KR20190022717A - 다당류의 불포화 유도체, 그 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피라노스 사이클의 4번 및 5번 위치에 이중 결합을 포함하는 새로운 다당류 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 제조 방법은 6번 위치에 OH 기를 알데하이드로 산화한 다음 제거 반응을 거쳐 4번 및 5번 위치에 이중 결합 -C=C-을 형성하고, 6번 위치의 알데하이드 기를 원래의 알코올 기로 환원하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 제조된 다당류 유도체는 강화된 항산화 활성을 나타내며, 또한 일부 유도체는 종양 세포 생존성에 선택적으로 부정적인 효과를 나타낸다.
Figure pct00014

상기 식에서, R은 -NH-CO-CH3 또는 -OH이다.

Description

다당류의 불포화 유도체, 그 제조 방법 및 용도
본 발명은, 구조식 중에 4번 및 5번 위치에 이중 결합을 가진 헤테로사이클을 포함하는 구조식 X에 따른 다당류 유도체에 관한 것이다.
Figure pct00001
상기 식에서, R은 -NH-CO-CH3 또는 -OH이다.
나아가, 본 발명은 구조식 Y를 포함하는 출발 다당류로부터 식 X의 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 변환 반응 자체가 하기 반응식으로 단순화될 수 있다:
Figure pct00002
상기 식에서, R은 -NH-CO-CH3 또는 -OH이고, R1은 -SO2-ONa, -SO2-OH 또는 -H이며, 4번 탄소 절대 배위는 R 또는 S일 수 있다.
또한, 본 발명은 천연 다당류와 비교해 향상된 항산화성을 나타내고 그중 일부는 암 세포 증식을 선택적으로 저해하는, 불포화 유도체의 용도에 관한 것이다.
일반식 Y 의 다당류
다당류는 유기체에 빌딩 (building), 스톡킹 (stocking) 또는 조절 기능과 같은 다양한 기능을 가진다. 또한, 일반식 Y의 다당류는 유기체에서 천연적으로 생성되는 폴리머에 속한다.
Figure pct00003
상기 식에서, R은 CH3-CO-NH- 또는 -OH이고, R1은 -SO2-ONa, -SO2-OH 또는 -H이다. 이는 예를 들어 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 카라기난, 케라탄 설페이트 또는 히알루론산을 포함한다.
콘드로이틴 설페이트는 N-아세틸-D-갈락토스아민과 D-글루쿠론산이 서로 β(1->3) 및 β(1->4) O-글리코시드 결합에 의해 연결된 단량체 반복 단위들로 구성된, 선형의 황산화된 음전하를 띠는 글리코스아미노글리칸이다 (콘드로이틴 설페이트의 구조식은 하기 참조)
Figure pct00004
상기 식에서,
R1은 -H 또는 -Na이고,
R2는 -H, -SO2-ONa 또는 -SO2-OH이다.
콘드로이틴 설페이트는 단백질이 결합된 동물 결합 조직으로부터 유래되며, 즉 프로테오글리칸의 일부를 형성한다. 콘드로이틴의 황산화는 다양한 위치에서 다양한 타입의 설포트랜스퍼라제를 이용해 이루어진다. 폴리머 체인의 특정 위치에서의 독특한 황산화 패턴은 콘드로이틴 설페이트의 특이적인 생물학적 활성을 코딩한다. 콘드로이틴 설페이트는 관절 내 연골의 중요한 구조 블럭으로서, 압축 강도를 제공하고, 관절 윤활액 조성물의 밸런스를 재개한다 (Baeurle S. A. a kol. Polymer 50, 1805, 2009).
더마탄 설페이트는 N-아세틸-D-갈락토스아민과 L-이두론산이 서로 β(1->3) 및 β(1->4) O-글리코시드 결합에 의해 연결된 단량체 반복 단위로 구성된, 선형의 황산화된 음전하를 띠는 글리코스아미노글리칸이다 (더마탄 설페이트의 구조식은 하기 참조).
Figure pct00005
상기 식에서,
R1은 -H 또는 -Na이고,
R2는 -H, -SO2-OH 또는 -SO2-ONa이다.
더마탄 설페이트는 D-글루쿠론산의 C-5 에피머인 L-이두론산이 존재한다는 점에서 콘드로이틴 설페이트와 차이가 있다. 이두론산의 인버스 배위 (inverse configuration)는 더마탄 설페이트 체인에 보다 우수한 유연성을 부여하고, 주변 환경에서 이의 특이적인 글리코스아미노글리칸-단백질 상호작용을 보장한다. 이러한 상호작용이 이동, 증식, 분화 또는 혈관신생과 같은 여러가지 세포 과정을 조절하는데 기여한다. 콘드로이틴 설페이트에서 더마탄 설페이트의 변환은 3가지 효소, 즉 더마탄 설페이트 에피머라제 1 (DS-epi1), 더마탄 설페이트 에피머라제 2 (DS-epi2) 및 더마탄 4-O-설포트랜스퍼라제 (D4ST1)에 의해 이루어진다 (Thelin M., et al. FEBS Journal 280, 2431, 2013).
케라탄 설페이트는 콘드로이틴 설페이트와 유사한 구조 및 결합을 가지며, β(1->3) 및 β(1->4) 결합으로 연결된 D-갈락토스, N-아세틸글루코사민 및 갈락토스-6-설페이트를 포함하는 선형의 황산화 다당류 그룹에 속한다. 이는 각막, 연골, 뼈 및 결합 조직에서 발견될 수 있다 (케라탄 설페이트의 구조식은 하기 참조).
Figure pct00006
상기 식에서, R2는 -H, -SO2-OH 또는 -SO2-ONa이다.
