JPH04504872A - ポリペプチドの修飾に使用するための活性ポリアルキレンオキシドカーボネート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドの修飾に使用するための活性ポリアルキレンオキシドカーボネート 本出願は１９８９年４月１９日出願の米国特許出願第３４０．９２８号の一部継 続出願であり、該特許出願の記載内容は本出願の明細書に含まれるものとする。

免匪座１遣 本発明は、Ｄａｖｉｓ他の米国特許第４．１７９．３３７号に開示されているよ うな、ポリペプチド分子とポリアルキレンオキシドのストランドとの共有結合に よるポリペプチドの化学的修飾に係る。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ　＆Ｄａｖｉｓの ｒＥｎｚｙｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇｓ」、Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ　＆　Ｒｏｂｅ ｒｔｓ、ｅｄｓ、。

ｐｐ、３６７〜３８３．　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、Ｎ、Ｙ、（１９ ８１）は、か力）るポリペプチド調製物が親ポリペプチドに比較して免疫原性及 び抗原性が少なく血流中の寿命が長いことを開示してνする。修飾ポリペプチド はこのような有利な特性を有するので酵素療法などの種々の治療的用途で極めて 有用である。

ポリマーを後でタンパク質に結合させるために、ポリアルキレンオキシドに導入 される活性基番よ以下の要件を満なす必要がある： １．活性基は穏やかな条件下に高速でタンパク質と反応し得るのに十分な反応性 を有していなければならない；２、修飾過程で活性基から遊離される残基は無毒 性であり及び／またはタンパク質−ポリマー付加化合物から分離容易でなければ ならない。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に共有結合させるためには、ま ず、ポリマーのヒドロキシル末端基を反応性官能基に変換する必要がある。普通 はこの過程を「活性化」と呼び、生成物を「活性化ＰＥＧＪと呼ぶ。

はとんどの場合、タンパク質分子のアミンに反応性の官能基によって一端がキャ ップされたメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）誘導体が使用される。

治療用酵素の調製のためにこれまで使用されている最も普及した形態の活性化Ｐ ＥＧはポリ（エチレングリコール）スクシンイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステル（ＳＳ−ＰＥＧ）（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、ＣａｎｃｅｒＢｉｏｃ ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ３’８．７．　１７５〜１８６（１９８４）、スキーム１〕 である。この活性化ポリマーは前述の２つの要件を満たす。しかしながら、重大 な欠点が１つある。ポリマーとコハク酸残基との間のエステル結合が水性媒体中 で十分な安定性を有していないことである（　Ｉ　ｗ　ａ　ｓ　ａ　ｋ　ｉ他の 米国特許第４．６７０，４１７号（１９８７）；Ｕｌｂｒｉｃｈ他、Ｍａｋｒｏ ｍｏｌ。

Ｃｈｅｍ、ｆ旦７．　１１３１〜１１４４（１９８６））。

た従来手順によるタンパク質とＰＥＧとの結合　・種々の官能化ポリエチレング リコール（ＰＥＧ）は、タンパク質修飾（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ　＆　Ｄａｖｉ ｓ。

１９８．１．Ｊｌ）、ペプチド化学（Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐ ｔｉｄｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ、、３０．　７４ＣＩ−７８３（１９８７）） 及び生物活性物質との複合体の調製（Ｚａｌ　１ｐｓｋｙ他。

Ｅｕｒ、Ｐｏｌｙｍ、Ｊ、旦、１１７７〜１１８３（１９８３）及びＺａｌｉｐ ｓｋｙ　＆　Ｂａｒａｎｙ。

Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、Ｄｉｖ、Ｐｏｌｙｍ、Ｃｈｅｍ、２７ニエユ１゜１〜２　（１９８６） ）　、などの分野で有効に使用されてきた。医薬として使用されるときのＰＥＧ タンパク質複合体は、特に、タンパク質分解消化に対する安定性がよい、免疫応 答が少ない、血流中の半減期が長い、などの利点を有すると期待されている。

従来技術ではこのような複合体を得るために、ＰＥＧのヒドロキシ基を塩化シア ヌルで活性化し、次いで、得られた化合物をタンパク質と結合させた（Ａｂｕｃ ｈｏｗｓｋｉ他（１９７７）、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、２５２．３５７８； Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ　＆　Ｄａｖｉｓ、　１９８１゜ｕ）、しかしながら、こ の方法には、塩化シアヌルが有毒である、遊離必須システィンまたはチロシン残 基のようなアミン以外の官能基を有するタンパク質に対して非特異的反応性を有 する、などの種々の欠点がある。

上記の欠点及びその他の欠点を克服するために、別の手順では、ＰＥＧのスクシ ニミジルスクシネート誘導体（ＳＳ−ＰＥＧ）を導入した（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋ ｉ他。

１９８４、ｌ！［、スキーム１、Ｌｌ！ｉ）、該誘導体は穏やかな条件下にタン パク質と迅速に（３０分）反応し、十分に修飾された活性複合体を生成する。こ の活性化ポリマーの使用には重大な欠点が１つある。ポリマーとコハク酸残基の 間のエステル結合が水性媒体中で十分な安定性を有していないことである（Ｉｗ ａｓａｋｉ他の米国特許第４゜６７０．４１７号、及び、Ｕｌｂｒｉｃｈ他＋　 Ｍ　ａ　ｋ　ｒ　。

