KR20120095463A

KR20120095463A - 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법 및 이의 변형 방법

Info

Publication number: KR20120095463A
Application number: KR1020127017887A
Authority: KR
Inventors: 라도반 부파; 소피앤 케토우; 루시 포스피실로바; 앤젤레스 글로리아 후에트라; 드라호미라 취라드코바; 블라드미르 벨레브니
Original assignee: 콘티프로 파마 에이.에스.
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2012-08-28
Also published as: CZ302503B6; DK2510016T3; US9434791B2; PL2510016T3; CZ2009835A3; HUE031497T2; BR112012013955A2; KR101766693B1; WO2011069475A2; US20120264913A1; BR112012013955B1; RU2559447C2; EP2510016A2; JP2013513672A; JP5886754B2; EP2510016B1; RU2012125154A; WO2011069475A3

Abstract

본 발명은 다당류 글루코사민 모이어티의 6번 위치에 알데하이드를 가진 히알루로난 유도체의 새로운 제조 방법에 관한 것이다. 히알루론산의 산화는 유기 염의 존재하에 또는 유기 염의 부재 하에 양성자성 환경에서 TEMPO/NaClO 또는 TEMPO/TCC를 이용하여 수행할 수 있다. 이렇게 제조되는 알데하이드는, 예컨대 수중 또는 수-유기 용매 시스템 중에서 NaBH₃CN을 이용한 환원성 아민화에 의해, 아민, 디아민, 아미노산, 펩타이드 또는 아민기를 포함하는 화합물과의 결합에 사용할 수 있다. 디아민 또는 3 이상의 아미노기를 포함하는 화합물을 사용하는 경우, 가교된 히알루로난 유도체를 제조할 수 있다. 또한, 가교된 유도체는 알데하이드를 아미노-알킬기 HA-알킬-NH₂로 치환된 히알루로난과 반응시켜 제조할 수 있다.

Description

히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법 및 이의 변형 방법{A METHOD OF PREPARATION OF AN OXIDIZED DERIVATIVE OF HYALURONIC ACID AND A METHOD OF MODIFICATION THEREOF}

본 발명은, 1차 하이드록시기 -CH₂-OH 대신 알데하이드기 -CH=O를 포함하는 히알루론산 유도체의 새로운 제조 방법에 관한 것이다. 산화는 4-치환된-TEMPO (2,2,6,6-테트라라메틸-피페리디닐옥실) / 공-산화제(co-oxidant) 시스템을 사용하여 양성자성 용매 중에서 수행할 수 있다:

TEMPO

상기 식에서, R은 수소 또는 임의의 치환기이고, 공-산화제는 소듐 하이포클로라이트(NaClO) 또는 트리클로로이소시아누린산 (TCC)이다.

히알루론산은 β-(1,3)-D-글루쿠론산과 β-(1,4)-N-아세틸-D-글루코사민으로 이루어진 2개의 단위가 반복된 주요 다당류이다. 분자량은, 분리 방법과 공급 원료에 따라 달라지며, 5.10⁴- 5.10⁶ g.mol^-1의 범위이다. 히알루론산 또는 이의 소듐염 히알루로난은 결합 조직, 관절 활액의 필수 구성 성분이며, 수화, 프로테오글리칸의 조직화, 세포 분화, 증식 및 혈관신생 등의 생물학적 과정에 중요한 역할을 수행한다. 히알루론산은 친수성이 상당히 높은 다당류이며, pH 전 범위에서 염 형태로 물에 용해된다.

반응도 1 히알루론산

히알루론산의 산화

다당류의 산화는 다당류 작용기의 산화도가 바뀌는 과정이다. 거의 대부분, 카르복시산 또는 알데하이드가 형성되어, 다당류의 특성이 급격하게 달라질 수 있다. 대부분의 경우, 반응은 산화도가 더 큰 원자를 포함하는 물질을 이용하여 이루어진다.

다당류의 1차 하이드록시기에서의 선택적인 산화 방법은 Angelino, European Journal of Organic Chemistry 2006, 19, 4323 - 4326에 기술되어 있으며, DMF 중의 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 라디컬 TEMPO / TCC 시스템을 0℃에서 사용하며, 주요 산물은 대응하는 알데하이드이다.

