ES2344670T3 - Derivatizacion del factor estimulante de colonias granulociticas (gcsf). - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que es un derivado polisacárido N-terminal del GCSF, o de una proteína parecida al GCSF, en el que el polisacárido es el ácido polisiálico que posee al menos 2 unidades de ácido siálico unidas una a la otra a través de enlaces α2,8 ó α2,9 y está compuesto de entre 2 y 200 unidades sacáridas.
Description
Derivatización del factor estimulante de
colonias granulocíticas (GCSF).
La presente invención hace referencia a
derivados polisacáridos novedosos del GCSF y a métodos para producir
dichos derivados. Los derivados son útiles para mejorar la
estabilidad, la farmacocinética y la farmacodinámica del GCSF.
El Factor Estimulante de Colonias Granulocíticas
(GCSF, CSF3) es una glicoproteina. Puede actuar como una hormona,
un factor de crecimiento o una citoquina y la producen cierto número
de tejidos diferentes para estimular que la médula ósea produzca
granulocitos y células madre. El GCSF también estimula la
supervivencia, proliferación, diferenciación y funcionamiento de
los precursores de neutrófilos y los neutrófilos maduros.
El GCSF es producido por el endotelio, los
macrófagos y cierto número de otras células inmunitarias. La
glicoproteína humana natural existe de dos formas, una proteína
larga de 174 y 180 aminoácidos con un peso molecular de 19,600
gramos por mol. La forma de 174 aminoácidos, más abundante y más
activa, se ha utilizado en el desarrollo de productos farmacéuticos
mediante la tecnología de ADN recombinante (ADNr). El GCSF de los
ratones fue reconocido y purificado por primera vez en Australia en
1983, y la forma humana fue clonada por grupos procedentes de Japón
y los Estados Unidos en 1986. El receptor de GCSF está presente
en células precursoras de la médula ósea, y, en respuesta a la
estimulación provocada por el GCSF, inicia la proliferación y la
diferenciación en granulocitos maduros.
El GCSF estimula la producción de glóbulos
blancos. En oncología y hematología, se utiliza una forma
recombinante del GCSF con determinados pacientes con cáncer para
acelerar la recuperación de la neutropenia tras la quimioterapia,
permitiendo regímenes de tratamiento de mayor intensidad. La
quimioterapia puede causar mielosupresión y niveles
inaceptablemente bajos de glóbulos blancos, haciendo que los
pacientes sean propensos a infecciones y sepsis. El GCSF también se
utiliza para incrementar el número de células madre hematopoyéticas
en la sangre antes de la recogida mediante leucoféresis para su uso
en los trasplantes de células madre hematopoyéticas.
El GCSF recombinante humano sintetizado en un
sistema de expresión de E. coli se denomina filgrastim. La
estructura del filgrastim difiere ligeramente de la estructura de la
glicoproteína natural. La mayoría de los estudios publicados han
utilizado el filgrastim. El filgrastim (Neupogen®) es una forma
comercialmente disponible del GCSFrh (GCSF recombinante
humano).
Otra forma de GCSF recombinante humano, el
lenograstim, se sintetiza en las células de los ovarios de los
hámsteres chinos. Dado que éste es un sistema de expresión de
células de mamíferos, es imposible de distinguir el lenograstim del
GCSF humano natural de 174 aminoácidos. Aún no se han identificado
consecuencias clínicas o terapéuticas de las diferencias entre el
filgrastim y el lenograstim, y no se han realizado estudios
comparativos formales.
Se han hecho intentos por derivatizar el GCSF
para mejorar sus propiedades farmacocinéticas. Existe un producto
en el mercado, el PEG-filgrastim (Neulasta®), que es
una forma derivatizada del polietilenglicol del GCSF. Se ha
demostrado que éste posee una vida media mayor que el filgrastim,
reduciendo la necesidad de inyecciones diarias. El diseño y
desarrollo del PEG-filgrastim viene descrito con más
detalle en Curr. Pharm Des. 2004; 10(11):
1235-44.
US20070014759 describe conjugados entre partes
de moléculas de PEG y GCSF que están unidas a través de un grupo de
enlace glicosilo intacto. Los conjugados se forman a partir de
péptidos tanto glicosilados como no glicosilados a través de la
acción de una glicosiltransferasa en aminoácidos de cadena media.
US6956027 facilita las condiciones para modificar de forma
selectiva el extremo N-terminal del GCSF con
PEG.
Otros han derivatizado el GCSF con moléculas que
no son PEG. WO 2005/014050, por ejemplo, describe el GCSF unido
covalentemente a almidón de hidroxialquilo.
En vista del estado anterior de la técnica,
existe la necesidad de proporcionar derivados mejorados del GCSF
que se puedan utilizar en terapia humana y animal y que posean una
estabilidad y vida media optimizadas y baja toxicidad. Hemos
descubierto que unir PSAs al GCSF confiere dichas propiedades y de
ese modo hemos llegado a esta invención. Ésta es la primera vez que
se ha descrito el GCSF unido en el extremo
N-terminal a polisacáridos aniónicos.
Los ácidos polisiálicos (PSAs) son polímeros del
ácido siálico no ramificados presentes de forma natural producidos
por determinadas cepas bacterianas y en los mamíferos en ciertas
células. Pueden producirse en diferentes grados de polimerización
desde n= alrededor de 80 ó más residuos de ácido siálico hasta n=2
mediante hidrólisis ácida limitada o mediante digestión con
neuraminidasas, o mediante fraccionamiento de las formas naturales
derivadas de manera bacteriana del polímero.
En los últimos años, se han aprovechado las
propiedades biológicas de los ácidos polisiálicos, en particular
las del ácido polisiálico homopolimérico unido con enlaces
alfa-2,8, para modificar las propiedades
farmacocinéticas de las moléculas de fármacos de bajo peso
molecular y de proteínas. La derivatización del ácido polisiálico
da lugar a aumentos espectaculares en la vida media de cierto número
de proteínas terapéuticas circulantes incluyendo la catalasa y la
asparaginasa, y también permite que se puedan utilizar dichas
proteínas con anticuerpos preexistentes generados como una
consecuencia no deseada (y a veces inevitable) a una exposición
previa a la proteína terapéutica [Fernandes y Gregoriadis, 2006;
Jain et. al., 2003, 2004]. El ácido polisiálico unido con
enlaces alfa-2,8 ofrece una alternativa atractiva al
PEG, siendo un polímero biodegradable inmunológicamente invisible
que forma parte de manera natural del cuerpo humano, y que se
degrada, a través de neuraminidasas de los tejidos, en ácido
siálico, un sacárido no tóxico.
Anteriormente hemos descrito métodos para la
unión de polisacáridos (en especial el PSA) a agentes terapéuticos
como por ejemplo las proteínas
[US-A-5846.951;
WO-A-0187922]. Algunos de estos
métodos dependen de la derivatización química del extremo "no
reductor" del polímero para crear una parte de una molécula de
aldehído reactiva a las proteínas que reaccione ante grupos amina
primarios. Una unidad terminal de ácido siálico no reductora,
debido a que contiene dioles vecinos, puede oxidarse fácilmente (y
de forma selectiva) con peryodato para producir una forma de
monoaldehído, que es mucho más reactiva ante las proteínas, y que
comprende un elemento adecuadamente reactivo para la unión de las
proteínas a través de la aminación reductiva y otros comportamientos
químicos. La reacción viene ilustrada en las Figuras 1 y 2 en las
que:
La Figura 1 muestra la oxidación del ácido
colomínico (ácido polisiálico unido con enlaces
alfa-2,8 de E. coli) con peryodato de sodio
para formar un aldehído reactivo ante las proteínas en el extremo no
reductor; y
La Figura 2 muestra la reducción selectiva de la
base de Schiff con cianoborohidruro de sodio para formar un enlace
covalente irreversible y estable con el grupo amino de las
proteínas.
Se pueden generar subproductos de forma no
intencionada durante las reacciones de conjugación convencionales
descritas anteriormente mediante la reacción del ácido colomínico
con cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo. Estos puede que
sean suficientes como para dar problemas en la fabricación de
conjugados químicamente definidos requeridos por las autoridades
reguladoras para el uso terapéutico en el hombre y los animales.
No resulta sencillo purificar el producto de
reacción buscado (por ejemplo el producto monopolisialilado) de los
diferentes productos no deseados, dado que las características
fisicoquímicas de la mayoría de los productos de reacción son
similares. Esto significa que técnicas como la cromatografía de
intercambio iónico y la cromatografía de permeación en gel (que
separan basándose respectivamente en la carga y el tamaño) producen
perfiles de purificación pobres. Este problema se puede superar
reduciendo la complejidad de los productos en la reacción de
conjugación. Hemos desarrollado un nuevo método para la conjugación
de polisacáridos con proteínas según el que puede utilizarse la
alta reactividad del extremo N-terminal de la
proteína y que evita la complejidad de los productos que se obtiene
usando el método establecido (Figura 1 y 2) de la aminación
reductiva de las proteínas con ácido colomínico natural oxidado con
peryodato.
