JP5457185B2

JP5457185B2 - グリセロール連結のｐｅｇ化された糖および糖ペプチド

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Publication number: JP5457185B2
Application number: JP2009531613A
Authority: JP
Inventors: デフリーズ，ショーン; ゼン，シャオ
Original assignee: ノヴォノルディスクアー／エス
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2027-10-04
Also published as: CA2665480A1; SI2068907T1; LTC2068907I2; CA2665480C; WO2008060780A3; EP2068907A2; CY2018016I2; HUE036502T2; HUS1800024I1; CY1119943T1; KR101556248B1; PT2068907T; US20150258206A1; CN101600448A; AU2007319657B2; JP2010505875A; AU2007319657A1; WO2008060780A2; IL197770A0; LT2068907T

Description

関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその全体を本明細書中に参照により組み込まれる、２００６年１０月４日出願の米国仮特許出願第６０／８２８，２０８号の優先権を主張するものである。

例示的な実施形態では、本発明の「グリコｐｅｇ化された」分子は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドと、その構造内にポリ（エチレングリコール）などの高分子修飾基などの修飾基が含まれる酵素転移可能な糖部分との間のコンジュゲートの酵素媒介性の形成によって生成される。例示的な実施形態では、ペプチドは、骨形態発生タンパク質（たとえば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン（たとえば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）、成長分化因子（たとえばＧＤＦ−５）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、完全長第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α_１−抗トリプシン（ＡＴＴ、すなわちα-１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧＦｃ領域融合タンパク質（Enbrel（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（Herceptin（商標））、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（Synagis（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（Remicade（商標））、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（Reopro（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（Rituxan（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（Fabrazyme（商標））、α−イズロニダーゼ（Aldurazyme（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ＭＬＢ５０７５）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡおよび線維芽細胞成長因子から選択されるメンバーである。高分子修飾基は、糖部分に結合しているか（すなわち、２つの反応基の反応によって形成された単一の基を介する）、またはリンカー部分、たとえば、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルなどを介して結合している。

したがって、一態様では、本発明は、ＰＥＧ部分、たとえばＰＥＧと、当分野で認識されている治療ペプチドと類似のｉｎｖｉｖｏ活性を有する、または他の様式で類似のペプチドとの間のコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートでは、ＰＥＧ部分は、完全な（intact）グリコシル連結基を介してペプチドと共有結合している。例示的な完全なグリコシル連結基には、ＰＥＧで誘導体化したシアル酸部分が含まれる。

高分子修飾基は、ペプチド上のグリコシル部分の任意の位置で結合させることができる。さらに、高分子修飾基は、野生型または突然変異体ペプチドのアミノ酸配列中の任意の位置でグリコシル残基と結合することができる。

例示的な実施形態では、本発明は、グリコシル連結基を介して高分子修飾基とコンジュゲートしているペプチドを提供する。例示的なペプチドコンジュゲートには、以下から選択される式を有するグリコシル連結基が含まれる。

式Ｉ、Ｉａ、ＩＩまたはＩＩａでは、Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＯ⁻またはＯＲ^７であり、Ｒ^７は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを表す。記号Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^６’は、独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９および糖部分を含む。指数ｄは、０または１である。Ｒ^８およびＲ^９は、独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、シアル酸から選択される。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’のうちの少なくとも１つには、高分子修飾基、たとえばＰＥＧが含まれる。例示的な実施形態では、Ｒ^６およびＲ^６’は、それらが結合している炭素と一緒になって、シアリル部分の側鎖の構成要素である。さらなる例示的な実施形態では、この側鎖は高分子修飾基で官能化されている。

例示的な実施形態では、高分子修飾基は、以下に示すように、一般にグリコシル核上のヘテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ）を介して、リンカーＬを介して、グリコシル連結基と結合している。

Ｒ^１は高分子修飾基であり、Ｌは、結合および連結基から選択される。指数ｗは、１〜６、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２から選択される整数を表す。例示的な連結基には、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸が含まれる。リンカーの例示的な構成要素はアシル部分である。別の例示的な連結基はアミノ酸残基である（たとえば、システイン、セリン、リシン、および短いオリゴペプチド、たとえば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓなど）。

Ｌが結合である場合、これは、Ｒ^１の前駆体上の反応性官能基と、グリコシル連結基の前駆体上の相補的反応性の反応性官能基との反応によって形成される。Ｌが非０次連結基である場合、Ｌは、Ｒ^１前駆体との反応の前にグリコシル部分上に配置されていることができる。あるいは、Ｒ^１の前駆体およびＬを事前に形成したカセット内に取り込ませ、続いてそれをグリコシル部分に結合させることができる。本明細書中に記載するように、適切な反応性官能基を用いて前駆体を選択および調製することは、当業者の能力範囲内にある。さらに、前駆体のカップリングは、当分野で周知の化学によって進行する。

例示的な実施形態では、Ｌは、アミノ酸、または小ペプチド（たとえば１〜４個のアミノ酸残基）から形成される連結基であり、高分子修飾部分が置換されたアルキルリンカーを介して結合している修飾糖がもたらされる。例示的なリンカーには、グリシン、リシン、セリンおよびシステインが含まれる。本明細書中で定義するアミノ酸類似体も、リンカー構成要素として役立つ。アミノ酸は、リンカーの追加の構成要素、たとえば、アシル結合を介して共有結合したアルキル、ヘテロアルキルを用いて、たとえば、アミノ酸残基のアミン部分を介して形成されるアミドまたはウレタンを用いて修飾し得る。

例示的な実施形態では、グリコシル連結基は式ＩまたはＩａに従った構造を有し、Ｒ^５には高分子修飾基が含まれる。別の例示的な実施形態では、Ｒ^５には高分子修飾基およびリンカーＬがどちらも含まれ、高分子修飾基をグリコシル核と結合している。Ｌは、直鎖状または分枝鎖状構造であることができる。同様に、高分子修飾基は分枝鎖状または直鎖状であることができる。

高分子修飾基は、水溶性または本質的に非水溶性であることができる２つ以上の繰り返し単位を含む。本発明の化合物で使用するための例示的な水溶性ポリマーには、ＰＥＧ、たとえばｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、たとえばｍ−ＰＰＧ、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、ポリエチエレンイミン、生分解性ポリマー（たとえば、ポリラクチド、ポリグリセリド）、および官能化ＰＥＧ、たとえば末端官能化ＰＥＧが含まれる。

ペプチドコンジュゲートにおいて役立つグリコシル連結基のグリコシル核は、天然および非天然のフラノースおよびピラノースから選択される。非天然サッカライドには、アルキル化またはアシル化されたヒドロキシルおよび／またはアミン部分、たとえば、環上でのエーテル、エステルおよびアミド置換基が任意選択で含まれる。他の非天然サッカライドには、そのような置換基が天然サッカライド中では存在しないような環上の位置における、Ｈ、ヒドロキシル、エーテル、エステルまたはアミド置換基が含まれる。あるいは、炭水化物は、たとえばデオキシ糖など、その名称が由来する炭水化物中で見つかるはずの置換基が欠損している。さらなる例示的な非天然糖には、酸化（たとえば、−オン酸および−ウロン酸）および還元された（糖アルコール）炭水化物がどちらも含まれる。糖部分は、モノ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドであることができる。

本発明においてグリコシル連結基の構成要素として役立つ例示的な天然糖には、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、フコース、マンノース、マンノサミン、キシラノース（xylanose）、リボース、Ｎ−アセチルグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびシアル酸が含まれる。

一実施形態では、本発明は、以下の部分を含むペプチドコンジュゲートを提供する。

式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり；Ｇは、ＨおよびＲ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択されるメンバーであり；Ｒ^１は、直鎖状または分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり；Ｌは、リンカー、たとえば、結合（「０次」）、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルである。例示的な実施形態では、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ^１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルである場合、ＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−である。

別の態様では、本発明は、グリコシル連結基を含むペプチドコンジュゲートを提供し、グリコシル連結基は、前記ペプチドのアミノ酸残基に結合しており、前記グリコシル連結基は、

から選択されるメンバーである式を有するシアリル連結基を含み、
式中、

は修飾基である。Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＯ⁻およびＯＲ^７から選択されるメンバーである。Ｒ^７は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、およびＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーである。Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびシアリルから独立して選択される。Ｌ^ａは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーである。Ｘ^５、Ｒ^１６およびＲ^１７は、非反応基および高分子部分（たとえばポリ（酸化アルキレン）、たとえばＰＥＧ）から独立して選択される。非反応基には、生理的ｐＨで本質的に非反応性、中性および／または安定であると考えられている基、たとえば、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルなどが含まれる。例示的な高分子部分には、式ＩＩＩａに記載の分枝鎖状構造式ＩＩＩａおよび以下のその典型が含まれる。当業者は、これらの式中のＰＥＧ部分を、他のポリマーで置き換えることができることを理解されよう。例示的なポリマーには、ポリ（酸化アルキレン）ファミリーのものが含まれる。Ｘ^２およびＸ^４は、高分子部分Ｒ^１６およびＲ^１７をＣと結合させる独立して選択される連結断片である。指数ｊは、１〜１５から選択される整数である。

別の例示的な実施形態では、高分子修飾基は、以下の式に従った構造を有する。

式中、指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。

例示的な実施形態では、高分子修飾基は、以下の式に従った部分を含む構造を有する。

上記式による別の例示的な実施形態では、高分子修飾基は、以下の式に従った構造を有する。

例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１〜約５０００、好ましくは約１００〜約４０００、より好ましくは約２００〜約３０００、さらにより好ましくは約３００〜約２０００、さらにより好ましくは約４００〜約１０００から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１〜約５００から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１〜約７０、約７０〜約１５０、約１５０〜約２５０、約２５０〜約３７５および約３７５〜約５００から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１０〜約３５、約４５〜約６５、約９５〜約１３０、約２１０〜約２４０、約３１０〜約３７０および約４２０〜約４８０から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１５〜約３０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約５０〜約６５から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１００〜約１３０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約２１０〜約２４０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約３１０〜約３７０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約４３０〜約４７０から選択される整数である。例示的な実施形態では、Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ、−ＯＨおよび−ＯＣＨ_３から選択されるメンバーである。

本実施形態による例示的な高分子修飾基には、以下の部分が含まれる。

本発明は、グリコシル連結基を含むペプチドコンジュゲートを提供し、グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基に結合しており、グリコシル連結基は、式：

を有するシアリル連結基を含み、
式中、

は修飾基である。指数ｓは、１〜２０から選択される整数である。指数ｆは、１〜２５００から選択される整数である。Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである。

例示的な実施形態では、本発明は、以下の式を有する修飾糖を提供する。

式中、Ｒ^１は高分子部分であり；Ｌは、結合および連結基から選択され；Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７およびＯＲ^７から選択されるメンバーであり；Ｒ^７は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり；Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８およびＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーであり；Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、シアル酸およびポリシアル酸から独立して選択される。指数ｗは、１〜６、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２から選択される整数を表す。例示的な連結基には、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸が含まれる。リンカーの例示的な構成要素はアシル部分である。

本発明は、ペプチドのコンジュゲートを形成する方法を提供する。本方法には、ペプチドを、糖と共有結合した修飾基を保有する修飾糖ドナーと接触させることが含まれる。修飾糖部分は、酵素の作用によって、ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に転移される。代表的な酵素には、それだけには限定されないが、グリコシルトランスフェラーゼ、たとえばシアリルトランスフェラーゼが含まれる。本方法には、ペプチドを、修飾糖部分をドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基へと転移させるために適した条件下で、ａ）修飾糖ドナー；およびｂ）修飾糖部分を修飾糖ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に転移させることができる酵素と接触させ、それにより前記ペプチドコンジュゲートを合成することが含まれる。

好ましい実施形態では、ステップａ）の前に、ペプチドをシアリダーゼと接触させ、それによりペプチド上のシアル酸の少なくとも一部分を除去する。

別の好ましい実施形態では、ペプチドを、シアリダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾糖ドナーと接触させる。本実施形態では、ペプチドは、様々な構成要素を加える順序にかかわらず、シアリダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾糖ドナーと本質的に同時に接触している。反応は、シアリダーゼがシアル酸残基をペプチドから除去するため、およびグリコシルトランスフェラーゼが修飾糖部分を修飾糖ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基へと転移させるために適した条件下で実施する。

別の好ましい実施形態では、脱シアリル化およびコンジュゲーションを同じ容器内で行い、脱シアリル化されたペプチドは、好ましくは、コンジュゲーションステップの前に精製しない。別の例示的な実施形態では、本方法は、ペプチドコンジュゲートのシアリル化を伴う「キャッピング」ステップをさらに含む。このステップは、シアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよび修飾糖ドナーを含むものと同じ容器内で、事前に精製せずに行う。

別の好ましい実施形態では、ペプチドの脱シアリル化を行い、アシアロペプチドを精製する。その後、精製したアシアロペプチドをコンジュゲーション反応条件に供する。別の例示的な実施形態では、本方法は、ペプチドコンジュゲートのシアリル化を伴う「キャッピング」ステップをさらに含む。このステップは、シアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよび修飾糖ドナーを含むものと同じ容器内で、事前に精製せずに行う。

別の例示的な実施形態では、キャッピングステップであるペプチドコンジュゲートのシアリル化を、シアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよび修飾糖ドナーを含むものと同じ容器内で、事前に精製せずに行う。

例示的な実施形態では、接触は、２０時間未満、好ましくは１６時間未満、より好ましくは１２時間未満、さらにより好ましくは８時間未満、さらにより好ましくは４時間未満の時間の間である。

さらなる態様では、本発明は、ペプチドコンジュゲート反応混合物を提供する。反応混合物は、ａ）シアリダーゼ、ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである酵素、ｃ）修飾糖、ならびにｄ）ペプチドを含む。

別の例示的な実施形態では、シアリダーゼ対ペプチドの比は、０．１Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ〜１０Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１．０Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１０Ｕ／Ｌ：２ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは０．１Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１．０Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１０Ｕ／Ｌ：１ｍｇ／ｍＬから選択される。

例示的な実施形態では、前記ペプチドコンジュゲートの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％に、最大で２つのＰＥＧ部分が含まれる。ＰＥＧ部分は、ワンポットプロセスで加えるか、またはアシアロを精製した後に加えることができる。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％に、最大で１つのＰＥＧ部分が含まれる。ＰＥＧ部分は、ワンポットプロセスで加えるか、またはアシアロペプチドを精製した後に加えることができる。

さらなる例示的な実施形態では、本方法は、「キャッピング」、すなわちシアル酸をペプチドコンジュゲートに加えることをさらに含む。別の例示的な実施形態では、シアリダーゼを加え、次いで３０分間、１時間、１．５時間、または２時間遅らせ、次いでグリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼ、またはエンドグリコシダーゼを加える。

別の例示的な実施形態では、シアリダーゼを加え、次いで３０分間、１時間、１．５時間、または２時間遅らせ、次いでグリコシルトランスファーゼ、エキソグリコシダーゼ、またはエンドグリコシダーゼを加える。本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。

別の例示的な実施形態では、本方法には、（ａ）

から選択されるグリコシル基を含むペプチドと
［式中、ａは、０〜１０の整数であり、修飾糖は、式：

を有する］、グリコシル連結基をＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌおよび前記グリコシル基のＳｉａから選択されるメンバー上に転移させる適切なトランスフェラーゼとを、前記転移に適した条件下で接触させることが含まれる。例示的な修飾糖は、リンカー部分を介して、ポリマー、たとえば直鎖状または分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）部分で修飾されたＣＭＰ−シアル酸である。上記式中の基は、本明細書中上記の同一の式中に見つかるものと実質的に同じものである。

ペプチドは本質的に任意の供給源から得ることができるが、一実施形態では、上述のように修飾する前に、ペプチドを適切な宿主中で発現させる。哺乳動物（たとえば、ＢＨＫ、ＣＨＯ）、細菌（たとえば大腸菌（E. coli））および昆虫細胞（たとえばＳｆ−９）が、本明細書中に記載の組成物および方法において役立つペプチドを提供する例示的な発現系である。

本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。

ＣＭＰ−シアル酸−グリセロールＰＥＧ４０ｋＤの調製を例示する図である。ＣＭＰ−シアル酸−グリセロールＰＥＧ４０ｋＤを調製する反応条件を例示する図である。ＣＭＰ−シアル酸−グリセロールＰＥＧ４０ｋＤの精製プロセスを例示する図である。Ｑ−セファロースを伴うＣＭＰ−シアル酸−グリセロールＰＥＧ４０ｋＤの精製プロセスを例示する図である。ＣＭＰ−シアル酸−グリセロールＰＥＧ４０ｋＤの^１ＨＮＭＲスペクトルを示す図である。本発明のグリココンジュゲート（glycconjugate)を形成すること、たとえばペプチドを修飾シアル酸でグリコＰＥＧ化することにおいて役立つ例示的なシアリルトランスフェラーゼを提供する表である。本発明のペプチドコンジュゲートを提供するために１つまたは複数のグリコシル連結基を結合させることができるペプチドの表である。

略記
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、酢酸マンノサミニル；Ｘｙｌ、キシロシル；ＮｅｕＡｃ、シアリルまたはＮ−アセチルノイラミニル；Ｓｉａ、シアリルまたはＮ−アセチルノイラミニル；ならびにその誘導体および類似体。

定義
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての専門用語および科学用語は、一般に、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書中で使用する学名、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室の手順は、当分野で周知かつ一般的に用いられるものである。核酸およびペプチド合成には標準技術を用いる。技術および手順は、一般に、当分野の慣用方法および本明細書全体にわたって提供する様々な一般参考文献（一般に、本明細書中に参照により組み込れられるSambrook他、分子クローニング:実験室の手引き（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL）、第２版（１９８９）Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州Cold Spring Harbor参照）に従って行う。本明細書中で使用する学名および分析化学における実験室の手順および以下に記載する有機合成は、当分野で周知かつ一般的に用いられているものである。標準技術またはその変形を、化学合成および化学分析に用いる。

本明細書中に記載のすべてのオリゴ糖は、非還元サッカライド（すなわちＧａｌ）の名称または略記、次いでグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与している還元サッカライドの環位置（２、３、４、６または８）、その後、還元サッカライドの名称または略記（すなわちＧｌｃＮＡｃ）を用いて記載している。それぞれのサッカライドは、好ましくはピラノースである。標準の糖鎖生物学の学名の総説には、糖鎖生物学の基本（Essentials of Glycobiology）、Ｖａｒｋｉ他編、ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。

オリゴ糖は、還元末端のサッカライドが実際に還元糖であるかどうかにかかわらず、還元末端および非還元末端を有するとみなされる。認められている学名に従って、オリゴ糖は、本明細書中で非還元末端を左側、還元末端を右側で示す。

用語「シアル酸」または「シアリル」とは、９個の炭素のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸である（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される）。このファミリーの第２のメンバーはＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノルロソン酸（ＫＤＮ）である（Nadano他（１９８６）J. Biol. Chem.、２６１：１１５５０〜１１５５７;Kanamori他、J. Biol. Chem.、２６５：２１８１１〜２１８１９（１９９０））。また、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換のシアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説には、たとえば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２：２５〜４０（１９９２）；シアル酸：化学、代謝および機能（Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function）、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Springer-Verlag、New York（１９９２））を参照されたい。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日公開の国際出願ＷＯ９２／１６６４０号に開示されている。

「ペプチド」とは、単量体がアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結合されているポリマーを指し、ポリペプチドとも呼ばれる。さらに、非天然アミノ酸、たとえば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれる。遺伝子にコードされていないアミノ酸も本発明で使用し得る。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療用部分、生体分子などが含まれるように修飾されたアミノ酸も、本発明で使用し得る。本発明で使用するすべてのアミノ酸は、Ｄ−またはＬ−異性体のどちらかであり得る。Ｌ−異性体が一般に好ましい。さらに、他のペプチド模倣体も本発明において有用である。本明細書中で使用する「ペプチド」とは、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドの両方を指す。ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されたペプチドも含まれる。一般的な総説には、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質の化学および生化学（CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS）、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ページ２６７（１９８３）を参照されたい。本発明のペプチドの一部の記載を図７に提供する。

用語「ペプチドコンジュゲート」とは、ペプチドが本明細書中に記載の修飾糖とコンジュゲートしている、本発明の種を指す。

用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされているアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、たとえば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造、すなわち、水素と結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、たとえば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は修飾されたＲ基（たとえばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学物質を指す。

本明細書中で使用する用語「修飾糖」、または「修飾糖残基」とは、本発明のプロセスにおいてペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に酵素的に付加される、天然に存在するまたは天然に存在しない炭水化物を指す。修飾糖は、それだけには限定されないが、糖ヌクレオチド（モノ−、ジ−、およびトリ−リン酸）、活性糖（たとえば、ハロゲン化グリコシル、グリコシルメシレート）および活性化されておらずヌクレオチドでもない糖を含めた、酵素基質から選択される。「修飾糖」は、「修飾基」で共有的に官能化されている。有用な修飾基には、それだけには限定されないが、ＰＥＧ部分、治療用部分、診断用部分、生体分子などが含まれる。修飾基は、好ましくは、天然に存在する、または未修飾の炭水化物ではない。修飾基で官能化する部位は、「修飾糖」がペプチドに酵素的に付加されることを妨げないように選択する。

本明細書中で使用する用語「高分子部分」とは、水溶性または非水溶性ポリマーを指す。用語「水溶性」とは、水に対してある程度の検出可能な度合の溶解度を有する部分を指す。水に対する溶解度を検出および／または定量する方法は当分野で周知である。例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、サッカライド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが含まれる。ペプチドは、混合配列を有するか、またはたとえばポリ（リシン）のように単一アミノ酸から構成されることができる。例示的な多糖はポリ（シアル酸）である。例示的なポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）が例示的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸が代表的なポリ（カルボン酸）である。好ましい水溶性ポリマーは、本質的に非蛍光であるか、またはアッセイにおいて蛍光マーカーとして使用するには不適切であるような必要最低限量の蛍光しか発光しない。天然に存在しない糖であるポリマーを使用し得る。さらに、別の実体（たとえば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（アスパラギン酸）、生体分子、治療用部分、診断用部分など）の共有結合によって修飾されており、そうでなければ天然に存在する糖の使用も企図される。また、水溶性ポリマーとの用語は、サッカライド（たとえば、デキストラン、アミロース、ヒアロウロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、たとえばポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（たとえば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、たとえばポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などの種も包含する。代表的な非水溶性ポリマーには、それだけには限定されないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールならびにそれらのコポリマーが含まれる。さらに、別の実体（たとえば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（アスパラギン酸）、生体分子、治療用部分、診断用部分など）の共有結合によって修飾されており、そうでなければ天然に存在する糖の使用も企図される。水溶性および非水溶性ポリマーのさらなる例を本出願中に記載する。

水溶性ポリマーのポリマー主鎖は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）であることができる。しかし、他の関連ポリマーも本発明の実施における使用に適しており、用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、この観点から、包含的であることを意図し排他的ではないことを理解されたい。用語ＰＥＧには、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、複数アームのＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、分枝鎖状ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、１つもしくは複数の官能基がポリマー主鎖にペンダントしたＰＥＧもしくは関連ポリマー）、または内部に分解可能な結合を有するＰＥＧを含めた任意の形態のポリ（エチレングリコール）が含まれる。

ポリマーは直鎖状または分枝鎖状であることができる。分枝鎖状ポリマーは一般に当分野で知られている。典型的には、分枝鎖状ポリマーは、中心分枝核部分および中心分枝核と連結した複数の直鎖状または分枝鎖状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールに酸化エチレンを付加することによって調製することができる分枝鎖状形態で、一般的に使用される。また、中心分枝部分は、リシンなどのいくつかのアミノ酸から誘導することもできる。分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）_ｍとして一般形態で表すことができ、Ｒは、グリセロールまたはペンタエリスリトールなどの核部分を表し、ｍは、アームの数を表す。その全体が本明細書中に参照により組み込れられる米国特許第５，９３２，４６２号に記載されているものなどの、複数アームのＰＥＧ分子も、ポリマー主鎖として使用することができる。例示的な実施形態では、分枝鎖状ポリマー自体が分枝部分（たとえば、システイン、セリン、リシン、およびリシンのオリゴマー）に結合している。

多くの他のポリマーも本発明に適している。非ペプチド性かつ水溶性であり、約２〜約３００個の範囲内の結合部位のポリマー主鎖が、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例には、それだけには限定されないが、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、その全体が本明細書中に参照により組み込れられる米国特許第５，６２９，３８４号に記載されているものなどのポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ならびにそれらのコポリマー、ターポリマー、および混合物が含まれる。ポリマー主鎖のそれぞれの鎖の分子量は変動することができるが、典型的には、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、多くの場合約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。

ペプチド薬を患者に投与するコンテクストにおいて本明細書中で使用する「曲線下面積」または「ＡＵＣ」とは、患者において全身循環中の薬物の濃度をゼロから無限大の時間の関数として記載する、合計曲線下面積として定義される。

ペプチド薬を患者に投与するコンテクストにおいて本明細書中で使用する用語「半減期」または「ｔ_１／２」とは、患者における薬物の血漿濃度が半減するまでに必要な時間として定義される。複数のクリアランス機構、再分布、および当分野で周知の他の機構に応じて、ペプチド薬に関連した２つ以上の半減期が存在し得る。通常はαおよびβ半減期が定義され、α相は再分布と関連しており、β相はクリアランスと関連している。しかし、大部分が血流中に限局されるタンパク質薬では、少なくとも２つのクリアランス半減期が存在する場合がある。一部のグリコシル化されたペプチドでは、急速なβ相クリアランスは、マクロファージ上の受容体、または末端ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、もしくはフコースを認識する内皮細胞によって媒介され得る。より遅いβ相クリアランスは、有効半径＜２ｎｍ（約６８ｋＤ）を有する分子に対する腎臓糸球体濾過ならびに／または組織における特異的もしくは非特異的な取り込みおよび代謝によって起こり得る。グリコＰＥＧ化は、末端糖（たとえば、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）をキャップすることで、これらの糖を認識する受容体による急速なα相クリアランスを遮断し得る。また、これは、より大きな有効半径を与え、したがって分布および組織取り込みの体積を低下させ、したがって後期β相を延長し得る。したがって、α相およびβ相半減期に対するグリコＰＥＧ化の正確な影響は、当分野で周知であるように、大きさ、グリコシル化の状態、および他のパラメータに応じて変化し得る。「半減期」のさらなる説明は、Pharmaceutical Biotechnology（１９９７、DFA CrommelinおよびRD Sindelar編、Harwood Publishers、Amsterdam、ページ１０１〜１２０）中に見出される。

