DD261791A1 - Verfahren zur herstellung von carbonaten hydroxylgruppenhaltiger polymere - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carbonaten hydroxylgruppenhaltiger Polymerer. Erfindungsgemaess werden Chlorameisensaeureester oder symmetrische Kohlensaeurediester mit einer elektronenanziehenden Gruppe in Gegenwart von zur Bildung von reaktiven Acyliumsalzen befaehigten supernucleophilen Aminen und gegebenenfalls einem weiteren tertiaeren Amin in wasserfreien organischen Loesungsmitteln bei Temperaturen von 0-100C mit hydroxylgruppenhaltigen Polymeren umgesetzt. Anwendungsgebiete sind die Biotechnologie und medizinische Diagnostik und Therapie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carbonaten hydroxylgruppenhaltiger Polymere. Polymercarbonate reagieren mit nucleophilen Reaktionspartnern und werden zur Kopplung von Aminen, Aminosäuren, Peptiden, Proteinen und Nucleinsäuren genutzt. Diese Umsetzungsprodukte finden vielfältige Anwendung für Stofftrennungs- und Stoffwändlungsprozesse. Einsatzgebiete sind die chemische und biochemische Forschung, die chemische Technik und die Biotechnologie sowie die medizinische Anwendung für Diagnostik und Therapie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Herstellung von Polymercarbonaten unterschiedlicher Struktur ist prinzipiell bekannt. So sind zum Beispiel unsymmetrische Kohlensäurediester der allgemeinen Formel J-O-CO-O-R mehrfach beschrieben worden, wobei J- die Matrix des hydroxylgruppenhaltigen Polymers J-OH und R eine Gruppierung, die einem geeigneten Alkohol, Phenol oder substituierten Hydroxylaminen entstammt, darstellt. In den meisten Fällen ist R eine elektronenanziehende Gruppe, die die hohe Reaktivität der gebildeten unsymmetrischen Kohlensäurediester-Gruppierungen bewirkt (J. Drobnik et al., Biotechnol. Bioeng. 24 [1982] 487; M.Wiicheketal. Biochem. Internat. 4 [1982] 629; M.Wilcheketal. Appl. Biochem. Biotechno!. 11 [1985] 3,141; GB 2015553; EP 0134041).

Natürliche hydroxylgruppenhaltige Polymere wie Agarosen und Cellulosen, die unsymmetrische aktive Kohlensäurediester-Gruppen tragen, sind für die Herstellung von affinitätschromatographischen Trennmaterialien oder von immobilisierten Enzymen verwendet worden. Neben den natürlichen oder modifizierten Polysacchariden sind aber auch synthetische organische Polymere durch Bildung von unsymmetrischen Kohlensäurediester-Gruppen aktiviert und mit Erfolg für affinitätschromatografische Trenn- und Reinigungsverfahren eingesetzt worden (M.Wilcheketal. Appl. Biochem. Biotechn. 11 [1985] 445).

Die Reaktion der beschriebenen Chlorameisensäureester und symmetrischen Kohlensäurediester mit elektronenanziehenden Gruppen führt bei Durchführung der Umsetzung in wasserfreien organischen Lösungsmitteln auch bei langen Reaktionszeiten nur zur Bildung von unsymmetrischen Kohlensäurediestern der Struktur J-O-CO-OR. Supernucleophile Amine wie z. b. 4-Dimethylaminopyridin beschleunigen die Reaktion sehr stark. Typische Reaktionsbedingungen in Gegenwart von sehr geringen Mengen supernucleophiler Amine sind kurze Reaktionszeiten (10-30 Minuten) und tiefe Temperaturen (0°-30°C). Bei Monosacchariden und Polysacchariden wie Stärke, Dextran, Agarose, Cellulose usw. ist je nach der Struktur der die Polymerketten bildenden Zucker auch die Existenz von cyclischen Carbonaten beschrieben worden (W. M. Doane etal., Carbohydrate Res. 4 [1967] 445; S.A. Barker etal.. Carbohydrate Res. 17 [1971 ] 471). Die aus Polysacchariden erhaltenen Produkte stellen jedoch Gemische von cyclischen Carbonaten und unsymmetrischen Kohlensäurediestern dar. Die Eignung derartiger Polymercarbonate (z. B. von Cellulose) für die Kopplung von Proteinen am Beispiel von Immunglobulinen ist von J. F. Kennedy