카라기난은 홍조류 (red marine algae)의 추출에 의해 수득되는 선형의 황산화 다당류 그룹에 속한다. β(1→3) 및 β(1→4) O-글리코시드 결합을 통해 서로 연결된, 갈락토스 및 이의 3,6-무수유도체 (anhydroderivative)가 카라기난의 기본 구성 단위이다. 카라기난에는 황산화 정도와 수용성 차이에 따라 주로 3가지 타입이 존재한다. κ-카나기난은 이량체 당 1개의 설페이트를 가지며, 수중에서 단단한 겔을 형성한다. ι-카나기난은 2개의 설페이트를 포함하며, 소프트 겔을 형성하는 반면, λ-카라기난은 설페이트 3개를 포함하지만 겔 형성 특성은 없다.
히알루론산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민 2개의 반복 단위들로 구성된 비-황산화된 글리코스아미노글리칸이다.
Figure pct00007
상기 식에서, R1은 H 또는 Na이다.
천연 히알루론상의 분자량은 5x104 내지 5x106 g.mol-1 범위이다. 이러한 고 친수성의 다당류는 결합 조직, 피부, 관절 윤활액의 일부이며, 프로테오글리칸 조직화, 세포 수화 (cell hydration) 및 분화와 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 담당한다. 이 폴리머는 신체에서 천연적으로 만들어지며 즉 생분해성이므로, 생물학적 활성 물질의 담체로서 또는 조직 공학 분야에서 기질로서 유용하다.
다중 결합을 가진 다당류
사카라이드 사이클의 일부를 형성하며 체인의 말단에 위치하지 않는 -C=C- 다중 결합을 가진 다당류는 매우 드물다. 일반적인 다당류의 예로, 셀룰로센 (cellulosenes)이라고 하는 셀룰로스의 5,6-불포화 유도체 (Vigo T. L. et al. Polymers for Advanced Technologies, 10, 6, 311-320, 1999) 또는 이의 2,3-불포화 유사체가 있다. 5,6-불포화 유도체의 제조 방법은 염기성 조건 하에 6번 위치의 이탈기와 5번 위치의 수소의 제거 반응을 통해 에놀 에테르 (-C=C- 다중 결합이 헤테로사이클릭 산소와 접합되어 있음)를 제조하는 반응을 토대로 한다. 셀룰로스의 2,3-불포화 유도체, 아밀로스 또는 크실란의 제조시, 표준 알켄을 제조하기 위해, 이탈기의 존재 뿐만 아니라, (다중 결합 및 산소의 접합없이) 환원제, 일반적으로 아연이 필요하다 (D. Horton et al. Carbohydrate Research, 40, 2, 345-352, 1975).
다중 결합을 가진 다당류의 이용
본 출원인은 주로 사카라이드 사이클의 직접적인 일부가 아닌 -C=C- 다중 결합을 변형시키고자 한다. 이 방법은 폴리머 골격에 새로운 물질을 결합시키는 방법을 토대로 하며, 이때 구조는 주요한 방식으로, 즉, 다당류의 본연의 특징들이 소실되는 방식으로 달라진다. 이 경우, 다중 결합이 일반적으로 중합 (Bellini D. WO96/37519), 부가 (Khetan S. et al. Soft Matter, 5, 1601-1606, 2009) 또는 고리부가 반응 (Nimmo Ch. M. et al. Biomacromolecules, 12, 824-830, 2011; Bobula, T. et al. Carbohydrate. Polymers, 125, 153-160, 2015)에 이용된다. 이러한 방법은 다당류의 효과적인 가교 (Collins M. N. et al. Carbohydrate Polymers, 92, 1262-1279, 2013; Hacker M. C. et al., Inter. J. of Mol. Sc., 16, 27677-706, 2015)와, 폴리머에 활성 물질의 선택적인 결합을 유도할 수 있다 (Mero A. et al. Polymers, 6, 346-369, 2014). 메타크릴레이트 기의 다중 결합은 또한 중합 반응을 수행하는데 매우 흔히 사용된다 (Granstrom M. a kol. EP2899214).
폴리머 체인에서 사카라이드 사이클에 -C=C- 다중 결합을 직접 도입하는 방법은 몇가지에 불과하다. 한가지 방법은 리아제에 의해 폴리머를 효소적으로 절단하는 것으로, 이중 결합이 폴리머, 이 경우 히알루론산의 비-환원 말단에 형성된다 (Kelly S. J. a kol. Glycobiology, 11, 4, 294-304, 2001) (하기 반응식 참조).
Figure pct00008
이러한 변형은 분자량에 매우 의존적이라는 것을 의미하며, 예를 들어, 분자량 4.104 g.mol-1의 경우, 이당류 백개 중 단 하나만 변형되며, 만일 분자량이 4.105 g.mol-1이면, 이당류 수천개 중 하나만 변형된다. 즉, 다당류 올리고머를 제외하고는, 이러한 타입의 변형은 소수이며, 실제 출발 고분자량 폴리머와 제조되는 폴리머 간에 차이가 없다.
2번째 방법은 체인의 전장을 따라 4번 및 5번 위치에서 다당류 구조에 이중 결합을 형성하는 방법으로, 고 분자량의 폴리머를 효과적으로 변형시킬 수 있다 (Buffa R. et al. WO2014/023272, Bobula T. et al. Carbohydrate Polymers, 136, 1002-1009, 2016). 그러나, 이 방법의 경우, 다중 결합 -C=C-이 형성되며, 이 결합이 강력한 전자 어셉터 알데하이드 기와 직접 공액된다. 이러한 변형은 매우 다양한 친핵체, 통상적으로 아민 화합물과 공유 결합을 형성할 수 있어, 다당류의 화학적 특성을 현저하게 바꾸게 된다. 이러한 사실은, 또한, 상기한 방식으로 변형된 폴리머가 현저하게 높은 친전자체 특징을 가지게 되며, 즉 천연 폴리머와는 화학적으로 다르다는 것을, 의미한다. 또한, 비-변형된 폴리머와 비교해, 활성도가 낮은 항산화제로서 간주될 수도 있다.
