새로이 트립신화된 MDBK 세포에 -희석액 당 4배 반복으로- 첨가하였다(웰당 40.000개의 세포). 에세이는 37 ℃에서 24시간 배양하였다(웰당 총 체적: 150 ㎕(실시예 15.1) 또는 175 ㎕(실시예 15.2, 15.3, 15.4, 15.5, 16.2, 16.3)).
이어서, 희석된 VSV 원액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여(양성 대조군 웰 제외) 감염 다중도 0.1로 하였다.
각 에세이에는 이하의 대조군이 포함되었다: 인터페론 대신에 바이러스 + 세포배지를 입수한 12개의 웰(음성 대조군) 및 인터페론 및 바이러스 대신에 세포 배지를 입수한 12개의 웰(양성 대조군).
에세이를 37℃에서 42시간 배양하였다.
배양기간의 말기에, 각 웰의 세포 배양 상청액을 MTT(세포 배지내 적어도 2 mg/㎖)의 용액 50 ㎕로 대체하였다. 세포를 3시간 배양하였다. 각 웰에 이소프로판올/HCl(40 mM HCl을 지닌 이소프로판올)의 100 ㎕ 용액을 첨가함으로써 증식 세포에 의해 형성된 보라색 포르마잔 염료를 가용화하였다. 이어서, 용액의 흡광도 수치를 마이크로티터 플레이트 리더에 의해 570/630 nm에서 측정하였다.
인터페론 및 VSV의 존재하에 증식된 MDBK 세포의 증식 활성을 다음과 같이 인터페론의 각 희석액에 대해 산출하였다:
[(4개의 인터페론 처리된 웰의 평균 흡광도)-(음성 대조군의 평균 흡광도)] * 100/[(양성 대조군의 평균 흡광도)-(음성 대조군의 평균 흡광도)]
인터페론-알파의 항바이러스 활성을 각 시험 항목에 대해 4개의 별도의 에세이에 있어서 구하였다.
실시예 15.1 NIH 표준에 대한 인트론 ® A의 항바이러스 활성
모든 실험에 있어서, NIH-표준 rhIFN-알파 2a(NIAID, NIH, Bethesda, USA, GxaOl-901-535)에 대해서 검정을 행한 인트론® A(IFN-알파 2b, Schering-Plough)를 내부 실험실 기준으로서 사용하였다. NIH-표준의 비활성도는 9,000 IU/㎖였다. 내부 실험실 기준인 인트론® A는 실시예 15에 기재된 바와 같은 시험에 있어서 비활성도가 8,487,000 IU/㎖였다.
NIH 표준 rhIFN-알파 2a에 대한 인트론®의 증식 활성은 도 33에 표시되어 있다.
실시예 15.2 비변성 출발물질에 대한 모의 배양된 IFN -α-HES의 항바이러스 활성
실시예 14.3.4에 기재된 바와 같이, 모의 배양된 IFN-알파-HES(실시예 14.3.2에 기재됨, 엔트리 G)를 반응 대조군으로서 사용하였다. 재료의 항바이러스 활성을 비변성 출발물질의 것과 비교해서 대 생물 활성에 대한 커플링의 영향 및 정제 프로세스를 연구하였다. 모의 배양은 IFN-알파의 시험관내 생체 활성에 영향을 미치지 않았다.
비변성 IFN-알파 출발 물질과 비교한 모의 배양된 IFN-알파-HES의 시험관내 상대 활성은 도 34에 표시되어 있다.
실시예 15.3 인트론 ® A에 대한 IFN -알파- HES 컨쥬게이트의 항바이러스 활성
실시예 15에 기재된 에세이 시스템에 있어서, 컨쥬게이트(실시예 14.4에 따라 정제된 실시예 14.3.2로부터의 엔트리 A, B, C, D, E)를 비변성 IFN-알파 출발물질인 인트론® A 및 페가시스®(Roche사 제품)와 비교해서 시험하였다. 재료의 CPE50 농도를 계산하였다. 모든 IFN-알파-HES 컨쥬게이트는 실제로 페가시스®보다 높은 항바이러스 활성을 유지하였다.
비변성 IFN-알파 출발물질인 인트론® A 및 페가시스®와 비교한 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 시험관내 상대 활성은 도 35에 표시되어 있다.
실시예 15.4 인트론 ® A에 대한 IFN -알파- HES 컨쥬게이트의 항바이러스 활성
실시예 15에 기재된 에세이 시스템에 있어서, 실시예 14.4에 따라 정제한 실시예 14.3.4의 IFN-알파-HES 컨쥬게이트를 인트론® A와 비교해서 시험하였다. 재료의 CPE50 농도를 계산하였다. IFN-알파-HES 컨쥬게이트는 인트론® A에 비해서 대략 25% 높은 항바이러스 활성을 유지하였다.
인트론® A와 비교한 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 시험관내 상대 활성은 도 36에 표시되어 있다.
실시예 15.5 인트론 ® A와 비교한 IFN -알파- HES 컨쥬게이트의 항바이러스 활 성
실시예 15에 기재된 에세이 시스템에 있어서, 실시예 14.4에 따라 정제한 실시예 14.3.3의 IFN-알파-HES 컨쥬게이트를 인트론® A 및 페그인트론(Peglntron)®과 비교해서 시험하였다. 재료의 CPE50 농도를 계산하였다. IFN-알파-HES 컨쥬게이트는 인트론® A에 비해서 대략 25% 높은 항바이러스 활성을 유지하였고, 이것은 페그인트론®의 시험관내 활성과 동일한 수준이다.
인트론® A와 비교한 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 시험관내 상대 활성은 도 37에 표시되어 있다.
실시예 16 IFN -알파-HES 컨쥬게이트의 생체내 생활성 (마우스에서의 PK 연구)
실시예 16.1 실시예 9에 기재된 바와 같은 에세이 시스템에 대한 마우스 혈청의 영향
인터페론-알파의 희석액을 세포 배지(대조군) 및 마우스 혈청(1:40 희석 및 1:80 희석)에서 제조하였다. 에세이는 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다.
인터페론-알파의 항바이러스 활성은 대조군, 1:40 희석된 마우스 혈청뿐만 아니라 1:80 희석된 마우스 혈청에 대해 2개의 별개의 에세이로 구하였다. 그 결 과는 1:40 희석 및 1:80 희석에서의 마우스 혈청이 인터페론-알파의 항바이러스 활성에 대한 생물학적 에세이에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
실시예 16.2 마우스에서의 생체내 연구(I)
혼주 혈청의 항바이러스 활성을 항바이러스성 에세이에서 시험하였다. 혈청은 IFN-알파 또는 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 30㎍/kg(단백질 함량을 기준으로 함)의 정맥내 주사후 2시간, 4시간, 12시간 및 24시간에 희생한 각 시각에서의 2마리의 마우스(8주령의 암컷 BALB/c 마우스)로부터 회수하였다.