本明細書中で使用する用語「グリココンジュゲーション」とは、修飾糖種を、ポリペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基、たとえば本発明のＧ−ＣＳＦペプチドに、酵素媒介によってコンジュゲーションさせることを指す。「グリココンジュゲーション」の下位部類は「グリコＰＥＧ化」であり、ここでは修飾糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）、およびそのアルキル誘導体（たとえばｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（たとえば、Ｈ_２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である。

用語「大スケール」および「工業スケール」は互換性があるように使用し、単一の反応サイクルの完了時に少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約１グラムのグリココンジュゲートを生じる反応サイクルを指す。

本明細書中で使用する用語「グリコシル連結基」とは、修飾基（たとえば、ＰＥＧ部分、治療用部分、生体分子）が共有結合されているグリコシル残基を指す。グリコシル連結基が修飾基をコンジュゲートの残りの部分と結合している。本発明の方法では、「グリコシル連結基」がグリコシル化または非グリコシル化ペプチドと共有結合され、それにより、薬剤がペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基とが連結される。「グリコシル連結基」は、一般に、「修飾糖」とペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基との酵素結合による「修飾糖」に由来する。グリコシル連結基は、修飾基−修飾糖カセットの形成中に分解されるサッカライド由来の構造であることができ（たとえば、酸化→シッフ塩基形成→還元）、または、グリコシル連結基は完全であり得る。「完全なグリコシル連結基」とは、修飾基とコンジュゲートの残りの部分とを連結するサッカライド単量体が、たとえばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによって分解されない、たとえば酸化されないグリコシル部分に由来する連結基を指す。本発明の「完全なグリコシル連結基」は、グリコシル単位を付加すること、または１つもしくは複数のグリコシル単位を親サッカライド構造から除去することによって、天然に存在するオリゴ糖から得てもよい。

本明細書中で使用する用語「非グリコシド修飾基」とは、グリコシル連結基と直接連結した天然に存在する糖が含まれない修飾基を指す。

本明細書中で使用する用語「標的化部分」とは、身体の特定の組織または領域中に選択的に局在化する種を指す。局在化は、分子決定因子の特異的認識、標的化剤またはコンジュゲートの分子の大きさ、イオン性相互作用、疎水性相互作用などによって媒介される。薬剤を特定の組織または領域に標的化する他の機構は、当業者に知られている。例示的な標的化部分には、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが含まれる。

本明細書中で使用する「治療用部分」とは、それだけには限定されないが、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒素、および放射性剤を含めた、治療に有用な任意の薬剤を意味する。「治療用部分」には、生物活性剤のプロドラッグ、複数の治療用部分が担体と結合している構築体、たとえば多価薬剤が含まれる。また、治療用部分には、タンパク質およびタンパク質が含まれる構築体も含まれる。例示的なタンパク質には、それだけには限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（たとえば、インターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（たとえばインターロイキンII）、血清タンパク質（たとえば、第ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ因子）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）ならびに抗体融合タンパク質（たとえば腫瘍壊死因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が含まれる。

本明細書中で使用する「薬学的に許容される担体」には、コンジュゲートと合わせた場合にコンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と非反応性である、任意の物質が含まれる。例には、それだけには限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳剤などの乳剤、および様々な種類の湿潤剤などの標準の医薬担体のうちの任意のものが含まれる。他の担体には、滅菌溶液、コーティングした錠剤を含めた錠剤およびカプセルも含まれ得る。典型的には、そのような担体は、デンプン、乳、糖、ある特定種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは油、ガム、グリコール、または他の既知の賦形剤などの賦形剤を含む。そのような担体には、香料および着色料の添加剤または他の成分も含まれ得る。そのような担体を含む組成物は、周知の慣用方法によって配合する。

本明細書中で使用する「投与すること」とは、対象に、経口投与、坐薬として投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内もしくは皮下投与、または徐放性装置、たとえばミニ浸透圧ポンプの埋め込みを行うことを意味する。投与は、非経口、および経粘膜（たとえば、経口、経鼻、経膣、直腸、もしくは経皮）を含めた任意の経路による。非経口投与には、たとえば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が含まれる。さらに、腫瘍を処置する、たとえばアポトーシスを誘発させるために注射する場合、腫瘍に直接および／または腫瘍の周りの組織内に投与し得る。他の送達様式には、それだけには限定されないが、リポソーム配合物、静脈点滴、経皮パッチなどの使用が含まれる。

用語「寛解させること（ameliorating）」または「寛解させる」とは、症状の軽減、緩和もしくは消失または患者の身体的もしくは精神的な健康の改善などの任意の客観的または主観的パラメータを含めた病理または状態の治療における任意の成功の兆候を指す。症状の寛解は、身体検査および／または精神鑑定の結果を含めた、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。

用語「療法（therapy）」とは、疾患に罹患しやすい可能性があるが疾患の症状を未だ経験または示していない動物において疾患または状態の発生を予防すること（予防的処置）、疾患を阻害すること（その発生を遅延または停止させること）、疾患の症状または副作用からの緩和をもたらすこと（対症処置を含む）、および疾患を軽減させること（疾患の回帰を引き起こす）を含めた、疾患または状態を「治療すること」または「治療」を意味する。

用語「有効量」または「有効な量」または「治療上有効な量」または任意の文法的に等価の用語は、疾患を治療するために動物に投与した場合に、そのような疾患の治療をもたらすために十分な量を意味する。

用語「単離した」とは、物質を生成するために用いた構成要素を実質的または本質的に含まない物質である。本発明のペプチドコンジュゲートでは、用語「単離した」とは、ペプチドコンジュゲートを調製するために使用した混合物中で通常は物質に伴う構成要素を実質的または本質的に含まない物質を指す。「単離した」および「純粋な」は、互換性があるように使用する。典型的には、本発明の単離したペプチドコンジュゲートは、好ましくは範囲として表す純度レベルを有する。ペプチドコンジュゲートの純度の範囲の下端は約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％を超える。

ペプチドコンジュゲートが約９０％を超えて純粋である場合、その純度も、好ましくは範囲として表す。純度の範囲の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の純度である。

純度は、当分野で認識されている任意の分析方法によって決定する（たとえば、銀染色ゲル上のバンドの強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または同様の手段）。

本明細書中で使用する「集団の本質的にそれぞれのメンバー」とは、ペプチドに付加する選択した割合の修飾糖が、ペプチド上の複数の同一の受容体部位に付加される、本発明のペプチドコンジュゲートの集団の特徴を説明している。「集団の本質的にそれぞれのメンバー」とは、修飾糖とコンジュゲートしたペプチド上の部位の「均質性」についていい、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明のコンジュゲートを指す。

「均質性」とは、修飾糖がコンジュゲートしている受容体部分の集団にわたる構造的な一貫性を指す。したがって、それぞれの修飾糖部分が、その他の修飾糖すべてがコンジュゲートしている受容体部位と同じ構造を有する受容体部位とコンジュゲートしている本発明のペプチドコンジュゲートでは、ペプチドコンジュゲートは約１００％均質であるといわれる。均質性は、典型的には範囲として表す。ペプチドコンジュゲートの均質性の範囲の下端は約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％を超える。

ペプチドコンジュゲートが約９０％以上均質である場合、その均質性も、好ましくは範囲として表す。均質性の範囲の下端は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均質性である。ペプチドコンジュゲートの純度は、典型的には、たとえば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離質量飛行時間分光測定（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動などの、当業者に知られている１つまたは複数の方法によって決定する。

糖ペプチド種に言及する場合、「実質的に均一なグリコフォーム」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、目的のグリコシルトランスフェラーゼ（たとえばフコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化される受容体部分の割合を指す。たとえば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化された類似体の実質的にすべて（以下に定義する）が、本発明のペプチドコンジュゲートにおいてフコシル化されている場合に、実質的に均一なフコシル化パターンが存在する。本明細書中に記載のフコシル化された構造において、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃ結合は、一般にα１，６またはα１，３であり、α１，６が一般に好ましい。当業者には、出発物質がグリコシル化された受容体部分（たとえばフコシル化されたＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含み得ることが理解されよう。したがって、グリコシル化の計算上の割合には、本発明の方法によってグリコシル化された受容体部分、および出発物質中で既にグリコシル化されている受容体部分が含まれる。

上記定義「実質的に均一」における用語「実質的に」とは、一般に、特定のグリコシルトランスフェラーゼの受容体部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されていることを意味する。

置換基を、左から右に書くその慣用の化学式によって指定する場合、これらには、その構造を右から左に書くことによって生じる、化学的に同一の置換基も同等に包含される。たとえば、−ＣＨ_２Ｏ−は、−ＯＣＨ_２−も挙げることを意図する。

用語「アルキル」とは、それ自体でまたは別の置換基の一部として、別段に記述しない限りは、完全に飽和、モノ−または多価不飽和であり得る直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素基、あるいはその組合せを意味し、指定した数の炭素原子を有する二価基および多価基が含まれ得る（すなわち、Ｃ_１〜Ｃ_１０とは１個〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例には、それだけには限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基、たとえば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体が含まれる。不飽和アルキル基とは、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例には、それだけには限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高度な相同体および異性体が含まれる。用語「アルキル」には、別段に言及しない限りは、「ヘテロアルキル」など、以下により詳細に定義するアルキルの誘導体も含まれることを意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。

用語「アルキレン」とは、それ自体でまたは別の置換基の一部として、それだけには限定されないが−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−によって例示されるように、アルカンに由来する二価基を意味し、以下に「ヘテロアルキレン」として記載する基もさらに含まれる。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明で好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、より短い鎖の、一般に８個以下の炭素原子を有するアルキルまたはアルキレン基である。

用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）とは、その慣用の意味で使用し、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残りの部分と結合しているアルキル基を指す。

用語「ヘテロアルキル」とは、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、別段に記述しない限りは、指定した数の炭素原子ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、窒素および硫黄原子が任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が任意選択で第四級化されていてもよい、安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素基、あるいはその組合せを意味する。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残りの部分と結合している位置に配置し得る。例には、それだけには限定されないが、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、−ＣＨ_２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ_３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３が含まれる。たとえば−ＣＨ_２−ＮＨ−ＯＣＨ_３および−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３などのように、２個までのヘテロ原子が連続していてもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」とは、それ自体でまたは別の置換基の一部として、それだけには限定されないが−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−および−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−によって例示されるように、ヘテロアルキルに由来する二価基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子が鎖の末端の一方または両方を占有することもできる（たとえば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基では、連結基の式を記載する方向によって連結基の配向は暗示されない。たとえば、式−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２−をどちらも表す。

用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」とは、それら自体でまたは別の用語と組み合わせて、別段に記述しない限りは、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを表す。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子が、ヘテロ環が分子の残りの部分と結合している位置を占有することができる。シクロアルキルの例、それだけには限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれる。ヘテロシクロアルキルの例には、それだけには限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが含まれる。

用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、それら自体でまたは別の置換基の一部として、別段に記述しない限りは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語には、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルが含まれることを意図する。たとえば、用語「ハロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル」には、それだけには限定されないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどが含まれることを意図する。

用語「アリール」とは、別段に記述しない限りは、一緒に融合したまたは共有結合した、単一の環または複数の環（好ましくは１〜３個の環）であることができる、多価不飽和の芳香族の置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含み、窒素および硫黄原子が任意選択で酸化されており、窒素原子が任意選択で第四級化されている、アリール基（または環）を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分と結合していることができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルが含まれる。上記で言及したアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれの置換基は、以下に記載する許容される置換基の群から選択される。

簡潔にするために、用語「アリール」には、他の用語（たとえば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて使用した場合は、上記定義したアリールおよびヘテロアリール環がどちらも含まれる。したがって、用語「アリールアルキル」には、アリール基が、炭素原子（たとえばメチレン基）がたとえば酸素原子によって置き換えられているアルキル基（たとえば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含めた、アルキル基（たとえば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に結合している基が含まれることを意図する。

上記用語のそれぞれ（たとえば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）には、示した基の置換されたおよび置換されていない形態がどちらも含まれることを意図する。それぞれの種類の基の好ましい置換基を以下に提供する。

アルキルおよびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）の置換基は、「アルキル基置換基」として総称し、これらは、０から（２ｍ’＋１）までの範囲の数で（式中、ｍ’はそのような基の中の炭素原子の合計数である）、それだけには限定されないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ_２から選択される様々な基のうちの１つまたは複数であることができる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’はそれぞれ、好ましくは独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、たとえば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物に複数のＲ基が含まれる場合は、たとえば、Ｒ基のそれぞれは独立して選択され、複数のこれらの基が存在する場合は、それぞれのＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基もそうである。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、これらは、窒素原子と合わせて５−、６−、または７員環を形成することができる。たとえば、−ＮＲ’Ｒ’’には、それだけには限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが含まれることを意図する。置換基の上記の記述から、当業者は、用語「アルキル」には、ハロアルキル（たとえば、−ＣＦ_３および−ＣＨ_２ＣＦ_３）ならびにアシル（たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）などの、水素基以外の基と結合した炭素原子を含めた基が含まれることを意図することを、理解されよう。

アルキル基で記載した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は、「アリール基置換基」として総称する。置換基は、たとえば、０から芳香環系上の空いている原子価の合計数までの範囲の数で、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ_２、−Ｒ’、−Ｎ_３、−ＣＨ（Ｐｈ）_２、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択される。本発明の化合物に複数のＲ基が含まれる場合は、たとえば、Ｒ基のそれぞれは独立して選択され、複数のこれらの基が存在する場合は、それぞれのＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基もそうである。以下のスキームでは、記号Ｘは上述の「Ｒ」を表す。

アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つを、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）_ｕ−Ｕ−の置換基によって任意選択で置き換えてもよく、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｕは、０〜３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つを、式−Ａ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｂ−の置換基によって任意選択で置き換えてもよく、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは、１〜４の整数である。そのようにして形成された新しい環の単結合のうちの１つを、二重結合によって任意選択で置き換えてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つを、式−（ＣＲＲ’）_ｚ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）_ｄ−の置換基によって任意選択で置き換えてもよく、ｚおよびｄは、独立して、０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは、水素または置換もしくは非置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから独立して選択される。

本明細書中で使用する用語「ヘテロ原子」には、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）が含まれることを意図する。

本明細書中で使用する第ＶＩＩ因子ペプチドとは、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子ペプチドの両方を指す。この用語は、一般に、付加、欠失、置換および融合タンパク質突然変異体を含めた、これらのペプチドの変異体および突然変異体を指す。第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子をどちらも使用する場合、使用は、属「第ＶＩＩ因子ペプチド」の２つの種を例示するものであることを意図する。

本発明には、本明細書中に記載の化合物上に見つかる具体的な置換基に応じて比較的無毒性の酸または塩基を用いて調製する本発明の化合物の塩が含まれることを意図する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合は、塩基付加塩は、そのような化合物の中性型を十分な量の所望の塩基と、ニートでまたは適切な不活性溶媒中で接触させることによって、得ることができる。塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウムの塩、または類似の塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合は、酸付加塩は、そのような化合物の中性型を十分な量の所望の酸と、ニートでまたは適切な不活性溶媒中で接触させることによって、得ることができる。酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素のリン酸、二水素のリン酸、硫酸、一水素の硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などの無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒性の有機酸に由来する塩が含まれる。また、アルギニン酸などのアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツノル酸などの有機酸の塩も含まれる（たとえば、Berge他、「製薬塩（Pharmaceutical Salts）」、Journal of Pharmaceutical Science、６６：１〜１９（１９７７）参照）。本発明の特定の具体的な化合物は、化合物が塩基または酸付加塩のどちらかに変換されることを可能にする、塩基性および酸性官能基をどちらも含む。

化合物の中性型は、好ましくは、塩を塩基または酸と接触させ、慣用の様式で親化合物を単離することによって再生する。化合物の原型は、極性溶媒に対する溶解度などの特定の物理特性において様々な塩形態とは異なる。

本明細書中で使用する「塩対イオン」とは、本発明の化合物と、その部分の１つが負荷電（たとえばＣＯＯ−）である場合に会合する正荷電イオンを指す。塩対イオンの例には、H^＋、Ｈ_３Ｏ^＋、アンモニウム、カリウム、カルシウム、リチウム、マグネシウムおよびナトリウムが含まれる。

本明細書中で使用する用語「ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコール部分を含むシアル酸とコンジュゲートしているシチジン一リン酸分子を指す。ポリエチレングリコール鎖の長さが指定されていない場合は、任意のＰＥＧ鎖の長さが可能である（たとえば、１ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ）。例示的なＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧは、スキーム１の化合物５である。

Ｉ．導入
治療目的で使用する組換えペプチドの有効性を改善するために、本発明は、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドと修飾基とのコンジュゲートを提供する。修飾基は、高分子修飾基、たとえば、ＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ）、ＰＰＧ（ｍ−ＰＰＧ）など、治療用部分、診断用部分、標的化部分などから選択し得る。たとえば水溶性高分子修飾基を用いたペプチドの修飾は、患者の循環中の組換えペプチドの安定性および保持時間を改善する、および／または組換えペプチドの抗原性を低下させることができる。

本発明のペプチドコンジュゲートは、修飾糖とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの酵素結合によって形成することができる。グリコシル化部位および／または修飾グリコシル基は、修飾基を保有する修飾糖をペプチドに、たとえばグリココンジュゲーションによってコンジュゲートさせるための部位を提供する。

また、本発明の方法は、実質的に均質な誘導体化パターンを有するペプチドコンジュゲートおよび糖ペプチドコンジュゲートをアセンブルすることも可能にする。本発明で使用する酵素は、一般に、ペプチドの特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の組合せ、特定のグリコシル残基、またはグリコシル残基の組合せに対して選択的である。また、本方法は、ペプチドコンジュゲートの大スケールの生成にも実用的である。したがって、本発明の方法は、事前に選択した均一な誘導体化パターンを有するペプチドコンジュゲートの大スケール調製の実用的な手段を提供する。本方法は、それだけには限定されないが、細胞培養細胞（たとえば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、もしくは原核細胞）またはトランスジェニック植物もしくは動物の産生中の不完全にグリコシル化された糖ペプチドを含めた、治療ペプチドの修飾に特によく適している。

また、本発明は、たとえばクリアランス速度の減少、または免疫もしくは細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込み速度の減少によって治療半減期が増加した、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドのコンジュゲートも提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原性決定因子をマスキングし、それにより、ペプチドに対する宿主の免疫応答を減少または排除するための手段を提供する。ペプチドを、特定の標的化剤に特異的な特定の組織または細胞表面受容体に対して標的化するために、標的化剤の選択的結合も用いることができる。

水溶性ポリマーを用いたペプチドコンジュゲートの調製に最適な条件の決定は、たとえば、ペプチドおよび水溶性ポリマーのアイデンティティーに依存する、数々のパラメータの最適化を含む。たとえば、ポリマーがポリ（エチレングリコール）、たとえば分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）である場合、反応中で利用するポリマーの量とポリマーの存在に起因する反応混合物の粘度との間でバランスを確立することが好ましい。ポリマーの濃度が高すぎる場合は、反応混合物は粘稠になり、物質移動および反応の速度が遅くなる。

さらに、過剰の酵素を加えることが直感的に明らかであるが、本発明者らは、酵素があまりにも過剰に存在する場合は、過剰の酵素が除去に余分な精製ステップおよび材料を要する汚染物質となり、最終生成物のコストを不必要に増加させることを認識した。

さらに、調節されたレベルの修飾を有するペプチドを生成することが一般に望まれる。一部の例では、１つの修飾糖を優先的に加えることが望ましい。他の場合では、２つの修飾糖を優先的に加えることが望ましい。したがって、ペプチドに対する修飾基のコンジュゲーションの度合に影響を与えるために反応条件を調節することが好ましい。

本発明は、所望のレベルのコンジュゲーションを有するペプチドの収量が最大となる条件を提供する。また、本発明の例示的な実施形態の条件は、様々な試薬および材料の費用ならびに生成物の精製に必要な時間も認識する。本明細書中に記載の反応条件は、優れた収量の所望の生成物を提供する一方で、高価な試薬の無駄を最小限にするように、最適化されている。

ＩＩ．物質／ペプチドコンジュゲートの組成
第１の態様では、本発明は、修飾糖とペプチドとの間のコンジュゲートを提供する。また、本発明は、修飾基とペプチドとの間のコンジュゲートも提供する。ペプチドコンジュゲートは、いくつかの形態のうちの１つを有することができる。例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、ペプチドおよびグリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸と連結している修飾基を含むことができる。別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、ペプチドおよびグリコシル連結基を介してペプチドのグリコシル残基と連結している修飾基を含むことができる。別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、ペプチド、ならびに糖ペプチド炭水化物に結合しており、かつペプチド主鎖のアミノ酸残基に直接結合しているグリコシル連結基を含むことができる。さらに別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、ペプチドおよびペプチドのアミノ酸残基に直接連結した修飾基を含むことができる。本実施形態では、ペプチドコンジュゲートはグリコシル基を含んでいなくてもよい。これらの実施形態の任意のものにおいて、ペプチドは、グリコシル化されていても、されていなくてもよい。

本発明のコンジュゲートは、典型的には、以下の一般構造に対応する。

式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは、正の０でない整数を表し、ｔは、０または正の整数である。「薬剤」、または修飾基は、治療剤、生物活性剤、検出可能な標識、水溶性ポリマー（たとえば、ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、およびｍ−ＰＰＧ）などの高分子修飾基等であることができる。「薬剤」、または修飾基は、ペプチド、たとえば、酵素、抗体、抗原などであることができる。リンカーは、幅広い範囲の連結基のうちの任意のものであることができ、下記を参照されたい。あるいは、リンカーは単結合または「０次リンカー」であり得る。

ＩＩ．Ａ．ペプチド
ペプチドコンジュゲート中のペプチドは、図７のペプチドから選択されるメンバーである。このような場合には、ペプチドコンジュゲート中のペプチドは、骨形態発生タンパク質（たとえば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン（たとえば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）、成長分化因子（たとえばＧＤＦ−５）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、完全長第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α_１−抗トリプシン（ＡＴＴ、すなわちα−１プロテアーゼ阻害剤、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧＦｃ領域融合タンパク質（Enbrel（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（Herceptin（商標））、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（Synagis（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（Remicade（商標））、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（Reopro（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（Rituxan（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（Fabrazyme（商標））、α−イズロニダーゼ（Aldurazyme（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡおよび線維芽細胞成長因子から選択されるメンバーである。特定の実施形態では、ペプチドコンジュゲート中のペプチドは、第ＶＩＩＩ因子である。他の実施形態では、ペプチドコンジュゲート中のペプチドは、インターフェロンαである。

例示的な実施形態では、高分子修飾基は、以下の式に従った部分が含まれる構造を有する。

上記のものなど、修飾基が分枝鎖状水溶性ポリマーである例示的な実施形態では、シアリダーゼの濃度は、約１．５〜約２．５Ｕ／Ｌの反応混合物であることが一般に好ましい。より好ましくは、シアリダーゼの量は約２Ｕ／Ｌである。

別の例示的な実施形態では、約５〜約９グラムのペプチド基質を上述の量のシアリダーゼと接触させる。

修飾糖は、反応混合物中に約１グラム〜約６グラム、好ましくは約３グラム〜約４グラムの量で存在する。一般に、分枝鎖状水溶性ポリマー修飾部分、たとえば上記の部分を有する修飾糖の濃度を、約０．５ｍＭ未満に維持することが好ましい。

特定の実施形態では、修飾基は、約２０ｋＤ〜約６０ｋＤ、より好ましくは約３０ｋＤ〜約５０ｋＤ、さらにより好ましくは約４０ｋＤの分子量を有する、分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、たとえばポリ（エチレングリコール）である。他の実施形態では、修飾基は、少なくとも約８０ｋＤ、好ましくは少なくとも約１００ｋＤ、より好ましくは少なくとも約１２０ｋＤ、少なくとも約１４０ｋＤまたは少なくとも約１６０ｋＤの分子量を有する、分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、たとえばポリ（エチレングリコール）である。さらに別の実施形態では、分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、たとえばポリ（エチレングリコール）は、少なくとも約２００ｋＤであり、たとえば、少なくとも約１６０ｋＤ、少なくとも約１８０ｋＤを含めた、少なくとも約８０ｋＤ〜少なくとも約２００ｋＤである。当業者には理解されるように、ポリマーの分子量はしばしば多分散であり、したがって、分子量のコンテクストにおける語句「約」には、好ましくは、指定した数の周辺の値の範囲が包含される。たとえば、約４０ｋＤの分子量を有する好ましい修飾基は、約３５ｋＤ〜約４５ｋＤの分子量を有するものである。当業者は、上述の分枝鎖状ＰＥＧ構造の信頼性は、単に例示を明らかにするためのものであり、ＰＥＧは、それだけには限定されないが、本明細書中に見つかる「高分子部分」の定義に記載の種を含めた実質的に任意の高分子部分によって置き換えることができることを理解されよう。

グリコシルトランスフェラーゼの濃度に関して、好ましい本実施形態では、上述の修飾基を用いて、グリコシルトランスフェラーゼ対ペプチドの比は、約４０μｇ／ｍＬのトランスフェラーゼに対して約２００μＭのペプチドである。

ＩＩ．Ｂ．修飾糖
例示的な実施形態では、第ＶＩＩＩ因子、インターフェロンα、および図７に記載のペプチドなどの本発明のペプチドを、修飾糖と反応させて、ペプチドコンジュゲートを形成させる。修飾糖は、「糖ドナー部分」ならびに「糖転移部分」を含む。糖ドナー部分とは、グリコシル部分またはアミノ酸部分のどちらかを介して、本発明のコンジュゲートとしてペプチドと結合する、修飾糖の任意の部分である。糖ドナー部分には、修飾糖からペプチドコンジュゲートのグリコシル連結基へそれを変換する間に化学的に変更される原子が含まれる。糖転移部分とは、本発明のコンジュゲートとしてペプチドと結合しない、修飾糖の任意の部分である。たとえば、本発明の修飾糖は、ＰＥＧ化された糖ヌクレオチド、ＰＥＧ−シアル酸ＣＭＰである。ＰＥＧ−シアル酸ＣＭＰでは、糖ドナー部分、またはＰＥＧ−シアリルドナー部分はＰＥＧ−シアル酸を含み、一方で、糖転移部分、またはシアリル転移部分はＣＭＰを含む。

