KR20090079222A - 글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드 - Google Patents

글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20090079222A
KR20090079222A KR1020097008970A KR20097008970A KR20090079222A KR 20090079222 A KR20090079222 A KR 20090079222A KR 1020097008970 A KR1020097008970 A KR 1020097008970A KR 20097008970 A KR20097008970 A KR 20097008970A KR 20090079222 A KR20090079222 A KR 20090079222A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
exemplary embodiment
moiety
substituted
glycosyl
Prior art date
Application number
KR1020097008970A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101556248B1 (ko
Inventor
숀 데프리스
샤오 쩡
Original Assignee
노보 노르디스크 에이/에스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노보 노르디스크 에이/에스 filed Critical 노보 노르디스크 에이/에스
Publication of KR20090079222A publication Critical patent/KR20090079222A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101556248B1 publication Critical patent/KR101556248B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Abstract

본 발명은 글리세롤 링커를 통해 펩티드와 PEG 모이어티 사이에 콘쥬게이트를 제공한다.
펩티드 콘쥬게이트, 글리코실화, PEG

Description

글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드{GLYCEROL LINKED PEGYLATED SUGARS AND GLYCOPEPTIDES}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위해 전체가 참고로써 본원에 포함되는 2006년 10월 4일 출원된 미국의 가특허 출원 번호 60/828,208에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 개요
대표적인 구체예에서, 본 발명의 "글리코페길화된" 분자는 글리코실화된 또는 비글리코실화된 펩티드와 효소적으로 전달할 수 있는 사카릴 모이어티 사이에서 콘쥬게이트의 효소 매개된 형성으로 생성되는데, 그것의 구조 내에 변형기, 예로써, 폴리머 변형기, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 대표적인 구체예에서, 펩티드는 뼈 형성 단백질(예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), 뉴로트로핀(예를 들어, NT-3, NT-4, NT-5), 성장 분화 인자(예를 들어, GDF-5), 신경아교세포계-유래 신경영양 인자(GDNF), 뇌유인성 신경영양인자(BDNF), 신경성장인자(NGF), 폰 빌리브란트 인자(vWF) 프로테아제, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, B-도메인 결실 인자 VIII, 전장 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, B-도메인 결실 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, 에리스로포이에틴(EPO), 과립구 대식세포 집락 자극인자(G-CSF), 과립백혈구생성자극인자(GM-CSF) 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, α1-항트립신(ATT, 또는 α-1 프로테아제 억제제), 글루코세레브로시데이즈, 조직형 플라스미노겐 활성제(TPA), 인터류킨-2 (IL-2), 유로키나제, 인간 DNase, 인슐린, B형간염표면단백질 (HbsAg), 인간 성장 호르몬, TNF 수용체-IgG Fc 영역 융합 단백질(EnbrelTM), 항-HER2 단일클론항체 (Herceptin™), 호흡기세포융합바이러스의 단백질 F에 대한 단일클론항체 (Synagis™), TNF-α에 대한 단일클론항체 (Remicade™), 글리코단백질 IIb/IIIa에 대한 단일클론항체 (Reopro™), CD20에 대한 단일클론항체 (Rituxan™), 항-트롬빈 III (AT III), 인체 융모 성선호르몬(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazyme™), 알파-이두로니다아제(Aldurazyme™), 여포자극호르몬, 베타-글루코시다아제, 항-TNF-알파 단일클론항체(MLB 5075), 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2), 베타-글루코시다아제, 알파-갈락토시다아제 A 및 섬유아세포성장인자로부터 선택되는 멤버이다. 폴리머 변형기는 사카릴 모이어티(즉, 두 개의 반응기의 반응에 의해 형성된 단일기를 통해) 또는 링커 모이어티, 예를 들어, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 등에 부착된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 당업계에 인식된 치료 펩티드에 유사한 생체내 활성 또는 다른 유사체를 가지는 PEG 모이어티, 예를 들어, PEG와 펩티드 사이의 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 콘쥬게이트에서, PEG 모이어티는 무손상 글리코실 연결기를 통해 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 무손상 글리코실 연결기는 PEG로 유도되는 시알산 모이어티를 포함한다.
폴리머 변형기는 펩티드 상의 글리코실 모이어티의 어떤 부분에 부착될 수 있다. 게다가, 폴리머 변형기는 야생형 또는 돌연변이 펩티드의 아미노산 서열 내 어떤 위치에서 글리코실 잔기에 결합될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 본 발명은 폴리머 변형기에 글리코실 연결기를 통해 콘쥬게이트된 펩티드를 제공한다. 대표적인 펩티드 콘쥬게이트는 하기로부터 선택되는 화학식을 가지는 글리코실 연결기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00001
Figure 112009026250918-PCT00002
및
Figure 112009026250918-PCT00003
Figure 112009026250918-PCT00004
화학식 I, Ia, II 또는 IIa에서, R2는 H, CH2OR7, COOR7, COO- 또는 OR7이고, R7은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬을 나타낸다. 기호 R3, R4, R5, R6 및 R6는 독립적으로 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, OR8, NHC(O)R9 및 사카릴 모이어티를 포함한다. 표시 d는 0 또는 1이다. R8 및 R9는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 시알산으로부터 독립적으로 선택된다. R3, R4, R5, R6 또는 R6 중 적어도 한 개는 폴리머 변형기, 예를 들어, PEG이다. 대표적인 구체예에서, R6 및 R6'는 탄소와 함께 시알릴 모이어티의 측쇄의 성분에 부착된다. 추가 대표적인 구체예에서, 이 측쇄는 폴리머 변형기로 기능화된다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 일반적으로 하기에 나타내는 링커 L을 통해 글리코실 코어(예를 들어, N, O) 상의 헤테로원자를 통해 글리코실 연결기에 결합된다:
Figure 112009026250918-PCT00005
R1은 폴리머 변형기이고, L은 결합 및 연결기로부터 선택된다. 표시 w는 1-6, 바람직하게는 1-3, 더 바람직하게는 1-2로부터 선택되는 정수를 나타낸다. 대표적인 연결기는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 모이어티 및 시알산을 포함한다. 대표적인 링커의 성분은 아실 모이어티이다. 다른 대표적인 연결기는 아미노산 잔기(예를 들어, 시스테인, 세린, 리신 및 짧은 올리고펩티드, 예를 들어, Lys-Lys, Lys-Lys-Lys, Cys-Lys, Ser-Lys 등)이다.
L이 결합일 때, R1의 전구체에서 반응 작용기와 글리코실 연결기의 전구체 상의 상보적 반응성의 반응 작용기의 반응에 의해 형성된다. L이 비 0차의 연결기일 때, L은 R1 전구체와의 반응 전에 글리코실 모이어티에 위치될 수 있다. 또 다르게는, R1 및 L의 전구체는 이후에 글리코실 모이어티에 부착되는 미리형성된 카세트에 포함될 수 있다. 본원에서 앞서 설명한 바와 같이, 전구체와 적절한 반응성 작용기의 선택 및 제조는 당업자의 능력 내이다. 게다가, 전구체의 커플링은 당업계에서 이해되는 화학으로 계속된다.
대표적인 구체예에서, L은 폴리머 변형 모이어티가 치환된 알킬 링커를 통해 부착되는 변형된 당을 제공하는 아미노산 또는 소 펩티드(예를 들어, 1-4개의 아미노산 잔기)로부터 형성되는 연결기이다. 대표적인 링커는 글리신, 리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 본원에 정의된 아미노산 유사체는 또한 링커 성분으로서 사용을 포함한다. 아미노산은 아실 연결, 예를 들어, 아미노산 잔기의 아민 모이어티 를 통해 형성된 아미드 또는 우레탄을 통해 공유적으로 부착된 링커의 추가 성분, 예를 들어, 알킬, 헤테로알킬로 변형될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 화학식 I 또는 Ia에 따르는 구조를 가지고, R5는 폴리머 변형기를 포함한다. 다른 대표적인 구체예에서, R5는 폴리머 변형기와, 글리코실 코어에 폴리머 변형기를 결합하는 링커, L 둘 다를 포함한다. L은 선형 또는 분지형 구조일 수 있다. 유사하게, 폴리머 변형기는 분지 또는 선형일 수 있다.
폴리머 변형기는 수용성 또는 물에서 본질적으로 불용성일 수 있는 2 이상의 반복 유닛을 포함한다. 본 발명의 화합물에서 사용되는 대표적인 수용성 폴리머는 PEG, 예를 들어, m-PEG, PPG, 예를 들어, m-PPG, 폴리시알산, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 폴리리신, 폴리에틸렌이민, 생분해성 폴리머(예를 들어, 폴리락티드, 폴리글리세라이드), 및 기능화된 PEG, 예를 들어, 말단 기능화된 PEG를 포함한다.
펩티드 콘쥬게이트에서 사용되는 글리코실 연결기의 글리코실 코어는 천연과 비천연 푸라노오스 및 피라노오스로부터 선택된다. 비천연 사카라이드는 환에서 선택적으로 알킬 또는 아실화된 히드록실 및/또는 아민 모이어티, 예를 들어, 에테르, 에스테르 및 아미드 치환기를 포함한다. 다른 비천연 사카라이드는 환의 위치에서 H, 히드록실, 에테르, 에스테르 또는 아미드 치환기를 포함하며, 이러한 치환기는 천연 사카라이드에 존재하지 않는다. 또 다르게는, 탄수화물은 그것의 명칭 이, 예를 들어, 데옥시당으로부터 유도된 탄수화물에서 발견되는 치환기가 없다. 또한 추가의 대표적인 비천연 당은 산화(예를 들어, -온산 및 -우론산) 그리고 환원된(당 알코올) 탄수화물을 둘 다 포함한다. 당 모이어티는 모노-, 올리고- 또는 폴리-사카라이드일 수 있다.
본 발명에서 글리코실 연결기의 성분으로서 사용되는 대표적인 천연 당은 글루코오스, 글루코사민, 갈락토오스, 갈락토사민, 푸코오스, 만노오스, 만노사민, 자일라노오스, 리보오스, N-아세틸 글루코오스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토오스, N-아세틸 갈락토사민 및 시알산을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기 모이어티를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00006
상기식에서 D는 -OH 및 R1-L-HN-으로부터 선택되는 멤버이고; G는 H 및 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되는 멤버이고; R1은 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜)잔기를 포함하는 모이어티이고; L은 링커, 예를 들어, 결합("0 차"), 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬이다. 대표적인 구체예에서, D가 OH일 때, G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬일 때, D는 R1-L-NH-이 다.
다른 양태에서, 본 발명은 글리코실 연결기를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공하며, 글리코실 연결기는 상기 펩티드의 아미노산 잔기에 부착되고, 상기 글리코실 연결기는 하기로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가지는 시알릴 연결기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00007
및
Figure 112009026250918-PCT00008
상기식에서
Figure 112009026250918-PCT00009
는 변형기이다. R2는 H, CH2OR7, COOR7, COO- 및 OR7로부터 선택되는 멤버이다. R7은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 멤버이다. R3 및 R4는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, OR8, 및 NHC(O)R9로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. R8 및 R9는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 및 시알릴로부터 독립적으로 선택된다. La는 결합, 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 링커이다. X5, R16 및 R17은 비-반응성 기 및 폴리머 모이어티(예를 들어, 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어, PEG)로부터 독립적으로 선택된다. 비-반응성기는 생리적 pH, 예를 들어, H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 등에서 본질적으로 비반응성, 중성 및/또는 안정한 것으로 생각되는 기들을 포함한다. 대표적인 폴리머 모이어티는 화학식 IIIa 및 그것의 하기 원형에서 설명되는 분지형 구조를 포함한다. 당업자는 이들 화학식에서 PEG 모이어티가 다른 폴리머로 치환될 수 있음을 인식할 것이다. 대표적인 폴리머는 폴리(알킬렌 옥시드) 패밀리의 것들을 포함한다. X2 및 X4는 C에 폴리머 모이어티 R16 및 R17을 결합시키는 독립적으로 선택된 연결 부분이다. 표시 j는 1 내지 15로부터 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00010
여기서, 표시 m 및 n은 0 내지 5000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 및 A11은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, -NA12A13, -OA12 및 -SiA12A13으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. A12 및 A13은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 및 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함하는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00011
및
Figure 112009026250918-PCT00012
.
상기 화학식에 따르는 다른 대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00013
대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 5000, 바람직하게는 약 100 내지 약 4000, 더 바람직하게는 약 200 내지 약 3000, 훨씬 더 바람직하게는 약 300 내지 약 2000 및 더욱더 바람직하게는 약 400 내지 약 1000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 70, 약 70 내지 약 150, 약 150 내지 약 250, 약 250 내지 약 375 및 약 375 내지 약 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 10 내지 약 35, 약 45 내지 약 65, 약 95 내지 약 130, 약 210 내지 약 240, 약 310 내지 약 370 및 약 420 내지 약 480으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 15 내지 약 30으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 50 내지 약 65로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 100 내지 약 130으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 210 내지 약 240으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 310 내지 약 370으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 430 내지 약 470으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3로부터 선택되는 멤버이다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기의 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00014
및
Figure 112009026250918-PCT00015
본 발명은 글리코실 연결기를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공하며, 글리코실 연결기는 펩티드의 아미노산 잔기에 부착되고, 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가지는 시알릴 연결기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00016
여기서,
Figure 112009026250918-PCT00017
는
변경기이다. 표시 s는 1 내지 20으로부터 선택되는 정수이다. 표시 f는 1 내지 2500으로부터 선택되는 정수이다. Q는 H 및 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되는 멤버이다.
대표적인 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식을 가지는 변형된 당을 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00018
R1은 폴리머 모이어티이고; L은 결합 및 연결기로부터 선택되고; R2는 H, CH2OR7, COOR7 및 OR7로부터 선택되는 멤버이고; R7은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 멤버이고; R3 및 R4는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, OR8 및 NHC(O)R9로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고; R8 및 R9는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 시알산 및 폴리시알산으로부터 독립적으로 선택된다. 표시 w는 1-6, 바람직하게는 1-3 및 더 바람직하게는 1-2로부터 선택되는 정수를 나타낸다. 대표적인 연결기는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 모이어티 및 시알산을 포함한다. 링커의 대표적인 성분은 아실 모이어티이다.
본 발명은 펩티드의 콘쥬게이트를 형성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 펩티드를 당에 공유적으로 부착된 변형기를 지탱하는 변형된 당 도너와 접촉하는 것을 포함한다. 변형된 당 모이어티는 효소의 작용에 의해 도너로부터 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 전달된다. 대표적인 효소는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 글리코실트랜스퍼라아제, 예를 들어, 시알릴트랜스퍼라아제를 포함한다. 본 방법은 펩티드를 변형된 당 모이어티로부터 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 전달하기에 적절한 조건하에서, a) 변형된 당 도너; 및 b) 변형된 당 모이어티를 변형된 당 도너로부터 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 전달할 수 있는 효소와 접촉하여, 이에 의해 상기 펩티드 콘쥬게이트를 합성하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 단계 a)에 앞서, 펩티드는 시알릴다아제와 접촉하여, 펩티드 상의 시알산의 적어도 일부분을 제거한다.
다른 바람직한 구체예에서, 펩티드는 시알릴다아제, 글리코실트랜스퍼라아제 및 변형된 당 도너와 접촉된다. 이 구체예에서, 다양한 성분의 부가의 명령과는 상관없이, 펩티드는 시알릴다아제, 글리코실트랜스퍼라아제 및 변형된 당 도너와 본질적으로 동시에 접촉된다. 반응은 펩티드로부터 시알산 잔기를 제거하기 위한 시알리다아제; 및 변형된 당 도너로부터 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 변형된 당 모이어티를 전달하기 위한 글리코실트랜스퍼라아제에 적당한 조건하에 수행된다.
다른 바람직한 구체예에서, 탈시알릴화 및 콘쥬게이션은 동일한 용기에서 수행되고, 탈시알릴화된 펩티드는 콘쥬게이션 단계 전에 바람직하게는 정제되지 않는다. 다른 대표적인 구체예에서, 방법은 추가로 펩티드 콘쥬게이트의 시알릴화를 포함하는 '캡핑' 단계를 포함한다. 이 단계는 앞의 정제 단계 없이 시알리다아제, 시알릴트랜스퍼라아제 및 변형된 당 도너를 함유하는 동일한 반응 용기에서 수행된다.
다른 바람직한 구체예에서, 펩티드의 탈시알릴화가 수행되고, 아시알로 펩티드는 정제된다. 정제된 아시알로 펩티드는 그 후 콘쥬게이션 반응 상태를 받는다. 다른 대표적인 구체예에서, 본 방법은 추가로 펩티드 콘쥬게이트의 시알릴화를 포함하는 '캡핑' 단계를 포함한다. 이 단계는 앞의 정제 없이 시알리디아제, 시알릴트랜스퍼라아제 및 변형된 당 도너를 함유하는 동일한 반응 용기에서 수행된다.
다른 대표적인 구체예에서, 캡핑 단계, 펩티드 콘쥬게이트의 시아릴화는 앞의 정제 없이 시알리다아제, 시아릴트랜스퍼라아제 및 변형된 당 도너를 함유하는 동일한 반응 용기에서 수행된다.
대표적인 구체예에서, 접촉은 20시간 미만, 바람직하게는 16시간 미만, 더 바람직하게는 12시간 미만, 훨씬 더 바람직하게는 8시간 미만, 및 더욱더 바람직하게는 4시간 미만의 시간 동안이다.
추가 양태에서, 본 발명은 펩티드 콘쥬게이트 반응 혼합물을 제공한다. 반응 혼합물은 a) 시알리다아제; b) 글리코실트랜스퍼라아제, 엑소글리코시다아제 및 엔도글리코시다아제로부터 선택되는 멤버인 효소; c) 변형된 당; 및 d) 펩티드를 포 함한다.
다른 대표적인 구체예에서, 시알리다아제 대 펩티드의 비율은 0.1 U/L:2 mg/mL 내지 10 U/L: 1 mg/mL, 바람직하게는 0.5 U/L:2 mg/mL, 더 바람직하게는 1.0 U/L:2 mg/mL, 훨씬 더 바람직하게는 10 U/L:2 mg/mL, 더욱더 바람직하게는 0.1 U/L: 1 mg/mL, 더 바람직하게는 0.5 U/L: 1 mg/mL, 훨씬 더 바람직하게는 1.0 U/L: 1 mg/mL, 더욱더 바람직하게는 10 U/L: 1 mg/mL로부터 선택된다.
대표적인 구체예에서, 상기 펩티드 콘쥬게이트의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%는 최대한 2개의 PEG 모이어티를 포함한다. PEG 모이어티는 원-포트 공정에서 부가될 수 있고, 또는 그것들은 아시알로가 정제된 후 부가될 수 있다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%는 최대한 1개의 PEG 모이어티를 포함한다. PEG 모이어티는 원-포트 공정에 부가될 수 있고, 또는 아시알로 펩티드가 정제된 후 부가될 수 있다.
추가 대표적인 구체예에서, 본 방법은 "캡핑" 또는 시알산을 펩티드 콘쥬게이트에 부가하는 것을 추가로 포함한다. 다른 대표적인 구체예에서, 시알리다아제가 부가된 후, 30분, 1시간, 1.5시간 또는 2시간 후 글리코실트랜스퍼라아제, 엑소글리코시다아제, 또는 엔도글리코시다아제가 부가된다.
다른 대표적인 구체예에서, 시알리다아제가 부가된 후 30분, 1시간, 1.5시간 또는 2시간 후 글리코실트랜스퍼라아제, 엑소글리코시다아제 또는 엔도글리코시다 아제가 부가된다. 본 발명의 다른 대상 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 방법은 하기를 포함한다: (a) 하기로부터 선택되는 글리코실기를 포함하는 펩티드를
Figure 112009026250918-PCT00019
및
Figure 112009026250918-PCT00020
(여기서 a는 0 내지 10의 정수이다)
전달에 적절한 조건하에서, GalNAc, Gal 및 상기 글리코실기의 Sia로부터 선택되는 멤버에 하기 화학식을 가지는 변형된 당
Figure 112009026250918-PCT00021
및 글리코실 연결기를 전달하는 적절한 트랜스퍼라아제와 접촉하는 것을 포함한다. 대표적인 변형된 당은 폴리머, 예를 들어, 직쇄 또는 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)모이어티를 가지는 링커 모이어티를 통해 변형된 CMP-시알산이다. 상기 화학식의 라디칼은 상기 본원의 동일한 화학식에서 발견되는 것들과 실질적으로 동일하다.
그러나 한 구체예에서, 상기 논의한 바와 같이 변형되기 전에 펩티드는 본질적으로 어떤 근원으로부터 획득될 수 있으며, 펩티드는 적당한 숙주에서 발현된다. 포유동물(예를 들어, BHK, CHO), 박테리아(예를 들어, E. coli) 및 곤충 세포(예를 들어, Sf-9)는 본원에서 설명한 조성물 및 방법에서 사용되는 펩티드를 제공하는 대표적인 발현 시스템이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 CMP-시알산-글리콜 PEG 40 kD의 제조를 도시한다.
도 2는 CMP-시알산-글리콜 PEG 40 kD의 제조에 대한 반응 조건을 도시한다.
도 3은 CMP-시알산-글리세롤 PEG 40 kD에 대한 정제 공정을 도시한다.
도 4는 CMP-시알산-글리세롤 PEG 40 kD에 대한 Q-세파로오스를 함유하는 정제 공정을 도시한다.
도 5는 CMP-시알산-글리세롤 PEG 40 kD의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 글리코콘쥬게이트, 예를 들어, 변형된 시알산을 가지는 글리코페길레이트를 형성하는데 사용되는 대표적인 시알릴트랜스퍼라아제를 제공하는 표이다.
도 7은 한 개 이상의 글리코실 연결기가 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트를 제공하기 위해 부착되는 펩티드의 표이다.
발명의 상세한 설명
약어
PEG, 폴리(에틸렌글리콜); PPG, 폴리(프로필렌글리콜); Ara, 아라비노실; Fru, 프룩토실; Fuc, 푸코실; Gal, 갈락토실; GalNAc, N-아세틸갈락토사미닐; Glc, 글루코실; GlcNAc, N-아세틸글루코사미닐; Man, 만노실; ManAc, 만노사미닐 아세테이트; Xyl, 자일로실; NeuAc, 시알릴 또는 N-아세틸뉴라미닐; Sia, 시알릴 또는 N-아세틸뉴라미닐; 및 그것의 유도체 및 유사체.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 업계에서 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 세포 배양의 실험 과정, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 혼성화는 공지되어 있고 당업계에서 통상적으로 사용된다. 표준 기법은 핵산 및 펩티드 합성을 위해 사용된다. 기법 및 공정은 일반적으로 당업계의 통상적인 방법 및 다양한 일반 참고문헌(일반적으로, 본원에 참고로써 포함되는 Sambrook et al . MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 따라서 수행되며, 이는 본 문헌을 통해 제공된다. 본원에 사용되는 명명법 및 분석 화학 및 하기 기술되는 유기 합성에서의 실험 공정은 공지되어 있으며 당업계에서 통상적으로 사용된다. 표준 기법 또는 그것의 변형이 화학적 합성 및 화학적 분석에 사용된다.
본원에 기술되는 모든 올리고당은 비환원성 사카라이드에 대한 명칭 또는 약어(즉, Gal)와 함께 기술된 후 글리코시딕 결합(α 또는 β), 환 결합(1 또는 2), 결합에 포함되는 환원성 사카라이드의 환 위치(2, 3, 4, 6 또는 8), 이어서 환원성 사카라이드의 명칭 또는 약어(즉, GlcNAc)가 기술된다. 각 사카라이드는 바람직하게는 피라노오스이다. 표준 당생물학 명명의 검토를 위해, Essentials of Glycobiology Varki et al . eds. CSHL Press (1999) 참조.
환원 말단에서 사카라이드가 실제로 환원성 당이든 아니든 올리고당은 환원 말단과 비 환원 말단을 가지는 것으로 생각된다. 일반적인 명명법에 따라서, 올리고당은 왼쪽 말단에서 비환원성이고 오른쪽 말단에서 환원성을 가지는 것으로 설명된다.
용어 "시알산" 또는 "시알릴"은 9개의 탄소 카르복실화된 당의 패밀리의 어떤 멤버를 말한다. 시알산 패밀리의 가장 흔한 멤버는 N-아세틸-뉴라민산 (2-케토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노눌로피라노오스-1-온산(종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA로서 약칭됨). 패밀리의 제 2 멤버는 N-글리콜릴-뉴라민산 (Neu5Gc 또는 NeuGc)이며, NeuAc의 N-아세틸기는 수산화된다. 제 3 시알산 패밀리 멤버는 2-케토-3-데옥시-노눌로손산(KDN)이다(Nadano et al . (1986) J. Biol . Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al , J. Biol . Chem . 265: 21811-21819 (1990)). 또한 9-치환된 시알산, 예로써, 9-O-C1-C6 아실-Neu5Ac 유사 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac이 포함된다. 시알산 패밀리의 검토를 위해, 예를 들어, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids : Chemistry , Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))을 참조. 시알릴화 공정에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 1992년 10월 1일 공개된 국제 출원 WO 92/16640에 개시되어 있다.
"펩티드"는 모노머가 아미노산이고 아미드 결합을 통해 함께 결합되는 폴리머를 말하며, 또 다르게는 폴리펩티드로서 언급된다. 추가로, 비천연 아미노산, 예를 들어, β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌이 또한 포함된다. 유전자-코딩되지 않은 아미노산이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 추가로, 반응성 기, 글리코실화 자리, 폴리머, 치료 모이어티, 생분자 등을 포함하기 위해 변형된 아미노산이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 모든 아미노산은 D- 또는 L- 이성질체 중 하나일 수 있다. L-이성질체가 일반적으로 바람직하다. 게다가, 다른 펩티도미메틱이 또한 본 발명에 유용하다. 본원에 사용된, "펩티드"는 글리코실화된 펩티드와 비글리코실화된 펩티드를 둘 다 언급한다. 또한 펩티드를 발현하는 시스템에 의해 불완전하게 글리코실화된 펩티드가 포함된다. 일반적 검토를 위해, Spatola, A. F., in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983) 참조. 본 발명의 일부 펩티드의 리스트는 도 7에서 제공된다.
용어 "펩티드 콘쥬게이트"는 펩티드가 본원에 설명된 변형된 당과 콘쥬게이트되는 본 발명의 종을 말한다.
용어 "아미노산"은 천연적으로 발생하는 것과 천연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 합성 아미노산 뿐 아니라 아미노산 유사체 및 아미노 산 모방체를 말한다. 천연적으로 발생하는 아미노산은 유전 코드 및 후에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린으로 코딩된 것이다. 아미노산 유사체는 천연적으로 발생하는 아미노산, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기에 결합되는 α 탄소 및 R 기, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄로서 동일한 염기성 화학 구조를 가지는 화합물을 말한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 천연적으로 발생하는 아미노산으로서 염기성 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 다른 구조를 가지지만, 천연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 말한다.
본원에 사용된, 용어 "변형된 당" 또는 "변형된 당 잔기"는 본 발명의 공정에서 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 효소적으로 부가되는 천연적- 또는 비천연적으로 발생하는 탄수화물을 말한다. 변형된 당은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 당 뉴클레오티드(모노-, 디- 및 트리-포스페이트), 활성화된 당(예를 들어, 글리코실 할로겐화물, 글리코실 메실레이트) 및 활성화도 또는 뉴클레오티드도 아닌 당을 포함하는 효소 기질로부터 선택된다. "변형된 당"은 "변형기"와 공유적으로 작용된다. 유용한 변형 기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, PEG 모이어티, 치료 모이어티, 진단 모이어티, 생분자 등을 포함한다. 변형기는 바람직하게는 천연적으로 발생하는, 또는 비변형 탄수화물이 아니다. 변형기를 가지는 기능화의 위치는 "변형된 당"이 펩티드에 효소적으로 부가되는 것을 막지 않도록 선택된다.
본원에 사용된, 용어 "폴리머 모이어티"는 수용성 또는 수불용성 폴리머를 언급한다. 용어 "수용성"은 물에서 약간 검출가능할 정도의 용해도를 가지는 모이어티를 말한다. 물 용해도를 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대표적인 수용성 폴리머는 펩티드, 사카라이드, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카르복실산) 등을 포함한다. 펩티드는 단일 아미노산, 예를 들어, 폴리(리신)으로 구성되는 혼합된 서열을 가질 수 있다. 대표적인 다당류는 폴리(시알산)이다. 대표적인 폴리(에테르)는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 폴리(에틸렌 이민)은 대표적인 폴리아민이고, 폴리(아크릴)산은 대표적인 폴리(카르복실산)이다. 바람직한 수용성 폴리머는 본질적으로 비형광성이거나 또는 최소의 양으로 형광을 방출하여, 그것들은 분석에서 형광성 마커로서 사용에 부적합하다. 천연적으로 발생하는 당이 아닌 폴리머가 사용될 수 있다. 게다가, 다른 실체(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(아스파르테이트), 생분자, 치료 모이어티, 진단 모이어티, 등)의 공유 부착에 의해 변형되는 다른 천연적으로 발생하는 당의 사용이 또한 생각된다. 용어 수용성 폴리머는 또한 단당류(예를 들어, 덱스트란, 아밀로오스, 히알루론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 폴리머(예를 들어, 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜); 펩티드, 단백질 등과 같은 종들을 포함한다. 대표적인 수용성 폴리머는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리포스파진, 폴리(비닐 알코올), 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥시드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 에 테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할로겐화물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸 메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실 메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트) 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리비닐 피롤리돈, 플루로닉 및 폴리비닐페놀 및 그것의 공중합체를 포함한다. 게다가, 다른 실체(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(아스파르테이트), 생분자, 치료 모이어티, 진단 모이어티 등)의 공유 부착으로 변형되는 다른 천연적으로 발생하는 당의 사용이 생각된다. 수용성 및 수불용성 폴리머의 추가 예는 본 출원에서 기술된다.
수용성 폴리머의 폴리머 백본은 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG)일 수 있다. 그러나, 다른 관련된 폴리머가 또한 본 발명의 실행에서의 사용에 적당하며, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 본 관심에서 포괄적인 것이며 배타적인 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 용어 PEG는 알콕시 PEG, 2작용성 PEG, 멀티암형 PEG, 갈라진 PEG, 분지된 PEG, 현수 PEG(즉, 폴리머 백본에 한 개 이상의 작용기 현수를 가지는 PEG 또는 관련된 폴리머) 또는 그것에 분해할 수 있는 연결을 가지는 PEG를 포함하는 그것의 임의의 형태로 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다.
폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지된 폴리머는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지된 폴리머는 중앙 분지 코어 모이어티 및 중심 분지 코어에 연결된 다수의 선형 또는 분지된 폴리머 사슬을 가진다. PEG는 다양한 폴리올, 예로써, 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드의 첨가로 제조될 수 있는 분지된 형태로 통상적으로 사용된다. 중심 분지 모이어티는 또한 다수의 아미노산, 예로써 리신으로부터 유도될 수 있다. 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)은 R(-PEG-OH)m과 같은 일반 형태로 나타날 수 있으며, R은 코어 모이어티, 예로써, 글리세롤 또는 펜타에리트리톨을 나타내고, m은 암(arm)의 수를 나타낸다. 본원에 그것 전체가 참고로써 포함된 미국 특허 5,932,462에 기술된 것과 같은 멀티암형 PEG 분자가 또한 폴리머 백본으로서 사용될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 분지된 폴리머는 분지 모이어티(예를 들어, 시스테인, 세린, 리신 및 리신의 올리고머)에 그 자체가 부착된다.
많은 다른 폴리머들이 또한 본 발명에 적합하다. 부착을 위해 약 2 내지 약 300 loci 내에서 비-펩티드 및 수용성인 폴리머 백본이 본 발명에 특히 유용하다. 적절한 폴리머의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예로써, 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 그것 전체가 본원에 참고로써 포함되는 미국 특허 번호 5,629,384에서 기술되는 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(α-히드록시산, 폴리(비닐 알코올), 폴 리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 및 그것의 공중합체, 3량체 및 혼합물을 포함한다. 비록 폴리머 백본의 각 사슬의 분자량이 다양할 수 있다해도, 이는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 흔히 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da의 범위에 전형적으로 있다.
환자에게 펩티드 약물을 투여하는 문맥에서 본원에 사용된 "곡선하면적" 또는 "AUC"는 0 내지 무한대의 작용 시간으로서 환자의 전신 순환에서 약물의 농도를 기술하는 곡선하총면적으로서 정의된다.
환자에게 펩티드 약물을 투여하는 문맥에서 본원에 사용된 용어 "반감기" 또는 "t1/2"는 환자 내에서 약물의 혈장 농도가 1/2로 감소되는데 필요로 되는 시간으로서 정의된다. 다중 제거 메커니즘, 재분배 및 기타 당업계에 공지된 메커니즘에 따라서 펩티드 약물과 관련된 한 번 이상의 반감기가 있을 수 있다. 보통 알파 및 베타 반감기는 알파층은 재분배와 관련되고 베타층이 제거와 관련되는 것으로 정의된다. 그러나, 대부분 혈류에 갇힌 단백질 약물을 가지는 적어도 2회의 제거 반감기가 있을 수 있다. 일부 글리코실화된 펩티드에 대해, 급속한 베타층 제거는 말단 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 만노오스 또는 푸코오스를 인식하는 대식세포 또는 내피세포 상의 수용체를 통해 매개될 수 있다. 더 느린 베타층 제거는 효과적인 반경 < 2 nm (대략 68 kD)을 가지는 분자에 대한 신장 사구체 여과 및/또는 조직 내 특이적 또는 비특이적 흡입과 물질대사를 통해 발생할 수 있다. 글리코페길레이션은 말단 당(예를 들어, 갈락토오스 또는 N-아세틸 갈락토사 민)을 캡핑하여 이들 당을 인식하는 수용체를 통해 급속도의 알파층 제거를 차단할 수 있다. 이는 또한 더 큰 효과적인 반경을 주어서 분배 및 조직 흡수의 부피를 감소시킬 수 있기 때문에 베타층을 연장시킨다. 따라서, 알파층과 베타층 반감기에 글리코페길레이션의 정확한 효과는 크기, 글리코실화의 상태 및 당업계에 공지된 기타 변수에 따라 다양할 것이다. "반감기"의 추가 의미는 Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120)에서 발견된다.
본원에 사용된 용어 "글리코콘쥬게이션"은 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, G-CSF 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 변형된 당 종의 효소적으로 매개된 콘쥬게이션을 언급한다. "글리코콘쥬게이션"의 아속은 "글리코-페길화"이며, 여기서 변형된 당의 변형기는 폴리(에틸렌 글리콜), 및 그것의 알킬 유도체(예를 들어, m-PEG) 또는 반응 유도체(예를 들어, H2N-PEG, HOOC-PEG)이다.
용어 "라지-스케일" 및 "산업적-스케일"은 서로 바꾸어서 사용되며, 단일 반응 사이클의 완료시 적어도 약 250 mg, 바람직하게는 적어도 약 500mg 및 더 바람직하게는 적어도 약 1 g의 글리코콘쥬게이트를 생성하는 반응 사이클을 말한다.
