Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití
CZ308106B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Radovan Buffa Tomáš Bobula Petra Šedová Ivana Basarabová Pavlína Procházková Hana Vágnerová Iva Dolečková Soňa Moravčíková Vladimír Velebný
Worldwide applications
Application CZ2016-375A events
2016-06-27
2016-06-27
2018-01-03
2020-01-08
Description
translated from
Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká derivátů polysacharidů, obsahujících ve struktuře heterocyklus s dvojnou vazbou v polohách 4 a 5 podle strukturního vzorce X, polysgcharíd
OH
R pcrfysacharid (X), kde R je skupina -NH-CO-CH3 nebo -OH.
Dále se vynález týká přípravy derivátů podle vzorce X z výchozího polysacharidů obsahujícího strukturní fragment Y, kde samotná modifikace pak může být zjednodušeně popsána následujícím schématem:
polysBcf.i'··.:' θ ’
OH ,O^ ' V oolysachand r\
-O poiysscharid
'^“polysacíiarid (X) (Y) kde R je skupina -NH-CO-CH3 nebo -OH, a R1 je skupina -SO2-ONa, -SO2-OH, nebo -H, přičemž absolutní konfigurace na uhlíku 4 může být R nebo S.
Dále se vynález týká použití těchto nenasycených derivátů, které oproti nativním polysacharidům vykazují zvýšené antioxidační vlastnosti a některé z nich selektivně inhibují růst rakovinových buněk.
Dosavadní stav techniky
Polysacharidy obecného vzorce Y
Polysacharidy mají v organismech širokou škálu funkcí, například stavební, zásobní nebo i regulační. Mezi polymery přirozeně se vyskytující v organismech patří i polysacharidy obecného vzorce Y
R!O pólyššchariď' .OH
O v\ ,-O *R poíysscharid (Y), kde R je skupina CH3-CO-NH- nebo -OH, a R1 je skupina -SO2-ONa, -SO2-OH, nebo -H. Sem patří například chondroitin sulfát, dermatan sulfát, karagenan, keratan sulfát nebo kyselina hyaluronová.
Chondroitin sulfát je lineární, sulfatovaný a negativně-nabitý glykosaminoglykan složený z opakujících se monomemích jednotek /V-acctyl-D-galaktosaminu a D-glukuronové kyseliny vzájemně propojených β(1 —>3) a β(1^4) O-glykosidickými vazbami (strukturní vzorec chondroitin sulfátu viz níže),
kde
R1 je -H nebo -Na,
R2 je -H, -SO2-ONa nebo -SO2-OH.
Zdrojem chondroitin sulfátu jsou živočišné pojivové tkáně, kde se váže na proteiny a tvoří tak součást proteoglykanů. Sulfatace chondroitinu se uskutečňuje pomocí sulfotransferáz v různých polohách a různém zastoupení. Jedinečný vzorec sulfatace jednotlivých poloh v polymemím řetězci kóduje specifickou biologickou aktivitu chondroitin sulfátu. Chondroitin sulfát je důležitým stavebním blokem chrupavky v kloubech, kterým dodává odolnost v tlaku a obnovuje rovnováhu ve složení kloubového maziva (Baeurle S. A. a kol. Polymer 50, 1805, 2009).
Dermatan sulfát je lineární, sulfatovaný a negativně-nabitý glykosaminoglykan složený z opakujících se monomemích jednotek /V-acctyl-D-galaktosaminu a L-iduronové kyseliny vzájemně propojených β(1 —>3) a β(1^·4) O-glykosidickými vazbami (strukturní vzorec dermatan sulfátu viz níže),
kde
R1 je -H nebo -Na,
R2 je -H, -SO2-OH, nebo -SO2-ONa
Dermatan sulfát se od chondroitin sulfátu odlišuje přítomností L-iduronové kyseliny, která je C5 epimerem D-glukuronové kyseliny. Opačná konfigurace iduronové kyseliny umožňuje lepší flexibilitu řetězců dermatan sulfátu a zabezpečuje jejich specifickou glykosaminoglykanproteinovou interakci v okolním prostoru. Tyto interakce přispívají k regulaci vícero buněčných procesů, jako např. migraci, proliferaci, diferenciaci nebo angiogenezi. Proměna chondroitin sulfátu na dermatan sulfát je zabezpečená pomocí tří enzymů, a to dermatan sulfát epimerázy 1 (DS-epil), dermatan sulfát epimerázy 2 (DS-epi2) a dermatan 4-O-sulfotransferázy (D4ST1) (Thelin M„ a kol. FEBS Journal 280, 2431, 2013).
Keratan sulfát patří do skupiny lineárních sulfatovaných polysacharidů obsahující D-galaktózu, /V-acctylglukosamin a galaktóza-6-sulfát spojených vazbami β( 1 —>3) a β( 1 —>4), který se
-2CZ 308106 B6 stavbou a vazbami podobá chondroitin sulfátu. Nachází se v rohovce, chrupavkách, kostech a pojivové tkáni (strukturní vzorec keratan sulfátu viz níže),
HO
OR2 \ ..,-0 -i
OH \ -ta
NHAc kde R2 je -H, -SO2-OH, nebo -SCE-ONa
Karagenany patří do skupiny lineárních sulfatovaných polysacharidů, které se získávají extrakcí z červených mořských řas. Základními stavebnými jednotkami jsou galaktóza a její 3,6-anhydro derivát, které jsou vzájemně propojeny α(1^·3) nebo β( 1 —>4) O-glykosidickými vazbami. Existují tři základní skupiny karagenanů, které se liší ve stupni sulfatace a rozpustnosti ve vodě. Kappa-karagenan má jednu sulfátovou skupinu v dimeru a tvoří tvrdé gely ve vodném prostředí, lota-karagenan obsahuje dva sulfáty a tvoří měkké gely, přičemž lambda-karagenan se třemi sulfáty nevykazuje gelující vlastnosti.
