ES2247656T3

ES2247656T3 - Un proceso para formar un polipeptido modificado que comprende un polipeptido y un oxido de polialquileno.

Info

Publication number: ES2247656T3
Application number: ES98203166T
Authority: ES
Inventors: Shmuel Zalipsky
Original assignee: Enzon Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-04-19
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2010-04-19
Also published as: ES2136595T3; DK0470128T3; ES2136595T5; DE69033192D1; DK0470128T4; EP0893439A1; ATE300519T1; WO1990013540A1; CA2053317A1; EP0893439B1; JPH04504872A; EP0470128B2; DE69033192T2; JP2875884B2; EP0470128B1; AU5526690A; DE69034200D1; EP0470128A4; DE69033192T3; DE69034200T2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A CARBONATO DE POLI(ETILEN GLICOL) N - SUCCINIMIDA Y A LA PREPARACION DEL MISMO. EL POLIETILEN GLICOL (PEG) SE CONVIERTE EN SU DERIVADO DE CARBONATO DE N SUCCINIMIDA, Y DICHA FORMA DEL POLIMERO REACCIONA RAPIDAMENTE CON GRUPOS AMINOS DE PROTEINAS EN TAMPONES ACUOSOS. LAS PROTEINAS MODIFICADAS TIENEN CADENAS PEG INJERTADAS EN EL ESQUELETO POLIPEPTIDICO, MEDIANTE UNIONES URETANO(CARBAMATO) ESTABLES, RESISTENTES A HIDROLISIS.

Description

Un proceso para formar un polipéptido modificado que comprende un polipéptido y un óxido de polialquileno.

Esta es una continuación parcial de la serie U.S. Nº. 340,928, solicitada él 19 de Abril, 1989, cuyo contenido está incorporado aquí por referencia en esta solicitud.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la modificación química de polipéptidos mediante fijación covalente de cadenas de óxido de polialquileno a una molécula polipeptídica como se describe en la patente U.S. Nº. 4,179,337, de Davis, et al. Se describe en Abuchowski & Davis "Enzymes as Drugs", Holcenberg & Roberts, Eds., págs. 367-383, John Wiley & Sons, N.Y. (1981) que estas preparaciones de polipéptidos tienen inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y también tienen una vida más larga en la circulación sanguínea en comparación con los polipéptidos genitores. Estas propiedades provechosas de los polipéptidos modificados los hacen muy útiles para varios usos terapéuticos, como por ejemplo la terapia enzimática.

Los grupos activos que son introducidos en los óxidos de polialquileno para una fijación posterior de estos polímeros a proteínas deben satisfacer los requisitos siguientes:

1.: Los grupos activos deben ser lo bastante reactivos para proporcionar una reacción rápida con una proteína bajo condiciones suaves;

2.: Los residuos liberados de los grupos activos durante el proceso de modificación deben ser no tóxicos y/o fácilmente separables del aducto proteína-polímero.

Para efectuar la fijación covalente del polietilenglicol (PEG) a una proteína, los grupos terminales hidróxilo del polímero tienen que ser convertidos en primer lugar en grupos funcionales reactivos. Frecuentemente, se hace referencia a este proceso como "activación" y el producto se denomina "PEG activado". Los derivados de metoxipolietilenglicol (mPEG), unidos por un extremo con un grupo funcional, reactivo a las aminas en una molécula de proteína, son usados la mayoría de las veces.

La forma más común de PEG activado usada hasta ahora para la preparación de enzimas terapéuticas es éster poli(etilenglicol) de succinil-N-hidroxisuccinimida (SS-PEG) [Abuchowski, et al. Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186 (1984), esquema 1]. El uso de este polímero activado satisface ambos requisitos arriba detallados. Sin embargo, esto tiene un inconveniente más importante. El enlace estérico entre el polímero y el residuo de ácido succínico Tiene una estabilidad limitada en medios acuosos [U.S. Patente Nº. 4,670,417, a Iwasaki, et al. (1987); Ulbrich, et al., Makromol. Chem. 187, 1131-1144 (1986)]

Esquema 1

Unión convencional de PEG a una proteína usando SS-PEG como la forma activada del polímero

1

Varios politilenglicoles (PEG) funcionalizados han sido eficazmente usados en campos como la modificación proteínica (Abuchowski & Davis, 1981, supra), la química peptídica [Zalipsky, et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 740-783 (1987))] y la preparación de conjugados con materiales biológicamente activos [Zalipsky, et al., Eur. Polym. J. 19, 1177-1183 (1983) y Zalipsky and Barany, Polymer Preprints, Am. Chem. Soc. Div. Polym. Chem. 27(1), 1-2 (1986)]. Los conjugados de PEG con proteínas útiles en aplicaciones médicas han demostrado prometer, particularmente con respecto a su estabilidad a la digestión proteolítica, una respuesta inmunológica reducida y medias de vida más largas en la circulación sanguínea.

Para conseguirlo, la técnica precedente ha activado el grupo hidroxi de PEG con cloruro de cianuro y el compuesto resultante luego se acopla con proteínas (Abuchowski, et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3578; Abuchowski and Davis, 1981, supra). No obstante, existen varias desventajas del uso de este método, como la toxicidad de cloruro de cianuro y la reactividad no específica para proteínas que tienen grupos funcionales distintos de las aminas, como la cisteína esencial libre o residuos de tirosina.

