JP2009544677A - 顆粒球コロニー刺激因子の誘導体化 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質の多糖誘導体である化合物であって、多糖はアニオン性であり、２〜２００個の糖ユニットを含む化合物に関する。本発明はまた、該新規化合物を含む医薬組成物、および該新規化合物の製造方法にも関する。

Description

本発明は、ＧＣＳＦの新規多糖誘導体、およびこのような誘導体を製造する方法に関する。該誘導体は、ＧＣＳＦの安定性、薬物動態（pharmacokinetics）及び薬力学（pharmacodynamics）を改善するのに有用である。

顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ、ＣＳＦ３）は糖タンパク質である。これは、ホルモン、増殖因子、またはサイトカインとして作用することができ、いくつかの異なる組織によって生成され、骨髄を刺激して、顆粒球および幹細胞を生成する。ＧＣＳＦは、また好中球前駆体および成熟好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する。

ＧＣＳＦは、内皮、マクロファージ、およびいくつかの他の免疫細胞によって生成される。天然のヒト糖タンパク質は、２つの形、すなわち分子量１９，６００グラム／モルの１７４および１８０アミノ酸長のタンパク質で存在する。より豊富でより活性な１７４アミノ酸の形は、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術による医薬品の開発で使用されている。１９８３年に初めて、マウスＧＣＳＦがオーストラリアで認められ、精製され、１９８６年に、日本および米国のグループによってヒト型がクローン化された。ＧＣＳＦ受容体は、骨髄の前駆細胞上に存在し、ＧＣＳＦによる刺激に応答して、成熟顆粒球への増殖および分化を開始する。

ＧＣＳＦは白血球の生成を刺激する。腫瘍学および血液学において、組換え型ＧＣＳＦは、ある種の癌患者において、化学療法を受けた後の好中球減少からの回復を加速して、より高強度の治療計画を可能にするために使用される。化学療法は、骨髄抑制を引き起こし、白血球レベルを許容されないほど低くする恐れがあり、患者は感染しやすく、敗血症にかかりやすくなる。ＧＣＳＦは、また造血幹細胞移植で使用するため白血球アフェレーシスによる回収の前に血中の造血幹細胞数を増加させるために使用される。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系において合成される組換え型ヒトＧＣＳＦは、フィルグラスチムと呼ばれる。フィルグラスチムの構造は、天然糖タンパク質の構造とわずかに異なる。公表された研究の大半は、フィルグラスチムを使用している。フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））は、ｒｈＧＣＳＦ（組換え型ヒトＧＣＳＦ）の市販されている形である。

別の形の組換え型ヒトＧＣＳＦであるレノグラスチムは、チャイニーズハムスター卵巣細胞において合成される。レノグラスチムは哺乳類細胞発現系であるので、１７４−アミノ酸天然ヒトＧＣＳＦと区別がつかない。フィルグラスチムとレノグラスチムでは臨床または治療結果の差はまだ特定されておらず、また正式な比較試験は行われていない。

ＧＣＳＦを誘導体化してその薬物動態特性を改善する試みがなされてきた。ＧＣＳＦのポリエチレングリコールで誘導体化された形であるＰＥＧ−フィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））という製品が市場に出ている。これは、フィルグラスチムより長い半減期を有し、毎日注射する必要性を低減することがわかっている。ＰＥＧ−フィルグラスチムの設計および開発は、さらにＣｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．、２００４年；１０（１１）：１２３５〜４４頁に記載されている。

米国特許出願公開第２００７００１４７５９号には、未変化のグリコシル連結基を介して結合しているＧＣＳＦとＰＥＧ部分の複合体が記載されている。複合体は、糖転移酵素の中鎖アミノ酸に対する作用によりグリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの両方から形成される。米国特許第６９５６０２７号は、ＧＣＳＦのＮ末端をＰＥＧで選択的に修飾するための条件を提供する。

他には、ＧＣＳＦがＰＥＧ以外の分子で誘導体化されている。例えば、国際公開第２００５／０１４０５０号には、ヒドロキシアルキルデンプンに共有結合しているＧＣＳＦが記載されている。

先行技術を考えると、ヒトおよび動物の治療において使用することができ、最適化された安定性、半減期、および低毒性を有する改善されたＧＣＳＦ誘導体を提供する必要がある。ＰＳＡをＧＣＳＦに結合させると、このような特性が与えられることが明らかになり、それによって本発明に到達した。Ｎ末端においてアニオン性多糖に結合しているＧＣＳＦが記載されたのは今回が初めてである。

ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、ある種の菌株によって、また哺乳類のある種の細胞において生成された天然シアル酸非分岐ポリマーである。これらは、限定酸加水分解、またはノイラミニダーゼによる消化、またはポリマーの細菌で誘導された天然の形の分画によって、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基からｎ＝２のシアル酸残基に至るまで様々な重合度で生成される可能性がある。

近年では、タンパク質および低分子量薬物分子の薬物動態特性を改変するために、ポリシアル酸の生物学的特性、具体的にはα−２，８結合同種重合ポリシアル酸の生物学的特性が利用されている。ポリシアル酸誘導体化によって、カタラーゼおよびアスパラギナーゼを含めて、いくつかの循環している治療用タンパク質の半減期に劇的な改善が生じ、またこのようなタンパク質を、治療用タンパク質に前曝露した望ましくない（および不可避なこともある）結果として生じる既存の抗体に直面して使用することも可能になる［ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００６年；Ｊａｉｎら、２００３年、２００４年］。α−２，８結合ポリシアル酸は、本来人体の一部であり、組織のノイラミニダーゼを介して、無毒性の糖であるシアル酸に分解する免疫学的に見えない生分解性ポリマーであって、ＰＥＧの魅力的な代替物を提供する。

我々は、以前に多糖（具体的には、ＰＳＡ）をタンパク質などの治療剤に結合させる方法を記載した［米国特許第５８４６，９５１号；国際公開第０１８７９２２号］。これらの方法の一部は、第一級アミン基において反応するタンパク質反応性アルデヒド部分を生じるポリマーの「非還元性」末端の化学誘導体化に依存する。非還元性シアル酸末端ユニットは、隣接ジオールを含有するので、容易に（かつ選択的に）過ヨウ素酸塩で酸化して、モノ−アルデヒドの形を得ることができる。このモノ−アルデヒドは、タンパク質に対して反応性がはるかに高く、還元的アミノ化および他の化学反応によるタンパク質の結合のための適切な反応性元素を含む。反応は図１および２で示される。

図１は、コロミン酸（大腸菌に由来するα−２，８結合ポリシアル酸）を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、タンパク質反応性アルデヒドを非還元性末端に形成する反応を示す。

図２は、シッフ塩基をシアノ水素化ホウ素ナトリウムで選択的に還元して、タンパク質アミノ基と安定な不可逆的共有結合を形成する反応を示す。

上述した通常の複合体化反応中、例えばコロミン酸とアミノ酸の側鎖との反応によって、意図していない副生物が生成されることがある。これらは、ヒトおよび動物において治療上使用するために規制当局から求められる化学的に定められた複合体の製造において十分扱いにくい可能性がある。

米国特許出願公開第２００７００１４７５９号 米国特許第６９５６０２７号 国際公開第２００５／０１４０５０号 米国特許第５８４６，９５１号 国際公開第０１８７９２２号 国際公開第２００６／０１６１６８号 国際公開第９２／２２３３１号 国際公開第２００５／０１６９７３号 国際公開第０３／０５５５２６号（６および７頁、表） 国際公開第０６／００５４０号 国際公開第０５／０１６９７４号 国際公開第２００５／０３１４９号

Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．、２００４年；１０（１１）：１２３５〜４４頁 ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、２００６年 Ｊａｉｎら、２００３年 Ｊａｉｎら、２００４年 Ｗａｎｇら、１９９９年 Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、１９５７年 Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、１９９３年 ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６年 ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９７年 Ｓｈｒｉｎｅｒら、１９８０年 ＰａｒｋおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９年

