JP6063103B1 - グリコサミノグリカンの硫酸化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
GAG:グリコサミノグリカン
HexN:ヘキソサミン
HexNAc:N−アセチルヘキソサミン
GalN:ガラクトサミン
GalNAc:N−アセチルガラクトサミン
GlcN:グルコサミン
GlcNAc:N−アセチルグルコサミン
GlcNS:N−スルホグルコサミン
HexA:へキスロン酸
GlcA:グルクロン酸
IdoA:イズロン酸
ΔHexA:不飽和ヘキスロン酸
CS:コンドロイチン硫酸
DS:デルマタン硫酸
CH:コンドロイチン
dCH:脱硫酸化コンドロイチン硫酸
HA:ヒアルロン酸
HPN:ヘパロサン
NAH:N−アセチルヘパロサン
HS:ヘパラン硫酸
HEP:ヘパリン
dHEP:脱硫酸化ヘパリン
AS:アカラン硫酸
ACH:アカラン(2−O−脱硫酸化AS)
KS:ケラタン硫酸
KPS:ケラタンポリ硫酸
ΔDi−0S:ΔHexAα1−3GalNAc
ΔDi−6S:ΔHexAα1−3GalNAc(6S)
ΔDi−4S:ΔHexAα1−3GalNAc(4S)
ΔDi−2S:ΔHexA(2S)α1−3GalNAc
ΔDi−diSD:ΔHexA(2S)α1−3GalNAc(6S)
ΔDi−diSE:ΔHexAα1−3GalNAc(4S,6S)
ΔDi−diSB:ΔHexA(2S)α1−3GalNAc(4S)
ΔDi−triS:ΔHexA(2S)α1−3GalNAc(4S,6S)
ΔDiHA−0S:ΔHexAα1−3GlcNAc
ΔDiHA−6S:ΔHexAα1−3GlcNAc(6S)
ΔDiHA−4S:ΔHexAα1−3GlcNAc(4S)
ΔDiHA−2S:ΔHexA(2S)α1−3GlcNAc
ΔDiHS−0S:ΔHexAα1−4GlcNAc
ΔDiHS−NS:ΔHexAα1−4GlcNS
ΔDiHS−6S:ΔHexAα1−4GlcNAc(6S)
ΔDiHS−2S:ΔHexA(2S)α1−4GlcNAc
ΔDiHS−diS1:ΔHexAα1−4Glc(NS,6S)
ΔDiHS−diS2:ΔHexA(2S)α1−4GlcNS
ΔDiHS−diS3:ΔHexA(2S)α1−4GlcNAc(6S)
ΔDiHS−triS:ΔHexA(2S)α1−4Glc(NS,6S)
上記において、α1−3はα1−3グリコシド結合を、α1−4はα1−4グリコシド結合を、6Sは6−O−硫酸基を、4Sは4−O−硫酸基を、2Sは2−O−硫酸基をそれぞれ示す。
[1]
グリコサミノグリカンと硫酸化剤を共存させた強塩基性の溶液中で硫酸化反応を行う、グリコサミノグリカンの硫酸化方法。
[2]
強塩基性の溶液が、pH11.5以上の溶液である、前記[1]に記載の方法。
[3]
強塩基性の溶液が、強塩基を含む強塩基性の溶液である、前記[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
グリコサミノグリカンが、下記(A)〜(D)から選択されるグリコサミノグリカンである、前記[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
(A)へキスロン酸残基を有するグリコサミノグリカン。
(B)前記(A)のグリコサミノグリカンに置換基又は官能基の付加又は脱離をしてなるグリコサミノグリカン。
(C)前記(A)のグリコサミノグリカンを脱アセチル化してなるグリコサミノグリカン。
(D)前記(A)のグリコサミノグリカンをアルキル化してなるグリコサミノグリカン。
[5]
硫酸化剤が、三酸化硫黄錯体である、前記[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
前記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、硫酸化グリコサミノグリカンの製造方法。
[7]
グリコサミノグリカンの脱アセチル化反応を行う工程をさらに含む、前記[6]に記載の方法。
[8]
グリコサミノグリカンのアルキル化反応を行う工程をさらに含む、前記[6]又は[7]に記載の方法。
[9]
二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を3モル%以上有するコンドロイチン硫酸。
[HexA(2S)1−3GalN1−4]
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「2S」は2−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
[10]
二糖組成比において下記構造式(a)で示される構造を含む二糖に対する下記構造式(b)で示される構造を含む二糖の割合が3超であるコンドロイチン硫酸。
[HexA1−3GalN(4S)1−4] (a)
[HexA(2S)1−3GalN1−4] (b)
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「4S」は4−O−硫酸基を、「2S」は2−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
[11]
二糖組成比において下記構造式(c)で示される構造を含む二糖に対する下記構造式(d)で示される構造を含む二糖の割合が0.1超であるコンドロイチン硫酸。
[HexA1−3GalN(6S)1−4] (c)
[HexA(2S)1−3GalN1−4] (d)
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「6S」は6−O−硫酸基を、「2S」は2−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
[12]
二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を25モル%以上有するコンドロイチン硫酸。
[HexA(2S)1−3GalN(6S)1−4]
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「2S」は2−O−硫酸基を、「6S」は6−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
[13]
二糖組成において下記構造式で示される構造を含む二糖を有する硫酸化ヒアルロン酸。
[HexA1−3GlcN(4S)1−4]
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GlcN」はグルコサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「4S」は4−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
[14]
以下の(A)及び(B)の特徴を有する硫酸化ヒアルロン酸。
(A)分子量が200万Da以上である。
(B)硫黄含量が2質量%以上である。
[15]
硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンである、前記[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[16]
硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化ヘパロサンである、前記[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[17]
硫酸化グリコサミノグリカンが、前記[9]〜[12]のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸、又は、前記[13]若しくは[14]に記載の硫酸化ヒアルロン酸である、前記[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[18]
硫酸化グリコサミノグリカンが、前記[9]、[10]、[11]及び/又は[12]に記載のコンドロイチン硫酸である、前記[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[19]
硫酸化グリコサミノグリカンが、前記[13]及び/又は[14]に記載の硫酸化ヒアルロン酸である、前記[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
前述のとおり、本発明においては、GAGと硫酸化剤を共存させた非有機溶媒の溶液中でGAGの硫酸化反応(GAGを硫酸化する反応)を行うことを特徴としたGAGを硫酸化する方法(以下「本発明の硫酸化方法」という。)が提供される。本発明において「非有機溶媒」とは、有機溶媒以外の溶媒(例えば、無機溶媒)を含む溶媒であることを意味する。ここにいう非有機溶媒の溶液は、具体的には、強塩基性の溶液である。本発明の硫酸化方法において、強塩基性は、pH11.5以上であることが好ましい。本発明の硫酸化方法において、強塩基性は、pH11.6以上、pH11.8以上、pH12以上、pH12.2以上、pH12.4以上、pH12.6以上、pH12.8以上、またはpH13以上であってもよい。
本発明の硫酸化GAGの製造方法1(以下「本発明の製造方法1」という。)は、本発明の硫酸化方法を行う工程を含むことを特徴とした、硫酸化GAGの製造方法である。
本発明の硫酸化GAGの製造方法2(以下「本発明の製造方法2」という。)は、本発明の硫酸化方法によって硫酸化反応を行う工程を含むことの他、GAGの脱アセチル化反応(GAGを脱アセチル化する反応)を行う工程をさらに含むことを特徴とした、硫酸化GAGの製造方法である。本発明の製造方法2によって製造される硫酸化GAGは、硫酸化反応および脱アセチル化反応を行う前のGAGに比してアセチル化の程度が低下したGAGであること、言い換えると、アセチル化の程度を示す指標が硫酸化反応および脱アセチル化反応を行う前のGAGに比して低下したGAGである。アセチル化の程度を示す指標は、例えば、GAGが有するアセチル基の数を構成二糖単位の数で除して算出される値(構成二糖単位あたりのアセチル基の数の平均値)を百分率換算した値(以下「脱アセチル化度」という。)として示すことができる。
本発明の硫酸化GAGの製造方法3(以下「本発明の製造方法3」という。)は、本発明の硫酸化方法によって硫酸化反応を行う工程を含むことの他、GAGのアルキル化反応(GAGをアルキル化する反応)を行う工程をさらに含むことを特徴とした、硫酸化GAGの製造方法である。本発明の製造方法3によって製造される硫酸化GAGは、硫酸化反応およびアルキル化反応を行う前のGAGに比してアルキル化の程度が高まったGAGであること、言い換えると、アルキル化の程度を示す指標が硫酸化反応およびアルキル化反応を行う前のGAGに比して高まったGAGである。アルキル化の程度を示す指標は、例えば、GAGが有するアルキル基の数を構成二糖単位の数で除して算出される値(構成二糖単位あたりのアルキル基の数の平均値)を百分率換算した値(以下「アルキル化度」という。)として示すことができる。ここにいうアルキル化としては、具体的には、メチル化やエチル化が挙げられる。
本発明の製造方法により製造することができる硫酸化GAG(以下「本発明の硫酸化GAG」という。)は、構成二糖単位の組成比(以下「二糖組成比」という。)において特に制限されないGAGであってよい。本発明の硫酸化GAGの二糖組成比は、本発明の硫酸化方法を行う時の諸条件に応じて任意の値に制御することができる。具体的には、GAGの種類や濃度、硫酸化剤や強塩基の種類や量、pH、反応時間、反応温度、有機溶媒の濃度等の諸条件を適宜設定し、反応産物が所望の二糖組成比を有する硫酸化GAGとなる条件に設定すればよい。
本発明の硫酸化GAGがCHを硫酸化して得られるGAG(以下「本発明の硫酸化CH」という。)である場合は、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するGAGであってよい。以後の説明において、[HexA1−3GalN1−4]で示される構造を含む二糖をCH−0S、[HexA1−3GalN(6S)1−4]で示される構造を含む二糖をCH−6S、[HexA1−3GalN(4S)1−4]で示される構造を含む二糖をCH−4S、[HexA(2S)1−3GalN1−4]で示される構造を含む二糖をCH−2S、[HexA(2S)1−3GalN(6S)1−4]で示される構造を含む二糖をCH−diSD、[HexA1−3GalN(4,6S)1−4]で示される構造を含む二糖をCH−diSE、[HexA(2S)1−3GalN(4S)1−4]で示される構造を含む二糖をCH−diSB、[HexA(2S)1−3GalN(4,6S)1−4]で示される構造を含む二糖をCH−triSとそれぞれ略記する。前記において、式中、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「6S」は6−O−硫酸基を、「4S」は4−O−硫酸基を、「2S」は2−O−硫酸基をそれぞれ示す。「HexA」は、GlcAまたはIdoAであってよい。「1−3グリコシド結合」は、HexAがGlcAである場合はβ1−3グリコシド結合であってよく、HexAがIdoAである場合はα1−3グリコシド結合であってよい。「1−4グリコシド結合」は、β1−4グリコシド結合であってよい。上記において、各二糖は明記された硫酸基以外の硫酸基を有しないものとする。上記において、「含む」という表現は「からなる」場合を包含する。よって、例えば、「[HexA1−3GalN1−4]で示される構造を含む二糖」は、「[HexA1−3GalN1−4]で示される構造からなる二糖」であってもよい。また、例えば、上記において、「GalN」は、GalNAcであってよい。よって、例えば、「[HexA1−3GalN1−4]で示される構造を含む二糖」は、「[HexA1−3GalNAc1−4]で示される構造を含む二糖」であってもよく、「[HexA1−3GalNAc1−4]で示される構造からなる二糖」であってもよい。
