JP6243456B2

JP6243456B2 - ポリサッカライドによるタンパク質のｎ末端誘導体化

Info

Publication number: JP6243456B2
Application number: JP2016020557A
Authority: JP
Inventors: サンジャイジェイン; ピーターレイン; グレゴリーグレゴリアディス
Original assignee: リポクセンテクノロジーズリミテッド
Priority date: 2006-07-25
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2017-12-06
Anticipated expiration: 2027-07-25
Also published as: US8946406B2; JP2009544677A; ES2581902T3; EP2630972B1; ES2569066T3; US20140134147A1; JP2009544680A; ATE467642T1; CN101511391A; JP2014114315A; WO2008012528A1; EP2043692B1; US20140309407A1; ES2344670T3; US9266936B2; US10300144B2; EP2041167A1; EP2043692A2; US20220133898A1; US20100022443A1

Description

本発明は、好ましくは少なくとも末端にシアル酸ユニットを有し、且つ好ましくは本質的にシアル酸ユニットのみから成るポリサッカライドが、制御条件下でタンパク質又はペプチドのＮ末端で反応し、Ｎ末端誘導体を生成する、タンパク質のＮ末端誘導体を製造する方法に関する。誘導体は、タンパク質及びペプチドの薬物動態及び薬力学を改善するのに有用である。

ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、或る特定の細菌株によって、及び哺乳動物の或る特定の細胞において生成された、自然発生的な非分岐ポリマーである。ポリシアル酸は、限定酸加水分解、又はノイラミニダーゼによる消化、又は天然の細菌誘導形態のポリマーの分別によって、ｎ＝約８０以上から下はｎ＝２までの様々な重合度で生成することができる。近年、タンパク質及び低分子量の薬物分子の薬物動態特性を変えるために、ポリシアル酸、特にα−２，８結合したホモポリマー状のポリシアル酸の生物学的特性が活用されている。ポリシアル酸の誘導体化によって、カタラーゼ及びアスパラギナーゼを含む多くの治療タンパク質に対する血中半減期が劇的に改善され、治療タンパク質への事前曝露の望ましくない（不可避である場合もある）結果として既存の抗体に直面した場合にもこのようなタンパク質を使用することが可能である（非特許文献１、非特許文献２）。α−２，８結合したポリシアル酸はＰＥＧに対する魅力的な代替手段を提供し、ヒトの身体の天然部分であり、且つ組織ノイラミニダーゼを介して非毒性サッカライドであるシアル酸へと分解する免疫学的に不可視の生分解性ポリマーである。

本発明者らは、ポリサッカライドとタンパク質等の治療薬とを連結する方法をこれまでに記載している（特許文献１、特許文献２）。これらの方法の幾つかは、第１級アミン基で反応するタンパク質反応性のアルデヒド部分を作製する、ポリマーの「非還元性」末端の化学的誘導体化によるものである。非還元性シアル酸末端ユニットは、隣接ジオールを含有するため、過ヨウ素酸塩により容易に（且つ選択的に）酸化され、タンパク質への反応性が非常に高く、且つ還元的アミノ化及び他の化学反応を介したタンパク質の連結に好適な反応因子を含む、モノアルデヒド形態を得ることができる。この反応は、図１に示され、
Ａ）非還元性末端でタンパク質反応性アルデヒドを形成する、過ヨウ素酸ナトリウムによるコロミン酸（大腸菌由来のα−２，８結合ポリシアル酸）の酸化を示し、
Ｂ）タンパク質アミノ基との安定な不可逆共有結合を形成する、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるシッフ塩基の選択的還元を示す。

タンパク質の多官能性のために、ＰＳＡ及びＰＥＧ結合戦略によって不可逆的に、化学的に異なる分子化合物（molecular entities）の混合物が得られる。例えば、コロミン酸とアミノ酸の側鎖との反応によって上記の従来の結合反応中に意図しない副産物が生成する可能性がある。これらは、ヒト及び動物における治療的使用のために規制当局が要求する化学的に定義された複合体を製造するのを困難にするのに十分であり得る。

タンパク質のアミン末端と結合する単一のＰＥＧ鎖を有する本質的に均質のＰＥＧ−タンパク質誘導体の調製を可能にする、タンパク質とポリ（エチレングリコール）との結合の部位特異的（site-directed）アプローチが非特許文献３に記載されている。この選択
性は、通常より低いｐＨでＰＥＧ−アルデヒドによるタンパク質の還元アルキル化を行うことによって達成される。しかし本方法は、ＰＥＧのみとの結合に適用された。

ＰＥＧ化の化学的役割は、これらの分子の生理化学的特性の違い等からポリシアル化に適用することはできない。ＰＳＡは酸に不安定なポリマーであり、中性ｐＨ付近では数週間安定である（図２．２）。図２．２の結果は、ｐＨ６．０及び７．４では、ＣＡは８日間安定であり、ｐＨ５．０では、分解は緩やかであり（４８時間後で最初のＭＷの９２％）、ｐＨ４．０では、分解が緩やかである（４８時間後で最初のＭＷの７０％）。ポリシアル酸が高親水性である一方で、ＰＥＧは自然状態で両親媒性分子である。ＰＥＧ化に使用する条件を用いてポリシアル化を行う場合、多くの場合でタンパク質の凝集及び析出が見られる。

米国特許第５，８４６，９５１号（Ａ）国際公開第０１８７９２２号（Ａ）

Fernandes and Gregoriadis, 2006 Jain et al., 2003, 2004 Kinstler et. al., 2002

タンパク質製剤の開発において残る最難題の１つは、タンパク質の物理的及び化学的な不安定性に対処することである。タンパク質製剤は通常、許容される貯蔵寿命を達成するために、冷条件下で保存されるか又は凍結乾燥しなければいけない。タンパク質の安定性を改善し、タンパク質製剤により大きな安定性及び貯蔵寿命を与えるために、賦形剤（例えば、安定バッファー、糖、ポリオール、界面活性剤、塩、ＰＥＧ、ポリマー、金属イオン及びアミノ酸）及び構造的変化を利用している。依然としてタンパク質−ＰＳＡ複合体の配合を改善する必要性がある。

本発明の第１の態様に従って、本発明者らは、タンパク質又はペプチドの精製Ｎ末端誘導体を製造する方法であって、（ｉ）酸性の水溶液中でタンパク質又はペプチドのＮ末端のアミン基でポリサッカライドを反応させ、Ｎ末端誘導体を生成し、（ｉｉ）工程（ｉ）よりも高いｐＨの水溶液中で、得られたＮ末端誘導体を精製する、タンパク質又はペプチドの精製Ｎ末端誘導体を製造する方法を提供する。

本発明において、本発明者らは、ポリサッカライド、好ましくはポリシアル酸（ＰＳＡ）のタンパク質のＮ末端との化学量論的に規定された部位特異的な複合体を調製することを可能にする簡易で且つ拡大縮小可能な化学的アプローチの適用結果を記載する。典型的に、これは水性環境下でＰＳＡ−アルデヒドによる還元アルキル化によるものである。Ｎ末端結合は、タンパク質におけるポリサッカライドと残りのアミノ酸残基との間の任意の望ましくない干渉を最小限にすると考えられるので好都合である。

本方法は、誘導体化、そうでなければ酸性環境の誘導体化バッファーに曝露することによって、ポリサッカライドが十分に分解された直後に、中性ｐＨに戻す必要がある。本方法は、ｐＨの制御、及び任意でタンパク質の析出を防ぐために反応中の製剤添加剤の存在も必要とする。

本発明によって、製薬産業における有用性が高いタンパク質の規定の化学的に均質で且つ効果的な複合体の合成が可能になる。

本明細書中では、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は区別なく使用される。

タンパク質は主にＮ末端アミン基で反応する。タンパク質のＮ末端で化学反応を選択的に促進する反応のｐＨ条件によって、この反応が行われる。図２．１は、ＰＳＡによるタンパク質の誘導体化を示す。Ｎ末端アミノ基と安定した不可逆的な共有結合を形成するためのシアノ水素化ホウ素(cyanoborohydride)によるシッフ塩基の選択的な還元が示される。