反応生成物の大部分の物理化学特性は類似しているので、所期の反応生成物（例えば、モノポリシアル化生成物）を意図されたものでない様々な生成物から精製することは簡単ではない。これは、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル浸透クロマトグラフィー（それぞれ電荷およびサイズを基準として分離する）などの技法が不十分な精製プロファイルを生じることを意味する。この問題は、複合体化反応における生成物の複雑さを低減させることによって克服することができる。我々は、タンパク質のＮ末端の高い反応性を利用することができ、過ヨウ素酸塩で酸化された天然コロミン酸を用いたタンパク質の還元的アミノ化の確立した方法（図１および２）で得られた生成物の複雑さを回避する、多糖のタンパク質への結合のための新規な方法を開発した。

本発明の第１の態様によれば、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のＮ末端多糖誘導体である化合物であって、多糖はアニオン性であり、２〜２００個の糖ユニットを含む化合物が提供される。

非還元性シアル酸末端ユニットの活性化の先行技術を示す反応スキームである。 タンパク質のＮ末端またはランダム誘導体化を示す反応スキームである。 トリプル検出ＧＰＣ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ：ＲＩ＋ＲＡＬＳ＋粘度計）を使用して、様々なｐＨにおける２４ｋＤａのコロミン酸（ＣＡ）の分解を示す図である。 ４００ｍＭのＮａＣｌで分画されたＣＡのＧＰＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。 製剤添加剤の存在下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるポリシアル化ＧＣＳＦの特徴付けを示す図である。 ＳＥ−ＨＰＬＣ（左側）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（右側）によるポリシアル化ＧＣＳＦのキャラクタリゼーションを示す図である。 ＳＥ−ＨＰＬＣによるＧＣＳＦのキャラクタリゼーションを示す図である。 未変性ＰＡＧＥによるポリシアル化４２ｋＤａ−ＧＣＳＦのキャラクタリゼーションを示す図である。 ＧＣＳＦの固定化金属アフィニティークロマトグラフィーからの結果を示す図である。 ＭＮＦＳ６０細胞におけるポリシアル化ＧＣＳＦのインビトロ活性を示す図である。 ポリシアル化ＧＣＳＦ製剤（ＣＡ４１ＫＤａ−ＧＣＳＦ）の安定性のＳＥ−ＨＰＬＣデータを示す図である。 ＧＣＳＦのＦＡＣＳデータを示す図である（好中球数）。 ＧＣＳＦ製剤のインビボ有効性を示す図である。 ＳＥ−ＨＰＬＣによるＰＥＧ化ＧＣＳＦのキャラクタリゼーションを示す図である。

以下、用語ＧＣＳＦが使用されるとき、ＧＣＳＦ様タンパク質も包含されるよう意図されている。ＧＣＳＦ様タンパク質は、（ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ．１と少なくとも５０パーセント（５０％）は同一であり、かつ（ｂ）バイオアッセイによって測定して、ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性が、実施例１に記載のバイオアッセイに従って測定されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ヒト、ｒＤＮＡ由来）の世界保健機構の国際規格（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ）に比べて、少なくとも３５パーセント（３５％）、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０または７０％である、ヒト顆粒球コロニー刺激因子の活性を有する任意の生物学的化合物を意味する。

ＧＣＳＦ様タンパク質は、「ＧＣＳＦホモログ」とも呼ばれることがある。２つの配列がホモログであるかどうかは、パーセント類似性または同一性（これらの用語は当技術分野でよく知られている）を使用してルーチンで算出される。配列は、スイスプロットアクセッション番号Ｐ０９９１９のヒトＧＣＳＦであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と比較するべきである。活性ＧＣＳＦは、この配列の残基３０〜２０７である。ＧＣＳＦホモログ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の全体またはその残基３０〜２０７と比較してもよい。ホモログは、活性ＧＣＳＦと比較されることが好ましい。

本発明では、ホモログは、類似性または同一性がアミノ酸レベルで５０％以上、より好ましくは６０％、７０％、８０％以上、より好ましくは９０％以上、具体的には同一性または類似性がアミノ酸レベルで９５％または９９％である。いくつかのプログラムが、類似性または同一性を算出するために利用可能である。好ましいプログラムは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能である、デフォルトパラメータで実行されるＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｐ、およびＢＬＡＳＴｘプログラムである。例えば、ＢＬＡＳＴｎプログラムをデフォルトパラメータ（スコア＝１００、語長＝１１、期待値＝１１、低複雑配列のフィルタリング＝オン）で使用して、２つのアミノ酸配列を比較することができる。これらのデフォルトパラメータを使用して、上記の相同性レベルを算出することができる。

ＧＣＳＦは、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。

本発明では、用語ＧＣＳＦは、ヒトまたは哺乳類の身体から抽出された天然ＧＣＳＦ、およびその合成のもの、具体的には組換え型ヒトＧＣＳＦ、例えば上述したフィルグラスチムおよびレノグラスチムを包含する。適切なＧＣＳＦ様活性を有するＧＣＳＦの変異体、具体的にはシステイン変異体も包含される。

「Ｎ末端誘導体」は、ＧＣＳＦがそのＮ末端アミン基においてアニオン性多糖で誘導体化されていることを意味する。

好ましくは、多糖は、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは少なくとも１０個、例えば少なくとも５０個の糖ユニットを有する。

アニオン性多糖は、好ましくはポリシアル酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸から選択される。好ましくは、多糖はポリシアル酸であり、実質的にシアル酸ユニットのみからなる。しかし、多糖は、分子中にシアル酸以外のユニットを有してもよい。例えば、シアル酸ユニットは、他の糖ユニットと交互に現れることがある。しかし、好ましくは、多糖は、実質的にシアル酸ユニットからなる。

好ましくは、多糖は末端シアル酸基を有し、上記に詳述するように、より好ましくはα−２−８またはα−２−９結合により互いに結合している少なくとも２個のシアル酸ユニットを含む多糖であるポリシアル酸である。適当なポリシアル酸は、重量平均分子量が２ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲、好ましくは５〜７５ｋＤａの範囲である。最も好ましくは、ポリシアル酸は、細菌源に由来し、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＫＩ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍａｒａｘｅｌｌａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、もしくはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの多糖Ｂ、またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ９２株由来のＫ９２多糖である。最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１由来のコロミン酸である。

ポリシアル酸は、塩の形、または遊離酸とすることができる。細菌源からの回収の後に分子量が低減されたように、加水分解された形でもよい。

多糖、好ましくはポリシアル酸は、広範な分子量を有する材料、具体的には１．３超、例えば２以上と同量の多分散度を有する材料とすることができる。好ましくは、分子量の多分散度が１．３または１．２未満、より好ましくは１．１未満であり、例えば１．０１と低い。

典型的には、本発明の化合物は、ＧＣＳＦのポリシアル酸誘導体であり、８０〜１８０個のシアル酸ユニットを含む。より典型的には、化合物は１００〜１５０個のシアル酸ユニットを含む。化合物は、好ましくは１２０〜１４５個、最も好ましくは１３０〜１４０個のシアル酸ユニットを含む。

本発明の第１の態様に従う化合物は、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のＮ末端とアニオン性多糖の間の共有結合複合体とすることができる。多糖とＧＣＳＦの間の結合の他の手段としては、静電引力が挙げられる。しかし、共有結合が好ましい。共有結合は、カルボキシル基とアミン基の間のアミド結合とすることができる。ＧＣＳＦが多糖に共有結合することができる別の結合は、シッフ塩基を介する。アミンに結合させるのに適当な基は、さらに国際公開第２００６／０１６１６８号に記載されている。

多糖は、その還元性または非還元性末端ユニットを介してＧＣＳＦに結合していてもよい。１つの多糖鎖は、両方の末端ユニットにおいてＧＣＳＦタンパク質に結合していてもよい。これは、１つの多糖鎖が２つのＧＣＳＦタンパク質に結合していてもよく、すなわちその還元性および非還元性末端において誘導体化されていてもよいことを意味する。