Kyselina hyaluronová je nesulfatovaný glykosaminoglykan, který je složený ze dvou opakujících se jednotek D-glukuronové kyseliny a /V-acctyl-D-glukosaminu.
OH NHAC kde
R1 je H nebo Na.
Molekulová hmotnost nativní kyseliny hyaluronové se pohybuje v rozsahu 5.104 až 5.106g.mol_1. Tento značně hydrofilní polysacharid tvoří součást pojivových tkání, kůže, synoviální tekutiny kloubů, hraje významnou roli v řadě biologických procesů jako je organizace proteoglykanů, hydratace a diferenciace buněk. Vzhledem k tomu, že se jedná o polymer tělu vlastní a tudíž biodegradovatelný, stává se vhodným substrátem pro tkáňové inženýrství, nebo jako nosič biologicky aktivních látek.
Polysacharidy obsahující násobné vazby
Polysacharidy s -C=C- násobnou vazbou, která je součástí sacharidového cyklu, a přitom není umístěná na konci řetězce, jsou velmi vzácné. Z běžných polysacharidů jsou popsány například 5,6-nenasycené deriváty celulózy známe jako celulozény (Vigo T. L. a kol. Polymers for Advanced Technologies, 10, 6, 311-320, 1999), případně jejich 2,3-nenasycené analogy. Postup přípravy 5,6-nenasycených derivátů je založen na eliminační reakci odstupující skupiny v poloze 6 a vodíku v poloze 5 v bazickém prostředí, přičemž produktem je enol ether (-C=C- násobná vazba v konjugaci s heterocyklickým kyslíkem). Příprava 2,3-nenasycených derivátů celulózy, amylózy nebo xylanu (D. Horton a kol. Carbohydrate Research, 40,2,345-352, 1975) vyžaduje kromě přítomnosti odstupujících skupin i redukční činidlo, nej častěji zinek, přičemž produktem je standardní alken (bez konjugace násobné vazby s kyslíkem).
Využití polysacharidů obsahujících násobné vazby
-3CZ 308106 B6
Aplikace jsou převážně zaměřeny na modifikaci -C=C- násobné vazby, která není přímou součástí sacharidového cyklu. Tyto metody jsou postaveny na připojení nové substance na skelet polymeru, kde dochází k zásadní změně struktury čili ke ztrátě nativního charakteru póly sacharidů. V takových případech se násobná vazba běžně používá v polymerizačních (Bellini D. WO96/37519), adičních (Khetan S. a kol. Soft Matter, 5, 1601-1606, 2009) nebo cykloadičních reakcích (Nimmo Ch. M. a kol. Biomacromolecules, 12, 824—830,2011; Bobula, T. a kol. Carbohydrate. Polymers, 125, 153-160, 2015). Tyto způsoby mohou vést jak k efektivnímu síťování polysacharidů (Collins Μ. N. a kol. Carbohydrate Polymers, 92, 12621279, 2013; Hacker M. C. a kol., Inter. J. of Mol. Sc., 16, 27677-706, 2015), tak k selektivnímu vázaní aktivních substancí na polymer (Mero A. a kol. Polymers, 6, 346-369, 2014). Velmi populární je i možnost využít násobní vazby metakrylátové skupiny pro uskutečnění polymerizační reakce (Granstrom M. a kol. EP2899214).
Existuje jenom několik způsobů, jak zavést násobnou -C=C- vazbu přímo do sacharidového cyklu v polymemím řetězci. Jedním z nich je enzymatické štěpení polymerů pomocí lyáz, kde dvojná vazba vzniká na neredukujícím konci polymeru (Kelly S. J. a kol. Glycobiology, 11,4, 294-304, 2001), v tomto případě kyseliny hyaluronové (viz schéma níže).
lyázs
NaOOC
HOOn _,OH
NaOOC íVoi
NHAc
OH .--O .,OH
ŮHAc
To znamená, že zastoupení takové modifikace je silně závislé na molekulové hmotnosti, například při molekulové hmotnosti 4.104 g.rnol-1 je modifikován jeden disacharid ze sta, v případě molekulové hmotnosti 4.105 g.rnol-1 je modifikován jeden disacharid z tisíce. Je tedy zřejmé, že pokud se nejedná o oligomery polysacharidů, je tento typ modifikace pro vyšší molekulové hmotnosti polymerů nepatrný a výsledný vysokomolekulámí polymer se prakticky neliší od výchozího.
Druhý způsob umožňuje zavést dvojnou vazbu do struktury polysacharidů v poloze 4 a 5 po celé délce řetězce, takže lze efektivně modifikovat i polymery s vyšší molekulovou hmotností (Buffa R. a kol. WO2014/023272, Bobula T. a kol. Carbohydrate Polymers, 136, 1002-1009, 2016). Tento způsob však vytváří -C=C- násobnou vazbu, která je v přímé konjugaci se silně elektronakceptomí aldehydickou skupinou. Tato modifikace výrazně mění chemické vlastnosti polysacharidů, protože umožňuje kovalentní vázání poměrně široké škály nukleofilů, nej častěji aminů. Z výše uvedeného také vyplývá, že takhle modifikovaný polymer má citelně vyšší elektrofilní charakter, tudíž se chemicky výrazně liší od nativního polymeru. Lze ho taky považovat za méně aktivní antioxidant v porovnání s nemodifikovaným polymerem.