TEMPO는 3가지의 레독스 형태로 반응에 존재할 수 있는 비교적 안정적인 라디컬이다. TEMPO의 산화된 형태만 알코올 또는 제미널 디올(geminal diol) 산화에 유용하다.

TEMPO는 촉매량으로 반응에 첨가되며, 그래서 TEMPO의 산화된 형태를 복원시키는 공-산화제가 반드시 사용된다.

히알루로난의 1차 하이드록시기의, 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥실 라디칼 (TEMPO)- 및 NaOCl-매개 카르복시산으로의 산화는 pH 10.2 및 0℃에서 이루어진다 (반응도 2) (Carbohydr Res 2000, 327 (4), 455-61).

반응도2 카르복시산으로의 산화

다른 다당류들과 유사하게, 폴리머의 높은 위치 선택성(regioselectivity)과 약간의 분해도 관찰되었다. 용액내 염 (NaBr, NaCl, Na₂SO₄) 농도를 증가시키면 산화율은 감소된다.

TEMPO/NaClO 시스템을 이용한 히알루로난의 산화는 특허 출원 WO 02/18448 A2에서 개시되었다. 또한, 저자는, 동시에 생물학적 복합체를 형성하는, 과카르복시화된 다당류들의 상호작용에 대해서도 다루었다.

소듐 페리오데이트의 사용시 HA 및 그외 다당류의 산화율에 대해서 Scott 등에 의해 연구가 이루어졌다 (반응도 3) (Histochemie 1969, 19 (2), 155-61).

반응도 3 디알데하이드로의 산화

체인의 길이, 치환, 폴리머 구성 및 온도 등의 인자들에 대한 연구들이 이루어졌고, 수치화되었다. 히알루로난의 산화에 NaIO₄를 사용하는 방법도 미국 특허 6,683,064 및 6,953,784에 기술되어 있다.

생리학적 완충액내에서 저분자량의 HA 유사체들에 대한 반응 모델들이 연구되었다 (Carbohydr Res 1999, 321, (3-4), 228-34). 글루쿠론 모이어티와 글루코사민 모이어티의 산화 산물을 GC-MS 분석으로 동정하였다. 그 결과, 산화는 주로 글루쿠론 모이어티에서 이루어지며, 메조-타르타르산이 주된 산물이며, 이것은 히알루로난 산화의 바이오마커로서 사용될 수 있다.

가교 반응에 있어서 산화된 HA의 사용

Weng 등은 가교된 하이드로겔의 제조에 산화된 HA를 사용하는 방법을 개시하였다 (반응도 4) (J Biomed Mater Res A 2008, 85 (2), 352-65). 이 경우 2가지 전구체들이 사용되었다: 부분 산화된 히알루로난 및 젤라틴:

반응도 4 산화된 히알루로난과 젤라틴의 가교 반응

제조된 히알루론산의 물리-화학적 특징들은 장치를 이용한 분석 FT-IR, SEM (주사 전자 현미경) 및 유동 측정(rheometry)에 의해 도출한다. 히알루로난의 산화도가 증가하면 그에 따라 하이드로겔 상용성은 커지고 물 흡수력은 줄어들게 된다. 세포와 하이드로겔 간의 상호작용 연구에 피부 섬유모세포가 사용되었다. 하이드로겔과 이의 분해 산물 모두, 장기간의 세포 생존성 분석에 의해 확인된 바와 같이, 생체에 적합하였다. 세포와 배양하였을 때, 하이드로겔은 4주 이내에 분해되고, 점착성(cohesiveness)이 확실하게 소실되었다. 양호한 생체적합성 및 생분해성은 또한 마우스 진피하 이식에서도 입증되었다. 최근에는, 하이드로겔내에 세포외 기질의 시험관내 및 생체내 축적(deposition)이 SEM 분석을 통해 확인되었다.

산화된 히알루로난과 젤라틴으로부터 유중수 에멀젼 방법에 의해, 3차원 하이드로겔을 임의의 외부 가교제를 사용하지 않고 만드는, 가교된 HA의 제조 방법이 Weng et al., Biomaterials 2008, 29, (31), 4149-56의 문헌을 통해 개시되었다. 이 방법에서, 하이드로겔 구조내로의 모델 약물의 병합(캡슐화)과 대식세포를 통한 방출이 HPLC를 통해 연구되었다.

