KR100382224B1 - 백신 컨쥬게이트를 이용한 능동면역 생성방법 - Google Patents

백신 컨쥬게이트를 이용한 능동면역 생성방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는, 투여대상의 체내에서 세균질환 또는 원충질환에 대한 능동면역성을 생성시키는 방법에 있어서, 생균 또는 생원충 및 상기 생균 또는 생원충에 결합된 중화인자를 포함하는 백신 컨쥬게이트를 투여대상에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다. 상기 중화인자는 항체 및 항체단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 생균 또는 생원충은 투여대상에서 질병을 일으킬 수 있고, 상기 항체 또는 항체단편은 상기 생균 또는 생원충을 중화시킬 수 있다.

Description

백신 컨쥬게이트를 이용한 능동면역 생성방법{Method of producing active immunity with vaccine conjugate}
백신 컨쥬게이트를 투여하여 바이러스 질환에 대한 능동면역이 생기도록 하는 방법으로서 상기 백신 컨쥬게이트가 생바이러스 및 바이러스 중화항체로 이루어진 방법은, 휘트필(Whitfill) 등의 미국 특허 5,397,568호와 5,397,569호에 기재되어 있다. 상기 참고문헌에는 바이러스 질환에 관한 것만이 기재되어 있다.
콕시디아증(coccidiosis), 즉 각종 에이미에리아종(Eimieriaspecies)에 의해 유발되는 조류 및 포유류의 원충질환 치료방법은, 바푼도(Baffundo) 등의 미국 특허 4,935,007호와 맥도날드(McDonald) 등의 미국 특허 5,055,292호에 기재되어 있다. 콕시디아증에 대한 난(卵) 내부(In ovo) 접종법은, PCT 출원공개 WO 96/40233호 및 WO 96/40234호에 기재되어 있다.
본 출원은 1996년 9월 30일에 미국출원된 60/027,084호의 가출원 이익을 주장한다.
본 발명은, 투여대상에게 백신 컨쥬게이트를 투여하여 세균 또는 원충질환에 대한 능동면역성이 생기도록 하는 방법에 관한 것으로서, 상기 컨쥬게이트는 생균 또는 생원충 및 중화항체 또는 중화항체단편을 포함한다.
도 1은, 2.5, 25 또는 150㎕의 다중클론항체와 500개의 에이미에리아 아세르불리나(E. acervulina) 낭포체(oocyst)가 복합된 복합체를 포함하는 백신 컨쥬게이트를 이용하여 조류에 백신접종시킨 후에 생성된 낭포체를, 백신접종되지 않은 대조군 및 항체와 복합되지 않은 낭포체로 백신접종된 대조군(대조군)과 비교하여 도시한 그래프이다. 낭포체 생성정도는 감염성의 척도로 사용된다.
도 2는, 25 또는 150㎕의 다중클론항체와 500개의 에이미에리아 아세르불리나(E. acervulina) 낭포체로 이루어진 복합체를 포함하는 백신 컨쥬게이트를 이용하여 조류에 백신접종시킨 후에 생성된 낭포체 생성정도를, 백신접종되지 않은 대조군(대조군) 및 항체와 복합되지 않은 낭포체로 백신접종된 대조군과 비교하여 도시한 그래프이다. 낭포체 생성정도는 감염성의 척도로서 사용된다.
도 3은, 백신 및 저용량의 에이미에리아 아세르불리나(E. acerulina) 접종 후 낭포체 생성정도를 도시한 것이다. 백신접종은 2.5, 25 또는 150㎕의 다중클론항체와 복합된 500개의 에이미에리아 아세르불리나(E. acerulina) 낭포체를 사용하였고; 대조군은 비-백신접종 대조군(대조군)과 항체와 복합되지 않은 낭포체로 백신접종된 대조군(0)을 사용하였다.
도 4는, 백신 및 고용량의 에이미에리아 아세르불리나(E. acerulina) 접종 후에 증가된 조류의 체중(g)을 도시한 것이다. 백신접종은 25 또는 150㎕의 다중클론항체와 복합된 500개의 에이미에리아 아세르불리나(E. acerulina) 낭포체를 사용하였고; 대조군은 비-백신접종 대조군(대조군)과 항체와 복합되지 않은 낭포체로 백신접종된 대조군(0)을 사용하였다.
도 5는, 백신 및 고용량의 에이미에리아 아세르불리나(E. acerulina) 접종 후의 장애기록(lesion scores)을 도시한 것이다. 백신접종은 25 또는 150㎕의 다중클론항체와 복합된 500 에이미에리아 아세르불리나(E. acerulina) 낭포체를 사용하였고; 대조군은 비-백신접종 대조군(대조군)과 항체와 복합되지 않은 낭포체로 백신접종된 대조군(0)을 사용하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 살아있는 유기체(세균 또는 원충)와 상기 유기체에 특이성을 갖는 중화항체가 복합된 복합체를 포함하는 백신제제를 제공한다. 상기 복합체중 중화항체량은, 상기 유기체가 능동면역반응을 유발할 수 있으면서 동시에 병원균의 해로운 효과에 대해서 어느 정도 방어할 수 있는 양이다. 발명자들은 어느 한 가지 이론에 얽매이기를 바라지는 않으나, 본 발명의 백신 복합체는 일정 병원체의 서방출형이라고 일반적으로 생각된다.
본 발명의 백신 복합체는 백신접종 대상에 미치는 백신체의 병원성 효과를 지연시키거나 상기 병원성 효과를 초기에 예방하는 것으로 생각된다. 그러나 이러한 지연효과 또는 초기 예방효과는 일시적인 것일 뿐이다(사멸 또는 비활성화 백신체를 사용하여 기대되는 효과와는 대조적임). 상기 복합체중의 백신체는 궁극적으로 접종대상을 감염시키고 능동면역을 유도한다. 상기 지연정도는, 사용 항체량, 특정 백신체 및 백신접종대상에 따라 달라질 것이다. 이러한 감염지연은 어린 대상자들을 백신접종하는 경우에, 특히 대다수의 개체가 백신접종되는 경우에 있어서 중요하다. 예컨대, 이제 막 부화된 병아리를 백신접종하는 것에 비해서는 병아리를난(卵) 내부에서(in ovo) 접종하는 것이 더 용이하고 비용면에서도 더 효율적이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 중화인자는 생백신체로 인해 접종대상이 감염됨으로써 나타나는 병리학적 변화의 발생을 지연시킬 정도의 양으로서 제공된다. 상기 "지연"이란 말은 상대적인데; 상기 병리학적 변화는, 중화인자와 복합되지 않은 생백신체가 투여되는 경우 일어날 수 있는 변화와 비교하여 지연된다는 것이다.
본 발명의 백신 컨쥬게이트를 사용하는 것이 방어성 능동면역반응을 유도하는 비컨쥬게이트 유기체를 사용하는 것보다 안전하다. 여기서 상기 "안전"이란 말은, 백신접종으로 인해 생기는 유리한 효과가 백신접종된 다수개체에서 발생할 수 있는 어떠한 해로운 영향을 능가한다는 의미로 사용된다.
본 발명의 실시에 사용되는 항체는 세균 또는 원충 중화항체이다. 세균 또는 원충 중화항체란, 상기 항체가 세균 또는 원충과 반응할 시간이 충분한 경우에 세균 또는 원충의 체내 감염성에 대항해 싸우는 항체를 말한다. 상기 세균 또는 원충 중화항체의 소스는 중요하지 않다. 조류(예, 닭, 칠면조 등)와 포유류(예, 랫트, 토끼, 염소, 말 등)를 포함해 어떤 동물로부터도 유래할 수 있다. 상기 세균 또는 원충 중화항체는 다중클론 또는 단일클론 유래물질일 수 있고(D. Yelton 및 M. Scharff, 68American Scientist510(1980)), 키메라항체일 수도 있다(M. Walker등, 26Molecular Immunology403(1989)).
본 발명의 실시에 사용되는 세균 또는 원충 중화항체는, IgM, IgG, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 면역글로불린 동형체일 수 있다. 바람직하기로는 IgG 및 IgM이고 가장 바람직하기로는 IgG 면역글로불린(예, IgG1, IgG2, IgG3 ,IgG4)이다.
본 발명의 실시에 사용되는 항체단편은, 그 가변영역 결합부위가 보존되어 있는 세균 또는 원충 중화항체의 단편이다. F(ab')2단편, F(ab')단편 및 Fab단편이 그 예이다(Immunology: Basic Processes, 95-97, J. Bellanti Ed. 2d ed. 1985).
본 발명의 실시에 사용되는 항체 또는 항체단편은, 상기 항체와 결합되는 부가요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 마이크로스피어 또는 마이크로파티클이 상기 항체 또는 항체단편에 결합될 수 있는데, 이러한 내용이 플라트(Platt)의 미국특허 4,493,825호에 개시되어 있고 그 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
본 발명은 중화인자와 컨쥬게이션되지 않는 경우에 투여대상의 체내에서 병원성(즉, 질병을 유발)을 갖는 세균 또는 원충을 사용한다는 점에서 특히 유리하다. 세균 또는 원충의 병원성은 세균 또는 원충 자체가 갖는 고유성 때문일 수도 있고 투여대상의 병원균 감수성 때문일 수도 있다(예, 난(卵)내 투여되는 조류). 일반적으로, 병원성 세균 또는 원충은 다수가 그 감염대상에서 능동면역을 유발하는 긍정적인 효과를 가지고 있으며, 세균 또는 원충 약독화 백신주는 다수가 투여대상에 적어도 어떤 질병을 일으킬 수 있다. 그러므로, 여기서 세균 또는 원충을 설명하기 위해 사용한 "병원성"이란 말은 일정 대상에 세균 또는 원충을 투여함으로써 생기는 해로운 효과가, 상기 세균 또는 원충을 투여함으로써 생기는 어떤 유리한 효과를 능가하는 것을 말한다. "능동(active)" 또는 "생(live)" 유기체란 사멸되지 않은 유기체를 말한다. "백신체(vaccin organism)"란, 방어성 면역반응을유도하기 위해 사용하는 것으로서 물론 부정적인 부작용을 유발할 수도 있다 (이경우, 능동면역성의 유리한 효과가 부정적인 부작용을 능가한다). 상기 세균 또는 원충은, 투여대상의 체내에서 상기 세균 또는 원충에 대한 능동면역반응을 일으킬 수 있는 살아있는 유기체인 것이 바람직하다.
상기 백신 컨쥬게이트는 백신제제에 함유되는데, 단위용량당 함유량은 투여대상에서 세균 또는 원충에 대한 능동면역반응을 일으키기에 충분한 정도의 양이다. 여기서 사용되는 "면역반응(immune response)"이란, 세균 또는 원충에 재차 노출되는 경우에 생기는 방어성을 말하는 것으로서, 그 방어성이 부분적인 것인지 완전한 것인지와는 상관없이 사망률의 감소, 장애기록의 감소, 식이전환율(feed conversion ratio)의 증가 또는 질병의 기타 다른 해로운 효과의 감소 등과 같은 형태로 대상 집단에 유리하게 나타난다.