本発明では、多糖は、天然多糖または天然多糖の誘導体、例えば糖残基における１つもしくは複数の活性基の反応によって誘導体化された多糖、または多糖鎖の末端の誘導体化基に共有結合された多糖とすることができる。

多糖をタンパク質に結合させるための方法は、当該技術分野でよく知られており、国際公開第９２／２２３３１号および国際公開第０１８７９２２号（Ａ）により詳細に記載されている。本発明において好ましい方法は、より詳細に後述される。方法は本願の図１および２にも記載されている。

多糖は、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質に直接、すなわち図１および２に示すように結合していてもよく、あるいはリンカーを介して結合していてもよい。適当なリンカーは、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド含有試薬に由来する。また、リンカーは、生物学的に安定であり、または生分解性であり、例えばポリペプチドまたは合成オリゴマーを含むことができる。リンカーは、国際公開第２００５／０１６９７３号にさらに記載される二官能性部分に由来してもよい。適当な二官能性試薬は、例えばビス−ＮＨＳである。試薬は、一般式Ｚ−Ｒ^１−Ｚを有することができ、式中、Ｚはそれぞれ、官能基であり、同じものでもあってもよく、または異なるものであってもよく、Ｒ^１は二官能性有機基である。好ましくは、Ｒ^１は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン、およびアルキルヘテロアリーレンからなる群から選択され、そのいずれも、カルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド、および／またはアミン結合で置換かつ／または介在されていてもよい。Ｃ_３〜Ｃ_６アルカンジイルが特に好ましい。最も好ましくは、Ｒ^１は、適当な二官能性試薬の適切な部分に対応する。

本発明の第２の態様によれば、一般式（Ｉ）の化合物が提供され、

式中、ｍは少なくとも１であり；
ＸＢは、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質であるＢ−ＸＨに由来し、ここでＸＨはＮＨ_２またはＳＨであり；
Ｌは、結合、連結基であり、またはポリペプチドもしくは合成オリゴマーを含み；
ＧｌｙＯは、アニオン性糖ユニットであり；
ただし、連結基が存在する場合それは、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^１−Ｃ（Ｏ）−を有するものであり；
ここで、ＹはＮＲ^２またはＮＲ^２−ＮＲ^２であり、Ｒ^１は上記に定義した二官能性有機基であり；Ｒ^２はＨまたはＣ_１〜６アルキルである。

本発明のこの態様では、ＧＣＳＦは、多糖の非還元性末端に結合している。末端の多糖ユニットはシアル酸ユニットである。多糖の他の糖ユニットは、ＧｌｙＯで表わされ、同じものでもあってもよく、または異なるものであってもよい。適当な糖ユニットとしては、ヘパリン、ヒアルロン酸、またはコンドロイチン硫酸が挙げられる。

ＧＣＳＦが多糖に直接結合している場合、Ｌ基は結合である。しかし、Ｌ基は、あるいはＮ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド含有試薬に由来していてもよい。試薬は、上記に定義した一般式Ｚ−Ｒ^１−Ｚを有することができる。この実施形態では、Ｌは一般に次の基である。

好ましくは、ＸＨはＮＨ_２であり、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のＮ末端アミンである。あるいは、ＮＨ_２は、リシンアミノ酸側鎖の第一級アミンとすることができる。別の実施形態では、ＸＨはシステインアミノ酸の側鎖のチオール基ＳＨである。

本発明の別の態様は、上記に定義した新規化合物および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。

医薬組成物は、水性懸濁液の形とすることができる。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して新規化合物を含有する。医薬組成物は、無菌注射水溶液または均質懸濁液の形とすることができる。この懸濁液は、公知の技術に従って適当な分散化剤または湿潤化剤、および懸濁化剤を使用して製剤することができる。

医薬組成物は、ヒトまたは動物での使用のために経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、局所、または気管投与することができる。

組成物は、さらに製剤添加剤を含むことができる。製剤添加剤は、Ｗａｎｇら（１９９９年）に記載されるように、ＧＣＳＦを内的または外的に安定化することができる賦形剤を意味する。賦形剤は、安定化剤、可溶化剤、または金属イオンとすることができる。製剤添加剤の適当な例としては、１つまたは複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール、またはアミノ酸が挙げられる。これらは、単独または組み合わせて使用することができる。

安定化剤は、一般にタンパク質のアンフォールディングのためのギブズ自由エネルギー変化の増大を招くタンパク質の変性状態の不安定化によって機能する。安定化剤は、好ましくは糖またはポリオール、例えばスクロース、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、マンニトール、ラクトース、およびエチレングリコールである。安定化バッファーはリン酸ナトリウムである。

可溶化剤は、好ましくは界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤である。適当な例としては、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ Ｆ６８、Ｂｒｉｊ ３５、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００が挙げられる。

金属イオンは好ましくは２価である。適当な金属イオンとしては、Ｚｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、およびＦｅ^２＋が挙げられる。

製剤添加剤は、ＰＳＡ、ＰＥＧ、またはヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されたポリマーとすることもできる。

製剤添加剤として使用するための適当なアミノ酸およびアミノ酸誘導体としては、ヒスチジン、グリシン、他の類似のアミノ酸、およびアスパラギン酸ナトリウムが挙げられる。

本発明の別の態様は、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のアニオン性多糖誘導体の集団を含む組成物であって、誘導体は２〜２００個の糖ユニットを含み、集団は実質的にタンパク質のＮ末端誘導体のみからなる。

「集団」は、組成物中に１つを超える多糖誘導体が存在することを意味する。誘導体は、同じまたは異なる数の糖ユニットを含むことができる。好ましくは、組成物中の多糖の多分散度は１．３未満、より好ましくは１．１未満である。好ましい多糖は、本発明の他の態様について上記に詳述する通りである。

その集団では、ＧＣＳＦは実質的にすべて、Ｎ末端アミンのみにおいて誘導体化されている。これは、その集団のタンパク質の８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、Ｎ末端アミンのみにおいてＰＳＡで誘導体化されていることを意味する。

Ｎ末端の誘導体化の程度は、ペプチドマッピングおよびエドマン分解など当技術分野でよく知られている技法で測定することができる。

本発明の別の態様は、治療で使用するための、上述した化合物である。

本発明の最後の態様によれば、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質の多糖誘導体を製造する方法であって、２〜２００個の糖ユニットを含むアニオン性多糖はＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質と化学的に反応する方法が提供される。

本発明のこの態様では、多糖はＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質の任意の基において反応できることに留意されたい。例えば、多糖は、アミン、アミド、アリール、アルデヒド、ケトン、グアニジノ、ミダゾール、ヒドロキシル、カルボキシル、またはスルフヒドリル基と反応することができる。好ましくは、その基はアミン基、より好ましくは末端アミン基である。アミンは、あるいはリシンアミノ酸などのアミノ酸のアミン側鎖とすることができる。多糖は、ＧＣＳＦの任意の炭水化物残基、具体的にはペンダントグリコン基においても反応することができる。

多糖は、当技術分野で知られている方法でアミノ酸側鎖に結合することができる。例えば、多糖は、インビトロカップリングによってＡｓｐまたはＧｌｕのＣ末端である−ＣＯＯＨまたはカルボキシル側鎖に結合することができる。システインアミノ酸のチオール基も、インビトロカップリングによって多糖に結合することができる。これらの方法は、国際公開第０３／０５５５２６号、具体的には６および７頁の表にさらに記載されている。この参考文献では、インビトロカップリングは、オリゴ糖部分をＧｌｎの側鎖のアミド基に結合させるためにも使用される。オリゴ糖部分をそれぞれＡｒｇおよびＨｉｓ残基のグアニジノ基およびイミダゾール基に結合させるインビトロカップリング方法も記載されている。これらの方法はそれぞれ、本発明のＧＣＳＦを誘導体化するために使用することができる。

多糖は、ＧＣＳＦの改変された形と反応することもできる。例えば、ＧＣＳＦの１つまたは複数の基は、例えば還元または酸化による化学転換を受けていてもよい。例えば酸化条件を使用して、反応性カルボニルがＧＣＳＦの末端アミノ基の代わりに生成することがある。