ｍｏｌ　Ｃｈｅｍ、、１８７．　１１３１〜１１４４（１９８６））。

タンパク質のアミノ基とＰＥＧとの間のウレタン結合の形成は、ポリマー鎖の加 水分解損の問題を解決する（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ他、Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌ、１ユ、１４１〜１５２　（１９８５））。

ウレタン結合が種々の生理学的条件下で完全に安定であることは、放射性標識さ れたＰＥＧ誘導体で実際に証明された［：Ｌａｒｗｏｏｄ　＆　５ｚｏｋａ　Ｊ 、、Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　Ｒａｉｏｐｈａｒｍ、、２１゜６０ ３〜６１４　（１９８４））。カルボニルジイミダゾール活性化ＰＥＧを使用す るとカルバメート誘導体を介してＰＥＧがタンパク質に結合した［Ｂｅａｕｃｈ ａｍｐ他。

Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３１．　２５〜３３（１９８３）：］。しか しながら、この種の活性化ポリマーは、反応性が強くはないので十分な修飾を行 なうまでに長い反応時間（ｐＨ８，５で４８〜７２時間）を要する。結局、カル ボニルジイミダゾール活性化物質は前述の第１の要件を明らかに満たしていない 、この方法の更に別の欠点は、カルボニルジイミダゾールが比較的高価なことで ある。

ウレタン結合したＰＥＧ−タンパク質を調製するためにＰＥＧ−フェニルカーボ ネート誘導体を使用することも報告されている（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ他（１９８５ ）、前出〕、この方法の重要な欠点は、疎水性フェノール残基（ｐ−ニトロフェ ノールまたは２．４．５−トリクロロフェノール）が有毒であり、また、タンパ ク質に親和性を有することである。この方法は明らかに前述の第２の要件を満た していない。

ポリマーの各活性化形態の緒特性は、使用される系次第で有利になったり不利に なったりすると考えらる。ＰＥＧ−ポリペプチドが多くの用途を有することを考 慮すると、特定の目的に使用すべく作製されたタンパク質修飾ＰＥＧ試薬の範囲 を拡大することが望ましい。

見１立１１ 本発明は、式： 〔式中、Ｒ３はＨ−１Ｈ，Ｃ−１Ｎ−ジカルボキシイミド基またはその他の任意 の官能基であり； Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々は、直鎖状、分校状、ジ置換または未置換のアルキル 基であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１の各々は互いに同じ基を示してもよくまたは夫々 に異なる基を示してもよく； Ｒ９はＮ−ジカルボキシイミド基であり；及Ｖ゛ａは１〜１０００の整数、ｂ及 びｃ（７）各々はｏ〜１ｏｏ。

の整数であり、ａとｂとＣとの和が１０〜１０００である〕で示される構造を有 する化合物を提供する。

本発明はまた、式： 〔式中、Ｒ１はＨ−２Ｈ３Ｃ−１Ｎ−ジカルボキシイミド基またはその他の任意 の官能基であり； Ｒ２、Ｒ，及びＲ４の各々は、直鎖状、分校状、ジ置換または未置換のアルキル 基であり、Ｒ２、Ｒ１及びＲ４の各々は互いに同じ基を示してもよくまたは夫々 に異なる基を示してもよく； Ｘはハロゲンであり； ａは１〜１０００の整数、ｂ及びｃ（１）各々はｏ〜１ｏｏ。

の整数であり、ａとｂとＣとの和が１０〜１０００である〕で示される構造を有 する化合物と、Ｎ−ヒドロキシジカルボキシイミドとを塩基の存在下に反応させ る化合物の製造方法を提供する。

本発明は更に、式： ネート基であり； Ｒ２、Ｒ３及びＲ１の各々は、直鎖状、分校状、置換または未置換のアルキル基 であり、Ｒ７、Ｒ２及びＲ１の各々は互いに同じ基を示してもよくまたは夫々に 異なる基を示してもよく； ａは１〜１０００の整数、ｂ及びＣの各々はＯ〜１０００の整数であり、ａとｂ とＣとの和が１０〜１０００である〕で示される構造を有する少なくとも１種の ポリマーと結合したポリペプチドを含み、各ポリマーがウレタン結合によってポ リペプチドのアミン基に共有結合していることを特徴とする修飾ポリペプチドを 提供する。

本発明は更に、約５．８〜１１のｐＨ範囲でポリペプチドを化合物と反応させる 修飾ポリペプチドの製造方法を提供する。

１１些ｉ皇ｌ五」 図１．ＰＥＧ−ＢＳＡ複合体からのｍＰＥＧの遊離え１倉１：双方のタイプのＰ ＥＧ−ＢＳＡ複合体く一６１％の修飾度）の濃度４ｍｇ／ｍｌ　（Ｂｉｕｒｅｔ アッセイ）の溶液を適当なバッファ中でインキュベートした。所与の時間間隔毎 にこれらの溶液のアリコートをＺｏｒｂａｘＧＦ−４５０カラム及びＲＩ−デテ クタを備えたＨＰＬＣに注入してｍＰＥＧ−５０００を定量した。