본원에 사용되는 용어 "글리코실 연결기"는 변형기(예를 들어, PEG 모이어티, 치료 모이어티, 생분자)가 공유적으로 부착되는 글리코실 잔기를 말하며; 글리코실 연결기는 콘쥬게이트의 나머지에 변형기를 결합시킨다. 본 발명의 방법에서, "글리코실 연결기"는 글리코실화된 또는 비글리코실화된 펩티드에 공유적으로 부착 되어, 펩티드 상의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 약제를 연결한다. "글리코실 연결기"는 펩티드의 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 "변형된 당"의 효소적 부착에 의해 "변형된 당"으로부터 일반적으로 유도된다. 글리코실 연결기는 변형기-변형된 당 카세트의 형성 동안 분해되는 사카라이드-유도 구조일 수 있고(예를 들어, 산화→시프(Schiff) 염기 형성→환원), 글리코실 연결기는 무손상일 수 있다. "무손상 글리코실 연결기"는 변형기를 연결하는 사카라이드 모너머에서 글리코실 모이어티로부터 유도되고, 콘쥬게이트의 나머지가 예를 들어, 메타과요오드산 나트륨에 의해 분해, 예로써, 산화되지 않는 연결기를 말한다. 본 발명의 "무손상 글리코실 연결기"는 글리코실 유닛(들)의 부가 또는 모 사카라이드 구조로부터 한 개 이상의 글리코실 유닛의 제거에 의해 올리고당을 자연적으로 발생시키는 것으로부터 유도될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "비-글리코시드 변형기"는 글리코실 연결기에 직접적으로 연결되는 당을 자연적으로 발생시키는 것을 포함하지 않는 변형기를 말한다.
본원에 사용되는 용어 "표적 모이어티"는 신체의 특정 조직 또는 영역에서 선택적으로 국소화되는 종들을 말한다. 국소화는 표적 약제 또는 콘쥬게이트, 이온성 상호작용, 소수성 상호작용 등의 분자 결정소, 분자 크기의 특이적 인식으로 매개된다. 특정 조직 또는 영역에 약제를 표적화하는 다른 메커니즘은 당업자에게 공지되어 있다. 대표적인 표적화 모이어티는 항체, 항체 분획, 트랜스페린, HS-글리코단백질, 응고인자, 혈청 단백질, β-글리코단백질, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등을 포함한다.
본원에 사용된, "치료 모이어티"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 항생물질, 항염증제, 항종양약물, 사이토톡신, 및 방사성 약제를 포함하는 치료에 유용한 어떤 약제를 의미한다. "치료 모이어티"는 한 개 이상의 치료 모이어티가 담체, 예를 들어, 다가 약제에 결합되는 생활성제, 구성체의 프로드러그를 포함한다. 치료 모이어티는 또한 단백질을 포함하는 단백질 및 구성체를 포함한다. 대표적인 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 백혈구조혈성장인자(GCSF), 과립백혈구생성자극인자(GMCSF), 인터페론(예를 들어, 인터페론-α, -β, -γ), 인터류킨(예를 들어, 인터류킨 II), 혈청 단백질(예를 들어, 인자 VII, VIIa, VIII, IX, 및 X), 인체 융모 성선호르몬(HCG), 여포자극호르몬(FSH) 및 항체촉진 호르몬 (LH) 및 항체 융합 호르몬(예를 들어, 종양괴사인자 수용체((TNFR)/Fc 도메인 융합 단백질))을 포함한다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"는 콘쥬게이트와 결합될 때 콘쥬게이트의 활성을 보유하고 피험자의 면역 체계와 비반응성인 어떤 물질을 포함한다. 예들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인산염 완충 생리식염수, 물, 에멀젼,예로써 오일/물 에멀젼 및 다양한 종류의 습윤제와 같은 어떤 표준 약학 담체를 포함한다. 다른 담체들은 또한 멸균 용액, 코팅된 정제 및 캡슐을 포함하는 정제를 포함할 수 있다. 전형적으로 이러한 담체는 전분, 우유, 당, 특정 형태의 점토, 젤라틴, 스테아르산 또는 그것의 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글리콜, 또는 기타 공지된 부형제와 같은 부형제를 함유한다. 이러한 담체는 또한 향 또는 색상 첨가제 또는 기타 성분을 포함할 수 있다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 통상적인 방법으로 제형으로 된다.
본원에 사용된, "투여하는"은 피험자에 경구 투여, 좌약, 국소 접촉, 정맥 주사, 복막내, 근육내, 병소내, 비내 또는 피하 투여로서의 투여, 또는 서방성 장치, 예를 들어, 미니-삼투압 펌프의 이식을 의미한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 경구, 비강, 질, 직장 또는 경피)를 포함하는 어떤 경로에 의한다. 비경구 투여는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 세동맥내, 진피내, 피하, 복막내, 뇌실내, 및 두개내를 포함한다. 게다가, 주사가 종양을 처리하기 위해, 예를 들어 아포토시스를 유발하기 위한 것인 경우, 투여는 종양 및/또는 종양 주변 조직에 직접적으로 될 수 있다. 전달의 다른 방식은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 리포좀 제형, 정맥내 주입, 경피성 패치 등을 포함한다.
용어 "개선하는" 또는 "개선하다"는 증상의 감퇴, 경감 또는 감소 또는 환자의 육체적 또는 정신적 웰빙에서 개선과 같은 어떤 객관적 또는 주관적 변수를 포함하는 병리 또는 질병의 치료에서 어떤 성공의 징후를 말한다. 증상의 개선은 육체적 검사 및/또는 정신적 평가의 결과를 포함하는 객관적 또는 주관적 변수를 기초로 할 수 있다.
용어 "요법"는 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 경험하거나 또는 질병의 증상을 나타내지 않는 동물에서 발생하는 것을 예방하는 것, 질병을 억제시키는 것(그것의 진행을 늦추거나 저지), 질병의 증상 또는 부작용의 경감을 제공하는 것(고식적 치료를 포함), 질병을 완화시키는 것(질병의 퇴보를 야기)을 포함하는 질병 또는 질환을 "치료하는 것" 또는 "치료"를 말한다.
용어 "유효한 양" 또는 "양으로 유효한" 또는 "치료적으로 유효한 양" 또는 어떤 문법적으로 동등한 용어는 질병을 치료하기 위해 동물에 투여되었을 때, 질병에 대한 치료를 달성하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "분리된"은 물질을 제조하기 위해 사용되는 성분으로부터 실질적으로 또는 본질적으로 자유로운 물질을 말한다. 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에 대해, 용어 "분리된"은 펩티드 콘쥬게이트를 제조하는데 사용되는 혼합물 내 물질을 정상적으로 수반하는 성분에서 실질적으로 또는 본질적으로 자유로운 물질을 말한다. "분리된" 및 "순수한"은 서로 바꾸어서 사용된다. 전형적으로, 본 발명의 분리된 펩티드 콘쥬게이트는 바람직하게는 어떤 범위로서 발생되는 순도의 수준을 가진다. 펩티드 콘쥬게이트에 대한 순도 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
펩티드 콘쥬게이트가 약 90% 이상의 순도일 때, 그것들의 순도는 바람직하게는 범위로서 표현된다. 순도의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 순도 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100% 순도이다.
순도는 어떤 당업계에 인식된 분석 방법으로 결정된다(예를 들어, 은 염색 겔, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 또는 유사한 수단 상의 밴드 강도).
본원에 사용된 "본질적으로 각 모집단의 멤버"는 펩티드에 부가된 변형된 당의 선택된 백분율이 펩티드 상의 다수의, 동일한 어셉터 자리에 부가되는 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트의 모집단의 특성을 기술한다. "본질적으로 각 모집단의 멤 버"는 변형된 당에 콘쥬게이트되는 펩티드 상 자리의 "동질성"을 말하며, 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90% 및 더 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한 본 발명의 콘쥬게이트를 말한다.
"동질성"은 변형된 당이 콘쥬게이트되는 어셉터 모이어티의 모집단을 가로지르는 구조적 일관성을 말한다. 따라서, 각 변형된 당 모이어티가 매번 다른 변형된 당이 콘쥬게이트되는 어셉터 자리로서 동일한 구조를 가지는 어셉터 자리에 콘쥬게이트되는 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에서, 펩티드 콘쥬게이트는 약 100% 동질한 것으로 언급된다. 동질성은 전형적으로 범위로서 표현된다. 펩티드 콘쥬게이트에 대한 동질성의 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
펩티드 콘쥬게이트가 약 90% 이상 동질할 때, 그것의 동질성은 또한 바람직하게는 범위로서 표현된다. 동질성 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 순도 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100%이다. 펩티드 콘쥬게이트의 순도는 당업자에게 공지된 한 가지 이상의 방법, 예를 들어, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS), 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량분석법(MALDITOF), 모세관 전기영동 등으로 전형적으로 결정된다.
글리코펩티드 종을 언급할 때, "실질적으로 균일한 글리코폼" 또는 "실질적으로 균일한 글리코실화 패턴"은 관심의 글리코실트랜스퍼라아제(예를 들어, 푸코실트랜스퍼라아제)에 의해 글리코실화되는 어셉터 모이어티의 백분율을 말한다. 예 를 들어, α1,2 푸코실트랜스퍼라아제의 경우에, 실질적으로 모든(하기 정의됨) Galβ 1,4-GlcNAc-R 및 그것의 시알릴화된 유사체가 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트에서 푸코실화된다면 실질적으로 균일한 푸코실화 패턴이 존재한다. 본원에서 설명한 푸코실화된 구조에서, Fuc-GlcNAc 연결은 일반적으로 α1,6 또는 α1,3이며, α1,6이 일반적으로 바람직하다. 출발 물질은 글리코실화된 어셉터 모이어티(예를 들어, 푸코실화된 Galβ1,4-GlcNAc-R 모이어티)를 함유할 수 있다. 따라서, 계산된 글리코실화 백분율은 본 발명의 방법으로 글리코실화된 어셉터 모이어티 및 출발 물질에서 이미 글리코실화된 어셉터 모이어티를 포함할 것이다.
"실질적으로 균일한"의 상기 정의에서 용어 "실질적으로"는 특정 글리코실트랜스퍼라아제에 대해 적어도 약 40%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 더 바람직하게는 적어도 약 90% 및 더욱더 바람직하게는 적어도 약 95%의 어셉터 모이어티가 글리코실화됨을 의미한다.
치환기가 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된 그것의 통상적인 화학식으로 특정될 때, 그것들은 구조를 오른쪽에서 왼쪽으로 기록한 결과로부터 초래된 화학적으로 동일한 치환기를 동일하게 포함한다, 예를 들어, -CH2O-는 또한 -OCH2-를 기술하는 것으로 의도된다.
용어 "알킬"은, 달리 언급되지 않는다면, 그것 단독 또는 다른 치환기의 부분으로서 직쇄 또는 분지쇄 또는 고리 탄화수소 라디칼, 또는 그것의 조합을 의미하며, 이는 완전히 포화일 수도 있고, 모노- 또는 폴리불포화일 수도 있고, 2- 및 다가의 라디칼일 수 있으며, 다수의 지정된 탄소 원자(즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미한다)를 가진다. 포화된 탄화 수소의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이것의 상동체 및 이성질체, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기를 포함한다. 불포화된 알킬기는 하나 이상의 이중결합 또는 삼중결합을 가지는 것이다. 불포화 알킬기의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 더 고급의 동족체 및 이성질체를 포함한다. 용어 "알킬"은 달리 언급되지 않는다면, 하기에서 더욱 상세하게 정의되는 "헤테로알킬"과 같은 알킬의 유도체를 또한 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소기로 제한되는 알킬기는 "호모알킬"로 칭해진다.
용어 "알킬렌"은 그것 단독 또는 다른 치환기의 부분으로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, -CH2CH2CH2CH2-로 예시되는 알칸으로부터 유도되는 2가의 라디칼을 의미하며, "헤테로알킬렌"으로서 하기 기술되는 기들을 포함한다. 전형적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 본 발명에서 바람직한 10개 이하의 탄소 원자를 가지는 기들과 함께 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 가지는 더 짧은 사슬의 알킬 또는 알킬렌기이다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 그것의 통상적인 의미로 사용되며, 알킬기가 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자 각각을 통해 분자의 나머지에 부착되는 것을 말한다.
용어 "헤테로알킬"은 그것 단독 또는 다른 치환기의 부분으로서, 달리 언급되지 않는다면, 언급된 수의 탄소 원자 O, N, Si 및 S로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 한 개의 헤테로원자로 구성되는 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 고리 탄화수소 라디칼, 또는 그것의 조합을 의미하며, 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화 될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬기의 어떤 내부 위치에 또는 알킬기가 분자의 나머지에 부착되는 위치에 위치될 수 있다. 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함한다. 2개 이하의 헤테로원자는 연속적, 예로써, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3일 수 있다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그것 단독 또는 다른 치환기의 부분으로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-로 예시되는 헤테로알킬로부터 유도되는 2가의 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기에 대해, 헤테로원자는 또한 사슬 말단(예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등) 중 하나 또는 둘 다를 점유할 수 있다. 또 추가로, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 대해, 연결기의 어떤 방향성도 연결기의 화학식이 기록된 방향으로써 의미되지 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'-과 -R'C(O)2- 둘 다를 나타낸다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 그것 단독 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 언급되지 않는다면, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 고리 형태를 나타낸다. 추가로, 헤테로시클로알킬에 대해, 헤테로원자는 헤테로고리가 분자의 나머지에 부착되는 위치에서 점유될 수 있다. 시클로알킬의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함한다. 헤테로시클로알킬의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함한다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 그것 단독 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 언급되지 않는다면, 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가적으로, "할로알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함한다.
용어 "아릴"은, 달리 언급되지 않는다면, 폴리불포화된, 방향족의, 단일 환 또는 다중 환일 수 있는 치환기(바람직하게는 1 내지 3개의 환)를 의미하며, 이는 함께 융합되거나 공유적으로 연결된다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O, 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴기(또는 환)를 말하며, 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)은 선택적으로 4차화된다. 헤테로아릴기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴의 비 제한적 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 테트라졸릴, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티에닐, 2,3-디히드로벤조[1,4]디옥신-6-일, 벤조[1,3]디옥솔-5-일 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 각각 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 환 시스템의 치환기는 하기 기술되는 허용가능한 치환기의 군으로부터 선택된다.
간결함을 위해, 용어 "아릴"은 다른 용어(예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)와 조합하여 사용될 때 상기 정의된 아릴과 헤테로아릴환 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴기가 알킬기(예를 들어, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등)에 부착되는 라디칼을 포함하는 것을 의미하며, 탄소 원자(예를 들어, 메 틸렌 기)가, 예를 들어, 산소 원자(예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)으로 치환되는 알킬기를 포함한다.
각각의 상기 용어(예를 들어, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")은 표시된 라디칼의 치환된 형태와 비치환된 형태 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 각 종류의 라디칼에 대해 바람직한 치환기는 하기 제공된다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및 헤테로시클로알케닐로서 언급되는 기들을 포함)에 대한 치환기는 일반적으로 "알킬기 치환체"로서 언급되며, 그것들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 0 내지 (2m'+1)의 범위에 있는 수로 -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', - S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 다양한 기들일 수 있고, m'는 이러한 라디칼에서 탄소 원자의 총 수이다. R', R", R'" 및 R""는 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 예를 들어, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 말한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들어, 각각의 R기는 하나 이상의 이들 기가 존재할 때 각 R', R", R'" 및 R"" 기로서 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착될 때, 이들은 질소 원자와 함께 결합하여 5-, 6-, 또는 7-원 환을 형성한다. 예를 들어, -NR'R"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 할로알킬(예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)과 같이 수소기 이외의 기들에 결합하는 탄소 원자를 포함하는 기들을 포함하는 것을 의미하는 것을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기술된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴에 대한 치환기는 일반적으로 "아릴기 치환기"로서 언급된다. 치환기는 방향족 환 시스템 상에서 0 내지 임의의 가능한 원자가(open valence)의 총 수의 범위에 있는 수로, 예를 들어, 할로겐, -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며; R', R", R'" 및 R""는 바람직하게는 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 및 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들어, 각각의 R기는 하나 이상의 이들 기가 존재할 때 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기들로부터 독립적으로 선택된다. 하기 반응 식에서, 기호 X는 상기 기술한 바와 같은 "R"을 나타낸다.
아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접한 원자 상의 2개의 치환기는 -T-C(O)-(CRR')u-U-의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있고, T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일 결합이고, u는 0 내지 3의 정수이다. 또 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접한 원자 상의 2개의 치환기는 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있고, A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 4의 정수이다. 이렇게 형성된 신규 환의 단일 결합 중 하나는 이중 결합으로 선택적으로 치환될 수 있다. 또 다르게는, 아릴 또는 헤테로아릴 환의 인접한 원자 상의 2개의 치환기는 화학식 -(CRR')z-X-(CR"R'")d-의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있고, z 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R" 및 R'"는 바람직하게는 수소 또는 치환된 또는 비치환된 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 사용된, 용어 "헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 규소(Si)를 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된, 인자 VII 펩티드는 인자 VII와 인자 VIIa 펩티드를 둘 다 말한다. 용어는 일반적으로 첨가, 결실, 치환 및 융합 단백질 돌연변이를 포함하는 이들 펩티드의 변종 및 돌연변이를 말한다. 인자 VII와 인자 VIIa가 둘 다 사용될 때, 사용은 예시적인 2 종류의 "인자 VII 펩티드"가 되는 것으로 의도된다.
본 발명은 본원에 기술되는 화합물에서 발견되는 특정 치환기에 따라서 상대적으로 비독성인 산 또는 염기로 제조되는 본 발명의 화합물의 염을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 산성인 작용기를 함유할 때, 염기 부가 염은 이러한 화합물의 중성 형태를 충분한 양의 요망되는 염기, 니트(neat) 또는 적당한 불활성 용매 중 하나와 접촉시킴으로써 얻을 수 있다. 염기 부가 염의 예는, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노 또는 마그네슘 염 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 상대적으로 염기성인 작용기를 함유할 때, 산 부가 염은 이러한 화합물의 중성 형태와 충분한 양의 요망되는 산, 니트 또는 적당한 불활성 용매와 접촉시킴으로써 얻을 수 있다. 산 부가 염의 예는 염화수소, 브롬화수소, 질산, 탄산, 모노탄화수소, 인산, 일인산수소, 이인산수소, 황산, 모노황산수소, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 무기산으로부터 유도되는 것 뿐 아니라 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등과 같은 상대적으로 비독성인 유기산으로부터 유도되는 염을 포함한다. 또한 아르기네이트와 같은 아미노산의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등과 같은 유기산의 염이 포함된다(예를 들어, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977) 참조). 본 발명의 어떤 특이적 화합물은 염기 또는 산 부가 염 중 하나로 변환되는 화합물을 허용하는 염기성과 산성 작용기를 둘다 함유한다.
화합물의 중성 형태는 염기 또는 산을 가지는 염과 모 화합물을 통상적인 방법으로 접촉시킴으로써 재발생된다. 화합물의 모 형태는 극성 용매에서 용해도와 같은 어떤 물리적 특성에서 다양한 염 형태와 다르다.
본원에 사용된 "염 반대이온"은 본 발명의 화합물의 모이어티가 음으로 하전되었을 때(예를 들어, COO-), 본 발명의 화합물과 관련된 양으로 하전된 이온을 말한다. 염 반대이온의 예는, H+, H3O+, 암모늄, 칼륨, 칼슘, 리튬, 마그네슘 및 나트륨을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "CMP-SA-PEG"는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 시알산에 콘쥬게이트된 시티딘 모노포스페이트 분자이다. 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 길이가 특정되지 않는다면, 임의의 PEG 사슬 길이가 가능하다(예를 들어, 1kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD, 40 kD). 대표적인 CMP-SA-PEG는 반응식 1의 화합물 5이다.
I. 서론
치료적 목적으로 사용되는 재조합 펩티드의 유효성을 개선하기 위해, 본 발명은 글리코실화된 및 비글리코실화된 펩티드와 변형기의 콘쥬게이트를 제공한다. 변형기는 예를 들어, PEG (m-PEG), PPG (m-PPG) 등, 치료 모이어티, 진단 모이어티, 표적 모이어티 등과 같은 폴리머 변형기로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 수용성 폴리머 변형기로 펩티드의 변형은 모 화합물의 순환에서 재조합 펩티드의 안정성 및 체류 시간을 개선시킬수 있고, 및/또는 재조합 펩티드의 항원성을 감소시 킬 수 있다.
본 발명의 펩티드 콘쥬게이트는 글리코실화된 또는 비글리코실화된 펩티드에 변형된 당의 효소적 부착에 의해 형성될 수 있다. 글리코실화 자리 및/또는 변형된 글리코실기는 펩티드에 대해 변형기를 지지하는 변형된 당을 콘쥬게이팅하기 위한, 예를 들어, 글리코콘쥬게이션에 의해, 장소를 제공한다.
본 발명의 방법은 실질적으로 균질한 유도 패턴을 가지는 펩티드 콘쥬게이트와 글리코펩티드 콘쥬게이트를 만드는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 사용되는 효소는 일반적으로 특정 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 조합, 특히 글리코실 잔기 또는 펩티드의 글리코실 잔기의 조합에 선택적이다. 본 방법은 또한 펩티드 콘쥬게이트의 라지-스케일 생성에 실용적이다. 따라서, 본 발명의 방법은 미리 선택된 독특한 유도 패턴을 가지는 펩티드 콘쥬게이트의 라지-스케일 제조를 의미한다. 본 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 세포 배양 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 곰팡이 세포, 이스트 세포 또는 원핵생물 세포) 또는 유전자이식 식물 또는 동물에서 생성 동안 불완전하게 글리코실화된 글리코펩티드를 포함하는 치료 펩티드의 변형에 특히 적합하다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 감소된 제거율, 또는 면역 또는 세망내피계(RES)에 의해 감소된 흡입률에 기인하여 증가된 치료 반감기를 가지는 글리코실화된 및 비글리코실화된 펩티드의 콘쥬게이트를 제공한다. 게다가, 본 발명의 방법은 펩티드 상의 항원성 결정소를 마스킹하기 위한 수단을 제공하여, 펩티드에 대한 숙주 면역 반응을 감소 또는 제거한다. 표적 약제의 선택적인 부착은 또한 특정 표 적 약제에 특이적인 특정 조직 또는 세포 표면 수용체에 펩티드를 표적화하는데 사용될 수 있다.
수용성 폴리머를 가지는 펩티드 콘쥬게이트의 제조를 위한 최적의 조건을 결정하는 것은, 예를 들어, 수많은 변수의 최적화를 포함하며, 펩티드와 수용성 폴리머의 동일함에 의존한다. 예를 들어, 폴리머가 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어, 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)일 때, 나머지는 바람직하게는 반응 중 이용된 폴리머의 양과 폴리머의 존재에 기인하는 반응 혼합물의 점성도 간에 확립되며: 폴리머가 너무 고도로 농축된다면, 반응 혼합물은 점착성이 되며, 질량 전달과 반응의 속도를 늦춘다.
게다가, 과량의 효소를 첨가하는 것이 직관적으로 명백함에도 불구하고, 효소가 너무 과량으로 존재할 때, 본 발명자들은 과량의 효소는 그것의 제거에 여분의 정제 단계 및 물질을 요구하는 오염물질이 되며 최종 생성물의 비용을 불필요하게 증가시킨다는 것을 인식하였다.
게다가, 변형의 조절된 수준으로 펩티드를 생성할 것이 일반적으로 요망된다. 일부 예에서, 바람직하게는 한 개의 변형된 당을 부가하는 것이 요망된다. 다른 예에서, 바람직하게는 두 개의 변형된 당을 부가하는 것이 요망된다. 따라서, 반응 조건은 펩티드에 변형기의 접합의 정도에 영향을 미치는 것으로 바람직하게 조절된다.
본 발명은 요망되는 수준의 콘쥬게이션을 가지는 펩티드의 수율이 최대가 되는 것 하에 조건을 제공한다. 본 발명의 대표적인 구체예에서 조건은 또한 다양한 시약 및 물질의 비용 및 생성물을 정제하는데 필요한 시간을 인식한다: 본원에 설명된 반응 조건은 요망되는 생성물의 최상의 수율을 제공하기 위해 최적화되고, 한편, 비용적으로 시약의 낭비를 최소화한다.
II . 재료/펩티드 콘쥬게이트의 조성
제 1 양태에서, 본 발명은 변형된 당과 펩티드 사이에 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 또한 변형기와 펩티드 사이에 콘쥬게이트를 제공한다. 펩티드 콘쥬게이트는 다수의 형태 중 하나를 가질 수 있다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 및 글리코실 연결기를 통해 펩티드의 아미노산에 연결된 변형기를 포함할 수 있다. 다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 및 글리코실 연결기를 통해 펩티드의 글리코실 잔기에 연결되는 변형기를 포함할 수 있다. 다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 및 글리코펩티드 탄수화물과 직접 펩티드 백본의 아미노산 잔기 둘 다에 결합되는 글리코실 연결기를 포함할 수 있다. 다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 및 글리코펩티드 탄수화물과 직접 펩티드 백본의 아미노산 잔기 둘 다에 결합되는 글리코실 연결기를 포함할 수 있다. 또 다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 및 펩티드의 아미노산 잔기에 직접 연결되는 변형기를 포함할 수 있다. 본 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 글리코실기를 포함하지 않을 수 있다. 어떤 이들 구체예에서, 펩티드는 글리코실화될 수도 되지 않을 수도 있다.
본 발명의 콘쥬게이트는 하기 일반 구조식에 전형적으로 대응할 것이다:
Figure 112009026250918-PCT00022
여기서, 기호 a, b, c, d 및 s는 양수이며, 0이 아닌 정수를 나타내고; t는 0 또는 양의 정수 중 하나이다. "약제" 또는 변형기는 치료제, 생활성제, 검출가능한 표지, 폴리머 변형기, 예로써, 수용성 폴리머(예를 들어, PEG, m-PEG, PPG, 및 m-PPG) 등일 수 있다. "약제" 또는 변형기는 펩티드, 예를 들어, 효소, 항체, 항원 등일 수 있다. 링커는 하기 연결기의 어떤 넓은 배열일 수 있다. 또 다르게는, 링커는 단일 결합 또는 "0차 링커"일 수 있다.
II .A. 펩티드
펩티드 콘쥬게이트 내 펩티드는 도 7의 펩티드로부터 선택되는 멤버이다. 이 경우에, 펩티드 콘쥬게이트 내 펩티드는 뼈 형성 단백질(예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), 뉴로트로핀(예를 들어, NT-3, NT-4, NT-5), 성장 분화 인자(예를 들어, GDF-5), 신경아교세포계-유래 신경영양 인자(GDNF), 뇌유인성 신경영양인자(BDNF), 신경성장인자(NGF), 폰 빌리브란트 인자(vWF) 프로테아제, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, B-도메인 결실 인자 VIII, 전장 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, B-도메인 결실 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, 에리스로포이에틴(EPO), 과립구 대식세포 집락 자극인자(G-CSF), 과립백혈구생성자극인자(GM-CSF) 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, α1-항트립신(ATT, 또는 α-1 프로테아제 억제제), 글루코세레브로시데이즈, 조직형 플라스미노겐 활성제(TPA), 인터류킨-2 (IL-2), 유로키나제, 인간 DNase, 인슐린, B형간염표면단백질 (HbsAg), 인간 성장 호르몬, TNF 수용체-IgG Fc 영역 융합 단백질(EnbrelTM), 항-HER2 단일클론항체 (Herceptin™), 호흡기세포융합바이러스의 단백질 F에 대한 단일클론항체 (Synagis™), TNF-α에 대한 단일클론항체 (Remicade™), 글리코단백질 IIb/IIIa에 대한 단일클론항체 (Reopro™), CD20에 대한 단일클론항체 (Rituxan™), 항-트롬빈 III (AT III), 인체 융모 성선호르몬(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazyme™), 알파-이두로니다아제(Aldurazyme™), 여포자극호르몬, 베타-글루코시다아제, 항-TNF-알파 단일클론항체, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2), 베타-글루코시다아제, 알파-갈락토시다아제 A 및 섬유아세포성장인자로부터 선택되는 멤버이다. 특정 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트 내 펩티드는 인자 VIII이다. 다른 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트 내 펩티드는 인터페론 알파이다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함하는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00023
;
Figure 112009026250918-PCT00024
및
Figure 112009026250918-PCT00025
.
대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 5000, 바람직하게는 약 100 내지 약 4000, 더 바람직하게는 약 200 내지 약 3000, 훨씬 더 바람직하게는 약 300 내지 약 2000 및 더욱더 바람직하게는 약 400 내지 약 1000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 70, 약 70 내지 약 150, 약 150 내지 약 250, 약 250 내지 약 375 및 약 375 내지 약 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 10 내지 약 35, 약 45 내지 약 65, 약 95 내지 약 130, 약 210 내지 약 240, 약 310 내지 약 370 및 약 420 내지 약 480으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 15 내지 약 30으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 50 내지 약 65로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n 은 약 100 내지 약 130으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 210 내지 약 240으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 310 내지 약 370으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 430 내지 약 470으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체 예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3로부터 선택되는 멤버이다.
본 발명에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00026
및
Figure 112009026250918-PCT00027
.
대표적인 구체예에서, 변형기는 하기 나타내는 것과 같은 분지된 수용성 폴리머이며, 이는 일반적으로 시알리다아제의 농도가 반응 혼합물의 약 1.5 내지 약 2.5 U/L인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 시알리다아제의 양은 약 2 U/L이다.
다른 대표적인 구체예에서, 약 5 내지 약 9 그램의 펩티드 기질은 상기 언급한 시알리다아제의 양과 접촉된다.
변형된 당은 약 1 그램 내지 약 6 그램, 바람직하게는 약 3 그램 내지 약 4 그램의 양으로 반응 혼합물 중 존재한다. 일반적으로 분지된 수용성 폴리머 변형기, 예를 들어 상기 나타낸 모이어티를 가지는 변형된 당의 농도를 약 0.5mM 미만으로 유지하는 것이 바람직하다.
특정 구체예에서, 변형기는 약 20 kD 내지 약 60 kD, 더 바람직하게는, 약 30 kD 내지 약 50 kD, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 40 kD의 분자량을 가지는 분지된 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 다른 구체예에서, 변형기는 적어도 약 80 kD, 바람직하게는 적어도 약 100 kD, 더 바람직하게는 적어도 약 120 kD, 적어도 약 140 kD 또는 적어도 약 160 kD의 분자량을 가지는 분지된 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 또 다른 구체예에서, 분지된 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)은 적어도 약 200 kD, 예로써, 적어도 약 160 kD 및 적어도 약 180 kD를 포함하여, 적어도 약 80 kD 내지 적어도 약 200 kD이다. 당업자로서 폴리머의 분자량은 종종 다분산성임을 인식할 것이고, 따라서, 분자량의 문맥에서 어구 "약"은 바람직하게는 언급된 수 근처의 값의 범위를 포함한다. 예를 들어, 약 40 kD의 분자량을 가지는 바람직한 변형기는 약 35 kD 내지 약 45 kD의 분자량을 가지는 것이다. 당업자는 상기 언급된 분지된 PEG 구조에 따라서 간단하게 예시의 명료함에 대해 인식할 것이고, 본원에서 발견되는 "폴리머 모이어티"의 정의에서 설명되는 종들을 제한하는 것 없이 포함하여 PEG가 실질적으로 어떤 폴리머 모이어티로 치환될 수 있음을 인식할 것이다.
글리코실트랜스퍼라아제 농도에 대해, 현재 바람직한 구체예에서, 상기 언급된 변형기를 사용하여, 글리코실트랜스퍼라아제 대 펩티드의 비율은 약 40 μg/mL 트랜스퍼라아제 내지 약 200 μM 펩티드이다.
II . B. 변형된 당
대표적인 구체예에서, 인자 VIII, 인터페론 알파, 및 도 7에 열거된 펩티드와 같은 본 발명의 펩티드는 변형된 당과 반응되어 펩티드 콘쥬게이트를 형성한다. 변형된 당은 "당 도너 모이어티" 뿐 아니라 "당 전달 모이어티"를 포함한다. 당 도 너 모이어티는 본 발명의 콘쥬게이트로서 글리코실 모이어티 또는 아미노산 모이어티 중 하나를 통해 펩티드에 부착될 변형된 당의 어떤 부분이다. 당 도너 모이어티는 변형된 당으로부터 펩티드 콘쥬게이트의 글리코실 연결기로 그것의 변환 동안 화학적으로 변경되는 원자들을 포함한다. 당 전달 모이어티는 본 발명의 콘쥬게이트로서 펩티드에 부착되지 않을 변형된 당의 어떤 부분이다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 당은 페길화된 당 뉴클레오티드, PEG-시알산 CMP이다. PEG-시알산 CMP, 당 도너 모이어티 또는 PEG-시알릴 도너 모이어티에 대해, PEG-시알산을 포함하며, 한편, 당 전달 모이어티 또는 시알릴 전달 모이어티는 CMP를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 변형된 당에서, 사카릴 모이어티는 바람직하게는 사카라이드, 데옥시-사카라이드, 아미노-사카라이드 또는 N-아실 사카라이드이다. 용어 "사카라이드" 및 그것의 동등물 "사카릴" "당" 및 "글리코실"은 모노머, 다이머, 올리고머 및 폴리머를 말한다. 당 모이어티는 또한 변형된 기와 함께 기능화된다. 변형기는 전형적으로 아민, 술프히드릴 또는 히드록실, 예를 들어, 1차 히드록실, 당의 모이어티와 콘쥬게이션을 통해 사카릴 모이어티에 콘쥬게이트된다. 대표적인 구체예에서, 변형기는 당의 아민 모이어티, 예를 들어, 아민과 변형기의 반응성 유도체의 반응을 통해 형성되는 아미드, 우레탄 또는 우레아를 통해 부착된다.
어떤 사카릴 모이어티는 변형된 당의 당 도너 모이어티로서 이용될 수 있다. 사카릴 모이어티는 공지된 당, 예로써, 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스 또는 공지된 당의 입체화학을 가지는 종일 수 있다. 이들 변형된 당의 화학식은 하기와 같다:
Figure 112009026250918-PCT00028
본 발명의 조성을 형성하는데 유용한 다른 사카릴 모이어티는, 이에 제한되는 것은 아니지만 푸코오스 및 시알산 뿐 아니라 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 시알산의 5-아민 유사체 등과 같은 아미노 당을 포함한다. 사카릴 모이어티는 천연에서 발결되는 구조일 수 있고 또는 변형기를 콘쥬게이팅하기 위한 자리를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 변형된 당은 9-히드록시 모이어티가 아민으로 치환되는 시알산 유도체를 제공한다. 아민은 선택된 변형기의 활성화된 유사체와 함께 용이하게 유도된다.
본 발명에서 사용되는 변형된 당의 예는, 본원에 참고로써 포함된 PCT 특허 출원 No. PCT/US05/002522에서 기술된다.