本発明の方法で使用するための適当な多糖は、新規化合物について前述した通りである。

本発明の化合物は、先行技術において記載される適当な方法のいずれかによって製造することができる。例えば、典型的な方法は、我々の先の特許出願である国際公開第９２／２２３３１号に記載されている。

典型的には、アニオン性多糖は、ＧＣＳＦへの誘導体化の前に活性化される。これは、例えば反応性アルデヒド基を有することができ、誘導体化反応は還元条件下で実施することができる。反応性アルデヒド基は、多糖のヒドロキシル基の酸化を制御することによって生成することができる。最も好ましくは、この反応性アルデヒドは、多糖を水溶液中、酸化条件制御下で例えば過ヨウ素酸ナトリウムを使用して反応させる予備ステップで生成される。このステップを実施することができる酵素も使用することができるが、酸化は化学的酸化であることが好ましい。反応性アルデヒド基は、多糖の非還元性末端または還元性末端に存在することができる。次いで、ＧＣＳＦ、典型的にはＮ末端は、反応性アルデヒド基と反応して、付加物を生成することができ、これは、還元されると、ＧＣＳＦのＮ末端誘導体を生成する。

多糖の活性化は、好ましくは多糖の主鎖の中鎖開裂が実質的にない、すなわち分子量低下が実質的にない条件下で実施されるべきである。酸化剤は、好適には過ルテニウム酸塩、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。酸化は、１ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度の過ヨウ素酸塩を用い、３〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度で、１分〜４８時間の範囲の時間、実行され得る。

誘導体化反応の適当な還元条件は、水素を触媒と共に、または好ましくは水素化物、具体的にはホウ水素化物(borohydride)を利用することができる。これらは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）によって担持されたボロヒドリドなど固定化することができる。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化アルカリ金属塩が、還元剤として１μＭ〜０．１Ｍの範囲の濃度、５．０〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度で、１分〜４８時間の範囲の時間使用される。出発材料のペンダントカルボキシル基が還元されないような反応条件が選択される。他の適当な還元剤は、酸性条件下のシアノホウ水素化物(cyanoborohydride)、例えばポリマーによって担持されたシアノホウ水素化物またはアルカリ金属シアノホウ水素化物、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−セレクトリド、トリアセトキシボロヒドリドなどである。

多糖の他の活性化された誘導体は、我々の先の特許出願である国際公開第０６／００５４０号に記載されるＮＨＳなどのペンダント官能基を有する誘導体を含めて、本発明で有用であり得る。

一実施形態では、反応性アルデヒドは多糖の還元性末端に存在し、非還元性末端は、ＧＣＳＦのペンダント基と反応しないように不動態化されている。

コロミン酸の還元性末端の反応性は、タンパク質の標的に対して弱いが、化学的に定められた複合体の製造においては十分に問題なものとなる。

多糖の還元性末端において反応性アルデヒドを有する多糖を調製するのに適した化学は、我々の先の出願である国際公開第０５／０１６９７４号に記載される。方法は、予備の選択的酸化ステップと、続いて還元、次いでさらに酸化して、還元性末端におけるアルデヒドおよび不動態化された非還元性末端を有する化合物を生成するものである。

国際公開第２００５／０１６９７３号には、タンパク質への複合体化に有用であるポリシアル酸誘導体、具体的には遊離スルフヒドリル薬物を有する誘導体が記載される。ポリシアル化合物をヘテロ二官能性試薬と反応させて、スルフヒドリル基への部位特異的な複合体化のためのペンダント官能基を導入する。本発明で使用するアニオン性多糖は、この方式でヘテロ二官能性試薬で誘導体化することもできる。

ＧＣＳＦと反応させる前に、多糖を誘導体化することができる。例えば、多糖を二官能性試薬と反応させることができる。

国際公開第２００６／０１６１６８号にさらに記載されるように、多糖を、好ましくはシアル酸である末端糖上に第一級アミン基、第二級アミン基、およびヒドラジンから選択された基が形成される予備反応ステップにかけ、続いてこれを二官能性試薬と反応させて、反応中間体が形成される反応ステップにかけることができる。次いで、中間体はＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質と反応することができる。二官能性試薬は、上記に定義した一般式Ｚ−Ｒ^１−Ｚを有することができる。

ある種の反応条件がＧＣＳＦのＮ末端において選択的誘導体化を促進することがわかった。Ｎ末端における選択的反応を促進するためには、誘導体化反応を酸性ｐＨの第１の水溶液中で実施するべきであり、次いで得られた多糖誘導体を第１の水溶液より高いｐＨの第２の水溶液中で精製すべきである。典型的には、第１の水溶液のｐＨは７未満であり、好ましくは４．０〜６．０の範囲である。第２の水溶液のｐＨは、６．５〜９．５、好ましくは６．５〜８．５の範囲である。誘導体化反応の低いｐＨによって、任意の中鎖部位ではなくタンパク質のＮ末端において選択的誘導体化が促進される。

さらに、ある種の製剤添加剤の使用によって、選択的安定多糖ＧＣＳＦ誘導体の形成が促進されることがわかった。製剤添加剤は、１つまたは複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール、またはアミノ酸から選択することができる。これらを反応媒体に添加することができ、あるいは最終生成物の組成物に安定化剤として添加することができる。

本発明の一実施形態では、製剤添加剤は、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、またはスクロースである。別の実施形態では、製剤添加剤は非イオン性界面活性剤である。製剤添加剤は、あるいはＰＳＡ、ＰＥＧ、またはヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されたポリマー、例えばＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＰＥＧとすることができる。別の実施形態では、製剤添加剤は２価の金属イオンである。好ましい２価の金属イオンとしては、Ｚｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｓｒ^２＋、またはＦｅ^２＋が挙げられる。

製剤添加剤はバッファーとすることができる。好ましくは、製剤添加剤は、バッファーである場合、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムである。

本発明の方法における多糖誘導体の精製は、当技術分野で知られている種々の方法を使用して実施することができる。適当な精製方法の例としては、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＡＥＸ（アニオン交換クロマトグラフィー）、およびＭＡＣ（金属アフィニティークロマトグラフィー）が挙げられる。

広範な分子量分布を有する集団のポリシアル酸を、多分散度がより低い画分、すなわち異なる平均分子量を有する画分に分別することができる。我々の先の特許出願である国際公開第２００５／０１６７９４号および国際公開第２００５／０３１４９号に記載されるように、アニオン交換クロマトグラフィーで、溶離には適当な塩基性バッファーを使用して、分画を行うことが好ましい。分画方法は、多糖出発材料、およびその誘導体に適している。したがって、技法は、本発明の本質的な工程段階の前または後に適用することができる。好ましくは、ＧＣＳＦの得られた多糖誘導体の多分散度は１．１未満である。

本発明に従うＧＣＳＦの誘導体化によって、ＧＣＳＦの半減期の増大、安定性の改善、免疫原性の低減、ならびに／または溶解性、したがってバイオアベイラビリティおよび薬物動態特性の制御が行われる。新規な方法は、モノポリシアル化ＧＣＳＦ複合体の生成にとって特に価値がある。