et al., (J. Immunol. Methods 50 [1982] 57) nachgewiesen worden. Aktivierte Trägermaterialien, die cyclische Polymercarbonate enthalten, haben bisher nur eine geringe Verbreitung gefunden, da die bekannten Herstellungsverfahren den Nachteil besitzen, daß sie große Mengen an Aktivierungsreagenzien benötigen. Barker etal. beschreiben die Darstellung von Cellulosecarbonat durch Umsetzung von Cellulose mit einem großen Überschuß an Chlorameisensäureethylester (ca. IOM0I/I Mol Cellulose-OH-Gruppen)in einem Lösungsmittelgemisch aus Dimethylsulfoxid und Dioxan in Gegenwart von Triethylamin. So wird zum Beispiel nach Aktivierung mit 16 ml (0,2 Mol) Chlorameisensäureethylester pro Gramm Cellulose ein Cellulosecarbonat erhalten, in dem ca. 10-30% der Glucosereste cyclische Carbonatgruppen enthalten. Sowohl die Menge des gebildeten cyclischen Carbonats als auch sein Anteil am Gesamtcarbonatgehalt sind an die Verwendung von Dimethylsulfoxid gebunden und erfordern eine äußerst genaue Einhaltung der anzuwendenden Reaktionsbedingungen. Da die Reaktionsführung, insbesondere die Temperatur einen starken Einfluß auf die Aktivierung hat, ist die reproduzierbare Herstellung eines Cellulosecarbonats gleichbleibender.Qualität sehr erschwert. Die Bildung cyclischer Polymercarbonate durch Umsetzung von hydroxylgruppenhaltigen Polymeren mit Phosgen (J.S.Ayers etal., DE 2805056, G.S. Bethell etal., J. Chromatogr. 219 [1981] 353) ist beschrieben worden, jedoch werden nur bei Einsatz eines sehr großen Phosgenüberschusses Träger mit hohen Koppiungskapazitäten erhalten.

Außerdem wird beschrieben, daß beim Umsatz von überschüssigen Phosgen mit Hydroxypropylcellulose eine quantitative Reaktion derOH-Gruppen zu Chlorcarbonyloxy-Gruppen (-O-CO-CI) erfolgt (S. Yolles etal., J. Polym. Sei., Polym. Chem. Ed. 17 [1979] 4111).

Nachteile der Reaktion mit Phosgen sind dessen Toxizität und die Notwendigkeit des Einsatzes eines hohen Reagenzüberschusses. Die bisher beschriebenen Polymercarbonate sind je nach Art des eingesetzten Polymers und der angewandten Herstellungsmethode meist Gemische von cyclischen Carbonaten und unsymmetrischen Kohlensäurediestern. Da die chemische Reaktivität dieser verschiedenen Carbonatgruppen sehr unterschiedlich sein kann und die Herstellung einheitlicher Produkte nur im Falle von unsymmetrischen Kohlensäurediestern bekannt ist, ist die bisher nur gelegentlich beschriebene Anwendung von cyclischen Carbonaten verständlich.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, unter milden Reaktionsbedingungen und unter möglichst geringem Einsatz des zu verwendenden Aktivierungsreagenzes sowie in reproduzierbarer Weise Carbonatstrukturen in hydroxylgruppenhaltigen Polymeren zu erzeugen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, hydroxylgruppenhaltige Polymere durch Umsatz mit geeigneten Chlorameisensäureestern oder den entsprechenden symmetrischen Kohlensäurediestern in Polymercarbonate hoher Kopplungskapazität zu überführen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Chlorameisensäureester der allgemeinen Formel CI-CO-OR oder symmetrische Kohlensäurediester der allgemeinen Formel RO-CO-OR, wobei der Rest R eine elektronenanziehende Gruppe darstellt, in Gegenwart von zur Bildung von reaktiven Acyliumsalzen befähigten supernucleophilen Aminen und gegebenenfalls einem weiteren der Gruppe starker Basen zugehörenden tertiären Amin in wasserfreien organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen von 0-100°Cmitden hydroxylgruppenhaltigen Polymeren innerhalb 0,5-50Stunden umgesetzt werden und gegebenenfalls die so erhaltenen Produkte einer Nachbehandlung mit supernucleophilen Aminen in wasserfreien organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen von 0-100⁰C unterworfen werden und sich gegebenenfalls eine Behandlung mit wäßrigen Lösungen anschließt. Als hydroxylgruppenhaltige Polymere sind sowohl wasserlösliche als auch unlösliche natürliche Polysaccharide und deren Derivate oder Hydrolyseprodukte wie Dextran, Stärke, Mannan, Agarose, Sepharose, Cellulose, Stärkehydrolyseprodukte (SHP) u.a. oder synthetische Polymere wie Fractogel,Töyoperl, Spheron, Trisacryl, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol usw. einsetzbar.

Dabei können die Polymeren als solche oder in Form daraus hergestellter Produkte wie Formkörper, Fasern, Gewebe, Folien oder Papier zur Reaktion gebracht werden.