소듐 페리오데이트를 사용하여 HA-알데하이드로 산화시킨 HA와, 아디프산 디하이드라자이드를 사용하여 변형시킨 HA를 결합시켜, 탄성 하이드로겔을 제조하는 방법이 Sahiner 등에 의해 개시되었다(반응도 5), J. Biomater. Sci. Polym. Ed 2008, 19 (2), 223-43.

반응도 5 가교된 히알루로난의 제조

제조되는 유사체는 MTT 분석에 의해 입증된 바와 같이 배양된 섬유모세포의 증식에 임의의 관찰가능한 효과를 나타내지 않았다.

본 발명은 다당류 글루코사민 모이어티의 6번 위치에서 히알루론산의 1차 하이드록시기를 알데하이드로 선택적으로 산화시키는 방법의 개선에 관한 것이다. 새로운 반응은 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐올실 라디컬 TEMPO/공-산화제 시스템을 이용하여 이루어진다. 지금까지 공개된 방법은, 사카라이드 고리를 개환하면서 히알루로난 글루쿠론 모이어티의 2번 및 3번 위치에 알데하이드기를 도입하는 방법 (반응도 6, 구조 2), 또는 히알루로난 글루코사민 모이어티의 6번 위치에 카르복시기를 도입하는 방법 (반응도 6, 구조 1)이다.

반응도 6 히알루로난 산화, 반응 산물

본 발명에 따른 방법은, 각 산화 산물 (구조 3, 반응도 6)이 접합된 사카라이드 고리 구조를 유지하는 것이, 보다 유익하다. 디알데하이드로 산화된 산물(구조 2, 반응도 6)이 개환되면, 체인 선형성(linearity)이 "파괴(breakage)"되고, 따라서 비-변형된 히알루로난과 비교하여 다당류의 3차원 구조에 현저한 변화가 야기된다. 카르복시산으로 산화시킨 산물 (구조 1, 반응도 6)에서는, 체인 선형성 "파괴"는 발생되지 않지만, 카르복시기는 알데하이드기와 같이 이러한 다양한 변형 (결합) 가능성을 실현시킬 수 없다. 카르복시기는 이미 비변형된 다당류의 구성 성분이기 때문에, 구조 1을 산화시키면 (반응도 6) 단순히 다당류 극성만 증가될 뿐 새로운 치환 형성에 이용가능한 새로운 종의 개발은 이루어지지 않는다.

알킬기가 결합된 알데하이드기는 수중에 이른바 제미널 디올 형태 HA-CH(OH)₂로 존재하며, 이것은 알데하이드의 거동과 유사하게 친핵기와 반응하는 것으로 알려져 있다. 수용액 중에서, 글루코사민 모이어티의 6번 위치에서 산화된 히알루로난(산물 3, 반응도 6)의 95% 이상은, NMR 스펙트로스코피로 확인된 바와 같이 제미널 디올 형태로 존재한다.

본 발명에 따른 방법에서, 히알루론산을 물에 용해시킨 다음, 산화제를 첨가하고, 혼합물을 -10 내지 20℃에서, 바람직하게는 0℃에서, 1 내지 150 시간 동안, 바람직하게는 24시간 동안 교반한다.

제조되는 산화된 히알루로난은 예컨대 아미노기를 포함하는 화합물과의 결합에 사용할 수 있다. 상기 결합은 이민 형태로 달성하거나 또는 환원 후 아민 형태(환원성 아민화)로 달성할 수 있다(반응도 7).

반응도 7 산화된 히알루로난에 아민의 결합

이러한 2가지 산화도(degree) 변형은 수용액 중에서 수행되며, 환원은 NaBH₃CN를 이용하여 이루어진다. 반응도 7에 기술된 산화도(degree) 반응은 한단계로 수행할 수 있다.

히알루론산 유도체의 변형은, 산화된 유도체를 일반식 H₂N-R의 아민, 또는 -R-NH₂ 기로 치환된 히알루로난과 반응시켜 수행할 수 있으며, 이때 R은 방향족 또는 헤테로방향족기를 선택적으로 포함하는, 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C₁ - C₃₀이다. 상기 아민은 알킬아민, 예컨대 부틸아민 또는 헥산디아민, 아미노산, 펩타이드 또는 유리 아미노기를 포함하는 다당류일 수 있다. 3개 이상의 아미노기를 포함하는 화합물 또는 디아민을 이용하는 경우, 가교된 히알루로난 유도체를 제조할 수 있다. 상기 가교된 유도체는, 또한 알데하이드를 아미노알킬기 HA-알킬-NH₂로 치환시킨 히알루로난과 반응시켜 제조할 수도 있다.