実施例１〜１０および下記の図面を参照して、本発明を説明する。

材料
炭酸アンモニウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（８ＫＤａ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（純度＞９８％）、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、および分子量マーカー、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ ２０およびトリスは、英国のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムは英国のＢＤＨから入手した。使用するコロミン酸である線状α−（２，８）−結合Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１ポリシアル酸（平均２２．７ｋＤａ、高い多分散度１．３４、３９ｋＤａ、多分散度１．４；１１ｋＤａ、多分散度１．２７）は、アイルランドのＣａｍｉｄａから入手した。他の材料には、２，４ジニトロフェニルヒドラジン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＫ）、透析チュービング（３．５ＫＤａおよび１０ＫＤａカットオフリミット；Ｍｅｄｉｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫ）、 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ ＨｉＴｒａｐ、ＰＤ−１０カラム、Ｑ ＦＦ［カラム１ｍｌまたは５ｍｌ］；ＨｉｔｒａｐブチルＨＰカラム［１ｍｌまたは５ｍｌ］；（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＫ）、トリスグリシンポリアクリルアミドゲル（４〜２０％および１６％）、トリスグリシンドデシル硫酸ナトリウム泳動バッファーおよびローディングバッファー（Ｎｏｖｅｘ，ＵＫ）が含まれた。脱イオン水は、水精製装置Ｅｌｇａｓｔａｔ Ｏｐｔｉｏｎ ４（Ｅｌｇａ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫ）から得られた。使用する試薬はすべて、分析用グレードであった。タンパク質またはＣＡのアッセイにおける分光光度定量のために、プレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を使用した。マウスは、英国のＨａｒｌａｎから購入し、使用に先立って少なくとも１週間順化させた。ＧＣＳＦはインドのＳＩＩＬから得た。

ＧＣＳＦバイオアッセイ
Ｇ−ＣＳＦ生物活性の定量は、このサイトカインによるＭ−ＮＦＳ−６０細胞増殖の刺激に基づく。細胞は、参照調製物とＧ−ＣＳＦ調製物の両方の段階希釈物と共に４８時間インキュベートする。細胞増殖応答は、生細胞染色系−ＰＭＳ（電子結合試薬）混合物を用いて４時間インキュベートした後、評価される。ＭＴＳは、細胞によって、組織培養培地に可溶なホルマザン生成物に生物還元する。ホルマザンの４９２ｎｍにおける吸光度は、さらに処理することなく、９６ウェルのアッセイプレートから直接測定することができる。ホルマザン生成物の量は４９２ｎｍにおける吸光度の量によって測定して、生細胞の数と正比例する。

ＧＣＳＦ（ヒトｒＤＮＡ由来）８８／５０２、１０，０００ＩＵ／アンプル、含有量１００ｎｇのＧ−ＣＳＦ（ＮＩＢＳＣ，ＵＫ）の世界保健機関の国際規格（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を参照として使用するべきである。

タンパク質およびコロミン酸の定量
レソルシノール試薬を用いたポリシアル酸（シアル酸として）の定量的評価は、他［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、１９９３年；ＦｅｒｎａｎｄｅｓおよびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９９６年、１９９７年］に記載するレゾルシノール方法［Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、１９５７年］によって実施した。タンパク質は、ＢＣＡ比色法または２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって測定した。

２．１ コロミン酸の活性化
新しく調製した０．０２Ｍのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）溶液（８倍モル過剰）を、２０℃でＣＡと混合し、反応混合物を、暗所で１５分間磁気撹拌した。次いで、２倍体積のエチレングリコールを反応混合物に添加して、過剰のＮａＩＯ_４を消費し、混合物を２０℃でさらに３０分間撹拌させた。酸化されたコロミン酸は、４℃で０．０１％の炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ ７．４）に対して長時間（２４ｈ）透析した（分子量３．５ＫＤａカットオフの透析チュービング）。限外濾過（分子量３．５ｋＤａカットオフを超える）を使用して、透析チュービングからのＣＡＯ溶液を濃縮した。必要とされた体積への濃縮に続いて、濾液を凍結乾燥し、その後使用するまで−４０℃で貯蔵した。あるいは、エタノールを用いて沈殿させること（２回）によって、ＣＡを反応混合物から回収した。

２．２ ＣＡおよび誘導体の酸化状態の決定
カルボニル化合物との相互作用時にやや溶けにくい２，４ジニトロフェニル−ヒドラゾンを生じる２，４ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いて、コロミン酸酸化度の定量的評価を実施した。非酸化（ＣＡ）／酸化（ＣＡＯ）を２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に添加し、溶液を振盪し、次いで結晶性沈殿物が観察されるまで３７℃で放置した［Ｓｈｒｉｎｅｒら、１９８０年］。ＣＡ酸化度（定量的）は、アルカリ性溶液中フェリシアン化物イオンのフェロシアン化鉄（プルシアンブルー（Persian blue））への還元、次いで６３０ｎｍにおける測定に基づく方法［ＰａｒｋおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９年］で測定した。この場合、グルコースを標準物質として使用した。

２．３ ゲル浸透クロマトグラフィー
コロミン酸試料（ＣＡおよびＣＡＯ）をＮａＮＯ_３（０．２Ｍ）、ＣＨ_３ＣＮ（１０％；５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、２本を超えるＧＭＰＷ_ＸＬカラムのクロマトグラフィーを屈折率による検出で行った（ＧＰＣ系：ＶＥ１１２１ ＧＰＣ溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０ ＲＩ検出器、およびＴｒｉｓｅｃ ３ソフトウェアによる照合（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ）。試料（５ｍｇ／ｍｌ）を０．４５μｍのナイロン膜で濾過し、移動相として０．２Ｍ ＮａＮＯ_３およびＣＨ_３ＣＮ（１０％）を用いて０．７ｃｍ／分で実行した。

結果を図３ｂならびに表４および５に示す（２５頁を参照のこと）。

２．４ コロミン酸安定性
ＰＥＧ化の化学の規則は、これらの分子の生理化学的特性が異なるためポリシアル化それ自体に適用することができない。ＰＳＡは、酸に不安定なポリマーであり、およそ中性ｐＨで何週間も安定である（図３ａ）。図３ａの結果は、ｐＨ ６．０および７．４において、ＣＡは８日間安定であり、ｐＨ ５．０において、ゆっくりとした分解（４８時間後、初期ＭＷの９２％）、およびｐＨ ４．０において、ゆっくりとした分解（４８時間後、初期ＭＷの７０％）が見られることを示す。ポリシアル酸は高親水性であり、一方ＰＥＧは事実上両親媒性分子である。ＰＥＧ化に使用される条件を用いてポリシアル化を実施する場合、タンパク質の凝集および沈殿が多くの場合見られる。

製剤添加剤を含むＮ末端タンパク質−ＣＡ複合体の調製
３．１ ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の調製（Ｎ末端方法）
ＧＣＳＦ（１８．８ｋＤａ）を溶液（５％ ソルビトール、０．０２５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート８０を含有する、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．０）中１．０５ｍｇ／ｍｌ）として供給し、２〜８℃で貯蔵した。必要量のＧＣＳＦをエッペンドルフに取り入れ、氷上に配置した。複合体化のために添加するＣＡの量を、次式に基づいて算出した。
ＣＡの重量＝｛タンパク質の量（ｇ）／（タンパク質のＭＷ）｝×（ＣＡのＭＷ）×（モル過剰のＣＡ）
ＣＡの必要量を計量した。ＣＡを１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５％ ソルビトール、ｐＨ ５．５（ここでは、最終反応体積の２０％体積を使用した）に可溶化し、ＣＡがすべて溶解するまで混合物を穏やかにボルテックスし、次いで濾過して新しいエッペンドルフに入れ、または４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいエッペンドルフに移し入れて、あらゆる凝集／沈殿材料を除去した。最終反応混合物中Ｔｗｅｅｎ ２０の最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにするために、必要体積の１０ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０保存溶液を添加した。必要量のＧＣＳＦタンパク質溶液をＣＡ溶液に添加して、１０モル過剰（少スケール）および９（大スケール）のＣＡを得、反応混合物を穏やかな振盪器上で４±１℃に維持することによって穏やかに混合した。最終反応混合物中５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍｌとするために、１００ｍｇ／ｍｌのＮａＣＮＢＨ_３溶液を添加し、穏やかに混合し、最終反応混合物のｐＨを調べ、必要ならｐＨを、４±１℃で１Ｍ ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いて５．５に調整した。１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５％ ソルビトール、ｐＨ ５．５を使用して、反応の体積を、反応混合物中タンパク質濃度が０．６７ｍｇ／ｍｌになるように最終的に調整した。チューブを封止し、所望の温度（４±１℃）で２４時間撹拌した。反応を適切な方法で止め、ＭＮＦＳ ６０細胞、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ トリスグリシンゲルを使用）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（スーパーロース ６カラム）でのインビトロ活性アッセイのための試料を取り出し、反応混合物のｐＨを調べた。あらゆる沈殿物を排除するために、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析および精製の前に反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＳＥ−ＨＰＬＣのための好ましいバッファーは０．１Ｍ リン酸Ｎａ（ｐＨ ６．９）であった。
最適化
還元的アミノ化は、Ｎ末端およびランダム誘導体化のためにＧＣＳＦにおいてＣＡ分子量（２９〜５２ｋｄａ）の範囲で行った。複合体化反応のためのプロセス変数の範囲を検討した：ＣＡＯ １０〜２０（小スケール）および８〜１５（大スケール）モル過剰；試薬＝５０〜１００ｍＭ ＮａＣＮＢＨ_３；反応バッファー＝１０ｍＭ ＮａＯＡｃ；ｐＨ ５．０〜７．４、製剤添加剤＝Ｔｗｅｅｎ ２０６ＫＤａ／Ｐｅｇ ８ＫＤａ（１０Ｍ過剰）／Ｔｗｅｅｎ ２０＋ＰＥＧ ６ＫＤａ；温度＝４±１℃、時間＝ｌ６〜２４時間など。

