JP2875884B2 - ポリペプチドの修飾に使用するための活性ポリアルキレンオキシドカーボネート - Google Patents

ポリペプチドの修飾に使用するための活性ポリアルキレンオキシドカーボネート

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は1989年４月19日出願の米国特許出願第340,92
8号の一部継続出願であり、該特許出願の記載内容は本
出願の明細書に含まれるものとする。
発明の背景 本発明は、Davis他の米国特許第4,179,337号に開示さ
れているような、ポリペプチド分子とポリアルキレンオ
キシドのストランドとの共有結合によるポリペプチドの
化学的修飾に係る。Abuchowski ＆ Davisの「Enzymes a
s Drugs」、Holcenberg ＆ Roberts,eds.,pp.367〜383,
John Wiley ＆ Sons,N.Y.（1981）は、かかるポリペプ
チド調製物が親ポリペプチドに比較して免疫原性及び抗
原性が少なく血流中の寿命が長いことを開示している。
修飾ポリペプチドはこのような有利な特性を有するので
酵素療法などの種々の治療的用途で極めて有用である。
ポリマーを後でタンパク質に結合させるために、ポリ
アルキレンオキシドに導入される活性基は以下の要件を
満たす必要がある： 1.活性基は穏やかな条件下に高速でタンパク質と反応し
得るのに十分な反応性を有していなければならない； 2.修飾過程で活性基から遊離される残基は無毒性であり
及び／またはタンパク質−ポリマー付加化合物から分離
容易でなければならない。
ポリエチレングリコール（PEG）をタンパク質に共有
結合させるためには、まず、ポリマーのヒドロキシル末
端基を反応性官能基に変換する必要がある。普通はこの
過程を「活性化」と呼び、生成物を「活性化PEG」と呼
ぶ。ほとんどの場合、タンパク質分子のアミンに反応性
の官能基によって一端がキャップされたメトキシポリエ
チレングリコール（mPEG）誘導体が使用される。
治療用酵素の調製のためにこれまで使用されている最
も普及した形態の活性化PEGはポリ（エチレングリコー
ル）スクシノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（SS−PEG）〔Abuchowski他,Cancer Biochem,Bioph
ys.7,175〜186（1984），スキーム１〕である。この活
性化ポリマーは前述の２つの要件を満たす。しかしなが
ら、重大な欠点が１つある。ポリマーとコハク酸残基と
の間のエステル結合が水性媒体中で十分な安定性を有し
ていないことである〔Iwasaki他の米国特許第4,670,417
号（1987）;Ulbrich他,Makromol.Chem.187,1131〜1144
（1986）〕。
スキーム1:SS−PEGを活性形態ポリマーとして用いた従
来手順によるタンパク質とPEGとの結合 種々の官能化ポリエチレングリコール（PEG）は、タ
ンパク質修飾（Abuchowski ＆ Davis,1981,前出）、ペ
プチド化学〔Zalipsky他,Int.J.Peptide Protein Res.,
30,740〜783（1987）〕及び生物活性物質との複合体の
調製〔Zalipsky他,Eur,Polym.J.19,1177〜1183（1983）
及びZalipsky ＆ Barany,Polymer Preprints,Am.Chem.S
oc.Div.Polym.Chem.27(1),1〜２（1986）〕、などの分
野で有効に使用されてきた。医薬として使用されるとき
のPEGタンパク質複合体は、特に、タンパク質分解消化
に対する安定性がよい、免疫応答が少ない、血流中の半
減期が長い、などの利点を有すると期待されている。
従来技術ではこのような複合体を得るために、PEGの
ヒドロキシ基を塩化シアヌルで活性化し、次いで、得ら
れた化合物をタンパク質と結合させた（Abuchowski他
（1977）,J.Biol,Chem.252,3578;Abuchowski ＆ Davis,
1981,前出）。しかしながら、この方法には、塩化シア
ヌルが有毒である、遊離必須システインまたはチロシン
残基のようなアミン以外の官能基を有するタンパク質に
対して非特異的反応性を有する、などの種々の欠点があ