DS = 치환도 = 100% * 결합된 기질의 몰량 / 모든 다당류 이량체의 몰량.

용어 "당량(equivalent, eq)"은 본원에서 다르게 언급되지 않은 한 히알루론산 이량체에 대해 참조된다. 본원에서 사용되는 퍼센트는 달리 언급되지 않은 한 중량%이다.

출발 물질 히알루로난(소스: CPN spol. s r.o., Dolni Dobrouc, CZ)의 분자량은 SEC-MALLS 분석으로 측정하였다.

실시예 1 TEMPO/NaClO 시스템에 의한 히알루론산의 산화

NaClO (0.5 eq) 수용액을 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa) (NaCl 10 중량% 함유), TEMPO (0.01 eq) 및 NaHCO₃ (30 eq)에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 -5℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 증류수를 첨가하여 0.2%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 10　% (NMR로 측정)

¹H NMR (D₂O) δ 5.26 ( s, 1H, 폴리머-CH(OH)₂)

HSQC (D₂O)크로스 신호 5.26　ppm　(¹H) - 90　ppm　(¹³C) (폴리머-CH(OH)₂)

FT-IR (KBr) 1740　cm^-1 -CH=O

실시예 2 TEMPO/NaClO 시스템에 의한 히알루론산의 산화

NaClO (0.5 eq) 수용액을 히알루로난 수용액 (0.5%) (0.1g, 2000　kDa) (NaCl 10 중량% 함유), TEMPO (0.01 eq) 및 NaHCO₃ (30 eq)에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 -5℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 증류수를 첨가하여 0.2%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 10　% (NMR로 결정, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 3 TEMPO/NaClO 시스템에 의한 히알루론산의 산화

NaClO (0.5 eq) 수용액을 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa) (NaCl 10 중량% 함유), 4-아세트아미도-TEMPO (0.01 eq) 및 NaHCO₃ (30 eq)에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 -5℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 증류수를 첨가하여 0.2%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 10　% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 4 TEMPO/NaClO 시스템에 의한 히알루론산의 산화

NaClO (0.5 eq) 수용액을 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa) (NaCl 10 중량% 함유), 4-아세트아미도-TEMPO (0.05 eq) 및 NaHCO₃ (30 eq)에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 -10℃에서 10시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 증류수를 첨가하여 0.2%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 10　% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 5 TEMPO/NaClO 시스템에 의한 히알루론산의 산화

NaClO (0.3 eq) 수용액을 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa), 4-아세트아미도-TEMPO (0.1 eq) 및 NaHCO₃ (30 eq)에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 20℃에서 1시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 증류수를 첨가하여 0.2%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 5　% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 6 TEMPO/TCC 시스템에 의한 히알루론산의 산화

4-아세트아미도-TEMPO (0.01 eq)와 TCC (0.2 eq)를 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa)에 N,N-디메틸포름아미드/물 70/30의 혼합물 중에서 첨가하였다. 이 혼합물을 -5℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.1%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 5　% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 7 TEMPO/TCC 시스템에 의한 히알루론산의 산화

4-아세트아미도-TEMPO (0.01 eq)와 TCC (0.2 eq)를 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa)에 N,N-디메틸포름아미드/물 90/10의 혼합물 중에서 첨가하였다. 이 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 0.1%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 10% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 8. TEMPO/TCC 시스템에 의한 히알루론산의 산화

4-아세트아미도-TEMPO (0.01 eq)와 TCC (0.1 eq)를 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa)에 N,N-디메틸포름아미드/물 40/60의 혼합물 중에서 첨가하였다. 이 혼합물을 -5℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.1%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 15% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 9. TEMPO/TCC 시스템에 의한 히알루론산의 산화

4-아세트아미도-TEMPO (0.01 eq)와 TCC (1 eq)를 히알루로난 수용액 (0.5%) (0.1g, 2000　kDa)에 N,N-디메틸포름아미드/물 40/60의 혼합물 중에서 첨가하였다. 이 혼합물을 -5℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.1%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 15% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 10. TEMPO/TCC 시스템에 의한 히알루론산의 산화