Tyto nedostatky odstraňuje řešení popsané v tomto vynálezu, kde modifikovaný polymer oproti nemodifikovanému neobsahuje žádnou reaktivní elektrofilní skupinu. Oproti tomu dvojnou vazbu v konjugaci s heterocyklickým kyslíkem lze považovat za seskupení s nukleofilními (antioxidačními) vlastnostmi.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou deriváty polysacharidů obsahující ve své struktuře heterocyklus s dvojnou vazbou v polohách 4 a 5 podle strukturního vzorce X,
-4CZ 308106 B6 χΟΗ \
^OÁ polysachand - C'V' 'polys^charíd
R (X), kde R je skupina -NH-CO-CH3 nebo -OH.
Deriváty mají molekulovou hmotnost v rozmezí 5.103 až 5.105 g.mol-1 a výchozí polysacharidy pro přípravu derivátů podle vynálezu jsou s výhodou vybrány ze skupiny obsahující chondroitin sulfát, karagenan, dermatan sulfát, kyselinu hyaluronovou nebo keratan sulfát.
Dále se vynález týká způsobu přípravy, který je založen na třech krocích (viz schéma níže):
RÝ ,-0H poíysacharíď poíysacherid .oxidace
poíysadiartó'''
poÍysacharid ii S.eliminace i
3.redukce
kde R je skupina -NH-CO-CH3 nebo -OH, a R1 je skupina -SO2-ONa, -SO2-OH nebo -H
1. Oxidace - zavedení aldehydické skupiny do polohy 6 sacharidového cyklu.
Oxidace primární hydroxylové skupiny v poloze 6 na aldehyd. Reakci lze provést například použitím oxidačního systému 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxyl radikálu TEMPO / NaClO ve vodě. Tento krok probíhá s výhodou ve vodě při teplotě 0 až 10 °C, molámí množství NaClO je v rozmezí 0,03 až 0,8 ekv. a molámí množství TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 ekv. vzhledem k opakující se jednotce póly sacharidů. Výchozí póly sacharid může mít molekulovou hmotnost v rozsahu 5.103 až 5.105 g.mol-1 a použije se s výhodou 0,1 až 8 % hmotn. vodný roztok póly sacharidů. Nakonec se do reakční směsi pro ukončení reakce za účelem likvidace zbytků nezreagovaného činidla (chlornanu) může přidat například etanol, thiosíran sodný aj. Alternativně lze oxidaci provést pomocí systému l,l,l-triacetoxy-l,l-dihydro-l,2benziodoxol-3(lH)-onu (DMP) při teplotě 10 až 50 °C v DMSO, kde množství DMP je v rozmezí 0,05 až 2 ekv. vzhledem k opakující se jednotce póly sacharidů.
2. Eliminace -
2a. pokud R1 = -H, dochází k eliminaci vody (dehydratace).
Je možné ji s výhodou uskutečnit ve vodně-organickém prostředí, kde organické rozpouštědlo je mísitelné s vodou a objemový poměr rozpouštědlo/voda je v rozsahu 3/1 až 1/2. S výhodou lze v tomto kroku použít báze například pyridin, triethylamin nebo /V./V-diisopiopylcthylamin, nebo anorganické báze, např. Ca(OH)2. Množství báze v reakci je 0,01 až 20 ekvivalentů, s výhodou 5 až 10 ekvivalentů přepočteno na opakující se jednotku póly sacharidů. Jako organická
-5CZ 308106 B6 rozpouštědla je možné použít aprotická polární rozpouštědla mísitelná s vodou, s výhodou DMSO nebo sulfolan. Oxidace probíhá 0,1 až 12 hod, s výhodou 1 až 4 hod, druhý krok reakce probíhá 12 až 150 hodin, s výhodu 20 až 40 h, při teplotě 30 až 80 °C, s výhodou 50 až 60 °C.
2b. pokud R1 = -SOz-ONa, resp. -SO2-OH, dochází k eliminaci NaO-SO2-Ona, resp. HO-SO2ONa. Pokud je skupina -OR1 v poloze 4 cyklu v antiperiplanámí pozici k vodíku v poloze 5, probíhá eliminace spontánně bez nutnosti přídavku bází a bez nutnosti navýšení reakční teploty. Doba trvání reakce kroku 1 + 2b je 0,1 až 12 hod, s výhodou 1 až 4 hod. Pokud není skupina OR1 v poloze 4 sacharidového cyklu v antiperiplanámí pozici k vodíku v poloze 5, k efektivní eliminaci lze použít i postup popsaný v části 2a.
3. Redukce - aldehydická skupina je selektivně redukovaná s borohydridy, s výhodou s NaBH4 za vzniku primárního alkoholu -CH2-OH se zachováním násobné vazby v poloze 4 a 5 sacharidového cyklu. Ačkoli by odborník očekával kromě redukce aldehydické skupiny -CHO (resp. geminálního diolu -CH(OH)2) i redukci -C=C- vazby, překvapivě k redukci dvojné vazby —C—C— při způsobu podle vynálezu nedochází. Množství redukčního činidla může být v rozsahu 0,1 až 10 ekvivalentů přepočteno na opakující se jednotku polysacharidů, s výhodou 0,3 až 2 ekvivalentů. Reakci lze provést ve vodě při teplotě 5 až 40 °C při pH 5 až 10, s výhodou při teplotě 15 až 25 °C a pH 6 až 8 v čase 1 až 24 h. Výchozí roztok aldehydu polysacharidů má s výhodou koncentraci 0,1 až 8 % hmotn.
