CN103169984A - N末端聚唾液酸化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含蛋白质的多糖衍生物群的组合物，其中所述蛋白质为胰岛素或胰岛素样蛋白质，所述多糖是阴离子型并包含2-125个糖单元，并且其中所述群基本上仅由所述蛋白质的N末端衍生物组成。所述多糖通常为PSA。本发明还涉及包含所述新型化合物的组合物，以及用于制备该新型化合物的方法。

Description

N末端聚唾液酸化
本申请是2009年3月11日提交的名称为“N末端聚唾液酸化”的200780033741.8发明专利申请的分案申请。
本发明涉及胰岛素的新型多糖衍生物以及用于产生这种衍生物的方法。所述衍生物可用于改良胰岛素的稳定性、药代动力学及药效学。
糖尿病是一种碳水化合物代谢紊乱，由胰岛素产生不足或对胰岛素敏感性降低导致。胰岛素在胰脏朗格罕氏岛(islets of Langerhans)的β细胞中合成，是体内大多数细胞正常利用葡萄糖所必需的。在患有糖尿病的人中，利用葡萄糖的正常能力受到抑制，从而增加了血糖水平(高血糖症)。
有两种不同类型的糖尿病。I型是胰岛素依赖型糖尿病即IDDM。IDDM在以前指的是青少年型糖尿病。在IDDM中，胰脏不分泌胰岛素，必须通过外源来提供。Ⅱ型成年型糖尿病通常可通过饮食进行控制，但在某些重症病例中需要胰岛素。
在20世纪20年代胰岛素被分离之前，大多数患者在疾病发作后短时间内死去。未治疗的糖尿病会导致酮症——酮(脂肪分解的产物)在血液中积聚；随后是具有恶心和呕吐症状的酸中毒(酸在血液中积聚)。随着紊乱的糖代谢和脂肪代谢的毒性产物的持续积累，患者会发生糖尿病昏迷。
糖尿病的治疗一般需要定期地注射胰岛素。这产生显著的、挽救生命的临床改良。然而，由于胰岛素注射的不便，大量努力聚焦于提高胰岛素的给药及生物同化。
胰岛素分子由两条通过二硫键连接的氨基酸链组成(mw5804)。胰岛[β]细胞分泌单链的胰岛素前体——被称为胰岛素原。胰岛素原的蛋白酶解导致4个碱性氨基酸(胰岛素原链的31、32、64和65位：分别为Arg、Arg、Lys、Arg)以及连接(“C”)多肽被除去。在形成的双链胰岛素分子中，在A链氨基末端具有甘氨酸，在B链氨基末端具有苯丙氨酸。
胰岛素可以以单体、二聚体或由三个二聚体形成的六聚体的形式存在。该六聚体与两个Zn2+原子络合。生物活性位于单体中。虽然直至最近几乎只有牛胰岛素和猪胰岛素被用于治疗人糖尿病，但是现有技术已知胰岛素在物种之间的许多不同。猪胰岛素与人胰岛素最相似，它与人胰岛素仅有的不同是B链C末端为丙氨酸残基而非苏氨酸残基。尽管有这些差异，但是大多数哺乳动物胰岛素具有相当的特异性活性。直至最近，动物提取物提供了所有用于治疗该疾病的胰岛素。重组技术的出现使得可以商业规模制造人胰岛素(例如Humulin(TM)胰岛素，可从印第安纳州印第安纳波利斯的Eli Lilly and Company购得)。
已经进行衍生胰岛素的尝试来改良其药代动力学性质。在市场上有一种产品，即PEG-胰岛素(PEG-insulin)(Nektar Therapeutics)。PEG是一种中性、溶于水的无毒聚合物，它包含任意数目的环氧乙烷的重复单元。设计聚乙二醇化(PEGylation)来增加活性分子大小，并最终通过如下途径来改良药物性能：优化药代动力学；增加生物利用度；以及降低免疫原性和给药频率。PEG-胰岛素的设计和开发在WO2004091494中被进一步描述。
现有技术已知大量用于产生聚乙二醇化胰岛素衍生物的方法。Davis等人(美国专利4,179,337)描述PEG-胰岛素构建体的合成，他们使用三氯-s-三嗪(三聚氰氯(cyanuric chloride))作为PEG和蛋白之间的衔接物。他们遵循这样的合成方案，即大过量的(50×)三聚氰氯活化的PEG(2000Da)在硼酸盐缓冲液(pH9.2)中与胰岛素反应2小时。该发明的技术能够产生具有部分活性(约50%)的PEG-胰岛素轭合物，这种轭合物是非免疫原性的和非抗原性的。Obermeier等人(加拿大专利1,156,217)发现，依照上文引用的Davis的专利制备PEG-胰岛素轭合物产生了一种包含大约50%的三-PEG-胰岛素的轭合物的不均匀混合物，并且其他可能的PEG-胰岛素衍生物结合物(单-PEG-胰岛素或双-PEG-胰岛素)在残基PheB1位置是未被取代的。
Obermeier等人(加拿大专利1,156,217)描述了专门在残基PheB1位置作出改进的PEG-胰岛素轭合物的合成。他们发明的基础涉及，用有机溶剂(例如DMF、DMSO、吡啶等)中的叔丁氧羟基(t-boc)或甲磺酰乙氧羰基(methylsulfonylethyloxycarbonyl)(Msc)在碱性条件下保护残基GlyA1和LysB29位置的活性胺。从(单-、双-及三-)保护的胰岛素的复杂混合物中，通过常规的色谱技术分离了NαA1，NεB29-双-保护的胰岛素种类(N.sup..alpha.A1,N.sup..epsilon.B29-bis-protected-insulin species)。在分离之后，将所述纯NαA1，NεB29-双-保护的胰岛素与活化的(例如酸性氯化物或异氰酸盐)PEG衍生物反应，随后使用肽化学的通用技术去除保护基团。该发明人观察到，GlyA1和LysB29的氨基在碱性反应条件下比PheB1的氨基活性大。他们已经确定，其位点专一性mPEG(1500)-B1-胰岛素轭合物对降低兔的血糖水平有100%的胰岛素效应(基于摩尔数计算)。
Geiger等人(1980)和Ehrat等人(1983)描述了专门在残基PheB1位置作出改进的PEG-胰岛素加合物，他们使用的保护/轭合/脱保护法与Obermeier等人、Geiger等人和Ehrat等人描述的多步法相似，并观察到，PEG(1500)-B1-胰岛素轭合物有比天然胰岛素小得多的抗原性以及大得多的稳定性(对于肝酶)。其他PEG-胰岛素制备法(Caliceti et al.,1999;Uchio et al.,1999;Hinds et al.,2002)具有以下特征之一：1)以上文所述的基本的保护/轭合/脱保护三步法为核心，2)形成所述胰岛素分子的非特异性改良，或者3)不能产生最有效的轭合物，即PEG-B1-胰岛素。
Liu等人(美国专利6,323,311 B1)描述了一种可用于合成PEG-B1-胰岛素轭合物的方法。该方法是Obermeier的保护/轭合/脱保护三步法的外延，但不需要在步骤之间分离反应中间体(即一锅式合成)。因此，将胰岛素在残基GlyA1和LysB29位置保护，立即与PEG反应，随后在分离任何种类之前进行脱保护。该发明人声称，他们的一锅式反应可以得到最多达50%正确位置的异构体(即PEG-B1-胰岛素)及30%未反应胰岛素，未反应胰岛素可再循环用于后续的衍生化中。假定快速地进行了这些构建体的制备，那也需耗时至少5天才能完成。另外，该发明需要大过量的PEG试剂来得到合意的结果。虽然该发明的产品可能是有效的，但是它们的制备仍需要蛋白质长时间在不利于蛋白质的环境中(高pH和低pH)经历三个反应步骤。
申请US2007083006中的发明通过提供一种简单制备高纯度胰岛素衍生物——胰岛素B链的N端(PheB1)在单个步骤中被特异性聚乙二醇化——的方法，克服了现有技术中聚乙二醇化咦岛素的方法的缺陷。与表明在PheB1位置聚乙二醇化为至少可能的反应产物的在先经验(例如Caliceti et al.,1999，见上文)不同，该专利方法通过控制特异性pH条件，应用金属离子螯合剂并添加有机溶剂，来增强PheB1氨基末端的相对反应性，该PheB1氨基末端变成聚乙二醇化的主要位点。考虑到在残基PheB1位置的位点特异性聚乙二醇化所赋予胰岛素的大量有利性质(例如减少免疫原性/抗原性；增加蛋白水解、化学和物理的稳定性；增加循环半衰期；增加水性的/有机的溶解度；完全生物活性)，用于得到这种结果的简单、低成本且易于规模化的方法将是对现有技术的一项显著进步。
由现有技术看来，需要提供这样的改良胰岛素衍生物，即其可用于人和动物治疗，具有优化的稳定性、半衰期和低毒性。我们已发现将PSA连接至胰岛素上会赋予这些性质。
聚唾液酸(PSA)是由某些细菌菌株和哺乳动物某些细胞产生的天然存在的无支链的唾液酸聚合物。通过限制性酸解或用神经氨酸酶消化，或者通过对天然的、细菌源形式的聚合物进行分级，可产生各种聚合度的聚唾液酸：从n=约80或更多个唾液酸残基，至下限n=2。