本発明において役立つ修飾糖では、糖部分は、好ましくはサッカライド、デオキシ−サッカライド、アミノ−サッカライド、またはＮ−アシルサッカライドである。用語「サッカライド」およびその均等物である「糖（saccharyl）」、「糖」、および「グリコシル」とは、単量体、二量体、オリゴマーおよびポリマーを指す。また、糖部分は修飾基で官能化されている。修飾基は、典型的には糖上のアミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル、たとえば一次ヒドロキシルの部分とのコンジュゲーションを介して、糖部分とコンジュゲートしている。例示的な実施形態では、修飾基は、糖上のアミン部分を介して、たとえば、アミンと修飾基の反応性誘導体との反応によって形成されたアミド、ウレタンまたは尿素を介して、結合している。

任意の糖部分を、修飾糖の糖ドナー部分として利用することができる。糖部分は、マンノース、ガラクトースもしくはグルコースなどの既知の糖、または既知の糖の立体化学を有する種であることができる。これらの修飾糖の一般式は以下のとおりである。

本発明の組成物の形成において有用な他の糖部分には、それだけには限定されないが、フコースおよびシアル酸、ならびにグルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミン類似体などのアミノ糖等が含まれる。糖部分は、天然に存在する構造であるか、または修飾基とコンジュゲーションするための部位を提供するために修飾されていることができる。たとえば、一実施形態では、修飾糖は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置き換えられているシアル酸誘導体を提供する。アミンは、選択した修飾基の活性類似体で容易に誘導体化される。

本発明において役立つ修飾糖の例は、本明細書中に参照により組み込れられるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／００２５２２号に記載されている。

さらなる例示的な実施形態では、本発明は、６−ヒドロキシル位置が、上述のものなどのリンカー−修飾基カセットを保有する対応するアミン部分に変換されている、修飾糖を利用する。これらの修飾糖の核として使用することができる例示的なグリコシル基には、Ｇｌｕ、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどが含まれる。本実施形態による代表的な修飾糖は以下の式を有する。

式中、Ｒ^１１〜Ｒ^１４は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_３から独立して選択されるメンバーである。Ｒ^１０は、別のグリコシル残基（−Ｏ−グリコシル）または第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子ペプチドのアミノ酸（−ＮＨ−（第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子））との連結である。Ｒ^１４は、ＯＲ^１、ＮＨＲ^１またはＮＨ−Ｌ−Ｒ^１である。Ｒ^１およびＮＨ−Ｌ−Ｒ^１は、上述のとおりである。

ＩＩ．Ｃ．グリコシル連結基
例示的な実施形態では、本発明は、本発明の修飾糖とペプチドとの間で形成されたペプチドコンジュゲートを提供する。別の例示的な実施形態では、修飾糖上の修飾基が

部分を含み、ペプチドコンジュゲート中のペプチドは図７のペプチドから選択されるメンバーである場合。さらに別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲート中のペプチドは、骨形態発生タンパク質（たとえば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン（たとえば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）、成長分化因子（たとえばＧＤＦ−５）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、完全長第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α_１−抗トリプシン（ＡＴＴ、すなわちα−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧＦｃ領域融合タンパク質（Enbrel（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（Herceptin（商標））、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（Synagis（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（Remicade（商標））、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（Reopro（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（Rituxan（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（Fabrazyme（商標））、α−イズロニダーゼ（Aldurazyme（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡおよび線維芽細胞成長因子から選択されるメンバーである。特定の実施形態では、ペプチドは第ＶＩＩＩ因子またはインターフェロンαである。本実施形態では、修飾糖の糖ドナー部分（糖部分および修飾基など）が「グリコシル連結基」となる。あるいは、「グリコシル連結基」は、ペプチドと修飾基との間に差し込まれたグリコシル部分を指すこともできる。

例示的な実施形態では、高分子修飾基には、以下の式に従った構造を有する部分が含まれる。

例示的な実施形態では、修飾糖上の修飾基には、以下の部分が含まれる。

例示的な実施形態では、Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ、−ＯＨおよび−ＯＣＨ_３から選択されるメンバーである。

当業者には理解されるように、上述の構造のそれぞれ中のＰＥＧ部分は、それだけには限定されないが本明細書中で「高分子部分」として定義した種を含めた、任意の他の高分子部分によって置き換えることができる。

ペプチド上のグリコシル残基を付加および／または修飾するために利用可能な方法の多用途性により、グリコシル連結基は実質的に任意の構造を有することができる。以下の記述では、本発明を、フラノースおよびピラノースの選択した誘導体の使用を参照により例示する。当業者は、記述の焦点は例示を明確にするためであり、記載した構造および組成物は、グリコシル連結基および修飾糖の属全体にわたって一般に適用可能であることを理解されよう。グリコシル連結基は、事実上任意のモノ−またはオリゴ−サッカライドを含むことができる。グリコシル連結基は、側鎖を介してまたはペプチド主鎖を介して、アミノ酸に結合していることができる。あるいは、グリコシル連結基は、糖部分を介してペプチドに結合していることができる。この糖部分は、ペプチド上のＯ連結またはＮ連結のグリカン構造の一部分であることができる。

例示的な実施形態では、本発明は、以下から選択される式を有する完全なグリコシル連結基を含むペプチドコンジュゲートを提供する。

式ＩおよびＩａでは、Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７またはＯＲ^７であり、Ｒ^７は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを表す。ＣＯＯＲ^７がカルボン酸またはカルボキシレートである場合、どちらの形態も、単一の構造ＣＯＯ⁻またはＣＯＯＨの指定によって表す。式Ｉ、Ｉａ、ＩＩまたはＩＩａでは、記号Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^６’は、独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９を表す。指数ｄは、０または１である。Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、シアル酸またはポリシアル酸から独立して選択される。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’のうちの少なくとも１つには、修飾基が含まれる。この修飾基は、結合または連結基を介して連結されている高分子修飾部分、たとえばＰＥＧであることができる。例示的な実施形態では、Ｒ^６およびＲ^６’は、それらが結合している炭素と一緒になって、シアル酸のピルビル側鎖の構成要素である。さらなる例示的な実施形態では、ピルビル側鎖は高分子修飾基で官能化されている。別の例示的な実施形態では、Ｒ^６およびＲ^６’は、それらが結合している炭素と一緒になって、シアル酸の側鎖の構成要素であり、高分子修飾基は、Ｒ^５の構成要素である。

例示的な実施形態では、本発明は、以下の式を有するグリコシル連結基を利用する。

式中、Ｊはグリコシル部分であり、Ｌは結合またはリンカーであり、Ｒ^１は、修飾基、たとえば高分子修飾基である。例示的な結合は、グリコシル部分上のＮＨ_２部分と修飾基上の相補的反応性基との間で形成されたものである。たとえば、Ｒ^１にカルボン酸部分が含まれる場合、この部分を活性化させてグリコシル残基上のＮＨ_２部分とカップリングさせて、構造ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^１を有する結合を与え得る。Ｊは、好ましくは、ピラノースまたはフラノース構造を切断する条件、たとえば酸化的条件、たとえば過ヨウ素酸ナトリウムに曝露されることによって分解されていない、「完全な」グリコシル部分である。

例示的なリンカーには、アルキルおよびヘテロアルキル部分が含まれる。リンカーには、連結基、たとえばアシルに基づいた連結基、たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などが含まれる。連結基は、本発明の種の構成要素間、たとえば、グリコシル部分とリンカー（Ｌ）との間、またはリンカーと修飾基（Ｒ^１）との間で形成された結合である。他の例示的な連結基は、エーテル、チオエーテルおよびアミンである。たとえば、一実施形態では、リンカーは、グリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分が、グリコシル残基上のアミンとの反応によって対応するアミドに変換され、グリシンのアミンが、修飾基の活性カルボン酸またはカーボネートとの反応によって対応するアミドまたはウレタンに変換される。

ＮＨ−Ｌ−Ｒ^１の例示的な種は、式：−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨ｝_ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨ｝_ｔＲ^１を有し、式中、指数ｓおよびｔは、独立して、０または１である。指数ａ、ｂおよびｄは、独立して、０〜２０の整数であり、ｃは、１〜２５００の整数である。他の同様のリンカーは、−ＮＨ部分が、別の基、たとえば、−Ｓ、−Ｏまたは−ＣＨ_２によって置き換えられている種に基づいている。当業者には理解されるように、指数ｓおよびｔに対応する括弧内の部分のうちの１つまたは複数を、置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル部分で置き換えることができる。

より詳細には、本発明は、ＮＨ−Ｌ−Ｒ^１が、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨ（ＣＨ_２）_ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨＲ^１、ＮＨ（ＣＨ_２）_ａＮＨＲ^１、およびＮＨＲ^１である化合物を利用する。これらの式では、指数ａ、ｂおよびｄは、０〜２０、好ましくは１〜５の整数から独立して選択される。指数ｃは、１〜約２５００の整数である。

例示的な実施形態では、ｃは、ＰＥＧ部分が約１ｋＤ、５ｋＤ、１０、ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤまたは４５ｋＤであるように選択する。

利便性のため、本セクションの残りの部分におけるグリコシル連結基は、シアリル部分に基づく。しかし、当業者には、マンノシル、ガラクトシル、グルコシル、またはフコシルなどの別のグリコシル部分を、シアリル部分の代わりに使用できることが理解されよう。

例示的な実施形態では、グリコシル連結基は完全なグリコシル連結基であり、グリコシル部分または連結基を形成する部分は、化学的（たとえばメタ過ヨウ素酸ナトリウム）または酵素的（たとえばオキシダーゼ）プロセスによって分解されない。本発明の選択したコンジュゲートには、アミノ−サッカライド、たとえば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミン部分に結合している修飾基が含まれる。このモチーフに従った例示的な修飾基−完全なグリコシル連結基のカセットは、以下の式を有するものなど、シアル酸構造に基づいている。

上記式で、Ｒ^１およびＬは、上述のとおりである。例示的なＲ^１基の構造に関するさらなる詳細を以下に提供する。

さらなる例示的な実施形態では、コンジュゲートは、ペプチドと修飾糖との間で形成されており、修飾基は、修飾糖の６−炭素位置でリンカーを介して結合している。したがって、本実施形態による例示的なグリコシル連結基は、以下の式を有する。

式中、基は上述のとおりである。グリコシル連結基には、それだけには限定されないが、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチル−マンノサミンなどが含まれる。

一実施形態では、本発明は、以下のグリコシル連結基を含むペプチドコンジュゲートを提供する。

Ｄは、−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり；Ｇは、Ｒ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル−Ｒ^１から選択されるメンバーであり；Ｒ^１は、直鎖状ポリ（エチレングリコール）残基および分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり；
Ｍは、Ｈ、塩対イオンおよび単一の負電荷から選択されるメンバーであり；Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである。例示的な実施形態では、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ^１−Ｌ−である。別の例示的な実施形態では、Ｇは−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルである場合、ＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−である。

本発明の任意の化合物において、ＣＯＯＨ基はＣＯＯＭであることもでき、Ｍは、Ｈ、負電荷、および塩対イオンから選択されるメンバーである。

本発明は、以下の式を有するグリコシル連結基が含まれるペプチドコンジュゲートを提供する。

式中、ＤおよびＧは上述のとおりである。

他の実施形態では、グリコシル連結基は以下の式を有する。

式中、ＤおよびＧは上述のとおりであり、指数ｔは０または１である。

さらなる例示的な実施形態では、グリコシル連結基は以下の式を有する。

さらに別の実施形態では、グリコシル連結基は以下の式を有する。

式中、ＤおよびＧは上述のとおりであり、指数ｐは、１〜１０の整数を表し；ａは、０または１である。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、以下の式から選択されるグリコシル部分を含む。

式中、指数ａおよびリンカーＬ^ａは、上述のとおりである。指数ｐは、１〜１０の整数である。指数ｔおよびａは、０または１から独立して選択される。これらの基のそれぞれを、上述のモノ−、ビ−、トリ−およびテトラ−分岐（antennary）サッカライド構造の構成要素として含めることができる。ＡＡは、ペプチドのアミノ酸残基である。当業者は、これらの式中のＰＥＧ部分を、他の非反応基および高分子部分で置き換えることができることを、理解されよう。例示的なポリマーには、ポリ（酸化アルキレン）ファミリーのものが含まれる。非反応基には、生理的ｐＨで本質的に非反応性、中性および／または安定であると考えられている基、たとえば、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルなどが含まれる。例示的な高分子部分には、式ＩＩＩａおよびその例に記載の分枝鎖状構造が含まれる。

例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約２０ｋＤである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約５ｋＤである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約１０ｋＤである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約４０ｋＤである。他の実施形態では、修飾基は、少なくとも約８０ｋＤ、好ましくは少なくとも約１００ｋＤ、より好ましくは少なくとも約１２０ｋＤ、少なくとも約１４０ｋＤまたは少なくとも約１６０ｋＤの分子量の、分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、たとえばポリ（エチレングリコール）である。さらに別の実施形態では、分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、たとえばポリ（エチレングリコール）は、少なくとも約２００ｋＤ、たとえば、少なくとも約１６０ｋＤおよび少なくとも約１８０ｋＤを含めた、少なくとも約８０ｋＤ〜少なくとも約２００ｋＤである。例示的な実施形態では、分枝鎖状ポリマー自体が、分枝部分（たとえば、システイン、セリン、リシン、およびリシンのオリゴマー）に結合している。

例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、システイン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。別の例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、リシン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、システイン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、リシン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、システイン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−５ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つ、２つまたは３つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、リシン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−５ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つ、２つまたは３つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、システイン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、リシン残基に基づいた分枝鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。

式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５またはＲ^６のうちの少なくとも１つは、以下から選択されるメンバーである構造を有する。

式中、変数は上述のとおりである。当業者は、上述の分枝鎖状ＰＥＧ構造の信頼性は、単に例示を明らかにするためのものであり、ＰＥＧは、それだけには限定されないが、本明細書中に見つかる「高分子部分」の定義に記載の種を含めた実質的に任意の高分子部分によって置き換えることができることを理解されよう。

例示的な実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５またはＲ^６のうちの少なくとも１つは、以下の式に従った構造を有する。

例示的な実施形態では、Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ、−ＯＨおよび−ＯＣＨ_３から選択される。

本実施形態による例示的な高分子修飾基には、以下が含まれる。

例示的な実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５またはＲ^６のうちの１つだけが、上述の修飾基が含まれる構造を有する。

式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５またはＲ^６は、上述のとおりである。

式中、Ｌ−（Ｒ^１）_ｗは、以下から選択されるメンバーである。

式中、変数は上述のとおりである。

例示的な実施形態では、Ｌ−（Ｒ^１）_ｗは、以下の式に従った構造を有する。

例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１〜約１０００から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１〜約５００から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１〜約７０、約７０〜約１５０、約１５０〜約２５０、約２５０〜約３７５および約３７５〜約５００から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１０〜約３５、約４５〜約６５、約９５〜約１３０、約２１０〜約２４０、約３１０〜約３７０および約４２０〜約４８０から独立して選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１５〜約３０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約５０〜約６５から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約１００〜約１３０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約２１０〜約２４０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約３１０〜約３７０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ｍおよびｎは、約４３０〜約４７０から選択される整数である。

式中、変数は上述のとおりである。

別の例示的な実施形態では、本実施形態による種には、以下が含まれる。

式中、変数は上述のとおりである。

例示的な実施形態では、本発明のグリコＰＥＧ化されたペプチドコンジュゲートは、以下に記載の式から選択される。

式中、変数は上述のとおりである。

上記式で、指数ｔは、０〜１の整数であり、指数ｐは、１〜１０の整数である。記号Ｒ^１５’は、Ｈ、ＯＨ（たとえばＧａｌ−ＯＨ）、シアリル部分、シアリル連結基（すなわち、シアリル連結基−高分子修飾基（Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）、またはポリマー修飾したシアリル部分が結合したシアリル部分（たとえばＳｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａ^ｐ」））、ガラクトシル部分、ガラクトシル連結基（すなわち、ガラクトシル連結基−高分子修飾基（Ｇａｌ−Ｌ−Ｒ^１）、またはポリマー修飾したガラクトシル部分が結合したシアリル部分（たとえばＳｉａ−Ｇａｌ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｇａｌ^ｐ」））、ガラクトサミニル部分、ガラクトサミニル連結基（すなわち、ガラクトサミニル連結基−高分子修飾基（ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−Ｒ^１）、またはポリマー修飾したガラクトサミニル部分が結合したシアリル部分（たとえばＳｉａ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−ＧａｌＮＡｃ^ｐ」））、グルコシル部分、グルコシル連結基（すなわち、グルコシル連結基−高分子修飾基（Ｇｌｃ−Ｌ−Ｒ^１）、またはポリマー修飾したグルコシル部分が結合したシアリル部分（たとえばＳｉａ−Ｇｌｃ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｇｌｃ^ｐ」））、グルコサミニル部分、グルコサミニル連結基（すなわち、グルコサミニル連結基−高分子修飾基（ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−Ｒ^１）、またはポリマー修飾したグルコサミニル部分が結合したシアリル部分（たとえばＳｉａ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−ＧｌｃＮＡｃ^ｐ」））、マンノシル部分、マンノシル連結基（すなわち、マンノシル連結基−高分子修飾基（Ｍａｎ−Ｌ−Ｒ^１）、またはポリマー修飾したマンノシル部分が結合したシアリル部分（たとえばＳｉａ−Ｍａｎ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｍａｎ^ｐ」））、フコシル部分、フコシル連結基（すなわち、フコシル連結基−高分子修飾基（Ｆｕｃ−Ｌ−Ｒ^１）、またはポリマー修飾したフコシル部分が結合したシアリル部分（たとえばＳｉａ−Ｆｕｃ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｆｕｃ^ｐ」））を表す。例示的なポリマー修飾した糖部分は、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩまたはＩＩａに従った構造を有する。本発明の例示的なペプチドコンジュゲートには、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩおよびＩＩａに従った構造が含まれるＲ^１５’を有する少なくとも１つのグリカンが含まれる。式Ｉ、Ｉａ、ＩＩまたはＩＩａの空いた原子価を有する酸素は、好ましくは、グリコシド結合を介して、ＧａｌまたはＧａｌＮＡｃ部分の炭素に結合している。さらなる例示的な実施形態では、酸素は、ガラクトース残基の位置３の炭素に結合している。例示的な実施形態では、修飾シアル酸は、ガラクトース残基にα２，３−で連結している。別の例示的な実施形態では、シアル酸は、ガラクトース残基にα２，６−で連結している。

例示的な実施形態では、シアリル連結基は、ポリマー修飾したシアリル部分が結合したシアリル部分である（たとえばＳｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａ^ｐ」）。ここでは、グリコシル連結基は、シアリル部分を介してガラクトシル部分と連結している。

このモチーフに従った例示的な種は、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合を形成する酵素、たとえば、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを用いて、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１をグリカンの末端シアル酸とコンジュゲートさせることによって調製する。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲート上のグリカンは、以下の群およびその組合せから選択される式を有する。

上記式のそれぞれで、Ｒ^１５’は上述のとおりである。さらに、本発明の例示的なペプチドコンジュゲートには、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩまたはＩＩａに従った構造を有するＲ^１５部分を有する少なくとも１つのグリカンが含まれる。

別の例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、以下の式を有する少なくとも１つのグリコシル連結基を含む。

式中、Ｒ^１５は、前記シアリル連結基であり；指数ｐは、１〜１０から選択される整数である。

例示的な実施形態では、グリコシル連結部分は以下の式を有する。

式中、ｂは、０〜１の整数である。指数ｓは、１〜１０の整数を表し；指数ｆは、１〜２５００の整数を表す。

例示的な実施形態では、高分子修飾基はＰＥＧである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約２０ｋＤである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約５ｋＤである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約１０ｋＤである。別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は約４０ｋＤである。他の実施形態では、修飾基は、少なくとも約８０ｋＤ、好ましくは少なくとも約１００ｋＤ、より好ましくは少なくとも約１２０ｋＤ、少なくとも約１４０ｋＤまたは少なくとも約１６０ｋＤの分子量を有する、分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、たとえばポリ（エチレングリコール）である。さらに別の実施形態では、分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、たとえばポリ（エチレングリコール）は、少なくとも約２００ｋＤ、たとえば、少なくとも約１６０ｋＤおよび少なくとも約１８０ｋＤを含めた、少なくとも約８０ｋＤ〜少なくとも約２００ｋＤである。

例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、直鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。別の例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、直鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−２０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、直鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−５ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つ、２つまたは３つが、ペプチドと共有結合している。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、直鎖状ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤ部分であり、これらのグリコシル連結基のうちの１つまたは２つが、ペプチドと共有結合している。

別の例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、以下の式を有するシアリル連結基である。

別の例示的な実施形態では、Ｑは、ＨおよびＣＨ_３から選択されるメンバーである。別の例示的な実施形態では、前記グリコシル連結基は以下の式を有する。

式中、Ｒ^１５は、前記シアリル連結基であり；指数ｐは、１〜１０から選択される整数である。例示的な実施形態では、グリコシル連結基は、以下の式を含む。

式中、指数ｂは、０および１から選択される整数である。例示的な実施形態では、指数ｓは１であり；指数ｆは、約２００〜約３００から選択される整数である。

ＩＩ．Ｄ．修飾基
本発明のペプチドコンジュゲートは、修飾基を含む。この基は、アミノ酸またはグリコシル連結基を介してペプチドと共有結合していることができる。別の例示的な実施形態では、修飾基が、

の部分を含み、ペプチドコンジュゲート中のペプチドは図７のペプチドから選択されるメンバーである場合。別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲート中のペプチドは、骨形態発生タンパク質（たとえば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン（たとえば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）、成長分化因子（たとえばＧＤＦ−５）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、完全長第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α_１−抗トリプシン（ＡＴＴ、すなわちα−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧＦｃ領域融合タンパク質（Enbrel（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（Herceptin（商標））、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（Synagis（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（Remicade（商標））、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（Reopro（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（Rituxan（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（Fabrazyme（商標））、α−イズロニダーゼ（Aldurazyme（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡおよび線維芽細胞成長因子から選択されるメンバーである。「修飾基」には、標的化部分、治療用部分、生体分子を含めた様々な構造が包含され得る。さらに、「修飾基」には、身体におけるその生体利用度またはその半減期などのペプチドの特性を変更することができるポリマーである、高分子修飾基が含まれる。

上記式による別の例示的な実施形態では、高分子修飾基には、以下の式に従った部分が含まれる。

利便性のため、本セクションの残りの部分における修飾基は、大部分が水溶性および非水溶性ポリマーなどの高分子修飾基に基づく。しかし、当業者には、標的化部分、治療用部分および生体分子などの他の修飾基を、高分子修飾基の代わりに使用できることが理解されよう。さらに、当業者は、上述の分枝鎖状ＰＥＧ構造の信頼性は、単に例示を明らかにするためのものであり、ＰＥＧは、それだけには限定されないが、本明細書中に見つかる「高分子部分」の定義に記載の種を含めた実質的に任意の高分子部分によって置き換えることができることを理解されよう。

ＩＩ．Ｄ．ｉ．修飾基のリンカー
修飾基のリンカーは、修飾基（すなわち、高分子修飾基、標的化部分、治療用部分および生体分子）をペプチドに結合させる役割を果たす。例示的な実施形態では、高分子修飾基は、以下に示すように、一般に核上のヘテロ原子、たとえば窒素を介して、リンカーＬを介して、グリコシル連結基と結合している。

Ｒ^１は、高分子部分であり、Ｌは、結合および連結基から選択される。指数ｗは、１〜６、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２から選択される整数を表す。例示的な連結基には、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸が含まれる。リンカーの例示的な構成要素はアシル部分である。

本発明による例示的な化合物は、上記式Ｉ、Ｉａ、ＩＩまたはＩＩａに従った構造を有し、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’のうちの少なくとも１つは、以下の式を有する。

本実施形態による別の例では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’のうちの少なくとも１つは、以下の式を有する。

式中、ｓは、０〜２０の整数であり、Ｒ^１は、直鎖状高分子修飾部分である。

例示的な実施形態では、高分子修飾基−リンカー構築体は、中心部分と結合した２本以上の高分子鎖が含まれる分枝鎖状構造である。本実施形態では、構築体は以下の式を有する。

式中、Ｒ^１およびＬは、上述のとおりであり、ｗ’は、２〜６、好ましくは２〜４、より好ましくは２〜３の整数である。

Ｌが結合である場合、これは、Ｒ^１の前駆体上の反応性官能基と糖核上の相補的反応性の反応性官能基との間で形成されている。Ｌが非０次リンカーである場合、Ｌの前駆体は、Ｒ^１前駆体との反応の前にグリコシル部分上に配置されていることができる。あるいは、Ｒ^１の前駆体およびＬを事前に形成したカセット内に取り込ませ、続いてそれをグリコシル部分に結合させることができる。本明細書中に記載するように、適切な反応性官能基を用いて前駆体を選択および調製することは、当業者の能力範囲内にある。さらに、前駆体のカップリングは、当分野で周知の化学によって進行する。

例示的な実施形態では、Ｌは、アミノ酸、または小ペプチド（たとえば１〜４個のアミノ酸残基）から形成される連結基であり、高分子修飾基が置換されたアルキルリンカーを介して結合している修飾糖がもたらされる。例示的なリンカーには、グリシン、リシン、セリンおよびシステインが含まれる。ＰＥＧ部分は、アミドまたはウレタン結合を介してリンカーのアミン部分に結合していることができる。ＰＥＧは、システインおよびセリンの硫黄または酸素原子と、それぞれチオエーテルまたはエーテル結合を介して連結している。

例示的な実施形態では、Ｒ^５には高分子修飾基が含まれる。別の例示的な実施形態では、Ｒ^５には高分子修飾基およびリンカーＬがどちらも含まれ、修飾基を分子の残りの部分と結合している。上述のように、Ｌは、直鎖状または分枝鎖状構造であることができる。同様に、高分子修飾基は分枝鎖状または直鎖状であることができる。