Para superar éstas y otras desventajas, se han introducido procedimientos alternativos, como los derivados del succinimidil succinato de PEG (SS-PEG) (Abuchowski, et al. 1984, supra, ver Esquema 1, arriba). Este reacciona rápidamente con proteínas (30 minutos) bajo condiciones suaves produciendo conjugados activos aún muy modificados, el uso de este polímero activado tiene una mayor desventaja. El enlace estérico entre el polímero y el residuo de ácido succínico tiene una limitada estabilidad en medios acuosos [Patente U.S. Nº. 4,670,417 de Iwasaki, et al. and Ulbrich, et al. Makromol Chem., 187, 1131-1144 (1986)].

La formación de enlaces de uretano entre grupos amino de una proteína y PEG supera el problema de pérdida hidrolítica de las cadenas poliméricas [Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 11, 141-152 (1985)]. De hecho, se demostró en derivados de PEG marcados radioactivamente que los enlaces de uretano son totalmente estables bajo una variedad de condiciones fisiológicas [Larwood & Szoka J., Labeled Compounds Radiopharm., 21, 603-614 (1984)]. Se realizó la unión de PEG a una proteína por medio de un derivado de carbamato [Beauchamp, et al. Analyt. Biochem. 131, 25-33 (1983)] usando PEG activado con carbonildiimidazol. No obstante, el polímero activado de esta manera no es muy reactivo y en consecuencia fueron necesarios largos períodos de reacción (48-72 hrs a pH 8.5) para conseguir suficientes modificaciones. En consecuencia, el agente activado con carbonildiimidazol claramente no satisface el primer requisito destacado arriba. Una desventaja adicional de este enfoque es el coste relativamente elevado del carbonildiimidazol.

Se describió el uso de derivados de PEG-fenilcarbonato para la preparación de PEG-proteína unida con uretano [ver Veronese, et al. (1985), supra]. El inconveniente principal de este enfoque se extiende en la toxicidad de los residuos hidrofóbicos de fenol (p-nitrofenol o 2, 4, 5-triclorofenol) y su afinidad para las proteínas. Claramente este método no satisface el segundo requisito destacado arriba.

Cada una de las formas activadas del polímero tiene propiedades que pueden ser consideradas ventajosas o desventajosas, dependiendo del sistema de uso. Considerando muchas aplicaciones de los PEG-polipéptidos, es deseable ampliar aquellos PEG-reactivos que modifican las proteínas hechos para un uso final específico.

WO 89/06546, que se publicó después de la fecha de prioridad de esta solicitud pero con una fecha de prioridad anterior, expone una proteína de CSF-1 biológicamente activa selectivamente conjugada por medio de ciertos residuos de aminoácidos o mitades carbohidrato a un polímero hidrosoluble seleccionado de polietilenglicol u homopolímeros de polipropilenglicol, polioles polioxietilados, o alcohol polivinílico.

WO 89/01033 expone un conjugado hidrosoluble sustancialmente no inmunogénico de superóxido dismutasa preparado por acoplamiento a un polialquilenglicol que es polietilenglicol o copolímero polipropileno-polietilenglicol, donde dicho glicol tiene un promedio de peso molecular de 40,000-1,000,000 y es terminalmente insustituido o sustituido por grupos C_{1-4} alquilo o C_{1-4} alcoxi.

Resumen de la invención

La invención proporciona un proceso para formar un polipéptido modificado que comprende un polipéptido y óxido de polialquileno que comprende el hecho de poner en contacto un óxido de polialquileno con un grupo terminal oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida con un polipéptido, con un pH en la gama de 5.8-11 donde dicho óxido de polialquileno se enlaza de manera covalente a un grupo amina del polipéptido por un enlace de uretano, y donde el óxido de polialquileno que tiene un grupo terminal oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida tiene la fórmula

R_{1}-(O-R_{2})-(O-R_{3})-(O-R_{4})-O-(CO)-O-R_{5}

donde R_{1} es H, H_{3}C, un grupo N-dicarboximida, o cualquier otro grupo funcional;

donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, disustituido, o insustituido, y

donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser independientemente igual, o diferente de los otros R_{2}, R_{3}, y R_{4};

donde R_{5} es un grupo de N-dicarboximida; y

donde a es un número entero entre 1 y 1000 y b y c es cada uno un número entero entre 0 y 1000, y la suma de a, b, y c da entre 10 y 1000.

La presente invención también describe un proceso que comprende el hecho de reaccionar un compuesto con la estructura

R_{1} --- (O --- R_{2})_{a} --- (O --- R_{3})_{b} --- (O --- R_{4})_{c} --- O ---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- X

donde R_{1} es H, H_{3}C, grupo de N-dicarboximida, o cualquier otro grupo funcional;

donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser independientemente el mismo o diferente de los otros de R_{2}, R_{3}, y R_{4};

donde X es un halógeno;

con una N-hdroxidicarboximida en presencia de una base.

La presente invención además describe un polipéptido modificado que comprende un polipéptido que tiene enlazado a él al menos un polímero que tiene la estructura

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

---

donde R_{1} es H, H_{3}C, o un grupo succinimida carbonato;

donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, sustituido, o insustituido, y

donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser independientemente el mismo, o diferente de los otros R_{2}, R_{3}, y R_{4};

donde cada polímero está unido de manera covalente a un grupo amina del polipéptido por un enlace de uretano.

