JP2008542288A - グリコｐｅｇ化エリスロポエチン製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、エリスロポエチンとＰＥＧ部分との接合体を提供する。接合体は、ペプチドと修飾基との間に挿入されかつそれらに共有結合される無傷グリコシル連結基を介して連結される。接合体は、グリコシル化ペプチドからグリコシルトランスフェラーゼの作用により形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、修飾糖部分をペプチド上のグリコシル残基上にライゲートする。接合体を調製するための方法、様々な病状を接合体で治療するための方法、および接合体を含有する医薬製剤もまた提供される。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２００５年５月２５日出願の米国仮特許出願第６０／６８４，６３７号明細書、２００５年５月２５日出願の米国仮特許出願第６０／６８５，００７号明細書、２００５年６月２日出願の米国仮特許出願第６０／６８７，５４８号明細書、２００５年６月２日出願の米国仮特許出願第１１／１４４，２２３号明細書、２００６年２月１日出願の米国仮特許出願第６０／７６４，６２５号明細書、２００６年２月１５日出願の米国仮特許出願第６０／７７３，９４１号明細書および２００６年２月１５日出願の米国仮特許出願第６０／７７４，０８８号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書中に援用される。

発明の背景
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、造血幹細胞に作用し赤血球の生成を刺激する腎臓および肝臓によって生成されるサイトカインである。該タンパク質は、２つの形態で、すなわち一方が１６５個のアミノ酸ペプチド、もう一方が１６６個のアミノ酸ペプチドとして存在する。１６６個のアミノ酸ペプチドは１６５個のアミノ酸と同じ配列を有するが、Ｃ末端位置に追加のアルギニンを有する。１６５個の成熟アミノ酸ペプチドは、３つのＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−２４、Ａｓｎ−３８、およびＡｓｎ−８３）および１つのＯ−グリコシル化部位（Ｓｅｒ−１２６）を含む３４ｋＤの糖タンパク質である。数種の変異体が５つのＮ−連結グリコシル化部位を含む「高グリコシル化」される。

エリスロポエチン合成が、動脈血酸素分圧の低下または血液の酸素親和性の増大などの組織低酸素症を有効に生じさせる状態により誘発される。ホメオスタシスの通常の条件下で、血液中のヘマトクリットおよびヘモグロンビン濃度は、赤血球生成が、骨髄、脾臓および肝臓内のマクロファージによる古い赤血球の恒常的破壊と平衡化することによって一定に維持される。定量的には、赤血球質量の約１％すなわち約２〜３×１０^１１個の赤血球が日々更新される。しかし、失血または高所への移動（ｌｏｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｉｇｈ ａｌｔｉｔｕｄｅｓ）など、組織低酸素症を有効にもたらす状況では、ＥＰＯの誘導により、赤血球生成が正常レベルに比べて１０倍またはそれより大きく刺激されうる。

ＥＰＯが赤血球生成を刺激することから、それはヘマトクリットの低下に関連した多数の疾患および症状に有効な治療である。末期腎不全を有する患者におけるヘマトクリットの回復を目的とした組換えヒトＥＰＯを用いた補充療法の初期試験が約２０年前に最初に報告された（例えば、ウィナールズ Ｃ．Ｇ．（Ｗｉｎｅａｒｌｓ Ｃ．Ｇ．）ら、（１９８６年） Ｌａｎｃｅｔ，２、１１７５〜１１７８頁、およびエシュバッハ Ｊ．Ｗ．（Ｅｓｃｈｂａｃｈ Ｊ．Ｗ．）ら、（１９８７年） Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６、７３〜７８頁）。この研究は、ＥＰＯの病態生理学および薬理学へのさらなる研究に弾みをつけた（例えば、ジェルクマン Ｗ．（Ｊｅｌｋｍａｎｎ Ｗ．）およびグロス Ａ．（Ｇｒｏｓｓ Ａ．）（１９８９年） ＥＲＹＴＨＲＯＰＯＩＥＴＩＮ；シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ） ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ） ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。

それらの初期の研究以来、組換えヒトＥＰＯは用いることで極めて多数の病状における治療が成功している。例えば、組換えヒトＥＰＯの外科患者への薬理学的適用により、術後貧血の重症度が低下しかつ期間が短縮しうる。組換えヒトＥＰＯの投与はまた、内因性ＥＰＯの相対的不足が貧血の発症に寄与する場合の、慢性炎症、悪性腫瘍およびＡＩＤＳなどのいくつかの非腎臓病に罹患した患者に対して有効な治療であることが判明している（例えば、ミーンズ Ｒ．Ｔ．（Ｍｅａｎｓ Ｒ．Ｔ．）およびクランツ Ｓ．Ｂ．（Ｋｒａｎｔｚ Ｓ．Ｂ．）（１９９２年） Ｂｌｏｏｄ，８０、１６３９〜１６４７頁、ならびにジェルクマン Ｗ．（Ｊｅｌｋｍａｎｎ Ｗ．）（１９９８年）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．、１８、５５５〜５５９頁を参照）。さらに、ＥＰＯが虚血性、外傷性、毒性および炎症性損傷において組織保護的であることが報告されている（例えば、ブリン Ｍ．（Ｂｒｉｎｅｓ Ｍ．）ら（２００４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１、１４９０７〜１４９１２頁およびブリン Ｍ．Ｌ．（Ｂｒｉｎｅｓ Ｍ．Ｌ．）ら（２０００年）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７、１０５２６〜１０５３１頁を参照）。

かかる多種多様な原因から生じる貧血および他の症状の治療におけるＥＰＯの有用性および有効性故に、組換えヒトＥＰＯがおそらくは世界中で最も売れる薬剤となっている。推定売上高は実に年間５０億米国ドル超に達する。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系内で生成される組換えヒトＥＰＯは、治療薬として幅広く用いられている。あらゆる哺乳類が類似構造のグリカンを生成することから、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、およびヒト胚性腎臓−２９３（ＨＥＫ−２９３）は、糖タンパク質治療薬の生成において好ましい宿主細胞である。当該技術分野で既知のように、適切なグリコシル化は、インビボで治療用ペプチドの半減期および免疫原性に作用する極めて重要な因子である。グリコシル化が不十分なタンパク質は、肝臓により「古いもの」として認識されることにより、適切にグリコシル化されたタンパク質よりも速やかに身体から除去される。

治療用ペプチドの使用を妨げる別の現象は、これらのペプチドによって示される比較的短いインビボ半減期である。総じて短いインビボ半減期の問題は、治療用のグリコペプチドが高用量で頻回投与されなければならないことを意味し、これは最終的には、もしより長く持続させるためのより効率的な方法、より有効な糖タンパク質治療薬が利用可能であった場合と比べてより高いヘルスケアコストが必要でありうると解釈される。

費用効果的なグリコペプチド治療薬の提供に関する問題への１つの解決策は、ペプチドのインビボ半減期の増加である。例えば、改善された薬物動態特性を有するグリコペプチド治療薬が、合成高分子のペプチド骨格への付着により生成される。ペプチドに接合されている典型的な高分子はポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ペプチド治療薬を誘導体化するためのＰＥＧの使用によりペプチドの免疫原性が低下することが示されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら．）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールに共役された酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドについて開示している。免疫原性の低下に加え、循環におけるクリアランス時間が、対象のポリペプチドのＰＥＧ−接合体の大きさの増大によって延長される。

ＰＥＧおよびその誘導体のペプチドに対する付着の主なモードは、ペプチドアミノ酸残基を介する非特異的な共有結合である（例えば、米国特許第４，０８８，５３８号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，４１４，１４７号明細書、米国特許第４，０５５，６３５号明細書、および国際公開第８７／０００５６号パンフレットを参照）。ＰＥＧのペプチドに対する付着の別なモードは、グリコペプチド上でのグリコシル残基の非特異的な酸化を介するものであり（例えば国際公開第９４／０５３３２号パンフレットを参照）、その後、生成されるカルボニル部分のアミノ−ＰＥＧ種との還元アミノ化がなされる。

これらの非特異的な方法では、ポリ（エチレングリコール）が無作為に非特異的な様式でペプチド骨格上の反応残基に付加される。ＰＥＧ分子のランダム結合は、最終生成物における均質性の不足、およびペプチドの生物活性または酵素活性が低下するという可能性を含む欠点を有する。したがって、治療用ペプチドの生成においては、特異的に標識され、容易に特徴づけ可能で、本質的に均質なＰＥＧ化ペプチドの形成をもたらす誘導体化方法の方が優れている。本明細書に示されるように、かかる方法が開発されている。