Für eine erfolgreiche Herstellung von Polymercarbonaten ist eine sorgfältige Entwässerung derfür die Aktivierung verwendeten Lösungsmittel und Reagenzien erforderlich. Polymere, die bei der Entwässerung irreversible strukturelle Veränderungen erleiden können, werden durch schrittweise Behandlung mit organischen wassermischbaren Lösungsmitteln sinkenden Wassergehaltes in wasserfreie Lösungsmittel überführt (z. B. Dioxan, Aceton). Für Reaktionen in anderen organischen Lösungsmitteln werden die wasserfreien Polymere ausgiebig mit den zur Verwendung kommenden Lösungsmitteln auf einer Fritte gewaschen.

Als Lösungsmittel für die Aktivierung werden Aceton und Dioxan bevorzugt, jedoch sind auch andere unpolare aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe (Hexan, Benzen, Toluen usw.), halogenierte Kohlenwasserstoffe (Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Chlorbenzen usw.) sowie stark polare Lösungsmittel (Acetonitril, Dimethylformamid usw.) mit gleichem Ergebnis einsetzbar. Alkohole oder andere Hydroxyl- oder SH-gruppenhaltige Lösungsmittel sind ungeeignet. Für die erfindungsgemäße Herstellung von Polymercarbonaten werden solche Chlorameisensäureester oder die entsprechenden symmetrischen Kohlensäurediester eingesetzt, die eine elektronenanziehende Gruppe R tragen, wobei R substituierte Phenylreste, wie p-Nitrophenyl- oder 2,4,5-Trichlorphenyl- oder einen Succinimidyl-, Phthalimidyl-, 5-Norbornen-2,3-dicarboximidyl-Rest u. a. bedeuten. Als supernucleophile Amine werden 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 4-Pyrrolidinooder4-Morpholinopyridin, N-Methylimidazol, Diazabicyclo/öAO/undecen, Diazabicyclo/2.2.0/octan u.a. eingesetzt. Bevorzugt wird DMAP in Mengen von 0,05 bis 5,0MoI pro Mol Chlorameisensäureester bzw. symmetrischen Kohlensäurediester. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß bei geeigneten Bedingungen die Reaktion von hydroxylgruppenhaltigen Polymeren mit Chlorameisensäureestern oder symmetrischen Kohlensäurediestern in Gegenwart supernucleophiier Amine zu cyclischen und acyclischen Polymercarbonaten als Hauptprodukte führt. Die Art und die Menge der Polymercarbonatgruppen sind auch von der Struktur des jeweiligen hydroxylgruppenhaltigen Polymers abhängig. Wird z.-B. die Aktivierung von

Perlcellulose mit N-Chlorcarbonyloxy-B-norbornen^^-dicarboximid (CI-CO-ONB) in Gegenwart von DMAP (ca. 0,1 Mol/1 Mol CI-CO-ONB) und Triethylamin (ca. 1 Mol/1 Mol CI-CO-ONB) in wasserfreiem Aceton bei Raumtemperatur nach 16 Stunden beendet, so erhält man eine aktivierte Perlcellulose, die ca. 700μΜοΙ Polymercarbonatgruppen neben ca. 900μΜοΙ unsymmetrischen Kohlensäurediester-Gruppen (J-O-CO-ONB), jeweils pro Gramm trockene Cellulose, enthält. Dagegen enthält unter gleichen Bedingungen aktivierte Perlcellulose nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten ausschließlich unsymmetrische Kohlensäurediestergruppen (ca. 1 200pMol/g trockene Cellulose).

Die bei Raumtemperatur langsam ablaufende Polymercarbonatbildung kann durch Erhöhung der Temperatur oder der Menge an supernucleophilem Amin beschleunigt werden. Dabei werden dann Polymere mit überwiegend Polymercarbonatgruppen erhalten. So kann z.B. durch Einsatz von 5MoI DMAP pro Mol Chlorameisensäureester die Polymercarbonatmenge an Perlcellulose nach 16 Stunden auf ca. ΙΟΟΟμΜοΙ/g trockene Cellulose und unter den gleichen Bedingungen bei 50⁰C nach einer Stunde auf ca. 1300μΜοΙ^ trockene Cellulose erhöht werden. Dabei nimmt der Anteil an unsymmetrischen. Kohlensäurediestergruppen ab. Das kann bei Einsatz geringerer Mengen an supernucleophilem Amin und bei niedrigeren Temperaturen auch durch eine Verlängerung der Reaktionszeit erreicht werden (ca. 24-50 Stunden).

Die Gegenwart von stark basischen Aminen wie z. B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, Ν,Ν-Dimethylanilin, Pyridin, Picolin, N-Methylpiperidin u.a. ist für die Bildung des cyclischen und acyclischen Polymercarbonate gegebenenfalls dann notwendig, wenn beim Einsatz von Chlorameisensäureestern geringere als äquimolare Mengen an supernucleophilem Amin verwendet werden. Die dann vorzugsweise einzusetzende Menge an stark basischem Amin sollte äquimolar zur Chlorameisensäureester gewählt werden.