추가 대표적인 구체예에서, 본 발명은 6-히드록실 위치가 대응하는 아민 모이어티로 변환되고, 상기 설명한 것과 같은 링커-변형기 카세트를 지지하는 변형된 당을 이용한다. 이들 변형된 당의 코어로서 사용될 수 있는 대표적인 글리코실기는 Glu, Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Man 등을 포함한다. 본 구체예에 따르는 대표적인 변형된 당은 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00029
R11-R14은 H, OH, C(O)CH3, NH, 및 NHC(O)CH3으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. R10은 다른 글리코실 잔기 (-O-글리코실) 또는 인자 VII/인자 VIIa 펩티드(-NH-(인자 VII/인자 VIIa))의 아미노산에 연결된다. R14는 OR1, NHR1 또는 NH-L-R1이다. R1 및 NH-L-R1은 상기 기술한 바와 같다.
II .C. 글리코실 연결기
대표적인 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 당과 펩티드 사이에서 형성된 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 다른 대표적인 구체예에서, 변형된 당에서의 변형기가 하기 모이어티를 포함할 때:
Figure 112009026250918-PCT00030
펩티드 콘쥬게이트의 펩티드는 도 7의 펩티드로부터 선택되는 멤버이다. 또 다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트의 펩티드는 뼈 형성 단백질(예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), 뉴로트로핀(예를 들어, NT-3, NT-4, NT-5), 성장 분화 인자(예를 들어, GDF-5), 신경아교세포계-유래 신경영양 인 자(GDNF), 뇌유인성 신경영양인자(BDNF), 신경성장인자(NGF), 폰 빌리브란트 인자(vWF) 프로테아제, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, B-도메인 결실 인자 VIII, 전장 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, B-도메인 결실 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, 에리스로포이에틴(EPO), 과립구 대식세포 집락 자극인자(G-CSF), 과립백혈구생성자극인자(GM-CSF) 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, α1-항트립신(ATT, 또는 α-1 프로테아제 억제제), 글루코세레브로시데이즈, 조직형 플라스미노겐 활성제(TPA), 인터류킨-2 (IL-2), 유로키나제, 인간 DNase, 인슐린, B형간염표면단백질 (HbsAg), 인간 성장 호르몬, TNF 수용체-IgG Fc 영역 융합 단백질(EnbrelTM), 항-HER2 단일클론항체 (Herceptin™), 호흡기세포융합바이러스의 단백질 F에 대한 단일클론항체 (Synagis™), TNF-α에 대한 단일클론항체 (Remicade™), 글리코단백질 IIb/IIIa에 대한 단일클론항체 (Reopro™), CD20에 대한 단일클론항체 (Rituxan™), 항-트롬빈 III (AT III), 인체 융모 성선호르몬(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazyme™), 알파-이두로니다아제(Aldurazyme™), 여포자극호르몬, 베타-글루코시다아제, 항-TNF-알파 단일클론항체, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2), 베타-글루코시다아제, 알파-갈락토시다아제 A 및 섬유아세포성장인자로부터 선택되는 멤버이다. 특정 구체예에서, 펩티드는 인자 VIII 또는 인터페론 알파이다. 본 구체예에서, 변형된 당의 당 도너 모이어티(예로써, 사카릴 모이어티 및 변형기)는 "글리코실 연결기"가 된다. "글리코실 연결기"는 또 다르게는 펩티드와 변형기 사이에 삽입되는 글리코실 모이어티를 말할 수 있다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 구조를 가지는 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00031
및
Figure 112009026250918-PCT00032
대표적인 구체예에서, 변형된 당에서 변형된 기는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00033
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3로부터 선택되는 멤버이다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00034
및
Figure 112009026250918-PCT00035
당업자에게 인식될 바와 같이, 상기 나타낸 각각의 구조에서 PEG 모이어티는 제한 없이 "폴리머 모이어티"로서 본원에 정의되는 종들을 포함하는 어떤 다른 폴리머 모이어티로 치환될 수 있다.
펩티드 상의 부가 및/또는 변형 글리코실 잔기에 이용가능한 본 방법의 다양성에 기인하여, 글리코실 연결기는 실질적으로 어떤 구조를 가질 수 있다. 하기 논의에서, 본 발명은 푸라노오스 및 피라노오스의 선택된 유도체의 사용에 대한 참고로써 예시된다. 당업자는 논의의 초점이 예시의 명확함을 위한 것이며 상기 언급한 구조와 조성은 글리코실 연결기 및 변형된 당의 종류에 대해 일반적으로 적용할 수 있음을 인식할 것이다. 글리코실 연결기는 사실상 어떤 모노- 또는 올리고-사카라이드를 포함할 수 있다. 글리코실 연결기는 측쇄 또는 펩티드 백본 중 하나를 통해서 아미노산에 부착될 수 있다. 또 다르게는, 글리코실 연결기는 사카릴 모이어티를 통해 펩티드에 부착될 수 있다. 이 사카릴 모이어티는 펩티드 상의 O-연결된 또는 N-연결된 글리칸 구조의 부분일 수 있다.
대표적인 구체예에서, 본 발명은 하기로부터 선택되는 화학식을 가지는 무손상 글리코실 연결기를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
(화학식 I)
Figure 112009026250918-PCT00036
(화학식 Ia)
Figure 112009026250918-PCT00037
및
(화학식 II)
Figure 112009026250918-PCT00038
(화학식 IIa)
Figure 112009026250918-PCT00039
화학식 I 및 Ia에서, R2는 H, CH2OR7, COOR7 또는 OR7이고, R7은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬을 나타낸다. COOR7이 카르복실산 또는 카르복실레이트일 때, 두 가지 형태는 단일 구조 COO- 또는 COOH의 지정에 의해 나타난다.
화학식 I, Ia, II 또는 IIa에서, 기호 R3, R4, R5, R6 및 R6는 독립적으로 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, OR8, NHC(O)R9를 나타낸다. 표시 d는 O 또는 1이다. R8 및 R9는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 시알산 또는 폴리시알산으로부터 독립적으로 선택된다. 적어도 하나의 R3, R4, R5, R6 또는 R6는 변형기를 포함한다. 이 변형기는 결합 또는 연결기를 통해 연결되는 폴리머 변형기, 예를 들어, PEG일 수 있다. 대표적인 구체예에서, R6 및 R6'는 그것들이 부착되는 탄소와 함께 시알릴산의 피루빌 측쇄의 성분에 부착된다. 추가 대표적인 구체예에서, 피루빌 측쇄는 폴리머 변형기로 기능화된다. 다른 대표적인 구체예에서, R6 및 R6'는 그것들이 부착된 탄소와 함께 시알산의 측쇄의 성분에 부착되고 변형기는 R5의 성분이다.
대표적인 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식을 가지는 글리코실 연결기를 이용한다:
Figure 112009026250918-PCT00040
여기서 J는 글리코실 모이어티이고, L은 결합 또는 링커이고, R1은 변형기, 예를 들어, 폴리머 변형기이다. 대표적인 결합은 글리코실 모이어티 상의 NH2와 변 형기 상의 상보적 반응의 기 사이에 형성된다. 예를 들어, R1이 카르복실산 모이어티를 포함할 때, 이 모이어티는 활성화되고 글리코실 잔기 상의 NH2 모이어티와 커플링되어 구조식 NHC(O)R1을 가지는 결합을 얻는다. J는 바람직하게는 피라노오스 또는 푸라노오스 구조를 절단하는 조건, 예를 들어 산화 조건, 예를 들어, 메타과요오드산나트륨에 노출에 의해 분해되지 않는 "무손상" 글리코실 모이어티이다.
대표적인 링커는 알킬 및 헤테로알킬 모이어티를 포함한다. 링커는 연결기, 예를 들어, 아실계 연결기, 예를 들어, -C(O)NH-, -OC(O)NH- 등을 포함한다. 연결기는 본 발명의 종의 성분간, 예를 들어, 글리코실 모이어티와 링커(L) 사이, 또는 링커와 변형기(R1) 사이에 형성된 결합이다. 다른 대표적 연결기는 에테르, 티오에테르 및 아민이다. 예를 들어, 한 구체예에서, 링커는 글리신 잔기와 같은 아미노산 잔기이다. 글리신의 카르복실산 모이어티는 글리코실 잔기 상의 아민과 반응에 의해 대응하는 아미드로 변환되고, 글리신의 아민은 변형기의 활성화된 카르복실산 또는 카르보네이트와 반응에 의해 대응하는 아미드 또는 우레탄으로 변환된다.
NH-L-R1의 대표적인 종은 하기 화학식을 가진다:
-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1, 여기서 표시 s 및 t는 독립적으로 0 또는 1이다. 표시 a, b 및 d는 독립적으로 0 내지 20의 정수이고, c는 1 내지 2500의 정수이다. 다른 유사한 링커는 -NH 모이어티가 다른 기, 예를 들 어, -S, -O 또는 -CH2로 치환되는 종에 기초한다. 당업자는 표시 s 및 t에 대응하는 하나 이상의 괄호로 묶인 모이어티가 치환된 또는 비치환된 알킬 또는 헤테로알킬 모이어티로 치환될 수 있음을 인식할 것이다.
더 구체적으로, 본 발명은 NH-L-R1이 하기인 화합물을 이용한다:
NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1,
NHC(O)(CH2MOCH2CH2)CO(CH2)CbNHR1, NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1, NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1, NHC(O)(CH2)aNHR1, NH(CH2)aNHR1, 및 NHR1. 이들 화학식에서, 표시 a, b 및 d는 독립적으로 0 내지 20, 바람직하게는 1 내지 5의 정수로부터 선택된다. 표시 c는 1 내지 2500의 정수이다.
대표적인 구체예에서, c는 PEG 모이어티가 대략 1 kD, 5 kD, 10, kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD 또는 45 kD인 것으로 선택된다.
편의의 목적을 위해, 본 섹션의 나머지에서 글리코실 연결기는 시알릴 모이어티를 기초로 할 것이다. 그러나, 당업자는 만노실, 갈락토실, 글루코실, 또는 푸코실과 같은 다른 글리코실 모이어티가 시알릴 모이어티 대신에 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 무손상 글리코실 연결기이고, 연결기를 형성하는 글리코실 모이어티 또는 모이어티들은 화학적(예를 들어, 메타과요 오드산나트륨) 또는 효소적(예를 들어, 옥시다아제) 처리에 의해 분해되지 않는다. 본 발명의 선택된 콘쥬게이트는 아미노-사카라이드, 예를 들어, 만노사민, 글루코사민, 갈락토사민, 시알산 등의 아민 모이어티에 부착되는 변형기를 포함한다. 이 모티브에 따르는 대표적인 변형기-무손상 글리코실 연결기 카세트는 하기 화학식을 가지는 것과 같은 시알산 구조를 기초로한다:
Figure 112009026250918-PCT00041
상기 화학식에서, R1 및 L은 상기 기술되었다. 대표적인 R1 기의 더욱 상세한 구조는 하기 제공된다.
또한 추가의 대표적인 구체예에서, 콘쥬게이트는 펩티드와 변형된 당 사이에 형성되며, 변형기는 변형된 당의 6-탄소 위치에서 링커를 통해 부착된다. 따라서, 본 구체예에 따르는 예시적인 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00042
여기서 라디칼은 상기 논의한 바와 같다. 글리코실 연결기는, 제한 없이, 글루코오스, 글루코사민, N-아세틸-글루코사민, 갈락토오스, 갈락토사민, N-아세틸-갈락토사민, 만노오스, 만노사민, N-아세틸-만노사민 등을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기 글리코실 연결기를 포함하는 펩티드 콘쥬게 이트를 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00043
D는 -OH 및 R1-L-HN-로부터 선택되는 멤버이고; G는 H 및 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되는 멤버이고; R1은 직쇄 또는 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 모이어티이고; L은 링커, 예를 들어, 결합("0 차"), 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬이다. 대표적인 구체예에서, D가OH일 때, G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬일 때, D는 R1-L-NH-이다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기 글리코실 연결기를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00044
D는 -OH 및 R1-L-HN-로부터 선택되는 멤버이고; G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬-R1로부터 선택되는 멤버이고; R1은 직쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기 및 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기로부터 선택되는 멤버를 포함하는 모이어티이고; M은 H, 염 반대이온 및 단일 음전하로부터 선택되는 멤버이고; L은 결합, 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 멤버인 링커이다. 대표적인 구체예에서, D가 OH일 때, G는 R1-L-이다. 다른 대표적인 구체예에서, G가 -C(O)(C1-C6)알킬일 때, D는 R1-L-NH-이다.
본 발명의 어떤 화합물에서, COOH 기는 또 다르게는 COOM이 될 수 있고, M은 H, 음전하, 및 염반대이온으로부터 선택되는 멤버이다.
본 발명은 하기 화학식을 가지는 글리코실 연결기를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00045
D 및 G는 상기 기술한 바와 같다.
다른 구체예에서, 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00046
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고 표시 t는 0 또는 1이다.
또 추가 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00047
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고 표시 t는 0 또는 1이다.
또 다른 구체예에서, 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00048
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고 표시 p는 1 내지 10의 정수를 나타내고; a는 0 또는 1 중의 하나이다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 화학식으로부터 선택되는 글리코실 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00049
Figure 112009026250918-PCT00050
Figure 112009026250918-PCT00051
Figure 112009026250918-PCT00052
Figure 112009026250918-PCT00053
Figure 112009026250918-PCT00054
Figure 112009026250918-PCT00055
Figure 112009026250918-PCT00056
Figure 112009026250918-PCT00057
Figure 112009026250918-PCT00058
Figure 112009026250918-PCT00059
Figure 112009026250918-PCT00060
Figure 112009026250918-PCT00061
표시 a 및 링커 La는 상기 논의되었다. 표시 p는 1 내지 10의 정수이다. 표시 t 및 a는 0 또는 1로부터 독립적으로 선택된다. 각각의 이들 기는 상기 언급된 모노-, 비-, 트리- 및 테트라-안테나 사카라이드 구조의 성분으로서 포함될 수 있다. AA는 펩티드의 아미노산 잔기이다. 당업자는 이들 화학식의 PEG 모이어티가 다른 비반응성기 및 폴리머 모이어티로 치환될 수 있음을 인식할 것이다. 대표적인 폴리머는 폴리(알킬렌 옥시드) 패밀리의 그것을 포함한다. 비반응성기는 생리적 pH에서 필수적으로 비반응성, 중성 및/또는 안정한 것으로 생각되는 기들, 예를 들어, H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 등을 포함한다. 대표적인 폴리머 모이어티는 화학식 IIIa 및 그것의 표본에서 앞서 설명한 분지된 구조를 포함한다.
대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 약 20 kD의 분자량을 가진다. 다른 대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 약 5 kD의 분자량을 가진다. 다른 대표적인 구 체예에서, PEG 모이어티는 약 10 kD의 분자량을 가진다. 다른 대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 약 40 kD의 분자량을 가진다. 다른 구체예에서, 변형기는 적어도 약 80 kD, 바람직하게는 적어도 약 100 kD, 더 바람직하게는 적어도 약 120 kD, 적어도 약 140 kD 또는 적어도 약 160 kD의 분자량을 가지는 분지된 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 또 다른 구체예에서, 분지된 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)은 적어도 약 200 kD, 예로써, 적어도 약 160 kD 및 적어도 약 180 kD을 포함하는 적어도 약 80 kD 내지 적어도 약 200 kD이다. 대표적인 구체예에서, 분지된 폴리머는 분지 모이어티(예를 들어, 시스테인, 세린, 리신 및 리신의 올리고머)에 그 자신이 부착된다.
대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 시스테인 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-10 kD 모이어티이고, 1 또는 2개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 다른 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 리신 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-10 kD 모이어티이고, 하나 또는 둘의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 시스테인 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-10 kD 모이어티이고, 1 또는 2개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 리신 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-10 kD 모이어티이고, 1 또는 2개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 시스테인 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-5 kD 모이어티이고, 1, 2 또는 3개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글 리코실 연결기는 리신 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-5 kD 모이어티이고, 1, 2 또는 3개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 시스테인 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-40 kD 모이어티이고, 1, 2 또는 3개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 시스테인 잔기에 기초한 분지된 SA-PEG-40 kD 모이어티이고, 1, 2 또는 3개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 화학식으로부터 글리코실 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00062
적어도 하나의 R2, R3, R4, R5 또는 R6는 하기로부터 선택되는 멤버인 구조이고,
Figure 112009026250918-PCT00063
변수는 상기 기술한 바와 같다. 당업자는 상기 언급한 분지된 PEG에 의존이 도시의 명료함을 간결하게 하며, 본원에서 발견된 "폴리머 모이어티"의 정의에서 언급한 이들 종의 제한 없이 포함하여 PEG가 실질적으로 어떤 폴리머 모이어티로 치환될 수 있음을 인식할 것이다.
대표적인 구체예에서, 적어도 하나의 R2, R3, R4, R5 또는 R6는 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00064
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 -OH 및 -OCH3로부터 각각 선택된다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00065
대표적인 구체예에서, 단지 하나의 R2, R3, R4, R5 또는 R6는 상기 기술된 변형기를 포함하는 구조를 가진다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 화학식으로부터 선택되는 글리코실 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00066
R2, R3, R4, R5 또는 R6는 상기 기술한 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 화학식으로부터 선택되는 글리코실 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00067
Figure 112009026250918-PCT00068
L-(R1)w는 하기로부터 선택되는 멤버이고,
Figure 112009026250918-PCT00069
변수는 상기 기술된 바와 같다.
대표적인 구체예에서, L-(R1)w는 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00070
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3로부터 선택된다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00071
대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 1000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 70, 약 70 내지 약 150, 약 150 내지 약 250, 약 250 내지 약 375 및 약 375 내지 약 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 10 내지 약 35, 약 45 내지 약 65, 약 95 내지 약 130, 약 210 내지 약 240, 약 310 내지 약 370 및 약 420 내지 약 480으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 15 내지 약 30으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 50 내지 약 65로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 100 내지 약 130으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 210 내지 약 240으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 310 내지 약 370으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 430 내지 약 470으로부터 선택되는 정수이다.
다른 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 화학식으로부터 선택되는 글리코실 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00072
변수는 상기 기술된 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 구체예에 따르는 종은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00073
Figure 112009026250918-PCT00074
변수는 상기 논의된 바와 같다.
대표적인 구체예에서, 본 발명의 글리코페길화된 펩티드 콘쥬게이트는 하기 언급된 화학식으로부터 선택된다:
Figure 112009026250918-PCT00075
변수는 상기 기술된 바와 같다.
상기 화학식에서, 지수 t는 0 내지 1의 정수이고 지수 p는 1 내지 10의 정수이다. 기호 R15'는 H, OH (예를 들어, Gal-OH), 시알릴 모이어티, 시알릴 연결기 (즉, 시알릴 연결기-폴리머 변형기 (Sia-L-R1), 또는 폴리머 변형된 시알릴 모이어 티(예를 들어, Sia-Sia-L-R1) ("Sia-Siap")), 갈락토사미닐 모이어티, 갈락토실 연결기 (즉, 갈락토실 연결기-폴리머 변형기(Gal-L-R1), 또는 폴리머 변형된 갈락토실 모이어티에 결합된 시알릴 모이어티(예를 들어, Sia-Gal-L-R1) ("Sia-Galp")), 갈락토실 모이어티, 갈락토사미닐 연결기(즉, 갈락토사미닐 연결기-폴리머 변형기(GalNAc-L-R1), 또는 폴리머 변형된 갈락토사미닐 모이어티에 결합되는 시알릴 모이어티 (예를 들어, Sia-GalNAc-L-R1) ("Sia-GalNAcp")), 글루코실 모이어티, 글루코실 연결기(즉, 글루코실 연결기-폴리머 변형기(Glc-L-R1), 또는 폴리머 변형된 글루코실 모이어티에 결합되는 시알릴 모이어티(예를 들어, Sia-Glc-L-R1) ("Sia-Glcp")), 글루코사미닐 모이어티, 글루코사미닐 연결기(즉, 글루코사미닐 연결기-폴리머 변형기(GlcNAc-L-R1)에 결합되는, 또는 폴리머 변형된 글루코사미닐 모이어티(예를 들어, Sia-GlcNAc-L-R1) ("Sia-GlcNAcp")), 만노실 모이어티, 만노실 연결기(즉, 만노실 연결기-폴리머 변형기 (Man-L-R1)에 결합된 시알릴 모이어티, 또는 폴리머 변형된 만노실 모이어티 (예를 들어, Sia-Man-L-R1) ("Sia-Manp")), 푸코실 모이어티, 푸코실 연결기 (즉, 푸코실 연결기-폴리머 변형기(Fuc-L-R1), 폴리머 변형된 푸코실 모이어티에 결합된 시알릴 모이어티(예를 들어, Sia-Fuc-L-R1) ("Sia- Fucp"))를 나타낸다. 대표적인 폴리머 변형된 사카릴 모이어티는 화학식 I, Ia, II 또는 IIa에 따르는 구조를 가진다. 본 발명의 대표적인 펩티드 콘쥬게이트는 화학식 I, Ia, II 및 IIa에 따르는 구조를 포함하는 R15'를 가지는 적어도 하나의 글리칸을 포함할 것이다. 화학식 I, Ia, II 또는 IIa의 임의의 가능한 원자가를 가지는 산소는 바람직하게는 Gal 또는 GalNAc 모이어티의 탄소에 글리코시드 결합을 통해 부착된다. 추가 대표적인 구체예에서, 산소는 갈락토오스 잔기의 위치 3에서 탄소에 부착된다. 대표적인 구체예에서, 변형된 시알산은 연결된 α2,3-갈락토오스 잔기이고, 시알산은 연결된 α2,6-갈락토오스 잔기이다.
대표적인 구체예에서, 시알릴 연결기는 폴리머 변형된 시알릴 모이어티(예를 들어, Sia-Sia-L-R1) ("Sia-Siap")에 결합되는 시알릴 모이어티이다. 여기서, 글리코실 연결기는 시알릴 모이어티를 통해 갈락토실 모이어티에 연결된다:
Figure 112009026250918-PCT00076
.
이 모티프에 따르는 대표적인 종은 Sia-Sia 결합, 예를 들어, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III 및 ST8Sia-IV를 형성하는 효소를 사용하는 글리칸의 말단 시알산에 Sia-L-R1을 콘쥬게이트함으로써 제조된다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트 상의 글리칸은 하기 군으로부터 선택되는 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00077
및 그것의 조합.
각각의 상기 화학식에서, R15'는 상기 논의한 바와 같다. 게다가, 본 발명의 대표적인 펩티드 콘쥬게이트는 화학식 I, Ia, II 또는 IIa에 따르는 구조를 가지는 R15 모이어티를 가지는 적어도 하나의 글리칸을 포함할 것이다.
다른 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가지는 적어도 하나의 글리코실 연결기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00078
여기서 R15는 상기 시알릴 연결기이고; 지수 p는 1 내지 10으로부터 선택되는 정수이다.
대표적인 구체예에서, 글리코실 연결 모이어티는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00079
b는 0 내지 1의 정수이다. 지수 s는 1 내지 10의 정수를 나타내고; 지수 f는 1 내지 2500의 정수를 나타낸다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 PEG이다. 다른 대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 약 20 kD의 분자량을 가진다. 다른 대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 약 5 kD의 분자량을 가진다. 다른 대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 약 10 kD의 분자량을 가진다. 다른 대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 약 40 kD의 분자량을 가진다. 다른 구체예에서, 변형기는 적어도 약 80 kD, 바람직하게는 적어도 약 100 kD, 더 바람직하게는 적어도 약 120 kD, 적어도 약 140 kD 또는 적어도 약 160 kD 및 적어도 약 180 kD의 분자량을 가지는 분지된 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)이다.
대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 선형 SA-PEG-10 kD 모이어티이고, 1 또는 2개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 다른 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 선형 SA-PEG-20 kD 모이어티이고, 1 또는 2개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 선형 SA-PEG-5 kD 모이어티이고, 1 또는 2개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 SA-PEG-40 kD 모이어티이고, 1 또는 2개의 이들 글리코실 연결기는 펩티드에 공유적으로 부착된다.
다른 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가지는 시알릴 연결기이다:
Figure 112009026250918-PCT00080
다른 대표적인 구체예에서, Q는 H 및 CH3로부터 선택되는 멤버이다. 다른 대표적인 구체예에서, 상기 글리코실 연결기는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00081
상기식에서, R15는 시알릴 연결기이고; 지수 p는 1 내지 10으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 글리코실 연결기는 하기 화학식을 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00082
상기식에서, 지수 b는 0 내지 1로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 지수 s는 1이고; 지수 f는 약 200 내지 약 300으로부터 선택되는 정수이다.
II . D. 변형기
본 발명의 펩티드 콘쥬게이트는 변형기를 포함한다. 이 기는 아미노산 또는 글리코실기를 통해 펩티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 다른 대표적인 구체예에서, 변형기가 하기 모이어티를 포함할 때:
Figure 112009026250918-PCT00083
펩티드 콘쥬게이트 내 펩티드가 도 7의 펩티드로부터 선택된다. 다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트 중 펩티드는 뼈 형성 단백질(예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15), 뉴로트로핀(예를 들어, NT-3, NT-4, NT-5), 성장 분화 인자(예를 들어, GDF-5), 신경아교세포계-유래 신경영양 인자(GDNF), 뇌유인성 신경영양인자(BDNF), 신경성장인자(NGF), 폰 빌리브란트 인자(vWF) 프로테아제, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, B-도메인 결실 인자 VIII, 전장 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, B-도메인 결실 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, 에리스로포이에틴(EPO), 과립구 대식세포 집락 자극인자(G-CSF), 과립백혈구생성자극인자(GM-CSF) 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, α1-항트립신(ATT, 또는 α-1 프로테아제 억제제), 글루코세레브로시데이즈, 조직형 플라스미노겐 활성제(TPA), 인터류킨-2 (IL-2), 유로키나제, 인간 DNase, 인슐린, B형간염표면단백질 (HbsAg), 인간 성장 호르몬, TNF 수용체-IgG Fc 영역 융합 단백질(EnbrelTM), 항-HER2 단일클론항체 (Herceptin™), 호 흡기세포융합바이러스의 단백질 F에 대한 단일클론항체 (Synagis™), TNF-α에 대한 단일클론항체 (Remicade™), 글리코단백질 IIb/IIIa에 대한 단일클론항체 (Reopro™), CD20에 대한 단일클론항체 (Rituxan™), 항-트롬빈 III (AT III), 인체 융모 성선호르몬(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazyme™), 알파-이두로니다아제(Aldurazyme™), 여포자극호르몬, 베타-글루코시다아제, 항-TNF-알파 단일클론항체, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2), 베타-글루코시다아제, 알파-갈락토시다아제 A 및 섬유아세포성장인자로부터 선택되는 멤버이다. "변형기"는 표적 모이어티, 치료 모이어티, 생분자를 포함하는 다양한 구조를 포함할 수 있다. 추가적으로, "변형기"는 그것의 생체이용률 또는 그것의 신체내 반감기와 같은 펩티드의 특성을 변형할 수 있는 폴리머인 폴리머 변형기를 포함한다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함하는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00084
및
Figure 112009026250918-PCT00085
상기 화학식에 따르는 다른 대포적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00086
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 -OH 및 -OCH3로부터 선택되는 각 멤버이다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00087
및
Figure 112009026250918-PCT00088
편의를 위해, 본 섹션의 나머지에서 변형기는 수용성 및 수불용성 폴리머와 같은 폴리머 변형기를 크게 기초로 할 것이다. 그러나, 당업자는 표적 모이어티, 치료 모이어티 및 생분자와 같은 기타 변형기가 폴리머 변형기 대신 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 게다가, 당업자는 상기 언급한 분지된 PEG 구조에 따라서 간단하게 예시의 명확함을 인식할 것이고, 본원에서 발견한 "폴리머 모이어티"의 정의에서 상기 언급한 이들 종을 제한하는 것 없이 포함하여, PEG는 실질적으로 어떤 폴리머 모이어티로 치환될 수 있다.
II . D. i 변형기의 링커
변형기의 링커는 펩티드에 변형기(즉, 폴리머 변형기, 표적 모이어티, 치료 모이어티 및 생분자)를 부착하는데 도움을 준다. 대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 글리코실 연결기에 결합되며, 일반적으로 예를 들어, 하기 나타내는 바와 같은 링커, L을 통해 코어 상에서, 헤테로원자, 예를 들어, 질소를 통해 일반적으로 글리코실 연결기에 결합된다:
Figure 112009026250918-PCT00089
.
R1은 폴리머 모이어티이고, L은 결합 및 연결기로부터 선택된다. 지수 w는 1-6, 바람직하게는 1-3 및 더 바람직하게는 1-2로부터 선택되는 정수를 나타낸다. 대표적인 연결기는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 모이어티 및 시알산을 포함한다. 링커의 대표적인 성분은 아실 모이어티이다.
본 발명에 따르는 대표적인 화합물은 상기 화학식 I, Ia, II 또는 IIa에 따르는 구조를 가지며, 적어도 하나의 R2, R3, R4, R5, R6 또는 R6'는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00090
본 구체예에 따르는 다른 예에서, 적어도 하나의 R2, R3, R4, R5, R6 또는 R6'은 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00091
s는 0 내지 20의 정수이고, R1은 선형 폴리머 변형 모이어티이다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기-선형 구조체는 중앙 모이어티에 부착된 2 이상의 폴리머 사슬을 포함하는 분지된 구조이다. 이 구체예에서, 구조는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00092
R1 및 L은 상기 논의한 바와 같고, w'는 2 내지 6, 바람직하게는 2 내지 4 및 더 바람직하게는 2 내지 3의 정수이다.
L이 결합일 때, 이는 R1의 전구체 상의 반응성 작용기와 사카릴 코어 상의 상보적 반응의 반응성 작용기 사이에서 형성된다. L이 0차가 아닌 링커일 때, L의 전구체는 R1 전구체와 반응 전 적당한 글리코실 모이어티에 있을 수 있다. 또 다르게는, R1 및 L의 전구체는 이후에 글리코실 모이어티에 부착되는 미리 형성된 카세트에 포함될 수 있다. 본원에 설명된 바와 같은, 적절한 반응성 작용기를 가지는 전구체의 선택 및 제조는 당업자의 능력 내이다. 게다가, 전구체 커플링은 당업계에서 이해되는 화학으로써 처리된다.
대표적인 구체예에서, L은 아미노산, 또는 소 펩티드(예를 들어, 1-4개의 아미노산 잔기)로부터 형성되는 연결기이며, 폴리머 변형기는 치환된 알킬 링커를 통해 부착되는 변형된 당을 제공한다. 대표적인 링커는 글리신, 리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. PEG 모이어티는 아미드 또는 우레탄 결합을 통해 링커의 아민 모이어티에 부착될 수 있다. PEG는 티오에테르 또는 에테르 결합을 통해 각각 시스테 인 및 세린의 황 또는 산소 원자에 결합된다.
대표적인 구체예에서, R5는 폴리머 변형기를 포함한다. 다른 대표적인 구체예에서, R5는 폴리머 변형기와 링커를 둘 다 포함하고, 분자의 나머지에 변형기를 결합시킨다. 상기 논의된 바와 같이, L은 선형 또는 분지된 구조일 수 있다. 유사하게, 폴리머 변형기는 분지형 또는 선형일 수 있다.
II . D. H. 수용성 폴리머
다수의 수용성 폴리머가 당업자에게 공지되어 있으며 본 발명의 실시에 유용하다. 용어 수용성 폴리머는 사카라이드(예를 들어, 덱스트란, 아밀로오스, 히알루론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 폴리머 (예를 들어, 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜); 펩티드, 단백질 등과 같은 종을 포함한다. 본 발명은 폴리머가 콘쥬게이트의 나머지에서 부착될 수 있는 지점을 포함해야 하는 단 하나의 제한을 가지는 어떤 수용성 폴리머로 실행될 수 있다.
폴리머의 활성을 위한 방법은 또한 WO 94/17039, 미국특허번호 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국특허번호 5,219,564, 미국특허번호 5,122,614, WO 90/13540, 미국특허번호 5,281,698, 및 WO 93/15189에서 발결될 수 있고, 활성화된 폴리머와 펩티드 사이의 콘쥬게이션, 예를 들어, 콘쥬게이션 인자 VIII (WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미국특허번호 4,412,989), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제(Veronese at al , App . Biochem . Biotech. 11: 141-45 (1985))에서 발견될 수 있다.
대표적인 수용성 폴리머는 폴리머의 샘플 내 폴리머 분자의 실질적인 부분이 대략 동일한 분자량인 것이며; 이러한 폴리머는 "단일 분산성(homodisperse)"이다.
본 발명은 폴리(에틸렌 글리콜) 콘쥬게이트에 참고로써 추가로 예시된다. PEG의 기능화와 콘쥬게이션에서 몇몇의 검토와 모노그래프가 이용가능하다. 예를 들어, Harris, Macronol . Chem . Phys . C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al ., Enzyme Microb . Technol . 14: 866-874 (1992); Delgado et al ., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995); 및 Bhadra, et al, Pharmazie, 57:5-29 (2002) 참조. 반응성 PEG 분자를 제조하고 반응성 분자를 사용하여 콘쥬게이트를 형성하기 위한 루트는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,672,662는 선형 또는 분지형 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 및 폴리(아크릴로모르폴린)으로부터 선택되는 폴리머산의 활성 에스테르의 수용성 및 불용성 콘쥬게이트를 개시한다.
미국 특허 번호 6,376,604는 유기 용매 중 폴리머의 말단 히드록실과 디(1-벤조트리아조일)카르보네이트의 반응에 의해 수용성 및 비펩티드성 폴리머의 수용성 1-벤조트리아졸릴카르보네이트 에스테르를 제조하기 위한 방법을 설명한다. 활성 에스테르는 단백질 또는 펩티드와 같은 생물학적으로 활성인 약제와 콘쥬게이트를 형성하기 위해 사용된다.
WO 99/45964는 생물학적으로 활성인 약제를 포함하는 콘쥬게이트와 안정한 연결을 통해 폴리머 백본에 연결되는 적어도 하나의 말단을 가지는 폴리머 백본을 포함하는 활성화된 수용성 폴리머를 기술하며, 적어도 하나의 말단은 분지 모이어티에 연결된 말단 반응성기를 가지는 분지 모이어티를 포함하고, 생물학적으로 활성인 약제는 적어도 하나의 말단 반응기에 연결된다. 다른 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)은 WO 96/21469에서 개시되며, 미국 특허 번호 5,932,462는 반응성 작용기를 포함하는 분지된 말단을 포함하는 분지된 PEG 분자와 함께 형성된 콘쥬게이트를 기술한다. 무 반응성기는 생물학적으로 활성인 종, 예로써 단백질 또는 펩티드와 반응하여 이용가능하며, 폴리(에틸렌 글리콜)과 생물학적으로 활성인 종 사이에 콘쥬게이트를 형성한다. 미국 특허 No. 5,446,090은 각각의 PEG 링커 말단에서 펩티드를 가지는 콘쥬게이트를 형성하는데 2 기능의 PEG 링커 및 그것의 사용을 기술한다.