ＩＩ．Ｄ．ｉｉ．水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが当業者に知られており、本発明の実施において有用である。用語、水溶性ポリマーには、サッカライド（たとえば、デキストラン、アミロース、ヒアロウロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、たとえば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（たとえば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、たとえばポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などの種が包含される。本発明は、任意の水溶性ポリマーを用いて実施し得るが、唯一の制限は、ポリマーにはコンジュゲートの残りの部分が結合できる点が含まれていなければならないことである。

また、ポリマーを活性化させる方法は、国際公開公報ＷＯ９４／１７０３９号、米国特許第５，３２４，８４４号、国際公開公報ＷＯ９４／１８２４７号、国際公開公報ＷＯ９４／０４１９３号、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、国際公開公報ＷＯ９０／１３５４０号、米国特許第５，２８１，６９８号、およびさらに国際公開公報ＷＯ９３／１５１８９号に見つけることができ、活性ポリマーとペプチド、たとえば第ＶＩＩＩ凝固因子（国際公開公報ＷＯ９４／１５６２５号）、ヘモグロビン（国際公開公報ＷＯ９４／０９０２７号）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Veronese他、App. Biochem. Biotech.、１１：１４１〜４５（１９８５））とをコンジュゲーションさせる方法も見つけることができる。

例示的な水溶性ポリマーは、ポリマーの試料中のポリマー分子の相当な割合がほぼ同じ分子量であるものである。そのようなポリマーは、「ホモ分散」である。

本発明は、ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートを参照によりさらに例示する。ＰＥＧの官能化およびコンジュゲーションに関するいくつかの総説および研究所が利用可能である。たとえば、Ｈａｒｒｉｓ、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１３５：３０〜６５（１９８７）；Ｗｏｎｇ他、ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏ他、ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ９：２４９〜３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．６：１５０〜１６５（１９９５）；およびＢｈａｄｒａ他、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５〜２９（２００２）を参照されたい。反応性ＰＥＧ分子を調製し、反応性分子を用いてコンジュゲートを形成する経路は、当分野で知られている。たとえば、米国特許第５，６７２，６６２号は、直鎖状または分枝鎖状ポリ（酸化アルキレン）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性かつ単離可能なコンジュゲートを開示している。

米国特許第６，３７６，６０４号は、ポリマーの末端ヒドロキシルをジ（１−ベンゾトリアゾイル）カーボネートと有機溶媒中で反応させることによって、水溶性かつ非ペプチド性のポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルを調製する方法を記載している。活性エステルを用いて、タンパク質またはペプチドなどの生物学的活性剤とのコンジュゲートを形成する。

国際公開公報ＷＯ９９／４５９６４号は、生物学的活性剤と、安定な連結を介してポリマー主鎖と連結している少なくとも１つの末端を有するポリマー主鎖を含む活性水溶性ポリマーとを含むコンジュゲートを記載しており、少なくとも１つの末端は、近位反応基が連結している分枝部分を含み、生物学的活性剤は、近位反応基のうちの少なくとも１つに連結している。他の分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）は国際公開公報ＷＯ９６／２１４６９号に記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号は、反応性官能基が含まれる分枝鎖状末端が含まれる分枝鎖状ＰＥＧ分子を用いて形成したコンジュゲートを記載している。遊離反応基がタンパク質またはペプチドなどの生物活性種と反応するために利用可能であり、ポリ（エチレングリコール）と生物活性種との間のコンジュゲートを形成する。米国特許第５，４４６，０９０号は、二官能性ＰＥＧリンカーおよびＰＥＧリンカー末端のそれぞれにペプチドを有するコンジュゲートの形成におけるその使用を記載している。

分解可能ＰＥＧ結合が含まれるコンジュゲートは、国際公開公報ＷＯ９９／３４８３３号、国際公開公報ＷＯ９９／１４２５９号、および米国特許第６，３４８，５５８号に記載されている。そのような分解可能な結合は、本発明に適用可能である。

上述の当分野で認識されているポリマー活性化方法は、本明細書中に記載の分枝鎖状ポリマーの形成、およびこれらの分枝鎖状ポリマーと他の種、たとえば、糖、糖ヌクレオチドなどとのコンジュゲーションにおける本発明のコンテクストにおいて役立つ。

例示的な水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、たとえばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明で使用するポリ（エチレングリコール）は、どの特定の形態または分子量範囲にも制限されない。分枝鎖状でないポリ（エチレングリコール）分子では、分子量は、好ましくは５００〜１００，０００である。好ましくは２０００〜６０，０００、好ましくは約５，０００〜約４０，０００の分子量を使用する。

ＩＩ．Ｄ．ｉｉｉ．分枝鎖状水溶性ポリマー
別の実施形態では、高分子修飾部分は、複数の直鎖状または分枝鎖状ＰＥＧ部分が結合した分枝鎖状ＰＥＧ構造である。分枝鎖状ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号；米国特許第５，３４２，９４０号；米国特許第５，６４３，５７５号；米国特許第５，９１９，４５５号；米国特許第６，１１３，９０６号；米国特許第５，１８３，６６０号；国際公開公報ＷＯ０２／０９７６６号；ＫｏｄｅｒａＹ．、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ５：２８３〜２８８（１９９４）；およびＹａｍａｓａｋｉ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：２１２５〜２１２７、１９９８に記載されている。

代表的な高分子修飾部分には、側鎖を含むアミノ酸、たとえば、セリン、システイン、リシン、および小ペプチド、たとえばｌｙｓ−ｌｙｓに基づいている構造が含まれる。一部の実施形態では、高分子修飾部分は、トリ−リシンペプチドなどのオリゴ−ペプチドに基づいた分枝鎖状ＰＥＧ部分である。使用に適した例示的なアミノ酸には、リシン、システイン、およびセリンが含まれる。そのような実施形態では、ペプチド構造に結合したそれぞれの高分子サブユニットは、直鎖状ＰＥＧ部分または分枝鎖状ＰＥＧ部分のどちらかであり得る。たとえば、トリ−リシンは、直鎖状ＰＥＧ部分、分枝鎖状ＰＥＧ部分、または直鎖状および分枝鎖状ＰＥＧ部分の組合せでモノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−ＰＥＧ化されていることができる。例示的な分枝鎖状構造には、以下の部分が含まれる。

当業者は、ジ−リシン構造中の遊離アミンは、直鎖状ＰＥＧ部分または分枝鎖状ＰＥＧ部分のどちらかで、アミドまたはウレタン結合を介してｐｅｇ化されていることができることを、理解されよう。

また、当業者には、上述の直鎖状ＰＥＧ構造に加えて、以前のセクションで例示した分枝鎖状ポリマーは、直鎖状ＰＥＧ構造の１つまたは複数の代わりに、分枝部分（たとえば、システイン、セリン、リシン、およびリシンのオリゴマー）に結合していることもできることが、理解されよう。さらに、当業者は、上述のＰＥＧ構造の信頼性は、単に例示を明らかにするためのものであり、ＰＥＧは、それだけには限定されないが、本明細書中に見つかる「高分子部分」の定義に記載の種を含めた実質的に任意の高分子部分によって置き換えることができることを、理解されよう。

任意の分子量、たとえば、１ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤおよび４５ｋＤのＰＥＧが本発明において役立つ。約２００ｋＤまで、たとえば、少なくとも約１８０ｋＤ、約１６０ｋＤ、約１４０ｋＤ、約１２０ｋＤ、約１００ｋＤ、約９０ｋＤ、約８０ｋＤ、および約７０ｋＤなどを含めた、より大きな分子量のＰＥＧも本発明で使用することができる。特定の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約８０ｋＤである。他の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、少なくとも約２００ｋＤ、少なくとも約１８０ｋＤ、少なくとも約１６０ｋＤ、または少なくとも約１４０ｋＤである。

分枝鎖状高分子修飾部分のそれぞれのＰＥＧ部分は、上に定義した分子量を有してもよく、または高分子修飾部分のすべてのＰＥＧ部分の合計分子量が上に定義したものであってもよい。たとえば、特定の実施形態では、分枝鎖状高分子修飾部分のそれぞれのＰＥＧ部分が約８０ｋＤであってもよく、または高分子修飾部分のすべてのＰＥＧ部分の合計分子量が約８０ｋＤであってもよい。同様に、特定の実施形態では、分枝鎖状高分子修飾部分のそれぞれのＰＥＧ部分が約２００ｋＤであってもよく、または高分子修飾部分のすべてのＰＥＧ部分の合計分子量が約２００ｋＤであってもよい。

例示的な本実施形態による種は、以下の式を有する。

式中、指数ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００の整数から独立して選択され；指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０の整数から独立して選択される。

当業者には明らかなように、本発明において役立つ分枝鎖状ポリマーには、上述の主題の変形が含まれる。たとえば、上述のジ−リシン−ＰＥＧコンジュゲートには、３つの高分子サブユニットが含まれ、３つ目が上記構造で未修飾であると示したα−アミンに結合していることができる。同様に、所望の様式で高分子修飾部分を用いて標識した３つまたは４つの高分子サブユニットで官能化したトリ−リシンの使用が、本発明の範囲内にある。

本明細書中に記載したように、本発明のコンジュゲートにおいて役立つＰＥＧは、直鎖状または分枝鎖状であることができる。本発明の本実施形態によるペプチドコンジュゲートを含む分枝鎖状ＰＥＧの形成に役立つ例示的な前駆体は、以下の式を有する。

本発明の本実施形態によるペプチドコンジュゲートを含む分枝鎖状ＰＥＧの形成に役立つ別の例示的な前駆体は、以下の式を有する。

本式に従った分枝鎖状ポリマー種は、本質的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ^３’は、イオン化可能な（たとえば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ_２ＰＯ_４、ＨＳＯ_３、ＨＰＯ_３、およびその塩など）または他の反応性の官能基が含まれる部分、たとえば下記である。Ｃは炭素である。Ｘ^５、Ｒ^１６およびＲ^１７は、非反応基および高分子部分（たとえばポリ（酸化アルキレン）、たとえばＰＥＧ）から独立して選択される。非反応基には、生理的ｐＨで本質的に非反応性、中性および／または安定であると考えられている基、たとえば、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルなどが含まれる。例示的な高分子部分には、式ＩＩＩａに記載の分枝鎖状構造およびその典型が含まれる。当業者は、これらの式中のＰＥＧ部分を、他のポリマーで置き換えることができることを理解されよう。例示的なポリマーには、ポリ（酸化アルキレン）ファミリーのものが含まれる。（たとえば、Ｈ、置換されていないアルキル、置換されていないヘテロアルキル）および高分子アーム（たとえばＰＥＧ）。Ｘ^２およびＸ^４は、好ましくは生理的条件下で本質的に非反応性である連結断片であり、同一または異なっていてよい。例示的なリンカーには、芳香族もエステル部分も含まれない。あるいは、これらの連結には、生理的に関連性のある条件下で分解するように設計されている１つまたは複数の部分、たとえば、エステル、ジスルフィドなどが含まれることができる。Ｘ^２およびＸ^４は、高分子アームＲ^１６およびＲ^１７をＣと結合させる。Ｘ^３’をリンカー上の相補的反応性の反応性官能基、糖またはリンカー−糖カセットと反応させた場合、Ｘ^３’は連結断片Ｘ^３の構成要素に変換される。

Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４の例示的な連結断片は独立して選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２Ｓ、ＣＨ_２Ｏ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ、（ＣＨ_２）_ｏＯ、（ＣＨ_２）_ｏＳまたは（ＣＨ_２）_ｏＹ’−ＰＥＧが含まれ、式中Ｙ’は、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは、１〜５０の整数である。例示的な実施形態では、連結断片Ｘ^２およびＸ^４は異なる連結断片である。

例示的な実施形態では、前駆体（式ＩＩＩ）、またはその活性誘導体を、Ｘ^３’と糖部分上の相補的反応性基、たとえばアミンとの反応を介して、糖、活性糖または糖ヌクレオチドと反応させ、それによりそれと結合させる。あるいは、Ｘ^３’は、リンカーＬの前駆体上の反応性官能基と反応する。式Ｉ、Ｉａ、ＩＩまたはＩＩａのＲ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’のうちの１つまたは複数には、分枝鎖状高分子修飾部分、またはＬを介して結合したこの部分が含まれ得る。

上記式による別の例示的な実施形態では、分枝鎖状ポリマーは、以下の式に従った構造を有する。

例示的な実施形態では、

の部分がリンカーアームＬである。本実施形態では、例示的なリンカーは、天然もしくは非天然のアミノ酸、アミノ酸類似体もしくはアミノ酸模倣体、または１つもしくは複数のそのような種から形成された小ペプチドに由来する。たとえば、本発明の化合物中に見つかる特定の分枝鎖状ポリマーは、以下の式を有する。

Ｘ^ａは、分枝鎖状高分子修飾部分の前駆体上の反応性官能基、たとえばＸ^３’と、糖部分、またはリンカーの前駆体上の反応性官能基との反応によって形成される連結断片である。たとえば、Ｘ^３’がカルボン酸である場合、これを活性化させてアミノ−サッカライドからペンダントしアミン基（たとえば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ_２、ＧｌｃＮＨ_２、ＭａｎＮＨ_２など）に直接結合させ、アミドであるＸ^ａを形成することができる。さらなる例示的な反応性官能基および活性前駆体は、本明細書中に以下に記載されている。指数ｃは、１〜１０の整数を表す。他の記号は、上述のものと同じである。

別の例示的な実施形態では、Ｘ^ａは、別のリンカー、すなわち、

を用いて形成した連結部分である。式中、Ｘ^ｂは第２の連結断片であり、Ｘ^ａについて記載した群から独立して選択され、Ｌと同様、Ｌ^１は、結合、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルである。

Ｘ^ａおよびＸ^ｂの例示的な種には、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）ＯならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨが含まれる。

別の例示的な実施形態では、Ｘ^４は、Ｒ^１７とのペプチド結合であり、これはアミノ酸、ジ−ペプチド（たとえばＬｙｓ−Ｌｙｓ）またはトリ−ペプチド（たとえばＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）であり、α−アミン部分および／または側鎖ヘテロ原子が高分子修飾部分で修飾されている。

さらなる例示的な実施形態では、本発明のペプチドコンジュゲートには、部分、たとえば以下から選択される式を有するＲ^１５部分が含まれる。

式中、様々な記号によって表される基のアイデンティティーは、本明細書中で上述したものと同じである。Ｌ^ａは、結合またはＬおよびＬ^１について上述したリンカー、たとえば、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分である。例示的な実施形態では、Ｌ^ａは、示したように高分子修飾部分で官能化されているシアル酸の側鎖部分である。例示的なＬ^ａ部分には、１つまたは複数のＯＨまたはＮＨ_２が含まれる置換または非置換アルキル鎖が含まれる。

さらに別の例示的な実施形態では、本発明は、部分、たとえば以下の式を有するＲ^１５部分を有するペプチドコンジュゲートを提供する。

様々な記号によって表される基のアイデンティティーは、本明細書中で上述したものと同じである。当業者には理解されるように、式ＶＩＩＩおよびＩＸ中のリンカーアームは、本明細書中に記載の他の修飾糖にも同等に適用可能である。例示的な実施形態では、式ＶＩＩＩおよびＩＸの種は、本明細書中に記載のグリカン構造に結合しているＲ^１５部分である。

さらに別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートには、以下から選択されるメンバーである式を有するＲ^１５部分が含まれる。

式中、基のアイデンティティーは、上述のとおりである。Ｌ^ａの例示的な種は、−（ＣＨ_２）_ｊＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｈＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、指数ｈおよびｊは、０〜１０の整数から独立して選択される。さらなる例示的な種は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。

本発明の上述の実施形態は、ポリマーが水溶性ポリマー、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、たとえばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）である種を参照によりさらに例示する。当業者は、以下のセクションの焦点は例示を明確にするためであり、ＰＥＧを例示的なポリマーとして使用して記載した様々なモチーフが、ＰＥＧ以外のポリマーを利用する種に同等に適用可能であることを理解されよう。

例示的な実施形態では、Ｒ^１５部分は、以下の群から選択されるメンバーである式を有する。

上記構造のそれぞれにおいて、リンカー断片−ＮＨ（ＣＨ_２）_ａ−は存在または存在しないことができる。

他の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートには、以下の群から選択されるＲ^１５部分が含まれる。

上記式のそれぞれで、指数ｅおよびｆは、１〜２５００の整数から独立して選択される。さらなる例示的な実施形態では、ｅおよびｆは、約１ｋＤ、２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤおよび４５ｋＤであるＰＥＧ部分がもたらされるように選択する。約２００ｋＤまで、たとえば、少なくとも約１８０ｋＤ、約１６０ｋＤ、約１４０ｋＤ、約１２０ｋＤ、約１００ｋＤ、約９０ｋＤ、約８０ｋＤ、および約７０ｋＤなどを含めた、より大きな分子量のＰＥＧも本発明で使用することができる。特定の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約８０ｋＤである。他の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、少なくとも約２００ｋＤ、少なくとも約１８０ｋＤ、少なくとも約１６０ｋＤ、または少なくとも約１４０ｋＤである。記号Ｑは、置換もしくは非置換アルキル（たとえばＣ_１〜Ｃ_６アルキル、たとえばメチル）、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはＨを表す。

他の分枝鎖状ポリマーは、ジ−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、たとえば、

ならびにトリ−リシンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、たとえば、

に基づいた構造を有する。上記図のそれぞれにおいて、指数ｅ、ｆ、ｆ’およびｆ’’は、１〜２５００から独立して選択される整数を表す。指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０から独立して選択される整数を表す。また、当業者には、上述の直鎖状ＰＥＧ構造に加えて、以前のセクションで例示した分枝鎖状ポリマーは、直鎖状ＰＥＧ構造の１つまたは複数の代わりに、分枝部分（たとえば、リシン、およびリシンのオリゴマー）に結合していることもできることが、理解されよう。

別の例示的な実施形態では、修飾基：

は、以下から選択されるメンバーである式を有する。

式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、指数ｑは、０〜２０から選択される整数である。

別の例示的な実施形態では、修飾基：

は、以下から選択されるメンバーである式を有する。

式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。

別の例示的な実施形態では、分枝鎖状ポリマーは、以下の式に従った部分が含まれる構造を有する。

式ＩＩＩａは式ＩＩＩのサブセットである。式ＩＩＩａによって説明される構造は、式ＩＩＩにも包含される。

上記式による別の例示的な実施形態では、分枝鎖状ポリマーは、以下の式に従った部分が含まれる構造を有する。

例示的な実施形態では、Ａ^１およびＡ^２は、−ＯＨおよび−ＯＣＨ_３から独立して選択されるメンバーである。

式中、変数は上述のとおりである。

例示的な実施形態では、修飾糖はシアル酸であり、本発明において役立つ選択した修飾糖化合物は、以下の式を有する。

指数ａ、ｂおよびｄは、０〜２０の整数である。指数ｃは、１〜２５００の整数である。上述の構造は、Ｒ^１５の構成要素であることができる。

別の例示的な実施形態では、糖の一次ヒドロキシル部分は、修飾基で官能化されている。たとえば、シアル酸の９−ヒドロキシルを対応するアミンを変換し、官能化して、本発明による化合物を提供することができる。本実施形態による式には、以下が含まれる。

上述の構造は、Ｒ^１５の構成要素であることができる。

本発明は、ＰＥＧを参照することによって前のセクションで例示しているが、当業者には理解されるように、高分子修飾部分のアレイは、本明細書中に記載の化合物および方法において役立つ。

選ばれた実施形態では、Ｒ^１またはＬ−Ｒ^１は、分枝鎖状ＰＥＧ、たとえば上述の種のうちの１つである。例示的な実施形態では、分枝鎖状ＰＥＧ構造は、システインペプチドに基づいている。本実施形態による例示的な修飾糖には、以下が含まれる。

式中、Ｘ^４は、結合またはＯである。上記構造のそれぞれにおいて、アルキルアミンリンカー−（ＣＨ_２）_ａＮＨ−は、存在または存在しないことができる。上述の構造は、Ｒ^１５／Ｒ^１５’の構成要素であることができる。

本明細書中に記載したように、本発明において役立つポリマー−修飾シアル酸は、直鎖状構造であってもよい。したがって、本発明は、以下のような構造に由来するシアル酸部分が含まれるコンジュゲートを提供する。

式中、指数ｑおよびｅは、上述のとおりである。

例示的な修飾糖は、水溶性または非水溶性ポリマーで修飾されている。有用なポリマーの例を以下にさらに例示する。

別の例示的な実施形態では、ペプチドは、昆虫細胞に由来し、ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌをマンノース核に付加し、直鎖状ＰＥＧ部分を保有するシアル酸を用いてグリコｐｅｇ化することによって再構築して、以下の式を有する少なくとも１つの部分を含むペプチドを与える。

式中、指数ｔは、０〜１の整数であり；指数ｓは、１〜１０の整数を表し；指数ｆは、１〜２５００の整数を表す。

例示的な実施形態では、Ｌ−Ｒ^１は以下の式を有する。

式中、ａは、０〜２０から選択される整数である。

例示的な実施形態では、Ｒ^１は、以下から選択される部分が含まれる構造を有する。

式中、ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり；ｑは、０〜２０から選択される整数である。

例示的な実施形態では、Ｒ^１は、以下から選択されるメンバーである構造を有する。

式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり；ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。

別の例示的な実施形態では、Ｒ^１は、以下から選択されるメンバーである構造を有する。

式中、ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数である。

別の例示的な実施形態では、グリコシルリンカーは以下の式を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、以下から選択される式に従った前記グリコシルリンカーのうちの少なくとも１つを含む。

式中、ＤおよびＧは上述のとおりであり、ＡＡは、前記ペプチドコンジュゲートのアミノ酸残基であり、ｔは、０および１から選択される整数である。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、前記グリコシルリンカーのうちの少なくとも１つを含み、前記グリコシルリンカーのそれぞれは、以下の式から独立して選択されるメンバーである構造を有する。

式中、ＤおよびＧは上述のとおりであり、ＡＡは、前記ペプチドコンジュゲートのアミノ酸残基であり、ｔは、０および１から選択される整数である。例示的な実施形態では、Ｇを含まないシアリル部分のうちの０個および２個から選択されるメンバーは存在しない。例示的な実施形態では、Ｇを含まないシアリル部分のうちの１個および２個から選択されるメンバーは存在しない。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、以下から選択される式に従った少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含む。

別の例示的な実施形態では、本発明は、適切な宿主中で産生したペプチドを提供する。また、本発明は、このペプチドを発現させる方法も提供する。別の例示的な実施形態では、宿主は哺乳動物発現系である。

別の例示的な実施形態では、本発明は、それを必要としている対象において状態を治療する方法を提供し、前記状態は、前記対象における弱まった凝固効力（clotting potency）を特徴とし、前記方法は、対象における状態を寛解させるために有効な量の本発明のペプチドコンジュゲートを対象に投与することを含む。別の例示的な実施形態では、本方法は、前記哺乳動物に、本明細書中に記載の方法に従って産生した一定量のペプチドコンジュゲートを投与することを含む。

別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のグリコシルリンカーを含むペプチドコンジュゲートを作製する方法を提供する。本方法は、（a）グリコシル部分：

を含むペプチドを、本明細書中に記載のＰＥＧ化されたヌクレオチド糖およびＰＥＧ化された糖を前記グリコシル部分のＧａｌに転移させる酵素と、前記転移に適した条件下で接触させることを含む。

別の例示的な実施形態では、以下の部分：

は、以下から選択されるメンバーである式を有する。

別の例示的な実施形態では、以下の部分：

は、以下から選択されるメンバーである式を有する。

式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり；
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。

別の例示的な実施形態では、グリコシルリンカーは、以下の式を含む。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートは、以下の式を有する少なくとも１つのグリコシルリンカーを含む。

式中、ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基であり；ｔは、０および１から選択される整数であり；Ｒ^１５は、修飾されたシアリル部分である。

別の例示的な実施形態では、本方法は、ステップ（a）の前に、（b）ペプチドを適切な宿主中で発現させるステップを含む。

ＩＩ．Ｄ．ｉｖ．非水溶性ポリマー
別の実施形態では、上述のものに類似して、修飾糖には、水溶性ポリマーではなく非水溶性ポリマーが含まれる。また、本発明のコンジュゲートには、１つまたは複数の水溶性ポリマーが含まれ得る。本発明の本実施形態は、コンジュゲートを、調節された様式で治療ペプチドを送達するために用いるビヒクルとして使用することによって、例示されている。高分子薬物の送達系は当分野で知られている。たとえば、Ｄｕｎｎ他編、高分子薬物および薬物送達系（POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS）、ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ第４６９巻、ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．１９９１を参照されたい。当業者は、実質的に任意の既知の薬物送達系が本発明のコンジュゲートに適用可能であることを、理解されよう。

Ｒ^１、Ｌ−Ｒ^１、Ｒ^１５、Ｒ^１５’および他の基について上述したモチーフは、非水溶性ポリマーに同等に適用可能であり、これは、それだけには限定されないが、当業者が容易に利用可能な化学を利用して、直鎖状および分枝鎖状構造内に取り込み得る。

代表的な非水溶性ポリマーには、それだけには限定されないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールならびにそれらのコポリマーが含まれる。

本発明のコンジュゲートにおいて役立つ合成によって修飾した天然ポリマーには、それだけには限定されないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが含まれる。幅広いクラスの合成によって修飾した天然ポリマーの特に好ましいメンバーには、それだけには限定されないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリル酸およびメタクリル酸エステルとアルギン酸とのポリマーが含まれる。

これらおよび本明細書中に記載した他のポリマーは、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（モンタナ州St. Louis）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（ペンシルベニア州Warrenton）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州Milwaukee）、Ｆｌｕｋａ（ニューヨーク州Ronkonkoma）、およびＢｉｏＲａｄ（カリフォルニア州Richmond）などの市販源から容易に入手するか、または、これらの供給者から得た単量体から、標準技術を用いて合成することができる。

本発明のコンジュゲートにおいて役立つ代表的な生分解性ポリマーには、それだけには限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、それらのブレンドおよびコポリマーが含まれる。コラーゲン、プルロニックなどを含むものなどの、ゲルを形成する組成物が特に役立つ。