る。
上記の欠点及びその他の欠点を克服するために、別の
手順では、PEGのスクシニミジルスクシネート誘導体（S
S−PEG）を導入した（Abuchowski他,1984,前出、スキー
ム１、前出）。該誘導体は穏やかな条件下にタンパク質
と迅速に（30分）反応し、十分に修飾された活性複合体
を生成する。この活性化ポリマーの使用には重大な欠点
が１つある。ポリマーとコハク酸残基の間のエステル結
合が水性媒体中で十分な安定性を有していないことであ
る〔Iwasaki他の米国特許第4,670,417号、及び、Ulbric
h他、Makromol Chem.,187,1131〜1144（1986）〕。
タンパク質のアミノ基とPEGとの間のウレタン結合の
形成は、ポリマー鎖の加水分解損の問題を解決する〔Ve
ronese他,Appl.Biochem.Biotechnol.11,141〜152（198
5）〕。ウレタン結合が種々の生理学的条件下で完全に
安定であることは、放射性標識されたPEG誘導体で実際
に証明された〔Larwood ＆ Szoka J.,Labeled Compound
s Raiopharm.,21,603〜614（1984）〕。カルボニルジイ
ミダゾール活性化PEGを使用するとカルバメート誘導体
を介してPEGがタンパク質に結合した〔Beauchamp他,Ana
lyt.Biochem.131,25〜33（1983）〕。しかしながら、こ
の種の活性化ポリマーは、反応性が強くはないので十分
な修飾を行なうまでに長い反応時間（pH8.5で48〜72時
間）を要する。結局、カルボニルジイミダゾール活性化
物質は前述の第１の要件を明らかに満たしていない。こ
の方法の更に別の欠点は、カルボニルジイミダゾールが
比較的高価なことである。
ウレタン結合したPEG−タンパク質を調製するためにP
EG−フェニルカーボネート誘導体を使用することも報告
されている〔Veronese他（1985），前出〕。この方法の
重要な欠点は、疎水性フェノール残基（ｐ−ニトロフェ
ノールまたは2,4,5−トリクロロフェノール）が有毒で
あり、また、タンパク質に親和性を有することである。
この方法は明らかに前述の第２の要件を満たしていな
い。
ポリマーの各活性化形態の諸特性は、使用される系次
第で有利になったり不利になったりすると考えらる。PE
G−ポリペプチドが多くの用途を有することを考慮する
と、特定の目的に使用すべく作製されたタンパク質修飾
PEG試薬の範囲を拡大することが望ましい。
発明の概要 本発明は、式： 〔式中、R1はＨ−、H3C−、オキシカルボニル−Ｎ−ジ
カルボキシイミド基またはその他の任意の官能基であ
り； R2、R3及びR4の各々は、直鎖状、分枝状、ジ置換また
は未置換のアルキル基であり、R2、R3及びR4の各々は互
いに同じ基を示してもよくまたは夫々に異なる基を示し
てもよく； R5はＮ−ジカルボキシイミド基であり；及び ａは１〜1000の整数、ｂ及びｃの各々は０〜1000の整
数であり、ａとｂとｃとの和が10〜1000である〕で示さ
れる構造を有する化合物を提供する。
本発明はまた、式： 〔式中、R1はＨ−、H3C−、またはその他の任意の官能
基であり； R2、R3及びR4の各々は、直鎖状、分枝状、ジ置換また
は未置換のアルキル基であり、R2、R3及びR4の各々は互
いに同じ基を示してもよくまたは夫々に異なる基を示し
てもよく； Ｘはハロゲンであり； ａは１〜1000の整数、ｂ及びｃの各々は０〜1000の整
数であり、ａとｂとｃとの和が10〜1000である〕で示さ
れる構造を有する化合物と、Ｎ−ヒドロキシジカルボキ
シイミドとを塩基の存在下に反応させる化合物の製造方
法を提供する。
本発明は更に、式： 〔式中、R1はＨ−、H3C−、オキシカルボニル−Ｎ−ジ
カルボキシイミドまたはその他の任意の官能基であり； R2、R3及びR4の各々は、直鎖状、分枝状、置換または
未置換のアルキル基であり、R2、R3及びR4の各々は互い
に同じ基を示してもよくまたは夫々に異なる基を示して
もよく； ａは１〜1000の整数、ｂ及びｃの各々は０〜1000の整
数であり、ａとｂとｃとの和が10〜1000である〕で示さ
れる構造を有する少なくとも１種のポリマーと結合した
ポリペプチドを含み、各ポリマーがウレタン結合によっ
てポリペプチドのアミン基に共有結合していることを特