Z uvedeného vyplývá, že pro přípravu derivátů polysacharidů podle způsobu chráněného tímto vynálezem je nezbytné, aby vstupní polysacharid obsahoval strukturu Y, _ 1Λ OH
R O ,z '\.Λ
Γ.Ο.Λ ..--.-A ,Ιθ'·. , . .
poiysachand'U '--v--- -polysachanc (Y) která zahrnuje (1^-3) propojený sacharidový cyklus, dále primární -CH2-OH skupinu v poloze 6 a -OH, -SO2-OH nebo -SO2-ONa skupinu v poloze 4. Skupina v poloze 2 není klíčová pro úspěšný průběh dané modifikace, pro většinu polysacharidů je R = -OH nebo -NH-CO-CH3.
Dále se vynález týká způsobu použití derivátů polysacharidů obecného vzorce X. Jak už bylo zmíněno výše, řešení popsané v tomto vynálezu nabízí nové typy derivátů polysacharidů se zvýšenou nukleofilicitou (antioxidačními vlastnostmi), přitom jenom s nepatrnou změnou primární struktury polysacharidů způsobenou eliminací vodíku z polohy 5 a skupiny -OH, -OSO2-OH nebo -O-SO2-ONa z polohy 4. Antioxidační schopnosti těchto nových derivátů byly prokázány standardním stanovením s 2,2-difenyl-l-pikrylhydrazyl radikálem, kde byl zjištěn významný rozdíl mezi nenasycenými deriváty polysacharidů připravenými podle vynálezu a nasycenými (nemodifikovanými) analogy. Proto lze deriváty podle vynálezu použít například pro přípravu materiálů s antioxidačním účinkem.
Dále bylo zjištěno, že pokud je polysacharidem kyselina hyaluronová, lze nenasycený derivát použít pro přípravu materiálů s antirakovinovým účinkem. Biologické vlastnosti připravených derivátů byly testovány na několika liniích rakovinových buněk, kde byla ve všech případech pozorována snížená viabilita, přičemž růst standardních fibroblastů nebyl potlačen v celém rozsahu testovaných koncentrací.
Termín polysacharid znamená polysacharid obsahující strukturní jednotku Y, jako například kyselinu hyaluronovou, karagenan, dermatan sulfát, keratan sulfát nebo chondroitin sulfát nebo jejich farmaceuticky přijatelnou sůl.
-6CZ 308106 B6
Termín farmaceuticky přijatelná sůl znamená soli, jež jsou bezpečné a účinné pro in vivo použití a mají požadovanou biologickou aktivitu. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují s výhodou ionty alkalických kovů nebo iontů kovů alkalických zemin, výhodněji Na+, K+, Mg+ nebo Li+.
Realizace řešení popsaného v tomto vynálezu není technologicky komplikovaná a nevyžaduje použití drahých chemikálií, rozpouštědel nebo izolačních postupů.
Objasnění výkresů
Obr. 1 - vliv ΔΗΑ připraveného podle Příkladu 25 na viabilitu buněk
Graf zobrazuje průběh inhibice růstu karcinogenních buněk MDA-MB-231 - prsní adenokarcinom, A-549 - plicní adenokarcinom, HEP-G2 - hepatocelulámí karcinom v porovnání s inhibicí NHDF - primárních lidských kožních fibroblastů
Postup je popsán v příkladu 27.
Obr. 2 - antioxidační vlastnosti materiálů AHA a ACS v porovnání s nemodifikovanými polysacharidy HA, CS a standardem Trolox - 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2karboxylová kyselina
HA - kyselina hyaluronová
AHA - kyselina hyaluronová dehydratovaná v poloze 4 a 5 (Příklad 22)
CS - chondroitin sulfát
ACS - chondroitin sulfát dehydratovaný v poloze 4 a 5 (Přiklad 2) testováno pomocí 2,2-difenyl-l-pikrylhydrazylu (DTTH) postupem popsaným v příkladu 23
T-test statistické významnosti - * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001
Příklady uskutečnění vynalezu
DS = stupeň substituce = 100 % * (molámí množství modifikované jednotky polysacharidů) / (molámí množství opakujících se jednotek polysacharidů)
Zde používaný výraz ekvivalent (ekv) se vztahuje na opakující se jednotku příslušného polysacharidů, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.
Molekulová hmotnost výchozích polysacharidů je hmotnostně střední stanovená pomocí metody SECMALLS.
Příklad 1
Oxidace a eliminace chondroitin sulfátu (CS) = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu CS
Do dvouprocentního vodného roztoku CS (200 mg, Mw = 4.104 g.mol-1) vychlazeného na 5 °C s obsahem hydrogenfosfátu sodného dodekahydrátu (2,2 ekv), bromidu sodného (0,8 ekv) a 4AcNH-TEMPO (0,01 ekv.) se postupně přidával vodný roztok chlornanu sodného (0,8 ekv, 11%
-7CZ 308106 B6 aktivního chloru). Směs se míchala 2 h při teplotě 5 °C. Následně byl k reakci přidán etanol (10 ekv) a reakce byla míchána další hodinu při laboratorní teplotě. Produkt byl izolován srážením s IPA a analyzován pomocí NMR.