特異的に標識された均質なペプチド治療薬が、酵素の作用によりインビトロで生成可能である。酵素に基づく合成は、合成高分子または他の標識をペプチドに付着させるための典型的な非特異的方法と異なり、位置選択性および立体選択性の利点を有する。標識ペプチドの合成において用いられる２つの主要なクラスの酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ（例えばシアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）およびグリコシダーゼである。これらの酵素を、後に治療部分を含むように修飾可能な糖類の特異的付着のために用いてもよい。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾グリコシダーゼを用い、修飾糖をペプチド骨格に直接転移させてもよい（例えば、米国特許第６，３９９，３３６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３／００４００３７号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３２６４０号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３７５５７号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１２６８３８号明細書および米国特許出願公開第２００４／０１４２８５６号明細書を参照。これら各々は参照により本明細書中に援用される）。化学的な合成因子と酵素的な合成因子の双方を組み合わせる方法もまた既知である（例えば、参照により本明細書中に援用される、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５〜４２２頁（１９９８年）および米国特許出願公開第２００４／０１３７５５７号明細書を参照）。

上で考察のように、エリスロポエチン（ＥＰＯ）は極めて価値の高い治療用ペプチドである。市販形態のＥＰＯが今日用いられているが、これらペプチドは、生成コストを増大させる糖タンパク質生成物の微小不均一性、得られる糖タンパク質の単離生成物における良好でない薬物動態、またはそれら２つの組み合わせを含む要因により最大限有効というわけではない。したがって、当該技術分野では、改善された有効性およびより優れた薬物動態を有する長期持続性のＥＰＯペプチドに対する需要が依然として存在する。さらに、それは最も多数の個人にとって有効であるように、何度となく容易に再生でき、予測可能で本質的に均質の構造を有し、改善された治療上の薬物動態を有するＥＰＯペプチドを工業規模で生成することが可能でなければならない

幸いにも、現在では治療有効性が改善されたＥＰＯペプチドおよびそれを作製するための方法が発見されている。本発明は、改善された薬物動態を有するＥＰＯペプチドを提供する。本発明はまた、修飾ＥＰＯペプチドの生成において産業上実用的でかつ費用効果的な方法を提供する。本発明のＥＰＯペプチドは、ＰＥＧ部分、治療部分、生体分子などの修飾基を含む。それ故、本発明は、症状および疾患の治療において有効な治療法をもたらす、改善された治療有効性および改善された薬物動態を有するＥＰＯペプチドに対する需要を満たすものである。

発明の概要
今では、１つまたは複数の高分子修飾部分、例えばポリ（エチレングリコール）を用いたエリスロポエチン（ＥＰＯ）の修飾の制御により、改善された薬物動態特性を有する新規のＥＰＯ誘導体が得られることが発見されている。さらに、本発明の高分子修飾ＥＰＯペプチドの信頼性の高い、再生可能な生成における費用効果的な方法が発見され、開発されている。

高分子修飾部分は、ＥＰＯのグリコシル部分の任意の位置で付着されうる。さらに、高分子修飾部分は、野生型または変異ＥＰＯペプチドのアミノ酸配列における任意の位置でグリコシル残基に結合されうる。

典型的な実施形態では、本発明は、グリコシル連結基を介して高分子修飾部分に接合されるＥＰＯペプチドを提供する。典型的なＥＰＯペプチド接合体は、

から選択される化学式を有するグリコシル連結基を含む。

化学式ＩおよびＩＩでは、Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７またはＯＲ^７である（式中、Ｒ^７はＨ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを示す）。記号Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^６’はＨ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９を独立して示す。指数ｄは０または１である。Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択される。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つは、高分子修飾部分、例えばＰＥＧを含む。典型的な実施形態では、Ｒ^６およびＲ^６’は、それらの付着対象である炭素とともにシアル酸の側鎖成分である。さらに典型的な実施形態では、この側鎖は高分子修飾部分で官能化される。

典型的な実施形態では、高分子部分は、一般にグリコシルコア（例えばＮ、Ｏ）上のヘテロ原子を介し、下記に示されるリンカーＬを介し、グリコシル連結基に結合される。

Ｒ^１は高分子修飾部分であり、Ｌは結合および連結基から選択される。指数ｗは１〜６、好ましくは１〜３およびより好ましくは１〜２から選択される整数を示す。典型的な連結基は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸を含む。リンカーの典型的な成分はアシル部分である。別の典型的な連結基はアミノ酸残基である（例えば、システイン、セリン、リジン、および短いオリゴペプチド、例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓなど）。

Ｌが結合である場合、それはＲ^１の前駆体上の反応性官能基とグリコシル連結基の前駆体上の相補的反応性を有する反応性官能基の反応により形成される。Ｌが０級以外の連結基である場合、ＬはＲ^１前駆体との反応に先立ちグリコシル部分上に配置されうる。あるいは、ＬおよびＲ^１の前駆体は、後にグリコシル部分に付着される予備形成されたカセットに取り込まれうる。本明細書に示されるように、適切な反応性官能基を有する前駆体の選択および調製は当業者の能力の範囲内にある。さらに、当該技術分野で十分に理解されている化学反応により、前駆体の共役が進行する。

典型的な実施形態では、Ｌは修飾糖をもたらすアミノ酸または小ペプチド（例えば、１〜４個のアミノ酸残基）から形成される連結基であり、ここでは高分子修飾部分が置換アルキルリンカーを介して付着される。典型的なリンカーは、グリシン、リジン、セリンおよびシステインを含む。本明細書で定義されるアミノ酸類似体は、リンカー成分としても有用である。アミノ酸は、例えばアミノ酸残基のアミン部分を介して形成されるアミドまたはウレタンであるアシル結合を介して共有結合される、アルキル、ヘテロアルキルを例とするリンカーの追加成分で修飾されうる。

典型的な実施形態では、グリコシルリンカーは化学式Ｉに準じた構造を有し、かつＲ^５は高分子修飾部分を含む。別の典型的な実施形態では、Ｒ^５は高分子修飾部分と、修飾部分をグリコシルコアに連結させるリンカーＬの双方を含む。Ｌは線状または分岐構造でありうる。同様に、該高分子修飾は分岐状または線状でありうる。

高分子修飾部分は、水溶性または本質的に水不溶性でありうる、２つまたはそれより大きい反復単位を含む。本発明の化合物にて用いられる典型的な水溶性高分子は、ＰＥＧ、例えばｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、例えばｍ−ＰＰＧ、ポリシアル酸、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリリシン、ポリエチレンイミン、生分解性高分子（例えば、ポリラクチド、ポリグリセリド）、および官能化ＰＥＧ、例えば末端官能化ＰＥＧを含む。

本発明のＥＰＯ接合体にて用いられるグリコシル連結基のグリコシルコアは、天然および非天然のフラノースとピラノースの双方から選択される。非天然糖類は、場合により、アルキル化またはアシル化されたヒドロキシルおよび／またはアミン部分、例えば、環上のエーテル、エステルおよびアミド置換基を含む。他の非天然糖類は、天然糖類中に存在しない、環上の位置でのＨ、ヒドロキシル、エーテル、エステルまたはアミド置換基を含む。あるいは、炭水化物は、その名称の由来となる炭水化物の中に見出されると思われる置換基を失っている、例えばデオキシ糖である。さらに典型的な非天然糖類は、酸化された（例えば、−オン酸および−ウロン酸）炭水化物と還元された（糖アルコール）炭水化物の双方を含む。糖部分は単糖類、オリゴ糖類または多糖類でありうる。

本発明におけるグリコシル連結基の成分として用いられる典型的な天然糖類は、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、フコース、マンノース、マンノサミン、キシラノース（ｘｙｌａｎｏｓｅ）、リボース、Ｎ−アセチルグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびシアル酸を含む。

一実施形態では、本発明は、部分

（式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、ＧはＨおよびＲ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ^１は直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、かつＬはリンカー、例えば結合（「０級」）、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルである）を含むエリスロポエチンペプチドを提供する。典型的な実施形態では、ＤがＯＨの場合、ＧはＲ^１−Ｌ−であり、かつＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルの場合、ＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−である。

