ES2569066T3

ES2569066T3 - Conjugación N-terminal de ácido polisiálico a proteínas

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Publication number: ES2569066T3
Application number: ES07766361.5T
Authority: ES
Inventors: Sanjay Jain; Peter Laing; Gregory Gregoriadis
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Current assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 2006-07-25
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2016-05-06
Anticipated expiration: 2027-07-25
Also published as: WO2008012542A8; US8981050B2; JP2009544681A; EP2630972A2; EP2041167B1; US20100022441A1; US9040478B2; US20140309166A1; EP2043692A2; JP5941440B2; JP2009544680A; US20180289823A1; US20150147307A1; KR20090057370A; JP5912152B2; US20170119893A1; US9579393B2; US20100056427A1; US20160129123A1; ES2647528T3

Abstract

Un método para producir un derivado N-terminal purificado de una proteína o un péptido, en el que (i) un polisacárido activado que es un ácido polisiálico se hace reaccionar en el grupo amina del N-terminal de una proteína o un péptido en una disolución ácida acuosa a un pH en el intervalo de 3 a 6,5 para producir un derivado Nterminal, y (ii) el derivado N-terminal resultante se purifica en una disolución acuosa con un pH mayor que en la etapa (i) y que está en el intervalo de 6,5 a 9,5.

Description

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necesario a pH 5,0, se cargó sobre la columna AEX previamente equilibrada con tampón A de AEX. Las fracciones de carga se recolectaron y se etiquetaron. La columna se lavó con tampón A de AEX (al menos 5 volúmenes de columna), las fracciones se recogieron (cada fracción de 1,5 de volumen de columna) y se etiquetaron. El producto se eluye con el tampón B de AEX (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 0,65 M, pH 7,0), las fracciones se recogieron (cada fracción de 1 de volumen de columna; 6 columnas) y se etiquetaron. Si dos fracciones consecutivas no contenían proteínas (UV 280 nm), se sigue hasta la siguiente etapa. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación. Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm) (la absorbancia de 1 mg/ml de G-CSF es de aproximadamente 0,872). Se tomaron muestras para SDS-PAGE y SE-HPLC. Para eliminar el CA libre de la mezcla se empleó HIC. Las muestras se concentraron si fue necesario.

Las fracciones de AEX que contenían el conjugado se reunieron y se añadió (NH4)2SO4 para obtener una concentración de 2,75 M en la disolución de carga. Esta disolución después se cargó sobre la columna HIC previamente equilibrada con tampón A de HIC (fosfato de sodio 10 mM, sulfato de amonio 2,75 M, pH 6,5). Las fracciones de carga se recogieron (cada fracción de 1,5 de volumen de columna) y se etiquetaron. La columna se lava con tampón A de HIC (al menos 5 volúmenes de columna; velocidad = 0,5 ml/min); las fracciones (1,5 volúmenes de columna) se recogieron y se etiquetaron. El producto se eluye con el tampón B de HIC (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4) (velocidad = 5 ml/min); las fracciones se recogieron (fracciones de 1 volumen de columna; 6 volúmenes de columna) y se etiquetaron. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación. Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm). Las fracciones de HIC que contenían el conjugado purificado se reunieron y se ajustó la composición del conjugado en la disolución con una disolución de sorbitol al 50% y una disolución de Tween 20 10 mg/ml para obtener una composición final de sorbitol al 5% y Tween 20 0,025 mg/ml. Después la disolución se concentró a 4  1°C y la concentración de proteínas se analizó mediante UV (280 nm). Puede realizarse una mayor purificación mediante SE-HPLC (por ejemplo, para separar los conjugados de la proteína libre/agregados, etc.). El conjugado se esterilizó mediante filtración y se tomaron muestras para el ensayo de actividad y para la caracterización mediante SDS-PAGE y SE-HPLC. Si es necesario se retira una parte alícuota para el ensayo de proteínas y el ensayo de CA. Se conserva el resto a 4  1°C hasta su uso posterior y se estudia la estabilidad física mediante SE-HPLC.

Se estudiaron los efectos de diversos procesos que afectan a la estabilidad de GCSF en disolución y el grado de derivatización.