酸性水溶液は、誘導体化反応が行われる反応媒体である。これは、緩衝溶液、例えば酢酸ナトリウムであり得る。反応媒体は水性である。

本発明の第１の態様による方法では、精製工程である工程（ｉｉ）が誘導体化工程である工程（ｉ）よりも高いｐＨで行われる必要がある。好ましくは、実質的に中性のｐＨで精製工程が行われる。誘導体化工程と同じ（酸性）ｐＨで精製を行う場合、ポリサッカライドが分解を受けやすいと考えられる。酸性のｐＨとは、本発明者らは７未満のｐＨを意図する。好ましくは、本方法の工程（ｉ）では、酸性の水溶液のｐＨは３．０〜６．５の範囲、より好ましくは４．０〜６．０の範囲である。本方法の工程（ｉｉ）で使用される溶液のｐＨは、第１の工程における溶液のｐＨより酸性ではない。このｐＨは実質的に中性であることが好ましく、６．５〜９．５、好ましくは６．５〜８．５、最も好ましくは６．５〜８．０の範囲のｐＨを有する。

本発明の一実施の形態において、タンパク質又はペプチドとの反応の前にポリサッカライドを活性化し、活性化誘導体を生成する。典型的に、ポリサッカライドの活性化誘導体は反応性アルデヒド基を有し、還元条件下で工程（ｉ）が行なわれる。還元条件を得るのに、水素化ホウ素(borohydride)を使用してもよい。タンパク質のＮ末端は、反応性アル
デヒド基と反応し、還元するとタンパク質又はペプチドのＮ末端誘導体を生成する付加物を産生する。

反応性アルデヒドは、過ヨウ素酸塩を使用したポリサッカライドの選択的酸化によって生成され得る。

好ましくはポリサッカライドの活性化は、長鎖（重合）出発物質の骨格の中鎖開裂が実質的にない、すなわち分子量の減少が実質的にないような条件下で行わなければいけない。活性化工程は典型的に、アルデヒド部分がポリサッカライドの末端にあることを条件とする。この工程を行うことのできる酵素を使用してもよい。最も都合がいいことには、酸化は化学的酸化である。反応は、ポリマーベースの過ルテニウム酸塩（perrhuthenate）
等の固定化試薬によって行ってもよい。最も直接的な方法は溶解試薬を使用して行われる。酸化剤は好適には過ルテニウム酸、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。１ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度の過ヨウ素酸塩、３〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度、１分〜４８時間の範囲の時間で酸化を行ってもよい。

誘導体化反応に好適な還元条件は、触媒、好ましくは水素化ホウ素等の水素化物で水素を利用してもよい。これらは、アンバーライト（商標）支持水素化ホウ素等で固定化されてもよい。好ましくは、１μＭ〜０．１Ｍの範囲の濃度、５．０〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度、及び１分〜４８時間の範囲の期間で水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物を還元剤として使用する。出発物質上のペンダント型カルボキシル基が還元されないように、反応条件を選択する。他の好適な還元剤は酸性条件下のシアノ水素化ホウ素、例えばポリマー支持シアノ水素化ホウ素又はアルカリ金属シアノ水素化ホウ素、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−セレクトリド、トリアセト
キシ水素化ホウ素等である。

本発明者らの以前の特許出願である国際特許出願第ＷＯ０６／００５４０号に記載されるようにＮＨＳ等のペンダント型官能基を有するものを含むポリサッカライドの他の活性化誘導体が本発明において有用性を有し得る。

好ましくはポリサッカライドは、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヘパリン又は硫酸コンドロイチン等のアニオン性ポリサッカライドである。最も好ましくは、ポリサッカライドはＰＳＡである。しかし、本発明ではこの好ましいポリサッカライド出発物質は、分子中にシアル酸以外のユニットを含んでいてもよい。例えばシアル酸ユニットは、他のサッカライドユニットを代わりにしてもよい。しかし好ましくは、ポリサッカライドは実質的にシアル酸ユニットのみから成る。好ましくはこれらは、２→８及び／又は２→９で結合する。

好ましくは、ポリサッカライド出発物質は、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも１０個、例えば少なくとも５０個のサッカライドユニットを有する。例えば、ポリサッカライドは少なくとも５つのシアル酸ユニットを含み得る。

ポリシアル酸は、任意の供給源、好ましくは細菌源（例えば大腸菌（E. coli）Ｋ１又
はＫ９２、Ｂ群髄膜炎菌（meningococci）、又はさらに牛乳若しくはＮ−ＣＡＭ）等の自然源に由来し、シアル酸ポリマーは、ナイセリア−メニンジティディス（N. meningitidis）の１３５群又はＶ群等のヘテロ高分子ポリマーであり得る。

ポリシアル酸は、塩又は遊離酸の形態であり得る。ポリシアル酸は、細菌源からの回収の後に分子量を低減させるような加水分解形態であり得る。

ポリサッカライド、好ましくはポリシアル酸は、１．３を超える、例えば２以上もの多分散度を有するような広範な分子量の物質であり得る。好ましくは、分子量の多分散度は、１．３又は１．２未満、より好ましくは１．１未満、例えば１．０１と低いものである。

当該技術分野で既知の様々な方法を使用して、本発明の第１の態様の方法の工程（ｉｉ）におけるＮ末端誘導体の精製を行ってもよい。好適な精製方法の例としては、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）及びＡＥＸ（アニオン交換クロマトグラフィ）が挙げられる。

本発明の方法では、反応性アルデヒドがポリサッカライドの非還元性末端にあるのが好ましい。しかし、反応性アルデヒドはポリサッカライドの還元性末端で与えられてもよい。ポリサッカライドの還元性末端で反応性アルデヒドによってポリサッカライドを調製するのに好適な化学的性質は本発明者らの以前の特許出願である国際特許出願第ＷＯ０５／０１６９７４号に記載されている。このプロセスは、予備選択的な酸化工程、続く還元工程、その後の酸化工程を伴い、還元性末端及び不動態化非還元性末端にアルデヒドを有する化合物を生成する。

本発明は、治療タンパク質の誘導体の生成に特に有用性がある。このタンパク質は、例えばオベスタチン、レプチン、インターフェロン、ＦＳＨ、ガラクトシダーゼ又はＤＮアーゼであり得る。

製剤添加剤は、本発明の第１の態様による方法の工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）のいずれ
か又は両方における水溶液中に存在してもよい。

製剤添加剤とは、本発明者らは、Wang et al.（1999）に記載されるように内部又は外
部のいずれかでタンパク質又はペプチドを安定化することが可能な賦形剤を意図する。賦形剤は、安定剤、可溶化剤又は金属イオンであり得る。製剤添加剤の好適な例としては、バッファー、安定剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール、又はアミノ酸のうちの１つ又は複数が挙げられる。これらは単独で又は組合せて使用してもよい。

典型的に、タンパク質のアンフォールディングのためのギブズ自由エネルギー変化の増大をもたらす変性状態のタンパク質の脱安定化によって、安定剤は作用する。安定剤は、糖又はポリオール、例えばスクロース、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、マンニトール、ラクトース及びエチレングリコールであるのが好ましい。安定化バッファーはリン酸ナトリウムである。

可溶化剤は界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤であることが好ましい。好適な例としては、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ
Ｆ６８、Ｂｒｉｊ３５及びＴｒｉｔｏｎＸ１００が挙げられる。

金属イオンは二価であることが好ましい。好適な金属イオンとしては、Ｚｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋及びＦｅ^２＋が挙げられる。