図２．２２℃での５Ｓ−ＰＥＧ及び５Ｃ−ＰＥＧの安定性 実験条件；微粉形態の活性化ＰＥＧを密閉ポリプロピレン容器に保存した。所与 の時間間隔毎に各ポリマーのサンプルの活性アシル含量を検定した。

図３．活性化ＰＥＧの反応性に対するｐＨの影響に隻倉１：適当なｐＨのトリエ タノールアミンボレートバッフｙ　（０，３Ｍ、１ｍｌ＞に、水中のＮＡＬの貯 蔵溶液（５０ｍＭ、０．１ｍｌ＞及びＣＨ，ＣＮ中の適当な活性化ＰＥＧの貯蔵 溶液く活性アシル５０ｍＭ、０．１ｍ１）を順次添加した。得られた溶液を渦動 させ、２８℃で１時間インキュベートした。５Ｘ−ＰＥＧを除いた同じ成分の混 合物を対照として使用した。５ｎｙｄｅ　ｒ他（（１９７５）Ａｎａｌ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、６４，２８４）のＴＮＢＳアッセイの修正方法で未反応ＮＡＬを定量 した。

１且１１泗 本発明は、一般式： 〔式中、Ｒ１はＨ−１Ｈ，Ｃ−１Ｎ−ジカルボキシイミド基またはその他の任意 の官能基であり；Ｒ２、Ｒ１及びＲ４の各々は、直鎖状、分校状、ジ置換または 未置換のアルキル基であり、Ｒ３、Ｒ１及びＲ１の各々は互いに同じ基を示して もよくまたは夫々に異なる基を示してもよく；Ｒ３はＮ−ジカルボキシイミド基 であり；ａは１〜１０００の整数、ｂ及びＣの各々は０〜１０００の整数であり 、ａとｂとＣとの和が１０〜１０００である〕で示される構造を有する活性化ポ リアルキレンオキシドを記載する。

より詳細には本発明は、新規な活性化ＰＥＧ、即ちポリ（エチレングリコール） −スクシンイミドカーボネート（ＳＣ−ＰＥＧ）　、及び、ＰＥＧの三官能誘導 体、即ちポリエチレングリコール−ビス−スクシンイミドカーボネート（ＢＳＣ −ＰＥＧ）の製造及び使用に係る。更に、ＰＥＧのへテロニ官能誘導体も可能で ある（Ｚａｌｉｐｓｋｙ　＆Ｂ　ａ　ｒ　ａ、ｎ　ｙ、　Ｌｉ；！ｊ）　；これ は、一方の末端基がスクシンイミドカーボネートであり、他方の末端基（Ｒ’、 スキーム２．１比）が遊離カルボキシル基またはアミノ酸のような異なる反応性 官能基を含む、これらの物質は、安定なウレタン結合を介してＰＥＧと結合する タンパク質のアミノ基と容易に反応する（スキーム２、ｕ）。新規な物質５Ｃ− ＰＥＧ及びＢＳＣ−ＰＥＧの反応性は、従来から使用されている５Ｓ−ＰＥＧに 匹敵する。即ち、穏やかな条件下（ｐＨ５，８〜１１、好ましくはＰＨ７，０〜 ９．５の水性バッファ中）で適度な温度（４〜４０℃）で約３０〜６０分間以内 に高い修飾度が達成される。更に、これらの物質は種々の有機溶媒に可溶であり 、従って低分子量の部分保護されたペプチド及びその他の生物学的に有用なリガ ンドとの結合において有用且つ重要である。

ＰＥＧは特定の分子量を有する必要はないが、好ましくは５００〜４０．０００ 、より好ましくＧｉ２，０００〜２０゜０００の範囲の分子量を有する。ＰＥＧ の分子量は、使用される特定タンパク質の性質、例えば修飾に利用できるアミノ 基の数に基づいて選択される。

タンパク質修飾中に遊離されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドは、特に生物活性 タンパク質付加化合物を製造するためにタンパク質化学でしばしば使用される無 毒性物質である。前記のカルボニルジイミダゾールで活性化したＰＥＧ及びＰＥ Ｇ−フェニルカーボネートの場合と同様に、５Ｃ−ＰＥＧまたはＢＳＣ−ＰＥＧ を使用したタンパク質の修飾産物は、カルバメート（ウレタン）結合を介してポ リペプチド骨格にグラフト重合したＰＥＧ−鎖を有する。しかしながら、新規な 物質はより高い反応性を有するので、より短時間でより高い修飾度が達成される 。スクシンイミドカーボネートで活性化したＰＥＧの付加的な利点は、タンパク 質のアミノ基と反応しない活性官能基が速やかに水性加水分解されてＮ−ヒドロ キシスクシンイミドと二酸化炭素とヒドロキシ末端をもつＰＥＧとを生成するこ とである。これは、三官能ＰＥＧ誘導体（ＢＳＣ−ＰＥＧ）の場合に特に重要で ある。これらの物質は同時に２つの目的、即ちＰＥＧ化及び架橋を果たし得る。

ＢＳＣ−ＰＥＧは任意のホモニ官能物質と同様に、異なる２つのタンパク質を架 橋させるために使用できる。ＢＳＣ−ＰＥ０分子が唯一つの末端基を介してタン パク質と反応するとき、アミンと反応しないポリマーの他方のＳＣ−基は加水分 解され、従ってＰＥＧ−タンパク質複合体に（潜在的に抗原性の）外来残基が導 入されない。