Es können jedoch auch größere Mengen stark basischer Amine eingesetzt werden. Besonders beim Einsatz weniger stark nucleophiler Amine aus der Gruppe der supernucleophilen Amine wird eine Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit der Bildung cyclischer und acyclischer Polymercarbonate in Gegenwart stark basischer tertiäre Amine erzielt. Pro Mol Chlorameisensäureester oder symmetrischem Kohlensäurediester werden =äO,05Mol supernucleophiles Amin und gegebenenfalls S1,0 Mol eines stark basischen Amins oder eines Gemisches von supernucleophilem und stark basischem Amin eingesetzt.

Die Herstellung von Polymercarbonaten (cyclische und acyclische Carbonatgruppen) hydroxylgruppenhaltiger Polymerer wird auch durch Umsetzung von aktivierten Polymeren, die unsymmetrische Kohlensäurediestergruppen vom Typ J-O-CO-OR, wobei R eine elektronenanziehende Gruppe darstellt, tragen, mit supernucleophilen Aminen in wasserfreien organischen . Lösungsmitteln erreicht. So wird z. B. beim Einsatz einer mit N-Chlorcarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (CI-CO-ONB) aktivierten Perlceljulose für die Reaktion mit 5MoI DMAP/Mol J-0-CO-ONB-Gruppen in Aceton nach 16 Stunden ein Träger mit ca. 450μΜοΙ Polymercarbonatgruppen/g trockene Cellulose erhalten. Diese Reaktion der aktivierten unsymmetrischen Kohlensäurediester der Struktur J-O-CO-OR kann zur Überführung der aktiven Gruppen in cyclische oder acyclische Polymercarbonatstrukturen genutzt werden. Durch Reaktion der erfindungsgemäß herstellbaren Polymercarbonate mit einem Anteil an unsymmetrischen Kohlensäurediester-Gruppen mit supernucleophilen Aminen sind Polymercarbonate mit ausschließlich cyclischen und acyclischen Carbonatgruppen darstellbar.

Die Umsetzung wird in wasserfreien Lösungsmitteln bei Temperaturen von O bis 100°C und Reaktionszeiten von 1 bis 24 Stunden vorgenommen. Die Menge an eingesetzten supernucleophilen Aminen beträgt vorzugsweise 1 bis 5MoI, bezogen auf den molaren Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester am Polymeren (J-O-CO-OR). Zur Ermittlung des Gehaltes sowohl an cyclischen und acyclischen Carbonaten als auch an unsymmetrischem Kohlensäurediester wird die Kopplung von überschüssigem Allylamin und nachfolgend die Bestimmung der am Polymeren befindlichen Doppelbindungen nach Umsetzung mit Jodmonobromid in Eisessig durchgeführt (H.-P.Kaufmann, Analyse der Fette und Fettprodukte Bd. 1, Springer-Verlag, Berlin-Göttingen-Heidelberg 1958). Die ausschließliche Bestimmung von unsymmetrischen Kohlensäurediestergruppen am Polymeren erfolgt durch Hydrolyse der aktivierten Träger mit 0,1 M NH₄OH und spektralphotometrische Bestimmung der abgespaltenen OH-Verbindung (substituierte Phenole oder Hydroxylamine). Für die Bildung cyclischer und acyclischer Polymercarbonate werden die Chlorameisensäureester bzw. die entsprechenden symmetrischen Kohlensäurediester in Mengen von 0,5-5OmMoI (bevorzugt 2-10mmol) pro Gramm trockene Polymerverbindung eingesetzt. Die Ausbeute derCarbonatbildung am Polymeren beträgt bei Einsatzmengen von 2-1OmMoI Aktivierungsreagenz pro Gramm trockenes Polymer ca. 15-20% der Theorie; das entspricht maximalen Kopplungskapazitäten von ca. 500-1300μΜοΙ. Es erweist sich als günstig, Reaktionszeiten für die Aktivierung von 1-16 Stunden anzuwenden und vorzugsweise bei Temperaturen von 4-50⁰C zu arbeiten. Bei sehr langen Reaktionszeiten und Temperaturen > 50⁰C wie auch bei einem großen Überschuß des supernucleophilen Amins können in Abhängigkeit von der Natur des hydroxylgruppenhaltigen Polymeren unerwünschte Nebenreaktionen auftreten, die u.a. zu einer Verfärbung der Polymeren führen können. Die Anzahl der Polymercarbonatgruppen kann durch die Wahl der geeigneten Reaktionsbedingungen (Menge des Aktivierungsreagenzes, Menge an supernucleophilem Amin, Temperatur und Reaktionszeit) sehr gut gesteuert werden. Unter günstigen Bedingungen sind Kopplungskapazitäten durch cyclische und acyclische Polymercarbonatstrukturen, ζ.B. bei Perlcellulose oder Sepha öse CI-6B, von > 1500 μΜοΙ/g Träger erreichbar. Verglichen mit Kopplungskapazitäten kommerzieller Produkte liegen diese Maximalwerte weit über den für die Herstellung von affinitätschromatographischen Trägern erforderlichen Werten. Der Verlauf der Aktivierungsreaktion und die Struktur der Polymercarbonate sowie der unsymmetrischen Kohlensäurediester wird durch IR-spektroskopische Untersuchungen kontrolliert und beurteilt.