혈청 샘플을 해동하고 소용돌이 교반에 의해 철저히 균질화(및 희석)하였다. 연속한 2배의 희석액을 세포배지에 준비하고, 인트론® A(희석됨)의 병을 해동하고 소용돌이 교반에 의해 철저히 균질화하였다. 연속한 2배 희석액을 세포배지에 준비하였다.
CPE-에세이에 있어서의 EC50-희석도를 실시예 15에 기재된 바와 같이 1:2 희석 연속물의 투여용량 응답 곡선으로부터 구하였다.
재료의 반감기는 비변성 출발물질 및 페가시스®와 비교해서 구하였다. 반감기는 EC50-희석액 대 주입후 시간의 반대수 플롯으로부터 산출하였다.
항바이러스 활성은 (i) IFN-알파-HES(실시예 14.3.2, 표의 엔트리 B),(ii) IFN-알파-HES(실시예 14.3.2, 표의 엔트리 D),(iii) IFN-알파-HES(실시예 14.3.4)에 대해서 24시간까지 검출하였다. 도 38로부터 알 수 있는 바와 같이, 반감기는 (i)(대략 3시간)에서 (ii)(대략 5시간)을 거쳐서 (iii)(대략 7시간)으로 증가하였 다.
비변성 IFN-알파에 대해서, 혈청의 항바이러스 활성은 너무 낮아 혈청 반감기를 산출할 수 없었다. K.R. Reddy 등의 Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586에 있어서, 래트(정맥 내)의 IFN-알파의 2시간의 혈청 반감기가 구해졌다.
실시예 16.3 마우스에서의 생체내 연구( II )
혼주 혈청의 항바이러스 활성을 항바이러스성 에세이에서 시험하였다. 혈청은 IFN-알파 또는 IFN-알파-HES 컨쥬게이트의 30 ㎍/kg(단백질 함량을 기준으로 함)의 정맥내 주사후 2시간, 4시간, 12시간 및 24시간에 희생한 각 시각에서의 2마리의 마우스(8주령의 암컷 BALB/c 마우스)로부터 회수하였다.
혈청 샘플을 해동하고 소용돌이 교반에 의해 철저히 균질화(및 희석)하였다. 연속한 2배의 희석액을 세포배지에 준비하고, 인트론® A(희석됨)의 병을 해동하고 소용돌이 교반에 의해 철저히 균질화하였다. 연속한 2배 희석액을 세포배지에 준비하였다.
CPE-에세이에 있어서의 EC50-희석도를 실시예 15에 기재된 바와 같이 1:2 희석 연속물의 투여용량 응답 곡선으로부터 구하였다.
재료의 반감기는 비변성 출발물질 및 페가시스®와 비교해서 구하였다. 반감기는 EC50-희석액 대 주입 후 시간의 반대수 플롯으로부터 산출하였다.
항바이러스 활성은 (i) 페그인트론®, (ii) IFN-알파-HES(실시예 14.3.3.1) 및 (iii) IFN-알파-HES(실시예 14.3.3.2)에 대해서 24시간까지 검출하였다. 도 39로부터 알 수 있는 바와 같이, 반감기는 (i) (대략 3.6시간) 내지 (ii) 및 (iii) (대략 6.5 및 6.8시간)으로 증가하였다.
실시예 17 IFN -알파-HES 컨쥬게이트의 생체내 생활성 ( 토끼에서의 PK 연구)
실시예 17.1 IFN -알파 및 IFN -알파- HES 컨쥬게이트의 방사성 표지화
PK 연구에 사용된 샘플을 클로르아민 T 방법에 따라 125I로 표지화하였다. 클로르아민 T는 요오드와 반응해서 할로겐화 종(I-Cl)이 형성되었다. 할로겐화는 티로신의 방향족 고리상에서 반응하여 그것을 o-위치에 치환한다.
실시예 17.2 참조 실험: 125 I에 의한 옥소- HES 50/0.4의 표지화
주어진 반응조건하의 첫번째 실험 시리즈에 있어서, 흔적량의 요오드는 예를 들면, HES와의 요오드, 폴리 요오드 또는 폴리요오드화물 형성용 복합체로 검출될 수 있는 지의 여부를 검사하였다. 비교를 위해, 옥소-HES(Mw 42.1 kD, DS = 0.41) 및 IFN-알파-HES(실시예 14.3.2, 표의 엔트리 E)를 동일한 조건하에서 표지화하고, 정제공정 후, 샘플의 방사능을 측정하였다. 문헌에 따르면, 아밀로펙틴은 나선형 구조가 적어도 11개의 무수글루코스 단위를 지닐 경우 요오드, 폴리요오 드 또는 폴리요오드화물과 복합체를 형성할 수 있다.
단지 IFN-알파-HES 샘플에서만, 방사능이 검출되었다. 이 결과는 방사능이 정제공정에서 제거되지 않은 잠재적으로 물리적으로 결합된 요오드에 의해서가 아니라 IFN-알파에서의 티로신 잔기의 공유 변성에 의해서 독점적으로 초래되는 것을 입증하였다. 옥소-HES 50/0.4(Mw 42.1 kD, DS = 0.41)는 음성 대조군으로서 간주될 수 있다. 이 옥소-HES 종에 있어서의 고분자량 및 낮은 치환도로 인해, 존재한다면 가장 긴 나선형 구조가 예상되고, 따라서, 이 경우 요오드의 복합화의 위험이 가장 높아지게 된다.
실시예 17.3 비방사성 요오드에 의한 인터페론-알파의 표지화("냉 요오드화 ")
인터페론 알파는 IFN-알파-HES-컨쥬게이트와 동일한 표지화 및 정제공정에 있어서 비방사성 요오드로 표지화되었다. 항바이러스성 에세이에 있어서, 항바이러스 활성이 유지되었다. 그러나, 표지화 및 정제 공정에 있어서 농도는 변화하였고 입수한 소량의 재료로 인해 결정될 수 없었기 때문에 정량화는 행하지 못했다.
실시예 17.4 IFN -알파- HES 컨쥬게이트의 방사성 표지화
샘플을 방사성 125I에 의해 실시예 17.1에 따라 표지화하였다. 샘플은 IFN-알파 출발물질인 IFN-알파-HES(실시예 14.3.2, 표의 엔트리 D)였다. 샘플의 비활 성도는 38 μCi/㎍(IFN-알파 출발물질), 41 μCi/㎍(IFN-알파-HES 30/0.7)였다.
실시예 17.5 토끼에서의 생체내 PK 연구
실시예 17.5.1 실험 절차
시험항목은 희석제로서 사용되었다. 4 μCi/㎖의 용액을 제조하였다. 희석 완충액은 PBS였다.