本発明の硫酸化GAGがHAを硫酸化して得られるGAG(以下「本発明の硫酸化HA」という。)である場合は、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するGAGであってよい。以後の説明において、[HexA1−3GlcN1−4]で示される構造を含む二糖をHA−0S、[HexA1−3GlcN(6S)1−4]で示される構造を含む二糖をHA−6S、[HexA1−3GlcN(4S)1−4]で示される構造を含む二糖をHA−4S、[HexA(2S)1−3GlcN1−4]で示される構造を含む二糖をHA−2Sとそれぞれ略記する。前記において、式中、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「6S」は6−O−硫酸基を、「4S」は4−O−硫酸基を、「2S」は2−O−硫酸基をそれぞれ示す。「HexA」は、GlcAまたはIdoAであってよい。「1−3グリコシド結合」は、HexAがGlcAである場合はβ1−3グリコシド結合であってよく、HexAがIdoAである場合はα1−3グリコシド結合であってよい。「1−4グリコシド結合」は、β1−4グリコシド結合であってよい。上記において、「含む」という表現は「からなる」場合を包含する。よって、例えば、「[HexA1−3GlcN1−4]で示される構造を含む二糖」は、「[HexA1−3GlcN1−4]からなる二糖」であってもよい。また、例えば、上記において、「GlcN」は、GlcNAcであってよい。よって、例えば、「[HexA1−3GlcN1−4]で示される構造を含む二糖」は、「[HexA1−3GlcNAc1−4]で示される構造を含む二糖」であってもよく、「[HexA1−3GlcNAc1−4]からなる二糖」であってもよい。
本発明の硫酸化GAGがHPNを硫酸化して得られるGAG(以下「本発明の硫酸化HPN」という。)である場合は、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するGAGであってよい。以後の説明において、[HexA1−4GlcN1−4]で示される構造を含む二糖をHS−0S、[HexA1−4GlcNS1−4]で示される構造を含む二糖をHS−NS、[HexA1−4GlcN(6S)1−4]で示される構造を含む二糖をHS−6S、[HexA(2S)1−4GlcN1−4]で示される構造を含む二糖をHS−2S、[HexA1−4Glc(NS,6S)1−4]で示される構造を含む二糖をHS−diS1、[HexA(2S)1−4GlcNS1−4]で示される構造を含む二糖をHS−diS2、[HexA(2S)1−4GlcNAc(6S)1−4]で示される構造を含む二糖をHS−diS3、[HexA(2S)1−4Glc(NS,6S)1−4]で示される構造を含む二糖をHS−triSとそれぞれ略記する。前記において、式中、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「6S」は6−O−硫酸基を、「NS」はN−硫酸基を、「2S」は2−O−硫酸基をそれぞれ示す。「HexA」は、GlcAまたはIdoAであってよい。「HexAの還元末端側の1−4グリコシド結合」は、HexAがGlcAである場合はβ1−4グリコシド結合であってよく、HexAがIdoAである場合はα1−4グリコシド結合であってよい。「HexAの非還元末端側の1−4グリコシド結合」は、α1−4グリコシド結合であってよい。上記において、各二糖は明記された硫酸基以外の硫酸基を有しないものとする。上記において、「含む」という表現は「からなる」場合を包含する。よって、例えば、「[HexA1−4GlcN1−4]で示される構造を含む二糖」は、「[HexA1−4GlcN1−4]からなる二糖」であってもよい。また、例えば、上記において、「GlcN」は、GlcNAcであってよい。よって、例えば、「[HexA1−4GlcN1−4]で示される構造を含む二糖」は、「[HexA1−4GlcNAc1−4]で示される構造を含む二糖」であってもよく、「[HexA1−4GlcNAc1−4]からなる二糖」であってもよい。
本発明の硫酸化GAGは、一態様において、HEPやDS等の硫酸基を有するGAGと同様の抗凝固活性を有することを特徴としたGAGである。よって、本発明の硫酸化GAGは、ヘパリン様の抗凝固活性を有することを特徴としたグリコサミノグリカンであってよく、具体的には、ヘパリン様の抗凝固活性を有することを特徴としたヘパロサンであってよい。本発明の硫酸化GAGは、例えば、血液の抗凝固剤として使用することができる。
コンドロイチン(CH)は、公知の文献(特表2013−520995号公報)に記載の方法に従い、大腸菌MSC702株(大腸菌W3110株(ATCC 27325)に、大腸菌K4株のkfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG遺伝子を各4コピー、大腸菌K4株のkpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT遺伝子を各1コピー、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のxylS遺伝子を1コピー導入して構築)を培養し、培養上清を精製して得た。
脱硫酸化コンドロイチン硫酸(dCH)は、公知の文献(J. Am. Chem. Soc., 1957, 79 (1), pp 152-153)に記載の方法に従い、コンドロイチン硫酸C(CSC)を脱硫酸化して得た。dCHの調製手順を以下に示す。
N−アセチルヘパロサン(NAH)は、公知の文献(特開2004−018840号公報)に記載の方法に従い、大腸菌K5株(Serotype O10:K5(L):H4, ATCC 23506)を培養し、培養上清を精製して得た。
CH、硫酸化CH、HPN、硫酸化HPNの分子量は、以下の条件に従ったゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量である。
HA、硫酸化HAの分子量は、以下の条件に従ったゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量である。
硫酸化CHの組成分析は、硫酸化CHを酵素で分解して得られる二糖の組成分析(以下「二糖分析」という。)により行った。二糖の検出は、HPLCポストカラム誘導体化法により行った。硫酸化CHの二糖分析の手順を以下に示す。
硫酸化CHに精製水を添加して10mg/mLとなるように調製した溶液に対し、1/2容量の100mM Tris−HCl(pH7.4)と1/2容量のコンドロイチナーゼ溶液(コンドロイチナーゼABC(生化学工業社製)に0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加して0.1U/μLとなるように調製)を添加した溶液を37℃で3時間静置した。この溶液を沸騰水中に1分間静置した後、4倍容の精製水を添加した溶液を遠心ろ過デバイス(マイクロコン−10、ミリポア社製)にアプライし、遠心後のろ液を二糖分析用の試料として回収した。
二糖分析は、カラムとしてSenshu Pak DOCOSIL SP100(内径:4.6mm×長さ:150mm、センシュー科学社製)を用い、カラム温度を55℃に設定して行った。溶離液には溶媒A(精製水)、溶媒B(200mM NaCl)、溶媒C(10mMテトラブチルアンモニウム)、溶媒D(50%アセトニトリル)をオンライン混合した溶液を用い、流速は1.1mL/minとした。カラムの溶出液と0.7mL/minで送液した誘導体化試薬の溶液(0.5% 2−シアノアセトアミドと0.25M NaOHを1:1の割合でオンライン混合させた溶液)を三方ジョイントに通して混合させた後、この混合液を反応コイル(内径:0.5mm×長さ:10m)、冷却コイル(内径:0.25mm×長さ:3m)、蛍光検出器の順に通液させた。反応コイルは、125℃に加温して使用した。冷却コイルは、室温の蒸留水に浸して使用した。蛍光検出器は、励起波長を346nmに、蛍光波長を410nmに設定して使用した。