５Ｃ−ＰＥＧ及びＢＳＣ−ＰＥＧで修飾されたタンパク質の生物活性は以後の実 施例に示すようにかなりの程度まで保持される。ウレタン結合を介してＰＥＧと 共有結合したタンパク質（組織プラスミノーゲン活性化因子）が５ｓ−ＰＥＧに よってほぼ同程度まで修飾された同じタンパク質よりも高度な比活性を有するこ とを示した先行文献が存在する（Ｂｅｒｇｅｒ　＆　Ｐｉｚｚｏ、Ｂｌｏｏｄ。

Ｌユ、１６４１〜１６４７）。

スキーム２　：　ＰＥＧをタンパク質に結合させるための５ｃ−ＰＥＧ及びＢＳ Ｃ−ＰＥＧの使用 勿論、ＳＣ−活性化したＰＥＧ−誘導体の利用は、低分子量ペプチド及び遊離ア ミノ基を含有するその他の物質のＰＥＧ複合体の製造にまで拡張できる。

ＳＣ−基をＰＥＧに導入するためのワンポット手順を開発した（スキーム３、ｆ ｌ）、まず、ポリマー（ＰＥＧ）をホスゲンで処理してポリエチレングリコール クロロホルメートをｉｎ　５ｉｔｕで生成した０次いで、得られたクロロホルメ ートをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯ３Ｕ）及びトリエチルアミン（ＴＥ Ａ）と順次反応させ、所望の活性化ＰＥＧ誘導体を得た。活性化ポリマー調製物 を低分子量物質から精製し、理論量の活性基を含有することを確認した。

Ｒ＝　−ＣＨ３ｏｒ　ＨＲヒ（ＯＣＨ２ＣＨ２）、□Ｈスキーム３：ボリ（エチ レングリコール）のＮ−スクシンイミドカーボネート誘導体の合成 東１自１１ ＳＣ−ＰＥＧの調製：分子量５０００のメトキシポリエチレングリコール（Ｕｎ ｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ、６０ｇ。

１２ｍｍｏ　１　）をトルエン／ジクロロメタン（３：１，２００ｍ１）に溶解 し、ホスゲンのトルエン溶液（３０ｍ　ｌ、５７ｍｍｏｌ）で−夜処理した。溶 液を蒸発乾固し、残留ホスゲンを真空下に除去した。残渣をトルエン／ジクロロ メタン（２：１．１５０ｍ１）に再溶解し、固体Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド （２，１ｇ、１８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１，７ｍ　ｌ　、　１２ｍ ｍｏ　ｌ　）で順次処理した。３時間後、溶液を沢通して蒸発乾固した。残渣を 温（５０℃）酢酸エチル（６００ｍｌ＞に溶解し、微量不溶物を枦別し、ポリマ ーが沈殿し易いように冷却した。生成物を濾過によって収集し、次いで、酢酸エ チルから再度再結晶させた。生成物を１ｎ　ｖａｃｕｏでＰ２Ｏ，によって乾燥 した。収量は５２．５ｇであった（理論量の８５％）。

生成物の活性カーボネート含量を測定するために、ポリマーのサンプルをジクロ ロメタン中の測定量のベンジルアミンと反応させ、余剰のアミンをジオキサン中 の過塩素酸で滴定した。これらの滴定の結果は、１ｇの生成物が１゜９７Ｘ１０ −’モルの活性カーボネート（理論量の１０１％）を含有していることを示した 。１．Ｒ，（ＮａＣ１上のフィルム、ｃｍ”’）特性バンド：　１８１２及び１ ７８９（双方ともＣ＝Ｏ，スクシンイミド）；　１７４２　（Ｃ＝Ｏ。

カーボネート）；　１１１４　（ＣＨ２０ＣＨ２）、’コＣ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１ ３）：δ　１６８．５　（ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）；　１５１．３　（０−Ｃｏ□）；７ １゜９（ＣＨ，ＯΩＨ２）７０．２（ＰＥＧ）；　６８．７　（ＣＨ２Ｃ８２０ ＣＯ２）；　６８．０　（ＣＨ２え１■ユ ＢＳＣ−ＰＥＧの調製：実施例１の手順に従い、ホスゲンのトルエン溶液＜５０ ｍ　ｌ　、９６．５ｍｍｏ　１　）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３，８ ｇ、２３ｍｍｏ　ｌ　）及びトリエチルアミン（３，２ｍ　ｌ　、２３ｍｍｏ　 Ｉ　）を順次用いて分子量４６００のポリエチレングリコール（Ｕｎｉｏｎ　Ｃ ａｒｂｉｄｅ、５０ｇ、２１．７ｍｅｑｕｉｖ。