近些年，PSA的生物学性质，特别是α-2,8-连接的均聚聚唾液酸的生物学性质，被用于改良蛋白质和低分子量药物分子的药代动力学性质。聚唾液酸衍生化使许多治疗型蛋白包括过氧化氢酶和天冬酰胺酶的循环半衰期得到了显著的提高，并且使得在应用这些蛋白质时不用考虑已经存在的抗体，这些抗体是先前暴露于该治疗型蛋白而产生的一种不需要的(而且有时是不可避免的)结果[Fernandes and Gregoriadis,1996and1997]。所述α-2,8-连接的聚唾液酸成为了使人关注的PEG替代物，它作为人体的天然部分是免疫系统不可见的生物可降解聚合物，而且可由组织神经氨酸酶降解为唾液酸，而唾液酸是一种无毒的糖类。
我们在以前已经描述了将多糖(特别是PSA)连接到治疗药剂如蛋白质上的方法[US-A-5846,951;WO-A-0187922]。这些方法中有一些是依赖于聚合物‘非还原端’的化学衍生化来产生在伯胺基位置反应的蛋白质反应活性醛基部分。由于含有邻二醇，非还原的唾液酸末端单元可以容易地(且选择性地)被高碘酸盐氧化而生成单醛形式，这种形式与蛋白质的反应活性更高，并且含有适宜的活性元件，用于通过还原性氨基化和其他化学作用将蛋白质连接。这一反应在图1和图2中进行了阐述，其中：
图1显示了用高碘酸钠氧化多聚唾液酸(colominic acid)(源自大肠杆菌的α-2,8-连接的PSA)，从而在非还原端形成一个有蛋白质活性的醛，和
图2显示了用氰基硼氢化钠选择性地还原希夫碱，从而与蛋白质氨基生成一个稳定、不可逆的共价键。
本发明人在以前的出版物(例如Biochimica et Biophysica Acta(2003))已描述了聚唾液酸化咦岛素的合成。在该参考文献中，22kDa和39kDa多聚唾液酸被氧化，并与重组人胰岛素的氨基反应。所使用CA的多分散度为1.33和1.40，这样的多分散度对于治疗用途来说是太大的。
在我们以前的专利申请(以WO2005/016974公开)中，我们还描述了胰岛素-多聚唾液酸轭合物的合成。然而，在该申请中，所述轭合物并非都具有特异性N末端，从而形成了多种轭合物。
例如，在上述常规轭合反应过程中，通过多聚唾液酸与氨基酸侧链的反应可能产生预期之外的副产物。这对于制备化学结构已知的轭合物来说足以成为问题，而化学结构已知的轭合物是监管机构对人和动物治疗用途所要求的。
从多种预期之外的产物中纯化预期的反应产物(例如单多聚唾液酸化的产物)是不容易做到的，这是因为大多数的反应产物的物理化学性质是类似的。这意味着，诸如离子交换色谱和凝胶渗透色谱(它们分别基于电荷和大小进行分离)的技术将产生较弱的纯化谱。
根据本发明的第一方面，我们提供了包含蛋白质的多糖衍生物群的组合物，其中所述蛋白质为胰岛素或胰岛素样蛋白质，所述多糖是阴离子型并包含2-125个糖单元，并且其中所述群基本上仅由所述蛋白质的N末端衍生物组成。
在下文中使用术语胰岛素时。我们还意在涵盖胰岛素样蛋白质。我们所指的胰岛素样蛋白质是指具有与胰岛素等效活性的蛋白质。胰岛素通常降低血糖浓度。它还增加单糖、氨基酸和脂肪酸的细胞通透性，并加速糖酵解、戊糖磷酸循环和肝中的糖原合成。优选地，胰岛素样蛋白质具有至少35%(更优选至少50%)的Swissprot登记号为P01308的人胰岛素的活性。
还可以使用上文详细描述的具有必需活性的胰岛素突变体。“胰岛素样”蛋白质还可以指“胰岛素同源物”。两个序列是否是同源的可使用相似性或同一性百分数来常规地进行计算，术语相似性和同一性在本领域中是熟知的。应将序列与SEQ I.D.No.1比较，后者是未加工的人胰岛素前体。残基25-54对应于胰岛素B链，90-110残基对应于胰岛素A链。同源序列还可以与活性类型的人胰岛素比较。
同源优选具有等于或大于50%的核酸水平或氨基酸水平的相似性或同一性，更优选等于或大于60%、70%、80%，更优选等于或大于90%，例如95%或99%的核酸水平或氨基酸水平的相似性或同一性。现有的多种程序可计算相似性或同一性；优选的程序为BLASTn、BLASTp和BLASTx程序，以默认参数运行，可从www.ncbi.nlm.nih.gov获取这些程序。例如，可以使用默认参数(score(分值)=100、word length(字长)＝11、expectation value(期望值)＝11、lowcomplexity filtering(低复杂性过滤)＝on(开))的BLASTn程序比较两个氨基酸序列。使用这些默认参数计算上述的同源性水平。
所述胰岛素可以是天然的，即源自人或动物，或者是合成的，例如通过重组方法制备的。
如本领域中所熟知的，胰岛素包含两条肽链。优选地，本发明中的所述胰岛素是在其B链的N末端被多糖衍生的。
我们所指的“群”是在所述组合物中有多于一种的多糖衍生物。所述衍生物可包含相同或不同数目的糖单元。优选地，在所述组合物中的多糖的多分散度低于1.3，更优选低于1.1。
在所述群中，基本上所有蛋白都仅在N末端被衍生化。因为在胰岛素中有两条肽链，所以有两个N末端单元。在所述群中，优选至少85%、更优选至少90%、最优选至少95%的B链在N末端被阴离子多糖衍生化。所述A链的N末端无需被衍生化。
可以使用本领域中的标准技术例如肽图谱(peptide mapping)或埃德曼降解(Edman Degradation)确定所述N末端的衍生化程度。
优选地，所述多糖具有至少2个，更优选至少5个，最优选至少10个例如至少50个的糖单元。
所述阴离子多糖优选选自聚唾液酸、肝素、透明质酸和硫酸软骨素。优选地，所述多糖是聚唾液酸并且基本上仅由唾液酸单元组成。然而，在所述多糖分子中可以有唾液酸之外的单元。例如，唾液酸单元可以与其他糖单元交替出现。然而，所述多糖优选基本上仅由唾液酸单元组成。
优选地，所述多糖具有一个末端唾液酸基团，并且如上文详细描述的，更优选为一个聚唾液酸，它是包含至少2个通过α-2-8或α-2-9键相互连接的唾液酸单元的多糖。适宜的聚唾液酸具有的重量平均分子量介于2-100kDa之间，优选介于1-35kDa之间。最优选的聚唾液酸具有的分子量介于10-20kDa之间，通常约14kDa。最优选的，所述聚唾液酸来源于细菌，例如来自大肠杆菌K1、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、液化性摩拉克氏菌(Maraxella liquefaciens)或铜绿巴斯德杆菌(Pasteurella aeruginosa)的多糖B，或者来自大肠杆菌株K92的K92多糖。最优选来自大肠杆菌K1的多聚唾液酸。
所述阴离子多糖优选聚唾液酸)可以为盐的形式或者为游离酸的形式。它可以为水解的形式，从而使得从细菌源回收后分子量已降低。所述多糖(优选聚唾液酸)可以是具有很宽分子量范围的材料，例如具有超过1.3例如高达2或更高的多分散度。优选地，所述分子量的多分散度小于1.3或1.2，优选小于1.1，例如低至1.01。
本发明的化合物通常为胰岛素的聚唾液酸衍生物，并包含2-125个唾液酸单元。所述化合物更常见包含10-80个唾液酸单元，优选20-60个唾液酸单元，最优选40-50个唾液酸单元。
在本发明的第一方面中的所述多糖衍生物可以是在胰岛素N末端和阴离子多糖之间共价连接的轭合物。所述多糖和所述胰岛素之间的其他联合方式包括静电吸引。但优选共价结合。所述共价键可以是羧基和胺基之间的酰胺键。所述胰岛素可共价结合于所述多糖的另一种键是通过希夫碱。用于轭合胺的合适基团在WO2006/016168中有进一步的描述。
在本发明中，所述多糖可以是天然存在的多糖，或者天然存在多糖的衍生物，例如通过糖残基上一个或多个活性基团的反应所衍生的多糖，或者在多糖链末端已共价连接有衍生基团的多糖。
所述多糖可以经其还原的或非还原的末端单元连接至所述胰岛素上。
用于将多糖连接至蛋白质的方法是本领域中熟知的，并且在WO92/22331和WO-A-0187922中有更详细的描述。在本发明中优选的方法在下文有更详细的描述。在本申请的图1和图2中也描述了这些方法。
所述多糖可以经其还原末端单元及非还原末端单元连接至所述胰岛素上。这意味着一个多糖链可连接有两个胰岛素蛋白质，即在其还原末端和非还原末端都被衍生。
所述多糖可直接连接至所述胰岛素肽(即如图1和图2中所示)，或者经一个衔接物连接至所述胰岛素肽。合适的衔接物来自N-马来酰亚胺、乙烯基砜、N-碘乙酰胺、正吡啶(orthopyridyl)或含N-羟基琥珀酰亚胺的试剂。所述衔接物还可以是生物稳定的或生物可降解的，并包含例如多肽或合成的寡聚物。所述衔接物可来自双官能部分，如WO2005/016973中进一步描述的。合适的双官能试剂为例如Bis-NHS。该试剂可以具有通式Z-R1-Z，其中每个Z为可以相同或不同的官能基团，R1为双官能有机基。优选地，R1选自烷二基(alkanediyl)、亚芳基(arylene)、烷亚芳基(alkarylene)、杂亚芳基(heteroarylene)和烷基杂亚芳基(alkylheteroarylene)，它们中的任一个都可被羰基、酯、硫化物、醚、酰胺和/或胺键取代及/或间断。特别优选C3-C6烷二基。R1最优选对应于所述合适的双官能试剂的适当部分。