중화인자가 제공하는 방어정도와 관련하여, 세균 또는 원충과 조합된 상태로 백신내에 함유되어서 투여되는 중화인자의 투여량은 세균 또는 원충에 대해 완벽한 방어를 제공할 정도로 충분한 양일 필요는 없는데, 이 경우 세균 또는 원충에 의해 생긴 해로운 효과는 상기 투여로 인해 유발된 면역반응의 유리한 효과에 의해 능가될 정도로 감소되는 것을 전제로한다.
여기서 사용한 "투여대상(subject)"이란, 다른 대상들 중에서 포유류와 조류를 포함한다. 포유류의 예로는 마우스, 랫트, 돼지, 토끼, 양, 흰족제비, 개, 고양이, 소, 말 및 사람을 포함하는 영장류가 포함된다. "조류(bird)"라는 말은 모든 종류의 암, 수 조류를 포함하나, 일차적으로는 난(卵) 또는 고기를 목적으로 사육되는 가금이 포함된다. 따라서 "조류"라는 말은 일차적으로 암탉, 수탉, 수오리, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기 및 꿩을 포함한다.
본 발명을 실시하는데 사용되는 세균으로는 악티노바실로시스 리그니에레시(Actinobacillosis lignieresi), 악티노마이세스 보비스(Actinomyces bovis), 에어로박터 에어로젠스(Aerobacter aerogenes), 아나플라스마 마지날레(Anaplsma marginale), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 보렐리아 안세리나(Borrelia anserina), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 클로스트리듐 쵸보(Clostridium chauvoei), 클로스트리듐 헤몰리티큠(C. hemolyticium), 클로스트리듐 노비이(C. novyi), 클로스트리듐 퍼르프린젠스(C. perfringens), 클로스트리듐 셉티쿰(C. septicum), 클로스트리듐 테타니(C. tetani), 코리네박테리움 에퀴이(Corynevacterium equi), 코리네박테리움 피오겐스(C. pyogens), 코리네박테리움 레날레(C. renale), 카우드리아 루미난튬(Cowdria ruminantium), 더마토필루스 콘골렌시스(Dermatophilus congolensis), 에리시펠로트릭스 인시디오사(Erysipelothrix insidiosa), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 푸시포르미스 네크로포루스(Fusiformis necrophorus), 헤모바르토넬라 카니스(Haemobartonella canis), 헤모필루스종(Hqemophilus spp.) 헤모필루스 수스(H. suis), 렙토스피라종(Leptospira spp.), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 미코플라스마종(Mycoplasm spp.), 미코플라스마 히오뉴모니아(M. hyopneumoniae), 나노피에투스 살민콜라(Nanophyetus salmincola), 파스퇴렐라 아나티페스티퍼(Pasteurella anatipestifer), 파스퇴렐라 헤몰리티카(P.hemolytica), 파스퇴렐라 물토시다(P. multocida), 살로넬라 아보르투스-오비스(Salmonella abortus-ovis), 쉬겔라 에퀴룰리스(Shigella equirulis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 하이쿠스(S. hyicus), 스타필로코커스 히오스(S. hyos), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcu agalactiae), 스트렙토코커스 디스갈락티아(S. dysgalactiae), 스트렙토코커스 에퀴이(S. equi), 스트렙토코커스 우베리스(S. uberis)및 비브리오 페투스(Vibrio fetus)(해당 질병을 위한 참조문헌은, Veterinary Pharmacology and Therapeutics 5판, p746 표50.2(N.Booth 및 L.McDonald Eds., 1982)(아이오와 주립 대학 출판부)); 및 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diptheriae), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 미코박테리움 레프라에(M. leprae), 미코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 다이피셀(C. difficile), 클로스트리듐 페르프린젠스(C. perfringens), 클로스트리듐 테타니(C. tetani), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오겐스(S. pyogenes), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertusiss), 슈도모나스 에루지노스(Psudomonas aeruginos), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 브루셀라종(Brucellaspp.), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularenssis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 클라미디아 사이타시(Clamydia psittaci), 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이피무리움(S. typhimurium), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Y. pestis), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 미코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노레아(Neiseseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스(N. meningitidis), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burneti), 리케치아 무세리아(Rickettsia mooseria), 리케치아 프로바제키(R. prowazekii), 리케치아 리케치(R. rickettsii), 리케치아 쓰쓰가무시(R. tsutsugamushi), 보렐리아종(Borrelia spp.), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interogans), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)(해당 질병을 위한 참고문헌으로는, R.Stanier 등, The Microbial World, p637-38 표32.3(5판 1986))가 포함된다. 그러나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시에 사용되는 원충으로는, 콕시디아증을 유발하는 에이메리아종(Eimeriaspecies)(에이메리아 테넬라(E. tenella), 에이메리아 네카트릭스(E. necatrix), 에이메리아 브루네티(E. brunetti), 에이메리아 아세르불리나(E. acervulina), 에이메리아 미바티(E. mivati) 및 에이메리아 막시마(E. maxima)), 아나플라스마 마지날레(Anaplasma marginale), 지아르데아종(Giardiaspecies)(예, 지아르데아 람블리아(G. lamblia)), 바베시아종(Babesiaspecies)(예, 바베시아 카니스(B. canis), 바베시아 깁스니(B. gibsoni), 바베시아 에퀴이(B. equi), 바베시아 카발리(B. caballi), 바베시아 바이게미나(B. bigemina), 바베시아 아르겐티나(B. argentina), 바베시아 다이버겐스(B. divergens) 및 바베시아 보비스(B. bovis)), 트리코모나스 포에투스(Trichomonas foetus), 엔트아메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica)및 발란티듐 콜라이(Balantidium coli); 플라스모듐종(Plasmodiumspecies)(예, 플라스모듐 팔시파룸(P. falciparum), 플라스모듐 말라리아(P. malariae), 플라스모듐 비박스(P. vivax) 및 플라스모듐 오발레(P. ovale)), 레이쉬마니아종(Leishmaniaspecies)(예, 레이쉬마니아 도노바니(L. donovani), 레이쉬마니아 브라질리엔시스(L. braziliensis), 레이쉬마니아 트로피카(L. tropica) 및 레이쉬마니아 멕시카나(L. mexicana)), 트리파노소마종(Trypanosomaspecies)(예, 트리파노소마 브루세이(T. brucei) 및 트리파노소마 크루지(T. cruzi)), 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 톡소플라스모사 곤디이(Toxoplasmosa gondii) 및 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii)가 포함된다. 그러나 이에 국한되는 것은 아니다. 여기서 사용된 "조류 원충"이란 조류를 감염시키는 것으로 알려진 원충을 말한다.
상기 유기체는 포자 또는 그 포자낭 등의 적절한 형태로 투여된다. 예를 들면, 감염성 콕시듐속 유기체는 포자형성 낭포체(oocyst), 포자소체(sporozoite) 및 포자낭(sporocyst) 형태로 투여된다.
컨쥬게이트형으로 투여되는 유기체의 정확한 숫자가 중요한 것은 아니나, 동물에 의한 면역반응이 생기도록 하기에 유효한 숫자이어야 한다. 일반적으로, 투여되는 유기체, 투여부위 및 투여방법, 투여대상의 연령 및 상태 등에 따라, 유기체의 투여숫자는 1, 10 또는 100에서부터 1000, 10,000, 100,000 또는 백만에까지 이른다. 유기체가 컨쥬게이트로서 조류에 난(卵)내부(in ovo) 투여되는 경우, 그 투여량은 50, 100 또는 500유기체 내지 2,000, 10,000, 20,000, 30,000, 50,000 또는 100,000유기체 이상이 될 것이다.
본 발명의 백신은 적절한 방법을 통해 투여대상에 투여된다. 예를 들면 경구, 근육내주사, 피하주사, 정맥주사, 복강내주사, 점안투여 또는 비분무(nasal spray)를 통해 투여된다. 투여대상이 조류인 경우, 상기 조류는 이제 막 부화된(즉, 부화된지 약 3일쯤 된)조류 등의 부화조류, 성장기 조류, 성숙조류일 수 있다. 백신은, 샬마(Sharma)의 미국특허 4,458,630호에 기재된 바대로(상기 특허문헌 및 상기 문헌에서 인용된 다른 모든 참고문헌의 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함되어 있다), 상기 조류에 난(卵)내(in ovo) 투여될 수 있다.
백신의 난내(in ovo) 투여는, 백신을 난(卵)에 투여하는 과정을 포함한다. 본 발명의 백신이 투여되는 난은 수정란으로서 바람직하기로는 부화 4단계중 4번째 단계에 있는 난이다. 달걀은 부화시작 약 15일 또는 16일째에 투여되는데, 가장 바람직하기로는 부화시작 약 18일째(배(胚)발달단계의 18일째)에 투여된다. 칠면조알은 부화시작 약 21일 내지 26일째에 투여되는 것이 바람직하고 가장 바람직하기로는 부화시작 약 25일째에 투여된다.
본 발명의 백신은, 난껍질을 통하여 백신 화합물이 운반될 수 있는 임의의방법으로 투여될 수 있다. 그러나 주사투여가 바람직하다. 주사부위는, 난황낭 내에 존재하는 양수 및 배(胚) 자체 등 양막에 의해 정해지는 영역 또는 기포(air cell)내 영역중 하나인 것이 바람직하다. 가장 바람직하기로는 양막에 의해 한정되는 부위에 주사되는 것이 다. 부화의 4번째 단계 초기에는 양막이 충분히 커져서, 난(卵)의 넓은말단 중심으로부터 세로축을 따라 주사되는 거의 모든 시간동안 백신이 확실하게 침투할 수 있게 된다.
상기 난주입 기전은 중요하지 않다. 그러나, 상기 투여방법으로 인해 배 또는 배주위에 존재하는 다른 배 성분 조직 또는 기관에 부당하게 해를 입히지 않고 투여로 인해 부화속도가 감소되지 않는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해 약 18 내지 22게이지의 바늘이 장착된 피하주사기를 이용하는 것이 적합하다. 폐포에 주사하기 위해서는, 상기 바늘이 단지 약 2밀리미터 정도만 난(卵)속으로 삽입될 필요가 있다. 1인치짜리 바늘이 난(卵)의 넓은말단 중심부쪽에서 완전히 삽입되면, 난껍질, 폐포를 둘러싼 껍질 내막과 외막 그리고 양막을 통과할 것이다. 정확한 배 발달단계와 배의 정확한 위치에 따라, 병아리 위쪽에 존재하는 양수 또는 병아리 자체에 소정 길이의 바늘끝이 다다를 것이다. 바늘을 삽입하기 전단계에서 길잡이 구멍을 미리 뚫어놓아 바늘이 손상되거나 무디어지는 것을 방지할 수 있다. 원한다면, 왁스 등 실질적으로 세균-불투과성 밀봉물질을 이용하여 상기 난을 시일링함으로써, 뒤이어 발생할 수 있는 바람직하지 못한 세균침입을 방지할 수 있다.