製剤添加剤は、ＰＳＡ、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーでもあり得る。

製剤添加剤として使用するのに好適なアミノ酸及びアミノ酸誘導体としては、ヒスチジン、グリシン、他の同様のアミノ酸及びアスパラギン酸ナトリウムが挙げられる。

分子量分布が幅広いポリシアル酸集団は、多分散度がより低い画分で、すなわち平均分子量が異なる画分に分別してもよい。本発明者らの以前の国際特許出願第ＷＯ２００５／０１６７９４号及び同第ＷＯ２００５／０３１４９号に記載されるように溶離に好適な塩基性バッファーを使用したアニオン交換クロマトグラフィによって、分別が行われるのが好ましい。分別方法は、ポリシアル酸出発物質及び誘導体に好適である。したがってこの技法は、本発明の必須のプロセス工程の前又は後に適用してもよい。好ましくは、得られたポリシアル酸誘導体の多分散度は１．１未満である。

本発明の第２の態様によれば、本発明者らは、タンパク質のポリシアル酸誘導体集団を含む組成物であって、誘導体が２個〜２００個のシアル酸ユニットを含み、集団が実質的にタンパク質のＮ末端誘導体のみから成る、タンパク質のポリシアル酸誘導体集団を含む組成物を提供する。

集団とは、本発明者らは、組成物中に２つ以上のポリシアル酸誘導体が存在することを意図する。誘導体は、同数又は異なる数のシアル酸ユニットを含み得る。好ましくは、組成物中のポリシアル酸の多分散度は１．３未満、より好ましくは１．１未満である。

集団において、実質的に全てのタンパク質がＮ末端のアミンのみで誘導体化される。このことは、本発明者らは、集団中のタンパク質の少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、Ｎ末端のアミンのみでＰＳＡによって誘導体化されることを意図する。ペプチドマッピング及びエドマン分解等の当該技術分野で既知の技法を使用して、Ｎ末端での誘導体化度を測定することができる。

タンパク質は、治療的用途を有する任意のタンパク質、例えばオベスタチン、レプチン、インターフェロン、ＦＳＨ、ガラクトシダーゼ又はＤＮアーゼであり得る。

タンパク質がＦＳＨである場合、誘導体は典型的に７５個〜２００個のシアル酸ユニットを含む。

タンパク質がα−ガラクトシダーゼである場合、誘導体は典型的に２０個〜１５０個のシアル酸ユニットを含む。

タンパク質がＤＮアーゼである場合、誘導体は典型的に２個〜１２０個のシアル酸ユニットを含む。

タンパク質がＩＦＮである場合、誘導体は典型的に８０個〜１８０個のシアル酸ユニットを含む。好ましいポリシアル酸は、本発明の他の態様において上記で詳述されるようなものである。

ポリシアル酸は、直接的に、すなわち図１で示されるように、又はリンカーを介してタンパク質と結合してもよい。好適なリンカーは、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド官能基含有試薬由来である。リンカーは生物学的安定又は生分解性であってもよく、例えばポリペプチド又は合成オリゴマーを含んでいてもよい。リンカーは、さらに国際特許出願第ＷＯ２００５／０１６９７３号に記載されるように二官能基含有試薬由来であり得る。例えば、好適な二官能性試薬はＢｉｓ−ＮＨＳである。この試薬は、一般式Ｚ−Ｒ^１−Ｚ（式中、各Ｚは官能基であり、同じであっても又は異なっていてもよく、Ｒ^１は二官能性有機基である）を有し得る。好ましくは、Ｒ^１は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルへテロアリーレン（そのいずれかがカルボニル結合、エステル結合、スルフィド結合、エーテル結合、アミド結合及び／又はアミン結合で置換及び／又は介在されてもよい）から成る群から選択される。Ｃ_３〜Ｃ_６アルカンジイルが特に好ましい。最も好ましくは、Ｒ^１は好適な二官能性試薬の適切な部分に対応する。

ポリシアル酸誘導体は、一般式（Ｉ）

（式中、ｍは少なくとも１であり、
ＨＮＢは、タンパク質のＮ末端アミンであるＢ−ＮＨ_２由来であり、
Ｌは化学結合若しくは連結基であるか、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
ＧｌｙＯはシアル酸ユニットであり、
連結基（存在する場合）は、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^１−Ｃ（Ｏ）−（式中、ＹはＮＲ^２又はＮＲ^２−ＮＲ^２であり、Ｒ^１は上記のような二官能性有機基であり、Ｒ^２はＨ又はＣ_１〜６アルキルである）を有する）を有し得る。

本発明のこの態様において、タンパク質はポリサッカライドの非還元性末端と結合する。

タンパク質がポリサッカライドに直接付着する場合、Ｌ基は結合である。しかし、Ｌ基は代替的にＮ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド含有試薬由来であってもよい。試薬は、上記のような一般式Ｚ−Ｒ^１−Ｚを有し得る。この実施の形態では、Ｌは典型的に、基

である。

ポリシアル酸誘導体及び希釈剤を含む組成物、生物学的に活性な新規の化合物を含む薬学的組成物、並びに薬学的に許容される賦形剤も本発明の一部を形成する。薬学的組成物は、ヒト又は獣医学的使用のために経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、局所又は気管内に投与されてもよい。

組成物は、上で詳述されるように製剤添加剤をさらに含んでいてもよい。

本発明の最後の態様は、本発明の第１の態様による方法によって得ることができるタンパク質又はペプチドのＮ末端誘導体である。また上記の誘導体の好ましい特性のいずれかが本発明のこの態様に適用可能である。

タンパク質及びペプチド等の誘導体化によって、半減期の増大、安定性の改善、免疫原性の低減、及び／又は溶解性の制御、したがってバイオアベイラビリティ及び薬物動態特性が得られるか、又は活性剤（actives）の溶解性、若しくは誘導体化された活性剤を含
有する溶液の粘性を高め得る。新規の方法は、モノポリシアル化タンパク質複合体の生成に関して特別な価値がある。このことは、低ｐＨでＮ末端のアミン基がプロトン化すればするほど、反応性が高くなるという理解に基づく。

本発明は実施例１〜実施例１０によって及び添付の図面を参照して例示される。

非還元性シアル酸末端ユニットの従来技術の活性化を示す反応スキームである。タンパク質−アミン部分を用いた反応スキーム１ａの生成物のアルデヒド部分の従来技術の還元アミノ化を示す反応スキームである。タンパク質のＮ末端誘導体化を示す反応スキームである。三重検出ＧＰＣ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ：ＲＩ＋ＲＡＬＳ＋粘度計（Viscosiometer）を使用した異なるｐＨでのコロミン酸（ＣＡ）の分解を示す図である。ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の特徴を示す図である。５０ｋＤａのＣＡＯ−レプチン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣを示す図である。ＥＰＯ製剤のｉｎｖｉｖｏクリアランスを示す図である（静脈内）。ＥＰＯ製剤のさらなるｉｎｖｉｖｏクリアランスを示す図である（皮下）。ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＥＰＯ−ＣＡ複合体の特徴を示す図である。ポリシアル化非グリコシル化ＥＰＯに対する非グリコシル化ＥＰＯのｉｎｖｉｖｏクリアランスを示す図である（ｎ＝３〜４±、皮下）。ポリシアル化ＥＰＯに対する非グリコシル化ＥＰＯのｉｎｖｉｖｏクリアランスをさらに示す図である（静脈注射、ｎ＝３〜４±ＳＥＭ）。ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＮＧＥＰＯ−ＣＡ複合体の特徴付けを示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシン（４％〜２０％）ゲル）によるＣＡ−インスリン複合体の特徴付けを示す図である。ＳＥ−ＨＰＬＣによる精製ＣＡＯ−インスリン複合体の特徴付けを示す図である。非近交系の雌マウスに対するＣＡＯ−インスリン製剤（皮下で０．３Ｕ、ｎ＝４）（約２５ｇ）のｉｎｖｉｖｏ有効性を示す図である。ポリシアル化インターフェロンα２ｂのＳＥ−ＨＰＬＣを示す図である（２４時間後のＣＡとの３９ｋＤａの反応混合物）。ポリシアル化インターフェロンのｉｎｖｉｖｏクリアランスを示す図である（静脈注射、ｎ＝４±ＳＥＭ）。複合体オベスタチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。実施例１０．４における複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。実施例１０．５における複合体のＳＥ−ＨＰＬＣを示す図である。ＤＮアーゼＩ活性対塩化カルシウム濃度を示すグラフである。