优选的多糖衍生物具有通式(I)
Figure BDA00002757140000071
其中m至少为1；
HNB来自B-NH2，后者是胰岛素或胰岛素样肽的N末端；
L为一个键、一个衔接基团，或者包含一个多肽或一个合成寡聚体；
GlyO为阴离子糖单元；
其中如果存在衔接基团，其具有通式-Y-C(O)-R1-C(O)-；
其中Y为NR2或NR2-NR2，R1为上文所述的双官能有机基；且R2为H或C1-6烷基。
在本发明的该方面，所述胰岛素连接至所述多糖的非还原端。所述末端多糖单元是一个唾液酸单元。所述多糖中其他的糖单元由GlyO表示，并且可以相同或不同。合适的糖单元包括肝素、透明质酸或硫酸软骨素。
如果所述胰岛素直接连接至所述多糖上，所述基团L是一个键。然而，或者所述基团L可来自N-马来酰亚胺、乙烯基砜、N-碘乙酰胺、正吡啶或含N-羟基琥珀酰亚胺的试剂。所述试剂可以具有上文定义的通式Z-R1-Z。在该实施方案中，L通常为一个
Figure BDA00002757140000081
基团。
本发明的另一个方面是一种上文定义的组合物，它是一种药物组合物并且还包含一种或多种药用赋形剂。
所述药物组合物可以为水性悬液的形式。水性悬液包含所述新型化合物，混合有适宜于制备水性悬液的赋形剂。所述药物组合物可以为一种无菌可注射的水性或均质悬液的形式。可依照现有技术使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂配制该悬液。
对于人或兽医的用途，可以经口服、静脉内、腹腔内、肌内、皮下、鼻内、真皮内、局部或气管内给予药物组合物。
所述组合物还可以包含制剂添加物。我们所指的制剂添加物是指能在体内或体外稳定所述胰岛素的赋形剂，如Wang等人(1999)所述。所述赋形剂可以是稳定剂、助溶剂或金属离子。制剂添加物的合适实例包括缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、盐、聚合物、金属离子、糖、多元醇或氨基酸的一种或多种。这些制剂添加物可单独使用，或者结合使用。
稳定剂通常的作用是，通过对蛋白质的变性状态进行脱稳定化，导致解折叠蛋白质的吉布斯自由能变化增大。所述稳定剂优选是糖或多元醇，例如蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘油、甘露醇、乳糖和乙二醇。一种稳定缓冲剂是磷酸钠。
所述助溶剂优选为表面活性剂，优选非离子型表面活性剂。合适的实例包括吐温(Tween)80、吐温20、吐温40、Pluoronic F68、Brij35和曲拉通X-100(TritonX100)。
所述金属离子优选是二价的。合适的金属离子包括Zn2+、Ni2+、Co2+、Sr2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+和Fe2+。
所述制剂添加物还可以是选自PSA、PEG或羟基-β-环糊精的聚合物。
还可以使用例如间甲酚(m-Cresol)的防腐剂。
用作制剂添加物的合适氨基酸及氨基酸衍生物包括组氨酸、甘氨酸、其他类似氨基酸和天冬氨酸钠。
本发明的又一方面是在治疗中使用的上文所述的化合物。
根据本发明的又一方面，我们提供了一种产生胰岛素的或胰岛素样蛋白质的多糖衍生物的方法，其中包含2-125个糖单元的阴离子多糖基本上仅与所述胰岛素的或胰岛素样蛋白质的N末端胺进行化学反应。
短语“基本上仅与N末端胺进行化学反应”是指在衍生物的群中，至少85%，更优选至少90%，最优选至少95%的蛋白仅在其N末端胺位置衍生。优选地，这是在胰岛素B链的N末端胺位置。
通过该方法以及下文详述的任何优选实施方案获得的多糖衍生物也构成本发明的一部分。
我们已经开发了一种新方法用于将多糖轭合至蛋白质上，由此可利用蛋白质N末端的高反应性，并且该方法避免了使用以高碘酸盐氧化的天然多聚唾液酸对蛋白质进行还原性胺化的现有方法(图1和图2)所产生的产物复杂性。
所述多糖还可以与修饰形式的胰岛素反应。例如，胰岛素上的一个或多个基团可以经化学转化(chemical transformation)，例如通过还原或氧化。例如，使用氧化条件可在胰岛素的末端氨基位置产生具有活性的羰基。
适合用于本发明的方法的多糖如前文对所述新型组合物所述的。
可以通过现有技术中所述的任一适合的方法制备本发明的化合物。例如，在我们以前的专利申请WO92/22331中描述了一种通常的方法。
所述阴离子多糖通常在衍生胰岛素之前已被活化。例如它可具有一个活性醛基，并且可在还原条件下进行所述衍生化反应。通过对所述多糖的羟基进行受控氧化，可产生所述活性醛基。最优选在一个预备步骤中产生所述活性醛，其中所述多糖在受控的氧化条件下例如使用高碘酸钠，在水性溶液中进行反应。所述氧化优选是化学氧化，但是也可以使用能进行此步骤的酶。所述活性醛基可以位于所述多糖的非还原端或还原端。胰岛素(通常其N末端)然后可以与所述活性醛基反应以产生一种加合物，该加合物在被还原时可产生胰岛素的N末端衍生物。
所述多糖的活化将优选在这样的条件下进行，即使得基本上没有多糖主链的链中间断裂，也就是说基本上没有减小分子量。合适的氧化剂为高钌酸盐(perrhuthenate)，或者优选为高碘酸盐。可以使用以下条件将氧化进行1min至48小时：1mM-1M的高碘酸盐浓度范围、3-10的pH范围、0-60℃的温度范围。
用于衍生化反应的合适还原条件可利用氢与催化剂，或者优选氢化物例如硼氢化物。它们可以是被固定的，例如以安柏莱特(Amberlite)(商标)固载的硼氢化物。碱土金属氢化物例如硼氢化钠优选在以下条件下被用作还原剂：1μM-0.1M的浓度范围、4-10的pH范围、0-60℃的温度范围以及1min-72小时的时间范围。选择条件，使得起始材料上的侧翼羧基不被还原。其他合适的还原剂为酸性条件下的氰基硼氢化物，例如以聚合物固载的氰基硼氢化物或碱金属氰基硼氢化物、L-抗坏血酸、焦亚硫酸钠、L-selectride、三乙酰氧基硼氢化物等。
多糖的其他活性衍生物可被应用于本发明中，包括具有诸如NHS的侧翼官能基团的那些活性衍生物，如我们以前的专利申请WO06/00540中所述的。
在一个实施方案中，所述活性醛基位于所述多糖的还原端，并且其非还原端已经被钝化使得其不与所述胰岛素的侧翼基团反应。
虽然多聚唾液酸还原端对目标蛋白质的活性是弱的，但是对于制备化学结构确定的轭合物却是足够麻烦的。
适合于制备在多糖的还原末端具有活性醛的多糖的化学法在我们以前的申请WO05/016974中有记载。该方法涉及一个预备选择氧化步骤，之后是还原，然后进一步氧化，以产生一种在还原端具有醛并且有钝化的非还原端的化合物。
WO2005/016973描述了用于轭合蛋白质的聚唾液酸衍生物，特别是那些具有游离巯基的药物的聚唾液酸衍生物。所述聚唾液酸化合物与异双官能试剂反应以引入一个侧翼官能基团用于位点特异性轭合巯基。本发明中使用的阴离子多糖也可以用异双官能试剂以这种方式衍生。
在所述多糖与胰岛素反应之前可以将其衍生。例如，所述多糖可以与双官能试剂反应。
所述多糖可以经过一个预备反应步骤，其中在末端糖(优选为唾液酸)上形成选自伯胺基团、仲胺基团及肼的基团，之后是其与双官能试剂反应的反应步骤，以形成一个反应中间体，如WO2006/016168中进一步所述的。该中间体然后可以与胰岛素或胰岛素样肽反应。所述双官能试剂可具有通式Z-R1-Z，如上述。
我们已经发现，某些反应条件促进胰岛素N末端位置的选择性衍生化。为了促进所述N末端的选择性反应，应在一种酸性pH的第一水性溶液中进行衍生化反应，然后应在比第一水性溶液pH更高的第二水性溶液中纯化所得到的多糖衍生物。对于酸性pH，我们是指小于7的pH。所述第一水性溶液的pH一般是4.0-6.5的范围，优选4.0-6.0，所述第二水性溶液的pH是6.5-9.0的范围，优选6.5-8.5或6.5-8.0。低pH的衍生化反应促进在所述蛋白质N末端——而不是在链的任何中间位点——的选择性衍生化。
再者，我们已经发现，使用某些制剂添加物促进形成选择性的、稳定的、多糖胰岛素衍生物。所述制剂添加物可选自缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、盐、聚合物、金属离子、糖多元醇或氨基酸的一种或多种。它们可被添加至所述反应介质中，或者可作为稳定剂被添加至终产物组合物中。