DS = 23 % (stanoveno z NMR)
Příklad 2
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu CS = Příprava ACS
Byl připraven 2% w/v roztok α,β-nenasyceného aldehydu CS (200 mg, 0,5 mmol) v destilované vodě, roztok byl vychlazen na 5 °C a následně byly k němu přidány 2 ekvivalenty borohydridu sodného. Reakční směs byla míchána 4 h při 5 °C. Produkt byl izolován srážením s izopropanolem a analyzován pomocí NMR,
DS = 25 % (stanoveno z NMR), Mw = 2.104 g.mol-1 (stanoveno SECMALLS)
Spektrální analýza ACS: NMR 'H (500 MHz, D2O, δ ppm): 2,02 a 2,04 (3H; Ac-NH-; bs); 4,03 (2H; H6; bs); 4,22 (1H; H2; bs); 4,26 (1H; H3; bs); 5,06 (1H; Hl; bs); 5,18 (1H; H4; bs); NMR ’H-’H COSY (D2O); krospíky; δ ppm: 4,22-5,06; 4,26-5,18; NMR ’H-13C HSQC (D2O); krospíky; δ ppm: 4,03-61,0; 4,22-50,5; 4,26-73,4; 5,06-98,3; 5,18-98,9; NMR DOSY (D2O); log D ((2,02 and 2,04; Ac-NH-); (4,03; H6); (4,22; H2); (4,26; H3); (5,06; H4); (5,18; Hl)) ~ 10,4 m2s_1; log D (4,72; H2O) ~ -8;6 mV1; IR (KBr; cm1): 1660 (v -C=C- st);
Příklad 3
Oxidace a eliminace dermatan sulfátu (DeS) = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu DeS
Do dvouprocentního vodného roztoku DeS (200 mg, 0,42 mmol) vychlazeného na 5 °C s obsahem hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu (2,2 ekv), bromidu sodného (0,8 ekv) a 4-AcNH-TEMPO (0,01 ekv) se postupně přidával vodný roztok chlornanu sodného (0,8 ekv, 11% aktivního chloru), směs se míchala 2 h při teplotě 5 °C. Následně byl k reakci přidán etanol (10 ekv) a reakce byla míchána další hodinu při laboratorní teplotě. Produkt byl izolován srážením s IPA a analyzován pomocí NMR.
DS = 20 % (stanoveno z NMR)
Příklad 4
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu dermatan sulfátu = Příprava ADeS
Byl připraven 2% w/v roztok α,β-nenasyceného aldehydu DeS (200 mg, 0,5 mmol) v destilované vodě. Roztok byl vychlazen na 5 °C a následně byl k němu přidán borohydrid sodný (2 ekvivalenty na disacharid DeS). Reakční směs byla míchána 4 h při 5 °C. Produkt byl izolován srážením s izopropanolem a analyzován pomocí NMR.
DS = 23 % (stanoveno z NMR)
Spektrální analýza ADeS: NMR 'H (500 MHz, D2O, δ ppm): 2,01 (3H, Ac-ΝΗ-, bs), 5,05 (1H, Hl,bs), 5,17 (1H, Hl,bs).
-8CZ 308106 B6
Příklad 5
Oxidace a eliminace karagenanu (KA) = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu KA
Do jednoprocentního vodného roztoku KA (200 mg, 0,31 mmol) vychlazeného na 10 °G s obsahem hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu (2,2 ekv), bromidu sodného (0,8 ekv) a 4-AcNH-TEMPO (0,01 ekv) se postupně přidával vodný roztok chlornanu sodného (0,8 ekv, 11% aktivního chloru). Směs se míchala 2 h při teplotě 10 °C. Následně byl k reakci přidán etanol (10 ekv) a reakce byla míchána další hodinu při laboratorní teplotě. Produkt byl izolován srážením s IPA a analyzován pomocí NMR.
DS = 10 % (stanoveno z NMR)
Příklad 6
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu karagenanu = Příprava ΔΚΑ
Byl připraven 2% w/v roztok α,β-nenasyceného aldehydu KA (200 mg, 0,5 mmol) v destilované vodě. Roztok byl vychlazen na 5 °C a následně byl k němu přidán borohydrid sodný (2 ekvivalenty na disacharid KA). Reakční směs byla míchána 4 h při 5 °C. Produkt byl izolován srážením s izopropanolem a analyzován pomocí NMR.
DS = 13 % (stanoveno z NMR)
NMR Ή (500 MHz, D2O, δ ppm): 5,07 (IH, Hl, bs), 5,18 (IH, Hl, bs),
Příklad 7
Oxidace keratan sulfátu (KS) = Příprava KS-aldehydu
Do jednoprocentního vodného roztoku KS (1 g, 2.104 g.mol-1) s obsahem NaCl 1%, KBr 1%), TEMPO (0,01 ekv) a NaHCO; (20 ekv), se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,3 ekv) pod dusíkem. Směs se míchala 24 h při teplotě 0 °C, pak se přidal 0,1 g tiosulfátu sodného a směs byla míchaná ještě 10 minut. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3) třikrát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě sedmkrát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 3 % (stanoveno z NMR)
Příklad 8
Eliminace KS-aldehydu = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu KS
Do tříprocentního roztoku KS-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=3 %, příklad 7) ve vodě se přidalo 6,7 ml DMSO a báze DIPEA (5 ekv). Směs se míchala 72 h při teplotě 60 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 2 % (stanoveno z NMR),
Ή NMR (D2O) δ 9,22 ( s, IH, CH=G), 6,32 (m, IH, -CW=C-CH=O)
Příklad 9
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu KS = Příprava AKS
-9CZ 308106 B6
Do 2% roztoku α,β-nenasyceného aldehydu KS (200 mg, Příklad 8) v destilované vodě, byl přidán borohydrid sodný (2 ekv) při 5 °C. Reakční směs byla míchána 3 h při 5 °C pak srážena s izopropanolem a analyzována pomocí NMR.