본 발명에 기술된 해법은 이러한 문제들을 해결할 수 있으며, 비-변형된 폴리머와 비교해 변형된 폴리머에 반응성 친전자체 기를 포함하지 않는다. 반면, 헤테로사이클릭 산소와 공액된 이중 결합은 친핵성 (항산화제) 특성을 가진 기로서 간주될 수 있다.
본 발명은 구조식 중에 4번 및 5번 위치에 이중 결합을 가진 헤테로사이클을 포함하는, 구조식 X에 따른 다당류 유도체에 관한 것이다.
Figure pct00009
상기 식에서, R은 -NH-CO-CH3 또는 -OH이다.
상기 유도체의 분자량은 5x103 내지 5x105 g.mol-1 범위이고, 본 발명에 따른 유도체를 제조하기 위한 출발 다당류는 바람직하게는 콘드로이틴 설페이트, 카라기난, 더마탄 설페이트, 히알루론산 또는 케라탄 설페이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.
나아가, 본 발명은 3단계에 기반한 제조 방법 (반응식은 하기 참조)에 관한 것이다:
Figure pct00010
상기 식에서, R은 -NH-CO-CH3 또는 -OH이고, R1은 -SO2-ONa, -SO2-OH 또는 -H이다.
1. 산화 - 사카라이드 사이클의 6번 위치에 알데하이드 기 도입.
6번 위치의 일차 하이드록시 기의 알데하이드로의 산화. 이 반응은, 예를 들어, 수중에 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥실 라디칼 TEMPO / NaClO 산화 시스템을 이용함으로써 수행할 수 있다. 이 단계는, 바람직하게는, 0 내지 10℃의 온도에서, 수중에, 다당류의 반복 단위을 기준으로, 0.03 - 0.8 eq. 몰량의 NaClO 및 0.005 - 0.2 eq. 범위의 몰량의 TEMPO를 사용해 수행된다. 출발 다당류는 5x103 내지 5x105　g.mol-1 범위의 분자량을 가질 수 있으며, 바람직하게는 다당류의 수용액이 사용된다. 마지막으로, 에탄올, 소듐 티오설페이트 등을 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 종료시키고, 남아있는 미-반응 물질 (하이드로클로라이트)을 제거할 수 있다. 다른 방법으로, 산화는 DMSO 중의 10℃ 내지 50℃의 온도에서 1,1,1-트리아세톡시-1,1-다이하이드로-1,2-벤즈요오드옥솔-3(1H)-온 (DMP) 시스템을 사용해 수행될 수 있으며, 이때 DMP의 함량은 다당류의 반복 단위에 대해 0.05 내지 2 eq. 범위이다.
2. 제거 반응
2a. R1 = -H일 경우, 물 제거를 수행한다 (탈수).
이는, 바람직하게는 수성-유기 매질 중에 수행될 수 있으며, 이때 유기 용매는 수-혼화성이며, 용매/물의 부피 비는 3/1 내지 1/2 범위이다. 바람직하게는, 피리딘, 트리에틸아민 또는 N,N-다이이소프로필에틸아민과 같은 염기, 또는 무기 염기, 예를 들어, Ca(OH)2가 이 단계에 사용될 수 있다. 반응에서 염기의 양은 다당류의 반복 단위을 기준으로 0.01 내지 20 eq., 바람직하게는 5 내지 10 eq.이다. 유기 용매로서, 수-혼화성 비양자성 극성 용매, 바람직하게는 DMSO 또는 설폴란이 사용될 수 있다. 산화는 0.1 내지 12시간, 바람직하게는 1 내지 4시간 동안 수행되며; 제2 반응 단계는 12 내지 150시간, 바람직하게는 20 내지 40시간 동안, 30 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 60℃의 온도에서 수행된다.
2b. R1 = -SO2-ONa 또는 SO2-OH일 경우, NaO-SO2-ONa 또는 HO-SO2-ONa 각각의 제거가 수행된다. 사이클의 4번 위치의 -OR1 기는 5번 위치의 수소에 대해 안티 준평면 (antiperiplanar) 포지션이며, 제거는 염기 첨가 및 반응 온도 승온 없이 자발적으로 진행된다. 단계 1 + 2b 반응의 지속 기간은 0.1 내지 12시간, 바람직하게는 1 내지 4시간이다. 사카라이드 사이클의 4번 위치의 -OR1 기는 5번 위치의 수소에 대해 안티 준평면 포지션이 아니며, 효과적인 제거를 위해 파트 2a에 기술된 방법 또한 사용할 수 있다.
3. 환원 - 알데하이드 기는 보로하이드라이드, 바람직하게는 NaBH4를 사용해 선택적으로 환원시켜, 사카라이드 사이클의 4번 및 5번 위치에 다중 결합을 유지하면서 일차 알코올 -CH2-OH를 형성한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, -CHO 알데하이드 기 (또는 제미널 다이올 (geminal diol) -CH(OH)2)의 환원과 더불어 -C=C- 결합의 환원을 예상할 것이지만, 놀랍게도 본 발명에 따른 방법에서는 -C=C- 이중 결합이 환원되지 않는다. 환원제의 양은 다당류의 반복 단위에 대해 0.1 내지 10 당량, 바람직하게는 0.3 내지 2 당량의 범위일 수 있다. 이 반응은 수중에 5 - 40℃, pH 5 - 10, 바람직하게는 15 - 25℃ 및 pH 6 - 8에서 1 - 24시간 동안 수행될 수 있다. 출발 알데하이드 용액의 농도는 바람직하게는 0.1 내지 8 % wt이다.