最適化反応条件は、次の通りであることがわかった：ＣＡＯ＝１０（小スケール）および９（大スケール）モル過剰、試薬＝５０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ_３、反応バッファー＝１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ ５．５、添加剤＝０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ ２０、温度＝４±１℃、時間＝２２時間。

３．２． ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の精製およびキャラクタリゼーション（Ｎ末端方法）
残存する反応混合物試料をＡＥＸバッファーＡ（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム ｐＨ ５．０）（１．５ｍｌの反応混合物＋９ｍｌのバッファーＡ）で希釈し、ｐＨを調べ、必要に応じてｐＨ ５．０に調整し、予めＡＥＸバッファーＡと平衡に達したＡＥＸカラムにローディングした。ローディング画分を回収し、標識した。カラムをＡＥＸバッファーＡ（少なくとも５カラム体積）で洗浄し、画分を回収し（各画分１．５カラム体積）、標識した。生成物をＡＥＸバッファーＢ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．６５Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ ７．０）で溶離し、画分を回収し（各画分１カラム体積；６カラム）、標識した。連続する２画分に、タンパク質含有量（ＵＶ２８０ｎｍ）がない場合、次のステップを実施した。精製中、試料を氷上で維持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＧＣＳＦのＡｂｓは約０．８７２であった）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣのために試料を採取した。遊離ＣＡを混合物から除去するために、ＨＩＣを使用した。必要に応じて、試料を濃縮した。

複合体を含有するＡＥＸ画分を貯留し、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加して、ローディング溶液中の濃度を２．７５Ｍにした。次いで、この溶液を、予めＨＩＣバッファーＡ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、２．７５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ ６．５）と平衡に達したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収し（各画分１．５カラム体積）、標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ（少なくとも５カラム体積；速度＝０．５ｍｌ／分）で洗浄し、（１．５カラム体積）画分を回収し、標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ ７．４）（速度＝５ｍｌ／分）で溶離し、画分を回収し（１カラム体積画分；６カラム体積）、標識した。精製中、試料を氷上で維持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した。精製した複合体を含有するＨＩＣ画分を合わせ、溶液の複合体組成物を、５％ ソルビトールおよび０．０２５ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０の最終組成物が得られるように５０％ソルビトール溶液および１０ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０溶液で調整した。次いで、溶液を４±１℃で濃縮し、タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した。さらに、ＳＥ−ＨＰＬＣによって精製を行った（例えば、複合体を遊離タンパク質／凝集体から分離するなどのため）。複合体を滅菌濾過し、活性アッセイ、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣによるキャラクタリゼーションのために試料を採取した。必要に応じて、タンパク質アッセイおよびＣＡアッセイのために一定分量を取り除いた。残りを、その後使用するまで４±１℃で貯蔵し、物理的安定性についてＳＥ−ＨＰＬＣによって検討した。

溶液のＧＣＳＦの安定性および誘導体化の程度に影響を及ぼす様々なプロセスの効果を検討した。

３．３．１． ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の調製（ランダム）
ＧＣＳＦ（１８．８ｋＤａ）を溶液（５％ ソルビトール、０．０２５ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート８０を含有する、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．０）中１．０５ｍｇ／ｍｌ）として供給し、２〜８℃で貯蔵した。必要量のＧＣＳＦをエッペンドルフに取り入れ、氷上に配置した。複合体化のために添加するＣＡ（例えば、酸化または非酸化ＣＡ）の量を、次式に基づいて算出した。
ＣＡの重量＝｛タンパク質の量（ｇ）／タンパク質のＭＷ｝×（ＣＡのＭＷ）×（モル過剰のＣＡ）
ＣＡの必要量を計量した。ＣＡを５０ｍＭ リン酸ナトリウム、５％ ソルビトール、ｐＨ ７．４（ここでは、最終反応体積の２０％体積を使用した）に可溶化した。ＣＡがすべて溶解するまで混合物を穏やかにボルテックスし、次いで濾過して新しいエッペンドルフに入れ、または４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいエッペンドルフに移し入れて、あらゆる凝集／沈殿材料を除去した。最終反応混合物中Ｔｗｅｅｎ ２０の最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにするために、必要体積の１０ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０保存溶液を添加した。必要量のＧＣＳＦタンパク質溶液をＣＡ溶液に添加して、１１モル過剰（４０ｋＤａに対して）のＣＡを得、反応混合物を穏やかな振盪器上で４±１℃に維持することによって穏やかに混合した。最終反応混合物中５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍｌとするために、１００ｍｇ／ｍｌのＮａＣＮＢＨ_３溶液を添加し、穏やかに混合し、最終反応混合物のｐＨを調べ、必要ならｐＨを、４±１℃で１Ｍ ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いて７．４に調整した。１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５％ ソルビトール、ｐＨ ７．４を使用して、反応の体積を、反応混合物中タンパク質濃度が０．６７ｍｇ／ｍｌになるように最終的に調整した。チューブを封止し、所望の温度（４±１℃）で２２時間撹拌した。反応を適切な方法で止め、ＭＮＦＳ ６０細胞、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ トリスグリシンゲルを使用）、ＳＥ−ＨＰＬＣでのインビトロ活性アッセイのための試料を取り出し、反応混合物のｐＨを調べた。あらゆる沈殿物を排除するために、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析および精製の前に反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＳＥ−ＨＰＬＣのための好ましいバッファーは０．１Ｍ リン酸Ｎａ（ｐＨ ６．９）であった。

３．３．２． ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の精製およびキャラクタリゼーション（ランダム）
ＨＩＣおよびＩＥＣによって、モノシアル化ＧＣＳＦ複合体を他のＧＣＳＦ複合体から精製した。残存する反応混合物試料をＡＥＸバッファーＡ（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム ｐＨ ５．０）（１．５ｍｌの反応混合物＋９ｍｌのバッファーＡ）で希釈し、ｐＨを調べ、必要に応じてｐＨ ５．０に調整し、予めＡＥＸバッファーＡと平衡に達したＡＥＸカラムにローディングした。ローディング画分を回収し、標識した。カラムをＡＥＸバッファーＡ（少なくとも５カラム体積）で洗浄し、画分を回収し（各画分１．５カラム体積）、標識した。生成物をＡＥＸバッファーＢ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．６５Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ ７．０）で溶離し、画分を回収し（各画分１カラム体積；６カラム）、標識した。連続する２画分にタンパク質含有量がない場合（ＵＶ２８０ｎｍ）、次のステップを実施した。精製中、試料を氷上で維持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＧＣＳＦのＡｂｓは約０．８７２であった）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣのために試料を採取した。遊離ＣＡを混合物から除去するために、ＨＩＣを使用した。必要に応じて、試料を濃縮した。