분해가능한 PEG 연결을 포함하는 콘쥬게이트는 WO 99/34833; 및 WO 99/14259, 및 미국 특허 번호 6,348,558에서 기술된다. 이러한 분해가능한 연결은 본 발명에 적용가능하다.
상기 설명한 폴리머 활성화의 당업계에 인식된 방법은 본원에 설명된 분지된 폴리머의 형성 중 본 발명에서 사용되며 또한 다른 종들, 예를 들어, 당, 당 뉴클레오티드 등에 이들 분지된 폴리머의 콘쥬게이션을 위한 사용이다.
대표적인 수용성 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)이다. 본 발명에 사용된 폴리(에틸렌 글리콜)은 어떤 특정 형태 또는 분자량 범위에 제한되지 않는다. 비분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 대해 분자량은 바람직하게는 500 내지 100,000이다. 2000-60,000의 분자량이 바람직하게 사용되고 더 바람직하게는 약 5,000 내지 약 40,000이다.
II . D. iii . 분지된 수용성 폴리머
다른 구체예에서, 폴리머 변형 모이어티는 하나 이상의 선형 또는 분지된 부착된 PEG 모이어티를 가지는 분지된 PEG 구조이다. 분지된 PEG의 예는 미국 특허 번호 5,932,462; 미국 특허 번호 5,342,940; 미국 특허 번호 5,643,575;미국 특허 번호 5,919,455; 미국 특허 번호 6,113,906; 미국 특허 번호 5,183,660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); 및 Yamasaki et al, Agric. Biol Chem., 52: 2125-2127, 1998에 기술된다.
대표적인 폴리머 변형 모이어티는 아미노산, 예를 들어, 세린, 시스테인, 리신 및 소 펩티드, 예를 들어, lys-lys을 함유하는 측쇄를 기초로 하는 구조를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리머 변형 모이어티는 올리고-펩티드, 예로써 트리-리신 펩티드를 기초로 하는 분지된 PEG 모이어티이다. 사용에 적당한 대표적인 아미노산은 리신, 시스테인, 및 세린을 포함한다. 이러한 구체예에서, 펩티드 구조에 부착되는 각 폴리머 서브유닛은 선형 PEG 모이어티 또는 분지된 PEG 모이어티 중 하나 일 수 있다. 예를 들어, 트리-리신은 선형 PEG 모이어티, 분지된 PEG 모이어티 또는 선형과 분지된 PEG 모이어티의 조합과 함께 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라-페길화될 수 있다. 대표적인 분지된 구조는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00093
당업자들은 디-리신 구조 중 자유 아민은 선형 PEG 모이어티 또는 분지된 PEG 모이어티 중 하나와 아미드 또는 우레탄 결합을 통해 페길화될 수 있음을 인식할 것이다.
상기 나타낸 선형 PEG 구조에 더하여, 앞의 섹션에서 예시된 분지된 폴리머는 하나 이상의 선형 PEG 구조 대신에 분지 모이어티(예를 들어, 시스테인, 세린, 리신 및 리신의 올리고머)에 부착될 수 있음이 당업자들에 의해 인식될 것이다. 게 다가, 상기 설명한 PEG 구조에 따라서 도시의 명확함이 간결하게 됨을 당업자들은 인식할 것이며, PEG는 실질적으로 본원에서 발견되는 "폴리머 모이어티"의 정의에서 설명된 종들의 제한 없이 포함하는 어떤 폴리머 모이어티로 치환될 수 있다.
PEG의 어떤 분자량, 예를 들어, 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD 및 45 kD는 본 발명에서의 사용이다. PEG의 더 큰 분자량은 또한 약 200 kD, 예로써 적어도 약 180 kD, 약 160 kD, 약 140 kD, 약 120 kD, 약 100 kD, 약 90 kD, 약 80 kD, 및 약 70 kD을 포함하여 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, PEG의 분자량은 약 80 kD이다. 다른 구체예에서, PEG의 분자량은 적어도 약 200 kD, 적어도 약 180 kD, 적어도 약 160 kD, 또는 적어도 약 140 kD이다.
분지된 폴리머 변형 모이어티의 각 PEG 모이어티는 상기 정의된 분자량을 가질 수 있고 또는 폴리머 변형 모이어티의 모든 PEG 모이어티의 총 분자량은 상기 정의된 바와 같다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분지된 폴리머 변형 모이어티의 각 PEG 모이어티는 약 80 kD일 수 있고 폴리머 변형 모이어티의 모든 PEG 모이어티의 총 분자량은 약 80 kD일 수 있다. 마찬가지로, 특정 구체예에서, 분지된 폴리머 변형 모이어티의 각 PEG 모이어티는 약 200 kD일 수 있고, 폴리머 변형 모이어티의 모든 PEG 모이어티의 총 분자량은 약 200 kD일 수 있다.
본 발명에 따르는 대표적인 종들은 하기 화학식을 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00094
여기서 표시 e, f 및 f'는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; 표시 q, q' 및 q"는 1 내지 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
당업자에게 명백하게 되는 바와 같이, 본 발명에서 분지된 폴리머의 사용은 상기 언급된 테마에서의 변형을 포함한다. 예를 들어, 상기 나타낸 디-리신-PEG 콘쥬게이트는 3개의 폴리머 서브유닛을 포함할 수 있고, 세번째는 상기 구조에서 변형되지 않은 것으로 나타난 α-아민에 결합된다. 유사하게, 요망되는 방식에서 폴리머 변형 모이어티로 표지된 3 또는 4개의 폴리머 서브유닛으로 기능화된 트리-리신의 사용은 본 발명의 범주 내이다.
본원에서 논의되는, 본 발명의 콘쥬게이트에서 사용되는 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 본 발명의 이 구체예에 따르는 펩티드 콘쥬게이트를 함유하는 분지된 PEG를 형성하기 위해 사용되는 대표적인 전구체는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00095
본 발명의 이 구체예에 따르는 펩티드 콘쥬게이트를 함유하는 분지된 PEG를 형성하기 위해 사용되는 다른 대표적인 전구체는 하기 화학식을 가진다:
(화학식 IIIa)
Figure 112009026250918-PCT00096
본 화학식에 따르는 분지된 폴리머 종은 본질적으로 순수한 수용성 폴리머이다. X3'는 이온화될 수 있는(예를 들어, OH, COOH, H2PO4, HSO3, HPO3, 및 그것의 염 등) 또는 기타 반응성 작용기, 예를 들어, 하기를 포함하는 모이어티이다. C는 탄소이다. X5, R16 및 R17은 비반응성 기 및 폴리머 모이어티(예를 들어, 폴리(알킬렌 옥시드), 예를 들어, PEG)로부터 독립적으로 선택된다. 비반응성 기는 본질적으로 생리적 pH에서 비반응성, 중성 및/또는 안정한 것으로 고려되는 기, 예를 들어, H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 등을 포함한다. 대표적인 폴리머 모이어티는 화학식 IIIa 및 그것의 표본에서 설명한 분지된 구조를 포함한다. 당업자는 이들 화학식에서 PEG 모이어티가 다른 폴리머로 치환될 수 있음을 인식할 것이다. 대표적인 폴리머는 폴리(알킬렌 옥시드) 패밀리, (예를 들어, H, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬) 및 폴리머 암(예, PEG)의 그것을 포함한다. X2 및 X4는 생리적 조건하에서 바람직하게는 본질적으로 비-반응성인 연결 부분이며, 이는 동일할 수도 또는 다를 수도 있다. 대표적인 링커는 방향족도 에스테르도 아닌 모이어티를 포함한다. 또 다르게는, 이들 연결은 생리적으로 적절한 조건하에서 분해되도록 계획되는 하나 이상의 모이어티, 예를 들어, 에스테르, 디술피드 등을 포함할 수 있다. X2 및 X4는 C에 폴리머 암 R16 및 R17을 결합시킨다. X3'가 링커, 당 또는 링커-당 카세트 상의 상보적 반응성의 반응성 작용기와 반응할 때, X3'는 연결 부분 X3의 성분으로 변환된다.
X2, X3 및 X4에 대한 대표적인 연결 부분은 독립적으로 선택되고 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(O)O, 및 OC(O)NH, CH2S, CH2O, CH2CH2O, CH2CH2S, (CH2)o0, (CH2)oS 또는 (CH2)oY'-PEG을 포함하고, 여기서, Y'는 S, NH, NHC(O), C(O)NH, NHC(O)O, OC(O)NH, 또는 O이고 o는 1 내지 50의 정수이다. 대표적인 구체예에서, 연결 부분 X2 및 X4는 다른 연결 부분이다.
대표적인 구체예에서, 전구체(화학식 III) 또는 그것의 활성화된 유도체는 반응하여, X3'와 당 모이어티 상의 상보적 반응성의 기, 예를 들어, 아민 사이의 반 응을 통해 활성화된 당 또는 당 뉴클레오티드에 결합된다. 또 다르게는, X3'은 링커 L에 전구체 상의 반응성 작용기와 반응한다. 하나 이상의 R2, R3, R4, R5, R6 또는 R6'의 화학식 I, Ia, II 또는 IIa은 분지된 폴리머 변형 모이어티, 또는 L을 통해 결합된 이 모이어티를 포함할 수 있다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함하는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00097
및
Figure 112009026250918-PCT00098
상기 화학식에 따르는 다른 대표적인 구체예에서, 분지된 폴리머는 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00099
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 -OH 및 -OCH3로부터 각각 선택된다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00100
및
Figure 112009026250918-PCT00101
.
대표적인 구체예에서, 모이어티
Figure 112009026250918-PCT00102
는 링커 암, L이다. 본 구체예에서, 대표적인 링커는 천연 또는 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 또는 아미노산 모방체, 또는 하나 이상의 이러한 종들로부터 형성된 소펩티드로부터 유도된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물에서 발견된 특정 분지된 폴리머는 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00103
Xa는 당 모이어티 상의 분지된 폴리머 변형 모이어티와 반응성 작용기의 전구체 또는 링커에 대한 전구체 상의 반응성 작용기, 예를 들어, X3'의 반응에 의해 형성되는 연결 부분이다. 예를 들어, X3'가 카르복실산일 때, 이는 활성화될 수 있 고 아미노-사카라이드(예를 들어, Sia, GalNH2, GlcNH2, ManNH2 등)로부터 현수된 아미노기에 직접 결합되어 아미드인 Xa를 형성한다. 추가의 대표적인 반응성 작용기 및 활성화된 전구체는 본원에서 하기에 기술된다. 지수 c는 1 내지 10의 정수를 나타낸다. 기타 기호는 상기 논의한 것과 동일하다.
다른 대표적인 구체예에서, Xa는 다른 링커와 함께 형성된 링킹 모이어티이다:
Figure 112009026250918-PCT00104
여기서, Xb는 제 2 연결 부분이고, Xa에 대해 설명된 기들로부터 독립적으로 선택되고, L과 유사하게, L1은 결합, 치환된 또는 비치환된 알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬이다.
Xa 및 Xb에 대한 대표적인 종들은 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), C(O)NH 및 NHC(O)O, 및 OC(O)NH를 포함한다.
다른 대표적인 구체예에서, X4는 R17에 대한 펩티드 결합이며, 이는 알파-아민 모이어티(들) 및/또는 측쇄 헤테로원자(들)이 폴리머 변형 모이어티와 함께 변형되는 아미노산, 디-펩티드(예를 들어, Lys-Lys) 또는 트리-펩티드(예를 들어, Lys-Lys-Lys)이다.
추가 대표적인 구체예에서, 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트는 하기로부터 선택 되는 화학식을 가지는 모이어티, 예를 들어, R15 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00105
Figure 112009026250918-PCT00106
Figure 112009026250918-PCT00107
다양한 기호로 나타내는 라디칼의 동일성은 본원에서 상기 논의된 것과 동일하다. La는 결합 또는 L 및 L1에 대해 상기 논의한 바와 같은 링커, 예를 들어, 치환된 또는 비치환된 알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 모이어티이다. 대표적인 구체예에서, La는 나타낸 폴리머 변형 모이어티와 함께 기능화되는 시알산의 측쇄의 모이어티이다. 대표적인 La 모이어티는 하나 이상의 OH 또는 NH2를 포함하는 치환된 또는 비치환된 알킬 사슬을 포함한다.
이제 다른 대표적인 구체예에서, 본 발명은 모이어티, 예를 들어, 하기 화학식을 가지는 R15 모이어티를 가지는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00108
; 및
Figure 112009026250918-PCT00109
다양한 기호로 나타내는 라디칼의 동일성은 상기 논의한 바와 같다. 당업자가 인식할 바와 같이, 화학식 VIII 및 IX의 링커 암은 본원에 설명된 다른 변형된 당에 동일하게 적용가능하다. 대표적인 구체예에서, 화학식 VIII 및 IX의 종들은 본원에 설명된 글리칸 구조에 부착되는 R15 모이어티이다.
또 다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가지는 R15모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00110
라디칼의 동일성은 상기 논의한 바와 같다. La에 대한 대표적인 종은 -(CH2)jC(O)NH(CH2)HC(O)NH-이고, 표시 h 및 j는 0 내지 10으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 추가 대표적인 종은 -C(O)NH-이다. 표시 m 및 n은 0 내지 5000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 및 A11은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, -NA12A13, -OA12 및 -SiA12A13으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. A12 및 A13은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 및 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다.
상기 설명한 본 발명의 구체예는 폴리머가 수용성 폴리머, 특히 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG"), 예를 들어, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)인 종에 대한 참고로써 추가로 예시된다. 당업자는 하기는 도시의 명확함을 위한 것이며 대표적인 폴리머로서 PEG를 사용하여 설명한 다양한 모티프가 PEG 이외의 폴리머가 이용되는 종에 동일하게 적용가능함을 섹션 내 논점에서 인식할 것이다.
대표적인 구체예에서, R15 모이어티는 하기 군으로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00111
각각의 상기 구조에서, 링커 부분 -NH(CH2)a-는 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 군으로부터 선택되는 R15 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00112
각각의 상기 화학식에서, 표시 e 및 f는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 추가 대표적인 구체예에서, e 및 f는 약 1 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 40 kD 및 45 kD인 PEG 모이어티를 제공하도록 선택된다. PEG의 더 큰 분자량은 또한 약 200 kD 이하로, 예로써 적어도 약 180 kD, 약 160 kD, 약 140 kD, 약 120 kD, 약 100 kD, 약 90 kD, 약 80 kD, 및 약 70 kD을 포함하여 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, PEG의 분자량은 약 80 kD이다. 다른 구체예에서, PEG의 분자량은 적어도 약 200 kD, 적어도 약 180 kD, 적어도 약 160 kD, or 적어도 약 140 kD이다. 기호 Q는 치환된 또는 비치환된 알킬 (예를 들어, C1-C6 알킬, 예를 들어, 메틸), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬 또는 H를 나타낸다.
다른 분지된 폴리머는 디-리신(Lys-Lys) 펩티드, 예를 들어
Figure 112009026250918-PCT00113
및 트리-리신 펩티드(Lys-Lys-Lys), 예를 들어:
Figure 112009026250918-PCT00114
를 기초로 한 구조를 가진다.
각각의 상기 그림에서, 표시 e, f, f' 및 f"는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수를 나타낸다. 표시 q, q' 및 q"는 1 내지 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수를 나타낸다. 상기 보여진 선형 PEG 구조에 더하여 앞의 섹션에 예시되는 분지된 폴리머는 또한 하나 이상의 선형 PEG 구조 대신 분지 모이어티(예를 들어, 리신 및 리신의 올리고머)에 부착될 수 있다
다른 대표적인 구체예에서, 변형기는:
Figure 112009026250918-PCT00115
하기로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00116
Q는 H 및 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되는 멤버이다. 표시 e 및 f는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, 표시 q는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 변형기는:
Figure 112009026250918-PCT00117
하기 군으로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00118
Q는 H 및 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되는 멤버이다. 표시 e, f 및 f'는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고, q 및 q'는 1 내지 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 분지된 폴리머는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함하는 구조를 가진다:
(화학식 IIIa)
Figure 112009026250918-PCT00119
표시 m 및 n은 0 내지 5000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 및 A11은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, -NA12A13, -OA12 및 -SiA12A13으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다. A12 및 A13은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 및 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다.
화학식 IIIa는 화학식 III의 서브세트이다. 화학식 IIIa으로 묘사되는 구조는 또한 화학식 III에 포함된다.
대표적인 구체예에서, 폴리머 변형기는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함하는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00120
; 및
Figure 112009026250918-PCT00121
상기 화학식에 따르는 다른 대표적인 구체예에서, 분지된 폴리머는 하기 화학식에 따르는 모이어티를 포함하는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00122
.
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 -OH 및 -OCH3으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기의 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00123
및
Figure 112009026250918-PCT00124
변수는 상기 기술한 바와 같다.
예시적인 구체예에서, 변형된 당은 시알산이며 본 발명에 사용되는 선택된 변형된 당 화합물은 하기의 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00125
표시 a, b 및 d는 0 내지 20의 정수이다. 표시 c는 1 내지 2500의 정수이다.
상기 설명한 구조는 R15의 성분일 수 있다.
다른 예시적인 구체예에서, 당의 1차 히드록실 모이어티는 변형기와 함께 기능화된다. 예를 들어, 9-히드록실의 시알산은 대응하는 아민으로 변환되고 기능화되어 본 발명에 따르는 화합물을 제공할 수 있다. 본 구체예에 따르는 화학식은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00126
상기 설명한 구조는 R15의 성분일 수 있다.
본 발명이 PEG에 대한 참고로써 앞의 섹션에 예시되었음에도 불구하고, 당업자는 폴리머 변형 모이어티의 배열이 본원에 설명된 화합물 및 방법의 사용에 의함을 인식할 것이다.
선택된 구체예에서, R1 또는 L-R1은 분지된 PEG, 예를 들어, 상기 설명된 종들 중 하나이다. 대표적인 구체예에서, 분지된 PEG 구조는 시스테인 펩티드를 기초로 한다. 본 구체예에 따르는 예시적인 변형된 당은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00127
X4는 결합 또는 O이다. 각각의 상기 구조에서, 알킬아민 링커 -(CH2)aNH-는 존재할 수 있고 또는 존재하지 않을 수 있다. 상기 설명한 구조는 R15/R15'의 성분일 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 본 발명에 사용되는 폴리머-변형된 시알산은 또한 선형 구조일 수 있다. 따라서, 본 발명은 예로써 하기 구조로부터 유도되는 시알산 모이어티를 포함하는 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00128
표시 q 및 e는 상기 논의된 바와 같다.
대표적인 변형된 당은 수용성 또는 수불용성 폴리머로 변형된다. 유용한 폴리머의 예는 하기에 추가로 예시된다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드는 곤충 세포로부터 유도되며, 만노오스 코어에 GlcNAc 및 Gal을 첨가함으로써 리모델링되고 선형 PEG 모이어티를 지지하는 시알산을 사용하여 글리코페길화되어, 하기 화학식을 가지는 적어도 하나의 모이어티를 포함하는 펩티드를 얻는다:
Figure 112009026250918-PCT00129
표시 t는 0 내지 1의 정수이고; 표시 s는 1 내지 10의 정수를 나타내고; 표시 f는 1 내지 2500의 정수를 나타낸다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기 글리코실 연결기를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00130
;
D는 -OH 및 R1-L-HN로부터 선택되는 멤버이고; G는 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬-R1으로부터 선택되는 멤버이고; R1은 직쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기 및 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기로부터 선택되는 멤버를 포함하는 모이어티이고; M은 H, 염반대이온 및 단일 음전하로부터 선택되는 멤버이고; L은 결합, 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 멤버인 링커이다. 대표적인 구체예에서, D가 OH일 때, G는 R1-L-이다. 다른 대표적인 구체예에서, G가 -C(O)(C1-C6)알킬일 때, D는 R1-L-NH-이다.
대표적인 구체예에서, L-R1은 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00131
a는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
대표적인 구체예에서, R1은 하기로부터 선택되는 모이어티를 포함하는 구조를 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00132
e, f, m 및 n은 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; q는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
대표적인 구체예에서, R1은 하기로부터 선택되는 멤버인 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00133
e, f 및 f'는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; q 및 q'는 1 내지 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, R1은 하기로부터 선택되는 멤버인 구조를 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00134
e, f 및 f'는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; q 및 q'는 1 내지 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, R1은 하기로부터 선택되는 멤버인 구조를 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00135
e 및 f는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 글리코실 링커는 하기 화학식을 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00136
변수는 상기 기술된 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기로부터 선택되는 화학식에 따르는 적어도 하나의 상기 글리코실 링커를 포함하며:
Figure 112009026250918-PCT00137
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고, AA는 상기 펩티드 콘쥬게이트의 아미노산 잔기이고 t는 0 및 1로부터 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 적어도 하나의 상기 글리코실 링커를 포함하며, 각각의 상기 글리코실 링커는 하기 화학식으로부터 독립적으로 선택되는 멤버인 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00138
Figure 112009026250918-PCT00139
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고, AA는 상기 펩티드 콘쥬게이트의 아미노산 잔기이고 t는 0 및 1로부터 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기로부터 선택되는 화학식에 따르는 적어도 하나의 상기 글리코실 링커를 포함하며:
Figure 112009026250918-PCT00140
Figure 112009026250918-PCT00141
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고, AA는 상기 펩티드 콘쥬게이트의 아미노산 잔기이고 t는 0 및 1로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, G를 포함하지 않는 0 및 2개의 시알릴 모이어티로부터 선택되는 멤버는 부재한다. 대표적인 구체예에서, G를 포함하지 않는 1 및 2개의 시알릴 모이어티로부터 선택되는 멤버 는 부재한다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기로부터 선택되는 화학식에 따르는 적어도 하나의 상기 글리코실 링커를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00142
Figure 112009026250918-PCT00143
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고, AA는 상기 펩티드 콘쥬게이트의 아미노산 잔기이고 t는 0 및 1로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, G를 포함하지 않는 0 내지 2개의 시알릴 모이어티로부터 선택되는 멤버가 부재한다. 대표적인 구체예에서, G를 포함하지 않는 1 및 2개의 시알릴 모이어티로부터 선택되는 멤버 는 부재한다.
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기로부터 선택되는 화학식에 따르는 적어도 하나의 상기 글리코실 링커를 포함하며:
Figure 112009026250918-PCT00144
Figure 112009026250918-PCT00145
D 및 G는 상기 기술한 바와 같고, AA는 상기 펩티드 콘쥬게이트의 아미노산 잔기이고 t는 0 및 1로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, G를 포함하지 않는 0 내지 2개의 시알릴 모이어티로부터 선택되는 멤버는 부재한다. 대표적인 구체예에서, G를 포함하지 않는 1 내지 2개의 시알릴 모이어티로부터 선택되는 멤버가 부재한다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 발명은 적당한 숙주에서 생성되는 펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 이 펩티드를 발현시키는 방법을 제공한다. 다른 대표적 인 구체예에서, 숙주는 포유동물 발현 시스템이다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 피험자에서 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 질병은 상기 피험자에서 면역반응이 제대로 작동되지 못하는 응고력을 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 피험자에서 상기 질환을 완화시키는데 유효한 본 발명의 펩티드 콘쥬게이트의 양으로 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 대표적인 구체예에서, 본 방법은 본원에 기술된 방법에 따라서 생성되는 펩티드 콘쥬게이트의 양을 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술되는 글리코실 링커를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 만드는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 하기 글리코실 모이어티를 포함하는 펩티드를
Figure 112009026250918-PCT00146
본원에 기술된 페길화된 뉴클레오티드 당과 상기 글리코실 모이어티의 Gal 상에 페길화된 당을 전달하는 효소와 상기 전달에 적합한 조건하에서 접촉하는 단계를 포함한다.
다른 대표적인 구체예에서, 모이어티
Figure 112009026250918-PCT00147
는 하기로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00148
Figure 112009026250918-PCT00149
e, f, m 및 n은 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되고; q는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 모이어티:
Figure 112009026250918-PCT00150
는 하기로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00151
e, f 및 f'는 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; q 및 q'는 1 내지 20으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 글리코실 링커는 하기 화학식을 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00152
다른 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 화학식을 가지는 적어도 하나의 글리코실 링커를 포함하며:
Figure 112009026250918-PCT00153
AA는 상기 펩티드의 아미노산 잔기이고; t는 0 및 1로부터 선택되는 정수이고; R15는 변형된 시알릴 모이어티이다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 방법은 단계 (a) 전에: (b) 적당한 숙주에서 펩티드를 발현시키는 단계를 포함한다.
II . D. iv . 수용성 폴리머
다른 구체예에서, 상기 논의한 것에 대한 유사체, 변형된 당은 수용성 폴리머보다 오히려 수불용성 폴리머를 포함한다. 본 발명의 콘쥬게이트는 또한 하나 이 상의 수불용성 폴리머를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구체예는 조절된 방법으로 치료 펩티드를 전달하기 위한 비히클로서 콘쥬게이트의 사용에 의해 예시된다. 폴리머 약물 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Dunn et al ., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991 참조. 당업자는 실질적으로 어떤 공지된 약물 전달 시스템이 본 발명의 콘쥬게이트에 적용가능함을 인식할 것이다.
R1, L-R1, R15, R15' 및 다른 라디칼에 대해 상기 설명한 모티프는 당업자가 용이하게 접근가능한 화학을 이용하여 제한 없이 선형 및 분지된 구조에 포함될 수 있는 수불용성 폴리머에 동일하게 적용가능하다.
대표적인 수불용성 폴리머는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리포스파진, 폴리(비닐 알코올), 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥시드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할로겐화물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸 메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실 메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트) 폴리에틸렌, 폴 리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리비닐 피롤리돈, 플루로닉 및 폴리비닐페놀 및 그것의 공중합체를 포함한다.
본 발명의 콘쥬게이트에서 사용되는 합성으로 변형된 천연 폴리머는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 알킬 셀룰로오스, 히드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 및 니트로셀룰로오스를 포함한다. 합성으로 변형된 천연 폴리머의 넓은 분류의 특히 바람직한 멤버는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 히드록시부틸 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 카르복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트, 셀룰로오스 술페이트 나트륨 염, 및 아크릴 및 메타아크릴 에스테르 및 알긴산을 포함한다.
본원에 논의되는 이들 및 다른 폴리머는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.), Polysciences (Warrenton, PA.), Aldrich (Milwaukee, WL), Fluka (Ronkonkoma, NY), 및 BioRad (Richmond, CA)와 같은 상업적 근원으로부터 용이하게 얻을 수 있고, 또는 그 밖에 표준 기법을 사용하여 이들 제조업자로부터 획득한 모노머로부터 합성될 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트에서 사용되는 대표적인 생분해성 폴리머, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리락티드, 폴리글리콜리드 및 그것의 공중합체, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 그것의 혼합 및 공중합체를 포함한다. 구체적 사용은 콜라겐, 플루로닉 등과 같은 겔을 형성하는 조성물이다.
본 발명에 사용되는 폴리머는 적어도 일부분 그것의 구조내에 생흡수성 분자를 가지는 수불용성 물질을 포함하는 "혼성" 폴리머를 포함한다. 이러한 폴리머의 예는 생흡수성 영역, 친수성 영역 및 폴리머 사슬 당 다수의 가교성 작용기를 가지는 수불용성 공중합체를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, "수불용성 물질"은 물 또는 물-함유 환경에서 실질적으로 불용성인 물질을 포함한다. 따라서, 비록 공중합체의 특정 영역 또는 단편이 친수성 또는 심지어 수용성일 수도 있다 하여도, 전체로서 폴리머 분자는 어떤 실질적인 측정을 위해 물에 용해되지 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "생흡수성 분자"는 신체에 의해 정상적인 배설 경로를 통해 대사되거나 또는 파괴되고 흡수되고 및/또는 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 이러한 대사물질 또는 파괴된 생산물은 바람직하게는 신체에 실질적으로 비독성이다.
생흡수성 영역은 전체로서 공중합체 조성물이 수용성으로 제공되지 않는 한 친유성 또는 친수성 중의 하나 일 수 있다. 따라서, 생흡수성 영역은 전체로서 폴리머가 수불용성으로 남는 것이 바람직함을 기초로 하여 선택된다. 따라서, 상대적인 특성, 즉, 함유되는 작용기의 종류, 및 흡수성 영역의 상대적 비율 및 친수성 영역은 유용한 생흡수성 조성물이 수불용성으로 남는 것을 보장하기 위해 선택된 다.
대표적인 흡수성 폴리머는, 예를 들어, 폴리(α-히드록시-카르복실산)/폴리(옥시알킬렌)의 합성으로 제조된 흡수성 블록 공중합체(Cohn et al ., 미국 특허 번호 4,826,945 참조)를 포함한다. 이들 공중합체는 가교되지 않고 수용성이어서 신체는 분해된 블록 공중합체 조성물을 배출할 수 있다. Younes et al ., JBiomed . Mater. Res . 21: 1301-1316 (1987); 및 Cohn et al ., J Biomed . Mater . Res . 22: 993-1009 (1988) 참조.
현재 바람직한 생흡수성 폴리머는 폴리(에스테르), 폴리(히드록시 산), 폴리(락톤), 폴리(아미드), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르토에스테르), 폴리(카르보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(포스포에스테르), 폴리(티오에스테르), 폴리사카라이드 및 그것의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 생흡수성 폴리머는 폴리(히드록시)산 성분을 포함한다. 폴리(히드록시)산, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레르산 및 공중합체 및 그것의 혼합물이 바람직하다.
생체내에서 흡수되는("생흡수되는") 단편을 형성하는 것에 더하여, 본 발명의 방법에서 사용을 위해 바람직한 폴리머 코팅은 또한 배출 및/또는 대사가능한 분획을 형성할 수 있다.
더 높은 차수의 공중합체가 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 1984년 3월 20일 발행된 Casey et al., 미국 특허 번호 4,438,253는 트리-블록 공중합체는 폴리(글리콜산) 및 히드록실-말단의 폴리(알킬렌 글리콜)의 에스테르교환 으로부터 생성됨을 개시한다. 이러한 조성물은 흡수성 모노필라멘트 구조로서 사용을 위해 개시된다. 이러한 조성물의 가요성은 테트라-p-톨릴 오르토 카르보네이트와 같은 방향족 오르토카르보네이트를 공중합체 구조에 포함시킴으로써 조절된다.
락트산 및/또는 글리콜산을 기초로 하는 다른 폴리머가 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 1993년 4월 13일 발행된 Spinu, U.S. Patent No. 5,202,413는 락티드 및/또는 글리콜리드의 올리고머 디올 또는 디아민 잔기 중 하나로 환-오프닝 중합화 후에 디이소시아네이트, 디아실클로라이드 또는 디클로로실란과 같은 2-작용성 화합물 사슬 확장으로 생성되는 폴리락티드 및/또는 폴리글리콜리드의 순차적으로 명령된 차단을 가지는 생분해성 멀티-블록 공중합체를 개시한다.
본 발명에 유용한 코팅의 생흡수성 영역은 가수분해적으로 및/또는 효소적으로 분해될 수 있도록 계획될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 "가수분해적으로 분해가능한"은 물 또는 물 함유 환경에서 가수분해에 대한 공중합체, 특히 생분해성 영역의 민감성을 말한다. 유사하게, 본원에 사용된 "효소적으로 분해가능한"은 내인성 또는 외인성 효소에 의한 분해에 대한 공중합체, 특히 생분해성 영역의 민감성을 말한다.
신체에 위치될 때, 친수성 영역은 배출할 수 있는 및/또는 대사할 수 있는 부분 안으로 처리될 수 있다. 따라서, 친수성 영역은, 예를 들어, 폴리에테르, 폴리알킬렌 옥시드, 폴리올, 폴리(비닐 피롤리딘), 폴리(비닐 알코올), 폴리(알킬 옥사졸린), 폴리사카라이드, 탄수화물, 펩티드, 단백질 및 그것의 공중합체를 포함할 수 있다. 게다가, 친수성 영역은 또한, 예를 들어, 폴리(알킬렌)옥시드일 수 있다. 이러한 폴리(알킬렌)옥시드는 예를 들어, 폴리(에틸렌) 옥시드, 폴리(프로필렌) 옥시드 및 그것의 혼합물 및 공중합체를 포함할 수 있다.
히드로겔의 성분인 폴리머는 또한 본 발명에 유용하다. 히드로겔은 상대적으로 많은 양의 물을 흡수할 수 있는 폴리머 물질이다. 히드로겔 형성 화합물의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리아크릴산, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리딘, 젤라틴, 캐라지난 및 기타 다당류, 히드록시에틸렌메타크릴산 (HEMA), 및 그것의 유도체 등을 포함한다. 히드로겔은 안정하고, 생분해성이고 생흡수성인 것으로 제조될 수 있다. 게다가 히드로겔 조성은 하나 이상의 이들 특성을 나타내는 서브유닛을 포함할 수 있다.
완전함이 가교를 통해 조절될 수 있는 생체 호환성 히드로겔 조성물은 공지되어 있고 본 발명의 방법에서 사용에 바람직하다. 예를 들어, 1996년 6월 25일 발행된 Hubbell et al ., 미국 특허 번호 5,410,016, 및 1996년 6월 25일 발행된 5,529,914는 2개의 가수분해적으로 불안정한 확장 사이에 샌드위칭된 수용성 중앙 블록 세그먼트를 가지는 가교된 블록 공중합체인 수용성 시스템을 개시한다. 이러한 공중합체는 추가로 광중합성 아크릴레이트 작용기로 말단-캡핑된다. 가교될 때, 이들 시스템은 히드로겔이 된다. 이러한 공중합체의 수용성 중앙 블록은 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있지만; 반면에, 가수분해적으로 불안정한 확정은 폴리(α-히드록시산), 예로써 폴리글리콜산 또는 폴리락트산일 수 있다. Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-587 (1993) 참조.
다른 바람직한 구체예에서, 겔은 열가역성 겔이다. 플루로닉, 콜라겐, 젤라 틴, 히알루론산, 폴리사카라이드, 폴리우레탄 히드로겔, 폴리우레탄-우레아 히드로겔 및 그것의 조합과 같은 성분을 포함하는 열가역성 겔이 현재 바람직하다.
또 다른 대표적인 구체예에서, 본 발명의 콘쥬게이트는 리포좀의 성분을 포함한다. 리포좀은 예를 들어, Eppstein et al ., 미국 특허 번호 4,522,811에 기술된 바와 같은 당업자에게 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형은 무기 용매 중 적절한 지질(들)(예로써, 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린 및 콜레스테롤)을 용해시킨 후 증발시키고, 용기의 표면에서 건조된 지질의 얇은 필름을 남김으로써 제조될 수 있다. 활성 화합물 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염의 수성 용액은 이후에 용기에 넣는다. 용기의 측면으로부터 지질물질을 제거하고 지질 덩어리를 분산시키기 위해 용기를 그 후 손으로 교반시켜서, 이에 의해 리포좀 현탁액을 형성한다.