De conformidad con un primer aspecto de esta
invención proporcionamos un compuesto que es un derivado
polisacárido N-terminal del GCSF, o de una proteína
parecida al GCSF, según el que el polisacárido es un ácido
polisiálico y está compuesto de entre 2 y 200 unidades
sacáridas.
En lo sucesivo, cuando utilicemos el término
GCSF, también es nuestra intención cubrir las proteínas parecidas
al GCSF. Por proteína parecida al GCSF, nos referimos a cualquier
compuesto biológico que posea la actividad del factor estimulante
de colonias granulocíticas humano (a) cuya secuencia de aminoácidos
sea al menos en un cincuenta por ciento (50%) idéntica a la ID DE
SECUENCIA Nº 1, y (b) que posea al menos un treinta y cinco por
ciento (35%), preferentemente al menos un 50%, más preferentemente
al menos un 60 ó un 70% de la actividad del factor estimulante de
colonias granulocíticas humano tal y como se mide mediante un
bioensayo en comparación con la Norma Internacional de la
Organización Mundial de la Salud para el factor estimulante de
colonias granulocíticas humano (Humano, derivado del ADNr) según se
mide de conformidad con el bioensayo descrito en el Ejemplo 1.
Las proteínas parecidas al GCSF también pueden
denominarse "homólogas del GCSF". Si dos secuencias son
homólogas se calcula de forma rutinaria utilizando la identidad o
similitud porcentual, términos que son bien conocidos en la
técnica. Las secuencias deberían compararse con la ID DE SECUENCIA
Nº 1, que es el GCSF humano con número de registro en Swissprot
P09919. El GCSF activo son los residuos 30-207 de
esta secuencia. Las secuencias de las homólogas del GCSF pueden
compararse o bien con la totalidad de la ID DE SECUENCIA Nº 1, o con
los residuos 30-207 de la misma. Preferentemente,
la homóloga se compara con el GCSF activo.
WO-A-2005055946,
WO-A-03031464 y Glycobiology
16(9), páginas 833-843 (2006) describen
conjugados de polisacáridos con proteínas.
En esta invención las homólogas poseen un 50% o
más de identidad en el nivel de los aminoácidos, más preferentemente
un 60%, 70%, 80% o más, más preferentemente un 90% o más, como por
ejemplo un 95% ó un 99% de identidad en el nivel de los
aminoácidos. Hay disponibles cierto número de programas para
calcular la identidad; los programas preferentes son los programas
BLASTn, BLASTp y BLASTx, ejecutados con parámetros por defecto,
disponibles en www.ncbi.nlm.nih.gov. Por ejemplo, 2 secuencias de
aminoácidos pueden compararse utilizando el programa BLASTn con
parámetros por defecto (puntuación = 100, longitud de palabra = 11,
valor previsto = 11, filtrado de baja complejidad = activado). Los
niveles anteriores de homología pueden calcularse utilizando estos
parámetros por defecto.
El GCSF puede ser glicosilado o no
glicosilado.
En esta invención, el término GCSF incluye el
GCSF natural extraído del cuerpo de un ser humano o de un mamífero
y versiones sintéticas del mismo, tales como el GCSF recombinante
humano, por ejemplo el filgrastim y el lenograstim tal y como se ha
analizado anteriormente. También se incluyen los mutantes del GCSF
que poseen una actividad adecuada parecida al GCSF, tal como los
mutantes de la cisteina.
Por "derivado N-terminal",
nos referimos a que el polisacárido aniónico derivatiza el GCSF en
su grupo amina N-terminal.
Preferentemente, el polisacárido posee al menos
2, más preferentemente al menos 5, lo más preferentemente al menos
10, por ejemplo al menos 50 unidades sacáridas.
El polisacárido aniónico es un ácido polisiálico
y consta básicamente solamente de unidades de ácido siálico. Sin
embargo, el polisacárido puede poseer unidades que no sean de ácido
siálico en la molécula. Por ejemplo, las unidades de ácido siálico
pueden alternarse con otras unidades sacáridas. Preferentemente, sin
embargo, el polisacárido consta básicamente de unidades de ácido
siálico.
El polisacárido posee un grupo de ácido siálico
terminal y es un ácido polisiálico, esto es un polisacárido que
está compuesto de al menos 2 unidades de ácido siálico unidas la una
a la otra a través de enlaces
\alpha-2-8 o
\alpha-2-9. Un ácido polisiálico
adecuado posee un peso molecular medio de entre 2 y 200 kDa,
preferentemente de entre 5 y 75 kDa. Lo más preferentemente, el
ácido polisiálico deriva de una fuente bacteriana, por ejemplo el
polisacárido B de E. coli K1, N. meningitidis, Maraxella
liquefaciens ó Pasteurella aeruginosa ó el polisacárido
K92 de la cepa K92 de E. coli. Lo más preferentemente es el
ácido colomínico de E. coli K1.
El ácido polisiálico puede tener la forma de una
sal o del ácido libre. Puede tener una forma hidrolizada, de modo
que el peso molecular se haya reducido tras la recuperación de una
fuente bacteriana.
El polisacárido, preferentemente el ácido
polisiálico, puede ser un material que posea una amplia gama de
pesos moleculares tal como por ejemplo poseer una polidispersidad de
más de 1,3, por ejemplo tanto como 2 ó más. Preferentemente la
polidispersidad del peso molecular es de menos de 1,3 ó 1,2, más
preferentemente de menos de 1,1, por ejemplo tan pequeña como
1,01.
Típicamente, el compuesto de esta invención es
un derivado del ácido polisiálico del GCSF y consta de
80-180 unidades de ácido siálico. Más típicamente,
el compuesto consta de 100-150 unidades de ácido
siálico. Preferentemente, el compuesto consta de
120-145, lo más preferentemente de
130-140 unidades de ácido siálico.
El compuesto de conformidad con el primer
aspecto de esta invención puede ser un conjugado unido
covalentemente entre el extremo N-terminal del GCSF
o una proteína parecida al GCSF y un polisacárido aniónico. Entre
otros medios de asociación entre el polisacárido y el GCSF se
incluyen la atracción electrostática. Sin embargo, se prefiere el
enlace covalente. El enlace covalente puede ser un enlace amídico
entre un grupo carboxilo y un grupo amina. Otro enlace por el que
el GCSF podría unirse covalentemente al polisacárido es a través de
una base de Schiff. Los grupos adecuados para conjugarse con aminas
se describen con mayor profundidad en WO 2006/016168.
El polisacárido puede estar unido al GCSF a
través de su unidad terminal o bien reductora o no reductora. Una
cadena polisacárida puede estar unida en ambas unidades terminales a
proteínas del GCSF. Esto significa que una cadena polisacárida
puede estar unida a dos proteínas del GCSF, es decir, estar
derivatizada tanto en su extremo reductor como en el no
reductor.
En la invención, el polisacárido puede ser un
polisacárido presente de forma natural, o un derivado de un
polisacárido presente de forma natural, por ejemplo, un polisacárido
que se haya derivatizado mediante una reacción de uno o más grupos
activos en los residuos sacáridos, o que se haya unido
covalentemente a un grupo derivatizador en el extremo de la cadena
polisacárida.
Los métodos para unir los polisacáridos a las
proteínas son bien conocidos en la técnica y se describen con más
detalle en WO 92/22331 y
WO-A-0187922. Los métodos
preferentes en esta invención se describen con más detalle a
continuación. También se describen métodos en las Figuras 1 y 2 de
esta solicitud.
El polisacárido puede enlazarse al GCSF o a la
proteína parecida al GCSF directamente, es decir, tal y como se
muestra en las Figuras 1 y 2, o a través de un enlazador. Los
enlazadores adecuados se derivan de los reactivos que contienen
N-maleimida, vinilsulfona,
N-yodoacetamida, ortopiridilo o
N-hidroxisuccinimida. El enlazador también puede
ser bioestable o biodegradable y comprender, por ejemplo, un
polipéptido o un oligómero sintético. El enlazador puede derivarse
de una parte de una molécula bifuncional, tal y como se describe con
mayor profundidad en WO 2005/016973. Un reactivo bifuncional
adecuado es, por ejemplo, el Bis-NHS. El reactivo
puede tener la fórmula general
Z-R^{1}-Z en la que cada Z es un
grupo funcional y puede ser el mismo o diferente y R^{1} es un
radical orgánico bifuncional. Preferentemente, R^{1} se selecciona
del grupo que está compuesto de alcanediilo, arileno, alcarileno,
heteroarileno y alquilheteroarileno, cualquiera de los cuales puede
ser sustituido y/o interrumpido por enlaces carbonilo, éster,
sulfuro, éter, amida y/o amina. Especialmente preferente es el
alcanediilo C_{3}-C_{6}. Lo más preferentemente,
R^{1} corresponde a la parte apropiada del reactivo bifuncional
adecuado.