複合体を含有するＡＥＸ画分を貯留し、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加して、添加溶液中の濃度を２．７５Ｍにした。次いで、この溶液を、予めＨＩＣバッファーＡ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、２．７５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ ６．５）と平衡に達したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収し（各画分１．５カラム体積）、標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ（少なくとも５カラム体積；速度＝０．５ｍｌ／分）で洗浄し、（１．５カラム体積）画分を回収し、標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ ７．４）（速度＝５ｍｌ／分）で溶離し、画分を回収し（１カラム体積画分；６カラム体積）、標識した。精製中、試料を氷上で維持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した。精製した複合体を含有するＨＩＣ画分を合わせ、溶液の複合体組成物を、５％ソルビトールおよび０．０２５ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０の最終組成物が得られるように５０％ソルビトール溶液および１０ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０溶液で調整した。次いで、溶液を４±１℃で濃縮し、タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した。さらに、ＳＥ−ＨＰＬＣによって精製を行った（例えば、複合体を遊離タンパク質／凝集体から分離するなどのため）。複合体を滅菌濾過し、活性アッセイ、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣによるキャラクタリゼーションのために試料を採取した。タンパク質アッセイおよびＣＡアッセイのために一定分量を取り除いた。残りを、その後使用するまで４±１℃で貯蔵し、物理的安定性についてＳＥ−ＨＰＬＣによって検討した。

溶液のＧＣＳＦの安定性および誘導体化の程度に影響を及ぼす様々なプロセスの効果を検討した。

３．４． ＧＣＳＦのペグ化（比較）：
ＧＣＳＦ（１８．８ｋＤａ）を溶液（５％ソルビトール、０．０２５ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を含有する、１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．０）中０．５ｍｇ／ｍｌ）として供給し、２〜８℃で貯蔵した。ＧＣＳＦ溶液を、約１．０ｍｇ／ｍｌの溶液となるように濃縮した。必要量のＧＣＳＦをエッペンドルフに取り入れ、氷上に配置した。複合体化のために添加するＰＥＧの量を、次式に基づいて算出した。
ＰＥＧの重量＝｛タンパク質の量（ｇ）／（タンパク質のＭＷ）｝×（ＰＥＧのＭＷ）×（モル過剰のＰＥＧ）
必要量のＰＥＧ２０Ｋを計量した。それを１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５％ソルビトール、ｐＨ５．５（ここでは、最終反応体積の２０％体積を使用した）に可溶化し、ＰＥＧがすべて溶解するまで混合物を穏やかにボルテックスし、次いで濾過して新しいエッペンドルフに入れ、または４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいエッペンドルフに移して、あらゆる凝集／沈殿材料を除去した。最終反応混合物中Ｔｗｅｅｎ ２０の最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにするために、必要体積の１０ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ ２０保存溶液を添加した。必要量のＧＣＳＦタンパク質溶液をＰＥＧ溶液に添加して、７．５モル過剰のＰＥＧを得、反応混合物を穏やかな振盪器上で４±１℃に維持することによって穏やかに混合した。最終反応混合物中５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍｌとするために、１００ｍｇ／ｍｌのＮａＣＮＢＨ_３溶液を添加し、穏やかに混合し、最終反応混合物のｐＨを調べ、必要ならｐＨを、４±１℃で１Ｍ ＮａＯＨ／ＨＣＬを用いて５．５に調整した。１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５％ソルビトール、およびｐＨ ５．５を使用して、反応の体積を、反応混合物中タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように最終的に調整した。チューブを封止し、所望の温度（４±１℃）で２４時間撹拌した。反応を適切な方法で止め、ＭＮＦＳ ６０細胞、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ トリスグリシンゲルを使用）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（スーパーロース ６カラム）でのインビトロ活性アッセイのための試料を取り出し、反応混合物のｐＨを調べた。あらゆる沈殿物を排除するために、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析および精製の前に反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＳＥ−ＨＰＬＣのための好ましいバッファーは０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６．９）であった。結果を図１３に示す。

３．５． 金属アフィニティークロマトグラフィー
ＧＣＳＦおよびＰＳＡ−ＧＣＳＦ複合体を、金属アフィニティークロマトグラフィーによってＰＳＡおよび反応混合物の副生物から精製した（図８）。この実験用の試料は、７５μＬの反応バッファー＋７５μｌの溶離液Ａ中５０μｇのＧＣＳＦであった。反応バッファーは、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ２０；５％ソルビトール；１０ｍＭ ＮａＯＡｃ；ｐＨ ５．０であった。溶離液Ａは１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ；ｐＨ７．０であった。溶離液Ｂは２０ｍＭ ＡｃＯＨ＋０．２Ｍ ＮａＣｌ；ｐＨ４．０であった。グラジエント：（ｔ／分）＝０から１２．５（Ａ １００％）；ｔ＝１２．５から２５（Ｂ ３０％）；２５から４０（Ｂ １００％）。０．８８７のピークはバッファーであり、１６．１４２のピークはＧＣＳＦである。

３．６． ＧＣＳＦ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣは、４℃で冷却したＪａｓｃｏ ＡＳ−２０５７プラスオートサンプラーおよびＪａｓｃｏ ＵＶ−９７５ ＵＶ／ＶＩＳ検出器を装備した液体クロマトグラフ（ＪＡＳＣＯ）で行った。データは、ＩＢＭ／ＰＣでＥＺｃｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅソフトウェアによって記録した。ＳＥＣ試料は、０．１Ｍ リン酸Ｎａ塩、ｐＨ ６．９の定組成の移動相；Ｔｗｅｅｎの存在下でＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムで分析した（図５）。図６は、ＧＣＳＦに起因する唯一のピークをＲＴ＝７６．４０８に示す。

図５の右側に示すＳＥＣのピークの表は以下の通りである。

３．７． 未変性、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
４〜２０％ トリスグリシンゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。試料を還元性または非還元性バッファーで希釈し、５．０μｇのタンパク質を各ウェルに添加した。ゲルをトリスグリシンバッファー系で泳動し、クマシーブルーで染色した。抗ＰＳＡ抗体を使用して、ウェスタンブロッティングを行った（図４）。図４は、ＧＣＳＦ製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（部位特異的；Ｎ末端）を示す。未変性ＰＡＧＥを１０％トリスグリシンゲルで行った（図７）。

３．８． インビトロ活性
ＧＣＳＦ、ＰＳＡ、およびＰＥＧ複合体を含むＭＮＦＳ ６０細胞でインビトロ試験を行った。ＥＣ５０値を測定し、様々なＧＣＳＦ製剤について比較した（図９）。

３．９． 安定性試験
無菌ＧＣＳＦ複合体を、４℃で２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４；５％ソルビトール、および０．０２５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０中に６週間貯蔵した。ＳＥＣカラムを使用して、試料のＳＥ−ＨＰＬＣを次の条件下で毎週行った：注入量１００μｌ、流量０．２５０ｍｌ／分、泳動バッファー０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．９（図１０）。

３．１０． ＧＣＳＦ製剤のインビボ有効性
７〜８週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１雌マウスにおいて、ＧＣＳＦ製剤のインビボ有効性を試験し、５〜１５μｇのタンパク質用量（同じ活性）をマウスに皮下注射した。動物を４匹の７群に分けた。ＧＣＳＦ製剤を、各群の各マウスに次の方式で投与した；ＧＣＳＦ（５μｇ）、ＧＣＳＦ（１５μｇ）、ＧＣＳＦ−ＰＳＡ複合体（５〜１５μｇ）、ＰＢＳ、ＧＣＳＦ−ＰＥＧ２０（ＮｅｕｌａｓｔａＲ；５μｇ）。５０μｌの血液を各マウスから採取し、ＷＢＣに特異的な抗体で染色した後ＦＡＣＳによって分析した（図１１および１２）。
結果
ＣＡの活性化および酸化度の定量
Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の線状α−２，８−結合ホモポリマーであるコロミン酸（ＣＡ）を使用した。室温で２０ｍＭ 過ヨウ素酸塩を使用して、コロミン酸を１５分間酸化にかけた。過ヨウ素酸塩処置後の内部α−２，８結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基の完全性をゲル浸透クロマトグラフィーによって分析し、酸化（ＣＡＯ）材料について得られたクロマトグラフを非酸化（ｎａｔｉｖｅ）ＣＡのクロマトグラフと比較した。酸化および非酸化（ｎａｔｉｖｅ）ＣＡはほぼ同一の溶離プロファイルを示すことが明らかになり、連続的酸化ステップがポリマー鎖の顕著な断片化を起こすという証拠はない。