상기 인용된 마이크로입자 및 마이크로입자를 제조하는 방법은 예의 방법으로써 제공되며 그것들은 본 발명에서 사용되는 마이크로입자의 범주를 한정하는 것을 의도하지는 않는다. 다른 방법으로 제작된 마이크로입자의 배열이 본 발명에서의 사용임은 당업자들에게 명백할 것이다.
수용성 폴리머에 대해 상기 논의된 구조 포맷은, 직쇄와 분지쇄 둘 다, 수불용성 폴리머에 대해서도 마찬가지로 일반적으로 적용가능하다. 따라서, 예를 들어, 시스테인, 세린, 디리신 및 트리리신 분지 코어는 2개의 수불용성 폴리머 모이어티로 기능화될 수 있다. 이들 종을 생성하는데 사용되는 방법은 일반적으로 수용성 폴리머를 생성하는데 사용되는 것과 밀접하게 유사하다.
II . D. v. 폴리머 변형기를 생성하는 방법
폴리머 변형기는 글리코실 또는 사카릴 모이어티 또는 아미노산 모이어티로 반응을 위해 활성화될 수 있다. 활성화된 종의 대표적인 구조(예를 들어, 카르보네이트 및 활성 에스테르)는 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00154
Figure 112009026250918-PCT00155
상기 그림에서, q는 1-40으로부터 선택되는 멤버이다. 본원에 설명된 화합물을 제조하는데 사용되는 선형 및 분지된 PEG를 활성화하는데 적합한 다른 활성화 또는 이탈기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기 종들을 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00156
이들 및 다른 종들로 활성화된 PEG 분자 및 활성화된 PEG를 제조하는 방법은 WO 04/083259에서 설명된다.
당업자는 상기 나타난 분지된 폴리머의 하나 이상의 m-PEG 암이 다른 말단, 예를 들어, OH, COOH, NH2, C2-C10-알킬 등을 가지는 PEG 모이어티로 치환될 수 있음을 인식할 것이다. 게다가, 상기 구조는 α-탄소 원자와 아미노산 측쇄의 작용기 사이에 알킬 링커를 삽입(또는 탄소 원자를 제거)함으로써 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, "호모" 유도체 및 고급의 동족체 및 저급의 동족체는 본 발명에 사용되는 분지된 PEG를 위한 코어의 범주내이다.
본원에 설명된 분지된 PEG 종들은 하기 반응식에 설명된 바와 같은 방법으로 용이하게 제조된다:
Figure 112009026250918-PCT00157
Xd는 O 또는 S이고 r은 1 내지 5의 정수이다. 표시 e 및 f는 1 내지 2500의 정수로부터 독립적으로 선택된다. 대표적인 구체예에서, 이들 표시 중 하나 또는 둘은 폴리머가 약 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 35 kD, 또는 40 kD의 분자량인 것으로부터 선택된다. 더 큰 분자량의 PEG가 또한 약 200 kD 이하, 예로써 적어도 약 180 kD, 약 160 kD, 약 140 kD, 약 120 kD, 약 100 kD, 약 90 kD, 약 80 kD, 및 약 70 kD을 포함하여 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, PEG의 분자량은 약 80 kD이다. 다른 구체예에서, PEG의 분자량은 적어도 약 200 kD, 적어도 약 180 kD, 적어도 약 160 kD, 또는 적어도 약 140 kD이다.
따라서, 이 반응식에 따라서, 천연 또는 비천연 아미노산은 활성화된 m-PEG 유도체와 접촉되며, 이 경우에 토실레이트는 측쇄 헤테로원자 Xd를 알킬화함으로써 형성된다. 모노-작용화된 m-PEG 아미노산은 반응성 m-PEG 유도체를 가지는 N-아실화 조건에 따라서, 분지된 m-PEG 2로 만든다. 당업자들은 토실레이트 이탈기가 어떤 적당한 이탈기, 예를 들어, 할로겐, 메실레이트, 트리플레이트 등으로 치환될 수 있음을 인식할 것이다. 유사하게, 아민을 아실화하는데 이용되는 반응성 카르보네이트는 활성 에스테르, 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 등으로 치환될 수 있고, 또는 산은 디시클로헥실 카르보디이믿, 카르보닐디이미다졸 등과 같은 탈수제를 사용하여 인시츄 활성화될 수 있다.
다른 대표적인 구체예에서, 우레아 모이어티는 아미드와 같은 기로 치환된다.
II . E. 물질의 호모분산 펩티드 콘쥬게이트 조성물
화학적으로 또는 효소적으로 부가되는 글리코실 연결기를 통해 형성되는 펩티드 콘쥬게이트를 제공하는 것에 더하여, 본 발명은 이들의 치환 패턴에서 매우 동질한 펩티드 콘쥬게이트를 포함하는 물질의 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여, 글리코실 연결기 및 펩티드 콘쥬게이트의 모집단을 가로지르는 글리 코실 모이어티의 실질적인 비율은 구조적으로 동일한 아미노산 또는 글리코실 잔기에 부착되는 펩티드 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 따라서, 제 2 양태에서, 본 발명은 글리코실 연결기, 예를 들어 무손상 글리코실 연결기를 통해 펩티드에 공유적으로 결합되는 수용성 폴리머 모이어티의 모집단을 가지는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 대표적인 펩티드 콘쥬게이트는, 본질적으로 폴리머 모집단의 각 멤버가 펩티드의 글리코실 잔기에 글리코실 연결기를 통해 결합되고, 글리코실 연결기가 부착된 펩티드의 각 글리코실 잔기는 동일한 구조를 가진다.
본 발명은 또한 펩티드가 글리코실 연결기를 통해 변형기, 예를 들어, 치료 모이어티, 진단 모이어티, 표적 모이어티, 독성 모이어티 등에 콘쥬게이트되는 펩티드에서 상기 기술한 것에 대한 콘쥬게이트 유사체를 제공한다. 각각의 상기 인용된 변형기는 소분자, 천연 폴리머(예를 들어, 폴리펩티드) 또는 합성 폴리머일 수 있다. 변형기가 시알산에 부착될 때, 변형기는 실질적으로 비형광성인 것이 일반적으로 바람직하다.
대표적인 구체예에서, 본 발명의 펩티드는, 폴리머 변형기, 예를 들어 PEG 모이어티를 포함하는 변형된 당과 함께 글리코실화되는 적어도 하나의 O- 연결된 또는 N-연결된 글리코실화 자리를 포함한다. 대표적인 구체예에서, PEG는 무손상 글리코실 연결기를 통해 또는 비-글리코실 링커, 예를 들어, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬을 통해 펩티드에 공유적으로 부착된다. 글리코실 연결기는 펩티드의 아미노산 잔기 또는 글리코실 잔기 중 하나에 공유적으로 부착된다. 또 다르게는, 글리코실 연결기는 글리코펩티드의 하나 이상의 글리코 실 유닛에 부착된다. 본 발명은 또한 글리코실 연결기가 아미노산 잔기와 글리코실 잔기 둘 다에 부착되는 콘쥬게이트를 제공한다.
본 발명의 펩티드 상의 글리칸은 일반적으로 본원에 설명된 방법에 따라서 리모델링에 따라서 포유동물(BHK, CHO) 세포 또는 곤충(예를 들어, Sf-9) 세포에 의해 생성되는 펩티드 상에서 발견되는 것에 대응한다. 예를 들어, 트리-만노실 코어로 발현되는 곤충-유도된 펩티드는 GlcNAc 도너와 GlcNAc 트랜스퍼라아제 및 Gal 도너와 Gal 트랜스퍼라아제와 순차적으로 접촉된다. 트리-만노실 코어에 GlcNAc 및 Gal를 부착하는 것은 2단계 또는 단일 단계로 수행된다. 변형된 시알산은 본원에 논의되는 바와 같은 글리코실 모이어티의 적어도 하나의 분지에 부가된다. 변형된 시알산으로 기능화되지 않는 Gal 모이어티들은 시알릴 트랜스퍼라아제의 존재에서 시알산 도너와 반응함으로써 선택적으로 "캡핑"된다.
대표적인 구체예에서, 펩티드의 모집단에서 적어도 60%의 말단 Gal 모이어티는 시알산으로 캡핑되고, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 및 더욱더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 시알산으로 캡핑된다.
II . F. 뉴클레오티드 당
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 또한 당 뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에 따르는 대표적인 종들은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00158
Figure 112009026250918-PCT00159
y는 O 내지 2로부터 선택되는 정수이고 적어도 하나의 R2, R3, R4, R5 또는 R6는 하기로부터 선택되는 멤버인 구조를 가진다
Figure 112009026250918-PCT00160
변수는 상기 기술한 바와 같다.
대표적인 구체예에서, 적어도 하나의 R2, R3, R4, R5 또는 R6는 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00161
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 -OH 및 -OCH3로부터 각각 선택된다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00162
대표적인 구체예에서, R2, R3, R4, R5 또는 R6 중 단 하나는 상기 기술된 변형기를 포함하는 구조를 가진다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 구체예에 따르는 종들은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00163
Figure 112009026250918-PCT00164
변수는 상기 기술한 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 구체예에 따르는 종들은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00165
Figure 112009026250918-PCT00166
Figure 112009026250918-PCT00167
L-(R1)w는 하기로부터 선택되는 멤버이고
Figure 112009026250918-PCT00168
변수는 상기 기술된 바와 같다.
대표적인 구체예에서, L-(R1)w는 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00169
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3으로부터 선택된다.
본 구체예에 따르는 대표적인 폴리머 변형기는 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00170
.
대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 1000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 1 내지 약 70, 약 70 내지 약 150, 약 150 내지 약 250, 약 250 내지 약 375 및 약 375 내지 약 500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 10 내지 약 35, 약 45 내지 약 65, 약 95 내지 약 130, 약 210 내지 약 240, 약 310 내지 약 370 및 약 420 내지 약 480으로부터 독립적으로 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 15 내지 약 30으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 50 내지 약 65로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 100 내지 약 130으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 210 내지 약 240을부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 310 내지 약 370으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, m 및 n은 약 430 내지 약 470으로부터 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 구체예에 따르는 종들은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00171
;
Figure 112009026250918-PCT00172
Figure 112009026250918-PCT00173
변수는 상기 기술된 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 구체예에 따르는 종들은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00174
Figure 112009026250918-PCT00175
변수는 상기 기술된 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 뉴클레오티드 당은 하기로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00176
Figure 112009026250918-PCT00177
변수는 상기 기술된 바와 같다.
본 구체예에 따라서 대표적인 뉴클레오티드 당은 하기 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00178
변수는 상기 기술된 바와 같다.
본 구체예에 따르는 대표적인 뉴클레오티드 당은 하기 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00179
변수는 상기 기술된 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 뉴클레오티드 당은 하기 화학식을 기초로 한다:
Figure 112009026250918-PCT00180
R 기, 및 L은 상기 논의된 바와 같은 모이어티를 나타낸다. 지수 "y"는 O, 1 또는 2이다. 대표적인 구체예에서, L은 NH와 R1 사이의 결합이다. 염기는 핵산 염기이다.
대표적인 구체예에서, L-R1은 하기로부터 선택되는 멤버이며
Figure 112009026250918-PCT00181
및
Figure 112009026250918-PCT00182
변수는 상기 기술된 바와 같다.
대표적인 구체예에서, L-R1은 하기 화학식에 따르는 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00183
대표적인 구체예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3로부터 선택된다.
III . 방법
상기 논의된 콘쥬게이트에 더하여, 본 발명은 이들 및 다른 콘쥬게이트를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 게다가, 본 발명은 질병이 진행하는 위험에 있는 피험자 또는 질병을 가지는 피험자에 본 발명의 콘쥬게이트를 투여함으로써 질병 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.
대표적인 구체예에서, 콘쥬게이트는 폴리머 변형 모이어티와 글리코실화된 또는 비글리코실화된 펩티드 사이에 형성된다. 폴리머는 펩티드(또는 글리코실 잔기)와 변형기(예를 들어, 수용성 폴리머) 사이에 삽입되고 둘 다에 공유적으로 연결되는 글리코실 연결기를 통해 펩티드에 콘쥬게이트된다. 본 발명은 변형된 당 및 효소, 예를 들어, 기질에 변형된 당을 콘쥬게이트하는 글리코실트랜스퍼라아제를 함유하는 혼합물을 펩티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 반응은 적절한 조건하에서 수행되어 변형된 당과 펩티드 사이의 공유결합을 형성한다. 변형된 당의 당 모이어티는 바람직하게는 뉴클레오티드 당으로부터 선택된다. a) 시알릴다아제; b) 글리 코실트랜스퍼라아제, 엑소글리코시다아제 또는 엔도글리코시다아제와 같은 글리코실 연결기의 전달을 촉매할 수 있는 효소; c) 변형된 당; d) 펩티드를 합하고, 따라서 펩티드 콘쥬게이트를 합성하는 것을 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 합성하는 방법. 반응은 변형된 당과 펩티드 사이에 공유 결합을 형성하는데 적당한 조건하에서 수행된다. 변형된 당의 당 모이어티는 뉴클레오티드 당으로부터 바람직하게 선택된다.
대표적인 구체예에서, 상기 설명된 것과 같은 변형된 당은 대응하는 뉴클레오티드 당으로서 활성화된다. 변형된 형태로 본 발명에 사용되는 대표적인 당 뉴클레오티드는 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 그것의 유사체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 변형된 당 뉴클레오티드는 UDP-글리코시드, CMP-글리코시드, 또는 GDP-글리코시드로부터 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, 변형된 당 뉴클레오티드의 당 뉴클레오티드 부분은 UDP-갈락토오스, UDP-갈락토사민, UDP-글루코오스, UDP-글루코사민, GDP-만노오스, GDP-푸코오스, CMP-시알산, 또는 CMP-NeuAc로부터 선택된다. 대표적인 구체예에서, 뉴클레오티드 포스페이트는 C-1에 부착된다.
본 발명은 또한 6-탄소 위치에서 L-R1와 함께 변형된 당 뉴클레오티드의 사용을 제공한다. 본 구체예에 따르는 대표적인 종은 하기를 포함한다:
Figure 112009026250918-PCT00184
R 기, 및 L은 상기 논의된 바와 같은 모이어티를 나타낸다. 지수 "y"는 0, 1 또는 2이다. 대표적인 구체예에서, L은 NH와 R1 사이의 결합이다. 염기는 핵산 염기이다.
본 발명에서 사용되는 대표적인 뉴클레오티드 당은 본원에 기술된다. 다른 대표적인 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 당은 6-위치에서 탄소가 변형되는 GDP 만노오스의 입체화학, 예를 들어, 하기를 가지는 종을 포함하는 것이다.
Figure 112009026250918-PCT00185
; 및
Figure 112009026250918-PCT00186
X5는 결합 또는 O이고 남은 변수는 상기 기술된 바와 같다. 지수 i는 0 또는 1을 나타낸다. 지수 a는 1 내지 20의 정수를 나타낸다. 표시 e 및 f는 1 내지 2500의 정수를 나타낸다. 상기 논의된 바와 같은 Q는 H 또는 치환된 또는 비치환된 C1- C6 알킬이다. 당업자에게 인식될 바와 같이, S가 O로 치환되는 세린 유도체는 이 일반적 모티프에 포함된다.
또한 추가의 대표적인 구체예에서, 본 발명은 변형된 당이 UDP 갈락토오스의 입체화학을 기초로하는 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명에서 사용을 위한 대표적인 뉴클레오티드 당은 하기 구조를 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00187
변수는 상기 기술한 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, 뉴클레오티드 당은 글루코오스의 입체화학을 기초로 한다. 본 구체예에 따르는 대표적인 종들은 하기 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00188
변수는 상기 기술된 바와 같다.
따라서, 글리코실 모이어티가 시알산인 예시적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 하기 화학식을 가지는 화합물을 이용하며:
Figure 112009026250918-PCT00189
L-R1은 상기 논의한 바와 같고, L1-R1은 변형기에 결합되는 링커를 나타낸다. L과 같이, L1에 대한 대표적인 링커 종은 결합, 알킬 또는 헤테로알킬 모이어티를 포함한다.
게다가, 상기 논의한 바와 같이, 본 발명은 직쇄 또는 분지쇄 중 하나인 수 용성 폴리머와 함께 변형된 뉴클레오티드 당의 사용을 제공한다. 예를 들어, 하기 보이는 화학식을 가지는 화합물은 본 발명의 범주 내인 펩티드를 제조하는데 사용된다:
Figure 112009026250918-PCT00190
X4는 0 또는 결합이다.
일반적으로, 당 모이어티 또는 당 모이어티-링커 카세트 및 PEG 또는 PEG-링커 카세트기는 반응성 기의 사용을 통해 함께 연결되는데, 이는 전형적으로 연결 과정에 의해 신규 유기 작용기 또는 비반응성 종으로 전환된다. 당 반응성 작용기(들)은 당 모이어티 상의 어떤 위치에 위치된다. 본 발명을 실행하는데 유용한 반응기 및 반응의 종류는 일반적으로 바이오콘쥬게이트 화학의 분야에 공지되어 있다. 반응성 당 모이어티와 함께 이용할 수 있는 반응의 현재 바람직한 분류는 상대적으로 마일드한 조건하에서 진행하는 것이다. 이는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 친핵 치환(예를 들어, 아민 및 알코올의 아실 할로겐화물, 활성 에스테르와의 반응), 친전자 치환(예를 들어, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중결합에 첨가(예를 들어, 마이클 반응, 딜스-알더 첨가)를 포함한다. 이들 및 다 른 유용한 반응은, 예를 들어, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney et al, MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982에서 논의된다.
당 핵(sugar nucleus) 또는 변형기로부터 현수된 유용한 반응성 작용기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기를 포함한다:
(a) 이에 제한되는 것은 아니지만, N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할로겐화물, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하는 카르복실기 및 그것의 다양한 유도체;
(b) 히드록실기, 이는 예를 들어, 에스테르, 에테르, 알데히드, 등으로 변환될 수 있다;
(c) 할로알킬기, 할로겐화물은 예를 들어, 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카르바니온 또는 알콕시드 이온과 같은 친핵성기로 후에 치환되어, 할로겐 원자의 작용기에서 신규기의 공유 부착을 야기한다;
(d) 디에노필기, 이는 예를 들어, 말레이미도 기와 같은 딜스-알더 반응에 참여할 수 있다;
(e) 알데히드 또는 케톤 기, 이후 유도체화는 예를 들어, 이민, 히드라존, 세미카르바존 또는 옥심과 같은 카르보닐 유도체를 통해, 또는 그리나드 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 메커니즘을 통해 가능하다;
(f) 아민과 이후의 반응을 위한 술포닐 할로겐화물, 예를 들어, 술폰아미드를 형성하는 것;
(g) 티올기, 이는 예를 들어, 디술피드로 변환 또는 아실 할로겐화물과 반응할 수 있다;
(h) 아민 또는 술프히드릴기, 이는, 예를 들어, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있다;
(i) 알켄, 이는 예를 들어, 시클로 첨가, 아실화, 마이클 첨가 등을 겪을 수 있다;
(j) 에폭시드, 이는 예를 들어 아민 및 히드록실 화합물과 반응할 수 있다.
반응성 작용기는 그것들이 반응성 당 핵 또는 변형기를 만드는데 필요한 반응에 참여 또는 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 또 다르게는, 반응성 작용기는 보호기의 존재에 의해 반응에 참여하는 것으로부터 보호될 수 있다. 당업자는 반응 조건의 선택된 세트를 방해하지 않는 특정 작용기를 보호하는 방법을 이해한다. 예를 들어, 유용한 보호기는 예를 들어, Greene et al ., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991 참조.
하기 논의에서 본 발명을 실행하는데 유용한 다수의 특정 변형된 당의 예가 설명된다. 대표적인 구체예에서, 시알산 유도체는 변형기가 부착되는 당 핵으로서 이용된다. 시알산 유도체에서의 논점은 단지 예시를 명확히하기 위함이며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 다양한 다른 당 모이어 티는 예로서 시알산을 사용하여 언급한 것과 유사한 방법으로 활성화되고 유도될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 수많은 방법이 업계에 인식된 방법으로 용이하게 변형되는 몇 개의 당 기질을 명명하기 위한 갈락토오스, 글루코오스, N-아세틸갈락토사민 및 푸코오스를 변형하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, Elhalabi et al., Curr . Med . Chem . 6: 93 (1999); 및 Schafer et al ., J. Org. Chem. 65: 24 (2000)) 참조.
대표적인 구체예에서, 변형된 당은 6-아미노-N-아세틸-글리코실 모이어티를 기초로 한다.
상기 반응식에서, 표시 n은 1 내지 2500의 정수를 나타낸다. 대표적인 구체예에서, 이 표시는 폴리머가 약 10 kD, 15 kD 또는 20 kD의 분자량인 것으로부터 선택된다. 기호 "A"는 활성화기, 예를 들어, 할로, 활성화된 에스테르의 성분(예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르), 카르보네이트의 성분(예를 들어, p-니트로페닐 카르보네이트) 등을 나타낸다. 당업자는 다른 PEG-아미드 뉴클레오티드 당이 이것 및 유사한 방법으로 용이하게 제조됨을 인식할 것이다.
펩티드는 전형적으로 원핵세포(예를 들어, E. coli같은 박테리아 세포) 또는 진핵세포, 예로써, 포유동물, 이스트, 곤충, 진균 또는 식물 세포에서 처음부터, 또는 재조합적으로 발현된다. 펩티드는 전장 단백질 또는 분획 중 하나일 수 있다. 게다가, 펩티드는 야생형 또는 돌연변이된 펩티드일 수 있다. 대표적인 구체예에서, 펩티드는 펩티드 서열에 하나 이상의 N- 또는 O- 연결된 글리코실화 자리를 부가하는 돌연변이를 포함한다.
본 발명은 또한 재조합적으로 생성된 불완전하게 글리코실화된 펩티드의 변형을 제공한다. 다수의 재조합적으로 생성된 글리코단백질은 불완전하게 글리코실화되고, 원치않는 특성, 예를 들어, 면역원성, RES에 의한 인식을 가질 수 있는 탄수화물 잔기를 노출한다. 본 발명의 방법에서 변형된 당을 사용하여, 펩티드는 동시에 추가로 글리코실화되고 예를 들어, 수용성 폴리머, 치료제 등으로 유도될 수 있다. 변형된 당의 당 모이어티는 완전히 글리코실화된 펩티드 또는 요망되는 특성을 가지는 다른 당 모이어티에서 어셉터에 적절하게 콘쥬게이트되는 잔기일 수 있다.
당업자는 본 발명이 실질적으로 어떤 근원으로부터 어떤 펩티드 또는 글리코펩티드를 사용하여 실행될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명이 실행될 수 있는 대표적인 펩티드는 WO 03/031464에서 설명되고, 참고는 그것에서 설명된다.
본 발명의 방법으로 변형되는 펩티드는 합성 또는 야생형 펩티드일 수 있고, 또는 그것들은 특정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis)와 같은 당업계에 공지된 방법으로 생성된 돌연변이된 펩티드일 수 있다. 펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. 대표적인 N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 변형된 당의 부착이다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 자리를 만든다. 비록 보통이 아닌 또는 비-천연 아미노산, 예를 들어, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용 될 수 있다해도, O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 바람직하게는, 세린 또는 트레오닌의 히드록시 측쇄에 한 개의 당(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 만노오스, GlcNAc, 글루코오스, 푸코오스 또는 자일로오스)의 부착을 말한다.
게다가, 펩티드에 더하여, 본 발명의 방법은 다른 생물학적 구조(예를 들어, 글리코실화 자리를 함유하는 글리코 지질, 지질, 스핑고이드, 세라마이드, 전체 세포 등)로 실행될 수 있다.
펩티드 또는 다른 구조에 글리코실화 자리의 부가는 그것이 하나 이상의 글리코실화 자리를 함유하는 아미노산 서열을 변형함으로써 통상적으로 수행된다. 부가는 펩티드 서열(O-연결된 글리코실화 자리에 대해) 내에서 -OH 기가 존재하는 하나 이상의 종, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 잔기의 포함에 의해 제조될 수 있다. 부가는 돌연변이 또는 펩티드의 완전한 화학적 합성에 의해 만들어질 수 있다. 펩티드 아미노산 서열은 바람직하게는 DNA 수준의 변화를 통해, 특히 코돈이 생성되고 요망되는 아미노산으로 번역될 미리 선택된 염기에서 펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 변형된다. DNA 돌연변이(들)은 바람직하게는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조된다.
대표적인 구체예에서, 글리코실화 자리는 셔플링 폴리뉴클레오티드에 의해 부가된다. 후보 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 셔플링 프로토콜로 조절될 수 있다. DNA 셔플링은 순환적인 재조합 및 돌연변이의 과정이며, 관련된 유전자의 풀의 무작위 단편화에 의해 수행된 후 중합효소연쇄반응으로 재조합된다. 예를 들어, Stemmer, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91 :10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); 및 미국 특허 번호 5,605,793, 5,837,458, 5,830,721 및 5,811,238 참조.
본 발명이 실행될 수 있는 대표적인 펩티드, 글리코실화 자리를 부가 또는 제거하는 방법, 및 글리코실 구조 또는 하부구조를 부가 또는 제거하는 방법은 WO03/031464 및 관련된 미국 및 PCT 출원에서 상세하게 기술된다
본 발명은 또한 변형된 당이 적어도 하나의 펩티드의 선택된 글리코실 잔기에 콘쥬게이트된 후 펩티드에 하나 이상의 선택된 글리코실 잔기를 부가(또는 제거)하는 이점을 가진다. 본 발명의 구체예는, 예를 들어, 펩티드 상에 존재하지 않거나 요망되는 양으로 존재하지 않는 선택된 글리코실 잔기에 변형된 당을 콘쥬게이트하도록 요망될 때 유용하다. 따라서, 펩티드에 변형된 당을 커플링하기 전에, 선택된 글리코실 잔기는 효소적 또는 화학적 커플링에 의해 펩티드에 콘쥬게이트된다. 다른 구체예에서, 글리코펩티드의 글리코실화 패턴은 글리코펩티드로부터 탄수화물 잔기의 제거에 의한 변형된 당의 콘쥬게이션 전에 변형된다. 예를 들어, WO 98/31826 참조.
글리코펩티드에 존재하는 어떤 탄수화물 모이어티의 부가 또는 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행된다. 대표적인 화학적 탈글리코실화는 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 동등한 화합물에 대한 폴리펩티드 변형의 노출에 의해 초래된다. 이 처리는 펩티드 무손상이 이탈하는 동안 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 분해를 초래한다. 화학적 탈 글리코실화는 Hakimuddin et al , Arch . Biochem . Biophys . 259: 52 (1987) 및 Edge et al , Anal . Biochem . 118: 131 (1981)로 기술된다. 폴리펩티드 변형 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 분해는 Thotakura et al , Meth . Enzymol. 138: 350 (1987)로 기술되는 엔도 및 엑소-글리코시다아제의 변형의 사용에 의해 달성될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 본질적으로 펩티드 상의 글리코콘쥬게이션 또는 리모델링 단계를 수행하기 전 펩티드는 뉴라미니다아제와 함께 완전하게 탈시알릴화된다. 글리코콘쥬게이션 또는 리모델링에 따라, 펩티드는 시알릴트랜스퍼라아제를 사용하여 선택적으로 재시알릴화된다. 대표적인 구체예에서, 재-시알릴화는 본질적으로 각각(예를 들어, > 80%, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 및 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상) 시알릴 어셉터의 모집단 중 말단 사카릴 어셉터에서 발생한다. 바람직한 구체예에서, 사카라이드는 실질적으로 동일한 시알릴화 패턴(즉, 실질적으로 동일한 글리코실화 패턴)을 가진다.
글리코실 모이어티의 화학적 부가는 임의의 업계에 인식된 방법으로 수행된다. 당 모이어티의 효소적 부가는 바람직하게는 본원에 설명된 방법의 변형을 사용하여 달성되고, 본 발명에 사용되는 변형된 당에 대해 본래의 글리코실 유닛을 치환한다. 당 모이어티를 부가하는 다른 방법은 미국 특허 번호 5,876,980, 6,030,815, 5,728,554, 및 5,922,577에 개시된다.
선택된 글리코실 잔기에 대한 대표적인 부착 지점은, 이에 제한되는 것은 아니지만: (a) N-연결된 글리코실화를 위한 일치 자리; (b) 글리코실트랜스퍼라아제데 대한 어셉터인 말단 글리코실 모이어티; (c) 아르기닌, 아스파라긴 및 히스티 딘; (d) 자유 카르복실기; (e) 시스테인의 것과 같은 자유 술프히드릴기; (f) 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 것과 같은 자유 히드록실기; (g) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기; 또는 (h) 글루타민의 아미드기를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 대표적인 방법은 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 Aplin and Wriston, CRC CRIT. REV. BIOCHEM., pp. 259-306 (1981)에 기술되어 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 연결기를 통해 2 이상의 펩티드를 연결하기 위한 방법을 제공한다. 연결기는 어떤 유용한 구조이며 직쇄 및 분지쇄 구조로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드에 부착되는 링커의 각 말단은 변형된 당(즉, 초기의 무손상 글리코실 연결기)을 포함한다.
본 발명의 대표적인 방법은, 2개의 펩티드가 폴리머(예를 들어, PEG 링커)를 포함하는 링커 모이어티를 통해 함께 연결된다. 구조는 상기 그림에서 설명한 일반적 구조에 따른다. 본원에 기술되는 바와 같은, 본 발명의 구조는 2개의 무손상 글리코실 연결기(즉, s + t = 1)를 포함한다. 2개의 글리코실기를 포함하는 PEG 링커 상의 초점은 명확함의 목적을 위한 것이며 본 발명의 구체예에서 사용되는 링커 암의 동일성을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
따라서, PEG 모이어티는 제 1 글리코실 유닛과 제 1 말단에서 그리고 제 2 글리코실 유닛과 제 2 말단에서 기능화된다. 제 1 및 제 2 글리코실 유닛은 바람직하게는 다른 트랜스퍼라아제에 대한 기질이며, 제 1 및 제 2 글리코실 유닛 각각에 제 1 및 제 2 펩티드의 직각의 부착을 허용한다. 실행에서, (글리코실)1-PEG-(글리코실)2 링커는 제 1 글리코실 유닛이 기질인 것에 대해 제 1 펩티드 및 제 1 트랜스퍼라아제와 접촉되며, 따라서, (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2을 형성한다. 트랜스퍼라아제 및/또는 반응하지 않은 펩티드는 그 후 반응 혼합물로부터 선택적으로 제거된다. 제 2 글리코실 유닛이 기질인 것에 대한 제 2 펩티드 및 제 2 트랜스퍼라아제는 (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2 콘쥬게이트에 첨가되고, (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2-(펩티드)2를 형성하며; 적어도 하나의 글리코실 잔기는 직접 또는 간접 중 하나로 O-연결된다. 당업자는 상기 약술한 방법이 또한, 예를 들어 분지된 PEG, 덴드리머, 폴리(아미노산), 폴리 사카라이드 등의 사용에 의해 2 이상의 펩티드 사이에 콘쥬게이트를 형성할 수 있음을 인식할 것이다.
대표적인 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 변형되는 펩티드는 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포) 또는 유전자이식 동물에 의해 생성된 글리코펩티드이고, 따라서 불완전하게 시알릴화된 N- 및/또는 O- 연결된 올리고당 사슬을 함유한다. 시알산이 결핍되고 말단 갈락토오스 잔기를 함유하는 글리코펩티드의 올리고당 사슬은 페길화, PPG화 또는 변형된 시알산과 함께 달리 변형될 수 있다.
반응식 1에서, 아미노 글리코시드 1은 보호된 아미노산(예를 들어, 글리신) 유도체의 활성 에스테르로 처리되고, 당 아민 잔기는 대응하는 보호된 아미노 산 아미드 부가물로 변환된다. 부가물은 알돌라아제로 처리되어 α-히드록시 카르복실 레이트 2를 형성한다. 화합물 2는 CMP-SA 합성효소의 작용에 의해 대응하는 CMP 유도체로 변환된 후, CMP 유도체의 촉매적 수소화로 화합물 3을 생성한다. 글리신 부산물의 형성을 통해 도입된 아민은 화합물 3을 활성화된 PEG 또는 PPG 유도체(예를 들어, PEG-C(O)NHS, PEG-OC(O)O-p-니트로페닐)와 반응시킴으로써 PEG 부착의 자리로서 이용되고, 각각 4 또는 5와 같은 종들을 생성한다.
Figure 112009026250918-PCT00191
대표적인 구체예에서, 변형된 당은 펩티드 상의 O-글리칸 결합 자리에 부착될 수 있다. 이 펩티드 콘쥬게이트를 생성하는데 사용될 수 있는 글리코실트랜스퍼라아제는 Ser56 (-Glc-(Xyl)n-Gal-SA-PEG에 대해 - 갈락토실트랜스퍼라아제 및 시알릴트랜스퍼라아제; Ser56 -Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG에 대해 - 자일로실트랜스퍼라아제; 및 Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-(SA)m-PEG에 대해 - GlcNAc 트랜스퍼라아제를 포함한다.
III . A. 펩티드에 변형된 당의 콘쥬게이션
PEG 변형된 당은 적절합 효소를 사용하여 글리코실화 또는 비글리코실화된 펩티드에 콘쥬게이트되어 콘쥬게이션을 매개한다. 바람직하게는, 변형된 도너 당(들), 효소(들) 및 어셉터 펩티드(들)의 농도는 어셉터가 소비될 때까지 글리코실화가 처리되도록 선택된다. 시알릴트랜스퍼라아제에 대해 설명하는 동안 하기 논의되는 고려사항은 일반적으로 글리코실트랜스퍼라아제 반응에 적용할 수 있다.본 발명에서 사용을 위한 바람직한 시알릴트랜스퍼라아제의 리스트는 도 6에서 제공된다.
요망되는 올리고당 구조를 합성하기 위해 글리코실트랜스퍼라아제를 사용하는 다수의 방법이 공지되어 있으며 일반적으로 즉석의 발명에 적용할 수 있다. 대표적인 방법은, 예를 들어, 본원에 참고로써 포함되는 WO 96/32491, Ito et al., Pure Appl . Chem. 65: 753 (1993), 미국 특허 번호 5,352,670, 5,374,541, 5,545,553, 공공 소유된 미국 특허 번호 6,399,336, 및 6,440,703, 및 공공 소유된 공개된 PCT 출원, WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231에서 기술된다.
본 발명은 단일 글리코실트랜스퍼라아제 또는 글리코실트랜스퍼라아제의 조합을 사용하여 실행된다. 예를 들어, 시알릴트랜스퍼라아제와 갈락토실트랜스퍼라아제의 조합을 사용할 수 있다. 하나 이상의 효소를 사용하는 구체예에서, 효소 및 기질은 바람직하게는 최초 반응 혼합물에서 혼합되고 또는 일단 제 1 효소 반응이 완료 또는 거의 완료된다면 제 2 효소 반응에 대한 효소 및 시약이 반응 매질에 첨가된다. 단일 용기 내 서열에서 2개의 효소적 반응을 수행함으로써, 전반적인 수율은 중간체 종이 분리되는 과정에 걸쳐 개선된다. 게다가, 여분 용매 및 부산물의 제거 및 정리가 감소된다.