전술한 측면들에 따르면, 본 발명에 따른 다당류 유도체의 제조 방법은, 출발 다당류에, (1->3) 연결된 사카라이드 사이클, 6번 위치에 일차 -CH2-OH 기, 및 4번 위치에 -OH, -SO2-OH 또는 -SO2-ONa 기를 포함하는, 구조식 Y를 포함하여야 한다는 것을, 의미한다.
Figure pct00011
2번 위치의 기는 소정의 변형을 성공적으로 수행하는데 결정적이지 않으며; 대부분의 다당류의 경우, R은 - OH 또는 -NH-CO-CH3이다.
또한, 본 발명은 일반식 X의 다당류 유도체의 용도에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본원에 기술된 해법은 강화된 친핵성 (항산화성)을 가지며; 동시에 5번 위치의 수소 그리고 4번 위치의 -OH, -O-SO2-OH 또는 -O-SO2-ONa 기의 제거에 의해 발생되는 다당류 일차 구조의 변형이 매우 작은, 새로운 타입의 다당류 유도체를 제공해준다. 이러한 새로운 유도체의 항산화성은 2,2-다이페닐-1-피크릴하이드라질 라디컬을 이용한 표준 측정법에 의해 입증되었으며, 본 발명에 따라 제조된 다당류 불포화 유도체와 포화된 (비-변형된) 유사체 간에 유의한 차이가 관찰되었다. 이로써, 본 발명에 따른 유도체를, 예를 들어, 항산화 효능을 가진 물질을 제조하는데 이용할 수 있다.
또한, 히알루론산이 다당류일 경우, 불포화 유도체를 항암 효과를 가진 물질을 제조하는데 이용할 수 있는 것으로 확인되었다. 제조된 유도체의 생물학적 특성을 수종의 암 세포주에서 테스트하였으며, 전체 사례들에서 생존성 저하가 관찰된 반면, 표준 섬유모 세포의 증식은 테스트한 농도 전체에서 억제되지 않았다.
용어 "다당류"는 구조식 Y를 포함하는 다당류, 예를 들어, 히알루론산, 카라기난, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 생체내 사용하기 안전하고 효과적이며 원하는 생물학적 활성을 가진 염을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 염은, 바람직하게는, 알칼리 금속의 이온 또는 알칼리 토금속의 이온, 더 바람직하게는 Na+, K+, Mg+ 또는 Li+을 포함한다.
본원에 기술된 해법을 구현하는 것은 기술적으로 복잡하지 않으며, 고가의 화학제, 용매 또는 단리 공정이 필요없다.
도 1 - 실시예 25에 따라 제조된 ΔHA의 세포 생존성 효과
본 실험은, NHDF - 일차 인간 진피 섬유모세포의 증식 저해 대비과 비교하여, 암 세포 MDA-MB-231 - 유방 선암종, A-549 - 폐 선암종, HEP-G2 - 간세포암의 증식 저해를 보여준다.
공정은 실시예 27에 기술된다.
도 2 - 비-변형된 다당류 HA, CS 및 표준 - Trolox - 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복시산 대비, ΔHA 및 ΔCS 물질의 항산화성
HA - 히알루론산
ΔHA - 4번 및 5번 위치에서 탈수된 히알루론산 (실시예 22)
CS - 콘드로이틴 설페이트
ΔCS - 4번 및 5번 위치에서 탈수된 콘드로이틴 설페이트 (실시예 2)
실시예 23에 기술된 공정에 따라 2,2-다이페닐-1-피크릴하이드라질 (DTTH)을 이용해 테스트함.
통계학적 유의성 t-검정 - * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001
본 발명의 바람직한 구현예
DS = 치환도 = 100 % * (변형된 사카라이드 단위의 몰량) / (다당류 반복 단위의 몰량)
본원에서, 용어 당량 (eq.)은, 달리 언급되지 않은 한, 특정 다당류의 반복 단위에 대한 것이다. %는 달리 언급되지 않은 한 중량%로 특정된다.
출발 다당류의 분자량은 SECMALLS 방법에 의해 측정한 중량 평균 분자량이다.
실시예 1
콘드로이틴 설페이트 (CS)의 산화 및 제거 = α,β-불포화 CS 알데하이드의 제조
소듐 하이포클로라이트 용액 (0.8 eq., 활성 염소 11%)을, 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물 (2.2 eq.), 소듐 브로마이드 (0.8 eq.) 및 4-AcNH-TEMPO (0.01 eq.)가 함유된 5℃로 냉각된 2% CS 수용액 (200 mg, Mw = 4.104 g.mol-1)에 점진적으로 첨가하였다. 혼합물을 5℃ 온도에서 2시간 교반하였다. 그런 후, 에탄올 (10 eq.)을 반응에 첨가하고, 반응물을 다시 실온에서 1시간 교반하였다. 생성물을 IPA를 이용한 석출로 분리하고, NMR로 분석하였다.
DS = 23% (NMR에 의한 측정시)
실시예 2
α,β-불포화 CS 알데하이드의 환원 = ΔCS 제조
증류수 중의 α,β-불포화 CS 알데하이드 (200 mg, 0.5 mmol) 2% w/v 용액을 제조하고, 이 용액을 5℃로 냉각시킨 다음 소듐 보로하이드라이드 2 당량을 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 4시간 교반하였다. 생성물을 IPA를 이용한 석출로 분리하고, NMR로 분석하였다.
