CN107406525A - 糖胺聚糖的硫酸化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明课题在于提供一种在非有机溶剂的溶液中将糖胺聚糖硫酸化的方法。在本发明中，使糖胺聚糖和硫酸化剂在强碱性的非有机溶剂的溶液中共存而进行硫酸化反应。在本发明中，强碱性优选为pH11.5以上。根据本发明，例如能够由N‑乙酰肝素前体来一锅合成具有肝素样抗凝活性的糖胺聚糖。此外，在一个方式中，通过本发明而得到的硫酸化糖胺聚糖为具有新型二糖组成比的硫酸化糖胺聚糖，作为新型材料是有用的。
Description
技术领域
本发明涉及对糖胺聚糖进行硫酸化的方法等。
背景技术
本申请的说明书中使用以下缩写。
GAG：糖胺聚糖
HexN：己糖胺
HexNAc：N-乙酰己糖胺
GalN：半乳糖胺
GalNAc：N-乙酰半乳糖胺
GlcN：葡糖胺
GlcNAc：N-乙酰葡糖胺
GlcNS：N-硫酸化葡糖胺
HexA：己糖醛酸
GlcA：葡萄糖醛酸
IdoA：艾杜糖醛酸
ΔHexA：不饱和己糖醛酸
CS：硫酸软骨素
DS：硫酸皮肤素
CH：软骨素
dCH：脱硫酸化硫酸软骨素
HA：透明质酸
HPN：肝素前体(heparosan)
NAH：N-乙酰肝素前体
HS：硫酸乙酰肝素
HEP：肝素
dHEP：脱硫酸化肝素
AS：硫酸Acharan(Acharan Sulfate)
ACH：Acharan(2-O-脱硫酸化AS)
KS：硫酸角质素
KPS：多硫酸角质素(keratan polysulfate)
ΔDi-0S：ΔHexAα1-3GalNAc
ΔDi-6S：ΔHexAα1-3GalNAc(6S)
ΔDi-4S：ΔHexAα1-3GalNAc(4S)
ΔDi-2S：ΔHexA(2S)α1-3GalNAc
ΔDi-diSD：ΔHexA(2S)α1-3GalNAc(6S)
ΔDi-diSE：ΔHexAα1-3GalNAc(4S，6S)
ΔDi-diSB：ΔHexA(2S)α1-3GalNAc(4S)
ΔDi-triS：ΔHexA(2S)α1-3GalNAc(4S，6S)
ΔDiHA-0S：ΔHexAα1-3GlcNAc
ΔDiHA-6S：ΔHexAα1-3GlcNAc(6S)
ΔDiHA-4S：ΔHexAα1-3GlcNAc(4S)
ΔDiHA-2S：ΔHexA(2S)α1-3GlcNAc
ΔDiHS-0S：ΔHexAα1-4GlcNAc
ΔDiHS-NS：ΔHexAα1-4GlcNS
ΔDiHS-6S：ΔHexAα1-4GlcNAc(6S)
ΔDiHS-2S：ΔHexA(2S)α1-4GlcNAc
ΔDiHS-diS1：ΔHexAα1-4Glc(NS，6S)
ΔDiHS-diS2：ΔHexA(2S)α1-4GlcNS
ΔDiHS-diS3：ΔHexA(2S)α1-4GlcNAc(6S)
ΔDiHS-triS：ΔHexA(2S)α1-4Glc(NS，6S)
上述之中，α1-3表示α1-3糖苷键，α1-4表示α1-4糖苷键，6S表示6-O-硫酸基，4S表示4-O-硫酸基，2S表示2-O-硫酸基。
作为对糖胺聚糖(GAG)进行硫酸化的方法，已知化学合成法、酶合成法、将这些组合而成的化学酶合成法。在化学合成法中，作为对GAG的羟基进行硫酸化的方法(O-硫酸化法)，已知使用有机溶剂的方法。作为O-硫酸化法，已知如下方法：将已转化为季铵盐的GAG溶解于有机溶剂，添加硫酸化剂来进行O-硫酸化的方法，例如，已知如下方法：将N-乙酰肝素前体的三丁胺盐溶解于N,N-二甲基甲酰胺，添加三氧化硫-吡啶络合物来进行O-硫酸化的方法(专利文献1)。此外，作为O-硫酸化法，还已知将GAG溶解于极性有机溶剂、添加硫酸化剂来进行O-硫酸化的方法，例如，已知如下方法：将软骨素溶解于甲酰胺，添加三氧化硫-三乙胺络合物来进行O-硫酸化的方法(专利文献2)。在使用有机溶剂的方法中，作为使硫酸化反应终止的方法，例如，由于硫酸化剂具有因水而失活的性质，因此使用添加含有用于调节pH的盐(例如，乙酸钠)的水溶液的方法(专利文献2)。
在化学合成法中，作为对GAG的氨基进行硫酸化的方法(N-硫酸化法)，已知如下方法：将N-脱乙酰化了的GAG溶解于碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液等pH为10左右的弱碱性水溶液，添加硫酸化剂来进行N-硫酸化的方法。作为N-硫酸化法，例如，已知下述方法：在通过肼分解对硫酸软骨素进行N-脱乙酰化后溶解于碳酸钠水溶液，添加三氧化硫-三乙胺络合物来进行N-硫酸化的方法；在通过碱水解对N-乙酰肝素前体(K5多糖)进行N-脱乙酰化后，进行中和，添加碳酸钠和三氧化硫-吡啶络合物来进行N-硫酸化的方法(非专利文献1、2)。但是，这种在弱碱性的水溶液中进行硫酸化反应的方法是特异性地对GAG的氨基进行硫酸化的方法，不能将GAG的羟基硫酸化。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-290383号公报
专利文献2：日本特表2013-520995号公报
非专利文献
非专利文献1：Nadkarni VD,Toida T,Van Gorp CL,Schubert RL,Weiler JM,Hansen KP,Caldwell EE,Linhardt RJ.,Carbohydr Res.1996Aug 26；290(1):87-96.
非专利文献2：Leali D,Belleri M,Urbinati C,Coltrini D,Oreste P,ZoppettiG,Ribatti D,Rusnati M,Presta M.,J Biol Chem.2001Oct12；276(41):37900-8.
发明内容
发明要解决的问题
本发明人等鉴于在化学方法对GAG的羟基进行硫酸化的方法中使用有机溶剂这一现状，从绿色化学、可持续化学的观点出发，对减少了有机溶剂的用量的GAG硫酸化方法、优选为不使用有机溶剂的GAG硫酸化方法进行了深入研究。
本发明的课题在于，提供在非有机溶剂的溶液中对GAG进行硫酸化的方法。此外，本发明的一个方式中，以提供在非有机溶剂的溶液中对GAG的羟基进行硫酸化的方法为课题。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过在共存有GAG和硫酸化剂的强碱性溶液中进行硫酸化反应，从而在不使用有机溶剂的方法(使用水性溶剂的方法)中能够进行GAG的羟基的硫酸化。此外，本发明人等发现，在一个方式中，通过该方法得到的硫酸化GAG为具有新型二糖组成比的硫酸化GAG，所述二糖组成比与在有机溶剂中进行硫酸化而得到的硫酸化GAG、以及从动物提取而得到的GAG不同。本发明人等基于这些见解而完成了本发明。
即，解决前述课题的本发明包括以下所例示的方式。
[1]一种糖胺聚糖的硫酸化方法，其在共存有糖胺聚糖和硫酸化剂的强碱性溶液中进行硫酸化反应。
[2]根据前述[1]所述的方法，其中，强碱性溶液为pH11.5以上的溶液。
[3]根据前述[1]或[2]所述的方法，其中，强碱性溶液为含有强碱的强碱性溶液。
[4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，糖胺聚糖为选自下述(A)～(D)中的糖胺聚糖。
(A)具有己糖醛酸残基的糖胺聚糖。
(B)在前述(A)的糖胺聚糖中添加或脱离取代基或官能团而成的糖胺聚糖。
(C)将前述(A)的糖胺聚糖脱乙酰化而成的糖胺聚糖。
(D)将前述(A)的糖胺聚糖烷基化而成的糖胺聚糖。
[5]根据前述[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，硫酸化剂为三氧化硫络合物。
[6]一种硫酸化糖胺聚糖的制造方法，其包含进行前述[1]～[5]中任一项所述的方法的工序。
[7]根据前述[6]所述的方法，其进一步包含进行糖胺聚糖的脱乙酰化反应的工序。
[8]根据前述[6]或[7]所述的方法，其进一步包含进行糖胺聚糖的烷基化反应的工序。
[9]一种硫酸软骨素，其二糖组成比中具有3摩尔％以上的含有下述结构式所示结构的二糖。
[HexA(2S)1-3GalN1-4]
(式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“2S”表示2-O-硫酸基。)
[10]一种硫酸软骨素，其二糖组成比中，含有下述结构式(b)所示结构的二糖相对于含有下述结构式(a)所示结构的二糖的比例超过3。
[HexA1-3GalN(4S)1-4] (a)
[HexA(2S)1-3GalN1-4] (b)
(式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“4S”表示4-O-硫酸基，“2S”表示2-O-硫酸基。)
[11]一种硫酸软骨素，其二糖组成比中，含有下述结构式(d)所示结构的二糖相对于含有下述结构式(c)所示结构的二糖的比例超过0.1。
[HexA1-3GalN(6S)1-4] (c)
[HexA(2S)1-3GalN1-4] (d)
(式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“6S”表示6-O-硫酸基，“2S”表示2-O-硫酸基。)
[12]一种硫酸软骨素，其二糖组成比中具有25摩尔％以上的含有下述结构式所示结构的二糖。
[HexA(2S)1-3GalN(6S)1-4]
(式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“2S”表示2-O-硫酸基，“6S”表示6-O-硫酸基。)
[13]一种硫酸化透明质酸，其二糖组成中具有含有下述结构式所示结构的二糖。
[HexA1-3GlcN(4S)1-4]
(式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GlcN”表示葡糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“4S”表示4-O-硫酸基。)
[14]一种硫酸化透明质酸，其具有以下(A)和(B)的特征。
(A)分子量为200万Da以上。
(B)硫含量为2质量％以上。
[15]根据前述[6]～[8]中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为具有肝素样抗凝活性的硫酸化糖胺聚糖。
[16]根据前述[6]～[8]中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为具有肝素样抗凝活性的硫酸化肝素前体。
[17]根据前述[6]～[8]中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为前述[9]～[12]中任一项所述的硫酸软骨素或者前述[13]或[14]所述的硫酸化透明质酸。
[18]根据前述[6]～[8]中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为前述[9]、[10]、[11]和/或[12]所述的硫酸软骨素。
[19]根据前述[6]～[8]中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为前述[13]和/或[14]所述的硫酸化透明质酸。
发明的效果
根据本发明，能够在非有机溶剂的溶液中对GAG进行硫酸化。此外，根据本发明，能够在非有机溶剂的溶液中对GAG的羟基进行硫酸化。
附图说明
图1为示出使CH和三氧化硫三甲胺络合物(TMA-SO3)共存于NaOH水溶液中而得到的硫酸化CH的硫酸化度与NaOH浓度的关系的图。
图2为示出通过使用了强碱性溶液的硫酸化方法而得到的硫酸化透明质酸的13C-NMR测定结果的图。
图3为示出通过在有机溶剂中的硫酸化方法而得到的硫酸化透明质酸的13C-NMR测定结果的图。
具体实施方式
(1)本发明的硫酸化方法
如前所述，本发明提供一种对GAG进行硫酸化的方法，其特征在于，在共存有GAG和硫酸化剂的非有机溶剂的溶液中进行GAG的硫酸化反应(对GAG进行硫酸化的反应)(以下称为“本发明的硫酸化方法”。)。在本发明中，“非有机溶剂”是指含有除有机溶剂以外的溶剂(例如无机溶剂)的溶剂。具体而言，这里所说的非有机溶剂的溶液为强碱性溶液。在本发明的硫酸化方法中，强碱性优选为pH11.5以上。在本发明的硫酸化方法中，强碱性也可以为pH11.6以上、pH11.8以上、pH12以上、pH12.2以上、pH12.4以上、pH12.6以上、pH12.8以上、或pH13以上。
在本发明的硫酸化方法中，硫酸化反应可以通过使GAG和硫酸化剂在强碱性溶液中共存而进行。共存是指：处于对象物彼此间可接触的状态。由此，硫酸化反应例如可以通过如下方式来进行，在含有GAG的强碱性溶液中添加硫酸化剂；在含有硫酸化剂的强碱性溶液中添加GAG；使含有GAG和硫酸化剂的溶液呈强碱性。此外，就硫酸化反应而言，只要在GAG与硫酸化剂共存的期间内存在溶液为强碱性的期间就能够进行，并不需要在该期间内溶液总是强碱性。即，根据本发明的硫酸化方法的实施方式，具体而言，例如根据所使用的硫酸化剂的种类、量，溶液的pH在GAG与硫酸化剂共存期间内可能会发生变动，但在GAG与硫酸化剂共存期间内，只要溶液为强碱性的时间在后述进行硫酸化反应的时间范围内，自然会通过本发明的硫酸化方法而使GAG硫酸化。
强碱性溶液为非有机溶剂的溶液即可，具体而言，例如可以为无机溶剂的溶液，也可以为将无机溶剂和有机溶剂混合而成的溶液。对这里所说的有机溶剂没有特别限制，优选为能够与无机溶剂混和的有机溶剂。作为这样的有机溶剂，可以列举极性有机溶剂。极性有机溶剂可以为非质子性极性溶剂，也可以为质子性极性溶剂。极性有机溶剂优选为非质子性极性溶剂。作为极性有机溶剂，可以列举：乙醇等醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、四氢呋喃、吡啶、丙酮、乙腈。此外，对这里所说的无机溶剂没有特别限制，优选为中性或碱性的溶剂。作为无机溶剂，具体可以列举水等水性溶剂。由此，在一个方式中，强碱性溶液可以为强碱性的水溶液。进而，对进行硫酸化反应的强碱性溶液的量(液量)没有限制，可以根据所使用的GAG的量、硫酸化剂的量等适当设定。
在本发明的硫酸化方法中，进行硫酸化反应时的溶液(以下称为“硫酸化反应溶液”。)可以为含有有机溶剂的溶液，也可以为不含有机溶剂的溶液。对硫酸化反应溶液中含有的有机溶剂的量没有特别限制，可以根据有机溶剂的种类、所期望的硫酸化程度等各条件来适当设定。在本发明的硫酸化方法中，例如可以按照硫酸化反应溶液中的有机溶剂的体积浓度(v/v)达到以下所例示的浓度范围的方式来使用有机溶剂。有机溶剂的体积浓度超过0％即可，例如可以为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、1％以上、5％以上。有机溶剂的体积浓度例如可以为99％以下、80％以下、60％以下、40％以下、20％以下、10％以下、5％以下。作为有机溶剂的体积浓度，优选例示超过0％且99％以下、超过0％且80％以下、超过0％且60％以下、超过0％且40％以下、超过0％且20％以下、超过0％且10％以下、超过0％且5％以下等。有机溶剂可以仅为1种也可以为2种或2种以上的组合。有机溶剂为2种或2种以上的组合的情况下，这里所说的有机溶剂的体积浓度是指各有机溶剂中的有机溶剂的体积浓度之和。
硫酸化反应溶液优选为实质上不含有机溶剂的溶液，更优选为不含有机溶剂的溶液。“实质上不含有机溶剂的溶液”是指仅含有如下程度的有机溶剂的溶液，所述程度使得：与使用不含有机溶剂的溶液(将制备实质上不含有机溶剂的溶液时混合的有机溶剂置换为水等无机溶剂从而制备的溶液)时相比，所得到的硫酸化糖胺聚糖的硫酸化程度完全不发生变化(增加或减少)、或者几乎不发生变化(增加或减少)。具体而言，“硫酸化程度几乎不发生变化”可以指：在以硫酸化糖胺聚糖的硫酸化度或硫含量为指标进行比较时，仅发生20％以下、10％以下、5％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、或0.1％以下变化。即，“硫酸化程度几乎不发生变化”可以指：在使用不含有机溶剂的溶液进行硫酸化反应时的硫酸化度或硫含量为n％的情况下，使用实质上不含有机溶剂的溶液进行硫酸化反应时的硫酸化度或硫含量为0.8n％以上且1.2n％以下、0.9n％以上且1.1n％以下、0.95n％以上且1.05n％以下、0.98n％以上且1.02n％以下、0.99n％以上且1.01n％以下、0.995n％以上且1.005n％以下、或0.999n％以上且1.001n％以下。具体而言，这样的“实质上不含有机溶剂的溶液”可以指：以体积浓度(v/v)计，含有超过0％且20％以下、超过0％且10％以下、超过0％且5％以下、超过0％且2％以下、超过0％且1％以下、超过0％且0.5％以下、或超过0％且0.1％以下有机溶剂的溶液。