Für die erfindungsgemäß hergestellten Polymercarbonate der Cellulose sind die C=O-Valenzschwingungen bei 1750cm"¹ für acyclische und die bei 1820 bzw. 1850cm"¹ für cyclische Carbonatstrukturen charakteristisch.

Im Vergleich dazu zeigt aktivierte'Perlcellulose des Typs J-O-CO-ONB scharfe C=0-Banden bei 1720cm"¹ für die Carbonat-C=O-Gruppe und bei 1780 und 1800cm"¹ für die Amid-C=O-Gruppe.

Es ist von Vorteil, die eventuell am Polymeren vorhandenen aktiven unsymmetrischen Kohlensäurediestergruppen durch eine hydrolytische Nachbehandlung der nach Aktivierung erhaltenen Polymeren zu beseitigen. Dazu werden die aktivierten Polymeren bei der schrittweisen Überführung in ein wäßriges Medium mit Lösungsmittel-Puffer-Gemischen behandelt. Durch eine sorgfältige Durchführung dieses Prozesses und Wahl eines geeigneten pH-Wertes des Puffers (pH4,0 bis 9,0) gelingt die Entfernung von aktiven unsymmetrischenKohlensäurediestergrupperi vollständig bei geringen Verlusten an cyclischen und acyclischen Polymercarbonatgruppen. Im Falle der Cellulose unterscheidet sich z. B. die Hydrolysegeschwindigkeit der Polymercarbonatgruppen von der der Cell-O-CO-ONB-Gruppe im schwach alkalischen pH-Bereich (z. B. pH 8,3) um den Faktor 10. So können z. B. durch Hydrolyse von aktivierter Perlcellulose, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde,

bei pH 5-6 die noch vorhandenen -O-CO-ONB-Gruppen vollständig abgespalten werden. Die auf diese Weise gewonnene aktivierte Perlcellulose enthält dann nur noch Polymercarbonatgruppen, wie durch UV-spektrometrische Bestimmung und IR-spektroskopische Untersuchung (Carbonat-C=O-Banden bei 1750,1820 und 1850cm"¹) gezeigt werden kann. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu bekannten Verfahren besteht in der relativ geringen Einsatzmenge an Aktivierungsreagenz bei Erzielung hoher Aktivierungsgrade. Außerdem wird durch eine relativ einfache Reaktionsführung die Einheitlichkeit der funktionellen Gruppen der aktivierten Polymere gewährleistet und reproduzierbar gestaltet. Vorteilhaft ist weiterhin, daß im Unterschied zu den bekannten aktive unsymmetrische Kohlensäurediester-Gruppen enthaltenden Polymeren bei der Kopplung von Liganden oder der hydrolytischen Spaltung der Polymercarbonatgruppen keine Substanzen entstehen (siehe Gleichung 1-3), die eventuell toxisch sind und deren Abtrennung mitunter erhebliche Schwierigkeiten bereitet.

f-0-CO-O-/ /-^N02 + H₂N-R > J-O-CO-NHR.

unsymmetrischer Kohlensäurediester

J-0-CO-O-f + H₂N-R > f-OH + ^/o-CO-NHR (2)

acyclisches Polymercarbonat

HÖH

0-CO-N HR ^(3>

cyclisches Polymercarbonat

Die Eignung der cyclischen und kettenvernetzenden Polymercarbonate zur Kopplung von Aminen, Aminosäuren und Proteinen (Enzyme, Lektine, Immunglobulineu.a.) wird anhand von Beispielen gezeigt. Die Kopplung kann je nach Art des Liganden sowohl in organischen Lösungsmitteln (z. B. Kopplung von Aminen) als auch in wäßrigen Pufferlösungen im pH-Bereich von 7 bis 10 bei Temperaturen von 4 bis 50⁰C erfolgen. Die erfindungsgemäße Herstellung von Polymercarbonaten hydroxylgruppenhaltiger Polymerer soll anhand folgender Beispiele erläutert werden:

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

10ml wasserfreie Perlcellulose werden in 30 ml wasserfreiem Aceton suspendiert, worin 80mg DMAP und 1,14ml Triethylamin gelöst sind. Unter Schütteln werden bei Raumtemperatur 1,52g N-Chlorcarbonyloxy-S-norbornen^^-dicarboximid, gelöst in 10ml Aceton hinzugegeben. Die Reaktion wird unter vorsichtigem Schütteln vorgenommen.

Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten wird eine Probe entnommen und auf der Fritte gründlich mit wasserfreiem Aceton gewaschen und analysiert. Bei einer Gesamtkopplungskapazität von 1227 μΜοΙ/g trockene Cellulose (ermittelt durch Kopplung von Allylamin beipHIOundtitrimetrische Bestimmung der. Doppelbindung mit JBr) beträgt der Gehalt an unsymmetrischem Kohlensäurediester (nach Hydrolyse mit 0,1 M NH₄OH durch spektralphotometrische Bestimmung von N-Hydroxy-5-norbomen-2,3-dicarboximid bei 270nm ermittelt) 1155 μΜοΙ/g trockene Cellulose.

Die Reaktion wird nach 16stündiger Inkubation beendet. Die Gesamtkopplungskapazität ist auf 1619pMol/g trockene Cellulose gestiegen, und der Gehalt an unsymmetrischem Kohlensäurediester ist auf 923μΜοΙ^ trockene Cellulose zurückgegangen.

Daraus ergibt sich ein Gehalt an cyclischen und acyclischen Carbonaten von 696pMol/g trockene Cellulose. 5 ml der so hergestellten aktivierten Cellulose werden mit 370 mg DMAP in 5 ml wasserfreiem Aceton 16 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln behandelt.

Danach enthält der Träger noch80pmol unsymmetrischen Kohlensäurediester und 1180μιηοΙ cyclisches und acyclisches Carbonat/g trockene Cellulose.

Beispiel 2

10 ml wasserfreie Perlcellulose werden in 30 ml wasserfreiem Aceton suspendiert, in dem 3,82 g DMAP und 0,44 ml Triethylamin gelöst sind. Unter Schütteln werden bei Raumtemperatur 1,52g N-Chlorcarbonyloxy-ö-norbornen^^-dicarboximid, gelöst in 10,0 ml Aceton, hinzugegeben und bei Raumtemperatur 16 Stunden inkubiert.

Durch Absaugen des Trägers und ausgiebiges Waschen mit wasserfreiem Aceton wird die Reaktion beendet.

Der Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester beträgt 820 μΜοΙ/g, die Gesamtkopplungskapazität 1 855μΜοΙ/^. Daraus läßt sich ein Anteil von cyclischem und acyclischem Carbonat von 1035 μΜοΙ/g Cellulose errechnen.

Beispiel 3 .

Die Aktivierung von Perlcellulose wird analog Beispiel 2 bei 50⁰C vorgenommen.

Der Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester beträgt 788 μΜοΙ/g, die Gesamtkopplungskapazität 2085pMol/g. Daraus ergibt sich der Gehaltan cyclischem und acyclischem Carbonatzu 1 297pMol/g.

5 ml des so hergestellten Trägers werden stufenweise in Wasser und anschließend in 20 ml 3 N Natriumchlorid-Lösung bei pH 5,6 überführt und 4 Tage bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln nachhydrolysiert.

Danach wird ein Gehalt an unsymmetrischen Kohlensäurediester-Gruppen von ca. 50pmol/g trockene Cellulose und ein Gehalt an cyclischem und acyclischem Carbonat von 1150pmol/g bestimmt. Im IR-Spektrum treten charakteristische C=O-Banden bei 1750,1810 und 185OcItT¹ auf.

Beispiel 4

Die Aktivierung von Perlcellulose wird analog Beispiel 3 vorgenommen, jedoch werden 4,4ml Triethylamin/10ml Cellulose eingesetzt.

Der Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester beträgt 740pmol/g, die Gesamtkopplungskapazität 1951 μΜοΙ/g, woraus sich ein Gehaltan cyclischem und acyclischem Carbonat von 1211 μΜοΙ/g ergibt.

5 ml der so aktivierten Cellulose werden stufenweise in Wasser überführt, auf einer Glasfritte abgesaugt und in einem Schliffkolben unter leichtem Schütteln 16 Stunden mit 20ml 0,1 M Natriumtetraborat-Puffer bei pH8,3 nachbehandelt. Danach enthält der Träger keine unsymmetrischen Kohlensäurediester-Gruppen mehr. Der Gehalt an acyclischem Carbonat beträgt 715pmol/g. Im IR-Spektrum zeigt das Produkt eine C=O-Bande bei 1750cm""¹.

2ml des nach Hydrolyse erhaltenen Celluloseträgers werden mit 420mg Glycin in 2 ml 0,1 M Natriumbicarbonat-PufferbeipHI 24 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln umgesetzt. Nach gründlichem Waschen wird die gekoppelte Glycinmenge durch Titration der COOH-Gruppen am Träger bestimmt. Sie beträgt 8,2 mg, das entspricht 710 μΓηοΙ/g trockene Cellulose.