本発明において役立つポリマーには、その構造の少なくとも一部分内に生体再吸収可能な分子を有する非水溶性物質が含まれる「ハイブリッド」ポリマーが含まれる。そのようなポリマーの例は、生体再吸収可能な領域、親水性領域およびポリマー鎖１本あたり複数の架橋結合可能な官能基を有する非水溶性コポリマーが含まれるものである。

本発明の目的のために、「非水溶性物質」には、水または水含有環境に実質的に不溶性である物質が含まれる。したがって、コポリマーの特定の領域またはセグメントが親水性またはさらには水溶性であってもよいが、ポリマー分子全体としては、如何なる実質的な量も水に溶けない。

本発明の目的のために、用語「生体再吸収可能な分子」には、代謝または分解され、再吸収および／または身体による通常の排泄経路を介して排除されることができる領域が含まれる。そのような代謝物または分解産物は、好ましくは身体に対して実質的に無毒性である。

コポリマー組成物が全体としては水溶性でない限りは、生体再吸収可能な領域は、疎水性または親水性であってよい。したがって、生体再吸収可能な領域は、ポリマーが全体として非水溶性に保たれるという優先度に基づいて選択される。したがって、関連する特性、すなわち、生体再吸収可能な領域および親水性領域によって含まれる官能基の種類、およびその相対割合は、有用な生体再吸収可能な組成物が非水溶性に保たれることを確実にするように選択される。

例示的な再吸収可能なポリマーには、たとえば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレンの、合成によって生成した再吸収可能なブロックコポリマーが含まれる（Cohn他、米国特許第４，８２６，９４５号参照）。これらのコポリマーは、身体が分解されたブロックコポリマー組成物を排泄できるように、架橋結合されておらず、かつ水溶性である。Ｙｏｕｎｅｓ他、ＪＢｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１〜１３１６（１９８７）；およびＣｏｈｎ他、ＪＢｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３〜１００９（１９８８）を参照されたい。

本発明で好ましい生体再吸収可能なポリマーには、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、多糖類およびそれらの混合物から選択される１つまたは複数の構成要素が含まれる。さらにより好ましくは、生体再吸収可能なポリマーにはポリ（ヒドロキシ）酸構成要素が含まれる。ポリ（ヒドロキシ）酸のうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸ならびにそれらのコポリマーおよび混合物が好ましい。

ｉｎｖｉｖｏで吸収される（「生体再吸収される」）断片を形成することに加えて、本発明の方法で使用するための好ましい高分子コーティングは、排泄可能および／または代謝可能な断片も形成することができる。

より高次のコポリマーも、本発明で使用することができる。たとえば、１９８４年３月２０日発行のＣａｓｅｙ他、米国特許第４，４３８，２５３号は、ポリ（グリコール酸）およびヒドロキシル末端ポリ（アルキレングリコール）のエステル交換から生成したトリ−ブロックコポリマーを開示している。そのような組成物は、再吸収可能なモノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。そのような組成物の柔軟性は、テトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートなどの芳香族オルトカーボネートをコポリマー構造内に取り込ませることによって調節する。

乳酸および／またはグリコール酸に基づいた他のポリマーも利用することができる。たとえば、１９９３年４月１３日発行のＳｐｉｎｕ、米国特許第５，２０２，４１３号は、オリゴマージオールまたはジアミン残基のどちらか上へのラクチドおよび／またはグリコリドの開環重合、次いでジイソシアネート、ジアシルクロライドまたはジクロロシランなどの二官能性化合物を用いた鎖伸長によって生成した、順次整列したポリラクチドおよび／またはポリグリコリドのブロックを有する生分解性マルチブロックコポリマーを開示している。

本発明において有用なコーティングの生体再吸収可能な領域は、加水分解および／または酵素的に切断可能であるように設計することができる。本発明の目的のために、「加水分解的に切断可能」とは、コポリマー、特に生体再吸収可能な領域が、水または水含有環境中で加水分解を受けやすいことを指す。同様に、本明細書中で使用する「酵素的に切断可能」とは、コポリマー、特に生体再吸収可能な領域が、内在性または外因性の酵素による切断を受けやすいことを指す。

身体内に置いた場合、親水性領域は、排泄可能および／または代謝可能な断片へとプロセッシングされることができる。したがって、親水性領域には、たとえば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、多糖類、炭水化物、ペプチド、タンパク質ならびにそれらのコポリマーおよび混合物が含まれることができる。さらに、親水性領域は、たとえばポリ（アルキレン）オキシドであることもできる。そのようなポリ（アルキレン）オキシドには、たとえば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドならびにそれらの混合物およびコポリマーが含まれることができる。

ヒドロゲルの構成要素であるポリマーも、本発明において有用である。ヒドロゲルとは、比較的大量の水を吸収することができる高分子物質である。ヒドロゲルを形成する化合物の例には、それだけには限定されないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラゲナンおよび他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体などが含まれる。安定、生分解性かつ生体再吸収可能なヒドロゲルを生成することができる。さらに、ヒドロゲル組成物には、これらの特性のうちの１つまたは複数を示すサブユニットが含まれることができる。

その完全性を架橋結合によって調節することができる生体適合性のあるヒドロゲル組成物が知られており、本発明の方法で使用するために本発明において好ましい。たとえば、１９９５年４月２５日発行のＨｕｂｂｅｌｌ他、米国特許第５，４１０，０１６号および１９９６年６月２５日発行の第５，５２９，９１４号は、２つの加水分解的に不安定な伸長部分の間に挟まれた水溶性の中心ブロックセグメントを有する架橋結合したブロックコポリマーである、水溶性の系を開示している。そのようなコポリマーは、さらに、末端が光重合可能なアクリレート官能基でキャップされている。架橋結合した際、これらの系がヒドロゲルとなる。そのようなコポリマーの水溶性の中心ブロックにはポリ（エチレングリコール）が含まれることができるが、一方で、加水分解的に不安定な伸長部分は、ポリグリコール酸またはポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）であることができる。Ｓａｗｈｎｅｙ他、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６：５８１〜５８７（１９９３）を参照されたい。

別の好ましい実施形態では、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアロウロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびその組合せなどの構成要素が含まれる熱可逆性ゲルが、本発明において好ましい。

さらに別の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートには、リポソームの構成要素が含まれる。リポソームは、当業者に知られている方法に従って、たとえば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ他、米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように調製することができる。たとえば、リポソーム配合物は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を無機溶媒中に溶かし、その後、無機溶媒を蒸発させ、容器の表面上に乾燥脂質の薄膜を残すことによって調製し得る。その後、活性化合物またはその薬学的に許容される塩の水溶液を容器内に導入する。その後、容器を手で旋回させて、脂質物質を容器の側面から遊離させ、脂質の凝集体を分散させて、それにより、リポソーム懸濁液を形成する。

上述の微粒子および微粒子を調製する方法は、例として提供し、本発明において役立つ微粒子の範囲を定義することを意図しない。当業者には、様々な方法によって作製した微粒子のアレイが本発明において役立つことが明らかであろう。

水溶性ポリマーのコンテクストで上述の構造様式は、直鎖状および分枝鎖状のもどちらも、非水溶性ポリマーに関しても一般に適用可能である。したがって、たとえば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分枝核を、２つの非水溶性ポリマー部分で官能化することができる。これらの種を生成するために使用する方法は、一般に、水溶性ポリマーを生成するために使用する方法に極めて類似している。

ＩＩ．Ｄ．ｖ．高分子修飾基の生成方法
高分子修飾基は、グリコシルもしくは糖部分またはアミノ酸部分と反応させるために活性化させることができる。活性種（たとえば、カーボネートおよび活性エステル）の例示的な構造には、以下が含まれる。

上の図では、ｑは、１〜４０から選択されるメンバーである。本明細書中に記載の化合物の調製において役立つ直鎖状および分枝鎖状ＰＥＧを活性化させるために適切な他の活性化基、または脱離基には、それだけには限定されないが、以下の種が含まれる。

これらおよび他の種で活性化されるＰＥＧ分子ならびに活性ＰＥＧを作製する方法は、国際公開公報ＷＯ０４／０８３２５９号に記載されている。

当業者は、上述の分枝鎖状ポリマーのｍ−ＰＥＧアームのうちの１つまたは複数を、異なる末端、たとえば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１０−アルキルなどを有するＰＥＧ部分によって置き換えることができることを、理解されよう。さらに、上記構造は、アミノ酸側鎖のα−炭素原子と官能基との間のアルキルリンカーを挿入すること（または炭素原子を除去すること）によって容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体およびより高次な相同体、ならびにより低次な相同体が、本発明において役立つ分枝鎖状ＰＥＧの核の範囲内にある。

本明細書中に記載の分枝鎖状ＰＥＧ種は、以下のスキームに記載のものなどの方法によって、容易に調製される。

式中、Ｘ^ｄは、ＯまたはＳであり、ｒは、１〜５の整数である。指数ｅおよびｆは、１〜２５００の整数から独立して選択される。例示的な実施形態では、これらの指数のうちの一方または両方は、ポリマーの分子量が約５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、または４０ｋＤであるように選択される。約２００ｋＤまで、たとえば、少なくとも約１８０ｋＤ、約１６０ｋＤ、約１４０ｋＤ、約１２０ｋＤ、約１００ｋＤ、約９０ｋＤ、約８０ｋＤ、および約７０ｋＤなどを含めた、より大きな分子量のＰＥＧも本発明で使用することができる。特定の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約８０ｋＤである。他の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、少なくとも約２００ｋＤ、少なくとも約１８０ｋＤ、少なくとも約１６０ｋＤ、または少なくとも約１４０ｋＤである。

したがって、本スキームによれば、天然または非天然のアミノ酸を、活性ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合はトシレートと接触させ、側鎖ヘテロ原子Ｘ^ｄを。アルキル化することによって１を形成する。モノ−官能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸は、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体とのＮ−アシル化条件に供され、それにより分枝鎖状ｍ−ＰＥＧ２がアセンブルされる。当業者には理解されるように、トシレート脱離基を、任意の適切な脱離基、たとえば、ハロゲン、メシレート、トリフレートなどで置き換えることができる。同様に、アミンをアシル化するために利用する反応性カーボネートを、活性エステル、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどで置き換えるか、または、酸を、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの脱水剤を用いてｉｎｓｉｔｕで活性化することができる。

他の例示的な実施形態では、尿素部分アミドなどの基によって置き換える。

ＩＩ．Ｅ．ホモ分散ペプチドコンジュゲート組成物
化学的または酵素的に付加したグリコシル連結基を介して形成されたペプチドコンジュゲートを提供することに加えて、本発明は、その置換パターンが高度に均質なペプチドコンジュゲートを含む組成物を提供する。本発明の方法を使用して、ペプチドコンジュゲートの集団にわたって相当な割合のグリコシル連結基およびグリコシル部分が構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基と結合しているペプチドコンジュゲートを形成することが可能である。したがって、第２の態様では、本発明は、グリコシル連結基、たとえば完全なグリコシル連結基を介してペプチドと共有結合している、水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチドコンジュゲートを提供する。本発明の例示的なペプチドコンジュゲートでは、水溶性ポリマー集団の本質的にそれぞれのメンバーが、グリコシル連結基を介してペプチドのグリコシル残基と結合しており、グリコシル連結基が結合しているペプチドのそれぞれのグリコシル残基は、同じ構造を有する。

また、本発明は、ペプチドが、修飾基、たとえば、治療用部分、診断用部分、標的化部分、毒素部分などと、グリコシル連結基を介してコンジュゲートしている、上述のものに類似のコンジュゲートも提供する。上述の修飾基のそれぞれは、小分子、天然ポリマー（たとえばポリペプチド）または合成ポリマーであることができる。修飾基がシアル酸に結合している場合、修飾基が実質的に非蛍光であることが一般に好ましい。

例示的な実施形態では、本発明のペプチドには、高分子修飾基、たとえばＰＥＧ部分が含まれる修飾糖でグリコシル化された、少なくとも１つのＯ連結またはＮ連結のグリコシル化部位が含まれる。例示的な実施形態では、ＰＥＧは、完全なグリコシル連結基を介して、または非グリコシルリンカー、たとえば、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルを介して、ペプチドと共有結合している。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基のどちらかに共有結合している。あるいは、グリコシル連結基は、糖ペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に結合している。また、本発明は、グリコシル連結基がアミノ酸残基およびグリコシル残基の両方に結合しているコンジュゲートも提供する。

本発明のペプチド上のグリカンは、一般に、本明細書中に記載の方法に従った再構築後に、哺乳動物（ＢＨＫ、ＣＨＯ）細胞または昆虫（たとえばＳｆ−９）細胞によって産生されるペプチド上に見られるグリカンに対応する。たとえば、続いて、トリ−マンノシル核を有して発現される昆虫由来のペプチドをＧｌｃＮＡｃドナーおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼならびにＧａｌドナーおよびＧａｌトランスフェラーゼと接触させる。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌをトリ−マンノシル核に付加することは、２つのステップまたは単一のステップのどちらかで達成する。修飾シアル酸は、本明細書中に記載のようにグリコシル部分の少なくとも１つの分枝に付加する。修飾シアル酸で官能化されないＧａｌ部分は、シアリルトランスフェラーゼの存在下におけるシアル酸ドナーとの反応によって、任意選択で「キャップされる」。

例示的な実施形態では、ペプチドの集団中の末端Ｇａｌ部分の少なくとも６０％がシアル酸でキャップされ、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％がシアル酸でキャップされる。

ＩＩ．Ｆ．ヌクレオチド糖
本発明の別の態様では、本発明は、糖ヌクレオチドも提供する。例示的な本実施形態による種には、以下が含まれる。

式中、ｙは、０〜２から選択される整数であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５またはＲ^６のうちの少なくとも１つは、以下から選択されるメンバーである構造を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

式中、変数は上述のとおりである。

式中、変数は上述のとおりである。

式中、変数は上述のとおりである。

式中、変数は上述のとおりである。

別の例示的な実施形態では、ヌクレオチド糖は、以下から選択されるメンバーである式を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

本実施形態による例示的なヌクレオチド糖は、以下の構造を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

式中、変数は上述のとおりである。

別の例示的な実施形態では、ヌクレオチド糖は、以下の式に基づいている。

式中、Ｒ基およびＬは、上述のとおりの部分を表す。指数「ｙ」は、０、１または２である。例示的な実施形態では、Ｌは、ＮＨとＲ^１との間の結合である。塩基は、核酸塩基である。

例示的な実施形態では、Ｌ−Ｒ^１は、以下から選択されるメンバーである。

式中、変数は上述のとおりである。

例示的な実施形態では、Ｌ−Ｒ^１は、以下の式に従った構造を有する。

例示的な実施形態では、Ａ^１およびＡ^２は、それぞれ−ＯＨおよび−ＯＣＨ_３から選択される。

ＩＩＩ．方法
上述のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製する方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のコンジュゲートを、疾患を発生する危険性にある対象または疾患に罹患している対象に投与することによって、病状を予防、治癒または寛解させる方法を提供する。

例示的な実施形態では、コンジュゲートは、高分子修飾部分とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間で形成されている。ポリマーは、グリコシル連結基を介してペプチドとコンジュゲートしており、これは、ペプチド（またはグリコシル残基）および修飾基（たとえば水溶性ポリマー）の間に差し込まれており、そのどちらにも共有結合している。本方法には、ペプチドを、修飾糖および修飾糖を基質とコンジュゲートさせる酵素、たとえばグリコシルトランスフェラーゼを含む混合物と接触させることが含まれる。反応は、修飾糖とペプチドとの間に共有結合を形成するために適した条件下で実施する。修飾糖の糖部分は、好ましくは、ヌクレオチド糖から選択される。ａ）シアリダーゼ；ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼなどの、グリコシル連結基の転移を触媒することができる酵素；ｃ）修飾糖；ｄ）ペプチドを混合することを含み、それによりペプチドコンジュゲートを合成する、ペプチドコンジュゲートの合成方法。反応は、修飾糖とペプチドとの間に共有結合を形成するために適した条件下で実施する。修飾糖の糖部分は、好ましく、ヌクレオチド糖から選択される。

例示的な実施形態では、上述のものなどの修飾糖は、対応するヌクレオチド糖として活性化される。本発明においてその修飾された形態で使用される例示的な糖ヌクレオチドには、ヌクレオチド一、二もしくは三リン酸またはその類似体が含まれる。好ましい実施形態では、修飾糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、修飾糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。例示的な実施形態では、ヌクレオチドリン酸は、Ｃ−１に結合している。

また、本発明は、６−炭素位置でＬ−Ｒ^１を用いて修飾した糖ヌクレオチドの使用も提供する。例示的な本実施形態による種には、以下が含まれる。

本発明において役立つ例示的なヌクレオチド糖を、本明細書に記載する。別の例示的な実施形態では、本発明において役立つヌクレオチド糖は、６位の炭素が修飾されたものであり、ＧＤＰマンノースの立体化学を有する種、たとえば、

が含まれる。式中、Ｘ^５は、結合またはＯであり、残りの変数は、上述のとおりである。指数ｉは、０または１を表す。指数ａは、１〜２０の整数を表す。指数ｅおよびｆは、独立して、１〜２５００の整数を表す。Ｑは、上述のように、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである。当業者には理解されるように、ＳがＯで置き換えられているセリン誘導体も、この一般モチーフの範囲内にある。

さらなる例示的な実施形態では、本発明は、修飾糖がＵＤＰガラクトースの立体化学に基づいているコンジュゲートを提供する。本発明において役立つ例示的なヌクレオチド糖は、以下の構造を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

別の例示的な実施形態では、ヌクレオチド糖は、グルコースの立体化学に基づいている。例示的な本実施形態による種は、以下の式を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

したがって、グリコシル部分がシアル酸である例示的な実施形態では、本発明の方法は、以下の式を有する化合物を利用する。

式中、Ｌ−Ｒ^１は上述のとおりであり、Ｌ^１−Ｒ^１は、修飾基と結合したリンカーを表す。Ｌと同様、Ｌ^１に従った例示的なリンカー種には、結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分が含まれる。

さらに、上述のように、本発明は、直鎖状または分枝鎖状のどちらかである水溶性ポリマーで修飾したヌクレオチド糖の使用を提供する。たとえば、以下に示す式を有する化合物が、本発明の範囲内のコンジュゲートの調製に役立つ。

式中、Ｘ^４は、Ｏまたは結合である。

一般に、糖部分または糖部分−リンカーのカセットおよびＰＥＧまたはＰＥＧ−リンカーのカセットの基は、反応基の使用を介して一緒に連結されており、これらは、典型的には、連結プロセスによって新しい有機官能基または非反応性種に変換されている。糖反応性官能基は、糖部分上の任意の位置にある。本発明の実施において有用な反応基および反応クラスは、一般に、バイオコンジュゲート化学の分野で周知のものである。反応性糖部分で利用可能な現在好ましい反応クラスは、比較的緩和な条件下で進行するものである。これらには、それだけには限定されないが、求核性置換（たとえば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子性置換（たとえばエナミン反応）ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（たとえば、ミカエル反応、ディールズ−アルダー付加）が含まれる。これらおよび他の有用な反応は、たとえば、３月号、最新有機化学（ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY）、第３版、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、バイオコンジュゲート技術（BIOCONJUGATE TECHNIQUES）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９６；およびＦｅｅｎｅｙ他、タンパク質の修飾；化学の進歩シリーズ（MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series）、第１９８巻、ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２に論じられている。

糖核または修飾基からペンダントした有用な反応性官能基には、それだけには限定されないが、以下が含まれる。
（ａ）それだけには限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含めた、カルボキシル基およびその様々な誘導体；
（ｂ）たとえば、エステル、エーテル、アルデヒド、などに変換することができるヒドロキシル基
（ｃ）ハロゲン化物を、後にたとえばアミン、カルボン酸陰イオン、チオール陰イオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置き換えて、ハロゲン原子の官能基で新しい基の共有結合をもたらすことができる、ハロアルキル基；
（ｄ）たとえばマレイミド基など、ディールズ−アルダー反応に参加することができるジエノフィル基；
（ｅ）たとえばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、または、グリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加などの機構を介して、続いて誘導化が可能な、アルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）続いてアミンと反応させて、たとえば、スルホンアミドを形成する、ハロゲン化スルホニル基；
（ｇ）たとえばジスルフィドに変換させるまたはハロゲン化アシルと反応させることができるチオール基；
（ｈ）たとえば、アシル化、アルキル化または酸化することができる、アミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）たとえば、シクロ付加、アシル化、ミカエル付加などを受けることができるアルケン；ならびに
（ｊ）たとえば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。

反応性官能基は、反応性糖核または修飾基のアセンブルに必要な反応に参加しない、またはそれを妨げないように選択する。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって反応に参加することから保護することができる。当業者には、特定の官能基を、選択した反応条件の組を妨げないように保護する方法が理解されよう。有用な保護基の例には、たとえば、Ｇｒｅｅｎｅ他、有機合成における保護基（PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１を参照されたい。

以下の記述では、本発明の実施において有用な修飾糖のいくつかの具体的な例を記載する。例示的な実施形態では、シアル酸誘導体を、修飾基が結合する糖核として利用する。シアル酸誘導体に関する記述の焦点は、例示を明確にするためのみであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。当業者は、シアル酸を例として用いて記載したものに類似の様式で、様々な他の糖部分を活性化および誘導体化できることを、理解されよう。たとえば、いくつかの糖基質を挙げるとガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースを修飾するために数々の方法が利用可能であり、これらは、当分野で認識された方法によって容易に修飾される。たとえば、Ｅｌｈａｌａｂｉ他、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３（１９９９）；およびＳｃｈａｆｅｒ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００））を参照されたい。

例示的な実施形態では、修飾糖は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分に基づいている。

上記スキーム中、指数ｎは、１〜２５００の整数を表す。例示的な実施形態では、この指数は、ポリマーの分子量が約１０ｋＤ、１５ｋＤまたは２０ｋＤであるように選択する。記号「Ａ」は、活性基、たとえば、ハロ、活性エステル（たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の構成要素、カーボネート（たとえば炭酸ｐ−ニトロフェニル）の構成要素などを表す。当業者は、他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖が、本方法および類似の方法によって容易に調製されることを理解されよう。

ペプチドは、典型的には、新規合成するか、あるいは、原核細胞（たとえば大腸菌などの細菌細胞）または哺乳動物、酵母、昆虫、真菌もしくは植物細胞などの真核細胞中で、組換えによって発現させる。ペプチドは、完全長タンパク質または断片のどちらかであることができる。さらに、ペプチドは、野生型または突然変異したペプチドであることができる。例示的な実施形態では、ペプチドには、ペプチド配列に１つまたは複数のＮ−またはＯ連結のグリコシル化部位を付加する突然変異が含まれる。

また、本発明の方法は、組換えによって産生される、不完全にグリコシル化されたペプチドの修飾も提供する。多くの組換えによって産生した糖タンパク質は、不完全にグリコシル化されており、望ましくない特性、たとえば、免疫原性、ＲＥＳによる認識を有し得る炭水化物残基がさらされている。本発明の方法において修飾糖を用いることで、ペプチドのさらなるグリコシル化およびたとえば水溶性ポリマー、治療剤などを用いた誘導体化を、同時に行うことができる。修飾糖の糖部分は、完全にグリコシル化されたペプチド中では受容体に適切にコンジュゲートしているであろう残基、または望ましい特性を有する別の糖部分であることができる。

当業者は、本発明は、任意の供給源からの実質的に任意のペプチドまたは糖ペプチドを用いて実施できることを理解されよう。本発明を実施するために用いることができる例示的なペプチドは、国際公開公報ＷＯ０３／０３１４６４号およびその中に記載の参考文献に記載されている。

本発明の方法によって修飾したペプチドは、合成もしくは野生型ペプチドであるか、または、部位特異的突然変異誘発などの当分野で知られている方法によって産生した、突然変異したペプチドであることができる。ペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ連結またはＯ連結のどちらかである。例示的なＮ−連結は、アスパラギン残基の側鎖への修飾糖の結合である。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合における認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ連結のグリコシル化とは、１つの糖（たとえば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）がヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはスレオニンのヒドロキシ側鎖に結合することを指すが、異常または非天然アミノ酸、たとえば、５−ヒドロキシプロリンもしくは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。

さらに、ペプチドに加えて、本発明の方法は、他の生物学的構造（たとえば、グリコシル化部位を含む、糖脂質、脂質、スフィンゴイド、セラミド、全細胞など）で実施することができる。

ペプチドまたは他の構造にグリコシル化部位を付加することは、１つまたは複数のグリコシル化部位を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、便利に達成される。また、付加は、−ＯＨ基を提示する１つまたは複数の種、好ましくはセリンまたはスレオニン残基を、ペプチドの配列内に取り込ませることによっても行い得る（Ｏ連結のグリコシル化部位のため）。付加は、突然変異によって、またはペプチドの完全な化学合成によって行い得る。ペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変更によって、具体的には、所望のアミノ酸へと翻訳されるコドンが生じるように、ペプチドをコードしているＤＮＡを事前に選択した塩基で突然変異させることによって、変化している。ＤＮＡの突然変異は、好ましくは、当分野で知られている方法を用いて行う。

例示的な実施形態では、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャフリングすることによって付加する。候補ペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャフリングプロトコルを用いて調節することができる。ＤＮＡシャフリングとは、関連遺伝子のプールのランダム断片化、次いでポリメラーゼ連鎖反応様プロセスによる断片の再アセンブルによって行う、繰り返しの組換えおよび突然変異のプロセスである。たとえば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１０７４７〜１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９〜３９１（１９９４）；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８３７，４５８号、第５，８３０，７２１号および第５，８１１，２３８号を参照されたい。

本発明を実施するために用いることができる例示的なペプチド、グリコシル化部位を付加または除去する方法、およびグリコシル構造または下部構造を付加または除去する方法は、国際公開公報ＷＯ０３／０３１４６４号ならびに関連の米国およびＰＣＴ出願に詳述されている。