此外，对硫酸化反应溶液中含有的无机溶剂的量没有特别限制，可以根据无机溶剂的种类、所期望的硫酸化程度等各条件来适当设定。在本发明的硫酸化方法中，例如可以按照硫酸化反应溶液中的无机溶剂的体积浓度(v/v)达到以下所例示的浓度范围的方式来使用无机溶剂。无机溶剂的体积浓度例如可以为1％以上、5％以上、10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上、99％以上、99.9％以上、100％。无机溶剂的体积浓度例如可以为100％以下、99％以下、95％以下、90％以下、80％以下、60％以下、40％以下、20％以下、10％以下、5％以下。作为无机溶剂的体积浓度，优选例示1％～100％、20％～100％、40％～100％、60％～100％、80％～100％、90％～100％、95％～100％等。无机溶剂可以仅为1种也可以为2种或2种以上的组合。在无机溶剂为2种或2种以上的组合的情况下，这里所说的无机溶剂的体积浓度是指各无机溶剂中的无机溶剂的体积浓度之和。
作为强碱性溶液，可以列举含有强碱的强碱性溶液。强碱只要是与水共存时使溶液呈强碱性的化合物则没有特别限制。强碱可以为与水共存时游离出氢氧根离子的化合物，也可以为离子化时游离出氢氧根离子的化合物。即，强碱可以为阿累尼乌斯碱。对这里所说的强碱的种类没有特别限制。作为强碱，可以列举：金属氢氧化物、四烷基氢氧化铵、胍、氨络合物氢氧化物。强碱优选为廉价且容易获得的化合物，优选为金属氢氧化物。作为金属氢氧化物，可以列举：碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物。金属氢氧化物优选为废弃、排水都容易的化合物，优选为碱金属氢氧化物。作为碱金属氢氧化物，可以列举：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂。
对硫酸化反应溶液中含有的强碱的量没有特别限制，可以根据强碱的种类、所期望的硫酸化程度、pH等各条件来适当设定。在本发明的硫酸化方法中，例如可以按照硫酸化反应溶液中的强碱的摩尔浓度达到以下所例示的浓度范围的方式来使用强碱。强碱的摩尔浓度例如可以为0.005M以上、0.01M以上、0.05M以上、0.1M以上、0.2M以上、0.5M以上、1M以上。强碱的摩尔浓度例如可以为10M以下、5M以下、4M以下、3M以下。作为强碱的摩尔浓度，优选例示0.005M～10M、0.01M～5M、0.01M～4M、0.05M～5M、0.05M～4M、0.1M～5M、0.1M～4M、0.2M～5M、0.2M～4M、0.5M～5M、0.5M～4M、1M～3M等。强碱可以仅为1种也可以为2种或2种以上的组合。在强碱为2种或2种以上的组合的情况下，这里所说的强碱的摩尔浓度是指各强碱中的强碱的摩尔浓度之和。此外，这里所说的强碱的摩尔浓度也意味着氢氧根离子的摩尔浓度。
强碱的形状可以为气体，也可以为粉末、颗粒等固体，还可以为液体。这里所说的液体可以为使气体、固体的强碱与溶剂共存而成的液体。这里所说的溶剂可以为有机溶剂，也可以为无机溶剂，还可以为有机溶剂与无机溶剂的混合溶剂。此外，这里所说的溶剂可以为溶解所共存的强碱的溶剂，也可以为不溶解所共存的强碱的溶剂。这里所说的不溶解强碱的溶剂可以为完全不溶解所共存的强碱的溶剂，也可以为将所共存的强碱部分溶解、但不完全溶解的溶剂。
供于本发明的硫酸化方法的GAG只要在本发明所属的技术领域中被视作GAG则没有特别限制。GAG是具有含氨基糖的二糖反复聚合而成的结构来作为骨架的直链状的多糖。氨基糖可以为己糖胺(HexN)，也可以为葡糖胺(GlcN)，还可以为半乳糖胺(GalN)。己糖胺(HexN)可以为N-乙酰己糖胺(HexNAc)，也可以为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，还可以为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为具有硫酸基的GAG，也可以为不具有硫酸基的GAG。作为具有硫酸基的GAG，可以列举：CS、DS、HS、HEP、AS、KS、KPS。具有硫酸基的GAG可以为通过本发明的硫酸化方法、公知的硫酸化方法等而硫酸化了的GAG。作为不具有硫酸基的GAG，可以列举：CH、HA、HPN、Testosteronan。此外，供于本发明的硫酸化方法的GAG也可以为脱硫酸化了的GAG。脱硫酸化了的GAG是指：与进行脱硫酸化反应前的具有硫酸基的GAG相比硫酸化程度降低的GAG，并不限于完全不具有硫酸基的GAG。对供于脱硫酸化反应的GAG没有特别限制，可以为上述所例示的具有硫酸基的GAG。作为脱硫酸化GAG，可以列举：dCH、dHEP、ACH。
供于本发明的硫酸化方法的GAG优选为具有含酸性糖的二糖反复聚合而成的结构作为骨架的直链状的多糖(即酸性多糖)。酸性糖可以为己糖醛酸(HexA)，也可以为葡萄糖醛酸(GlcA)，还可以为艾杜糖醛酸(IdoA)。即，供于本发明的硫酸化方法的GAG优选为具有HexA残基的GAG。作为酸性多糖，可以列举：CS、DS、CH、HA、HS、HEP、HPN、AS、ACH、Testosteronan。
如上所述，供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为具有含有氨基糖和酸性糖的二糖反复聚合而成的结构作为骨架的直链状的多糖。供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为含有氨基糖和HexA作为构成成分的多糖，也可以为仅含有氨基糖和GlcA的多糖，还可以为仅含有氨基糖和IdoA的多糖，还可以为含有氨基糖、GlcA、IdoA的多糖。关于仅含有氨基糖和GlcA作为构成成分的多糖，可以列举：CS、CH、HA、HPN、Testosteronan。关于仅含有氨基糖和IdoA作为构成成分的多糖，可以列举：AS、ACH。关于含有氨基糖、GlcA、IdoA作为构成成分的多糖，可以列举：DS、HS、HEP。
关于含有IdoA作为构成成分的多糖，除了上述所例示的多糖以外，也可以为将GlcA残基异构化为IdoA残基而得到的多糖。例如，供于本发明的硫酸化方法的GAG也可以为：将含有GlcA作为构成成分的多糖的部分或全部GlcA残基异构化为IdoA残基而得到的多糖。作为这样的多糖，可以列举：部分或全部GlcA残基异构化为IdoA残基的HPN异构体(异构化肝素前体)。HPN的异构化可以参照例如文献(WO2014/200045)中记载的方法来进行。
关于含有GlcA作为构成成分的多糖，除了上述所例示的多糖以外，也可以为将IdoA残基异构化为GlcA残基而得到的多糖。例如，供于本发明的硫酸化方法的GAG也可以为：将含有IdoA作为构成成分的多糖的部分或全部IdoA残基异构化为GlcA残基而得到的多糖。作为这样的多糖，可以列举：部分或全部IdoA残基异构化为GlcA残基的dHEP或HEP的异构体(异构化肝素)、ACH或AS的异构体(异构化Acharan)。dHEP、ACH的异构化可以参照例如文献(WO2014/200045)中记载的方法来进行。
供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为具有侧链的糖残基的GAG，也可以为不具有侧链的糖残基的GAG。作为侧链的糖残基，可以列举果糖(Frc)残基。作为具有侧链的糖残基的GAG，可以列举具有Frc残基作为侧链的CH、即K4多糖(果糖基化软骨素)。供于本发明的硫酸化方法的GAG优选为不具有侧链的糖残基的GAG。
供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为GAG本身，也可以为GAG的衍生物。GAG的衍生物是指：相对于GAG本身，发生了取代基、官能团的添加、脱离的GAG。GAG的衍生物只要是具有通过本发明的硫酸化方法进行硫酸化的部位的GAG则没有特别限制。作为通过本发明的硫酸化方法进行硫酸化的部位，可以列举：羟基、氨基。这里所说的羟基可以为GAG原本具有的羟基(GAG的糖残基的羟基)。这里所说的氨基可以为GAG原本具有的氨基(GAG的糖残基的氨基)。作为GAG的衍生物，可以列举：脱去了乙酰基(脱乙酰化)的GAG；添加了疏水基(甲基等烷基、乙酰基等酰基、苯基等芳基等)的GAG。
作为供于本发明的硫酸化方法的GAG的衍生物，可以列举脱去了GAG的乙酰基(脱乙酰化)而成的GAG(以下称为“脱乙酰化GAG”。)。这里所说的脱乙酰化可以为氨基的脱乙酰化(N-脱乙酰化)，在一个方式中，脱乙酰化GAG可以为N-脱乙酰化GAG。脱乙酰化GAG可以为GAG的糖残基的乙酰基完全或部分性脱离而成的产物。此外，作为供于本发明的硫酸化方法的GAG衍生物，可以列举在GAG中引入烷基(烷基化)而成的GAG(以下称为“烷基化GAG”。)。这里所说的烷基化可以为羟基的烷基化(O-烷基化)，在一个方式中，烷基化GAG可以为O-烷基化GAG。烷基化GAG可以为GAG的糖残基的伯羟基或仲羟基、醛基等官能团被完全或部分性烷基化而成的产物。作为烷基化，可以列举：甲基化、乙基化。
对供于本发明的硫酸化方法的GAG的来源没有特别限制，可以将化学合成的、酶促合成的、来自动物或微生物的GAG等供于本发明的硫酸化方法。供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为通过公知的方法等制备而成的GAG，也可以为市售的GAG。
供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为GAG本身，也可以为与其它物质形成了复合物的GAG。作为这里所说的其它物质，没有特别限制，可以列举蛋白质。在本发明的硫酸化方法中，例如也可以将蛋白聚糖等GAG与蛋白质的复合物供于GAG的硫酸化反应。供于本发明的硫酸化方法的GAG优选为未与其它物质形成复合物的GAG。
对供于本发明的硫酸化方法的GAG的分子量没有特别限制，可以为任意的值。分子量例如可以为4MDa(兆道尔顿)(400万Da)以下、3MDa以下、2MDa以下、1MDa以下、500kDa以下、200kDa以下、100kDa以下、50kDa以下。分子量例如可以为5kDa以上、10kDa以上、20kDa以上、30kDa以上、50kDa以上、100kDa以上、500kDa以上、1MDa以上、2MDa以上。作为分子量，优选例示5kDa～4MDa、5kDa～3MDa、5kDa～2MDa、5kDa～1MDa、5kDa～500kDa、5kDa～100kDa、5kDa～50kDa、10kDa～3MDa、10kDa～1MDa、10kDa～500kDa、10kDa～100kDa、10kDa～50kDa、20kDa～100kDa、20kDa～50kDa、30kDa～50kDa、500kDa～4MDa、500kDa～3MDa、1MDa～4MDa、1MDa～3MDa、2MDa～3MDa等。这里所说的分子量是指重均分子量。在GAG为与其它物质的复合物的情况下，这里所说的分子量可以为GAG本身的分子量。GAG的分子量例如可以通过公知的方法来测定。具体而言，GAG的分子量例如可以为通过凝胶过滤色谱测定的重均分子量。更具体而言，GAG的分子量例如可以通过后述＜参考例4＞或＜参考例5＞中记载的方法来测定。
对硫酸化反应溶液中含有的GAG的量没有限制，可以根据强碱性溶液的种类和液量、所期望的硫酸化程度等各条件来适当设定。在本发明的硫酸化方法中，例如可以按照硫酸化反应溶液中的GAG的重量浓度(w/v)达到以下所例示的浓度范围的方式来使用GAG。GAG的重量浓度例如可以为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、1％以上。GAG的重量浓度例如可以为50％以下、40％以下、30％以下、20％以下。作为GAG的重量浓度，优选例示0.001％～50％、0.01％～40％、0.1％～30％、0.1％～20％、1％～20％、1％～10％、0.1％～10％、0.1％～1％等。GAG可以仅为1种也可以为2种或2种以上的组合。在GAG为2种或2种以上的组合的情况下，这里所说的GAG的重量浓度是指各GAG中的GAG的重量浓度之和。这里所说的GAG的重量浓度可以为GAG的干燥粉末的重量除以硫酸化反应溶液的液量而得的值，也可以为GAG的通过浓度分析法测得的测定值。作为GAG的浓度分析法，可以列举咔唑硫酸法(BITTER T,MUIR HM.,Anal Biochem.1962Oct；4:330-4.)。
GAG的形状可以为真空干燥物、冷冻干燥物、粉末、颗粒等固体，也可以为液体。这里所说的液体可以为使固体的GAG与溶剂共存而成的液体。这里所说的溶剂可以为有机溶剂，也可以为无机溶剂，还可以为有机溶剂与无机溶剂的混合溶剂。此外，这里所说的溶剂可以为溶解所共存的GAG的溶剂，也可以为不溶解所共存的GAG的溶剂。这里所说的不溶解GAG的溶剂可以为完全不溶解所共存的GAG的溶剂，也可以为将所共存的GAG部分溶解、但不完全溶解的溶剂。
硫酸化剂只要是能够对GAG进行硫酸化的化合物则没有特别限制。硫酸化剂例如可以为硫酸化反应中通常使用的公知的硫酸化剂。硫酸化剂例如可以为三氧化硫本身、与三氧化硫的复合物、氯磺酸等卤代磺酸等。硫酸化剂优选为与三氧化硫的复合物。作为与三氧化硫的复合物，可以列举三氧化硫络合物。三氧化硫络合物是三氧化硫和路易斯碱配位键合成的化合物。作为这里所说的路易斯碱，可以列举：胺、吡啶。作为三氧化硫络合物，可以列举：含有三氧化硫和胺的络合物(三氧化硫胺络合物)、含有三氧化硫和吡啶的络合物(三氧化硫吡啶络合物)。作为三氧化硫胺络合物，可以列举：三氧化硫三烷基胺络合物。作为三氧化硫三烷基胺络合物，可以列举：三氧化硫三甲胺络合物、三氧化硫二甲基乙胺络合物、三氧化硫甲基二乙胺络合物、三氧化硫三乙胺络合物。
对硫酸化反应溶液中含有的硫酸化剂的量没有特别限制，可以根据硫酸化剂的种类、所期望的硫酸化程度等各条件来适当设定。在本发明的硫酸化方法中，例如可以按照硫酸化反应溶液中的硫酸化剂的重量浓度(w/v)达到以下所例示的浓度范围的方式来使用硫酸化剂。硫酸化剂的重量浓度例如可以为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、1％以上。硫酸化剂的重量浓度例如可以为100％以下、60％以下、40％以下、20％以下。作为硫酸化剂的重量浓度，优选例示0.001％～100％、0.01％～60％、0.1％～40％、1％～20％等。硫酸化剂可以仅为1种也可以为2种或2种以上的组合。在硫酸化剂为2种或2种以上的组合的情况下，这里所说的硫酸化剂的重量浓度是指，各硫酸化剂中的硫酸化剂的重量浓度之和。
此外，在本发明的硫酸化方法中，例如可以按照硫酸化剂的量相对于硫酸化反应溶液中含有的GAG的构成二糖单元的总数达到以下所示的当量范围的方式来使用硫酸化剂。以下所示的硫酸化剂的量中的“当量”在没有特别声明时指“摩尔当量”。硫酸化剂的量相对于GAG的构成二糖单元的总数例如可以为0.001当量以上、0.01当量以上、0.1当量以上。硫酸化剂的量相对于GAG的构成二糖单元的总数例如可以为200当量以下、120当量以下、60当量以下、30当量以下、10当量以下、5当量以下。作为硫酸化剂的量相对于GAG的构成二糖单元的总数，优选例示0.001当量～200当量、0.01当量～120当量、0.1当量～60当量、0.1当量～30当量、0.1当量～10当量、0.1当量～5当量等。在硫酸化剂为2种或2种以上的组合的情况下，这里所说的硫酸化剂的量相对于GAG的构成二糖单元的总数是指，各硫酸化剂中的硫酸化剂的量相对于GAG的构成二糖单元的总数之和。GAG的构成二糖单元的总数例如可以通过公知的方来测定。具体而言，GAG的构成二糖单元的总数例如可以通过后述＜参考例6＞、＜参考例10＞、＜参考例11＞中记载的二糖分析法来测定。此外，GAG的构成二糖单元的总数例如还可以通过咔唑硫酸法(BITTER T,MUIR HM.,Anal Biochem.1962Oct；4:330-4.)来测定。