Resultados

El procedimiento para preparar y purificar conjugados de ácido colomínico (CA) (en una escala de 20 mg) del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) de una manera selectiva para el N-terminal realizando la reacción a un pH reducido (pH 5,5) y a 4  1°C se detalló anteriormente. Esto implica la conjugación en presencia de cianoborohidruro de sodio, seguido de una purificación empleando una cromatografía de intercambio iónico (AEX) para eliminar el G-CSF libre, seguido de la eliminación del CA mediante una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Se empleó un pH bajo para favorecer la derivatización selectiva del grupo alfa-amino del N-terminal, y también para minimizar la agregación de GCSF durante la reacción. La composición del tampón de reacción final fue de sorbitol al 5%, Tween 20 0,5 mg/ml en NaOAc 10 mM a pH 5,5.

La formación de los conjugados de GCSF-CA se confirmó mediante SE-HPLC (cambio en los tiempos de retención de GCSF-CS comparado con GCSF; también coelución de ambos restos), una cromatografía de intercambio iónico (unión de los conjugados a la columna AEC) y una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; desplazamiento de las bandas con especies de alto peso molecular). Los conjugados utilizados en el ensayo de la línea celular in vitro (en células MNFS-60) fueron aproximadamente 40% activos comparados con la proteína nativa. Los conjugados preparados sin aditivos de la formulación condujeron a la agregación de las proteínas con un bajo grado de derivatización. La figura 3.1, parte izquierda, muestra los datos de SE-HPLC para una mezcla de reacción de GCSF-CA 39 kDa después de 24 horas, preparada en presencia de Tween 20. Las condiciones de la caracterización fueron Superdex 200, bicarbonato de amonio 0,15 M, pH 7,8. La tabla 2 muestra el análisis de los picos:

Tabla 2

Pico: TR % de área Especie

1: 31,683 8,80 agregados

2: 42,683 11,77 (CA)2-GCSF

3: 49,058 68,55 CA-GCSF

4: 68,833 10,89 GCSF

La parte derecha de la figura 3.1 muestra los resultados de SDS-PAGE.

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menos 10 ml), las fracciones se recogieron y se etiquetaron. El producto se eluye con el tampón C de AXC (tampón fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 7,0), se recogió la primera fracción (0,5 ml) y después fracciones de 0,5-1 ml, y se etiquetaron. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación.

Puede realizarse una purificación alternativa mediante SE-HPLC (por ejemplo, para separar los conjugados de EPO si el CA utilizado tiene un peso molecular alto, por ejemplo 39 kDa). Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm) (la absorbancia de 1 mg/ml de EPO es de aproximadamente 0,743). Se toman muestras para la SDS-PAGE.

Se retira una parte alícuota para el ensayo de proteínas y el ensayo de CA. El resto se conserva a -20°C hasta su uso. Los productos se caracterizaron mediante SDS-PAGE. Para determinar la actividad de las muestras de EPO para inducir la proliferación in vitro se emplearon células progenitoras de eritrocitos aisladas del bazo de un ratón que se hizo anémico artificialmente mediante una inyección intraperitoneal de fenilhidrazina. El protocolo se adaptó basándose en el método indicado por Krystal [1972]. El ensayo depende de la adición de EPO a progenitores de eritrocitos y la medición de la velocidad de replicación del ADN mediante la determinación de la velocidad de incorporación de 3H-timidina. Los estudios de farmacocinética (PK) y de farmacodinámica (PD) in vivo se realizaron en ratones B6D2F1.

Resultados

La formación de los conjugados de EPO-CA se confirmó mediante SE-HPLC (cambio en el tiempo de retención de EPO-CA comparado con EPO; también coelución de ambos restos), una cromatografía de intercambio iónico (unión de los conjugados a la columna AEC) y una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; desplazamiento de las bandas con especies de alto p.m.) (figura 5.3). Las muestras polisialiladas eran activas in vitro y mostraron un perfil muy superior (PK y PD) a la EPO normal. Las figuras 5.1 y 5.2 muestran los resultados in vivo.

La figura 5.3, parte izquierda, muestra los datos de SE-HPLC de una conjugación de EPO-CA 39 kDa después de 24 horas. La tabla 3 es la tabla de análisis de los picos. Condiciones de caracterización: columna Superdex 200, tampón bicarbonato de amonio 0,15 M, pH 7,8.