Beispiel 5

10ml eines durch Reaktion von Perlcellulose mit N-Chlorcarbonyloxy-ö-norbornen^^-dicarboximid hergestellten Trägers mit unsymmetrischen Kohlensäurediester-Gruppen (Kopplungskapazität = 900μΜοΙ^) werden in einer Lösung von 363mg DMAP in 10 ml wasserfreiem Aceton durchschütteln bei Räumtemperatur zur Reaktion gebracht. Nach einer Reaktionszeit von 16 Stunden wird der verbleibende Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester zu 120μΜοΙ^ Cellulose ermittelt. Die gesamte Kopplungskapazität des Trägers beträgt 572 μΜοΙ/g Cellulose. Aus der Differenz beider Werte ergibt sich ein Gehalt des Produktes an cyclischem und acyclischem Carbonat von 452μΜοΙ/g. Dieses Ergebnis wird durch das IR-Spektrum des Produktes bestätigt, welches eine C=O-Bande bei 1750cm"¹ zeigt.

Beispiel 6

Gemäß Beispiel 5 wird die Umsetzung mit DMAP 16 Stunden bei 50°C durchgeführt.

Der Anteil unsymmetrischen Kohlensäurediesters sinkt auf 40 μΜοΙ/g Cellulose, während die Bestimmung der Gesamtkopplungskapazität einen Wert von 506μΜοΙ^ ergibt. Der Gehalt an cyclischem und acyclischem Carbonat errechnet sich zu 466μΜοΙ^ Cellulose. .

Beispiel?

2 ml des in Beispiel 6 erhaltenen Cellulosecarbonats werden nach schrittweiser Überführung in Wasser 18 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,1 M Boratpuffer, pH 8,3 behandelt. Im IR-Spektrum der Cellulose tritt nur eine C=O-Bande bei 1750cm~¹ auf. Es läßt sich am Träger kein N-Hydroxy-ö-norbornen^^-dicarboximid mehr nachweisen. Der Gehalt an acyclischem Carbonat wird zu 300 μΜόΙ/g Träger ermittelt. 1 ml des nachhydrolysierten Trägers wird mit einer Lösung von 10 mg Concanaval in A in einem Milliliter 0,1 M Natriumtetraborat-Puffer bei pH 8,3 versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach gründlichem Waschen mit Wasser wird die am Träger gekoppelte Proteinmenge bestimmt. Sie beträgt 1,7 mg/ml sedimentierte Cellulose. Unter gleichen Bedingungen₍aber bei pH 9,3 werden 2,5 mg/ml Cellulose gebunden.

Beispiel 8

Die Aktivierung von Perlcellulose wird analog Beispiel 2 vorgenommen, jedoch werden 382 mg DMAP/10 ml Cellulose eingesetzt. Der Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester beträgt 980 μΜοΙ/g, die Gesamtkopplungskapazität 1722 μΜοΙ/g. Daraus ergibt sich ein Gehalt an cyclischem und acyclischem Carbonat von 744 μΜοΙ/g.

Beispiel 9

4ml wasserfreiesTrisacryl G F 2000 werden in 45ml wasserfreiem Dioxan, die 5,1 g DMAP enthalten, suspendiert. Unter Schütteln werden bei Raumtemperatur 2,04g N-Chlorcarbonyloxy-S-norbornen^^-dicarboximid, gelöst in 45ml wasserfreiem Dioxan, hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt. Danach wird der Träger auf einer Glasfritte abgesaugt und mit 50 ml Dioxan gewaschen. Nach Überführung in Wasser, das mit 0,1 N HCI auf pH 2,2 eingestellt wurde, wird derTräger mit 100 ml 0,2 N Kaliumchlorid-HCI-Puffer-Lösung pH 2,2 gründlich gewaschen und analysiert. Der Gehalt an cyclischem und acyclischem Carbonat beträgt 181 μΜοΙ/g Trisacryl, der an unsymmetrischem Kohlensäurediester

Beispiel 10

4ml wasserfreie SepharoseCL-4 B werden in 10 ml wasserfreiem Aceton, in dem 0,97 g DMAP gelöst sind, suspendiert und nach Zugabe einer Lösung von 0,38g N-Chlorcarbonyloxy-ö-norbornen^S-dicarboximid in 10ml wasserfreiem Aceton 16 Stunden bei Raumtemperatur leicht geschüttelt.

Durch Absaugen des Trägers und Waschen mit 50 ml wasserfreiem Aceton wird die Reaktion beendet.

Der Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester beträgt 1621 μΜοΙ/g trockene Sepharose, die Gesamtkopplungskapazität 2659μΜοΙ^. Daraus ergibt sich ein Gehalt an cyclischem und acyclischem Carbonat von 1038μΜοΙ^.

2ml der aktivierten Sepharose werden stufenweise in Wasser überführt, abgesaugt und mit 20ml 0,1 M Citrat-Puffer pH 5,6 7 Tage bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln nachbehandelt. Danach beträgt der Gehalt an unsymmetrischem Kohlensäurediester ΙΟμΜοΙ/g trockene Sepharose und der an cyclischem und acyclischem Carbonat980pMol/g.