硫酸化剂的形状可以为气体，也可以为粉末、颗粒等固体，还可以为液体。这里所说的液体可以为使气体、固体的硫酸化剂与溶剂共存而成的液体。这里所说的溶剂可以为有机溶剂，也可以为无机溶剂，还可以为有机溶剂与无机溶剂的混合溶剂。此外，这里所说的溶剂可以为溶解所共存的硫酸化剂的溶剂，也可以为不溶解所共存的硫酸化剂的溶剂。这里所说的不溶解硫酸化剂的溶剂可以为完全不溶解所共存的硫酸化剂的溶剂，也可以为将所共存的硫酸化剂部分溶解、但不完全溶解的溶剂。
硫酸化反应溶液可以为作为除了溶剂以外的成分仅含有GAG和硫酸化剂的强碱性溶液，也可以为作为除了溶剂以外的成分仅含有GAG、硫酸化剂、强碱的强碱性溶液，还可以为作为除了溶剂以外的成分进一步含有除了上述以外的其它成分的强碱性溶液。这里所说的其它成分只要是即使含有在硫酸化反应溶液中、硫酸化反应也能够进行的成分则没有特别限制。作为这样的其它成分，可以列举：碱金属盐、碱土金属盐、磷酸盐、硫酸盐、表面活性剂、缓冲剂、来自于进行GAG的提取的动物或微生物的成分(核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质等)。作为其它成分，具体可以列举：硫酸钠、来自大肠杆菌等微生物的成分。
在本发明的硫酸化方法中，用于硫酸化反应的物质可以以任意的顺序添加或同时添加而使其共存。硫酸化反应例如可以以任意的顺序添加GAG、硫酸化剂、无机溶剂以及根据需要使用的强碱、其它成分、有机溶剂来进行。此外，在本发明的硫酸化方法中，还可以在制备硫酸化反应溶液后进一步添加任意的溶剂。例如，在所制备的硫酸化反应溶液为部分或全部的强碱、硫酸化剂不溶解的状态的情况下，可以进一步添加使它们溶解所需的溶剂，从而使其完全溶解。硫酸化反应溶液的制备优选在每次添加所使用的物质时进行适当搅拌而将其混合。
在本发明的硫酸化方法中，硫酸化反应溶液中的GAG可以为完全不溶的状态，也可以为部分溶解、但不完全溶解的状态，还可以为完全溶解的状态。在硫酸化反应溶液中的GAG为完全不溶的状态或部分溶解、但不完全溶解的状态的情况下，优选适当搅拌硫酸化反应溶液来保持使GAG分散在溶剂中的状态。
对进行硫酸化反应的温度没有特别限制，可以根据硫酸化剂的种类、所期望的硫酸化程度等各条件来适当设定。在本发明的硫酸化方法中，进行硫酸化反应的温度例如可以按照达到以下所例示的温度范围的方式来设定。进行硫酸化反应的温度例如可以为0℃以上、4℃以上、10℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃以上。进行硫酸化反应的温度例如可以为100℃以下、90℃以下、80℃以下、70℃以下、60℃以下。作为进行硫酸化反应的温度，优选例示0℃～100℃、0℃～60℃、4℃～90℃、4℃～60℃、10℃～80℃、20℃～70℃、20℃～60℃、30℃～70℃、40℃～60℃等。
对进行硫酸化反应的时间没有特别限制，可以根据硫酸化剂的种类、所期望的硫酸化程度等各条件来适当设定。在本发明的硫酸化方法中，进行硫酸化反应的时间例如可以按照达到以下所例示的时间范围的方式来设定。进行硫酸化反应的时间例如可以为1分钟以上、5分钟以上、10分钟以上、20分钟以上、30分钟以上、1小时以上。进行硫酸化反应的时间例如可以为168小时以下、48小时以下、24小时以下、18小时以下、6小时以下、3小时以下。作为进行硫酸化反应的时间，优选例示1分钟～168小时、5分钟～168小时、5分钟～48小时、10分钟～24小时、20分钟～18小时、30分钟～6小时、1小时～3小时等。
硫酸化反应虽然也可以在静置的状态下进行，但优选适当搅拌硫酸化反应溶液来保持使GAG和硫酸化剂均匀分散在溶液中的状态。
在本发明中，糖残基(HexN、HexA等)优选为D体。
根据本发明的硫酸化方法，可以对GAG进行硫酸化。在本发明的硫酸化方法中，硫酸化可以为氨基的硫酸化(N-硫酸化)和/或羟基的硫酸化(O-硫酸化)。换言之，硫酸化可以为N-硫酸化且O-硫酸化(N,O-硫酸化)、N-硫酸化、或O-硫酸化。
(2)本发明的硫酸化GAG的制造方法1
本发明的硫酸化GAG的制造方法1(以下称为“本发明的制造方法1”。)，是特征在于包含进行本发明的硫酸化方法的工序的硫酸化GAG的制造方法。
在本发明中，硫酸化GAG是指与进行硫酸化反应前的GAG相比硫酸化程度提高了的GAG，换言之，是指与进行硫酸化反应前的GAG相比，表征GAG的硫酸化程度的指标增加了的GAG。
表征GAG的硫酸化程度的指标例如可以以下述形式示出：将用GAG所具有的硫酸基的个数除以构成二糖单元的个数而算出的值(每构成二糖单元的硫酸基的个数平均值)换算为百分率而得的值(以下称为“硫酸化度”。)。硫酸化度例如可以通过公知的方法来算出。具体而言，硫酸化度例如可以通过＜参考例7＞、＜参考例8＞、＜参考例13＞中记载的方法来算出。
此外，表征GAG的硫酸化程度的指标例如也可以以下述形式示出：将用GAG所具有的硫原子的量(GAG所具有的硫原子的个数乘以硫的原子量而得的值)除以GAG的分子量而算出的值换算为百分率而得的值(以重量百分比浓度(w/w)表示的、硫原子的总重量相对于构成GAG的原子的总重量的值)(以下称为“硫含量”。)。硫含量例如可以通过公知的方法来测定。具体而言，硫含量例如可以通过氧瓶燃烧法来测定。此外，具体而言，硫含量例如可以通过＜参考例9＞、＜参考例12＞中记载的方法来算出。
如前所述，供于本发明的硫酸化方法的GAG可以为GAG本身，也可以为异构化的GAG，还可以为具有侧链的GAG，还可以为GAG的衍生物。即，在本发明中，硫酸化GAG可以为GAG本身被硫酸化的产物，也可以为异构化的GAG被硫酸化的产物，还可以为具有侧链的GAG被硫酸化的产物，还可以为GAG的衍生物被硫酸化的产物。作为GAG的衍生物，可以列举：脱乙酰化的GAG、附加有疏水基(甲基等烷基、乙酰基等酰基、苯基等芳基等)的GAG，具体可以列举：脱乙酰化GAG、烷基化GAG。在本发明中，硫酸化GAG可以为硫酸化的GAG的衍生物，具体而言，例如可以为硫酸化的脱乙酰化GAG，也可以为硫酸化的烷基化GAG。
本发明的制造方法1除了进行本发明的硫酸化方法的工序以外，根据需要可以进一步含有其它工序。作为这里所说的其它工序，可以列举使硫酸化反应终止的工序。硫酸化反应例如可以通过如下方式终止：将硫酸化反应溶液的pH调节为比适合硫酸化反应的pH还低、优选使硫酸化反应溶液呈中性或弱酸性。具体而言，硫酸化反应例如可以通过使pH为0～8、优选使pH为2～8、更优选使pH为4～8、进一步优选使pH为6～8来终止。硫酸化反应例如可以通过在硫酸化反应溶液中添加中和成分、酸性成分等来终止。这里所说的酸性成分只要是与水共存时使溶液呈酸性的化合物则没有特别限制。作为酸性成分，具体可以列举乙酸、盐酸。
此外，作为这里所说的其它工序，也可以列举进行硫酸化GAG的乙酰化的工序。对将硫酸化GAG乙酰化的方法没有特别限制，例如可以通过公知的方法来进行。作为将硫酸化GAG乙酰化的方法，可以列举使用乙酸酐的方法。作为使用乙酸酐的方法，可以列举公知的文献(Purkerson ML,Tollefsen DM,Klahr S.,J Clin Invest.1988Jan；81(1):69-74.)中记载的方法。
进而，作为这里所说的其它工序，还可以列举进行硫酸化GAG的纯化的工序。对纯化硫酸化GAG的方法没有特别限制，例如可以通过公知的方法来进行。作为纯化硫酸化GAG的方法，可以列举：利用乙醇等溶剂的醇沉法、阴离子交换等色谱法。
(3)本发明的硫酸化GAG的制造方法2
本发明的硫酸化GAG的制造方法2(以下称为“本发明的制造方法2”。)，是特征在于除了含有通过本发明的硫酸化方法进行硫酸化反应的工序以外、进一步包含进行GAG的脱乙酰化反应(对GAG进行脱乙酰化的反应)的工序的硫酸化GAG的制造方法。与进行硫酸化反应和脱乙酰化反应前的GAG相比，通过本发明的制造方法2制造的硫酸化GAG是乙酰化程度降低了的GAG，换言之，是与进行硫酸化反应和脱乙酰化反应前的GAG相比，表征乙酰化程度的指标降低了的GAG。表征乙酰化程度的指标例如可以以下述形式来示出：将用GAG所具有的乙酰基个数除以构成二糖单元的个数而算出的值(乙酰基相对于构成二糖单元的个数平均值)换算为百分率而得的值(以下称为“脱乙酰化度”。)。
在本发明的制造方法2中，脱乙酰化可以为氨基的脱乙酰化(N-脱乙酰化)和/或羟基的脱乙酰化(O-脱乙酰化)。换言之，脱乙酰化可以为N-脱乙酰化且O-脱乙酰化(N,O-脱乙酰化)、N-脱乙酰化、或O-脱乙酰化。这里所说的氨基可以为GAG原本具有的氨基(GAG的糖残基的氨基)。这里所说的羟基可以为GAG原本具有的羟基(GAG的糖残基的羟基)。
在本发明的制造方法2中，进行脱乙酰化反应的方法例如为碱水解法。在本发明的制造方法2中，脱乙酰化反应例如可以通过使碱性的溶液与GAG共存来进行。由此，脱乙酰化反应例如可以通过在碱性的溶液中添加GAG、使含有GAG的溶液呈碱性来进行。
在本发明的制造方法2中，可以同时进行脱乙酰化反应和硫酸化反应，也可以在进行脱乙酰化反应后进行硫酸化反应，还可以在进行硫酸化反应后进行脱乙酰化反应。此外，在本发明的制造方法2中，在进行脱乙酰化反应时和进行硫酸化反应时，溶液的pH、溶液中含有的成分可以分别相同也可以不同。例如，在进行脱乙酰化反应后进行硫酸化反应的情况下，既可以进行脱乙酰化反应后添加酸、碱来改变溶液的pH，然后进行硫酸化反应；也可以进行脱乙酰化反应后添加其它成分来改变溶液中含有的成分，然后进行硫酸化反应。
对进行脱乙酰化反应时的溶液pH(以下称为“脱乙酰化反应时的pH”。)没有特别限制，可以根据所期望的脱乙酰化程度等各条件来适当设定。脱乙酰化反应时的pH例如可以为pH11以上、pH11.5以上、pH12以上、pH12.5以上、pH13以上。脱乙酰化反应时的pH例如可以为pH14以下、pH13.5以下。
进行脱乙酰化反应时的溶液的温度(以下称为“脱乙酰化反应时的温度”。)没有特别限制，可以根据溶液的pH、所期望的脱乙酰化程度等各条件来适当设定。脱乙酰化反应时的温度例如可以按照达到以下所例示的温度范围的方式来设定。脱乙酰化反应时的温度例如可以为20℃以上、30℃以上、40℃以上。脱乙酰化反应时的温度例如可以为100℃以下、90℃以下、80℃以下、70℃以下、60℃以下。作为脱乙酰化反应时的温度，优选例示20℃～100℃、20℃～90℃、30℃～80℃、30℃～70℃、40℃～60℃等。
对进行脱乙酰化反应的时间没有特别限制，可以根据溶液的温度和pH、所期望的脱乙酰化程度等各条件来适当设定。进行脱乙酰化反应的时间例如可以按照达到以下所例示的时间范围的方式来设定。进行脱乙酰化反应的时间例如可以为1分钟以上、5分钟以上、10分钟以上、30分钟以上、1小时以上。进行脱乙酰化反应的时间例如可以为72小时以下、48小时以下、24小时以下、8小时以下、4小时以下。作为进行脱乙酰化反应的时间，优选例示1分钟～72小时、5分钟～48小时、10分钟～24小时、30分钟～8小时、1小时～4小时等。
本发明的制造方法2根据需要可以进一步含有其它工序。作为这里所说的其它工序，可以列举例如本发明的制造方法1中所列举的其它工序。
(4)本发明的硫酸化GAG的制造方法3
本发明的硫酸化GAG的制造方法3(以下称为“本发明的制造方法3”。)，是特征在于除了含有通过本发明的硫酸化方法进行硫酸化反应的工序以外、进一步包含进行GAG的烷基化反应(对GAG进行烷基化的反应)的工序的硫酸化GAG的制造方法。与进行硫酸化反应和烷基化反应前的GAG相比，通过本发明的制造方法3制造的硫酸化GAG为烷基化程度提高了的GAG，换言之，是与进行硫酸化反应和烷基化反应前的GAG相比，表征烷基化程度的指标提高了的GAG。表征烷基化程度的指标例如可以以下述形式来示出：将用GAG所具有的烷基个数除以构成二糖单元的个数而算出的值(烷基个数相对于构成二糖单元的平均值)换算为百分率而得的值(以下称为“烷基化度”。)。作为这里所说的烷基化，具体可以列举：甲基化、乙基化。
在本发明的制造方法3中，烷基化可以为氨基的烷基化(N-烷基化)和/或羟基的烷基化(O-烷基化)。换言之，烷基化可以为N-烷基化且O-烷基化(N,O-烷基化)、N-烷基化、或O-烷基化。这里所说的氨基可以为GAG原本具有的氨基(GAG的糖残基的氨基)。这里所说的羟基可以为GAG原本具有的羟基(GAG的糖残基的羟基)。
在本发明的制造方法3中，烷基化反应例如可以通过使GAG和烷基化剂在碱性的溶液中共存来进行。由此，烷基化反应例如可以通过如下方式来进行，在含有GAG的碱性的溶液中添加烷基化剂；在含有烷基化剂的碱性的溶液中添加GAG；使含有GAG和烷基化剂的溶液呈碱性。
烷基化剂为烷基化反应中通常使用的公知的烷基化剂即可，只要是能够将GAG烷基化的化合物则没有特别限制。作为烷基化剂，可以列举卤代烷基。作为卤代烷基，可以列举：碘甲烷、碘乙烷。
在本发明的制造方法3中，可以同时进行烷基化反应和硫酸化反应，也可以在进行烷基化反应后进行硫酸化反应，还可以在进行硫酸化反应后进行烷基化反应。此外，在本发明的制造方法3中，在进行烷基化反应时和进行硫酸化反应时，溶液的pH、溶液中含有的成分可以分别相同也可以不同。例如，在进行烷基化反应后进行硫酸化反应的情况下，既可以进行烷基化反应后添加酸、碱来改变溶液的pH，然后进行硫酸化反应；也可以在进行烷基化反应后添加其它成分来改变溶液中含有的成分，然后进行硫酸化反应。
对进行烷基化反应时的溶液pH(以下称为“烷基化反应时的pH”。)没有特别限制，可以根据所期望的烷基化程度等各条件来适当设定。烷基化反应时的pH例如可以为pH11以上、pH11.5以上、pH12以上、pH12.5以上、pH13以上。烷基化反应时的pH例如可以为pH14以下、pH13.5以下。
对进行烷基化反应时的溶液的温度(以下称为“烷基化反应时的温度”。)没有特别限制，可以根据溶液的pH、所期望的烷基化程度等各条件来适当设定。烷基化反应时的温度例如可以按照达到以下所例示的温度范围的方式来设定。烷基化反应时的温度例如可以为20℃以上、30℃以上、40℃以上。烷基化反应时的温度例如可以为100℃以下、90℃以下、80℃以下、70℃以下、60℃以下。作为烷基化反应时的温度，优选例示20℃～100℃、20℃～90℃、30℃～80℃、30℃～70℃、40℃～60℃等。
对进行烷基化反应的时间没有特别限制，可以根据溶液的温度和pH、所期望的烷基化程度等各条件来适当设定。进行烷基化反应的时间例如可以按照达到以下所例示的时间范围的方式来设定。进行烷基化反应的时间例如可以为1分钟以上、5分钟以上、10分钟以上、30分钟以上、1小时以上。进行烷基化反应的时间例如可以为72小时以下、48小时以下、24小时以下、8小时以下、4小时以下。作为进行烷基化反应的时间，优选例示1分钟～72小时、5分钟～48小时、10分钟～24小时、30分钟～8小时、1小时～4小时等。
本发明的制造方法3根据需要可以进一步含有其它工序。作为这里所说的其它工序，可以列举例如本发明的制造方法1中所列举的其它工序。
在本发明的制造方法2和本发明的制造方法3中，碱性的溶液可以沿用本发明的制造方法1中的关于强碱性溶液的记载。例如，碱性的溶液可以为含有强碱的溶液，此时的强碱可以沿用本发明的制造方法1中的关于强碱的记载。
在一个方式中，本发明的制造方法1、本发明的制造方法2、和本发明的制造方法3(以下总称为“本发明的制造方法”。)可以各自独立地为氨基和羟基被硫酸化的GAG(N,O-硫酸化GAG)的制造方法、氨基被硫酸化的GAG(N-硫酸化GAG)的制造方法、或羟基被硫酸化的GAG(O-硫酸化GAG)的制造方法。此外，当本发明的制造方法是特征在于含有2个以上反应的方法时，特征还可以在于这些反应通过一锅合成来进行。例如，特征还可以在于，本发明的制造方法2中的硫酸化反应和脱乙酰化反应通过一锅合成来进行。此外，例如特征还可以在于，本发明的制造方法3中的硫酸化反应和烷基化反应通过一锅合成来进行。一锅合成是指：在进行伴随有2个以上反应的多阶段合成时，在不对反应中间体进行纯化、分离的条件下制备目标产物的合成方法。在本发明的制造方法中，一锅合成也可以为进而在不进行溶剂置换的条件下制备目标产物的合成方法。