徴とする修飾ポリペプチドを提供する。
本発明は更に、約5.8〜11のpH範囲でポリペプチドを
化合物と反応させる修飾ポリペプチドの製造方法を提供
する。
図面の簡単な説明 図1.PEG−BSA複合体からのmPEGの遊離 実験条件：双方のタイプのPEG−BSA複合体（−61％の修
飾度）の濃度4mg/ml（Bluretアッセイ）の溶液を適当な
バッファ中でインキュベートした。所与の時間間隔毎に
これらの溶液のアリコートをZorbax GF−450カラム及び
RI−デテクタを備えたHPLCに注入してmPEG−5000を定量
した。
図2.22℃でのSS−PEG及びSC−PEGの安定性 実験条件：微粉形態の活性化PEGを密閉ポリプロピレン
容器に保存した。所与の時間間隔毎に各ポリマーのサン
プルの活性アシル含量を検定した。
図3.活性化PEGの反応性に対するpHの影響 実験条件：適当なpHのトリエタノールアミンボレートバ
ッフア（0.3M、1ml）に、水中のNALの貯蔵溶液（50mM、
0.1ml）及びCH3CN中の適当な活性化PEGの貯蔵溶液（活
性アシル50mM、0.1ml）を順次添加した。得られた溶液
を渦動させ、28℃で１時間インキュベートした。SX−PE
Gを除いた同じ成分の混合物を対照として使用した。Sny
der他〔（1975）Anal.Biochem.64,284〕のTNBSアッセイ
の修正方法で未反応NALを定量した。
詳細な説明 本発明は、一般式： 〔式中、R1はＨ−、H3C−、オキシカルボニル−Ｎ−ジ
カルボキシイミド基またはその他の任意の官能基であ
り；R2、R3及びR4の各々は、直鎖状、分枝状、ジ置換ま
たは未置換のアルキル基であり、R2、R3及びR4の各々は
互いに同じ基を示してもよくまたは夫々に異なる基を示
してもよく；R5はＮ−ジカルボキシイミド基であり;aは
１〜1000の整数、ｂ及びｃの各々は０〜1000の整数であ
り、ａとｂとｃとの和が10〜1000である〕で示される構
造を有する活性化ポリアルキレンオキシドを記載する。
より詳細には本発明は、新規な活性化PEG、即ちポリ
（エチレングリコール）−スクシンイミジルカーボネー
ト（SS−PEG）、及び、PEGの二官能誘導体、即ちポリエ
チレングリコール−ビス−スクシンイミジルカーボネー
ト（BSC−PEG）の製造及び使用に係る。更に、PEGのヘ
テロ二官能誘導体も可能である（Zalipsky ＆ Barany、
前出）；これは、一方の末端基がスクシンイミジルカー
ボネートであり、他方の末端基（R1、スキーム２、後
出）が遊離カルボキシル基またはアミンのような異なる
反応性官能基を含む。これらの物質は、安定なウレタン
結合を介してPEGと結合するタンパク質のアミノ基と容
易に反応する（スキーム２、後出）。新規な物質SC−PE
G及びBSC−PEGの反応性は、従来から使用されているSS
−PEGに匹敵する。即ち、穏やかな条件下（pH5.8〜11、
好ましくはpH7.0〜9.5の水性バッファ中）で適度な温度
（４〜40℃）で約30〜60分間以内に高い修飾度が達成さ
れる。更に、これらの物質は種々の有機溶媒に可溶であ
り、従って低分子量の部分保護されたペプチド及びその
他の生物学的に有用なリガンドとの結合において有用且
つ重要である。
PEGは特定の分子量を有する必要はないが、好ましく
は500〜40,000、より好ましくは2,000〜20,000の範囲の
分子量を有する。PEGの分子量は、使用される特定タン
パク質の性質、例えば修飾に利用できるアミノ基の数に
基づいて選択される。
タンパク質修飾中に遊離されるＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドは、特に生物活性タンパク質付加化合物を製造
するためにタンパク質化学でしばしば使用される無毒性
物質である。前記のカルボニルジイミダゾールで活性化
したPEG及びPEG−フェニルカーボネートの場合と同様
に、SC−PEGまたはBSC−PEGを使用したタンパク質の修
飾産物は、カルバメート（ウレタン）結合を介してポリ
ペプチド骨格にグラフト重合したPEG−鎖を有する。し
かしながら、新規な物質はより高い反応性を有するの
で、より短時間でより高い修飾度が達成される。スクシ
ンイミドカーボネートで活性化したPEGの付加的な利点
は、タンパク質のアミノ基と反応しない活性官能基が速