Tabla 3

Pico: TR % de área Especie

1: 31,421 3,38 agregados

2: 48,346 80,76 CA39-EPO

3: 59,204 15,86 EPO

6.1 Preparación de conjugados (NGepo-CA) no glicosilados N-terminales (ejemplo comparativo)

La EPO desnuda se suministró como una disolución (0,18 mg/ml en tampón fosfato de sodio 20 mM, NaCl 300 mM, pH 6,65; actividad específica 100000 U/ml; p.m. 19000) y se conservó a -32°C, la proteína se descongeló a 2-8°C y la cantidad requerida se introdujo en un tubo Eppendorf de 2 ml. Se calculó la cantidad de ácido colomínico (por ejemplo, ácido colomínico oxidado o no oxidado) para ser añadido a la conjugación. Se pesó la cantidad requerida de ácido colomínico y se registró el peso. Se añadió la disolución de proteínas al CA sólido y se mezcló suavemente. Se añadieron los microlitros de disolución de cianoborohidruro de sodio requeridos para obtener 50 mM o 3,17 mg/ml en la mezcla de reacción, se mezcló en vórtice y se comprobó el pH de la mezcla de reacción final; si es necesario se ajusta el pH a 7,4. El tubo se selló y se agitó a la temperatura deseada (4  1°C) durante 24 horas. Después de la incubación se tomaron las muestras necesarias (por ejemplo, para el ensayo de actividad, SDS-PAGE, SE-HPLC).

6.2 Purificación y caracterización de conjugados de NGepo-CA

El resto de la muestra de la mezcla de reacción se diluyó con tampón A de HIC (sulfato de amonio 1,2 M, pH 6,3) (1 ml de muestra + 4 ml de tampón A) y se cargó en la columna HIC previamente equilibrada con tampón A de HIC. Las fracciones de carga se recolectaron y se etiquetaron. La columna se lavó con tampón A de HIC (al menos 10 ml) y las fracciones se recogieron y se etiquetaron. El producto se eluye con el tampón B de HIC, se recoge la primera fracción (0,5 ml) y después fracciones de 0,5-1 ml, y se etiquetan. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación. Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm) (la absorbancia de 1 mg/ml de nEPO es de aproximadamente 0,743). Se toman muestras para la SDS-PAGE. Las condiciones de reacción no dejaron EPO desnuda libre en la mezcla de reacción, así que no necesaria otra purificación. Si había EPO desnuda en la mezcla de reacción, las fracciones de HIC que contenían proteínas se concentran empleando Vivaspin 6 (5000 de corte de peso molecular), y la purificación puede realizarse mediante SE-HPLC. Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm) (la absorbancia de 1 mg/ml de nEPO es de aproximadamente 0,743). Se toman muestras para la SDS-PAGE.

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Se retira una parte alícuota para el ensayo de proteínas y el ensayo de CA. El resto se conserva a -20°C hasta su uso. El producto puede caracterizarse mediante SDS-PAGE.

Resultados

La formación de los conjugados de NGepo-CA se confirmó mediante SE-HPLC (cambio en el tiempo de retención de NGepo-CA comparado con NGEPO; también coelución de ambos restos), una cromatografía de intercambio iónico (unión de los conjugados a la columna AEC) y una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; desplazamiento de las bandas con especies de alto peso molecular) (figuras 6.1 a 6.3). La figura 6.3, parte izquierda, muestra la conjugación de EPO-CA 39k Da después de 24 horas. Las muestras polisialiladas eran activas in vitro y mostraron un perfil muy superior (PK y PD) a la NGepo normal.

La figura 6.3 muestra los resultados de SE-HPLC. El análisis de los picos se muestra en la siguiente tabla 4. Condiciones de caracterización: columna Superdex 200, tampón bicarbonato de amonio 0,15 M, pH 7,8.

Tabla 4

Pico: TR % de área Especie

1: 31,863 3,41 agregados

2: 33,212 6,65 agregados

3: 42,667 14,72 (CA)2-EPO

4: 48,571 74,49 CA-nEPO

5: 68,183 0,73 nEPO

La figura 6.1 muestra los resultados de la eliminación in vivo. PSA-NGEPO muestra un perfil muy superior, comparado con NGEPO.