De conformidad con un segundo aspecto de esta
invención proporcionamos un compuesto con la fórmula general (I)
en la
que
m es al menos uno;
XB se deriva de B-XH que es el
GCSF o una proteína parecida al GCSF en donde XH es NH_{2} ó
SH;
L es un enlace, un grupo de enlace o está
compuesto de un polipéptido o un oligómero sintético;
GlyO es una unidad sacárida aniónica;
en la que el grupo de enlace, si lo hubiera
presente, tiene la fórmula general
-Y-C(O)-R^{1}-C(O)-;
en la que Y es NR^{2} ó
NR^{2}-NR^{2} y R^{1} es un radical orgánico
bifuncional tal y como se ha definido anteriormente; y R^{2} es H
ó un alquilo C_{1-6}.
En este aspecto de la invención el GCSF está
unido al extremo no reductor del polisacárido. La unidad
polisacárida terminal es una unidad de ácido siálico. Las otras
unidades sacáridas del polisacárido están representadas por GlyO y
pueden ser las mismas o diferentes. Entre las unidades sacáridas
adecuadas se incluyen la heparina, el ácido hialurónico o el
sulfato de condroitina.
Cuando el GCSF está unido directamente al
polisacárido, el grupo L es un enlace. Sin embargo, el grupo L puede
estar derivado alternativamente de un reactivo que contenga
N-maleimida, vinilsulfona,
N-yodoacetamida, ortopiridilo ó
N-hidroxisuccinimida. El reactivo puede poseer la
fórmula general Z-R^{1}-Z tal y
como se ha definido anteriormente. En esta realización, L es
típicamente un grupo
Preferentemente, XH es NH_{2} y es la amina
N-terminal del GCSF o la proteína parecida al GCSF.
De forma alternativa, NH_{2} puede ser la amina primaria de la
cadena lateral de un aminoácido lisina.
Otro aspecto de la invención es una composición
farmacéutica que comprende un compuesto novedoso tal y como se ha
definido anteriormente y uno o más excipientes farmacéuticamente
aceptables.
La composición farmacéutica puede tener la forma
de una suspensión acuosa. Las suspensiones acuosas contienen los
compuestos novedosos mezclados con los excipientes adecuados para la
elaboración de suspensiones acuosas. Las composiciones
farmacéuticas pueden tener la forma de una suspensión homogénea o
acuosa estéril inyectable. Esta suspensión puede estar formulada de
conformidad con la técnica conocida utilizando agentes humectantes
o dispersantes adecuados y agentes de suspensión.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse de forma oral, intravenosa, intraperitoneal,
intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica, tópica o
intratraqueal para su uso en seres humanos o su uso veterinario.
Las composiciones pueden además comprender un
aditivo de formulación. Por aditivo de formulación nos referimos a
un excipiente que es capaz de estabilizar el GCSF bien internamente
o externamente, tal y como aparece descrito en Wang et al
(1999). El excipiente puede ser un estabilizador, un solubilizador o
un ión metálico. Entre los ejemplos adecuados de aditivos de
formulación se incluyen uno o más tampones, estabilizadores,
surfactantes, sales, polímeros, iones metálicos, azúcares, polioles
o aminoácidos. Estos pueden utilizarse solos o combinados.
Los estabilizadores típicamente actúan mediante
la desestabilización del estado desnaturalizado de una proteína, lo
que lleva a un cambio creciente de la energía libre de Gibbs para
desplegar la proteína. El estabilizador es preferentemente un
azúcar o un poliol, por ejemplo la sacarosa, el sorbitol, la
trehalosa, el glicerol, el manitol, la lactosa y el etilenglicol.
Un tampón estabilizador es el fosfato de sodio.
El solubilizador es preferentemente un
surfactante, preferentemente un surfactante no iónico. Entre los
ejemplos adecuados se incluyen Tween 80, Tween 20, Tween 40,
Pluoronic F68, Brij 35 y Triton X100.
El ión metálico es preferentemente divalente.
Entre los iones metálicos adecuados se incluyen Zn^{2+},
Ni^{2+}, Co^{2+}, Sr^{2+}, Cu^{2+}, Ca^{2+}, Mg^{2+} y
Fe^{2+}.
El aditivo de formulación también puede ser un
polímero seleccionado de entre el PSA, el PEG o la
hidroxi-beta-ciclodextrina.
Entre los aminoácidos y los derivados de los
aminoácidos adecuados para su uso como el aditivo de formulación se
incluyen la histidina, la glicina, otros aminoácidos similares y el
aspartato sódico.
Otro aspecto de esta invención es una
composición que comprende una población de derivados polisacáridos
aniónicos del GCSF o de una proteína parecida al GCSF, en la que
los derivados están compuestos de entre 2 y 200 unidades sacáridas
y en la que la población está compuesta básicamente solo de
derivados N-terminal de la proteína.
Por "población" nos referimos a que hay más
de un derivado polisacárido en la composición. Los derivados pueden
constar de los mimos números o de diferentes números de unidades
sacáridas. Preferentemente, la polidispersidad del polisacárido en
la composición es menor de 1,3, más preferentemente menor de 1,1.
Los polisacáridos preferentes son según se han detallado
anteriormente para los otros aspectos de esta invención.
En la población, básicamente todo el GCSF se
derivatiza solamente en la amina N-terminal. Con
esto, queremos decir que el 85%, preferentemente al menos el 90%,
lo más preferentemente al menos el 95% de la proteína en la
población se derivatiza con PSA solamente en la amina
N-terminal.
El grado de derivatización en el extremo
N-terminal se puede medir utilizando técnicas bien
conocidas en este campo, tales como el mapeo peptídico y la
degradación de Edman.
Un aspecto adicional de la invención es un
compuesto tal y como se ha descrito anteriormente para su uso en
terapia.
De conformidad con un aspecto final de la
invención, proporcionamos un método para producir un
N-derivado polisacárido del GCSF o de una proteína
parecida al GCSF en el que un polisacárido aniónico que está
compuesto de 2-200 unidades sacáridas se hace
reaccionar químicamente con el GCSF o la proteína parecida al
GCSF.
Según se observará en este aspecto de la
invención, el polisacárido puede reaccionar ante cualquier grupo
del GCSF o de la proteína parecida al GCSF. Por ejemplo, el
polisacárido puede reaccionar con un grupo amina, amida, arilo,
aldehído, cetona, guanidino, imidazol, hidroxilo, carboxilo o
sulfhidrilo. Preferentemente, el grupo es un grupo amina, más
preferentemente un grupo amina terminal. La amina puede ser de forma
alternativa la cadena lateral amínica de un aminoácido, tal como un
aminoácido lisina. El polisacárido también puede reaccionar ante
cualesquiera residuos de carbohidratos del GCSF, tales como en los
grupos glicol pendientes.
Los polisacáridos pueden estar enlazados a
cadenas laterales de aminoácidos mediante métodos que se conocen en
la técnica. Por ejemplo, un polisacárido puede estar acoplado a las
cadenas laterales del extremo C-terminal, -COOH ó
carboxilo de Asp o Glu mediante acoplamiento in vitro. Los
grupos tiol de los aminoácidos cisteína también pueden estar
enlazados a polisacáridos mediante acoplamiento in vitro.
Estos métodos se describen más detalladamente en WO03/055526, en
particular la tabla de las páginas 6 y 7. En esta referencia, el
acoplamiento in vitro también se utiliza para enlazar la
parte de una molécula de un oligosacárido al grupo amida en la
cadena lateral de Gln. También se describen métodos de acoplamiento
in vitro para enlazar partes de moléculas de oligosacáridos
con grupos guanidino e imidazol de residuos de Arg e His
respectivamente. Cada uno de estos métodos puede utilizarse para
derivatizar el GCSF de la presente invención.
El polisacárido también puede reaccionar con una
forma modificada del GCSF. Por ejemplo, uno o más grupos del GCSF
puede que haya(n) sufrido una transformación química, por
ejemplo, mediante reducción u oxidación. Por ejemplo, puede
generarse un carbonilo reactivo en el lugar del grupo amino terminal
del GCSF utilizando condiciones de oxidación.
Los polisacáridos adecuados para utilizar en el
método de esta invención son los descritos anteriormente para los
compuestos novedosos.
Los compuestos de la invención pueden ser
elaborados mediante cualesquiera de los métodos adecuados descritos
en el estado anterior de la técnica. Por ejemplo, un método típico
se describe en nuestra anterior solicitud de patente WO
92/22331.
Típicamente, el polisacárido aniónico se ha
activado antes de la derivatización al GCSF. Por ejemplo, puede
tener un grupo aldehído reactivo y la reacción de derivatización
puede llevarse a cabo bajo condiciones de reducción. El grupo
aldehído reactivo puede elaborarse mediante oxidación controlada de
un grupo hidroxilo del polisacárido. Lo más preferentemente, este
aldehído reactivo se genera en un paso preliminar, en el que el
polisacárido se hace reaccionar bajo condiciones de oxidación
controlada, por ejemplo utilizando peryodato de sodio, en una
solución acuosa. Preferentemente, la oxidación es una oxidación
química, aunque también pueden utilizarse enzimas que son capaces
de llevar a cabo este paso. El grupo aldehído reactivo puede estar
en el extremo no reductor o en el extremo reductor del
polisacárido. El GCSF, típicamente el extremo
N-terminal, puede entonces reaccionar con el grupo
aldehído reactivo para producir un aducto que, cuando se reduce,
produce el derivado N-terminal del GCSF.