본 발명의 실시에 조류 배(胚)에 사용되는 고속자동 난주사 시스템을 이용하는 것이 특히 적합할 것으로 생각된다. 다수의 장치가 이용가능한데, 그 예가 헤브랭크(Hebrank)의 미국특허 4,681,063호 및 밀러(Miller)의 미국특허 4,040,388호, 4,469,047호와 4,593,646호에 기재되어 있다. 이러한 장치는 모두, 본 발명의 실시에 사용될 때, 본 발명에서 설명한 백신이 들어있는 주사기를 포함하고 있고, 상기 주사기는 상기 장치에 의해 운반된 난에 상기 백신을 주사할 수 있도록 위치하고 있다. 상기 장치의 다른 특징들은 상기 문헌에 기재되어 있다. 이외에도, 원한다면, 주사장치와 작동가능하게 연결되어 있는 시일링 장치를 제공함으로써 주사 후에 난(卵)구멍을 밀봉할 수 있다.
본 발명을 실시하기 위한 바람직한 난주사장치가 헤브랭크의 미국특허 4,681,063호 및 4,903,635호에 개시되어 있고, 그 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 상기 장치는 주사장치와 흡입장치를 포함하는데, 주사장치는 유체물질을 다수의 난으로 운반하는 역할을 하고, 흡입장치는 다수개의 난을 동시에 잡아 위로향한 부분을 들어올린 다음 난이 흡입장치에 의해 고정되어 있는 동안에 주사장치와 함께 작용하여 백신이 난에 주사되도록 하는 역할을 한다. 상기 장치의 이러한 특성은 전술된 상기 장치의 다른 특성과 결합되어서 본 발명의 실시에 사용될 수도 있다. 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 투여대상은 조류이다.
본 발명의 방법은, 조류를 대상으로하여 난 내부에서(in ovo) 실시된다.
본 발명의 백신 컨쥬게이트는, 약제학적으로 허용가능한 담체내에서 중화인자와 생균 또는 생원충을 충분한 시간동안 혼합시켜 생균- 또는 생원충-중화인자 컨쥬게이트가 형성되도록 함으로써(예컨대, 투여대상에게 투여하기 전에, 컨쥬게이트가 형성될 때까지 중화인자와 생균 또는 생원충을 통상의 액상담체내에서 조합시킴으로써) 제조된다. 상기 제조방법은, 중화인자가 포함된 초면역 혈청을 생균 또는 생원충이 포함된 액상용액에 단순히 부가시킴으로써 편리하게 실시될 수 있다. 본 발명의 백신제제는, 동결건조 형태의 백신 컨쥬게이트 또는 약제학적으로 허용가능한 담체에 담겨진 백신 컨쥬게이트를 포함하는 것이 바람직한다. 약제학적으로 허용가능한 담체로는, 액상 특히 수성담체인 것이 바람직하다. 상기 백신제제를 제조하기 위하여, 중화인자와 생균 또는 생원충을 인산나트륨-완충 식염수(pH 7.4), MEM과 같은 통상의 배지 또는 세균 성장배지에서 혼합시킬 수 있다. 상기 백신제제는, 고무마개로 밀봉된 멸균 유리용기에 보관될 수 있는데, 상기 고무마개를 통해 액체가 주입되고 제제가 주사기내로 들어갈 수 있다.
본 발명의 백신 컨쥬게이트 또는 복합체는 항체와 생백신체와의 컨쥬게이트 또는 복합체이다; 항체와 백신체간의 결합은 분리가능한 결합이고 공유결합이 아니다. 주어진 백신체 및 투여대상에 사용하기 적합한 중화항체량은 당업계에 사용되는 방법을 이용하여 용이하게 정할 수 있다. 사용되는 항체량이 너무 적으면 바람직하지 못한 백신체로 인해 초기 병원성 효과 또는 심각한 병원성 효과가 유발되고; 항체량이 너무 많으면 백신체를 완전히 불활성화시키거나 또는 백신체가 방어성 면역반응을 유도하지 못하도록 한다.
본 발명의 백신제제는 경우에 따라 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 항원에 대한 면역계 반응을 증강시키는 화학물질 및 폴리펩티드 면역자극제 등의 적절한 보조제가 사용될 수 있다. 바람직하기로는, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 식물성오일 및 동물오일 등과 같은 보조제가, 백신 컨쥬게이트에 대한 투여대상의면역반응을 증강시키기에 충분한 양만큼, 백신 컨쥬게이트와 함께 투여된다. 백신 컨쥬게이트에 첨가되는 보조제의 양은, 보조제의 성질에 따라 달라지는데 일반적으로 세균 또는 원충 무게의 약 0.1 내지 약 100배 범위이고, 바람직하기로는 세균 또는 원충 무게의 약 1 내지 약 10배 범위이다.
본 발명의 백신제제는 경우에 따라 하나 이상의 안정화제를 포함할 수 있다. 안정화제로는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 덱스트린 또는 글루코스와 같은 탄수화물; 알부민 또는 카제인과 같은 단백질; 및 인산 알칼리금속염과 같은 완충제 등 적합한 안정화제가 사용될 수 있다. 안정화제는 상기 백신제제가 동결건조된 제제인 경우에 사용하면 특히 유익하다.
이하, 본 발명을 하기 비제한적 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다.
발명의 개요
본 발명은, 투여대상에 세균질환 또는 원충질환에 대한 능동면역성이 생기도록 하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 투여대상에 생균 또는 생원충 및 상기 생균 또는 생원충에 결합된 중화인자를 포함하는 백신 컨쥬게이트를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 중화인자는 항체 및 항체단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 항체 또는 항체 단편은 상기 생균 또는 생원충을 중화시키는 능력이 있다. 상기 백신 컨쥬게이트는 투여대상에 생균 또는 생원충에 대한 면역반응이 생기도록 하는데 유효한 양만큼 투여된다.
본 발명의 다른 측면은, 투여대상에 있어서 세균질환 또는 원충질환에 대한 능동면역이 생기도록 하는데 유용한 백신제제를 제공하는 것이다. 상기 백신제제는 백신 컨쥬게이트를 포함하여 이루어지는 약제학적으로 허용가능한 제제이다. 상기 백신 컨쥬게이트는 생균 또는 생원충과 상기 생균 또는 생원충에 결합된 중화인자를 포함한다. 상기 중화인자는 항체 및 항체단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 항체 또는 항체단편은 상기 생균 또는 생원충을 중화시키는 능력이 있다. 상기 백신 컨쥬게이트는 투여대상에 생균 또는 생원충에 대한 면역반응이 생기도록 하기에 유효한 양만큼 상기 약제학적으로 허용가능 제제내에 포함된다.
본 발명의 또다른 측면은, 병원균-불침투성 밀폐용기 및 상기 밀폐용기내에 봉입된 무균백신제제를 포함하는 제품을 제공하는 것이다.
실시예 1
세균종(Bacterial Species)
세균 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida)는 다수의 조류에서 전염성이 매우 강한 급성질환을 일으킨다. 가금 콜레라(Fowl cholea)병은 발병율과 치사율이 높은 패혈증 질환형태로 종종 발생한다. 닭과 칠면조에 투여되는 가금 콜레라용 생백신이 몇 종류 존재한다.
파스퇴렐라 물토시다(P. multocida) 균주는 파스퇴렐라 물토시다주에 특이성을 갖는 항체와 시험관내에서 복합됨으로써 세균-항체 복합체를 형성한다. 세균과항체를 서로 다른 비율로 하여 시험함으로서, 세균을 완전히 불활성화시키지는 않으면서 능동면역반응은 여전히 일으킬 수 있는 비율을 결정하였다. 이렇게 형성된 복합체를 닭 또는 칠면조에 백신으로 사용하였다. 뒤이어 백신접종 반응이 일어났고, 이를 항체와 복합되지 않은 동량의 파스퇴렐라 물토시다로 접종된 조류의 반응과 비교하였다. 백신접종 후 장애, 시간에 따른 항체반응 및 일반적인 조류 건강을 시험기간 내내 모니터링하였다.
다른 세균들도 이와 유사한 방법으로 시험하였다. 이러한 세균으로는 닭 또는 칠면조에서의 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallicepticum), 칠면조에서의 보르데텔라 아비움(Bordetella avium), 닭 또는 칠면조에서의 살모넬라종(Salmonillaspecies) 및 설치류에서의 살모넬라종 및 리스테리아종(Listeriaspecies)이 포함된다. 그러나 이에 국한되는 것은 아니다.
백신 컨쥬게이트는, 전술한 바와 같이 난 내부에(in ovo) 또는 부화 후에 조류에 투여되었다.
실시예 2
원충종(Protozoal Species)
원충 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina)(보다 상세하게는, 포자낭 및/또는 그 낭포체)는 상기 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina)에 특이성을 갖는 항체와 시험관내에서 복합되어 원충-항체 복합체를 형성하였다. 상기 복합체를 백신으로서 닭에 사용하였다. 상기 원충-항체 복합체 백신접종 반응이 일어났고, 이를 항체와 복합되지 않은 동량의 에이메리아 아세르불리나(Eimeriaacervulina)를 접종시킨 조류에서의 반응과 비교하였다. 원충과 항체를 서로 다른 비율로하여 시험함으로서, 원충을 완전히 불활성화시키지는 않으면서도 여전히 능동면역반응은 일으키는 비율을 결정하였다. 백신접종 후 백신접종 분변내 낭포체 생성율, 장내 흡수력(카로티노이드 흡수로서 평가함) 및 체중을 측정하였다. 백신접종 후 10 내지 21일째에, 각 백신접종군 조류에게 유독성의 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina)를 접종시켰다. 백신접종군과 비-백신접종 대조군에 대하여, 백신접종 배설물에서의 낭포체 생성율, 접종기간 동안의 체중증가 및 장내 흡수력(카로티노이드 흡수로서 평가함)을 측정하였다.
다른 에이메리아종을 닭, 칠면조 또는 설치류에 대해서도 시험하였을 뿐 아니라 크립토스포리듐종(Cryptosporidium species)을 닭 또는 칠면조에 대해 시험하였고, 히스토모나스 멜레아그리디스(Histomonas meleagridis)를 닭 또는 칠면조에 대해 시험하였다.
백신 컨쥬게이트는, 전술한 바와 같이 난 내부에(in ovo) 또는 부화 후에 조류에 투여되었다.