7.1 Preparación de conjugados de insulina-CA N-terminales

La insulina se disolvió en un mínimo de HCl 100 mM y después se ajustó hasta el pH requerido. Se calculó la cantidad de ácido colomínico (por ejemplo, ácido colomínico oxidado o no oxidado) para la conjugación. La cantidad requerida de ácido colomínico se pesó y se disolvió en un volumen mínimo de tampón de reacción, se añadió a la disolución de proteínas y se mezcló suavemente utilizando un mezclador de vórtice. Se añadieron los microlitros de disolución de cianoborohidruro de sodio requeridos para obtener una concentración final de 4 mg por ml de mezcla de reacción. Se emplea un estabilizante adecuado, si se requiere, en la mezcla de reacción. El tubo se selló y se agitó a la temperatura deseada (37°C; según sea apropiado) durante 48 horas. El tiempo y la temperatura pueden variar según la proteína utilizada. La proteína polisialilada se purificó mediante IEC y HIC. Se logró 100% de la conjugación de proteína-polímero después de 24 horas. Se caracterizó mediante PAGE nativo, SDS-PAGE, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, etc.

En la IEC, se purifican la insulina y los conjugados de insulina-ácido colomínico mediante una cromatografía de intercambio catiónico en una columna High Trap SP para separar la insulina polisialilada (no se une a la columna) de la insulina libre (que se retiene en la columna). Esto implica la separación del conjugado por debajo de su punto isoeléctrico de 5,2 (al menos una unidad por debajo) utilizando una resina de intercambio catiónico. La actividad de estos conjugados se determinó en ratones sanos.

7.2 Purificación y caracterización de conjugados de insulina-CA

La muestra de la mezcla de reacción se diluyó 5 veces con tampón A de AEX (acetato de sodio 0,05 M, pH 4,4), se comprobó el pH y se ajustó si fue necesario a pH 4,4, se cargó en la columna AEX (velocidad = 1 ml/min) previamente equilibrada con tampón A de AEX. Las fracciones de carga se recolectaron (cada fracción de 1,5 de volúmenes de columna) y se etiquetaron. La columna se lavó con tampón A de AEX (acetato de sodio 0,05 M, pH 4,4) (al menos 5 volúmenes de columna, velocidad = 1 ml/min), las fracciones se recogieron (cada fracción de 1,5 de volumen de columna y se etiquetaron. El producto se eluye con el tampón B de AEX (acetato de sodio 0,05 M, cloruro de sodio 1 M, pH 4,4) (velocidad = 1 ml/min), las fracciones se recogieron (cada fracción de 1 de volumen de columna; 6 columnas) y se etiquetaron. Si dos fracciones consecutivas no contenían proteínas, se sigue hasta la siguiente etapa. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación.

Las fracciones de AEX que contenían el conjugado se reunieron y se diluyeron 10 veces con tampón A de HIC (sulfato de amonio 0,8 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4), el pH se ajustó a 7,4 con una disolución de ácido clorhídrico o una disolución de hidróxido de sodio. Esta disolución después se cargó sobre la columna HIC (velocidad = 0,3 ml/min) previamente equilibrada con tampón A de HIC (sulfato de amonio 0,8 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4). Las fracciones de carga se recogieron (cada fracción de 1,5 de volumen de columna) y se etiquetaron. La columna se lava con tampón A de HIC (al menos 5 volúmenes de columna; velocidad = 0,5 ml/min); las

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fracciones (1,5 volúmenes de columna) se recogieron y se etiquetaron. El producto se eluye con el tampón B de HIC (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4) (velocidad = 5 ml/min); las fracciones se recogieron (fracciones de 1 volumen de columna; 6 volúmenes de columna) y se etiquetaron. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación. Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm). Las fracciones de HIC que contenían el conjugado purificado se reunieron y se concentraron a 4  1°C y se analizó la concentración de proteínas mediante UV (280 nm).

Resultados

La formación de los conjugados de insulina-CA se confirmó mediante SE-HPLC (cambio en el tiempo de retención de insulina-CA comparado con la insulina; también coelución de ambos restos), una cromatografía de intercambio iónico (unión de los conjugados a la columna CEC) y una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; desplazamiento de las bandas con especies de alto peso molecular) (figuras 7.1 a 7.2). Las muestras polisialiladas mostraron una mayor eficacia in vivo, comparado con la proteína nativa.