La activación del polisacárido debería llevarse
a cabo preferentemente bajo tales condiciones que básicamente no
haya ninguna división a mitad de la cadena de la estructura básica
del polisacárido, es decir, que básicamente no haya una reducción
en el peso molecular. El oxidante es, de forma adecuada, el
perrutenato, o, preferentemente, el peryodato. La oxidación puede
llevarse a cabo con peryodato en una concentración de entre 1 mM y 1
M, con un pH de entre 3 y 10, a una temperatura de entre 0 y 60ºC y
durante un periodo de tiempo de entre 1 minuto y 48 horas.
Las condiciones adecuadas de reducción para la
reacción de derivatización pueden utilizar hidrógeno con
catalizadores o, preferentemente hidruros, tales como los
borohidruros. Estos pueden inmovilizarse tal como el borohidruro
soportado en Amberlite (marca registrada). Preferentemente se
utilizan hidruros de metal alcalino tales como el borohidruro de
sodio como agente reductor, en una concentración de entre 1 \muM y
0,1 M, con un pH de entre 5,0 y 10, una temperatura de entre 0 y
60ºC y durante un periodo de tiempo de entre 1 minuto y 48 horas.
Las condiciones de la reacción se seleccionan de tal manera que los
grupos carboxilo pendientes en el material de inicio no sufran
reducción.
Otros agentes reductores adecuados son los
cianoborohidruros bajo condiciones de acidez, por ejemplo, el
cianoborohidruro de metal alcalino o el cianoborohidruro soportado
en polímero, el ácido L-ascórbico, el metabisulfito
sódico, el L-selectride, el triacetoxiborohidruro,
etc.
Otros derivados activados de los polisacáridos
pueden tener utilidad en la presente invención, incluyendo los que
poseen grupos funcionales pendientes tales como NHS, tal y como se
describe en nuestra anterior solicitud de patente WO 06/00540.
En una realización, el aldehído reactivo se
encuentra en el extremo reductor del polisacárido y el extremo no
reductor se ha neutralizado de tal manera que no reaccione con los
grupos pendientes del GCSF.
La reactividad del extremo reductor del ácido
colomínico, aunque débil hacia las proteínas objetivo, es suficiente
como para dar problemas a la hora de elaborar conjugados
químicamente definidos.
La química adecuada para preparar un
polisacárido con un aldehído reactivo en el extremo reductor del
polisacárido se describe en nuestra anterior solicitud WO
05/016974. El proceso implica un paso preliminar de oxidación
selectiva seguido de una reducción y después de más oxidación para
producir un compuesto con un aldehído en el extremo reductor y un
extremo no reductor neutralizado.
WO 2005/016973 describe los derivados del ácido
polisiálico que son útiles para la conjugación de proteínas, en
particular aquellos que poseen fármacos con sulfhidrilo libre. El
compuesto de ácido polisiálico se hace reaccionar con un reactivo
heterobifuncional para introducir un grupo funcional pendiente para
la conjugación sitio-específica con grupos de
sulfhidrilo. Los polisacáridos aniónicos utilizados en la presente
invención también se pueden derivatizar con un reactivo
heterobifuncional de esta manera.
El polisacárido se puede derivatizar antes de
que reaccione con el GCSF. Por ejemplo, el polisacárido puede
reaccionar con un reactivo bifuncional.
El polisacárido puede someterse a un paso
preliminar de reacción, en el que se forma un grupo seleccionado de
un grupo amina primario, un grupo amina secundario y de una
hidracina en el sacárido terminal, que es preferentemente el ácido
siálico, seguido de un paso de reacción en el que esto se hace
reaccionar con un reactivo bifuncional para formar un producto
intermedio de reacción, tal y como se describe más detalladamente en
WO 2006/016168. El producto intermedio puede entonces reaccionar
con el GCSF o la proteína parecida al GCSF. El reactivo bifuncional
puede poseer la fórmula general
Z-R^{1}-Z, tal y como se ha
definido anteriormente.
Hemos descubierto que ciertas condiciones de
reacción potencian la derivatización selectiva en el extremo
N-terminal del GCSF. Para potenciar la reacción
selectiva en el extremo N-terminal, la reacción de
derivatización debería llevarse a cabo en una primera solución
acuosa de pH acídico, y el derivado polisacárido resultante debería
después purificarse en una segunda solución acuosa de un pH más alto
que el de la primera solución acuosa. Típicamente, el pH de la
primera solución acuosa es menor de 7, y está preferentemente entre
4,0 y 6,0. El pH de la segunda solución acuosa está entre 6,5 y
9,5, preferentemente entre 6,5 y 8,5. El pH bajo de la reacción de
derivatización potencia la derivatización selectiva en el extremo
N-terminal de la proteína en vez de en cualesquiera
sitios en mitad de la cadena.
Además, hemos descubierto que el uso de ciertos
aditivos de formulación potencia la formación de un derivado del
GCSF polisacárido estable y selectivo. El aditivo de formulación
puede seleccionarse de entre uno o más tampones, estabilizadores,
surfactantes, sales, polímeros, iones metálicos, azúcares, polioles
o aminoácidos. Estos se pueden añadir al medio de reacción, o de
forma alternativa se pueden añadir a la composición de producto
final, como un estabilizador.
En una realización de esta invención, el aditivo
de formulación es sorbitol, manitol, trehalosa o sacarosa. En una
realización diferente, el aditivo de formulación es un surfactante
no iónico. El aditivo de formulación puede ser de forma alternativa
un polímero seleccionado de entre el PSA, el PEG o la
hidroxi-beta-ciclodextrina, por
ejemplo, Tween 20, Tween 80, PEG. En una realización diferente el
aditivo de formulación es un ión metálico divalente. Entre los
iones metálicos divalentes preferentes se incluyen Zn^{2+},
Ni^{2+}, Co^{2+}, Sr^{2+} ó Fe^{2+}.
El aditivo de formulación puede ser un tampón.
Preferentemente cuando el aditivo de formulación es un tampón, es
fosfato de sodio o acetato de sodio.
La purificación del derivado polisacárido en el
método de la presente invención puede llevarse a cabo utilizando
una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Entre los
ejemplos de métodos de purificación adecuados se incluyen la HIC
(cromatografía de interacción hidrofóbica), la SEC (cromatografía de
exclusión por tamaño), la HPLC (cromatografía líquida de alto
rendimiento), la AEX (cromatografía de intercambio aniónico) y la
MAC (cromatografía de afinidad metálica).
Se puede fraccionar una población de ácidos
polisiálicos que posean una amplia distribución de peso molecular
en fracciones con polidispersidades inferiores, esto es, en
fracciones con diferentes pesos moleculares medios. El
fraccionamiento se lleva a cabo preferentemente mediante
cromatografía de intercambio aniónico, utilizando para la elución
un tampón básico adecuado, tal y como aparece descrito en nuestras
anteriores solicitudes de patente WO 2005/016794 y WO 2005/03149.
El método de fraccionamiento es adecuado para un material de inicio
polisacárido así como para los derivados. La técnica puede así
aplicarse antes o después de los pasos de proceso esenciales de
esta invención. Preferentemente, la polidispersidad del derivado
polisacárido resultante del GCSF es menor de 1,1.
La derivatización del GCSF de conformidad con
esta invención, da por resultado una mayor vida media, una mejor
estabilidad, una reducción de la inmunogenicidad y/o el control de
la solubilidad y por consiguiente la biodisponibilidad y las
propiedades farmacocinéticas del GCSF. El nuevo método es de
especial valor para la creación de conjugados del GCSF
monopolisialilado.