DS = 2 % (stanoveno z NMR)
Ή NMR (D2O) 5,05 (1H, Hl, bs), 5,17 (1H, H4, bs)
Příklad 10
Oxidace kyseliny hyaluronové (HA) = Příprava HA-aldehydu
Do jednoprocentního vodného roztoku HA (1 g, 2.105 g.mol-1), s obsahem NaCl 1%, KBr 1%), TEMPO (0,01 ekv.) a NaHCOs (20 ekv), se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,5 ekv) pod dusíkem. Směs se míchala 12 h při teplotě 0 °C, pak se přidal 0,5 ml etanolu a směs byla míchaná ještě 1 hodinu. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1 % NaCl, 0,1% NaHCOs) třikrát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě sedmkrát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 10 % (stanoveno z NMR)
Příklad 11
Oxidace HA = Příprava HA-aldehydu
Do jednoprocentního vodného roztoku HA (1 g, 2.105 g.mol-1), s obsahem NaCl 1%, KBr 1%), N-acetylamino-TEMPO (0,01 ekv) a NaHCOs (20 ekv), se postupně přidával vodný roztok NaClO (0, ekv) pod dusíkem. Směs se míchala 12 h při teplotě 10 °C, pak se přidal 0,1 ml etanolu a směs byla míchaná ještě 1 hodinu. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCCh) třikrát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě sedmkrát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 9 % (stanoveno z NMR)
Příklad 12
Oxidace HA = Příprava HA-aldehydu
Do jednoprocentního vodného roztoku HA (1 g, 2.105 g.mol-1), s obsahem NaCl 1%, KBr 1%), TEMPO (0,2 ekv) a NaHCOs (10 ekv), se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,3 ekv) pod dusíkem. Směs se míchala 48 h při teplotě 5 °C, pak se přidal 0,1 ml etanolu a směs byla míchaná ještě 1 hodinu. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1 % NaHCOs) třikrát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě sedmkrát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 5 % (stanoveno z NMR)
Příklad 13
Oxidace kyseliny hyaluronová (HA) = Příprava HA-aldehydu
Do jednoprocentního vodného roztoku hyaluronanu (1 g, 2.105 g.mol-1), s obsahem NaCl 1%, KBr 1%), TEMPO (0,01 ekv) a NaHCOs (20 ekv), se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,7 ekv) pod dusíkem. Směs se míchala 0,5 h při teplotě 0 °C, pak se přidal 0,1 ml etanolu a směs byla míchaná ještě 1 hodinu. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a
- 10CZ 308106 B6 dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCCh) třikrát 5 litrů (Ix denně) a oproti destilované vodě sedmkrát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 9 % (stanoveno z NMR)
Příklad 14
Oxidace kyseliny hyaluronová (HA) = Příprava HA-aldehydu
Do jednoprocentního vodného roztoku HA (1 g, 2.105 g.mol-1), s obsahem NaCl 1%, KBr 1%), TEMPO (0,01 ekv) a NaHCO; (20 ekv), se postupně přidával vodný roztok NaClO (0,5 ekv) pod dusíkem. Směs se míchala 12 h při teplotě 0 °C, pak se přidal 0,1 ml etanolu a směs byla míchaná ještě 1 hodinu. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1% NaCl, 0,1% NaHCOs) třikrát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě sedmkrát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 10 % (stanoveno z NMR)
Příklad 15
Oxidace kyseliny hyaluronová (HA) = Příprava HA-aldehydu
Do jednoprocentního roztoku kyselé formy hyaluronanu (1 g, 1.105 g.mol-1), v bezvodém DMSO, se pňdal 1,2 ekvivalentu l,l,l-triacetoxy-l,l-dihydro-l,2-benziodoxol-3(lH)-onu (Dess-Martin Periodinan) a směs se míchala 5 h při teplotě 20 °C. Výsledný roztok pak byl zředěn destilovanou vodou na 0,2% a dialyzován oproti směsi (0,1 % NaCl, 0,1% NaHCO3) třikrát 5 litrů (1 x denně) a oproti destilované vodě sedmkrát 5 litrů (2 x denně). Výsledný roztok byl pak odpařen a analyzován.