En la figura 7.2, las condiciones de HPLC fueron las siguientes: columna: Superose 12; tampón: fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,9); caudal: 0,25ml/min; volumen de inyección: 200 l.

8.1 Preparación de conjugados de interferón-CA N-terminales

El procedimiento para preparar y purificar conjugados de ácido colomínico (CA) de IFNalfa2b implica la conjugación en presencia de cianoborohidruro de sodio, seguido de una purificación mediante HIC para eliminar el ácido colomínico libre, seguido de la eliminación del IFN no conjugado mediante AXC o SE-HPLC (si es necesario) (ejemplo 1 mg escala).

El IFNalfa2b fue suministrado como una disolución (1,75 mg/ml en tampón acetato, pH 5) y se conservó -32°C. La proteína se descongeló a 2-8°C y la cantidad requerida se introdujo en un tubo Eppendorf de 2 ml. Si la concentración de proteína en la mezcla de reacción era menor que 1,75 mg/ml, entonces se diluyó con la cantidad requerida de PBS, pH 7,4.

La cantidad requerida de CA se pesó y se registró. El CA se solubilizó en el volumen mínimo de tampón de reacción, se añadió a la disolución de proteína y se mezcló suavemente empleando un mezclador de vórtice. Se añadieron los microlitros requeridos para obtener 50 mM o 3,17 mg/ml en la mezcla de reacción, se mezcló suavemente, y se comprobó el pH de la mezcla de reacción final; si es necesario se ajusta el pH a 6,0. El tubo se selló y se agitó a la temperatura deseada (4  1°C) durante 24 horas. Se tomaron las muestras necesarias después del tiempo de incubación (por ejemplo, para el ensayo de actividad, SDS-PAGE, SE-HPLC).

8.2 Purificación y caracterización de conjugados de interferón-CA

El resto de la muestra de la mezcla de reacción se diluyó con tampón A de HIC (tampón Tris 25 mM, cloruro de sodio 3 M, pH 7,5) (1 ml de muestra + 4 ml de tampón A) y se cargó en la columna HIC previamente equilibrada con tampón A de HIC. Las fracciones de carga se recolectaron y se etiquetaron. La columna se lavó con tampón A de HIC (tampón Tris 25 mM, cloruro de sodio 3 M, pH 7,5) (al menos 10 ml), las fracciones se recogieron y se etiquetaron. La columna se eluyó con tampón B de HIC (tampón Tris 25 mM, pH 7,5), se recogió la primera fracción (0,5 ml) y después fracciones de 0,5-1 ml, y se etiquetaron. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación.

Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm) (la absorbancia de 1 mg/ml de IFN es de aproximadamente 1). Se toman muestras para la SDS-PAGE.

La separación del IFN no conjugado se realizó empleando una cromatografía de intercambio aniónico (AXC) o SEHPLC. Para la AXC, las fracciones de HIC que contenían la proteína se diluyeron con el tampón A de AXC (tampón Tris 25 mM, pH 7,5) (1 ml de muestra + 5 ml de tampón A de AXC) y se cargaron en la columna AXC preequilibrada con tampón A de AXC. Las fracciones de carga se recolectaron y se etiquetaron. La columna se lavó con tampón B de AXC (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5) (al menos 10 ml), las fracciones se recogieron y se etiquetaron. El producto se eluye con el tampón C de AXC (tampón fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 7), se recogió la primera fracción (0,5 ml) y después fracciones de 0,5-1 ml, y se etiquetaron. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificación.

Se realiza otra purificación mediante SE-HPLC (por ejemplo, para separar los diconjugados de los monoconjugados). (figura 8.1)

Se analiza la concentración de proteínas mediante UV (280 nm) (la absorbancia de 1 mg/ml de IFN es de aproximadamente 1) o mediante un ensayo BCA. Se tomaron muestras para SDS-PAGE. Se retiró una parte alícuota para el ensayo de proteínas y el ensayo de CA. El producto remanente se conservó a -20°C hasta su uso. El producto se caracterizó mediante SDS-PAGE. La actividad se determinó en una línea de células Daudi.

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Resultados

La formación de los conjugados de interferón-CA se confirmó mediante SE-HPLC (cambio en el tiempo de retención de interferón-CA comparado con el interferón; también coelución de ambos restos), una cromatografía de intercambio iónico (unión de los conjugados a la columna AEC) y una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; desplazamiento de las bandas con especies de alto peso molecular) (figuras 8.1 a 8.2). Las muestras polisialiladas eran activas in vitro y mostraron un perfil muy superior (PK) al interferón normal.