在本发明的一个实施方案中，所述制剂添加物为山梨糖醇、海藻糖或蔗糖。在另一个实施方案中，所述制剂添加物可以是非离子型表面活性剂。所述制剂添加物或者可以是选自PSA、PEG或羟基-β-环糊精的聚合物。在另一个实施方案中，所述制剂添加物是二价金属离子。二价金属离子包括Zn2+、Ni2+、Co2+、Sr2+或Fe2+。
所述制剂添加物可以是缓冲剂。如果所述制剂添加物是缓冲剂，那么它优选是磷酸钠或乙酸钠。
在本发明的方法中，纯化多糖衍生物可以使用本领域中已知的多种方法进行。合适纯化方法的实例包括HIC(疏水相互作用色谱法)、SEC(尺寸排除色谱法)、HPLC(高效液相色谱)以及IEC(离子交换色谱法)。
可将具有较宽分子量分布的聚唾液酸群分级成具有较低多分散性的部分，即分级成具有不同平均分子量的部分。分级优选通过阴离子交换色谱进行，阴离子交换色谱用于洗脱合适的碱性缓冲剂，如我们以前的专利申请WO2005/016794和WO2005/03149中所述的。所述分级方法不但适用于所述衍生物，还适用于多糖起始材料。该技术因此可被应用于本发明的基本处理步骤之前或之后。优选地，所产生的胰岛素多糖衍生物具有小于1.1的多分散度。
根据本发明对胰岛素进行衍生化会导致胰岛素半衰期增加、稳定性提高、免疫原性降低，以及/或者控制溶解性并因此控制生物利用度和药代动力学性质。该新方法对于产生单聚唾液酸化的胰岛素轭合物是特别有用的。
通过实施例1-6并通过参考以下附图对本发明进行阐述：
图1显示用高碘酸钠氧化多聚唾液酸(来自大肠杆菌的α-2,8连接的聚唾液酸)；
图2显示用氰基硼氢化钠选择性地还原希夫碱，以形成一个连接蛋白质氨基的稳定、不可逆的共价键；
图3是22kDa CAO-重组人胰岛素轭合物在不同温度下的SDS-PAGE；
图4显示温度对衍生化程度的效应；
图5是27kDa CAO-重组人胰岛素轭合物在不同摩尔比时的SDS-PAGE；
图6显示摩尔比对衍生化程度的效应；
图7是8和11kDa CAO-重组人胰岛素轭合物的SDS-PAGE；
图8是8kDa CAO-重组人胰岛素制剂及胰岛素的SE-HPLC；
图9显示10、15和21.5kDa CAO-重组人胰岛素制剂的体内效力；
图10显示用于纯化轭合物的用IEC或HIC的制备型HPLC实验装置；
图11显示通过在HiTrap Butyl FF柱上的疏水相互作用色谱法纯化CAO-胰岛素轭合物；
图12显示通过在HitrapQ FF柱上的阴离子交换色谱法以13kDa CAO作为例子从HIC的峰2纯化CAO-胰岛素轭合物；
图13显示13KDa和27KDa CAO-胰岛素轭合物的等电聚焦(IEF)凝胶；
图14显示CAO-胰岛素轭合物在小鼠中的体内结果；以及
图15显示埃德曼氨基酸降解的结果。
实施例
1．蛋白和多聚唾液酸的确定
通过间苯二酚法[Svennerholm1957]用间苯二酚试剂进行聚唾液酸(如唾液酸)的定量测定，关于间苯二酚法也可参考[Gregoriadis et.al.,1993;Fernandes and Gregoriadis,1996,1997]。用BCA比色法或280nm的UV吸光度测量蛋白质。
2．聚唾液酸的活化
在20℃下将新鲜制备的0.02M的高碘酸钠(NaIO4)溶液(8倍摩尔数过量)与CA混合，并且在黑暗中将反应混合物磁力搅拌15分钟。然后将2倍体积的乙二醇添加至所述反应混合物中以耗尽过量的NaIO4，将所述混合物置于20℃下再搅拌30分钟。在4℃下，将所述氧化的多聚唾液酸(CAO)对0.01%碳酸铵缓冲液pH7.4)充分(24h)透析(3.5KDa截留分子量的透析袋)。超滤(大于3.5kDa的截留分子量)被用于浓缩透析袋中的CAO溶液。在浓缩至所需体积之后，将所述滤液低压冻干并置于-40℃直至进一步使用。或者，通过乙醇沉淀(2次)从所述反应混合物中回收CAO。
3．CA和衍生物的氧化态的测定
用2,4-二硝苯基肼(2,4-DNPH)定量测定多聚唾液酸的氧化度，2,4-二硝苯基肼与羰基化合物相互作用会生成微溶的2,4-二硝基苯基腙。在2,4-DNPH试剂(1.0ml)中加入未氧化的(CA)/氧化的(CAO)，振荡溶液然后置于37℃下直到观察到晶体沉淀[Shriner et.al.,1980]。利用一种这样的方法[Park and Johnson,1949]测量了CA的氧化度(定量)，即方法该基于在碱性溶液中将氰化铁离子还原为亚铁氰化铁(波斯蓝)，然后在630nm下测量该亚铁氰化铁。在本实施例中，用葡萄糖作为标准。
4．凝胶渗透色谱法
多聚唾液酸样品(CA和CAO)溶于含NaNO3(0.2M)的CH3CN(10%;5mg/ml)中，并在2×GMPWXL柱上用色谱法分离，通过折光率(GPC系统：VE1121GPC溶剂泵,VE3590Rl检测器)检测，并用Trisec3软件(ViscotekEurope Ltd)校正。样品(5mg/ml)用0.45μm尼龙膜过滤，以0.7cm/min的速度过柱，以0.2M NaNO3和CH3CN(10%)作为流动相。
5．多聚唾液酸稳定性
用于化学法聚乙二醇化的规则不适用于聚唾液酸化，这是因为这些分子生理化学性质的差异。PSA是一种对酸敏感的聚合物，在中性pH附近可稳定存在数周(图3)。图3中的结果表明，CAO在pH6.0和7.4可稳定存在8天，在pH5.0时缓慢降解(48小时后，92%的初始MW)，在pH4.0时缓慢降解(48小时后，70%的初始MW)。在本性上，聚唾液酸是高度亲水的，而PEG是双亲性分子。如果使用用于聚乙二醇化的条件进行聚唾液酸化，在多数情况下会观察到蛋白质的聚集及沉淀。
6．N末端蛋白质-CA轭合物与制剂添加物的制备
6.1胰岛素-CA轭合物的制备(N末端方法)
胰岛素(5804Da)以白色固体提供。将胰岛素溶解于最少的100mM HCl中，然后将其调节至所需的pH并置于冰上。需要添加用于轭合的CAO量根据下式计算：
称取所需的CAO量。将CAO溶解于10mM NaOAc，pH6.0中，轻轻涡旋混合物直至所有CAO已溶解，然后或过滤至一个新的容器中以除去任何聚集/沉淀的物质。将所需量的胰岛素蛋白质溶液添加至所述CAO溶液中以获得7.5倍(小规模)和5倍(大规模摩尔数过量的CAO，并且在4±1℃下通过将所述反应混合物置于低速振荡器上轻轻混合。添加100mg/ml NaCNBH3溶液以在终反应混合物中含有8mg/ml，轻轻混合并检查所述终反应混合物的pH，如果需要则在4±1℃下用0.5M NaOH/HCl将pH调节至6.0。最后用10mM NaOAc，pH6.0调整所述反应物的体积，以得到所述反应混合物中1mgml的蛋白质浓度。将管子密封并在所需温度(4±1℃)下涡旋24小时。通过合适的方法(例如pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液)终止所述反应，并将样品取出用于SDS-PAGE(使用18%的Tris甘氨酸凝胶)、SE-HPLC(superose12柱)，并检测反应混合物的pH。为了消除任何的沉淀物，在SE-HPLC分析和纯化前将所述反应混合物在13000rpm下离心5min，优选的SE-HPLC的缓冲液为0.1M磷酸钠(pH6.9)。
6.2优化
用一定分子量范围的CAO(10-30kda)在胰岛素上进行还原性氨基化，用于N末端衍生化和随机衍生化。研究了轭合反应的处理变量范围：10-20倍(小规模)和5-10倍(大规模)CAO摩尔数过量，试剂=50-100mM NaCNBH3，反应缓冲剂=10mM NaOAc pH5.5-6.5，温度＝4±1℃，时间=16-24小时等。
观察到的优化反应条件如下：CAO=7.5倍(小规模)和5倍(大规模)摩尔数过量，试剂=50mM NaCNBH3。反应缓冲剂=10mM NaOAc pH5.5，温度＝4±1℃，时间=24小时。
6.3胰岛素-CA轭合物(N末端方法)的纯化和表征
为了从混合物中除去游离的CAO，使用了HIC(HiTrap Butyl FF)。使用浓缩(NH4)2SO4(例如3M)、20mM Na2HPO4(pH7.4)，通过用最小体积来稀释胰岛素反应混合物制备加样溶液，以得到所述加样溶液中0.8M(NH4)2SO4。检查pH，应该为7.4或者用0.5M HCl/NaOH进行调节，需要用0.2μm的膜滤器过滤所述加样溶液。