DS 40 % (stanoveno z NMR)
Příklad 16
Eliminace HA-aldehydu = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu HA
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=40 %, příklad 15) ve vodě se přidalo 6,7 ml DMSO a báze DIPEA (5 ekv). Směs se míchala 72 h při teplotě 60 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 20 % (stanoveno z NMR),
Ή NMR (D2O) δ 9,24 (s, 1H, CH=O, 6,32 (m, 1H, -CH=C-CH=O)
UV-Vis (D2O) 252 nm, π-π* přechod α,β-nenasycený aldehyd
Příklad 17
Eliminace HA-aldehydu = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu HA
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10%, příklad 10) ve vodě se přidalo 6,7 ml DMSO a báze triethylaminu (20 ekv). Směs se míchala 150 h při teplotě 30 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR)
- 11 CZ 308106 B6
Příklad 18
Eliminace HA-aldehydu = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu HA
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 10) ve vodě se přidalo 6,7 ml DMSO a báze pyridinu (0,01 ekv). Směs se míchala 12 h při teplotě 80 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 3 % (stanoveno z NMR),
Příklad 19
Eliminace HA-aldehydu = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu HA
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 10) ve vodě se přidalo 1,7 ml DMSO a báze pyridin (10 ekv). Směs se míchala 48 h při teplotě 60 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 4 % (stanoveno z NMR),
Příklad 20
Eliminace HA-aldehydu = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu HA
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 10) ve vodě se přidalo 10 ml DMSO a báze DIPEA (5 ekv). Směs se míchala 48 h při teplotě 60 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR),
Příklad 21
Eliminace HA-aldehydu = Příprava α,β-nenasyceného aldehydu HA
Do tříprocentního roztoku HA-aldehydu (0,1 g, stupeň oxidace DS=10 %, příklad 10) ve vodě se přidalo 6,7 ml sulfolanu a báze DIPEA (5 ekv). Směs se míchala 72 h při teplotě 50 °C. Výsledný roztok byl pak srážen směsí isopropanol/hexan a tuhý podíl sušen ve vakuu.
DS 5 % (stanoveno z NMR),
Příklad 22
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu HA = Příprava ΔΗΑ
Do 2% roztoku α,β-nenasyceného aldehydu HA (200 mg, Příklad 16) v destilované vodě, byl přidán borohydrid sodný (10 ekv) při 5 °C. Reakční směs byla míchána 1 h při 5 °C, pak srážena s izopropanolem a analyzována pomocí NMR.
DS = 20 % (stanoveno z NMR)
Ή NMR (D2O) 5,06 (1H, Hl, bs), 5,17 (1H, Hl, bs)
- 12 CZ 308106 B6
Příklad 23
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu HA = Příprava AHA
Do 2% roztoku α,β-nenasyceného aldehydu HA (200 mg, Příklad 17) v destilované vodě, byl přidán borohydrid sodný (0,1 ekv) při 5 °C. Reakční směs byla míchána 20 h při 5 °C, pak srážena s izopropanolem a analyzována pomocí NMR,
DS = 4 % (stanoveno z NMR)
Příklad 24
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu HA = Příprava AHA
Do 2% roztoku α,β-nenasyceného aldehydu HA (200 mg, Příklad 17) v destilované vodě, byl přidán borohydrid sodný (1 ekv) při 40 °C. Reakční směs byla míchána 1 h při 40 °C, pak srážena s izopropanolem a analyzována pomocí NMR,
DS = 5 % (stanoveno z NMR)
Příklad 25
Redukce α,β-nenasyceného aldehydu HA = Příprava AHA
Do 2% roztoku α,β-nenasyceného aldehydu HA (200 mg, Příklad 17) v destilované vodě, byl přidán borohydrid sodný (2 ekv) při 20 °C. Reakční směs byla míchána 4 h při 20 °C, pak srážena s izopropanolem a analyzována pomocí NMR,
DS = 5 % (stanoveno z NMR)
Příklad 26
Stanovení antioxidační aktivity (obrázek 2).
Antioxidační aktivita polysacharidů AHA připraveného podle příkladu 22 a ACS připraveného podle příkladu 2, byla stanovená pomocí stabilního volného radikálu 2,2-difenyl-lpikrylhydrazylu (DPPH). Toto stanovení bylo uskutečněno podle literatury (Brand-Williams W. a kol, LWT - Food Science and Technology, 28, 1, 25-30, 1995) s malou modifikací. Stručně, 100 pl 0,01% roztoku DPPH v metanolu bylo přidáno do 100 μΐ testované substance rozpuštěné v 50 mM Tris pH 7,1. Pokles absorbance byl měřen po 15 min při 515 nm. Trolox (6-Hydroxy2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina) byl použit jako pozitivní kontrola. Data byla měřena třemi nezávislými experimenty. Pro analýzu statistické významnosti byla data vyhodnocena T-testem * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 (obrázek 2).
Příklad 27
Testování cytotoxicity derivátů připravených podle příkladu 25 (obrázek 1)
Bylo porovnáváno cytotoxické působení derivátu HA na nenádorových buňkách - primárních lidských kožních fibroblastech (NHDF) a dále na nádorových liniích prsního karcinomu (MDAMB-231), plicního karcinomu (A-549) a hepatocelulámího karcinomu (HEP-G2). Pro experimenty byly buňky kultivovány za standardních podmínek (37 °C, 5% CCE) v příslušném médiu (10% FBS - fetální bovinní sérum). Při dosažení 80% konfluence byly buňky zpasážované, spočítané pomocí automatického počítadla ČASY TT, Roche a nasazené na 96jamkové panely v hustotě 5000 buněk na jamku v 200 μΐ média. Po 24 hodinách bylo médium
- 13 CZ 308106 B6 vyměněno za roztoky testovaných látek v koncentracích 1000, 500, 100 a 10 pg/ml 10% média.
V čase 24, 48 a 72 hodin po ovlivnění byla měřena viabilita buněk pomocí MTT testu - do každé jamky bylo přidáno 20 pl roztoku MTT (5 mg/ml), následovala 2,5 hodinová inkubace, po které byly buňky lyžovány solubilizačním roztokem (IPA:DMSO 1:1 s 10% Triton X-100 a 9,9% 37% HC1) po dobu 30 minut. Následně se měřila absorbance na přístroji Microplate reader VERSAmax při vlnové délce 570 run a 690 run (korekce pozadí). Viabilita ovlivněných buněk byla při vyhodnocení vztažena k neovlivněné kontrole, která na obrázku 1 odpovídá nulové hodnotě. Hodnoty vyšší, než nula značí aktivaci buněk (žádný cytotoxický efekt derivátů) a naopak hodnoty nižší, než nula ukazují na sníženou viabilitu buněk - tedy cytotoxický efekt derivátů. V případě NHDF je z obrázku č. 1 zřejmé, že testovaný derivát nepůsobil cytotoxický.