실시예 3
백신접종에 따른 에이메리아 낭포체 생산
닭에 백신접종시킨 후 연구를 거쳐 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 낭포체 백신과 항체와의 복합효과를 결정하였다.
백신접종방법을 네가지로 연구하였다. 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina)에 대한 특이성을 가진 다중클론항체 0, 2.5, 25 또는 150단위 중의 어느 하나와 복합된 500개의 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 포자형성 낭포체를, 투여군에게 접종(경구용 위관 이용)시켰다. 레그혼종 닭(Leghorn chickens) 다섯군(각 투여군이 15마리이고, 전체 투여마리수는 60마리임)중 세군에 각각 투여하였다. 다섯 번째 군인 대조군(5마리씩 3반복군)에는 낭포체나 항체를 전혀 투여하지 않았고, 대신 경구용 위관을 통해 0.1㎖의 PBS를 부화일에 투여하고 이어서 계속 투여하였다.
항체단위는 부피에 기초하여 정하였고, 1㎕가 1단위이다. 본 실시예에 사용된 항체제제의 "역가단위"는 ELISA 분석법을 이용하여 결정하였다; 그러나, 이 분석법은 유효하지 않았다. ELISA 분석법에 의할 때 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 항체제제의 역가는 90,782단위/㎖이었다. 여기서 사용된 용량은 상대적인 비교값인데; 주어진 유기체와 복합되는 항체의 적정량은 상기 유기체, 항체제제 및 의도된 투여대상에 따라 달라질 것이다. 당업자는 당기술분야에 공지된 방법을 이용하여 소정의 용도를 위한 유기체:항체의 적정비율을 정할 수 있을 것이다.
백신접종 전, 낭포체와 항체를 실온의 PBS중에서 최소 한 시간동안 혼합하였다. 그 다음, 백신복합체를 투여전까지 4℃에 보관하였다. 부화일의 닭에 백신접종을 하였다.
백신접종에 따른 낭포체 생성은, 백신접종 후 4 내지 8일째에 분변을 모아 분변중에 있는 낭포체의 수를 세는 방법으로 결정하였다. 각 군에 대해 낭포체 생성 평균과 표준편차를 구하였다. [표 1]에서 보는 바와 같이, 500개의 낭포체와150㎕단위의 항체를 복합시켜 사용한 경우 낭포체 생성이 상당히 감소하였다.
감염성 -- 조류당 낭포체 생성
백신접종 처리 낭포체 평균/조류 (x 106)
비투여평균표준편차N 0.000.0032
항체 0㎕ + 낭포체평균표준편차N (a)111.652.9132
항체 2.5㎕ + 낭포체평균표준편차N (a)110.182.5432
항체 25㎕ + 낭포체평균표준편차N (a)110.614.2832
항체 150㎕ + 낭포체평균표준편차N (b)15.401.9432
1. a,b: LSD시험에 의해 0.15수준에서 차이남. 샘플크기가 적음으로 인한 유의성은 0.20수준에 맞춰짐. 대조군은 이 통계모델에 포함되지 않음.
2. N = 각군당 5마리씩인 세 군
실시예 4
균접종에 따른 에이메리아 낭포체 생성
실시예 3에서 기재한 투여군 조류에 대해, 부화 후 13일째에 PBS중에 포함되어 있는 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 낭포체 250을 경구위관을 통해 투여하였다. 접종 후 4일 내지 8일째에 분변을 수집하여, 대조군 낭포체 생성에 대한 비율(%)로서 낭포체 평균 생성수를 결정하였다(통계 모델에 대조군이 포함됨). 그 결과가 [표 2]에 나타나있다. 균접종 후 더 많은 양의 낭포체가 생성되었다는 것은 병원균 접종에 대해 방어가 덜 되었다는 것을 나타낸다.
균접종 후 방어성
백신접종 처리 낭포체 평균/조류; 접종 후(x 106) 낭포체 평균(대조군에 대한%)2
대조군 2 평균표준편차N A123.081.673 A1100.007.223
항체 0㎕ + 낭포체평균표준편차N C15.200.723 C122.543.133
항체 2.5㎕ + 낭포체평균표준편차N B18.722.453 C137.7610.603
항체 25㎕ + 낭포체평균표준편차N B19.761.783 B142.297.703
항체 150㎕ + 낭포체평균표준편차N B110.492.333 B145.4710.103
1. A,B,C: SNK시험에 의해 0.05수준에서 차이남.
2. 대조군 = 백신접종되지 않고 균접종된 조류
실시예 5
균접종 후 방어성
[표 2]에서 제공된 데이터를 통계 모델에 대조군을 포함시키지 않은 채 재분석하였다. 그 결과가 [표 3]에 나타나있다.
백신접종 처리 접종 후 평균 낭포체(x 106) 평균 낭포체(대조군에 대한%)2
대조군 2 평균표준편차N 23.081.673 100.007.223
항체 0㎕ + 낭포체평균표준편차N B15.200.723 B122.543.133
항체 2.5㎕ + 낭포체평균표준편차N AB18.722.453 AB137.7610.603
항체 25㎕ + 낭포체평균표준편차N A19.761.783 A142.297.703
항체 150㎕ + 낭포체평균표준편차N A110.492.333 A145.4710.103
1. A,B,C: SNK시험에 의해 0.05수준에서 차이남.
2. 대조군 = 백신접종되지 않고 균접종된 조류.
실시예 1 내지 3에서 얻은 결과에 의하면, 500개의 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 낭포체 백신용량과 150㎕의 항체를 함께 사용하는 경우에는, 백신접종의 병원성 효과가 감소되거나(더 적은 양의 항체를 사용하거나 또는 항체를 사용하지 않은 동일한 백신을 사용한 경우와 비교하였을 때; 이는 백신접종 후 낭포체 생성의 감소로 나타남), 또는 백신접종량의 병원성 효과가 지연될 수도 있다는 것을 알 수 있다. [표 1]에서 보는 바와 같이, 백신 낭포체에 150㎕의 항체를 복합시킨 경우가 더 적은 양의 항체를 복합시키거나 아예 항체를사용하지 않은 경우에 비해 감염성 정도가 떨어졌다(p≤0.15).
[표 2]에서 보는 바와 같이, 항체-낭포체 백신으로 백신접종된 조류의 경우 250개의 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 낭포체로 접종시킨 후의 낭포체 생성이 백신접종되지 않은 조류의 경우에 비하여 감소하였다. 이러한 결과는, 접종된 병원균에 대한 방어성 면역반응을 유도하는데 있어서 항체-낭포체 백신제제가 효과적이라는 것을 보여준다. 방어성은 항체없이 낭포체로 백신접종된 투여군에서 가장 높았는데, 그 유의수준은 0.05이었다. [표 3]에서 보는 바와 같이, 항체-낭포체 백신으로 처리한 조류중 항체없이 낭포체로 처리한 군에서 가장 높은 방어성을 보였다.
상기 결과는, 항체와 낭포체 백신 복합체를 사용하는 경우, 여전히 방어성 면역반응은 일으키면서도 백신 낭포체의 병원성 효과를 감소시키거나 아니면 백신 낭포체의 병원성을 지연시키는 효과가 있다는 것을 보여준다. 어느 효과에 의하든 백신 안정성을 증가시켜줄 것으로 기대할 수 있는데, 이로써 백신체의 병원성 효과에 대한 감수성이 큰 투여대상 또는 보다 어린 연령의(조류에 난내 투여와 같이) 투여대상에게 백신을 투여할 수 있다.
상술한 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명을 제한하는 것으로 취급되어서는 안된다. 본 발명은 후술하는 청구항 및 이에 포함되는 청구항 균등물에 의해 정의된다.
실시예 6
저용량 접종모델에 항체-낭포체( Eimeria acervulina ) 백신 컨쥬게이트의 사용
본 연구에서는 다양한 양의 항체(2.5 내지 150㎕)와 복합된 500개의 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina) 낭포체 백신을 시험하였다. 백신접종하지 않은 대조군 및 항체없이 백신접종한 대조군과 투여군을 비교하였다. 투여군은 모두 부화일에 투여되었다. 투여군 모두에 대해 백신접종 후 4일 내지 8일째의 낭포체 생성을 측정하였다. 또한 저용량의 균접종 후 13일째에서 낭포체 생성을 측정하였다.
시험물질 및 방법 : Hyvac SPF 레그혼종을 사용하여 모체의 항체 효과를 배제하였다. 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina)로 면역시킨 닭으로부터 다중클론항체를 생산하였다. 두 항체제제를 조합하여 최종 역가가 90,782인 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina)항체를 생성시켰다. 투여군 및 실험계획이 [표 4]에 나타나있다.
투여 낭포체 투여량 항체(㎕) 조류 수 /반복군 반복군 수 전체조류 수
1(A,B,C) 0 0 5 3 15
2(A,B,C) 500 0 5 3 15
3(A,B,C) 500 2.5 5 3 15
4(A,B,C) 500 25 5 3 15
5(A,B,C) 500 150 5 3 15
낭포체(USDA #12 Lot 28-131-36)와 적정량의 항체를 혼합하여 백신 복합체를 생성하였다. 투여전에 상기 복합체를 1시간 동안 주위온도에서 항온배양하였다. 부화일에 각 투여량 200㎕를 조류에게 위관을 통해 투여하였다. 투여 후 4일 내지 8일째에 분변을 수집하였다. 분변샘플을 처리하고 McMaster 챔버를 이용하여 조류당낭포체 생성숫자를 세었다.
조류를 인공부화기로 옮기고 부화 후 13일째되는 날에 저용량의 균접종(250E.acervulina낭포체)을 하였다. 접종 후 4내지 8일째에 분변을 수집하고 전술한 바와 같이 숫자를 세었다.
백신접종한 대조군은 조류당 약 12x106개의 낭포체 생성을 보였다. 2.5㎕ 및 25㎕의 항체 투여군에서도 이와 유사한 결과를 보였으나, 150㎕의 항체 투여군에서는 대조군에 대해 46%의 생성을 보여, 낭포체 생성에 대한 저해효과를 갖는 것으로 보인다([도 1] 참조).
저용량 접종 후, 항체 백신접종 투여군 모두에서 유사한 결과를 보였다([도 3] 참조). 항체를 투여한 세 군에서의 평균은 약 대조군의 40%이었다. 백신접종 대조군은 겨우 대조군의 23%에 해당하는 생성율을 보였다.