然后将该溶液加样至(速率=0.5ml/min)以HIC缓冲液B(20mM磷酸钠+0.8M(NH4)2SO4，pH7.4)预先平衡的HIC柱上。收集所述加样部分(每个部分为1.5倍柱体积)并标记(L1-Lx)，然后用HIC缓冲液B(至少5倍柱体积；速率=0.5ml/min；1.5倍柱体积的部分)洗涤柱，收集并标记(W1-Wx)。将产物与HIC缓冲液A(10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)洗脱(速率=5ml/min)，并收集所述部分(1倍柱体积部分；6倍柱体积)并标记(E1-Ex)。如果两个连续部分中没有蛋白质成分(UV280nm)，进行下一步骤。在纯化过程中将所述样品置于冰上。通过UV(280nm)(1mg/ml胰岛素在280nm下的消光系数为约1.043)分析蛋白质浓度。取所述样品用于SDS-PAGE和SE-HPLC。
含蛋白质部分的HIC部分经IEC缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗涤，以除去Vivaspin20(MW：5Kd)中任何可能的硫酸铵。检查pH，并且如果需要将其调节至pH7.4。加样至以IEC缓冲液A预先平衡的IEC柱上。以如下的方式应用一个梯度系统：
加样：以0.25ml/min注入样品的IEC缓冲液A溶液，3CV的洗涤液
洗涤：梯度系统：IEC缓冲液A：90％，AEX缓冲液B(20mM磷酸盐缓冲液+1M NaCl，pH7.4)：10％，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
IEC缓冲液A：68％，IEC缓冲液B：32％，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
IEC缓冲液A：35％，IEC缓冲液B：65％，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
IEC缓冲液A：0％，IEC缓冲液B：100％，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
将含有纯化的轭合物的IEC部分合并，将缓冲液改变为PBS缓冲液进行洗涤以除去盐。在除去盐后调节pH至7.4。然后在4±1℃下浓缩该溶液，通过UV光谱法(280nm)分析蛋白质浓度。轭合物经无菌过滤，取所述样品用于活性测定，并用于通过SDS-PAGE和SE-HPLC的表征。如果需要，则取出等分试样用于蛋白质测定及CA测定。剩余物在4±1℃下保存至进一步使用，并且通过SE-HPLC研究物理稳定性。
多种方法影响胰岛素在溶液中的稳定性以及衍生化程度的效应已被研究。
6.4胰岛素-14kDaCA轭合物(单分散性)的制备
胰岛素(5808Da)以白色固体提供。通过添加最少量100mM HCl的溶解胰岛素，然后调节至所需pH并置于冰上。需要添加用于轭合的14kDa CA量根据下式计算：
称取所需的14kDa CAO量。将14kDa CAO溶解于10mM磷酸盐缓冲液，pH6.0中，轻轻涡旋混合物直至所有14kDa CAO已溶解，然后或过滤至一个新的容器中以除去任何聚集的/沉淀的材料。将所需量的胰岛素蛋白质溶液添加至所述14kDa CAO溶液中以获得7.5倍(小规模)和5倍(大规模)摩尔数过量的14kDa CAO，并且在4±1℃下通过将所述反应混合物置于低速振荡器上轻轻混合。添加100mg/ml NaCNBH3溶液以在终反应混合物中含有63.5mM或4mg/ml，轻轻混合并检查所述终反应混合物的pH，如果需要则在4±1℃下用0.5M NaOH/HCl将pH调节至6.0。最后用10mM NaOAc，pH6.0调整所述反应物的体积，以得到所述反应混合物中1mg/ml的蛋白质浓度。将管子密封并在所需温度(4±1℃)下涡旋24小时。通过合适的方法终止所述反应，并将样品取出用于SDS-PAGE(使用18%的Tris甘氨酸凝胶)、SE-HPLC(superose12柱)，并检测反应混合物的pH。为了消除任何的沉淀物，在SE-HPLC分析和纯化前将所述反应混合物在13000rpm下离心5min，优选的SE-HPLC的缓冲液为0.1M磷酸钠(pH6.9)。
6.5优化
用一定分子量范围的CAO(10-30kda)在胰岛素上进行还原性氨基化，用于N末端衍生化和随机衍生化。研究了轭合反应过程变化的范围：10-20倍(小规模)和5-10倍(大规模)CAO摩尔数过量；试剂=50-100mM NaCNBH3；反应缓冲剂=10mM磷酸盐缓冲液，pH=5-7.4；温度＝4-37±1℃，时间=16-24小时等。
观察到的优化反应条件如下：CAO=7.5倍(小规模)和5倍(大规模)摩尔数过量，试剂=63.5mM NaCNBH3(4mg/ml)。反应缓冲液＝10mM NaOAc pH6.0，温度＝4±1℃，时间=24小时。
6.6胰岛素-CA轭合物(N末端方法)的纯化和表征
为了从混合物中除去游离的CAO，使用了HIC。通过稀释最小体积的胰岛素反应混合物制备加样溶液，使用浓缩的(NH4)2SO4(例如3M)，20mMNa2HPO4(pH7.4)以得到所述加样溶液中0.8M(NH4)2SO4。检查pH，应该为7.4或者用0.5M HCl/NaOH调节，需要用0.2μm的膜滤器过滤所述加样溶液。
然后将该溶液加样至(速率=0.5ml/min)以HIC缓冲液B(20mM磷酸钠+0.8M(NH4)2SO4，pH7.4)预先平衡的HIC柱上。收集所述加样部分(每个部分1.5的柱体积)并标记(L1-Lx)。用缓冲液B(至少5倍柱体积；速率=0.5ml/min；收集1.5倍柱体积的部分)洗涤柱，收集部分并标记(W1-Wx)。将产物与HIC缓冲液A(10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)洗脱(速率=5ml/min)；收集部分(1倍柱体积部分；6倍柱体积)并标记(E1-Ex)。如果两个连续部分中没有蛋白质成分(UV280nm)，进行下一步骤。在纯化过程中将所述样品置于冰上。通过UV(280nm)(1mg/ml胰岛素在280nm下的消光系数为约1.043)分析蛋白质浓度。所述样品被用于SDS-PAGE和SE-HPLC。
含蛋白质部分的HIC部分经IEC缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗涤，以除去Vivaspin20(MW:5Kd)中任何可能的硫酸铵。检查pH，并且如果需要将其调节至pH7.4。加样至以IEC缓冲液A预先平衡的IEC柱上。以如下的方式应用一个梯度系统：
加样：以0.25ml/min注入样品的IEC缓冲液A溶液，3CV的洗涤液
洗涤：梯度系统：IEC缓冲液A：90%，AEX缓冲液B(20mM磷酸盐缓冲液+1M NaCl，pH7.4)：10%，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
IEC缓冲液A：68%，IEC缓冲液B：32%，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
IEC缓冲液A：35%，IEC缓冲液B：65%，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
IEC缓冲液A：0%，IEC缓冲液B：100%，5CV的梯度液&3CV的洗涤液，流速：0.25ml/min
将含有纯化的轭合物的IEC部分合并，将缓冲液改变为PBS缓冲液进行洗涤以除去盐。在除去盐后调节pH至7.4。然后在4±1℃下浓缩该溶液，通过UV光谱法(280nm)分析蛋白质浓度。轭合物经无菌过滤，取所述样品用于测定活性，并用于通过SDS-PAGE和SE-HPLC的表征。如果需要，则取出等分试样用于蛋白质测定及CA测定。剩余物在4±1℃下保存至进一步使用，并且通过SE-HPLC研究物理稳定性。
多种方法影响胰岛素在溶液中的稳定性以及衍生化程度的效应已被研究。
6.7胰岛素制剂的SE-HPLC
在装配有Jasco，AS-2057plus冷却至4℃的自动采样器，以及Jasco UV-975UV/VIS探测器的液相色谱仪(JASCO)上进行HPLC。通过EZchrom Elite软件在IBM/PC上记录数据。在Superose12柱上，用0.1M磷酸钠，pH6.9的等度洗脱流动相(isocratic mobile phase)分析SEC样品(图8)。图8仅显示了RT=75.408位置的一个峰，该峰由胰岛素产生。
6.8SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳&蛋白质印迹
使用18%二甘氨酰甘氨酸凝胶(triglyine gel)进行SDS-PAGE。使用还原性缓冲液或非还原性缓冲液稀释样品，并将5.0ug蛋白质加样至每孔中。在甘油三酯(triglycerine)缓冲液体系中对该凝胶进行电泳，并用考马斯蓝(CoomasieBlue)进行染色(图5&7)。使用抗PSA抗体进行蛋白质印迹。图4显示了胰岛素制剂的SDS-PAGE(位点特异性；N末端)。