別の態様では、本発明は、化学式

を有するグリコシル連結基を含むペプチドを提供する。

他の実施形態では、基は化学式

（式中、ｔは０または１である）
を有する。

さらに別の実施形態では、基は化学式

（式中、指数ｐは１〜１０の整数を示し、かつａは０または１を示す）
を有する。

別の態様では、本発明は、本発明のＰＥＧ化エリスロポエチンを作製する方法を提供する。本方法は、（ａ）

から選択されるグリコシル基を含む基質のエリスロポエチンペプチドを化学式

を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー、およびＰＥＧ−シアル酸を該ドナーから該グリコシル基のＧａｌおよびＳｉａから選択されるメンバー上に該転移に適切な条件下で転移させる酵素と接触させるステップを含む。典型的な修飾シアル酸ドナーは、リンカー部分を介して高分子、例えば直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）部分で修飾されるＣＭＰ−シアル酸である。

ペプチドは本質的に任意のソースから取得可能であるが、一実施形態では、上で考察された修飾に先立ち、エリスロポエチンペプチドは適切な宿主内で発現される。哺乳類（例えばＣＨＯ）および昆虫細胞（例えばＳｆ−９）は、本明細書に記載の組成物および方法で有用なＥＰＯをもたらす典型的な発現系である。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする被験者における症状を治療する方法を提供する。典型的な状態は、被験者における赤血球生成の障害として特徴づけられる状態を含む。本方法は、被験者における状態を改善するのに有効な量の本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドを被験者に投与するステップを含む。

別の態様では、本発明は、哺乳動物における赤血球生成を高める方法を提供する。本方法は、哺乳動物における赤血球生成を高めるのに有効な量の本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドを哺乳動物に投与するステップを含む。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする被験者における組織損傷を治療する方法を提供する。典型的な損傷は、虚血、外傷、炎症または毒性物質との接触に起因する損傷として特徴づけられるものを含む。本方法は、被験者における組織障害を改善するのに有効な量の本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドを被験者に投与するステップを含む。保護または治療における典型的なクラスは神経保護を含む（例えば、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の変性神経疾患の治療）。本発明の修飾ＥＰＯはまた、腎機能障害、癌、および網膜症などの疾患を有する患者の治療も有用である。

別の態様では、本発明は、本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドを含有する医薬製剤を提供し、かつ製剤は保存、処理、および／または治療適用において実質的に安定である。

別の態様では、本発明は、本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドおよび医薬的に許容できる担体を含有する医薬製剤を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドと、例えば製剤に適するｐＨ範囲をもたらす緩衝液を含有するエリスロポエチン製剤を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドおよび等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含有するエリスロポエチン製剤を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドおよび界面活性剤を含有するエリスロポエチン製剤を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドと、選択的水和により安定化する一般的な安定剤、および金属キレート剤、抗酸化剤または抗菌防腐剤などの特定の安定剤を含む（がこれらに限定されない）少なくとも１種の安定剤とを含有するエリスロポエチン製剤を提供する。

本発明の高分子修飾エリスロポエチン糖接合体では、高分子が結合している各アミノ酸残基は本質的に個々のペプチド分子の集団全体にわたり同じ構造を有する。例えば、もし１個のペプチド分子が高分子修飾部分に付着されるグリコシル連結基を含む、Ｓｅｒに連結されたグリコシル残基を含む場合、集団内の他のペプチドの少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、またはより好ましくは９９．８％が、同じＳｅｒ残基に共有結合した高分子修飾部分を有する同じグリコシル残基を有することになる。

本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。

発明の詳細な説明および好ましい実施形態
略称
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミニル）、Ｓｉａ（シアリル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−リン酸。

定義
他に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されているように一般に同じ意味を有する。一般に、本明細書で用いられる命名法および細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションにおける実験手順は周知のものであり、当該技術分野で共通に用いられる。標準技術は、核酸およびペプチド合成において用いられる。技術および手順は、一般に当該技術分野における従来の方法および様々な一般的な参考文献（一般には、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、第２版（１９８９年） コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州を参照。これは参照により本明細書中に援用される）に従って実施され、この文書全体を通して提供される。本明細書で用いられる命名法および分析化学における実験手順ならびに下記の有機合成は周知のものであり、当該技術分野で共通に用いられる。標準技術またはその改良は、化学合成および化学分析において用いられる。

本明細書で記載のすべてのオリゴ糖は、非還元糖類についての名称または略称（すなわちＧａｌ）、次いでグリコシド結合（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与する還元糖類の環位置（２、３、４、６または８）の配置で記載され、次いで還元糖類の名称または略称（すなわちＧｌｃＮＡｃ）で記載される。各糖類は、好ましくはピラノースである。標準のグリコバイオロジーの命名法に関するレビューとして、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」 ヴァルキ（Ｖａｒｋｉ）ら編 ＣＳＨＬプレス（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９９９年）を参照のこと。

オリゴ糖は、還元末端の糖類が実際に還元糖である無しを問わず、還元末端および非還元末端を有すると考えられている。一般に認められた命名法に従い、オリゴ糖は、本明細書では左側に非還元末端および右側に還元末端で示される。

「シアル酸」という用語は、９炭素のカルボキシル化糖類のファミリーの任意のメンバーを示す。シアル酸ファミリーの最も共通のメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−オン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略記されることが多い））である。ファミリーの第２のメンバーはＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基は水酸化される。第３のシアル酸ファミリーメンバーは２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（ナダノ（Ｎａｄａｎｏ）ら、（１９８６年） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０〜１１５５７頁；カナモリ（Ｋａｎａｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９頁（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸もまた含められる。シアル酸ファミリーに関するレビューとしては、例えば、ヴァルキ（Ｖａｒｋｉ）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２：２５〜４０頁（１９９２年）；「Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｒ．シャウワー（Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ）編（シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９２年））を参照のこと。シアリル化手順でのシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公表された国際公開第９２／１６６４０号パンフレットにおいて開示されている。

「ペプチド」は、単量体がアミノ酸でありかつアミド結合を介して互いに連結される高分子を示し、別にポリペプチドと称される。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子でコードされていないアミノ酸もまた本発明にて使用可能である。さらに、本発明においては反応基、グリコシル化部位、高分子、治療部分、生体分子などを含むように修飾されているアミノ酸もまた使用可能である。本発明で用いられるすべてのアミノ酸はＤ−またはＬ−異性体でありうる。Ｌ−異性体が一般には好ましい。さらに、本発明では他のペプチド模倣体もまた有用である。本明細書で用いられる「ペプチド」は、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの双方を示す。ペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されるペプチドもまた含まれる。一般的レビューとして、スパトラ Ａ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ Ａ．Ｆ．）、「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、Ｂ．ワインシュタイン（Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２６７頁（１９８３年）を参照のこと。

「ペプチド接合体」という用語は、ペプチドが本明細書にて示される修飾糖と接合される場合の本発明の種を示す。

「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体および天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸模倣体を示す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾される該アミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合されるα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを示す。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが天然アミノ酸と同様に機能する化合物を示す。

本明細書で用いられる「修飾糖」という用語は、本発明のプロセス内での、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に酵素的に付加される天然または非天然炭水化物を示す。修飾糖は、糖ヌクレオチド（一リン酸塩、二リン酸塩、および三リン酸塩）、活性化糖類（例えば、ハロゲン化グリコシル、グリコシルメシレート）ならびに活性化物でもヌクレオチドでもない糖類を含むがこれらに限定されない酵素基質から選択される。「修飾糖」は、「修飾基」と共有結合的に官能化される。有用な修飾基は、ＰＥＧ部分、治療部分、診断部分、生体分子などを含むがこれらに限定されない。修飾基は、好ましくは天然物でないか、または非修飾の炭水化物である。修飾基で官能化された座は、それが「修飾糖」におけるペプチドへの酵素的付加を阻止しないように選択される。

「水溶性」という用語は、ある程度検出可能な水への溶解度を有する部分を示す。水溶解度を検出および／または定量するための方法は当該技術分野で周知である。典型的な水溶性高分子は、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などを含む。ペプチドは、単一のアミノ酸、例えばポリ（リジン）からなる混合配列を有しうる。典型的な多糖類はポリ（シアル酸）である。典型的なポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）は典型的なポリアミンであり、かつポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。

水溶性高分子の高分子骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）でありうる。しかし、他の関連高分子も本発明の実施における使用に適し、かつＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語の使用がこの観点で包括的であり、排他的でないことは理解されるべきである。ＰＥＧという用語は、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、高分子骨格に対してペンダント状の１つまたは複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連高分子）、または分解性連結を内包するＰＥＧを含む、その形態のいずれかにおけるポリ（エチレングリコール）を含む。