TEMPO (0.01 eq)와 TCC (0.2 eq)를 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa)에 N,N-디메틸포름아미드/물 70/30의 혼합물 중에서 첨가하였다. 이 혼합물을 20℃에서 1시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.1%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 5% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 11 TEMPO/TCC 시스템에 의한 히알루론산의 산화

TEMPO (0.01 eq)와 TCC (0.2 eq)를 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa)에 DMF/물 70/30의 혼합물 중에서 첨가하였다. 이 혼합물을 -5℃에서 100시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.1%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 5% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 12 TEMPO/NaBrO 시스템에 의한 히알루론산의 산화

NaClO (0.5 eq) 수용액을 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 20　kDa) (NaBr 5 중량% 함유), 4-아세트아미도-TEMPO (0.5 eq) 및 NaHCO₃ (30 eq)에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 증류수를 첨가하여 0.2%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 14% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 13 TEMPO/NaClO 시스템에 의한 히알루론산의 산화

NaClO (0.5 eq) 수용액을 히알루로난 수용액 (1%) (0.1g, 200　kDa) (NaBr 10 중량% 함유), TEMPO (0.5 eq) 및 NaHCO₃ (5 eq)에 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 증류수를 첨가하여 0.2%로 희석하고, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 18% (NMR로 측정함, 상세 내용은 실시예 1 참조)

실시예 14 산화된 히알루로난과 아민의 반응

부틸아민 (0.4　eq)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1 g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 이 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액에 2배량의 아세톤과 0.1 ml의 NaCl 포화 수용액을 첨가하여 석출시킨 다음, 여과하고, 진공에서 건조하였다. 제조되는 노란 물질을 분석하였다.

UV-VIS 328nm, n->π* 전이 -CH=N-

실시예 15. 산화된 히알루로난과 부틸아민의 반응 및 이후 환원 반응

부틸아민 (0.4　eq)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1 g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 수 0.5 ml 중에서 NaBH₃CN(3 eq)과 혼합하였다. 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.1% 희석한 다음, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 15　% (NMR로 측정함)

¹H NMR (D₂O) δ 3.05 (m, 2H, 폴리머-CH₂-NH-CH ₂-), 1.60 (m, 2H, 폴리머-CH₂--NH-CH₂-CH ₂-), 1.35 (m, 2H, 폴리머-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH ₂-), 0.85 (m, 3H, -CH₂-CH ₃)

DOSY NMR (D₂O) logD (0.85ppm, -CH₂-CH ₃) ~ -10.3 m²/s

logD (1.35ppm, 폴리머-CH₂-NH-CH₂-CH₂-CH ₂-) ~ -10.3 m²/s

logD (1.60ppm, 폴리머-CH₂-NH-CH₂-CH ₂-) ~ -10.3 m²/s

logD (3.05ppm, 폴리머-CH₂-NH-CH ₂-) ~ -10.3 m²/s

logD (2.03ppm, CH ₃-CO-NH-polymer) ~ -10.3 m²/s

logD (H ₂O) ~ -8.6 m²/s

실시예 16 산화된 히알루로난과 디아민의 반응 및 후속적인 환원

헥산디아민 (0.4　eq)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1 g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 수 0.5 ml 중에서 NaBH₃CN(3 eq)과 혼합하였다. 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.1%로 희석한 다음, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 16　% (NMR로 측정함)

¹H NMR (D₂O) δ 3.12 (m, 2H, 폴리머-CH₂-NH-CH ₂-), 3.02 (m, 2H, -CH ₂-NH₂), 1.7 (m, 4H, -NH-CH₂-CH ₂-CH₂-CH₂-CH ₂-), 1.45 (m, 4H, -NH-CH₂--CH₂-CH ₂-CH ₂-CH₂-)

DOSY NMR (D₂O) logD (1.45ppm, -NH-CH₂-CH₂-CH ₂-CH ₂-CH₂-) ~ -10.5 m²/s

logD (1.7ppm, -NH-CH₂-CH ₂-CH₂-CH₂-CH ₂-) ~ -10.5 m²/s

logD (3.02ppm, -CH ₂-NH₂) ~ -10.5 m²/s

logD (2.03ppm, CH ₃-CO-NH-polymer) ~ -10.5 m²/s

logD (H ₂O) ~ -8.7 m²/s

실시예 17 산화된 히알루로난과 아민-히알루로난의 반응

헥산디아민으로 치환된 히알루로난 유도체 1% 수용액 (1　eq, DS=16　%, 실시예 16)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1 g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 20℃에서 첨가하였다. 수분 후 수득되는 제조되는 불용성의 점착성 고형 석출물을 작은 단편으로 기계를 사용하여 분쇄한 다음, 여과하고, 감압 건조하였다.