DS = 25% (NMR에 의한 측정시), Mw = 2.104 g.mol-1 (SECMALLS에 의한 측정시)
ΔCS의 스펙트럼 분석: NMR 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 2.02 및 2.04 (3H; Ac-NH-; bs); 4.03 (2H; H6; bs); 4.22 (1H; H2; bs); 4.26 (1H; H3; bs); 5.06 (1H; H1; bs); 5.18 (1H; H4; bs); NMR 1H-1H COSY (D2O); 크로스 피크; δ ppm: 4.22-5.06; 4.26-5.18; NMR 1H-13C HSQC (D2O); 크로스 피크; δ ppm: 4.03-61.0; 4.22-50.5; 4.26-73.4; 5.06-98.3; 5.18-98.9; NMR DOSY (D2O); log D ((2.02 and 2.04; Ac-NH-); (4.03; H6); (4.22; H2); (4.26; H3); (5.06; H4); (5.18; H1)) ~ -10.4 m2s-1; log D (4.72; H2O) ~ -8;6 m2s-1; IR (KBr; cm-1): 1660 (υ-C=C- st).
실시예 3
더마탄 설페이트 (DeS)의 산화 및 제거 = α,β-불포화 DeS 알데하이드의 제조
소듐 하이포클로라이트의 수용액 (0.8 eq., 활성 염소 11%)을, 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물 (2.2 eq.), 소듐 브로마이드 (0.8 eq.) 및 4-AcNH-TEMPO (0.01 eq.)가 함유된 5℃로 냉각된 2% DeS 수용액 (200 mg, 0.42 mmol)에 점진적으로 첨가하였다. 혼합물을 5℃ 온도에서 2시간 교반하였다. 그런 후, 에탄올 (10 eq.)을 반응에 첨가하고, 반응물을 다시 실온에서 1시간 교반하였다. 생성물을 IPA를 이용한 석출로 분리하고, NMR로 분석하였다.
DS = 20% (NMR에 의한 측정시)
실시예 4
α,β-불포화 더마탄 설페이트 알데하이드의 환원 = ΔDeS의 제조
증류수 중의 α,β-불포화 DeS 알데하이드 (200 mg, 0.5 mmol) 2% w/v 용액을 제조하고, 이 용액을 5℃로 냉각시킨 다음 소듐 보로하이드라이드 (DeS 이당류 당 2 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 4시간 교반하였다. 생성물을 IPA를 이용한 석출로 분리하고, NMR로 분석하였다.
DS = 23% (NMR에 의한 측정시)
ΔDeS의 스펙트럼 분석: NMR 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 2.01 (3H, Ac-NH-, bs), 5.05 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H1, bs).
실시예 5
카라기난 (KA)의 산화 및 제거 = α,β-불포화 KA 알데하이드의 제조
소듐 하이포클로라이트의 수용액 (0.8 eq., 활성 염소 11%)을, 다이-소듐 하이드로겐 포스페이트 도데카수화물 (2.2 eq.), 소듐 브로마이드 (0.8 eq.) 및 4-AcNH-TEMPO (0.01 eq.)가 함유된 10℃로 냉각된 1% KA 수용액 (200 mg, 0.31 mmol)에 점진적으로 첨가하였다. 혼합물을 10℃ 온도에서 2시간 교반하였다. 그런 후, 에탄올 (10 eq.)을 반응에 첨가하고, 반응물을 다시 실온에서 1시간 교반하였다. 생성물을 IPA를 이용한 석출로 분리하고, NMR로 분석하였다.
DS = 10% (NMR에 의한 측정시)
실시예 6
α,β-불포화 카라기난 알데하이드의 환원 = ΔKA의 제조
증류수 중의 α,β-불포화 KA 알데하이드 (200 mg, 0.5 mmol) 2% w/v 용액을 제조하고, 이 용액을 5℃로 냉각시킨 다음 소듐 보로하이드라이드 (KA 이당류 당 2 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 4시간 교반하였다. 생성물을 IPA를 이용한 석출로 분리하고, NMR로 분석하였다.
DS = 13% (NMR에 의한 측정시)
NMR 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5.07 (1H, H1, bs), 5.18 (1H, H1, bs),
실시예 7
케라탄 설페이트 (KS)의 산화 = KS-알데하이드 제조
NaClO (0.3 eq.)의 수용액을, 질소 하에, NaCl 1%, KBr 1%, TEMPO (0,01 eq.) 및 NaHCO3 (20 eq.)가 포함된 KS 1% 수용액 (1 g, 2.104 g.mol-1)에 점진적으로 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 24시간 교반한 다음 소듐 티오설페이트 0.1 g을 첨가하고, 혼합물을 10분 더 교반하였다. 제조된 용액을 증류수로 0.2%로 희석하고, (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 혼합물 5 L에서 3회 (1일 1회) 투석하고, 다시 증류수 5 L에서 7회 (1일 2회) 투석하였다. 수득되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.
DS 3% (NMR에 의한 측정시)
실시예 8
KS-알데하이드의 제거 = α,β-불포화 KS 알데하이드 제조
DMSO 6.7 ml 및 DIPEA 염기 (5 eq.)를 수중 3% KS-알데하이드 용액 (0.1 g, DS의 산화도 = 3 %, 실시예 7)에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 72시간 교반하였다. 그런 후, 수득한 용액을 이소프로판올/헥산 혼합물에 의해 석출시킨 다음 고체를 진공 건조시켰다.
DS 2% (NMR에 의한 측정시),
1H NMR (D2O) δ 9.22 ( s, 1H, -CH=O), 6.32 ( m, 1H, -CH=C-CH=O)
실시예 9
α,β-불포화 KS 알데하이드의 환원 = ΔKS 제조
소듐 보로하이드라이드 (2 eq.)를 수중 α,β-불포화 KS 알데하이드 2% 용액 (200 mg, 실시예 8)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 3시간 교반한 다음 이소프로판올로 석출하고 NMR로 분석하였다.