실시예 7
고용량 접종모델에 항체-낭포체( Eimeria acervulina ) 백신 컨쥬게이트의 사용
항체-낭포체 백신 컨쥬게이트 제제 두가지에 대해 고용량 접종모델에서 시험하였다. 감염성은 낭포체 생성수로서 측정하였고, 접종에 대한 반응성은 체중증가와 장애기록으로서 측정하였다. 상기 백신 컨쥬게이트는, 500개의 에이메리아 아세르불리나와 25㎕ 또는 150㎕의 항체와의 복합체(실시예 6에서 전술함)로 이루어진다; [ 표 5]참조. 조류주, 항체 및 낭포체 롯트는 전술한 실시예 6에서와 동일하다.
투여수 낭포체 투여량 항체(㎕) 조류수/반복군 반복군 수 전체조류 수
1(A,B,C) 0 0 10 3 30
2(A,B,C) 500 0 10 3 30
3(A,B,C) 500 25 10 3 30
4(A,B,C) 500 150 10 3 30
전술한 바대로 백신을 제조하여 부화 후 0일째 되는 날에 200㎕ 투여하였다. 투여 후 4일 내지 8일째에 분변물을 수집하고 숫자를 세었다.
본 실시예에서 측정되는 접종후 변수는 실시예 6에서와는 달랐다. 백신접종 후 13일째에 투여군 모두에 고용량 균접종을 하였고 각 조류마다의 체중증가를 기록하였다. 8일후(백신접종 후 21일째) 조류의 체중을 측정하였고 장애를 기록하였다.
본 실험에서의 낭포체 생성수는 실시예 6과 비교하여 백신접종된 대조군 및 두 항체 투여군에서 모두 낮았는데; 백신접종 대조군(항체는 없음)에서는 낭포체 생성이 20배 감소하였다([도 2] 참조). 이러한 감소의 원인은 명확하지 않다.
투여군 모두에게 균접종을 고용량으로(500 낭포체 접종) 하였고 체중증가 및 장애기록을 조사하였다. 체중증가 결과([도 4])는, 백신접종 대조군 및 비백신접종 대조군을 포함해 투여군간의 차이성을 보이지 않았다. 장애기록 데이터([도 5])는, 비백신접종 대조군에 비하여 백신접종된 모든 군에서 방어성이 있다는 것을 보여주었다.
실시예 8
파스퇴렐라 물토시다( Pasteurella multocida )
파스퇴렐라 물토시다(P. multocida)에 대한 면역혈청 생산 : 청결한 방에서 10마리의 SPF 닭을 부화때부터 사육하였다; 4주때에 각 조류에 0.5㎖의 백신(Solvay's "Pabac")을 투여하였는데, 상기 백신은 상업적으로 판매되는, 혈청형 1, 3 및 4를 포함하는 불활성 파스퇴렐라 물토시다 오일 에멀젼 백신이다; 8주때에는 상기 백신 0.5㎖를 목에 피하주사하였고 다시 0.5㎖를 오른쪽 가슴에 근육주사하였다. 10주때에 심장천자에 의해 각 조류로부터 약 20㎖의 혈액을 채취하였다. 상기 혈액에서 면역혈청을 모아 혼주하고 0.45㎛ 필터를 통해 여과하였다. 각종 멸균시험을 거쳐 모든 시험에서 음성결과를 얻은 후, 상기 면역혈청을 다양한 크기의 바이알에 담아 -20℃ 냉장고에서 투여전까지 보관하였다.
파스퇴렐라 물토시다(P. multocida)의 Cu 및 M9 균주의 분리 및 역가결정: 파스퇴렐라 물토시다 Cu 및 M9 균주를 바이오뮨(Biomune)에 의해 생산된 생백신 콜레라뮨(Choleramune) Cu 및 멀티뮨(Multimune) M으로부터 각각 성장시켰다. 상기 파스퇴렐라 물토시다 균주들은 90%의 배양균과 10%의 글리세롤 혼합물 상태로 -70℃에서 가장 잘 냉동된다는 것을 알았다.
실시예 9
파스퇴렐라 물토시다로 18일째에 접종된 난(卵)의 부화력
본 실험은, 파스퇴렐라 물토시다 Cu 및 M9 균주의 다양한 수의 콜로니 형성 단위(CFUs, colony forming units)가 항온배양 18일째에 난내부 접종에 따른 SPF 난의 부화력에 미치는 영향을 평가하기 위한 것이다. 각 파스퇴렐라 물토시다 균주를 인산염-완충 식염수(PBS)로 희석하여 세 개의 희석균주를 만들었는데; 0.1㎖당1000CFUs; 0.1㎖당 100CFUs; 및 0.1㎖당 10CFUs이다. 항온배양 18일째에 상기 각 균주에 대한 각 희석액을 0.1㎖씩 14개의 SPF 난에 접종하였다. 13개의 난은 BHI(Brain Heart Infusion Broth), PBS 및 글리세롤(운반체 대조군)로 된 혼합액 0.1㎖를 접종하였고, 13개의 난은 전혀 접종하지 않았다.
[표 6]의 결과는, 2군 내지 7군에서 SPF 난의 부화력이 심하게 떨어진 것을 보여준다.
18일째 파스퇴렐라 물토시다(P. multocida) 접종 후의 SPF 난의 부화력
1군BHI,PBS글리세롤 2군Cu,1000CFUs 3군Cu,100CFUs 4군Cu,10CFUs 5군M9,1000CFUs 6군M9100CFUs 7군M9,10CFUs 8군접종안함
정상부화 12 3 1 11
비-부화 1 14 14 11 14 14 13 2
부화% 92 0 0 21 0 0 7 85
적정수의 CFUs를 포함하는 배양균/PBS 혼합액 0.1㎖로 각 접종란을 접종시켰다. 각 균주에 대하여 1x102CFUs/㎖를 포함하는 희석액의 역가를 결정하였고, 상기 역가는 목표치와 다소 차이가 있었다. 4군은 실제로 10.5CFUs/난을 포함하고, 3군은 105CFUs/난을 포함하며, 2군은 1050CFUs/난을 포함한다. 7군은 12.5CFUs/난을 포함하고 6군은 125CFUs/난을 포함하며 5군은 1250CFUs/난을 포함한다. 1군은 0.1㎖의 BHI/PBS/글리세롤 혼합액으로 접종하였다.
실시예 10
닭 면역혈청과 복합된 후 파스퇴렐라 물토시다( P. multocida )의 콜로니 성장
1㎖의 닭 파스퇴렐라 물토시다 면역혈청(실시예 8 참조)을 -20℃에서 꺼내실온에서 해동시켰다. 계속하여 상기 혈청을 PBS에서 2배로 희석시켰다. 각 혈청 희석액 0.5㎖를, 100CFUs/0.5㎖를 포함하는 파스퇴렐라 물토시다 Cu주 배양액 0.5㎖와 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간이 경과한 후, 각 혈청희석액 혼합물 0.5㎖를 2개의 TSA 플레이트에 도포하고, 200CFUs/㎖의 파스퇴렐라 물토시다 Cu 균주를 3개의 플레이트에 도포하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 24시간 및 48시간 후에 콜로니 숫자를 세었다. 그 결과가 [표 7] 및 [표 8]에 나타나있다.
혈청 희석 24시간CFUs/0.5㎖ 평균 CFUs/1.0㎖ CFUs예상치*혼합물 48시간 동안 혼합물 1.0㎖당CFU총수의 변화
1:16 114 + 96 = 105 x 2 = 210 152 변화 없음
1:32 72 + 75 = 73.5 x 2 = 147 152 변화 없음
1:64 92 + 86 = 89 x 2 = 178 152 변화 없음
1:128 98 + 71 = 84.5 x 2 = 169 152 변화 없음
1:256 81 + 92 = 86.5 x 2 = 173 152 변화 없음
1:512 64 + 80 = 72 x 2 = 144 152 변화 없음
1:1024 63 + 101 = 82 x 2 = 164 152 변화 없음
1:2048 73 + 73 = 73 x 2 = 146 152 변화 없음
1:4096 68 + 81 = 74.5 x 2 = 149 152 변화 없음
1:8192 60 + 61 = 60.5 x 2 = 121 152 변화 없음
1:16384 42 + 61 = 51.5 x 2 = 103 152 + 1 콜로니
1:32768 56 + 59 = 57.5 x 2= 115 152 변화 없음
* [표 8] 역가로부터 계산된, 혼합물 1㎖중의 CFUs 예상치.
파스퇴렐라 물토시다 Cu 균주의 2x102보존용액의 역가
CFU/0.5㎖ 평균 1.0㎖당
176131150 152 x 2 = 304
혼합물이 모두 제조된 후에, [표 8]의 보존용액 샘플을 도포하였다. 상기 용액을 따로 더 방치하지 않았다. 상기 보존용액 0.5㎖와 면역혈청 0.5㎖를 혼합하여기대했던 152CFUs/㎖ 혼합물을 얻었다.
결과를 보면([표 7]) 희석도가 가장 낮은 면역혈청에서 희석도가 가장 높은 면역혈청으로 갈수록 세균 CFUs수가 감소하였다. 이것은 반응시간 때문일 수 있다. 희석도가 가장 높은 면역혈청은 희석도가 가장 낮은 면역혈청에 비해 생배양균과 더 오랜시간 반응(20 내지 30분 더 오래 반응)시켰다. 반응시간의 연장으로 인해 더 많은 수의 콜로니가 소멸되었을 것이다. 보존용액을 반복해서 교반(3 내지 4CFUs/㎖)시킨 것 역시 콜로니 숫자의 감소에 영향을 미쳤을 것이다. 다음 실시예에서 이러한 동향을 더욱 상세히 조사하였다.
실시예 11
본 실험에서는 파스퇴렐라 물토시다(P. multocida) Cu주 콜로니와 [표 6]의 동일한 파스퇴렐라 물토시다 면역혈청 희석액들간의 반응성을 조사하였다. 상기 파스퇴렐라 물토시다 Cu주의 2x102보존용액을 계속해서 간헐적으로 교반(vortexing)시키는 대신 피펫을 이용하여 서서히 혼합시켰다. 각각의 항체-균 복합체를 형성시키기 위하여, 1㎖의 면역혈청 희석액과 1㎖의 스탁배양액 희석액을 혼합하였다. 이 혼합물을 4시간 동안 방치함으로써 반응이 일어나도록 하였다. 상기 보존용액을 3개의 TSA 플레이트에 도포시켰고, 186CFU/㎖가 함유되어 있다는 것을 알았다. 상기 용액의 잔여분 역시 실온에서 4시간 동안 방치하였다.
4시간의 반응시간이 경과한 후, 각각의 항체-균 혼합액 0.5㎖를 혼합하여 2개의 TSA상에 도포시켰다. 186CFU/㎖ 저장용액을 혼합하여 3개의 TSA 상에 도포(각플레이트당 0.5㎖씩)시켰다. 37℃에서 24시간 동안 항온배양시킨 후 콜로니 수를 계산하였고 다시 96시간 항온배양 시킨 후 콜로니 수를 계산하였다. 그 결과가 [표 9] 및 [표 10]에 나타나있다.