La invención también proporciona un proceso para preparar un polipéptido modificado que comprende el hecho de reaccionar un polipéptido con el compuesto a un pH dentro de la gama de aproximadamente 5.8-11.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Liberación de mPEG de conjugados de PEG-BSA.

Condiciones experimentales: Soluciones de ambos tipos de conjugados de PEG-BSA (-61% modificación) a una concentración de 4 mg/ml (mediante ensayo Bluret) fueron incubados en el tampón apropiado. A unos intervalos de tiempo dados, unas partes alícuotas de estas soluciones fueron inyectadas en una HPLC equipada con columna Zorbax GF-450 y detector de RI para determinar mPEG-5000.

Figura 2. Estabilidad de SS-PEG y SC-PEG a 22ºC.

Condiciones experimentales: Los PEGs activados fueron almacenados en forma de polvo fino en contenedores herméticamente cerrados de polipropileno. Se evaluó el contenido de acilo activo de las muestras de cada polímero a intervalos temporales dados.

Figura 3. Reactividad de PEGs activados como una función del pH.

Condiciones experimentales: Al tampón de borato de trietanolamina (0.3 M, 1 ml) con el apropiado pH, se añadió una solución madre de NAL en agua (50 mM, 0.1 ml) seguido de una solución madre del apropiado PEG activado en CH_{3}CN (50 mM de acilo activo, 0.1 ml). La solución resultante fue removida e incubada a 28ºC durante 1 h. Una mezcla de los mismos componentes pero dejando fuera SX-PEG fue usada como control. Se usó TNBS - versión de ensayo de Snyder, et al. [(1975) Anal. Biochem. 64, 284] para determinar la NAL no reaccionada.

Descripción de la invención

La presente invención describe óxidos de polialquileno activados que tienen la estructura general:

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- O --- R_{5}

donde R_{1} es H, H_{3}C, un grupo de N-dicarboximida, o cualquier otro grupo funcional; donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, disustituido, o insustituido, y

donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser independientemente el mismo, o diferente de los otros R_{2}, R_{3}, y R_{4}; donde R_{5} es un grupo de N-dicarboximida; y donde a es un número entero entre 1 y 1000 y b y c es cada uno un número entero entre 0 y 1000, y la suma de a, b, y c da entre 10 y 1000.

Más específicamente, la invención se refiere a la preparación y uso de un nuevo PEG activado, es decir, carbonato de poli(etilenglicol)-succinimida (SC-PEG) y el derivado bifuncional de PEG, es decir, carbonato de polietilenglicol-bis-succinimida (BSC-PEG). Además, derivados heterobifuncionales de PEG son posibles (Zalipsky and Barany, supra); uno de los grupos terminales es carbonato de succinimida y el otro grupo terminal (R^{1}, ver Esquema 2, infra) contiene un grupo funcional reactivo diferente, como un grupo carboxilo libre o un aminoácido. Estos materiales reaccionan fácilmente con grupos amino de proteínas para proporcionar la fijación del PEG mediante enlaces de uretano estables (Esquema 2, abajo). La reactividad de los agentes nuevos, SC-PEG y BSC-PEG, son comparables a los SS-PEG usados de forma convencional. Así, se pueden alcanzar altos grados de modificación en condiciones suaves (tampones acuosos, pH 5.8-11, preferiblemente pH 7.0-9.5) en aproximadamente 30-60 min. y temperaturas moderadas (4-40ºC). Además, los agentes son solubles en una variedad de disolventes orgánicos, siendo así útiles e importantes para el acoplamiento de péptidos de peso molecular bajo, parcialmente protegidos y otros ligandos biológicamente útiles.

El PEG no debe tener un peso molecular particular, pero se prefiere que el peso molecular esté entre 500 y 40,000; más preferiblemente entre 2,000 y 20,000. La elección del peso molecular del PEG se hace en base a la naturaleza de la proteína particular empleada, por ejemplo, el número de grupos amino disponibles para la modificación.

La N-hidroxisuccinimida liberada durante la modificación de la proteína es de material no tóxico usado frecuentemente en química de proteínas, especialmente para la preparación de aductos de proteínas biológicamente activos. Como en el caso del anteriormente mencionado PEG de carbonildiimidazol activado y fenilcarbonatos de PEG, el producto de modificación proteínica usando SC-PEG o BSC-PEG tiene cadenas de PEG injertadas en la estructura del polipéptido mediante enlaces de carbamato (uretano). No obstante, debido a la mayor reactividad de los agentes nuevos, se pueden alcanzar unos grados más altos de modificación en períodos de tiempo más cortos. Una ventaja adicional del PEG activado de carbonato de succinimida es que los grupos funcionales activos que no reaccionan con grupos amino de una proteína son sometidos a hidrólisis rápida acuosa produciendo N-hidroxisuccinimida, dióxido de carbono y PEG hidroxi-terminado. Esto es de particular importancia en el caso de derivados de PEG bifuncional (BSC-PEG). Estos materiales pueden servir para un objetivo doble: PEGilación y entrecruzamiento simultáneo. El BSC-PEG, como cualquier material homobifuncional puede utilizarse para entrecruzar dos proteínas diferentes. Cuando una molécula de BSC-PEG reacciona con una proteína por medio de un solo grupo terminal, el otro grupo SC del polímero, que no reacciona con la amina, es hidrolizado y en consecuencia no se introducen residuos extraños (potencialmente antigénicos) en el conjugado de PEG-proteína.

