ES2247656T3 - Un proceso para formar un polipeptido modificado que comprende un polipeptido y un oxido de polialquileno. - Google Patents
Un proceso para formar un polipeptido modificado que comprende un polipeptido y un oxido de polialquileno.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A CARBONATO DE POLI(ETILEN GLICOL) N - SUCCINIMIDA Y A LA PREPARACION DEL MISMO. EL POLIETILEN GLICOL (PEG) SE CONVIERTE EN SU DERIVADO DE CARBONATO DE N SUCCINIMIDA, Y DICHA FORMA DEL POLIMERO REACCIONA RAPIDAMENTE CON GRUPOS AMINOS DE PROTEINAS EN TAMPONES ACUOSOS. LAS PROTEINAS MODIFICADAS TIENEN CADENAS PEG INJERTADAS EN EL ESQUELETO POLIPEPTIDICO, MEDIANTE UNIONES URETANO(CARBAMATO) ESTABLES, RESISTENTES A HIDROLISIS.
Description
Un proceso para formar un polipéptido modificado
que comprende un polipéptido y un óxido de polialquileno.
Esta es una continuación parcial de la serie U.S.
Nº. 340,928, solicitada él 19 de Abril, 1989, cuyo contenido está
incorporado aquí por referencia en esta solicitud.
La presente invención se refiere a la
modificación química de polipéptidos mediante fijación covalente de
cadenas de óxido de polialquileno a una molécula polipeptídica como
se describe en la patente U.S. Nº. 4,179,337, de Davis, et
al. Se describe en Abuchowski & Davis "Enzymes as
Drugs", Holcenberg & Roberts, Eds., págs.
367-383, John Wiley & Sons, N.Y. (1981) que
estas preparaciones de polipéptidos tienen inmunogenicidad y
antigenicidad reducidas y también tienen una vida más larga en la
circulación sanguínea en comparación con los polipéptidos
genitores. Estas propiedades provechosas de los polipéptidos
modificados los hacen muy útiles para varios usos terapéuticos,
como por ejemplo la terapia enzimática.
Los grupos activos que son introducidos en los
óxidos de polialquileno para una fijación posterior de estos
polímeros a proteínas deben satisfacer los requisitos
siguientes:
- 1.
- Los grupos activos deben ser lo bastante reactivos para proporcionar una reacción rápida con una proteína bajo condiciones suaves;
- 2.
- Los residuos liberados de los grupos activos durante el proceso de modificación deben ser no tóxicos y/o fácilmente separables del aducto proteína-polímero.
Para efectuar la fijación covalente del
polietilenglicol (PEG) a una proteína, los grupos terminales
hidróxilo del polímero tienen que ser convertidos en primer lugar
en grupos funcionales reactivos. Frecuentemente, se hace referencia
a este proceso como "activación" y el producto se denomina
"PEG activado". Los derivados de metoxipolietilenglicol (mPEG),
unidos por un extremo con un grupo funcional, reactivo a las aminas
en una molécula de proteína, son usados la mayoría de las
veces.
La forma más común de PEG activado usada hasta
ahora para la preparación de enzimas terapéuticas es éster
poli(etilenglicol) de
succinil-N-hidroxisuccinimida
(SS-PEG) [Abuchowski, et al. Cancer Biochem.
Biophys. 7, 175-186 (1984), esquema 1]. El uso de
este polímero activado satisface ambos requisitos arriba detallados.
Sin embargo, esto tiene un inconveniente más importante. El enlace
estérico entre el polímero y el residuo de ácido succínico Tiene
una estabilidad limitada en medios acuosos [U.S. Patente Nº.
4,670,417, a Iwasaki, et al. (1987); Ulbrich, et al.,
Makromol. Chem. 187, 1131-1144 (1986)]
Esquema
1
Unión convencional de PEG a una
proteína usando SS-PEG como la forma activada del
polímero
Varios politilenglicoles (PEG) funcionalizados
han sido eficazmente usados en campos como la modificación
proteínica (Abuchowski & Davis, 1981, supra), la química
peptídica [Zalipsky, et al., Int. J. Peptide Protein Res.,
30, 740-783 (1987))] y la preparación de
conjugados con materiales biológicamente activos [Zalipsky, et
al., Eur. Polym. J. 19, 1177-1183 (1983) y
Zalipsky and Barany, Polymer Preprints, Am. Chem. Soc. Div. Polym.
Chem. 27(1), 1-2 (1986)]. Los
conjugados de PEG con proteínas útiles en aplicaciones médicas han
demostrado prometer, particularmente con respecto a su estabilidad a
la digestión proteolítica, una respuesta inmunológica reducida y
medias de vida más largas en la circulación sanguínea.
Para conseguirlo, la técnica precedente ha
activado el grupo hidroxi de PEG con cloruro de cianuro y el
compuesto resultante luego se acopla con proteínas (Abuchowski,
et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3578; Abuchowski and
Davis, 1981, supra). No obstante, existen varias desventajas
del uso de este método, como la toxicidad de cloruro de cianuro y la
reactividad no específica para proteínas que tienen grupos
funcionales distintos de las aminas, como la cisteína esencial
libre o residuos de tirosina.
Para superar éstas y otras desventajas, se han
introducido procedimientos alternativos, como los derivados del
succinimidil succinato de PEG (SS-PEG) (Abuchowski,
et al. 1984, supra, ver Esquema 1, arriba). Este
reacciona rápidamente con proteínas (30 minutos) bajo condiciones
suaves produciendo conjugados activos aún muy modificados, el uso
de este polímero activado tiene una mayor desventaja. El enlace
estérico entre el polímero y el residuo de ácido succínico tiene
una limitada estabilidad en medios acuosos [Patente U.S. Nº.