やかに水性加水分解されてＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドと二酸化炭素とヒドロキシ末端をもつPEGとを生成す
ることである。これは、二官能PEG誘導体（BSC−PEG）
の場合に特に重要である。これらの物質は同時に２つの
目的、即ちPEG化及び架橋を果たし得る。BSC−PEGは任
意のホモ二官能物質と同様に、異なる２つのタンパク質
を架橋させるために使用できる。BSC−PEG分子が唯一つ
の末端基を介してタンパク質と反応するとき、アミンと
反応しないポリマーの他方のSC−基は加水分解され、従
ってPEG−タンパク質複合体に（潜在的に抗原性の）外
来残基が導入されない。
SC−PEG及びBSC−PEGで修飾されたタンパク質の生物
活性は以後の実施例に示すようにかなりの程度まで保持
される。ウレタン結合を介してPEGと共有結合したタン
パク質（組織プラスミノーゲン活性化因子）がSS−PEG
によってほぼ同程度まで修飾された同じタンパク質より
も高度な比活性を有することを示した先行文献が存在す
る〔Berger ＆ Pizzo,Blood,71,1641〜1647（198
8）〕。
スキーム2:PEGをタンパク質に結合させるためのSC−PEG
及びBSC−PEGの使用 勿論、SC−活性化したPEG−誘導体の利用は、低分子
量ペプチド及び遊離アミノ基を含有するその他の物質の
PEG複合体の製造にまで拡張できる。
SC−基をPEGに導入するためのワンポット手順を開発
した（スキーム３、後出）。まず、ポリマー（PEG）を
ホスゲンで処理してポリエチレングリコールクロロホル
メートをin situで生成した。次いで、得られたクロロ
ホルメートをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）及
びトリエチルアミン（TEA）と順次反応させ、所望の活
性化PEG誘導体を得た。活性化ポリマー調製物を低分子
量物質から精製し、理論量の活性基を含有することを確
認した。
スキーム3:ポリ（エチレングリコール）のＮ−スクシン
イミドカーボネート誘導体の合成 実施例１ SC−PEGの調製：分子量5000のメトキシポリエチレング
リコール（Union Carbide,60g,12mmol）をトルエン／ジ
クロロメタン（3:1、200ml）に溶解し、ホスゲンのトル
エン溶液（30ml、57mmol）で一夜処理した。溶液を蒸発
乾固し、残留ホスゲンを真空下に除去した。残渣をトル
エン／ジクロロメタン（2:1、150ml）に再溶解し、固体
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（2.1g、18mmol）及びト
リエチルアミン（1.7ml、12mmol）で順次処理した。３
時間後、溶液を過して蒸発乾固した。残渣を温（50
℃）酢酸エチル（600ml）に溶解し、微量不溶物を別
し、ポリマーが沈殿し易いように冷却した。生成物を
過によって収集し、次いで、酢酸エチルから再度再結晶
させた。生成物をin vacuoでP2O5によって乾燥した。
収量は52.5gであった（理論量の85％）。
生成物の活性カーボネート含量を測定するために、ポ
リマーのサンプルをジクロロメタン中の測定量のベンジ
ルアミンと反応させ、余剰のアミンをジオキサン中の過
塩素酸で滴定した。これらの滴定の結果は、1gの生成物
が1.97×10-4モルの活性カーボネート（理論量の101
％）を含有していることを示した。I.R.（NaCl上のフィ
ルム，cm-1）特性バンド:1812及び1789（双方ともＣ＝
O,スクシンイミド）;1742（Ｃ＝O,カーボネート）;1114
（CH2OCH2）。13C−NMR（CDCl3）：δ 168.5（CH2 C＝
Ｏ）;151.3（Ｏ−CO2）;71.9（CH3OCH2）70.2（PEG）;6
8.7（CH2CH2OCO2）;68.0（CH2 CH2OCO2）;58.9（CH3O）;
25.2（CH2C＝Ｏ）ppm。
実施例２ BSC−PEGの調製：実施例１の手順に従い、ホスゲンのト
ルエン溶液（50ml、96.5mmol）及びＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（3.8g、23mmol）及びトリエチルアミン（3.