Las actividades biológicas de proteínas modificadas con SC-PEG y BSC-PEG son conservadas en gran parte como se muestra por los ejemplos sucesivos. Hay una bibliografía anterior donde una proteína (activadora del tejido plasminógeno) conjugada de manera covalente con PEG por medio de enlaces de uretano tenía una actividad específica más alta que la misma proteína modificada con SS-PEG aproximadamente en la misma medida [Berger & Pizzo, Blood, 71, 1641-1647

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Esquema 2

Uso de SS-PEG y BSC-PEG para la unión de PEG a proteínas

2

Naturalmente, la utilidad de derivados de PEG activado con SC se extiende a la preparación de conjugados de PEG de péptidos de peso molecular bajo y otros materiales que contienen grupos amino libres.

Un procedimiento de recipiente único "one-pot" para la introducción de grupos SC en PEG fue desarrollado (Esquema 3 abajo). Primero, se produjo cloroformato de polietilenglicol in situ por tratamiento del polímero (PEG) con fosgeno. El cloroformato resultante fue luego reaccionado con N-hidroxisuccinimida (HOSu) seguido de trietilamina (TEA) para producir los derivados activados deseados de PEG. Las preparaciones poliméricas activadas fueron purificadas de materiales de peso molecular bajo y se determina que contienen las cantidades teóricas de grupos activos.

Esquema 3

Síntesis de derivados de carbonato de N-succinimida de poli(etilenglicol)

3

Ejemplo 1 Preparación de SC-PEG

Metoxipolietilenglicol de peso molecular 5000 (Union Carbide, 60 g, 12 mmol) fué disuelto en tolueno/diclorome-
tano (3:1, 200 ml) y tratado con una solución de tolueno de fosgeno (30 ml, 57 mmol) durante toda la noche. La solución fue evaporada a sequedad y el resto de fosgeno fue extraído al vacío. El residuo fue redisuelto en tolueno/diclorometano (2:1, 150 ml) y tratado con N-hidroxisuccinimida sólida (2.1 g, 18 mmol) seguido de trietilamina (1.7 ml, 12 mmol). Después de 3 horas, la solución fue filtrada y evaporada a sequedad. El residuo fue disuelto en acetato de etilo (600 ml) caliente (50ºC), filtrado de insolubles de metal traza y enfriado para facilitar la precipitación del polímero. El producto fue recogido por filtración y luego recristalizado una vez más del etilacetato. El producto fue secado al vacío con P_{2}O_{5}. El rendimiento fue 52.5 g (85% en teoría).

Para determinar el contenido de carbonato activo del producto, se reaccionaron muestras del polímero con una cantidad medida de bencilamina en diclorometano y el exceso de amina fue titrado con ácido perclórico en dioxano. Estas titraciones indicaron que 1 g del producto contenía 1.97 x10^{-4} mol de carbonato activo (101% de contenido teórico). Bandas características de I.R. (película en NaCl, cm^{-1}) a: 1812 y 1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114 (CH_{2}OCH_{2}). ^{13}C-NMR (CDCl_{3}): \delta 168.5 (CH_{2}C=O); 151.3 (O-CO_{2}); 71.9 (CH_{3}OCH_{2}) 70.2 (PEG); 68.7 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68.0 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 58.9 (CH_{3}O); 25.2 (CH_{2}C=O) ppm.

Ejemplo 2 Preparación de BSC-PEG

Polietilenglicol de peso molecular 4600 (Union Carbide, 50g, 21.7 mequiv. OH) fue convertido al carbonato de bis-N-hidroxisuccinimida correspondiente usando una solución de tolueno de fosgeno (50 ml, 96.5 mmol) y luego N-hidroxisuccinimida (3.8 g, 23 mmol) y trietilamina (3.2 ml, 23 mmol) según el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Después de la purificación se obtuvo el producto como un polvo blanco (51 g, 96%). El contenido de carbonato activo fue 4.0 X 10^{-4} mol/g (98% teórico) según se determinó por titraciones con ácido perclórico de bencilamina. Bandas características de I.R. (película en NaCl, cm^{-1}) a: 1812 y 1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114 (CH_{2}OCH_{2}). ^{13}C-NMR(CDCl_{3}): \delta 168.5 (CH_{2}C=O); 151.3 (O-CO_{2}); 70.2 (PEG); 68.7 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68.0 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 25.2 (CH_{2}C=O) ppm. H-NMR (CDCl_{3}): \delta 4.35 (m, 4H, CH_{2}OCO_{2}); 3.55 (s, - 400H, PEG); 2.74 (s, 8H, CH_{2}C=O) ppm.

Ejemplo 3 Preparación de conjugados de albumina sérica bovina de polietilenglicol (PEG-BSA)

A. Se añadió SC-PEG (1 g) a una solución agitada de Albúmina Sérica Bovina (BSA) (100 mg) en 0.1 M de fosfato sódico, pH 7.8 (20 ml). Se usó hidróxido sódico (0.5 N) para mantener un pH 7.8 durante 30 min. El exceso de PEG libre fue extraído por diafiltración usando 50 mM de solución salina tamponada con fosfato. La extensión de la modificación de BSA fue aproximadamente del 50% (30) según fue determinado por titración de trinitrobencenosulfonato (TNBS) de grupos amino [Habeeb, Analyt. Biochem. 14, 328-336 (1966)].

