KR20060096981A - 단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체 - Google Patents

단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체 Download PDF

Info

Publication number
KR20060096981A
KR20060096981A KR1020067002900A KR20067002900A KR20060096981A KR 20060096981 A KR20060096981 A KR 20060096981A KR 1020067002900 A KR1020067002900 A KR 1020067002900A KR 20067002900 A KR20067002900 A KR 20067002900A KR 20060096981 A KR20060096981 A KR 20060096981A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
group
sialic acid
reducing
protein
Prior art date
Application number
KR1020067002900A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101113726B1 (ko
Inventor
산자이 자인
피터 라잉
그레고리 그레고리아디스
데일 하워드 렉주크-히스트
이아온니스 파파이오안노우
Original Assignee
리폭센 테크놀로지즈 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 filed Critical 리폭센 테크놀로지즈 리미티드
Publication of KR20060096981A publication Critical patent/KR20060096981A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101113726B1 publication Critical patent/KR101113726B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
    • C07H5/04—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to nitrogen
    • C07H5/06—Aminosugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C07K17/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

유도체는 출발물질, 보통 환원 말단에 터미날 말단을 갖는 시알산을 갖는 폴리사카라이드로 합성되고, 여기서 환원 말단은 알데히드기로 변형된다. 폴리사카라이드가 비-환원 말단에 시알산 유니트를 가질 때, 이것은 예를 들면 히드록실-치환 모이어티에 의해 부동태화된다. 유도체는 예를 들면 아민 또는 히드라진기를 함유하는 치환체와 반응하여 비-가교된 폴리시알산화 화합물을 형성할 수 있다. 기질은 예를 들면, 치료약학적으로 유용한 약물 펩티드 또는 단백질 또는 약물전달 시스템이다.
단백질 유도체, 시알산 유도체, 폴리시알산