ＯＨ）を対応するビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカーボネートに変換した 。精製後に白色粉末状の生成物（５１ｇ、９６％）が得られた。ベンジルアミン −過塩素酸で滴定して測定した活性カーボネート含量は４．０Ｘ１０−’ｍｏｌ ｅ／ｇ（理論量の９８％）であった、１．Ｒ，（ＮａＣ１上のフィルム、ｃｍ− ’）特性バンド：１８１２及び１７８９（双方ともＣ＝○、スクシンイミド）； １７４２　（Ｃ＝Ｏ，カーボネート）；　１１１４　（ＣＨ２０ＣＨ２）。”Ｃ −ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＞　：δ　１６８．５　（ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）；　１５１．３ 　（０−Ｃｏ、）；７０．２　（ＰＥＧ）；６８．７　（ＣＨ２ＣＨ２０ＣＯ２ ）；　６８．０　（ＣＨ２ＣＨ２０ＣＯ２）　；　２５．２　（ＣＨ２Ｃ＝Ｏ） 　ｐ　ｐ　ｍ、、ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）：δ　４　、３５　（ｍ　、　４　Ｈ 、ＣＨ２０ＣＯｚ　）　；　３　。

５５　（ｓ　、〜４００　Ｈ、Ｐ　Ｅ　Ｇ　）　；　２．７４　（ｓ　、　８　 Ｈ、ＣＨｚポリエチレングリコール−ウシ血清アルブミン複合体くＰＥＧ−ＢＳ Ａ）の調製： Ａ、０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐ　Ｈ７，８中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）（１００ｍｇ）の攪拌溶液（２０ｍｌ）に５Ｃ−ＰＥＧ　（１ｇ＞を添加した 。水酸化ナトリウム（０，５Ｎ）を使用してｐＨ７，８を３０分間維持した。５ ０ｍＭのリン酸Ｍ！衝生理食塩水で透析沢過して余剰の遊離ＰＥＧを除去した。

アミノ基のトリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）滴定［Ｈａｂｅｅｂ、 Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、■４．　３２８〜３３６（１９６６＞）によって測定したＢＳ Ａの修飾度は約５０％（３０）であった。

５Ｃ−ＰＥＧの代わりに５Ｓ−ＰＥＧを用いて同じ条件下に繰り返した実験でも 同じ修飾度が得られた。

Ｂ、０．１Ｍのホウ酸ナトリウムｐ　Ｈ９，２中のＢＳＡ（１００ｍｇ）の攪拌 溶液に、５Ｃ−ＰＥＧ　（Ｉｇ）を添加した。水酸化ナトリウム（０，５Ｎ＞を 使用してｐＨ９，２を３０分間維持した。余剰のＰＥＧを透析ｒ通によって除去 し、生成物の遊離アミノ基の数を検定した。天然ＢＳＡのアミノ基の約６８％（ ４１）が修飾されていた。

Ｃ，０，１Ｍのホウ酸ナトリウム　ＰＨ９，２中のＢＳＡ（１００ｍｇ）の攪拌 溶液に、ＢＳＣ−ＰＥＧ　（１ｇ＞を添加した。水酸化ナトリウム（０，５Ｎ） を使用してｐＨ９，２を３０分間維持した。透析濾過によって余剰の遊離ＰＥＧ を除去し、生成物の遊離アミノ基の数を検定した。

天然ＢＳＡのアミノ基の約８０％（４８）が修飾されていた。生成物をＨＰＬＣ （ゲル濾過）分析すると、ＰＥＧ−ＢＳＡの６５％以上が分子間架橋形であり、 生成物の約３５％が実施例３ＢのＰＥＧ−ＢＳＡと同じ分子量を有していること が判明した。

え１且Ａ ＰＥＧ−グルタミナーゼの調製：０．ＩＭのリン酸ナトリウム　ｐＨ７，８中の グルタミナーゼＰｓｅｕｄｏｍｏ−ｎａｓ　７Ａ（２００ｍｇ）の溶液を、５Ｃ −ＰＥＧ（４，７ｇ）で処理した。溶液を攪拌し、Ｐ　Ｈ７，８を３０分間維持 した。５０ｍＭのＰＢＳを用いた透析Ｆ通によって余剰の遊離ＰＥＧを除去した 。アミノ基のトリニトロベンゼンスルホネート滴定によって測定したグルタミナ ーゼの修飾度は７４％であった（Ｈａｂｅｅｂ、１９６６、前１）、ＰＥＧ−グ ルタミナーゼ生成物は親グルタミナーゼの酵素活性の８１％を維持していた。

Ｋ１■５ ＰＥＧ−）リプシンの調製：１ｍＭのＨＣｌ中の２０ｍＭのＣａＣ１ｚに４℃で 一夜透析したウシ膵臓トリプシンの溶液（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ、２０ｍ１中に１２０ｍｇ）を２５℃にし、ＳＣ−ＰＥＧ（６００ｍｇ）で３ ０分間処理した。０，５ＮのＮａＯＨの自動滴定によつて処理時間中に反応容器 内をｐ　Ｈ７，８に維持した。溶液をｐＨ３まで酸性化し、１ｍＭのＨＣｌ中の ２０ｍＭのＣａＣ１，を置換流体として用い、十分に透析−過して余剰の遊離ポ リマーを除去した。アミノ基のＴＮＢＳ滴定（Ｈａｂｅｅｂ　１９６６）によっ て測定すると、修飾トリプシンは親酵素の遊離アミノ基のほぼ半分を有していた （トリプシン１分子あたり７つのＰＥＧ鎖）、ＰＥＧ−）リプシン生成物は、Ｎ ’−ベンゾイル−し−アルギニンエチルエステルに対して親酵素の酵素活性の９ ６％を維持していた。