二糖組成の比率(以下「二糖組成比」という。)は、上記(1)で調製した試料を10μLアプライし、上記(2)に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いて各二糖のモル数を算出し、各二糖のモル数を全二糖のモル数を総和した値で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料としてコンドロイチン硫酸由来の不飽和二糖(ΔDi−0S(以下「0S」という。)、ΔDi−6S(以下「6S」という。)、ΔDi−4S(以下「4S」という。)、ΔDi−2S(以下「2S」という。)、ΔDi−diSD(以下「diSD」という。)、ΔDi−diSE(以下「diSE」という。)、ΔDi−triS(以下「triS」という。)、いずれも生化学工業社製)を用いて作成した。
硫酸化CHの硫酸化度は、上記<参考例6>で算出した二糖組成比を下記の式3で示される数式に代入して算出した。
硫酸化HAの硫酸化度は、硫酸化HAを酸加水分解して得られる試料を測定対象としたキャピラリー電気泳動により測定した。具体的には、硫酸化HAを酸加水分解して得られる試料に含まれるグルコサミン(GlcN)と硫酸イオンのモル濃度をキャピラリー電気泳動により測定し、硫酸イオンのモル濃度をGlcNのモル濃度で除した値を百分率換算して硫酸化度を算出した。硫酸化HAの硫酸化度測定の手順を以下に示す。
硫酸化HAに精製水を添加して1mg/mLとなるように調製した溶液に対し、3倍容の6N HClを添加した溶液を115℃で3時間静置して酸加水分解した。この溶液を遠心エバポレーターに供して乾固させた後、硫酸化HAに添加した時と等量の精製水を添加して再溶解した。この溶液を遠心して不溶物を沈殿させた後、上清をGlcNと硫酸イオンのモル濃度測定用の試料として回収した。
GlcNと硫酸イオンのモル濃度の測定は、キャピラリーとしてUncoated fused silica capillary(内径:50μm×長さ:104cm、アジレント社製)を用い、温度を25℃に設定して行った。移動相にはBasic Anion Buffer(アジレント社製)を用い、印加電圧を−30kVに設定した。検出は分光光度検出器で行い、測定波長を350nm、対照波長を230nmに設定した。
硫酸化度は、上記(1)で調製した試料を100mbarで8秒間加圧してアプライし、上記(2)に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いてGlcNと硫酸イオンのモル濃度を算出し、硫酸イオンのモル濃度をGlcNのモル濃度で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料としてGalNAcと硫酸ナトリウム(Na2SO4)を用い、上記(1)に従った酸加水分解等の処理に供した後の試料を用いて作成した。
硫酸化GAGの硫黄含量は、硫酸化度を下記の式4で示される数式に代入して算出した。
硫酸化HAの組成分析は、硫酸化HAを酵素で分解して得られる二糖の組成分析(二糖分析)により行った。硫酸化HAの二糖分析の手順を以下に示す。
硫酸化HAに精製水を添加して10mg/mLとなるように調製した溶液に対し、1/2容量の100mM Tris−HCl(pH7.4)と1/2容量のコンドロイチナーゼ溶液(コンドロイチナーゼABC(生化学工業社製)に0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加して0.1U/μLとなるように調製)を添加した溶液を37℃で3時間静置した。この溶液を沸騰水中に1分間静置した後、4倍容の精製水を添加した溶液を遠心ろ過デバイス(マイクロコン−10、ミリポア社製)にアプライし、遠心後のろ液を二糖分析用の試料として回収した。
二糖分析は、カラムとしてUK−Amino(内径:4.6mm×長さ:150mm、センシュー科学社製)を用い、カラム温度を60℃に設定して行った。溶離液には、溶媒A(精製水)、溶媒B(0.8M NaH2PO4)をオンラインで混合した溶液を用い、流速は1mL/minとした。検出は分光光度検出器で行い、測定波長を232nmに設定した。
二糖組成比は、上記(1)で調製した試料を10μLアプライし、上記(2)に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いて各二糖のモル数を算出し、各二糖のモル数を全二糖のモル数を総和した値で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料として硫酸化ヒアルロン酸由来の不飽和二糖(ΔDiHA−0S(以下「0S」という。)、ΔDiHA−6S(以下「6S」という。)、ΔDiHA−4S(以下「4S」という。)、ΔDiHA−2S(以下「2S」という。))を用いて作成した。硫酸化ヒアルロン酸由来の不飽和二糖は、本発明の硫酸化方法により硫酸化したHAを上記(1)の方法により二糖に分解した後、陰イオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーを行って調製し、質量分析およびNMRによって硫酸基の結合位置を同定したものを使用した。
硫酸化ヘパロサンの組成分析は、硫酸化ヘパロサンを酵素で分解して得られる二糖の組成分析(二糖分析)により行った。二糖の検出は、HPLCポストカラム誘導体化法により行った。硫酸化ヘパロサンの二糖分析の手順を以下に示す。
硫酸化ヘパロサンに精製水を添加して10mg/mLとなるように調製した溶液に対し、1/2容量の20mM酢酸ナトリウム水溶液(pH7.0)/2mM酢酸カルシウムと1/2容量のEMII溶液(3mU/μL ヘパリチナーゼI、2mU/μL ヘパリチナーゼII、5mU/μL ヘパリナーゼ(いずれも生化学工業社製)となるように0.1%BSAを添加して調製)を添加した溶液を37℃で3時間静置した。この溶液を沸騰水中に1分間静置した後、4倍容の精製水を添加した溶液を遠心ろ過デバイス(マイクロコン−10、ミリポア社製)にアプライし、遠心後のろ液を二糖分析用の試料として回収した。
二糖分析は、<参考例6>の「(2)HPLCポストカラム誘導体化法による分析」に記載の方法と同じ条件により行った。
二糖組成比は、上記(1)で調製した試料を10μLアプライし、上記(2)に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いて各二糖のモル数を算出し、各二糖のモル数を全二糖のモル数を総和した値で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料としてヘパリンまたはヘパラン硫酸由来の不飽和二糖(ΔDiHS−0S(以下「0S」という。)、ΔDiHS−NS(以下「NS」という。)、ΔDiHS−6S(以下「6S」という。)、ΔDiHS−diS1(以下「diS1」という。)、ΔDiHS−diS2(以下「diS2」という。)、ΔDiHS−triS(以下「triS」という。)、いずれも生化学工業社製)を用いて作成した。