바람직한 구체예에서, 각각의 제 1 및 제 2 효소는 글리코실트랜스퍼라아제이다. 다른 바람직한 구체예에서, 한 효소는 엔도글리코시다아제이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 2 이상의 효소가 본 발명의 변형된 글리코단백질을 만드는데 사용된다. 효소는 펩티드에 변형된 당의 첨가 전 또는 후 중 하나의 어떤 시점에 펩티드 상의 사카라이드 구조를 변형하기 위해 사용된다.
다른 구체예에서, 본 방법은 하나 이상의 엑소 또는 엔도글리코시다아제의 사용을 만든다. 글리코시다아제는 전형적으로 그것들을 파괴하기보다 오히려 글리코실 결합을 형성하기 위해 처리되는 돌연변이이다. 돌연변이 글리카나아제는 전형적으로 활성 자리 산성 아미노산 잔기에 대한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 예를 들어, 엔도글리카나아제가 엔도-H일 때, 치환된 활성 자리 잔기는 전형적으로 위치 130에서 Asp, 위치 132에서 Glu 또는 그것의 조합일 것이다. 아미노산은 일반적으로 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환될 수 있다.
돌연변이 효소는 보통 엔도글리카나아제 가수분해 단계의 역반응에 유사한 합성 단계에 의해 반응을 촉매한다. 이들 구체예에서, 글리코실 도너 분자(예를 들어, 요망되는 올리고- 또는 모노-사카라이드 구조)는 이탈기를 함유하고 반응은 단백질 상의 GlcNAc 잔기에 도너 분자의 부가로 진행된다. 예를 들어, 이탈기는 할로겐, 예로써, 플루오르일 수 있다. 다른 구체예에서, 이탈기는 Asn 또는 Asn-펩티드 모이어티이다. 추가 구체예에서, 글리코실 도너 분자 상의 GlcNAc 잔기가 변형된다. 예를 들어, GlcNAc 잔기는 1,2 옥사졸린 모이어티를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 콘쥬게이트를 생성하는데 이용되는 각각의 효소는 촉매적 양으로 존재한다. 특정 효소의 촉매적 양은 효소 기질의 농도 뿐 아니라 온도, 시간 및 pH 값과 같은 반응 조건에 따라서 다양하다. 미리 선택된 기질 농도 및 반응 조건 하에서 주어진 효소에 대한 촉매적 양을 결정하기 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있다.
상기 과정이 수행되는 온도는 대부분의 민감한 효소가 변성되는 온도로 결빙되는 것 이상의 범위에 있을 수 있다. 바람직한 온도 범위는 약 0 ℃ 내지 약 55 ℃, 더 바람직하게는 약 20 ℃ 내지 약 37 ℃이다. 다른 대표적인 구체예에서, 본 방법의 하나 이상의 성분은 호열성 효소를 사용하여 상승된 온도에서 수행된다.
반응 혼합물은 글리코실화된 어셉터에 충분한 시간 기간 동안 유지되며, 따라서 원하는 콘쥬게이트를 형성한다. 일부 콘쥬게이트는 보통 24 이하의 시간 내에 획득되는 회수가능한 양으로 몇 시간 후 검출될 수 있다. 당업자는 반응의 속도가 선택된 시스템에 대해 최적화되는 다수의 가변 인자(예를 들어, 효소 농도, 도너 농도, 어셉터 농도, 온도, 용매 부피)에 의존함을 이해할 것이다.
본 발명은 또한 변형된 펩티드의 산업적 스케일 제조를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은, 산업적 스케일은 적어도 1 그램의 완료되고, 정제된 콘쥬게이트를 생성한다.
하기 논의에서, 본 발명은 글리코실화된 펩티드에 변형된 시알산 모이어티의 콘쥬게이션에 의해 예시된다. 대표적인 변형된 시알산은 PEG로 표지된다. PEG-변형된 시알산 및 글리코실화된 펩티드의 사용에서 하기 논의의 초점은 예시의 명확함을 위한 것이며 본 발명이 이들 2개의 파트너의 콘쥬게이션으로 제한되는 것을 암 시하고자하는 의도는 아니다. 당업자는 일반적으로 시알산 이외의 변형된 글리코실 모이어티의 부가가 가능함을 이해한다. 게다가, 논의는 다른 PEG 모이어티, 치료 모이어티, 및 생분자를 포함하는 PEG 이외의 약제를 가지는 글리코실 유닛의 변형에 동일하게 적용가능하다.
효소적 접근은 펩티드 또는 글리코펩티드 상에서 페길화 또는 PPG화된 탄수화물의 선택적 도입을 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 PEG, PPG, 또는 마스킹된 반응 작용기를 함유하는 변형된 당을 이용하며, 적절한 글리코실트랜스퍼라아제 또는 글리코합성효소와 조합된다. 요망되는 탄수화물 연결을 만들 글리코실트랜스퍼라아제를 선택하고 도너 기질로서 변형된 당을 이용함으로써, PEG 또는 PPG는 펩티드 백본 상에, 글리코펩티드의 존재하는 당 잔기에 또는 펩티드에 부가된 당 잔기에 직접적으로 도입될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 시알릴트랜스퍼라아제에 대한 어셉터는 천연적으로 발생하는 구조로서 또는 그것이 재조합적으로, 효소적으로 또는 화학적으로 위치되는 것 중 하나로 변형된 펩티드 상에서 존재한다. 적절한 어셉터는, 예를 들어, 갈락토실 어셉터, 예로써, Galβ1, 4GlcNAc, Galβ1, 4GalNAc, Galβ1, 3GalNAc, 락토-N-테트라오스, Galβ1, 3GlcNAc, Galβ1, 3Ara, Galβ1, 6GlcNAc, Galβ1, 4Glc (락토오스) 및 당업자에게 공지된 기타 어셉터(예를 들어, Paulson et al , J. Biol. Chem . 253: 5617-5624 (1978) 참조)를 포함한다. 대표적인 시알릴트랜스퍼라아제는 본원에 설명된다.
한 구체예에서, 시알릴트랜스퍼라아제에 대한 어셉터는 글리코펩티드의 생체 내 합성에서 변형되는 글리코펩티드 상에 존재한다. 이러한 글리코펩티드는 글리코펩티드의 글리코실화 패턴의 우선 변형 없이 요구된 방법을 사용하여 시알릴화될 수 있다. 또 다르게는, 본 발명의 방법은 적당한 어셉터를 포함하지 않는 펩티드를 시알릴화하는데 사용될 수 있고; 우선 당업자에게 공지된 방법으로 어셉터를 포함하는 펩티드를 변형시킨다. 대표적인 구체예에서, GalNAc 잔기는 GalNAc 트랜스퍼라아제의 작용에 의해 부가된다.
대표적인 구체예에서, 갈락토실 어셉터는 펩티드, 예를 들어 GalNAc에 연결된 적절한 어셉터에 갈락토오스 잔기를 부착함으로써 만들어진다. 본 방법은 갈락토실트랜스퍼라아제 (예를 들어, Galβ1,3 또는 Galβ1,4)의 적절한 양 및 적절한 갈락토실 도너(예를 들어, UDP-갈락토오스)를 함유하는 반응 혼합물로 변형되는 펩티드를 인큐베이팅하는 것을 포함한다. 반응은 실질적으로 완료로 진행되도록 허용하고 또는 다르게는, 반응은 갈락토오스 잔기가 부가되는 양이 미리 선택될 때 종결된다. 선택된 사카라이드 어셉터를 만드는 다른 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
또 다른 구체예에서, 글리코펩티드-연결된 올리고당은 전체적으로 또는 부분적으로 중 하나로 우선 "트리밍"되어 하나 이상의 적절한 잔기가 적절한 어셉터를 얻도록 부가될 수 있는 시알릴트랜스퍼라아제에 대한 어셉터 또는 모이어티 중 하나에 노출된다. 글리코실트랜스퍼라아제 및 엔도글리코시다아제(예를 들어 미국 특허 번호 5,716,812)와 같은 효소가 부착 및 트리밍 반응에 유용하다. 본 방법의 다른 구체예에서, 펩티드의 시알산 모이어티는 본질적으로 완전히 제거되고(예를 들 어, 적어도 90, 적어도 95 또는 적어도 99%), 변형된 시알산에 대한 어셉터를 노출시킨다.
하기 논의에서, 본 발명은 그것에 부착되는 PEG 모이어티를 가지는 변형된 당의 사용으로 예시된다. 본 논의의 초점은 예시의 명확함을 위한 것이다. 당업자는 본 논의가 변형된 당이 치료 모이어티, 생분자 등을 지탱하는 이들 구체예에 동일하게 적절함을 인식할 것이다.
변형된 당의 부가 전에 탄수화물 잔기가 "트리밍"되는 본 발명의 대표적인 구체예에서, 고 만노오스는 원래의 제 1 세대 쌍안테나 구조로 트리밍된다. PEG 모이어티를 지지하는 변형된 당은 "트리밍 백(trimming back)"에 의해 노출되는 하나 이상의 당 잔기에 콘쥬게이트된다. 한 실시예에서, PEG 모이어티는 PEG 모이어티에 콘쥬게이트되는 GlcNAc 모이어티를 통해 부가된다. 변형된 GlcNAc는 쌍안테나 구조의 말단 만노오스 잔기의 하나 또는 둘 다에 부착된다. 또 다르게는, 변형되지 않은 GlcNAc는 분지된 종들의 말단의 하나 또는 둘 다에 부가될 수 있다.
다른 대표적인 구체예에서, PEG 모이어티는 갈락토오스 잔기를 가지는 변형된 당을 통해 쌍안테나 구조의 말단 만노오스 잔기의 하나 또는 둘 다에 부가되며, 이는 말단 만노오스 잔기 상에 부가되는 GlcNAc 잔기에 콘쥬게이트된다. 또 다르게는, 비변형된 Gal은 말단 GlcNAc 잔기의 하나 또는 둘 다에 부가될 수 있다.
또 추가 예에서, PEG 모이어티는 상기 논의된 바와 같은 변형된 시알산을 사용하여 Gal 잔기 상에 부가된다.
다른 대표적인 구체예에서, 고 만노오스 구조는 쌍안테나 구조 분지로부터 " 트리밍 백"된 만노오스이다. 한 구체예에서, PEG 모이어티는 폴리머와 함께 변형된 GlcNAc를 통해 부가된다. 또 다르게는, 비변형된 GlcNAc가 만노오스에 부가된 후, 부착된 PEG 모이어티와 함께 Gal에 부가된다. 또 다른 구체예에서, 비변형된 GlcNAc 및 Gal 잔기는 만노오스에 순차적으로 부가된 후 PEG 모이어티와 함께 변형된 시알산에 부가된다.
고 만노오스 구조는 또한 기본적인 트리-만노실 코어로 트리밍 백 될 수 있다.
추가 대표적인 구체예에서, 고 만노오스는 제 1 만노오스가 부착되는 GlcNAc에 "트리밍 백"된다. GlcNAc는 PEG 모이어티를 지지하는 Gal 잔기에 콘쥬게이트된다. 또 다르게는, 비변형된 Gal은 GlcNAc에 부가된 후 수용성 당과 함께 변형된 시알산이 부가된다. 또 다른 구체예에서, 말단 GlcNAc는 Gal과 콘쥬게이트되고 GlcNAc는 PEG 모이어티를 지탱하는 변형된 푸코오스와 함께 순차적으로 푸코실화된다.
고 만노오스는 또한 펩티드의 Asn에 부착되는 제 1 GlcNAc로 다시 트리밍될 수 있다. 한 구체예에서, GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 수용성 폴리머를 지탱하는 ha GlcNAc와 콘쥬게이트된다. 다른 구체예에서, GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 Gal과 함께 변형되어 수용성 폴리머를 지탱한다. 또 추가의 구체예에서, GlcNAc는 Gal과 함께 변형된 후, PEG 모이어티와 함께 변형되는 시알산의 Gal에 콘쥬게이션된다.
다른 대표적인 구체예에서, 각각 본원에 참고로써 포함되는 공공 소유된 미국 특허 출원 공개 20040132640; 20040063911; 20040137557; 미국 특허 출원 번호 10/369,979; 10/410,913; 10/360,770; 10/410,945 및 PCT/US02/32263에서 설명된다.
상기 설명된 예는 본원에 설명된 방법의 힘의 예시를 제공한다. 본원에 기술된 방법을 사용하여, "트리밍 백"하고 실질적으로 어떤 요망되는 구조의 탄수화물 잔기로 세우는 것이 가능하다. 변형된 당은 상기 설명된 탄수화물 모이어티의 말단에 부가될 수 있고, 또는 펩티드 코어와 탄수화물 말단 사이의 중간체가 될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 존재하는 시알산은 시알릴다아제를 사용하여 글리코펩티드로부터 제거되며, 이에 의해 모든 또는 대부분의 기초적인 갈락토실 잔기를 마스킹하지 않는다. 또 다르게는, 펩티드 또는 글리코펩티드는 갈락토오스 잔기 또는 갈락토오스 유닛으로 종결되는 올리코당 잔기로 표지된다. 갈락토오스 잔기의 노출 또는 부가에 따라, 적절한 시알릴트랜스퍼라아제는 변형된 시알산을 부가하는데 사용된다.
다른 대표적인 구체예에서, 시알산에 시알산을 전달하는 효소가 이용된다. 본 방법은 시알산 바로 밑에 글리칸 잔기를 노출시키기 위해 시알릴다아제와 함께 시알릴화된 글리칸을 처리하는 것 없이 실행될 수 있다. 대표적인 폴리머-변형된 시알산은 폴리(에틸렌 글리콜)로 변형된 시알산이다. 시알산 및 변형된 시알산 모이어티를 글리칸에 첨가하는 다른 대표적인 효소는 시알산을 포함하고 또는 ST3Gal3, CST-II, ST8Sia-II, ST8Sia-III 및 ST8Sia-IV를 포함하는 이들 종에 대해 글리칸 상에 존재하는 시알산 잔기를 교환한다.
또 추가의 접근에서, 마스킹된 반응성 작용은 시알산에 존재한다. 마스킹된 반응기는 바람직하게는 인자 VII/인자 VIIa 펩티드에 변형된 시알산을 부착하는데 사용되는 조건하에서 영향을 받지 않는다. 펩티드에 변형된 시알산의 공유적 부착 후, 마스크는 제거되고 펩티드는 PEG와 같은 약제와 함께 콘쥬게이트된다. 약제는 변형된 당 잔기에서 마스킹되지 않은 반응성 기와 그것의 반응에 의해 특이적 방법으로 펩티드에 콘쥬게이트된다.
글리코펩티드의 올리고당 측쇄의 말단 당에 따라서 어떤 변형된 당은 그것의 적절한 글리코실트랜스퍼라아제와 함께 사용될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 페길화된 구조의 도입에 요구되는 글리코펩티드의 말단 당은 발현 동안 자연적으로 도입될 수 있고 또는 적절한 글리코시다아제(들), 글리코실트랜스퍼라아제(들) 또는 글리코시다아제(들)과 글리코실트랜스퍼라아제(s)의 혼합물을 사용하여 발현 후 생성될 수 있다.
추가 대표적인 구체예에서, UDP-갈락토오스-PEG는 β1,4-갈락토실트랜스퍼라아제와 반응하여, 이에 의해 적절한 말단의 N-아세틸글루코사민 구조에 변형된 갈락토오스를 전달한다. 글리코펩티드 상의 말단 GlcNAc 잔기는 발현 동안 생성될 수 있고, 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균으로서 이러한 발현 시스템에서 발생할 뿐 아니라, 요구되는 시알릴다아제 및/또는 글리코시다아제 및/또는 글리코실트랜스퍼라아제와 함께 글리코펩티드를 처리함으로써 제조될 수 있다.
다른 대표적인 구체예에서, GlcNAc 트랜스퍼라아제, 예로써 GNT 1-5는 글리코펩티드 상의 말단 만노오스 잔기에 페길화된-GlcNAc를 전달하는데 이용된다. 또한 추가의 대표적인 구체예에서, N- 및/또는 O-연결된 글리칸 구조는 변형된 당과 함께 이후에 콘쥬게이트되는 아미노산 또는 말단 글리코실 잔기에 노출되기 위해 글리코펩티드로부터 효소적으로 제거된다. 예를 들어, 엔도글리카나아제는 글리코펩티드 상에 GlcNAc-연결된-Asn으로서 말단 GlcNAc을 노출시키기 위한 글리코펩티드의 N-연결된 구조를 제거하기 위해 사용된다. UDP-Gal-PEG 및 적절한 갈락토실트랜스퍼라아제가 노출된 GlcNAc에 기능적으로 PEG-갈락토오스를 도입하는데 사용된다.
또 다른 구체예에서, 변형된 당이 펩티드 백본에 당 잔기를 전달하는 것으로 알려진 글리코실트랜스퍼라아제를 사용하여 펩티드 백본에 직접 부가된다. 본 발명의 실행에 유용한 대표적인 글리코실트랜스퍼라아제는 이에 제한되는 것은 아니지만, GalNAc 트랜스퍼라아제 (GalNAc T1-14), GlcNAc 트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 글루코실트랜스퍼라아제, 자일로실트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제 등을 포함한다. 이 접근의 사용은 어떤 탄수화물이 결핍된 펩티드 상에서 또는 다르게는 글리코펩티드에 존재하는 펩티드 상에서 변형된 당의 직접 첨가를 허용한다. 두 경우에, 변형된 당의 첨가는 글리코실트랜스퍼라아제의 기질 특이성으로 정의되는 펩티드 백본 상의 특이적 위치에서 발생하며, 화학적 방법을 사용하여 단백질의 펩티드 백본의 변형 동안 일어나는 무작위 방법이 아니다. 약제의 배열은 적절한 아미노산 서열이 폴리펩티드 사슬에 엔지니어링 됨으로써 글리코실트랜스퍼라 아제 기질 펩티드 서열이 겹핍된 단백질 또는 글리코펩티드에 도입될 수 있다.
상기 설명한 각각의 대표적인 구체예에서, 펩티드에 변형된 당의 콘쥬게이션에 따라서 하나 이상의 추가 화학 또는 효소 변형 단계들이 이용될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 효소(예를 들어, 푸코실트랜스퍼라아제)는 펩티드에 부착되는 말단의 변형된 당에 글리코실 유닛(예를 들어, 푸코오스)를 부가하는데 사용된다. 다른 예에서, 효소적 반응은 변형된 당이 콘쥬게이트되지 않은 "캡" 자리에 이용된다. 또 다르게는, 화학적 반응은 콘쥬게이트된 변형된 당의 구조를 변형하는데 이용된다. 예를 들어, 콘쥬게이트된 변형된 당은 변형된 당이 부착되는 펩티드 성분과 함께 그것의 연결을 안정화 또는 불안정화하는 약제와 반응한다. 다른 예에서, 변형된 당의 성분은 펩티드에 그것의 콘쥬게이션에 따라서 탈보호된다. 당업자는 변형된 당이 펩티드에 콘쥬게이트된 후 단계에서 본 발명의 방법에 유용한 효소의 배열 및 화학적 공정이 있음을 인식할 것이다. 변형된 당-펩티드 콘쥬게이트의 추가 상술은 본 발명의 범주 내이다.
본 발명의 콘쥬게이트를 제조하기 위한 효소 및 반응 조건은 즉시 출원 및 공공 소유의 공개된 PCT 특허 출원 WO 03/031464, WO 04/033651, WO 04/099231의 상세한 설명에서 논의된다.
선택된 구체예에서, 곤충세포에서 발현된 펩티드는 리모델링된 글리코펩티드 상의 글리칸이 GlcNAc-Gal 글리코실 잔기를 포함하도록 리모델링된다. GlcNAc 및 Gal의 부가는 단일 용기에서 별개의 반응 또는 단일 반응으로서 발생할 수 있다. 이 예에서, GlcNAc-트랜스퍼라아제 I 및 Gal-트랜스퍼라아제 I이 사용된다. 변형된 시알릴 모이어티는 ST3 Gal-III를 사용하여 부가된다.
다른 구체예에서, GlcNAc, Gal 및 변형된 Sia의 부가는 또한 상기 설명한 효소를 사용하여 단일 반응 용기에서 발생할 수 있다. 각각의 효소적 리모델링 및 글리코페길화 단계는 개별적으로 수행된다.
펩티드가 포유동물 세포에서 발현될 때, 다른 방법이 사용된다. 한 구체예에서, Sia-Sia-L-R1을 형성하는 펩티드 상의 시알산에 직접적으로 변형된 시알산을 전달하거나, 또는 Sia-L-R1을 형성하는 변형된 시알산에 대한 펩티드 상의 시알산을 교환하는 시알릴트랜스퍼라아제와 펩티드가 접촉하는 것에 의한 콘쥬게이션 전에 리모델링에 대한 필요없이 펩티드는 콘쥬게이트된다. 본 방법에서 사용되는 대표적이 효소는 CST-II이다. 시알산에 시알산을 부가하는 다른 효소는 당업자에게 공지되어 있고 이러한 효소의 예는 본원에 첨부된 도면에서 설명된다.
본 발명의 콘쥬게이트를 제조하는 또 다른 방법에서, 포유동물 시스템에서 발현되는 펩티드는 시알릴다아제를 사용하여 탈시알릴화된다. 노출된 Gal 잔기는 O-연결된 글리칸에 특이적인 시알릴트랜스퍼라아제를 사용하여 변형된 시알산과 함께 시알릴화되며, O-연결된 변형된 글리칸을 가지는 펩티드를 제공한다. 탈시알릴화된, 변형된 펩티드는 선택적으로 ST3GalIII과 같은 시알릴트랜스퍼라아제를 사용하여 부분적으로 또는 완전히 재시알릴화된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 페길화된 펩티드 콘쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 하기로부터 선택되는 글리코실기를 포함하는 포함하는 펩티드와
Figure 112009026250918-PCT00192
하기로부터 선택되는 멤버인 화학식을 가지는 PEG-시알산 도너를 접촉하는 단계를 포함하며,
Figure 112009026250918-PCT00193
및
Figure 112009026250918-PCT00194
변수는 상기 기술한 바와 같고, 상기 도너로부터 PEG-시알산을 멤버에 전달하는 효소는 상기 전달에 적절한 조건하에서 상기 글리코실기의 GalNAc, Gal 및 Sia로부터 선택된다. 대표적인 변형된 시알산 도너는 폴리머, 예를 들어, 직쇄 또는 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티와 함께 링커 모이어티를 통해 변형된 CMP-시알산이다. 본원에 논의된 바와 같이, 펩티드는 변형된 당을 부착하기 전에 GalNAc 및/또는 Gal 및/또는 Sia ("리모델링됨")와 함께 선택적으로 글리코실화된다. 리모델링 단계는 단계들 사이에 글리코실화된 펩티드의 정제 없이 동일한 용기에서 순차적으로 일어날 수 있다. 또 다르게는, 하나 이상의 리모델링 단계 후, 글리코실화된 펩티드는 다음 글리코실화 또는 글리코페길화 단계에 대해 그것을 따르게 하기 전에 정제될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 본 발명은 추가로 숙주에서 펩티드를 발현하는 단계를 포함한다. 대표적인 구체예에서, 숙주는 포유동물 세포 또는 곤충 세포이다. 다른 대표적인 구체예에서, 포유동물 세포는 BHK 세포 및 CHO 세포로부터 선택된 멤버이고 곤충 세포는 스포도프테라 프루기페르다( Spodoptera frugiperda) 세포이다.
실시예에서 예시되고 하기 추가로 논의되는 바와 같이, PEG-당에 대한 어셉터 모이어티의 치환은 어떤 요망되는 수의 단계로 수행된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 펩티드에 GalNAc의 추가 다음에 PEG-당이 동일한 반응 용기에서 GalNAc에 콘쥬게이트되는 2 단계 일 수 있다. 또 다르게는, 이들 두 단계는 단일 용기에서 대략 동시에 수행될 수 있다.
대표적인 구체예에서, PEG-시알산 도너는 하기 화학식을 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00195
변수는 상기 기술된 바와 같다.
다른 대표적인 구체예에서, PEG-시알산 도너는 하기의 화학식을 가진다:
Figure 112009026250918-PCT00196
변수는 상기 기술된 바와 같다.
추가 대표적인 구체예에서, 펩티드는 글리코페길화 또는 리모델링되기 전 적절한 발현 시스템에서 발현된다. 대표적인 발현 시스템은 Sf-9/바큘로바이러스 및 중국 햄스터 난소세포주(CHO) 세포를 포함한다.
대표적인 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식을 가지는 변형된 시알릴 잔기를 포함하는 글리코실 링커를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다:
Figure 112009026250918-PCT00197
D는 -OH 및 R1-L-HN-으로부터 선택되는 멤버이고; G는 Rl-L- 및 -C(O)(C1-C6)알킬-R1로부터 선택되는 멤버이고; R1은 직쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기 및 분지된 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기로부터 선택되는 멤버를 포함하는 모이어티이고; M은 H, 금속 및 단일 음전하로부터 선택되는 멤버이고; L은 결합, 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 멤버인 링커이며, D가 OH일 때, G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6)알킬일 때, D는 R1-L-NH- 이고
상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 하기 글리코실 모이어티를 포함하는 펩티드를
Figure 112009026250918-PCT00198
하기 화학식을 가지는 PEG-시알산 도너 모이어티 및 전달에 적절한 조건하에서 상기 글리코실 모이어티의 Gal 상에 상기 PEG-시알산을 전달하는 효소와 접촉하 는 단계:
Figure 112009026250918-PCT00199
변수는 상기 기술된 바와 같다.
대표적인 구체예에서, L-R1은 하기 화학식을 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00200
a는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
다른 대표적인 구체예에서, R1은 하기로부터 선택되는 멤버인 구조를 가지며:
Figure 112009026250918-PCT00201
e, f, m 및 n은 1 내지 2500으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고; q는 0 내지 20으로부터 선택되는 정수이다.
펩티드 콘쥬게이트의 큰 스케일 또는 작은 스케일의 양이 본원에 기술된 방법으로 제조될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.5 mg 내지 약 100kg으로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.1 kg 내지 약 1 kg로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.5 kg 내지 약 10kg로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.5 kg 내지 약 3kg으로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.1 kg 내지 약 5kg으로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.08 kg 내지 약 0.2 kg으로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.05 kg 내지 약 0.4kg으로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 0.1 kg 내지 약 0.7kg로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에 서, 펩티드의 양은 약 0.3 kg 내지 약 1.75 kg으로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드의 양은 약 25 kg 내지 약 65kg로 선택되는 멤버이다.
본원에 기술되는 반응에 이용되는 펩티드의 농도는 약 0.5 내지 약 10 mg 펩티드/mL 반응 혼합물로부터 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 농도는 약 0.5 내지 약 1 mg 펩티드/mL 반응 혼합물로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 농도는 약 0.8 내지 약 3 mg 펩티드/mL 반응 혼합물로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 농도는 약 2 내지 약 6 mg 펩티드/mL 반응 혼합물로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 농도는 약 4 내지 약 9 mg 펩티드/mL 반응 혼합물로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 농도는 약 1.2 내지 약 7.8 mg 펩티드/mL 반응 혼합물로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 농도는 약 6 내지 약 9.5 mg 펩티드/mL 반응 혼합물로 선택되는 멤버이다.
본원에 기술되는 반응에서 이용될 수 있는 페길화된 뉴클레오티드 당의 농도는 약 0.1 내지 약 1.0 mM로 선택되는 멤버이다. 농도를 증가 또는 감소시킬 수 있는 인자는 PEG의 크기, 인큐베이션 시간, 온도, 버퍼 성분 및 사용된 글리코실트랜스퍼라아제의 종류 및 농도를 포함한다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.1 내지 약 1.0 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.1 내지 약 0.5 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.1 내지 약 0.3 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.2 내지 약 0.7 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.3 내지 약 0.5 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.4 내지 약 1.0 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.5 내지 약 0.7 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.8 내지 약 0.95 mM로 선택되는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당 농도는 약 0.55 내지 약 1.0 mM로 선택되는 멤버이다.
본원에 기술되는 반응에 이용될 수 있는 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 단백질에 부가될 수 있는 페길화된 당의 이론적 수를 기초로 한다. 페길화된 당의 이론적 수는 단백질의 당 자리의 이론적 수뿐 아니라 MW와 비교할 때 단백질의 MW 및 이에 따라 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰을 기초로 한다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 1 내지 20으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 1 내지 20으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 2 내지 6으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 3 내지 17로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 4 내지 11로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당은 5 내지 20으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 1 내지 10으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량 은 12 내지 20으로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 14 내지 17로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 7 내지 15로부터 선택되는 정수이다. 대표적인 구체예에서, 페길화된 뉴클레오티드 당의 몰 당량은 8 내지 16로부터 선택되는 정수이다.
III . B. 동시에 일어나는 탈시알릴화 및 글리코페길화
본 발명은 글리코페길화의 "원-포트" 방법을 제공한다. 원-포트 방법은 펩티드 콘쥬게이트를 만드는 다른 대표적인 공정과 분리되며, 시알리다아제로 순차적인 탈-시알릴화, 이후에 음이온 교환 컬럼에서 아시알로펩티드의 정제, 다음에 CMP-시알산-PEG 및 글리코실트랜스퍼라아제(예로써, ST3Gal3), 엑소글리코시다아제 또는 엔도글리코시다아제를 사용하여 글리코페길화 한다. 펩티드 콘쥬게이트는 이후에 음이온 교환 후 정제된 펩티드 콘쥬게이트를 생성하기 위한 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제된다.
원-포트 방법은 펩티드 콘쥬게이트를 제조하기 위한 개선된 방법이다. 이 방법에서 탈-시알릴화 및 글리코페길화 반응은 아시알로펩티드를 정제하기 위해 이전에 기술된 공정에서 사용된 제 1 음이온 교환 크로마토그래피를 제거하는 원-포트 반응으로 조합된다. 공정 단계에서의 이 감소는 몇 개의 이점을 만든다. 첫째로, 펩티드 콘쥬게이트를 만드는데 요구되는 공정 단계의 수가 감소되며, 이는 또한 공정의 작업 복잡성을 감소시킨다. 둘째로, 펩티드 콘쥬게이트의 생성을 위한 공정 시간은 예를 들어, 4 내지 2일로 감소된다. 이는 가공되지 않은 물질 요구 및 공정 내 조절과 관련된 품질 조절 비용을 감소시킨다. 셋째, 본 발명은, 예를 들어, 500 mU/L가 본 공정에 대한 펩티드 콘쥬게이트를 생성하는데 필요로되는 더 적은 시알리다아제, 예를 들어, 20-배 미만 시알리다아제를 이용한다. 시알리다아제의 사용에서 이런 감소는 반응 혼합물에서 시알리다아제와 같은 오염물질의 양을 상당히 감소시킨다.
대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 하기 방법으로 제조된다. 제 1 단계에서, 펩티드는 시알릴다아제, 본 발명의 변형된 당, 변형된 당으로부터 펩티드에 글리코실 연결기의 전달을 촉매할 수 있는 효소와 합쳐지고, 따라서 펩티드 콘쥬게이트가 제조된다. 어떤 시알릴다아제가 본 방법에서 사용될 수 있다. 본 방법에 사용되는 대표적인 시알릴다아제는 CAZY 데이터베이스에서 찾을 수 있다(afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html 및 www.cazy.org/CAZY 참조). 대표적인 시알릴다아제는 임의의 수의 제조업자로부터 구입할 수 있다(QA-Bio, Calbiochem, Manikin, Prozyme 등). 대표적인 구체예에서, 시알릴다아제는 세포질 시알릴다아제, 리소좀 시알릴다아제, 엑소-α 시알리다아제 및 엔도시알리다아제로부터 선택되는 멤버이다. 다른 대표적인 구체예에서, 사용되는 시알리다아제는 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 또는 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae)과 같은 박테리아 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스로부터 생성된다. 대표적인 구체예에서, 변형된 당으로부터 펩티드에 글리코실 연결기의 전달을 촉매할 수 있는 효소는 시알릴트랜스퍼라아제 및 푸코실트랜스퍼라아제와 같은 글리코실트랜스퍼라아제 및 엑소글리코시다아제 및 엔도글리코시다아제로부터 선택되 는 멤버이다. 대표적인 구체예에서, 효소는 ST3Gal3인 글리코실트랜스퍼라아제이다. 다른 대표적인 구체예에서, 사용되는 효소는 대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아 또는 아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger)와 같은 진균으로부터 생성된다. 다른 대표적인 구체예에서, 시알릴다아제는 특정 시간 동안 글리코실트랜스퍼라아제 전에 펩티드를 첨가하여, 시알릴다아제 반응을 진행되도록 한 후 PEG-시알산 시약과 글리코실트랜스퍼라아제의 첨가로 글리코페길화 반응을 시작한다. 다수의 이들 예가 본원에서 논의된다. 최종적으로, 본원에 기술된 어떤 변형된 당이 본 반응에 이용될 수 있다.
다른 대표적인 구체예에서, 본 방법은 '캡핑' 단계를 추가로 포함한다. 이 단계에서, 추가의 비-페길화된 시알산이 반응 혼합물에 부가된다. 대표적인 구체예에서, 이 시알산은 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트에 부가되어 PEG-시알산의 더 이상의 부가를 예방한다. 다른 대표적인 구체예에서, 이 시알산은 반은 혼합물에서 글리코실트랜스퍼라아제의 기능을 방해하고, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트에 글리코실 연결기의 부가를 효과적으로 멈춘다. 가장 중요하게는, 반응 혼합물에 부가되는 시알산은 비글리코페길화된 글리칸을 캡핑하여 개선된 약동학을 가지는 펩티드 콘쥬게이트를 제공한다. 게다가, 특정 양의 페길화 정도가 우선 정제 없이 요망될 때 이 시알릴다아제는 직접적으로 페길화 반응 혼합물에 부가될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 캡핑 단계 후, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 시알릴화 자리의 약 50% 미만은 시알릴 모이어티를 포함하지 않는다. 대표적인 구체예에서, 캡핑 단계 후, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 시알릴화 자리의 약 40% 미만은 시알릴 모이어티를 포함하지 않는다. 대표적인 구체예에서, 캡핑 단계 후, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 시알릴화 자리의 약 30% 미만은 시알릴 모이어티를 포함하지 않는다. 대표적인 구체예에서, 캡핑 단계 후, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 시알릴화 자리의 약 20% 미만은 시알릴 모이어티를 포함하지 않는다. 대표적인 구체예에서, 캡핑 단계 후, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 시알릴화 자리의 약 10% 미만은 시알릴 모이어티를 포함하지 않는다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 시알릴화 자리의 약 20% 내지 약 5%는 시알릴 모이어티를 포함하지 않는다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 시알릴화 자리의 약 25% 내지 약 10%는 시알릴 모이어티를 포함하지 않는다. 대표적인 구체예에서, 캡핑 단계 후, 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트 상의 본질적으로 모든 시알릴화 자리는 시알릴 모이어티를 포함한다.