また、本発明は、ペプチドに１つまたは複数の選択したグリコシル残基を付加する（またはそれから除去する）こと、その後、修飾糖をペプチドの選択したグリコシル残基のうちの少なくとも１つにコンジュゲートさせることも利用する。本実施形態は、たとえば、修飾糖を、ペプチド上に存在しないまたは所望の量で存在しない選択したグリコシル残基とコンジュゲートさせることを所望する場合に、有用である。したがって、修飾糖をペプチドとカップリングさせる前に、選択したグリコシル残基をペプチドと、酵素的または化学的カップリングによってコンジュゲートさせる。別の実施形態では、糖ペプチドのグリコシル化パターンは、炭水化物残基を糖ペプチドから除去することによる修飾糖のコンジュゲーションの前に変化させる。たとえば、国際公開公報ＷＯ９８／３１８２６号を参照されたい。

糖ペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の付加または除去は、化学的または酵素的に達成する。例示的な化学的脱グリコシル化は、ポリペプチド変異体を、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価な化合物に曝露させることによってもたらす。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたはすべての糖の切断をもたらす一方で、ペプチドを完全なまま残す。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。ポリペプチド変異体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）に記載のように、様々なエンド−およびエキソグリコシダーゼを使用することによって達成することができる。

例示的な実施形態では、ペプチドは、ペプチドにグリココンジュゲーションまたは再構築ステップを行う前に、ノイラミニダーゼで本質的に完全に脱シアリル化されている。グリココンジュゲーションまたは再構築後、シアリルトランスフェラーゼを用いてペプチドを任意選択で再シアリル化する。例示的な実施形態では、再シアリル化は、シアリル受容体の集団中の本質的にそれぞれ（たとえば、＞８０％、好ましくは８５％より多く、９０％より多く、好ましくは９５％より多く、より好ましくは９６％、９７％、９８％または９９％より多く）の末端糖受容体で起こる。好ましい実施形態では、サッカライドは、実質的に均一なシアリル化パターン（すなわち、実質的に均一なグリコシル化パターン）を有する。

グリコシル部分の化学的付加は、任意の当分野で認識されている方法によって実施する。糖部分の酵素的付加は、好ましくは、本明細書中に記載の方法の変形を用いて、本発明で使用する修飾糖の代わりにネイティブグリコシル単位を用いて達成する。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第５，８７６，９８０号、第６，０３０，８１５号、第５，７２８，５５４号、および第５，９２２，５７７号に開示されている。

選択したグリコシル残基の例示的な結合点には、それだけには限定されないが、（ａ）Ｎ連結のグリコシル化のコンセンサス部位、およびＯ連結のグリコシル化の部位；（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼの受容体である末端グリコシル部分；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離カルボキシル基；（ｅ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｆ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｈ）グルタミンのアミド基が含まれる。本発明において役立つ例示的な方法は、１９８７年９月１１日公開の国際公開公報ＷＯ８７／０５３３０号、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、ページ２５９〜３０６（１９８１）に記載されている。

一実施形態では、本発明は、連結基を介して２つ以上のペプチドを連結させる方法を提供する。連結基は任意の有用な構造のものであり、直鎖状および分枝鎖状の鎖構造から選択され得る。好ましくは、ペプチドと結合しているリンカーのそれぞれの末端には、修飾糖が含まれる（すなわち、新生の完全なグリコシル連結基）。

本発明の例示的な方法では、２つのペプチドが、高分子（たとえばＰＥＧリンカー）が含まれるリンカー部分を介して一緒に連結されている。構築体は、上記図に示す一般構造に従う。本明細書中に記載のように、本発明の構築体には、２つの完全なグリコシル連結基が含まれる（すなわちｓ＋ｔ＝１）。２つのグリコシル基が含まれるＰＥＧリンカー上の焦点は、明確にする目的であり、本発明の本実施形態において役立つリンカーアームのアイデンティティーを限定するものであると解釈されるべきでない。

したがって、ＰＥＧ部分は、第１の末端で第１のグリコシル単位によって、かつ第２の末端で第２のグリコシル単位によって官能化されている。第１および第２のグリコシル単位は、好ましくは、異なるトランスフェラーゼの基質であり、第１および第２のペプチドがそれぞれ第１および第２のグリコシル単位と直交に結合することを可能にする。実際では、（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２リンカーを、第１のペプチド、および第１のグリコシル単位が基質である第１のトランスフェラーゼと接触させ、それにより、（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２を形成する。その後、トランスフェラーゼおよび／または未反応のペプチドを、反応混合物から任意選択で除去する。第２のペプチド、および第２のグリコシル単位が基質である第２のトランスフェラーゼを、（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２コンジュゲートに加えて、（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２−（ペプチド）^２を形成する。グリコシル残基のうちの少なくとも１つが、直接または間接的にＯ連結している。当業者は、上に概要を示した方法は、たとえば、分枝鎖状ＰＥＧ、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖などを使用することによって、２つより多くのペプチド間のコンジュゲートの形成にも適用可能であることを、理解されよう。

例示的な実施形態では、本発明の方法によって修飾されるペプチドは、哺乳動物細胞（たとえばＣＨＯ細胞）またはトランスジェニック動物中で産生される糖ペプチドであり、したがって、不完全にシアリル化されたＮおよび／またはＯ連結のオリゴ糖鎖を含む。シアル酸を欠き、末端ガラクトース残基を含む糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化、ＰＰＧ化または他の様式によって修飾シアル酸で修飾されていることができる。

スキーム１では、アミノグリコシド１を、保護アミノ酸（たとえばグリシン）誘導体の活性エステルで処理し、糖アミン残基を対応する保護アミノ酸アミド付加物に変換する。付加物をアルドラーゼで処理して、α−ヒドロキシカルボキシレート２を形成する。ＣＭＰ−ＳＡ合成酵素の作用によって化合物２を対応するＣＭＰ誘導体に変換し、次いで、ＣＭＰ誘導体の触媒水素化により化合物３を生成する。グリシン付加物の形成によって導入されたアミンを、化合物３を活性ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（たとえば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と反応させることによって、ＰＥＧ結合の部位として利用し、それぞれ４または５などの種が生成される。

例示的な実施形態では、修飾糖は、ペプチド上のＯ−グリカン結合部位に結合することができる。このペプチドコンジュゲートを生成するために使用することができるグリコシルトランスフェラーゼには、Ｓｅｒ５６（−Ｇｌｃ−（Ｘｙｌ）ｎ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−には、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ；Ｓｅｒ５６−Ｇｌｃ−（Ｘｙｌ）ｎ−Ｘｙｌ−ＰＥＧ−には、キシロシルトランスフェラーゼ；ならびにＳｅｒ６０−Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃ−（Ｇａｌ）ｎ−（ＳＡ）ｍ−ＰＥＧ−には、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが含まれる。

ＩＩＩ．Ａ．修飾糖とペプチドとのコンジュゲーション
ＰＥＧ修飾糖は、コンジュゲーションを媒介するために適切な酵素を用いて、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとコンジュゲートされている。好ましくは、修飾されたドナー糖、酵素および受容体ペプチドの濃度は、グリコシル化が、受容体が消費されるまで進行するように選択する。以下に記述の検討事項は、シアリルトランスフェラーゼのコンテクストで記載しているが、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。本発明で使用するための好ましいシアリルトランスフェラーゼリストを図６に提供する。

所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを使用するいくつかの方法が知られており、一般に本発明に適用可能である。例示的な方法は、たとえば、本明細書中に参照により組み込れられる、国際公開公報ＷＯ９６／３２４９１号、Ｉｔｏ他、ＰｕｒｅＡｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３）、米国特許第５，３５２，６７０号、第５，３７４，５４１号、第５，５４５，５５３号、公有米国特許第６，３９９，３３６号および第６，４４０，７０３号、ならびに公有公開ＰＣＴ出願の国際公開公報ＷＯ０３／０３１４６４号、国際公開公報ＷＯ０４／０３３６５１号、国際公開公報ＷＯ０４／０９９２３１号に記載されている。

本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組合せを用いて実施する。たとえば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組合せを使用することができる。複数の酵素を使用する実施形態では、酵素および基質は、好ましくは、最初の反応混合物で合わせるか、または、第１の酵素反応が完了もしくはほぼ完了した後に第２の酵素反応の酵素および試薬を反応媒体に加える。２つの酵素反応を順々に単一の容器内で実施することによって、中間体の種を単離する手順よりも全収率が向上する。さらに、余分な溶媒および副産物の精製および廃棄も低減される。

好ましい実施形態では、第１および第２の酵素のそれぞれがグリコシルトランスフェラーゼである。別の好ましい実施形態では、一方の酵素がエンドグリコシダーゼである。さらなる好ましい実施形態では、２つより多くの酵素を使用して本発明の修飾糖タンパク質をアセンブルする。酵素を使用して、修飾糖をペプチドに付加させる前または後の任意の時点で、ペプチド上のサッカライド構造を変化させる。

別の実施形態では、本方法は、１つまたは複数のエクソ−またはエンド−グリコシダーゼを使用する。グリコシダーゼは、典型的には突然変異体であり、グリコシル結合を破壊するのではなく形成するように操作されている。突然変異体グリカナーゼには、典型的には、活性部位の酸性アミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。たとえば、エンドグリカナーゼがエンド−Ｈである場合、置換された活性部位残基は、典型的には、位置１３０のＡｓｐ、位置１３２のＧｌｕまたはその組合せとなる。アミノ酸は、一般に、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置き換えられる。

突然変異体酵素は、通常はエンドグリカナーゼの加水分解ステップの逆反応に類似の合成ステップによって、反応を触媒する。これらの実施形態では、グリコシルドナー分子（たとえば、所望のオリゴ−またはモノ−サッカライド構造）は脱離基を含み、反応は、ドナー分子をタンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基に付加することによって進行する。たとえば、脱離基は、フッ化物などのハロゲンであることができる。他の実施形態では、脱離基はＡｓｎまたはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらなる実施形態では、グリコシルドナー分子上のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾されている。たとえば、ＧｌｃＮＡｃ残基は１，２オキサゾリン部分を含み得る。

好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートを生成するために利用する酵素のそれぞれは、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件に応じて変化する。事前に選択した基質濃度および反応条件下における所定の酵素の触媒量を決定する手段は、当業者に周知である。

上記プロセスを実施する温度の範囲は、氷点のすぐ上からほとんどの感受性のある酵素が変性する温度であることができる。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃、より好ましくは約２０℃〜約３７℃である。別の例示的な実施形態では、本方法の１つまたは複数の構成要素は、好熱性酵素を用いて高温で実施する。

反応混合物を、受容体がグリコシル化されるために十分な時間維持し、それにより、所望のコンジュゲートが形成される。コンジュゲートの一部は、多くの場合数時間後に検出することができ、回収可能な量は、通常２４時間以内に得られる。当業者は、反応速度が、選択した系に対して最適化されたいくつかの変動要因（たとえば、酵素濃度、ドナー濃度、受容体濃度、温度、溶媒体積）に依存することを理解されよう。

また、本発明は、修飾されたペプチドの工業スケールの生成も提供する。本明細書中で使用する工業的スケールでは、一般に、少なくとも１グラムの仕上がった精製したコンジュゲートが生成される。

以下の記述では、本発明を修飾シアル酸部分とグリコシル化されたペプチドとのコンジュゲーションによって例示する。例示的な修飾シアル酸は、ＰＥＧで標識する。ＰＥＧ−修飾シアル酸およびグリコシル化されたペプチドの使用に関する以下の記述の焦点は、例示を明確にするためであり、本発明がこれら２つのパートナーのコンジュゲーションに限定されることを示唆することを意図しない。当業者は、記述は、一般に、シアル酸以外の修飾されたグリコシル部分の付加に適用可能であることを理解されよう。さらに、記述は、他のＰＥＧ部分、治療用部分、および生体分子を含めたＰＥＧ以外の薬剤を用いたグリコシル単位の修飾に、同等に適用可能である。

酵素的手法を、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化された炭水化物をペプチドまたは糖ペプチド上に選択的導入するために使用することができる。本方法では、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含む修飾糖を利用し、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコ合成酵素と合わせる。所望の炭水化物連結を生じるグリコシルトランスフェラーゼを選択し、修飾糖をドナー基質として利用することによって、ＰＥＧまたはＰＰＧを、ペプチド主鎖上、糖ペプチドの既存の糖残基上またはペプチドに付加された糖残基上に直接導入することができる。

例示的な実施形態では、シアリルトランスフェラーゼの受容体（acceptor）は、修飾するペプチド上に、天然に存在する構造として存在するか、または組換えによって、酵素的もしくは化学的にそこに配置する。適切な受容体には、たとえば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に知られている他の受容体が含まれる（たとえば、Paulson他、J. Biol. Chem.２５３：５６１７〜５６２４（１９７８）参照）。例示的なシアリルトランスフェラーゼは、本明細書中に記載されている。

一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼの受容体は、糖ペプチドのｉｎｖｉｖｏ合成の際に修飾する糖ペプチド上に存在する。そのような糖ペプチドは、特許請求した方法を用いて、糖ペプチドのグリコシル化パターンを事前に修飾することなしに、シアリル化することができる。あるいは、本発明の方法を用いて、適切な受容体が含まれないペプチドをシアリル化することができ、当業者に知られている方法によって、受容体が含まれるようにペプチドを最初に修飾する。例示的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によって付加される。

例示的な実施形態では、ガラクトシル受容体は、ガラクトース残基を、ペプチドと連結した適切な受容体、たとえばＧｌｃＮＡｃに結合させることによって、アセンブルする。本方法には、修飾するペプチドを、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（たとえば、Ｇａｌβ１，３またはＧａｌβ１，４）および適切なガラクトシルドナー（たとえばＵＤＰ−ガラクトース）を含む反応混合物と共にインキュベートすることが含まれる。実質的に完了するまで反応を進行させるか、または、事前に選択した量のガラクトース残基を加えた際に反応を停止させる。選択したサッカライド受容体をアセンブルする他の方法は、当業者に明らかであろう。

さらに別の実施形態では、糖ペプチドと連結したオリゴ糖を、最初に全体でまたは部分的に「トリミング」して、シアリルトランスフェラーゼの受容体または１つもしくは複数の適切な残基を付加して適切な受容体を得ることができる部分のどちらかを曝露させる。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素（たとえば米国特許第５，７１６，８１２号）が、結合およびトリミング反応に有用である。本方法の別の実施形態では、ペプチドのシアル酸部分を本質的に完全に（たとえば、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも９９％）除去して、修飾シアル酸の受容体を曝露させる。

以下の記述では、本発明の方法は、それにＰＥＧ部分が結合した修飾糖の使用によって例示する。記述の焦点は例示を明確にするためである。当業者は、この記述が、修飾糖が治療用部分、生体分子などを保有する実施形態にも同等に関連することを、理解されよう。

修飾糖の付加の前に炭水化物残基が「トリミングされた（trimmed）」本発明の例示的な実施形態では、高マンノースを、第１世代の二分岐（biantennary）構造までトリミングして戻す。ＰＥＧ部分を保有する修飾糖を、「トリミングして戻す（timming back）」ことによって曝露された糖残基のうちの１つまたは複数とコンジュゲートさせる。一例では、ＰＥＧ部分を、ＰＥＧ部分とコンジュゲートしたＧｌｃＮＡｃ部分を介して付加する。修飾されたＧｌｃＮＡｃを、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に結合させる。あるいは、未修飾のＧｌｃＮＡｃを、分枝鎖状種の末端の一方または両方に付加することができる。

別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ部分を、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に、末端マンノース残基上に付加したＧｌｃＮＡｃ残基とコンジュゲートした、ガラクトース残基を有する修飾糖を介して、付加する。あるいは、未修飾のＧａｌを、一方または両方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に付加することができる。

さらなる例では、ＰＥＧ部分を、Ｇａｌ残基上に、上述のものなどの修飾シアル酸を用いて付加する。

別の例示的な実施形態では、高マンノース構造を、二分岐構造が分枝するマンノースまで「トリミングして戻す」。一例では、ＰＥＧ部分を、ポリマーで修飾したＧｌｃＮＡｃを介して付加する。あるいは、未修飾のＧｌｃＮＡｃをマンノースに付加し、次いでＰＥＧ部分が結合したＧａｌを付加する。さらに別の実施形態では、未修飾のＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基をマンノースに逐次的に付加し、次いでＰＥＧ部分で修飾したシアル酸部分を付加する。

また、高マンノース構造を、基本のトリ−マンノシル核までトリミングして戻すこともできる。

さらなる例示的な実施形態では、高マンノースを、第１のマンノースが結合しているＧｌｃＮＡｃまで「トリミングして戻す」。ＧｌｃＮＡｃを、ＰＥＧ部分を保有するＧａｌ残基とコンジュゲートさせる。あるいは、未修飾のＧａｌをＧｌｃＮＡｃに付加し、次いで水溶性の糖で修飾したシアル酸を付加する。さらなる例では、末端ＧｌｃＮＡｃをＧａｌとコンジュゲートさせ、続いて、ＧｌｃＮＡｃをＰＥＧ部分を保有する修飾されたフコースでフコシル化する。

高マンノースを、ペプチドのＡｓｎに結合した第１のＧｌｃＮＡｃまでトリミングして戻してもよい。一例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）_ａ残基のＧｌｃＮＡｃを、水溶性ポリマーを保有するＧｌｃＮＡｃとコンジュゲートさせる。別の例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）_ａ残基のＧｌｃＮＡｃを、水溶性ポリマーを保有するＧａｌで修飾する。さらなる実施形態では、ＧｌｃＮＡｃをＧａｌで修飾し、次いで、ＰＥＧ部分で修飾したシアル酸のＧａｌとコンジュゲーションさせる。

他の例示的な実施形態は、そのそれぞれが本明細書中に参照により組み込れられる、公有米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号；第２００４００６３９１１号；第２００４０１３７５５７号；米国特許出願第１０／３６９，９７９号；第１０／４１０，９１３号；第１０／３６０，７７０号；第１０／４１０，９４５号およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号に記載されている。

上述の例は、本明細書中に記載の方法の能力の例示を提供する。本明細書中に記載の方法を用いて、「トリミングして戻す」こと、および実質的に任意の所望の構造の炭水化物残基を構築することが可能である。修飾糖は、上述のように炭水化物部分の末端に付加するか、または、ペプチド核と炭水化物の末端の中間部であることができる。

例示的な実施形態では、既存のシアル酸を糖ペプチドから、シアリダーゼを用いて除去し、それにより、その下にあるガラクトシル残基のすべてまたはほとんどのマスクを外す。あるいは、ペプチドまたは糖ペプチドを、ガラクトース残基、またはガラクトース単位で終わるオリゴ糖残基で標識する。ガラクトース残基の曝露または付加後、適切なシアリルトランスフェラーゼを用いて修飾シアル酸を付加する。

別の例示的な実施形態では、シアル酸をシアル酸上に転移させる酵素を利用する。本方法は、シアリル化されたグリカンをシアリダーゼで処理してシアル酸の下のグリカン残基をさらさずに、実施することができる。例示的なポリマー−修飾シアル酸は、ポリ（エチレングリコール）で修飾したシアル酸である。シアル酸および修飾シアル酸部分を、シアル酸残基が含まれるグリカン上に付加する、または、グリカン上の既存のシアル酸残基をこれらの種に交換する、他の例示的な酵素には、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶが含まれる。

さらなる手法では、マスクされた反応性官能基がシアル酸上に存在する。マスクされた反応基は、好ましくは、修飾シアル酸を第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子ペプチドに結合させるために使用する条件によって影響を受けない。修飾シアル酸とペプチドとの共有結合後、マスクを除去し、ペプチドをＰＥＧなどの薬剤とコンジュゲートさせる。薬剤は、ペプチドと、修飾糖残基上のマスクが外された反応基とのその反応によって、特異的な様式でコンジュゲートする。

任意の修飾糖を、糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に応じて、その適切なグリコシルトランスフェラーゼと共に使用することができる。上述のように、ＰＥＧ化された構造の導入に必要な糖ペプチドの末端糖は、発現中に自然に導入するか、または、適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの混合物を用いて発現後に生じさせることができる。

さらなる例示的な実施形態では、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧをβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させ、それによって、修飾されたガラクトースを適切な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造に転移させる。糖ペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳動物、昆虫、植物または真菌などの発現系で起こり得るように発現中に生じさせ得るが、必要に応じて糖ペプチドをシアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで処理することによっても生じさせることができる。

別の例示的な実施形態では、ＧＮＴ１〜５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを利用して、ＰＥＧ化された−ＧｌｃＮＡｃを糖ペプチド上の末端マンノース残基に転移させる。さらなる例示的な実施形態では、Ｎおよび／またはＯ連結のグリカン構造を糖ペプチドから酵素的に除去して、アミノ酸または末端グリコシル残基を曝露させ、続いてこれを修飾糖とコンジュゲートさせる。たとえば、エンドグリカナーゼを用いて糖ペプチドのＮ連結の構造を除去し、末端ＧｌｃＮＡｃを、糖ペプチド上のＧｌｃＮＡｃ連結のＡｓｎとして曝露させる。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、ＰＥＧ−ガラクトース官能基を曝露されたＧｌｃＮＡｃ上に導入する。

代替実施形態では、糖残基をペプチド主鎖に転移させることが知られているグリコシルトランスフェラーゼを用いて、修飾糖をペプチド主鎖に直接付加する。本発明の実施において有用な例示的なグリコシルトランスフェラーゼには、それだけには限定されないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ１〜１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが含まれる。この手法を使用することにより、修飾糖を、炭水化物を全く欠くペプチド上、または既存の糖ペプチド上に直接付加することが可能となる。どちらの場合でも、修飾糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって定義されるペプチド主鎖上の特異的な位置で起こり、化学的方法を用いたタンパク質のペプチド主鎖の修飾中に起こるようなランダムな様式では起こらない。適切なアミノ酸配列をポリペプチド鎖内に操作することによって、グリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列を欠くタンパク質または糖ペプチド内に薬剤のアレイを導入することができる。

上述の例示的な実施形態のそれぞれにおいて、修飾糖とペプチドとのコンジュゲーションに続いて、１つまたは複数の追加の化学的または酵素的修飾ステップを利用することができる。例示的な実施形態では、酵素（たとえばフコシルトランスフェラーゼ）を用いて、グリコシル単位（たとえばフコース）を、ペプチドに結合している末端修飾糖上にペンダントさせる。別の例では、酵素反応を利用して、修飾糖がコンジュゲートできなかった部位に「キャップ」を行う。あるいは、化学反応を利用して、コンジュゲートした修飾糖の構造を変化させる。たとえば、コンジュゲートした修飾糖を、修飾糖が結合しているペプチド構成要素とのその連結を安定化または不安定化させる薬剤と反応させる。別の例では、修飾糖の構成要素を、ペプチドとのそのコンジュゲーション後に脱保護する。当業者は、修飾糖がペプチドとコンジュゲートした後の段階で本発明の方法において有用な酵素的および化学的手順のアレイが存在することを、理解されよう。修飾糖−ペプチドコンジュゲートのさらなる詳細は本発明の範囲内にある。

本発明のコンジュゲートを調製するための酵素および反応条件は、本出願の親出願および共同所有の公開ＰＣＴ特許出願国際公開公報ＷＯ０３／０３１４６４号、国際公開公報ＷＯ０４／０３３６５１号、国際公開公報ＷＯ０４／０９９２３１号に詳述されている。

選ばれた実施形態では、昆虫細胞中で発現されるペプチドは、再構築された糖ペプチド上のグリカンにＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌグリコシル残基が含まれるように、再構築する。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌの付加は、別々の反応として、または単一容器内の単一の反応として起こることができる。この例では、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩおよびＧａｌ−トランスフェラーゼＩを用いる。修飾されたシアリル部分は、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩを用いて付加する。

別の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌおよび修飾Ｓｉａの付加も、上述の酵素を用いて、単一の反応器内で起こることができる。酵素的再構築およびグリコＰＥＧ化ステップのそれぞれは、個別に実施する。

ペプチドを哺乳動物細胞中で発現させる場合は、様々な方法が役立つ。一実施形態では、ペプチドを、修飾シアル酸をペプチド上のシアル酸上に直接転移させてＳｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１を形成する、またはペプチド上のシアル酸を修飾シアル酸で交換してＳｉａ−Ｌ−Ｒ^１を形成するシアリルトランスフェラーゼと接触させることによって、コンジュゲーション前に再構築する必要なしに、ペプチドをコンジュゲートさせる。本方法において役立つ例示的な酵素は、ＣＳＴ−ＩＩである。シアル酸をシアル酸に付加する他の酵素は当業者に知られており、そのような酵素の例を、本明細書に添付する図に記載する。

本発明のコンジュゲートを調製するさらに別の方法では、哺乳動物系中で発現させるペプチドは、シアリダーゼを用いて脱シアリル化する。曝露されたＧａｌ残基を、Ｏ連結のグリカンに特異的なシアリルトランスフェラーゼを用いて修飾シアル酸でシアリル化して、Ｏ連結の修飾されたグリカンを有するペプチドを提供する。脱シアリル化された修飾されたペプチドは、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩなどのシアリルトランスフェラーゼを用いることによって、任意選択で部分的にまたは完全に再シアリル化する。

別の態様では、本発明は、本発明のＰＥＧ化されたペプチドコンジュゲートを作製する方法を提供する。本方法には、（ａ）

から選択されるグリコシル基を含むペプチドと、以下から選択されるメンバーである式を有するＰＥＧ−シアル酸ドナーと

［式中、変数は上述のとおりである］、前記ドナーからのＰＥＧ−シアル酸を、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌおよび前記グリコシル基のＳｉａから選択されるメンバー上に転移させる酵素とを、前記転移に適した条件下で接触させることが含まれる。例示的な修飾シアル酸ドナーは、リンカー部分を介して、ポリマー、たとえば直鎖状または分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）部分で修飾されたＣＭＰ−シアル酸である。本明細書中に論じたように、ペプチドは、ＧａｌＮＡｃおよび／またはＧａｌおよび／またはＳｉａで、任意選択でグリコシル化（「再構築」）した後に、修飾糖を結合する。再構築ステップは、ステップ間にグリコシル化されたペプチドを精製せずに、同じ容器内で順々に起こることができる。あるいは、１つまたは複数の再構築ステップの後、グリコシル化されたペプチドを精製した後に、次のグリコシル化またはグリクＰＥＧ化ステップに供することができる。例示的な実施形態では、本方法は、ペプチドを宿主中で発現させることをさらに含む。例示的な実施形態では、宿主は哺乳動物細胞または昆虫細胞である。別の例示的な実施形態では、哺乳動物細胞は、ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞から選択されるメンバーであり、昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ細胞である。