アルキル化された硫酸化CHの硫黄含量は、当該硫酸化CHを酸加水分解して得られる試料を測定対象としたキャピラリー電気泳動により測定した。具体的には、アルキル化された硫酸化CHを酸加水分解して得られる試料に含まれる硫酸イオンのモル濃度をキャピラリー電気泳動により測定した後、下記の式5で示される数式により硫黄含量を算出した。
硫酸化HPNの硫酸化度は、上記<参考例11>で算出した二糖組成比を下記の式6で示される数式に代入して算出した。
CH(35.8kDa)にNa2SO4と0.1M〜4MのNaOH水溶液を添加し、CHが100mg/mL(10% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。これらの溶液を40℃に加温し、2.9当量(重量濃度(w/v)でCHと同じ濃度となる量)の三酸化硫黄トリメチルアミン錯体(TMA−SO3)(シグマアルドリッチ社製)を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表1及び図1に示す。
HA(800kDa)にNa2SO4と0.5M〜4MのNaOH水溶液を添加し、HAが10mg/mL(1% w/v)、Na2SO4が100mg/mLとなるように溶液を調製した。これらの溶液を40℃に加温し、58当量(重量濃度(w/v)でHAの20倍の濃度となる量)のTMA−SO3を添加した後、スターラーで3時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に等量の精製水を添加した後、精製水に対して透析を一晩行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化HAの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表2に示す。
CH(35.8kDa)にNa2SO4と0.05M〜2MのNaOH水溶液を添加し、CHが100mg/mL(10% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。これらの溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで5分間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表3に示す。
CH(41.8kDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。この溶液を0〜60℃に加温または冷却し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化CHの分子量を測定した。結果を表4に示す。
CH(30.2kDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、CHが10〜66.7mg/mL(1〜6.67% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。これらの溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化CHの分子量を測定した。結果を表5に示す。
精製水に溶解したHA(2.7MDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、終濃度で1〜10mg/mL(0.1〜1% w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOHとなるように溶液を調製した。これらの溶液を4℃に冷却し、58当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで18時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化HAの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。また、硫酸化HAの分子量を測定した。結果を表6に示す。
CH(41.8kDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間〜9時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化CHの分子量を測定した。結果を表7に示す。
精製水に溶解したHA(2.7MDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、終濃度で1mg/mL(0.1% w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOHとなるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、58当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1日間〜7日間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化HAの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表8に示す。
CH(41.8kDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、0.3〜2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで20時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に1.5倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表9に示す。
精製水に溶解したHA(2.7MDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、終濃度で1mg/mL(0.1% w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOHとなるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、29〜116モル当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで18時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化HAの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表10に示す。
HA(800kDa)にNa2SO4と1Mの強塩基性水溶液(NaOH水溶液、KOH水溶液、またはLiOH水溶液)を添加し、終濃度で1mg/mL(0.1%w/v)HA、100mg/mL Na2SO4となるように溶液を調製した。これらの溶液を4℃に冷却し、58当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで18時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化HAの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表11に示す。