4,670,417 de Iwasaki, et al. and Ulbrich, et al.
Makromol Chem., 187, 1131-1144 (1986)].
La formación de enlaces de uretano entre grupos
amino de una proteína y PEG supera el problema de pérdida
hidrolítica de las cadenas poliméricas [Veronese, et al.,
Appl. Biochem. Biotechnol. 11, 141-152
(1985)]. De hecho, se demostró en derivados de PEG marcados
radioactivamente que los enlaces de uretano son totalmente estables
bajo una variedad de condiciones fisiológicas [Larwood & Szoka
J., Labeled Compounds Radiopharm., 21, 603-614
(1984)]. Se realizó la unión de PEG a una proteína por medio de un
derivado de carbamato [Beauchamp, et al. Analyt. Biochem.
131, 25-33 (1983)] usando PEG activado con
carbonildiimidazol. No obstante, el polímero activado de esta
manera no es muy reactivo y en consecuencia fueron necesarios largos
períodos de reacción (48-72 hrs a pH 8.5) para
conseguir suficientes modificaciones. En consecuencia, el agente
activado con carbonildiimidazol claramente no satisface el primer
requisito destacado arriba. Una desventaja adicional de este
enfoque es el coste relativamente elevado del
carbonildiimidazol.
Se describió el uso de derivados de
PEG-fenilcarbonato para la preparación de
PEG-proteína unida con uretano [ver Veronese, et
al. (1985), supra]. El inconveniente principal de este
enfoque se extiende en la toxicidad de los residuos hidrofóbicos de
fenol (p-nitrofenol o 2, 4,
5-triclorofenol) y su afinidad para las proteínas.
Claramente este método no satisface el segundo requisito destacado
arriba.
Cada una de las formas activadas del polímero
tiene propiedades que pueden ser consideradas ventajosas o
desventajosas, dependiendo del sistema de uso. Considerando muchas
aplicaciones de los PEG-polipéptidos, es deseable
ampliar aquellos PEG-reactivos que modifican las
proteínas hechos para un uso final específico.
WO 89/06546, que se publicó después de la fecha
de prioridad de esta solicitud pero con una fecha de prioridad
anterior, expone una proteína de CSF-1
biológicamente activa selectivamente conjugada por medio de ciertos
residuos de aminoácidos o mitades carbohidrato a un polímero
hidrosoluble seleccionado de polietilenglicol u homopolímeros de
polipropilenglicol, polioles polioxietilados, o alcohol
polivinílico.
WO 89/01033 expone un conjugado hidrosoluble
sustancialmente no inmunogénico de superóxido dismutasa preparado
por acoplamiento a un polialquilenglicol que es polietilenglicol o
copolímero polipropileno-polietilenglicol, donde
dicho glicol tiene un promedio de peso molecular de
40,000-1,000,000 y es terminalmente insustituido o
sustituido por grupos C_{1-4} alquilo o
C_{1-4} alcoxi.
La invención proporciona un proceso para formar
un polipéptido modificado que comprende un polipéptido y óxido de
polialquileno que comprende el hecho de poner en contacto un óxido
de polialquileno con un grupo terminal
oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida
con un polipéptido, con un pH en la gama de 5.8-11
donde dicho óxido de polialquileno se enlaza de manera covalente a
un grupo amina del polipéptido por un enlace de uretano, y donde el
óxido de polialquileno que tiene un grupo terminal
oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida
tiene la fórmula
R_{1}-(O-R_{2})-(O-R_{3})-(O-R_{4})-O-(CO)-O-R_{5}
donde R_{1} es H, H_{3}C, un
grupo N-dicarboximida, o cualquier otro grupo
funcional;
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un
grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, disustituido, o
insustituido, y
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser
independientemente igual, o diferente de los otros R_{2}, R_{3},
y R_{4};
donde R_{5} es un grupo de
N-dicarboximida; y
donde a es un número entero entre 1 y 1000 y b y
c es cada uno un número entero entre 0 y 1000, y la suma de a, b, y
c da entre 10 y 1000.
La presente invención también describe un proceso
que comprende el hecho de reaccionar un compuesto con la
estructura
R_{1} --- (O
--- R_{2})_{a} --- (O --- R_{3})_{b} --- (O
--- R_{4})_{c} --- O ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}--- X
donde R_{1} es H, H_{3}C, grupo
de N-dicarboximida, o cualquier otro grupo
funcional;
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un
grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, disustituido, o
insustituido, y
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser
independientemente el mismo o diferente de los otros de R_{2},
R_{3}, y R_{4};
donde X es un halógeno;
donde a es un número entero entre 1 y 1000 y b y
c es cada uno un número entero entre 0 y 1000, y la suma de a, b, y
c da entre 10 y 1000.
con una N-hdroxidicarboximida en
presencia de una base.
La presente invención además describe un
polipéptido modificado que comprende un polipéptido que tiene
enlazado a él al menos un polímero que tiene la estructura
R_{1} --- (O
--- R_{2})_{a} --- (O --- R_{3})_{b} --- (O
--- R_{4})_{c} --- O ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---
donde R_{1} es H, H_{3}C, o un
grupo succinimida
carbonato;
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un
grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, sustituido, o
insustituido, y
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser
independientemente el mismo, o diferente de los otros R_{2},
R_{3}, y R_{4};
donde a es un número entero entre 1 y 1000 y b y
c es cada uno un número entero entre 0 y 1000, y la suma de a, b, y
c da entre 10 y 1000.
donde cada polímero está unido de manera
covalente a un grupo amina del polipéptido por un enlace de
uretano.
La invención también proporciona un proceso para
preparar un polipéptido modificado que comprende el hecho de
reaccionar un polipéptido con el compuesto a un pH dentro de la
gama de aproximadamente 5.8-11.
Figura 1. Liberación de mPEG de conjugados de
PEG-BSA.
Condiciones experimentales: Soluciones de
ambos tipos de conjugados de PEG-BSA (-61%
modificación) a una concentración de 4 mg/ml (mediante ensayo
Bluret) fueron incubados en el tampón apropiado. A unos intervalos
de tiempo dados, unas partes alícuotas de estas soluciones fueron
inyectadas en una HPLC equipada con columna Zorbax
GF-450 y detector de RI para determinar
mPEG-5000.
Figura 2. Estabilidad de SS-PEG y
SC-PEG a 22ºC.
Condiciones experimentales: Los PEGs
activados fueron almacenados en forma de polvo fino en contenedores
herméticamente cerrados de polipropileno. Se evaluó el contenido de
acilo activo de las muestras de cada polímero a intervalos
temporales dados.
Figura 3. Reactividad de PEGs activados como una
función del pH.
Condiciones experimentales: Al tampón de
borato de trietanolamina (0.3 M, 1 ml) con el apropiado pH, se
añadió una solución madre de NAL en agua (50 mM, 0.1 ml) seguido de
una solución madre del apropiado PEG activado en CH_{3}CN (50 mM
de acilo activo, 0.1 ml). La solución resultante fue removida e
incubada a 28ºC durante 1 h. Una mezcla de los mismos componentes
pero dejando fuera SX-PEG fue usada como control.
Se usó TNBS - versión de ensayo de Snyder, et al. [(1975)
Anal. Biochem. 64, 284] para determinar la NAL no reaccionada.
La presente invención describe óxidos de
polialquileno activados que tienen la estructura general:
R_{1} --- (O
--- R_{2})_{a} --- (O --- R_{3})_{b} --- (O
--- R_{4})_{c} --- O ---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}--- O --- R_{5}
donde R_{1} es H, H_{3}C, un
grupo de N-dicarboximida, o cualquier otro grupo
funcional; donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un grupo
alquilo que puede ser recto, ramificado, disustituido, o
insustituido,
y
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser
independientemente el mismo, o diferente de los otros R_{2},
R_{3}, y R_{4}; donde R_{5} es un grupo de
N-dicarboximida; y donde a es un número entero entre
1 y 1000 y b y c es cada uno un número entero entre 0 y 1000, y la
suma de a, b, y c da entre 10 y 1000.
Más específicamente, la invención se refiere a la
preparación y uso de un nuevo PEG activado, es decir, carbonato de
poli(etilenglicol)-succinimida
(SC-PEG) y el derivado bifuncional de PEG, es decir,
carbonato de
polietilenglicol-bis-succinimida
(BSC-PEG). Además, derivados heterobifuncionales de
PEG son posibles (Zalipsky and Barany, supra); uno de los
grupos terminales es carbonato de succinimida y el otro grupo
terminal (R^{1}, ver Esquema 2, infra) contiene un grupo
funcional reactivo diferente, como un grupo carboxilo libre o un
aminoácido. Estos materiales reaccionan fácilmente con grupos amino
de proteínas para proporcionar la fijación del PEG mediante enlaces
de uretano estables (Esquema 2, abajo). La reactividad de los
agentes nuevos, SC-PEG y BSC-PEG,
son comparables a los SS-PEG usados de forma
convencional. Así, se pueden alcanzar altos grados de modificación
en condiciones suaves (tampones acuosos, pH 5.8-11,
preferiblemente pH 7.0-9.5) en aproximadamente
30-60 min. y temperaturas moderadas
(4-40ºC). Además, los agentes son solubles en una
variedad de disolventes orgánicos, siendo así útiles e importantes
para el acoplamiento de péptidos de peso molecular bajo,
parcialmente protegidos y otros ligandos biológicamente útiles.
El PEG no debe tener un peso molecular
particular, pero se prefiere que el peso molecular esté entre 500 y
40,000; más preferiblemente entre 2,000 y 20,000. La elección del
peso molecular del PEG se hace en base a la naturaleza de la
proteína particular empleada, por ejemplo, el número de grupos
amino disponibles para la modificación.
La N-hidroxisuccinimida liberada
durante la modificación de la proteína es de material no tóxico
usado frecuentemente en química de proteínas, especialmente para la
preparación de aductos de proteínas biológicamente activos. Como en
el caso del anteriormente mencionado PEG de carbonildiimidazol
activado y fenilcarbonatos de PEG, el producto de modificación
proteínica usando SC-PEG o BSC-PEG
tiene cadenas de PEG injertadas en la estructura del polipéptido
mediante enlaces de carbamato (uretano). No obstante, debido a la
mayor reactividad de los agentes nuevos, se pueden alcanzar unos
grados más altos de modificación en períodos de tiempo más cortos.
Una ventaja adicional del PEG activado de carbonato de succinimida
es que los grupos funcionales activos que no reaccionan con grupos
amino de una proteína son sometidos a hidrólisis rápida acuosa
produciendo N-hidroxisuccinimida, dióxido de carbono
y PEG hidroxi-terminado. Esto es de particular
importancia en el caso de derivados de PEG bifuncional
(BSC-PEG). Estos materiales pueden servir para un
objetivo doble: PEGilación y entrecruzamiento simultáneo. El
BSC-PEG, como cualquier material homobifuncional
puede utilizarse para entrecruzar dos proteínas diferentes. Cuando
una molécula de BSC-PEG reacciona con una proteína
por medio de un solo grupo terminal, el otro grupo SC del polímero,
que no reacciona con la amina, es hidrolizado y en consecuencia no
se introducen residuos extraños (potencialmente antigénicos) en el
conjugado de PEG-proteína.
Las actividades biológicas de proteínas
modificadas con SC-PEG y BSC-PEG
son conservadas en gran parte como se muestra por los ejemplos
sucesivos. Hay una bibliografía anterior donde una proteína
(activadora del tejido plasminógeno) conjugada de manera covalente
con PEG por medio de enlaces de uretano tenía una actividad
específica más alta que la misma proteína modificada con
SS-PEG aproximadamente en la misma medida [Berger
& Pizzo, Blood, 71, 1641-1647
\newpage
Esquema
2
Uso de SS-PEG y
BSC-PEG para la unión de PEG a
proteínas
Naturalmente, la utilidad de derivados de PEG
activado con SC se extiende a la preparación de conjugados de PEG
de péptidos de peso molecular bajo y otros materiales que contienen
grupos amino libres.
Un procedimiento de recipiente único
"one-pot" para la introducción de grupos SC en
PEG fue desarrollado (Esquema 3 abajo). Primero, se produjo
cloroformato de polietilenglicol in situ por tratamiento del
polímero (PEG) con fosgeno. El cloroformato resultante fue luego
reaccionado con N-hidroxisuccinimida (HOSu) seguido
de trietilamina (TEA) para producir los derivados activados
deseados de PEG. Las preparaciones poliméricas activadas fueron
purificadas de materiales de peso molecular bajo y se determina que
contienen las cantidades teóricas de grupos activos.
Esquema
3
Síntesis de derivados de
carbonato de N-succinimida de
poli(etilenglicol)
Metoxipolietilenglicol de peso molecular 5000
(Union Carbide, 60 g, 12 mmol) fué disuelto en
tolueno/diclorome-
tano (3:1, 200 ml) y tratado con una solución de tolueno de fosgeno (30 ml, 57 mmol) durante toda la noche. La solución fue evaporada a sequedad y el resto de fosgeno fue extraído al vacío. El residuo fue redisuelto en tolueno/diclorometano (2:1, 150 ml) y tratado con N-hidroxisuccinimida sólida (2.1 g, 18 mmol) seguido de trietilamina (1.7 ml, 12 mmol). Después de 3 horas, la solución fue filtrada y evaporada a sequedad. El residuo fue disuelto en acetato de etilo (600 ml) caliente (50ºC), filtrado de insolubles de metal traza y enfriado para facilitar la precipitación del polímero. El producto fue recogido por filtración y luego recristalizado una vez más del etilacetato. El producto fue secado al vacío con P_{2}O_{5}. El rendimiento fue 52.5 g (85% en teoría).
tano (3:1, 200 ml) y tratado con una solución de tolueno de fosgeno (30 ml, 57 mmol) durante toda la noche. La solución fue evaporada a sequedad y el resto de fosgeno fue extraído al vacío. El residuo fue redisuelto en tolueno/diclorometano (2:1, 150 ml) y tratado con N-hidroxisuccinimida sólida (2.1 g, 18 mmol) seguido de trietilamina (1.7 ml, 12 mmol). Después de 3 horas, la solución fue filtrada y evaporada a sequedad. El residuo fue disuelto en acetato de etilo (600 ml) caliente (50ºC), filtrado de insolubles de metal traza y enfriado para facilitar la precipitación del polímero. El producto fue recogido por filtración y luego recristalizado una vez más del etilacetato. El producto fue secado al vacío con P_{2}O_{5}. El rendimiento fue 52.5 g (85% en teoría).
Para determinar el contenido de carbonato activo
del producto, se reaccionaron muestras del polímero con una
cantidad medida de bencilamina en diclorometano y el exceso de
amina fue titrado con ácido perclórico en dioxano. Estas
titraciones indicaron que 1 g del producto contenía 1.97 x10^{-4}
mol de carbonato activo (101% de contenido teórico). Bandas
características de I.R. (película en NaCl, cm^{-1}) a: 1812 y
1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114
(CH_{2}OCH_{2}). ^{13}C-NMR (CDCl_{3}):
\delta 168.5 (CH_{2}C=O); 151.3
(O-CO_{2}); 71.9 (CH_{3}OCH_{2}) 70.2
(PEG); 68.7 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68.0
(CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 58.9 (CH_{3}O); 25.2
(CH_{2}C=O) ppm.
Polietilenglicol de peso molecular 4600 (Union
Carbide, 50g, 21.7 mequiv. OH) fue convertido al carbonato de
bis-N-hidroxisuccinimida
correspondiente usando una solución de tolueno de fosgeno (50 ml,
96.5 mmol) y luego N-hidroxisuccinimida (3.8 g, 23
mmol) y trietilamina (3.2 ml, 23 mmol) según el procedimiento
descrito en el ejemplo 1. Después de la purificación se obtuvo el
producto como un polvo blanco (51 g, 96%). El contenido de
carbonato activo fue 4.0 X 10^{-4} mol/g (98% teórico) según se
determinó por titraciones con ácido perclórico de bencilamina.
Bandas características de I.R. (película en NaCl, cm^{-1}) a:
1812 y 1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114
(CH_{2}OCH_{2}).
^{13}C-NMR(CDCl_{3}): \delta 168.5
(CH_{2}C=O); 151.3 (O-CO_{2}); 70.2
(PEG); 68.7 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68.0
(CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 25.2 (CH_{2}C=O) ppm.
H-NMR (CDCl_{3}): \delta 4.35 (m, 4H,
CH_{2}OCO_{2}); 3.55 (s, - 400H, PEG); 2.74 (s, 8H, CH_{2}C=O)
ppm.
A. Se añadió SC-PEG (1 g) a una
solución agitada de Albúmina Sérica Bovina (BSA) (100 mg) en 0.1 M
de fosfato sódico, pH 7.8 (20 ml). Se usó hidróxido sódico (0.5 N)
para mantener un pH 7.8 durante 30 min. El exceso de PEG libre fue
extraído por diafiltración usando 50 mM de solución salina tamponada
con fosfato. La extensión de la modificación de BSA fue
aproximadamente del 50% (30) según fue determinado por titración de
trinitrobencenosulfonato (TNBS) de grupos amino [Habeeb, Analyt.
Biochem. 14, 328-336 (1966)].
El mismo grado de modificación se obtuvo cuando
el experimento fue repetido bajo condiciones idénticas usando
SS-PEG en vez de SC-PEG.
B. Se añadió SC-PEG (1 g) a una
solución agitada de BSA (100 mg) en 0.1 M de borato de sodio, pH
9.2. Se usó hidróxido sódico (0.5 N) para mantener el pH 9.2
durante 30 min. El exceso de PEG libre fue extraído por
diafiltración y se evaluó el número de grupos amino libres del
producto. Aproximadamente el 68% (41) de los grupos amino de la BSA
nativa fue modificado.
C. Se añadió BSC-PEG (1 g) a una
solución agitada de BSA (100 mg) en 0.1 M de borato de sodio, pH
9.2. Se usó hidróxido sódico (0.5 N) para mantener un pH 9.2
durante 30 min. El exceso de PEG libre fue extraído por
diafiltración y se evaluó el número de grupos amino libres del
producto. Aproximadamente el 80% (48) de los grupos amino de la BSA
nativa fue modificado. El análisis del producto por HPLC
(Filtración en gel) indicó que cerca de un 65% de
PEG-BSA estaba en forma entrecruzada
intermolecularmente y aproximadamente el 35% del producto tenía el
mismo peso molecular que el PEG-BSA del Ejemplo
3B.
Una solución de Pseudomonas 7A de
glutaminasa (200 mg) en 0.1 M de fosfato sódico, pH 7.8 fue tratada
con SC-PEG (4.7) g). La solución fue agitada y se
mantuvo un pH 7.8 durante 30 minutos. El exceso de PEG libre fue
extraído por diafiltración usando 50 mM de PBS. El alcance de la
modificación de glutaminasa fue del 74% según fue determinado por
titración de trinitrobencenosulfonato de grupos amino (ver Habeeb,
1966 arriba). El producto de PEG-glutaminasa
conservó el 81% de la actividad enzimática de la glutaminasa
original.
Una solución de tripsina pancreática bovina
(Boeringer-Mannheim, 120 mg en 20 ml), que fue
dializada durante toda la noche a 4ºC contra 20 mM de CaCl_{2} en
1 mM de HCl, fue llevada a 25ºC y tratada con
SC-PEG (600 mg) durante 30 min. Durante este tiempo
se mantuvo el pH 7.8 en el recipiente de reacción por titración
automática con 0.5 N de NaOH. La solución fue acidificada hasta un
pH 3 y diafiltrada en gran medida para eliminar el exceso de
polímero libre usando 20 mM de CaCl_{2} en 1 mM de HCl como
fluido de sustitución. La tripsina modificada tuvo aproximadamente
la mitad de los grupos amino libres de la enzima original (7
cadenas de PEG por molécula de tripsina) según fue determinado por
titración de TNBS de grupos amino (Habeeb 1966). El producto de
PEG-tripsina conservó el 96% de actividad
enzimática de la enzima original hacia etil éster de
N^{\alpha}-benzoil-L-arginina.
Una solución de arginasa hepática bovina (Sigma,
90 mg) en 0.1 M de NaCl (20 ml) fue tratada con
SC-PEG (1.3 g) a 27ºC mientras que se mantuvo el pH
8.0 por titración automática con 0.5 N de NaOH. Después de 30 min.
la mezcla reactiva fue diafiltrada usando 50 mM de PBS como fluido
de sustitución. Aproximadamente el 64% de los grupos amino de la
arginasa nativa fueron modificados (56 cadenas de PEG por molécula
de arginasa). El producto de PEG-Arginasa retuvo el
70% de actividad específica de la enzima nativa al ser evaluada con
2,3-butanodiona (reactivo BUN-urea)
a pH 9.5.
Otros polipéptidos, que incluyen quimiotripsina,
asparaginasa, y adenosina-desaminasa, han sido
modificados con SC-PEG usando los procedimientos
presentados en la presente.
Los métodos de utilización de óxidos de
polialquileno funcionalizados con SC y/o BSC, como el PEG y sus
copolímeros son en general aplicables a la preparación de otros
polipéptidos modificados y otros componentes biológicamente activos
que tienen grupos amino.
Mientras que la presente invención ha sido
descrita por referencia a derivados de
N-hidroxisuccinimida, será obvio para los expertos
en la técnica que otras N-hidroxidicarboximidas
pueden ser sustituidas para tal fin. Son típicos de estos derivados
N-hidroxiftalimida,
N-hidroxiglutarimida,
N-hidroxitetrahidroftalimida,
N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida
u otros derivados N-acilo de hidroxilamina.
Como se ha visto en el Esquema 2, el producto de
la modificación proteínica que usa SC-PEG tiene
cadenas de PEG injertadas en la estructura del polipéptido mediante
enlaces de carbamato (uretano). Se esperaba que una mayor
estabilidad del enlace de uretano con respecto al enlace estérico
producido tras el uso de SS-PEG (ver Esquema 1)
demostrara una diferencia clave entre los dos PEGs activados y los
conjugados de PEG-proteínas correspondientes.
Nuestros estudios de hecho confirmaron esta esperanza. La Figura 1
muestra los resultados de las mediciones de GF-HPLC
de las cantidades de mPEG libre producido como resultado de la
incubación de conjugados de PEG-BSA derivados de
cada uno de los PEGs activados. Una estabilidad considerablemente
superior del conjugado derivado de SC-PEG es
evidente.
Para estimar las reacciones de
SC-PEG y SS-PEG, hemos realizado
mediciones cinéticas de las hidrólisis de polímeros activados en un
tampón de fosfato y su aminolisis por
N\alpha-acetil-lisina (NAL). Los
resultados de estos experimentos están resumidos en la tabla 1. Es
evidente a partir de estos datos que el SS-PEG es
un agente reactivo más reactivo que SC-PEG. La
diferencia en los índices de la hidrólisis fue más grande que la
diferencia en los índices de la aminolisis; como consecuencia, el
SC-PEG mostró unas proporciones de K_{am}/K_{h}
más favorables. La hidrólisis más lenta de SC-PEG
también se manifestó en una mayor estabilidad de almacenamiento del
reactivo (Figura 2).
La reactividad de los PEGs activados como función
de pH fue también determinada usando NAL como modelo para el grupo
\varepsilon-amino de una proteína. Hicimos
reaccionar cada PEG activado con una cantidad equimolar de NAL a
diferente pH, y medimos la NAL no reaccionada mediante el ensayo con
TNBS (Figura 3). El pH óptimo para el uso de SC-PEG
resultó ser aproximadamente 9.3. No es aconsejable usar
SS-PEG a pH>8.0, debido a la estabilidad limitada
del éster de PEG-succinato. No obstante, incluso a
valores de pH inferiores a 8.0 este PEG activado resultó ser muy
reactivo.
Ambos reactivos mostraron alta reactividad hacia
la tripsina produciendo derivados enzimáticos comparativamente
modificados en condiciones suaves (pH 7.5-8.5) en
un periodo de 30 min. Los productos fueron purificados por
diafiltración, y los grados de modificación fueron determinados por
ensayo fluorométrico, según Stocks, et al. [(1986) Anal.
Biochem. 154, 232].
Todos los derivados de tripsina modificados con
PEG fueron esencialmente carentes de actividad proteolítica (<1%
nativa) según fue determinado por el ensayo Azocoll [Chavira, et
al. (1984) Anal. Biochem. 136, 446]. Las actividades
específicas de tripsinas representativas modificadas con SS- y
SC-PEG hacia sustratos de peso molecular bajo están
resumidas en la tabla 2. Las modificaciones produjeron con
dificultad varios cambios en las actividades esterolíticas hacia el
éster etílico de benzoil-L-arginina,
pero incrementó las actividades hacia
p-nitroanilidas. Las constantes cinéticas de
Michaelis-Menten para diferentes tripsinas
modificadas con SC- y SS-PEG fueron medidas usando
ZAPA como sustrato. Estos resultados, resumidos en la figura 6,
indican que, mientras que V_{max}, K_{cat} y K_{cat}/K_{m}
aumentaban gradualmente hasta alcanzar modificaciones, los valores
de K_{m} fueron decrecientes.
A veces se atribuye la intensificación en la
actividad tríptica hacia sustratos simples a la acilación de
residuos de tirosilo en las enzimas [Trenholm, et al. (1969)
Bioquímica, 8, 1741; Nakata, et al. (1972) J. Biochem.
72,281]. Los derivados de PEG-tripsina fueron
evaluados por cualquier presencia de residuos de tirosilo acilado.
El tratamiento de derivados de tripsina modificados con
SC-PEG con hidroxilamina no produjo ningún cambio en
los espectros UV, indicando que el SC-PEG no aciló
los residuos de tirosilo de la enzima. Sin embargo, cuando los
derivados de tripsina modificados con SS-PEG fueron
sometidos a tratamiento con NH_{2}OH, se observaron de forma
consistente los incrementos de la absorbencia de UV (DA_{278}).
Estos cambios espectrales fueron inicialmente interpretados como
evidencia de la presencia de tirosinas aciladas. Tras un examen más
ajustado de estos cambios espectrales, se determinó que los
incrementos de absorbencia inducidos por NH_{2}OH se centraron
alrededor de 260 nm y no alrededor de 275-280 nm
(característica de los residuos de tirosilo desacetilados). En un
grupo diferente de experimentos, la presencia de
N^{\alpha}-acetil-tirosina (NAT)
en la reacción entre NAL y cada uno de los PEGs activados mostró
influencia en la cantidad de amina reaccionada (Tabla 3). En
cambio, los resultados presentados en la tabla 3 muestran que
SC-PEG es ligeramente más selectivo hacia la amina
que el SS-PEG.
En comparación con el SS-PEG, el
SC-PEG es un reactivo menos reactivo aún más
selectivo. Esto se constata por sus proporciones más altas de
K_{am}/K_{h}, mejor estabilidad de almacenamiento e
interferencia inferior de NAT en reacciones de
SC-PEG con amina. El SC-PEG es un
reactivo suficientemente reactivo para producir conjugados de
PEG-proteína bajo condiciones suaves en 30 min. El
SC-PEG puede ser usado en un margen más amplio de pH
que el SS-PEG, mostrando la reactividad máxima a
pH=9.3. Los conjugados de PEG-proteína que se
obtienen usando SC-PEG son químicamente más estables
que los conjugados derivados de SS-PEG. Los
conjugados de PEG-tripsina producidos por ambos
PEGs activados tienen propiedades muy similares: No muestran
actividad proteolítica, actividad esterolítica bien conservada, y
actividad espectacularmente aumentada hacia sustratos de
p-nitroanilida. Las constantes de
Michaelis-Menten de las enzimas modificadas indican
que la fijación de PEG a tripsina causa un aumento en el nivel de
producción de ZAPA y en su afinidad hacia las enzimas modificadas.
Estos aumentos de actividad amidolítica parecen no estar
relacionados con la acilación de residuos de tirosilo.
Hidrólisis: K_{h}^{b}(min^{-1})x 10^{3} | Aminólisis: K_{am}^{c}(min^{-1})x 10^{3} | |||||
Temp. | y [l _{^{1}/_{2}}(min)] | y [K_{am}/K_{h}] | ||||
pH | (ºC) | SC-PEG | SS-PEG | SC-PEG | SS-PEG | |
4 | 0.87 [793] | 1.84 [376] | 2.64 [3.0] | 3.74 [2.0] | ||
7.0 | 27 | 6.05 [115] | 10.4 [67] | 26.4 [4.4] | 41.4 [4.0] | |
37 | 14.2 [49] | 25.9 [27] | 81.7 [5.8] | 104 [4.0] | ||
22 | 5.37 [129] | 10.7 [65] | 29.1 [5.4] | 42.7 [4.0] | ||
7.4 | 27 | 9.0 [77] | 16.0 [43] | 48.6 [5.4] | 73.6 [4.6] | |
37 | 19.3 [36] | 37.6 [18] | 145 [7.5] | 193 [5.1] | ||
4 | 1.37 [505] | 2.58 [268] | 12.4 [9.1] | 15.0 [5.8] | ||
7.8 | 27 | 10.3 [67] | 21.6 [32] | 130 [12.6] | 152 [7.0] | |
37 | 21.8 [32] | 48.8 [14] | 226 [10.6] | 267 [5.5] | ||
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm}Todas las mediciones se realizaron según la apariencia del anión de N-hidroxisuccinimida (-OSu) a 260 nm en 0.8 M de fosfato de sodio; la concentración del acilo activo de succinimidilo enlazado con PEG a tiempo cero [SX-PEG]_{0} fué 0.1M; en experimentos de aminólisis la concentración de N^{\alpha}\text{-}etil\text{-}lisina a tiempo cero [NAL]_{0} fue 3mM\end{minipage} | ||||||
^{b} \begin{minipage}[t]{150mm}K_{h} = Nivelh/[SX-PEG]_{0}, donde Nivel_{h} = dA_{260} = dA_{260}/dt x 1 E_{260} x 1F; E_{260} = 8500 M^{-1} cm^{-1} es un coeficiente de extinción de -OSu; y F = [-OSu]/[HOSu] + [-OSu] = (1 +10^{6\text{.}0-pH})^{-1}\end{minipage} | ||||||
^{c} \begin{minipage}[t]{150mm} K_{am} = Nivel Total/[SX-PEG]_{0} -Kh. El Nivel Total en experimentos de aminólisis fue calculado de la misma manera que Nivel_{h} en experimentos de hidrólisis.\end{minipage} |
Derivados^{a} de | Modif^{b} | BAEE^{c} | % | BAPA^{d} | % | ZAPA^{d} | % |
Tripsina | (%) | (u/mg) | nativo | (u/mg) | nativo | (u/mg) | nativo |
Tripsina Nativa | o | 92.4 | 100 | 1.26 | 100 | 7.81 | 100 |
SC-PEG^{N}-Tripsina | |||||||
N = 6 | 42.3 | 103 | 112 | 2.26 | 179 | 15.3 | 196 |
N = 7 | 45.8 | 87.9 | 95.1 | 2.38 | 188 | 17.5 | 224 |
N = 9 | 58.8 | 90.1 | 97.5 | 2.67 | 212 | 18.9 | 242 |
N = 12 | 77.9 | 85.1 | 92.2 | 3.83 | 304 | 25.5 | 326 |
SS-PEG_{h}-Tripsina | |||||||
N = 7 | 44.8 | 102 | 110 | 3.25 | 258 | 18.8 | 241 |
N = 12 | 770 | 94.3 | 102 | 4.34 | 344 | 24.7 | 316 |
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Para SX-PEG_{h}-Tripsina, N = 15 x (% de Modif)/100 y se redondea al número entero más cercano.\end{minipage} | |||||||
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm}El porcentaje de grupos amino modificados como se determina por el ensayo de fluorecamina [Stocks, et al. (1996) Anal. Biochem. 154, 232].\end{minipage} | |||||||
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm}El ensayo de tripsina de BAEE (etil éster de N^{\alpha}\text{-}benzoil\text{-}L\text{-}arginina) se realizó en un pH 7.8, 37^{o}C con una concentración de sustrato 0.5 mM. El coeficiente de extinción fue \varepsilon_{283} = 808 M^{-1} cm^{-1} [Kezdy, et al. (1965) Biochemistry 4, 99].\end{minipage} | |||||||
^{d} \begin{minipage}[t]{155mm}Los ensayos amidoilticos de BAPA (N^{\alpha}\text{-}benzoil\text{-}D, L-arginina-p-nitroanilida) y ZAPA (N^{\alpha}\text{-}CBZ\text{-}L\text{-} arginina\text{-}p\text{-}nitroanilida) fueron realizados con una concentración de sustrato de 1 mM en 50 mM de Tris-HCl pH 8.1, 10 mM de CaCl_{2}, y 37^{o}C. El coeficiente de extinción para p-nitroanilina, \varepsilon_{410} = 8800 M^{-1}cm^{-1}, fue utilizado en ambos ensayos.\end{minipage} | |||||||
Constantes de michaelis-menten para la actividad amidolítica de tripsina nativa y sus derivados^{a} de mPEG | ||||
Derivados de Tripsina | Km | V_{max} | K_{cat} | K^{cat}/K^{m} |
(mM) | (\muM/min) | (min^{-1}) | (mM-1 min^{-1}) | |
Tripsina nativa | 1.08 | 15.7 | 378 | 349 |
SC-PEG_{h}-Tripsina | ||||
N = 7 | 0.29 | 19.6 | 470 | 1626 |
N = 9 | 0.21 | 20.2 | 484 | 2290 |
N = 12 | 0.11 | 22.9 | 549 | 4973 |
SS-PEGh -Tripsina | ||||
N = 7 | 0.21 | 18.6 | 447 | 2172 |
N = 12 | 0.13 | 22.5 | 539 | 4159 |
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm}Las mediciones se produjeron a 37^{o}C con una concentración constante de proteína tripsina de 1.0 \mug/ml (por medio del ensayo Bluret). N^{\alpha}\text{-}carbobenzoxi\text{-}L\text{-}arginina\text{-}p\text{-}nitroanilida (AZPA) fue usada como un sustrato en concentraciones que varían entre 0.02 y 1.71 mM en 50 mM de Tris-HCl pH 7.8, 10 mM de cloruro de calcio.\end{minipage} | ||||
\hskip0,1cm \begin{minipage}[t]{150mm}Las constantes fueron calculadas a partir de diagramas de Lineweaver Burk de los valores iniciales de la apariencia de p-nitroanilina (\varepsilon_{410} = 8800 M^{-1} cm^{-1}).\end{minipage} | ||||
Efecto de N\alpha-Ac-L-Tir (NAT) hasta la reacción de SS-PEG y SC-PEG con N\alpha-Ac-L-Lis (NAL) | ||
% de NAL Reaccionado con^{a} | ||
NAT/NAL | SS-PEG | SC-PEG |
0 | 78.55 (100)^{b} | 53.75 (100) |
1.0 | 77.15 (98.2) | 55.25 (103) |
2.5 | 74.50 (94.8) | 52.55 (97.8) |
5.0 | 68.50 (87.2) | 48.60 (90.4) |
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Se añadió a un tampón de borato de trietanolamina (0.3 m, pH 8.1) lo siguiente: una solución de NAL (50 mM, 0.1 ml) y una solución de NAT (100 mM, volumen correspondiente a las proporciones dadas en la tabla y llevando el volumen combinado a 1.1 ml) ambos en el mismo tampón, y finalmente el PEG apropiado activado en CH_{3}CN (50 mM de acilo activo, 0.1 ml). La solución resultante fue removida e incubada a 28^{o}C durante 1 hr. Una mezcla de los mismos componentes pero quitando el SX-PEG fue usada como control. La versión del ensayo de TNBS de Snyder, et al. [(1975) Anal. Biochem. 64, 284] fue usada para determinar el NAL no reaccionado.\end{minipage} | ||
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm}Los números dados en los paréntesis representan los valores de porcentaje de la reacción de NAL dividido por el porcentaje de la reacción de NAL cuando NAT/NAL = 0.\end{minipage} |
Claims (10)
1. Un proceso para formar un polipéptido
modificado que comprende un polipéptido y óxido de polialquileno
que comprende el hecho de poner en contacto a un óxido de
polialquileno que tiene un grupo terminal
oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida
con un pH en la gama de 5.8-11, en el que dicho
óxido de polialquileno está enlazado de manera covalente a un grupo
amina del polipéptido por un enlace de uretano, y donde el óxido de
polialquileno con un grupo terminal
oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida
tiene la fórmula
R_{1}
(O-R_{2})_{a} -(O-R_{3})_{b}
-(O-R_{4})_{c}
-O-(CO)-O-R_{5}
donde R_{1} es H, H_{3}C o un
grupo de
N-dicarboximida;
donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} es un
grupo alquilo que puede ser recto, ramificado, disustituido, o
insustituido, y donde cada R_{2}, R_{3}, y R_{4} puede ser
independientemente el mismo, o diferente de los otros R_{2},
R_{3}, y R_{4};
donde R_{5} es un grupo de
N-dicarboximida; y
donde a es un número entero entre 1 y 1000 y b y
c es cada uno un número entero entre 0 y 1000, y la suma de a, b, y
c da entre 10 y 1000.
2. El proceso según la reivindicación 1, donde
dicho grupo terminal
oxicarbonoil-oxi-N-dicarboximida
es carbonato de succinimida.
3. El proceso según la reivindicación 2, donde
dicho óxido de polialquileno es polietilenglicol.
4. El proceso según la reivindicación 3, donde
dicho polipéptido modificado es biológicamente activo.
5. El proceso según la reivindicación 2 que
comprende
a) tratar dicho óxido de polialquileno con
fosgeno para formar un cloroformato de óxido de polialquileno in
situ;
b) reaccionar dicho cloroformato de óxido de
polialquileno con una
N-hidroxi-N-dicarboximida
seguido de trietilamina para formar un óxido de polialquileno con
un grupo terminal
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida;
y
c) reaccionar dicho óxido de polialquileno con un
grupo terminal
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida
con dicho polipéptido con lo cual dicho polipéptido y dicho óxido de
polialquileno se acoplan de manera covalente por dicho enlace de
uretano.
6. El proceso según la reivindicación 5, donde un
óxido de polialquileno se fija de manera covalente a dicho
polipéptido.
7. El proceso según la reivindicación 6, donde
dicho óxido de polialquileno es polietilenglicol.
8. El proceso según la reivindicación 7, donde el
peso molecular del óxido de polialquileno está entre 500 y 40,000
daltons.
9. El proceso según la reivindicación 8, donde el
peso molecular del óxido de polialquileno está entre 2,000 y 20,000
daltons.
10. El proceso según la reivindicación 9, donde
dicho polipéptido modificado es biológicamente activo.
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