La invención viene ilustrada mediante los
Ejemplos 1-10 y mediante las referencias a los
siguientes dibujos:
La Figura 1 es un esquema de reacción que
muestra la activación por la técnica anterior de la unidad terminal
no reductora del ácido siálico;
La Figura 2 es un esquema de reacción que
muestra la derivatización N-terminal o aleatoria de
las proteínas;
La Figura 3a muestra la degradación del ácido
colomínico (AC) de 24 kDa con diferentes pHs utilizando GPC de
Triple Detección (Viscotek: RI + RALS + Viscosímetro);
La Figura 3b muestra los resultados de la
cromatografía de permeación en gel (GPC) del AC fraccionado 400 mM
de NaCl;
La Figura 4 muestra la caracterización del GCSF
polisialilado mediante SDS-PAGE en presencia de
aditivos de formulación;
La Figura 5 muestra la caracterización de
SE-HPLC (lado izquierdo) y del GCSF polisialilado
mediante SDS-PAGE (lado derecho);
La Figura 6 muestra la caracterización del GCSF
mediante SE-HPLC;
La Figura 7 muestra la caracterización del GCSF
polisialilado de 42 kDa mediante PAGE nativa;
La Figura 8 ilustra los resultados de la
cromatografía de afinidad metálica inmovilizada del GCSF;
La Figura 9 ilustra la actividad in vitro
del GCSF polisialilado en células MNFS 60;
La Figura 10 muestra los datos de
SE-HPLC para la estabilidad de la formulación del
GCSF polisialilado (GCSF del AC de 41 kDa);
La Figura 11 muestra los datos de FACS para el
GCSF (número de neutrófilos);
La Figura 12 muestra la eficacia in vitro
de las formulaciones del GCSF;
La Figura 13 muestra la caracterización del GCSF
pegilado mediante SE-HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron carbonato de amonio, etilenglicol,
polietilenglicol (8 kDa), cianoborohidruro de sodio (> 98%
puro), metaperyodato de sodio y marcadores de peso molecular,
sulfato de amonio, cloruro sódico, fosfato de sodio, sorbitol,
Tween 20 y Tris de Sigma Chemical Laboratory, Reino Unido. El
acetato de sodio y el fosfato de sodio provenían de BDH, Reino
Unido. El ácido colomínico utilizado, los ácidos polisiálicos
lineales unidos con enlaces alfa-(2,8) de E. coli K1 (22,7
kDa de media, alta polidispersidad de 1,34, 39 kDa, p.d. de 1,4; 11
kDa, p.d. de 1,27) provenía de Carmida, Irlanda. Entre otros
materiales se incluyeron 2,4-dinitrofenil hidracina
(Aldrich Chemical Company, Reino Unido), la membrana de diálisis
(límites de corte de 3,5 kDa y 10 kDa; Medicell International
Limited, Reino Unido), Sefarosa SP HiTrap, PD-10
columnas, Q FF [columna de 1 ml ó 5 ml]; columna de Hitrap Butilo
HP [de 1 ó 5 ml]; (Pharmacia, Reino Unido), geles de poliacrilamida
en tris-glicina (4-20% y 16%),
tampón de carga y tampón de migración del dodecilsulfato sódico de
tris-glicina (Novex, Reino Unido). El agua
desionizada se obtuvo de una unidad de purificación de agua de
Elgastat Opción 4 (Elga Limited, Reino Unido). Todos los reactivos
utilizados eran de calidad analítica. Se utilizó un lector de
placas (Dynex Technologies, Reino Unido) para las determinaciones
espectrofotométricas en ensayos de proteínas o AC. Se adquirieron
los ratones en Harlan, Reino Unido, y se aclimataron al menos
durante una semana antes de utilizarlos. El GCSF se obtuvo de SIIL,
India.
La determinación de la actividad biológica del
G-CSF está basada en la estimulación de la
proliferación de células M-NFS-60
mediante esta citoquina. Las células se incuban con diluciones en
serie de preparados tanto de referencia como de
G-CSF durante 48 horas. Se calcula la respuesta
proliferativa de las células tras una incubación de 4 horas de
duración con un sistema de teñido de células viables - mezcla de PMS
(reactivo de acoplamiento electrónico). El MTS se ve bioreducido
mediante las células en un producto formazán que es soluble en un
medio de cultivo tisular. La absorbencia del formazán a 492 nm puede
medirse directamente a partir de placas de ensayo de 96 pocillos
sin necesidad de un procesamiento adicional. La cantidad de producto
formazán, según se mide a partir de la cantidad de absorbencia a
492 nm, es directamente proporcional al número de células
vivas.
Debería utilizarse como referencia la Norma
Internacional de la Organización Mundial de la Salud para el GCSF
(derivado del ADNr humano) 88/502, 10.000 UI/ampolla, contenido de
100 ng de G-CSF, NIBSC (Instituto Nacional de
Control y Estándares Biológicos), Reino Unido.
Se llevó a cabo una estimación cuantitativa de
los ácidos polisiálicos (como el ácido siálico) con el reactivo
resorcinol mediante el método del resorcinol [Svennerholm, 1957] tal
y como viene descrito en otras partes [Gregoriadis et al.,
1993; Fernandes y Gregoriadis, 1996, 1997]. La proteína se midió
mediante el método colorimétrico de BCA o la absorbencia UV a 280
nm.
Se mezcló una solución de metaperyodato de sodio
(NaIO_{4}) de 0,02 M (exceso molar 8 veces superior) recién
preparada con AC a 20ºC y la mezcla de reacción se agitó de forma
magnética durante 15 minutos en la oscuridad. Después se añadió un
volumen doble de etilenglicol a la mezcla de reacción para consumir
el exceso de NaIO_{4} y la mezcla se dejó para agitar a 20ºC
durante 30 minutos adicionales. El ácido colomínico oxidado se
dializó (membrana de diálisis con límite de corte de peso molecular
de 3,5 kDa) exhaustivamente (24 horas) contra un tampón de
carbonato de amonio al 0,01% (con pH de 7,4) a 4ºC. Se utilizó la
ultrafiltración (sobre un límite de corte de peso molecular de 3,5
kDa) para concentrar la solución de ACO de la membrana de diálisis.
Después de obtener la concentración con el volumen necesario, el
filtrado se liofilizó y guardó a -40ºC hasta que se volviera a
utilizar. De forma alternativa, el AC se recuperó de la mezcla de
reacción mediante la precipitación (dos veces) con etanol.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una estimación cualitativa del
grado de oxidación del ácido colomínico con 2,4
dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH), que produce 2,4
dinitrofenil-hidrazonas solubles en pequeñas
cantidades en interacción con compuestos carbonilo. Se añadieron
(AC) no oxidado/(ACO) oxidado al reactivo 2,4-DNFH
(1,0 ml), las soluciones se agitaron y después se dejaron reposar a
37ºC hasta que se observó un precipitado cristalino [Shriner et
al., 1980]. El grado (cuantitativo) de oxidación de AC se midió
con un método [Park y Johnson, 1949] basado en la reducción de
iones de ferricianuro en una solución alcalina a ferrocianuro
férrico (azul de Prusia), que entonces se mide a 630 nm. En este
ejemplo, se utilizó la glucosa como la norma.
Se disolvieron las muestras de ácido colomínico
(AC y ACO) en NaNO_{3} (0,2 M), CH_{3}CN (10%; 5 mg/ml) y se
cromatografiaron en más de 2 columnas GMPW_{XL} con detección
mediante índice de refracción (sistema GPC: bomba de disolvente GPC
VE1121, detector RI VE3580 y cotejo con software Trisec 3 (Viscotek
Europe Ltd.). Las muestras (5 mg/ml) se filtraron sobre una
membrana de nylon de 0,45 \mum y procesaron a 0,7 cm/min con 0,2
M de NaNO_{3} y CH_{3}CN (10%) como la fase móvil.
Los resultados se muestran en la Figura 3b y las
tablas 4 y 5 (véase la página 25).
Las normas para la química de la Pegilación no
pueden aplicarse a la polisialilación como tal debido a la
diferencia en las propiedades fisioquímicas de estas moléculas. El
PSA es un polímero ácido alterable y permanece estable durante
semanas en torno al pH neutro (Figura 3a). Los resultados en la
Figura 3a muestran que con un pH de 6,0 y un pH de 7,4 el AC
permanece estable durante 8 días, con un pH de 5,0 se produce una
degradación lenta (tras 48 horas 92% del PM inicial), y con un pH
de 4,0 se produce una degradación lenta (tras 48 horas 70% del PM
inicial). El ácido polisiálico es enormemente hidrofílico mientras
que el PEG es una molécula anfifílica por naturaleza. Cuando se
lleva a cabo la polisialilación utilizando condiciones usadas para
la Pegilación, se observa agregación y precipitación de las
proteínas en muchos casos.
El GCSF (18,8 kDa) se suministró como una
solución (1,05 mg/ml en 10 mM de tampón de acetato de sodio, pH de
4,0 con un 5% de sorbitol, 0,025 mg/ml de polisorbato 80) y se
guardó a 2-8ºC. Se tomó la cantidad necesaria de
GCSF en un eppendorf y se colocó en hielo. La cantidad de AC a
añadir para la conjugación se calculó en base a la siguiente
fórmula:
Se pesó la cantidad necesaria de AC. El AC se
solubilizó en 10 mM de NaOAc, 5% de sorbitol, pH de 5,5 (aquí se
utilizó el 20% del volumen del volumen de la reacción final), la
mezcla se sometió ligeramente a agitación vorticial hasta que todo
el AC se hubiera disuelto y después o bien se filtró introduciéndola
en un nuevo eppendorf o se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos
y el sobrenadante se transfirió a un nuevo eppendorf para eliminar
cualquier material agregado/precipitado. Se añadió el volumen
necesario de 10 mg/ml de solución madre de Tween 20, para obtener
una concentración final de 0,5 mg/ml del Tween 20 en la mezcla de la
reacción final. Se añadió la cantidad necesaria de solución de
proteína GCSF a la solución de AC para obtener un exceso molar de
10 (a pequeña escala) y de 9 (a gran escala) de AC y se mezcló
ligeramente manteniendo la mezcla de la reacción en un agitador
suave a 4\pm1ºC. Se añadieron 100 mg/ml de solución de
NaCNBH_{3} para obtener 50 mM o 3, 17 mg/ml en la mezcla de la
reacción final, se mezcló ligeramente y se comprobó el pH de la
mezcla de la reacción final, en caso necesario se ajustó el pH a 5,5
con 1M de NaOH/HCl a 4\pm1ºC. Por último, se ajustó el volumen de
la reacción utilizando 10 mM de NaOAc, 5% de sorbitol, con pH de 5,5
para obtener una concentración proteica de 0,67 mg/ml en la mezcla
de la reacción. El tubo se cerró herméticamente y se agitó a la
temperatura deseada (4\pm1ºC) durante 24 horas. La reacción se
detuvo mediante un método adecuado y se tomaron muestras para un
ensayo de actividad in vitro en células MNFS 60,
SDS-PAGE (utilizando 4-20% de gel
de Tris glicina), SE-HPLC (columna de superose 6) y
se comprobó el pH de la mezcla de la reacción. Para eliminar
cualquier precipitado se centrifugó la mezcla de la reacción a 13000
rpm durante 5 minutos antes del análisis y purificación por
SE-HPLC, el tampón preferente para la
SE-HPLC era 0,1 M de fosfato de Na (con pH de
6,9).