4마리의 뉴질랜드 화이트 래비트(토끼) HsdIf: NZW. 공급원 Harlan Winkelmann GmbH사, D-33178 Borchen, 성별: 암컷; 연구개시시의 체중: > 2.5 kg. 모든 동물은 방사성 표지화 시험물질이 체중 1 kg당 1 ㎖의 체적으로 정맥내로 적용되었고, 이 양은 체중 1kg당 4 μCi의 투여량에 상당한다. 혈액 샘플을 규정된 시점에서 채혈하였다. 각 샘플링 지점에서, 또 다른 연구를 위해서 동물의 귓바퀴 정맥으로부터 대략 600 ㎕를 채혈하였다.
혈액 샘플링을 위해, 정맥내 유치카테터(intravenous indwelling catheter)를 귓바퀴 정맥내로 일반의 마취(Ketamin/Rompun)하에 설치하였다. 마취는 적용전의 혈액 샘플링 시점 동안, 적용 자체 동안 그리고 적용 후 최초의 3회의 혈액 샘플링 동안(0.5시간, 1시간 및 2시간) 유지되었다. 카테터는 이들이 동물 자신들에 의해 움직이게 될 때까지 또 다른 샘플링 시점 동안 동물 속에 넣었다. 또한, 혈액 샘플링은 귓바퀴 정맥의 상이한 영역을 통해 삽관에 의해 결정되었다.
혈액 샘플의 또 다른 처리는 혈액 샘플링 후에 수행하였다. 혈액내의 방사성 표지된 시험 항목을 결정하기 위해, 회수된 혈액 샘플을 특정 가용화 프로토콜 에 따라 처리하였다. 이것을 위해서, 혈액 샘플 250 ㎕를 새로운 병에 옮기고 등체적의 Solvable™을 첨가하였다. 샘플을 진탕수조에서 50℃에서 1시간 배양하였다. 배양시간 후, 샘플을 실온까지 냉각하고, EDTA-용액[100 mM] 100 ㎕를 첨가하였다. 이어서, H2O2[30 %] 300 ㎕를 첨가하고, 재차 진탕후 샘플을 진탕수조에서 50℃에서 1시간 배양하였다. 더욱 처리후 샘플을 회수하였다.
혈액의 회수 및 가용화의 말기에, 샘플을 20 ㎖ 신틸레이션 병(scintillation vial)으로 옮기고, 신틸레이션 칵테일 Ultima Gold™ 10 ㎖를 첨가하였다. 신틸레이션-계수기에서 동위원소 125I가 측정될 때까지(칵테일 첨가후 72시간 정도), 샘플을 어두운 곳에서 2 내지 8℃에서 보관하였다.
데이터의 처리 및 통계학적 분석 전에 특정 실험 조건하에서의 활성 검출의 억제(quench)를 결정하였다. 회귀계수(r2 = 0.9970)는 라인에 대한 적합성의 척도이다. 억제 인자[pCi/cpm]는 3.315938인 것으로 판명되었다.
결과(도 40 참조):
IFN-알파-HES는 출발물질과 비교해서 명백한 반감기의 연장을 보였다. 24시간 이하(대략 < 1000 pCi/㎖)에서, 비변성 물질의 곡선은 평평하게 되어 거의 활성의 감소가 관찰되지 않았다. 모든 샘플에 대한 측정된 방사능의 작은 표준 편차는 실험의 품질을 증명한다.
반감기는 혈액 샘플에 있어서의 IFN-알파의 농도로부터 산출하였다. 도 41 에 도시된 평가를 위해서, 4시간과 24시간 사이에 채취한 혈액 샘플로부터의 데이터만을 고려하였다. 비변성 재료에 대해서, 7시간의 반감기가 산출되었다. IFN-알파-HES에 의하면, 반감기의 실질적인 증가가 관찰되었다(대략 33 시간).
데이터는 도 42 a 및 b(컷-아웃 0 내지 12 시간)에 있어서의 도면에 표시한 바와 같이 상이한 구획 모델에 따라 통계학적으로 평가되었다. 1-구획 모델에 있어서, IFN-알파의 농도는 주입후 첫번째 2시간 동안 급격히 떨어지는 것이 명백하다. IFN-알파-HES에 대해서는, 반감기는 명백히 연장되었다. 통계학적으로 산출된 반감기는 IFN-알파에 대해서 0.26 시간, IFN-알파-HES에 대해서 7.7 시간이다. 비구획 모델에 따르면, 통계학적 평가의 결과, 반감기는 비변성 IFN-알파에 대해서는 147시간(24 내지 120 시간의 데이터에 의거함), IFN-알파-HES에 대해서는 42.7 시간(36 내지 120 시간의 데이터에 의거함)이었다. 전술한 바와 같이, 비변성 IFN-알파의 반감기는 곡선이 24시간 이하에서 평평하였으므로, 실질적으로 연장되었다.
계산용의 전술한 모델에 의거해서, 두 샘플의 반감기를 하기 표에 요약하였다.
실시예 17.5.1의 표:
상이한 모델에 따라 산출된 IFN -알파 및 IFN -알파- HES 의 반감기
IFN-알파-HES 출발물질 t1 /2 IFN-알파-HES t1 /2
비구획모델 (147.0*) 42.7**
1구획 모델 0.26 7.7
반대수 플롯 (도 40 참조, 4 내지 24시간) 7 33
* 24 내지 120 시간 평가 데이터
** 36 내지 120 시간 평가 데이터
실시예 18.1 아미노 작용화된 하이드록시에틸 스타치의 합성
옥소-HES(Mw = 41,000 D, DS = 0.76)는 DE 196 28 705 Al에 따라 독일의 Rosbach-Rodheim에 소재한 Supramol Parenteral Colloids GmbH사에서 제조되었다.
건조 디메틸 설폭사이드(DMSO, 벨기에의 길(Geel)시에 소재한 Acros Organics BVBA사 제품) 2 ㎖ 중의 옥소-HES(19.15 μmol) 0.51 g의 용액에 질소하에 1,4-디아미노부탄(벨기에의 길(Geel)시에 소재한 Acros Organics BVBA사 제품) 200 ㎕(19.9 mmol)를 적하하고, 혼합물을 70℃에서 24시간 교반하였다. 반응 혼합물을 냉 아세톤(0 ℃) 20 ㎖에 첨가하였다. 얻어진 석출물을 여과에 의해 분리하고, 아세톤 40 ㎖로 세척하고, 물 20 ㎖에 재용해시켰다. 이 용액을 물에 대해서 1일간 투석하고(Snake-Skin 투석 튜빙, 4-6 kD 컷 오프, 독일의 본시에 소재한 Perbio Sciences Deutschland GmbH사), 동결건조시켰다. 아미노-HES의 수율은 80 %(0.41 g)였다.