DS = 2% (NMR에 의한 측정시)
1H NMR (D2O) 5.05 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H4, bs)
실시예 10
히알루론산 (HA) 산화 = HA-알데하이드 제조
NaClO 수용액 (0.5 eq.)을 질소 하에 NaCl 1%, KBr 1%, TEMPO (0,01 eq.) 및 NaHCO3 (20 eq.)가 포함된 HA 1% 수용액 (1 g, 2.105 g.mol-1)에 점진적으로 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 12시간 교반한 다음 에탄올 0.5 ml을 첨가하고, 혼합물을 1시간 더 교반하였다. 제조된 용액을 증류수로 0.2%로 희석하고, (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 혼합물 5 L에서 3회 (1일 1회) 투석하고, 다시 증류수 5 L에서 7회 (1일 2회) 투석하였다. 수득되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.
DS 10% (NMR에 의한 측정시)
실시예 11
HA 산화 = HA-알데하이드 제조
NaClO 수용액 (0.5 eq.)을 질소 하에 NaCl 1%, KBr 1%, N-아세틸아미노-TEMPO (0,01 eq.) 및 NaHCO3 (20 eq.)가 포함된 HA 1% 수용액 (1 g, 2.105 g.mol-1)에 점진적으로 첨가하였다. 이 혼합물을 10℃에서 12시간 교반한 다음 에탄올 0.1 ml을 첨가하고, 혼합물을 1시간 더 교반하였다. 제조된 용액을 증류수로 0.2%로 희석하고, (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 혼합물 5 L에서 3회 (1일 1회) 투석하고, 다시 증류수 5 L에서 7회 (1일 2회) 투석하였다. 수득되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.
DS 9% (NMR에 의한 측정시)
실시예 12
HA 산화 = HA-알데하이드 제조
NaClO 수용액 (0.3 eq.)을 질소 하에 NaCl 1%, KBr 1%, TEMPO (0,2 eq.) 및 NaHCO3 (20 eq.)가 포함된 HA 1% 수용액 (1 g, 2.105 g.mol-1)에 점진적으로 첨가하였다. 이 혼합물을 5℃에서 48시간 교반한 다음 에탄올 0.1 ml을 첨가하고, 혼합물을 1시간 더 교반하였다. 제조된 용액을 증류수로 0.2%로 희석하고, (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 혼합물 5 L에서 3회 (1일 1회) 투석하고, 다시 증류수 5 L에서 7회 (1일 2회) 투석하였다. 수득되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.
DS 5% (NMR에 의한 측정시)
실시예 13
히알루론산 (HA) 산화 = HA-알데하이드 제조
NaClO 수용액 (0.7 eq.)을 질소 하에 NaCl 1%, KBr 1%, TEMPO (0,01 eq.) 및 NaHCO3 (20 eq.)가 포함된 HA 1% 수용액 (1 g, 2.105 g.mol-1)에 점진적으로 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 0.5시간 교반한 다음 에탄올 0.1 ml을 첨가하고, 혼합물을 1시간 더 교반하였다. 제조된 용액을 증류수로 0.2%로 희석하고, (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 혼합물 5 L에서 3회 (1일 1회) 투석하고, 다시 증류수 5 L에서 7회 (1일 2회) 투석하였다. 수득되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.
DS 9% (NMR에 의한 측정시)
실시예 14
히알루론산 (HA) 산화 = HA-알데하이드 제조
NaClO 수용액 (0.5 eq.)을 질소 하에 NaCl 1%, KBr 1%, TEMPO (0,01 eq.) 및 NaHCO3 (20 eq.)가 포함된 HA 1% 수용액 (1 g, 2.105 g.mol-1)에 점진적으로 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 12시간 교반한 다음 에탄올 0.1 ml을 첨가하고, 혼합물을 1시간 더 교반하였다. 제조된 용액을 증류수로 0.2%로 희석하고, (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 혼합물 5 L에서 3회 (1일 1회) 투석하고, 다시 증류수 5 L에서 7회 (1일 2회) 투석하였다. 수득되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.
DS 10% (NMR에 의한 측정시)
실시예 15
히알루론산 (HA) 산화 = HA-알데하이드 제조
1,1,1-트리아세톡시-1,1-다이하이드로-1,2-벤즈요오드옥솔-3(1H)-온 (Dess-Martin Periodinan) 1.2 eq.을, 비-수성 DMSO 중의 히알루론난의 산성 형태의 1% 용액 (1 g, 1.105 g.mol-1)에 첨가하고, 이 혼합물을 20℃에서 5시간 교반하였다. 제조된 용액을 증류수로 0.2%로 희석하고, (0.1% NaCl, 0,1% NaHCO3) 혼합물 5 L에서 3회 (1일 1회) 투석하고, 다시 증류수 5 L에서 7회 (1일 2회) 투석하였다. 수득되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.
DS 40% (NMR에 의한 측정시)
실시예 16
HA-알데하이드의 제거 = α,β-불포화 HA 알데하이드 제조
DMSO 6.7 ml 및 DIPEA 염기 (5 eq.)를 수중 3% HA-알데하이드 용액 (0.1 g, DS의 산화도 = 40 %, 실시예 15)에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 72시간 교반하였다. 그런 후, 수득한 용액을 이소프로판올/헥산 혼합물에 의해 석출시킨 다음 고체를 진공 건조시켰다.
DS 20% (NMR에 의한 측정시),
1H NMR (D2O) δ 9.24 (s, 1H, -CH=O), 6.32 (m, 1H, -CH=C-CH=O)
UV-Vis (D2O) 252 nm, π-π* 트랜지션 α,β-불포화 알데하이드
실시예 17
HA-알데하이드의 제거 = α,β-불포화 HA 알데하이드의 제조
DMSO 6.7 ml 및 트리에틸아민 염기 (20 eq.)를 수중 3% HA-알데하이드 용액 (0.1 g, DS의 산화도 = 10%, 실시예 10)에 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 150시간 교반하였다. 그런 후, 수득한 용액을 이소프로판올/헥산 혼합물에 의해 석출시킨 다음 고체를 진공 건조시켰다.
DS 5% (NMR에 의한 측정시)
실시예 18
HA-알데하이드의 제거 = α,β-불포화 HA 알데하이드 제조
DMSO 6.7 ml 및 피리딘 염기 (0.01 eq.)를 수중 3% HA-알데하이드 용액 (0.1 g, DS의 산화도 = 10%, 실시예 10)에 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 12시간 교반하였다. 그런 후, 수득한 용액을 이소프로판올/헥산 혼합물에 의해 석출시킨 다음 고체를 진공 건조시켰다.
DS 3% (NMR에 의한 측정시)
실시예 19
HA-알데하이드의 제거 = α,β-불포화 HA 알데하이드 제조
DMSO 1.7 ml 및 피리딘 염기 (10 eq.)를 수중 3% HA-알데하이드 용액 (0.1 g, DS의 산화도 = 10%, 실시예 10)에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 48시간 교반하였다. 그런 후, 수득한 용액을 이소프로판올/헥산 혼합물에 의해 석출시킨 다음 고체를 진공 건조시켰다.
DS 4% (NMR에 의한 측정시)
실시예 20
HA-알데하이드의 제거 = α,β-불포화 HA 알데하이드 제조
DMSO 10 ml 및 DIPEA 염기 (5 eq.)를 수중 3% HA-알데하이드 용액 (0.1 g, DS의 산화도 = 10%, 실시예 10)에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 48시간 교반하였다. 그런 후, 수득한 용액을 이소프로판올/헥산 혼합물에 의해 석출시킨 다음 고체를 진공 건조시켰다.
DS 5% (NMR에 의한 측정시)
실시예 21
HA-알데하이드의 제거 = α,β-불포화 HA 알데하이드 제조
설포난 6.7 ml 및 DIPEA 염기 (5 eq.)를 수중 3% HA-알데하이드 용액 (0.1 g, DS의 산화도 = 10%, 실시예 10)에 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 72시간 교반하였다. 그런 후, 수득한 용액을 이소프로판올/헥산 혼합물에 의해 석출시킨 다음 고체를 진공 건조시켰다.
DS 5% (NMR에 의한 측정시)
실시예 22
α,β-불포화 HA 알데하이드의 환원 = ΔHA 제조
소듐 보로하이드라이드 (10 eq.)를 증류수 중의 α,β-불포화 HA 알데하이드 2% 용액 (200 mg, 실시예 16)에 5℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 1시간 교반한 다음 이소프로판올로 석출시키고, NMR로 분석하였다.
DS 20% (NMR에 의한 측정시)
1H NMR (D2O) 5.06 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H1, bs)
실시예 23
α,β-불포화 HA 알데하이드의 환원 = ΔHA 제조
소듐 보로하이드라이드 (0.1 eq.)를 증류수 중의 α,β-불포화 HA 알데하이드 2% 용액 (200 mg, 실시예 17)에 5℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 20시간 교반한 다음 이소프로판올로 석출시키고, NMR로 분석하였다.
DS = 4% (NMR에 의한 측정시)
실시예 24
α,β-불포화 HA 알데하이드의 환원 = ΔHA 제조
소듐 보로하이드라이드 (1 eq.)를 증류수 중의 α,β-불포화 HA 알데하이드 2% 용액 (200 mg, 실시예 17)에 40℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 1시간 교반한 다음 이소프로판올로 석출시키고, NMR로 분석하였다.
DS = 5% (NMR에 의한 측정시)
실시예 25
α,β-불포화 HA 알데하이드의 환원 = ΔHA 제조
소듐 보로하이드라이드 (2 eq.)를 증류수 중의 α,β-불포화 HA 알데하이드 2% 용액 (200 mg, 실시예 17)에 20℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 4시간 교반한 다음 이소프로판올로 석출시키고, NMR로 분석하였다.
DS = 5% (NMR에 의한 측정시)
실시예 26
산화 활성 측정 (도 2)
실시예 22에 따라 제조한 ΔHA 다당류와 실시예 2에 따라 제조한 ΔCS의 항산화 활성을, 안정한 유리 라디칼 2,2-다이페닐-1-피크릴하이드라질 (DPPH)을 이용해 측정하였다. 측정은 약간의 수정을 가하여 문헌 (Brand-Williams W. et al., LWT - Food Science and Technology, 28, 1, 25-30, 1995)에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 간략하게는, 메탄올 중의 0.01% DPPH 용액 100 ㎕를 50 mM Tris pH 7.1에 용해된 테스트 물질 100 ㎕에 첨가하였다. 15분 후 515 nm에서 흡광도 감소가 측정되었다. Trolox (6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복시산)을 양성 대조군으로 사용하였다. 데이타는 3번의 독립적인 실험으로 측정하였다. 통계학적 유의성 평가를 위해 t-검정을 이용하였다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 (도 2).
실시예 27
실시예 25에 따라 제조한 유도체의 세포독성 검사 (도 1)
HA 유도체의 세포독성 효과를 비-암 세포인 일차 인간 진피 섬유모세포 및 유방암 세포주 (MDA-MB-231), 폐암 세포주 (A-549) 및 간세포암 세포주 (HEP-G2)에서 비교하였다. 실험을 위해, 세포를 적절한 배지 (10% FBS - 소 태아 혈청)에서 표준 조건 (37℃, 5% CO2) 하에 배양하였다. 80% 컨플루언시에 도달한 후, 세포를 계대 배양하고, 자동 카운터 CASY TT (Roche)를 사용해 계수하였으며, 96웰 패널에 배지 200 ㎕ 당 세포 5,000개의 밀도로 각 웰에 넣었다. 24시간 후, 10% 배지 중의 1,000; 500; 100; 및 10 ㎍/mL의 농도의 테스트 물질 용액으로 배지를 교체하였다. 처리 후 24, 48 및 72시간에, MTT 검사를 통해 세포 생존성을 측정하였다 - MTT 용액 (5 mg/mL) 20 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음 2.5시간 인큐베이션하고, 가용화 용액 (IPA:DMSO 1:1 s 10% Triton X-100 및 9.9% 37% HCl)을 30분간 처리하여 세포를 세포용해하였다. 그런 후, Microplate reader VERSAmax를 사용해 570 nm 및 690 nm (백그라운드 보정)에서 흡광도를 측정하였다. 도 1에서 0에 해당되는 무처리 대조군과의 상관관계에 의해 테스트 세포의 생존성을 평가하였다. 0 보다 큰 값은 세포 활성화 (유도체의 세포독성 효과가 없음)를 의미하며, 0 보다 낮은 값은 세포 생존성 저하 - 즉, 유도체의 세포독성 효과를 의미한다. NHDF의 경우, 도 1에서 명백한 바와 같이, 테스트한 유도체는 세포독성 효과가 없었다. 암 세포주 (MDA-MB-231, A-549, HEP-G2)에서, 유도체의 세포독성 효과가 관찰되었다. 본 검사 결과를 토대로, 유도체의 잠재적인 항암 효과를 유추할 수 있다 (도 1).

Claims (14)

  1. 구조식 중에 4번 및 5번 위치에 이중 결합을 가진 하나 이상의 헤테로사이클을 포함하는, 구조식 X에 따른 다당류의 불포화 유도체:
    Figure pct00012

    상기 식에서, R은 -NH-CO-CH3 또는 -OH임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유도체는 분자량이 5x103 내지 5x105 g.mol-1 범위이고,
    상기 다당류가 콘드로이틴 설페이트, 카라기난, 더마탄 설페이트, 히알루론산 또는 케라탄 설페이트를 포함하는 군으로부터 선택되는, 다당류의 불포화 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 다당류 유도체의 제조 방법으로서,
    식 Y를 포함하는 출발 다당류에 대해 6번 위치에서 알데하이드로 산화하는 제1 단계;
    사이클의 4번 및 5번 위치에서 제거 (elimination) 반응을 실시하여 이중 결합을 형성하는 제2 단계; 및
    상기 알데하이드 기를 선택적으로 환원하는 제3 단계를 포함하는, 제조 방법:
    Figure pct00013

    상기 식에서, R은 -NH-CO-CH3 또는 -OH이고, R1은 -SO2-ONa, -SO2-OH 또는 -H임.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 출발 다당류가 콘드로이틴 설페이트, 카라기난, 더마탄 설페이트, 히알루론산 또는 케라탄 설페이트인, 제조 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 제1 단계에서, C-6번 위치에서의 산화는,
    R3가 수소 또는 N-아세틸 기인 R3-TEMPO/NaClO 시스템을 이용하여 수중에서 0℃ 내지 10℃의 온도에서 진행되며, 여기서 상기 다당류의 반복 단위에 대해, NaClO의 몰량이 0.3 내지 0.8 eq. 범위이고, R3-TEMPO의 몰량이 0.005 내지 0.2 eq. 범위이거나, 또는
    1,1,1-트리아세톡시-1,1-다이하이드로-1,2-벤즈요오드옥솔-3(1H)-온 (DMP)을 이용하여 DMSO 중에서 10℃ 내지 50℃의 온도에서 진행되며, 여기서 상기 다당류의 반복 단위에 대해 DMP의 함량이 0.05 내지 2 eq. 범위인, 제조 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 출발 다당류가 히알루론산 또는 케라탄 설페이트이고,
    제2 단계에서, 산화된 다당류는 염기의 존재 하에 물/극성 비양자성 용매의 혼합물 중에서 30 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 60℃의 온도에서 제거 반응을 거치는, 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 염기의 함량이 다당류 반복 단위에 대해 0.01 내지 20 eq., 바람직하게는 5 내지 10 eq.이고,
    상기 염기는 피리딘, 트리에틸아민 또는 N,N-다이이소프로필에틸아민과 같은 유기 염기 또는 Ca(OH)2와 같은 무기 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 비양자성 용매가 수-혼화성 (water miscible)이고, 예를 들어 DMSO 또는 설폴란을 포함하며, 용매/물의 부피 비가 3/1 내지 1/2 범위인, 제조 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 반응 단계가 12 내지 150시간 동안 진행되는, 제조 방법.
  10. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 출발 다당류가 콘드로이틴 설페이트, 카라기난 또는 더마탄 설페이트이고,
    산화된 다당류는 제2 단계에서 반응 혼합물 중에서 자발적으로 직접 제거 반응을 거쳐 α,β-불포화 알데하이드가 형성되며,
    자발적인 제거 반응은 염기, 유기 용매의 첨가 없이, 반응 온도 증가 없이 진행되는, 제조 방법.
  11. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 출발 다당류의 분자량이 5x103 내지 5x105　g.mol-1 범위인, 제조 방법.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3 단계에서 소듐 보로하이드라이드가 다당류 반복 단위에 대하여 0.1 내지 10 당량, 바람직하게는 0.3 내지 2 당량의 함량으로 5 내지 40℃, 바람직하게는 15 내지 25℃의 온도에서, pH 5 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 8의 범위에서 수중에 첨가되는, 제조 방법.
  13. 강화된 항산화 효과를 가진 물질의 제조를 위한 제1항 또는 제2항에 따른 다당류 유도체의 용도.
  14. 항암 효과를 가진 물질의 제조를 위한 제2항에 따른 다당류 유도체의 용도로서, 다당류가 히알루론산인 다당류 유도체의 용도.
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