FT-IR (KBr) 1700　cm^-1

실시예 18 산화된 히알루로난과 라이신의 환원성 아민화

라이신 (0.3　eq)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1　g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.5 ml 수중에서 NaBH₃CN (3　eq)과 혼합하였다. 이 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 이 용액을 0.1%로 희석한 다음, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 14　% (NMR로 측정함)

¹H, HSQC, DOSY NMR (2% NaOD/D₂O): δ 1.33 (m, 2H, -CH-CH₂-CH ₂-), 1.48 (m, 2H, -CH-CH₂-CH₂-CH ₂-), 1.55 (m, 1H, -CH-CHH-), 1.63 (m, 1H, -CH--CHH-), 2.62 (m, 2H, -CH-CH₂-CH₂-CH₂-CH ₂-), 2.65 (m, 1H, 폴리머-CHH-NH-), 2.99 (m, 1H, 폴리머-CHH-NH-), 3.16 (m, 1H, -CH-CH₂-).

실시예 19 산화된 히알루로난과 라이신의 환원성 아민화

라이신 (20　eq)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1　g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.5 ml 수중에서 NaBH₃CN (10　eq)과 혼합하였다. 이 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 이 용액을 0.1%로 희석한 다음, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 17　% (NMR로 측정함, 실시예 10)

실시예 20 산화된 히알루로난과 세린의 환원성 아민화

세린 (0.3　eq)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1　g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 1분 동안 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.5 ml 수중에서 NaBH₃CN (3　eq)과 혼합하였다. 이 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 이 용액을 0.1%로 희석한 다음, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 14　% (NMR로 측정함)

¹H, HSQC, DOSY NMR (2% NaOD/D₂O): δ 2.74 (m, 1H, 폴리머-CHH-NH-), 3.08 (m, 1H, 폴리머-CHH-NH-), 3.21 (m, 1H, -CH-CH₂-OH), 3.72 (m, 1H, -CH-CHH-OH), 3.78 (m, 1H, -CH-CHH-OH).

실시예 21 산화된 히알루로난과 아르기닌의 환원성 아민화

아르기닌 (0.3　eq)을 산화된 히알루론산 수용액 (1%) (0.1　g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 100시간 동안 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.5 ml 수중에서 NaBH₃CN (3　eq)과 혼합하였다. 이 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 이 용액을 0.1%로 희석한 다음, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 11　% (NMR로 측정함)

¹H, HSQC, DOSY NMR (2% NaOD/D₂O): δ 1.61 (m, 2H, -CH-CH₂-CH ₂-), 1.63 (m, 1H, -CH-CHH-), 1.70 (m, 1H, -CH-CHH-), 2.65 (m, 1H, 폴리머-CHH-NH-), 3.01 (m, 1H, 폴리머-CHH-NH-), 3.13 (m, 1H, -CH-CH₂-), 3.21 (m, 2H, -CH-CH₂-CH₂-CH ₂-).

실시예 22 산화된 히알루로난과 펜타펩타이다드 PAL-KTTKS (팔미토일-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)의 환원성 아민화

이소프로필 알코올 중의 치환된 펜타펩타이드 PAL-KTTKS (0.05　eq) 1% 용액을, 물/이소프로판올 2/1 시스템 중의 산화된 히알루론산 용액(1%) (0.1 g, 산화도 DS=18　%, 실시예 13)에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 그런 후, 용액을 0.5 ml 수중에서 NaBH₃CN (3　eq)과 혼합하였다. 이 혼합물을 20℃에서 24시간 교반하였다. 이 용액을 0.1%로 희석한 다음, 혼합물 (0.1% NaCl, 0.1% NaHCO₃)에 대해 3 x 5　L (1회/일)로 투석하고, 물에 대해 7 x 5　L (2회/일)로 투석하였다. 제조되는 용액을 증발시키고, 분석하였다.