6.927和13kDa CAO-胰岛素的等电聚焦(IEF)凝胶
Figure BDA00002757140000181
凝胶被用于确定咦岛素和CAO-胰岛素轭合物等电点的差异。以0.5mg/ml的浓度溶解样品。用5ul Novex IEF样品缓冲液pH3-10(Novex IEFSample Buffer pH3-10)稀释5ul样品，然后将该蛋白质样品加样至凝胶。
6.10稳定性研究
无菌胰岛素轭合物在PBS缓冲液中于4℃下保存6周。每周进行所述样品的非变性PAGE(Native-PAGE)。
6.11胰岛素制剂的体内效力
使用7-8周龄的雌性CD-1小鼠研究了胰岛素制剂的体内效力，0.3IU的蛋白质剂量(相同活性)皮下注射小鼠。将动物分成7组，每组4只，按照以下方式对每组的每只动物给予胰岛素制剂：胰岛素(0.3IU/小鼠)、Lantus(Aventis)胰岛素-PSA轭合物(14KDa)、PBS。从每只动物取一滴血液，并通过ACCU-CHEKActive(Roche Diagnostics)测量血糖。
结果
CA的活化及氧化程度的测定
所使用的多聚唾液酸(CA)是一种α-2.8-连接的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)残基的线性均聚物。在室温下使用20mM高碘酸盐对多聚唾液酸进行氧化暴露15min。通过凝胶渗透色谱分析高碘酸盐处理后内部α-2.8连接的Neu5Ac残基的完整性，将从所述氧化(CAO)材料获得的色谱与天然CA的色谱进行了比较。本发明人发现，氧化CA和天然CA呈现了几乎同样的洗脱谱，没有迹象表明所述连续氧化步骤会引起所述聚合物链的显著断裂。
通过在碱性溶液中将氰化铁离子还原为亚铁氰化铁(波斯蓝)[Park andJohnson,1949]，用葡萄糖作为标准定量测量了CA的氧化态。这表明，所述氧化多聚唾液酸被发现有比化学计算量更多的还原剂(>100%)，即112摩尔%的表观醛含量包含还原端半缩酮和引入醛(在另一端)的结合还原力。
聚唾液酸化反应的优化
使用1mg重组人胰岛素与CAO在不同温度以及反应物摩尔比和链长下优化聚唾液酸化条件。结果在图5-12中显示。在该反应过程中，4℃明显是CAO和胰岛素稳定性的最适温度。然而，在更高温度下可获得更多轭合，7.5:1的CAO与胰岛素的摩尔比更为有效。
表1显示摩尔比对聚唾液酸化的效应
Figure BDA00002757140000191
表1
在PBS对照的影响下，在图9中使用的轭合物中，21.5kd CAO-胰岛素对降低小鼠血糖具有最显著的效应。
表2显示了不同链的CAO-胰岛素轭合物的体内效力的T-检验(统计分析，成对检验)。
Figure BDA00002757140000192
表2
星号表示各组相对于Tris缓冲液差异的概率水平：＊P<0.05，＊＊P<0.01，＊＊＊P<0.001。
表3
星号表示各组相对于PBS缓冲液差异的概率水平：＊P<0.05，＊＊P<0.01，＊＊＊P<0.001。
pH对15kDa CAO-胰岛素的体内效力还表明，pH6.0优于7.4。因此在pH6.0下进行了后面的实验。来自肽谱法和埃德曼降解的数据进一步证实，pH6.0的聚唾液酸化条件的轭合物在胰岛素B链是被N末端特异性阻断的。
胰岛素轭合物的制备、纯化和表征
可成功轭合单分散CAO-胰岛素，并通过规模化HIC和IEC纯化得到了高度纯化的轭合物。通过图10中表明的IEC和HIC联合装置与预备型HPLC设备，改良了所述纯化效率。
上文已经详述了这样的步骤，即通过在降低的pH(pH6.0)及4±1℃下进行反应，以一种N末端选择性的方式制备并纯化多聚唾液酸(CA)轭合物。这涉及在存在氰基硼氢化钠的情况下进行轭合，然后使用疏水相互作用色谱法(HIC)进行纯化以除去游离CA(图11)，然后通过离子交换色谱法(IEC)除去胰岛素(图12)。使用了较低pH，以有利于在胰岛素B-链的N末端(PheB1)选择性衍生化，并且还为了在反应过程中使胰岛素的聚集最少化。最终的反应缓冲液的组成为pH6.0的10mM NaOAc中1mg/ml胰岛素、8mg/ml NaCNBH3和5倍摩尔数过量的CAO。
图13中的13Kda和27Kda CAO-胰岛素轭合物的等电聚焦(IEF)凝胶显示，聚唾液酸化胰岛素的轭合物没有固定的等电点(pI)。
胰岛素-CA轭合物的形成和稳定性被以下技术所证实：SE-HPLC(胰岛素-PSA与胰岛素相比保留时间的变化；以及两部分的共洗脱)；离子交换色谱(轭合物在IEC柱上的结合)，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE；具有较高分子量种类的带的偏移)。
用于体内效力(在CD-1小鼠上，平均25g)的胰岛素轭合物显示了比胰岛素更优的体内效力(延长)和钝性(谱峰少)。所述轭合物降低血糖能力的延长与所述制剂中使用的聚合物的链长成比例，如图14中所示。
27KDa CAO-胰岛素轭合物的稳定性研究表明，在40天期间4℃的保存过程中没有任何降解，这是基于来自非变性-PAGE的结果。
对规模化制备及纯化的14kDa-胰岛素轭合物的表征
在700mg胰岛素作为起始反应物的实例中，使用规模化柱纯化得到了230mg14kDa CAO-胰岛素(蛋白质重量)。
通过比较色谱，图15中氨基酸量的变化显示了来自N末端的氨基酸。在pH7.4PBS中1mg/mL的水性样品经水100倍稀释。取2μL的这种稀释溶液用于分析。结论是，序列G-I-V-E可标识胰岛素的A链。无氨基酸Phe/Val/Asn/Gln表明胰岛素的B链是被N末端阻断的。
在体外活性测定中发现PSA轭合物是有活性的。体内效力研究表明，PSA-胰岛素轭合物大大优于胰岛素。
参考文献
Geiger et al.(in D.Branderburg，and A.Wollmer(eds.)，1980，Insulin：Chemistry，Structure，and Function of Insulin and Related Hormones，Walter de Gruyter&Co.，New York，P409-415，
Ehrat M.，Luisi P.L.，1983，Synthesis and spectroscopic characterization of insulinderivatives containing one or two poly(ethylene oxide)chains at specificpositions，Biopolymers，22：P569-573，
Caliceti P，(1999)mprovement of the physicochemical and biopharmaceuticalproperties of insulin by poly(ethyleneglycol)conjugation，STP Pharma Sciences9：P107-113
Uchio，T.，Baudys，M.，Liu，F.，Song，S.C.，Kim，S.W.，(1999)Site-specific insulinconjugates with enhanced stability and extended action profile.，Advanced DrugDelivery Reviews，35，P289-306
Hinds K，.Koh J.J，Joss L.，Liu F.，Baudys M.Kim，S.W.，(2000).″Synthesis andCharacterization of Poly(ethylene glycol)-Insulin Conjugates，″BioconjugateChem.，11，195-201
Hinds K.D.；Kim S.W.(2002)，Advanced Drug Delivery Reviews，54：505-530，
Fernandes，A.I.，Gregoriadis，G.，Synthesis，characterization and properties ofpolysialylated catalase，Biochimica et Biophysica Acta，1293(1996)92-96
Fernandes，A.I.，Gregoriadis，G.，Polysialylated asparaginase：preparation，activity and pharmacokinetics，Biochimica et Biophysica Acta，1341(1997)26-34.