2x102CFUs/㎖ 파스퇴렐라 물토시다 균주 Cu의 최종 보존용액이 역가
샘플 1㎖를 혈청에 부가한 직후 실온에서 4시간동안 방치한 후
CFU/0.5㎖ 평균 1㎖당 CFU/0.5㎖ 평균 1㎖당
93 93 186 39
47 44.7 89
48
혈청 희석 24시간CFUs/0.5㎖ 평균 CFUs/1.0㎖ CFUs예상치* 96시간
1:16 114 + 92 103 206 93 변화 없음
1:32 79 + 73 76 152 93 변화 없음
1:64 50 + 48 49 98 93 변화 없음
1:128 58 + 69 63.5 127 93 변화 없음
1:256 52 + 67 59.5 119 93 변화 없음
1:512 72 + 63 67.5 135 93 변화 없음
1:1024 55 + 63 59 118 93 변화 없음
1:2048 55 + 62 58.5 117 93 변화 없음
1:4096 51 + 53 52 104 93 변화 없음
1:8192 28 + 34 31 64 93 변화 없음
1:16384 20 + 26 23 46 93 변화 없음
1:32768 24 + 20 22 44 93 변화 없음
[표 10]의 데이터를 보면, 좀 더 단정적이긴 하지만 앞의 실시예에서 보았던 것과 마찬가지로 희석도가 증가함에 따라 콜로니수가 감소하는 것을 알 수 있다. 1:16 희석 혼합액에서부터 1:4096 희석 혼합액까지는 예상치보다 CFUs/㎖가 더 높게 나타난다. [표 7]의 데이터에서도 이와 유사한 결과를 보였다. [표 9]의 콜로니수를 보면, 혈청이 없는 경우 CFUs는 PBS중에서 시간이 경과함에 따라 소멸되는 것을 알 수있다. 이에 의해, 상기 양 연구에 있어서 1:8192 희석액에서 1:32768희석액까지의 콜로니수가 예상치보다 적은 것을 설명할 수 있다. 면역혈청은 희석도가 가장 낮은 혼합물에서는 성장촉진효과를 보이는 반면 희석도가 보다 높은 혼합물에서는 어느 정도 성장저해력을 보이는 것 같다. 다음 실시예에서는 이러한 관찰사실에 대한 가능성이 있는 원인을 조사하였다.
실시예 12
파스퇴렐라 물토시다(P. multocida) 면역혈청 및 음성혈청(파스퇴렐라 물토시다 항체를 포함하지 않는 닭혈청)이 파스퇴렐라 물토시다(P. multocida) M9 균주의 성장에 미치는 영향과, 실시예 11에서 제조한 혈청희석액 및 파스퇴렐라 물토시다 배양균 희석액이 미치는 영향을 시험관내 실험으로 비교하였다. 1㎖당 139CFUs를 함유하는 배양액 ([표 6])1㎖와 희석혈청 1㎖를 혼합하였다. 세 개의 음성혈청 희석액(1:16, 1:512 및 1:32768)을 제조하여 적정량의 세균 배양액과 혼합하였다. 상기 세균배양액/혈청희석액 혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 혈청항체-세균 혼합물을 2개의 TSA 플레이트상에 도포(0.5㎖씩)시켰고, 상기 음성혈청 세균 혼합물을 1시간동안 반응시킨 다음 3개의 TSA 플레이트상에 도포시켰다. 상기 파스퇴렐라 물토시다 M9 균주 보존용액 1.0㎖를 모든 면역혈청 및 음성혈청 희석액에 부가하고 다시 실온에서 1시간 동안 방치시킨 다음에, 3개의 TSA상에 도포시켰다. 37℃에서 24시간 동안 항온배양한 후 콜로니수를 세었고, 48시간 동안 항온배양한 후 콜로니수의 변화를 기록하였다. 그 결과가 [표 11] 및 [표 12]에 나타나있다.
2x102CFUs/㎖ 파스퇴렐라 물토시다 균주 Cu의 최종 보존용액의 역가
샘플 1㎖를 혈청에 부가한 직후 실온에서 1시간동안 방치한 후
CFU/0.5㎖ 평균 1㎖당 CFU/0.5㎖ 평균 1㎖당
6876 69.3 138.664 61
63 64.3 128.6
69
* [표 11]의 역가로부터 계산한 1㎖중의 CFUs 예상수.
37℃에서 48시간 동안 항온배양한 후의 콜로니 숫자에는 변화가 없었다.
실시예 10 내지 12의 데이터를 보면 파스퇴렐라 물토시드 면역혈청의 희석도가 증가함에 따라 CFUs수가 초기에는 증가하다가 점차 감소하는 것을 알 수 있다. 상기 데이터들을 조합해보면, 두 파스퇴렐라 물토시드 균주는 실제로 혈청을 성장배지로 이용하는 것을 알 수 있다. 혈청농도가 감소하는 만큼 파스퇴렐라 물토시드의 성장 역시 감소한다. 몇몇 결과들은, 파스퇴렐라 물토시드를 PBS중에서 희석하거나 실온에서 1시간 내지 4시간 동안 방치하는 경우에 파스퇴렐라 물토시드가 사멸하는 것을 시사한다. 이러한 사실은 1:8191 희석액에서 1:32769 희석액에 이르기까지 CFUs수가 예상치보다 적은 이유를 설명해준다. 혈청의 농도가 희박해짐에 따라 PBS의 농도는 증가한다. 본 실시예에서, 1시간 동안의 방치 전후에 있어서 보존용액의 콜로니수에는 별로 큰 차이가 없으나 희석도가 보다 높은 경우에는 여전히 낮은 콜로니수를 보인다.
파스퇴렐라 물토시드에 대한 항체를 함유하지 않는 혈청혼합물에 있어서의 콜로니 숫자를 파스퇴렐라 물토시드 항체를 함유하는 대응 혈청혼합물 및 보존용액에서의 콜로니 숫자와 비교해 보면, 파스퇴렐라 물토시드 항체를 포함하는 면역혈청이 어느 정도 콜로니 성장억제 효과를 갖는 것을 알 수 있다. 파스퇴렐라 물토시드 면역혈청이 없는 샘플에서의 CFU 숫자는 처음에는 높으나 점차 감소해간다. 그러나, 1시간 후의 보존용액에서의 CFU 숫자와 비교하여 기대되는 수치보다 낮아지지는 않는다. CFU 숫자는, 파스퇴렐라 물토시드를 포함하는 3분의 2의 샘플에 있어서 파스퇴렐라 물토시드를 함유하지 않는 음성혈청 샘플에서보다 더 낮다. 파스퇴렐라 물토시드 면역혈청의 성장억제효과는 다른 인자의 존재에 의해 가려지는 것 같다.
실시예 13
파스퇴렐라 물토시드 면역혈청-파스퇴렐라 물토시드 CFUs를 항온배양 18일째에 주입한 난의 부화력
본 실험은, SPF 난에 혈청항체-세균 복합체를 난내부(in-ovo) 투여하는 경우의 효과를 시험하기 위한 것이다. 동일한 CFU수의 파스퇴렐라 물토시드 M9 균주를 다양한 양의 파스퇴렐라 물토시드 면역혈청과 혼합한 다음, 상기 혼합물을 각각 0.1㎖씩 7개군 각군에 15개의 SPF 난에 접종시켰다. 100 CFUs/㎖ 보존용액은 파스퇴렐라 물토시드 균주 M9 배양액을 사용하여 준비하였다. 각각의 난에 동일 숫자의 CFU가 접종되도록 하기위해, 적정량의 혈청과 보존용액을 5분 간격으로 혼합하여 각 군을 위해 준비하였다. 상기 혼합물들을 실온에서 30분간 방치한 다음, 항온배양 18일째에 각군의 15개의 난에 접종하였다. 최종 군혼합물을 제조한 후에 그리고 다시 상기 최종 군혼합물을 30분 동안 반응시킨 후에, 100 CFUs/㎖ 보존용액을 3개의 플레이트에 도포하였다.([표 13]). 상기 플레이트를 모두 37℃에서 24시간 동안 항온배양시킨 다음 콜로니수를 세었다. 각 군에 대한 부화력 결과가 [표 14]에 나타나있다.
1x102파스퇴렐라 물토시다 균주 M9 보존용액의 역가
CFUs/0.5㎖ 평균 1㎖당
30분 방치 전 382830 32 64
30분 방치 후 303027 29 58
파스퇴렐라 물토시다 면역혈청 및 파스퇴렐라 물토시다 균주 M9의 CFU를 함유하는 혼합물 1㎖를 항온배양 18일째 SPF 난에 접종시킨 경우의 부화력효과
1군혈청없음+ 3.2CFUs 2군혈청0.1㎕ + 3.2CFUs 3군혈청1.0㎕ + 3.2CFUs 4군혈청10.0㎕ + 3.2CFUs 5군혈청25.0㎕ + 3.2CFUs 6군혈청50.0㎕ + 3.2CFUs 7군혈청50.0㎕+PBS50.0㎕/난
정상부화 2 1 2 4 15
부화(사멸)
부화(임상영향) 1 3 3 3 5
비-부화 14 13 11 12 10 6
부화% 6.7 13.3 26.7 20.0 33 60.0 100
본 실험은 처음부터, 파스퇴렐라 물토시다 면역혈청 적정량과 5.0 CFUs 세균혼합물을 각 난에 접종시키기 위해 의도된 것이다. 역가에 관한 [표 13]을 보면, 5보다는 3.2에 가까운 다수의 CFU가 상기 난(卵)들에 접종되었고 30분간의 반응시간의 결과 콜로니 손실은 거의 발생하지 않았다는 것을 알 수 있다. [표 14]의 결과에서는, 파스퇴렐라 물토시다 M9 균주는 항온배양 18일째에 투여되는 경우 소수의 CFU만으로도 SPF 난이 부화되지 못하도록 하는 것을 알 수 있다. 대조군인 7군에서는 100%의 부화율을 보였다. 다른 군에서는 부화에 심한 영향을 받았다. 다른 군들중 5군과 6군이 그 다음으로 높은 부화율을 보였다. 6군에서는, 파스퇴렐라 물토시다 면역혈청의 비율(50㎕+3.2CFUs)이 가장 높게 접종되었고 총 부화율은 60%이고 이중 정상부화율은 27%이었다. 이러한 동향의 결과는, 파스퇴렐라 물토시다 면역혈청이 생균과 조합되는 경우 세균의 병원성 감소시키거나 또는 지연시킴으로써 닭의 배(胚)를 어느정도 보호한다는 점을 시사한다.