DS 9　% (NMR로 측정함)

¹H, HSQC, DOSY NMR (2%　NaOD/D₂O): δ 1.61 (m, 2H, -CH-CH₂-CH ₂-), 1.63 (m, 1H, -CH-CHH-), 1.70 (m, 1H, -CH-CHH-), 2.65 (m, 1H, 폴리머-CHH--NH-), 3.01 (m, 1H, 폴리머-CHH-NH-), 3.13 (m, 1H, -CH-CH₂-), 3.21 (m, 2H, -CH-CH₂-CH₂-CH ₂-).

Claims

히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법으로서,
히알루론산을 양성자성 용매 중에서 4-R-TEMPO 및 공-산화제(co-oxidant)와 반응시키는 단계를 포함하며,
상기 R은, 선택적으로 방향족 또는 헤테로방향족기를 포함하는, 원자수 1 - 50의 직쇄 또는 분지쇄인 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 공-산화제는 소듐 하이포클로라이트 또는 TCC(트리클로로이소시아누린산)를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히알루론산은 유리형 산 또는 염의 형태인 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 히알루론산의 분자량은 1.10⁴ 내지 5.10⁶ g.mol^-1의 범위인 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서,
상기 양성자성 용매는 물과 일반식 MX의 수성 염 용액을 포함하며,
M은 알칼리 금속이며,
X는 HCO₃ ^-, CO₃ ^2-, PO₄ ^3-, HPO₄ ^2-, H₂PO₄ ^- 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 수성 염 용액의 농도는 0 내지 15 중량%인 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 히알루론산, 4-R-TEMPO 및 공-산화제의 반응은, -10 내지 20℃, 바람직하게는 0℃에서, 5분 내지 24시간 동안, 바람직하게는 10시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 4-R-TEMPO는 히알루로난 이량체에 대해 0.005 내지 0.5 당량의 범위의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 공-산화제는 히알루로난 이량체에 대해 0.05 내지 1 당량의 범위의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 용매는 물 또는 물 함량이 30 %(v/v) 이상인, 물과 DMF와 같은 비양성자성 용매의 혼합물인 것을 특징으로 하는 히알루론산의 산화된 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 따라 제조되는 히알루론산 유도체의 변형 방법으로서,
상기 산화된 히알루론산 유도체를 일반식 H₂N-R의 아민 또는 -R-NH₂ 기로 치환된 히알루로난과 반응시키는 것을 포함하며,
상기 R은 선택적으로 방향족 또는 헤테로방향족 기를 포함하는 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C₁ - C₃₀인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제11항에 있어서, 상기 산화된 히알루론산 유도체를 아미노산과 반응시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제11항에 있어서, 상기 산화된 히알루론산 유도체를 펩타이드와 반응시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제11항에 있어서, 상기 산화된 히알루론산 유도체를 유리 아미노기를 포함하는 다당류와 반응시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 다당류의 양은 히알루로난 이량체에 대해 0.05 내지 10 당량의 범위인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제11항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 산화된 히알루론산 유도체와, 상기 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 다당류의 반응은, 수중에서 또는 수-유기 용매 시스템 중에서, 0 내지 80℃, 바람직하게는 20℃에서, 1분 내지 24시간 동안, 바람직하게는 1시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제16항에 있어서,
상기 산화된 히알루론산 유도체와 상기 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 다당류의 반응은 환원제로서 NaBH₃CN의 존재 하에 수행되며,
상기 NaBH₃CN은 상기 아민, 아미노산, 펩타이드 또는 다당류의 첨가 후 0 내지 100시간 이내에 상기 반응물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제17항에 있어서, 상기 환원제로서의 NaBH₃CN의 양은 알데하이드 또는 제미널 디올의 몰량에 대해 0 내지 20몰 당량의 범위인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 유기 용매는 수-혼화성 알코올, 특히 이소프로판올 또는 에탄올, 및 수-혼화성 극성 비양성자성 용매, 특히 디메틸설폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서, 상기 물의 양은 전체 용액의 부피에 대해 50% (v/v) 이상인 것을 특징으로 하는 히알루론산 유도체의 변형 방법.