Ｋ施贋玉 ＰＥＧ−アルギナーゼのｍ製：　０．ＩＭのＮａＣｌ　（２０ｍｌ）中のウシ肝 臓アルギナーゼ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、９１ｍｇ）の溶液を０．５ＮのＮａＯＨの自 動滴定によってｐＨを８．０に維持しながら２７℃において５Ｃ−ＰＥＧ　（１ ，３ｇ）で処理した。３０分後に、５０ｍＭのＰＢＳを置換流体として用い、反 応混合物を透析濾過しな。天然アルギナーゼのアミン基の約６４％が修飾されて いた（アルギナーゼ１分子あたり５６個のＰＥＧｊｌ）、ｐＨ９，５において２ ，３−ブタンジオン（ＢＵＮ−尿素試薬）で検定すると、ＰＥＧ−アルギナーゼ 生成物は天然酵素の比活性の７０％を°維持していた。

ＬｆＬＺ キモトリプシン、アスパラギナーゼ及びアデノシンデアミナーゼのごときその他 のポリペプチドを本文に記載の手順で５Ｃ−ＰＥＧによって修飾した。

ＰＥＧ及びそのコポリマーのごときＳＣ−及び／またはＢ１０−官能化ポリアル キレンオキシドを使用する方法は、別の修飾ポリペプチドの調製及びアミノ基を 有する別の生物活性成分の調製に全般的に使用され得る。

本発明をＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体に関して説明してきたが、その他 のＮ−ヒドロキシジカルボキシイミドに置換してもよいことは当業者に明らかで あろう、かかる誘導体の代表例は、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキ シグルタルイミド、Ｎ−ヒドロキシテトラヒドロフタルイミド、Ｎ−しドロキシ −５−ノルボルネン−２゜３−ジカルボキシイミドまたはヒドロキシルアミンの その他のＮ−アシル誘導体である。

スキーム２に見られるように、５Ｃ−ＰＥＧを使用したタンパク質修飾の生成物 は、カルバメート（ウレタン）結合を介してポリペプチド骨格にグラフト重合し たＰＥＧ鎖を有する。５Ｓ−ＰＥＧ使用の際に生成されたエステル結合（スキー ム１参照）に比べてウレタン結合の安定性が高いことが、２種類の活性化ＰＥＧ 及び対応するＰＥＧ−タンパク質複合体の主たる違いを証明すると予測されてい た。

我々の研究はこの予測を実際に確認した。図１は各活性化ＰＥＧに由来のＰＥＧ −ＢＳＡ複合体のインキュベーションの結果として生成された遊離ｍＰＥＧの量 をＧＦ−ＨＰＬＣで測定した結果を示す、５Ｃ−ＰＥＧ由来の複合体の安定度が かなり高いことが明らかである。

５Ｃ−ＰＥＧ及び５Ｓ−ＰＥＧの反応性を推定するために、活性化ポリマーのリ ン酸塩バッファ中での加水分解及びＮａ−アセチル−リシン（ＮＡＬ）によるア ミツリシスの速度論的測定を行なった。これらの実験の結果を表１にまとめる。

これらのデータから、５Ｓ−ＰＥＧが５ｃ−ｐＥＧよりも反応性の大きい試薬で あることが明らかである。

加水分解速度の差はアミツリシス速度の差よりも大きい。

従って、５Ｃ−ＰＥＧはより有利なに、、／Ｋｈ比を示した。

５Ｃ−ＰＥＧの加水分解が遅いことは試薬の貯蔵安定性が高いことからも明らか である（図２）。

また、タンパク質のε−アミノ基のモデルとしてＮＡＬを用いて活性化ＰＥＧの 反応性に対するｐ）（の影響を測定した。種々のｐ）ｌで各活性化ＰＥＧを等モ ル量のＮＡＬと反応させ、ＴＮＢＳ−アッセイを用いて未反応ＮＡＬを測定した く図３）、５Ｃ−ＰＥＧに使用すべき最適ｐＨは約９．３であることが知見され た。ＰＥＧ−スクシネートエステルの安定性が小さいので５Ｓ−ＰＥＧにはｐＨ ＞８．０を使用するのは好ましくない。しかしながら、この活性化ＰＥＧは８． ０未満のＰＨでも極めて反応性であることが知見された。

双方の試薬はトリプシンに対して高い反応性を示し、穏やかな条件下（ｐＨ７， ５〜８．５）で３０分以内に同程度に修飾された酵素誘導体を生じた。生成物を 透析濾過によって精製し、Ｓ　ｔ　ｏ　ｃ　ｋ　ｓ他の蛍光測定アッセイ（（１ ９８６）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５４．　２３２）によって修飾度を測定 した。

Ａｚｏｃｏ　ｌ　ｌアッセイ（Ｃｈａｖ　ｉ　ｒａ他（１９８４）Ａｎａｌ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１３６．　４４６）によって測定すると、すべてのＰＥＧ−修飾 トリプシン誘導体ではタンパク質分解活性が実質的に欠失していた（天然物質の く１％）、低分子量基質に対する代表的なｓｓ−及び５ｃ−ＰＥＧ修飾トリプシ ンの比活性を表２にまとめる。修飾は、ベンゾイル−し−アルギニンエチルエス テルに対するエステル分解活性をほとんど変化させなかったが、ｐ−二トロアニ リドに対する活性を増進した。ＺＡＰＡを基質として用い、いくつかのＳＣ−及 び５Ｓ−ＰＥＧ修飾トリプシンのミカエリス−メンテン反応動力学定数を測定し た。