2ml、23mmol）を順次用いて分子量4600のポリエチレン
グリコール（Union Carbide、50g、21.7mequiv.OH）を
対応するビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカーボネ
ートに変換した。精製後に白色粉末状の生成物（51g、9
6％）が得られた。ベンジルアミン−過塩素酸で滴定し
て測定した活性カーボネート含量は4.0×10-4mole/g
（理論量の98％）であった。I.R.（NaCl上のフィルム，
cm-1）特性バンド:1812及び1789（双方ともＣ＝O,スク
シンイミド）;1742（Ｃ＝O,カーボネート）;1114（CH2O
CH2）。13C−NMR（CDCl3）：δ 168.5（CH2 C＝Ｏ）;15
1.3（Ｏ−CO2）;70.2（PEG）;68.7（CH2CH2OCO2）;68.0
（CH2 CH2OCO2）;25.2（CH2C＝Ｏ）ppm。Ｈ−NMR（CDC
l3）；δ 4.35（m,4H,CH2OCO2）;3.55（s,〜400H,PE
G）;2.74（s,8H,CH2C＝Ｏ）ppm。
実施例３ ポリエチレングリコール−ウシ血清アルブミン複合体
（PEG−BSA）の調製： A.0.1Mのリン酸ナトリウムpH7.8中のウシ血清アルブミ
ン（BSA）（100mg）の攪拌溶液（20ml）にSC−PEG（1
g）を添加した。水酸化ナトリウム（0.5N）を使用してp
H7.8を30分間維持した。50mMのリン酸緩衝生理食塩水で
透析過して余剰の遊離PEGを除去した。アミノ基のト
リニトロベンゼンスルホネート（TNBS）滴定〔Habeeb,A
nalyt.Biochem.14,328〜336（1966）〕によって測定し
たBSAの修飾度は約50％（SC−PEGと反応性であるBSAの
全60のアミノ基の内30）であった。
SC−PEGの代わりにSS−PEGを用いて同じ条件下に繰り
返した実験でも同じ修飾度が得られた。
B.0.1Mのホウ酸ナトリウムpH9.2中のBSA（100mg）の攪
拌溶液に、SC−PEG（1g）を添加した。水酸化ナトリウ
ム（0.5N）を使用してpH9.2を30分間維持した。余剰のP
EGを透析過によって除去し、生成物の遊離アミノ基の
数を検定した。天然BSAのアミノ基の約68％（41）が修
飾されていた。
C.0.1Mのホウ酸ナトリウムpH9.2中のBSA（100mg）の攪
拌溶液に、BSC−PEG（1g）を添加した。水酸化ナトリウ
ム（0.5N）を使用してpH9.2を30分間維持した。透析
過によって余剰の遊離PEGを除去し、生成物の遊離アミ
ノ基の数を検定した。天然BSAのアミノ基の約80％（4
8）が修飾されていた。生成物をHPLC（ゲル過）分析
すると、PEG−BSAの65％以上が分子間架橋形であり、生
成物の約35％が実施例3BのPEG−BSAと同じ分子量を有し
ていることが判明した。
実施例４ PEG−グルタミナーゼの調製:0.1Mのリン酸ナトリウムpH
7.8中のグルタミナーゼPseudomo−nas 7A（200mg）の
溶液を、SC−PEG（4.7g）で処理した。溶液を攪拌し、p
H7.8を30分間維持した。50mMのPBSを用いた透析過に
よって余剰の遊離PEGを除去した。アミノ基のトリニト
ロベンゼンスルホネート滴定によって測定したグルタミ
ナーゼの修飾度は74％であった（Habeeb、1966、前
出）。PEG−グルタミナーゼ生成物は親グルタミナーゼ
の酵素活性の81％を維持していた。
実施例５ PEG−トリプシンの調製:1mMのHC1中の20mMのCaCl2に４
℃で一夜透析したウシ膵臓トリプシンの溶液（Boeringe
r−Mannheim、20ml中に120mg）を25℃にし、SC−PEG（6
00mg）で30分間処理した。0.5NのHaOHの自動滴定によっ
て処理時間中に反応容器内をpH7.8に維持した。溶液をp
H3まで酸性化し、1mMのHCl中の20mMのCaCl2を置換流体
として用い、十分に透析過して余剰の遊離ポリマーを
除去した。アミノ基のTNBS滴定（Habeeb 1966）によっ
て測定すると、修飾トリプシンは親酵素の遊離アミノ基
のほぼ半分を有していた（トリプシン１分子あたり７つ
のPEG鎖）。PEG−トリプシン生成物は、Ｎα−ベンゾイ
ル−Ｌ−アルギニンエチルエステルに対して親酵素の酵
素活性の96％を維持していた。
実施例６ PEG−アルギナーゼの調製:0.1MのNaCl（20ml）中のウシ
肝臓アルギナーゼ（Sigma、91mg）の溶液を0.5NのNaOH
の自動滴定によってpHを8.0に維持しながら27℃におい
てSC−PEG（1.3g）で処理した。30分後に、50mMのPBSを
置換流体として用い、反応混合物を透析過した。天然
アルギナーゼのアミノ基の約64％が修飾されていた（ア
ルギナーゼ１分子あたり56個のPEG鎖）。pH9.5において
2,3−ブタンジオン（BUN−尿素試薬）で検定すると、PE
G−アルギナーゼ生成物は天然酵素の比活性の70％を維
持していた。
実施例７ キモトリプシン、アスパラギナーゼ及びアデノシンデ
アミナーゼのごときその他のポリペプチドを本文に記載
の手順でSC−PEGによって修飾した。
PEG及びそのコポリマーのごときSC−及び／またはBSC
−官能化ポリアルキレンオキシドを使用する方法は、別
の修飾ポリペプチドの調製及びアミノ基を有する別の生
物活性成分の調製に全般的に使用され得る。
本発明をＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体に関し
て説明してきたが、その他のＮ−ヒドロキシジカルボキ
シイミドに置換してもよいことは当業者に明らかであろ