CH(41.8kDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量の三酸化硫黄ピリジン錯体(Pyr−SO3、東京化成工業社製)を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表12に示す。
CH(41.8kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、CHが100mg/mL(10% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量の三酸化硫黄ジメチルエチルアミン錯体(DMEA−SO3)(ジメチルエチルアミン100mLとクロロホルム100mLの混合溶媒にクロロスルホン酸10mLとクロロホルム20mLの混合溶媒を氷冷下で添加して調製)を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表13に示す。
HA(800kDa)にNa2SO4と2Mまたは3MのNaOH水溶液を添加し、HAが10mg/mL(1% w/v)、Na2SO4が80mg/mLとなるように溶液を調製した。これらの溶液を4℃に冷却し、58当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで18時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を一晩行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化HAの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表14に示す。
CH(41.8kDa)にNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)、Na2SO4が200〜600mg/mLとなるように溶液を調製した。また、CHに2MのNaOH水溶液のみを添加し、Na2SO4を含まない溶液も調製した。これらの溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化CHの分子量を測定した。結果を表15に示す。
コンドロイチン硫酸A(CSA)(20.1kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、CSAが200mg/mL(20% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CSを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表16に示す。
コンドロイチン硫酸C(CSC)(14.8kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、CSCが200mg/mL(20% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CSを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表17に示す。
dCH(8.2kDa)に5%(v/v)のN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)を含む2MのNaOHの溶液を添加し、CHが100mg/mL(10% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表18に示す。
dCH(8.2kDa)に5%(v/v)の有機溶媒(ジメチルスルホキシド(DMSO)、ホルムアミド(FA)、ピリジン(Pyr)、アセトニトリル(MeCN)、エタノール(EtOH)、またはテトラヒドロフラン(THF))を含む2MのNaOHの溶液を添加し、dCHが100mg/mL(10% w/v)となるように溶液を調製した。これらの溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで3時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表19に示す。
dCH(8.2kDa)に10〜40%(v/v)の有機溶媒(DMSOまたはEtOH)を含む2MのNaOHの溶液を添加し、dCHが100mg/mL(10% w/v)となるように溶液を調製した。これらの溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで3時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表20に示す。
(1)強塩基性の溶液を用いた硫酸化
CHにNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、CHが66.7mg/mL(6.67% w/v)、Na2SO4が500mg/mLとなるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
CHにホルムアミド(FA)を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液に5当量の三酸化硫黄トリエチルアミン錯体(TEA−SO3)を添加した後、スターラーで2時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
(1)強塩基性の溶液を用いた硫酸化
CHに2MのNaOH水溶液を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、2.9当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで1時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
CHにホルムアミド(FA)を添加し、CHが200mg/mL(20% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、5当量のTEA−SO3を添加した後、スターラーで2時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
(1)強塩基性の溶液を用いた硫酸化
精製水に溶解したHAにNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、終濃度で1mg/mL(0.1% w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOHとなるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、58当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで18時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