El mismo grado de modificación se obtuvo cuando el experimento fue repetido bajo condiciones idénticas usando SS-PEG en vez de SC-PEG.

B. Se añadió SC-PEG (1 g) a una solución agitada de BSA (100 mg) en 0.1 M de borato de sodio, pH 9.2. Se usó hidróxido sódico (0.5 N) para mantener el pH 9.2 durante 30 min. El exceso de PEG libre fue extraído por diafiltración y se evaluó el número de grupos amino libres del producto. Aproximadamente el 68% (41) de los grupos amino de la BSA nativa fue modificado.

C. Se añadió BSC-PEG (1 g) a una solución agitada de BSA (100 mg) en 0.1 M de borato de sodio, pH 9.2. Se usó hidróxido sódico (0.5 N) para mantener un pH 9.2 durante 30 min. El exceso de PEG libre fue extraído por diafiltración y se evaluó el número de grupos amino libres del producto. Aproximadamente el 80% (48) de los grupos amino de la BSA nativa fue modificado. El análisis del producto por HPLC (Filtración en gel) indicó que cerca de un 65% de PEG-BSA estaba en forma entrecruzada intermolecularmente y aproximadamente el 35% del producto tenía el mismo peso molecular que el PEG-BSA del Ejemplo 3B.

Ejemplo 4 Preparación de PEG-glutaminasa

Una solución de Pseudomonas 7A de glutaminasa (200 mg) en 0.1 M de fosfato sódico, pH 7.8 fue tratada con SC-PEG (4.7) g). La solución fue agitada y se mantuvo un pH 7.8 durante 30 minutos. El exceso de PEG libre fue extraído por diafiltración usando 50 mM de PBS. El alcance de la modificación de glutaminasa fue del 74% según fue determinado por titración de trinitrobencenosulfonato de grupos amino (ver Habeeb, 1966 arriba). El producto de PEG-glutaminasa conservó el 81% de la actividad enzimática de la glutaminasa original.

Ejemplo 5 Preparación de PEG-tripsina

Una solución de tripsina pancreática bovina (Boeringer-Mannheim, 120 mg en 20 ml), que fue dializada durante toda la noche a 4ºC contra 20 mM de CaCl_{2} en 1 mM de HCl, fue llevada a 25ºC y tratada con SC-PEG (600 mg) durante 30 min. Durante este tiempo se mantuvo el pH 7.8 en el recipiente de reacción por titración automática con 0.5 N de NaOH. La solución fue acidificada hasta un pH 3 y diafiltrada en gran medida para eliminar el exceso de polímero libre usando 20 mM de CaCl_{2} en 1 mM de HCl como fluido de sustitución. La tripsina modificada tuvo aproximadamente la mitad de los grupos amino libres de la enzima original (7 cadenas de PEG por molécula de tripsina) según fue determinado por titración de TNBS de grupos amino (Habeeb 1966). El producto de PEG-tripsina conservó el 96% de actividad enzimática de la enzima original hacia etil éster de N^{\alpha}-benzoil-L-arginina.

Ejemplo 6 Preparación de PEG-Arginasa

Una solución de arginasa hepática bovina (Sigma, 90 mg) en 0.1 M de NaCl (20 ml) fue tratada con SC-PEG (1.3 g) a 27ºC mientras que se mantuvo el pH 8.0 por titración automática con 0.5 N de NaOH. Después de 30 min. la mezcla reactiva fue diafiltrada usando 50 mM de PBS como fluido de sustitución. Aproximadamente el 64% de los grupos amino de la arginasa nativa fueron modificados (56 cadenas de PEG por molécula de arginasa). El producto de PEG-Arginasa retuvo el 70% de actividad específica de la enzima nativa al ser evaluada con 2,3-butanodiona (reactivo BUN-urea) a pH 9.5.

Ejemplo 7

Otros polipéptidos, que incluyen quimiotripsina, asparaginasa, y adenosina-desaminasa, han sido modificados con SC-PEG usando los procedimientos presentados en la presente.

Los métodos de utilización de óxidos de polialquileno funcionalizados con SC y/o BSC, como el PEG y sus copolímeros son en general aplicables a la preparación de otros polipéptidos modificados y otros componentes biológicamente activos que tienen grupos amino.

Mientras que la presente invención ha sido descrita por referencia a derivados de N-hidroxisuccinimida, será obvio para los expertos en la técnica que otras N-hidroxidicarboximidas pueden ser sustituidas para tal fin. Son típicos de estos derivados N-hidroxiftalimida, N-hidroxiglutarimida, N-hidroxitetrahidroftalimida, N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida u otros derivados N-acilo de hidroxilamina.

Como se ha visto en el Esquema 2, el producto de la modificación proteínica que usa SC-PEG tiene cadenas de PEG injertadas en la estructura del polipéptido mediante enlaces de carbamato (uretano). Se esperaba que una mayor estabilidad del enlace de uretano con respecto al enlace estérico producido tras el uso de SS-PEG (ver Esquema 1) demostrara una diferencia clave entre los dos PEGs activados y los conjugados de PEG-proteínas correspondientes. Nuestros estudios de hecho confirmaron esta esperanza. La Figura 1 muestra los resultados de las mediciones de GF-HPLC de las cantidades de mPEG libre producido como resultado de la incubación de conjugados de PEG-BSA derivados de cada uno de los PEGs activados. Una estabilidad considerablemente superior del conjugado derivado de SC-PEG es evidente.