う。かかる誘導体の代表例は、Ｎ−ヒドロキシフタルイ
ミド、Ｎ−ヒドロキシグルタルイミド、Ｎ−ヒドロキシ
テトラヒドロフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノル
ボルネン−2,3−ジカルボキシイミドまたはヒドロキシ
ルアミンのその他のＮ−ジ置換誘導体である。
実施例８（SC−PEGとSS−PEGの比較） A.スキーム２に見られるように、SC−PEGを使用したタ
ンパク質修飾の生成物は、カルバメート（ウレタン）結
合を介してポリペプチド骨格にグラフト重合したPEG鎖
を有する。SS−PEG使用の際に生成されたエステル結合
（スキーム１参照）に比べてウレタン結合の安定性が高
いことが、２種類の活性化PEG及び対応するPEG−タンパ
ク質複合体の主たる違いを証明すると予測されていた。
我々の研究はこの予測を実際に確認した。図１は各活性
化PEGに由来のPEG−BSA複合体のインキュベーションの
結果として生成された遊離mPEGの量をGF−HPLCで測定し
た結果を示す。SC−PEG由来の複合体の安定度がかなり
高いことが明らかである。
B.SC−PEG及びSS−PEGの反応性を推定するために、活性
化ポリマーのリン酸塩バッファ中での加水分解及びＮα
−アセチル−リシン（NAL）によるアミノリシスの速度
論的測定を行なった。これらの実験の結果を表１にまと
める。これらのデータから、SS−PEGがSC−PEGよりも反
応性の大きい試薬であることが明らかである。加水分解
速度の差はアミノリシス速度の差よりも大きい。従っ
て、SC−PEGはより有利なKam／Kh比を示した。SC−PEG
の加水分解が遅いことは試薬の貯蔵安定性が高いことか
らも明らかである（図２）。
C.タンパク質のε−アミノ基のモデルとしてNALを用い
て活性化PEGの反応性に対するpHの影響を測定した。種
々のpHで各活性化PEGを等モル量のNALと反応させ、TNBS
−アッセイを用いて未反応NALを測定した（図３）。SC
−PEGに使用すべき最適pHは約9.3であることが知見され
た。PEG−スクシネートエステルの安定性が小さいのでS
S−PEGにはpH＞8.0を使用するのは好ましくない。しか
しながら、この活性化PEGは8.0未満のpHでも極めて反応
性であることが知見された。
D.双方の試薬はトリプシンに対して高い反応性を示し、
穏やかな条件下（pH7.5〜8.5）で30分以内に同程度に修
飾された酵素誘導体を生じた。生成物を透析過によっ
て精製し、Stocks他の蛍光測定アッセイ〔（1986）Ana
l.Biochem.154,232〕によって修飾度を測定した。
Azocollアッセイ〔Chavira他（1984）Anal.Biochem.1
36,446〕によって測定すると、すべてのPEG−修飾トリ
プシン誘導体ではタンパク質分解活性が実質的に欠失し
ていた（天然物質の＜１％）。低分子量基質に対する代
表的なSS−及びSC−PEG修飾トリプシンの比活性を表２
にまとめる。修飾は、ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチ
ルエステルに対するエステル分解活性をほとんど変化さ
せなかったが、ｐ−ニトロアニリドに対する活性を増進
した。ZAPAを基質として用い、いくつかのSC−及びSS−
PEG修飾トリプシンのミカエリス−メンテン反応動力学
定数を測定した。表３にまとめたこれらの結果は、
Vmax、Kcat及びKcat／Kmの値は修飾の程度に伴って次第
に増加するが、Kmの値は減少することを示す。
SS−PEGに比較してSC−PEGは反応性がより小さく選択
性がより大きい試薬である。これは、Kam／Kh比が高
く、貯蔵安定性がよいことによって証明される。SC−PE
Gは穏やかな条件下で30分以内にPEG−タンパク質複合体
を生成できる十分な反応性を有する試薬である。SC−PE
GはSS−PEGよりも広いpH範囲で使用でき、pH＝9.3で最
大反応性を示す。SC−PEGを使用して得られるPEG−タン
パク質複合体はSS−PEG誘導複合体よりも化学的に安定
である。双方の活性化PEGによって生成されたPEG−トリ
プシン複合体は極めて類似した特性を有する。即ち双方
ともに、タンパク質分解活性を示さない、エステル分解
活性を十分に維持している、ｐ−ニトロアニリン基質に
対する分解活性が劇的に増加している、などの特性を有
する。修飾酵素のミカエリス−メンテン定数は、トリプ
シンにPEGが結合すると、ZAPAの回転率及び修飾酵素に
対する親和性の双方が増加することを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 17/08 Ａ６１Ｋ 37/54 Ｃ１２Ｎ 11/08 37/547 (56)参考文献 特開 昭63−304000（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−240521（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−61484（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−150061（ＪＰ，Ａ) 米国特許4248786（ＵＳ，Ａ) 米国特許4891430（ＵＳ，Ａ) 米国特許5122614（ＵＳ，Ａ) 欧州公開149520（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C08G 65/00 - 65/32 A61K 37/00 - 37/547 ＣＡＳ ＯＮＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の式： R1−(O-R2)a−(O-R3)b−(O-R4)c−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−R