생성물의 정제는 AKTA 익스플로러 시스템(Amersham Biosciences사 제품)을 이용해서 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(100 mm, Amersham Biosciences사 제품)에의 적용에 의해 달성하였다. 따라서, HiPrep 26/10 탈염 컬럼은 0.1 M NaCl 용액(10 ㎖/min)으로 평형화하고, 0.1 M NaCl 중의 아미노-HES(5 mg/㎖, 주입 체적 10 ㎖)를 적용하였다. 저류된 아미노-HES 분획을 물로 평형화된 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(주입 체적 10 ㎖)에 적용하였다. 저류된 HES 분획을 컬럼에 대해서 동일한 조건에서 재적용하였다. 순수한 생성물을 동결건조하고, 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBSA(Pierce사 제품), Instructions TNBSA 제품 번호 28997) 및 검정용의 Boc-Lys-OH에 의한 유도체화에 의해 아민 량을 구하였다. 아민량은 34.02 nmol/mg(92 %)인 것으로 판명되었다.
실시예 18.2 아이오도아세틸 작용화된 하이드록시에틸 스타치의 합성
0.1 M Na2CO3(pH = 8.3) 5 ㎖ 중의 아미노 작용화된 하이드록시에틸 스타치(실시예 18.1에서 제조된 바와 같은 아미노-HESμmol) 101.9 mg의 용액에 아이오도아세트산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(44.65 μmol, 독일 타우프키르첸시에 소재한 Sigma사 제품) 12.63 mg을 부여하였다. 이 혼합물을 질소하에 어두운 곳의 실온에서 15시간 교반하였다. 물 15 ㎖를 상기 수용액에 부여하고, 생성물의 정제는 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(Amersham Biosciences사 제품)에의 적용에 의해 달성하였다. 따라서, HiPrep 26/10 탈염 컬럼(100 mm)은 0.1 M NaCl 용액(10 ㎖/min)으로 평형화하고, 아이오도아세틸 작용화된 하이드록시에틸 스타치를 적용하였다(주입 체적 10 ㎖). 저류된 아이오도아세틸-HES 분획은 물로 평형화된 HiPrep 26/10 탈염 컬럼에 적용하고, 저류된 분획을 상기 컬럼에 대해 동일한 조건에서 재적용하였다. 순수한 생성물을 동결건조하고, 아이오도아세틸량은 전술한 바와 같은 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산에 의한 아민 정량화에 의해 간접적으로 구 하였다. 아민량은 아이오도아세틸 량 32.37 nmol/mg(95 %)에 대응하는 1.65 nmol/mg인 것으로 판명되었다.
실시예 18.3 실시예 18.1의 아미노HES로부터의 말레이미도 HES의 합성
계산된 아미노함량 ~ 29 nmolmg-1을 지닌 아미노 HES(실시예 18.1에 기재된 바와 같이 제조됨) 25 mg을 반응 버퍼(0.1 M 인산 나트륨, 150 mM NaCl, 5.0 M EDTA, pH 7.0) 450 ㎕에 용해시켰다. 별도로, N-[a-말레이미도아세톡실숙신이미드 에스테르(AMAS; 독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 9 mg을 건조 DMSO(벨기에의 길(Geel)시에 소재한 Acros Organics BVBA사 제품) 200 ㎕에 용해시켰다. 이어서, 상기 두 용액을 함께 합했다.
최종적인 용액을 22℃에서 100분간 교반하에 유지하고, 더욱 40℃에서 20분간 유지하였다. 이어서, 얻어진 용액을 5 ㎖까지 희석하고, 미반응 AMAS, NHS 및 DMSO를 제거하기 위하여 AKTA 익스플로러 시스템(Amersham Biosciences사 제품)을 이용해서 탈염 컬럼상에 적용하였다.
따라서, HiPrep 26/10 탈염 컬럼(100 mm, Amersham Biosciences사 제품)은 반응 버퍼(0.1 M 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, 5 mM EDTA, pH 7.0)에 의해 평형화시키고, 말레이미도-HES 용액을 주입하여(주입체적 5 ㎖) 분획화하였다. 정제 파라미터는 다음과 같이 선정하였다:
컬럼: HiPrep 26/10 탈염
유량: 10 ㎖ / min
용리액: 0.1 M 인산 나트륨 버퍼,
150 mM 염화 나트륨,
5 mM EDTA,
pH = 7.0
샘플 체적: 5.0 ㎖
용리액 분획화: 2.5 ㎖
평형화: 0.5 컬럼 체적
용출 길이 2.0 컬럼 체적
최종 용액 중의 AMAS, NHS 및 DMSO의 부재를 확인하기 위해 동일한 조건하에서 저류된 HES 분획(7 ㎖)의 재주입을 행하였다. 두번재 정제에 의해 알파1AT와 커플링할 준비가 된 순수한 말레이미도HES 10 ㎖를 수득하였다.
그 후 용출된 폴리머를 동일한 버퍼에서 최종 체적 250 ㎕로 농축하였다.
실시예 18.4a DL - 디티오트레이톨(DTT)에 의한 알파1AT 의 환원
알파1AT 용액(c(알파1AT) = 0.1 M 인산나트륨 버퍼, 150 mM 염화나트륨(pH 7.2) 0.5 ㎖중 5.0 ㎎, 미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품 알파1AT= rh 알파1AT, 로트 번호 080604A)의 용액에 반응 버퍼(0.1 M 인산 나트륨 버퍼, 150 mM 염화 나트륨, 5 mM EDTA, pH = 7.0) 4 ㎖ 및 DTT(독일 타우프키르첸시에 소재한 Sigma사 제품) 68.77 mg을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 배양하고, 환원된 단백질을 AKTA 익스플로러 시스템(Amersham Biosciences사 제품)을 이용한 크기배제크로마토그래피(SEC: size exclusion chromatography)에 의해 정제하였다. 따라서, HiPrep 26/10 탈염 컬럼(100 mm, Amersham Biosciences사 제품)을 0.1 M 인산 나트륨 버퍼, 150 mM 염화 나트륨, 5 mM EDTA(pH = 7.0) 용액으로 평형화시키고, 환원된 단백질 용액을 적용하고(주입 체적 4.5 ㎖), 분획화하였다. 정제 파라미터는 이하에 요약한 바와 같이 선정하였다:
컬럼: HiPrep 26/10 탈염
유량: lO ㎖ / min
용리액: 0.1 M 인산 나트륨 버퍼,
150 mM 염화 나트륨,
5 mM EDTA,
pH = 7.0
샘플 체적: 4.5 ㎖
용리액 분획화: 2.5 ㎖
평형화: 0.5 컬럼 체적
용출 길이: 2.0 컬럼 체적
단백질 용액 중의 DTT의 부재를 확인하기 위해 저류된 단백질 분획(8 ㎖)을 동일 조건에서 재주입하였다. 두번째 정제에 의해 대략 농도 0.5 mg/㎖를 지닌 순수 환원 α1AT 용액 10 ㎖를 얻었고, 실시예 18.5에 기재된 바와 같은 말레이미 도 HES와의 커플링에 이용하였다.