材料
炭酸アンモニウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（８ｋＤａ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（９８％超純粋）、メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び分子量マーカーは、Sigma Chemical Laboratory（英国）から得た。使用されるコロミン酸、鎖状α
−（２→８）結合大腸菌Ｋ１ポリシアル酸（平均２２．７ｋＤａ高多分散度１．３４、３９ｋＤａ多分散度１．４、１１ｋＤａ多分散度１．２７）はCamida（アイルランド）から、放射性ヨウ化物（Ｎａ^１２５I）はAmersham（英国）から購入した。他の材料は
、２，４ジニトロフェニルヒドラジン（Aldrich Chemical Company、英国）、透析チューブ（３．５ｋＤａ及び１０ｋＤａのカットオフ限界、Medicell International Limited、英国）、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＳＰＨｉＴｒａｐ、ＰＤ−１０カラム（Pharmacia、英
国）、トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（４％〜２０％及び１６％）、トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー（Novex、英国）を含んでいた。脱イオン水は、ＥｌｇａｓｔａｔＯｐｔｉｏｎ４水精製ユ
ニット（Elga Limited、英国）から得た。使用される全ての試薬は分析用グレードであった。プレートリーダー（Dynex Technologies、英国）を、タンパク質又はＣＡ分析における分光測定に使用した。Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス（７週齢〜８週齢、体重２０ｇ）は、Harlan（英国）から購入し、これらを使用する前に少なくとも１週間順化させた。

硫酸アンモニウム、ＧＣＳＦ（Sll、インド）、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｑ
ＦＦ（カラム１ｍｌ又は５ｍｌ、Amersham Biosciences、英国）、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ＨｉｔｒａｐＢｕｔｙｌＨＰカラム（１ｍｌ又は５ｍｌ、Amersham Biosciences、英国）、マウスレプチン組み換え体（Biomyx）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及び非グリコシル化ＥＰＯ（ＮＧＥＰＯ）（分子量３０６００、SIIL、インド）、トリス（Sigma、英国）、酢酸ナトリウム（BDH、英国）、リン酸ナトリウム（BDH、英国）、
インスリン（Sigma、英国）。
１．タンパク質及びコロミン酸測定
レゾルシノール試薬を用いたポリシアル酸（シアル酸として）の定量的評価は、別記されるようなレゾルシノール法（Svennerholm, 1957）によって行われた（Gregoriadis et.al., 1993；Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997）。タンパク質を、ＢＣＡ比色法又は２８０ｎｍでのＵＶ吸光によって測定した。
２．１コロミン酸の活性化
新たに調製した０．０２Ｍのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）溶液（８倍モル過剰）を２０℃でＣＡと混合し、反応混合物を暗所で１５分間、磁気的に攪拌した。その後、２倍体積のエチレングリコールを反応混合物に添加して過剰なＮａＩＯ_４を消費し、混合物を２０℃でさらに３０分間攪拌した。酸化したコロミン酸を、４℃で、０．０１％炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．４）に対して十分に（２４時間）透析した（分子量カットオフが３．５ｋＤａの透析チューブ）。限外濾過（分子量カットオフが３．５ｋＤａを超える）を、透析チューブからＣＡＯ溶液を濃縮するために用いた。必要な体積に濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、後に使用するまで−４０℃で保存した。代替的に、エタノールによる（２回の）析出によって、ＣＡを反応混合物から回収した。
２．２ＣＡ及び誘導体の酸化状態の測定
コロミン酸の酸化度の定量的評価は、カルボニル化合物との相互作用において、やや溶けにくい２，４ジニトロフェニル−ヒドラゾンを生じる２，４ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いて行われた。非酸化コロミン酸（ＣＡ）／酸化コロミン酸（ＣＡＯ）を、２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に添加し、溶液を振盪し、その後、結晶性沈殿が観察されるまで３７℃に置いた（Shriner et al., 1980）。ＣＡの酸化度（定量的）は、アルカリ性溶液中のフェリシアン化物イオンのフェロシアン化第二鉄（ペルシアンブルー）への還元（その後６３０ｎｍで測定する）に基づく方法（Park and Johnson, 1949）を用いて測定した。この例では、グルコースを標準として用いた。
２．３ゲル浸透クロマトグラフィ
コロミン酸試料（ＣＡ及びＣＡＯ）をＮａＮＯ_３（０．２Ｍ）、ＣＨ_３ＣＮ（１０％、５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、２倍を超えるＧＭＰＷ_ＸＬカラム上で、屈折率を検出しながら（ＧＰＣシステム：ＶＥ１１２１ＧＰＣ溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０ＲＩ検出器及びＴｒｉｓｅｃ３ソフトウェア（Viscotek Europe Ltd.）による照合）、クロマトグラフィを行った。試料（５ｍｇ／ｍｌ）を、０．４５μｍナイロン膜で濾過し、移動相として０．２ＭのＮａＮＯ_３及びＣＨ_３ＣＮ（１０％）を用いて０．７ｃｍ／分で流した。
結果
コロミン酸（ＣＡ）（ポリシアル酸）は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の鎖状のα−２，８結合したホモポリマーである（図１ａ）。室温で２０ｍＭの過ヨウ素酸塩を使用して１５分間、コロミン酸の酸化曝露を行った（Lifely et. al., 1981）。ゲル浸透クロマトグラフィ、及び酸化コロミン酸（ＣＡＯ）に関して得られたクロマトグラフによって、過ヨウ素酸塩処理後の内部のα−２，８結合したＮｅｕ５Ａｃ残基の完全性を分析し、その物質を天然ＣＡのものと比較した。酸化及び天然のＣＡは、ほとんど同一の溶出プロファイルを示し、連続する酸化工程によって、ポリマー鎖の顕著な断片化が起こる証拠はないことが見出された。

ＣＡの酸化状態の定量的測定は、グルコースを標準として使用し、アルカリ性溶液中でフェリシアン化物イオンをフェロシアン化物（プルシアンブルー）に還元することにより行われた（Park and Johnson, 1949）。表１は、酸化したコロミン酸が、化学量論を超える（１００％超）量の還元剤、即ち、還元性末端ヘミケタール及び（他の末端において）導入されたアルデヒドの組み合わされた還元力を含む、１１２モル％の見かけのアルデヒド含有量を有することが見出されたことを示す。

表１：グルコースを標準として用いて２重酸化反応スキーム中の各種コロミン酸の酸化度を平均化する（intermediates）（１００％、グルコース１モル当たり１モルのアルデヒ
ド、ｎ＝３±標準偏差）。
３．製剤添加剤を使用したＮ末端タンパク質−ＣＡ複合体の調製
３．１ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の調製
Ｇ−ＣＳＦ（１８．８ｋＤａ）は溶液として与られ（５％ソルビトール、０．０２５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含有する１０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）中で１．０５ｍｇ／ｍｌ)、２℃〜８℃で保存した。必要量のＧＣＳＦをエッペン
ドルフ管に入れ、氷上に置いた。結合のために添加するＣＡ（例えば酸化又は非酸化ＣＡ、１１モル過剰を超えるタンパク質）の量を式：
ＣＡの重量＝｛タンパク質量（ｇ）／（タンパク質分子量）｝×（ＣＡ分子量）×（モル過剰のＣＡ）
に基づき算出した。