    5 〔式中、R1はＨ−，H3C−、又は、カルボニル−オキシ
    −Ｎ−ジカルボキシイミド基であり； R2，R3及びR4は独立して直鎖及び分枝鎖アルキル基から
    成る群から選択され； R5はＮ−ジカルボキシイミド基であり； ａは１〜1,000の整数であり；及び ｂ及びｃは独立して０又は１〜1,000の整数である〕 で示される構造を有する、ポリアルキレンオキシド。
  2. 【請求項２】R2，R3及びR4は独立して、−CH2CH2−，−
    CH2CH(CH3)−、及び−CH2CH2CH2−から成る群から選択
    される、請求項１に記載のポリアルキレンオキシド。
  3. 【請求項３】R1がカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキ
    シイミド基であり、R5がＮ−ジカルボキシイミド基であ
    って、R1のＮ−ジカルボキシイミドとR5が独立して、Ｎ
    −スクシンイミド、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−グルタルイ
    ミド、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、及びＮ−ノルボ
    ルネン−2,3−ジカルボキシイミドから成る群から選択
    される、請求項１に記載のポリアルキレンオキシド。
  4. 【請求項４】R5がＮ−スクシンイミド基である、請求項
    ３に記載のポリアルキレンオキシド。
  5. 【請求項５】以下の式： 〔式中、R1はH3C−であり、ａは上記式のポリアルキレ
    ンオキシドの分子量が20,000未満となる様に選択される
    整数である〕 で示される構造を有する、請求項１に記載のポリアルキ
    レンオキシド。
  6. 【請求項６】以下の式： 〔式中、ａは上記式のポリアルキレンオキシドの分子量
    が20,000未満となる様に選択される整数である〕 で示される構造を有する、請求項１に記載のポリアルキ
    レンオキシド。
  7. 【請求項７】以下の式： 〔式中、ａは10〜1,000の整数である〕 で示される構造を有するポリアルキレンオキシド。
  8. 【請求項８】20,000未満の分子量を有し、且つ、以下の
    式： R1−(O-R2)a−(O-R3)b−(O-R4)c−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−R
    5 〔式中、R1はＨ−，H3C、又は、カルボニル−オキシ−
    Ｎ−ジカルボキシイミド基であり； R2，R3及びR4は独立して直鎖及び分枝鎖アルキル基から
    成る群から選択され； R5はＮ−ジカルボキシイミド基であり； ａは１〜1,000の整数であり；及び ｂ及びｃは独立して０又は１〜1,000の整数である〕 で示される構造を有するポリアルキレンオキシドの製造
    方法であって、 20,000未満の分子量を有し、且つ、以下の式： R1−(O-R2)a−(O-R3)b−(O-R4)c−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ 〔式中、R1はＨ−，H3C−、又は、カルボニル−オキシ
    −Ｎ−ジカルボキシイミド基であり； R2，R3及びR4は独立して直鎖及び分枝鎖アルキル基から
    成る群から選択され； ａは１〜1,000の整数であり； ｂ及びｃは独立して０又は１〜1,000の整数であり；及
    び Ｘはハロゲンである〕 で示される構造を有する化合物を、塩基の存在下で、Ｎ
    −ヒドロキシジカルボキシイミドと反応させることを含
    んで成る方法。
  9. 【請求項９】以下の式： R1−(O-R2)a−(O-R3)b−(O-R4)c−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−R
    5 〔式中、R1はカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイ
    ミド基であり； R2，R3及びR4は独立して直鎖及び分枝鎖アルキル基から
    成る群から選択され； R5はＮ−ジカルボキシイミド基であり； ａは１〜1,000の整数であり；及び ｂ及びｃは独立して０又は１〜1,000の整数である〕 で示される構造を有するポリアルキレンオキシドの製造
    方法であって、 式： R1−(O-R2)a−(O-R3)b−(O-R4)c−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ 〔式中、R1はカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイ
    ミド基であり； R2，R3及びR4は独立して直鎖及び分枝鎖アルキル基から
    成る群から選択され； ａは１〜1,000の整数であり； ｂ及びｃは独立して０又は１〜1,000の整数であり；及
    び Ｘはハロゲンである〕 で示される構造を有する化合物を、塩基の存在下で、Ｎ
    −ヒドロキシジカルボキシイミドと反応させることを含
    んで成る方法。
  10. 【請求項１０】Ｎ−ヒドロキシジカルボキシイミドがＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドである、請求項８又は９に