La tabla 5 muestra el análisis de los picos del SE-HPLC en la figura 8.1.

Tabla 5

Agregado: Tr % del área

32,1: 4,3

CA-IFN (di-): 55,1 9,7

CA-IFN (mono-): 62,4 56,2

IFN libre: 74,7 29,4

9.1. Polisialilación de obestatina

La obestatina es una hormona supresora del apetito de 2,5 kDa. Aunque está codificada por el gen de grelina, la obestatina se opone a los efectos estimulantes del apetito de la grelina Se ha demostrado que el tratamiento con obestatina en ratas suprime la ingesta de alimentos, inhibe la contracción del yeyuno, y disminuye la ganancia de peso.

9.2 Conjugación N-terminal (específica de sitio)

Se disolvió un exceso en 15 molar de ácido polisiálico 14 kDa oxidado (PSA) en tampón y se ajustó el pH a 6,0. Entonces se añadió obestatina y cianoborohidruro de sodio 50 mM (concentración final), se reajustó el pH, y la mezcla de reacción se llevó al volumen requerido. Las reacciones se realizaron a 4  1°C con agitación suave durante 18 horas.

9.3 Conjugación aleatoria (comparativo)

Se disolvió un exceso en 10 molar de PSA 14 kDa oxidado en tampón, y el pH se ajustó a 7,4. Entonces se añadió obestatina y cianoborohidruro de sodio 50 mM (concentración final), se reajustó el pH, y la mezcla de reacción se llevó al volumen requerido. Las reacciones se realizaron a 4  1°C con agitación suave durante 18 horas.

Análisis de la conjugación

La conjugación se confirma mediante una disminución en el tiempo de retención, que significa un mayor tamaño, en una cromatografía líquida de alta resolución de exclusión molecular (SE-HPLC). Se inyectaron 100 l de la reacción de conjugación en una columna SE-HPLC Superose 12 preequilibrada con fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,9, con un caudal de 0,25 ml/min. Se registra la absorbancia a 280 nm.

Los conjugados se visualizan mediante una disminución en la movilidad en una electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (figura 9). Las muestras se sometieron a una electroforesis en gel de Tris-glicina al 4-20% bajo condiciones no desnaturalizantes. Carril 1: marcadores de peso molecular; 2: obestatina; 3: reacción a pH 6,0; 4: reacción a pH 7,4.

Según se confirmó mediante SE-HPLC, los conjugados de obestatina-PSA fueron creados con éxito a pH 6,0 y pH 7,4. Los conjugados creados a pH 7,4 también se visualizan mediante SDS-PAGE.

10.1 Polisialilación de la ADNasa I

En pacientes con fibrosis quística (CF), la retención de secreciones purulentas viscosas en las vías respiratorias contribuye a una menor función pulmonar y a la exacerbación de las infecciones. Las secreciones pulmonares purulentas contienen concentraciones muy altas de ADN extracelular, que es liberado por leucocitos en degeneración que se acumulan en respuesta a una infección. El tratamiento de los pacientes de CF con desoxirribonucleasa I (ADNasa I) hidroliza el ADN y así reduce la viscoelasticidad del esputo. También se ha propuesto para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico y para el transporte dirigido a tumores.

10.2 Conjugación N-terminal (específica de sitio)

Se disolvió un exceso en 20 molar de ácido polisiálico 26 kDa oxidado (PSA) en tampón y se ajustó el pH a 6,0. Entonces de añadió ADNasa I bovina (Samsong & Sigma) y cianoborohidruro de sodio 50 mM (concentración final),

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se reajustó el pH, y la mezcla de reacción se llevó al volumen requerido. Las reacciones se realizaron a 37  1°C y a 4  1°C con agitación suave durante 18 horas.

10.3 Conjugación aleatoria (comparativo)

Se disolvió un exceso en 10-50 molar de PSA 14 kDa oxidado en tampón, y el pH se ajustó a 7,4. Entonces de añadió ADNasa I bovina (Samsong & Sigma) y cianoborohidruro de sodio 50 mM (concentración final), se reajustó el pH, y la mezcla de reacción se llevó al volumen requerido. Las reacciones se realizaron a 37  1°C y a 4  1°C con agitación suave durante 18 horas.