실시예 18.4b 트리스-(2-카복시에틸)-포스핀-하이드로클로라이드(TCEP)고정화된 α 1AT 의 전처리 및 티올 함유 단백질의 분리
잠재적인 디설파이드 결합을 환원시키기 위해, 고정화된 TCEP(Pierce 77712, 2 ㎖ 겔 슬러리 / mg 단백질)에 의해 알파1AT(미국 메사추세츠주 프레이밍햄시에 소재한 GTC Biotherapeutics Inc.사 제품, 로트 번호 080604A)를 새롭게 처리하였다. 고정화된 TCEP는 버퍼 pH= 7.0(100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨 및 5 mM EDTA5)를 이용해서 제품에 기재된 바와 같이 제조되었다. 제조사의 지시에 따라 환원을 수행하였다. 티올함유 단백질을 공유결합시키기 위해, 환원된 단백질을 티올-활성화 세파로스(Amersham Biosciences사 제품 71-7106-00; 0.15 g 겔/ mg 단백질)에 의해 배양하였다. 미결합 단백질을 단백질이 용출액에서 검출되지 않을 때까지 100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨 및 5 mM EDTA(pH = 7)를 함유하는 버퍼에 의해 세척하였다. 단백질 검출을 위해서, BCA-에세이를 이용하였다(Pierce사). 컬럼에 결합된 단백질을, 20 mM TCEP를 함유하는 버퍼(pH = 7.0)(100 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨 및 5 mM EDTA)를 이용해서 유리시키고 용출하였다.
실시예 18.5 실시예 18.3의 말레이미도HES 로부터 시스테인 커플링을 통한 HES-알파 1AT 컨쥬게이트의 제조
반응 버퍼(0.1 M 인산 나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.0) 250 ㎕에 용해된 말레이미도HES(실시예 18.3에 기재된 바와 같이 제조됨) 725 nmol을 동일 버퍼 중 0.5 mg㎖-1 알파1AT 용액 1540 ㎕에 첨가하였다. 단백질을 실시예 18.4a에 기재된 바와 같은 DTT에 의해 예비 배양하였다. 반응액을 22℃에서 18시간 교반하고, 질소하 동결함으로써 반응을 정지시키고, -80℃에서 보관하였다. 반응 혼합물을 겔 전기 영동에 의해 분석하였다(도 43 참조).
실시예 18.6 실시예 18.2의 아이오도아세트아마이도 HES로부터 시스테인 커플링을 통한 HES -α1 AT 컨쥬게이트의 제조
계산된 요오드 함량 ~ 16 nmolmg-1을 지닌 아이오도아세트아마이드HES(실시예 18.2에 기재된 바와 같이 제조됨) 96 mg을 반응 버퍼(1.0 M 탄산 나트륨, 2.0 mM EDTA, pH 8.3) 1.0 ㎖ 및 증류수 2.5 ㎖에 용해시켰다. 0.1 M 인산 나트륨 버퍼, 150 mM NaCl(pH 7.0) 중의 3 mg㎖-1 알파1AT(실시예 18.4b에 기재된 바와 같이 전처리됨)의 용액 500 ㎕를 폴리머 용액과 혼합하고, 최후로 TCEP(독일 타우프키르첸시에 소재한 Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH사 제품) 7.2 mg을 함유하는 용액 500 ㎕를 첨가하여 환원제의 최종 농도 5 mM을 얻었다. 빛을 배제한 상태에서 실온에서 18시간 교반하에 반응을 진행시켰다. 그 후, 액체 질소하에 반응을 정지시키고, -88℃에서 보관하였다.
실시예 18.7 실시예 18.2의 아이오도아세트아마이도HES 로부터 시스테인 커플링을 통해 제조된 HES - 알파1AT 의 정제
샘플 제조: 용리액으로서 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 염화 나트륨, pH 8을 이용해서 AKTA-익스플로러 크로마토그래피 시스템과 조합해서 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(Amersham biosciences사 제품) 상에서의 버퍼 교환.
버퍼 교환은 이하의 파라미터를 이용해서 조제의 반응 혼합물(실시예 18.6에 기재된 바와 같이 제조, 대략 4 ㎖)에 의해 수행하였다:
컬럼: HiPrep 26/10 탈염
유량: 10 ㎖ / min
용리액: 20 mM 인산 나트륨,
20 mM 염화 나트륨,
pH 8
샘플 체적: 10 ㎖
용리액 분획화: 2.5 ㎖
평형: 5 컬럼 체적
용출 길이: 2 컬럼 체적
6 내지 16 ㎖의 분획을 저류시켰다. 과잉의 HES-유도체는 이하의 파라미터를 이용해서 IEC에 의해 제거하였다:
컬럼: HiTrap Q HP 1 ㎖
유량: 1 ㎖ / min
결합 버퍼(BB): 20 mM 인산 나트륨,
20 mM 염화 나트륨,
pH 8
용출 버퍼(EB): 20 mM 인산 나트륨,
1 M 염화 나트륨,
pH 8
빈 루프: 12 ㎖
플로우 쓰루 분획화: 2 ㎖
용리액 분획화: 1 ㎖
개시 농도 EB : 0 %
평형화: 5 컬럼 체적
미결합 샘플의 세척제거: 15 ㎖
목적 농도 EB : 15 %
그래디언트의 길이: 50 ㎖
43 내지 73 ㎖의 분획을 회수해서 초원심분리에 의해 최종 체적 10㎖로 농축시켰다. 전술한 바와 같이 탈염후(샘플 체적 10 ㎖, 회수된 분획은 최초의 14 ㎖를 함유함), 미결합 단백질로부터 컨쥬게이트의 분리를 위한 제 2의 IEC를 이하의 파라미터를 이용해서 수행하였다:
컬럼: HiTrap Q HP 1 ㎖
유량: 1 ㎖ / min
결합 버퍼(BB): 20 mM 인산 나트륨,
20 mM 염화 나트륨,
pH 8
용출 버퍼(EB): 20 mM 인산 나트륨,
1 M 염화 나트륨,
pH 8
빈 루프: 15 ㎖
플로우 쓰루 분획화: 2 ㎖
용리액 분획화: 1 ㎖
개시 농도 EB: 0 %
평형화: 1 컬럼 체적
비결합 샘플의 세척제거: 2 ㎖
구배: 5-15 %
그래디언트의 길이: 100 ㎖
이하의 분획을 회수해서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 44 참조):
A: 26 - 32 ㎖
B: 37 - 45 ㎖
C: 55 - 65 ㎖

Claims (86)

  1. 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체의 적어도 하나의 작용기 A를 단백질의 적어도 하나의 작용기 Z와 반응시켜 공유결합을 형성하는 것을 포함하며, 여기에서 Z는 아미노기, 티올기, 알데하이드기 및 케토기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    - Z가 알데하이드기 또는 케토기인 경우에, A는 Z와 상기 결합을 형성하는 아미노기를 포함하고, 단백질은 IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    - Z가 아미노기일 경우에, A는 반응성 카복시기 및 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    -- A가 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기인 경우,
    --- 하나의 작용기는 폴리머와 반응시키고 적어도 하나의 다른 작용기는 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈이거나, 혹은 추가로 화학적으로 변성되어 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기를 제공하는 작용기인 적어도 이작용성 화합물과 상기 폴리머를 반응시킴으로써, 혹은
    --- 폴리머를 산화시켜 적어도 하나의, 특히 적어도 두 개의 알데하이드기를 얻음으로써,
    A를 상기 폴리머에 도입하여 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하거나, 또는,
    -- A가 반응성 카복시기인 경우,
    --- 폴리머를 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화시켜 생성된 카복시기를 활성시킴으로써, 혹은
    --- 폴리머를 그의 비-산화된 환원성 말단에서 탄산 디에스테르와 반응시킴으로써,
    A를 상기 폴리머에 도입하여 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하거나, 또는
    - Z가 티올기인 경우, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, tPA, A1AT, APC, 인자 VII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되고, A는 Z와 상기 결합을 형성하는 말레이미도기 또는 할로겐아세틸기를 포함하는 것인, 단백질과 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하는 컨쥬게이트를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 하이드록시알킬 스타치는 하이드록시에틸 스타치인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 하이드록시에틸 스타치의 분자량은 2 내지 200 kD, 바람직하게는 4 내지 130 kD, 더 바람직하게는 4 내지 70 kD인 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 알데하이드기 또는 케토기 이고, 단백질은 IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 알데하이드기 또는 케토기는 단백질의 탄수화물 측쇄 및/또는 단백질의 N-말단기에 위치된 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 단백질의 탄수화물 측쇄를 산화시키고/시키거나 단백질의 N-말단기를 산화시켜 알데하이드기 또는 케토기를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 산화 반응이 효소에 의해 또는 과옥소산을 사용하여, 각 경우에, 필요에 따라, 말단 시알산을 제거한 후에 수행되는 방법.