(5)本发明的硫酸化GAG
可以通过本发明的制造方法制造的硫酸化GAG(以下称为“本发明的硫酸化GAG”。)可以为在构成二糖单元的组成比(以下称为“二糖组成比”。)方面没有特别限制的GAG。本发明的硫酸化GAG的二糖组成比可以根据进行本发明的硫酸化方法时的各条件而控制为任意的值。具体而言，对GAG的种类和浓度、硫酸化剂和强碱的种类和量、pH、反应时间、反应温度、有机溶剂的浓度等各条件进行适当设定，设定为使反应产物成为具有所期望的二糖组成比的硫酸化GAG的条件即可。
本发明的硫酸化GAG例如可以为在二糖组成比方面具有以下特征的GAG。
以下所示的二糖组成比中的“％”在没有特别声明时是指“摩尔％”。在本发明的硫酸化GAG中，二糖组成比可以为任意的值。本发明的硫酸化GAG例如可以为在二糖组成比方面具有以下特征的GAG。关于本发明的硫酸化GAG的二糖组成比，例如在各二糖中可以各自独立地为99.9％以下、99％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下。此外，关于本发明的硫酸化GAG的二糖组成比，例如在各二糖中可以各自独立地为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上。作为本发明的硫酸化GAG的二糖组成比，在各二糖中各自独立地优选例示0.1％～99.9％、0.1％～99％、0.1％～95％、0.1％～90％、0.1％～85％、0.1％～80％、0.1％～75％、0.1％～70％、0.1％～65％、0.1％～60％、0.1％～55％、0.1％～50％、0.1％～45％、0.1％～40％、0.1％～35％、0.1％～30％、0.1％～25％、0.1％～20％、0.1％～15％、0.1％～10％、0.1％～9％、0.1％～8％、0.1％～7％、0.1％～6％、0.1％～5％、0.1％～4％、0.1％～3％、0.1％～2％、0.1％～1％、1％～5％、1％～6％、1％～7％、1％～8％、1％～9％、1％～10％、1％～15％、1％～20％、1％～25％、2％～5％、2％～6％、2％～7％、2％～8％、2％～9％、2％～10％、2％～15％、2％～20％、2％～25％、3％～5％、3％～6％、3％～7％、3％～8％、3％～9％、3％～10％、3％～15％、3％～20％、3％～25％、4％～5％、4％～6％、4％～7％、4％～8％、4％～9％、4％～10％、4％～15％、4％～20％、4％～25％、5％～6％、5％～7％、5％～8％、5％～9％、5％～10％、5％～15％、5％～20％、5％～25％、5％～30％、5％～40％、5％～50％、5％～60％、5％～70％、5％～80％、5％～90％、10％～15％、10％～20％、10％～25％、10％～30％、10％～40％、10％～50％、10％～60％、10％～70％、10％～80％、10％～90％、15％～20％、15％～25％、15％～30％、15％～40％、15％～50％、15％～60％、15％～70％、15％～80％、15％～90％、20％～25％、20％～30％、20％～40％、20％～50％、20％～60％、20％～70％、20％～80％、20％～90％、25％～30％、25％～40％、25％～50％、25％～60％、25％～70％、25％～80％、25％～90％、30％～40％、30％～50％、30％～60％、30％～70％、30％～80％、30％～90％、40％～50％、40％～60％、40％～70％、40％～80％、40％～90％等。
本发明的硫酸化GAG的二糖组成比例如可以通过公知的方法来测定。具体而言，二糖组成比例如可以通过后述＜参考例6＞、＜参考例10＞或＜参考例11＞中记载的二糖分析法来测定。
(6)本发明的硫酸化软骨素(本发明的硫酸软骨素)
在本发明的硫酸化GAG为对CH进行硫酸化而得到的GAG(以下称为“本发明的硫酸化CH”。)时，例如可以为在二糖组成比方面具有以下特征的GAG。在之后的说明中，分别将含有[HexA1-3GalN1-4]所示结构的二糖缩写为CH-0S、将含有[HexA1-3GalN(6S)1-4]所示结构的二糖缩写为CH-6S、将含有[HexA1-3GalN(4S)1-4]所示结构的二糖缩写为CH-4S、将含有[HexA(2S)1-3GalN1-4]所示结构的二糖缩写为CH-2S、将含有[HexA(2S)1-3GalN(6S)1-4]所示结构的二糖缩写为CH-diSD、将含有[HexA1-3GalN(4,6S)1-4]所示结构的二糖缩写为CH-diSE、将含有[HexA(2S)1-3GalN(4S)1-4]所示结构的二糖缩写为CH-diSB、将含有[HexA(2S)1-3GalN(4,6S)1-4]所示结构的二糖缩写为CH-triS。前述之中，式中，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“6S”表示6-O-硫酸基，“4S”表示4-O-硫酸基，“2S”表示2-O-硫酸基。“HexA”可以为GlcA或IdoA。关于“1-3糖苷键”，在HexA为GlcA的情况下可以为β1-3糖苷键，在HexA为IdoA的情况下可以为α1-3糖苷键。“1-4糖苷键”可以为β1-4糖苷键。上述中，各二糖不具有明确记载的硫酸基以外的硫酸基。上述中，“含有”这一表述包括了“由某某构成”的情况。由此，例如“含有[HexA1-3GalN1-4]所示结构的二糖”可以为“由[HexA1-3GalN1-4]所示结构构成的二糖”。此外，例如上述中，“GalN”可以为GalNAc。由此，例如“含有[HexA1-3GalN1-4]所示结构的二糖”可以为“含有[HexA1-3GalNAc1-4]所示结构的二糖”，也可以为“由[HexA1-3GalNAc1-4]所示结构构成的二糖”。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中具有硫酸基的二糖(除CH-0S以外的二糖)中CH-6S含量最多的GAG。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-6S所占的比例优选为10％以上、更优选为20％以上、进一步优选为30％以上、特别优选为40％以上。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-6S所占的比例可以为100％以下、80％以下、60％以下、50％以下。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-6S所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-6S所占的比例范围，具体可以列举例如：10％～100％、20％～80％、20％～60％、20％～50％、30％～60％、30％～50％、40％～50％。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中所含的CH-4S比CH-6S少的GAG。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-4S所占的比例优选为5％以下、更优选为4％以下、进一步优选为3％以下、特别优选为2％以下。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-4S所占的比例可以为0.1％以上、0.2％以上、0.5％以上、1％以上。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-4S所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-4S所占的比例范围，具体可以列举例如：0.1％～5％、0.2％～4％、0.2％～3％、0.2％～2％、0.5％～3％、0.5％～2％、1％～2％。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中所含的CH-2S比CH-4S多的GAG。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-2S所占的比例优选为3％以上、更优选为4％以上、进一步优选为5％以上、特别优选为6％以上。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-2S所占的比例可以为25％以下、20％以下、15％以下、10％以下。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-2S所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-2S所占的比例范围，具体可以列举例如：3％～25％、4％～20％、4％～15％、4％～10％、5％～15％、5％～10％、6％～10％。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中CH-2S相对于CH-4S的比例(2S/4S比)在以下所例示的范围的GAG。本发明的硫酸化CH的2S/4S比优选超过3、更优选为3.5以上、进一步优选为4以上、特别优选为5以上。本发明的硫酸化CH的2S/4S比可以为20以下、15以下、10以下。在本发明的硫酸化CH中，作为2S/4S比的范围，可以列举：超过3～20、超过3～15、3.5～15、3.5～10、4～10、5～10等。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中所含的CH-2S比CH-6S少的GAG。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-2S所占的比例优选为25％以下、更优选为20％以下、进一步优选为15％以下、特别优选为10％以下。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-2S所占的比例可以为3％以上、4％以上、5％以上、6％以上。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-2S所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-2S所占的比例范围，具体可以列举例如：3％～25％、4％～20％、4％～15％、4％～10％、5％～15％、5％～10％、6％～10％。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中CH-2S相对于CH-6S的比例(2S/6S比)在以下所例示的范围的GAG。本发明的硫酸化CH的2S/6S比优选为2以下、更优选为1.5以下、进一步优选1以下、特别优选为0.5以下。本发明的硫酸化CH的2S/6S比可以为超过0.1、0.125以上、0.15以上。在本发明的硫酸化CH中，作为2S/6S比的范围，可以列举：超过0.1～2、0.125～2、0.125～1.5、0.15～1.5、0.15～1、0.15～0.5等。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中实质上不具有CH-diSB的GAG。就本发明的硫酸化CH而言，CH-diSB所占的二糖组成比优选为1％以下、更优选为0.5％以下、特别优选为0.1％以下。此外，本发明的硫酸化CH也可以为：特征在于，在二糖组成比中不具有CH-diSB的GAG。
本发明的硫酸化CH例如可以为：特征在于，在二糖组成比中所含的CH-diSD比CH-4S多的GAG。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-diSD所占的比例优选为10％以上、更优选为15％以上、进一步优选为20％以上、特别优选为25％以上。就本发明的硫酸化CH而言，在二糖组成比中CH-diSD所占的比例可以为50％以下、40％以下、35％以下、30％以下。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-diSD所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-diSD所占的比例范围，具体可以列举例如：10％～50％、15％～40％、15％～35％、15％～30％、20％～35％、20％～30％、25％～30％、25％～40％、25％～50％。
在本发明的硫酸化CH中CH-0S、CH-diSE、CH-triS所占的二糖组成比在各二糖中可以各自独立地为任意的值。在本发明的硫酸化CH中，作为CH-0S、CH-diSE、CH-triS所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。
本发明的硫酸化CH的二糖组成比例如可以通过后述＜参考例6＞中记载的二糖分析法测定不饱和二糖的组成比而算出。具体而言，CH-0S的二糖组成比可以以ΔDi-0S的组成比的形式来测定，CH-6S的二糖组成比可以以ΔDi-6S的组成比的形式来测定，CH-4S的二糖组成比可以以ΔDi-4S的组成比的形式来测定，CH-2S的二糖组成比可以以ΔDi-2S的组成比的形式来测定，CH-diSD的二糖组成比可以以ΔDi-diSD的组成比的形式来测定，CH-diSE的二糖组成比可以以ΔDi-diSE的组成比的形式来测定，CH-diSB的二糖组成比可以以ΔDi-diSB的组成比的形式来测定，CH-triS的二糖组成比可以以ΔDi-triS的组成比的形式来测定。
对本发明的硫酸化CH的分子量没有特别限制，可以为任意的值。分子量例如可以为在前述“(1)本发明的硫酸化方法”中、作为供于本发明的硫酸化方法的GAG的分子量而例示的分子量。
对本发明的硫酸化CH的硫酸化度没有特别限制，可以为任意的值。硫酸化度例如可以为1％以上、5％以上、10％以上、25％以上、50％以上。硫酸化度例如可以为400％以下、200％以下、150％以下、125％以下。作为硫酸化度，优选例示1％～400％、5％～200％、10％～200％、10％～150％、10％～125％、25％～200％、25％～150％、25％～125％、50％～200％、50％～150％、50％～125％等。
(7)本发明的硫酸化透明质酸
在本发明的硫酸化GAG为对HA进行硫酸化而得到的GAG(以下称为“本发明的硫酸化HA”。)时，例如可以为在二糖组成比方面具有以下特征的GAG。在之后的说明中，分别将含有[HexA1-3GlcN1-4]所示结构的二糖缩写为HA-0S、将含有[HexA1-3GlcN(6S)1-4]所示结构的二糖缩写为HA-6S、将含有[HexA1-3GlcN(4S)1-4]所示结构的二糖缩写为HA-4S、将含有[HexA(2S)1-3GlcN1-4]所示结构的二糖缩写为HA-2S。前述中，式中，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“6S”表示6-O-硫酸基，“4S”表示4-O-硫酸基，“2S”表示2-O-硫酸基。“HexA”可以为GlcA或IdoA。关于“1-3糖苷键”，在HexA为GlcA的情况下可以为β1-3糖苷键，在HexA为IdoA的情况下可以为α1-3糖苷键。“1-4糖苷键”可以为β1-4糖苷键。上述中，“含有”这一表述包括了“由某某构成”的情况。由此，例如“含有[HexA1-3GlcN1-4]所示结构的二糖”可以为“由[HexA1-3GlcN1-4]构成的二糖”。此外，例如上述中，“GlcN”可以为GlcNAc。由此，例如“含有[HexA1-3GlcN1-4]所示结构的二糖”可以为“含有[HexA1-3GlcNAc1-4]所示结构的二糖”，也可以为“由[HexA1-3GlcNAc1-4]构成的二糖”。