III . C. 펩티드의 탈시알릴화 및 선택적 변형
다른 대표적인 구체예에서, 본 발명은 펩티드를 탈시알릴화하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 약 40%, 바람직하게는 45%, 바람직하게는 약 50%, 바람직하게는 약 55%, 바람직하게는 약 60%, 바람직하게는 약 65%, 바람직하게는 약 70%, 바람직하게는 약 75%, 바람직하게는 약 80%, 바람직하게는 약 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 94%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 96%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 98%, 및 훨씬 더 바람직하게는 100% 탈시알릴화되는 펩티드를 제공한다.
본 방법은 바람직하게는 시간 기간 동안 펩티드를 시알릴다아제와 접촉하는 것을 포함한다. 미리선택된 시간 기간은 요망된 정도로 펩티드를 탈시알릴화하기에 충분하다. 바람직한 구체예에서, 요망되는 정도의 탈시알릴화가 달성될 때, 탈시알릴화된 펩티드는 시알리다아제로부터 분리된다. 대표적인 탈시알릴화 반응 및 정제 사이클은 본원에서 설명된다.
당업자는 탈시알릴화 반응을 수행하는데 적절한 미리선택되는 시간 기간을 결정할 수 있다. 대표적인 구체예에서, 기간은 24시간 미만, 바람직하게는 8시간 미만, 더 바람직하게는 6시간 미만, 더 바람직하게는 4시간, 훨씬 더 바람직하게는 2시간 및 더욱더 바람직하게는 1시간 미만이다.
다른 대표적인 구체예에서, 탈시알릴화 반응의 마지막에 펩티드 콘쥬게이트 제조에서, 펩티드 모집단 멤버의 적어도 10%는 그것에 부착되는 유일한 단일 시알산을 가지며, 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 40%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 50% 및 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 및 훨씬 더 바람직하게는 완전하게 탈시알릴화된다.
또 추가의 대표적인 구체예에서, 탈시알릴화 반응의 마지막에 제조에서, 펩티드 모집단의 멤버의 적어도 10%는 완전히 탈시알릴화되며, 바람직하게는 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 30%, 더욱더 바람직하게는 적어도 40%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 50% 및 더욱 훨씬 더 바람직하게는 적어도 60%이다.
또 다른 대표적인 구체예에서, 탈시알릴화 반응의 마지막에 제조에서, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%의 펩티드 모집단은 유일한 단일 시알산을 가지며, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%의 펩티드는 완전히 디시알릴화된 다.
바람직한 구체예에서, 탈시알릴화 반응의 마지막에 제조에서, 펩티드 모집단의 적어도 50%는 완전히 디시알릴화되고 펩티드 모집단 멤버의 적어도 40%는 오직 단일 시알산 모이어티를 지탱한다.
탈시알릴화 후에, 펩티드는 변형된 당과 함께 선택적으로 콘쥬게이트된다. 대표적인 변형된 당은 분지된 또는 선형의 폴리(에틸렌 글리콜)모이어티에 결합된 사카릴 모이어티를 포함한다. 콘쥬게이션은 변형된 당 도너로부터 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 변형된 당을 전달하는 효소에 의해 촉매된다. 대표적인 변형된 당 도너는 분지된 또는 선형 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 지지하는 CMP-시알산이다. 대표적인 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티는 적어도 약 2 kD, 더 바람직하게는 적어도 약 5 kD, 더 바람직하게는 적어도 약 10 kD, 바람직하게는 적어도 약 20 kD, 더 바람직하게는 적어도 약 30 kD, 및 더 바람직하게는 적어도 약 40 kD의 분자량을 가진다.
대표적인 구체예에서, 변형된 당 도너로부터 변형된 당 모이어티를 전달하기 위해 이용되는 효소는 글리코실트랜스퍼라아제, 예를 들어, 시알릴트랜스퍼라아제이다. 본 발명의 방법에 사용되는 대표적인 시알릴트랜스퍼라아제는 ST3Gal3이다.
본 발명의 대표적인 방법은 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개의 변형기를 지지하는 변형된 펩티드를 초래한다. 한 구체예에서, 생성된 펩티드는 펩티드의 경쇄에 있는 단일 변형기를 지지한다. 다른 구체예에서, 본 방법은 중쇄의 단일 변형기를 지지하는 변형된 펩티드를 제공한다. 또 다른 구 체예에서, 본 방법은 경쇄의 단일 변형기와 중쇄의 단일 변형기를 가지는 변형된 펩티드를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 변형된 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 변형기를 지탱하는 변형된 당 도너를 가지는 펩티드와 변형된 당 모이어티를 변형된 당 도너로부터 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 전달할 수 있는 효소를 접촉하는 것을 포함한다.
대표적인 구체예에서, 본 방법은 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80%의 모집단 멤버가 펩티드의 경쇄 사슬에서 모노-콘쥬게이트되는 변형된 펩티드의 모집단을 제공한다.
대표적인 구체예에서, 본 방법은 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 80%의 모집단 멤버가 펩티드의 경쇄에서 디-콘쥬게이트되는 변형된 펩티드의 모집단을 제공한다.
본 양태의 대표적인 구체예에서, 본 방법은 50% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만의 모집단 멤버가 펩티드의 중쇄에서 모노-콘쥬게이트되는 변형된 펩티드의 모집단을 제공한다.
본 양태의 대표적인 구체예에서, 본 방법은 50% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 더 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만의 모집단 멤버가 펩티드의 중쇄에 디-콘쥬게이트되는 변형된 펩티드의 모집단을 제공한다.
펩티드는 접촉 단계 전 시알리다아제의 작용을 받을 수 있고, 또는 펩티드는 우선 탈시알릴화 없이 사용될 수 있다. 펩티드가 시알리다아제와 접촉될 때, 이는 본질적으로 완전하게 탈시알릴화 또는 단지 부분적으로 탈시알릴화 중의 하나일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 펩티드는 접촉 단계 전에 적어도 부분적으로 탈시알릴화된다. 펩티드는 본질적으로 완전하게 탈시알릴화(본질적으로 아시알로) 또는 단지 부분적으로 탈시알릴화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 탈시알릴화된 펩티드는 본원에서 상기 기술된 탈시아릴화된 구체예 중 하나이다.
III . D. 펩티드 콘쥬게이트 합성에서 부가된 시약의 추가적 알리쿼트
본원에 기술된 펩티드 콘쥬게이트의 합성의 대표적인 구체예에서, 하나 이상의 추가 알리쿼트의 반응 성분/시약이 선택된 시간 기간 후 반응 혼합물에 부가된다. 대표적인 구체예에서, 펩티드 콘쥬게이트는 펩티드 콘쥬게이트이다. 다른 대표적인 구체예에서, 부가된 반응 성분/시약은 변형된 당 뉴클레오티드이다. 반응에 변형된 당 뉴클레오티드의 도입은 글리코페길화 반응이 완료로 움직이는 가능성을 증가시킨다. 대표적인 구체예에서, 뉴클레오티드 당은 본원에 기술된 CMP-SA-PEG 이다. 대표적인 구체예에서, 부가된 반응 성분/시약은 시알리다아제이다. 대표적인 구체예에서, 부가된 반응 성분/시약은 글리코실트랜스퍼라아제이다. 대표적인 구체예에서, 부가된 반응 성분/시약은 마그네슘이다. 대표적인 구체예에서, 부가된 추가적 알리쿼트는 반응의 시작에 부가되는 본래 양의 약 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 80% 또는 90%를 나타낸다. 대표적인 구체예에서, 반응 성분/시약은 반응의 시작 후 약 3시간, 또는 6시간 또는 8시 간, 또는 10 시간, 또는 12시간, 또는 18 시간, 또는 24 시간 또는 30 시간, 또는 36 시간에 부가된다.
III . E. 펩티드 콘쥬게이트의 정제
상기 과정으로 생성된 생성물은 정제없이 사용될 수 있다. 그러나, 이는 생성물 및 하나 이상의 중간체, 예를 들어, 뉴클레오티드 당, 분지된 및 선형 PEG 종, 변형된 당 및 변형된 뉴클레오티드 당을 회수하기에 보통 바람직하다. 얇은 또는 두꺼운 층 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 막여과와 같은 글리코실화된 펩티드의 회수를 위한 표준의 공지된 기법이 사용될 수 있다. 회수를 위해 막 여과가 바람직하며, 더 바람직하게는 역삼투막 또는 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 기법을 이용하는 것은 본원에서 이후에 그리고 본원에 인용된 문헌에서 논의된다. 예를 들어, 막이 약 3000 내지 약 10,000의 분자량 컷오프를 가지는 막 여과는 글리코실 트랜스퍼라아제와 같은 단백질을 제거하는데 사용될 수 있다. 특정 예에서, 불순물과 생성물 사이의 분자량 컷오프 차이는 생성물 순도를 보장하기 위해 이용될 것이다. 예를 들어, 미반응된 CMP-SA-PEG-40 kD으로부터 생성물 펩티드-SA-PEG-40 kD을 정제하기 위해, 필터는, 예를 들어, 펩티드-SA-PEG-40 kD가 잔여물 내 남는 것을 허용하며, 한편 CMP-SA-PEG-40 kD은 여액에 흘러들어가도록 선택되어야한다. 나노여과 또는 역삼투압은 그 후 염을 제거 및/또는 생성물 사카라이드를 정제하는데 사용될 수 있다(예를 들어, WO 98/15581 참조). 나노여과 막은 사용된 막에 따라서 1가의 염은 통과하지만 다가의 염 및 약 100 내지 2,000 달톤 이상의 비전하 용질은 남는 역삼투압 막의 종류이다. 따라서, 전형적인 용도로, 본 발명의 방법으로 제조되는 사카라이드는 막에 남을 것이고 오염 염은 통과할 것이다.
펩티드가 제 1 단계로서 세포 내로 생성된다면, 숙주 세포 또는 용혈된 분획 중 하나의 미립자 파편은 제거된다. 글리코페길화 후, 페길화된 펩티드는 당업계에 인식된 방법, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과로 정제되며; 선택적으로, 단백질은 상업적으로 이용가능한 단백질 농도 필터로 농축된 후 면역친화 크로마토그래피, 이온-교환 컬럼 분류(예를 들어, 디에틸아미노에틸 (DEAE) 또는 카르복시메틸 또는 술포프로필기를 함유하는 매트릭스), 블루-세파로오스, CM 블루-세파로오스, MONO-Q, MONO-S, 렌틸렉틴-세파로오스, WGA-세파로오스, Con A-세파로오스, 에테르 토요펄, 부틸 토요펄, 페닐 토요펄, 또는 단백질 A 세파로오스 상의 크로마토그래피, SDS-PAGE 크로마토그래피, 실리카 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 역상 HPLC (예를 들어, 첨부된 지방족 기를 가지는 실리카겔), 예를 들어, 세파덱스 몰레큘러 시브 또는 크기-배제 크로마토그래피, 폴리펩티드, 및 에탄올 또는 황산 암모늄 침전을 선택적으로 연결하는 컬럼 상 크로마토그래피를 사용하는 겔 여과로부터 선택되는 하나 이상의 단계에 의해 다른 불순물로부터의 폴리펩티드 변형을 분리시킨다. 정제는 본 섹션 후에 추가로 기술되는 다른 것으로부터 인자 VII/인자 VIIa 펩티드 콘쥬게이트의 하나의 사슬을 분리하는데 사용될 수 있다.
배양에서 생성된 변형된 글리코펩티드는 세포, 효소 등으로부터 처음 추출에 의해 통상적으로 분리된 후 하나 이상의 농도, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기-배제 크로마토그래피 단계를 따른다. 추가적으로, 변형된 글리코단백질은 친화도 크 로마토그래피로 정제될 수 있다. 최종적으로, HPLC는 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다.
프로테아제 억제제는 단백질 가수 분해를 억제하기 위해 앞서 언급한 어떤 단계들에 포함될 수 있고, 항생제 또는 보존제가 외부 오염물질의 성장을 막기 위해 포함될 수 있다. 앞서 언급한 단계들에 사용되는 프로테아제 억제제는 안티파인, 알파-1-안티트립신, 안티-트롬빈, 류펩틴, 아미스타틴, 키모스타틴, 반자미딘, 및 기타 세린 프로테아제 억제제(즉, 세르핀)을 포함하는 낮은 분자량 억제제일 수 있다. 일반적으로, 비록 세포 배양 내 키모스타틴이 200 μM 이상의 농도에서 사용될 수 있다 해도, 세린 프로테아제 억제제는 0.5-100 μM 범위의 농도에서 사용되어야 한다. 다른 세린 프로테아제 억제제는 키모트립신-유사, 서브틸리신-유사, 알파/베타 히드롤라아제, 또는 세린 프로테아제의 단일 펩티다아제 클랜에 특이적인 억제제를 포함할 것이다. 세린 프로테아제에 더하여, 다른 종류의 프로테아제 억제제도 또한 시스테인 프로테아제 억제제(1 - 10 μM) 및 아스파르트산 프로테아제 억제제(1 -5 μM) 및 펩스타틴과 같은 비-특이적 프로테아제 억제제(.1 - 5 μM)를 포함하여 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 프로테아제 억제제는 또한 천연 프로테아제 억제제, 예로써 거머리로부터 분리되는 히루스타신(hirustasin) 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 프로테아제 억제제는 글리코페길화 반응을 방해하지 않고 인자 VII/인자 VIIa을 안정화하는 프로테아제 촉매 자리에 특이적으로 결합할 수 있는 합성 펩티드 또는 항체들을 포함할 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 변형된 글리코펩티드를 생성하는 시스템으로부 터 상청액은 시판중인 단백질 농도 필터, 예를 들어, 아미콘 또는 밀리포아 펠리콘 한외여과 유닛을 사용하여 우선 농축된다. 농축 단계 후, 농축물은 적당한 정제 매트릭스에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적당한 친화 매트릭스는 펩티드, 적당한 지지대에 결합된 렉틴 또는 항체 분자를 포함할 수 있다. 또 다르게는, 음이온-교환 수지, 예를 들어, 현수된 DEAE 기를 가지는 매트릭스 또는 기질이 사용된다. 적당한 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 단백질 정제에 흔히 사용되는 다른 종류를 포함한다. 또 다르게는, 양이온-교환 단계가 사용될 수 있다. 적절한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 술포프로필기가 특히 바람직하다.
정제에서 사용되는 다른 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 수산화인회석 크로마토그래피, 소수 상호작용 크로마토그래피 및 블루 세파로오스 상의 크로마토그래피를 포함한다. 이들 및 다른 유용한 방법이 공동-양도된 미국 가특허 번호 (2005년 5월 6일 출원된 대리인 명부 No. 40853-01-5168-P1)에서 예시된다.
소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어, 현수된 메틸 또는 다른 지방족기를 가지는 실리카겔을 사용하는 하나 이상의 RP-HPLC 단계가 폴리펩티드 콘쥬게이트 조성물을 추가로 정제하는데 사용될 수 있다. 다양한 조합으로 앞서 언급한 정제 단계들의 일부 또는 모두가 또한 균질한 또는 본질적으로 균질한 변형된 글리코단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
라지 스케일의 발효로부터 야기되는 본 발명의 변형된 글리코펩티드는 Urdal et al ., J. Chromatog . 296: 171 (1984)에 의해 개시되는 것과 유사한 방법으로 정 제될 수 있다. 이 참고문헌은 분취 HPLC 컬럼 상 재조합 인간 IL-2의 정제를 위한 2 서열의, RP-HPLC 단계들을 기술한다. 또 다르게는, 친화도 크로마토그래피와 같은 기법이 변형된 글리코단백질을 정제하기 위해 이용될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 정제는 공공 소유되고, 공동-양도된 2005년 3월 24일 출원된 미국 가특허 번호 60/665,588에서 언급된 방법으로 수행된다.
본 발명에 따라서, 순차적인 탈시알릴화 또는 동시의 시알릴화 중 하나를 통해 생성된 페길화된 펩티드 또는 펩티드 콘쥬게이트는 염화마그네슘 기울기를 사용하여 정제되고 분해될 수 있다.
IV . 약학 조성물
다른 양태에서, 본 발명은 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 및 비천연적으로 발생하는, PEG 모이어티, 치료 모이어티 또는 생분자와 글리코실화된 또는 비-글리코실화된 펩티드 사이의 공유적 콘쥬게이트를 포함한다. 폴리머, 치료 모이어티 또는 생분자는 사이에 삽입된 무손상 글리코실 연결기를 통해 펩티드에 콘쥬게이트되고, 펩티드 둘 다에 및 폴리머, 치료 모이어티 또는 생분자에 공유적으로 연결된다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용에 적당하다. 본 발명에서의 사용에 적당한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)에서 발견된다. 약물 전달을 위한 간략한 검토에 대해, Langer, Science 249:1527-1533 (1990) 참조.
대표적인 구체예에서, 약학 제형은 펩티드 콘쥬게이트 및, 염화 나트륨, 염 화 칼슘 2수화물, 글리실글리신, 폴리소르베이트 80 및 만니톨로부터 선택되는 멤버인 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함한다. 다른 대표적인 구체예에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 염화나트륨 및 글리글리신이다. 다른 대표적인 구체예에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 염화 칼슘 2수화물 및 폴리소르베이트 80이다. 다른 대표적인 구체예에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 만니톨이다.
약학적 조성물은 국소, 경구, 비강, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함하는 어떤 적당한 방법을 위해 제형으로 될 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여를 위해, 담체는 바람직하게는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함한다. 경구 투여를 위해, 어떤 상기 담체 또는 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스 및 탄산 마그네슘과 같은 고체 담체가 사용될 수 있다. 생분해성 마이크로스피어(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)가 또한 본 발명의 약학 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 적당한 생분해성 마이크로스피어는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,897,268 및 5,075,109에 개시된다.
통상적으로, 약학 조성물은 비경구적으로, 예를 들어, 정맥 내로 투여된다. 따라서, 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에서 용해 또는 현탁된 화합물을 포함하는 비경구 투여를 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 pH 조절 및 완충제, 등장 조절제, 습윤제, 세제 등과 같은 적절한 생리적 조건에 요구되는 약학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다.
이들 조성물은 통상적인 멸균 기법으로 멸균될 수 있고, 또는 멸균여과될 수 있다. 결과 수성 용액은 동결건조되거나, 투여 전 멸균 수성 담체와 조합된 동결건조 제제로서 사용을 위해 패키징될 수 있다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9, 가장 바람직하게는 7 내지 8일 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 글리코펩티드는 표준 소포-형성 지질로부터 형성되는 리포좀에 포함될 수 있다. 예를 들어, Szoka et al ., Ann . Rev . Biophys . Bioeng. 9: 467 (1980), 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728 및 4,837,028에 기술된 다양한 방법이 리포좀의 제조를 위해 이용될 수 있다. 다양한 표적 약제를 사용하여 리포좀을 표적화하는 것(예를 들어, 본 발명의 시알릴 갈락토시드)은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 4,957,773 및 4,603,044 참조).
리포좀에 표적 약제를 커플링하는 표준 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 표적 약제 또는 본 발명의 지질-유도된 글리코펩티드와 같은 유도된 친지질성 화합물의 부착을 위해 활성화될 수 있는 포스파티딜에탄올아민과 같은 지질 성분의 리포좀에 포함을 일반적으로 포함한다.
표적화 메커니즘은 표적 모이어티가 표적, 예를 들어, 세포 표면 어셉터와 상호작용할 수 있도록 표적 약제가 리포좀의 표면에 위치되는 것을 일반적으로 요구한다. 본 발명의 탄수화물은 당업자에게 공지된 방법(예를 들어, 각각 장쇄 알킬 할로겐화물 또는 지방산을 가지는 탄수화물 상에 존재하는 히드록실기의 알킬화 또는 아실화)을 사용하여 리포좀이 형성되기 전에 지질 분자에 부착될 수 있다. 또 다르게는, 리포좀은 연결부분이 막을 형성하는 시기에 막에 우선 포함되도록 형성 될 수 있다. 연결 부분은 막에서 단단하게 임베딩되고 고정되는 친지질성 부분을 가져야 한다. 또한 리포좀의 수성 표면에서 화학적으로 이용할 수 있는 반응 부분을 가져야한다. 반응 부분은 후에 첨가되는 표적 약제 또는 탄수화물과 안정한 화학 결합을 형성하기 위해 화학적으로 적당하게 되도록 선택된다. 일부 경우에, 연결 분자에 직접 표적 약제를 부착할 수 있지만, 대부분의 경우에는 화학적 브릿지로서 작용하는 제 3 분자를 사용하는 것이 더 적합하고, 따라서 소포 표면으로부터 3차원적으로 연장된 표적 약제 또는 탄수화물을 가지는 막에서 연결 분자를 연결한다.
본 발명의 방법으로 제조되는 화합물은 또한 진단 시약으로서 사용을 발견할 수 있다. 예를 들어, 표지된 화합물은 염증을 가지는 것으로 의심되는 환자에서 염증 또는 종양 전이의 부위를 알아내기 위해 사용될 수 있다. 이 사용을 위해, 화합물은 125I, 14C, 또는 트리튬으로 표지될 수 있다.
본 발명의 조성물을 제조하는데 사용되는 종들에 대한 분취 방법은 다양한 특허 공보, 예를 들어, US 20040137557; WO 04/083258; 및 WO 04/033651에 일반적으로 기술되어 있다. 하기 실시예는 본 발명의 콘쥬게이트, 및 방법을 예시하기 위해 제공되며, 청구된 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
인자 VIIa 의 탈시알릴화
무혈청 배지에서 발현되는 인자 VIIa, 혈청 함유 배지에서 생성되는 인자 VIIa에 인자 VIIa 돌연변이 N145Q, N322Q, 및 유사체 DVQ(V158D/E296V/M298Q)를 더한다.
효소적 탈시알릴화를 위한 제조에서, 인자 VIIa를 MES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 5OmM MES, pH 6으로 4℃에서 밤새 10 kD의 MWCO와 함께 스네이크스킨 반투막(akeskin dialysis tubing)에서 투석하였다. 인자 VIIa (1 mg/mL)의 탈시알릴화를 교환된 완충제에서 18시간 동안 32℃에서 아스로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens)(Calbiochem)으로부터 10 U/L 가용성 시알릴다아제와 함께 수행하였다.
실시예 2
인자 VIIa 의 시알릴 - 페길화 .
시알릴-페길화("글리코페길화")를 2-6시간 동안 탈시알릴화 완충제에서 100 U/L ST3Gal-III 및 200 μM CMP-시알산-PEG (40 kD, 20 kD, 10 kD, 5 kD, 및 2 kD)와 함께 32℃에서 아시알로-인자 VIIa(1 mg/mL) 상에서 수행하였다. 적절한 반응 시간이 끝난 후, 페길화된 샘플을 추가 글리코페길화를 최소화하기 위해 즉시 정제하였다.
글리코페길화된 인자 VII/인자 VIIa를 시알산으로 캡핑된 샘플과 함께 캡핑하기 위해, 시알릴다아제를 하기 나타내는 음이온-교환 크로마토그래피로 아시알로-인자 VIIa로부터 우선 제거하였다. 초과 CMP-시알산(5mM)를 첨가하였고 2시간 동 안 32℃에서 배양하고, 시알산과 함께 글리코페길화된 인자 VIIa를 캡핑하였다. 인자 VIIa의 시알릴-페길화된 형태를 인비트로젠에 의해 기술되는 비-환원성 SDS-PAGE(트리스-글리신 겔 및/또는 NuPAGE 겔) 및 콜로이달 블루 염색 키트로 분석하였다.
실시예 3
페길화된 인자 VIIa 의 정제.
인자 VIIa의 글리코페길화된 샘플을 변형된 음이온-교환 방법으로 정제하였다. 샘플을 5℃에서 취급하였다. 컬럼 로딩 전에 즉시, 10 mL 인자 VIIa 용액 당 1g Chelex 100 (BioRad)를 리모델링된 샘플에 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 현탁액을 진공 시스템으로 셀룰로오스 아세테이트 막(0.2 μm)에서 여과하였다. 필터에 남은 킬레이터 수지를 10mL 벌크당 1-2mL로 일단 세척하였다. 여과물의 전도성을 5℃에서 10 mS/cm로 조절하였고 필요하다면 pH 8.6으로 조절하였다.
음이온 교환을 8-10℃에서 수행하였다. Q 세파로오스 FF를 함유하는 컬럼을 1 M NaOH (10 컬럼 부피), 물 (5 컬럼 부피), 2 M NaCl, 50 mM HOAc, pH 3 (10 컬럼 부피)으로 세척함으로써 로딩하고, 175 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신, pH 8.6 (10 컬럼 부피)로 평형을 유지시키기 전에 제조하였다. 각 페길화 반응에 대해, 15-20 mg 인자 VIIa를 100 cm/h의 유속으로 10 mL Q 세파로오스 FF (mL 수지 당 2 mg 이하 단백질)를 가지는 XK16 컬럼(아머샴 바이오사이언스)에 로딩하였다. 2 kD 선형 PEG에 대해, 20 mg 인자 VIIa를 100 cm/h의 유속으로 40 mL Q 세파로오스 FF (mg 수지 당 0.5 mg 단백질)를 가지는 XK26 컬럼(아머샴 바이오사이언스)에 로딩하 였다.
로딩 후, 컬럼을 175 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신, pH 8.6 (10 컬럼 부피) 및 50 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신, pH 8.6 (2 컬럼 부피)으로 세척하였다. 50 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신, 15 mM CaCl2, pH 8.6 (5 컬럼 부피)를 사용하여 15 mM CaCl2의 단계 기울기로 용리를 수행하였다. 컬럼을 이후에 1 M NaCl, 10 mM 글리실글리신, pH 8.6 (5 컬럼 부피)으로 세척하였다. 방출물을 280 nm 흡광도로 모니터링하였다. 분획(5 mL)을 플로-스루와 2번의 세척 동안 수집하였고; 2.5 mL 분획을 CaCl2 및 1M 염 용리 동안 수집하였다. 인자 VIIa를 함유하는 분획을 비-환원성 SDS-PAGE(트리스-글리신 겔 및/또는 NUPAGE 겔) 및 콜로이달 블루 염색 키트로 분석하였다. 인자 VIIa를 가지는 적절한 분획을 풀링하고, 4 M HCl로 pH를 7.2로 조절하였다.
인자 VIIa-SA-PEG-10 kD을 하기 변화를 제외하고 상기 기술한 바와 같이 정제하였다. EDTA (10 mM)를 페길화된 인자 VIIa 용액에 첨가하였고, pH를 pH 6으로 조절하였고, 전도도를 5℃에서 5mS/cm로 조절하였다. 약 20 mg의 인자 VIIa-SA-PEG-10 kD을 100 cm/h의 유속으로 10 mL Poros 50 Micron HQ 수지(mL 수지 당 2mg 이하의 단백질)을 가지는 XK16 컬럼 (아머샴 바이오사이언스)에 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 175 mM NaCl, 10 mM 히스티딘 pH 6 (10 column volumes) 및 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6 (2 컬럼 부피)으로 세척하였다. 용리를 50 mM NaCl 중 20 mM CaCl2, 10 mM 히스티딘, pH 6 (5 컬럼 부피)의 단계 기울기로 수행하였다. 컬 럼을 그 후 1 M NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6 (5 컬럼 부피)으로 세척하였다.
인자 VIIa-SA-PEG-10 kD (25mL)을 함유하는 음이온-교환 용리액을 제조업자의 지침에 따라서(밀리포) 아미콘 울트라-15 1OK 원심 필터 장치를 사용함으로써 5-7mL로 농축하였다. 농축 후, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 대부분의 페길화된 변형에 대해 50 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신, 15 mM CaCl2, pH 7.2로 평형을 유지시킨 수퍼덱스 200 (HiLoad 16/60, 분취 등급; 아머샴 바이오사이언스)을 함유하는 컬럼에 샘플(5-7 mL)을 로딩하였다. 인자 VIIa-SA-PEG-10 kD를 1 mL/min의 유속에서 비변형된 아시알로-인자 VIIa로부터 분리하였고, 흡광도를 280 nm에서 모니터링하였다. 인자 VIIa를 함유하는 분획(1 mL)를 수집하였고 비-환원성 SDS-PAGE (트리스-글리신 겔 및/또는 NuPAGE 겔) 및 콜로이달 블루 염색 키트로 분석하였다. 표적화된 페길화된 동형을 함유하고 비변형이 없는, 아시알로-인자 VIIa가 결핍된 분획을 풀링하였고 아미콘 울트라-15 10K 원심 필터 장치를 사용하여 1mg/mL로 농축하였다. 단백질 농축을 1.37 (mg/mL)-1cm-1의 흡광계수를 사용하여 280 nm 에서 흡광도 판독으로 결정하였다.
실시예 4
역상 HPLC 분석으로 페길화된 동형의 결정.
페길화된 인자 VIIa를 역상컬럼(Zorbax 300SB-C3, 5 μm 입자 크기, 2.1 x 150 mm)에서 HPLC로 분석하였다. 용리액은 A) 물에서 0.1 TFA 및 B) 아세토니트릴 중 0.09% TFA이었다. 검출은 214 nm이었다. 기울기, 유속 및 컬럼 온도는 PEG 길이 (40 kD, 20 kD, 및 10 kD PEG: 30분 내 35-65 %B, 0.5 mL/min, 45℃; 10 kD PEG: 30분 내 35-60 %B, 0.5 mL/min, 45℃; 5 kD: 40분 내 40-50 %B, 0.5 mL/min, 45℃; 2 kD: 67분 내 38-43 %B, 0.6 mL/min, 55℃)에 의존한다. 각 피크의 동일성은 다음 4개 중 2 이상의 다른 증거를 기초로 정해진다: 본래 인자 VIIa의 공지된 체류 시간, 분리된 피크의 SDS-PAGE 이동, 분리된 피크의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼, 및 증가된 수의 부착된 PEG를 가지는 각 피크의 체류 시간의 규칙적인 진행.
실시예 5
역상 HPLC 에 의한 PEG 부착의 자리 결정.
인자 VIIa 및 페길화된 인자 VIIa 변형을 15분 동안 실온에서 환원 완충제(40 μL, 50 mM NaCl, 10 mM 글리실글리신, 15 mM EDTA, 8 M 우레아, 20 mM DTT, pH 8.6)와 함께 샘플(1 mg/mL에서 10 μL)을 혼합함으로써 환원하였다. 물(50 μL)을 첨가하였고 샘플을 HPLC (< 12 hrs)에서 주입할 때까지 4℃로 냉각시켰다. HPLC 컬럼, 용리액, 및 검출을 비-환원 샘플에 대해서 상기 기술하였다. 유속은 0.5 mL/min이고 기울기는 90분 내 30-55 %B이었고, 다음에 90 %B 까지 간단한 세척 사이클을 따랐다. 각 피크의 동일성은 실시예 4에 기술된 바와 같이 정했다.
실시예 6
인자 VIIa 응고 분석.
페길화된 샘플 및 표준을 2개로 테스트하였고, 10OmM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% BSA (wt/vol), 5OmM 트리스, pH 7.4에서 희석하였다. 표준 및 샘플을 0.1 내지 10ng/mL의 범위에 걸쳐 분석하였다. 동일한 부피의 희석한 표준 및 샘플을 인자 VIIa 결핍 혈장(Diagnostica Stago)과 혼합하였고 그것들을 분석하기 전에 4시간 이하 동안 얼음에서 저장하였다.
응고 시간을 STart4 코아귤로미터(coagulometer) (Diagnostica Stago)로 측정하였다. 코아귤로미터는 샘플 큐벳 내 마그네틱 볼의 부드러운 앞뒤 움직임의 정지에 의해 표시되는 시험관 내 응고가 형성될 때까지 경과된 시간을 측정하였다.
각 큐벳에, 한 개의 마그네틱 볼을 두었고, 100 μL 인자 VIIa 샘플/결핍 혈장과 100 μL의 희석한 래트 뇌 세팔린 용액(4시간 이하 동안 얼음에서 저장)을 더했다. 각각의 시약을 각 웰 사이에 5초로 첨가하였고, 최종 혼합물을 37℃에서 300초 동안 배양하였다. 희석한 래트 뇌 세팔린(RBC) 용액을 2 mL RBC 저장 용액(Haemachem제의 1 바이알 RBC 저장 + 10 mL 15OmM NaCl) 및 4 mL 10OmM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% BSA (wt/vol), 5OmM 트리스, pH 7.4로부터 만들었다.
300초에서, 분석을 10OmM NaCl, 12.5mM CaCl2, 0.1% BSA (wt/vol), 5OmM 트리스, pH 7.4. 중 가용성 조직 인자(2μg/mL; 아미노산 1-209)의 100 μL의 미리 가열된(37℃) 용액의 첨가로 시작하였다. 또, 이것 다음의 용액을 샘플 사이에 5초 간격으로 첨가하였다.
희석한 표준으로부터 응고 시간을 표준 커브(log 응고시간 대 log 인자 VIIa 농도)를 생성하기 위해 사용하였다. 커브로부터 결과 선형 회귀를 페길화된 변형의 상대적인 응고 활성을 결정하기 위해 사용하였다. 페길화된 인자 VIIa 변형을 인자 VIIa의 알리쿼트된 저장에 대해 비교하였다.
실시예 7
BHK 세포에서 생성되는 재조합 인자 VIIa 의 글리코페길화
본 실시예는 BHK 세포에서 만들어지는 재조합 인자 VIIa의 페길화를 설명한다.
아시알로 -인자 VIIa 의 제조. 재조합 인자 VIIa를 BHK 세포(새끼 햄스터 신장 세포)에서 생성하였다. 인자 VIIa(14.2 mg)를 완충제 용액(pH 7.4, 0.05 M 트리스, 0.15 M NaCl, 0.001 M CaCl2, 0.05% NaN3) 중 1 mg/mL로 용해하였고 3일 동안 32℃에서 300 mU/mL 시알리다아제(비브리오 콜레라)-아가로오스 콘쥬게이트와 함께 배양하였다. 반응을 모니터링하기 위해 반응의 소 알리쿼트를 인비트로젠 과정에 따라 수행되는 적절한 완충제 및 IEF 겔로 희석하였다(도 157). 혼합물을 3,500 rpm에서 원심분리하였고 상청액을 수집하였다. 수지를 상기 완충제 용액(pH 7.4, 0.05 M 트리스, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3)으로 3회(3x2 mL) 세척하였고, 합한 세척물을 센트리콘-플러스-20에서 농축하였다. 남은 용액은 14.4 mL의 최종 부피에서 0.05 M 트리스 (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 0.05% NaN3으로 교환된 완충제이다.