図６にまとめたこれらの結果は、Ｖ　ＩＩＩＩＸ、　Ｋｃｓｔ及びＫｃ、ｔ／に １の値は修飾の程度に伴って次第に増加するが、Ｋ、の値は減少することを示す 。

単純基質に対するトリプシン活性の増進が、酵素上のチロシル残基のアシル化に 起因するという考え方もある（Ｔｒｎｈｏ　１ｍ他（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔ−ｒｙ、８，１７４１；Ｎａｋａｔａ他（１９７２）Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２．　２８１）、ＰＥＧ−トリプシン誘導体についてアシル 化チロシル残基の存在を検査した。

５Ｃ−ＰＥＧ修飾トリプシン誘導体をヒドロキシルアミンで処理してもＵＶスペ クトルは全く変化しなかった。これは５Ｃ−ＰＥＧが酵素のチロシル残基をアシ ル化しながったことを示す、しかしながら、５Ｓ−ＰＥＧ修飾トリプシン誘導体 をＮＨ２ＯＨ処理すると、ＵＶ吸光度の増加（ＤＡｚｔｓ）が終始観察された。

最初は、これらのスペクトル変化がアシル化チロシンの存在の証拠であると解釈 されていた。これらのスペクトル変化をより詳細に検討すると、ＮＨ，ＯＨで誘 発された吸光度増加は、２７５〜２８０ｎｍ（脱アシル化チロシル残基の特性値 ）の近傍ではなくほぼ２６０ｎｍに集中していた。別の実験シリーズでは、ＮＡ Ｌと各々の活性化ＰＥＧとの間の反応におけるＮａ−アセチル−チロシン（ＮＡ Ｔ）の存在は反応アミンの量にほとんど影響を与えなかった（表３）、他方、表 ３の結果は、５Ｃ−ＰＥＧが５Ｓ−ＰＥＧよりもアミンに対してやや選択性であ ることを示す。

５Ｓ−ＰＥＧに比較して５Ｃ−ＰＥＧは反応性がより小さく選択性がより大きい 試薬である。これは、Ｋ　、、／　Ｋｈ比が高い、貯蔵安定性がよい、アミンと の反応中にＮＡＴの干渉が少ない、などによって証明される。５Ｃ−ＰＥＧは穏 やかな条件下で３０分以内にＰＥＧ−タンパク質複合体を生成できる十分な反応 性を有する試薬である。５Ｃ−ＰＥＧは５Ｓ−ＰＥＧよりも広いｐＨ範囲で使用 でき、ｐＨ＝９．３で最大反応性を示す、５Ｃ−ＰＥＧを使用して得られるＰＥ Ｇ−タンパク質複合体は５Ｓ−ＰＥＧ誘導複合体よりも化学的に安定である。双 方の活性化ＰＥＧによって生成されたＰＥＧ−）リプシン複合体は極めて類似し た特性を有する。即ち双方ともに、タンパク質分解活性を示さない、エステル分 解活性を十分に維持している、ｐ−二トロアニリン基質に対する分解活性が劇的 に増加している、などの特性を有する。修飾酵素のミカエリス−メンテン定数は 、トリプシンにＰＥＧが結合すると、ＺＡＰＡの回転率及び修飾酵素に対する親 和性の双方が増加することを示す、アミド分解活性におけるこれらの増加はチロ シル残基のアシル化には無関係であると考えられる。

ｄ　Σ　淋　− 表３ 天然トリプシン及びそのｍＰＥＧ誘導体のアミド分解活性のミカエリス−メンテ ン定数１ トリプシン誘導体　Ｋ、　Ｖ、、、　Ｋｃ、、　Ｋｃ、、／Ｋ。

（ｍＭ）　（ＩＩＮ／ｍ１ｎ）　（＋ｍ１ｎ−’）　（″”−’ｗｉｎ−’）天 然トリプシン　１．０８　１５．７　３７８　３４９ＳＣＰＥＧｈ−トリプシン Ｎ＝７　０．２９　１９．６　４７０　１６２６Ｎ＝９　０．２１　２０．２　 ４８４　２２９ＯＮ＝１２　０．１１　２２．９　５４９　４９７３ＳＳ−ＰＥ Ｇｈ−）リプシン Ｎ＝７　０．２１　１８．６　４４７　２１７２Ｎ　＝　１２　０．１３　２２ ．５　５３９　４１５９′″１．０μｇ／ｍ１の一定のトリプシンタンパク質濃 度で３７℃で測定した（Ｂｉｕｒｅｔアッセイ使用）、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ 　ｐＨ７，８，１０ｍＭ塩化カルシウム中の０．０２〜１．７１ｍＭの濃度のＮ α−カルボベンゾキシ−し−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン（ＡＺＰＡ）を基 質として使用した。