高分子骨格は線状または分岐状でありうる。分枝高分子骨格は一般に当該技術分野で既知である。典型的には、分枝高分子は中央分岐コア部分および中央分岐コアに連結された複数の線状高分子鎖を有する。ＰＥＧは、酸化エチレンのグリセロール、ペンタエリトリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールへの添加によって調製可能な分岐形態で一般に用いられる。中央分岐部分は、リジンなどの数種のアミノ酸からも誘導可能である。分岐ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）_ｍ（式中、Ｒはグリセロールまたはペンタエリトリトールなどのコア部分を示し、ｍはアームの数を示す）としての一般形態で表現可能である。例えば米国特許第５，９３２，４６２号明細書（参照によりその全体が本明細書中に援用される）中に記載されたマルチ−アームＰＥＧ分子は、高分子骨格としても使用可能である。

多数の他の高分子についても本発明に適する。２〜約３００の末端を有する、非ペプチド性および水溶性である高分子骨格は、本発明において特に有用である。適切な高分子の例として、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体などの他のポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、例えば米国特許第５，６２９，３８４号明細書（参照によりその全体が本明細書中に援用される）中に記載されたポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ならびにこれらの共重合体、三元重合体、および混合物が挙げられるがこれらに限定されない。高分子骨格の各鎖の分子量は変化しうるが、それは典型的には約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの範囲内であり、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａである場合が多い。

ペプチド薬の患者への投与に関連する、本明細書で用いられる「曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、患者における全身循環での薬剤の濃度をゼロから無限に至る時間の関数として記述する曲線下の総面積として定義される。

ペプチド薬の患者への投与に関連する、本明細書で用いられる「半減期」または「ｔ１／２」は、患者内での薬剤の血漿濃度が半分減少するのに必要な時間として定義される。複数のクリアランス機構、再分布、および当該技術分野で周知の他の機構に依存するペプチド薬剤に関連した２以上の半減期がありうる。通常、αおよびβ半減期は、α相が再分布に関連しかつβ相がクリアランスに関連するように定義される。しかし、大部分で血流に限定されるタンパク質薬剤の場合、少なくとも２つのクリアランス半減期がありうる。一部のグリコシル化ペプチドにおいては、急速なβ相クリアランスが、マクロファージ上の受容体、あるいは末端ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、またはフコースを認識する内皮細胞を介して媒介されうる。遅延したβ相クリアランスが、２ｎｍ未満の有効半径（約６８ｋＤａ）を有する分子における腎臓糸球体濾過ならびに／あるいは組織内での特異的または非特異的な取り込みおよび代謝を介して生じうる。グリコＰＥＧ化は、末端糖類（例えばガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）をキャッピングすることにより、これらの糖類を認識する受容体を介する急速なα相クリアランスを遮断しうる。それはまた、より大きな有効半径を与えることによって分布および組織取り込みの容量を減少させ、それにより遅いβ相を延長しうる。したがって、グリコＰＥＧ化のα相およびβ相の半減期に対する正確な影響は、当該技術分野で周知のように大きさ、グリコシル化の状態、および他のパラメータにより変化しうる。「半減期」についてのさらなる説明は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９７年、ＤＦＡ クロメリン（ＤＦＡ Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ）およびＲＤ シンデラー（ＲＤ Ｓｉｎｄｅｌａｒ）編、ハーウッド・パブリッシャーズ（Ｈａｒｗｏｏｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、１０１〜１２０頁）の中に見出される。

本明細書で用いられる「糖接合」という用語は、修飾糖種の、ポリペプチド、例えば本発明のエリスロポエチンペプチドのグリコシル残基またはアミノ酸への酵素に媒介された接合を示す。「糖接合」の亜属は、修飾糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）およびそれらのアルキル誘導体（例えばｍ−ＰＥＧ）または反応誘導体（例えばＨ_２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＫ−ＰＥＧ）である場合の「グリコ−ＰＥＧ化」である。

「大規模」および「工業規模」という用語は、同義的に用いられ、かつ単一の反応サイクルの完了時に少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、およびより好ましくは少なくとも約１ｇの糖接合体を生成する反応サイクルを示す。

本明細書で用いられる「グリコシル連結基」という用語は、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療部分、生体分子）の共有結合対象のグリコシル残基を示し、グリコシル連結基は修飾基を接合体の残部に連結させる。本発明の方法においては、「グリコシル連結基」はグリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドに共有結合された状態になり、それにより該作用物質がペプチド上のアミノ酸残基および／またはグリコシル残基に連結される。「グリコシル連結基」は、一般に「修飾糖」のペプチドのアミノ酸残基および／またはグリコシル残基への酵素による付着によって「修飾糖」から誘導される。グリコシル連結基は修飾基−修飾糖カセットの形成の間（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）に分解される糖類由来の構造でありうるか、またはグリコシル連結基は無傷でありうる。「無傷グリコシル連結基」は、修飾基を接合体の残部に連結する糖類単量体が、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによって、分解、例えば酸化されない場合の、グリコシル部分から誘導される連結基を示す。本発明の「無傷グリコシル連結基」は、グリコシル単位の付加または親糖類構造からの１つまたは複数のグリコシル単位の除去によって天然オリゴ糖から誘導されうる。

本明細書で用いられる「標的化部分」という用語は、身体の特定の組織内または領域内で選択的に局在化することになる種を示す。局在化は、分子決定基の特異的認識、標的化剤または接合体の分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などにより媒介される。作用物質を特定の組織または領域に標的化する他の機構は当業者に既知である。典型的な標的化部分は、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどを含む。

本明細書で用いられる「治療部分」は、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒素、および放射活性物質を含むがこれらに限定されない、治療に有用な任意の作用物質を意味する。「治療部分」は、生体活性物質のプロドラッグ、２つ以上の治療部分が担体に結合される場合の作成物、例えば多価物質を含む。治療部分はまた、タンパク質およびタンパク質を含む作成物を含む。典型的なタンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α，−β，−γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、第ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ因子）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）ならびに抗体融合タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））を含むがこれらに限定されない。

本明細書で用いられる「医薬的に許容できる担体」は、接合体と結合する場合に接合体の活性を保持しかつ被験者の免疫系と反応性を示さない任意の物質を含む。例として、リン酸塩緩衝生理食塩溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの浸潤剤などの標準医薬担体のいずれかが挙げられるがこれらに限定されない。他の担体には、無菌溶液、被覆タブレットを含むタブレットおよびカプセルも含まれうる。典型的には、かかる担体は、デンプン、ミルク、糖、特定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、マグネシウムまたはカルシウムステアレート、タルク、植物性脂肪またはオイル、ガム、グリコールなどの賦形剤、あるいは他の既知の賦形剤を含有する。かかる担体は、フレーバーおよび着色添加剤または他の原料も含みうる。かかる担体を含有する組成物は、周知の従来の方法によって調合される。

本明細書で用いられる「投与」は、被験者に対する、経口投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病変内投与、鼻腔内投与または皮下投与、あるいは小型浸透ポンプを例とする徐放デバイスの移植を意味する。投与は非経口および経粘膜（例えば、経口、鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路によるものである。非経口投与は、例えば静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内投与を含む。さらに、腫瘍を治療する、例えばアポトーシスを誘発するために注射がなされる場合、投与は、腫瘍および／または腫瘍を取り囲む組織内に直接的に行われうる。他の送達モードは、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用を含むがこれらに限定されない。

「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」または「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」という用語は、徴候の軽減、寛解もしくは低減または患者の身体もしくは精神の健康における改善など、任意の客観的または主観的パラメータを含む、病理または症状の治療における奏功に関する任意の徴候を示す。徴候の改善は、身体検査および／または精神鑑定の結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づくものでありうる。

「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、疾患に罹患しやすいもののまだ疾患の徴候を経験したりまたは呈することがない動物において生じる疾患または症状の予防（予防治療）、疾患の阻害（その発症の遅延化または停止）、疾患の徴候または副作用の軽減を与えること（緩和治療を含む）、および疾患の緩和（疾患の退行を引き起こす）を含む、疾患または症状の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」を示す。

「有効量」または「に対する有効量」または「治療有効量」という用語あるいは任意の文法的に等価な用語は、疾患を治療するために動物に投与される場合における、その疾患に対して治療効果を発揮するための十分な量を意味する。