Se llevó a cabo una aminación reductiva con una
gama de pesos moleculares del AC (29-52 kDa) en el
GCSF para una derivatización N-terminal y
aleatoria. Se estudiaron una serie de variables del proceso para las
reacciones de conjugación: exceso molar de ACO de
10-20 (a pequeña escala) y 8-15 (a
gran escala); reactivo = 50-100 mM de NaCNBH_{3};
tampón de la reacción = 10 mM de NaOAc; pH de
5,0-7,4; aditivos de formulación = 6 kDa de Tween
20/8 kDa de PEG (exceso de 10 M)/ 6 kDa de Tween 20+PEG; temperatura
= 4\pm1ºC, tiempo = 16-24 horas, etc.
Se descubrió que las condiciones de reacción
optimizadas eran las siguientes: ACO = exceso molar de 10 (a
pequeña escala) y 9 (a gran escala), reactivo = 50 mM de
NaCNBH_{3}, tampón de reacción = 10 mM de NaOAc, pH de 5,5;
aditivos = 0,5 mg/ml de Tween 20, temperatura = 4\pm1ºC, tiempo =
22 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra restante de la mezcla de la reacción
se diluyó con tampón A de AEX (20 mM de acetato de sodio, 50 mM de
cloruro sódico, pH de 5,0) (1,5 ml de mezcla de la reacción + 9 ml
de tampón A), el pH se comprobó y se ajustó si era necesario a un
pH de 5,0, y se cargó en la columna de AEX previamente equilibrada
con el tampón A de AEX. Se recogieron y etiquetaron las fracciones
de carga. La columna se lavó con tampón A de AEX (al menos 5
volúmenes de columna), se recogieron las fracciones (cada fracción
1,5 volúmenes de columna) y se etiquetaron. El producto se eluyó
con tampón B de AEX (50 mM de fosfato de sodio, 0,65 M de cloruro
sódico, pH de 7,0), se recogieron las fracciones (cada fracción 1
volumen de columna; 6 columnas) y se etiquetaron. Si dos fracciones
consecutivas no poseían ningún contenido proteico (UV a 280 nm), se
llevaba a cabo el paso siguiente. Las muestras se conservaron en
hielo durante la purificación. La concentración proteica se analizó
mediante UV (280 nm) (la absorbencia de 1 mg/ml de GCSF era de
aproximadamente 0,872). Se tomaron las muestras para
SDS-PAGE y SE-HPLC. Para eliminar el
AC libre de la mezcla, se utilizó HIC. Las muestras se concentraron,
en caso necesario.
Las fracciones de AEX que contenían conjugado se
combinaron y se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} para obtener
una concentración de 2,75 M en la solución de carga. Esta solución
se cargó después en la columna de HIC previamente equilibrada con
el tampón A de HIC (10 mM de fosfato de sodio, 2,75 M de sulfato de
amonio, pH de 6,5). Se recogieron las fracciones de carga (cada
fracción 1,5 volúmenes de columna) y se etiquetaron. La columna se
lavó con tampón A de HIC (al menos 5 volúmenes de columna; velocidad
= 0,5 ml/minuto; (1,5 volúmenes de columna) se recogieron las
fracciones y se etiquetaron. El producto se eluyó con tampón B de
HIC (20 mM de fosfato de sodio con pH de 7,4) (velocidad = 5
ml/minuto); se recogieron las fracciones (fracción de 1 volumen de
columna; 6 volúmenes de columna) y se etiquetaron. Las muestras se
conservaron en hielo durante la purificación. Se analizó la
concentración proteica mediante UV (280 nm).
Las fracciones de HIC que contenían el conjugado
purificado se combinaron y se ajustó la composición del conjugado
en la solución con solución de sorbitol al 50% y 10 mg/ml de
solución de Tween 20 para obtener una composición final de 5% de
sorbitol y 0,025 mg/ml de Tween 20. La solución se concentró
entonces a 4\pm1ºC y se analizó la concentración proteica
mediante UV (280 nm). Se realizó una purificación adicional mediante
SE-HPLC (por ejemplo para separar los conjugados de
los agregados/proteína libre, etc.). El conjugado se filtró de
forma estéril y se recogieron muestras para un ensayo de actividad
y para caracterización mediante SDS-PAGE y
SE-HPLC. En caso necesario, se extrajo una alícuota
para un ensayo proteico y un ensayo de AC. El resto se guardó a
4\pm1ºC hasta utilizarlo de nuevo y se estudió para conocer la
estabilidad física mediante SE-HPLC.
Se estudiaron los efectos de varios procesos que
afectaban a la estabilidad del GCSF en la solución y el grado de
derivatización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suministró el GCSF (18,8kDa) como una
solución (1,05 mg/ml en 10 mM de tampón de acetato de sodio, pH de
4,0 con un 5% de sorbitol, 0,025 mg/ml de polisorbato 80) y se
guardó a 2-8ºC. Se tomó la cantidad necesaria de
GCSF en un eppendorf y se colocó en hielo. La cantidad de AC (por
ejemplo AC oxidado o no oxidado) a añadir para la conjugación se
calculó en base a la siguiente fórmula:
Se pesó la cantidad necesaria de AC. El AC se
solubilizó en 50 mM de fosfato de sodio, 5% de sorbitol, pH de 7,4
(aquí se utilizó el 20% del volumen del volumen de la reacción
final). La mezcla se sometió ligeramente a agitación vorticial
hasta que todo el AC se hubiera disuelto y después o bien se filtró
introduciéndola en un nuevo eppendorf o se centrifugó a 4000 rpm
durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo
eppendorf para eliminar cualquier material agregado/precipitado. Se
añadió el volumen necesario de 10 mg/ml de solución madre de Tween
20, para obtener una concentración final de 0,5 mg/ml del Tween 20
en la mezcla de la reacción final. Se añadió la cantidad necesaria
de solución de proteína GCSF a la solución de AC para obtener un
exceso molar de 11 (para 40 kDa) de AC y se mezcló ligeramente
manteniendo la mezcla de la reacción en un agitador suave a
4\pm1ºC. Se añadieron 100 mg/ml de solución de NaCNBH_{3} para
obtener 50 mM ó 3,17 mg/ml en la mezcla de la reacción final, se
mezcló ligeramente y se comprobó el pH de la mezcla de la reacción
final, en caso necesario se ajustó el pH a 7,4 con 1 M de NaOH/HCl a
4\pm1ºC. Por último, se ajustó el volumen de la reacción
utilizando 10 mM de NaOAc, 5% de sorbitol, pH de 7,4 para obtener
una concentración proteica de 0,67 mg/ml en la mezcla de la
reacción. El tubo se cerró herméticamente y se agitó a la
temperatura deseada (4\pm1ºC) durante 22 horas. La reacción se
detuvo mediante un método adecuado y se tomaron muestras para un
ensayo de actividad in vitro en células MNFS 60,
SDS-PAGE (utilizando 4-20% de gel de
Tris glicina), SE-HPLC y se comprobó el pH de la
mezcla de la reacción. Para eliminar cualquier precipitado se
centrifugó la mezcla de la reacción a 13000 rpm durante 5 minutos
antes del análisis y purificación por SE-HPLC, el
tampón preferente para la SE-HPLC era 0,1 M de
fosfato de Na (pH de 6,9).
\vskip1.000000\baselineskip
Los conjugados de GCSF monosialilado se
purificaron de los otros conjugados de GCSF mediante HIC e IEC. La
muestra restante de la mezcla de la reacción se diluyó con tampón A
de AEX (20 mM de acetato de sodio, 50 mM de cloruro sódico con pH
de 5,0) (1,5 ml de mezcla de la reacción + 9 ml de tampón A), se
comprobó el pH y se ajustó en caso necesario a un pH de 5,0 y se
cargó en la columna de AEX previamente equilibrada con tampón A de
AEX. Se recogieron las fracciones de carga y se etiquetaron. La
columna se lavó con tampón A de AEX (al menos 5 volúmenes de
columna), se recogieron las fracciones (cada fracción 1,5 volúmenes
de columna) y se etiquetaron. El producto se eluyó con tampón B de
AEX (50 mM de fosfato de sodio, 0,65 M de cloruro sódico, pH de
7,0), se recogieron las fracciones (cada fracción 1 volumen de
columna; 6 columnas) y se etiquetaron. Si dos fracciones
consecutivas no poseían ningún contenido proteico (UV a 280 nm), se
llevaba a cabo el paso siguiente. Las muestras se conservaron en
hielo durante la purificación. La concentración proteica se analizó
mediante UV (280 nm) (la absorbencia de 1 mg/ml de GCSF era de
aproximadamente 0,872). Se tomaron las muestras para
SDS-PAGE y SE-HPLC. Para eliminar el
AC libre de la mezcla, se utilizó HIC. Las muestras se concentraron,
en caso necesario.