[표 12] 및 [표 14]의 데이터에서 파스퇴렐라 물토시다 항체를 함유한 또는 함유하지 않은 혈청 및 다양한 양의 혈청항체를 비교해보면, 파스퇴렐라 물토시다 혈청항체는 유기체의 성장에 대해 저해효과를 미칠 수 있고 어쩌면 세균의 병원성 효과에 대해서도 저해효과를 미칠 수 있다는 것을 알 수 있다. [표 14]에서, 가장 고용량의 항체를 투여받은 군(5군과 6군)이 세균만을 투여받은 군(1군)에 비하여 부화율이 더 높다는 것을 알 수 있었다.
실시예 14
미코플라스마 갈리셉티쿰( M. gallisepticum )의 성장; 초면역혈청 생산
북캐롤라이나주립대학 미코플라스마 연구실 수의학 칼리지로부터 세균 미코플라스마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum)F 배양균을 구입하였다. 상기 미코플라스마 갈리셉티쿰 F 균주는 레이어 산업에 생백신으로서 상업적으로 사용된다. 15%의 돼지혈청이 보충된 프레이 배지(Frey's Media)(FMS) 40㎖에 배양균 1.33㎖를 혼합하였다. 그 다음에 상기 혼합물을 37℃에서 약 18시간 동안 항온배양시킨 후 성장 배양균을 멸균 글리세롤과 80/20으로 혼합하여 -70℃에서 냉동시켰다. 트립티카아제 소이 아가(Trypticase Soy Agar, TSA)를 이용하여 상기 혼합물의 무균성 시험을 하였는데 외부균 성장은 전혀 보이지 않았다. -70℃에서 24시간 경과한 후 미코플라스마 갈리셉티쿰 F 균주의 역가를 결정한 결과 5.8x108CFUs/㎖이었다.
미코플라스마 갈리셉티쿰 면역혈청은 북캐롤라이나주립대학 미코플라스마 연구실로부터 구입하였다. 상기 면역혈청은, 뉴질랜드 흰토끼에 보조제 내에 들어있는 비활성 미코플라스마 갈리셉티쿰 F 균주를 초면역접종시켜 생산한 것이다. 토끼에게 세차례 근육주사 및 피하주사하여 면역시킨 후 혈액을 채취하였다. 상기 면역혈청을 MGA로 명명된다.
실시예 15
미코플라스마 갈리셉티쿰 F 균주에 미치는 MGA의 성장저해 효과
본 실험에서는, 소정량의 미코플라스마 갈리셉티쿰 F 균주와 다양한 양의 MGA를 혼합한 후에 시간 경과에 따른 상기 미코플라스마 갈리셉티쿰 F 균주의 성장을 조사하였다. MGA샘플을 처음에 인산염-완충 식염수(PBS)에서 1:10으로 희석하였다. 그 다음에, 바로 이전 단계에서 희석된 샘플 0.5㎖에 PBS 0.5㎖를 부가함으로써 상기 면역혈청을 더욱 희석하여, 1:2 희석 샘플을 일렬로 10개(1:20에서 1:10240까지) 만들었다. 미코플라스마 갈리셉티쿰 F 스탁배양균 1바이알을 실온에서 해동시킨 다음 1:100으로 희석하였다. 이 10-2보존용액은 5.8x106CFUs/㎖를 포함하였다. 세균-항체 복합체는 0.4㎖의 58x106보존용액을 11개군의 각 MGA 희석액 0.4㎖에 부가하여 만들었다. 이 복합체들을 실온에서 30분간 방치하였다. 투여군 12는 0.4㎖의 PBS와 동일한 세균 보존용액 0.4㎖가 혼합되어 있다.
반응시간 30분이 경과한 후, 12개의 투여군 각각을 FMS 중에서 10-1에서 10-8까지 연속적으로 희석하였다. 희석액이 담긴 상기 시험관을 14일간 항온배양하면서, 41시간, 47.5시간 및 14일째에서 각 성장여부를 측정하였다(FMS중 미코플라스마 갈리셉티쿰의 성장은 색변화로써 검출하였다. 세균이 성장함에 따라 배지의 pH가 감소하며 이것이 pH지시약인 페놀레드를 변색시킨다. 성장에 따라 색이 진한 적색에서 오렌지색으로 변하고 결국에는 황색으로 변한다. 배지색에 기초하여 성장정도를 기록할 수 있다). 그 결과가 [표 15]에 나타나있다.
MgF* = MgF 면역혈청 0.4㎖
0.4㎖ MgF** = 0.4㎖ MgF 2.32x10-6
MgF 존재*** = 희석시험관에서의 MgF 존재(14일 항온배양한 후)
- (성장안함; 진한 적색)
+/- (겨우 성장시작; 대조군에 비해 연한 적색)
+ (약간 성장; 연한 적색)
++ (중정도 성장; 진한 오렌지색)
+++ (중 내지 대량 성장; 연한 오렌지)
++++ (대량 성장; 황색)
14일째에 12개의 투여군 모두에서 성장여부를 검출하였다([표 15]). 1군 내지 4군에서 성장의 지연을 보였는데, 이 군들은 가장 높은 농도의 MGA를 함유하고있다. 이 군들에서의 성장은 낮은 농도의 MGA를 함유하는 그룹들에서만큼 초기에 명백하지 않았다. 이러한 결과는, 높은 농도의 MGA는 세균에 대해 성장저해효과를 갖는다는 사실을 시사하는 것이다.
실시예 16
미코플라스마 갈리셉티쿰의 성장에 미치는 MGA의 성장저해 효과
미코플라스마 갈리셉티쿰 F 1바이알을 해동시켜 FMS중에서 1:100으로 희석하였다. 이 10-2희석액은 대략 5x106CFUs/㎖를 함유한다. 상기 10-2스탁희석용액 1㎖를 완전히 혼합한 다음 8개의 희석시험관에 담았다. 소정량의 MGA를 각 시험관에 부가하여([표 16]참조) 세균/면역혈청 복합체를 혼합시켰다. 이를 실온에서 15분간 항온배양한 후 다시 37℃에서 항온배양하였다. FMS배지에서의 색변화를 지표로 삼아 13일에 걸쳐 성장여부를 검출하였다. 그 결과가 [표 16]에 나타나있다.
MgF 5.0x106CFU/㎖ Mg면역혈청(MGA)의 ㎕ 37℃에서 27시간 경과 후 성장 37℃에서 46시간 경과 후 성장 37℃에서 13일 경과 후 성장
1.0㎖ 혈청 없음 +++ ++++ ++++
1.0㎖ 48 성장안함 성장안함 ++++
1.0㎖ 24 성장안함 성장안함 ++++
1.0㎖ 12 성장안함 성장안함 ++++
1.0㎖ 6 성장암함 + ++++
1.0㎖ 3 성장안함 ++ ++++
1.0㎖ 1.5 성장안함 +++ ++++
1.0㎖ 0.5 ++ ++++ ++++
+ (약간 성장; 연한 적색)
++ (중정도 성장; 진한 오렌지색)
+++ (중 내지 대량 성장; 연한 오렌지색)
++++ (대량 성장; 황색)
면역혈청을 함유하지 않은 시험관에서 항온배양한 처음 27시간동안에, 미코플라스마 갈리셉티큠은 중정도의 성장을 보였고, 37℃에서 46시간 경과한 후에는 상기 시험관에서 대량의 성장을 보였다([표 16]). 1.5㎕정도 또는 그 이상의 MGA를 함유한 시험관에서는 항온배양한 처음 27시간 동안에는 세균 성장이 검출되지 않았다. 항온배양 46시간이 경과한 후에도 12, 24 및 48㎕의 MGA를 함유한 시험관에서는 세균 성장이 검출되지 않았다. 37℃에서 13일이 경과한 후에는 모든 시험관에서 미코플라스마 갈리셉티큠의 대량성장을 보였다. 이러한 결과는, 시험관 모두에 세균은 존재하나 더 많은 양의 면역혈청이 포함된 경우가 더 적은 양의 면역혈청이 포함된 경우보다 더 장시간 세균성장을 지연시킨다는 것을 보여준다. 검출을 위한 성장에 요하는 시간은 세균-면역혈청 복합체에 존재하는 MGA의 양에 직접 비례하는 것으로 보인다.
실시예 17
부화에 미치는 미코플라스마 갈리셉티큠-MGA 복합체의 효과
인공부화 18일째에 9개군의 난을 접종하였다. 상기 군들중 7개군에 서로 다른 7개의 미코플라스마 갈리셉티큠-MGA 복합체중 하나를 접종하였다. 한 군은 세균만을 접종하였고 나머지 한 군은 PBS중에서 1:4로 희석시킨 FMS를 접종하였다.
미코플라스마 갈리셉티큠 F 보존용액 1바이알을 해동시켜 FMS 10%와 PBS 90%로된 희석액중에서 1:5 및 1:10으로 희석시켰다. 상기 희석용액 적정량을 사용하여 세균-MGA 복합체를 형성시켰다. 1군을 제외한 각 난에, 동일수의 미코플라스마 갈리셉티큠 CFU 및 각 군에 적절한 면역혈청량이 포함된 상기 복합체를 0.1㎖씩 투여하였다. 1군에 있는 난에는 FMS/PBS 희석액을 0.1㎖ 투여하였다. 상기 복합체들을 접종 전에 10분간 방치함으로써 반응이 일어나도록 하였다. 그 다음 상기 난들을 부화될 때까지 인공부화하였다.
상기 1:10 세균 희석보존용액을, 10-9까지의 세 개의 연속 희석시리즈를 만듦으로써 역가를 측정하였고 두 희석시리즈의 10-6희석액을 TSA상에 도포하고 37℃에서 항온배양하였다. 세 개의 연속 희석시리즈 시험관 모두에서 미코플라스마 갈리셉티큠의 성장이 관찰되었다. 역가는 8x108CFUs/㎖이었다. 부화력 결과가 [표 17]에 나타나있다.
군 MgF CFUs Mg면역혈청(MGA) 양 부화란 수/주사란 수 건강한 병아리수 /주사란 수
1 0 0 13/14(93%) 12/14(86%)
2 8.0 x 106 40㎕ 10/11(91%) 8/11(73)
3 8.0 x 106 20㎕ 10/10(100%) 8/10(80%)
4 8.0 x 106 10㎕ 6/11(55%) 0/11(0%)
5 8.0 x 106 5㎕ 10/10(100%) 2/10(20%)
6 8.0 x 106 2㎕ 6/11(55%) 1/11(9%0
7 8.0 x 106 0.5㎕ 7/11(64%) 0/11(0%)
8 8.0 x 106 0.05㎕ 8/11(73%) 0/11(0%)
9 8.0 x 106 0 8/14(57%) 0/14(0%)
MGA-미코플라스마 갈리셉티큠 복합체는 부화율과 병아리 건강에 영향을 미쳤다. 부화율 90%를 보인 군은 MGA 대 CFU 비율이 가장 큰 군이었다(4군의 경우는 제외). 건강한 병아리 비율(%)은, 면역혈청 함량이 상대적으로 적은 MGA-세균 복합체를 투여받은 다른 군들 보다도, 2군 및 3군에서 더 높았다. 이러한 결과는, 소정비율의 MGA:세균 복합체가 세균의 병원성 효과를 지연 및/또는 감소시킴으로써 닭의 배(胚) 발육을 보호한다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 18
미코플라스마 갈리셉티큠 F 균주/항체 복합체 백신
16개의 생장가능한 난(卵) 6개군을 항온배양 18일째에 접종시켰다. 18일째에 음성 대조군(6군)에 있는 16개의 난에 0.1㎖의 희석액(1중량부의 FMS와 9중량부의 PBS)을 접종시키고, 다른 난이 들어있지 않은 대형 부화기에서 부화시켰다.