HAのトリブチルアミン(TBA)塩にN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)を添加し、HAが10mg/mL(1% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を60℃に加温し、12当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで48時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2.5倍容のアセトンを添加して30分間撹拌した後、3時間静置した。この溶液から沈殿物を回収してHAが8mg/mL(0.8% w/v)となるように精製水に溶解した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
NAH(33.1kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、NAHが40mg/mL(4% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を60℃に加温し、スターラーで4時間撹拌して脱アセチル化反応を行った。温度を40℃に変更し、7当量または12当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで20時間撹拌して硫酸化反応を行った。この溶液にHClを添加して中和した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ヘパロサンを前記<参考例11>の方法に従って二糖分析した。結果を表24に示す。
(1)メチル化された硫酸化コンドロイチンの調製
CHに2MのNaOH水溶液を添加し、CHが100mg/mL(10% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、0.5倍容のヨードメタン(CH3I)を添加した後、スターラーで2時間撹拌してメチル化反応を行い、一部をメチル基の導入率(メチル化度)の測定用試料として分取した。その後、この溶液に2.9当量のTMA−SO3を添加し、室温においてスターラーで2時間撹拌して硫酸化反応を行った。メチル化度の測定用試料と反応停止後の溶液それぞれに3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得たメチル化されたコンドロイチン(硫酸化反応に供する前のコンドロイチン)とメチル化された硫酸化コンドロイチンを以下の分析に供した。
メチル化度の測定は、1H−NMRにより行った。上記(1)で得たメチル化されたコンドロイチン5mgに0.01%の3−(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウム−2,2,3,3−d4(TSP)を含有する重水を添加して調製した溶液を1H−NMRに供し、CHに導入したメチル基由来のシグナル(2.9ppm、3.1ppm、3.2ppm、3.4ppm、3.5ppm)の積分比をGalNAc残基のアセチル基由来のシグナル(2.0ppm)の積分比で除した値を百分率換算してメチル化度を算出した。その結果、メチル化されたコンドロイチンのメチル化度は58%であった。
硫黄含量の測定は、<参考例12>に記載の方法により行った。その結果、上記(1)で得たメチル化された硫酸化コンドロイチンの硫黄含量は3.8%であった。
CH(5.0kDa、28.0kDa、30.2kDa、32.0kDa、35.8kDa、または41.8kDa)に溶媒を添加し、CHが10〜200mg/mL(1〜20% w/v)となるように溶液を調製した。これらの溶液を0〜60℃に加温または冷却し、0.9〜10当量の硫酸化剤(TMA−SO3、TEA−SO3、Pyr−SO3、または三酸化硫黄N,N−ジメチルホルムアミド錯体(DMF−SO3))を添加した後、スターラーで0.5〜20時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
HA(20kDa、または100kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、HAが50mg/mL(5% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、8.7当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで24時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化HAの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表28に示す。
NAH(33.1kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、NAHが100mg/mL(10% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を60℃に加温し、スターラーで4時間撹拌して脱アセチル化反応を行った。この溶液にH2SO4を添加して中和した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして脱アセチル化HPNを得た。
上記(1)で得た脱アセチル化HPNに20%(v/v)のDMSOを含む2MのNaOHの溶液を添加し、脱アセチル化HPNが50mg/mL(5% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、18当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで20時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
HEPと実施例28で得た硫酸化HPNを測定対象試料とし、下記の方法に従って活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)を測定した。
(1)異性化ヘパロサンの調製
文献(WO2014/200045)に記載の方法を参照してNAH(33.1kDa)の異性化反応を行い、一部のGlcA残基がIdoA残基に異性化されたHPN(EpHPN)を得た。EpHPNのIdoA含量は32.8%であった。
NAHに代えて上記(1)で得たEpHPNを用い、実施例28に記載の方法に従って行った。
CH(113kDa)に2M〜4MのNaOH水溶液を添加し、CHが50mg/mL(5% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、14.5当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで24時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化CHを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表32に示す。
CH(113kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、CHが50mg/mL(5% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、8.7当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで24時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応終了時(硫酸化剤を添加してから24時間後)に測定した硫酸化反応溶液のpHは13.8であった。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