ｐ−ニトロアニリン出現の初速度のラインライ−パーパークプロットから定数を 計算した（ε＜ｔｏ＝８８００Ｍ−’ａｍ−’）。

表４ ＳＳ−ＰＥＧ及び５Ｃ−ＰＥＧとＮａ−Ａｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ＮＡＬ）との反応度 に対するＮａ−Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ　（ＮＡＴ）の効果 ＮＡＬとの反応％１ １トリエタノールアミン−ボレートバッファ（０，３ＭｐＨ８，１）に、以下の 物質二同じバッファ中のＮＡＬ（５０ｍＭ、０．１ｍ１）の溶液及びＮＡＴ（１ ００ｍＭ、表に与えた割合に対応しＮＡＴ＋ＮＡＬが１．１ｍｌになる量）の溶 液；最後にＣＨ３ＣＮ中の適当な活性化ＰＥＧ（５０ｍＭの活性アシル、０．１ ｍ１）を添加した。得られた溶液を渦動させ、２８℃で１時間インキュベートし た。

５Ｘ−ＰＥＧを除いた同じ成分の混合物を対照として使用した。５ｎｙｄｅｒ他 （（１９７５）Ａｎａｌ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、６４．　２８４）のＴＮＢＳアッ セイの修正方法を使用して未反応ＮＡＬを測定した。

５括弧内の数値は、ＮＡＬ反応の％を、ＮＡＴ／ＮＡＬ＝ＯのときのＮＡＬ反応 の％によって除算した値を示す。

Ｆｉｇぼｅｌ ＰＥＧ−ＢＳＡ複合体からのｍＰＥＧの遊離３７°Ｃでのインキュベーション時 間 活性アシル含量（初期値の％） 反応ＮＡＬの％ 国際調査報告 −１−−＾峠−ａＩ馴Ｎ・　ｔｌ＋”〒／＋ｌ＜ｏｎ／ｎｔ＋ｔｔｐｒＴ／ＵＳ ９０１０２１３’１

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１はＨ−、Ｈ３Ｃ−、Ｎ−ジカルボキシイミド基またはその他の任意 の官能基であり； Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々は、直鎖状、分枝状、ジ置換または未置換のアルキル 基であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々は互いに同じ基でもよくまたは夫々に異な る基でもよく；Ｒ５はＮ−ジカルボキシイミド基であり；及びａは１〜１０００ の整数、ｂ及びｃは夫々０〜１０００の整数であり、ａとｂとｃとの和が１０〜 １０００である〕で示される構造を有する化合物。
2. ２．Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々が、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨＣＨ３またはＣＨ ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
3. ３．Ｒ１及びＲ５の各々が、Ｎ−スクシンイミド、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−グル タルイミド、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド及びＮ−ノルボルネン−２，３−ジ カルボキシイミドから成るグループから選択されたＮ−ジカルボキシイミド基で あり、Ｒ１及びＲ５が同じ基であっても異なる基であってもよいことを特徴とす る請求項１に記載の化合物。
4. ４．Ｒ５がＮ−スクシンイミド基であることを特徴とする請求項３に記載の化合 物。
5. ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１はＨ３Ｃ−、Ｈ−、Ｎ−ジカルボキシイミド基またはその他の任意 の官能基；ａは１０〜１０００の整数である〕で示される構造を有する請求項１ に記載の化合物。
6. ６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ａは１０〜１０００の整数である〕で示される構造を有する請求項１に 記載の化合物。
7. ７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１はＨ−、Ｈ３Ｃ−、Ｎ−ジカルボキシイミド基またはその他の任意 の官能基であり； Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々は直鎖状、分枝状、ジ置換または未置換のアルキル基 であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々は互いに同じ基でもよく夫々に異なる基でも よく；Ｘはハロゲンであり； ａは１〜１０００の整数、ｂ及びｃは夫々０〜１０００の整数であり、ａとｂと ｃとの和が１０〜１０００である〕で示される構造を有する化合物と、Ｎ−ヒド ロキシジカルボキシイミドとを塩基の存在下に反応させることを特徴とする請求 項１に記載の化合物の製造方法。
8. ８．Ｎ−ヒドロキシジカルボキシイミドがＮ−ヒドロキシスクシンイミドである ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. ９．ハロゲンが塩素であり、塩基がトリエチルアミンであることを特徴とする請 求項７に記載の方法。
10. １０．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１はＨ−、Ｈ３Ｃ−またはＮ−ジカルボキシイミド基またはその他の 任意の官能基であり；Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々は直鎖状、分枝状、置換または 未置換のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の各々は互いに同じ基でもよく または異なる基でもよく；ａは１〜１０００の整数、ｂ及びｃは夫々０〜１００ ０の整数であり、ａとｂとｃとの和が１０〜１０００である〕で示される構造を 有する少なくとも１種のポリマーと結合したポリペプチドを含み、各ポリマーが ウレタン結合によってポリペプチドのアミン基に共有結合していることを特徴と する修飾ポリペプチド。
11. １１．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ポリペプチドで示される構造を有する請求項 １に記載の修飾ポリペプチド。
12. １２．ポリペプチドがウシ血清アルブミン、グルタミナーゼ、トリプシン、アル ギナーゼ、キモトリプシン、アスパラギナーゼまたはアデノシンデアミナーゼで あることを特徴とする請求項１２に記載の修飾ポリペプチド。
13. １３．約５．８〜１１のｐＨでポリペプチドを請求項１の化合物と反応させるこ とを特徴とする修飾ポリペプチドの製造方法。
14. １４．ｐＨが約９．３であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。