1바이알의 미코플라스마 갈리셉티큠 F 균주 스톡을 실온에서 해동시켜 1:5로 희석(스톡2)시켰다. 스톡2를 적정한 결과 7x107CFUs/㎖를 포함하였다. 그 다음에 스톡2를 0.9㎖씩 분할하여, 0, 5, 10, 20 또는 40㎕의 MGA와 조합하였다. 일단 혼합되면, 상기 세균-MGA 제제를 실온에서 15분간 항온배양시켰다. 이 세균-MGA 복합체를 각 군의 난에 투여량 0.1㎖로 투여하였다. 1군 난들은 세균만 접종시켰다. 그 다음에, 16개의 난으로 된 각 군을 별도의 부화기에 넣고 부화일까지 두었다. MGA-미코플라스마 갈리셉티큠 제제의 CFUs 시험결과가 [표 18]에 나타나있다.
스톡2 희석액의 잔여량은, FMS를 사용하여 10-9까지 별도로 세 개의 연속된 10배 희석액으로 만들었다. 각 연속 희석시험관중 10-4, 10-5및 10-6희석시험관을 FMS 한천배지에 4회 도포하고 37℃에서 9일 동안 배양시켰다.
부화일에 1 내지 5군을 일정처리하였다. 멸균된 면봉으로 정상적이고 건강해보이는 병아리의 후비공(後鼻空)에서 샘플을 채취해 1.8㎖의 FMS가 포함된 시험관에 접종시켜 미코플라스마 갈리셉티쿰의 존재여부를 검출하였다. 병아리를 일정처리한 다음, 각 군의 시험 병아리를 P2 봉쇄실에 두었다. 각 군을 별도의 인공부화기에 넣고 어느 두 군도 서로 접촉되지 않게 하였다.
대조군 6군에 있는 병아리들은 부화가 지연되었고 1군 내지 5군 부화일 후에 일정처리되었다. 10마리의 대조군을 면봉으로 샘플채취하여 미코플라스마 갈리셉티쿰을 검출하였고 별도의 P2 봉쇄실내 인공부화기에 두었다. 21일째 되는 날에, 생존 병아리 모두의 혈액을 채취해 혈청을 수집하고 혈청 플레이트 응집법(Serum Plate Agglutination, SPA) 및 ELISA법을 이용하여 미코플라스마 갈리세쿰에 대한 항체를 검출하였다. 그 결과가 [표 18]에 나타나있다.
군CFUs수/난MGA/난 1*1.4x1060㎕ 23.5x1065㎕ 33.5x10610㎕ 43.5x10620㎕ 53.5x10640㎕ 6CFU없음100㎕희석액
정상부화수 0 0 0 8 12 10
임상영향 부화수 9 7 8 3 2 1
비부화/사멸 7 9 8 5 2 5
부화율(%) 56.25 43.75 50.0 68.75 87.5 68.75
정상부화율(%) 0 0 0 50 75 62.5
병아리 수 0 0 3 9 10 10
3주때 생존병아리수 NA NA 1 2 7 10
MgF 재분리양성수/샘플수 시험안함 3/3 3/3 9/9 9/10 0/10
SPA**양성수/샘플수 NA NA 1/1 2/2 6/7 0/10
평균 ELISA 역가 NA NA 599 643 645 0
* 계산오류로 인해 1군의 난에 1.4x106CFUs를 투여하였다.
** 모든 SPA 양성반응은 0 내지 4 눈금에 기초해 3 이상으로 기록하였고, 가장 반응이 강한 경우를 4로 기록하였다.
면역혈청 없이 세균만 투여된 난(1군)과 저용량의 MGA + 미코플라스마 갈리셉툼이 투여된 두 군(2군 및 3군)에서 부화율이 가장 낮았고, 정상 부화된 닭이 없었다. 대조군(6군)은 부화가 지연되었고 또 예상치보다 부화율이 저조했다. 이는 항온배양 난들이, 2000개의 난을 항온배양하도록 의도된 대형 부화기에서 항온배양되었기 때문일 수 있다. 이러한 부화 문제점에도 불구하고, 10마리의 병아리가 건장하였고 미코플라스마 갈리셉티쿰 분리 시험 및 두 개의 혈청항체 시험에서 음성을 보였다. 4군 및 5군에서는, 1군 내지 3군에 비하여 부화율 및 정상부화율에 있어서 상당히 증가하였음을 보였다. 상기 두군은 고용량의 MGA를 투여받았고, 5군(3.5x106CFU + 40㎕ MGA)은 모든 군중에서 가장 높은 부화율을 보였다. 혈청수집시에 생존해있던 모든 조류들은 건강하였다. SPA시험 및 ELISA법으로 실시한 미코플라스마 갈리셉티쿰에 대한 항체반응을 보면, 미코플라스마 갈리셉티쿰 F 균주 복합체 백신이 3군 내지 5군의 조류에 대해 효능이 있다는 것을 알 수 있다.
5군내의 조류 한 마리는 흥미롭게도, 부화시 미코플라스마 갈리셉티쿰 재분리 시험, SPA시험 및 ELISA에 대해 음성으로 나타났다. 3군 내지 5군에서 시험대상으로 된 다른 모든 조류들은 상기 각 시험에서 양성으로 나타났다. 5군의 한 마리는 전혀 감염되지 않은 것으로 보인다.
실시예 14 내지 18은, 세균:항체 백신 복합체의 유용성을 시험하기 위해 고안되었다. 상기 데이터는, 특이성있는 면역항체(백신균에 특이성을 갖는)를 생균에적정비율로 부가하는 경우에는 세균의 병원성 효과를 감소 또는 지연시켜 병아리 배의 발육을 보호하는 한편 능동 체액성 면역반응으로 증명되는 부화중 면역반응이 일어나도록 하는데도 동시에 효과적이라는 사실을 뒷받침한다.

Claims (37)

  1. 인간을 제외한 투여대상에서 세균 또는 원충 질환에 대한 능동 면역성을 생성시키는 방법에 있어서, 상기 방법이:
    생균 및 생원충으로 구성된 군에서 선택된 생유기체와 상기 생유기체에 결합된 중화인자를 포함하는 백신 컨쥬케이트를 투여대상에 투여하는 단계를 포함하고;
    상기 중화인자는 항체 및 가변영역 결합부위가 보존되어 있는 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 항체 및 항체단편은 상기 생유기체를 중화시킬 수 있으며;
    상기 백신 컨쥬케이트는 투여대상에서 상기 생유기체에 대한 면역반응을 일으키는데 유효한 양만큼 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생유기체는 투여대상에서 질병을 일으킬 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 중화인자가 IgG 면역글로불린 및 가변영역 결합부위가 보존되어 있는 IgG 면역글로불린 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 중화인자가 다중클론 유래물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 생유기체가 조류 원충이고 상기 투여대상이 조류인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 생원충이 에이메리아종(Eimeriaspecies)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 생원충이 에이메리아 테넬라(E. tenella) 또는 에이메리아 아세르불리나(E. acervulina)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 생유기체는 생 미코플라스마인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 미코플라스마가 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 투여대상이 피하투여, 복강내투여 및 근육내투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 백신 컨쥬케이트를 투여받는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 투여대상이 조류이고 상기 투여단계가 난(卵) 내부에서(in ovo) 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 투여대상에서 세균 또는 원충 질환에 대한 능동면역성을 생성시키는데 유용한 백신제제에 있어서, 상기 백신제제가:
    백신 컨쥬케이트를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 제제를 포함하고;
    상기 백신 컨쥬케이트가 생균 및 생원충으로 구성된 군에서 선택된 생유기체와 상기 생유기체에 결합된 중화인자를 포함하고;
    상기 중화인자가 항체 및 가변영역 결합부위가 보존되어 있는 항체단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 항체 또는 항체단편이 상기 생유기체를 중화시킬 수 있으며;
    상기 백신 컨쥬케이트가 투여대상에서 상기 생유기체에 대한 면역반응을 일으키는데 유효한 양만큼 상기 약제학적으로 허용가능한 제제내에 함유되는 것을 특징으로 하는 제제.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 생유기체는 투여대상에서 질병을 일으킬 수 있는 것을 특징으로 하는 제제.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 제제가 동결건조된 것임을 특징으로 하는 제제.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 생유기체가 조류 원충이고 상기 투여대상이 조류인 것을 특징으로 하는 제제.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 생원충이 에이메리아종(Eimeriaspecies)인 것을 특징으로 하는 제제.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 생원충이 에이메리아 테넬라(E. tenella) 또는 에이메리아 아세르불리나(E. acervulina)인 것을 특징으로 하는 제제.
  19. 제 13항에 있어서, 상기 생유기체는 생 미코플라스마인 것을 특징으로 하는 제제.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 미코플라스마가 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum)인 것을 특징으로 하는 제제.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 세균 또는 원충 질환에 대한 능동면역성을 생성시키는데 유용한 백신의 제조방법에 있어서, 상기 제조방법이:
    생균 및 생원충으로 구성된 군에서 선택된 생유기체와 상기 생유기체에 결합된 중화인자를 포함하는 컨쥬게이트를 백신제제내에 조제하는 단계를 포함하고;
    상기 중화인자가 상기 생유기체를 중화시킬 수 있으며, 항체 및 가변영역 결합부위가 보존되어 있는 항체단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 생유기체는 투여대상에서 질병을 일으킬 수 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  30. 제 28항에 있어서, 상기 중화인자가 IgG 면역글로불린 및 가변영역 결합부위가 보존되어 있는 IgG 면역글로불린 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  31. 제 28항에 있어서, 상기 중화인자가 다중클론 유래물질인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  32. 삭제
  33. 제 28항에 있어서, 상기 생유기체가 조류 원충인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 생원충이 에이메리아종(Eimeriaspecies)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 생원충이 에이메리아 테넬라(E. tenella) 또는 에이메리아 아세르불리나(E. acervulina)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  36. 제 28항에 있어서, 상기 생유기체는 생 미코플라스마인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 미코플라스마가 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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