Jain，S.et al Polysialylated insulin：synthesis，characteristaion and biologicalactivity in vivo，Biochimica et Biophysica Acta，1662(2003)42-49；
Gregoriadis，G.，McCormack，B.，Wang，Z.，Lifely，R.，Polysialic acids：potential indrug delivery，FEBS Letters，315(1993)271-276.
Park，J.T.，Johnson，M.J.，A submicrodetermination of glucose，Journal ofBiological Chemistry，181(1949)149-151.
Shriner，R，L.，Fuson，R.D.C.，Curtin，D.Y.，Morill，T.C.，The SystematicIdentification of Organic Compounds，6th ed.，Wiley，New York，1980.
Svennerholm，L.，Quantitative estimation of sialic acid II：A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method，Biochimca et Biophysica Acta，24(1957)604-611.
Wang，W.，Instability，stabilization，and formulation of liquid proteinpharmaceuticals，Intemational Journal of Pharmaceutics，185(1999)129-188.

Claims (11)

1.一种包含蛋白质的多糖衍生物群的组合物，其中所述蛋白质为胰岛素或胰岛素样蛋白质，所述多糖包含2-125个糖单元，并且其中至少85%的所述蛋白质的衍生物群仅在B链的N末端衍生化，
其中所述胰岛素样蛋白质是胰岛素在核酸或氨基酸水平上具有90%或大于90%的序列相似性或同一性的同源物。
2.根据权利要求1的组合物，其中至少90%的所述蛋白质的衍生物群仅在B链的N末端衍生化。
3.根据权利要求2的组合物，其中至少95%的所述蛋白质的衍生物群仅在B链的N末端衍生化。
4.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述胰岛素或胰岛素样蛋白质被所述多糖在所述多糖的还原末端单元衍生化。
5.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述多糖衍生物具有通式（I）
其中HNB衍生自B-NH2，B-NH2为胰岛素的或胰岛素样蛋白质的B链的N末端；
L为一个键、一个衔接基团，或者包含一个多肽或一个合成寡聚体；
GlyO为一个唾液酸单元；
其中如果存在所述衔接基团，则其具有通式-Y-C(O)-R1-C(O)-；
其中Y为NR2或NR2-NR2，R1为选自以下的双官能有机基团：烷二基、亚芳基、烷亚芳基、杂亚芳基和烷基杂亚芳基，它们中的任一种都可被羰基、酯、硫化物、醚、酰胺和/或胺键取代和/或间断；
且R2为H或C1-6烷基。
6.根据权利要求5的组合物，其中L是一个键或者一个
Figure FDA00002757139900021
基团。
7.根据权利要求1-3任一项的组合物，其中所述多糖的多分散度低于1.3。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述多糖的多分散度低于1.2。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述多糖的多分散度低于1.1。
10.根据权利要求1-3任一项的组合物，所述组合物是一种药物组合物并且包含一种或多种可药用赋形剂。
11.根据权利要求1-10任一项的组合物用于治疗糖尿病的用途。
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007501888A (ja) * 2003-08-12 2007-02-01 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリシアル酸誘導体
WO2005016974A1 (en) 2003-08-12 2005-02-24 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
US8394921B2 (en) 2006-07-25 2013-03-12 Lipoxen Technologies Limited N-terminal derivatisation of proteins with polysaccharides
BRPI0720282B8 (pt) 2006-12-15 2021-05-25 Baxalta GmbH construção proteica, composição farmacêutica, e, kit
ES2375314T3 (es) 2007-02-28 2012-02-28 Lipoxen Technologies Limited Reducción de endotoxina en ácidos polisiálicos.
AU2008290217B2 (en) 2007-08-20 2013-09-05 Protalix Ltd. Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof
BRPI0919827B8 (pt) * 2008-10-20 2021-05-25 Usv Ltd processos para aumentar o rendimento de uma reação de peguilação de r-methug-csf processo para a produção em escala grama de peg- r-methug-csf
EP2344527A4 (en) * 2008-10-31 2012-04-04 Amgen Inc MATERIALS AND METHODS FOR STEM CELL MOBILIZATION THROUGH A MULTIPLE PEGYLATED GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR
PE20120582A1 (es) 2009-01-28 2012-05-26 Smartcells Inc Conjugados de insulina cristalina
WO2010088286A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Smartcells, Inc. Synthetic conjugates and uses thereof
AU2010208381A1 (en) 2009-01-28 2011-08-04 Smartcells, Inc. Exogenously triggered controlled release materials and uses thereof
SG173112A1 (en) 2009-01-28 2011-08-29 Smartcells Inc Conjugate based systems for controlled drug delivery
EP2408808A4 (en) 2009-03-20 2015-05-06 Smartcells Inc TERMINAL-FUNCTIONALIZED CONJUGATES AND THEIR USE
WO2010107520A1 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Smartcells, Inc. Soluble non-depot insulin conjugates and uses thereof
EP2459226B1 (en) 2009-07-27 2016-06-29 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
ES2597954T3 (es) 2009-07-27 2017-01-24 Baxalta GmbH Conjugados de proteína de la coagulación sanguínea
RU2744370C2 (ru) * 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US9194011B2 (en) 2009-11-17 2015-11-24 Protalix Ltd. Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
CN101787117B (zh) * 2010-02-08 2012-05-23 江南大学 聚乙二醇-聚唾液酸嵌段共聚物的制备方法及应用
MX2012013375A (es) * 2010-05-17 2013-04-11 Cebix Inc Peptido c pegilado.
WO2011156242A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 Lpath, Inc. Improved anti-lysophospholipid antibody design using antibody structures
CA2806399A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Smartcells, Inc. Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof
EP2598522A4 (en) 2010-07-28 2014-11-12 Smartcells Inc RECOMBINANT LECTINES, LECTINES WITH MODIFIED BINDING SITE AND USES THEREOF
CA2805739A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Smartcells, Inc. Drug-ligand conjugates, synthesis thereof, and intermediates thereto
SI3272861T1 (sl) 2011-01-20 2020-06-30 Protalix Ltd. Alfa-galaktozidazni sestavki
WO2013075117A2 (en) 2011-11-17 2013-05-23 John Wahren Pegylated c-peptide
WO2015051052A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Glucose-responsive insulin conjugates
US10188739B2 (en) 2014-02-27 2019-01-29 Xenetic Biosciences, Inc. Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain
JP2019218265A (ja) * 2016-09-14 2019-12-26 生化学工業株式会社 ペプチドの血中滞留性を増強させる方法
US20200179524A1 (en) * 2017-04-25 2020-06-11 Lipoxen Technologies Limited Methods of treating multiple myeloma cancers expressing high levels of epo-receptor using psa-epo
WO2018197547A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Lipoxen Technologies Limited Methods of treating diseases related to net formation with parenteral administration of polysialylated dnase i
JP2022519586A (ja) * 2019-02-04 2022-03-24 ゼネティック バイオサイエンシーズ インコーポレイテッド 糖ポリシアル酸化治療用タンパク質を使用する方法
CN116249552A (zh) * 2020-08-11 2023-06-09 隆延生物科技（上海）有限公司 一种液体制剂及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005016974A1 (en) * 2003-08-12 2005-02-24 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2930542A1 (de) 1979-07-27 1981-02-12 Hoechst Ag Neue insulinderivate und verfahren zu ihrer herstellung
US5308617A (en) * 1988-08-10 1994-05-03 Halzyme Ltd. Protein heparin conjugates
US7217689B1 (en) * 1989-10-13 2007-05-15 Amgen Inc. Glycosylation analogs of erythropoietin
JP2983629B2 (ja) * 1989-10-13 1999-11-29 キリン―アムジエン・インコーポレイテツド エリスロポエチンイソフォーム
GB9112212D0 (en) 1991-06-06 1991-07-24 Gregoriadis Gregory Pharmaceutical compositions
US5846951A (en) * 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
DK0550108T3 (da) 1991-12-30 1999-01-04 Akzo Nobel Nv Thyreoaktiv sammensætning med langvarig frigivelse
JP2747967B2 (ja) * 1993-07-23 1998-05-06 雪印乳業株式会社 シアル酸粉末
US20030053982A1 (en) * 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
PT1003525E (pt) * 1997-08-05 2003-03-31 Bioniche Life Sciences Inc Composicao e metodo para a regulacao da proliferacao e da morte celular
WO1999043307A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 Prange Arthur J Jr Thyroid hormone replacement using sustained release triiodothyronine
RU2141531C1 (ru) 1999-05-26 1999-11-20 Российское акционерное общество открытого типа "Биопрепарат" Способ получения рекомбинантного инсулина человека
US6323311B1 (en) 1999-09-22 2001-11-27 University Of Utah Research Foundation Synthesis of insulin derivatives
WO2001087922A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of proteins in aqueous solution