ＣＡの酸化状態の定量測定は、グルコースを標準物質として使用して、アルカリ性溶液中フェリシアン化物イオンのフェロシアン化物（プルシアンブルー）への還元によって行われた［ＰａｒｋおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９４９年］。表２は、酸化させたコロミン酸が、化学量論（＞１００％）量の還元剤より高い、すなわち還元性末端ヘミケタールおよび導入されたアルデヒド（他端、還元性末端）を合わせた還元力を含む１１２ｍｏｌ％の見かけのアルデヒド含有量を有することがわかったことを明らかにする。

表２：グルコースを標準物質として使用する二重酸化反応スキームにおける様々なコロミン酸中間体の酸化度（１００％、アルデヒド１モル／グルコース１モル；ｎ＝３±標準偏差）。
ＧＣＳＦ複合体の調製、精製、およびキャラクタリゼーション
低減したｐＨ（ｐＨ ５．５）および４±１℃で反応を実施することによって、Ｎ末端選択的方式で顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のコロミン酸（ＣＡ）複合体を調製および精製する手順は、上記に詳述する。これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下での複合体化、続いてイオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を使用して遊離ＧＣＳＦを除去する精製、続いて疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるＣＡの除去を含む。Ｎ末端のαアミノ基の選択的誘導体化を促進し、また反応中のＧＣＳＦの凝集を最小限に抑えるためにも、低いｐＨを使用した。最終反応バッファーの組成は、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中５％ソルビトール、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐＨ ５．５）であった。

ＧＣＳＦ−ＣＡ複合体の形成および安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ（ＧＣＳＦに比べてＧＣＳＦ−ＰＳＡの保持時間の変化；また両方の部分の共溶離）；イオン交換クロマトグラフィー（複合体のＡＥＣカラムへの結合）、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；高分子量種および未変性ｐａｇｅのバンドのシフト）によって確認した。インビトロ細胞系アッセイで使用する複合体（ＭＮＦＳ−６０細胞）は、未変性タンパク質と比較して約４０％活性であった。製剤添加剤なしで調製した複合体は、誘導体化が不十分でタンパク質の凝集を招いた。図５は、Ｔｗｅｅｎ ２０の存在下で調製された、２４時間後のＧＣＳＦ−ＣＡ ３９ｋＤａ反応混合物のＳＥ−ＨＰＬＣデータを示す。キャラクタリゼーションの条件は、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、バッファー：重炭酸アンモニウム０．１５Ｍ、ｐＨ ７．８であった。ＧＣＳＦ−ＰＥＧ複合体の形成をＳＥ−ＨＰＬＣによって確認した（図１３）。ＧＣＳＦおよびＰＳＡ−ＧＣＳＦ複合体を、金属アフィニティークロマトグラフィーによってＰＳＡおよび反応混合物の副生物から精製することに成功した（図８）。ＧＣＳＦ複合体は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．４）中に６週間貯蔵した後でも安定であることがわかった（図１０）。

表３は図５のピーク分析を示す。

表４は使用した様々なパラメータの値を示し、表５はＣＡ画分の分子量および多分散度を示す。

ＰＳＡ複合体は、インビトロ活性アッセイで活性であることがわかった（図９）。インビボ有効性試験によって、ＰＳＡ−ＧＣＳＦ複合体は、ＰＥＧ複合体と同様に良好であり、ＧＣＳＦよりも大いに優れていることが明らかである（図１１および１２）。
参考文献

Claims (28)

1. ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のＮ末端多糖誘導体である化合物であって、多糖はアニオン性であり、２〜２００個の糖ユニットを含む化合物。
2. 多糖が、ポリシアル酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、またはコンドロイチン硫酸から選択される、請求項１に記載の化合物。
3. 多糖が、ポリシアル酸であり、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなるポリシアル酸である、請求項２に記載の化合物。
4. ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質が、多糖の還元性末端ユニットにおける多糖によって誘導体化される、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
5. 一般式（Ｉ）の化合物：
   

   

   ［式中、ｍは少なくとも１であり；
   ＸＢは、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質であるＢ−ＸＨに由来し、ここでＸＨはＮＨ_２またはＳＨであり；
   Ｌは、結合、連結基であり、またはポリペプチドもしくは合成オリゴマーを含み；
   ＧｌｙＯは、アニオン性糖ユニットであり；
   ただし、連結基が存在する場合それは、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ^１−Ｃ（Ｏ）−を有するものであり；
   ここで、ＹはＮＲ^２またはＮＲ^２−ＮＲ^２であり；Ｒ^１は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン、およびアルキルヘテロアリーレンからなる群から選択された二官能性有機基であって、そのいずれも、カルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド、および／またはアミン結合で置換および／または介在されていてもよく；
   Ｒ^２はＨまたはＣ_１〜６アルキルである］。
6. Ｌが、結合または下記の基である、請求項５に記載の化合物。
   

   
7. ＸＨがＮＨ_２であり、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のＮ末端アミンである、請求項５または６に記載の化合物。
8. ＸＨがＮＨ_２であり、リシンアミノ酸側鎖のアミン基である、請求項５または６に記載の化合物。
9. ８０〜１８０個のシアル酸ユニットを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
11. 治療で使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物。
12. ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質の多糖誘導体を製造する方法であって、２〜２００個の糖ユニットを含むアニオン性多糖はＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質と化学的に反応する方法。
13. アニオン性多糖が、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質と反応する反応性アルデヒド基を有し、誘導体化反応が還元性条件下で実施される、請求項１２に記載の方法。
14. 反応性アルデヒド基が、多糖の非還元性末端に存在する、請求項１３に記載の方法。
15. 反応性アルデヒドが多糖の還元性末端に存在し、非還元性末端がＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質と反応しないように不動態化されている、請求項１３に記載の方法。
16. 多糖がＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のアミン基と反応する、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. アミンが末端アミン基である、請求項１６に記載の方法。
18. アミンがＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質のリシンアミノ酸側鎖に由来する、請求項１６に記載の方法。
19. アニオン性多糖が、予備反応ステップでアミンに変換され、次いでＮ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドから選択された少なくとも１つの官能基を含む二官能性試薬と反応して反応中間体を形成する反応性アルデヒド基を有し、反応中間体がＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質と反応する、請求項１２に記載の方法。
20. アニオン性多糖または反応中間体が、酸性のｐＨの第１の水溶液中でＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ様タンパク質の末端アミン基と反応し、得られた多糖誘導体が、第１の水溶液より高いｐＨの第２の水溶液中で精製される、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 第１の水溶液のｐＨが４．０〜６．０の範囲であり、第２の水溶液のｐＨが６．５〜８．５の範囲である、請求項２０に記載の方法。
22. 製剤添加剤の存在下で実施される、請求項１２から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 製剤添加剤が、１つまたは複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール、またはアミノ酸から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 製剤添加剤が、ソルビトール、トレハロース、またはスクロースである、請求項２３に記載の方法。
25. 製剤添加剤が非イオン性界面活性剤である、請求項２３に記載の方法。
26. 製剤添加剤が、ＰＳＡ、ＰＥＧ、またはヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されたポリマーである、請求項２３に記載の方法。
27. 製剤添加剤が２価の金属イオン、好ましくは Ｚｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、またはＦｅ^２＋である、請求項２０または２１に記載の方法。
28. 製剤添加剤がバッファーであり、バッファーがリン酸ナトリウム／酢酸ナトリウムである、請求項２３に記載の方法。

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