必要量のＣＡを秤量した。１０ｍＭのＮａＯＡｃ、５％ソルビトール（ｐＨ５．５）（ここでは、最終反応体積の２０体積％を使用した）中でＣＡを可溶化し、ＣＡが全て溶解するまで、混合物をゆっくりとボルテックスした後、新しいエッペンドルフ管に濾過するか、又は４０００ｒｐｍで５分間遠心分離をし、上清を新しいエッペンドルフ管に移し、任意の凝集／析出材料を取り除いた。最終反応混合物中でＴｗｅｅｎ２０の最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにするのに必要な量の１０ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ２０ストック溶液を添加した。必要量のＧ−ＣＳＦタンパク質溶液をＣＡ溶液に添加し、（４０ｋＤａに関して）１１モル過剰のＣＡを得て、４±１℃で緩速振盪器（gentle shaker）に反応混合物を
置くことによってゆっくり混合させた。最終反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌにするために、１００ｍｇ／ｍｌのＮａＣＮＢＨ_３溶液を添加し、ゆっくりと混合して、最終反応混合物のｐＨを調べ、必要に応じて４±１℃の１ＭのＮａＯＨ／ＨＣｌでｐＨを５．５に調整した。最後に１０ｍＭのＮａＯＡｃ、５％ソルビトール（ｐＨ５．５）を用いて、反応体積を調整し、反応混合物中で０．６７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。管を封止し、所望の温度（４±１℃）で２４時間撹拌した。適切な方法で反応を止め、ＭＮＦＳ６０セル、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％〜２０％トリスグリシンゲルを使用する）、ＳＥ−ＨＰＬＣ；ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラム）でのｉｎｖｉｔｒｏ活性分析のために試料を回収し、反応混合物のｐＨを調べた。いかなる析出物も取り除くために、反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析及び精製を行った。ＳＥ−ＨＰＬＣに好ましいバッファーは０．１Ｍのリン酸Ｎａ（ｐＨ６．９）であった。３．２ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をＡＥＸバッファーＡ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５．０））で希釈して（反応混合物１．５ｍｌ＋バッファーＡ９ｍｌ）、ｐＨを調べ、必要に応じてｐＨを５．０に調整し、ＡＥＸバッファーＡで予め平衡化したＡＥＸカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをＡＥＸバッファーＡ（少なくとも５カラム体積）で洗浄し、画分（各画分１．５カラム体積）を回収し
、標識した。ＡＥＸバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））で生成物を溶離し、画分（各１カラム体積の画分、６カラム体積）を回収し、標識した。２つの連続した画分がタンパク質含量中に存在しなかった場合（ＵＶ２８０ｎｍ）、次の工程に移った。精製中は試料を氷上に置いた。ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した（１ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦの吸光度は約０．８７２であった）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣのために試料を回収した。混合物から遊離ＣＡを取り除くために、ＨＩＣを使用した。必要に応じて、試料を濃縮した。

ＡＥＸ画分含有複合体をプールし、充填溶液中で２．７５Ｍの濃度になるように、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加した。それから、ＨＩＣバッファーＡ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２．７５Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．５））で予め平衡化したＨＩＣカラムにこの溶液を充填した。充填画分（各１．５カラム体積の画分）を回収し、標識した。ＨＩＣバッファーＡでカラムを洗浄し（少なくとも５カラム体積、流速＝０．５ｍｌ／分）、画分（１．５カラム体積）を回収し、標識した。ＨＩＣバッファーＢ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４））で生成物を溶離し（流速＝５ｍｌ／分）、画分（１カラム体積の画分、６カラム体積）を回収し、標識した。精製中は試料を氷上に置いた。ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した。精製複合体を含有するＨＩＣ画分を組合せて、溶液中の複合体組成物を５０％ソルビトール溶液及び１０ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ２０溶液で調整し、５％ソルビトール及び０．０２５ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ２０の最終組成物を得た。それから、４±１℃で溶液を濃縮し、ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した。（例えば遊離のタンパク質／凝集体等から複合体を分離するために）ＳＥ−ＨＰＬＣによってさらに精製することも可能である。複合体を滅菌濾過し、活性分析のために並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣによる特徴付けのために試料を回収した。必要に応じて、タンパク質分析及びＣＡ分析のために、アリコートを取り出した。次に使用するまで残りを４±１℃で保存し、ＳＥ−ＨＰＬＣで物理的安定性を試験した。

溶液中のＧＣＳＦの安定性及び誘導体化度に影響を与える様々なプロセスの効果を試験した。
結果
低ｐＨ（ｐＨ５．５）及び４±１℃で反応を行うことによってＮ末端で選択的に、（２０ｍｇスケールで）顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のコロミン酸（ＣＡ）複合体を調製及び精製する手法が上記に詳述される。これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下での結合、その後の遊離Ｇ−ＣＳＦを取り除くためのイオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）を用いた精製、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によるＣＡの除去を伴う。Ｎ末端のαアミノ基の選択的誘導体化に有利なように、及びまた反応中のＧＣＳＦの凝集を最小限にするのに低ｐＨを用いた。最終反応バッファーの組成は、１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）において５％ソルビトール、０．５ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ２０であった。

ＳＥ−ＨＰＬＣ（ＧＣＳＦと比較したＧＣＳＦ−ＣＳのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする）、イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムでの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分子量の高い種のバンドのシフト）によって、ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の形成を確認した。（ＭＮＦＳ−６０セルにおける）ｉｎｖｉｔｒｏ細胞株分析で使用される複合体は、天然タンパク質に比べて約４０％活性であった。製剤添加剤なしで調製した複合体によって、誘導体化度が低いタンパク質が凝集した。図３．１の左側は、Ｔｗｅｅｎ２０の存在下で調製した、ＧＣＳＦ−ＣＡの３９ｋＤａの反応混合物に対する２４時間後のＳＥ−ＨＰＬＣデータを示す。特徴付け条件は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、０．１５Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）であった。表２はピーク解析を示す。

図３．１の右側はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
４．１製剤添加剤によるＮ末端レプチン−ＣＡ複合体の調製
レプチンは凍結乾燥粉末として与えられ（分子量１６２４０）、−８０℃で保存した。結合のために添加するコロミン酸（例えば酸化又は非酸化コロミン酸、７．５モル過剰）の量を算出した。最小量の酢酸ナトリウムバッファー中にコロミン酸を溶解し、濾過して、ｐＨを５．５に調整した。レプチン溶液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１％スクロース、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸および０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ５．５）におけるタンパク質）中にコロミン酸溶液を添加した後、反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌにするのに必要なμｌのＮａＣＮＢＨ_３を添加して、ゆっくり混合し、最終反応混合物のｐＨを調べて、ｐＨを５．５に調整した。管を封止し、所望の温度（４±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベート後、（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ等のために）必要な試料を回収した。ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した（１ｍｇ／ｍｌのレプチンの吸光度は０．８７８である）。タンパク質の誘導体化度及び安定性への影響が異なる様々なプロセスを試験した。
４．２レプチン−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
余分なＣＡ及び遊離レプチンを反応混合物から取り除くのに、それぞれＨＩＣ及びＩＥＣを使用した。タンパク質分析及びＣＡ分析のためにアリコートを取り出した。使用するまで残りを−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ウェスタンブロッティング、ＣＡ及びタンパク質分析等によって、生成物を特徴付けた。
結果
低ｐＨ（ｐＨ５．５）及び４±１℃で反応を行うことによってＮ末端で選択的に、（５ｍｇスケールで）レプチンのコロミン酸（ＣＡ）複合体を調製及び精製する手法が上記に示されている。これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下での結合、その後の遊離Ｇ−ＣＳＦを取り除くためのイオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）を用いた精製、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によるＣＡの除去を伴う。Ｎ末端のαアミノ基の選択的誘導体化に有利なように、及びまた反応中のＧＣＳＦの凝集を最小限にするのに低ｐＨ及び製剤添加剤を用いた。最終反応バッファーの組成は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１％スクロース、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ５．５）中のタンパク質であった。

ＳＥ−ＨＰＬＣ（レプチンと比較したレプチン−ＣＡのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする）、イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムへの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分子量の高い種のバンドのシフト）によって、レプチン−ＣＡ複合体の形成を確認した。製剤添加剤なしで調製した複合体によって、誘導体化度が低いタンパク質が凝集した。