本发明的硫酸化HA例如可以为：特征在于，在二糖组成比中具有HA-4S的GAG。在本发明的硫酸化HA中，HA-4S所占的二糖组成比可以为任意的值。在本发明的硫酸化HA中，HA-4S所占的二糖组成比例如可以为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、0.5％以上、1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上。HA-4S所占的二糖组成比例如可以为25％以下、20％以下、15％以下。在本发明的硫酸化HA中，作为CH-4S所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。在本发明的硫酸化HA中，作为HA-4S所占的比例范围，具体可以列举例如：0.1％～25％、1％～20％、1％～15％、2％～20％、2％～15％、3％～20％、3％～15％、4％～20％、4％～15％、5％～20％、5％～15％。
在本发明的硫酸化HA中，HA-0S、HA-6S、HA-2S所占的二糖组成比在各二糖中可以各自独立地为任意的值。在本发明的硫酸化HA中，作为HA-0S、HA-6S、HA-2S所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。
本发明的硫酸化HA的二糖组成比例如可以通过后述＜参考例10＞中记载的二糖分析法测定不饱和二糖的组成比而算出。具体而言，HA-0S的二糖组成比可以以ΔDiHA-0S的组成比的形式来测定，HA-6S的二糖组成比可以以ΔDiHA-6S的组成比的形式来测定，HA-4S的二糖组成比可以以ΔDiHA-4S的组成比的形式来测定，HA-2S的二糖组成比可以以ΔDiHA-2S的组成比的形式来测定。
对本发明的硫酸化HA的分子量没有特别限制，可以为任意的值。分子量例如可以为在前述“(1)本发明的硫酸化方法”中、作为供于本发明的硫酸化方法的GAG的分子量而例示的分子量。此外，本发明的硫酸化HA例如可以为特征在于为高分子的GAG。分子量例如可以为4MDa(兆道尔顿)以下、3.5MDa以下、3MDa以下、2.5MDa以下。分子量例如可以为1MDa以上、1.5MDa以上、2MDa以上。作为分子量，优选例示1MDa～4MDa、1MDa～3.5MDa、1MDa～3MDa、1MDa～2.5MDa、1.5MDa～4MDa、1.5MDa～3.5MDa、1.5MDa～3MDa、1.5MDa～2.5MDa、2MDa～4MDa、2MDa～3.5MDa、2MDa～3MDa、2MDa～2.5MDa等。这里所说的分子量是指重均分子量。硫酸化HA的分子量例如可以通过公知的方来测定。具体而言，硫酸化HA的分子量例如可以为通过凝胶过滤色谱测定的重均分子量。更具体而言，硫酸化HA的分子量例如可以通过后述＜参考例5＞中记载的方法来测定。
以下所示的硫含量中的“％”在没有特别声明时是指“质量％”。本发明的硫酸化HA例如可以为在硫含量方面具有以下特征的GAG。在本发明的硫酸化HA中，硫含量可以为任意的值。硫含量例如可以为10％以下、8％以下、6％以下、4％以下。硫含量例如可以为0.5％以上、1％以上、2％以上。作为硫含量，优选例示0.5％～10％、0.5％～8％、0.5％～6％、0.5％～4％、1％～10％、1％～8％、1％～6％、1％～4％、2％～10％、2％～8％、2％～6％、2％～4％等。
(8)本发明的硫酸化肝素前体
在本发明的硫酸化GAG为对HPN进行硫酸化而得到的GAG(以下称为“本发明的硫酸化HPN”。)时，例如可以为在二糖组成比方面具有以下特征的GAG。在之后的说明中，分别将含有[HexA1-4GlcN1-4]所示结构的二糖缩写为HS-0S、将含有[HexA1-4GlcNS1-4]所示结构的二糖缩写为HS-NS、将含有[HexA1-4GlcN(6S)1-4]所示结构的二糖缩写为HS-6S、将含有[HexA(2S)1-4GlcN1-4]所示结构的二糖缩写为HS-2S、将含有[HexA1-4Glc(NS，6S)1-4]所示结构的二糖缩写为HS-diS1、将含有[HexA(2S)1-4GlcNS1-4]所示结构的二糖缩写为HS-diS2、将含有[HexA(2S)1-4GlcNAc(6S)1-4]所示结构的二糖缩写为HS-diS3、将含有[HexA(2S)1-4Glc(NS，6S)1-4]所示结构的二糖缩写为HS-triS。前述中，式中，“1-4”表示1-4糖苷键，“6S”表示6-O-硫酸基，“NS”表示N-硫酸基，“2S”表示2-O-硫酸基。“HexA”可以为GlcA或IdoA。关于“HexA的还原末端侧的1-4糖苷键”，在HexA为GlcA的情况下可以为β1-4糖苷键，在HexA为IdoA的情况下可以为α1-4糖苷键。“HexA的非还原末端侧的1-4糖苷键”可以为α1-4糖苷键。上述中，各二糖不具有明确记载的硫酸基以外的硫酸基。上述中，“含有”这一表述包括了“由某某构成”的情况。由此，例如“含有[HexA1-4GlcN1-4]所示结构的二糖”可以为“由[HexA1-4GlcN1-4]构成的二糖”。此外，例如上述中，“GlcN”可以为GlcNAc。由此，例如“含有[HexA1-4GlcN1-4]所示结构的二糖”可以为“含有[HexA1-4GlcNAc1-4]所示结构的二糖”，也可以为“由[HexA1-4GlcNAc1-4]构成的二糖”。
在本发明的硫酸化HPN中，HS-0S、HS-NS、HS-6S、HS-2S、HS-diS1、HS-diS2、HS-diS3、HS-triS所占的二糖组成比在各二糖中可以各自独立地为任意的值。在本发明的硫酸化HPN中，作为HS-0S、HS-NS、HS-6S、HS-2S、HS-diS1、HS-diS2、HS-diS3、HS-triS所占的二糖组成比的范围，可以列举上述“(5)本发明的硫酸化GAG”中例示的二糖组成比的范围。
本发明的硫酸化HPN的二糖组成比例如可以通过后述＜参考例11＞中记载的二糖分析法测定不饱和二糖的组成比而算出。具体而言，HS-0S的二糖组成比可以以ΔDiHS-0S的组成比的形式来测定，HS-NS的二糖组成比可以以ΔDiHS-NS的组成比的形式来测定，HS-6S的二糖组成比可以以ΔDiHS-6S的组成比的形式来测定，HS-2S的二糖组成比可以以ΔDiHS-2S的组成比的形式来测定，HS-diS1的二糖组成比可以以ΔDiHS-diS1的组成比的形式来测定，HS-diS2的二糖组成比可以以ΔDiHS-diS2的组成比的形式来测定，HS-diS3的二糖组成比可以以ΔDiHS-diS3的组成比的形式来测定，HS-triS的二糖组成比可以以ΔDiHS-triS的组成比的形式来测定。
对本发明的硫酸化HPN的分子量没有特别限制，可以为任意的值。分子量例如可以为在前述“(1)本发明的硫酸化方法”中、作为供于本发明的硫酸化方法的GAG的分子量而例示的分子量。
对本发明的硫酸化HPN的硫酸化度没有特别限制，可以为任意的值。硫酸化度例如可以为1％以上、5％以上、10％以上、25％以上、50％以上。硫酸化度例如可以为400％以下、200％以下、150％以下、125％以下。作为硫酸化度，优选例示1％～400％、5％～200％、10％～200％、10％～150％、10％～125％、25％～200％、25％～150％、25％～125％、50％～200％、50％～150％、50％～125％等。
(9)本发明的硫酸化GAG的用途
在一个方式中，本发明的硫酸化GAG为：特征在于，具有与HEP、DS等含硫酸基的GAG同样的抗凝活性的GAG。由此，本发明的硫酸化GAG可以为特征在于具有肝素样的抗凝活性的糖胺聚糖，具体而言，可以为特征在于具有肝素样的抗凝活性的肝素前体。本发明的硫酸化GAG例如可以作为血液的抗凝剂来使用。
此外，在一个方式中，本发明的硫酸化GAG为：特征在于，二糖组成比与来自动物的GAG、使用有机溶剂的方法的硫酸化GAG等公知的GAG不同的GAG。由此，本发明的硫酸化GAG作为新型材料也是有用的。
实施例
以下，通过实施例来具体说明本发明，但这些例子对本发明的保护范围没有限定。
以下说明的实施例中，硫酸化反应的终止是通过添加乙酸或盐酸将硫酸化反应溶液中和至pH6～8来进行的。
以下说明的实施例中，添加的硫酸化剂的量中的当量是指摩尔当量。
以下说明的实施例中所使用的GAG中，HA和CS使用了市售品(生化学工业公司制)，除此以外的GAG(CH、dCH、NAH)则使用了按照以下说明的＜参考例1＞～＜参考例3＞中记载的方法制备的GAG。
＜参考例1＞软骨素的制备
软骨素(CH)是按照公知的文献(日本特表2013-520995号公报)中记载的方法培养大肠杆菌MSC702株、对培养上清液进行纯化而得到的，所述大肠杆菌MSC702株是在大肠杆菌W3110株(ATCC 27325)中导入大肠杆菌K4株的kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG基因各4个拷贝，大肠杆菌K4株的kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT基因各1个拷贝，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的xylS基因1个拷贝而构建的。
＜参考例2＞脱硫酸化硫酸软骨素的制备
脱硫酸化硫酸软骨素(dCH)是按照公知的文献(J.Am.Chem.Soc.,1957,79(1),pp152-153)中记载的方法将硫酸软骨素C(CSC)脱硫酸化而得到的。dCH的制备步骤如下所示。
在甲醇盐酸溶液(在甲醇93mL中添加乙酰氯7mL而制备)中添加CSC(来自鲨鱼软骨、生化学工业公司制)10g，用磁力搅拌器(以下简称为“搅拌器”。)搅拌20小时后进行离心分离，回收沉淀。将该沉淀溶解在100mL的纯化水中，添加NaOH水溶液中和后，相对于纯化水透析一夜。在将该溶液冷冻干燥而得到的干燥粉末中添加0.1M NaOH而制备成20g/L，将所制备的溶液用搅拌器搅拌一夜。在该溶液中添加HCl而中和后，相对于纯化水透析一夜。将该溶液冷冻干燥，得到dCH的冷冻干燥品。如此操作而得到的dCH是在二糖组成比中CH-0S为99.8％、CH-6S为0.2％、未检测到其它二糖的GAG。
＜参考例3＞N-乙酰肝素前体的制备
N-乙酰肝素前体(NAH)如下得到：按照公知的文献(日本特开2004-018840号公报)中记载的方法培养大肠杆菌K5株(Serotype O10:K5(L):H4,ATCC 23506)，对培养上清液进行纯化，从而得到。
＜参考例4＞糖胺聚糖的分子量测定(1)
CH、硫酸化CH、HPN、硫酸化HPN的分子量是通过满足以下条件的凝胶过滤色谱测定的重均分子量。
CH、硫酸化CH、HPN、硫酸化HPN的分子量测定如下进行：作为柱，将TSKgel的G4000PWXL、G3000PWXL、G2500PWXL(内径：7.8mm×长度：300mm、东曹公司制)依次连接后使用，将柱温设为40℃。流动相使用0.2M NaCl，流速设为0.6mL/分钟。检测通过示差折光率检测器来进行，分子量如下算出：将溶解成1mg/mL的试样进样100μL，使用标准曲线利用所得到的峰的保留时间来算出。使用标准品(分子量：52.2kDa、31.4kDa、20.0kDa、10.2kDa、6.57kDa)来制作标准曲线，所述标准品是对CSC(来自鲨鱼软骨、生化学工业公司制)逐级地进行乙醇分级而制备的，并通过静态光散射法(SLS)测定了绝对分子量。
＜参考例5＞糖胺聚糖的分子量测定(2)
HA、硫酸化HA的分子量是通过满足以下条件的凝胶过滤色谱测定的重均分子量。
HA、硫酸化HA的分子量测定如下进行：作为柱，使用Ultrahydrogel Linear(内径：7.8mm×长度：300mm、Waters公司制)，将柱温设为40℃。流动相使用0.2M NaCl，流速设为0.6mL/分钟。检测通过示差折光率检测器来进行，分子量如下算出：将溶解成1mg/mL的试样进样50μL，使用标准曲线利用所得到的峰的保留时间来算出。标准曲线使用普鲁兰多糖(5.9kDa、11.8kDa、22.8kDa、47.3kDa、112kDa、212kDa、404kDa、788kDa、1.22MDa、2.35MDa、昭和电工公司制)并按照公知文献(Yomota C,Miyazaki T,Okada S.,Kokuritsu IyakuhinShokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku.1999；117:135-9.)中记载的方法进行马克-霍温克校正而制作。马克-霍温克校正是利用下述性质对异种聚合物间的分子量进行校正的方法，所述性质为：特性粘度[η]和重均分子量[Mw]相乘而得的值与流体力学体积成比例，换言之凝胶过滤色谱中显示相同洗脱位置(保留时间)的2种高分子聚合物的[η]和[Mw]相乘而得的值相等。由此，通过进行马克-霍温克校正，例如即使以普鲁兰多糖为标准试样也可以测定HA、硫酸化HA的分子量。马克-霍温克校正中，对于普鲁兰多糖，使用由下述式1所示的数学式来算出特性粘度[η]，对应HA，使用由下述式2所示的数学式来算出特性粘度[η]。
[η]＝0.014Mw0.70 (式1)
[η]＝0.0228Mw0.816 (式2)
在上述数学式中，Mw表示各物质的重均分子量。马克-霍温克校正使用HPLC系统(Prominence GPC、株式会社岛津制作所制)附带的软件来进行。
＜参考例6＞硫酸化软骨素的组成分析
硫酸化CH的组成分析通过将硫酸化CH酶解而得到的二糖的组成分析(以下称为“二糖分析”。)来进行。二糖的检测通过HPLC柱后衍生化法来进行。以下示出硫酸化CH的二糖分析步骤。
(1)硫酸化软骨素的分解
相对于在硫酸化CH中添加纯化水而制备为10mg/mL的溶液，添加1/2容量的100mMTris-HCl(pH7.4)和1/2容量的软骨素酶溶液(在软骨素酶ABC(生化学工业公司制)中添加0.1％牛血清白蛋白(BSA)而制备成0.1U/μL)，将该溶液在37℃静置3小时。将该溶液在沸水中静置1分钟后，添加4倍容量的纯化水，将该溶液供于离心过滤设备(Microcon-10、Millipore Corporation制)，将离心后的滤液回收，作为二糖分析用的试样。
(2)基于HPLC柱后衍生化法的分析
二糖分析如下进行：作为柱，使用Senshu Pak DOCOSIL SP100(内径：4.6mm×长度：150mm、Senshu Scientific Co.,Ltd.制)，将柱温设为55℃。洗脱液使用将溶剂A(纯化水)、溶剂B(200mM NaCl)、溶剂C(10mM四丁基铵)、溶剂D(50％乙腈)在线混合的溶液，流速设为1.1mL/分钟。将柱洗脱液和以0.7mL/分钟输送的衍生物化试剂的溶液(将0.5％2-氰基乙酰胺和0.25M NaOH以1：1的比例在线混合的溶液)通入三通接头中而混合后，将该混合液依次通入反应管(内径：0.5mm×长度：10m)、冷却管(内径：0.25mm×长度：3m)、荧光检测器。将反应管加热到125℃而使用。冷却管浸渍在室温的蒸馏水中而使用。荧光检测器则将激发波长设为346nm、将荧光波长设为410nm而使用。
洗脱通过线性梯度来进行，关于溶剂B的混合比率，在自分析开始后至10分钟后的期间从1％增加到4％，10分钟后至11分钟后的期间从4％增加到15％，11分钟后至20分钟后的期间从15％增加到25％，20分钟后至22分钟后的期间从25％增加到53％，22分钟后至29分钟后的期间维持在53％。此外，溶剂C和溶剂D的混合比率不变，维持在溶剂C的混合比率为12％、溶剂D的混合比率为17％。
(3)二糖组成的比率的算出
二糖组成的比率(以下称为“二糖组成比”。)如下算出：将上述(1)中制备的试样进样10μL，由通过基于上述(2)的分析得到的峰面积，使用标准曲线算出各二糖的摩尔数，将用各二糖的摩尔数除以全部二糖的摩尔数之和而得的值换算为百分率。关于标准曲线，使用来自硫酸软骨素的不饱和二糖(ΔDi-0S(以下称为“0S”。)、ΔDi-6S(以下称为“6S”。)、ΔDi-4S(以下称为“4S”。)、ΔDi-2S(以下称为“2S”。)、ΔDi-diSD(以下称为“diSD”。)、ΔDi-diSE(以下称为“diSE”。)、ΔDi-triS(以下称为“triS”。)、均为生化学工业公司制)作为标准试样来制作。