  8. 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, A를 포함하는 폴리머 유도체 및 Z를 포함하는 단백질을 반응시키기 전에, 폴리머를 그의 비산화된 환원성 말단에서, 상기 폴리머의 비-산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 작용기 및 A기를 포함하는 적어도 이작용성의 연결용 화합물과 반응시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 4항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, A는 아미노옥시기 또는 히드라 지도기인 방법.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 적어도 이작용성의 연결용 화합물은 동종 이작용성(homobifunctional) 화합물인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 동종 이작용성 화합물은 두 개의 아미노옥시기를 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 동종 이작용성 화합물은 O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]하이드록실 아민인 방법.
  13. 제 8항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머와 적어도 이작용성의 연결용 화합물과의 반응은 수성 매질 중에서 수행되는 방법.
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머와 적어도 이작용성의 연결용 화합물과의 반응은 옥심 결합 및/또는 옥시아미노 결합을 형성하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 아미노기이고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 폴리머를 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화시키고, 산화된 폴리머를 그의 산화된 환원성 말단에서 N,N'-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시켜 반응성 카복시기 A를 포함하는 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기를 탄산 디에스테르와 반응시켜 반응성 카복시기 A를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 탄산 디에스테르는 대칭성 디에스테르인 방법.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 에스테르의 알코올 성분은 N-하이드록시 숙신이미드, 설폰화 N-하이드록시 숙신이미드, N-하이드록시 벤조트리아졸, 및 니트로- 및 할로겐-치환된 페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 할로겐-치환된 페놀은 니트로페놀, 디니트로페놀, 트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀 및 펜타플루오로페놀로 이루어진군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 에스테르기 A를 제공하기 위해 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기와 탄산 디에스테르와의 반응은 무수 비양자성 극성 용매 중에서 수행되는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 용매는 디메틸 아세트아마이드, 디메틸 포름아마이드 또는 그의 혼합물인 방법.
  23. 제 15항에 있어서, A는 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기이고, 폴리머를 적어도 이작용성 화합물의 작용기 M과 반응시켜 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 적어도 이작용성 화합물은 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기 A인 적어도 하나의 다른 작용기 Q를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, M은 아미노기를 포함하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, A는 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기이고, 폴리머를 적어도 이작용성 화합물의 작용기 M과 반응시켜 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 적어도 이작용성 화합물은 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기가 아닌 적어도 하나의 다른 작용기 Q를 추가로 포함하고, 작용기 Q를 적어도 하나의 적절한 화합물과 반응시켜 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기 A를 포함하는 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, M 및 Q는 아미노기를 포함하는 방법.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 적어도 하나의 적절한 화합물은 카복시기 및 알데하이드기, 케토기 또는 헤미아세탈기를 포함하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 적어도 하나의 적절한 화합물은 포르밀벤조산 또는 4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)부틸산인 방법.
  29. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, M은 아미노기를 포함하고, Q는 베타 하이드록시 아미노기를 포함하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 폴리머를 그의 산화된 환원성 말단에서 적어도 이작용성 화합물의 작용기 M과 반응시키는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 베타 하이드록시아미노기를 산화시켜 알데하이드기를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 산화 반응은 과옥소산을 사용하여 수행되는 방법.
  33. 제 15항에 있어서, 폴리머를 과옥소산을 사용하여 개환 산화 반응시켜 적어도 하나의, 특히 적어도 두 개의 알데하이드기 A를 갖는 폴리머 유도체를 제공하는 방법.
  34. 제 23항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머 또는 폴리머 유도체와 단백질과의 반응은 환원성 아민화인 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 환원성 아민화는 NaCNBH3의 존재 하에 수행되는 방법.
  36. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 환원성 아민화는 pH 7 이하에서 수행되는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, pH는 6 이하인 방법.
  38. 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화는 0 내지 25 ℃의 온도에서 수행되는 방법.
  39. 제 34항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화는 수성 매질 중에서 수행되는 방법.
  40. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 티올기이고, 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, tPA, A1AT, APC, 인자 VII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, A는 할로겐아세틸기를 포함하고, 폴리머를 그의 임의적으로 산화된 환원성 말단에서 각각 아미노기를 포함하는 적어도 두 개의 작용기를 갖는 적어도 이작용성 화합물과 반응시켜 아미노기를 포함하는 적어도 하나의 작용기를 가진 폴리머 유도체를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 폴리머 유도체를 모노할로겐-치환된 아세트산 및/또는 반응성 모노할로겐-치환된 아세트산 유도체와 반응시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 할로겐은 Br 또는 I인 방법.
  43. 제 41항 또는 제 42항에 있어서, 적어도 이작용성 화합물은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 디아미노알칸인 방법.
  44. 제 41항 또는 제 42항에 있어서, 적어도 이작용성 화합물은 1 내지 5개의 알킬렌 단위를 갖는 디아미노폴리에틸렌글리콜인 방법.
  45. 제 41항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머를 그의 산화된 환원 성 말단에서 적어도 이작용성 화합물과 반응시키는 방법.
  46. 제 41항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 할로겐아세틸기를 포함하는 폴리머 유도체를 디메틸 포름아마이드와 물의 혼합물을 포함하는 용매의 존재 하에 단백질과 반응시키는 방법.