「組織保護性」という用語は、典型的には、虚血／低酸素症、外傷、毒性および／または炎症に関する組織または器官での経験に関連した細胞障害の作用に対する組織の防御を示す。細胞障害により、アポトーシスおよび／または壊死（すなわち毒性細胞死）が生じる場合がある。したがって、「組織保護性」作用は、所定の外傷性、炎症性、毒性または虚血性障害に通常関連したある程度のアポトーシスおよび／または毒性細胞死を経験することから組織を保護する。例えば、ＥＰＯは、齧歯類モデルにおいて中大脳動脈閉塞後の梗塞の領域を減少させる（サイレン Ａ．Ｌ．（Ｓｉｒｅｎ Ａ．Ｌ．）ら（２００１年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８、４０４４〜４０４９頁）。それ故、ＥＰＯは、かかる条件下で、虚血性障害（例えば虚血性脳卒中）に通常関連した壊死および／またはアポトーシスを有効に低下させることにより「組織保護性」作用をもたらす。「組織保護性」はまた、網膜症または神経変性疾患などの変性疾患に関連した細胞障害および続発する細胞死の作用に対する組織の防御を示す。

「単離された」という用語は、物質を生成するのに用いられる成分から実質的または本質的に遊離している物質を示す。本発明のペプチド接合体においては、「単離された」という用語は、ペプチド接合体を調製するのに用いられる混合物中に物質を通常伴う成分から実質的または本質的に遊離している物質を示す。「単離された」および「純粋な」は同義的に用いられる。典型的には、本発明の単離ペプチド接合体は、好ましくはある範囲で表される、あるレベルの純度を有する。ペプチド接合体における純度範囲の下限は約６０％、約７０％または約８０％であり、かつ純度範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。

ペプチド接合体が約９０％の純度を超える場合、それらの純度も好ましくはある範囲で表される。純度範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の純度である。

純度は、任意の当該技術分野で認められた分析方法（例えば、銀染色ゲル上の帯強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段）により測定される。

本明細書で用いられる「集団の本質的に各々のメンバー」は、ペプチドに付加される選択された百分率の修飾糖類がペプチド上の複数の同一のアクセプタ部位に付加される場合の本発明のペプチド接合体の集団の特性を示す。「集団の本質的に各々のメンバー」は修飾糖に接合されるペプチド上の部位の「均質性」に言及したものであり、それらは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％およびより好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明の接合体を示す。

「均質性」は、修飾糖類の接合対象のアクセプタ部分の集団全体にわたる構造的一貫性を示す。したがって、各修飾糖部分がすべての他の修飾糖の接合対象のアクセプタ部位と同じ構造を有するアクセプタ部位に接合される場合の本発明のペプチド接合体では、ペプチド接合体は約１００％均質であるといわれる。均質性は、典型的にはある範囲で表される。ペプチド接合体における均質性の範囲の下限は約６０％、約７０％または約８０％であり、かつ純度の範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。

ペプチド接合体が約９０％またはそれより大きい割合で均質である場合、それらの均質性についても好ましくはある範囲で表される。均質性の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均質性である。ペプチド接合体の純度は、典型的には、例えば液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱着飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動など、当業者に既知の１つまたは複数の方法により測定される。

グリコペプチド種に言及する場合、「実質的に均一なグライコフォーム」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」は、目的のグリコシルトランスフェラーゼ（例えばフコシルトランスフェラーゼ）によりグリコシル化されるアクセプタ部分の百分率を示す。例えばα１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、もし本発明のペプチド接合体内でＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化類似体の実質的にすべて（下に定義）がフコシル化されると仮定すると、実質的に均一なフコシル化パターンが存在する。本明細書で示されるフコシル化構造においては、Ｆｕｃ−ＧｌｃＮＡｃ連結は一般にα１，６またはα１，３であり、ここでは一般にα１，６が好ましい。出発原料がグリコシル化アクセプタ部分（例えばフコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を有しうることは当業者により理解されるであろう。したがって、計算された百分率のグリコシル化は、本発明の方法によってグリコシル化されるアクセプタ部分、ならびに出発原料中で既にグリコシル化されたアクセプタ部分を含むことになる。

「実質的に均一な」の上記の定義における「実質的に」という用語は、一般に、特定のグリコシルトランスフェラーゼにおけるアクセプタ部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されることを意味する。

置換基が左から右に記載されたその従来の化学式によって特定される場合、それらは化学的に同一の置換基を等しく包含し、そうであれば該置換基は右から左への構造の記載から得られることになる。例えば−ＣＨ_２Ｏ−は−ＯＣＨ_２−も挙げるように意図されている。

「アルキル」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、指定される炭素原子の数を有する（すなわちＣ_１〜Ｃ_１０は１〜１０個の炭素を意味する）、直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味し、それらは完全飽和、一価不飽和または多価不飽和の場合があり、かつジラジカルおよび多価ラジカルを含みうる。飽和炭化水素ラジカルの例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体が挙げられるがこれらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例として、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級の相同体および異性体が挙げられるがこれらに限定されない。「アルキル」という用語は、特に断りのない限り、「ヘテロアルキル」など、下記により詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことも意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と称される。

「アルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−で例示される（がこれに限定されない）、アルカンから誘導されるジラジカルを意味し、かつ「ヘテロアルキレン」として下記に示される基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有することになり、ここで本発明では１０個またはそれより少ない炭素原子を有する基が好ましい。「低級のアルキル」または「低級のアルキレン」は、鎖がより短いアルキル基またはアルキレン基であり、一般に８個またはそれより少ない炭素原子を有する。

「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）はそれらの従来の意味で用いられ、かつそれぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介する分子の残部に付着されるアルキル基を示す。

「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、記載された数の炭素原子とＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味し、ここで窒素および硫黄原子は場合により酸化されかつ窒素ヘテロ原子は場合により四級化される可能性がある。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残部に付着される位置に配置される場合がある。例として、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、−ＣＨ_２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ_３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３が挙げられるがこれらに限定されない。最大２つのヘテロ原子が連続する場合があり、例として−ＣＨ_２−ＮＨ−ＯＣＨ_３および−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３などが挙げられる。同様に「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−および−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−で例示される（がこれらに限定されない）、ヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基においては、ヘテロ原子は鎖の一末端または両末端を占有しうる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基においては、連結基の化学式が記される場合の向きによっては、連結基の配向は示唆されない。例えば、化学式−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−は−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２−の双方を示す。

「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それら自体でまたは別の用語と組み合わせ、特に明記しない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状変形体を示す。さらに、ヘテロシクロアルキルにおいては、ヘテロ原子は複素環が分子の残部に付着される位置を占有しうる。シクロアルキルの例として、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるがこれらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例として、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるがこれらに限定されない。

「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それら自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル」という用語は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むがこれらに限定されないことを意味する。

「アリール」という用語は、特に明記しない限り、互いに融合されるかまたは共有結合される単環または複環（好ましくは１〜３つの環）でありうる多価不飽和の芳香族置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有するアリール基（または環）を示し、ここで窒素および硫黄原子は場合により酸化され、かつ窒素原子は場合により四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着されうる。アリール基およびヘテロアリール基の限定されない例として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンジミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々における置換基は、下記の許容可能な置換基の群から選択される。

簡潔のために、「アリール」という用語は、他の用語と併用される場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上で定義されたようなアリール環とヘテロアリール環の双方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子により置換されているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジロキシメチル、３−（１−ナフチロキシ）プロピルなど）を含むアルキル基に付着されるアリール基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）のラジカルを含むことを意味する。

上記用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）の各々は、指定されるラジカルの置換形態と非置換形態の双方を含むことを意味する。ラジカルの各タイプにおいて好ましい置換基は下記に提供される。

アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されることが多いそれらの基を含む）における置換基は一般に「アルキル基置換基」と称され、かつそれらは、０〜（２ｍ’＋１）（ｍ’はかかるラジカル中の炭素原子の総数である）の範囲の数内の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ_２から選択される（がこれらに限定されない）１つまたは複数の種々の基でありうる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’の各々は、好ましくは独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば１−３ハロゲン、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基で置換されたアリール基を示す。例えば、本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、各Ｒ基は、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基それぞれでも、２つ以上が存在する場合そうであるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に付着される場合、窒素原子との結合によって５−、６−、または７−員環が形成されうる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むがこれらに限定されないことを意味する。置換基に関する上の考察によると、当業者は、「アルキル」という用語がハロアルキル（例えば−ＣＦ_３および−ＣＨ_２ＣＦ_３）およびアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）などのように、水素基以外の基に結合される炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解するであろう。

アリール基およびヘテロアリール基における置換基は、アルキルラジカルにて示される置換基と同様、一般に「アリール基置換基」と称される。置換基は、０から芳香環系上の開放原始価（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅｓ）の総数の範囲の数内の、例えば、ハロゲン、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ_２、−Ｒ’、−Ｎ_３、−ＣＨ（Ｐｈ）_２、フルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルから選択され、ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択される。例えば、本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、各Ｒ基は、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基それぞれでも、２つ以上が存在する場合そうであるように、独立して選択される。以下のスキームでは、記号Ｘは上記のように「Ｒ」を示す。

アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、場合により化学式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）_ｕ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｕは０〜３の整数である）の置換基で置換されうる。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、場合により化学式−Ａ（ＣＨ_２）_ｒＢ−（式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜４の整数である）の置換基と置換されうる。そのようにして形成された新規の環の単結合の１つは、場合により二重結合と置換されうる。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、場合により化学式−（ＣＲＲ’）_ｚ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）_ｄ−（式中、ｚおよびｄは独立して０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である）の置換基と置換されうる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは水素または置換もしくは非置換（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルから独立して選択される。

本明細書で用いられる「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびシリコン（Ｓｉ）を含むことを意味する。

はじめに
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球合成の主要な調節物質としての機能を果たす糖タンパク質である。エリスロポエチンは、前駆体細胞の成熟赤血球への分割および分化を引き起こす骨髄内で同細胞を刺激することにより作用する。ＥＰＯは１６５個または１６６個のアミノ酸糖タンパク質として存在しうる。１６６個のアミノ酸変異体は、タンパク質のＣ末端での追加のアルギニン残基の存在により１６５個のアミノ酸変異体と区別される。

組換えＥＰＯはこれまで随時使用可能なものであり、かつ慢性腎不全に関連した貧血、ジドビジンで治療されるＨＩＶ感染患者、および化学療法中の癌患者を含む様々な形態の貧血の治療に有効な治療薬である。糖タンパク質は、非経口、すなわち静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）注射として投与される。

治療目的に用いられる組換えエリスロポエチンの有効性を改善するため、本発明はグリコシル化エリスロポエチンペプチドおよび非グリコシル化エリスロポエチンペプチドの高分子接合体を提供する。接合体を、治療部分、診断部分、標的化部分などの多様な種とのさらなる接合によりさらに修飾することが可能である。

本発明の接合体は、高分子修飾部分を担持する修飾糖のグリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドへの酵素による付着により形成される。グリコシル化部位は、例えば糖接合により高分子性のおよび他の修飾基をペプチドに接合するための座を提供する。典型的な修飾基として、ポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）などの水溶性高分子が挙げられる。ＥＰＯペプチドの修飾により、患者の循環系における組換えＥＰＯの安定性および保持時間を改善しかつ／または組換えＥＰＯの抗原性を低下することが可能である。

本発明は、実質的に均質の誘導体化パターンを有するＥＰＯペプチドおよびグリコペプチドを提供する。本発明は、かかるペプチドの調製方法も提供する。本発明の方法にて用いられる酵素は、一般に特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の組み合わせ、またはペプチドの特定のグリコシル残基に対して選択性を示す。本方法は、修飾ペプチドおよびグリコペプチドの大規模生成においても実用的である。したがって、本発明の方法は、予め選択された均一な誘導体化パターンを有するグリコペプチドを大規模に調製するための実用的手段を提供する。

本発明は、例えばクリアランス速度の低下あるいは免疫または細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込み速度の低下に起因して治療における半減期が増加したグリコシル化および非グリコシル化ペプチドの接合体も提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基をマスクすることでペプチドに対する宿主免疫応答を低下または除去するための手段を提供する。標的化剤の選択的付着を用いることで、特定の標的化剤に特異的な特定の組織または細胞表面受容体に対してペプチドを標的化することも可能である。

接合体
第１の態様では、本発明は、選択された修飾基とＥＰＯペプチドとの接合体を提供する。ペプチドと修飾部分の間の連結は、ペプチドと選択された部分との間に挿入されたグリコシル連結基を含む。本明細書で考察のように、選択された修飾部分は本質的に糖類単位に付着されうる任意の種であり、これから適切なトランスフェラーゼ酵素により認識される「修飾糖」が得られる。ここで該酵素は修飾糖をペプチドまたはそれに付着されるグリコシル残基上に付加する。修飾糖の糖類成分は、ペプチドと選択された部分との間に挿入される場合、「グリコシル連結基」、例えば「無傷グリコシル連結基」になる。グリコシル連結基は、修飾基での修飾後において修飾糖をペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に付加する酵素における基質である任意の単糖類またはオリゴ糖類から形成される。

グリコシル連結基は、修飾基の付加の前または間に分解的に修飾される糖類部分でありうるかまたはそれを含みうる。例えば、グリコシル連結基は、例えばメタ過ヨウ素酸塩の作用を介する、無傷糖類の対応するアルデヒドへの酸化的分解により生成され、次いで、適切なアミンを有するシッフ塩基に変換され、そして、対応するアミンに還元される糖類残基から誘導されうる。

本発明の接合体は、典型的には一般構造

（式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは正のゼロでない整数を示し、ｔは０または正の整数である）に対応することになる。「作用物質」は、治療薬、生体活性物質、検出可能な標識、水溶性部分（例えば、ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、およびｍ−ＰＰＧ）または同種のものである。「作用物質」は、ペプチド、例えば酵素、抗体、抗原などでありうる。リンカーは、以下の多様な連結基のいずれかでありうる。あるいは、リンカーは単結合または「０級リンカー」でありうる。

典型的な実施形態では、選択された修飾基は水溶性高分子、例えばｍ−ＰＥＧである。水溶性高分子は、グリコシル連結基を介してペプチドに共有結合される。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に共有結合される。本発明は、アミノ酸残基およびグリコシル残基がグリコシル連結基で修飾される場合の接合体も提供する。

典型的な水溶性高分子は、ポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明で用いられるポリ（エチレングリコール）は、ある特定の形態または分子量範囲に限定されない。非分岐ポリ（エチレングリコール）分子においては、分子量は好ましくは５００〜１００，０００である。好ましくは２０００〜６０，０００、および好ましくは約５，０００〜約３０，０００の分子量が用いられる。

別の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上のＰＥＧ部分を付着させる分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧの例が、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，３４２，９４０号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，９１９，４５５号明細書；米国特許第６，１１３，９０６号明細書；米国特許第５，１８３，６６０号明細書；国際公開第０２／０９７６６号パンフレット；コデラ Ｙ．（Ｋｏｄｅｒａ Ｙ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：２８３〜２８８頁（１９９４年）；およびヤマサキ（Ｙａｍａｓａｋｉ）ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：２１２５〜２１２７頁、１９９８年において記載されている。好ましい実施形態では、分岐ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は４０，０００ダルトン以下である。

本発明は、酵素的に付加されたグリコシル連結基を介して形成される接合体の提供に加え、それらの置換パターンにおいて高度に均質な接合体を提供する。本発明の方法を用い、本発明の接合体の集団全体にわたる本質的にすべての修飾糖部分が構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基に付着される、ペプチド接合体を形成することが可能である。したがって、第２の態様では、本発明は、グリコシル連結基、例えば無傷グリコシル連結基を介してペプチドに共有結合される水溶性高分子部分の集団を有するペプチド接合体を提供する。好ましい本発明の接合体では、集団の本質的に各々のメンバーは、グリコシル連結基を介してペプチドのグリコシル残基に結合され、かつグリコシル連結基の付着対象のペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有する。

さらに、グリコシル連結基を介して共有結合された水溶性高分子部分の集団を有するペプチド接合体が提供される。好ましい実施形態では、水溶性高分子部分の集団の本質的にすべてのメンバーがグリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸残基に結合され、かつグリコシル連結基を付着させる各アミノ酸残基は同じ構造を有する。

本発明は、ペプチドが無傷グリコシル連結基を介して治療部分、診断部分、標的化部分、毒素部分または同種のものに接合する、上記のものに類似した接合体も提供する。上に挙げた部分の各々は、小分子、天然高分子（例えばポリペプチド）または合成高分子であってもよい。修飾部分がシアル酸に付着される場合、修飾部分が実質的に非蛍光であることが一般に好ましい。

任意の配列を有する本質的に任意のエリスロポエチンペプチドが本発明の接合体の成分として用いられる。典型的な実施形態では、ペプチドは、配列

を有する。

別の典型的な実施形態では、ペプチドは、配列

を有する。

好ましくは、ＥＰＯペプチドのアミノ末端もカルボキシ末端も高分子修飾部分で誘導体化されない。

本発明のペプチドは、少なくとも１つのＮ−連結またはＯ−連結グリコシル化部位を含み、それは高分子修飾部分、例えばＰＥＧ部分を含むグリコシル残基でグリコシル化される。典型的な実施形態では、ＰＥＧは無傷グリコシル連結基を介してペプチドに共有結合される。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に共有結合される。あるいは、グリコシル連結基は、グリコペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に付着される。本発明は、グリコシル連結基がアミノ酸残基とグリコシル残基の双方に付着される場合の接合体も提供する。