Beispiel 11

1g Polyvinylalkohol wird in 10ml wasserfreiem Aceton, das 0,97g DMAP und 0,55ml Triethylamin enthält, suspendiert. Unter Schütteln werden 1,93g N-Chlorcarbonyloxy-ö-norbornen^^-dicarboximid in 5ml wasserfreiem Aceton hinzugegeben und 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt.

Danach wird der Polyvinylalkohol abgesaugt und mit 30 ml Aceton gewaschen. Anschließend wird mit einer Lösung von Methanol/Wasser 1:1 pH 2,5 gewaschen bis die Extinktion bei 261 nm in der Waschlösung <0,01 ist.

Der so aktivierte und nachbehandelte Polyvinylalkohol enthält 13,2μΜοΙ unsymmetrischen Kohlensäurediestor und 450 μΜοΙ cyclisches und acyclisches Carbonat/g Polyvinylalkohol.

Beispiel 12

5ml wasserfreie Perlcellulose werden in 5ml wasserfreiem Aceton, in dem 1,85g Diazabicyclo[2.2.2]octan und 0,24ml Triethylamin gelöst sind, suspendiert. Nach Zugabe von 0,84g N-Chlorcarbonyloxy-ö-norbornen^^-dicarboximid in 5 ml wasserfreiem Aceton wird das Reaktionsgemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Träger wird abgesaugt und mit 50ml Aceton gewaschen.

Der Anteil an unsymmetrischem Kohlensäurediester beträgt 3,2 μΜοΙ und der an cyclischem und acyclischem 03^οη3ί96μΜοΙ/ g trockene Cellulose.

Beispiel 13

2 ml wasserfreie Perlcellulose werden analog Beispiel 12 mit 0,1g DMAP und 0,053 g p-Nitrophenylcarbonat umgesetzt. Der so aktivierte Träger enthält 165μΜοΙ unsymmetrischen Kohlensäurediester und 160μΜοΙ cyclisches und acyclisches Carbonat/g Cellulose. Die Nachbehandlung mit 0,1 M Citrat-Puffer pH 5,6 bei Raumtemperatur ergibt nach 5 Tagen einen Träger, dessen Gehalt an cyclischem und acyclischem Carbonat 153μΜοΙ und an unsymmetrischem Kohlensäurediester 6,3μΜοΙ/g Cellulose beträgt. Der Gehalt an unsymmetrischem Kohlensäurediester wurde nach Hydrolyse mit 0,1 M NH₄OH durch spektralphotometrische Bestimmung von p-Nitrophenol bei 400 nm ermittelt.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Carbonaten hydroxylgruppenhaltiger Polymere durch Umsetzung von Polymeren mit Chlorameisensäureestern oder symmetrischen Kohlensäurediestern, dadurch gekennzeichnet, daß man Chlorameisensäureester der allgemeinen Formel CI-CO-OR oder symmetrische Kohlensäurediester der allgemeinen Formel RO-CO-OR, wobei der Rest R eine elektronenanziehende Gruppe darstellt, in Gegenwart von zur Bildung von reaktiven Acyliumsalzen befähigten supernucleophilen Aminen und gegebenenfalls einem weiteren der Gruppe starker Basen zugehörenden tertiären Amin in wasserfreien organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen von 0-100°C mit hydroxylgruppenhaltigen Polymeren innerhalb von 0,5 bis 50 Stunden umsetzt und gegebenenfalls die so erhaltenen aktivierten Polymere einer Nachbehandlung mit supernucleophilen Aminen in wasserfreien organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen von 0-100⁰C unterwirft und gegebenenfalls eine Behandlung mit wäßrigen Lösungen anschließt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als elektronenanziehende Gruppe R substituierte Phenylreste, wie p-Nitrophenyl- oder 2,4,5-Trichlorphenyl oder einen Succinimidyl-, Phthalimidyl- oder 5-Norbomen-2,3-dicarboximidyl-Rest einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als supernucleophile Amine 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 4-Pyrrolidinopyridin, 4-Morpholinopyridin, N-Methylimidazol, Diazabicyclo/öAO/undecen, Diazabicyclo/2.2.0/-octan und ähnliche Verbindungen einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als stark basische tertiäre Amine Triethylamin, N-Methylmorpholin, Ν,Ν-Dimethylaminoanilin oder heterocyclische Amine wie Pyridin, Picolin, N-Methylpiperidin und ähnliche Verbindungen einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man pro Mol Chlorameisensäureester oder symmetrischen Kohlensäurediester § 0,05 Mol supernucleophiles Amin und gegebenenfalls ^ 1,0 Mol eines stark basischen Amins oder eines Gemisches von supernucleophilem und stark basischem Amin einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzungsprodukte einer Behandlung mit wäßrigen Lösungen im pH-Bereich 4 bis 9 unterwirft.