  47. 제 40항에 있어서, A는 말레이미도기를 포함하고, 폴리머를 그의 임의로 산화된 환원성 말단에서, 임의로 산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는 작용기 U를 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응시키는 것을 추가로 포함하며, 상기 적어도 이작용성 화합물은 화학적으로 변성되어 말레이미도기를 제공할 수 있는 작용기 W를 추가로 포함하고, 작용기 W를 화학적으로 변성하여 말레이미도기를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서, U는 아미노기를 포함하는 방법.
  49. 제 47항 또는 제 48항에 있어서, W는 아미노기를 포함하는 방법.
  50. 제 47항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, W를 포함하는 폴리머 유도체를 W와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고 또 말레이미도기를 추가로 포함하는 적어도 이작용성 화합물과 반응시키는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 적어도 이작용성 화합물은 N-(알파-말레이미도아세톡시)숙신이미드 에스테르인 방법.
  52. 제 1항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 컨쥬게이트.
  53. 제 52항에 있어서, A는 반응성 카복시기이고; A는 폴리머의 적어도 하나의 하이드록시기를 탄산 디에스테르와 반응시켜, 환원성 말단이 산화되지 않은 폴리머에 도입되며; 컨쥬게이트는 하나의 폴리머 분자 및 아마이드 결합을 통하여 폴리머에 결합된 적어도 하나의, 특히 1 내지 10개의 단백질 분자를 포함하고; 단백질은 IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  54. IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00117
    및/또는
    Figure 112006072272527-PCT00118
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
    G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 0이며,
    L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 임의로 적절히 치환된 직쇄형, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기, 바람직하게는 2 내지 60개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬 잔기이다.
  55. 제 54항에 있어서, -L-은 -(CH2)n-이고, 여기에서, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 더 바람직하게는 2, 3, 4, 특히 바람직하게는 4인 컨쥬게이트.
  56. IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00119
    및/또는
    Figure 112006072272527-PCT00120
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴 기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
    G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 0이다.
  57. IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00121
    및/또는
    Figure 112006072272527-PCT00122
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드 록시에틸기이고,
    L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 임의로 적절히 치환된 직쇄형, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기, 바람직하게는 2 내지 60개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬 잔기이다.
  58. 제 57항에 있어서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-인 컨쥬게이트:
    상기 식 중,
    Ra, Rb, Rc 및 Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고;
    G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 0이며;
    m은 1, 2, 3 또는 4이며, 여기에서, m개의 CRaRb기에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고;
    n은 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 가장 바람직하게는 1 또는 2이며;
    o는 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 가장 바람직하게는 1 또는 2이고, 여기에서, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있고;
    n 및 o에 대한 정수는 상기 식에 있어서 n 및 o가 동시에 o이 아닌 것과 같이 퍼옥시부분이 없도록 선택된다.
  59. 제 57항 또는 제 58항에 있어서, Ra, Rb, Rc 및 Rd는 수소이고, m = 2이며, n = 1이고, o = 2인 컨쥬게이트.
  60. IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00123
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이다.
  61. IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS) 인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00124
    상기 식에서,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
    결합 -0-(C=0)-는 카복시기 또는 반응성 카복시기와 HAS 분자의 하이드록시기의 반응에 의해 형성되며, HAS"는 상기 하이드록시기가 없는 HAS 분자를 의미한다.
  62. IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00125
    및/또는
    Figure 112006072272527-PCT00126
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
    L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는, 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10, 더욱더 바람직하게는 1 내지 6, 보다 더욱더 바람직하게는 1 내지 2, 특히 바람직하게는 1개의 탄소 원자를 지닌 임의로 치환된 직쇄형, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기이고, L은 특히 CH2이다.
  63. IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00127
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
    L1 및 L2는 독립적으로 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬 헤테로알킬, 및/또는 헤테로아르알킬 부분을 포함하는 1 내지 60, 바람직하게는 1 내지 40, 더 바람직하게는 1 내지 20, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 직쇄형, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기이며,
    D는 결합, 바람직하게는 L1에 결합된 적합한 작용기 F2 및 L2에 결합된 적합한 작용기 F3에 의해 형성된 공유 결합이다.
  64. 제 63항에 있어서, L1은 -(CH2)n-이고, 여기서 n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 더 바람직하게는 2, 3, 4, 특히 바람직하게는 4인 컨쥬게이트.
  65. 제 63항 또는 제 64항에 있어서, L2는 임의로 적절히 치환된 아릴 부분, 바람직하게는 탄소 원자수 6의 아릴 부분이고, 특히 바람직하게는 L2는 C6H4인 컨쥬게이트.
  66. 제 63항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서, F2는
    - C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
    - 티올기 또는 하이드록시기;
    - 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
    - 1,2-디올;
    - 1,2-아미노-티오알코올;
    - 아지드;
    - 1,2-아미노알코올;
    - 아미노기 -NH2, 또는 아미노알킬기, 아미노아릴기, 아미노아르알킬기 혹은 알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노기의 유도체;
    - 하이드록실아미노기 -O-NH2, 또는 하이드록실알킬아미노기, 하이드록실아릴아미노기, 하이드록실아르알킬아미노기 혹은 하이드록살알크아릴아미노기와 같은 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 하이드록실아미노기의 유도체;
    - 각각 구조단위 -NH-O-를 포함하는 알콕시아미노기, 아릴옥시아미노기, 아르알킬옥시아미노기 또는 알크아릴옥시아미노기;
    - 카보닐기, -Q-C(=G)-M을 가지는 잔기이고, 여기에서 G는 O 또는 S이고, M은 예로서
    -- OH 또는 -SH;
    -- 알콕시기, 아릴옥시기, 아르알킬옥시기 또는 알크아릴옥시기;
    -- 알킬티오기, 아릴티오기, 아르알킬티오기 또는 알크아릴티오기;
    -- 알킬카보닐옥시기, 아릴카보닐옥시기, 아르알킬카보닐옥시기, 알크아릴카보닐옥시기;
    -- N-하이드록시숙신이미드와 같은 이미드 구조, 또는 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐과 같이 치환된 아릴 잔기를 가지는 아릴옥시 화합물과 같은 구조 단위 O-N(여기서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이거나, G = O이고, Q는 존재하지 않음)을 가지는 히드록실아민의 에스테르와 같은 활성화 에스테 르이고; 여기에서, Q는 존재하지 않거나 또는 NH 또는 S 또는 O 등의 헤테로원자이고; Q가 존재하지 않거나 NH 또는 S 또는 O와 같은 헤테로원자이며;
    - -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
    - N02;
    - 니트릴기;
    - 알데하이드기 또는 케토기와 같은 카보닐기;
    - 카복시기;
    - -N=C=O기 또는 -N=C=S기;
    - 요오드화 비닐 또는 비닐 브로마이드기 또는 트리플레이트와 같은 비닐 할라이드기;
    - -C≡C-H ;
    - -(C=NH2Cl)-O알킬;
    - -(C=O)-CH2-Hal기(여기에서 Hal은 Cl, Br, 또는 I임);
    - -CH=CH-S02-;
    - -S-S-구조를 포함하는 디설파이드기;
    Figure 112006072272527-PCT00128
    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    F3는 F2와 화학 결합을 형성할 수 있는 작용기이며, 바람직하게는 상기 언급된 기로부터 선택되고; 여기에서, F2는 바람직하게는 부분 -NH-를 포함하며, 더 바람직하게는 아미노기를 포함하고, F3는 바람직하게는 부분 -(C=G)-, 더 바람직하게는 -(C=O)-, 더 바람직하게는 부분 -(C=G)-G-, 보다 더 바람직하게는 -(C=O)-G-, 특히 바람직하게는 -(C=O)-O를 포함하며; D는 특히 바람직하게는 아마이드 결합인 컨쥬게이트.