Las fracciones de AEX que contenían conjugado se
combinaron y se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} para obtener
una concentración de 2,75 M en la solución de carga. Esta solución
se cargó después en la columna de HIC previamente equilibrada con
el tampón A de HIC (10 mM de fosfato de sodio, 2,75 M de sulfato de
amonio, pH de 6,5). Se recogieron las fracciones de carga (cada
fracción 1,5 volúmenes de columna) y se etiquetaron. La columna se
lavó con tampón A de HIC (al menos 5 volúmenes de columna; velocidad
= 0,5 ml/minuto; (1,5 volúmenes de columna) se recogieron las
fracciones y se etiquetaron. El producto se eluyó con tampón B de
HIC (20 mM de fosfato de sodio con pH de 7,4) (velocidad = 5
ml/minuto); se recogieron las fracciones (fracción de 1 volumen de
columna; 6 volúmenes de columna) y se etiquetaron. Las muestras se
conservaron en hielo durante la purificación. Se analizó la
concentración proteica mediante UV (280 nm). Las fracciones de HIC
que contenían el conjugado purificado se combinaron y se ajustó la
composición del conjugado en la solución con solución de sorbitol
al 50% y 10 mg/ml de solución de Tween 20 para obtener una
composición final de 5% de sorbitol y 0,025 mg/ml de Tween 20. La
solución se concentró entonces a 4\pm1ºC y se analizó la
concentración proteica mediante UV (280 nm). Se realizó una
purificación adicional mediante SE-HPLC (por ejemplo
para separar los conjugados de los agregados/proteína libre, etc.).
Los conjugados se filtraron de forma estéril y se recogieron
muestras para un ensayo de actividad y para caracterización
mediante SDS-PAGE y SE-HPLC. Se
extrajo una alícuota para un ensayo proteico y un ensayo de AC. El
resto se guardó a 4\pm1ºC hasta utilizarlo de nuevo y se estudió
para conocer la estabilidad física mediante
SE-HPLC.
Se estudiaron los efectos de diversos procesos
que afectaban a la estabilidad del GCSF en la solución y el grado
de derivatización.
\vskip1.000000\baselineskip
El GCSF (18,8 kDa) se suministró como una
solución (0,5 mg/ml en 10 mM de tampón de acetato de sodio, pH de
4,0 con un 5% de sorbitol, 0,025 mg/ml de polisorbato 80) y se
guardó a 2-8ºC. Se concentró la solución de GCSF
para obtener aproximadamente 1,0 mg/ml de solución. Se tomó la
cantidad necesaria de GCSF en un eppendorf y se colocó en hielo. La
cantidad de PEG a añadir para la conjugación se calculó en base a la
siguiente fórmula:
Se pesó la cantidad necesaria de PEG 20K. Se
solubilizó en 10 mM de NaOAc, 5% de sorbitol, pH de 5,5 (aquí se
utilizó el 20% del volumen del volumen de la reacción final), la
mezcla se sometió ligeramente a agitación vorticial hasta que todo
el PEG se hubiera disuelto y después o bien se filtró
introduciéndola en un nuevo eppendorf o se centrifugó a 4000 rpm
durante 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo
eppendorf para eliminar cualquier material agregado/precipitado. Se
añadió el volumen necesario de 10 mg/ml de solución madre de Tween
20, para obtener una concentración final de 0,5 mg/ml del Tween 20
en la mezcla de la reacción final. Se añadió la cantidad necesaria
de solución de proteína GCSF a la solución de PEG para obtener un
exceso molar de PEG de 7,5 y se mezcló ligeramente manteniendo la
mezcla de la reacción en un agitador suave a 4\pm1ºC. Se
añadieron 100 mg/ml de solución de NaCNBH_{3} para obtener 50 mM ó
3,17 mg/ml en la mezcla de la reacción final, se mezcló ligeramente
y se comprobó el pH de la mezcla de la reacción final y en caso
necesario se ajustó el pH a 5,5 con 1 M de NaOH/HCl a 4\pm1ºC.
Por último, se ajustó el volumen de la reacción utilizando 10 mM de
NaOAc, 5% de sorbitol y un pH de 5,5 para obtener una concentración
proteica de 1 mg/ml en la mezcla de la reacción. El tubo se cerró
herméticamente y se agitó a la temperatura deseada (4\pm1ºC)
durante 24 horas. La reacción se detuvo mediante un método adecuado
y se tomaron muestras para buscar la actividad in vitro en
células MNFS 60, SDS-PAGE (utilizando
4-20% de gel de Tris glicina),
SE-HPLC (columna de superose 6) y se comprobó el pH
de la mezcla de la reacción. Para eliminar cualquier precipitado se
centrifugó la mezcla de la reacción a 13000 rpm durante 5 minutos
antes del análisis y purificación por SE-HPLC, el
tampón preferente para la SE-HPLC era 0,1 M de
fosfato de sodio (pH de 6,9). Los resultados se muestran en la
Figura 13.
\vskip1.000000\baselineskip
El GCSF y los conjugados
PSA-GCSF se purificaron del PSA y los subproductos
de la mezcla de la reacción mediante cromatografía de afinidad
metálica (Figura 8). La muestra para este experimento era 50 ug de
GCSF en 75 uL de tampón de reacción + 75 ul de eluyente A. El
tampón de reacción era 0,5 mg/mL de Tween 20; 5% de sorbitol; 10 mM
de NaOAc; pH de 5,0. El eluyente A era 10 mM de Tris/HCl; pH de 7,0.
El eluyente B era 20 mM de AcOH + 0,2 M de NaCl; pH de 4,0.
Gradiente: (t/min) = 0 a 12,5 (100% de A); t = 12,5 a 25 (30% de B);
25 a 40 (100% de B). El pico a 0,887 es el tampón y a 16,142 es el
GCSF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la HPLC en un Cromatógrafo
Líquido (JASCO) equipado con un muestreador automático
AS-2057 plus de Jasco refrigerado a 4ºC, y un
detector UV-975 UV/VIS de Jasco. Se registraron los
datos mediante software EZchrom Elite en un IBM/PC. Las muestras de
la SEC se analizaron con una fase móvil isocrática de 0,1 M de
fosfato de Na, pH de 6,9; en una columna de Superose 6 (Figura 5) en
presencia de Tween. La Figura 6 muestra únicamente un pico a TA =
76,408, que se atribuye al GCSF.
La tabla de picos para la SEC que se muestra en
el lado derecho de la Figura 5 es la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una SDS-PAGE
utilizando 4-20% de geles de trisglicina. Las
muestras se diluyeron con tampón reductor o no reductor y se
cargaron 5,0 ug de proteína en cada pocillo. Los geles se vertieron
en un sistema de tampón de trisglicina y se tiñeron con azul de
Coomassie. Se llevó a cabo una inmunoelectrotransferencia de tipo
Western utilizando anticuerpo anti PSA (Figura 4). La Figura 4
muestra la SDS-PAGE de las formulaciones de GCSF
(sitio-específicas; N-terminales).
Se llevó a cabo una PAGE nativa en el 10% del gel de tris glicina
(Figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo estudios in vitro en
células MNFS 60 con conjugados de GCSF, PSA y PEG. Se midieron los
valores EC50 y se compararon en diversas formulaciones de GCSF
(Figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Se guardaron los conjugados de GCSF estériles en
20 mM de fosfato de sodio, pH de 7,4; 5% de sorbitol y 0,025 mg/ml
de Tween 20; a 4ºC durante seis semanas. Se llevó a cabo una
SE-HPLC de las muestras todas las semanas
utilizando columnas de SEC bajo las condiciones siguientes: volumen
de inyección de 100 ul, medida del caudal de 0,250 ml/min, tampón
utilizado de 0,1 M de fosfato de sodio, pH de 6,9 (Figura 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la eficacia in vivo de las
formulaciones de GCSF en ratones hembra B6D2F1, de
7-8 semanas de edad, se inyectaron
5-15 ugs de dosis de proteína (misma actividad) en
los ratones de forma subcutánea. Se dividieron los animales en
siete grupos de cuatro. Se administraron formulaciones de GCSF a
cada animal de cada grupo de la siguiente manera: GCSF (5 \mug),
GCSF (15 \mug), conjugados GCSF-PSA
(5-15 \mug), PBS, GCSF-PEG20
(NeulastaR; 5 \mug). Se extrajeron 50 \mul de sangre de cada
animal y se analizó mediante FACS tras teñirla con anticuerpos
específicos para los glóbulos blancos (Figuras 11 y 12).