10.4 Análisis de la conjugación

Los conjugados se visualizan mediante una disminución en la movilidad en una electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (figura 10.1). Las muestras se sometieron a una electroforesis en gel de Tris-glicina al 4-20% bajo condiciones no desnaturalizantes. Carril 1: marcadores de peso molecular; 2: blanco; 3: ADNasa I; 4: ADNasa I de Sigma; 5: blanco; 6: ADNasa I con PSA no oxidado; 7: PSA oxidado con ADNasa I, reacción a pH 7,4; 8: PSA oxidado con ADNasa I, reacción a pH 6,0.

10.5 Purificación de conjugados

Los conjugados de ADNasa I-PSA se purificaron empleando una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC): matriz de fenil-Sepharose, tampón de partida con sulfato de amonio 2,0 M, elución en tampón sin sulfato de amonio. Las fracciones de elución después se aplicaron a una matriz de intercambio iónico Q-Sepharose Fast Flow, y se eluyeron con tampón que contenía cloruro de sodio. La purificación de los conjugados se confirmó mediante una cromatografía líquida de alta resolución de exclusión molecular (SE-HPLC) (figura 10.2). Se inyectaron 100 l de la reacción de conjugación en una columna SE-HPLC Superose 12 preequilibrada con fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,9, con un caudal de 0,25 ml/min. Se registra la absorbancia a 280 nm.

Los conjugados de ADNasa I-PSA muestran un menor tiempo de retención en una columna de exclusión molecular, comparado con la ADNasa I sola.

10.6 Purificación de ADNasa I activa

La ADNasa I activa se purificó a partir de una mezcla de ADNasa I activa e inactivada por calor mediante una cromatografía de heparina-Sepharose. La mezcla de ADNasa I se aplicó a la columna en un tampón con bajo contenido en sales, y se eluyó con un gradiente creciente de cloruro de sodio. La actividad por mg de la ADNasa I en la fracción A12 fue aproximadamente 4 veces mayor que la de la muestra.

10.7 Actividad de los conjugados

Se midió la actividad de los conjugados y se comparó con la de la ADNasa I no conjugada empleando el ensayo de verde de metilo (Sinicropi et al. (1994), Anal. Biochem., 222(2):351-358). Los conjugados de ADNasa I-PSA purificados creados a 37  1°C mostraron aproximadamente 10% de actividad (en tampón CaCl2 4 mM (véase a continuación)), comparado con la ADNasa I no conjugada.

Se midió el efecto de la titulación de CaCl2 sobre la actividad de hidrólisis del ADN de la ADNasa I y de los conjugados de ADNasa l-PSA (n = 1) (figura 10.3). El CaCl2 es un aditivo de la formulación. Se dispuso el ensayo de ADNasa I de verde de metilo y se añadió más CaCl2. La actividad se expresa con relación a la actividad en un tampón CaCl2 4 mM. El ensayo de ADNasa I de verde de metilo se dispuso con ADNasa I conjugada y libre, y el CaCl2 se añade a concentraciones variables hasta una concentración máxima de 100 mM. Se descubrió que la adición de CaCl2 aumenta la actividad de la ADNasa I conjugada más que la de la ADNasa I libre. Así, se requiere más CaCl2 para la actividad completa de los conjugados de ADNasa l-PSA.

Conclusión

Se han creado conjugados de ADNasa l-PSA activos en presencia de cianoborohidruro de sodio. Los conjugados se han purificado a partir de ADNasa I libre y mostraron aproximadamente 10% de actividad por mg de ADNasa I, comparado con la de la ADNasa I libre.

Referencias

Fernandes, A.I., Gregoriadis, G., Polysialylated asparaginase: preparation, activity and pharmacokinetics, Biochimica et Biophysica Acta, 1341 (1997), 26-34.

Fernandes, A.I., Gregoriadis, G., Synthesis, characterization and properties of polysialylated catalase, Biochimica et Biophysica Acta, 1293 (1996), 92-96.

Gregoriadis, G., McCormack, B., Wang, Z., Lifely, R., Polysialic acids: potential in drug delivery, FEBS Letters, 315 (1993), 271-276.

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Claims

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