V případě nádorových linií (MDA-MB-231, A-549, HEP-G2) byl zaznamenán cytotoxický efekt derivátů. Na základě výsledků uvedených testů lze vyvodit potenciální protinádorový účinek derivátu (Obrázek 1).
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (14)
Hide Dependent
translated from
Claims (14)
Hide Dependent
translated from
1. Nenasycené deriváty polysacharidů obsahující ve struktuře minimálně jeden heterocyklus s dvojnou vazbou v polohách 4 a 5 podle strukturního vzorce X, .OH (X), kde R je skupina -NH-CO-CH3 nebo -OH a kde póly sacharidy jsou vybrány ze skupiny sestávající z chondroitin sulfátu, karagenanu, dermatan sulfátu, kyseliny hyaluronové nebo keratan sulfátu.
2. Deriváty polysacharidů podle nároku 1, kde molekulová hmotnost derivátů je v rozmezí 5.103 až 5.104 5 g.mol-1.
3. Způsob přípravy derivátů polysacharidů definovaných v nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se výchozí polysacharid obsahující fragment Y
(Y) kde R je skupina -NH-CO-CH3 nebo -OH, a R1 je skupina -SO2-ONa, -SO2-OH nebo -H, v prvém kroku oxiduje na aldehyd v poloze 6, v druhém kroku se eliminuje v polohách 4 a 5 cyklu za vzniku dvojné vazby a ve třetím kroku se selektivně redukuje aldehydická skupina -CHO v poloze 6 na skupinu -CH2OH při současném zachování dvojné vazby v polohách 4 a 5 cyklu.
4. Způsob přípravy podle nároku 3, vyznačující se tím, že výchozím polysacharidem je chondroitin sulfát, karagenan, dermatan sulfát, kyselina hyaluronová nebo keratan sulfát.
- 14CZ 308106 B6
5. Způsob přípravy podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že oxidace v pozici C-6 v prvém kroku probíhá buď pomocí systému 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxyl radikálu neboli TEMPO-radikálu, nebo R3-TEMP0/NaC10, kde R3 je vodík nebo skupina N-acetyl, ve vodě při teplotě 0 až 10 °C, kde molámí množství NaClO je v rozmezí 0,3 až 0,8 ekv. a molámí množství R3-TEMPO je v rozmezí 0,005 až 0,2 ekv. vzhledem k opakující se jednotce polysacharidů, nebo pomocí l,l,l-triacetoxy-l,l-dihydro-l,2-benziodoxol-3(lH)-onu (DMP) při teplotě 10 až 50 °C v DMSO, kde množství DMP je v rozmezí 0,05 až 2 ekv. vzhledem k opakující se jednotce polysacharidů.
6. Způsob přípravy podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že výchozím póly sacharidem je kyselina hyaluronová nebo keratan sulfát a že oxidovaný póly sacharid ve druhém kroku podléhá eliminaění reakci ve směsi voda/polámí aprotické rozpouštědlo v přítomnosti báze při teplotě 30 až 80 °C, s výhodou při teplotě 50 až 60 °C.
7. Způsob přípravy podle nároku 6, vyznačující se tím, že množství báze je 0,01 až 20 ekvivalentů, s výhodou 5 až 10 ekvivalentů vzhledem k opakující se jednotce polysacharidů, přičemž báze je vybrána ze skupiny zahrnující organické báze, s výhodou pyridin, triethylamin nebo N-diisopropylethylamin, nebo anorganické báze, s výhodou Ca(OH)2.
8. Způsob přípravy podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že aprotické rozpouštědlo je mísitelné s vodou a zahrnuje s výhodou DMSO nebo sulfolan, a objemový poměr rozpouštědlo/voda je v rozsahu 3/1 až 1/2.
9. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 6 až 8, vyznačující se tím, že druhý krok reakce probíhá po dobu 12 až 150 hodin.
10. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že výchozím polysacharidem je chondroitin sulfát, karagenan nebo dermatan sulfát a že se oxidovaný polysacharid ve druhém kroku spontánně eliminuje přímo v reakční směsi za vzniku α,βnenasyceného aldehydu a spontánní eliminace probíhá při stejných podmínkách, při kterých proběhl první krok oxidace.
11. Způsob přípravy podle kteréhokoliv z nároků 3 až 10, vyznačující se tím, že výchozí polysacharid má molekulovou hmotnost v rozsahu 5.103 až 5.105 g-mol“1.
12. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 3 až 11, vyznačující se tím, že ve třetím kroku se přidá borohydrid sodný v množství 0,1 až 10 ekvivalentů, s výhodou 0,3 až 2 ekvivalentů přepočteno na opakující se jednotku polysacharidů, ve vodě při teplotě 5 až 40 °C, s výhodou při teplotě 15 až 25 °C, při pH v rozmezí 5 až 10, s výhodou 6 až 8.
13. Použití derivátů definovaných v nároku 1 nebo 2 pro přípravu prostředku se zvýšeným antioxidačním účinkem.
14. Použití derivátů definovaných v nároku 2, kde polysacharidem je kyselina hyaluronová, pro přípravu prostředku s antirakovinovým účinkem.