인자 VIIa - SA - PEG -1 kD 및 인자 VIIa - SA - PEG -10 kD 의 제조. 인자 VIIa 용액의 탈시알릴화를 2개의 동일한 7.2 mL 샘플로 스플리팅하였다. 각 샘플에 CMP-SA-PEG-1 kD (7.4 mg) 또는 CMP-SA-PEG-10 kD (7.4 mg) 중 하나를 첨가하였다. ST3Gal3 (1.58U)를 튜브 둘 다에 첨가하였고 반응 혼합물을 32℃에서 96시간 동안 인큐베이 팅하였다. 반응을 인비트로젠에 의해 기술된 시약 및 조건을 사용하여 SDS-PAGE 겔로 모니터링하였다. 반응이 완료되었을 때, 반응 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.1)를 사용하고 UV 흡광도를 기초로 분획을 수집하는 Toso Haas TSK-Gel-3000 분취 컬럼을 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 합한 분획을 센트리콘-플러스-20 원심분리 필터(Millipore, Bedford, MA) 중 4℃에서 농축하였고, 농축한 용액을 다시 제형으로 만들어 1.97 mg (BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석, BCA 분석, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)의 인자 VIIa-SA-PEG를 얻었다. 반응의 생성물을 본 과정에 따르는 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 분석하였고 시약을 인비트로젠으로 공급하였다. 샘플을 물에 대해 투석하였고 MALDI-TOF로 분석하였다.
실시예 8
인자 VIIa - SA - PEG -10 kD : 원 포트 방법
인자 VIIa (1 mg/mL의 최종 농도로 생성물 제형 완충제 중에 5mg 희석됨), CMP-SA-PEG-10 kD (1OmM, 60 μL) 및 검은 곰팡이(A. niger) 효소 ST3Gal3 (33 U/L) 및 10 mM 히스티딘, 50 mM NaCl, 20 mM CaCl2을 10 U/L, 1 U/L, 0.5 U/L 또는 0.1 U/L의 시알리다아제(CalBiochem) 중 하나와 함께 반응 용기에서 합하였다. 성분을 혼합하였고, 32℃에서 인큐베이팅하였다. 반응 과정을 첫번째 4시간 동안 30분 간격으로 알리쿼트를 분석함으로써 측정하였다. 알리쿼트를 이후에 20시간 시점에서 제거하였고 SDS-PAGE를 받았다. 페길화의 정도를 1.5, 2.5 및 3.5 시간 시점에 1mL를 제거하고 Poros 50HQ 컬럼에서 샘플을 정제함으로써 결정하였다.
10 U/L의 시알리다아제를 함유하는 반응 조건에 대해, 어떤 감지할 수 있는 양의 인자 VIIa-SA-PEG 생성물도 형성되지 않았다. 1 U/L의 시알리다아제를 함유하는 반응 조건에 대해, 반응 혼합물에서 약 17.6 %의 인자 VIIa는 1.5시간 후 모노 또는 디페길화된다. 이는 2.5 시간 후 29%, 및 3.5시간 후 40.3%로 증가되었다. 0.5 U/L의 시알리다아제를 함유하는 반응 조건에 대해, 반응 혼합물에서 약 44.5 %의 인자 VIIa는 3시간 후 모노 또는 디페길화되고, 0.8%는 트리페길화 또는 그 이상이다. 20 시간 후, 69.4%는 모노 또는 디페길화되고, 18.3%는 트리페길화 또는 그 이상이다.
0.1 U/L의 시알리다아제를 함유하는 반응 혼합물에 대해, 반응 혼합물 중 약 29.6%의 인자 VIIa는 3시간 후 모노 또는 디페길화 중 하나이다. 20시간 후, 71.3%는 모노 또는 디페길화 중 하나이고, 15.1%는 트리페길화 또는 그 이상이다.
실시예 9
시스테인-PEG2 (2)의 제조
Figure 112009026250918-PCT00202
a. 화합물 1의 합성
수산화칼륨(분말로서 84.2 mg, 1.5 mmol)을 아르곤 하에 무수 메탄올(20 L) 중 L-시스테인(93.7mg, 0.75 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였고, 이후 분자량 20 킬로 달톤의 mPEG-O-토실레이트(Ts; 1.0 g, 0.05 mmol)를 2시간에 걸쳐 수회의 포션으로 첨가하였다. 혼합물을 5일 동안 실온에서 교반하였고, 회전 증발기로 농축하였다. 잔여물을 물(30mL)로 희석하였고, 2시간 동안 실온에서 교반하여 약간 과량의 20 킬로달톤 mPEG-O-토실레이트를 파괴하였다. 그 후 용액을 아세트산으로 중화하고, pH를 pH 5.0으로 조절하고 역상 크로마토그래피(C-18 실리카) 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 메탄올/물 (생성물은 약 70% 메탄올에서 용리한다)의 기울기로 용리되고, 생성물 용리는 증발 광산란으로 모니터링 되고, 적절한 분획은 수집되고 물로 희석된다(500 mL). 이 용액은 크로마토그래피되고(이온 교환, XK 50 Q, BIG Beads, 300 mL, 수산화물 형태; 물/아세트산-0.75N에 물의 기울기) 적절한 분획의 pH는 아세트산으로 6.0까지 낮춰진다. 이 용액을 그 후 역상 컬럼(C-18 실리카)에서 캡쳐하였고 상기 기술한 바와 같이 메탄올/물의 기울기로 용리하였다. 생성물 분확을 풀링, 농축하고, 물에서 재용해하고 동결건조시켜 453 mg (44%)의 백색 고체를 얻었다(1).
화합물에 대핸 구조적 데이터는 다음과 같다: 1H-NMR (500 MHz; D2O) δ 2.83 (t, 2H, 0-C-CH 2 -S), 3.05 (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.18 (q, 1H, (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.38 (s, 3H, CH 3O), 3.7 (t, OCH 2CH 2O), 3.95 (q, 1H, CHN). 생성물의 순도는 SDS PAGE로 확인하였다.
b. 시스테인 PEG 2 (2)의 합성
트리에틸아민(~0.5 mL)을 용액이 염기성이 될 때까지 무수 CH2Cl2 (30 mL)에 용해되는 화합물 1(440 mg, 22 μmol)의 용액에 적가하였다. CH2Cl2 (20 mL) 중 20 킬로달톤 mPEG-O-p-니트로페닐 카르보네이트(660 mg, 33 μmol) 및 N-히드록시숙신이미드(3.6 mg, 30.8 μmol)의 용액을 실온에서 1시간에 걸쳐 수회의 포션으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 이후에 용매를 회전 증발기로 제거하였고, 잔여물을 물(100 mL)에 용해하였고, pH를 1.0 NaOH로 9.5로 조절하였다. 염기성 용액을 2시간 동안 실온에서 교반한 후 아세트산으로 pH 7.0으로 중화하였다. 용액을 이후에 역상 크로마토그래피(C-18 실리카) 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 메탄올/물의 기울기로 용리하였고(생성물은 약 70% 메탄올에서 용리한다), 생성물 용리를 증발 광산란으로 모니터링하고, 적절한 분획을 수집하고 물(500mL)로 희석하였다. 이 용액을 크로마토그래피하였고(이온 교환, XK 50 Q, BIG 비드, 300 mL, 수산화물 형태; 물/아세트산-0.75N에 물의 기울기), 적절한 분획의 pH를 아세트산으로 6.0으로 낮추었다. 이 용액을 그 후 역상 컬럼(C-18 실리카)에서 캡쳐하였고 상기 기술한 메탄올/물의 기울기로 용리하였다. 생성물 분획을 풀링, 농축하였고, 물에서 재용해하고 동결건조시켜 575 mg (70 %)의 백색 고체(2)를 얻었다.
화합물에 대한 구조적 데이타는 다음과 같다: 1H-NMR (500 MHz; D2O) δ 2.83 (t, 2H, 0-C-CH2-S), 2.95 (t, 2H, 0-C-CH 2 -S), 3.12 (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.39 (s, 3H CH 3O), 3.71 (t, OCH 2CH 2O). 생성물의 순도를 SDS PAGE로 확인하였다.
실시예 10
인자 VIIa - SA - PEG -40 kD
인자 VIIa의 글리코페길화(캡핑과 함께 원 포트). 인자 VIIa의 글리코페길화를 탈시알릴화와 페길화가 동시에 일어나는 원-포트 반응으로 수행한 후 시알산으로 캡핑하였다. 반응을 워터배스를 재순환시킴으로써 32℃에서 조절된 재킷형 유리 용기에서 수행하였다. 우선, 농축된 0.2μm-여과된 인자 VIIa를 용기에 도입하였고 20분 동안 교반바와 함께 혼합함으로써 32℃로 가열하였다. 시알리다아제의 용액을 1OmM 히스티딘/50mM NaCl/20mM CaCl2, 4,000 U/L의 농도에서 pH 6.0에서 건조 분말로부터 제조하였다. 일단 인자 VIIa가 32℃에 도달하면, 시알리다아제를 인자 VIIa에 첨가하였고 반응을 대략 5분 동안 혼합하여 혼합이 정지된 시간 후 균일한 용액을 보장하였다. 탈시알릴화를 1.0h 동안 32℃에서 진행시켰다. 탈시알릴화 반응 동안, CMP-SA-PEG-40 kD를 1OmM 히스티딘/50mM NaCl/20mM CaCl2, pH 6.0 완충제에 용해시켰고, 농도를 271nm에서 UV 흡광도로 결정하였다. CMP-SA-PEG-40 kD가 용해된 후, CMP-SA-PEG-40 kD를 반응 및 ST3Gal3에 첨가하였고, 반응을 대략 15분 동안 교반 바와 함께 혼합하여 균일한 용액을 보장하였다. 추가 85mL 부피의 완충제를 반응 1.0 L를 만들기 위해 첨가하였다. CMP-SA를 4.3mL의 농도에 첨가하여 반응을 퀀칭하고 남은 말단 갈락토오스 잔기를 시알산으로 캡핑하기 전에 반응을 24시간 동 안 교반 없이 진행시켰다. 퀀칭을 30분 동안 32℃에서 혼합하여 진행시켰다. 반응의 총 부피는 퀀칭 전 1.0L였다. 시점 샘플(1mL)은 0, 4.5, 7.5, 및 24 h에 취하여 CMP-SA와 함께 퀀칭하였고, RP-HPLC 및 SDS-PAGE로 분석하였다.
인자 VIIa - SA - PEG -40 kD 의 정제. 캡핑 후, 용액을 4℃에서 밤새 저장한 2.0 L의 1OmM 히스티딘, pH 6.0로 희석하였고, 샘플을 0.2μm Millipak 60 필터를 통해 여과하였다. 결과 로딩 부피는 3.1L였다. AEX2 크로마토그래피를 Akta Pilot 시스템에서 20-25℃ (주변 실온)로 수행하였다. 로딩 후, 평형 완충제 10 컬럼 부피 세척을 수행하였고, 생성물을 비페길화된 인자 VIIa로부터 페길화된-인자 VIIa 종의 용해를 초래한 MgCl2의 10 컬럼 부피 기울기를 사용하여 컬럼으로부터 용리하였다. 이 컬럼에 대한 로딩은 계획적으로 낮게 유지되어, < 2 mg 인자 VIIa/mL 수지를 표적화한다. SDS-PAGE 겔을 벌크 생성물의 풀을 만들기 위해 분획 및 풀로부터 선택된 RP-HPLC에 더하여 수행하였다. 풀링된 분획을 1M NaOH로 pH를 6.0으로 조절하였고 2-8℃에서 밤새 냉장실에 저장하였다.
최종 농축/ 정용여과 , 무균여과 및 알리쿼팅 . 풀링된 분획을 Millipak 20 0.2μm 필터를 통해 여과하였고 2-8 ℃에서 밤새 저장하였다. 농축/정용여과를 수행하기 위해, Millipore 0.1m2 30 kD 재발생된 셀룰로오스 막을 정량펌프(peristaltic pump) 및 실리콘 튜빙으로 적합하게 된 시스템에서 사용하였다. 시스템을 만들었고 물로 씻은 후, 적어도 1시간 동안 0.1M NaOH로 소독하였고, 이후 10mM 히스티딘/ 5 mM CaCl2/ 100 mM NaCl pH 6.0 정용여과 완충제로 사용전 즉시 평행으로 할 때까지 0.1 M NaOH에서 저장하였다. 생성물을 대략 400mL로 농축시킨 후 대략 5 dia 부피의 완충제로 일정한 부피에서 정용여과하였다. 생성물은 그 후 대략 300mL로 농축되고 5분 동안 저압 재순환 후 회수하였고, 막을 5분 동안 재순환함으로써 200mL의 정용여과 완충제로 헹구었다. 세척물을 생성물과 함께 회수하였고, 다른 50mL의 완충제를 최종 세척 동안 다른 5분 동안 재순환시켰다. 결과 벌크는 대략 510mL였고, 0.2μm PES 막(Millipore)으로 적합하게 된 1L 진공 필터를 통해 여과하였다. 무균으로 여과된 벌크를 그 후 50mL 멸균 팔콘튜브에서 25mL 알리쿼트로 알리쿼팅하였고, -80℃로 냉동시켰다.
HPLC 에 의한 페길화 반응의 분석( 실시예 10)
콘쥬게이션 반응 시간 정제
0시간 4.5시간 7.5시간 24시간 크로마토그래피 후
비페길화 % 94.7 76.1 66.6 51.0 0.6
모노페길화 % 0.9 17.9 26.1 39.1 85.6
디페길화 % 0.1 0.9 1.9 5.1 5.1
트리페길화 % 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2
24시간 후, 벌크 생성물 PEG-상태 분포는 0.7% 비페길화, 85.3% 모노-페길화, 11.5% 디-페길화, 및 0.3% 트리-페길화였다. 컬럼 크로마토그래피는 모노- 및 디-페길화된 종으로부터 비페길화된 물질을 제거하는 것을 통해 크게 생성물 분배를 초래하는 과정에서 주된 단계이다.
본원에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 그것의 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 본 출원의 정신과 범위 및 첨부된 청구항의 범주 내에 포함됨이 이해된다. 본원에 인용된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 그것 전체가 모든 목적을 위해 참고로써 포함된다.

Claims (4)

  1. 하기를 포함하는 펩티드 콘쥬게이트:
    a) 하기로부터 선택되는 멤버인 모이어티에 공유적으로 부착되는 펩티드:
    Figure 112009026250918-PCT00203
    R2는 H, CH2OR7, COOR7 및 OR7로부터 선택되는 멤버이고,
    R7은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬 및 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬로부터 선택되는 멤버이고;
    R3, R4, R5 및 R6는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, OR8 및 NHC(O)R9로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
    R8 및 R9는 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 시알산 및 폴리시알산으로부터 독립적으로 선택되고;
    적어도 하나의 R3, R4, R5, R6는 하기로부터 선택되는 멤버인 모이어티를 포함하고:
    Figure 112009026250918-PCT00204
    표시 m 및 n은 1 내지 1000으로부터 독립적으로 선택되는 정수이고;
    A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 및 A11은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, -NA12A13, -OA12 및 -SiA12A13으로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
    A12 및 A13은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 및 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되는 멤버이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 R3, R4, R5, R6은 하기로부터 선택되는 멤버인 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드 콘쥬게이트:
    Figure 112009026250918-PCT00205
    .
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 모이어티는 하기로부터 선택되는 멤버인 것을 특징으로 하는 펩티드 콘쥬게이트:
    Figure 112009026250918-PCT00206
    .
  4. 제 1 항에 있어서, 펩티드 콘쥬게이트 내 상기 펩티드는 뼈 형성 단백질 2(BMP-2), 뼈 형성 단백질 7(BMP-7), 뼈 형성 단백질 15(BMP-15), 뉴로트로핀 3(NT-3), 폰 빌리브란트 인자(vWF) 프로테아제, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, B-도메인 결실 인자 VIII, 전장 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, B-도메인 결실 인자 VIII를 가지는 vWF-인자 VIII 융합 단백질, 에리스로포이에틴(EPO), 과립구 대식세포 집락 자극인자(G-CSF), 과립백혈구생성자극인자(GM-CSF) 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, α1-항트립신(ATT, 또는 α-1 프로테아제 억제제), 글루코세레브로시데이즈, 조직형 플라스미노겐 활성제(TPA), 인터류킨-2 (IL-2), 유로키나제, 인간 DNase, 인슐린, B형간염표면단백질 (HbsAg), 인간 성장 호르몬, TNF 수용체-IgG Fc 영역 융합 단백질(EnbrelTM), 항-HER2 단일클론항체 (Herceptin™), 호흡기세포융합바이러스의 단백질 F에 대한 단일클론항체 (Synagis™), TNF-α에 대한 단일클론항체 (Remicade™), 글리코단백질 IIb/IIIa에 대한 단일클론항체 (Reopro™), CD20에 대한 단일클론항체 (Rituxan™), 항-트롬빈 III (AT III), 인체 융모 성선호르몬(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazyme™), 알파-이두로니다아제(Aldurazyme™), 여포자극호르몬, 베타-글루코시다아제, 항-TNF-알파 단일클론항체(MLB 5075), 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2), 베타-글루코시다아제, 알파-갈락토시다아제 A 및 섬유아세포성장인자로부터 선택되는 멤버인 것을 특징으로 하는 펩티드 콘쥬게이트.
KR1020097008970A 2006-10-04 2007-10-04 글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드 KR101556248B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82820806P 2006-10-04 2006-10-04
US60/828,208 2006-10-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090079222A true KR20090079222A (ko) 2009-07-21
KR101556248B1 KR101556248B1 (ko) 2015-09-30

Family

ID=39402350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097008970A KR101556248B1 (ko) 2006-10-04 2007-10-04 글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드

Country Status (21)

Country Link
US (4) US20080146782A1 (ko)
EP (1) EP2068907B1 (ko)
JP (1) JP5457185B2 (ko)
KR (1) KR101556248B1 (ko)
CN (1) CN101600448B (ko)
AU (1) AU2007319657B9 (ko)
BR (1) BRPI0717505B8 (ko)
CA (1) CA2665480C (ko)
CY (2) CY1119943T1 (ko)
DK (1) DK2068907T3 (ko)
ES (1) ES2655734T3 (ko)
HU (2) HUE036502T2 (ko)
IL (1) IL197770A (ko)
LT (2) LT2068907T (ko)
LU (1) LUC00075I2 (ko)
MX (1) MX2009003470A (ko)
PL (1) PL2068907T3 (ko)
PT (1) PT2068907T (ko)
RU (1) RU2460543C2 (ko)
SI (1) SI2068907T1 (ko)
WO (1) WO2008060780A2 (ko)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7157277B2 (en) * 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
DE60336555D1 (de) 2002-06-21 2011-05-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
KR20060003862A (ko) 2003-03-14 2006-01-11 네오스 테크놀로지스, 인크. 수용성분기폴리머 및 그 접합체
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20070026485A1 (en) * 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7932364B2 (en) * 2003-05-09 2011-04-26 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
EP1694347B1 (en) * 2003-11-24 2013-11-20 BioGeneriX AG Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) * 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20070254836A1 (en) * 2003-12-03 2007-11-01 Defrees Shawn Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor
KR101439880B1 (ko) 2004-01-08 2014-09-12 라티오팜 게엠베하 펩티드의 오-결합형 글리코실화
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US20090292110A1 (en) * 2004-07-23 2009-11-26 Defrees Shawn Enzymatic modification of glycopeptides
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
ES2572779T3 (es) 2004-10-29 2016-06-02 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF)
JP2008526864A (ja) * 2005-01-06 2008-07-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 糖断片を用いる糖結合
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) * 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
JP5457185B2 (ja) * 2006-10-04 2014-04-02 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリセロール連結のｐｅｇ化された糖および糖ペプチド
CA2682897C (en) 2007-04-03 2016-11-22 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
EP2162535A4 (en) * 2007-06-04 2011-02-23 Novo Nordisk As O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
US7968811B2 (en) * 2007-06-29 2011-06-28 Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. Integrated ignition and key switch
US8207112B2 (en) * 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
JP5647899B2 (ja) * 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
US8535655B2 (en) 2008-10-10 2013-09-17 Polyactiva Pty Ltd. Biodegradable polymer—bioactive moiety conjugates
KR101726715B1 (ko) * 2008-10-10 2017-04-13 폴리액티바 피티와이 리미티드 생분해성 폴리머-생물활성 모이어티 공액체
WO2010040187A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 The Bionic Ear Institute Polymer-bioactive agent conjugates
JP5826772B2 (ja) 2010-02-16 2015-12-02 ノヴォ ノルディスク アー／エス コンジュゲートタンパク質
CN103619358B (zh) 2011-03-31 2017-02-15 辉凌公司 药物制剂
KR102011924B1 (ko) * 2011-05-18 2019-08-21 메더리스 다이어비티즈, 엘엘씨 인슐린 저항성에 대한 개선된 펩티드 제약
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
JP6256882B2 (ja) 2012-02-15 2018-01-10 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子組成物、ならびに組成物の作製方法および用途
JP6383666B2 (ja) 2012-02-15 2018-08-29 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 組換え第ｖｉｉｉ因子タンパク質
SG10201913893XA (en) 2012-07-11 2020-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
AU2014302100B2 (en) * 2013-06-28 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Thrombin cleavable linker with XTEN and its uses thereof
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
RS63583B1 (sr) 2014-01-10 2022-10-31 Bioverativ Therapeutics Inc Himerni proteini faktora viii i njihova upotreba
US10464955B2 (en) 2014-02-28 2019-11-05 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Charged linkers and their uses for conjugation
CA2964123C (en) * 2014-10-09 2023-09-05 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
CN109790529A (zh) 2016-06-24 2019-05-21 财团法人牧岩生命科学研究所 包含FVIII和vWF因子的嵌合蛋白及其用途
WO2018115309A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Novo Nordisk A/S Preparation of sugar-nucleotides
JP7423070B2 (ja) * 2018-04-06 2024-01-29 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 増加した溶解度および改善された薬物動態特性を有するコンプスタチンアナログ
AU2019416109A1 (en) * 2018-12-28 2021-07-22 Sirnaomics, Inc. Targeted delivery of therapeutic molecules

Family Cites Families (170)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US516933A (en) * 1894-03-20 Propulsion gearing for bicycles
CH596313A5 (ko) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
US4385260A (en) * 1975-09-09 1983-05-24 Beckman Instruments, Inc. Bargraph display
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4438253A (en) 1982-11-12 1984-03-20 American Cyanamid Company Poly(glycolic acid)/poly(alkylene glycol) block copolymers and method of manufacturing the same
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4565653A (en) * 1984-03-30 1986-01-21 Pfizer Inc. Acyltripeptide immunostimulants
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JPS6238172A (ja) * 1985-08-12 1987-02-19 株式会社　高研 抗血栓性医用材料の製造方法
SE451849B (sv) * 1985-12-11 1987-11-02 Svenska Sockerfabriks Ab Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter
US4925796A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
IL82834A (en) 1987-06-09 1990-11-05 Yissum Res Dev Co Biodegradable polymeric materials based on polyether glycols,processes for the preparation thereof and surgical artiicles made therefrom
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5104651A (en) * 1988-12-16 1992-04-14 Amgen Inc. Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf
US4957773A (en) 1989-02-13 1990-09-18 Syracuse University Deposition of boron-containing films from decaborane
US5194376A (en) * 1989-02-28 1993-03-16 University Of Ottawa Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
HUT64022A (en) 1989-04-19 1993-11-29 Enzon Inc Process for producing active polyalkileneoxide carbonates for the modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5342940A (en) 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
US5182107A (en) * 1989-09-07 1993-01-26 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5595900A (en) * 1990-02-14 1997-01-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
DE4009630C2 (de) * 1990-03-26 1995-09-28 Reinhard Prof Dr Dr Brossmer CMP-aktivierte fluoreszierende Sialinsäuren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
US5180674A (en) * 1990-04-16 1993-01-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
US5951972A (en) * 1990-05-04 1999-09-14 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5410016A (en) 1990-10-15 1995-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers
US5529914A (en) 1990-10-15 1996-06-25 The Board Of Regents The Univeristy Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
US5861374A (en) * 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
US5278299A (en) * 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
ATE193551T1 (de) 1991-03-18 2000-06-15 Scripps Research Inst Oligosaccharide als enzymsubstrate und - inhibitoren: verfahren und zusammensetzungen
US5352670A (en) 1991-06-10 1994-10-04 Alberta Research Council Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5384249A (en) * 1991-12-17 1995-01-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α2→3 sialyltransferase
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
US5858751A (en) * 1992-03-09 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for producing sialyltransferases
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US6361977B1 (en) * 1992-11-24 2002-03-26 S. Christopher Bauer Methods of using multivariant IL-3 hematopoiesis fusion protein
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5202413A (en) 1993-02-16 1993-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alternating (ABA)N polylactide block copolymers
US5409817A (en) * 1993-05-04 1995-04-25 Cytel, Inc. Use of trans-sialidase and sialyltransferase for synthesis of sialylα2→3βgalactosides
US5374541A (en) 1993-05-04 1994-12-20 The Scripps Research Institute Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5874075A (en) * 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5492841A (en) * 1994-02-18 1996-02-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents
ZA951877B (en) * 1994-03-07 1996-09-09 Dow Chemical Co Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates
US5629384A (en) * 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5922577A (en) 1995-04-11 1999-07-13 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US6030815A (en) * 1995-04-11 2000-02-29 Neose Technologies, Inc. Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5728554A (en) 1995-04-11 1998-03-17 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US5876980A (en) 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6015555A (en) * 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5858752A (en) * 1995-06-07 1999-01-12 The General Hospital Corporation Fucosyltransferase genes and uses thereof
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
ATE455171T1 (de) * 1995-09-21 2010-01-15 Genentech Inc Varianten des menschlichen wachstumshormons
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US5716812A (en) 1995-12-12 1998-02-10 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby
EP0888377B1 (en) * 1996-03-08 2007-12-12 The Regents Of The University Of Michigan MURINE alpha(1,3)-FUCOSYLTRANSFERASE (Fuc-TVII)
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
WO1998015581A1 (en) 1996-10-10 1998-04-16 Cytel Corporation Carbohydrate purification using ultrafiltration, reverse osmosis and nanofiltration
WO1998031826A1 (en) 1997-01-16 1998-07-23 Cytel Corporation Practical in vitro sialylation of recombinant glycoproteins
US6183738B1 (en) * 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
US5876960A (en) * 1997-08-11 1999-03-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Bacterial spore detection and quantification methods
US20030027257A1 (en) * 1997-08-21 2003-02-06 University Technologies International, Inc. Sequences for improving the efficiency of secretion of non-secreted protein from mammalian and insect cells
WO1999028491A1 (en) 1997-12-01 1999-06-10 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of gangliosides
EP0924298A1 (en) * 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
CA2316834C (en) 1998-01-07 2006-01-03 Shearwater Polymers, Inc. Degradable heterobifunctional poly(ethylene glycol) acrylates and gels and conjugates derived therefrom
ES2307865T3 (es) * 1998-03-12 2008-12-01 Nektar Therapeutics Al, Corporation Metodo para preparar conjugados polimericos.
AU758097B2 (en) * 1998-03-25 2003-03-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Trimeric antigenic O-linked glycopeptide conjugates, methods of preparation and uses thereof
DE19852729A1 (de) * 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
CN1329502A (zh) * 1998-12-04 2002-01-02 普罗瓦利斯英国有限公司 含有胰岛素的药物组合物
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6716626B1 (en) * 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
US6348558B1 (en) * 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
WO2001045796A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol)
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
EP1263771B1 (en) * 2000-03-16 2006-06-14 The Regents Of The University Of California Chemoselective ligation by use of a phosphine
US20020019342A1 (en) * 2000-05-12 2002-02-14 Robert Bayer In vitro modification of glycosylation patterns of recombinant glycopeptides
WO2001087329A1 (en) * 2000-05-15 2001-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate
KR100396983B1 (ko) 2000-07-29 2003-09-02 이강춘 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
US6531121B2 (en) * 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
SE0004932D0 (sv) * 2000-12-31 2000-12-31 Apbiotech Ab A method for mixed mode adsorption and mixed mode adsorbents
WO2002055278A1 (fr) * 2001-01-09 2002-07-18 Ichimaru Giken Co., Ltd. Dispositif de prehension de pneumatiques installe sur un dispositif de gonflage par post-vulcanisation
US7173003B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7399613B2 (en) * 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US8008252B2 (en) * 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7157277B2 (en) * 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7696163B2 (en) * 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7297511B2 (en) * 2001-10-10 2007-11-20 Neose Technologies, Inc. Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
NZ532027A (en) * 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
CA2468230A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Neose Technologies, Inc. Glycopeptide remodeling using amidases
US7473680B2 (en) * 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
US20060035224A1 (en) * 2002-03-21 2006-02-16 Johansen Jack T Purification methods for oligonucleotides and their analogs
KR100416627B1 (ko) * 2002-06-18 2004-01-31 삼성전자주식회사 반도체 장치 및 그의 제조방법
DE60336555D1 (de) * 2002-06-21 2011-05-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
DK1517710T3 (da) * 2002-06-21 2011-07-18 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylerede faktor VII-glycoformer
ATE365794T1 (de) * 2002-11-08 2007-07-15 Glycozym Aps Verfahren zur identifizierung von die funktionen von polypeptid-galnac-transferasen modulierenden agentien, solche agentien umfassende pharmazeutische zusammensetzungen und verwendung solcher agentien zur herstellung von arzneimitteln
JP4412461B2 (ja) 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US8828373B2 (en) * 2002-11-20 2014-09-09 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
US20050064540A1 (en) * 2002-11-27 2005-03-24 Defrees Shawn Ph.D Glycoprotein remodeling using endoglycanases
KR20060003862A (ko) 2003-03-14 2006-01-11 네오스 테크놀로지스, 인크. 수용성분기폴리머 및 그 접합체
US20060276618A1 (en) 2003-03-18 2006-12-07 Defrees Shawn Activated forms of water-soluble polymers
US20070026485A1 (en) * 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2006127896A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
US7691603B2 (en) * 2003-04-09 2010-04-06 Novo Nordisk A/S Intracellular formation of peptide conjugates
US7932364B2 (en) * 2003-05-09 2011-04-26 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
WO2005012484A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20060198819A1 (en) * 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
US7524813B2 (en) * 2003-10-10 2009-04-28 Novo Nordisk Health Care Ag Selectively conjugated peptides and methods of making the same
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
EP1694347B1 (en) 2003-11-24 2013-11-20 BioGeneriX AG Glycopegylated erythropoietin
US20070254836A1 (en) * 2003-12-03 2007-11-01 Defrees Shawn Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor
US7956032B2 (en) * 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060040856A1 (en) * 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
EP1694351A2 (en) * 2003-12-03 2006-08-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated follicle stimulating hormone
WO2005055950A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
KR101439880B1 (ko) * 2004-01-08 2014-09-12 라티오팜 게엠베하 펩티드의 오-결합형 글리코실화
EP1720892B1 (en) * 2004-01-26 2013-07-24 BioGeneriX AG Branched polymer-modified sugars and nucleotides
US20070037966A1 (en) * 2004-05-04 2007-02-15 Novo Nordisk A/S Hydrophobic interaction chromatography purification of factor VII polypeptides
WO2006004959A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
EP1771066A2 (en) * 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US20060024286A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Paul Glidden Variants of tRNA synthetase fragments and uses thereof
US8268967B2 (en) * 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
JP2008514215A (ja) * 2004-09-29 2008-05-08 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 改変タンパク質
EP1805216A2 (en) * 2004-10-18 2007-07-11 Novo Nordisk A/S Growth hormone conjugates
WO2006042847A2 (en) * 2004-10-18 2006-04-27 Novo Nordisk A/S Method for the preparation of oxime, thiazolidine, dithiane, dithiolane or hydrazone linked analogues of growth hormone
ES2572779T3 (es) * 2004-10-29 2016-06-02 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF)
US20090054623A1 (en) * 2004-12-17 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. Lipo-Conjugation of Peptides
JP2008526864A (ja) * 2005-01-06 2008-07-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 糖断片を用いる糖結合
ES2449195T3 (es) * 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
PA8660701A1 (es) 2005-02-04 2006-09-22 Pfizer Prod Inc Agonistas de pyy y sus usos
EP1688150A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of alkoxyamine functionalised poly ethylene glycols
EP2386571B1 (en) * 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
EP1926817A2 (en) * 2005-09-14 2008-06-04 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor vii polypeptides
US20090048440A1 (en) * 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
ITMI20061624A1 (it) * 2006-08-11 2008-02-12 Bioker Srl Mono-coniugati sito-specifici di g-csf
EP2059527B1 (en) * 2006-09-01 2014-12-03 Novo Nordisk Health Care AG Modified glycoproteins
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
JP5457185B2 (ja) * 2006-10-04 2014-04-02 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリセロール連結のｐｅｇ化された糖および糖ペプチド
US20090053167A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides

Also Published As

Publication number Publication date
US20080146782A1 (en) 2008-06-19
EP2068907B1 (en) 2017-11-29
ES2655734T3 (es) 2018-02-21
PT2068907T (pt) 2018-01-15
LTPA2018505I1 (lt) 2018-06-11
PL2068907T3 (pl) 2018-05-30
WO2008060780A2 (en) 2008-05-22
AU2007319657A1 (en) 2008-05-22
IL197770A0 (en) 2011-08-01
LTC2068907I2 (lt) 2019-08-12
AU2007319657B2 (en) 2013-05-02
EP2068907A2 (en) 2009-06-17
RU2460543C2 (ru) 2012-09-10
US20170281785A1 (en) 2017-10-05
EP2068907A4 (en) 2012-05-09
CA2665480A1 (en) 2008-05-22
HUE036502T2 (hu) 2018-07-30
HUS1800024I1 (hu) 2018-07-30
US20100041872A1 (en) 2010-02-18
BRPI0717505B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0717505B1 (pt) 2020-06-02
CY2018016I1 (el) 2018-09-05
CN101600448A (zh) 2009-12-09
LUC00075I2 (en) 2018-07-30
MX2009003470A (es) 2009-04-14
IL197770A (en) 2017-04-30
US20150258206A1 (en) 2015-09-17
SI2068907T1 (en) 2018-01-31
BRPI0717505A2 (pt) 2015-06-16
CY2018016I2 (el) 2018-09-05
RU2009116605A (ru) 2010-11-10
KR101556248B1 (ko) 2015-09-30
JP5457185B2 (ja) 2014-04-02
CY1119943T1 (el) 2018-12-12
DK2068907T3 (en) 2018-01-15
WO2008060780A3 (en) 2008-08-14
JP2010505875A (ja) 2010-02-25
AU2007319657B9 (en) 2019-10-31
LT2068907T (lt) 2018-01-10
CA2665480C (en) 2019-11-12
CN101600448B (zh) 2015-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101556248B1 (ko) 글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드
US8911967B2 (en) One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US8916360B2 (en) Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) Glycopegylated erythropoietin
EP1858543B1 (en) Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US8632770B2 (en) Glycopegylated factor IX
JP5216580B2 (ja) グリコペグ化第ｉｘ因子
US20090305967A1 (en) Glycopegylated factor vii and factor viia
EP1888098A2 (en) Glycopegylated erythropoietin formulations
EP1799249A2 (en) Glycopegylated interferon alpha
US20130137157A1 (en) Glycopegylated factor vii and factor viia
JP2008542288A (ja) グリコｐｅｇ化エリスロポエチン製剤

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant