ES2136595T5 - Carbonatos activos de oxidos de polialquileno para la modificacion de polipeptidos. - Google Patents
Carbonatos activos de oxidos de polialquileno para la modificacion de polipeptidos.Info
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Abstract
SE DESCRIBE EL CARBONATO POLI(ETILENO-GLICOL)-N-SUCINIMIDA Y SU PREPARACION. EL POLIETILENO GLICOL (PEC) SE CONVIERTE EN DERIVADOS DEL CARBONATO N-SUCCINIMIDA. ESTA FORMA DE POLIMERO REACCIONA CON LOS GRUPOS AMINO DE PROTEINAS EN BUFFERS ACUOSOS. LAS PROTEINAS MODIFICADAS TIENEN LAS PEG-CADENAS GRABADAS EN LA BASE DEL POLIPEPTIDO POR MEDIO DE ENLACES URETANO (CARBAMATE) ESTABLES, HIDROLISIS-RESISTENTES.
Description
Carbonatos activos de óxidos de polialquileno
para la modificación de polipéptodos.
La presente invención se refiere a una
modificación química de polipéptidos mediante el enlace covalente
de cadenas de óxido de polialquileno a una molécula de polipéptido
como se describe en la solicitud de patente US Nº. 4,179,337, de
Davis, et al. En "Enzymes as Drugs" de Abuchowski & Davis,
Holcenberg & Roberts, eds. pp. 367-383, Juan
Wiley & Sons, N.Y. (1981) se describe que tales preparaciones
de polipéptidos presentan una inmunogenicidad y una antigenicidad
reducidas y que además tienen una vida más larga en la corriente
sanguínea en comparación con los polipéptidos padres. Estas
propiedades beneficiosas de los polipéptidos modificados hacen que
éstos resulten muy útiles en diversas aplicaciones terapéuticas,
como la terapia enzimática.
Los grupos activos que se introducen en óxidos de
polialquileno con el objetivo de enlazar posteriormente estos
polímeros a proteínas debe cumplir los siguientes requisitos:
- 1.
- Los grupos activos tienen que ser lo suficientemente reactivos como para proveer una reacción rápida con una proteína bajo condiciones normales;
- 2.
- Los residuos liberados de los grupos activos durante el proceso de modificación no tienen que ser tóxicos y/o tienen que poderse separar rápidamente del aducto de proteína-polímero.
Para realizar el enlace covalente de
polietilenoglicol (PEG) a una proteína, los grupos hidróxilos
finales del polímero deben ser convertidos en primer lugar en
grupos reactivos funcionales. Este proceso se denomina con
frecuencia "activación" y el producto se denomina "PEG
activado". En la mayoría de los casos se emplean derivados de
metoxipolietilenoglicol (mPEG), cubiertos en un extremo con un
grupo funcional y que reaccionan con, aminas en una molécula de
proteína.
La forma más común que se emplea del PEG activado
para la preparación de enzimas terapéuticas es el éster de
poli(etilenoglicol)succinoil-N-hidroxisuccinimida
(SS-PEG) [Abuchowski, et al. Cancer Biochem.
Biophys. 7, 175-186 (1984), Esquema 1] El empleo de
este polímero activado cumple los dos requisitos mencionados
anteriormente. Sin embargo presenta un inconveniente mayor. El
enlace del éster entre el polímero y el residuo del ácido succínico
presenta una estabilidad limitada en medios acuosos [Patente US Nº.
4,670,417, Iwasaki, et al. (1987); Ulbrich, et al. Makromol. Chem.
187, 1131-1144 (1986)].
\newpage
Varios polietilenoglicoles que se han hecho
funcionales (PEG) han sido empleados de forma efectiva en campos
como la modificación de proteínas (Abuchowski & Davis, 1981,
supra), en la química de péptidos [Zalipsky, et al., Int. J
Peptide Protein Res.,30 740-783 (1987)] y en
la preparación de conjugados con materiales biológicamente activos
[Zalipsky, et al., Eur. Polym. J 19,
1177-1183 (1983) y Zalipsky y Barany, Polymer
Preprints, Am Chem Soc. Div Polym. Chem.27(1),1 -2
(1986)] Los conjugados de proteína con PEG útiles en aplicaciones
medicas han demostrado que garantizan, particularmente en lo que
respecta a su estabilidad para la digestión proteolítica, una
respuesta inmunológica reducida y tiempos de vida media más
prolongados en la corriente sanguínea.
Para conseguir esto, la técnica precedente ha
activado el grupo hidroxi de PEG con cloruro cianúrico y a
continuación ha enlazado el compuesto resultante con proteínas
(Abuchowski, et al. (1977) J. Biol Chem. 252, 3578; Abuchowski y
Davis, 1981, supra). Sin embargo existen diversas desventajas
en el empleo de este método, como la toxicidad del cloruro
cianúrico y la reactividad no específica para aquellas proteínas
que tienen grupos funcionales que no son aminos, como residuos de
cisteínas o tirosinas esenciales libres.
Para poder superar estas y otras desventajas, se
han introducido procedimientos alternativos, como derivados de
succinimidilo succinato de PEG (SS-PEG)
(Abuchowski, et al. 1984, supra, ver Esquema 1, arriba). Éste
reacciona rápidamente con proteínas (30 minutos) bajo condiciones
normales haciendo activos incluso los conjugados extensamente
modificados, pero su uso presenta otra desventaja mayor. El enlace
del éster entre el polímero y el residuo del ácido succínico
presenta una estabilidad limitada en medios acuosos [U.S. Patente
Nº. 4,670,417 a Iwasaki, et al. y Ulbrich, et al. Makromol Chem.,
187,1131-1144 (1986)].
La formación de enlaces de uretano entre grupos
aminos de una proteína y PEG supera el problema de la pérdida
hidrolítica de las cadenas de polímeros [Veronese, et al., Appl.
Biochem. Biotechnol. 11, 141-152 (1985)]. De
hecho, se ha demostrado sobre derivados de PEG marcados de forma
radioactiva que los enlaces de uretano son completamente estables
bajo diversas condiciones fisiológicas [Larwood & Szoka J.,
Labeled Compounds Radiofarm.,21,603-614 (1984)]. El
enlace de PEG a una proteína por medio de un derivado de carbamato
fue realizado [Beauchamp, et al. Analyt. Biocem. 131,
25-33 (1983)] empleando PEG activado con
carbonildiimidazol. Sin embargo, el polímero activado de esta manera
no es muy reactivo y en consecuencia se necesitan largos periodos
de tiempo de reacción (48 - 72 hrs a pH 8.5) para conseguir
suficientes modificaciones. En consecuencia, resulta evidente que
el agente activado por carbonildiimidazol no cumple el primer
requisito apuntado anteriormente. Una desventaja adicional de este
enfoque se encuentra en el coste relativamente elevado del
carbonildiimidazol.
Se ha descrito el empleo de derivados de
fenilcarbonato de PEG para la preparación de proteínas de PEG
enlazadas a uretano [ver Veronese, et al. (1985), supra]. El
inconveniente principal de este enfoque reside en la toxicidad de
los residuos de fenol hidrófobos (p-nitrofenol o 2,
4, 5-triclorofenol) y su afinidad con las
proteínas. Es evidente que este método no cumple el segundo
requisito mencionado anteriormente.
La Patente U.S. Nº. 4,248,786 muestra compuestos
del éster de hidroxisuccinimida y su empleo para enlazar proteínas
activas biológicamente a materiales matrices de soportes líquidos o
sólidos.
La Patente U. S. Nº. 4,891,430 muestra entre
otras cosas un proceso para preparar carbonatos
alfa-halogenados donde un terminal del carbonato es
un radical N-succinimidilo,
N-ftalimidilo o
1-benzotriazolilo.
La Solicitud de Patente Europea
EP-A-0149520 muestra conjugados de
lipasas y polialquilenoglicol. Los conjugados pueden formarse
empleando uno de los diversos polímeros activados. Los grupos de
succinimidilo carbonato y grupos relacionados con
oxicarbonil-N-dicarboximida no han
sido descritos.
En los Resúmenes de Patentes de Japón 13, Nº. 145
(C-583) [3493] se expone un método para inmovilizar
las substancias derivadas de un cuerpo vivo. El método incluye la
reacción de grupos aminos primarios de la sustancia derivada del
cuerpo vivo con grupos funcionales introducidos en un polímero
hidrófilo polifuncional, que se ha enlazado previamente a un
soporte como una aminoetilcelulosa.
Cada una de las formas activadas del polímero
tiene propiedades que se pueden considerar ventajosas o
desventajosas, dependiendo del sistema de uso. A la luz de la
multitud de aplicaciones de los polipéptidos de PEG, es deseable
ampliar el arsenal de proteínas que modifican los reactivos de PEG
y que se han realizado con una finalidad de uso específica.
La presente invención provee un óxido de
polialquileno que tiene la estructura
R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}-(O--R_{4})_{c}--O--
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}--O--R_{5}
\newpage
donde R_{1} es H, CH_{3} o un grupo de
carboniloxi-N-dicarboximida;
R_{2}, R_{3}, y R_{4} son independientemente seleccionados
del grupo consistente en -CH_{2}CH_{2}- ,
-CH_{2}CH(CH_{3})- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-;
R_{5} es un grupo N-dicarboximida;
a es un número entero entre 1 y 1,000; b y c son
cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y la suma de a, b, y c
se encuentra entre 10 y 1,000.
La presente invención también provee un proceso
para preparar el compuesto que comprende la reacción de un
compuesto que tiene la estructura
R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O--R_{4})_{c}--O--
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}--X
donde R_{1} es H, CH_{3} o un grupo de
carboniloxi-N-dicarboximida;
R_{2}, R_{3}, y R_{4} son
independientemente seleccionados del grupo consistente en
-CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2} CH(CH_{3})- y -
CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-; X es un halógeno;
a es un número entero entre 1 y 1,000; b y c son
cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y la suma de a, b, y c
se encuentra entre 10 y 1,000;
con una N-hidroxidicarboximida en
presencia de una base.
Figura 1. Liberación de mPEG de los conjugados de
PEG-BSA. Se incubaron soluciones de ambos tipos de
conjugados de PEG-BSA (-61% de modificación) en una
concentración de 4 mg/ml (por análisis de Bluret) en el tampón
apropiado. A determinados intervalos de tiempo se inyectaron partes
alícuotas de estas soluciones en una CLAR equipada con una columna
Zorbax GF450 y con un detector de RI para cuantificar
mPEG-5000.
Figura 2. Estabilidad de SS-PEG y
SC-PEG a 22ºC. Condiciones experimentales:
Los PEG activados fueron almacenados en forma de polvo fino en
recipientes de polipropileno bien cerrados. A determinados
intervalos de tiempo se analizaron muestras de cada uno de los
polímeros para determinar el contenido de acilo activo.
Figura 3. Reactividad de PEG activado como
función de pH. Condiciones experimentales: A un tampón de
trietanolamina-borato (0,3 M, 1 ml) con el pH
apropiado, se le añadió una solución controlada de NAL en agua (50
mM, 0,1 ml) seguido de una solución controlada del PEG activado
apropiado en CH_{3}CN (50 mM de acilo activo, 0,1 ml). La solución
resultante fue removida e incubada a 28ºC durante 1 h. Se empleó una
mezcla de los mismos componentes pero dejando fuera
SX-PEG como control. Se empleó la versión del
análisis TNBS de Snyder, et al. [(1975) Anal. Biochem. 64, 284]
para determinar el NAL que no reaccionó.
La presente invención describe óxidos de
polialquileno activados que presentan la estructura general:
R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O_R_{4})_{c}--O--
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}--O--R_{5}
donde R_{1} es H, CH_{3} o un grupo
carboniloxi-N-dicarboximida;
R_{2}, R_{3}, y R_{4} son independientemente seleccionados
de -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})- y -
CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-; R_{5} es un grupo
N-dicarboximida; a es un número entero entre 1 y
1000; b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1000; y la suma
de a, b, y c se encuentra entre 10 y
1000.
Más específicamente, la invención se refiere a la
preparación y uso de un PEG activado nuevo, es decir,
poli(etilenoglicol) de succinimidilo carbonato
(SC-PEG) y el derivado bifuncional de PEG, es decir,
poli(etilenoglicol)-bis-succinimidilo
carbonato (BSC-PEG). Además, resultan posibles
derivados heterobifuncionales de PEG (Zalipsky y Barany,
supra); uno de los grupos finales es succinimidilo carbonato
y el otro grupo final (R^{1}, ver Esquema 2, abajo) contiene un
grupo reactivo funcional diferente, como un grupo carboxilo libre o
una amina. Estos materiales reaccionan rápidamente con grupos
aminos de proteínas para proveer un enlace de PEG a través de
enlaces de uretano estables (Esquema 2, abajo). La reactividad de
los agentes nuevos, SC-PEG y
BSC-PEG, es comparable a la del
SS-PEG que se emplea habitualmente. Así, se puede
alcanzar un alto grado de modificación en condiciones normales
(tampones acuosos, pH 5.8-11, preferentemente pH
7.0-9.5) dentro de un margen de cerca de
30-60 minutos y temperaturas moderadas
(4-40ºC). Adicionalmente, los agentes son solubles
en diversos disolventes orgánicos, resultando útiles e importantes
de esta manera para el enlace de peso molecular bajo, péptidos
protegidos parcialmente y otros ligantes biológicamente útiles.
El PEG no tiene por que ser de un peso molecular
concreto, pero es preferible que el peso molecular se encuentre
entre 500 y 40,000; más preferentemente entre 2,000 y 20,000. La
elección del peso molecular de PEG se realiza en base a la
naturaleza de la proteína concreta que se ha empleado, por ejemplo,
el número de grupos aminos disponibles para la modificación.
La N-hidroxisuccinimida liberada
durante la modificación de la proteína es un material no tóxico que
se emplea a menudo en la química proteínica, especialmente para
preparar aductos de proteína biológicamente activos. Como en el
caso del PEG activado con carbonildiimidazol mencionado
anteriormente y fenilcarbonatos de PEG, el producto de la
modificación de la proteína con el empleo de SC-PEG
o BSC-PEG tiene cadenas de PEG injertadas sobre la
base del polipéptido a través de conexiones de carbamato (uretano).
Sin embargo, debido a la elevada reactividad de los agentes nuevos,
se puede alcanzar un alto grado de modificación en períodos de
tiempo más breves. Una ventaja adicional del PEG activado con
succinimida carbonato es que aquellos grupos funcionales activos que
no reaccionan con grupos aminos de una proteína sufren una
hidrólisis acuosa rápida produciendo
N-hidroxisuccinimida, dióxido de carbono y PEG con
terminación de hidroxi. Esto resulta particularmente importante en
el caso de derivados de PEG bifuncionales (BSC-PEG).
Estos materiales pueden servir para un doble objetivo: PEGilación y
reticulación al mismo tiempo. El BSC-PEG, como
cualquier material homobifuncional puede ser empleado para
reticular dos proteínas diferentes. Cuando una molécula de
BSC-PEG reacciona con una proteína por medio de sólo
un grupo de los extremos, el otro grupo SC del polímero, que no
reacciona con la amina, es hidrolizado y en consecuencia no se
introduce ningún residuo extraño (potencialmente antígeno) en el
conjugado de la proteína con PEG.
Las actividades biológicas de proteínas
modificadas con SC-PEG y BSC-PEG se
conservan en gran parte como se muestra a través de los ejemplos
que aparecen más adelante. Hay una publicación anterior en la que
la proteína (activador del plasminogen del tejido) conjugado con PEG
de manera covalente por medio de enlaces de uretano presenta una
actividad específica más alta que la misma proteína modificada con
SS-PEG en aproximadamente la misma extensión
[Berger & Pizzo, Blood, 71, 1641-1647
(1988)].
Naturalmente, la utilidad de derivados de PEG
activados con SC se extiende a la preparación de conjugados con PEG
de péptidos de peso molecular bajo y otros materiales conteniendo
grupos aminos libres.
Se desarrolló un procedimiento de cultivo único
para la introducción de grupos SC en PEG (Esquema 3 abajo).
Primero, se generó cloroformato de polietilenoglicol in situ
mediante el tratamiento del polímero (PEG) con fosgeno. El
cloroformato resultante fue hecho reaccionar a continuación con
N-hidroxisuccinimida (HOSu) seguido de trietilamina
(TEA) para dar los derivados activados de PEG deseados. Las
preparaciones activadas del polímero fueron purificadas para
eliminar los materiales de peso molecular bajó y determinadas de
modo que contuvieran las cantidades teóricas de los grupos
activos.
Preparación de SC-PEG: Se
disolvió metoxipolietilenoglicol con un peso molecular de 5000
(Unión Carbide,60 g,12 mmol) en tolueno/diclorometano (3:1, 200 ml)
y se trató con una solución de tolueno de fosgeno (30 ml, 57mmol)
durante la noche. La solución fue evaporada hasta que se secó y el
resto del fosgeno fue extraído al vacío. Se disolvió el residuo en
tolueno/declorometano (2:1, 150 ml) y se trató con N-
hidroxisuccinimida sólida (2,1 g, 18 mmol) seguido de trietilamina
(1,7 ml, 12 mmol). Después de 3 horas, la solución fue filtrada y
evaporada hasta que se secó. Se disolvió el residuo en etilacetato
(600 ml) caliente (50ºC), se filtró para eliminar los restos
insolubles y se enfrió para facilitar la precipitación del
polímero. Se recogió el producto por filtración y a continuación se
volvió a recristalizar a partir de etilacetato. El producto se secó
al vacío sobre P_{2}O_{5}. El rendimiento fue de 52,5 g (85%
de teoría).
Para determinar el contenido de carbonato activo
del producto, se reaccionaron muestras del polímero con una
cantidad medida de bencilamina en diclorometano y el exceso de
amina fue valorado con ácido perclórico en dioxano. Estas
valoraciones indicaban que 1 g del producto contenía 1,97 x
10^{-4} mol de carbonato activo (101% del contenido teórico).
I.R. (película sobre NaCl, cm^{-1}) bandas características en:
1812 y 1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114
(CH_{2}OCH_{2}) ^{13}C-NMR (CDCl_{3}):
\delta 168,5 (CH_{2}C=O); 151,3 (O-CO_{2});
71,9 (CH_{3}OCH_{2}) 70,2 (PEG); 68,7
(CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68,0 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 58,9
(CH_{3}O); 25,2 CH_{2}C=O) ppm.
Preparación de BSC-PEG: Se
convirtió polietilenoglicol de peso molecular 4600 (Carburo de
unión, 50g, 21,7 mequiv. OH) en el correspondiente
bis-N-hidroxisuccinimida carbonato
empleando una solución de tolueno de fosgeno (50 ml, 96,5 mmol) y a
continuación N- hidroxisuccinimida (3,8 g, 23 mmol) y trietilamina
(3,2 ml, 23 mmol) siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
1. Tras purificar el producto se obtuvo como un polvo blanco (51 g,
96%). El contenido de carbonato activo fue de 4,0 x
10-4 mollg (98% de teórico) determinado por
valoraciones con ácido perclórico de bencilamina. I.R. (película
sobre NaCl, cm-1) bandas características en: 1812 y
1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114
(CH_{2}OCH_{2}) ^{13}C-NMR (CDCl_{3}):
\delta 168,5 (CH_{2}C=O); 151,3
(O-CO_{2}); 70,2 (PEG); 68,7
CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68,0
(CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 25,2 (CH_{2}C=0) ppm.
H-NMR (CDCl_{3}): \delta 4,35 (m, 4H,
CH_{2}OCO_{2}); 3,55 (s, \sim400H, PEG); 2,74 (s, 8H,
CH_{2}C=O) ppm.
Preparación de conjugados de albúmina de suero
bovino de polietilenoglicol (PEG-BSA):
A. SC-PEG (1 9) fue añadido a una
solución agitada de albúmina de suero bovino (BSA) (100 mg) en 0,1
M fosfato de sodio, pH 7.8 (20 ml). Se empleó hidróxido sódico (0,5
N) para mantener el pH 7.8 durante 30 minutos. Se extrajo el exceso
de PEG libre por diafiltración empleando 50 mM de salina tamponada
de fosfato. La extensión de modificaciones de BSA fue
aproximadamente del 50%, determinada por valoración con
trinitrobencenesulfonato (TNBS) de grupos aminos [Habeeb, Analyt.
Biochem. 14, 328-336 (1966)].
Se obtuvo el mismo grado de modificación cuando
se repitió el experimento bajo condiciones idénticas empleando
SS-PEG en lugar de SC-PEG.
B. SC-PEG(1g) fue añadido
a una solución agitada de BSA (100mg) en 0,1 M de sodioborato, pH
9.2. Se empleó sodiomidroxida (0,5 N) para mantener el pH 9.2
durante 30 minutos. Se extrajo el exceso de PEG libre por
diafiltración y se evaluó el producto para determinar el número de
grupos aminos libres. Aproximadamente 68% (41) de los grupos aminos
del BSA nativo fueron modificados.
C. BSC-PEG (1 g) fue añadido a
una solución agitada de BSA (100 mg) en 0,1 M de borato de sodio,
pH 9.2. Se empleó hidróxido sódico (0,5 N) para mantener el pH 9.2
durante 30 minutos. Se extrajo el exceso de PEG libre por
diafiltración y se avaluó el producto para determinar el número de
grupos aminos libres. Aproximadamente el 80% (48) de los grupos
aminos del BSA nativo fueron modificados. El análisis del producto
por CLAR (Filtración de gel) indicaba que más del 65% de
PEG-BSA se encontraba en forma reticulada
intermolecularmente y cerca del 35% del producto tenía el mismo
peso molecular que el PEG-BSA del Ejemplo 3B.
Preparación de PEG-glutaminasa:
Una solución de Pseudomonas de glutaminasa 7A (200 mg) en
0,1 M de fosfato de sodio, pH 7.8 fue tratada con
SC-PEG (4.7) g). Se agitó la solución y se mantuvo
el pH 7.8 durante 30 minutos. Se extrajo el exceso de PEG libre por
diafiltración empleando 50 mM de PBS.
Preparación de PEG-Tripsina: Una
solución de tripsina pancreática bovina
(Boeringer-Manneim, 120 mg en 20 ml), que fue
dializada durante la noche a 40ºC con 20 mM de CaCl_{2} en 1 mM
de HCl, se dejó a 25ºC y se trató con SC-PEG (600
mg) durante 30 minutos. Durante este tiempo se mantuvo el pH 7.8 en
el recipiente de reacción por valoración automática con 0,5 N de
NaOH. La solución fue acidificada a pH 3 y extensamente diafiltrada
para eliminar el exceso de polímero libre empleando 20 mM de
CaCl_{2} en 1 mM de HCl como un fluido de sustitución. La
tripsina modificada presentaba aproximadamente la mitad de los
grupos aminos libres de la enzima madre (7 Cadenas de pEG por
molécula de tripsina) determinado por valoración con TNBS de los
grupos aminos (Habeeb 1966). El producto de tripsina PEG mantenía
un 96% de actividad enzimática de la enzima madre hacia etiléster
de
Na-benzoil-L-arginina.
Preparación de PEG-Arginasa: Una
solución de arginasa de hígado bovino (Sigma, 90 mg) en 0,1 M de
NaCl (20 ml) fue tratada con SC-PEG (1,3 g) a 27ºC
mientras que se mantuvo el pH 8.0 por valoración automática con 0,5
N de NaOH. Después de 30 minutos se diafiltró la mezcla de reacción
empleando 50 mM de PBS como un fluido de sustitución.
Aproximadamente un 64% de los grupos aminos de la arginasa nativa
fueron modificados (56 Cadenas de pEG por molécula de arginasa). El
producto de PEG-arginasa retuvo el 70% de actividad
específica de la enzima nativa al evaluarse con
2,3-butanodiona (Reactivo BUN-urea)
a pH 9.5.
Otros polipéptidos, entre los que se encuentra la
quimiotripsina, asparaginasa, y deaminasa de adenosina, fueron
modificados con SC-PEG empleando los procedimientos
que se muestran aquí.
Los métodos de empleo de óxidos de polialquileno
que se han hecho funcionales SC y/o BSC, como PEG y sus copolímeros
se pueden aplicar generalmente para la preparación de otros
polipéptidos modificados y otros componentes biológicamente activos
que tengan grupos aminos.
Aunque la presente invención ha sido descrita con
referencia a derivados de N-hidroxisuccinimida,
resultará obvio para los expertos en la técnica que se pueden
sustituir otras N-hidroxidicarboximidas. Derivados
típicos de este tipo son N-hidroxiftalimida,
N-hidroxiglutarimida, N- hidroxitetrahidroftalimida,
N-hidroxi-5-nor-borneno-2,3-dicarboximida
u otros derivados disubstituídos de hidroxilamina.
A. Como se ha visto en el Esquema 2, el producto
de la modificación con proteína empleando SC-PEG
tiene cadenas PEG injertadas sobre la base de polipéptido a través
de enlaces de carbamato (uretano). Se esperaba que una mayor
estabilidad del enlace de uretano con relación al enlace del éster
producido empleando SS-PEG (ver Esquema 1)
demostrara una diferencia clave entre los dos PEG activados y el
correspondiente conjugado de proteína PEG. Nuestros estudios de
hecho confirmaron esta esperanza. La figura 1 muestra los
resultados de las medidas GF-PLC de las cantidades
de mPEG libre producido como consecuencia de la incubación de
conjugados de PEG-BSA derivados de cada uno de los
PEG activados. Se aprecia considerablemente una mayor estabilidad
del conjugado SC-PEG.
B. Para estimar las reacciones de
SC-PEG y SS-PEG, se llevaron a cabo
mediciones cinéticas de hidrólisis de los polímeros activados en
tampón de fosfato y su aminolisis por
N^{\alpha}-acetil-lisina (NAL).
Los resultados de estos experimentos se encuentran resumidos en la
Tabla 1. A partir de estos datos resulta claro que
SS-PEG es un reactivo más reactivo que
SC-PEG. La diferencia en los índices de hidrólisis
fue mayor que la diferencia en los índices de aminolisis;
consecuentemente, SC-PEG mostró ratios de
K_{am}/K_{h} más favorables. La hidrólisis más lenta de
SC-PEG también se manifestó en una estabilidad de
almacenamiento superior del reactivo (Figura 2).
C. La reactividad de los PEG activados como
función de pH se determinó empleando NAL como un modelo para el
grupo \epsilon-amino de una proteína. Cada uno de
los PEG activados fue hecho reaccionar con una cantidad equimolar
de NAL con diferentes pH, y se midió el NAL que no reaccionó
empleando la valoración TNBS (Figura 3). El pH óptimo para el
empleo de SC-PEG se encontró que estaba cerca de
9.3. No resulta aconsejable el empleo de SS-PEG a
pH>8.0, debido a la estabilidad limitada del éster de
PEG-succinato. Sin embargo se descubrió que incluso
a valores de pH menores de 8.0 este PEG activado era muy
reactivo.
D. Ambos reactivos mostraron una reactividad
elevada frente a la Tripsina que se hace comparable a la que
producen los derivados de enzimas modificadas en condiciones
normales (pH 7.5 - 8.5) en 30 minutos. Los productos fueron
purificados por diafiltración, y los grados de modificaciones
determinados por evaluación fluorométrica, según Stocks, et al.
(1986) Anal. Biochem. 154, 232.
Todos derivados de tripsina modificados con PEG
carecían esencialmente (<1% de nativo) de actividad proteolítica
determinada por la prueba de Azocoll [Chavira, et al. (1984) Anal.
Biocem.136, 446]. Las actividades específicas de las tripsinas
modificadas con SS- y SC-PEG representativas hacia
substratos de peso molecular bajo se encuentran resumidas en la
Tabla 2. Los modificaciones apenas produjeron cambios en las
actividades esterolíticas hacia el etiléster de
benzoil-L-arginina, pero si que
mejoró las actividades hacia las p-nitroanilidas.
Las constantes cinéticas de Micaelis-Menten para
diferentes tripsinas modificadas con SC- y SS-PEG
fueron medidas empleando ZAPA como substrato. Estos resultados, que
se encuentran resumidos en la Tabla 3, indican que, mientras que
V_{max}, K_{cat}, y K_{cat} /K_{m} iban aumentando
gradualmente a medida que iban decreciendo los valores de las
modificaciones K_{m}.
En comparación con SS-PEG,
SC-PEG es un reactivo aún menos reactivo y más
selectivo. Esto se observa por sus ratios K_{am}/K_{h} más
altos y un SC-PEG de mejor estabilidad de
almacenamiento es un reactivo suficientemente reactivo como para
producir conjugados de proteína PEG bajo condiciones normales en 30
minutos. Se puede emplear SC-PEG en un margen más
amplio de pH que SS-PEG, mostrando la máxima
reactividad a pH=9.3. Lo conjugados de proteína con PEG obtenidos
por el empleo de SC-PEG son químicamente más
estables que los conjugados derivados de SS-PEG.
Los conjugados de Tripsina con PEG producidos por ambos PEGs
activados presentan una propiedades muy similares: No muestran
actividad proteolítica, muestran una actividad esterolítica bien
preservada y una actividad aumentada espectacularmente hacia
substratos de p-nitroanilida. Las constantes de
Micaelis-Menten de las enzimas modificadas indican
que el enlace de PEG a la tripsina produce un aumento tanto en el
índice de renovación de ZAPA como en su afinidad hacia las enzimas
modificadas.
Temp. | Hidrólisis: K_{h} ^{b}(min^{-1}) x 10^{3} | Aminolisis: K_{am} ^{c}(min^{-1}) x 10^{3} | |||||||
pH | (ºC) | y | [t 1/2 (min)] | y [K_{am}/K_{h}] | |||||
SC-PEG | SS-PEG | SC-PEG | SS-PEG | ||||||
4 | 0.87 | [793] | 1.84 | [376] | 2.64 | [3.0] | 3.74 | [2.0] | |
7.0 | 27 | 6.05 | [115] | 10.4 | [67] | 26.4 | [4.4] | 41.4 | [4.0] |
37 | 14.2 | [49] | 25.9 | [27] | 81.7 | [5.8] | 104 | [4.0] |
Temp. | Hidrólisis: K_{h} ^{b}(min^{-1}) x 10^{3} | Aminolisis: K_{am} ^{c}(min^{-1}) x 10^{3} | |||||||
pH | (ºC) | y | [t 1/2 (min)] | y [K_{am}/K_{h}] | |||||
SC-PEG | SS-PEG | SC-PEG | SS-PEG | ||||||
22 | 5.37 | [129] | 10.7 | [65] | 29.1 | [5.4] | 42.7 | [4.0] | |
7.4 | 27 | 9.0 | [77] | 16.0 | [43] | 48.6 | [5.4] | 73.6 | [4.6] |
37 | 19.3 | [36] | 37.6 | [18] | 145 | [7.5] | 193 | [5.1] | |
4 | 1.37 | [505] | 2.58 | [268] | 12.4 | [9.1] | 15.0 | [5.8] | |
7.8 | 27 | 10.3 | [67] | 21.6 | [32] | 130 | [12.6] | 152 | [7.0] |
37 | 21. | [32] | 48.8 | [14] | 226 | [10.6] | 267 | [5.5] | |
Todas las mediciones se realizaron siguiendo la apariencia del anión de la N-hidroxisuccinimida -Osu) a 260 nm | |||||||||
( en 0.008 M de fosfato sódico; la concentración del acilo activo de succinimidilo enlazado con PEG en tiempo | |||||||||
cero [SX-PEG] fue 0.1 mM; en los experimentos de aminólisis la concentración de Na etil-lisina en tiempo cero | |||||||||
[NAL]_{\alpha} fue 3 mM. |
^{b}K_{h} =
Índice_{h}/[SX-PEG]_{0}, donde
Índice_{h} = dA_{260}/dt x 1 E_{260} x 1F; \sum_{260} =
8500 M^{-1} cm^{-1} es un coeficiente de extinción de -Osu; y F
= [-Osu] / ([HOsu] + [ Osu)] = (1 + 10^{6\cdot0-
pH})^{-1}.
^{c}K_{am} = Índice Total /
[SX-PEG]_{0} - K_{h}. El indice Total en
experimentos de aminólisis fue calculado de la misma manera que el
Índice_{h} en los experimentos de hidrólisis.
Derivados^{a} de | Modif^{b} | BAEE^{c} | % | BAPA^{d} | % | ZAPA^{d} | % |
Tripsina | (%) | (u/mg) | Nativo | (u/mg) | Nativo | (u/mg) | Nativo |
Tripsina Nativa | 0 | 92.4 | 100 | 1.26 | 100 | 7.81 | 100 |
SC-PEG_{N}-Tripsina | |||||||
N = 6 | 42.3 | 103 | 112 | 2.26 | 179 | 15.3 | 196 |
N = 7 | 45.8 | 87.9 | 95.1 | 2.38 | 188 | 17.5 | 224 |
N = 9 | 58.8 | 90.1 | 97.5 | 2.67 | 212 | 18.9 | 242 |
N = 12 | 77.9 | 85.1 | 92.2 | 3.83 | 304 | 25.5 | 326 |
SS-PEG_{N}-Tripsina | |||||||
N = 7 | 44.8 | 102 | 110 | 3.25 | 258 | 18.8 | 241 |
N = 12 | 770 | 94.3 | 102 | 4.34 | 344 | 24.7 | 316 |
^{a} Para SX-PEG_{h}-Tipsina, N = 15 x (% Modif)/100 y es redondeado al entero más próximo. | |||||||
^{b} El porcentaje de grupos aminos modificados fue determinado por el análisis de fluorescamina [Stocks, et al. | |||||||
(1986) Anal. Biochem. 154, 232]. | |||||||
^{c} El análisis de BAEE (éster etílico de Na-benzoil-L-arginina) fue realizado a pH 7.8, 37º con una concentración | |||||||
del substrato de 0.5 mM. El coeficiente de extinción fue \varepsilon_{253} = 808 M^{-1} cm^{-1} [Kezdy, et al. (1965) Biochemistry | |||||||
4,99]. | |||||||
^{d} Los análisis amidolíticos the BAPA (N\alpha-benzoil-D, L- arginina-p-nitroanilida) y ZAPA (N\alpha-CBZ-L-arginina- | |||||||
p-nitroanilida) fueron realizados con una concentración del substrato de 1 mM en 50 mM Tris-HCl pH 8.1, 10 | |||||||
mM CaCl_{2}, a 37ºC. El coeficiente de extinción para la p- nitroanilina, \varepsilon_{410} = 8800 M^{-1} cm^{-1}, fue usado en ambos | |||||||
análisis. |
Constantes Michaelis-Menten para actividad aminolitica de | ||||
tripsina nativa y sus derivados^{a} de mPEG | ||||
Derivados de | ||||
Tripsina | Km (mM) | V_{max} (\muM/min) | K_{cat} (min^{-1}) | K_{cat}/K_{m} (mM^{-1} min^{-1}) |
Tripsina nativa | 1.08 | 15.7 | 378 | 349 |
SC-PEG_{N-} | ||||
Tripsina | ||||
N = 7 | 0.29 | 19.6 | 470 | 1626 |
N = 9 | 0.21 | 20.2 | 484 | 2290 |
N = 12 | 0.11 | 22.9 | 549 | 4973 |
SSS-PEG_{N-} | ||||
Tripsina | ||||
N=7 | 0.21 | 18.6 | 447 | 2172 |
N = 12 | 0.13 | 22.5 | 539 | 4159 |
^{a} Las mediciones fueron realizadas a 37ºC con una concentración de proteína de Tripsina constante de | ||||
1,0 gg/ml (mediante el ensayo de Bluret). Se empleó N^{\alpha}- carbobenzoxi-L-arginina-p-nitroanilida (ZAP) | ||||
como substrato en concentraciones que variaban de 0,02 a 1,71 mM en 50 mM de tris-HCl pH 7.8 mM | ||||
de cloruro de calcio. Las constantes fueron calculadas a partir de lotes de Lineweaver-Burk de los índi- | ||||
ces iniciales de aparición de p-nitroanilina (\varepsilon_{410} =8800 M^{-1} cm^{-1}). |
Claims (9)
1. Óxido de polialquileno que presenta la
estructura:
R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O--R_{4})_{c}
O--CO--
O--R_{5}
donde
- -
- R_{1} es H, CH_{3} o un grupo carboniloxi-N-dicarboximida;
- -
- R_{2}, R_{3} y R_{4} son independientemente seleccionados del grupo consistente en -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-;
- -
- R_{5} es un grupo N-dicarboximida;
- -
- a es un número entero entre 10 y 1,000;
- -
- b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y
- -
- la suma de a, b y c se encuentra entre 10 y 1,000.
2. Óxido de polialquileno según la reivindicación
1, donde R_{1} es un grupo
carboniloxi-N-dicarboximida y
R_{5} es un grupo N-dicarboximida y las N-
dicarboximidas de R_{1} y R_{5} son seleccionadas del grupo
consistente en N-succinimida,
N-ftalimida, N-glutarimida,
N-tetrahidroftalimida y
N-norborneno-2,3-dicarboximida.
3. Óxido de polialquileno según la reivindicación
2, donde R_{5} es un grupo N-succinimida.
4. Óxido de polialquileno según la reivindicación
1 que presenta la estructura:
donde R_{1} es
CH_{3}.
5. Óxido de polialquileno según la reivindicación
1 que presenta la estructura:
\newpage
6. Proceso para preparar un óxido de
polialquileno que presenta la estructura:
R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O--R_{4})_{c}
O--CO--
O--R_{5}
donde
- -
- R_{1} es H, CH_{3} o un grupo carboniloxi-N-dicarboximida;
- -
- R_{2}, R_{3} y R_{4} son independientemente seleccionados del grupo consistente en -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-;
- -
- R_{5} es un grupo N-dicarboximida;
- -
- a es un número entero entre 10 y 1,000;
- -
- b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y
- -
- la suma de a, b y c se encuentra entre 10 y 1,000.
incluyendo la reacción de un compuesto que
presenta la estructura:
R_{1}-(O-R_{2})_{a}-(O-R_{3})_{b}-(O-R_{4})_{c}
O-CO-X
donde
- -
- R_{1} es H, CH_{3} o un grupo carboniloxi-N-dicarboximida;
- -
- R_{2}, R_{3} y R_{4} son independientemente seleccionados del grupo consistente en
-CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})-
y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-;
- -
- X es un halógeno;
- -
- a es un número entero entre 10 y 1,000;
- -
- b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y
- -
- la suma de a, b y c se encuentra entre 10 y 1,000. con una N-hidroxidicarboximida en presencia de una base.
7. Proceso según la reivindicación 6, donde dicha
N-hidroxidicarboximida es
N-hidroxisuccinimida.
8. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 6-7, donde dicha base es
trietilamina.
9. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 6-8, donde R_{1} es un grupo
carboniloxi-N-dicarboximida.
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