図４．１の左側は、５０ｋＤａのＣＡＯ−レプチン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、右側はＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示す。
５．１Ｎ末端エリスロポエチン（ＥＰＯ）−ＣＡ複合体の調製
ＥＰＯは溶液として与えられ（１０ｍＭのリン酸バッファー、１３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中０．３４ｍｇ／ｍｌ、比活性：１１０，０００Ｕ／ｍｌ、分子量３０６００）、−３２℃で保存した。タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を２ｍｌ容エッペンドルフ管に入れた。必要量のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体ＣＡに添加しゆっくり混合した。反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌにするのに必要なμｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を添加し、ボルテックスして、最終反応混合物のｐＨを調べて、必要に応じてｐＨを７．４に調整した。管を封止し、所望の温度（４±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベート後、（例えば活性分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣのために）必要な試料を回収した。
５．２ｅｐｏ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をＨＩＣバッファーＡ（１．２Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．３））で希釈して（試料１ｍｌ＋バッファーＡ４ｍｌ）、ＨＩＣバッファーＡで予め平衡化したＨＩＣカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ（１．２Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．３））（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収し、標識した。ＨＩＣバッファーＢ（１０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．０））で生成物を溶離し、初めの画分（０．５ｍｌ）を回収し、その後の０．５ｍｌ〜１ｍｌ画分を標識した。精製中は試料を氷上に保持した。

ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３であった）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料を取った。ＳＥ−ＨＰＬＣによって複合体とＥＰＯとを分離するにはＣＡの分子量が小さすぎる（例えば２２ｋＤａ）場合、アニオン交換クロマトグラフィ（ＡＸＣ）を用いて非結合ＥＰＯの分離を行った。ＡＸＣのために、ＨＩＣ画分含有タンパク質をＡＸＣバッファーＡ（１０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．０））で希釈して（試料１ｍｌ＋ＡＸＣバッファーＡ５ｍｌ）、ＡＸＣバッファーＡで予め平衡化したＡＸＣカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをＡＸＣバッファーＢ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０））（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収し、標識した。ＡＸＣバッファーＣ（５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））で生成物を溶離し、初めの画分（０．５ｍｌ）を回収し、その後の０．５ｍｌ〜１ｍｌ画分を標識した。精製中は試料を氷上に保持した。

（例えば使用するＣＡの分子量が高い場合（例えば３９ｋＤａ）に、ＥＰＯから複合体を分離するために）ＳＥ−ＨＰＬＣによって代替的な精製を行うことが可能である。ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料を回収した。

タンパク質分析及びＣＡ分析のためにアリコートを取り出した。使用するまで残りを−２０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、生成物を特徴付けた。ＥＰＯの活性を測定するために、フェニルヒドラジンを腹腔内注射することによって人為的に貧血状態にしたマウスの脾臓から単離した、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖を誘導する赤血球前駆細胞における試料を使用した。Krystal（1972）で報告された方法に基づき、プロトコルを調整した
。この分析は、赤血球前駆細胞にＥＰＯを添加すること、及び^３Ｈ−チミジンの取り込み速度を求めることによってＤＮＡ複製速度を測定することによる。ｉｎｖｉｖｏの薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）試験をＢ６Ｄ２Ｆ１マウスで行った。
結果
ＳＥ−ＨＰＬＣ（ＥＰＯと比較したＥＰＯ−ＣＡのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする）、イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムへの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分子量の高い種のバンドのシフト）によって、ＥＰＯ−ＣＡ複合体の形成を確認した（図５．３）。ポリシアル化試料はｉｎｖｉｔｒｏで活性であり、未処理（plain）ＥＰＯに対して非常に優れたプ
ロファイル（ＰＫ及びＰＤ）を示した。図５．１及び図５．２はｉｎｖｉｖｏの結果を示す。

図５．３の左側は、２４時間後のＥＰＯ−ＣＡの３９ｋＤａの複合体のＳＥ−ＨＰＬＣを示す。表３はピーク解析表である。特徴付けの条件：カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００、バッファー０．１５Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）。

６．１Ｎ末端非グリコシル化（ＮＧｅｐｏ−ＣＡ）複合体の調製
無処理の（naked）ＥＰＯは溶液として与えられ（２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッフ
ァー、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．６５）中０．１８ｍｇ／ｍｌ、比活性：１０００００Ｕ／ｍｌ、分子量１９０００）、−３２℃で保存した。タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を２ｍｌ容エッペンドルフ管に入れた。結合のために添加するコロミン酸（例えば酸化又は非酸化コロミン酸）の量を算出した。必要量のコロミン酸を秤量し、重量を記録した。タンパク質溶液を固体ＣＡに添加しゆっくり混合した。反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌにするのに必要なμｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を添加し、ボルテックスして、最終反応混合物のｐＨを調べて、必要に応じてｐＨを７．４に調整した。管を封止し、所望の温度（４±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベート後、（例えば活性分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣのために）必要な試料を回収した。
６．２ＮＧｅｐｏ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をＨＩＣバッファーＡ（１．２Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．３））で希釈して（試料１ｍｌ＋バッファーＡ４ｍｌ）、ＨＩＣバッファーＡで予め平衡化したＨＩＣカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収し、標識した。ＨＩＣバッファーＢで生成物を溶離し、初めの画分（０．５ｍｌ）を回収し、その後の０．５ｍｌ〜１ｍｌ画分を標識した。精製中は試料を氷上に保持した。ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した（１ｍｇ／ｍｌのｎＥＰＯの吸光度は約０．７４３であった）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料を回収した。反応条件によっては、反応混合物中の無処理の遊離ＥＰＯがなくなるので、さらなる精製の必要はなかった。無処理のＥＰＯが反応混合物中に存在していた場合は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ６（５０００ＭＷＣＯ）を使用してＨＩＣ画分含有タンパク質を濃縮し、精製をＳＥ−ＨＰＬＣによって行うことが可能である。ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した（１ｍｇ／ｍｌのｎＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料を回収した。

タンパク質分析及びＣＡ分析のためにアリコートを取り出した。使用するまで残りを−２０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、生成物を特徴付けた。
結果
ＳＥ−ＨＰＬＣ（ＮＧＥＰＯと比較したＮＧｅｐｏ−ＣＡのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする）、イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムでの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分子量の高い種
のバンドのシフト）によって、ＮＧｅｐｏ−ＣＡ複合体の形成を確認した（図６．１〜図６．３）。図６．３の左側は、２４時間後のＥＰＯ−ＣＡの３９ｋＤａの複合体を示す。ポリシアル化試料はｉｎｖｉｔｒｏで活性であり、未処理ＮＧｅｐｏに対して非常に優れたプロファイル（ＰＫ及びＰＤ）を示した。

図６．３は、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。ピーク解析を以下の表４に示す。特徴付け条件 − カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００、バッファー：０．１５Ｍの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）。

図６．１はｉｎｖｉｖｏクリアランスの結果を示す。ＰＳＡ−ＮＧＥＰＯは、ＮＧＥＰＯと比較して非常に優れたプロファイルを示した。
７．１Ｎ末端インスリン−ＣＡ複合体の調製
インスリンを最低１００ｍＭのＨＣｌで溶解した後、必要なｐＨに調整した。結合のためのコロミン酸（例えば酸化又は非酸化コロミン酸）の量を算出した。必要量のコロミン酸を秤量し、最低量の反応バッファー中に溶解し、タンパク質溶液に添加して、ボルテックスミキサを使用してゆっくり混合した。反応混合物１ｍｌ当たり４ｍｇの最終濃度を得るのに必要なμｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。必要に応じて反応混合物中に好適な安定剤を使用した。管を封止し、所望の温度（場合に応じて３７℃）で４８時間撹拌した。使用するタンパク質によって時間及び温度を変えてもよい。ポリシアル化タンパク質をＩＥＣ及びＨＩＣで精製した。２４時間後、タンパク質−ポリマー複合体が１００％に達した。これは、ｎａｔｉｖｅ−ｐａｇｅ、ＳＤＳ−ｐａｇｅ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ等によって特徴付けられた。