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】塩基がトリエチルアミンである、請求項
    ８又は９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】蛋白質又はポリペプチドを分子量20,000
    未満のポリアルキレンオキシドに結合させるウレタン結
    合を含有する、ポリアルキレンオキシドを主成分とする
    複合体であって、該ウレタン結合が、 ａ）ポリアルキレンオキシドをホスゲンと反応させて、
    インシトゥでポリアルキレンオキシドクロロホルマート
    を形成し； ｂ）前記ポリアルキレンオキシドクロロホルマートをＮ
    −ヒドロキシ−Ｎ−ジカルボキシイミドと反応させた
    後、トリエチルアミンと反応させて、オキシカルボニル
    −オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド末端基を有するポリ
    アルキレンオキシドを形成し；及び ｃ）前記オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシ
    イミド末端基を有するポリアルキレンオキシドを前記蛋
    白質又はポリペプチドと反応させて、前記蛋白質又はポ
    リペプチドのアミノ基に前記ポリアルキレンオキシドの
    Ｎ−スクシンイミドカーボネート誘導体を結合させるウ
    レタン結合を形成する； ことから成る方法によって形成される、前記複合体。
  13. 【請求項１３】式 〔R1−(OCH2CH2)a−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−NH−〕k−ポリペプ
    チド （式中、R1はCH3又はＨであり、ａは上記ポリマーの分
    子量が20,000未満となる様に選択される整数であり、ｋ
    は整数である） で示される構造を有する、請求項12に記載のポリアルキ
    レンオキシドを主成分とする複合体。
  14. 【請求項１４】2,000〜20,000の分子量を有する、請求
    項12に記載のポリアルキレンオキシドを主成分とする複
    合体。
  15. 【請求項１５】5,000の分子量を有する、請求項14に記
    載のポリアルキレンオキシドを主成分とする複合体。
  16. 【請求項１６】ポリペプチドがウシ血清アルブミン、グ
    ルタミナーゼ、トリプシン、アルギナーゼ、キモトリプ
    シン、アスパラギナーゼ、及びアデノシンデアミナーゼ
    から成る群から選択される、請求項12に記載のポリアル
    キレンオキシドを主成分とする複合体。
  17. 【請求項１７】オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカル
    ボキシイミド末端基を有するポリアルキレンオキシド
    が、以下の式： 〔式中、R1はＨ−，H3C−、又はオキシカルボニル−オ
    キシ−Ｎ−ジカルボキシイミドであり、ａは上記式のポ
    リアルキレンオキシドの分子量が20,000未満となる様に
    選択される整数である〕 で示される構造を有する、請求項12に記載のポリアルキ
    レンオキシドを主成分とする複合体。
  18. 【請求項１８】オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカル
    ボキシイミド末端基を有するポリアルキレンオキシド
    が、以下の式： 〔式中、ａは上記式のポリアルキレンオキシドの分子量
    が20,000末端となる様に選択される整数である〕 で示される構造を有する、請求項12に記載のポリアルキ
    レンオキシドを主成分とする複合体。
  19. 【請求項１９】オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカル
    ボキシイミド末端基が、Ｎ−スクシンイミド、Ｎ−フタ
    ルイミド、Ｎ−グルタルイミド、Ｎ−テトラヒドロフタ
    ルイミド、及びＮ−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシ
    イミドから成る群の一員を含有する、請求項12に記載の
    ポリアルキレンオキシドを主成分とする複合体。
  20. 【請求項２０】前記ポリペプチドと前記オキシカルボニ
    ル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド末端基を有するポ
    リアルキレンオキシドとの反応が、5.8〜11の範囲のpH
    で実施される、請求項12に記載のポリアルキレンオキシ
    ドを主成分とする複合体。
  21. 【請求項２１】オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカル
    ボキシイミド末端基を有するポリアルキレンオキシド
    が、ポリエチレングリコール−スクシニジルカーボネー
    ト及びポリエチレングリコール−ビス−スクシニジルカ
    ーボネートから成る群から選択される、請求項12に記載
    のポリアルキレンオキシドを主成分とする複合体。
  22. 【請求項２２】前記ポリアルキレンオキシドと前記蛋白
    質を、5.8〜11の範囲のpHを有する水性緩衝液中で反応
    させる、請求項12に記載のポリアルキレンオキシドを主
    成分とする複合体。
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