El ácido colomínico (AC) es un homopolímero
lineal unido con enlaces alfa-2,8 de residuos del
ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac). Se llevó a cabo
una exposición de los ácidos colomínicos a la oxidación durante 15
minutos utilizando 20 mM de peryodato a temperatura ambiente. Se
analizó la integridad de los residuos internos del Neu5Ac con
enlaces alfa-2,8 después del tratamiento con
peryodato mediante cromatografía de permeación en gel y las
cromatografías obtenidas para el material (ACO) oxidado se
compararon con las del AC nativo. Se descubrió que el AC oxidado y
el nativo presentan unos perfiles de elución casi idénticos, sin
existir evidencia de que los pasos sucesivos de oxidación provoquen
una fragmentación significativa de la cadena polimérica.
Se llevó a cabo una medición cuantitativa del
estado de oxidación del AC mediante la reducción de iones de
ferricianuro en una solución alcalina a ferrocianuro (azul de
Prusia) [Park y Johnson, 1949] utilizando la glucosa como la norma.
La Tabla 2 muestra que se descubrió que el ácido colomínico oxidado
poseía una cantidad mayor a la estequiométrica (>100%) del
agente reductor, esto es, 112 mol % del contenido aparente de
aldehído comprendiendo el poder reductor combinado del hemicetal de
extremo reductor y el aldehído introducido (en el otro extremo,
extremo reductor).
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Se detalla a continuación el procedimiento para
preparar y purificar conjugados de ácido colomínico (AC) del
factor estimulante de colonias granulocíticas (GCSF) de una
manera selectiva N-terminal llevando a cabo la
reacción con un pH reducido (pH de 5,5) y a 4\pm1ºC. Esto implica
una conjugación en presencia de cianoborohidruro de sodio, seguido
de una purificación utilizando cromatografía de intercambio iónico
(AEX) para extraer el GCSF libre seguido de la extracción del AC
mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). El pH bajo
se utilizó para favorecer la derivatización selectiva del grupo alfa
amino del extremo N-terminal, y también para
minimizar la agregación de GCSF durante la reacción. La composición
del tampón de reacción final era de 5% de sorbitol, 0,5 mg/ml de
Tween 20 en 10 mM de NaOAc con un pH de 5,5.
Se confirmó la formación de los conjugados
GCSF-AC y la estabilidad mediante
SE-HPLC (cambio del tiempo de retención del
GCSF-PSA en comparación con el GCSF; también
co-elución de ambas partes de moléculas);
cromatografía de intercambio iónico (unión de conjugados en la
columna de AEC) y electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE; cambio de bandas con especies de alto
p.m. y PAGE nativa). Los conjugados utilizados en el ensayo de
línea celular in vitro (en células MNFS-60)
eran activos al \sim40% en comparación con la proteína nativa.
Los conjugados preparados sin aditivos de formulación llevaron a la
agregación de proteína con bajo grado de derivatización. La Figura
5 muestra los datos de la SE-HPLC para la mezcla de
la reacción de GCSF-AC de 39 kDa después de 24
horas, preparada en presencia de Tween 20. Las condiciones de
caracterización eran: columna Superdex 200, tampón de bicarbonato
amónico de 0,15 M con pH de 7,8. La formación de un conjugado
GCSF-PEG se confirmó mediante una
SE-HPLC (Figura 13). Los conjugados de
GCSF-PSA y GCSF se purificaron satisfactoriamente
del PSA y los subproductos de la mezcla de la reacción mediante
cromatografía de afinidad metálica (Fig. 8). Se descubrió que los
conjugados de GCSF eran estables incluso después de seis semanas de
almacenamiento en 20 mM de fosfato de sodio, pH de 7,4 (Fig.
10).
La Tabla 3 muestra el análisis de los picos de
la Figura 5.
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\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 4 muestra los valores de diversos
parámetros utilizados y la Tabla 5 da el peso molecular y la
polidispersidad de las fracciones de AC.
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Se descubrió que los conjugados de PSA se
mostraban activos en el ensayo de actividad in vitro (Figura
9). El estudio de eficacia in vivo muestra que los conjugados
PSA-GCSF son tan buenos como los conjugados de PEG
e infinitamente superiores al GCSF (Figuras 11 y 12).
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (19)
1. Un compuesto que es un derivado polisacárido
N-terminal del GCSF, o de una proteína parecida al
GCSF, en el que el polisacárido es el ácido polisiálico que posee
al menos 2 unidades de ácido siálico unidas una a la otra a través
de enlaces \alpha2,8 ó \alpha2,9 y está compuesto de entre 2 y
200 unidades sacáridas.
2. Un compuesto de conformidad con la
reivindicación 1, en el que el polisacárido es un ácido polisiálico,
que consta básicamente solamente de unidades de ácido siálico.
3. Un compuesto de conformidad con la
reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el que el polisacárido
derivatiza el GCSF o la proteína parecida al GCSF en la unidad
terminal reductora del polisacárido.
4. Un compuesto con la fórmula general (I)
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
m es al menos uno;
XB deriva de B-XH que es el GCSF
o una proteína parecida al GCSF donde XH es NH_{2} ó SH;
L es un enlace, un grupo de unión, o está
compuesto de un polipéptido o un oligómero sintético;
GlyO es una unidad de ácido siálico, donde las
unidades de ácido siálico están unidas con enlaces \alpha2,8 ó
\alpha2,9 las unas a las otras;
en la que el grupo de unión, si está presente,
tiene la fórmula general
-Y-C(O)-R^{1}-C(O)-;
en la que Y es NR^{2} ó
NR^{2}-NR^{2}; R^{1} es un radical orgánico
bifuncional seleccionado del grupo que está compuesto de
alcanediilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y
alquilheteroarileno, cualquiera de los cuales puede ser sustituido
y/o interrumpido por enlaces carbonilo, éster, sulfuro, éter, amida
y/o amina;
y R^{2} es H o un alquilo
C_{1-6}.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un compuesto de conformidad con la
reivindicación 4, en el que L es un enlace o es un grupo.
6. Un compuesto de conformidad con la
reivindicación 4 ó 5, en el que XH es NH_{2} y es la amina
N-terminal del GCSF o de la proteína parecida al
GCSF.
7. Un compuesto de conformidad con la
reivindicación 4 ó 5, en el que XH es NH_{2} y es un grupo amina
de la cadena lateral de un aminoácido lisina.
8. Un compuesto de conformidad con cualesquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido polisiálico
está compuesto de 80-180 unidades de ácido
siálico.
9. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones
1-8, y uno o más excipientes farmacéuticamente
aceptables.
10. Un compuesto de conformidad con
cualesquiera de las reivindicaciones 1-8, para su
uso en terapia.
11. Un método para producir un
N-derivado polisacárido del GCSF o de una proteína
parecida al GCSF en el que un polisacárido aniónico, es decir, un
ácido polisiálico que posea al menos 2 unidades de ácido siálico
unidas con enlaces \alpha2,8 ó \alpha2,9 la una a la otra y que
esté compuesto de 2-200 unidades sacáridas, se hace
reaccionar químicamente con el GCSF o la proteína parecida al
GCSF.
12. Un método de conformidad con la
reivindicación 11, en el que el polisacárido aniónico posee un grupo
aldehído reactivo que reacciona con el GCSF o con la proteína
parecida al GCSF y la reacción de derivatización se lleva a cabo
bajo condiciones de reducción.
13. Un método de conformidad con la
reivindicación 12, en el que el grupo aldehído reactivo se encuentra
en el extremo no reductor del polisacárido.
14. Un método de conformidad con cualesquiera
de las reivindicaciones 11-13, en el que el
polisacárido reacciona con un grupo amina del GCSF o de la proteína
parecida al GCSF.
15. Un método de conformidad con la
reivindicación 14, donde la amina es un grupo amina terminal.
16. Un método de conformidad con la
reivindicación 15, en el que la amina se deriva de la cadena lateral
de un aminoácido lisina del GCSF o de la proteína parecida al
GCSF.
17. Un método de conformidad con cualesquiera
de las reivindicaciones 11-16, en el que el
polisacárido aniónico o producto intermedio de la reacción
reacciona con un grupo amina terminal del GCSF o de la proteína
parecida al GCSF en una primera solución acuosa de pH acídico de
entre 4,0-6,0; y el derivado polisacárido resultante
se purifica en una segunda solución acuosa de un pH mayor que el de
la primera solución acuosa en la gama entre
6,5-8,5.
18. Un método de conformidad con cualesquiera
de las reivindicaciones 11-17, que se lleva a cabo
en presencia de un aditivo de formulación seleccionado de entre uno
o más tampones, estabilizadores, surfactantes, sales, polímeros,
iones metálicos, azúcares, polioles o aminoácidos.
19. Un método de conformidad con la
reivindicación 18, en el que el aditivo de formulación se selecciona
de entre el sorbitol, la trehalosa, la sacarosa, los surfactantes
no iónicos, los polímeros seleccionados de entre el PSA, el PEG y
la hidroxi-beta-ciclodextrina, los
iones metálicos divalentes, y el tampón de acetato/fosfato de
sodio.
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