ＩＥＣでは、（カラムに残留する）遊離インスリンから（カラムと結合しない）ポリシアル化インスリンを分離するために、ＨｉｇｈＴｒａｐＳＰカラムによるカチオン交換クロマトグラフィによって、インスリン及びインスリン−コロミン酸複合体を精製する。これは、カチオン交換樹脂を使用する５．２の等電点以下（少なくとも１つの以下のユニット）での複合体の分離を伴う。これらの複合体の活性は、健常なマウスで測定した。７．２インスリン−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
反応混合物試料をＡＥＸバッファーＡ（０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．４））で５倍に希釈し、ｐＨを調べて、必要に応じてｐＨを４．４に調整し、ＡＥＸバッファーＡで予め平衡化したＡＥＸカラム（流速＝１ｍｌ／分）に充填した。充填画分（各１．５カラム体積の画分）を回収し、標識した。ＡＥＸバッファーＡ（０．０５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．４））でカラムを洗浄し（少なくとも５カラム体積、流速＝１ｍｌ／分）、画分（各１．５カラム体積の画分）を回収し、標識した。ＡＥＸバッファーＢ（０．０５Ｍの酢酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ４．４））で生成物を溶離し（流速＝１ｍｌ／分）、画分（各１カラム体積の画分、６カラム）を回収し、標識した。２つの
連続した画分がタンパク質含量中に存在しなかった場合、次の工程に移った。精製中は試料を氷上に保持した。

ＡＥＸ画分含有複合体をプールし、ＨＩＣバッファーＡ（０．８Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４））で１０倍に希釈し、塩酸溶液又は水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．４に調整した。それから、ＨＩＣバッファーＡ（０．８Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４））で予め平衡化したＨＩＣカラム（流速＝０．３ｍｌ／分）にこの溶液を充填した。充填画分（各１．５カラム体積の画分）を回収し、標識した。ＨＩＣバッファーＡでカラムを洗浄し（少なくとも５カラム体積、流速＝０．５ｍｌ／分）、画分（１．５カラム体積）を回収し、標識した。ＨＩＣバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４））で生成物を溶離し（流速＝５ｍｌ／分）、画分（１カラム体積の画分、６カラム体積）を回収し、標識した。精製中は試料を氷上に保持した。ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した。精製複合体を含有するＨＩＣ画分を組合せて、４±１℃で溶液を濃縮し、ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した。
結果
ＳＥ−ＨＰＬＣ（インスリンと比較したインスリン−ＣＡのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする）、イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣカラムでの複合体の溶離）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分子量の高い種のバンドのシフト）によって、インスリン−ＣＡ複合体の形成を確認した（図７．１及び図７．２）。ポリシアル化試料は、天然タンパク質と比べて優れたｉｎｖｉｖｏ有効性を示した。

図７．２において、ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ１２、バッファー：０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、流速０．２５ｍｌ／分、注入量２００μｌ。
８．１Ｎ末端インターフェロン−ＣＡ複合体の調製
ＩＦＮα２ｂのコロミン酸（ＣＡ）複合体を調製及び精製する手法は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下での結合、その後の遊離コロミン酸を取り除くためのＨＩＣによる精製、その後のＡＸＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣ（任意）のいずれかによる非結合ＩＦＮの除去を伴う（例として１ｍｇスケール）。

ＩＦＮα２ｂは溶液として与えられ（酢酸バッファー（ｐＨ５）中１．７５ｍｇ／ｍｌ）、−３２℃で保存した。タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を２ｍｌ容エッペンドルフ管に入れた。反応混合物中のタンパク質濃度が１．７５ｍｇ／ｍｌよりも低かった場合、必要量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。

必要量のＣＡを秤量し、記録した。ＣＡを最低量の反応バッファーに可溶化させ、タンパク質溶液に添加し、ボルテックスを使用してゆっくりと混合した。反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌにするのに必要なμｌを添加し、ゆっくり混合して、最終反応混合物のｐＨを調べて、必要に応じてｐＨを６．０に調整した。管を封止し、所望の温度（４±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベーション時間後、（例えば活性分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣのために）必要な試料を回収した。
８．２インターフェロン−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をＨＩＣバッファーＡ（２５ｍＭのトリスバッファー、３Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５））で希釈して（試料１ｍｌ＋バッファーＡ４ｍｌ）、ＨＩＣバッファーＡで予め平衡化したＨＩＣカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ（２５ｍＭのトリスバッファー、３Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５））（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収し、標識した。ＨＩＣバッファーＢ（２５ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．５））でカラムを溶離し、初めの画分
（０．５ｍｌ）を回収し、その後の０．５ｍｌ〜１ｍｌ画分を回収し、標識した。精製中は試料を氷上に保持した。

ＵＶ（２８０ｎｍ）でタンパク質濃度を分析した（１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮの吸光度は約１である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料を回収した。

アニオン交換クロマトグラフィ（ＡＸＣ）又はＳＥ−ＨＰＬＣを使用して、非結合ＩＦＮの分離を行った。ＡＸＣのために、ＨＩＣ画分含有タンパク質をＡＸＣバッファーＡ（２５ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．５））で希釈して（試料１ｍｌ＋ＡＸＣバッファーＡ５ｍｌ）、ＡＸＣバッファーＡで予め平衡化したＡＸＣカラムに充填した。充填画分を回収し、標識した。カラムをＡＸＣバッファーＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５））（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収し、標識した。ＡＸＣバッファーＣ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７））で生成物を溶離し、初めの画分（０．５ｍｌ）を回収し、その後の０．５ｍｌ〜１ｍｌ画分を標識した。精製中は試料を氷上に保持した。

（例えばモノ複合体からジ複合体を分離するために）ＳＥ−ＨＰＬＣによってさらなる精製を行った（図８．１）。

ＵＶ（２８０ｎｍ）（１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮの吸光度は約１である）又はＢＣＡ分析でタンパク質濃度を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料を回収した。タンパク質分析及びＣＡ分析のためにアリコートを取り出した。使用するまで残りの生成物を−２０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、生成物を特徴付けた。活性をダウディ細胞株で求めた。
結果
ＳＥ−ＨＰＬＣ（インターフェロンと比較したインターフェロン−ＣＡのリテンションタイムの変化、両方の部分が同時に溶離もする）、イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムへの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分子量の高い種のバンドのシフト）によって、インターフェロン−ＣＡ複合体の形成を確認した（図８．１〜図８．２）。ポリシアル化試料はｉｎｖｉｔｒｏで活性であり、未処理インターフェロンに対して非常に優れたプロファイル（ＰＫ）を示した。

表５は、図８．１のＳＥ−ＨＰＬＣのピーク解析を示す。

９．１．オベスタチンのポリシアル化
オベスタチンは、２．５ｋＤａの食欲抑制ホルモンである。グレリン遺伝子によってコードされるが、オベスタチンはグレリンの食欲刺激効果に拮抗する。ラットのオベスタチン処理によって、食物摂取の抑制、空腸収縮の阻害、及び体重増加の低減が示されている。
９．２Ｎ末端結合（部位特異的）
１５モル過剰の１４ｋＤａの酸化したポリシアル酸（ＰＳＡ）をバッファー中で溶解し、ｐＨを６．０に調整した。それから、オベスタチン及び５０ｍＭ（最終濃度）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、ｐＨを再び調整して、反応混合物を必要量にした。１８時間、ゆっくりと振盪させながら４±１℃で反応を行った。
９．３ランダム結合（相対的）
１０モル過剰の１４ｋＤａの酸化したＰＳＡをバッファー中で溶解し、ｐＨを７．４に調整した。それから、オベスタチン及び５０ｍＭ（最終濃度）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、ｐＨを再調整して、反応混合物を必要量にした。１８時間、ゆっくりと振盪させながら４±１℃で反応を行った。
結合の解析
サイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）でリテンションタイムの低減、したがってサイズの増大によって、結合を確認する。０．２５ｍＬ／分の流速で、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）で予め平衡化したＳＥ−ＨＰＬＣＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに結合反応物１００μＬを注入した。２８０ｎｍでの吸光度の記録した。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルでの移動性の低減によって、複合体を可視化する（図９）。非変性条件下で４％〜２０％トリスグリシンゲルで試料を電気泳動した。レーン１：分子量マーカー、２：オベスタチン、３：ｐＨ６．０の反応物、４：ｐＨ７．４の反応物。