実施例に例示し、以下にさらに論じるように、ＰＥＧ−糖のための受容体部分の配置は、任意の所望のステップ数で達成する。たとえば、一実施形態では、ＧａｌＮＡｃをペプチドに付加することに、同じ反応器内でＰＥＧ−糖をＧａｌＮＡｃとコンジュゲートさせる第２のステップが続くことができる。あるいは、これらの２つのステップを、単一の容器内でほぼ同時に実施することができる。

例示的な実施形態では、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは以下の式を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

別の例示的な実施形態では、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは以下の式を有する。

式中、変数は上述のとおりである。

さらなる例示的な実施形態では、ペプチドを適切な発現系中で発現させた後に、グリコｐｅｇ化または再構築する。例示的な発現系には、Ｓｆ−９／バキュロウイルスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。

例示的な実施形態では、本発明は、以下の式を有する修飾されたシアリル残基を含むグリコシルリンカーを含むペプチドコンジュゲートを作製する方法を提供する。

式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり；Ｇは、Ｒ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル−Ｒ^１から選択されるメンバーであり；Ｒ^１は、直鎖状ポリ（エチレングリコール）残基および分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり；Ｍは、Ｈ、金属および単一の負電荷から選択されるメンバーであり；Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、たとえば、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ^１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルである場合、ＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−であり、前記方法は、（ａ）グリコシル部分：

を含むペプチドを、式：

［式中、変数は上述のとおりである］を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、前記ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌ上に転移させる酵素とを、前記転移に適した条件下で接触させることを含む。

例示的な実施形態では、Ｌ−Ｒ^１は以下の式を有する。

式中、ａは、０〜２０から選択される整数である。

大スケールまたは小スケールの量のペプチドコンジュゲートを、本明細書中に記載の方法によって生成することができる。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．５ｍｇ〜約１００ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．１ｋｇ〜約１ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．５ｋｇ〜約１０ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．５ｋｇ〜約３ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．１ｋｇ〜約５ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．０８ｋｇ〜約０．２ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．０５ｋｇ〜約０．４ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．１ｋｇ〜約０．７ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約０．３ｋｇ〜約１．７５ｋｇから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチドの量は、約２５ｋｇ〜約６５ｋｇから選択されるメンバーである。

本明細書中に記載の反応で利用するペプチドの濃度は、ペプチド約０．５〜約１０ｍｇ／反応混合物１ｍＬから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチド濃度は、ペプチド約０．５〜約１ｍｇ／反応混合物１ｍＬから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチド濃度は、ペプチド約０．８〜約３ｍｇ／反応混合物１ｍＬから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチド濃度は、ペプチド約２〜約６ｍｇ／反応混合物１ｍＬから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチド濃度は、ペプチド約４〜約９ｍｇ／反応混合物１ｍＬから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチド濃度は、ペプチド約１．２〜約７．８ｍｇ／反応混合物１ｍＬから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ペプチド濃度は、ペプチド約６〜約９．５ｍｇ／反応混合物１ｍＬから選択されるメンバーである。

本明細書中に記載の反応で利用することができるＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．１〜約１．０ｍＭから選択されるメンバーである。濃度を増加または減少させ得る要因には、ＰＥＧの大きさ、インキュベーション時間、温度、緩衝液の構成要素、ならびに使用するグリコシルトランスフェラーゼの種類および濃度が含まれる。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．１〜約１．０ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド濃度は、約０．１〜約０．５ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．１〜約０．３ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．２〜約０．７ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．３〜約０．５ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．４〜約１．０ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．５〜約０．７ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．８〜約０．９５ｍＭから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の濃度は、約０．５５〜約１．０ｍＭから選択されるメンバーである。

本明細書中に記載の反応で利用することができるＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、タンパク質に付加することができるＰＥＧ化された糖の理論数に基づいている。ＰＥＧ化された糖の理論数は、タンパク質上の糖部位の理論数、ならびにそのモル数と比較したタンパク質の分子量、したがってＰＥＧ化されたヌクレオチド糖の分子量に基づいている。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、１〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、１〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、２〜６から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、３〜１７から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、４〜１１から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、５〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、１〜１０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、１２〜２０から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、１４〜１７から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、７〜１５から選択される整数である。例示的な実施形態では、ＰＥＧ化されたヌクレオチド糖のモル当量は、８〜１６から選択される整数である。

ＩＩＩ．Ｂ．同時脱シアリル化およびグリコＰＥＧ化
本発明は、グリコｐｅｇ化の「ワンポット」方法を提供する。ワンポット方法は、ペプチドコンジュゲートを作製する他の例示的なプロセスとは明確に異なり、シアリダーゼを用いた逐次的な脱シアリル化、続いて陰イオン交換カラム上でのアシアロペプチドの精製、その後、ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよびグリコシルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｇａｌ３など）、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを使用したグリコＰＥＧ化を用いる。その後、ペプチドコンジュゲートを陰イオン交換、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって精製して、精製したペプチドコンジュゲートを生成する。

ワンポット方法は、ペプチドコンジュゲートを製造するための改善された方法である。この方法では、脱シアリル化およびグリコＰＥＧ化反応をワンポットの反応で合わせ、アシアロペプチドを精製するための以前に記載されたプロセスで使用する最初の陰イオン交換クロマトグラフィーステップが不要となる。このプロセスステップの軽減は、いくつかの利点をもたらす。第１に、ペプチドコンジュゲートを生成するために必要なプロセスステップの数が減少し、これにより、プロセスの操作の複雑さも軽減する。第２に、ペプチドコンジュゲートを生成するためのプロセス時間が、たとえば４日間から２日間まで短縮される。これにより、プロセス中の調節に関連する原材料の要件および品質管理コストが減少する。第３に、本発明では、より少ないシアリダーゼ、たとえば２０倍まで少ないシアリダーゼを利用し、たとえば、プロセスに関連するペプチドコンジュゲートを生成するために５００ｍＵ／Ｌが必要である。このシアリダーゼの使用の減少により、反応混合物中のシアリダーゼなどの汚染物質の量が顕著に減少する。

例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートを以下の方法によって調製する。第１のステップでは、ペプチドを、シアリダーゼ、本発明の修飾糖、およびグリコシル連結基の修飾糖からペプチドへの転移を触媒することができる酵素と合わせて、ペプチドコンジュゲートを調製する。任意のシアリダーゼを本方法で使用し得る。本発明において役立つ例示的なシアリダーゼは、ＣＡＺＹデータベース中に見つけることができる（afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.htmlおよびwww.cazy.org/CAZY参照）。例示的なシアリダーゼは、任意の数の供給源から購入することがでできる（QA-Bio、Calbiochem、Marukin、Prozymeなど）。例示的な実施形態では、シアリダーゼは、細胞質シアリダーゼ、リソソームシアリダーゼ、エクソ−αシアリダーゼ、およびエンドシアリダーゼから選択されるメンバーである。別の例示的な実施形態では、使用するシアリダーゼは、ウェルシュ菌もしくは肺炎連鎖菌などの細菌、またはアデノウイルスなどのウイルスから産生させる。例示的な実施形態では、グリコシル連結基の修飾糖からペプチドへの転移を触媒することができる酵素は、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼ、ならびにエキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである。例示的な実施形態では、酵素は、ＳＴ３Ｇａｌ３であるグリコシルトランスフェラーゼである。別の例示的な実施形態では、使用する酵素は、大腸菌などの細菌またはクロカビなどの真菌から産生させる。別の例示的な実施形態では、シアリダーゼを、グリコシルトランスフェラーゼの前に指定した時間ペプチドに加え、ＰＥＧ−シアル酸試薬およびグリコシルトランスフェラーゼを加えることでグリコＰＥＧ化反応を開始させる前にシアリダーゼ反応を進行させる。これらの例の多くは、本明細書中に論じられている。最後に、本明細書中に記載の任意の修飾糖を本反応で利用することができる。

別の例示的な実施形態では、本方法は、「キャッピング」ステップをさらに含む。このステップでは、追加のＰＥＧ化されていないシアル酸を反応混合物に加える。例示的な実施形態では、このシアル酸をペプチドまたはペプチドコンジュゲートに加えることで、ＰＥＧ−シアル酸のさらなる付加を妨げる。別の例示的な実施形態では、このシアル酸は、反応混合物中のグリコシルトランスフェラーゼの機能を妨害し、グリコシル連結基がペプチドまたはペプチドコンジュゲートに付加することを有効に止める。最も重要なことに、反応混合物に加えるシアル酸は、非グリコＰＥＧ化されたグリカンにキャップを行い、それにより、薬物動態学が向上したペプチドコンジュゲートがもたらされる。さらに、このシアリダーゼは、事前に精製せずに特定の量までのＰＥＧ化の度合が所望される場合に、グリコＰＥＧ化反応混合物に直接加えることができる。

例示的な実施形態では、キャッピングステップの後、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の約５０％未満が、シアリル部分を含まない。例示的な実施形態では、キャッピングステップの後、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の約４０％未満が、シアリル部分を含まない。例示的な実施形態では、キャッピングステップの後、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の約３０％未満が、シアリル部分を含まない。例示的な実施形態では、キャッピングステップの後、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の約２０％未満が、シアリル部分を含まない。例示的な実施形態では、キャッピングステップの後、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の約１０％未満が、シアリル部分を含まない。例示的な実施形態では、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の約２０％〜約５％が、シアリル部分を含まない。例示的な実施形態では、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の約２５％〜約１０％が、シアリル部分を含まない。例示的な実施形態では、キャッピングステップの後、ペプチドまたはペプチドコンジュゲート上のシアリル化部位の本質的にすべてが、シアリル部分を含む。

ＩＩＩ．Ｃ．ペプチドの脱シアリル化および選択的修飾
別の例示的な実施形態では、本発明は、ペプチドを脱シアリル化する方法を提供する。本方法は、好ましくは、少なくとも約４０％、好ましくは４５％、好ましくは約５０％、好ましくは約５５％、好ましくは約６０％、好ましくは約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約７５％、好ましくは約８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは１００％ジシアリル化されたペプチドを提供する。

本方法には、ペプチドをシアリダーゼに、好ましくは一定時間接触させることが含まれる。事前に選択した時間は、ペプチドを所望の度合まで脱シアリル化するために十分である。好ましい実施形態では、所望の度合の脱シアリル化を達成した際に、脱シアリル化されたペプチドをシアリダーゼから分離する。例示的な脱シアリル化反応および精製サイクルは、本明細書中に記載されている。

当業者は、脱シアリル化反応を実施するために適切な、事前に選択した時間を決定できるであろう。例示的な実施形態では、時間は、２４時間未満、好ましくは８時間未満、より好ましくは６時間未満、より好ましくは４時間未満、さらにより好ましくは２時間未満、さらにより好ましくは１時間未満である。

別の例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲート調製中、脱シアリル化反応の終わりに、ペプチドの集団のメンバーの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％で、単一のシアル酸しかそれに結合しておらず、さらにより好ましくは完全に脱シアリル化されている。

さらなる例示的な実施形態では、調製中、脱シアリル化反応の終わりに、ペプチドの集団のメンバーの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％が完全に脱シアリル化されている。

さらに別の例示的な実施形態では、調製中、脱シアリル化反応の終わりに、ペプチド集団のメンバーの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が、単一のシアル酸のみを有し、ペプチドの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が完全にジシアリル化されている。

好ましい実施形態では、調製中、脱シアリル化反応の終わりに、ペプチドの集団の少なくとも５０％が完全にジシアリル化されており、ペプチド集団のメンバーの少なくとも４０％が単一のシアル酸部分のみを有する。

脱シアリル化後、ペプチドを修飾糖と任意選択でコンジュゲートさせる。例示的な修飾糖には、分枝鎖状または直鎖状ポリ（エチレングリコール）部分と結合した糖部分が含まれる。コンジュゲーションは、修飾糖を修飾糖ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上へと転移させる酵素によって触媒される。例示的な修飾糖ドナーは、分枝鎖状または直鎖状ポリ（エチレングリコール）部分を保有するＣＭＰ−シアル酸である。例示的なポリ（エチレングリコール）部分の分子量は、少なくとも約２ｋＤ、より好ましくは少なくとも約５ｋＤ、より好ましくは少なくとも約１０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤ、より好ましくは少なくとも約３０ｋＤ、より好ましくは少なくとも約４０ｋＤである。

例示的な実施形態では、修飾糖部分を修飾糖ドナーから転移させるために利用する酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ、たとえばシアリルトランスフェラーゼである。本発明の方法において役立つ例示的なシアリルトランスフェラーゼは、ＳＴ３Ｇａｌ３である。

本発明の例示的な方法は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの修飾基を保有する、修飾されたペプチドをもたらす。一実施形態では、生じたペプチドは、ペプチドの軽鎖上に単一の修飾基を保有する。別の実施形態では、本方法は、重鎖上に単一の修飾基を保有する、修飾されたペプチドを提供する。さらに別の実施形態では、本方法は、軽鎖上に単一の修飾基および重鎖上に単一の修飾基を有する、修飾されたペプチドを提供する。

別の態様では、本発明は、修飾されたペプチドを調製する方法を提供する。本方法には、ペプチドを、修飾基を保有する修飾糖ドナーおよび修飾糖部分を修飾糖ドナーからペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に転移させることができる酵素と接触させることが含まれる。

例示的な実施形態では、本方法は、集団メンバーの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％が、ペプチドの軽鎖上でモノ−コンジュゲートされている、修飾されたペプチドの集団を提供する。

例示的な実施形態では、本方法は、集団メンバーの少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％が、ペプチドの軽鎖上でジ−コンジュゲートされている、修飾されたペプチドの集団を提供する。

本態様の例示的な実施形態では、本方法は、集団メンバーの５０％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下が、ペプチドの重鎖上でモノ−コンジュゲートされている、修飾されたペプチドの集団を提供する。

本態様の例示的な実施形態では、本方法は、集団メンバーの５０％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下が、ペプチドの重鎖上でジ−コンジュゲートされている、修飾されたペプチドの集団を提供する。

ペプチドを接触ステップの前にシアリダーゼの作用に供することができるか、または事前の脱シアリル化なしでペプチドを使用することができる。ペプチドをシアリダーゼと接触させる場合、本質的に完全に脱シアリル化されているか、または部分的にのみ脱シアリル化されているかのどちらかであることができる。好ましい実施形態では、ペプチドは、接触ステップの前に少なくとも部分的に脱シアリル化する。ペプチドは、本質的に完全に脱シアリル化されているか（本質的にアシアロ）、または部分的にのみ脱シアリル化されていてよい。好ましい実施形態では、脱シアリル化されたペプチドは、本明細書中に上述した脱シアリル化された実施形態のうちの１つである。

ＩＩＩ．Ｄ．ペプチドコンジュゲートの合成中に加えた試薬の追加のアリコート
本明細書中に記載のペプチドコンジュゲートを合成する例示的な実施形態では、選択した時間の後、反応構成要素／試薬の１つまたは複数の追加のアリコートを反応混合物に加える。例示的な実施形態では、ペプチドコンジュゲートはペプチドコンジュゲートである。別の例示的な実施形態では、加える反応構成要素／試薬は修飾糖ヌクレオチドである。修飾糖ヌクレオチドを反応内に導入することにより、グリコＰＥＧ化反応が完了まで駆動される可能性が高まる。例示的な実施形態では、ヌクレオチド糖は、本明細書中に記載のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧである。例示的な実施形態では、加える反応構成要素／試薬はシアリダーゼである。例示的な実施形態では、加える反応構成要素／試薬はグリコシルトランスフェラーゼである。例示的な実施形態では、加える反応構成要素／試薬はマグネシウムである。例示的な実施形態では、加える追加のアリコートは、反応の開始時に加えた最初の量の約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％または９０％を表す。例示的な実施形態では、反応構成要素／試薬は、反応開始の約３時間、または６時間、または８時間、または１０時間、または１２時間、または１８時間、または２４時間、または３０時間、または３６時間後に反応に加える。

ＩＩＩ．Ｅ．ペプチドコンジュゲートの精製
上記プロセスによって生成した生成物は、精製せずに使用することができる。しかし、通常は、生成物ならびに中間体の１つまたは複数の、たとえば、ヌクレオチド糖、分枝鎖状および直鎖状ＰＥＧ種、修飾糖および修飾ヌクレオチド糖を回収することが好ましい。薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過などの、グリコシル化されたペプチドを回収するための標準の周知の技術を使用することができる。膜濾過、より好ましくは逆浸透膜を利用すること、または、本明細書以下および本明細書中で言及した文献に記載されている、回収のための１つもしくは複数のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好ましい。たとえば、膜が約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する膜濾過を使用して、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。特定の事例では、生成物の精製を確実にするために、不純物と生成物との間の分子量カットオフの差異を利用する。たとえば、生成物ペプチド−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤを未反応のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤから精製するためには、たとえば、ペプチド−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤが濃縮水中に留まることを可能にする一方で、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤが濾液中に流れることを可能にするフィルターを選択しなければならない。その後、ナノ濾過または逆浸透を使用して、塩を除去するおよび／または生成物サッカライドを精製することができる（たとえば国際公開公報ＷＯ９８／１５５８１号参照）。ナノフィルター膜は、一価の塩を通すが、使用する膜に応じて約１００〜約２，０００ダルトンより大きい多価の塩および非帯電の溶質を保持する、逆浸透膜のクラスである。したがって、典型的な応用では、本発明の方法によって調製したサッカライドは膜中に保持され、汚染塩は通過する。

ペプチドを細胞内で産生させる場合は、第１のステップとして、宿主細胞または溶解断片のどちらかである粒子状の細片を除去する。グリコＰＥＧ化後、ＰＥＧ化されたペプチドを、当分野で認識されている方法によって、たとえば、遠心分離または限外濾過によって精製する。任意選択で、タンパク質を市販のタンパク質濃縮フィルターで濃縮してもよく、次いで、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（たとえば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含むマトリックス上で）、Ｂｌｕｅ−セファロース上のクロマトグラフィー、ＣＭＢｌｕｅ−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、エーテルＴｏｙｏｐｅａｒｌ、ブチルＴｏｙｏｐｅａｒｌ、フェニルＴｏｙｏｐｅａｒｌ、またはタンパク質Ａセファロース、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ（たとえば、脂肪族基がペンダントしたシリカゲル）、たとえばＳｅｐｈａｄｅｘモレキュラーシーブまたはサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲル濾過、ポリペプチドを選択的に結合するカラム上のクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫安塩析から選択される、１つあるいは複数のステップによって、ポリペプチド変異体を他の不純物から分離する。精製を用いて、本セクション中以下にさらに記載するように、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子ペプチドコンジュゲートの一方の鎖を他方から分離することができる。

培養中に産生される修飾糖ペプチドは、通常、最初に細胞、酵素などから抽出し、次いで、１つまたは複数の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離する。さらに、修飾糖タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し得る。最後に、ＨＰＬＣを最終精製ステップに使用し得る。

タンパク質分解を阻害するために前述のステップの任意のものにプロテアーゼ阻害剤を含めてもよく、偶発的な汚染物質の増殖を妨げるために抗生物質および保存料を含めてもよい。前述のステップで使用するプロテアーゼ阻害剤は、抗疼痛剤、α−１−抗トリプシン、抗トロンビン、ロイペプチン、アマスタチン、キモスタチン、バンザミジン（banzamidin）、および他のセリンプロテアーゼ阻害剤（すなわちセルピン）を含めた低分子量阻害剤であり得る。一般に、セリンプロテアーゼ阻害剤は、０．５〜１００μＭの範囲の濃度で使用すべきであるが、細胞培養物中のキモスタチンは、２００μＭ以上の濃度で使用してもよい。他のセリンプロテアーゼ阻害剤には、キモトリプシン様、サブチリシン様、α／β加水分解酵素、またはセリンプロテアーゼのシグナルペプチダーゼのクランに特異的な阻害剤が含まれる。セリンプロテアーゼ以外に、システインプロテアーゼ阻害剤（１〜１０μＭ）およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤（１〜５μＭ）、ならびにペプスタチン（．１〜５μＭ）などの非特異的プロテアーゼ阻害剤を含めた、他の種類のプロテアーゼ阻害剤も使用し得る。本発明で使用するプロテアーゼ阻害剤には、ヒルから単離されたヒルスタシン阻害剤などの天然プロテアーゼ阻害剤も含まれ得る。一部の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、特異性を持ってプロテアーゼ触媒部位と結合して、グリコＰＥＧ化反応を妨害せずに第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子を安定化することができる、合成ペプチドまたは抗体を含む。

別の実施形態では、最初に、本発明の修飾糖ペプチドを産生する系からの上清を最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットを用いて濃縮する。濃縮ステップに続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用し得る。たとえば、適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体と結合した、ペプチドに対するリガンド、レクチンまたは抗体分子を含み得る。あるいは、陰イオン交換樹脂、たとえば、ペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基材を用い得る。適切なマトリックスには、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製で一般的に用いられる他の種が含まれる。あるいは、陽イオン交換ステップを用い得る。適切な陽イオン交換剤には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が特に好ましい。

精製において役立つ他の方法には、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびＢｌｕｅセファロース上のクロマトグラフィーが含まれる。これらおよび他の有用な方法は、共同で譲渡された米国仮特許第（2005年5月6日出願、代理人整理番号第40853-01-5168-P1）に例示されている。

疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、たとえばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた、１つまたは複数のＲＰ−ＨＰＬＣステップを用いて、ポリペプチドコンジュゲート組成物をさらに精製し得る。前述の精製ステップの一部またはすべてを、様々な組合せで用いて、均質または本質的に均質な修飾糖タンパク質を提供することもできる。

大スケールの発酵から生じる本発明の修飾糖ペプチドは、Ｕｒｄａｌ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．、２９６：１７１（１９８４）に開示されている方法に類似の方法によって精製し得る。この参考文献は、調製用ＨＰＬＣカラム上で組換えヒトＩＬ−２を精製する、２つの逐次的なＲＰ−ＨＰＬＣステップを記載している。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーなどの技術を利用して修飾糖タンパク質を精製し得る。

例示的な実施形態では、精製は、２００５年３月２４日出願の、共同所有の共同譲渡された米国仮特許第６０／６６５，５８８号に記載の方法によって達成する。

本発明によれば、逐次的な脱シアリル化または同時シアリル化のどちらかによって生成したｐｅｇ化されたペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、塩化マグネシウム勾配を用いて精製または分離することができる。

ＩＶ．薬剤組成物
別の態様では、本発明は薬剤組成物を提供する。薬剤組成物には、薬学的に許容される希釈剤、および天然に存在しない、ＰＥＧ部分、治療用部分または生体分子とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間の共有コンジュゲートが含まれる。ポリマー、治療用部分または生体分子は、ペプチドとポリマー、治療用部分または生体分子との間に差し込まれており、その両方に共有結合している、完全なグリコシル連結基を介して、ペプチドとコンジュゲートしている。

本発明の薬剤組成物は、様々な薬物送達系での使用に適している。本発明で使用するために適切な調製物は、レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、ＭａｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、第１７版（１９８５）中に見つかる。薬物を送達する方法の手短な総説には、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照されたい。

例示的な実施形態では、薬剤調製物は、ペプチドコンジュゲート、ならびに塩化ナトリウム、塩化カルシウム二水和物、グリシルグリシン、ポリソルベート８０、およびマンニトールから選択されるメンバーである薬学的に許容される希釈剤を含む。別の例示的な実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、塩化ナトリウムおよびグリシルグリシンである。別の例示的な実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、塩化カルシウム二水和物およびポリソルベート８０である。別の例示的な実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、マンニトールである。

薬剤組成物は、たとえば、局所的、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含めた、任意の適切な投与様式のために配合し得る。皮下注射などの非経口投与には、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与には、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの、上記担体または固体担体のうちの任意のものを使用し得る。生分解性ミクロスフェア（たとえば、ポリラクテートポリグリコレート）も、本発明の薬剤組成物の担体として用い得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、たとえば、米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号に開示されている。

一般的に、薬剤組成物は、非経口的に、たとえば静脈内で投与する。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体、たとえば、水、緩衝用水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁させた化合物が含まれる、非経口投与のための組成物を提供する。組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じて、ｐＨ調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、湿潤剤、洗剤などの薬学的に許容される補助物質を含み得る。

これらの組成物は、慣用の滅菌技術によって滅菌するか、または滅菌濾過し得る。生じる水溶液を、そのままで使用するためにパッケージするか、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌水性担体と合わせる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８である。

一部の実施形態では、本発明の糖ペプチドは、標準の小胞形成脂質から形成したリポソーム内に取り込ませることができる。たとえば、Ｓｚｏｋａ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第４，８３７，０２８号に記載のように、様々な方法がリポソームの調製に利用可能である。様々な標的化剤（たとえば本発明のシアリルガラクトシド）を用いたリポソームの標的化は、当分野で周知である（たとえば、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号参照）。

標的化剤をリポソームとカップリングさせる標準方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質構成要素のリポソーム内への取り込みを含み、これは、標的化剤、または本発明の脂質で誘導体化した糖ペプチドなどの誘導体化した親油性化合物を結合させるために、活性化することができる。

標的化の機構は、標的化剤が、標的部分が標的、たとえば細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるような様式で、リポソームの表面上に位置することを、一般に要する。本発明の炭水化物は、当業者に知られている方法を用いて、リポソームを形成する前に脂質分子に結合させ得る（たとえば、それぞれ長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸を用いた、炭水化物上に存在するヒドロキシル基アルキル化またはアシル化）。あるいは、リポソームは、膜を形成する時点で連結部分を最初に膜内に取り込むような方法で作製し得る。連結部分は、膜中にしっかりと包埋かつ固定されている親油性部分を有していなければならない。また、これは、リポソームの水性表面上に化学的に利用可能である反応性部分も有していなければならない。反応性部分は、後に付加する標的化剤または炭水化物と安定な化学結合を形成するために化学的に適切であるように、選択する。一部の事例では、標的剤を連結分子に直接結合することが可能であるが、ほとんどの場合、第３の分子を使用して化学的橋として働かせて、膜中にある連結分子と標的剤または小胞表面から外れて三次元的に伸長している炭水化物とを連結させることが、より適切である。