JP5178982B2 (ja) 2000-05-18 2013-04-10 セリックス， インコーポレイテッド 経口投薬形態における、毒性コアの非毒性領域中へのカプセル化
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
AU2001290312A1 (en) 2000-10-16 2002-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
CN100528235C (zh) * 2000-12-20 2009-08-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 红细胞生成素共轭物
KR100401296B1 (ko) 2000-12-27 2003-10-11 드림바이오젠 주식회사 수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
NZ532027A (en) 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
WO2003055526A2 (en) 2001-12-21 2003-07-10 Maxygen Aps Erythropoietin conjugates
ITPD20010302A1 (it) 2001-12-28 2003-06-28 Bbs Riva Spa Dispositivo idraulico per pompare e / p intercettare metallo allo stato fuso
US6763226B1 (en) 2002-07-31 2004-07-13 Computer Science Central, Inc. Multifunctional world wide walkie talkie, a tri-frequency cellular-satellite wireless instant messenger computer and network for establishing global wireless volp quality of service (qos) communications, unified messaging, and video conferencing via the internet
EP1681303B1 (en) 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
DE02020425T1 (de) * 2002-09-11 2004-07-15 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylierte Polypeptide, besonders hasyliertes Erythropoietin
BR0314107A (pt) * 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Método de produção de derivados de hidroxialquil amido
AU2004229461A1 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Pr Pharmaceuticals Inc. Method for preparation of site-specific protein conjugates
JPWO2004101619A1 (ja) * 2003-05-15 2006-10-26 塩野義製薬株式会社 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成
US7074755B2 (en) * 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
US7550593B2 (en) 2003-07-03 2009-06-23 Cipla Limited Process for the preparation of finasteride Form I
US7383935B2 (en) 2003-08-05 2008-06-10 Dematic Corp. Motorized roller transverse drive
EP1651261B1 (en) 2003-08-06 2014-10-08 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Polysaccharide-protein conjugate vaccines
CA2534418A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
JP2007501888A (ja) 2003-08-12 2007-02-01 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリシアル酸誘導体
EP1694347B1 (en) * 2003-11-24 2013-11-20 BioGeneriX AG Glycopegylated erythropoietin
US7956032B2 (en) * 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20070254836A1 (en) * 2003-12-03 2007-11-01 Defrees Shawn Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor
WO2005092928A1 (en) * 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
FR2868071B1 (fr) * 2004-03-26 2006-06-09 Biomerieux Sa Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
DE102004030392A1 (de) 2004-06-23 2006-01-19 Endress + Hauser Flowtec Ag, Reinach Meßwandler vom Vibrationstyp
WO2006014148A2 (fr) 2004-08-04 2006-02-09 Sergey Alexandrovich Orlov Procede permettant d'organiser un processus de jeu a action intermittente
GB2416993A (en) 2004-08-11 2006-02-15 Dinesh Verma Opthalmic prosthesis
WO2006016168A2 (en) * 2004-08-12 2006-02-16 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
US8652334B2 (en) 2004-08-12 2014-02-18 Lipoxen Technologies Limited Fractionation of charged polysaccharide
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
TWI376234B (en) * 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
US8217154B2 (en) 2005-02-23 2012-07-10 Lipoxen Technologies Limited Activated sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
JP3989936B2 (ja) * 2005-04-07 2007-10-10 進 須永 抗腫瘍剤及び新規ｄｎアーゼ
WO2007047997A2 (en) 2005-10-19 2007-04-26 Smartcells, Inc. Methods for reducing the mitogenicity of lectin compositions
US8394921B2 (en) * 2006-07-25 2013-03-12 Lipoxen Technologies Limited N-terminal derivatisation of proteins with polysaccharides
WO2011007865A1 (ja) 2009-07-16 2011-01-20 花王株式会社 食後血中インスリン濃度上昇抑制剤
US9006400B2 (en) 2011-09-26 2015-04-14 Novartis Ag Fibroblast growth factor-21-Fc fusion proteins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005016974A1 (en) * 2003-08-12 2005-02-24 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SATO M., ET AL.: "Site-Specific Introduction of Sialic Acid into insulin", 《ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101511391B (zh) 2013-03-13
US20140309407A1 (en) 2014-10-16
DE602007006492D1 (de) 2010-06-24
JP5419689B2 (ja) 2014-02-19
US20130116176A1 (en) 2013-05-09
US8796207B2 (en) 2014-08-05
US20100056427A1 (en) 2010-03-04
US20170080054A1 (en) 2017-03-23
ES2569066T3 (es) 2016-05-06
WO2008012542A8 (en) 2009-07-16
US20140161765A1 (en) 2014-06-12
JP2015145400A (ja) 2015-08-13
JP2009544678A (ja) 2009-12-17
US8981050B2 (en) 2015-03-17
US20150147307A1 (en) 2015-05-28
US8299015B2 (en) 2012-10-30
US8299026B2 (en) 2012-10-30
JP6243456B2 (ja) 2017-12-06
RU2432175C2 (ru) 2011-10-27
US10300144B2 (en) 2019-05-28
JP5420091B2 (ja) 2014-02-19
KR101400105B1 (ko) 2014-06-19
US20100016217A1 (en) 2010-01-21
EP2043693B1 (en) 2016-04-27
ATE467642T1 (de) 2010-05-15
WO2008012540A9 (en) 2009-03-12
US20170119893A1 (en) 2017-05-04
EP2043693A1 (en) 2009-04-08
JP5912152B2 (ja) 2016-04-27
EP2630972A2 (en) 2013-08-28
US8933026B2 (en) 2015-01-13
WO2008012528A1 (en) 2008-01-31
WO2008012542A3 (en) 2008-05-15
US9492556B2 (en) 2016-11-15
US20100022443A1 (en) 2010-01-28
US20160129124A1 (en) 2016-05-12
ES2581902T3 (es) 2016-09-08
US20140134147A1 (en) 2014-05-15
EP3299033A1 (en) 2018-03-28
JP5096466B2 (ja) 2012-12-12
JP2014114315A (ja) 2014-06-26
US20160095930A1 (en) 2016-04-07
EP2043692B1 (en) 2016-05-18
JP2009544680A (ja) 2009-12-17
WO2008012525A1 (en) 2008-01-31
US20170058273A1 (en) 2017-03-02
EP2630972A3 (en) 2013-10-16
US20160129123A1 (en) 2016-05-12
US9040478B2 (en) 2015-05-26
US20220133898A1 (en) 2022-05-05
EP2043616B1 (en) 2016-01-27
JP6055506B2 (ja) 2016-12-27
ES2647528T3 (es) 2017-12-22
US9789163B2 (en) 2017-10-17
US9266936B2 (en) 2016-02-23
CN103169984B (zh) 2016-08-03
JP2013121982A (ja) 2013-06-20
WO2008012525A8 (en) 2010-04-29
US20100022441A1 (en) 2010-01-28
KR20090057370A (ko) 2009-06-05
US20180289823A1 (en) 2018-10-11
EP2041167B1 (en) 2010-05-12
JP2009544681A (ja) 2009-12-17
EP2043616A1 (en) 2009-04-08
JP2018039791A (ja) 2018-03-15
US20140309166A1 (en) 2014-10-16
WO2008012542A2 (en) 2008-01-31
JP2013049675A (ja) 2013-03-14
JP6165079B2 (ja) 2017-07-19
JP5542195B2 (ja) 2014-07-09
JP2009544677A (ja) 2009-12-17
CN101511391A (zh) 2009-08-19
US20140315802A1 (en) 2014-10-23
JP6581157B2 (ja) 2019-09-25
US9579393B2 (en) 2017-02-28
JP2016128493A (ja) 2016-07-14
EP2043692A2 (en) 2009-04-08
RU2009105696A (ru) 2010-08-27
JP2015007062A (ja) 2015-01-15
US9234020B2 (en) 2016-01-12
JP2013241446A (ja) 2013-12-05
WO2008012540A1 (en) 2008-01-31
US20150252090A1 (en) 2015-09-10
ES2344670T3 (es) 2010-09-02
JP2013100309A (ja) 2013-05-23
US20150158924A1 (en) 2015-06-11
US20190216938A1 (en) 2019-07-18
US8394921B2 (en) 2013-03-12
EP2041167A1 (en) 2009-04-01
ES2581983T3 (es) 2016-09-08
US8946406B2 (en) 2015-02-03
JP2017018107A (ja) 2017-01-26
JP5941440B2 (ja) 2016-06-29
US9549990B2 (en) 2017-01-24
JP6203342B2 (ja) 2017-09-27
US9492557B2 (en) 2016-11-15
JP5586669B2 (ja) 2014-09-10
US9474805B2 (en) 2016-10-25
EP2630972B1 (en) 2017-08-30

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