  67. IFN 알파, IFN 베타, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00129
    상기 식 중,
    -CH2-NH- 부분의 탄소 원자는 개환 산화 반응에 의해 폴리머에 도입된 알데하이드기로부터 유도되고, 질소 원자는 단백질의 아미노기로부터 유도되며, HAS"는 반응에 포함된 상기 알데하이드기의 탄소 원자가 없는 HAS를 의미한다.
  68. IFN 알파, IFN 베타, tPA, A1AT, 인자 VII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00130
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
    L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬 및/또는 헤테로아르알킬 부분을 함유하는, 2 내지 60, 바람직하게는 2 내지 40, 더 바람직하게는 2 내지 20, 보다 더 바람직하게는 2 내지 10개의 탄소원자를 갖는 임의로 치환된 직쇄형, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기이며,
    황 원자는 단백질의 시스테인 잔기 또는 디설파이드기로부터 유도된다.
  69. 제 68항에 있어서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-의 구조를 가진 컨쥬게이트:
    상기 식 중,
    Ra, Rb, Rc 및 Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고,
    G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 0이고,
    m은 1, 2, 3 또는 4, 가장 바람직하게는 2이며, 여기에서, m개의 CRaRb기에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고,
    n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4이며,
    o는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2이고, 가장 바람직하게는 1이고, 여기에서, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있거나;
    또는
    n은 0이고,
    o는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이며, 여기에서, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있다.
  70. IFN 알파, IFN 베타, tPA, A1AT, APC, 인자 VII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 및 하이드록시알킬 스타치(HAS)인 폴리머 또는 그의 유도체를 포함하고, 하기 화학식에 따른 구조를 지닌 컨쥬게이트:
    Figure 112006072272527-PCT00131
    상기 식 중,
    R1, R2 및 R3는 독립적으로 수소, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬기, 하이드록시아릴기, 하이드록시아르알킬기 또는 하이드록시알크아릴기, 바람직하게는 수소 또는 하이드록시알킬기, 더 바람직하게는 수소 또는 하이드록시에틸기이고,
    L은 임의로 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로알킬 및/또는 헤테로아르알킬 부분을 함유하는, 2 내지 60, 바람직하게는 2 내지 40, 더 바람직하게는 2 내지 20, 보다 더 바람직하게는 2 내지 10개의 탄소 원 자를 갖는 임의로 치환된 직쇄형, 분기형 및/또는 환식 탄화수소 잔기이며,
    황 원자는 단백질의 시스테인 잔기 또는 디설파이드기로부터 유도된다.
  71. 제 70항에 있어서, -L-은 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]o-의 구조를 가지는 컨쥬게이트:
    상기 식 중,
    Ra, Rb, Rc 및 Rd는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 바람직하게는 수소이고,
    G는 O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 0이고,
    m은 1, 2, 3 또는 4, 가장 바람직하게는 2이며, 여기에서, m개의 CRaRb기에서 잔기 Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있고,
    n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4이며,
    o는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1이고, 여기에서, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있거나,
    n은 0이고,
    o는 2 내지 20, 바람직하게는 2 내지 10, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 여기에서, o개의 CRcRd기에서 잔기 Rc 및 Rd는 동일하거나 상이할 수 있다.
  72. 제 54항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 스타치는 하이드록시에틸 스타치인 컨쥬게이트.
  73. 제 72항에 있어서, 하이드록시에틸 스타치의 분자량은 2 내지 200 kD, 바람직하게는 4 내지 130 kD, 더 바람직하게는 4 내지 70 kD인 컨쥬게이트.
  74. 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 있어서, 인체 또는 동물 체내 치료방법에 사용하기 위한 컨쥬게이트.
  75. 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  76. 제 75항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  77. 모발상 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 다발골수종과 같은 백혈병, 소포림프종, 카르시노이드 종양, 악성 흑색종과 같은 암 및 만성 B형 간염, 만성 C형 간염과 같은 간염의 치료용의 약물의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
  78. 다발 경화증, 바람직하게는 다발 경화증의 재발형태의 치료용 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
  79. 단백질이 GM-GSF이고, 급성 골수 백혈병을 지닌 노인의 골수 이식 또는 유도 화학요법, 골수이식접목 실패 혹은 지연, 기동(mobilization) 후, 그리고 자가이식 말초 혈액 전구 세포의 이식후의 골수 재구성용의 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
  80. 단백질이 APC이고, 중증 패혈증, 혈전증, 혈전색전증 또는 폐쇄성 질환, 특히 폐쇄성 동맥 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
  81. 단백질은 tPA이고, 심근경색증(심장 기능상실), 혈전증, 혈전색전증 또는 폐쇄성 질환, 특히 폐쇄성 동맥 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬 게이트의 용도.
  82. 단백질은 A1AT이고, 폐기종, 낭성 섬유증, 아토피 피부염 및/또는 기관지염의 치료용 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
  83. 단백질은 AT III이고, 유전성 결핍증, 정맥폐쇄병, 화상 및 심장동맥우회술(CABG) 수술과 관련된 헤파린 내성의 치료, 폐환기 처치와 관련된 마이크로-클롯(micro-clot) 형성의 예방, 외상 또는 위장 수술로 인한 장천공; 파종혈관내응고(DIC) 및/또는 패혈증의 치료용 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
  84. 단백질이 인자 VII이고, 인자 VIII 또는 인자 IX에 대한 저해제를 지닌 A형 또는 B형 혈우병에서의 발작의 치료용 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
  85. 단백질이 인자 VIII이고, A형 혈우병의 치료용 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단 백질 컨쥬게이트의 용도.
  86. 단백질이 인자 IX이고, 수술 환경에서의 출혈의 억제 및 예방을 포함하는, B형 혈우병, 바람직하게는 선천 인자 IX 결함 또는 크리스마스병을 지닌 환자에서의 출혈 발작의 억제 및 예방용의 약제의 제조를 위한 제 52항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 따른 HAS-단백질 컨쥬게이트, 바람직하게는 HES-단백질 컨쥬게이트의 용도.
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