ＳＥ−ＨＰＬＣによって確認されたように、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方でオベスタチン−ＰＳＡ複合体が首尾よく作製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ｐＨ７．４で作製された複合体も可視化した。
１０．１ＤＮアーゼＩのポリシアル化
嚢胞性線維症（ＣＦ）患者では、気道中の粘性の化膿分泌物の滞留が、肺機能の低下及び感染の増悪の一因となる。肺の化膿分泌物は、感染に応じて集積する白血球を変性することによって放出される非常に高濃度の細胞外ＤＮＡを含有する。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）によるＣＦ患者の治療によって、ＤＮＡが加水分解し、これにより痰の粘弾性が低減する。この治療は、全身性エリテマトーデスの治療及び腫瘍の標的化にも提案されている。
１０．２Ｎ末端結合（部位特異的）
２０モル過剰の２６ｋＤａの酸化したポリシアル酸（ＰＳＡ）をバッファー中で溶解し、ｐＨを６．０に調整した。それから、ウシＤＮアーゼＩ（Samsong & Sigma）及び５０
ｍＭ（最終濃度）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、ｐＨを再び調整して、反応混合物を必要量にした。１８時間、ゆっくりと振盪させながら、３７±１℃及び４±１℃で反応を行った。
１０．３ランダム結合（相対的）
１０〜５０モル過剰の１４ｋＤａの酸化したＰＳＡをバッファー中で溶解し、ｐＨを７．４に調整した。それから、ウシＤＮアーゼＩ（Samsong & Sigma）及び５０ｍＭ（最終
濃度）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、ｐＨを再び調整して、反応混合物を必要量にした。１８時間、ゆっくりと振盪させながら、３７±１℃及び４±１℃で反応を行った。
１０．４結合の解析
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルでの移動性の低減によって、複合体を可視化した（図１０．１）。非変性条件下で４％〜２０％トリスグリシンゲルで試料を電気泳動した。レーン１：分子量マーカー、２：ブランク、３：ＤＮアーゼＩ、４：SigmaのＤＮアーゼＩ、５：ブランク、６：非酸化ＰＳＡを
有するＤＮアーゼＩ、７：ＤＮアーゼＩ酸化ＰＳＡ（ｐＨ７．４）反応物、８：ＤＮアーゼＩ酸化ＰＳＡ（ｐＨ６．０）反応物。
１０．５複合体の精製
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）−フェニルセファロースマトリクス、２．０Ｍの硫酸アンモニウムを含有する開始バッファー、硫酸アンモニウムを有しないバッファー中の溶離を用いて、ＤＮアーゼＩ−ＰＳＡ複合体を精製した。それから、溶離画分をイオン交換マトリクスＱ−セファロースＦａｓｔＦｌｏｗに加え、塩化ナトリウムを含有するバッファーで溶離した。サイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）で、複合体の精製を確認した（図１０．２）。０．２５ｍＬ／分の流速で、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）で予め平衡化したＳＥ−ＨＰＬＣＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに結合反応物１００μｌを注入した。２８０ｎｍでの吸光度の記録した。

ＤＮアーゼＩ−ＰＳＡ複合体は、ＤＮアーゼＩ単独と比べて、サイズ排除カラムにおけるリテンションタイムの低減を示す。
１０．６活性ＤＮアーゼＩの精製
ヘパリン−セファロース（sepahrose）クロマトグラフィによって活性ＤＮアーゼＩと
熱不活化ＤＮアーゼＩとの混合物から活性ＤＮアーゼＩを精製した。低塩バッファー中のカラムにＤＮアーゼＩ混合物を加え、漸増勾配の塩化ナトリウムで溶離した。画分Ａ１２中のＤＮアーゼＩ１ｍｇ当たりの活性は、試料の活性よりもおよそ４倍高かった。
１０．７複合体の活性
複合体の活性を測定し、メチル−グリーン分析（Sinicropi et. al.,（1994） Anal Biochem, 222（2）:351-8）を使用して非結合ＤＮアーゼＩの活性と比較した。３７±１℃
で作製された精製ＤＮアーゼＩ−ＰＳＡ複合体は、非結合ＤＮアーゼＩと比べて（４ｍＭのＣａＣｌ_２バッファー（下記を参照されたい））中でおよそ１０％の活性を示した。

ＤＮアーゼＩ及びＤＮアーゼＩ−ＰＳＡ複合体のＤＮＡ加水分解活性に対するＣａＣｌ_２滴定の効果を測定した（ｎ＝１）（図１０．３）。ＣａＣｌ_２は製剤添加剤である。メチル−グリーンＤＮアーゼＩ分析を設定し、さらにＣａＣｌ_２を添加した。活性は、４ｍＭのＣａＣｌ_２バッファーにおける活性と比較して表す。結合ＤＮアーゼＩ及び遊離ＤＮアーゼＩで、ＤＮアーゼＩのメチル−グリーン分析を設定し、最大１００ｍＭの濃度までの様々な濃度でＣａＣｌ_２を添加した。ＣａＣｌ_２の添加によって、遊離ＤＮアーゼＩの活性よりも結合ＤＮアーゼＩの活性が増大したことが見出された。したがって、ＤＮアーゼ−ＰＳＡ複合体の完全活性化にはより多くのＣａＣｌ_２が必要である。
結論
活性なＤＮアーゼＩ−ＰＳＡ複合体は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で作製されている。複合体は、遊離ＤＮアーゼＩから精製され、遊離ＤＮアーゼの活性に比べて、ＤＮアーゼＩ１ｍｇ当たりの活性はおよそ１０％を示す。
参照文献

Claims

以下の工程を含む、タンパク質の精製Ｎ末端ポリシアル酸誘導体を製造する方法：
（ｉ）ｐＨが６．０の水溶液中でタンパク質のＮ末端のアミン基でポリシアル酸を反応させる工程であって、実質的にタンパク質のＮ末端誘導体のみからなる集団を生成する、工程、及び
（ｉｉ）ｐＨが６．５〜８．０の水溶液中で、得られたタンパク質のＮ末端誘導体を精製する工程、
該タンパク質のＮ末端誘導体が、２〜２００個のシアル酸ユニットを含み、
該タンパク質がインターフェロン、オベスタチン又はＤＮアーゼＩである、方法。
前記ポリシアル酸が反応性アルデヒド基を有し、工程（ｉ）を還元条件下で行う、請求項１に記載の方法。
前記反応性アルデヒド基が前記ポリシアル酸の非還元性末端にある、請求項２に記載の方法。
前記反応性アルデヒド基が前記ポリシアル酸の還元性末端にあり、前記ポリシアル酸の非還元性末端が、タンパク質のＮ末端と反応しないように不動態化している、請求項２に記載の方法。
製剤添加剤が、工程（ｉ）における前記水溶液に添加される、請求項１に記載の方法。
前記製剤添加剤が、バッファー、安定剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸のうちの１つ又は複数から選択される、請求項５に記載の方法。
前記糖が、ソルビトール、トレハロース又はスクロースである、請求項６に記載の方法。
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
前記ポリマーが、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーである、請求項６に記載の方法。
前記金属イオンが、二価の金属イオンである、請求項６に記載の方法。
前記バッファーが、リン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムバッファーである、請求項６に記載の方法。
水素化ホウ素が工程（ｉ）における前記水溶液中に存在することにより、前記還元条件が得られる、請求項２に記載の方法。