ＰＥＧ部分は、無傷グリコシルリンカーに直接にまたは非グリコシルリンカー、例えば置換またはは非置換アルキル、置換またはは非置換ヘテロアルキルを介して付着される。

典型的な実施形態では、本発明では、化学式：

（式中、Ｊはグリコシル部分、Ｌは結合またはリンカーであり、Ｒ^１は修飾基、例えば高分子修飾基である）を有するグリコシル連結基が用いられる。典型的な結合は、グリコシル部分上のＮＨ_２部分と修飾基上の相補的反応性を有する基の間に形成されるものである。例えば、Ｒ^１がカルボン酸部分を含む場合、この部分は活性化され、かつＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^１構造を有する結合を与えるグリコシル残基上のＮＨ_２部分と結合されうる。Ｊは好ましくは「無傷」のグリコシル部分であり、ピラノースまたはフラノース構造を切断する条件、例えば過ヨウ素酸ナトリウム、例えば酸化状態への暴露によって分解されていない。

典型的なリンカーは、アルキルおよびヘテロアルキル部分を含む。リンカーは、連結基、例えばアシルに基づく連結基、例えば−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などを含む。連結基は、本発明の種の成分間、例えばグリコシル部分とリンカー（Ｌ）の間またはリンカーと修飾基（Ｒ^１）の間に形成される結合である。他の典型的な連結基は、エーテル、チオエーテルおよびアミンである。例えば、一実施形態では、リンカーは、グリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基上のアミンとの反応によって対応するアミドに変換され、かつグリシンのアミンは、修飾基の活性化カルボン酸または炭酸塩との反応によって対応するアミドまたはウレタンに変換される。

別の典型的なリンカーは、ＰＥＧ部分、例えばアミノ酸残基で官能化されるＰＥＧ部分である。ＰＥＧリンカーは、一方のＰＥＧ末端のアミノ酸残基を介してグリコシル基に接合され、かつもう一方のＰＥＧ末端を介してＲ^１に結合される。あるいは、アミノ酸残基はＲ^１に結合され、およびアミノ酸に結合されないＰＥＧ末端がグリコシル基に結合される。

ＮＨ−Ｌ−Ｒ^１の典型的な種は、化学式−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨ｝_ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨ｝_ｔＲ^１（式中、指数ｓおよびｔは独立して０または１である）を有する。指数ａ、ｂおよびｄは独立して０〜２０の整数であり、ｃは１〜２５００の整数である。他の類似のリンカーは、−ＮＨ部分が別の基、例えば−Ｓ、−Ｏまたは−ＣＨ_２で置換される場合の種に基づく。当業者が理解するように、指数ｓおよびｔに対応する１つまたは複数の括弧部分は、置換もしくは非置換アルキルまたはヘテロアルキル部分と置換可能である。

より詳細には、本発明では、ＮＨ−Ｌ−Ｒ^１がＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨ（ＣＨ_２）_ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨＲ^１、ＮＨ（ＣＨ_２）_ａＮＨＲ^１、およびＮＨＲ^１である場合の化合物が用いられる。これらの化学式では、指数ａ、ｂおよびｄは独立して０〜２０の整数、好ましくは１〜５の整数から選択される。指数ｃは１〜約２５００の整数である。

典型的な実施形態では、ｃは、ＰＥＧ部分が約１ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７５ｋＤａまたは約８０ｋＤａであるように選択される。

便宜目的で、このセクションの残りの部分でのグリコシル連結基はシアリル部分に基づくことになる。しかし、当業者は、マンノシル、ガラクトシル、グルコシル、またはフコシルなどの別のグリコシル部分であればシアリル部分の代わりに使用可能であることを理解するであろう。

典型的な実施形態では、グリコシル連結基は無傷グリコシル連結基であり、ここでグリコシル部分または連結基を形成する部分は化学的（例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウム）プロセスまたは酵素的（例えばオキシダーゼ）プロセスにより分解されない。本発明の選択された接合体は、アミノ−糖類、例えばマンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミン部分に付着される修飾基を含む。典型的な実施形態では、本発明は、

から選択される化学式を有する無傷グリコシル連結基を含むペプチド接合体を提供する。化学式Ｉでは、Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７またはＯＲ^７（式中、Ｒ^７はＨ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを示す）である。ＣＯＯＲ^７がカルボン酸またはカルボン酸塩である場合、両形態は、単一の構造ＣＯＯ⁻またはＣＯＯＨを指定することにより示される。化学式ＩおよびＩＩでは、記号Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^６’は、独立してＨ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９を示す。指数ｄは０または１である。Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、シアル酸またはポリシアル酸から独立して選択される。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つは修飾基を含む。この修飾基は、結合または連結基を介して連結される高分子修飾部分、例えばＰＥＧでありうる。典型的な実施形態では、Ｒ^６およびＲ^６’は、それらの付着対象の炭素とともにシアル酸のピルビル側鎖の成分である。さらなる典型的な実施形態では、ピルビル側鎖は高分子修飾基で官能化される。別の典型的な実施形態では、Ｒ^６およびＲ^６’はそれらの付着対象の炭素とともにシアル酸の側鎖成分であり、かつ高分子修飾基はＲ^５の成分である。

このモチーフに従う典型的な修飾基−無傷グリコシル連結基カセットは、例えば化学式

を有するシアル酸構造に基づく。

上記化学式におけるＲ^１およびＬは上記のとおりである。典型的なＲ^１基の構造に関するさらなる詳細は下記に示される。

さらに典型的な実施形態では、接合体はペプチドと修飾糖の間で形成され、ここで修飾基は修飾糖の６−炭素位置でリンカーを介して付着される。それ故、この実施形態における具体的なグリコシル連結基は、化学式：

を有し、ここで基は上で考察のとおりである。グリコシル連結基は、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチル−マンノサミンなどを含むがこれらに限定されない。

一実施形態では、本発明は、

（式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、ＧはＨおよびＲ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ^１は直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、ならびにＬはリンカー、例えば結合（「０級」）、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルである）というグリコシル連結基を含むペプチド接合体を提供する。典型的な実施形態では、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ^１−Ｌ−であり、かつＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルである場合、ＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−である。

本発明は、化学式：

を有するグリコシル連結基を含むペプチド接合体を提供する。

他の実施形態では、グリコシル連結基は、化学式：

（式中、指数ｔは０または１である）を有する。

さらに典型的な実施形態では、グリコシル連結基は化学式：

（式中、指数ｔは０または１である）
を有する。

さらに別の実施形態では、グリコシル連結基は、化学式：

（式中、指数ｐは１〜１０の整数を示し、ａは０または１である）
を有する。

典型的な実施形態では、本発明のグリコＰＥＧ化ペプチド接合体は、

の化学式から選択される。

上記化学式では、指数ｔは０〜１の整数であり、指数ｐは１〜１０の整数である。記号Ｒ^１５’は、Ｈ、ＯＨ（例えばＧａｌ−ＯＨ）、シアリル部分、シアリル連結基（すなわちシアリル連結基−高分子修飾基（Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）、または高分子修飾シアリル部分が結合しているシアリル部分（例えばＳｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａ^ｐ」））を示す。典型的な高分子修飾サッカリル部分は、化学式ＩおよびＩＩに従う構造を有する。本発明の典型的なペプチド接合体は、化学式ＩまたはＩＩに従う構造を含むＲ^１５’を有する少なくとも１つのグリカンを含むことになる。化学式ＩおよびＩＩの開放原子価を有する酸素は、好ましくはグリコシド結合を介してＧａｌまたはＧａｌＮＡｃ部分の炭素に付着される。さらなる典型的な実施形態では、酸素はガラクトース残基の位置３で炭素に付着される。典型的な実施形態では、修飾シアル酸はガラクトース残基にα２，３−として連結される。別の典型的な実施形態では、シアル酸はガラクトース残基にα２，６−として連結される。

典型的な実施形態では、シアリル連結基は、高分子修飾シアリル部分の結合対象であるシアリル部分（例えばＳｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａ^ｐ」）である。ここでグリコシル連結基は、シアリル部分を介してガラクトシル部分に連結される。