＜参考例7＞硫酸化软骨素的硫酸化度的算出
关于硫酸化CH的硫酸化度，将上述＜参考例6＞中算出的二糖组成比代入由下述式3所示的数学式中来算出。
硫酸化度(％)＝S1+2×S2+3×S3 (式3)
上述数学式中，S1表示6S、4S、2S的二糖组成比之和，S2表示diSD、diSE的二糖组成比之和，S3表示triS的二糖组成比。
＜参考例8＞硫酸化透明质酸的硫酸化度的测定
关于硫酸化HA的硫酸化度，以将硫酸化HA酸水解而得到的试样为测定对象，通过毛细管电泳来测定。具体而言，通过毛细管电泳测定将硫酸化HA酸水解而得到的试样中含有的葡糖胺(GlcN)和硫酸根离子的摩尔浓度，将用硫酸根离子的摩尔浓度除以GlcN的摩尔浓度而得的值换算为百分率硫酸化度。以下示出硫酸化HA的硫酸化度测定步骤。
(1)糖胺聚糖的分解
相对于在硫酸化HA中添加纯化水而制备为1mg/mL的溶液，添加3倍容量的6N HCl，将该溶液在115℃静置3小时而进行酸水解。将该溶液供于离心蒸发器而进行干固，然后添加与添加在硫酸化HA中时等量的纯化水而将其再溶解。对该溶液进行离心，使不溶物沉淀，然后将上清液回收，作为GlcN和硫酸根离子的摩尔浓度测定用的试样。
(2)基于毛细管电泳的分析
GlcN和硫酸根离子的摩尔浓度的测定如下进行：作为毛细管，使用Uncoatedfused silica capillary(内径：50μm×长度：104cm、Agilent Company制)，将温度设为25℃。流动相使用Basic Anion Buffer(Agilent Company制)，施加电圧设为-30kV。检测通过分光光度检测器来进行，将测定波长设为350nm，将对照波长设为230nm。
(3)硫酸化度的算出
硫酸化度如下算出：以100mbar对上述(1)中制备的试样加压8秒并进样，由通过基于上述(2)的分析而得到的峰面积，使用标准曲线算出GlcN和硫酸根离子的摩尔浓度，将用硫酸根离子的摩尔浓度除以GlcN的摩尔浓度而得的值换算为百分率。使用GalNAc和硫酸钠(Na2SO4)作为标准试验，使用供于基于上述(1)的酸水解等处理后的试样来制作标准曲线。
＜参考例9＞硫酸化糖胺聚糖的硫含量的算出
关于硫酸化GAG的硫含量，将硫酸化度代入由下述式4所示的数学式来算出。
上述数学式中，0S的分子量为379.3，SO3的分子量为80.1，硫的原子量为32.1。
＜参考例10＞硫酸化透明质酸的组成分析
硫酸化HA的组成分析通过将硫酸化HA酶解而得到的二糖的组成分析(二糖分析)来进行。以下示出硫酸化HA的二糖分析的步骤。
(1)硫酸化透明质酸的分解
相对于在硫酸化HA中添加纯化水而制备为10mg/mL的溶液，添加1/2容量的100mMTris-HCl(pH7.4)和1/2容量的软骨素酶溶液(在软骨素酶ABC(生化学工业公司制)中添加0.1％牛血清白蛋白(BSA)而制备为0.1U/μL)，将该溶液在37℃静置3小时。将该溶液在沸水中静置1分钟后，添加4倍容量的纯化水，将该溶液供于离心过滤设备(Microcon-10、Millipore Corporation制)，将离心后的滤液回收，作为二糖分析用的试样。
(2)HPLC分析
二糖分析如下进行：作为柱，使用UK-Amino(内径：4.6mm×长度：150mm、SenshuScientific Co.,Ltd.制)，将柱温设为60℃。洗脱液使用将溶剂A(纯化水)、溶剂B(0.8MNaH2PO4)在线混合的溶液，流速设为1mL/分钟。检测通过分光光度检测器来进行，将测定波长设为232nm。
洗脱通过线性梯度来进行，对于溶剂B的混合比率，在自分析开始起至20分钟后的期间从2％增加到65％。
(3)二糖组成比的比率的算出
二糖组成比如下算出：将上述(1)中制备的试样进样10μL，由通过基于上述(2)的分析得到的峰面积，使用标准曲线算出各二糖的摩尔数，将用各二糖的摩尔数除以全部二糖的摩尔数之和而得的值换算为百分率。关于标准曲线，使用来自硫酸化透明质酸的不饱和二糖(ΔDiHA-0S(以下称为“0S”。)、ΔDiHA-6S(以下称为“6S”。)、ΔDiHA-4S(以下称为“4S”。)、ΔDiHA-2S(以下称为“2S”。))作为标准试样来制作。使用的来自硫酸化透明质酸的不饱和二糖为：将利用本发明的硫酸化方法经硫酸化的HA通过上述(1)的方法分解为二糖，然后进行阴离子交换和凝胶过滤色谱而制备、并且通过质谱和NMR鉴定了硫酸基的键合位置的不饱和二糖。
＜参考例11＞硫酸化肝素前体的组成分析
硫酸化肝素前体的组成分析通过将硫酸化肝素前体酶解而得到的二糖的组成分析(二糖分析)来进行。二糖的检测通过HPLC柱后衍生化法来进行。以下示出硫酸化肝素前体的二糖分析的步骤。
(1)硫酸化肝素前体的分解
相对于在硫酸化肝素前体中添加纯化水而制备为10mg/mL的溶液，添加1/2容量的20mM乙酸钠水溶液(pH7.0)/2mM乙酸钙和1/2容量的EMII溶液(按照成为3mU/μL肝素酶I、2mU/μL肝素酶II、5mU/μL肝素酶(均为生化学工业公司制)的方式添加0.1％BSA而制备)，将该溶液在37℃静置3小时。将该溶液在沸水中静置1分钟后，添加4倍容量的纯化水，将该溶液供于离心过滤设备(Microcon-10、Millipore Corporation制)，将离心后的滤液回收，作为二糖分析用的试样。
(2)基于HPLC柱后衍生化法的分析
二糖分析通过与＜参考例6＞的“(2)基于HPLC柱后衍生化法的分析”中记载的方法相同的条件来进行。
(3)二糖组成比的比率的算出
二糖组成比如下算出：将上述(1)中制备的试样进样10μL，由通过基于上述(2)的分析得到的峰面积，使用标准曲线算出各二糖的摩尔数，将用各二糖的摩尔数除以全部二糖的摩尔数之和而得的值换算为百分率。关于标准曲线，使用来自肝素或硫酸乙酰肝素的不饱和二糖(ΔDiHS-0S(以下称为“0S”。)、ΔDiHS-NS(以下称为“NS”。)、ΔDiHS-6S(以下称为“6S”。)、ΔDiHS-diS1(以下称为“diS1”。)、ΔDiHS-diS2(以下称为“diS2”。)、ΔDiHS-triS(以下称为“triS”。)均为生化学工业公司制)作为标准试样来制作。
＜参考例12＞烷基化的硫酸化软骨素的硫含量的算出
关于烷基化的硫酸化CH的硫含量，以将硫酸化CH酸水解而得到的试样作为测定对象，通过毛细管电泳来测定。具体而言，通过毛细管电泳测定将烷基化的硫酸化CH酸水解而得到的试样中含有的硫酸根离子的摩尔浓度，然后通过由下述式5所示的数学式算出硫含量。
上述式中，硫的原子量为32.1、硫酸根离子的分子量为96.1。此外，上述式中，GAG的浓度为烷基化的硫酸化CH的干燥重量除以试样溶液的液量而得的值。
上述方法中，基于酸水解和毛细管电泳的测定通过与＜参考例8＞中记载的方法相同的条件来进行。
＜参考例13＞硫酸化肝素前体的硫酸化度的算出
硫酸化HPN的硫酸化度将上述＜参考例11＞中算出的二糖组成比代入由下述式6所示的数学式来算出。
硫酸化度(％)S1+2×S2+3×S3 (式6)
上述数学式中，S1表示NS、6S、2S的二糖组成比之和，S2表示diS1、diS2、diS3的二糖组成比之和，S3表示triS的二糖组成比。
＜实施例1＞强碱的摩尔浓度的研究(1)
在CH(35.8kDa)中添加Na2SO4和0.1M～4M的NaOH水溶液，按照CH为100mg/mL(10％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将这些溶液加温到40℃，添加2.9当量(以重量浓度(w/v)计达到与CH相同浓度的量)的三氧化硫三甲胺络合物(TMA-SO3)(Sigma-Aldrich公司制)后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表1和图1。
[表1]
通过本发明的硫酸化方法得到的硫酸化CH中的CH-diSB的二糖组成比均小于0.1％，因此未记载到表中。在之后的实施例中，CH-diSB也未记载到表中。
如表1所示，已使用CH确认，通过使GAG和硫酸化剂在强碱性溶液中共存而能够进行GAG的硫酸化。此外确认，通过适当设定强碱的摩尔浓度，得到具有所期望的硫酸化度的硫酸化GAG。
＜实施例2＞强碱的摩尔浓度的研究(2)
在HA(800kDa)中添加Na2SO4和0.5M～4M的NaOH水溶液，按照HA为10mg/mL(1％w/v)、Na2SO4为100mg/mL的方式制备溶液。将这些溶液加温到40℃，添加58当量(以重量浓度(w/v)计，达到HA浓度的20倍的量)的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌3小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加等量的纯化水后，相对于纯化水透析一夜。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。测定如此操作而得到的硫酸化HA的硫酸化度，并算出硫含量。将结果示于表2。
[表2]
如表2所示，确认了在使用HA作为GAG的情况下也能进行GAG的硫酸化。
＜实施例3＞强碱的摩尔浓度的研究(3)
在CH(35.8kDa)中添加Na2SO4和0.05M～2M的NaOH水溶液，按照CH为100mg/mL(10％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将这些溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌5分钟而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表3。
[表3]
表3所示的pH为在反应结束时(添加硫酸化剂起5分钟后)测定的硫酸化反应溶液的pH。如表3所示，确认了通过使GAG和硫酸化剂在pH11.5以上的溶液中共存而能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例4＞反应温度的研究
在CH(41.8kDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照CH为200mg/mL(20％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将该溶液加温或冷却到0～60℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。此外，测定硫酸化CH的分子量。将结果示于表4。
[表4]
如表4所示，确认了在任意的反应温度下均能够进行GAG的硫酸化。此外确认，通过适当设定反应温度，得到了具有所期望的硫酸化度的硫酸化GAG。此外，在一个方式中，将CH硫酸化而得到的硫酸化CH为：特征在于，在二糖组成比中CH-6S含量最多的GAG，这一特征是硫酸软骨素C(CSC)共同的特征。由此还可知，根据本发明能够制备CSC样多糖。
＜实施例5＞糖胺聚糖的浓度的研究(1)
在CH(30.2kDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照CH为10～66.7mg/mL(1～6.67％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将这些溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。此外，测定硫酸化CH的分子量。将结果示于表5。
[表5]
如表5所示，使用CH确认了在任意的GAG浓度下均能够进行GAG的硫酸化。此外确认，通过适当设定GAG的浓度，得到了具有所期望的硫酸化度的硫酸化GAG。
＜实施例6＞糖胺聚糖的浓度的研究(2)
在溶解于纯化水的HA(2.7MDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照以终浓度计为1～10mg/mL(0.1～1％w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOH的方式制备溶液。将这些溶液冷却到4℃，添加58当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌18小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。测定如此操作而得到的硫酸化HA的硫酸化度，并算出硫含量。此外，测定硫酸化HA的分子量。将结果示于表6。
[表6]
如表6所示，确认了在使用HA作为GAG的情况下，在任意的GAG的浓度下均能够进行GAG的硫酸化。此外确认，在一个方式中，通过本发明的硫酸化方法制备的硫酸化HA为硫酸化反应后也具有2MDa以上的分子量的GAG。
＜实施例7＞反应时间的研究(1)
在CH(41.8kDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照CH为200mg/mL(20％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时～9小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。此外，测定硫酸化CH的分子量。将结果示于表7。
[表7]
如表7所示，使用CH确认了在任意的反应时间下都能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例8＞反应时间的研究(2)
在溶解于纯化水的HA(2.7MDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照以终浓度计为1mg/mL(0.1％w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOH的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加58当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1天～7天而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。测定如此操作而得到的硫酸化HA的硫酸化度，并算出硫含量。将结果示于表8。
[表8]
如表8所示，确认了在使用HA作为GAG的情况下，在任意的反应时间下均能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例9＞硫酸化剂的添加量的研究(1)
在CH(41.8kDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照CH为200mg/mL(20％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加0.3～2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌20小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加1.5倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表9。
[表9]
如表9所示，使用CH确认了能够通过添加任意量的硫酸化剂来进行GAG的硫酸化。此外确认，通过适当设定硫酸化剂的添加量，得到了具有所期望的硫酸化度的硫酸化GAG。
＜实施例10＞硫酸化剂的添加量的研究(2)
在溶解于纯化水的HA(2.7MDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照以终浓度计为1mg/mL(0.1％w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOH的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加29～116摩尔当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌18小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。测定如此操作而得到的硫酸化HA的硫酸化度，并算出硫含量。将结果示于表10。