Para estimar las reacciones de SC-PEG y SS-PEG, hemos realizado mediciones cinéticas de las hidrólisis de polímeros activados en un tampón de fosfato y su aminolisis por N\alpha-acetil-lisina (NAL). Los resultados de estos experimentos están resumidos en la tabla 1. Es evidente a partir de estos datos que el SS-PEG es un agente reactivo más reactivo que SC-PEG. La diferencia en los índices de la hidrólisis fue más grande que la diferencia en los índices de la aminolisis; como consecuencia, el SC-PEG mostró unas proporciones de K_{am}/K_{h} más favorables. La hidrólisis más lenta de SC-PEG también se manifestó en una mayor estabilidad de almacenamiento del reactivo (Figura 2).

La reactividad de los PEGs activados como función de pH fue también determinada usando NAL como modelo para el grupo \varepsilon-amino de una proteína. Hicimos reaccionar cada PEG activado con una cantidad equimolar de NAL a diferente pH, y medimos la NAL no reaccionada mediante el ensayo con TNBS (Figura 3). El pH óptimo para el uso de SC-PEG resultó ser aproximadamente 9.3. No es aconsejable usar SS-PEG a pH>8.0, debido a la estabilidad limitada del éster de PEG-succinato. No obstante, incluso a valores de pH inferiores a 8.0 este PEG activado resultó ser muy reactivo.

Ambos reactivos mostraron alta reactividad hacia la tripsina produciendo derivados enzimáticos comparativamente modificados en condiciones suaves (pH 7.5-8.5) en un periodo de 30 min. Los productos fueron purificados por diafiltración, y los grados de modificación fueron determinados por ensayo fluorométrico, según Stocks, et al. [(1986) Anal. Biochem. 154, 232].

Todos los derivados de tripsina modificados con PEG fueron esencialmente carentes de actividad proteolítica (<1% nativa) según fue determinado por el ensayo Azocoll [Chavira, et al. (1984) Anal. Biochem. 136, 446]. Las actividades específicas de tripsinas representativas modificadas con SS- y SC-PEG hacia sustratos de peso molecular bajo están resumidas en la tabla 2. Las modificaciones produjeron con dificultad varios cambios en las actividades esterolíticas hacia el éster etílico de benzoil-L-arginina, pero incrementó las actividades hacia p-nitroanilidas. Las constantes cinéticas de Michaelis-Menten para diferentes tripsinas modificadas con SC- y SS-PEG fueron medidas usando ZAPA como sustrato. Estos resultados, resumidos en la figura 6, indican que, mientras que V_{max}, K_{cat} y K_{cat}/K_{m} aumentaban gradualmente hasta alcanzar modificaciones, los valores de K_{m} fueron decrecientes.

A veces se atribuye la intensificación en la actividad tríptica hacia sustratos simples a la acilación de residuos de tirosilo en las enzimas [Trenholm, et al. (1969) Bioquímica, 8, 1741; Nakata, et al. (1972) J. Biochem. 72,281]. Los derivados de PEG-tripsina fueron evaluados por cualquier presencia de residuos de tirosilo acilado. El tratamiento de derivados de tripsina modificados con SC-PEG con hidroxilamina no produjo ningún cambio en los espectros UV, indicando que el SC-PEG no aciló los residuos de tirosilo de la enzima. Sin embargo, cuando los derivados de tripsina modificados con SS-PEG fueron sometidos a tratamiento con NH_{2}OH, se observaron de forma consistente los incrementos de la absorbencia de UV (DA_{278}). Estos cambios espectrales fueron inicialmente interpretados como evidencia de la presencia de tirosinas aciladas. Tras un examen más ajustado de estos cambios espectrales, se determinó que los incrementos de absorbencia inducidos por NH_{2}OH se centraron alrededor de 260 nm y no alrededor de 275-280 nm (característica de los residuos de tirosilo desacetilados). En un grupo diferente de experimentos, la presencia de N^{\alpha}-acetil-tirosina (NAT) en la reacción entre NAL y cada uno de los PEGs activados mostró influencia en la cantidad de amina reaccionada (Tabla 3). En cambio, los resultados presentados en la tabla 3 muestran que SC-PEG es ligeramente más selectivo hacia la amina que el SS-PEG.

En comparación con el SS-PEG, el SC-PEG es un reactivo menos reactivo aún más selectivo. Esto se constata por sus proporciones más altas de K_{am}/K_{h}, mejor estabilidad de almacenamiento e interferencia inferior de NAT en reacciones de SC-PEG con amina. El SC-PEG es un reactivo suficientemente reactivo para producir conjugados de PEG-proteína bajo condiciones suaves en 30 min. El SC-PEG puede ser usado en un margen más amplio de pH que el SS-PEG, mostrando la reactividad máxima a pH=9.3. Los conjugados de PEG-proteína que se obtienen usando SC-PEG son químicamente más estables que los conjugados derivados de SS-PEG. Los conjugados de PEG-tripsina producidos por ambos PEGs activados tienen propiedades muy similares: No muestran actividad proteolítica, actividad esterolítica bien conservada, y actividad espectacularmente aumentada hacia sustratos de p-nitroanilida. Las constantes de Michaelis-Menten de las enzimas modificadas indican que la fijación de PEG a tripsina causa un aumento en el nivel de producción de ZAPA y en su afinidad hacia las enzimas modificadas. Estos aumentos de actividad amidolítica parecen no estar relacionados con la acilación de residuos de tirosilo.

TABLA 1 Comparación de las constantes de primer orden para hidrólisis (K_{h}) y aminólisis (K_{am}) de SC-PEG y SS-PEG^{a}

		Hidrólisis: K_{h}^{b}(min^{-1})x 10^{3}		Aminólisis: K_{am}^{c}(min^{-1})x 10^{3}
	Temp.	y [l _{^{1}/_{2}}(min)]		y [K_{am}/K_{h}]
pH	(ºC)	SC-PEG	SS-PEG		SC-PEG	SS-PEG
	4	0.87 [793]	1.84 [376]		2.64 [3.0]	3.74 [2.0]
7.0	27	6.05 [115]	10.4 [67]		26.4 [4.4]	41.4 [4.0]
	37	14.2 [49]	25.9 [27]		81.7 [5.8]	104 [4.0]
	22	5.37 [129]	10.7 [65]		29.1 [5.4]	42.7 [4.0]
7.4	27	9.0 [77]	16.0 [43]		48.6 [5.4]	73.6 [4.6]
	37	19.3 [36]	37.6 [18]		145 [7.5]	193 [5.1]
	4	1.37 [505]	2.58 [268]		12.4 [9.1]	15.0 [5.8]
7.8	27	10.3 [67]	21.6 [32]		130 [12.6]	152 [7.0]
	37	21.8 [32]	48.8 [14]		226 [10.6]	267 [5.5]
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm}Todas las mediciones se realizaron según la apariencia del anión de N-hidroxisuccinimida (-OSu) a 260 nm en 0.8 M de fosfato de sodio; la concentración del acilo activo de succinimidilo enlazado con PEG a tiempo cero [SX-PEG]_{0} fué 0.1M; en experimentos de aminólisis la concentración de N^{\alpha}\text{-}etil\text{-}lisina a tiempo cero [NAL]_{0} fue 3mM\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{150mm}K_{h} = Nivelh/[SX-PEG]_{0}, donde Nivel_{h} = dA_{260} = dA_{260}/dt x 1 E_{260} x 1F; E_{260} = 8500 M^{-1} cm^{-1} es un coeficiente de extinción de -OSu; y F = [-OSu]/[HOSu] + [-OSu] = (1 +10^{6\text{.}0-pH})^{-1}\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{150mm} K_{am} = Nivel Total/[SX-PEG]_{0} -Kh. El Nivel Total en experimentos de aminólisis fue calculado de la misma manera que Nivel_{h} en experimentos de hidrólisis.\end{minipage}

TABLA 2 Resumen de datos de modificación, actividad esterolítica, y actividad amidolítica para la tripsina y sus derivados de mPEG

Derivados^{a} de	Modif^{b}	BAEE^{c}	%	BAPA^{d}	%	ZAPA^{d}	%
Tripsina	(%)	(u/mg)	nativo	(u/mg)	nativo	(u/mg)	nativo
Tripsina Nativa	o	92.4	100	1.26	100	7.81	100
SC-PEG^{N}-Tripsina
N = 6	42.3	103	112	2.26	179	15.3	196
N = 7	45.8	87.9	95.1	2.38	188	17.5	224
N = 9	58.8	90.1	97.5	2.67	212	18.9	242
N = 12	77.9	85.1	92.2	3.83	304	25.5	326
SS-PEG_{h}-Tripsina
N = 7	44.8	102	110	3.25	258	18.8	241
N = 12	770	94.3	102	4.34	344	24.7	316
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Para SX-PEG_{h}-Tripsina, N = 15 x (% de Modif)/100 y se redondea al número entero más cercano.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm}El porcentaje de grupos amino modificados como se determina por el ensayo de fluorecamina [Stocks, et al. (1996) Anal. Biochem. 154, 232].\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm}El ensayo de tripsina de BAEE (etil éster de N^{\alpha}\text{-}benzoil\text{-}L\text{-}arginina) se realizó en un pH 7.8, 37^{o}C con una concentración de sustrato 0.5 mM. El coeficiente de extinción fue \varepsilon_{283} = 808 M^{-1} cm^{-1} [Kezdy, et al. (1965) Biochemistry 4, 99].\end{minipage}
^{d} \begin{minipage}[t]{155mm}Los ensayos amidoilticos de BAPA (N^{\alpha}\text{-}benzoil\text{-}D, L-arginina-p-nitroanilida) y ZAPA (N^{\alpha}\text{-}CBZ\text{-}L\text{-} arginina\text{-}p\text{-}nitroanilida) fueron realizados con una concentración de sustrato de 1 mM en 50 mM de Tris-HCl pH 8.1, 10 mM de CaCl_{2}, y 37^{o}C. El coeficiente de extinción para p-nitroanilina, \varepsilon_{410} = 8800 M^{-1}cm^{-1}, fue utilizado en ambos ensayos.\end{minipage}

TABLA 3

Constantes de michaelis-menten para la actividad amidolítica de tripsina nativa y sus derivados^{a} de mPEG
Derivados de Tripsina	Km	V_{max}	K_{cat}	K^{cat}/K^{m}
	(mM)	(\muM/min)	(min^{-1})	(mM-1 min^{-1})
Tripsina nativa	1.08	15.7	378	349
SC-PEG_{h}-Tripsina
N = 7	0.29	19.6	470	1626
N = 9	0.21	20.2	484	2290
N = 12	0.11	22.9	549	4973
SS-PEGh -Tripsina
N = 7	0.21	18.6	447	2172
N = 12	0.13	22.5	539	4159
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm}Las mediciones se produjeron a 37^{o}C con una concentración constante de proteína tripsina de 1.0 \mug/ml (por medio del ensayo Bluret). N^{\alpha}\text{-}carbobenzoxi\text{-}L\text{-}arginina\text{-}p\text{-}nitroanilida (AZPA) fue usada como un sustrato en concentraciones que varían entre 0.02 y 1.71 mM en 50 mM de Tris-HCl pH 7.8, 10 mM de cloruro de calcio.\end{minipage}
\hskip0,1cm \begin{minipage}[t]{150mm}Las constantes fueron calculadas a partir de diagramas de Lineweaver Burk de los valores iniciales de la apariencia de p-nitroanilina (\varepsilon_{410} = 8800 M^{-1} cm^{-1}).\end{minipage}

TABLA 4

Efecto de N\alpha-Ac-L-Tir (NAT) hasta la reacción de SS-PEG y SC-PEG con N\alpha-Ac-L-Lis (NAL)
% de NAL Reaccionado con^{a}
NAT/NAL	SS-PEG	SC-PEG
0	78.55 (100)^{b}	53.75 (100)
1.0	77.15 (98.2)	55.25 (103)
2.5	74.50 (94.8)	52.55 (97.8)
5.0	68.50 (87.2)	48.60 (90.4)
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Se añadió a un tampón de borato de trietanolamina (0.3 m, pH 8.1) lo siguiente: una solución de NAL (50 mM, 0.1 ml) y una solución de NAT (100 mM, volumen correspondiente a las proporciones dadas en la tabla y llevando el volumen combinado a 1.1 ml) ambos en el mismo tampón, y finalmente el PEG apropiado activado en CH_{3}CN (50 mM de acilo activo, 0.1 ml). La solución resultante fue removida e incubada a 28^{o}C durante 1 hr. Una mezcla de los mismos componentes pero quitando el SX-PEG fue usada como control. La versión del ensayo de TNBS de Snyder, et al. [(1975) Anal. Biochem. 64, 284] fue usada para determinar el NAL no reaccionado.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm}Los números dados en los paréntesis representan los valores de porcentaje de la reacción de NAL dividido por el porcentaje de la reacción de NAL cuando NAT/NAL = 0.\end{minipage}

Claims

1. Un proceso para formar un polipéptido modificado que comprende un polipéptido y óxido de polialquileno que comprende el hecho de poner en contacto a un óxido de polialquileno que tiene un grupo terminal oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida con un pH en la gama de 5.8-11, en el que dicho óxido de polialquileno está enlazado de manera covalente a un grupo amina del polipéptido por un enlace de uretano, y donde el óxido de polialquileno con un grupo terminal oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida tiene la fórmula

R_{1} (O-R_{2})_{a} -(O-R_{3})_{b} -(O-R_{4})_{c} -O-(CO)-O-R_{5}

donde R_{1} es H, H_{3}C o un grupo de N-dicarboximida;

donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, disustituido, o insustituido, y donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser independientemente el mismo, o diferente de los otros R_{2}, R_{3}, y R_{4};

donde R_{5} es un grupo de N-dicarboximida; y

2. El proceso según la reivindicación 1, donde dicho grupo terminal oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida es carbonato de succinimida.

3. El proceso según la reivindicación 2, donde dicho óxido de polialquileno es polietilenglicol.

4. El proceso según la reivindicación 3, donde dicho polipéptido modificado es biológicamente activo.

5. El proceso según la reivindicación 2 que comprende

a) tratar dicho óxido de polialquileno con fosgeno para formar un cloroformato de óxido de polialquileno in situ;

b) reaccionar dicho cloroformato de óxido de polialquileno con una N-hidroxi-N-dicarboximida seguido de trietilamina para formar un óxido de polialquileno con un grupo terminal oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida; y

c) reaccionar dicho óxido de polialquileno con un grupo terminal oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida con dicho polipéptido con lo cual dicho polipéptido y dicho óxido de polialquileno se acoplan de manera covalente por dicho enlace de uretano.

6. El proceso según la reivindicación 5, donde un óxido de polialquileno se fija de manera covalente a dicho polipéptido.

7. El proceso según la reivindicación 6, donde dicho óxido de polialquileno es polietilenglicol.

8. El proceso según la reivindicación 7, donde el peso molecular del óxido de polialquileno está entre 500 y 40,000 daltons.

9. El proceso según la reivindicación 8, donde el peso molecular del óxido de polialquileno está entre 2,000 y 20,000 daltons.

10. El proceso según la reivindicación 9, donde dicho polipéptido modificado es biológicamente activo.