Description

단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체{SIALIC ACID DERIVATIVES FOR PROTEIN DERIVATISATION AND CONJUGATION}
본 발명은 적어도 터미날 시알산 유니트를 갖는, 및 바람직하기는 필수적으로 시알산 유니트만으로 이루어진, 환원 터미날 말단에서 기질과 반응하기 위한 알데히드기를 갖는 폴리사카라이드와 같은 화합물의 유도체 및 그들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 유도체들은 다른 반응성 유도체로의 전환 및 펩티드, 단백질, 약물, 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀), 바이러스, 세포, 예를 들면 동물 세포, 미생물, 합성 폴리머 등과 같은 기질을 함유하는 아미노기로의 컨쥬게이션에 유용하다.
폴리시알산(PSA)은 특정 세균성 균주와 포유동물의 특정 세포에 의해 생산된 시알산의 비분지된 폴리머에서 천연적으로 발생한다[Roth et al., 1993]. 이들은 제한된 산 가수분해에 의해 또는 뉴라미니다아제에 의한 소화에 의해, 또는 천연적으로, 세균적으로 유도된 형태의 폴리머의 세분에 의해 n=약 80 이상의 시알산 잔기에서 n=2까지의 여러 중합도로 생산될 수 있다. 다양한 폴리시알산의 조성은, 호모폴리머의 형태, 즉 E. coli 균주 K1의 캡슐형 폴리사카리이드와 그룹-B 수막염구균를 포함하는 알파-2,8-링크된 폴리시알산이도록 변하며, 이것은 신경 세포 점착 분자(N-CAM)의 배아 형태에서도 발견된다. E. coli 균주 K92의 교대 알파-2,8 알파-2,9 폴리시알산과 N. meningitidis의 그룹 C 폴리사카라이드와 같은 헤테로폴리머 형태도 또한 존재한다. 시알산은 N. meningitidis의 그룹 W35 또는 그룹 Y와 같은 시알산 이와의 단량체를 갖는 교대 공폴리머에서도 발견된다. 비록 포유동물에서 폴리시알산에 대한 수용체가 알려져 있지 않지만, 폴리시알산은 병원성 세균에 의한 면역과 보체 시스템의 도피 및 태아 발육중의 미성숙 뉴런의 신경교 흡착성의 조절을 포함하는 중요한 생리학적 기능을 갖는다(여기서 폴리머는 항-흡착 지능을 갖는다)[Muhlenhoff et. al., 1998; Rutishauser, 1989; Troy, 1990, 1992;Cho and Troy, 1994]. E. coli 균주 K1의 알파-2,8-링크된 폴리시알산은 또한 '콜로민산'으로 알려져 있고 본 발명을 예시하기 위해 (다양한 길이로) 사용된다.
세균성 폴리사카라이드 중, 폴리시알산의 알파-2,3-링크된 형태는 (세균 뿐 아니라) 포유동물 폴리머로서의 그의 상태를 반영할 수 있는 (포유동물 개체에서, 비면역성 담체 단백질에 컨쥬게이트된 경우에도 T세포 또는 항체 반응을 끌어내지 않는) 독특한 비-면역성이다. 폴리머의 짧은 형태(최대 n=4)는 세포-표면 당지질에서 발견되며, 이것은 신체에 널리 분포되어 있고, 폴리시알산에 면역성 내성을 효과적으로 부여하고 유지시킨다고 믿어진다. 최근, 시알산의 생리학적 특성, 특히 알파-2,8-링크된 호모폴리머성 폴리시알산의 생리적 특성들이 단백질 및 저분자량 약물분자들의 약물동태학적 특성을 변화시키기 위해 개발되어왔다[Gregoriadis, 2001; Jain et al., 2003; US-A-5846,951: WO-A-0187922]. 폴리시알산 유도는 카탈라아제와 아스파라기나아제를 포함한 수많은 치료약학적 단백질의 순환반감기에 극 적인 개선을 가져왔고[Fernandes and Gregoriadis, 1996 및 1997], 또한 이와 같은 단백질이 치료약학적 단백질에 노출되기 전에 원하지 않는(그리고 때때로 필연적인) 결과로서 발생하는 선-존재 항체에도 불구하고 사용되도록 한다[Fernandes and Gregoriadis, 2001]. 여러가지 면에서, 폴리시알산화된 단백질의 변형된 특성은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 유래된 단백질과 비교할 수 있다. 예를 들면, 각각의 경우, 반감기가 증가되고, 단백질과 펩티드는 단백질성 소화에 더욱 안정하지만, 생리학적 활성의 유지는 PEG에서 보다 PSA에서 더 크다고 보여진다[Hreczuk-Hirst et. al., 2002]. 또한, PEG는 오직 매우 느리게 생분해되고[Beranova et. al., 2000] 고분자량 형태는 조직에 축적되는 경향을 가지므로[Bendele, et. al., 1998; Convers, et al., 1997], 임상적으로 투여되어야만 하는 치료약학적 약제와의 PEG의 사용에 관하여는 의문이 있다. PEG화된 단백질은 혈액순환에서 컨쥬게이트의 잔류시간에 영향을 줄 수 있는 항 PEG 항체를 발생한다는 것이 발견되었다(Cheng et al., 1990). 그럼에도 불구하고, 치료제와 컨쥬게이트된 비경구적으로 투여가능한 폴리머로서의 확립된 PEG의 경력, 그것의 면역독물학, 약리학 및 대사작용의 더 나은 이해가 요구될 것이다(Hunter and Moghimi, 2002; Brocchini, 2003). 한편 PEG의 축적은 독성을 야기할 수 있으므로, 고투여량이 요구될 수 있는 치료제 중 PEG의 융용성에 관한 관심이 있다. 그러므로 알파-2,8-링크된 폴리시알산(PSA)은 PEG에 매력적인 대체물을 제공하고, 인체의 천연 일부인 면역학적으로 눈에 띄지 않는 생분해성 폴리머이며, 이것은 조직 뉴라미니다아제를 거쳐, 시알산, 비독성 사카라이드로 열화된다.
본 발명자들은 기존의 과학논문과 특허에서, 단백질 치료제의 약물동태학적 특성을 개선하는데 있어서의 천연 폴리시알산의 유용성을 개시하였다[Gregoriadis, 2001; Frenandes and Gregoriadis; 1996, 1997, 2001; Gregoriadis et al., 1993, 1998, 2000; Hreczuk-Hirst et al., 2002; Mital, 2003; Jain et al., 2003, 2004; US-A-05846,951; WO-A-0187922]. 이제, 본 발명자들은 PSA의 새로운 유도체를 개시하며, 이것은 PSA-유도 단백질(및 치료제의 다른 형태)의 새로운 조성물 및 생산방법을 가능하게 한다. 이들 새로운 물질 및 방법은 인간과 동물에서의 사용을 위해 의도된 PSA-유도 치료제의 생산에 특히 알맞고, 여기서 약물 본질의 화학적 및 분자적 정의는 의학적 윤리 및 규정 당국(예를 들면, FDA, EMEA)의 안정성 요구 때문에 매우 중요한 것이다.
단백질과 같은 치료제에 폴리사카라이드의 결합에 관하여 방법은 이미 기재되어있다[Jennings and Lugowski 1981, US-A-5846,951; WO-A-0187922_. 이들 방법 중 몇몇은 단백질-반응성 알데히드 모이어티를 생성하기 위한 폴리머의 '비-환원'말단의 화학적 유도에 따른다(도 1). 이것은 PSA 및 다른 폴리사카라이드의 환원 말단이 컨쥬게이션 동안 PSA와 단백질의 단백질 형태와 화학적 완전성을 보존하기 위해 요구되는 온화한 조건하에서 단백질과 아주 약하게 반응하기 때문이다. 비-환원 시알산 기술유니트는, 이것이 근접한 디올을 함유하므로, 쉽게(그리고 선택적으로) 과요오드산염과 반응하여 모노-알데히드 형태를 낳고, 이것은 단백질에 대해 훨씬 반응성이고, 이것은 환원성 아미노화와 다른 화학적 성질을 통한 단백질의 결합에 알맞는 반응성 구성요소를 포함한다. 본 발명자들은 이것을 이미 US-A- 5846,951; WO-A-0187922에 기술하였다. 반응은 도 1에 설명되고, 이것은
a)비-환원 말단에서 단백질-반응성 알데히드를 형성하기 위해 과요오드산 나트륨에 의한 콜로민산(E. coli로부터 알파-2,8-링크된 폴리시알산)의 산화를 나타내고
b)단백질 아미노기와의 안정한 비가역 공유결합을 형성하기 위한 시프염기와 소듐 시아노보로하이드라이드의 선택적 환원반응을 나타낸다.
폴리시알산이 치료제에 결합되는 것이 기술되어 있는 여러 방법 중에서[US-A-5846,951; WO-A-0187922], 어느 것도 환원 말단을 통한 컨쥬게이트를 특이적으로 의도한 것은 없는데, 이것은 치료약학적 단백질에 대한 그것의 약한 반응성 때문이다. 비록 이론적으로는 유용한 반응이지만, 단백질과 PSA의 환원 말단의 헤미케탈(hemiketal)의 반응을 통해 컨쥬게이트의 허용할 수 있는 수득률의 달성은 단백질 안정성에 도움이 되지 않는 반응 시간을 요구한다. 두번째로는, 달성할 수 없는 또는 비경제적인 (폴리머 초과량의)반응물 농도가 요구된다. 그럼에도 불구하고, 이 반응의 비경제성에도 불구하고, 본 발명자들은 폴리머의 (반대의)비-환원 말단에서 도입된 알데히드를 통해 단백질과의 컨쥬게이트를 생성하도록 의도된 컨쥬게이션 반응 동안 의도되지 않은 부생성물이 발생한다는 것을 관찰하였다. 이와 같은 부생성물의 가능성은 카달라아제, 인슐린 및 아스파라기나아제의 발행된 문헌에서 증거되고[Fernandes and Gregoriadis; 1996, 1997, 2001; Jain et al., 2003], 여기서 폴리머의 (화학적으로 변형되지 않은) 천연형의 케탈은 환원성 아미노화 동안 낮은 수준의 효율(단백질의 5% 미만이 유도, 아래의 참조예 및 표 1을 추가로 참조)에서 단백질 컨쥬게이트를 발생한다.
콜로민산의 환원 말단의 반응성은, 비록 단백질 표적에 대해서는 약하지만, 인간 및 동물에 치료약학적 사용을 위한 구정 당국에 의해 선호되어질 종류의 화학적으로 정의된 컨쥬게이트의 제조에는 충분히 문제가 된다. 약한 단일작용성인 천연 콜로민산 폴리머와 달리, (한 말단에 알데히드를 갖고 다른 말단에 헤미케탈을 갖는) PSA의 과요오드산염 산화 형태는 불가피하게 생성물의 복잡성을 가져오고 분자적으로 정의되고 약제학적으로 허용가능한 컨쥬게이트의 생산을 위한 노력을 상당히 복잡하게 한다(도2). 도 2a는 폴리시알산반응(원래의 방법) 동안 부생성물의 형성을 나타내는 개략적인 다이아그램이다. 도 2b는 폴리시알산반응(원래의 방법) 동안 부생성물의 형성, 특히
ⅰ)비대칭성 다이머;
ⅱ)선형 폴리머;
ⅲ)분지된 폴리머; 및
ⅳ)다양한 더욱-복잡한 구조물
을 나타내는 더욱 상세한 개략적인 다이아그램이다.
첫눈에, 도2에 기재된 여러가지 원하지 않는 생성물로부터 의도된 반응 생성물을 정제하는 간단한 문제가 보일 것이다. 그러나, 의도된 형태의 몇몇은 물리화학적 특성(크기 변화 등)이 생성물의 의도된 형태의 것과 상당히 유사하고, 참으로 거의 동일하므로, 절대로 단순하지 않다. 이것은 (각각, 전하와 크기를 근거로 분리하는) 이온-교환크로마트그래피와 겔-투과 크로마토그래피와 같은 기술에 의해 반응 혼합물로부터 의도된 종들을 정제하려는 시도를 좌절시키고, 그리고 또한 많은 다른 정제법을 무력화시킨다. 그러므로, 이제 본 발명자들은 환원 말단에서 시알산기를 갖는 폴리사카라이드를 단백질에 컨쥬게이션하기 위한 새로운 방법을 개발함으로써 상기 문제를 해결하였고, 따라서 환원 말단의 약한 반응성은 유리한 효과로 사용될 수 있고, 이것은 과요오드산염 산화된 천연 클로민산에 의한 단백질의 환원성 아미노화의 확립된 방법(도 1)을 이용하여 도2(b)에 기재된 생성물의 복잡성을 막는다.
Jennings 및 Lugowski는 US 4,356,170에 예비 환원단계를 포함하는 활성화된 환원 말단 유니트를 통한 단백질에 대한 세균성 폴리사카라이드의 유도를 기재한다. 이들은 환원 말단 유니트가 N-아세틸만노사민, 글루코스, 클루코사민, 람노스 및 리보오스린 방법을 제안한다.
EP-A-0454898에서, 단백질의 아미노기는 글리코사미노글리칸의 환원 말단 당 모이어티의 환원 및 부분적 산화에 의해 생산된 알데히드기에 결합한다. 이 방법으로 처리된 글리코사미노글리칸은 히알우론산, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 및 더마탄설페이트를 포함한다. 이들 화합물 중 어느 것도 환원 말단에 시알산 유니트를 갖지 않는다.
본 발명에서, 시알산 화합물의 알데히드 유도체를 생산하기 위한 새로운 방법이 제공되며, 여기서. 환원 말단에 시알산 유니트를 갖는 출발물질은 다음의 단계를 겪는다
a)환원 말단 시알산 유니트에서 고리를 환원적으로 개방시키는 환원에 의해 근접한 디올기가 형성되는 단계; 및
b)단계 a)에서 형성된 근접한 디올기를 알데히드기가 형성되도록 산화하기 위한 선택적 산화단계.
출발물질은, 비록 본 발명이 다른 출발물질에 대해서도 유용성을 갖지만, 바람직하기는 디-, 올리고- 또는 폴리-사카라이드이다.
본 발명의 과정에서 사용된 출발물질은 바람직하기는 그것의 8 탄소원자를 통해 근접한 유니트에 연결된 환원 말단에서 시알산을 가져야 한다. 단계 b)에서 6,7-디올기는 산화되어 탄소 7 원자에서 알데히드를 형성한다.
선택적 구현예에서, 환원된 터미날 말단에서 시알산 유니트가 9 탄소원자를 통해 이웃 유니트에 연결되는 경우(단계 b), 7,8-디올기가 형성되고 그리고 산화되어 8 탄소원자에서 알데히드가 형성된다.
본 발명의 방법에서, 출발물질이 디-, 올리고- 또는 폴리-사카라이드인 경우, 출발물질은 근접한 디올기를 갖는 비-환원 말단에서 터미날 사카라이드 유니트를 가지며, 출발물질은 단계 a) 전에, 근접한 디올기를 알데히드로 산화시키는 선택적 산화의 예비 단계를 겪고, 그것에 의해 단계 a)에서 알데히드가 또한 환원되어 근접한 디올기의 일부가 아닌 히드록시기를 형성한다. 본 발명은 출발물질의 환원 말단의 터미날 유니트가 시알산 유니트인 경우 특별히 유용하다. 선택적 구현예에서, 출발물질은 근접한 인돌기를 가질 수 있고 이것은 단계 a)를 위한 출발물질의 비-환원 말단 사카라이드 유니트에서 이와 같이 유지된다. 이것은 환원 단계에 의해 변형되지 않고, 알데히드기를 형성하기 위한 산화단계에서 산화될 것이다. 생성물은 이-작용성일 것이고 두 알데히드기에서 기질에서의 적절한 작용기와의 반응에 의해 기질을 가교하는 그들의 능력으로부터 유래된 유용한 치료약학적 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 제2 면에 따르면, 비-환원 터미날 말단에 터미날 시알산을 갖는 시알산 출발물질이 다음 단계를 겪는 새로운 방법이 제공된다:
c)7-알데히드를 형성하기 위한 7,8- 근접한 디올기에서 비-환원 말단 시알산기를 산화하는 선택적 산화단계; 및
d)7-알데히드기를 상응하는 알콜로 환원하기 위한 환원단계.
본 발명의 이 면은 부동태화된 비-환원 말단을 갖는 시알산 유도체를 제공하여, 이후의 반응을 위한 환원 말단의 활성화를 허용한다. 활성화는, 예를 들면 아민을 형성하기 위한 아민화와 같은 알데히드기를 또 다른 기로 전환하기 위한 임의의 순차적 단계를 갖는, 본 발명의 제1면의 환원/산화 단계일 수 있다. 환원 말단을 활성화하기 위한 다른 단계가 고안될 수 있다.
바람직하기는 본 발명의 제2 단계는 출발물질이 환원 말단 유니트를 갖고 그 유니트를 통해 다른 분자에 순차적으로 컨쥬게이트 되도록 요구되는 과정의 일부이다. 이와 같은 과정에서, 환원 말단 유니트는 일반적으로 그렇지 않으면 시알산 비-환원 말단 유니트의 일부를 활성화하는 반응에 의해 활성화된다. 이와 같은 반응은, 예를 들면, 근접한 디올 모이어티의 선택적 산화이고 단계 d) 이후에 실시된다.
본 발명에서, 바람직한 폴리사카라이드 출발물질은 분자에서 시알산 이외의 다른 유니트를 포함할 수 있다. 예를 들면, 시알산 유니트는 다른 사카라이드 유니트로 대체될 수 있다. 그러나, 바람직하기는 폴리사카라이드는 실질적으로 오직 시알산 유니트만으로 이루어진다. 바람직하기는 이들은 2→8 및/또는 2→9 결합이다.
바람직하기는 바람직한 폴리사카라이드 출발물질은 적어도 2, 더욱 바람직하기는 적어도 5, 더욱 바람직하기는 적어도 10, 예를 들면 적어도 50 사카라이드 유니트를 갖는다. 예를 들면, 폴리사카라이드는 적어도 5 시알산 유니트를 포함할 수 있다.
폴리시알산은 어느 기원, 예를 들면, E. coli K1 또는 K92, 그룹 B 수막염구균, 또는 우유 또는 N-CAM과 같은 세균성 기원의 천연원으로부터 유래될 수 있고 시알산 폴리머는 수막염구균의 그룹 135 또는 그룹 V와 같은 헤테로중합성 폴리머일 수 있다. 폴리시알산은 염 또는 유리산의 형태일 수 있다. 이것은 가수분해 형태일 수 있고, 이와 같은 분자량은 세균성원으로부터 회수된 감소된다. 폴리시알산은 1.3보다 큰, 예를 들면 2 이상의 다분산도를 갖는 넓은 범위의 분자량을 갖는 물질일 수 있다. 바람직하기는 분자량의 다분산도는 1.2 미만, 예를 들면 1.01 정도로 낮다.
넓은 분자량 분포를 갖는 폴리시알산의 개체군을 낮은 다분산도를 갖는 부분, 즉 다른 평균분자량을 갖는 부분으로 나누었다. 분획법은 바람직하기는 용출을 위해 알맞는 염기성 완충액을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피이다. 본 발명자들은 적절한 음이온 교환 매질 ⅰ)4급 암모늄 이온 펜던트기(즉, 강염기)를 갖는 활성화된 아가로스를 기재로 한 강한 이온-교환 물질과 같은 제조 매질을 발견하였다. 용출 완충액은 비-반응성이고 바람직하기는 원하는 생성물을 증발에 의한 각 분획중 염기로부터 회수될 수 있도록 휘발성이다. 기술은 이 발명의 필수적인 과정 단계 전 또는 후에 적용될 수 있다.
이것은 이온-교환 크로마토그래피가 약 5kD를 넘는 분자량을 갖는 이온성 폴리사카라이드, 특별히 분자량을 기준으로 하여 이와 같은 MS의 폴리시알산을 분획하는데 적용된 첫번째라고 믿어진다. 본 발명의 추가의 면에 따르면, 용출 완충액 중에 바람직하기는 휘발성인 염기 또는 산을 이용한 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 5kD보다 높은 분자량을 갖는 이온성 폴리사카라이드의 개체군을 분획하기위한 방법이 제공된다. 바람직하기는 폴리사카라이드는 카르복실산기를 가지며 이온-교환은 음이온 교환이다. 바람직하기는 용출 완충액은 아민, 더욱 바람직하기는 트리에탄올아민을 함유한다. 더욱 바람직하기는 폴리사카라이드는 냉동-건조에 의해 분획으로부터 회수된다. 이 방법은 다른 반응성 모이어티(말레이미드 또는 요오드화아세테이트 등) 및 다른 천연(예를 들면, 덱스트린 설페이트) 및 합성(예를 들면 폴리글루타민산; 후자의 경우 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 폴리라이신) 하전된 폴리머를 갖는 CA의 분획에 적용될 수 있다. IEC가 침전 기술 및/또는 한외여과법과 결합하여 이온성 폴리사카라이드를 분리하는데 사용된 것은 첫번째라고 믿어진다.
IEC법은 엔도톡신과 같은 시판되는 PSA 및 CA에 남아있는 생산의 부생성물을 제거한다는 것이 발견되었다.
예비 산화단계 및 단계 c)에서, 선택적 산화는 바람직하기는 긴-사슬(중합성) 출발물질의 백본의 중간-사슬의 분열이 실질적으로 없는, 즉 실질적으로 분자량 감소가 없는 조건에서 실시된다. 이 단계를 수행할 수 있는 효소가 사용될 수 있다. 가장 통상적으로 산화는 화학적 산화이다. 반응은 폴리머-기재 퍼루테네이트와 같은 고정화시약으로 실시될 수 있다. 가장 직접적인 방법은 용해된 시약으로 실시된다. 옥시던트는 적당하기는 퍼루테네이트이거나, 또는 바람직하기는 페리오데이트이다. 산화는 농도 1mM~1M의 범위의 페리오데이트에 의해, pH 3~10의 범위, 온도 0~60℃, 1분~48시간 동안 실시될 수 있다.
공정에서, 단계 a)는 환원 말단에서의 시알산 유니트가 환원되는 단계이다. 일반적으로 출발물질의 환원 말단에서 유니트는 케탈고리를 형태를 갖고 단계 a)의 환원은 고리를 열고 케톤을 알콜로 환원시킨다. 그러므로 6-탄소 원자에서의 히드록시기는 근접한 디올 모이어티의 일부이다.
단계 a) 및 d))의 적절한 환원조건은 촉매와 함께 수소, 또는 바람직하기는 보론수소화물과 같은 수소화물을 이용한다. 소듐 보로하이드라이드와 같은 바람직한 알칼리금속 수소화물이 환원제로서 1μM ~ 0.1μM의 농도, pH 6.5~10, 온도 0~60℃ 및 1분~48시간으로 사용된다. 반응 조건은 출발물질의 펜던트 카르복실시가 환원되지 않도록 선택된다. 예비 산화단계가 실시된 경우, 생성된 알데히드기는 근접한 디올기의 일부가 아닌 알콜기로 환원된다. 다른 알맞는 환원제는 산성조건하의 시아노보로하이드라이드, 예를 들면 폴리머 담지된 시아노보로하이드라이드 또는 알칼리 금속 시아노보로하이드라이드, L-아르코르브산, 소듐 메타바이설파이트, L-셀렉트리드, 트리아세톡시보로하이드라이드 등이다.
어느 예비 산화단계와 환원 단계 사이와 단계 b) 이후 그리고 산화단계 c)와 환원단계 d) 사이 그리고 단계 d)와 어느 이후의 산화단계 사이에, 각각의 중간체는 각각 이후의 단계를 겪기 전에 산화 및 환원제로부터 분리되어야만 한다. 단계가 용액 상으로 실시되는 경우, 분리물은 에틸렌 글리콜을 사용한 과량의 산화제의 소비, 폴리사카라이드의 삼투 및 수용액을 농축하기 위한 한외여과와 같은 종래의 기술에 의해 이루어질 수 있다. 환원단계로부터의 생성 혼합물은 다시 삼투 및 한외여과에 의해 분리될 수 있다. 생성물을 간단히 분리하는 고정화된 산화 및 환원 시약에서 실시되는 반응을 고안하는 것이 가능하다.
선택적 산화 단계, 단계 b)는 상기와 같이 예비 산화단계와 유사한 조건에서 적절히 실시된다. 한편 산화제는 에틸렌 글리콜을 사용한 생성물의 회수 전에 소모되어야만 한다. 생성물은 이후 투석과 한외여과와 같은 적절한 수단에 의해 순차적으로 회수된다.
환원 말단 사카라이드 유니트를 활성화하기 위한 단계 d) 이후 순차적인 산화 단계를 포함하는 발명의 제 1면과 제2면의 바람직한 구현예의 방법은 환원 말단로부터 유래된 반응성 알데히드 모이어티를 갖는 활성화된 유도체를 생산한다. 산화, 그리고 환원, 그리고 산화 단계를 포함하는 바람직한 공정은 단일 반응성 알데히드 모이어티를 갖는 활성화된 생성물을 생성한다. 예비 산화단계가 없고 출발물질이 근접한 디올기(예를 들면 시알산)을 갖는 비-환원 말단 유니트를 갖는다면, 생성물은 유용성을 갖는 각 터미날에서 알데히드기를 가질 것이다.
알데히드기는 기질 또는 히드라진 화합물을 함유하는 아민-기에 컨쥬게이트되기에 알맞다. 산화단계의 활성화 산물이 이후 기질 화합물에 컨쥬게이트되는 방법은 본 발명의 추가의 면을 형성한다. 바람직하기는 컨쥬게이션 반응은 본 발명자들의 상기 문헌에 기재된 바와 같고, 그것은 시프 염기를 형성하기 위해 아민과 컨쥬게이션되고, 바람직하기는 2차 아민 모이어티를 형성하기 위해 이후 환원되는 것을 포함한다. 본 방법은 특히 단백질을 유도하기에 알맞고, 그것의 아민기는 라이신기의 엡실론 아민기 또는 N-터미날 아미노기인 것이 적절하다. 방법은 특히 시토킨, 성장 호르몬, 효소, 호르몬, 항체 또는 단편과 같은, 단백질 또는 펩티드 치료약학적 활성제를 유도하기에 가치있다. 선택적으로, 본 방법은 예를 들면 알데히드와 리포좀 형성성분의 아민기의 반응에 의해 리포좀과 같은 약물 전달 시스템을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 다른 약물 전달 시스템은 본 발명자들의 초기의 경우 US-A-5846951에 기재된다. 유도될 수 있는 다른 물질은 바이러스, 미생물, 동물세포를 포함하는 세포 및 합성 폴리머를 포함한다.
선택적으로, 기질은 히드라진 기를 가질 수 있고, 이 경우, 생성물은 히드라존이다. 이것은 필요에 따라, 추가의 안정성을 위해 알킬 히드라지드로 환원될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 산화단계 b) 또는 단계 d) 이후의 순차의 산화단계는, 아민기 또는 히드라지드기 및 단백질 또는 다른 치료약학적 활성 화합물 또는 약물 전달 시스템의 선택적 유도에 알맞는 다른 작용기를 포함하는, 알데히드 기와 링커 화합물의 반응이 이어진다. 이와 같은 링커는, 예를 들면, 설프히드릴 기와의 특정반응을 위한 작용기 및 아민에 연결된 이-염기성 유기성기 또는 히드라지드기 및 작용기를 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 알데히드 모이어티와 아미노 또는 히드라지드기의 반응은 티올(설프히드릴)기를 갖는 기질에 결합하기에 알맞는 반응성 컨쥬게이트를 형성한다. 이와 같은 컨쥬게이트는 특히 단백질과 펩티드의 선택성 및 부위-지향 유도에 가치가 있다.
단백질과 약물 전달 시스템의 유도는 증가된 반감기, 개선된 안정성, 감소된 면역원성, 및/또는 용해도 및 따라서 생체이용가능성 및 약제학-동태학 특성의 조절을 가져오거나, 또는 용해도 활동분자 또는 유도된 활동분자를 함유하는 용액의 점도를 강화할 수 있다.
본 발명에 따르면, 시알산 모이어티를 포함하는 디-, 올리고 또는 폴리사카라이드의 알데히드 유도체인 신규 화합물이 제공되고, 여기서 환원 말단의 터미날 유니트는 기 또는 여기서 R은
Figure 112006010046539-PCT00001
Figure 112006010046539-PCT00002
Figure 112006010046539-PCT00003
-CH2CH2NHR1, CH2CH=N-NHR1 및 CH2CH2NHNHR1 으로부터 선택되고, 여기서 R1은 H, C1 - 24알킬, 아릴, C2 -6 알카노일, 또는 N-터미날 또는 라이신 잔기의 부사슬, 약물 전달 시스템을 통해 링크된 펩티드 또는 단백질이고, 또는 술프히드릴기와의 반응을 위해 채택된 작용성기를 갖는 유기 기이며, 바람직하기는 비-환원 말단의 터미날 모이어티는 부동태화된다.
새로운 화합물은 2개의 터미날 유니트 사이에 중간사슬 사카라이드 유니트를 포함할 것이다. 중간-사슬 유니트는 시알산 유니트만으로 이루어질 수 있고, 또는 선택적으로 시알산 유니트로부터 유도된 터미날 유니트에 더하여 다른 사카라이드 유니트를 포함할 수 있다. 화합물은 일반적으로 본 발명의 제 1면과 관련하여 기재된 바에 따라 형성된다.
새로운 화합물은 폴리시아릴화된 기질이고, 기질의 각 분자에 컨쥬게이트된 적어도 하나의 폴리시알산(폴리사카리아드)기를 포함하고, 상기 컨쥬게이션은 2차 아민, 히드라존 또는 폴리시알산의 환원 말단을 통한 알킬 히드라지드 연결을 포함하며, 실질적으로 폴리시알산기의 비-환원 말단을 통한 기질의 다른 분자로의 가교가 없다. 기질은, 예를 들면, 생리학적 활성 화합물, 예를 들면 약제학적 활성 화합물일 수 있고, 특히 펩티드 또는 단백질 치료 또는 약물 전달 시스템이다. 이와 같은 활동분자는 일반적으로 상기와 같다.
새로운 화합물은 일반식 Ⅰ의 구조를 갖는다
Figure 112006010046539-PCT00004
여기서 R은
Figure 112006010046539-PCT00005
Figure 112006010046539-PCT00006
Figure 112006010046539-PCT00007
-CH2CH2NHR1, CH2CH=N-NHR1 및 CH2CH2NHNHR1 으로부터 선택되고, 여기서 R1은 H, C1 - 24알킬, 아릴 C2 -6 알카노일, 또는 N-터미날 또는 라이신 잔기의 γ-아민기를 통해 링크된 펩티드 또는 단백질, 약물 전달 시스템이거나 또는 설프히드릴기와의 반응을 위해 채택된 기능적 치환체를 갖는 유기기이고;
R3 및 R4는
ⅰ) R3는 H이고 R4는 OH이고
ⅱ) 여기서 R은 CH(CH2OH)CH2OH 또는 -CH2CHO, R3 및 R4는 함께 O이고;
ⅲ)여기서 R은 CH(CH2OH)CH2NHR1 또는 -CH2CH2NHR1이고, R3는 H이고 R4는 -NHR1 이고;
ⅳ)여기서 R은 -CH(CH2OH)CH2NHNHR1 또는 -CH2CH2NHNHR1이고, R3는 H 이고 R4는 -NHNHR1 이고;
ⅴ)-CH2CH=N-NHR1이고 R3 및 R4는 함께 N-NHR1로부터 선택되고
Ac는 아세틸이고,
n은 0 이상이고; 그리고
GlyO는 글리코실기이다.
R이
이면, 일반식 Ⅰ의 화합물은 환원 말단 유니트에서 알데히드기를 갖는 폴리시알산 유도체인 폴리사카라이드이다.
R이
Figure 112006010046539-PCT00009
,
CH2CH=N-NHR1 또는 CH2CH2NHNHR1이면, 화합물은 폴리시알산의 알데히드 유도체와 히드라지드 R1NHNH2의 반응에 의해 형성된 컨쥬게이트이다. 히드라지드는 바람직하기는 아실 히드라지드(R1이 터미날 카보닐기를 갖는다)이다.
R이
Figure 112006010046539-PCT00010
기이면, 화합물은 폴리시알산의 알데히드 유도체와 화합물 R1NH2를 함유하는 1차 아민기와의 반응에 의해 형성된 컨쥬게이트이다.
R1은 상기와 같은 펩티드 또는 단백질 치료, 예를 들면 항체 또는 단편, 효소 또는 다른 생리학적 활성 화합물의 잔기일 수 있다. R1기는 활성 화합물로부터 폴리시알산에 대한 링커 모이어티를 포함할 수 있다.
선택적으로, R1은 예를 들면 활성화합물 상의 아미노기 또는 히드라지드 이외의 기에 컨쥬게이트 되기에 적절한 유도된 폴리시알산기를 형성하기 위한 링커 시약의 잔기일 수 있다. 예로는 식
Figure 112006010046539-PCT00011
의 N-말레이미도 화합물인 링커 약제이고, 여기서 R2는 예를 들면 아릴렌 올리고(알콕시)알칸인 이염기성 유기성기이고, 또는 바람직하기는 예를 들면, C2 -12-알칸 디일기인 알칸디일기이다.
본 발명은 신규한 화합물이 모노-작용성이고 비-환원 말단의 터미날 유니트에서 부동화된 경우 가장 유용하다. 이와 같은 화합물에서 R3는 H이고 R4는 OH이다. R은 상기 의미 중 어느 것일 수 있다. 글리코실기는 바람직하기는 시알산기를 포함하고 가장 바람직하기는 서로에 2-8 및/또는 2-9 결합된, 예를 들면 교대의 2-8/2-9와 같은 유니트 만으로 이루어진다.
본 발명은 또한 신규화합물과 희석제를 포함하는 조성물뿐 아니라, 신규화합물(여기서 R1은 생리적 활성을 갖는다)과 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 경구적, 정맥내, 근육내, 피하내, 비내, 피부내, 국소적 또는 기관내 투여된다.
본 발명의 제 2면은 일반식 Ⅱ를 갖는, 두번째 방법의 면에 따른 방법의 산물인 새로운 화합물을 제공한다.
Figure 112006010046539-PCT00012
여기서, Ac는 아세틸이고;
m은 0 이상이고;
Gly1O는 글리콜이고; 및
R5는 유기기이고, 바람직하기는 터미날 환원 사카라이드 유니트의 환원형태이고, 그것의 산화 유도체는 알데히드 또는 알데히드의 반응산물이고, 이것은 예를 들면 아민 또는 히드라지드이다.
바람직하기는 R5는 상기 R과 동일한 군으로부터 선택된다.
선택적으로 R5는 탄소 8 또는 9의 하나를 통해
Figure 112006010046539-PCT00013
에 연결된 기 Ⅲ이다.
(여기서 탄소 8 또는 9의 나머지는 히드록실로 치환된다)
Figure 112006010046539-PCT00014
이것은 환원 말단 시알산의 고리-개방 환원의 생성물이다.
바람직하기는 Gly1O는 시알산 유니트를 포함하고, 가장 바람직하기는 시알산 유니트로 이루어진다. m의 값은 바람직하기는 2 이상이고, 더욱 바람직하기는 5~1000이고, 예를 들면 10~500, 더욱 바람직하기는 10~50이다.
새로운 방법은 특정의 모노작용성 폴리시알산(PSA)에 대해 특히 가치가 있다. 이것은 PSA의 환원 말단 고리, 예를 들면 도 3의 콜로민산(CA)의 타우토머성 평형의 해석을 기준으로 한다. PSA의 환원 말단 시알산 잔기는 동시에 호변이성에 의해 개방된 고리 케톤을 형성한다. 환원 말단 시알산 잔기의 고리와 선형구조물상이의 동적평형에서, 케톤 모이어티는 어느 순간의 PSA 분자의 서브개체군만으로 존재한다. 그러나, 상기한 바와 같이, 환원 말단 헤미케탈의 반응성은 PSA의 단백질에의 접착에 실제로 사용하기에 불충분하고, 이것은 이미 기재된 방법이 폴리머 상의 이 부위를 단백질 또는 다른 고리에 접착시키기 위해 사용할 수 없는 이유이다. 그러므로, 도3의 설명과 같이, 용액 중에서, 폴리시알산의 환원 말단에서의 터미날 시알산 잔기는 타우토머성 평형으로 존재한다. 비록 평형에서 낮은 풍부이지만, 고리-개방 형태는 단백질 아민기와 약하게 반응하고 소듐 시아노보로하이드라이드의 존재하에 단백질과의 공유결합 부가물을 생성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, PSA과 컨쥬게이션된 단백질의 우수한 생성물을 얻기 위해, 본 발명자들은 모노작용성인 폴리시알산의 화학적으로 변형된 형태를 생성하였다. 새로운 형태는 천연 폴리시알산 분자의 양쪽 터미날에의 화학적 변형을 포함한다. 반응의 기본 형태와 달리(도 1), 폴리머는 우선적으로 2-8 위치에서, 최외부 '환원 말단'과 컨쥬게이트되고, 폴리머의 새로운 형태는 반대 위치에서 배타적으로 결합된다.
유도를 위한 폴리시알산 또는 다른 폴리사카라이드 알데히드의 새로운 바람직한 모노작용성 형태는, 변형안된 환원 말단과 중합형태의 사용에 의해 그렇지 않으면 우연히 생성되는 상당한 복잡성을 피할 수 있기 때문에, 약제학적으로 허용가능한 생성물의 합성 및 제조에 더욱 도움이 된다(도 2). 새로운 형태의 폴리머의 생산은(도 4) 바람직하기는 본 발명자들의 기존 문헌과 같이 과요오드산염에 의한 비-환원 말단에서 알데히드 작용을 도입하기 위한 선택적 산화를 포함한다. 그러나, 도 1에서 설명된 선행기술과 달리, 이 알데히드 모이어티는 예를 들면 보로하이드라이드에 의해 환원되어 파괴된다. 폴리머의 다른 말단에서 보로하이드라이드 환원 단계는 헤미케탈의 환원에 의해 환원 말단의 고리구조의 개방을 동시에 막는다. 히드록시 모이어티에 대한 케톤의 동시 환원은 제2 산화단계에서 선택적 산화를 변화시킬 수 있는 새로운 디올 작용성을 유도한다. 천연 폴리머가 과요오드산염으로 (연속적으로)산화되고, 보로히드록시드로 환원되고, 과요오드산염으로 두번째 산화되면, 새로운 폴리머 형태가 생성되고, 이것은 진짜 모노작용성이고, 오직 환원발단에서만 단일 반응기(알데히드)를 갖는다(도 3).
도 4의 '이중 산화' 공정에 기재된 여러 중간체의 (환원성 아민화에 의한) 단백질 반응성은 표 2에 나타내었다. 놀랍게도, 이들 자료는 과요오드산염 산화된 폴리머의 보오하이드라이드 환원에 의해 생성된 중간체 'CAOR'(콜로민산-폴리시알산-산화된/환원된)가, 그들의 알데히드와 헤미케탈 모이어티 모두가 보로히아드라이드 환원에 의해 파괴되는 조건으로, 단백질 표적물에 삽입된다는 것을 나타낸다. '단백질 불활성' CAOR 중간체의 과요오드산염 산화의 두번째 순환에서, 새로운 폴리시알산 유도체가 형성되고(CAORO) 이것은 단백질에 대해 더욱 반응성이며(표2), 더우기 참으로 폴리머의 '환원 말단'에서 단일 알데히드기를 갖고 그리고 그것의 다른 말단에서는 단백질에 대해 비반응성인 모노작용성이다. 모노작용성 PSA는 단백질에 대해, 최외부 비-환원 말단과 오직 단일-위치 결합만을 하며 불필요한 가교 단백질이 불가능하다. 이 새로운 반응 도해(도 4)는 '이중 산화'로 알려져 있고, 방법은 여러가지 의도되지 않은 산물로부터 의도된 산물을 정제하는 필요를 고상하게 피하도록 하고, 상기 의도되지 않은 산물은 새로운 반응 도해에서는 완전히 피해진다.
다음은 도면의 간단한 설명이다.
도 1a는 비-환원 시알산 터미날 유니트에서 종래기술의 활성화를 나타내는 반응 도해이다.
도1b는 단백질-아민 모이어티를 사용한 반응 도해 1a의 생성물의 알데히드 모이어티의 종래기술의 환원성 아민화를 나타내는 반응 도해이다.
도 2a는 환원 말단을 포함하는 도 1b의 반응에서 일어나는 잠재적 부반응을 나타내는 개략적인 다이아그램이다.
도 2b는 도 2a의 부반응의 잠재적 부생성물을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 PSA의 환원 말단 시알산의 케탈과 고리-밀폐형 사이의 호변이성을 나태내는 반응 도해이다.
도 4a는 PSA의 바람직한 산화-환원 산화반응을 나타내는 반응 도해이다.
도 4b는 도4의 도해의 단계를 위한 적절한 조건을 제공하며 출발물질, 중간체 및 최종생성물을 위해 사용되는 약어를 설명한다.
도 5는 도2b와 유사한 개략적인 다이아그램이지만, 도 4의 반응의 생성물을 나타낸다.
도 6은 실시예 1의 생성물의 GPC 분석의 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 2의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 3에서 마이스의 인비보에서 시험된 컨쥬게이트의 순환 반감기의 약물동태학을 나타낸다.
도 9는 참조예 2에서 CA22.7 kDa에 대한 IEC 결과를 나타낸다.
도 10은 참조예 2에서 CA22.7 kDa에 대한 천연 PAGE 결과를 나타낸다.
도 11은 참조예 2.2에서와 같이 공급된 여러 CA 재료와 분리된 분획에 대한 천연 PAGE 결과를 나타낸다.
도 12는 참조예 2.2에서와 같이 분리된 CA의 분획중 3에 대한 GPC 크로마토그래피를 나타낸다.
도 13은 도 12에 사용된 샘플 및 참조예 2.2에 기재된 다른 CA 및 CAO 샘플 중 2개에 대한 천연 PAGE를 나타낸다.
도 14는 참조예 2.4에 기재된 바와 같은 CA 22.7 kDa의 한외여과 결과를 나타낸다.
도 15는 실시예 5에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸다.
도 16은 실시예 5와 같이 형성된 분획화된 GH-CA 컨쥬게이트의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 17은 실시예 7의 결과를 나타낸다.
본 발명은 첨부된 실시예에서 더욱 설명될 것이다.
재료
암모늄 카보네이트, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜(8KDa), 소듐시아노보로라이드라이드(>98% 순도), 소듐 메타-과요오드산염 및 분자량 마커를 Sigma Chemical Laboratiry(UK)로부터 얻었다. 사용된 콜로민산, 선형 α-(2→8)-링크된 E. coli K1 폴리시알산(평균 22.7kDa, 고분산도 1.34, 39kDa p.d. 1.4; 11kDa, p.d. 1.27)을 Camida(Ireland)로부터 얻었고, 방사성 요오드(Na125I)를 Amersham(UK)으로부터 구매하였다. 다른 재료는 2,4-디니트로페닐 히드라지(Aldrich Chemical Company, UK), 삼투 튜브(3.5KDa 및 컷오프 한계 10KDa; Medicell Intermational Limited, UK), 세파로스 SP HiTrap, PD-10 칼럼(Pharmacia, UK), Tris-글리신 폴리아크릴아미드 겔(4~20% 및 16%), Tris-글리신 소듐 도데실설페이트 러닝 완충액 및 로딩 완충액(Novex)을 포함한다. 탈이온수는 Elgastat Option 4 물 정제 유니트(Elga Limited, UK)로 부터 얻었다. 사용된 모든 시약은 분석 등급이였다. 플레이트 리더(Dynex Technologies, UK)를 단백질 또는 CA 분석에서 분광광도계 결정을 위해 사용하였다. CD1 이배 교배 마이스(8~9 주령; 무게 29-35g)를 Charles River(UK)에서 구매하였고 사용 전 적어도 1주 동안 적응시켰다.
방법
단백질 및 콜로민산 측정
레조르시놀 시약을 사용하여 폴리시알산(시알산)의 정량적 측정을 다른 곳에 기재된 바와 같이[Gregoriadis et al., 1993; Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997] 레조르시놀법으로 수행하였다[Svennerholm 1957]. Fab(단백질)을 BCA 열량분석법으로 측정하였다.
참고예 1
공유결합 PSA-단백질 컨쥬게이트를 E. coli로부터 폴리시알산(콜로민산, CA) 의 천연 형태를 사용하여, 그것의 약한 반응성 환원 말단을 통해, 소듐 시아노보로하이드라이드를 사용한 반응성 아민화로 생성하였다. CA=콜로민산; CAO=산화된 톨로민산 Fernandes 및 Gregoriadis, 1996; Jain et al., 2003. 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)를 4mg/ml의 농도로 사용하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다. 칼럼 1의 몰비는 단백질에 대한 출발 CA(O)의 비율이다. n=3±표준편차
표 1
제조 CA 몰비의 변화 정도(CA:단백질)
카탈라제+CAO+NaCNBH3(10:1) 카탈라제+CAO+NaCNBH3(50:1) 카탈라제+CA+NaCNBH3(50:1) 카탈라제+CA(50:1) 0.77±0.16 2.59±0.08 0.55±0.05 0.65±0.04
카탈라제+CAO+NaCNBH3(25:1) 카탈라제+CAO+NaCNBH3(50:1) 카탈라제+CAO+NaCNBH3(100:1) 카탈라제+CA+NaCNBH3(25:1) 카탈라제+CA+NaCNBH3(50:1) 카탈라제+CA+NaCNBH3(100:1) 1.60±0.14 1.65±0.14 1.74±0.12 0.20±0.02 0.21±0.04 0.24±0.06
실시예 1 - 모노작용성 폴리시알산의 제조
1a 콜로민산의 활성
새롭게 제조된 0.1M 메타과요오드산염(NaIO4) 용액을 CA(100mg CA/ml NaIO4)와 20℃에서 혼합하였고 반응 혼합물을 자기적으로 15분 동안 암실에서 교반시켰다. 2배 부피의 에틸렌 글리콜을 반응 혼합물에 첨가하여 과량의 NaIO4로 확장하고 혼합물을 20℃에서 추가 30분 동안 교반하였다. 산화된 콜로민산을 4℃에서 0.01% 암모늄 카보네이트 완충액(pH7.4)에 대해 광범위하게 삼투시켰다(3.5KDa 분자량 컷 오프 삼투튜브). 삼투 튜브에서 CAO 용약을 농측하기 위해 한외여과법(과분자량 컷 오프 3.5kDa)을 사용하였다. 원하는 부피로 농축시킨 후, 여과물을 냉동건조시키고 추가 사용시까지 -40℃에서 보관하였다.
1b 콜로민산의 환원
산화된 콜로민산(CAO; 22.7kDA)을 소듐 보로하이드라이드의 존재하에 환원시켰다. 새롭게 제조된 0.15mM 소듐보로하이드라이드(NaBH4; 묽은 H2SO4 용액을 사용하여 pH 8~8.5로 희석된 0.1M NaOH)를 CAO(100mg CA/ml)와 20℃에서 혼합하고 반응 혼합물을 최대 2시간 동안 암실에서 교반하였다. 반응을 완성하여 pH를 7까지 내렸다. 산화/환원된 콜로민산(CAOR)을 4℃에서 0.01% 암모늄 카보네이트 완충액 pH(7)에 대해 삼투시켰다(3.5kDa 분자량 컷 오프 삼투 튜브). 초원심분리를 사용하여 삼투 튜브로부터 CAOR 용액을 농축시켰다. 여과물을 냉동건조시키고 추가 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
1c CA의 재산화
알데히드 성분이 없음을 확인한 후, 산화/환원된 콜로민산(CAOR)을, CAOR을 장기간(최대 1시간)동안 과요오드화 용액으로 배양시킨 것을 제외하고는 콜로민산의 활성화에 관하여 보고된 바와 같이 다시 산화시켰다. CAORO 산물에서 산화정도는 이 단계에서 얻은 냉동건조된 분말상에서 측정하였다.
1d CA와 유도체들의 산화상태의 측정
콜로민산 산화 정도의 정량적 평가를 2,4-디니트로페닐히드라진(2,4-DNPH)로 실시하였고, 이것은 카보닐 화합물과의 상호작용 후 인색하게 녹는 2,4- 디니트로페닐-히드라존을 생성하였다. 비-산화(CA), 산화(CAO), 환원(CAOR) 및 재-산화(CAORO)(각각 5mg)을 2,4-DNPH 시약(1,0ml)에 첨가하고, 용액을 흔들고 난 후 37℃에서 결정성 침전이 관찰될 때까지 방치하였다[Shriner et al., 1980]. CA 산화의 정도(정량적)를 알칼리 용액 중의 페로시아나이드 이온의 페릭 페로시아나이드로의 환원을 기준으로 하는 방법으로 측정하였고[Park and Johnson, 1949], 이것은 630nm에서 측정된다. 이 경우, 글루코스를 표준으로 사용하였다.
1e 겔 투과성 크로마토그래피
콜로민산 샘플(CA, CAO, CAOR 및 CAORO)을 NaNO3(0.2M), CH3CN(10%; 5mg/ml)에 용해시키고 2x GMPWXL 칼럼에서 굴절률을 측정하여 색층분석하였다(GPC 시스템:VE1121 GPC 용매 펌프, VE3580 RI 검출기 및 Trisec 3 software(Viscotex EEuroe Ltd)에 의한 대조). 샘플 (5mg/ml)을 0.45㎛ 나일론막으로 여과하고 0.7cm분 동안 이동상으로서 NaNO3 및 CH3CN(10%)를 사용하여 작동하였다.
결과
콜로민산 (CA), 폴리시알산은 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 잔기의 선형 알파-2,8-링크된 호모폴리머이다(도 1a). 그러나, 과요오드산염은 강력한 산화제이고 비록 이웃의 탄소원자상의 수산기를 함유하는 탄수화물에 대해 선택적이지만[Fleury and Lange, 1932], 이것은 내부 Neu5Ac에 대해 시간-의존 분열을 일으킬 수 있다. 그러므로, 현 작업에서, 산화에 대한 콜로민산의 노출은 실온에서 100mM 과요오드 산염을 사용하여 15~60분으로 제한된다[Lifely et al., 1981]. 더우기, 과요오드산염이 빛에 노출된 후 분해됨에 따라 더욱 반응성 종이 생겨나므로[Dyer, 1956] 반응혼합물은 암실에 보관된다. 과요오드산염과 보로하이드라이드 처리 후 내부 알파-2,8-링크된 Neu5Ac 잔기의 강도는 겔 투과 크로마토그래피에 의해 측정되었고, 산화(CAO), 산화환원(CAOR), 이중 산화(CAORO) 재료에 대하여 얻은 크로마토그래프는 천연 CA의 것과 비교하였다. 산화(15분)(CAO)(6b), 환원(CAOR)(6c), 이중산화(1시간)(CAORO) 및 천연(6a)CA는 거의 동일한 용출 프로필을 나타내었고 연속 산화 및 환원단계가 폴리머 사슬의 중요한 분열을 가져왔다는 증거가 없다는 것을 발견하였다(도 6). 작은 피크들은 완충액염을 나타낸다.
CA의 산화상태의 정량적 측정은 표준으로서 글루코스를 사용한 알칼리성 용액에서의 페리시아나이드 이온의 페로시아나이드로의 환원에 의해 실행되었다[Park and Johnson, 1949]. 표 2는 산화된 콜로민산이 환원제의 화학양론적 양(>100%)보다 커야하고, 즉 환원 말단 헤미케탈과 (다른 말단에)도입된 알데히드의 결합된 환원력을 포함하는 외관 알데히드 함량의 112몰%이라는 것을 나타낸다. CAO에서의 ㅂ반응성은 보이지 않았고 알데히드와 헤미케탈 모두의 중화가 보로하이드라이드 환원에 의해 완전히 수행되었다는 것을 설명한다. 과요오드화염 산화의 두번째 순환 후, 폴리머의 알데히드 함량은 CAORO의 95%까지 회복되었고(실험적 에러 10% 이내)환원 말단에 새로운 알데히드 모이어티의 도입이 성공적이라는 것을 설명한다.
페리시아나이드를 사용한 이중 산화공정에서 콜로민산 중간체의 정량적 분석 결과(표 2)는 천연 CA와의 옅은 황색 침전, 및 폴리머의 형태를 함유하는 알데히드 와의 진한 오렌지색을 생성하고, 실온에서 반응의 10분 후 진한 오렌지 침전물을 가져오는 2,4-디니트로페닐히드라진으로 실시된 정량적 시험의 결과와 일치하였다.
표 2
CA종 산화도
콜로민산(CA) 16.1±0.63
산화된-콜로민산(CAO) 112.03±4.97
환원된-콜로민산(CAOR) 0;검출안됨
산화-환원-산화된 콜로민산(CAORO) 95.47±7.11
표 2: 기준으로 글루코스를 이용한 이중 산화 반응 도해에서 다양한 콜로민산 중간체의 산화도(100%, 글루코스 몰 당 알데히드 1몰). n=3s.d.
실시예 2 - Fab - 콜로민산 컨쥬게이트의 제조
Fab이 0.15M PBS(pH 7.4) 중에 용해되고 소디움 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3)의 존재하에 환원성 아미노화에 의해 다른 콜로민산(CA, CAO, CAOR 및 CAORO)에 공유 연결되었다. CA:Fab 몰 비율 (100:1)의 Fab과 함께 합성(출발 물질 및 실시예 1a 내지 c의 각각의 생성물)의 각 단계로부터의 콜로민산은 밀봉된 용기 내에 소디움 시아노보로하이드라이드(4mg/ml)를 함유하고 있는 0.15M PBS (pH 7.4; 2ml) 중에서 오븐에서 35±2℃로 자력 교반을 하여 반응되었다. 혼합물은 그 후 70% w/v 포화도를 달성하도록, 계속적으로 교반하는 동안, 천천히 염을 첨가함으로써 암모늄 술페이트((NH4)2SO4) 침전을 행했다. 1h 동안 4℃에서 교반된 샘플은 15분 동안 원심분리되었고(5000xg) 폴리시알산화된 Fab을 함유하고 있는 펠렛은 포화된 (NH4)2SO4 용액에서 현탁되었고 다시 15분 동안 원심분리되었다(5000xg). 재생된 침전물은 0.9% NaCl (pH 7.1; PBS)로 보충된 1ml의 0.15M Na 포스페이트 완충용액 에 재용해되었고 동일한 PBS에 대해 4℃로 광범위하게(24h) 투석되었다. 투석물은 그 후 시알산에 대해 분석되었고 Fab 내용물과 컨쥬게이션 수율은 CA: Fab 몰 비율이라는 용어로 표현되었다. 대조구는 기술된 조건 하에서, 비-산화된 CA의 존재시에 또는 CA의 부재시에 천연(native) 단백질에 컨쥬게이션 절차를 행하는 것을 포함했다. 부수되는 단백질의 변성을 피하기 위해 교반이 최소한도로 유지되었다. 폴리시알산화된 Fab은 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 추가로 특징이 부여되었다.
2b 이온 교환 크로마토그래피
반응 혼합물로부터의 0(대조구)및 48h 샘플(0.5ml)이 Sepharose SP 양이온 교환 컬럼(1ml; 유속 1ml/분; 결합/세척 완충용액 50mM 소디움 포스페이트, pH 4.0; 용출 완충용액, 1M 염화나트륨을 함유하고 있는 50mM 소디움 포스페이트 완충용액, pH 4.0)에 대해 이온 교환 크로마토그래피를 행했다. 컬럼은 세척되고, 용출되었고 용출 분획은 CA 및 단백질(Fab) 내용물에 대해 분석되었다. PD-10 컬럼은 컬럼에 적용시키기 전에 탈염 샘플을 위해 사용되었다.
2c SDS- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
SDS-PAGE(MiniGel, Vertical Gel Unit, model VGT 1, power supply model Consort E132; VWR, UK)는 폴리시알산화시 Fab의 분자 크기의 변화를 검출하기 위해 이용되었다. 방법 조절(비산화된 CA)뿐만 아니라 반응 혼합물로부터 나온 Fab 및 그것의 컨쥬게이트(CA, CAO, CAOR 및 CAORO와 같이)의 0(대조구) 및 48h 샘플의 SDS-PAGE는 4-20% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행되었다. 샘플은 넓은 범위 의 분자량 표지에 대해 보정되었다.
다른 단백질에 의한 이전의 실험[Jain et. al., 2003; Gregoriadis, 2001]에서 최적 CA:Fab (양의 IgG에서 유도됨) 몰 컨쥬게이션 수율은 48h동안 pH 6-9의 0.15M PBS 완충용액에서 35±2℃의 온도를 필요로 한다는 것이 발견되었다. 중합체 알데히드와 단백질간의 이러한 조건들 하에서 형성된 이민(쉬프 염기) 종은 안정한 이차 아민[Fermandes and Gregoriadis, 1996; 1997]을 형성하도록 NaCNBH3로 성공적으로 환원되었다. 산화된-과요오드화산염(periodate-oxidised) 천연 CA로의 단백질의 노출은 준안정(metastable) 쉬프 염기 CA-단백질 부가물(adduct)을 발생시킨다(카탈라아제의 폴리시알산화에 대해 보고된 것과 같이)[Fernandes and Gregoriadis, 1996]. 마찬가지로, CA의 산화된 형태의 Fab과의 반응에서, NaCNBH3(중합체의 알데히드 모이어티가 아니라, 쉬프 염기 이민 구조를 환원시킴)에 의한 선택적 환원(환원성 아미노화)에 의해 그 후 강화된, 37℃에서 48h 동안 산화된 중합체의 Fab과의 배양에 의해, 우리는 먼저 준안정 쉬프 염기 부가물을 만들었다. '이중 산화법'의 다양한 CA 중간체의 단백질 반응성에 특성을 부여하기 위해 Fab은 천연 CA(CA), 산화된 CA(CAO), 산화되고-환원된 CA(CAOR) 및 '이중 산화된' CA(CAORO)의 존재시에 환원성 아미노화를 행한다. 이러한 연구들을 위해 (100:1)의 CA:Fab 몰 비율에서 22.7kDa PAS가 사용되었다. NaCNBH3의 존재시에 배양 48h 후에, Fab 컨쥬게이트는 암모늄 술페이트와의 침전에 의해 반응 혼합물로부터 분리되었고(실시예에 기술되어 있듯이) 그 결과는 그 결과의 컨쥬게이트(표 3)에서의 CA:Fab 몰 비율이라는 용 어로 표현했다.
표 3: Fab (단백질) 콜로민산 화합물들의 합성.
Figure 112006010046539-PCT00015
천연의, 비-산화된 CA(시아노보로하이드라이드의 존재시)가 사용될 때, 중대하지만 낮은 수준의 컨쥬게이션이 환원 말단에서 CA의 헤미아세탈 기와의 반응에 의해 관찰되었다는 것은(0.21:1, CA:Fab 몰 비율로 끝남) 표3으로부터 명백하다.
CA-Fab 컨쥬게이트의 형성은 (NH4)2SO4(염의 존재시 침전되지 않는 CA)의 첨가시 두 모이어티의 공동-침전에 의해 추가로 확인되었다. 컨쥬게이션의 증거는 또한 이온 교환 크로마토그래피(IEC, 도시되지 않음) 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE; 도 7)에 의해 확인되었다.
이온-교환 크로마토그래피에 대해, (NH4)2SO4 침전에 의해 얻어진 폴리시알산화된 Fab은 소디움 포스페이트 완충용액(50mM, pH 4.0)에서 재용해되었고 Sepharose SP HiTrap 컬럼(양이온 교환)을 사용하여 IEC를 행했다. CA(세척에서) 및 Fab(용출된 분획에서)의 완전한 분해(resolution)를 나타내는 결과와 대조적으로, 세척 분획에 공동-용출된 48h 반응 샘플로부터의 CA 및 Fab 둘 다는 CA-Fab 컨쥬게이트의 존재를 나타낸다.
도 7은 상기에 설명된 항체 Fab 컨쥬게이트의 분석을 설명한다. 이들 데이터는 두 컨쥬게이트의 분자량 분포가 매우 유사하다는 것을 확증한다(예상되는 것과 같이, 비대칭적으로 2 기능성 CA로부터 얻어진 부산물이 분자 총 수의 작은 백분율만을 구성하므로). Fab 컨쥬게이트가 비대칭적으로 2 기능성 CA(즉, 과요오드화산염 산화된 천연 CA)로부터 제조되었는지, 또는 비유도된 Fab 대조구의 분자량으로부터 상승된, 넓은 분자량 분포의 컨쥬게이트가 만들어진 단일 기능성 PSA로부터 제조되었는지는 도 7로부터 또한 명백하다. 이는 우리의 이전의 발표된 연구에서 보고된 천연 중합체의 알려진 다중분산도(polydispersity)와 일치한다. 도 7은 또한 하나의 기능을 가진 CA에 의한 환원성 아미노화는 과요오드화산염 산화된 천연 CA를 기초로 하는 더 이른 방법에 필적하는 수율로 Fab 컨쥬게이트를 발생시킨다는 것을 확증한다(도 1에 기술됨). 단지 미량의 비유도된 Fab이 각각의 컨쥬게이트 샘플에 남았다는 것이 도 7로부터 또한 명백하다. 미량의 잔여 Fab은 생체 내 연구 이전에 이온 교환 크로마토그래피에 의해 이러한 컨쥬게이트들로부터 제거되었다(하기 실시예 3).
실시예 3 - 생체 내 연구
양의 IgG Fab 조각 또는 CAO나 CAORO를 가진 컨쥬게이트의 샘플들이 하기와 같이 I125로 방사성표지가 달렸다:
이들 샘플의 각각은 부피로써 10%가 제거되었고(~100㎕) 새로운 IODO-gen 튜브로 넣어졌다. 125I(as Nal)의 200mCi를 함유하고 있는 PBS의 20㎕ 샘플이 단백질 또는 컨쥬게이트에 첨가되었고 튜브는 캡핑되었고 실온에서 10분 동안 배양되었다. 튜브의 내용물은 그 후에 500㎕ 원심 필터(3.5kDa m.w. cut off)로 옮겨졌고 샘플은 마이크로원심분리기에서 6500rpm으로 회전되었다. 용출액은 버려졌고 보전물의 부피(막 위에)는 500㎕로 보충되었다. 이 과정은 Packard Cobra Gamma 계수기를 사용하여 5㎕ 샘플을 위한 상부 방사성(단백질) 및 하부(유리(free) 요오드) 막이 평가된 후에 추가로 5회 반복되었다. 유리 I125에 기인한 총수(counts)가 컨쥬게이트된 분획에서의 것의 5% 미만이었다면, 더 이상의 정제는 행하지 않았다. 유리 I125가 >5%이면 정제 주기는 반복되었고 샘플은 재평가되었다.
CD1 마우스(29-35g 체중)에게 마우스 당 40μg(PBS 중의 100㎕ 부피)의 단백질이(~ 1.6mg/kg) 단일 주사로써 i.v. 경로(꼬리 정맥)로 투여되었고 50㎕ 혈액 샘플이 그 후에 다른 꼬리 정맥으로부터 시간 간격을 두어서 취해졌고(헤파린화된 눈금새긴 모세관을 사용함) 500㎕ PBS로 첨가되었다. 기록된 마지막 블리드는 충분한 수를 허용하기 위해 총 블리드였다. 그 후 샘플은 3000rpm으로 10분간 원심분리되었고 기록된 상청이 제거되었고 감마 계수기 튜브에 넣어졌다. 샘플은 Packard Cobra Ⅱ 자동 감마 계수기에서 주사된 단백질의 대표 샘플과 함께 계수되었다. 기 록된 수는 주사된 원래 투여량의 백분율로써 표시되었다.
방사성-요오드화된 Fab, 및 CAO 및 CAORO Fab의 샘플들은 컨쥬게이트되고 혈액 순환에서 반감기를 측정하기 위해 마우스에게 정맥내 주사되었다. 도 8은 원래의 방법(CAO를 사용함) 및 신규한 이중-산화 방법(CAORO를 사용함)에 의해 제조된 자연 그대로의 Fab Vs Fab-콜로민산 컨쥬게이트의 약물동태학을 보여준다. 이러한 결과들은 비유도된 Fab의 경우보다 CAO-Fab 및 CAORO-Fab이 순환에서 현저하고 상당히 더 긴 잔류 시간을 일으킨다는 것을 증명한다. 그것은 자연 그대로의 Fab에 비교되는 AUC 값의 (각각) 6.28배 및 5.28배의 상승을 일으킨다.
실시예 4 - 말레이미드 컨쥬게이트의 합성
상기 실시예 1c에서 합성된 CAORO를 0.1M 소디움 아세테이트 중의 5 몰 당량의 N-[베타-말레이미도프로피온산]히드라지드와 2h 동안 37℃로 반응시켰다. 생성물 히드라존은 에탄올에서 침전되었고, 소디움 아세테이트에서 재현탁되었고 에탄올에서 다시 침전되었고 물에 재용해되었고 냉동-건조되었다. 생성물은 단백질과 펩티드들에서 시스테인 모이어티의 티올 기로의 자리-특이성 컨쥬게이션에 유용하다. 단일 기능성 폴리시알산 알데히드 유도체는 또한 티올 기와의 반응에 유용한 활성 말레이미드 작용성을 가지고 있는 안정한 히드라존을 형성하기 위해 히드라지드 모이어티 및 N-말레이미드 모이어티를 가지고 있는 연결 화합물과 반응될 수 있었다.
참조 실시예 2 - 이온 교환 크로마토그래피(CA, 22.7 KDa , pd 1.34)에 의한 콜로민산의 분획화 (CA, 22.7 kDa , pd 1.34)
참조 실시예 2.1 - 대규모로 분획화
XK50 컬럼(Amersham Biosciences, UK)이 900ml Sepharose Q FF(Amersham Biosciences)로 충전되었고 유속 50ml/분으로 3 컬럼 부피의 세척 완충용액(20mM 트리에탄올아민; pH 7.4)에 의해 평형시켜졌다. CA(200ml 세척 완충용액 중의 25 gram)는 주사기 포트에 의해 분 당 50ml로 컬럼상에 채워 넣어졌다. 1.5 컬럼 부피(1350ml)의 세척 완충용액으로 컬럼을 세척하는 것이 뒤따랐다.
결합 CA는 1.5 컬럼 부피의 다른 용출 완충용액(25mM NaCl 단계 중의 0mM~475mM의 NaCl을 가진 트리에탄올아민 완충용액, 20mM pH 7.4)으로 용출되었고 최종적으로 모든 잔여 CA 및 다른 잔여물(있다면)을 제거하기 위해 동일한 완충용액에서 1000mM NaCl로 용출되었다.
샘플은 5kDa 막(Vivascience, UK) 위로 고압 초미세여과법에 의해 20ml로 농축되었다. 이러한 샘플들은 4℃에서 반복된 초미세여과법에 의해 탈이온화된 물로 완충용액 교환되었다. 샘플들은 평균 분자량 및 GPC(실시예 1e에 보고되어 있듯이) 및 자연 PAGE(알시안 블루로 염색됨)에 의한 다른 파라미터에 대해 분석되었다.
참조 실시예 2.2
더 작은 규모로 분획화
하기 샘플들은 더 작은 규모에 동일한 세척 및 구배 시스템을 사용하여 분획되었다(1-5ml 매트릭스; 0.2-3 gram의 콜로민산):
콜로민산(CA, 22.7kDa, pd 1.34; CA, 39 KDa, pd=1.4), 콜로민산-알데히드(CAO, 22.7kDa, pd 1.34), 단일 기능성 콜로민산(CAORO, 22.7kDa; pd 1.34), 콜로 민산-아민(CA-NH2, 22.7kDa, pd 1.34), 콜로민산 말레이미드(CAM, 실시예 4 및 throughout 모니터되고 제조된 CA의 m.w. 에 따라)
상기 절차를 사용하여 제조된 CA의 좁은 분획은 10mM 과요오드화산염으로 산화되었고 중합체에 총 변성에 대한 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 및 자연 PAGE에 의해 분석되었다.
결과
표4
CA22 .7의 이온 교환 크로마트그래피 : 스케일 업(75ml 매트릭스, 3g의 CA)
Figure 112006010046539-PCT00016
콜로민산 및 그 유도체(22.7kDa)는 상이한 %의 수를 가진 46kDa까지의 평균 m.w.를 가진 1.1 이하의 다중분산도의 다양한 좁은 종으로 성공적으로 분획되었다.
도 9 및 10; 표 4는 5ml의 비율로 22.7kDa 물질을 분리시킨 결과를 보여준다. 도 9는 GPC 결과이고 도 10은 자연 PAGE이다.
이 과정은 각각의 눈금에 거의 동일한 분획 프로파일을 가진 매트릭스의 1ml~900ml까지 측량될 수 있었다.
더 큰 중합체(CA, 39kDa, pd 1.4)의 분획은 90kDa까지 종을 생성했다. 이 과정은 중합체의 더 큰 배치의 분획화를 위해 성공적으로 사용될 수 있다. 도 11은 공급된 것과 같은 3 CA 샘플에 대한, 그리고 표 4에서와 같이 분석된 이온-교환에 의해 분리된 분획에 대한 자연 PAGE 결과를 보여준다. PAGE 결과는 이온 교환 분획이 좁게 분산된다는 것을 보여준다. 이것은 22.7kDa CA로부터 분리된 3 분획에 대한 결과를 보여주는 도 12에서 보여지는 GPC 데이터와 일치한다. 보유 부피는 표 5에 보여진다.
표 5
Figure 112006010046539-PCT00017
22.7kDa 물질은 대규모로 분리된다. GPC를 사용하여 이온 교환으로부터의 분획이 분석된다. 표 6(도 참조)에서 보여지는 하기 분획은 재생되었다.
모든 좁은 분획은 10mM 과요오드화산염으로 성공적으로 산화되었고 샘플들이 제조 과정의 다른 단계로부터 취해졌고 GPC에 의해 분석되었고 자연 PAGE는 분자량과 다중분산도의 변화를 보여주지 않았다. 일부 샘플들의 데이터가 도 13에 도시된다.
2.3 콜로민산의 침전
분별 에탄올 침전은 다른 사슬 길이의 콜로민산을 침전시키는데 사용되었다.
결과
분별 에탄올 침전은 더 작은 CAs는 더 많은 에탄올(EtOH)를 필요로 한다는 것을 보여주었다. 넓은 p.d. 22.7kDa 중합체는 생성물 중합체의 >80%의 수득율을 제공하는 70% EtOH로 침전되었다. 더 낮은 MW 6.5kDa(pd<1.1)의 >80%의 침전물에 80% EtOH의 농도가 필요로 되었다. 이 과정은 또한 생성물을 오염시키는 염을 제거한다.
2.4 여과에 의한 콜로민산의 분획화
22.7kDa의 샘플은 다른 분자량 차단 막 상으로 초미세여과법에 의해 정제되었다(5, 10, 30, 50 및 100kDa). 모든 경우에 보전물은 GPC 및 자연 그대로의 PAGE에 의해 시험되었다.
결과
22.7kDa의 샘플은 다른 분자량에 대해 초미세여과법에 의해 정제되었고 차단 막은 중합체의 다중분산도의 감소 및 막 차단의 증가와 함께 더 큰 분자량을 향한 이동이 있었다는 것을 보여주었다(도 14).
조합된 방법들과 이온쌍 크로마토그래피가 또한 중합체의 분획을 위해 있을 수 있다.
실시예 5 - 성장 호르몬( GH )- 콜로민산 컨쥬게이트의 합성(넓게 그리고 좁게 분산된)
참조 실시예 2.2에서 제조된 산화된-콜로민산(CAO; 22.7kDa)) 및 좁게 분산된-산화된-콜로민산(NCAO; 27.7kDa pd=1.09; 40.9kDa. pd=1.02)은 GH 컨쥬게이트의 제조에 사용되었다.
성장 호르몬- 콜로민산 컨쥬게이트의 제조
성장 호르몬은 0.15M PBS(ph 7.4)에 용해되었고 다른 콜로민산(CAO 및 NCAO)에 공유 결합되었다. 다른 CAs(22kDa, CAO; 27.7kDa & 40.9kDa, NCA))는 CA:GH 몰 비율(12.5:1)로 GH(2mg)에 개별적으로 첨가되었다. 소디움 시아노보로하이드라이드가 4mg/ml의 최종 농도로 첨가되었다. 반응 혼합물은 밀봉되었고 24h 동안 35±2℃로 자기적으로 교반되었다. 혼합물은 그 후 70% w/v 포화도를 달성하도록, 계속적으로 교반하는 동안, 천천히 염을 첨가함으로써 암모늄 술페이트((NH4)2SO4) 침전을 행했다. 1h 동안 4℃에서 교반되고, 그 후에 15분 동안 회전되었고(5000xg) 펠렛은 포화된 (NH4)2SO4 용액에서 재현탁되었고 다시 15분 동안 회전되었다(5000xg). 재생된 침전물은 1ml PBS pH 7.4에서 재용해되었고 동일한 완충용액에 대해 4℃로 광범위하게(24h) 투석되었다. 대조구는 기술된 조건 하에서, 비-산화된 CA의 존재시에 또는 CA의 부재시에 컨쥬게이션 절차를 천연 단백질에 행하는 것을 포함했다. 부수되는 단백질의 변성을 피하기 위해 교반이 최소한도로 유지되었다. 폴리시알산화된 GH는 참조 실시예 2에 기술되어 있듯이 음이온 교환 크로마토그래피를 통과시켜졌고 생성물 분획은 SDS PAGE를 행했다.
결과
결과(도 15)는 조절 웰(GH가 있는)에서 샘플의 이동은 새로운 GH에 대한 것과 유사하다는 것을 보여준다. 컨쥬게이트 레인(lane)에서 폴리시알산화된-GH를 나타내는 질량의 증가를 전형적으로 나타내는 띠의 이동이 있다. 띠 폭은 넓게 분산된 중합체를 가진 컨쥬게이트에 비교하여 좁게 분산된 중합체를 가진 컨쥬게이트의 경우에 상당히 좁아진다. 더욱이, GH 컨쥬게이트(넓게 분산된 중합체를 가짐)는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 다른 종으로 분리되었다(도 16).
실시예 6 - 인슐린- 콜로민산 컨쥬게이트의 합성
실시예 1에서 제조된 활성화된 폴리시알산(산화된-콜로민산(CAO)) 및 단일 기능성 폴리시알산(산화된-환원된-산화된-콜로민산(CAORO))은 rh-인슐린 컨쥬게이트의 제조에 사용되었다.
인슐린- 콜로민산 컨쥬게이트의 제조
인슐린은 0.15M PBS(pH 7.4)에 의한 희석이 뒤따르는 15mM HCl의 최소 부피에 용해되었고 다른 콜로민산에 공유 연결되었다(CA, CAO 및 단일 기능성 CAORO). CA:인슐린 몰 비율(25:1)로 인슐린(2mg)과 함께 콜로민산(22kDa)이 배양기에서 35±2℃로 자기적 교반을 하면서 밀봉된 용기 내에 소디움 시아노보로하이드라이드(4mg/ml)을 함유하고 있는 0.15M PBS(pH 7.4; 2ml)에서 48h 동안 반응되었다. 혼합물은 그 후 70% w/v 포화도를 달성하도록, 계속적으로 교반하는 동안, 천천히 염을 첨가함으로써 암모늄 술페이트((NH4)2SO4) 침전을 행했다. 1h 동안 4℃에서 교반된 샘플은, 그 후에 15분 동안 회전되었고(5000xg) 펠렛은 포화된 (NH4)2SO4 용액에서 현탁되었고 다시 15분 동안 원심분리되었다(5000xg). 재생된 침전물은 0.9% NaCl(pH 7.4; PBS)로 보충된 1ml 0.15M Na 포스페이트 완충용액에서 재용해되었고 동일한 PBS에 대해 4℃로 광범위하게(24h) 투석되었다. 투석물은 그 후에 시알산에 대해 분석되었고 단백질 내용물과 컨쥬게이션 수율은 CA: 인슐린 몰 비율(실시예 1에서와 같이)라는 용어로 표현되었다: 대조구는 기술된 조건 하에서, 비-산화된 CA의 존재시에 또는 CA의 부재시에 천연 단백질에 컨쥬게이션 절차를 행하는 것을 포함했다. 부수되는 단백질의 변성을 피하기 위해 교반이 최소한도로 유지되었다. 폴리시알산화된 인슐린은 이온 교환 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 추가로 특징이 부여됐다. 결과는 결과 컨쥬게이트에서의 인슐린 CA:인슐린 몰 비율이라는 용어로 표현된다(표 7).
표 7: 인슐린 (단백질) 콜로민산 화합물의 합성
Figure 112006010046539-PCT00018
천연, 비-산화된 CA(시아노보로하이드라이드의 존재시)가 사용될 때, 중대하 지만 낮은 수준의 컨쥬게이션이 환원 말단에서 CA의 헤미아세탈 기와의 반응에 의해 관찰되었다는 것은(0.07:1, CA:인슐린 몰 비율로 끝남) 표 4로부터 명백하다.
CA-인슐린 컨쥬게이트의 형성은 (NH4)2SO4(염의 존재시 침전되지 않는 CA)의 첨가시 두 모이어티의 공동-침전에 의해 추가로 확인되었다. 컨쥬게이션의 증거는 또한 이온 교환 크로마토그래피(IEC) 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)에 의해 확인되었다.
실시예 7 - 생체 내 연구
실시예 6의 인슐린 및 폴리시알산화된 인슐린 구성체는 정상 암컷 T/O 무작위교배계 마우스(22-24 그램 체중)의 혈중 글루코스 수준을 감소시키는 그것들의 능력에 대해 시험되었다. 동물은 5개 군으로 나뉘었고, 인슐린을(마우스 당 0.9% 염화나트륨 중의 0.3 유니트 또는 폴리시알산화된 인슐린의 동일한 단백질 당량으로) 피하주사시켰고(s.c.) 혈액 샘플 내 글루코스 수준은 글루코스 분석 키트(Accu-Chek Advantage, Roche, UK)를 사용하여 시간 간격을 두고 측정되었다.
결과
폴리시알산화된 인슐린 구성체의 약리적 활성은 피하 주사된 정상 쥐의 완전한 인슐린의 것과 비교되었고 시간 간격을 두고 출혈시켜졌다. 3 인슐린에 대한 마우스의 혈중 글루코스 수준은 도 17에 도시된다. 데이터 점은 5 샘플의 평균을 보여주고 에러 막대기는 s.e.m. 값이다. 도 17의 결과는 폴리시알산화된 인슐린이(본래의 방법에 의해(CAO를 사용) 그리고 새로운 이중-산화 방법에 의해(단일 기능성 CAORO를 사용) 제조됨)) 혈중 글루코스 수준의 더 연장된 감소를 발휘함을 분명히 보여준다. 따라서, 글루코스 수준이 완전한 인슐린으로 처리 2시간 후에 정상 수준으로 되돌아 가기에 0.75 시간의 최저값을 달성한 반면에, 폴리시알산화된 펩티드로 처리된 마우스의 글루코스 수준은, 비록 0.75h에 가장 낮지만, 6시간에는 정상 수치로 되돌아왔다. 이러한 결과들은 비유도된 인슐린의 경우보다 CAO-인슐린 및 CAORO-인슐린이 순환에서 현저하고 상당히 더 긴 잔류 시간을 일으킨다는 것을 증명한다. 그것은 천연 인슐린에 비교되는 커브 위 구역의 증가를 일으킨다.
참조
Figure 112006010046539-PCT00019
Figure 112006010046539-PCT00020
Figure 112006010046539-PCT00021

Claims (45)

  1. 환원 말단에 시알산 유니트를 가지고 있는 출발 물질에 하기의 순차적인 단계가 행해지는 시알산의 알데히드 유도체를 제조하는 방법:
    a) 환원 말단 시알산 유니트에서 고리를 환원적으로 개방시키는 환원함에 의해서, 근접한 디올 기가 형성되는 단계; 및
    b) 알데히드 기를 형성하도록 근접한 디올 기를 산화시키는 선택적 산화 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 환원 말단에의 시알산 유니트는 8 탄소 원자를 통해 근접한 유니트에 결합됨에 의해 단계 b)에서 6,7의 근접한 디올 기가 탄소-7 원자 상에 알데히드를 형성하도록 산화되는 것인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 출발 물질이 근접한 디올 기를 가지는 비-환원 말단에 터미날 사카라이드 유니트를 갖고, 출발 물질은 근접한 디올 기를 알데히드로 산화시키는 선택적 산화의 예비 단계를, 단계 a) 이전에, 행함에 의해, 단계 a)에서 알데히드는 또한 근접한 디올 기의 일부가 아닌 히드록시 기를 형성하기 위해 환원되는 것인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 비-환원 말단에의 사카라이드 유니트는 시알산 유니트인 것인 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 물질은 디-, 올리고-, 또는 폴리-사카라이드인 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 폴리사카라이드는 실질적으로 시알산 유니트로만 이루어진 폴리시알산인 것인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 폴리사카라이드는 분자 내에 2 이상의, 바람직하기는 5 이상의 또는 더 바람직하기는 10 이상의, 가장 바람직하기는 50 이상의 시알산 유니트를 가지는 것인 방법.
  8. 제 2항 및 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 예비 산화 단계는 실질적으로 폴리사카라이드 사슬의 중앙-사슬 절단이 없도록 하는 조건 하에 수행되는 것인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 예비 산화 단계는 1mM~1M 농도 범위, 3~10의 pH 범위, 0℃~60℃의 온도 범위 및 1분~48시간의 시간 범위에서, 과요오드화산염의 존재 하에 수용액에서 수행되는 것인 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)는 출발 물질 상에의 펜던트(pendent) 카르복시 기가 환원되지 않도록 하는 조건 하에 수행되는 것인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 a)는 1μM~0.1M 농도 범위, 6.5~10의 pH 범위, 0℃~60℃의 온도 범위 및 1분~48시간의 시간 범위에서, 보로하이드라이드의 존재 하에 수용액에서 수행되는 것인 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 알데히드 유도체는 일차 아민 기 또는 히드라지드 기를 가지는 기질과 반응되는 것인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 생성물이 환원되는 것인 방법.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 기질은 펩티드 또는 단백질인 것인 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 기질은 펩티드 치료약(therapeutic)인 것인 방법.
  16. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 기질은 작용기 치환체 및 아민을 결합시키는 2염기성 유기 기 또는 히드라지드 기 및 작용기를 가지는 화합물인 것인 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 생성물은 연이어서 티올 기를 가지는 화합물, 바람직하기는 단백질과 반응되는 것인 방법.
  18. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 기질은 약물 전달 시스템, 세포, 바람직하기는 미생물 세포 또는 동물 세포, 바이러스 또는 합성 중합체인 것인 방법.
  19. 하나 이상의 시알산 유니트를 포함하는 디-, 올리고 또는 폴리-사카라이드의 알데히드 유도체인 화합물로, 여기서 환원 말단의 터미날 유니트는 알데히드 모이어티를 포함하거나 OR 기이고, 여기서 R은
    Figure 112006010046539-PCT00022
    Figure 112006010046539-PCT00023
    -CH2CH2NHR1, CH2CH=N-NHR1 및 CH2CH2NHNHR1으로부터 선택되고, 여기서 R1은 H, C1-24 알킬, 아릴 C2 -6 알카노일, 또는 폴리펩티드 또는 N 터미날 또는 라이신 잔기의 γ-아민 기를 통해 연결된 단백질, 약물 전달 시스템이거나, 또는 술프히드릴 기와의 반응을 위해 적응된 작용성 치환체를 가지는 유기 기인 것인 화합물.
  20. 제 19항에 있어서, 화합물은 비-환원 말단에서 부동태화된(passivated) 유니트를 가지는 것인 화합물.
  21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 일반식 Ⅰ을 가지고
    Figure 112006010046539-PCT00024
    여기서 R3 및 R4는 하기로부터 선택되는 것인 화합물:
    ⅰ) R3은 H이고 R4는 OH이고;
    ⅱ) R이 CH(CHO)CH2OH 또는 -CH2CHO인 경우에, R3 및 R4는 함께 =O이고;
    ⅲ) R이 CH(CH2OH)CH2NHR1 또는 -CH2CH2NHR1인 경우에, R3은 H이고 R4는 -NHR1이고;
    ⅳ) R이 -CH(CH2OH)CH2NHNHR1이거나 -CH2CH2NHNHR1인 경우에, R3은 H이고 R4는 -NHNHR1이거나; 또는
    ⅴ) -CH2CH=N-NHR1이고, R3 및 R4는 함께 = N-NHR1이고; Ac는 아세틸이다.
  22. 제 21항에 있어서, R3는 H이고 R4는 OH인 화합물.
  23. 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 모든 사카라이드 유니트가 서로에 2-8, 2-9 또는 교대 2-8/2-9 결합된 시알산인 폴리사카라이드인 화합물.
  24. 제 23항에 있어서, 폴리사카라이드 사슬에 2 이상의, 바람직하기는 5 이상의, 더 바람직하기는 10 이상의, 가장 바람직하기는 50 이상의 시알산 유니트를 가지는 화합물.
  25. 제 19항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 단백질 또는 펩티드 또는 약물 전달 시스템인 것인 화합물.
  26. 제 19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, R은
    Figure 112006010046539-PCT00025
    인 것인 화합물.
  27. 제 19항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, R은
    Figure 112006010046539-PCT00026
    인 것인 화합물.
  28. 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 펩티드 또는 단백질 치료학, 바람직하기는 항체 또는 단편인 화합물.
  29. 제 19항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, R1은
    Figure 112006010046539-PCT00027
    기이고, R2는 2염기성 유기 기, 바람직하기는 C2 -12-알칸디일 기인 것인 화합물.
  30. 제 19항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 희석제를 포함하는 조성물.
  31. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 비-환원 터미날 말단에 터미날 시알산을 가지는 시알산 출발 물질에 하기 단계를 행하는 것인 방법:
    c) 7-알데히드를 형성하도록 7,8 근접한 디올 기에 비-환원 말단 시알산 유니트를 산화시키는 선택적 산화 단계; 및
    d) 상응하는 알콜로 7-알데히드 기를 환원시키는 환원 단계.
  33. 제 32항에 있어서, 출발 물질은 디-, 올리고-, 또는 폴리-사카라이드인 것인 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 폴리사카라이드는 중간-사슬 시알산 유니트를 포함하고, 바람직하기는 실질적으로 시알산 유니트로만 이루어진 것인 방법.
  35. 제 32항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 단계는 환원 말단 유니트를 산화시키는 산화 단계가 뒤따르지만 비-환원 말단 유니트의 산화와 환원 반응에서 생성된 모이어티를 산화시키지는 않는 것인 방법.
  36. 제 32항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 단계 (c)는 1mM~1M 범위의 농도, 3~10 범위의 pH, 0~60℃ 범위의 온도 및 1분~48시간 범위의 시간에 과옥소산의 존재 하에 수용액에서 수행되는 것인 방법.
  37. 제 32항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 환원 단계 d)는 1μM~0.1M 범위의 농도, 6.5~10 범위의 pH, 0~60℃ 범위의 온도 및 1분~48시간 범위의 기간에 보로하이드라이드의 존재 하에 수용액에서 수행되는 것인 방법.
  38. 일반식 Ⅱ를 가지는 화합물로,
    Figure 112006010046539-PCT00028
    여기서 Ac는 아세틸이고;
    m은 0 이상이고;
    Gly1O는 글리코실이고; 그리고
    R5는 유기 기인 것인 화합물.
  39. 제 38항에 있어서, R은
    Figure 112006010046539-PCT00029
    Figure 112006010046539-PCT00030
    -CH2CH2NHR1, CH2CH=N-NHR1 및 CH2CH2NHNHR1으로부터 선택되고, 여기서 R1은 H, C1-24 알킬, 아릴 C2 -6 알카노일, 또는 N 터미날 또는 라이신 잔기의 γ-아민 기를 통해 연결된 폴리펩티드 또는 단백질이거나, 약물 전달 시스템이거나, 술프히드릴 기와의 반응을 위해 적응된 작용성 치환체를 가지는 유기 기인 것인 화합물.
  40. 제 39항에 있어서, R5는 일반식 Ⅲ의 기인 것인 화합물.
    Figure 112006010046539-PCT00031
  41. 제 38항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, GlyO 기가 시알산을 포함하고, 바람직하기는 실질적으로 시알산으로만 이루어진 것인 화합물.
  42. 제 39항에 있어서, R5는
    Figure 112006010046539-PCT00032
    인 것인 화합물.
  43. 제 42항에 있어서, R1은 펩티드 또는 단백질 치료약, 바람직하기는 항체 또는 단편인 것인 화합물.
  44. 제 43항에 따른 화합물 및 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  45. 제 38항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 희석제를 포함하는 조성물.
KR1020067002900A 2003-08-12 2004-08-12 단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체 KR101113726B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03254989.1 2003-08-12
EP03254989 2003-08-12
PCT/GB2004/003511 WO2005016974A1 (en) 2003-08-12 2004-08-12 Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060096981A true KR20060096981A (ko) 2006-09-13
KR101113726B1 KR101113726B1 (ko) 2012-02-27

Family

ID=34178604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067002900A KR101113726B1 (ko) 2003-08-12 2004-08-12 단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체

Country Status (7)

Country Link
US (4) US7807824B2 (ko)
EP (1) EP1654290B1 (ko)
JP (1) JP4566194B2 (ko)
KR (1) KR101113726B1 (ko)
ES (1) ES2735809T3 (ko)
RU (1) RU2333223C2 (ko)
WO (2) WO2005016949A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190022717A (ko) * 2016-06-27 2019-03-06 콘티프로 에이.에스. 다당류의 불포화 유도체, 그 제조 방법 및 용도

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101113726B1 (ko) 2003-08-12 2012-02-27 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체
ES2640767T3 (es) * 2004-08-12 2017-11-06 Lipoxen Technologies Limited Fraccionamientodepolisacáridos cargados
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US8299015B2 (en) 2006-07-25 2012-10-30 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor
GB0615067D0 (en) * 2006-07-28 2006-09-06 Ttp Communications Ltd Reconfigurable signal processing scheme
EP2101821B1 (en) * 2006-12-15 2014-08-13 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
JP2010520320A (ja) 2007-02-28 2010-06-10 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリシアル酸におけるエンドトキシンの低減
DK2120774T3 (da) * 2007-03-16 2011-01-10 Bien Air Holding Sa Håndholdt del til dental eller kirurgisk anvendelse
WO2010045321A2 (en) * 2008-10-15 2010-04-22 Baxter International Inc. Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
TW201042257A (en) * 2009-05-26 2010-12-01 Baxter Int Detection of antibody that binds to water soluble polymer-modified polypeptides
NZ597600A (en) 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
SG10201401194VA (en) 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
EP2459224B1 (en) 2009-07-27 2016-06-01 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
WO2011028229A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
RU2522846C2 (ru) * 2009-11-30 2014-07-20 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации Лекарственный препарат и способ улучшения реологических свойств мокроты и ингаляционное применение такого препарата
EP2536753B1 (en) 2010-02-16 2017-12-20 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
KR102269494B1 (ko) 2010-07-30 2021-06-25 박스알타 인코퍼레이티드 옥심 결합용 친핵성 촉매
NZ612320A (en) 2010-12-22 2015-06-26 Baxter Healthcare Sa Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
CA3012117A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Baxalta Incorporated Fusions of psa with serpins and other therapeutic proteins
AU2012267484B2 (en) 2011-06-10 2017-03-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
IN2014CN02448A (ko) 2011-09-23 2015-06-19 Novo Nordisk As
LT2804623T (lt) 2012-01-12 2019-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc Chimeriniai viii faktoriaus polipeptidai ir jų panaudojimas
RS63870B1 (sr) 2012-02-15 2023-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih
HUE043537T2 (hu) 2012-02-15 2019-08-28 Bioverativ Therapeutics Inc Rekombináns VIII faktor fehérjék
AU2013204754C1 (en) 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
JP2015525222A (ja) 2012-06-08 2015-09-03 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． キメラ性凝固因子
JP2015521589A (ja) 2012-06-08 2015-07-30 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． プロコアグラント化合物
LT2882450T (lt) 2012-07-11 2020-03-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii komplekso su xten ir von vilebrando faktoriumi baltymas ir jo panaudojimas
MX362275B (es) 2013-04-18 2019-01-10 Novo Nordisk As Co-agonista de peptido similar a glucagon tipo 1 (glp-1) receptor de glucagon de larga duracion, estables para uso medico.
EP3013358A4 (en) 2013-06-28 2017-03-22 Biogen MA Inc. Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
CN116731201A (zh) 2014-01-10 2023-09-12 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
WO2015130963A2 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Xenetic Biosciences, Inc. Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain
CN106536547A (zh) 2014-06-04 2017-03-22 诺和诺德股份有限公司 用于医疗用途的glp‑1/胰高血糖素受体共激动剂
AU2015323769A1 (en) 2014-09-26 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof
EA201700181A1 (ru) 2014-10-14 2017-09-29 Галозим, Инк. Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
EP3331608A4 (en) 2015-08-03 2019-05-01 Bioverativ Therapeutics Inc. FUSION XI FUSION PROTEINS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME
KR20180088727A (ko) 2015-12-03 2018-08-06 박스알타 인코퍼레이티드 연장된 반감기 및 감소된 리간드-결합 특성을 가진 인자 viii
MA45473A (fr) 2016-04-04 2019-02-13 Shire Human Genetic Therapies Inhibiteur de c1 estérase conjugué et ses utilisations
MX2019002489A (es) 2016-09-02 2019-10-21 Sanofi Pasteur Inc Vacuna contra neisseria meningitidis.
CA3056248A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
WO2018197547A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Lipoxen Technologies Limited Methods of treating diseases related to net formation with parenteral administration of polysialylated dnase i
WO2018197545A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Lipoxen Technologies Limited Methods of treating multiple myeloma cancers expressing high levels of epo-receptor using psa-epo
AR115024A1 (es) 2018-03-28 2020-11-18 Bristol Myers Squibb Co PROTEÍNAS DE FUSIÓN INTERLEUCINA-2 / RECEPTOR a DE INTERLEUCINA-2 Y MÉTODOS DE USO
CN114903978A (zh) 2018-07-03 2022-08-16 百时美施贵宝公司 Fgf-21配制品
WO2020099513A1 (en) 2018-11-13 2020-05-22 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of blinatumomab
WO2020163269A1 (en) * 2019-02-04 2020-08-13 Xenetic Biosciences, Inc. Methods of using glycopolysialylated therapeutic proteins
JP2022537369A (ja) 2019-06-18 2022-08-25 バイエル アクチェンゲゼルシャフト 長期安定化のためのアドレノメデュリン－類似体およびその使用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US375006A (en) * 1887-12-20 Lafayette w
US375008A (en) * 1887-12-20 Die for making wood type
US375010A (en) * 1887-12-20 Chaeles a
US4356170A (en) * 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US5097020A (en) * 1983-07-05 1992-03-17 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
JPS63264493A (ja) * 1986-12-29 1988-11-01 Mect Corp 活性カルボニル基を持つシアル酸誘導体
DK0504202T3 (da) 1989-12-14 1995-10-02 Ca Nat Research Council Forbedret meningokok-polysaccharid-konjugat vaccine
JP2975632B2 (ja) * 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン
GB9112212D0 (en) * 1991-06-06 1991-07-24 Gregoriadis Gregory Pharmaceutical compositions
US5846951A (en) * 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
US5352670A (en) * 1991-06-10 1994-10-04 Alberta Research Council Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides
US5329028A (en) * 1992-08-05 1994-07-12 Genentech, Inc. Carbohydrate-directed cross-linking reagents
AUPO284096A0 (en) * 1996-10-08 1996-10-31 Macquarie Research Limited Glycan derivatives
EP1035137A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
ES2256234T3 (es) 2000-05-16 2006-07-16 Lipoxen Technologies Limited Derivatizacion de proteinas en solucion acuosa.
KR101113726B1 (ko) * 2003-08-12 2012-02-27 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체
RU2327703C2 (ru) * 2003-08-12 2008-06-27 Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед Производные полисиаловой кислоты
US8299015B2 (en) * 2006-07-25 2012-10-30 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190022717A (ko) * 2016-06-27 2019-03-06 콘티프로 에이.에스. 다당류의 불포화 유도체, 그 제조 방법 및 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US20070191597A1 (en) 2007-08-16
WO2005016974A1 (en) 2005-02-24
US7807824B2 (en) 2010-10-05
KR101113726B1 (ko) 2012-02-27
EP1654290A1 (en) 2006-05-10
WO2005016949A3 (en) 2005-03-31
RU2333223C2 (ru) 2008-09-10
US10406209B2 (en) 2019-09-10
US20140220046A1 (en) 2014-08-07
US8653255B2 (en) 2014-02-18
ES2735809T3 (es) 2019-12-20
JP2007501889A (ja) 2007-02-01
RU2006107546A (ru) 2007-09-20
WO2005016949A2 (en) 2005-02-24
US20110082077A1 (en) 2011-04-07
US9452224B2 (en) 2016-09-27
JP4566194B2 (ja) 2010-10-20
EP1654290B1 (en) 2019-03-13
US20170007706A1 (en) 2017-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101113726B1 (ko) 단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체
JP5795040B2 (ja) タンパク質の誘導体化及び結合のための活性化シアル酸誘導体
US20220133898A1 (en) Derivatisation of Insulin with Polysaccharides
US9828443B2 (en) Fractionation of charged polysaccharide
JP2022058911A (ja) 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150128

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160129

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170202

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180202

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190201

Year of fee payment: 8