CH(27kDa)に2MのNaOH水溶液を添加し、CHが50mg/mL(5% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、8.7当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで24時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に3倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
(1)強塩基性の溶液を用いた硫酸化
精製水に溶解したHAにNa2SO4と2MのNaOH水溶液を添加し、終濃度で10mg/mL(1% w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOHとなるように溶液を調製した。この溶液を4℃に冷却し、58当量のTMA−SO3を添加した後、スターラーで18時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に2倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ヒアルロン酸の硫黄含量は2.9%であった。
HAのトリブチルアミン(TBA)塩にN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)を添加し、HAが1mg/mL(0.1% w/v)となるように溶液を調製した。この溶液を40℃に加温し、1当量のPyr−SO3を添加した後、スターラーで3時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に等量の精製水を添加した後、精製水に対して透析を2日間行った。この溶液にNaOH水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ヒアルロン酸の硫黄含量は3.0%であった。
硫酸基の測定は、13C−NMRにより行った。上記に従って得た硫酸化ヒアルロン酸5mgに0.01%のテトラメチルシラン(TMS)を含有する重水を添加して調製した溶液を13C−NMRに供し、GlcNAc残基の4−O−硫酸基に由来するシグナル(77.5ppm)の有無を確認した。本発明の硫酸化方法に供して得た硫酸化ヒアルロン酸を測定した結果を図2に、従来の硫酸化方法に供して得た硫酸化ヒアルロン酸を測定した結果を図3に、それぞれ示す。
Claims (8)
- グリコサミノグリカンと硫酸化剤を共存させたpH11.5以上の強塩基性の溶液中で硫酸化反応を行う、グリコサミノグリカンの硫酸化方法。
- グリコサミノグリカンが、下記(A)〜(D)から選択されるグリコサミノグリカンである、請求項1に記載の方法。
(A)ヘキスロン酸残基を有するグリコサミノグリカン。
(B)前記(A)のグリコサミノグリカンに置換基又は官能基の付加又は脱離をしてなるグリコサミノグリカン。
(C)前記(A)のグリコサミノグリカンを脱アセチル化してなるグリコサミノグリカン。
(D)前記(A)のグリコサミノグリカンをアルキル化してなるグリコサミノグリカン。 - 請求項1又は2に記載の方法を行う工程を含む、硫酸化グリコサミノグリカンの製造方法。
- グリコサミノグリカンの脱アセチル化反応を行う工程をさらに含む、請求項3に記載の方法。
- グリコサミノグリカンのアルキル化反応を行う工程をさらに含む、請求項3又は4に記載の方法。
- 硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンである、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化ヘパロサンである、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 硫酸化グリコサミノグリカンが、下記(i)〜(iv)から選択されるコンドロイチン硫酸、又は、下記(v)若しくは(vi)から選択される硫酸化ヒアルロン酸である、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
(i)二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を3モル%以上有するコンドロイチン硫酸。
[HexA(2S)1−3GalN1−4]
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「2S」は2−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
(ii)二糖組成比において下記構造式(a)で示される構造を含む二糖に対する下記構造式(b)で示される構造を含む二糖の割合が3超であるコンドロイチン硫酸。
[HexA1−3GalN(4S)1−4] (a)
[HexA(2S)1−3GalN1−4] (b)
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「4S」は4−O−硫酸基を、「2S」は2−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
(iii) 二糖組成比において下記構造式(c)で示される構造を含む二糖に対する下記構造式(d)で示される構造を含む二糖の割合が0.1超であるコンドロイチン硫酸。
[HexA1−3GalN(6S)1−4] (c)
[HexA(2S)1−3GalN1−4] (d)
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「6S」は6−O−硫酸基を、「2S」は2−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
(iv)二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を25モル%以上有するコンドロイチン硫酸。
[HexA(2S)1−3GalN(6S)1−4]
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GalN」はガラクトサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「2S」は2−O−硫酸基を、「6S」は6−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
(v)二糖組成において下記構造式で示される構造を含む二糖を有する硫酸化ヒアルロン酸。
[HexA1−3GlcN(4S)1−4]
(式中、「HexA」はヘキスロン酸残基を、「GlcN」はグルコサミン残基を、「1−3」は1−3グリコシド結合を、「1−4」は1−4グリコシド結合を、「4S」は4−O−硫酸基を、それぞれ示す。)
(vi)以下の(A)及び(B)の特徴を有する硫酸化ヒアルロン酸。
(A)分子量が200万Da以上である。
(B)硫黄含量が2質量%以上である。
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