また、本発明の方法によって調製した化合物は、診断試薬としても使用し得る。たとえば、標識した化合物を用いて、炎症を患っていることが疑われる患者において炎症または腫瘍転移の領域の位置を決定することが可能である。この使用のために、化合物を^１２５Ｉ、^１４Ｃ、またはトリチウムで標識することができる。

本発明の組成物の調製において役立つ種の調製方法は、一般に、様々な特許公開、たとえば、米国特許ＵＳ２００４０１３７５５７号；国際公開公報ＷＯ０４／０８３２５８号；および国際公開公報ＷＯ０４／０３３６５１号に記載されている。以下の実施例は、本発明のコンジュゲートおよび方法を例示するために提供するが、特許請求した本発明を限定しない。
実施例

第ＶＩＩａ因子の脱シアリル化。
無血清培地中で発現させた第ＶＩＩａ因子、血清含有培地中で産生させた第ＶＩＩａ因子、ならびに３つの第ＶＩＩａ因子の突然変異体Ｎ１４５Ｑ、Ｎ３２２Ｑ、および類似体ＤＶＱ（V158D/E296V/M298Q）。

酵素的脱シアリル化の準備のため、第ＶＩＩａ因子を、ＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣ１_２、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６中に、終夜、４℃で、１０ｋＤの分子量カットオフを有するＳｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ中で透析した。第ＶＩＩａ因子（１ｍｇ／ｍＬ）の脱シアリル化は、１０Ｕ／Ｌのアルスロバクター・ウレアファシレンス（Calbiochem）由来の可溶性シアリダーゼを用いて、３２℃で１８時間、交換した緩衝液中で行った。

第ＶＩＩａ因子のシアリル−ＰＥＧ化。
アシアロ−第ＶＩＩａ因子（１ｍｇ／ｍＬ）のシアリル−ＰＥＧ化（「グリコＰＥＧ化」）を、１００Ｕ／ＬのＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩならびに２００μＭのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（４０ｋＤ、２０ｋＤ、１０ｋＤ、５ｋＤ、および２ｋＤ）を用いて、３２℃、脱シアリル化緩衝液中で２〜６時間行った。適切な反応時間が終了した後、さらなるグリコＰＥＧ化を最小限にするためにＰＥＧ化された試料を直ちに精製した。

グリコＰＥＧ化された第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子を、シアル酸でキャップした試料でキャッピングするために、以下に示すように、陰イオン交換クロマトグラフィーによって、シアリダーゼを最初にアシアロ−第ＶＩＩａ因子から除去した。過剰のＣＭＰ−シアル酸（５ｍＭ）を加え、３２℃で２時間インキュベーションして、グリコＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子をシアル酸でキャッピングした。第ＶＩＩａ因子のシアリル−ＰＥＧ化された形態を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに記載されているように、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシンゲルおよび/またはＮｕＰＡＧＥゲル）ならびにＣｏｌｌｏｉｄａｌＢｌｕｅ染色キットによって分析した。

ＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子の精製。
第ＶＩＩａ因子のグリコＰＥＧ化された試料を、変性陰イオン交換方法で精製した。試料は５℃で取り扱った。カラムにロードする直前に、１０ｍＬの第ＶＩＩａ因子の溶液あたり１ｇのＣｈｅｌｅｘ１００（BioRad）を、再構築した試料に加えた。１０分間撹拌した後、懸濁液を、真空系を用いて酢酸セルロース膜（０．２μｍ）上で濾過した。フィルター上の保持されたキレート剤樹脂を、１０ｍＬのバルクあたり１〜２ｍＬの水で１回洗浄した。濾液の伝導率を５℃で１０ｍＳ／ｃｍに調節し、必要な場合はｐＨ８．６に調節した。

陰イオン交換を８〜１０℃で行った。ロードする前に、ＱセファロースＦＦを含むカラムを、１ＭのＮａＯＨ（１０倍カラム体積）、水（５倍カラム体積）、２ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＯＡｃ、ｐＨ３（１０倍カラム体積）で洗浄し、１７５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグリシルグリシン、ｐＨ８．６（１０倍カラム体積）で平衡化することによって調製した。それぞれのＰＥＧ化反応について、１５〜２０ｍｇの第ＶＩＩａ因子を、１０ｍＬのＱセファロースＦＦ（１ｍＬの樹脂あたり２ｍｇ以下のタンパク質）を用いて、１００ｃｍ／時の流速で、ＸＫ１６カラム（Amersham Biosciences）にロードした。２ｋＤの直鎖状ＰＥＧでは、２０ｍｇの第ＶＩＩａ因子を、４０ｍＬのＱセファロースＦＦ（１ｍｇの樹脂あたり０．５ｍｇのタンパク質）を用いて、１００ｃｍ／時の流速で、ＸＫ２６カラム（Amersham Biosciences）にロードした。

ロードした後、カラムを、１７５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグリシルグリシン、ｐＨ８．６１０倍カラム体積）および５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグリシルグリシン、ｐＨ８．６（２倍カラム体積）で洗浄した。溶出は、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグリシルグリシン、１５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ８．６（５倍カラム体積）を使用することによって、１５ｍＭのＣａＣｌ_２のステップ勾配を用いて行った。その後、カラムを１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグリシルグリシン、ｐＨ８．６（５倍カラム体積）で洗浄した。溶出液を２８０ｎｍでの吸光度によって監視した。流動中におよび２回の洗浄中に画分（５ｍＬ）を採取し、ＣａＣｌ_２および１Ｍの塩の溶出中に２．５ｍＬの画分を採取した。第ＶＩＩａ因子を含む画分を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシンゲルおよび/またはNUPAGEゲル）ならびにＣｏｌｌｏｉｄａｌＢｌｕｅ染色キットによって分析した。第ＶＩＩａ因子を有する適切な画分をプールし、４ＭのＨＣｌを用いてｐＨを７．２に調節した。

以下の変更以外は、第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤを上述のように精製した。ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）をＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子の溶液に加え、ｐＨをｐＨ６に調節し、伝導率を５℃で５ｍＳ／ｃｍに調節した。約２０ｍｇの第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤを、１０ｍＬのＰｏｒｏｓ５０ミクロンＨＱ樹脂（１ｍＬの樹脂あたり２ｍｇ以下のタンパク質）を用いて、１００ｃｍ／時の流速で、ＸＫ１６カラム（Amersham Biosciences）にロードした。ロードした後、カラムを、１７５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６（１０倍カラム体積）および５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６（２倍カラム体積）で洗浄した。溶出は、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６（５倍カラム体積）中の２０ｍＭのＣａＣｌ_２のステップ勾配を用いて行った。その後、カラムを１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６（５倍カラム体積）で洗浄した。

第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤを含む陰イオン交換溶出液（２５ｍＬ）を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５１０Ｋ遠心分離フィルター装置を用いることによって、製造者の指示（Millipore）に従って、５〜７ｍＬまで濃縮した。濃縮後、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。試料（５〜７ｍＬ）を、ほとんどのＰＥＧ化された変異体について、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグリシルグリシン、１５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．２に平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（HiLoad 16/60、調製グレード;Amersham Biosciences）を含むカラムにロードした。１ｍＬ／分の流速で第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤを未修飾のアシアロ−第ＶＩＩａ因子から分離し、吸光度を２８０ｎｍで監視した。第ＶＩＩａ因子を含む画分（１ｍＬ）を採取し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシンゲルおよび/またはＮｕＰＡＧＥゲル）ならびにＣｏｌｌｏｉｄａｌＢｌｕｅ染色キットによって分析した。標的のＰＥＧ化されたアイソフォームを含み、未修飾のアシアロ−第ＶＩＩａ因子を欠く画分をプールし、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５１０Ｋ遠心分離フィルター装置を用いて１ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度の読取値から、１．３７（ｍｇ／ｍＬ）^−１ｃｍ^−１の消光係数を用いて決定した。

逆相ＨＰＬＣ分析によるＰＥＧ化されたアイソフォームの決定。
ＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子を、逆相カラム（Zorbax 300SB-C3、５μｍの粒子径、２．１×１５０ｍｍ）上のＨＰＬＣで分析した。溶出液は、Ａ）水中の０．１のＴＦＡおよびＢ）アセトニトリル中の０．０９％のＴＦＡであった。検出は２１４ｎｍであった。勾配、流速、およびカラム温度は、ＰＥＧの長さに依存した（４０ｋＤ、２０ｋＤ、および１０ｋＤのＰＥＧ：３５〜６５％のＢ、３０分、０．５ｍＬ／分、４５℃；１０ｋＤのＰＥＧ：３５〜６０％のＢ、３０分、０．５ｍＬ／分、４５℃；５ｋＤ：４０〜５０％のＢ、４０分、０．５ｍＬ／分、４５℃；２ｋＤ：３８〜４３％のＢ、６７分、０．６ｍＬ／分、５５℃）。それぞれのピークのアイデンティティーは、４つの異なる証拠、すなわち、ネイティブ第ＶＩＩａ因子の既知の保持時間、単離したピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ遊走、単離したピークのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル、および結合しているＰＥＧ数の増加に伴うそれぞれのピークの保持時間の規則的な進行のうちの、２つ以上に基づいて割り当てた。

逆相ＨＰＬＣによるＰＥＧ結合部位の決定。
試料（１ｍｇ／ｍＬの濃度で１０μＬ）を還元緩衝液（４０μＬ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのグリシルグリシン、１５ｍＭのＥＤＴＡ、８Ｍの尿素、２０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．６）と、１５分間、室温で混合することによって、第ＶＩＩａ因子およびＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子の変異体を還元した。水（５０μＬ）を加え、ＨＰＬＣに注入するまで（１２時間未満）試料を４℃まで冷却した。ＨＰＬＣカラム、溶出液、および検出は、非還元試料について上述したとおりである。流速は０．５ｍＬ／分であり、勾配は３０〜５５％のＢ、９０分間であり、次いで、９０％のＢまでの手短な洗浄サイクルであった。それぞれのピークのアイデンティティーは、実施例４に記載のように割り当てた。

第ＶＩＩａ因子の凝固アッセイ。
ＰＥＧ化された試料および標準物質を２つ組で試験し、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡ（重量/体積）、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４で希釈した。標準物質および試料は、０．１〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたってアッセイした。等体積の希釈した標準物質および試料を、第ＶＩＩａ因子欠乏血漿（Diagnostica Stago）と混合し、アッセイするまで、氷上で４時間以内までだけ保存した。

凝固時間をＳＴａｒｔ４凝固計（Diagnostica Stago）で測定した。凝固計により、試料キュベット内の磁気球の穏やかな前後の動きの停止によって示されるように、ｉｎｖｉｔｒｏ凝固が形成されるまでに経過した時間が測定された。

それぞれのキュベット内に１個の磁気球を入れ、さらに１００μＬの第ＶＩＩａ因子の試料／欠乏血漿および１００μＬの希釈したラット脳セファリン溶液（氷上で４時間以下までだけ保存）を入れた。それぞれの試薬を、それぞれのウェル間で５秒間の間隔で加え、最終混合物を３００秒間、３７℃でインキュベーションした。希釈したラット脳セファリン（ＲＢＣ）溶液を、２ｍＬのＲＢＣストック溶液（１本のバイアルのＲＢＣストック、Haemachem、さらに１０ｍＬの１５０ｍＭのＮａＣｌ）ならびに４ｍＬの１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡ（重量/体積）、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４から作製した。

３００秒で、１００μＬの予熱した（３７℃）１００ｍＭのＮａＣｌ、１２．５ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡ（重量/体積）、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４中の可溶性組織因子（２μｇ／ｍＬ；アミノ酸１〜２０９）の溶液を加えることによって、アッセイを開始した。ここでも、この次の溶液は、試料の間で５秒間の間隔をあけて加えた。

希釈した標準物質からの凝固時間を用いて検量線を作成した（凝固時間のｌｏｇ対第ＶＩＩａ因子の濃度のｌｏｇ）。曲線から生じる直線回帰を用いて、ＰＥＧ化された変異体の相対凝固活性を決定した。ＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子の変異体を、アリコート分割した第ＶＩＩａ因子のストックと比較した。

ＢＨＫ細胞中で産生された組換え第ＶＩＩａ因子のグリコＰＥＧ化
本実施例では、ＢＨＫ細胞中で作製された組換え第ＶＩＩａ因子のＰＥＧ化を記載する。

アシアロ−第ＶＩＩａ因子の調製。組換え第ＶＩＩａ因子をＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎細胞）中で産生させた。第ＶＩＩａ因子（１４．２ｍｇ）を１ｍｇ／ｍＬで緩衝溶液（ｐＨ７．４、０．０５Ｍのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００１ＭのＣａＣｌ_２、０．０５％のＮａＮ_３）に溶かし、３００ｍＵ／ｍＬのシアリダーゼ（コレラ菌）−アガロースコンジュゲートと共に、３日間、３２℃でインキュベーションした。反応を監視するために、反応の小アリコートを適切な緩衝液で希釈し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの手順に従ってＩＥＦゲルを行った（図１５７）。混合物を３，５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を採取した。樹脂を上記緩衝溶液（ｐＨ７．４、０．０５Ｍのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮａＮ_３）で３回洗浄し（３×２ｍＬ）、合わせた洗浄液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ−２０で濃縮した。残りの溶液の緩衝液を０．０５Ｍのトリス（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮａＮ_３で交換して、最終体積を１４．４ｍＬとした。

第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−１ｋＤおよび第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤの調製。第ＶＩＩａ因子の溶液の脱シアリル化を２つの等量の７．２ｍＬの試料に分割した。それぞれの試料に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ｋＤ（７．４ｍｇ）またはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ（７．４ｍｇ）のどちらかを加えた。ＳＴ３Ｇａｌ３（１．５８Ｕ）を両方のチューブに加え、反応混合物を３２℃で９６時間インキュベーションした。反応を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって記載されている試薬および条件を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって監視した。反応が完了した後、ＴｏｓｏＨａａｓＴＳＫ−Ｇｅｌ−３０００調製用カラムを使用して、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いて、採取画分をＵＶ吸収に基づいて、反応混合物を精製した。生成物を含む合わせた画分を、４℃で、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｐｌｕｓ−２０遠心分離フィルター(Millipore、マサチューセッツ州Bedford）中で濃縮し、濃縮した溶液を再配合して、１．９７ｍｇ（ビシンコニン酸タンパク質アッセイ、BCAアッセイ、Sigma-Aldrich、モンタナ州St. Louis）の第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧが得られた。反応の生成物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給される手順および試薬に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析を用いて分析した。試料を水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。

第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ：ワンポット方法
第ＶＩＩａ因子（５ｍｇを生成物調製緩衝液で最終濃度１ｍｇ／ｍＬまで希釈）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤ（１０ｍＭ、６０μＬ）ならびにクロカビ酵素ＳＴ３Ｇａｌ３（３３Ｕ／Ｌ）および１０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＣａＣｌ_２を、１０Ｕ／Ｌ、１Ｕ／Ｌ、０．５Ｕ／Ｌまたは０．１Ｕ／Ｌのシアリダーゼ（CalBiochem）と共に反応器内で合わせた。成分を混合し、３２℃でインキュベーションした。アリコートを３０分間隔で最初の４時間分析することによって、反応の進行を測定した。その後、アリコートを２０時間時点で取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＰＥＧ化の程度は、１ｍＬを１．５、２．５および３．５時間時点で取り出し、試料をＰｏｒｏｓ５０ＨＱカラムで精製することによって決定した。

１０Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含む反応条件では、認識できる量の第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ生成物は形成されなかった。１Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含む反応条件では、反応混合物中の第ＶＩＩａ因子の約１７．６％は、１．５時間後にモノまたはジＰＥＧ化されていた。これは、２．５時間後には２９％まで増加し、３．５時間には４０．３％まで増加した。０．５Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含む反応条件では、反応混合物中の第ＶＩＩａ因子の約４４．５％が３時間後にモノまたはジＰＥＧ化されており、０．８％がトリＰＥＧ化またはそれ以上にＰＥＧ化されていた。２０時間後、６９．４％がモノまたはジＰＥＧ化されており、１８．３％がトリＰＥＧ化またはそれ以上にＰＥＧ化されていた。

０．１Ｕ／Ｌのシアリダーゼを含む反応条件では、反応混合物中の第ＶＩＩａ因子の約２９．６％が３時間後にモノまたはジＰＥＧ化されていた。２０時間後、７１．３％がモノまたはジＰＥＧ化されており、１５．１％がトリＰＥＧ化またはそれ以上にＰＥＧ化されていた。

システイン−ＰＥＧ２（２）の調製
ａ．化合物１の合成
水酸化カリウム（８４．２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、粉末として）を、無水メタノール（２０Ｌ）中のＬ−システイン（９３．７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン下で加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、その後、分子質量２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−トシレート（Ｔｓ；１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をいくつかの部分に分けて、２時間かけて加えた。混合物を室温で５日間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を水（３０ｍＬ）で希釈し、室温で２時間撹拌して、任意の過剰の２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−トシレートをすべて破壊した。その後、溶液を酢酸で中和し、ｐＨをｐＨ５．０に調節し、逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラムにロードした。カラムをメタノール／水の勾配で溶出させ（生成物は約７０％のメタノールで溶出する）、生成物の溶出は蒸発光散乱によって監視し、適切な画分を採取し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液のクロマトグラフィーを行い（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、大きなビーズ、３００ｍＬ、水酸化物の形態；水から水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）、適切な画分のｐＨを酢酸で６．０まで下げた。その後、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）で捕捉し、上述のメタノール／水の勾配で溶出させた。生成物の画分をプールし、濃縮し、水に再度溶かし、凍結乾燥して、４５３ｍｇ（４４％）の白色固体（１）が得られた。

化合物の構造データは、以下のとおりであった：^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ _２−Ｓ）、３．０５（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．１８（ｑ，１Ｈ，（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ _３Ｏ）、３．７（ｔ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ）、３．９５（ｑ，１Ｈ，ＣＨＮ）。生成物の純度は、ＳＤＳＰＡＧＥによって確認した。

ｂ．システイン−ＰＥＧ２（２）の合成
トリエチルアミン（約０．５ｍＬ）を、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）中の化合物１（４４０ｍｇ、２２μｍｏｌ）の溶液に、溶液が塩基性になるまで滴下した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）中の２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（６６０ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ、３０．８μｍｏｌ）の溶液をいくつかの部分に分けて、１時間かけて室温で加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、残渣を水（１００ｍＬ）に溶かし、１．０ＮのＮａＯＨでｐＨを９．５に調節した。塩基性の溶液を室温で２時間撹拌し、その後、酢酸でｐＨ７．０まで中和した。その後、溶液を逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラムにロードした。カラムをメタノール／水の勾配で溶出させ（生成物は約７０％のメタノールで溶出する）、生成物の溶出は蒸発光散乱によって監視し、適切な画分を採取し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液のクロマトグラフィーを行い（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、大きなビーズ、３００ｍＬ、水酸化物の形態；水から水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）、適切な画分のｐＨを酢酸で６．０まで下げた。その後、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）で捕捉し、上述のメタノール／水の勾配で溶出させた。生成物の画分をプールし、濃縮し、水に再度溶かし、凍結乾燥して、５７５ｍｇ（７０％）の白色固体（２）が得られた。

化合物の構造データは、以下のとおりであった：^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ _２−Ｓ）、２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ _２−Ｓ）、３．１２（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３９（ｓ，３ＨＣＨ _３Ｏ）、３．７１（ｔ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ）。生成物の純度は、ＳＤＳＰＡＧＥによって確認した。

第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤ
第ＶＩＩａ因子のグリコＰＥＧ化（キャッピングを用いたワンポット）。第ＶＩＩａ因子のグリコＰＥＧ化をワンポット反応で達成し、ここでは、脱シアリル化およびＰＥＧ化が同時に起こり、次いでシアル酸でのキャッピングが起こる。反応は、再循環水浴によって３２℃に調節したジャケット付きガラス容器内で行った。最初に、濃縮した０．２μｍで濾過した第ＶＩＩａ因子を容器内に導入し、撹拌子と共に２０分間撹拌することによって３２℃まで加熱した。１０ｍＭのヒスチジン／５０ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．０中に４，０００Ｕ／Ｌの濃度の乾燥粉末からシアリダーゼの溶液を作製した。第ＶＩＩａ因子が３２℃に達した後、シアリダーゼを第ＶＩＩａ因子に加え、均一な溶液を確実にするために反応を約５分間撹拌し、その後、撹拌を停止した。脱シアリル化を１．０時間３２℃で進行させた。脱シアリル化反応中、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤを１０ｍＭのヒスチジン／５０ｍＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ６．０の緩衝液に溶かし、濃度は２７１ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤが溶けた後、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤおよびＳＴ３Ｇａｌ３を反応に加え、均一な溶液を確実にするために反応を約１５分間、撹拌子と共に混合した。さらなる８５ｍＬの体積の緩衝液を加えて、反応を１．０Ｌにした。反応を撹拌子なしで２４時間進行させた後、ＣＭＰ−ＳＡを４．３ｍＭの濃度まで加えて、反応を停止させて残りの末端ガラクトース残基をシアル酸でキャッピングした。３０分間、３２℃で混合しながら反応停止を進行させた。反応の合計体積は、反応停止前に１．０Ｌであった。時点の試料（１ｍＬ）を０、４．５、７．５、および２４時間で採取し、ＣＭＰ−ＳＡで反応停止させ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

第ＶＩＩａ因子−ＳＡ−ＰＥＧ−４０ｋＤの精製。キャッピング後、溶液を、終夜４℃で保存した２．０Ｌの１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０で希釈し、試料を０．２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ６０フィルターを通して濾過した。生じたロード体積は３．１Ｌであった。ＡｋｔａＰｉｌｏｔシステムでＡＥＸ２クロマトグラフィーを２０〜２５℃（周囲室温）で行った。ロードした後、平衡化緩衝液を用いた１０倍カラム体積の洗浄を行い、ＭｇＣｌ_２の１０倍カラム体積の勾配を用いて生成物をカラムから溶出させることにより、ＰＥＧ化された第ＶＩＩａ因子種がＰＥＧ化されていない第ＶＩＩａ因子から分離された。このカラムのロードは意図的に低く保ち、第ＶＩＩａ因子２ｍｇ未満／樹脂１ｍＬを標的とした。バルク生成物のプールを作製するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、さらに選択した画分および画分のプールのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。１ＭのＮａＯＨを用いてプールした画分のｐＨを６．０に調節し、２〜８℃で終夜、低温室で保存した。

最終濃度／ダイアフィルトレーション、無菌濾過およびアリコート分割。プールした画分を、Ｍｉｌｌｉｐａｋ２０の０．２μｍフィルターを通して濾過し、終夜２〜８℃で保存した。濃縮／ダイアフィルトレーションを行うために、蠕動ポンプおよびケイ素チューブを装着したシステムでＭｉｌｌｉｐｏｒｅの０．１ｍ^２の３０ｋＤの再生セルロース膜を用いた。システムをアセンブルし、水をフラッシュし、その後、０．１ＭのＮａＯＨで少なくとも１時間清浄にし、その後、使用直前に１０ｍＭのヒスチジン／５ｍＭのＣａＣｌ_２／１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０のダイアフィルトレーション緩衝液で平衡化するまで、０．１ＭのＮａＯＨ中で保存した。生成物を約４００ｍＬまで濃縮し、その後、約５のダイアフィルトレーション体積（diavolume）の緩衝液を用いて、一定体積でダイアフィルトレーションを行った。その後、生成物を約３００ｍＬまで濃縮し、５分間の低圧再循環の後に回収し、膜を２００ｍＬのダイアフィルトレーション緩衝液で５分間再循環させることによってすすいだ。洗浄液を生成物と共に回収し、最終洗浄のためにさらに５０ｍＬの緩衝液をさらに５分間再循環させた。生じたバルクは約５１０ｍＬであり、これを、０．２μｍのＰＥＳ膜（Millipore）を装着した１Ｌの真空フィルターを通して濾過した。その後、無菌濾過したバルクを２５ｍＬのアリコートで５０ｍＬの滅菌ｆａｌｃｏｎチューブ中にアリコート分割し、−８０℃で凍結した。

２４時間後、バルク生成物のＰＥＧ状態の分布は以下のとおりであった０．７％ｐｅｇ化されていない、８５．３％モノ−ｐｅｇ化された、１１．５％ジ−ｐｅｇ化された、および０．３％トリ−ｐｅｇ化された。カラムクロマトグラフィーが生成物の分布を生じるプロセスの主なステップであり、これは主に、ＰＥＧ化されていない物質をモノ−およびジ−ＰＥＧ化された種から取り除くことによる。

本明細書中に記載の実施例および実施形態は例示目的のみであり、それに鑑みた様々な修正または変更が当業者に提案されており、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものであることを、理解されたい。本明細書中で言及したすべての出版物、特許、および特許出願は、すべての目的で、その全体で本明細書中に参照により組み込れられる。

Claims

ａ）以下から選択されるメンバーである部分と共有結合したペプチドを含むペプチドコンジュゲート

［式中、Ｒ^２は、Ｈ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７およびＯＲ^７から選択されるメンバーであり、
Ｒ^７は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり；
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８およびＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーであり；
Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、シアル酸およびポリシアル酸から独立して選択され；
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６のうちの少なくとも１つは、以下から選択されるメンバーである部分を含み：

ここで、指数ｍおよびｎは、１〜１０００から独立して選択される整数である］。
前記部分が、以下から選択されるメンバーである、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
ペプチドコンジュゲート中の前記ペプチドが、骨形態発生タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形態発生タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形態発生タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、完全長第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子を有するｖＷＦ−第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、α_１−抗トリプシン（ＡＴＴ、すなわちα−１プロテアーゼ阻害剤）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト成長ホルモン、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧＦｃ領域融合タンパク質（Enbrel（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（Herceptin（商標））、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（Synagis（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（Remicade（商標））、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体（Reopro（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（Rituxan（商標））、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、α−ガラクトシダーゼ（Fabrazyme（商標））、α−イズロニダーゼ（Aldurazyme（商標））、卵胞刺激ホルモン、β−グルコシダーゼ、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡおよび線維芽細胞成長因子から選択されるメンバーである、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。
前記指数ｍおよびｎは、４２０〜４８０から独立して選択される整数である、請求項１に記載のペプチドコンジュゲート。