[表10]
如表10所示，确认了在使用HA作为GAG的情况下，能够通过添加任意量的硫酸化剂来进行GAG的硫酸化。
＜实施例11＞强碱的种类的研究
在HA(800kDa)中添加Na2SO4和1M的强碱性水溶液(NaOH水溶液、KOH水溶液、或LiOH水溶液)，按照以终浓度计为1mg/mL(0.1％w/v)HA、100mg/mL Na2SO4的方式制备溶液。将这些溶液冷却到4℃，添加58当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌18小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。测定如此操作而得到的硫酸化HA的硫酸化度，并算出硫含量。将结果示于表11。
[表11]
如表11所示，确认了在使用KOH水溶液、LiOH水溶液作为强碱性溶液的情况下，也能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例12＞硫酸化剂的种类的研究(1)
在CH(41.8kDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照CH为200mg/mL(20％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的三氧化硫吡啶络合物(Pyr-SO3、东京化成工业公司制)后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表12。
[表12]
如表12所示，确认了在使用Pyr-SO3作为硫酸化剂的情况下，也能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例13＞硫酸化剂的种类的研究(2)
在CH(41.8kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照CH为100mg/mL(10％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的三氧化硫二甲基乙胺络合物(DMEA-SO3)(在二甲基乙胺100mL和氯仿100mL的混合溶剂中，在冰冷却下添加氯磺酸10mL和氯仿20mL的混合溶剂而制备)后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表13。
[表13]
如表13所示，确认了在使用DMEA-SO3作为硫酸化剂的情况下，也能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例14＞强碱的摩尔浓度的研究(4)
在HA(800kDa)中添加Na2SO4和2M或3M的NaOH水溶液，按照HA为10mg/mL(1％w/v)、Na2SO4为80mg/mL的方式制备溶液。将这些溶液冷却到4℃，添加58当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌18小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析一夜。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。测定如此操作而得到的硫酸化HA的硫酸化度，并算出硫含量。将结果示于表14。
[表14]
如表14所示，关于将反应温度设为4℃时的NaOH浓度，与1M(将反应温度设为40℃时显示最高的硫酸化反应效率的浓度。参照表2)相比，2M、3M显示出更高的硫酸化反应效率。
＜实施例15＞硫酸钠的添加量的研究
在CH(41.8kDa)中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照CH为200mg/mL(20％w/v)、Na2SO4为200～600mg/mL的方式制备溶液。此外，还制备了在CH中仅添加了2M的NaOH水溶液的、不含Na2SO4的溶液。将这些溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。此外，测定硫酸化CH的分子量。将结果示于表15。
[表15]
如表15所示，确认了不受硫酸钠的添加量的左右，均能够进行GAG的硫酸化。此外确认，为了抑制与硫酸化反应相伴随的分子量降低而优选不使硫酸钠等硫酸盐共存的方式。
＜实施例16＞具有硫酸基的GAG的硫酸化的研究(1)
在硫酸软骨素A(CSA)(20.1kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照CSA为200mg/mL(20％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CS进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表16。
[表16]
如表16所示，使用CSA确认了通过使具有硫酸基的GAG与硫酸化剂在强碱性溶液中共存，从而能够对具有硫酸基的GAG进行硫酸化、使硫酸化度进一步增加。此外，在一个方式中，将CSA硫酸化而得到的硫酸化CSA为：特征在于，在二糖组成比中CH-diSE含量最多的GAG，这一特征为硫酸软骨素E(CSE)共同的特征。由此还可知，根据本发明能够制备CSE样多糖。
＜实施例17＞具有硫酸基的GAG的硫酸化的研究(2)
在硫酸软骨素C(CSC)(14.8kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照CSC为200mg/mL(20％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CS进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表17。
[表17]
如表17所示，使用CSC确认了通过使具有硫酸基的GAG与硫酸化剂在强碱性溶液中共存，从而能够对具有硫酸基的GAG进行硫酸化、使硫酸化度进一步增加。此外，在一个方式中，对CSC进行硫酸化而得到的硫酸化CSC为：特征在于，在二糖组成比中以20％以上的比例具有CH-diSD的GAG，这一特征为硫酸软骨素D(CSD)共同的特征。由此还可知，根据本发明能够制备CSD样多糖。
＜实施例18＞使用混合溶剂的硫酸化的研究(1)
在dCH(8.2kDa)中添加含有5％(v/v)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的2M的NaOH溶液，按照CH为100mg/mL(10％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表18。
[表18]
如表18所示，确认了在使用含有有机溶剂的混合溶剂的情况下也能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例19＞使用混合溶剂的硫酸化的研究(2)
在dCH(8.2kDa)中添加含有5％(v/v)的有机溶剂(二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺(FA)、吡啶(Pyr)、乙腈(MeCN)、乙醇(EtOH)、或四氢呋喃(THF))的2M的NaOH溶液，按照dCH为100mg/mL(10％w/v)的方式制备溶液。将这些溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌3小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表19。
[表19]
如表19所示，确认了在使用含有除DMF以外的有机溶剂的混合溶剂的情况下也能够进行GAG的硫酸化。
＜实施例20＞使用混合溶剂的硫酸化的研究(3)
在dCH(8.2kDa)中添加含有10～40％(v/v)的有机溶剂(DMSO或EtOH)的2M的NaOH溶液，按照dCH为100mg/mL(10％w/v)的方式制备溶液。将这些溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌3小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表20。
[表20]
如表20所示，确认了使用含有有机溶剂的混合溶剂的情况下也能够进行GAG的硫酸化。此外确认了通过适当设定有机溶剂的浓度，得到了具有所期望的硫酸化度的硫酸化GAG。此外观察到：与使用不含DMSO的溶液作为有机溶剂的情况进行比较，使用含有DMSO的混合溶剂作为有机溶剂时有使所得到的硫酸化糖胺聚糖的硫酸化度增加的倾向。具体而言，在使用含有10％～30％(v/v)的DMSO的混合溶剂的情况下观察到该倾向。进而可知，使用含有30％(v/v)程度的DMSO的混合溶剂的情况下，所得到的硫酸化糖胺聚糖的硫酸化度最高。由此可知，在本发明的硫酸化方法可以优选例示使用含有DMSO作为有机溶剂的方式。
＜实施例21＞与现有的硫酸化方法的比较(1)
(1)使用了强碱性溶液的硫酸化
在CH中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照CH为66.7mg/mL(6.67％w/v)、Na2SO4为500mg/mL的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
(2)在有机溶剂中的硫酸化
在CH中添加甲酰胺(FA)，按照CH为200mg/mL(20％w/v)的方式制备溶液。在该溶液中添加5当量的三氧化硫三乙胺络合物(TEA-SO3)后，用搅拌器搅拌2小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
上述(1)和(2)中得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表21。
[表21]
如表21所示，确认了与通过现有技术(在有机溶剂中的硫酸化)得到的硫酸化CH相比，通过本发明(使用了强碱性溶液的硫酸化)得到的硫酸化CH为：特征在于，在二糖组成比中含有较多CH-2S的GAG。
＜实施例22＞与现有的硫酸化方法的比较(2)
(1)使用了强碱性溶液的硫酸化
在CH中添加2M的NaOH水溶液，按照CH为200mg/mL(20％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加2.9当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌1小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
(2)在有机溶剂中的硫酸化
在CH中添加甲酰胺(FA)，按照CH为200mg/mL(20％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加5当量的TEA-SO3后，用搅拌器搅拌2小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
对上述(1)和(2)中得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表22。
[表22]
如表22所示，再次确认了与通过现有技术(在有机溶剂中的硫酸化)得到的硫酸化CH相比，通过本发明(使用了强碱性溶液的硫酸化)得到的硫酸化CH为：特征在于，在二糖组成比中含有较多CH-2S的GAG。
＜实施例23＞与现有的硫酸化方法的比较(3)
(1)使用了强碱性溶液的硫酸化
在溶解于纯化水的HA中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照以终浓度计为1mg/mL(0.1％w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOH的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加58当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌18小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
(2)在有机溶剂中的硫酸化
在HA的三丁胺(TBA)盐中添加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，按照HA为10mg/mL(1％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到60℃，添加12当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌48小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2.5倍容量的丙酮并搅拌30分钟后，静置3小时。从该溶液回收沉淀物，按照HA为8mg/mL(0.8％w/v)的方式溶解在纯化水中后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
对上述(1)和(2)中得到的硫酸化HA进行二糖分析。将结果示于表23。
[表23]
如表23所示，确认了通过现有技术(在有机溶剂中的硫酸化)得到的硫酸化HA为：特征在于，在二糖组成比中含有较多HA-6S、实质上不含HA-4S和HA-2S的GAG，而通过本发明(使用了强碱性溶液的硫酸化)得到的硫酸化HA为：特征在于含有HA-4S、HA-2S的GAG。
＜实施例24＞肝素前体的脱乙酰化和硫酸化的一锅反应
在NAH(33.1kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照NAH为40mg/mL(4％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到60℃，用搅拌器搅拌4小时而进行脱乙酰化反应。将温度变更为40℃，添加7当量或12当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌20小时而进行硫酸化反应。在该溶液中添加HCl而中和后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。通过前述＜参考例11＞的方法，对如此操作而得到的硫酸化肝素前体进行二糖分析。将结果示于表24。
[表24]
如表24所示，使用NAH确认了通过使GAG和硫酸化剂在强碱性溶液中共存，从而能够进行GAG的硫酸化。此外，确认了能够通过在强碱性溶液中一锅合成来进行GAG的脱乙酰化和硫酸化。
＜实施例25＞软骨素的烷基化和硫酸化的一锅反应
(1)甲基化的硫酸化软骨素的制备
在CH中添加2M的NaOH水溶液，按照CH为100mg/mL(10％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加0.5倍容量的碘甲烷(CH3I)后，用搅拌器搅拌2小时而进行甲基化反应，取出一部分作为甲基导入率(甲基化度)测定用试样。然后，在该溶液中添加2.9当量的TMA-SO3，在室温下用搅拌器搅拌2小时而进行硫酸化反应。在甲基化度测定用试样和反应终止后的溶液中分别添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。将如此操作而得到的甲基化的软骨素(供于硫酸化反应前的软骨素)和甲基化的硫酸化软骨素供于以下分析。
(2)甲基化度的测定
甲基化度的测定通过1H-NMR来进行。在上述(1)中得到的甲基化的软骨素5mg中添加含有0.01％的3-(三甲基甲硅烷基)丙酸钠-2,2,3,3-d4(TSP)的重水，将所制备的溶液供于1H-NMR，将用来自导入到CH中的甲基的信号(2.9ppm、3.1ppm、3.2ppm、3.4ppm、3.5ppm)的积分比除以来自GalNAc残基的乙酰基的信号(2.0ppm)的积分比而得的值换算为百分率甲基化度。其结果是，甲基化的软骨素的甲基化度为58％。
(3)硫含量的测定
硫含量的测定通过＜参考例12＞中记载的方法来进行。其结果是，上述(1)中得到的甲基化的硫酸化软骨素的硫含量为3.8％。
由以上的结果确认，能够通过在强碱性溶液中一锅合成来进行GAG的烷基化和硫酸化。
＜实施例26＞与现有的硫酸化方法的比较(4)
在CH(5.0kDa、28.0kDa、30.2kDa、32.0kDa、35.8kDa、或41.8kDa)中添加溶剂，按照CH为10～200mg/mL(1～20％w/v)的方式制备溶液。将这些溶液加温或冷却到0～60℃，添加0.9～10当量的硫酸化剂(TMA-SO3、TEA-SO3、Pyr-SO3、或三氧化硫N,N-二甲基甲酰胺络合物(DMF-SO3))后，用搅拌器搅拌0.5～20小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
上述反应条件中，在进行本发明的硫酸化方法(使用了强碱性溶液的硫酸化)时，使用0.1～2M的NaOH水溶液作为溶剂。此外，上述反应条件中，在进行现有的硫酸化方法(在有机溶剂中的硫酸化)时，使用甲酰胺(FA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)作为溶剂。
对按照上述而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出CH-2S相对于CH-4S的比例(2S/4S比)、以及CH-2S相对于CH-6S的比例(2S/6S比)。将对通过本发明的硫酸化方法得到的硫酸化CH(29检体)进行二糖分析的结果示于表25，将对通过现有的硫酸化方法得到的硫酸化CH(26检体)进行二糖分析的结果示于表26。此外，将对从动物中提取到的CS进行二糖分析的结果示于表27。表27中，硫酸软骨素A(CSA)为从鲟鱼的脊索中提取到的CS，硫酸软骨素B(CSB)为从猪的皮肤中提取到的CS，硫酸软骨素C(CSC)和硫酸软骨素D(CSD)为从鲨鱼的软骨中提取到的CS，硫酸软骨素E(CSE)为从乌贼的软骨中提取到的CS。
[表25]
[表26]
[表27]
如表25所示，通过本发明的硫酸化方法得到的硫酸化CH的2S/4S比显示出3.50～9.75的值，2S/6S比显示出0.15～0.50的值。另一方面，如表26所示，通过现有的硫酸化方法得到的硫酸化CH的2S/4S比显示出0.00～3.00的值，2S/6S比显示出0.00～0.10的值。此外，如表27所示，从动物提取到的CS(自然界中存在的CS)中检测不到CH-2S，2S/4S比和2S/6S比均显示出0.00的值。
＜实施例27＞低分子透明质酸的硫酸化
在HA(20kDa、或100kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照HA为50mg/mL(5％w/v)的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加8.7当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌24小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。测定如此操作而得到的硫酸化HA的硫酸化度，并算出硫含量。将结果示于表28。
[表28]
如表28所示，确认供于本发明的硫酸化方法来进行硫酸化的HA并非仅限于高分子的HA，也可以为低分子的HA(分子量100kDa以下)。
＜实施例28＞硫酸化肝素前体的制备(1)
(1)肝素前体的脱乙酰化
在NAH(33.1kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照NAH为100mg/mL(10％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到60℃，用搅拌器搅拌4小时而进行脱乙酰化反应。在该溶液中添加H2SO4而中和后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。由此得到脱乙酰化HPN。
(2)脱乙酰化肝素前体的硫酸化
在上述(1)中得到的脱乙酰化HPN中添加含有20％(v/v)的DMSO的2M的NaOH溶液，按照脱乙酰化HPN为50mg/mL(5％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加18当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌20小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
将对上述(2)中得到的硫酸化的HPN(硫酸化HPN)进行二糖分析的结果示于表29。
[表29]
＜实施例29＞硫酸化肝素前体的抗凝活性的测定
将HEP和实施例28中得到的硫酸化HPN作为测定对象试样，基于下述方法测定活化部分凝血活酶时间(APTT)。
使用Venoject II真空采血管(装入了3.2％柠檬酸钠，Terumo Corporation制)从SD系雄性大鼠采血，得到血浆。将用蒸馏水溶解为0.1mg/mL的试样(硫酸化NAH或HEP)溶液25μL和血浆225μL混合，从而制备测定用试样。此外，将蒸馏水25μL和血浆225μL混合，从而制备阴性对照。APTT测定中，使用全自动凝血纤溶测定装置STA Compact(RocheDiagnostics公司制)，按照附带说明书中记载的方法来实施试验。
将结果示于表30。
[表30]
如表30所示，实施例28中得到的硫酸化HPN显示出与HEP相同程度的APTT。由此确认，在一个方式中，通过本发明的硫酸化方法得到的硫酸化GAG为具有肝素样的抗凝活性的硫酸化GAG。
＜实施例30＞硫酸化肝素前体的制备(2)
(1)异构化肝素前体的制备
参照文献(WO2014/200045)中记载的方法进行NAH(33.1kDa)的异构化反应，得到部分GlcA残基异构化为IdoA残基的HPN(EpHPN)。EpHPN的IdoA含量为32.8％。
(2)异构化肝素前体的脱乙酰化和硫酸化
使用上述(1)中得到的EpHPN来代替NAH，基于实施例28中记载的方法来进行。
将对上述(2)中得到的硫酸化的EpHPN(硫酸化EpHPN)进行二糖分析的结果示于表31。
[表31]
如表31所示，确认了供于本发明的硫酸化方法来进行硫酸化的GAG并非限于仅具有GlcA残基作为HexA残基的GAG，也可以为具有IdoA残基的GAG。此外，本发明人等确认了：上述硫酸化EpNAH为与实施例28中记载的硫酸化NAH同样具有肝素样的抗凝活性的GAG。因此确认，根据本发明，可以制备具有GlcN残基作为HexN残基、具有GlcA残基和IdoA残基作为HexA残基且与作为显示抗凝活性的硫酸化多糖的HPN具有同样的组成和性质的GAG。
＜实施例31＞硫酸化软骨素的制备(1)
在CH(113kDa)中添加2M～4M的NaOH水溶液，按照CH为50mg/mL(5％w/v)的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加14.5当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌24小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表32。
[表32]
＜实施例32＞硫酸化软骨素的制备(2)
在CH(113kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照CH为50mg/mL(5％w/v)的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加8.7当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌24小时而进行硫酸化反应。反应结束时(添加硫酸化剂起24小时后)测定的硫酸化反应溶液的pH为13.8。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
将通过上述而得到的干燥粉末供于基于与上述相同条件的硫酸化反应，再次得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表33。
[表33]
＜实施例33＞硫酸化软骨素的制备(3)
在CH(27kDa)中添加2M的NaOH水溶液，按照CH为50mg/mL(5％w/v)的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加8.7当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌24小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加3倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。
将通过上述得到的干燥粉末供于基于条件与上述相同的硫酸化反应，再次得到干燥粉末。将该干燥粉末再次供于条件与上述相同的硫酸化反应，又一次得到干燥粉末。对如此操作而得到的硫酸化CH进行二糖分析，算出硫酸化度。将结果示于表34。
[表34]
如表32～表34所示，确认了在一个方式中将CH硫酸化而得到的硫酸化CH为：特征在于，在二糖组成比中以20％以上的比例具有CH-diSD的GAG，这一特征为硫酸软骨素D(CSD)共同的特征。由此确认，根据本发明能够制备CSD样多糖。
＜实施例34＞与现有的硫酸化方法的比较(5)
(1)使用了强碱性溶液的硫酸化
在溶解于纯化水的HA中添加Na2SO4和2M的NaOH水溶液，按照以终浓度计为10mg/mL(1％w/v)HA、80mg/mL Na2SO4、1M NaOH的方式制备溶液。将该溶液冷却到4℃，添加58当量的TMA-SO3后，用搅拌器搅拌18小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加2倍容量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。如此操作而得到的硫酸化透明质酸的硫含量为2.9％。
(2)在有机溶剂中的硫酸化
在HA的三丁胺(TBA)盐中添加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，按照HA为1mg/mL(0.1％w/v)的方式制备溶液。将该溶液加温到40℃，添加1当量的Pyr-SO3后，用搅拌器搅拌3小时而进行硫酸化反应。在反应终止后的溶液中添加等量的纯化水后，相对于纯化水透析2天。在该溶液中添加NaOH水溶液中和后，进行冷冻干燥，得到干燥粉末。如此操作而得到的硫酸化透明质酸的硫含量为3.0％。
(3)基于NMR的硫酸基的测定
硫酸基的测定通过13C-NMR来进行。在按照上述而得到的硫酸化透明质酸5mg中添加含有0.01％的四甲基硅烷(TMS)的重水，将所制备的溶液供于13C-NMR，确认有无来自GlcNAc残基的4-O-硫酸基的信号(77.5ppm)。将供于本发明的硫酸化方法得到的硫酸化透明质酸的测定结果示于图2，将供于现有的硫酸化方法得到的硫酸化透明质酸的测定结果示于图3。
如图2所示，供于本发明的硫酸化方法得到的硫酸化透明质酸显示出77.5ppm的信号，因此确认GlcNAc残基中具有4-O-硫酸基。另一方面，如图3所示，供于现有的硫酸化方法得到的硫酸化透明质酸不显示77.5ppm的信号，因此确认GlcNAc残基中不具有4-O-硫酸基。
产业上的可利用性
根据本发明，能够在非有机溶剂的溶液中进行GAG硫酸化，从而能够制造硫酸化GAG。
日本专利申请第2015-073148号(申请日：2015年3月31日)的全部公开内容通过参照而纳入本说明书中。本说明书中记载的全部文献、专利申请、和技术标准，以与通过参照而纳入各文献、专利申请、和技术标准并且具体且逐个加入时同等程度地通过参照而纳入本说明书。
Claims (15)
1.一种糖胺聚糖的硫酸化方法，其在共存有糖胺聚糖和硫酸化剂的强碱性溶液中进行硫酸化反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，强碱性溶液为pH11.5以上的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，糖胺聚糖为选自下述(A)～(D)中的糖胺聚糖，
(A)具有己糖醛酸残基的糖胺聚糖，
(B)在所述(A)的糖胺聚糖中添加或脱离取代基或官能团而成的糖胺聚糖，
(C)将所述(A)的糖胺聚糖脱乙酰化而成的糖胺聚糖，
(D)将所述(A)的糖胺聚糖烷基化而成的糖胺聚糖。
4.一种硫酸化糖胺聚糖的制造方法，其包含进行权利要求1～3中任一项所述的方法的工序。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包含进行糖胺聚糖的脱乙酰化反应的工序。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其进一步包含进行糖胺聚糖的烷基化反应的工序。
7.一种硫酸软骨素，其二糖组成比中具有3摩尔％以上的含有下述结构式所示结构的二糖，
[HexA(2S)1-3GalN1-4]
式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“2S”表示2-O-硫酸基。
8.一种硫酸软骨素，其二糖组成比中，含有下述结构式(b)所示结构的二糖相对于含有下述结构式(a)所示结构的二糖的比例超过3，
[HexA1-3GalN(4S)1-4] (a)
[HexA(2S)1-3GalN1-4] (b)
式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“4S”表示4-O-硫酸基，“2S”表示2-O-硫酸基。
9.一种硫酸软骨素，其二糖组成比中，含有下述结构式(d)所示结构的二糖相对于含有下述结构式(c)所示结构的二糖的比例超过0.1，
[HexA1-3GalN(6S)1-4] (c)
[HexA(2S)1-3GalN1-4] (d)
式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“6S”表示6-O-硫酸基，“2S”表示2-O-硫酸基。
10.一种硫酸软骨素，其二糖组成比中具有25摩尔％以上的含有下述结构式所示结构的二糖，
[HexA(2S)1-3GalN(6S)1-4]
式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GalN”表示半乳糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“2S”表示2-O-硫酸基，“6S”表示6-O-硫酸基。
11.一种硫酸化透明质酸，其二糖组成中具有含有下述结构式所示结构的二糖，
[HexA1-3GlcN(4S)1-4]
式中，“HexA”表示己糖醛酸残基，“GlcN”表示葡糖胺残基，“1-3”表示1-3糖苷键，“1-4”表示1-4糖苷键，“4S”表示4-O-硫酸基。
12.一种硫酸化透明质酸，其具有以下(A)和(B)的特征，
(A)分子量为200万Da以上，
(B)硫含量为2质量％以上。
13.根据权利要求4～6中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为具有肝素样抗凝活性的硫酸化糖胺聚糖。
14.根据权利要求4～6中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为具有肝素样抗凝活性的硫酸化肝素前体。
15.根据权利要求4～6中任一项所述的方法，其中，硫酸化糖胺聚糖为权利要求7～10中任一项所述的硫酸软骨素或者权利要求11或12所述的硫酸化透明质酸。
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