このモチーフに従う典型的な種は、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合を形成する酵素、例えばＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを用いてＳｉａ−Ｌ−Ｒ^１をグリカンの末端シアル酸に接合することにより調製される。一部の実施形態では、修飾グリカンは、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３および／またはＳｅｒ１２６から選択される１つまたは複数の位置でＥＰＯペプチドに結合される。

このモチーフに従う典型的な種は、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合を形成する酵素、例えばＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを用いてＳｉａ−Ｌ−Ｒ^１をＡｓｎ２４でグリカンの末端シアル酸に接合することにより調製される。

別の典型的な実施形態では、ペプチド接合体上のグリカンは、基

から選択される化学式およびその組み合わせを有する。

この基のグリカンは一般に昆虫細胞（例えばＳｆ−９）によって生成されるＥＰＯペプチド上に見出されるものに対応し、次いで本明細書に示される方法に従ってグリカンの再構築およびグリコＰＥＧ化が行われる。例えば、トリ−マンノシルコアを用いて発現される昆虫由来のＥＰＯが、ＧｌｃＮＡｃドナーおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼならびにＧａｌドナーおよびＧａｌトランスフェラーゼと接触される。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌのトリ−マンノシルコアへの付加が２つのステップまたは単一のステップで行われる。本明細書で考察のように、修飾シアル酸がグリコシル部分の少なくとも１つの分岐に付加される。修飾シアル酸で官能化されないＧａｌ部分は、場合によりシアリルトランスフェラーゼの存在下でのシアル酸ドナーとの反応により「キャッピングされる（ｃａｐｐｅｄ）」。シアリルでキャッピングされたガラクトース残基、およびシアリルでキャッピングされたガラクトース残基とキャッピングされていないガラクトース残基の混合物を含むグリカンの典型的な構造については図２Ａ、図２Ｂおよび図３を参照のこと。

上記の各化学式では、Ｒ^１５’は上で考察のとおりである。さらに、本発明の典型的なペプチド接合体は、化学式ＩまたはＩＩに従う構造を有するＲ^１５部分を有する少なくとも１つのグリカンを含むことになる。

典型的な実施形態では、ペプチドの集団内の少なくとも６０％の末端Ｇａｌ部分がシアル酸でキャッピングされ、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％およびさらに好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％がシアル酸でキャッピングされる。

別の典型的な実施形態では、グリコシル連結基は、化学式

（式中、Ｒ^１５は前記シアリル連結基であり、指数ｐは１〜１０から選択される整数である）を有する少なくとも１つのグリコシル連結基を含む。

典型的な実施形態では、グリコシル連結部分は、化学式：

（式中、ｂは０〜１の整数である。指数ｓは１〜１０の整数を示し、指数ｆは１〜２５００の整数を示す）を有する。

特定の実施形態では、ＥＰＯペプチドは、かかる３つの部分を含み、１つはＡｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３の各々にて付着される。別の実施形態では、ペプチドはこれらＡｓｎ部分のうちの２つの組み合わせた場所で付着されるかかる２つの部分を含む。これら２つの種（すなわちＰＥＧ_３およびＰＥＧ_２）の混合物である組成物も提供される。混合物は、好ましくは、３つの修飾グリコシル残基を含む種の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは９０％およびさらに好ましくは９５％、９６％、９７％または９８％を含む。非修飾末端Ｇａｌ残基は、上で考察のように、場合によりＳｉａでキャッピングされる。典型的な実施形態では、ペプチドは、昆虫細胞内で発現され、再構築され、かつグリコＰＥＧ化される（図５）。

典型的な実施形態では、高分子修飾基はＰＥＧである。別の典型的な実施形態では、ＰＥＧ部分は約２０ｋＤａ分子量を有する。別の典型的な実施形態では、ＰＥＧ部分は約５ｋＤａの分子量を有する。別の典型的な実施形態では、ＰＥＧ部分は約１０ｋＤａの分子量を有する。別の典型的な実施形態では、ＰＥＧ部分は約４０ｋＤａの分子量を有する。

典型的な実施形態では、グリコシル連結基は線状１０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、かつ１つまたは２つのこれらのグリコシル連結基はペプチドに共有結合される。典型的な実施形態では、グリコシル連結基は線状２０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、かつ１つまたは２つのこれらのグリコシル連結基はペプチドに共有結合される。典型的な実施形態では、グリコシル連結基は線状５ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、かつ１つ、２つまたは３つのこれらのグリコシル連結基はペプチドに共有結合される。典型的な実施形態では、グリコシル連結基は線状４０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、かつ１つまたは２つのこれらのグリコシル連結基はペプチドに共有結合される。

修飾基
本発明のペプチド接合体は修飾基を含む。この基は、アミノ酸またはグリコシル連結基を介してＦＧＦペプチドに共有結合されうる。「修飾基」は、標的化部分、治療部分、生体分子を含む種々の構造を包含しうる。さらに「修飾基」は高分子修飾基を含み、それは身体内でのそのバイオアベイラビリティまたはその半減期など、ペプチドの特性を変更しうる高分子である。

典型的な実施形態では、修飾基は、接合体の成分としての標的化剤の存在に起因する、特定の組織内で選択的に局在化する標的化剤である。典型的な実施形態では、標的化剤はタンパク質である。典型的なタンパク質は、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ−糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体特異的な抗原を有する組織、血液プール）、凝固第Ｖ−ＸＩＩ因子（損傷組織、凝血塊、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えばα−酸糖タンパク質、フェツイン（ｆｅｔｕｉｎ）、α−胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２−糖タンパク質（肝臓、アテローム硬化症プラーク、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＥＰＯ（免疫刺激、癌、血液プール、赤血球の過剰生成、神経防護）、アルブミン（半減期の増加）、およびリポタンパクＥを含む。

便宜目的で、このセクションの残りの部分での修飾基は、主に水溶性および水不溶性高分子などの高分子修飾基に基づくことになる。しかし、当業者は標的化部分、治療部分および生体分子などの他の修飾基があれば高分子修飾基の代わりに用いられうることを理解するであろう。

修飾基のリンカー
修飾基のリンカーは、修飾基（すなわち高分子修飾基、標的化部分、治療部分および生体分子）をペプチドに付着させるという役割を果たす。典型的な実施形態では、高分子修飾基は、一般に、下記に示されるリンカーＬを介し、コア上のヘテロ原子、例えば窒素を介してグリコシル連結基に結合される。

Ｒ^１は高分子部分であり、Ｌは結合および連結基から選択される。指数ｗは１〜６、好ましくは１〜３およびより好ましくは１〜２から選択される整数を示す。典型的な連結基は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸を含む。リンカーの典型的な成分はアシル部分である。

本発明に従う典型的な化合物は、上記の化学式ＩまたはＩＩに従う構造を有する（式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つは化学式

を有する）。

この実施形態に従う別の例では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つは化学式

（式中、ｓは０〜２０の整数であり、Ｒ^１は線状高分子修飾部分である）
を有する。

典型的な実施形態では、高分子修飾基−リンカー作成物は、中央部分に付着される２つ以上の高分子鎖を含む分岐構造である。この実施形態では、作成物は、化学式

（式中、Ｒ^１およびＬは上で考察のとおりであり、ｗ’は２〜６の整数、好ましくは２〜４の整数およびより好ましくは２〜３の整数である）
を有する。

Ｌが結合である場合、それはＲ^１の前駆体上の反応性官能基とサッカリルコア上の相補的反応性を有する反応性官能基の間に形成される。Ｌが０級以外のリンカーである場合、Ｌの前駆体は、Ｒ^１前駆体との反応に先立ちグリコシル部分上に配置されうる。あるいは、Ｒ^１およびＬの前駆体は、グリコシル部分に結果的に付着される予備形成されたカセットに取り込まれうる。本明細書に示されるように、適切な反応性官能基を有する前駆体の選択および調製は、当業者の能力の範囲内で行われる。さらに、前駆体の共役は当該技術分野で十分に理解されている化学反応によって進行する。

典型的な実施形態では、Ｌは、高分子修飾基が置換アルキルリンカーを介して付着される場合の修飾糖をもたらすアミノ酸または小ペプチド（例えば１〜４個のアミノ酸残基）から形成される連結基である。典型的なリンカーは、グリシン、リジン、セリンおよびシステインを含む。ＰＥＧ部分は、アミドまたはウレタン結合を介してリンカーのアミン部分に付着されうる。ＰＥＧは、システインおよびセリンの硫黄または酸素原子にそれぞれチオエーテルまたはエーテル結合を介して連結される。

典型的な実施形態では、Ｒ^５は高分子修飾基を含む。別の典型的な実施形態では、Ｒ^５は、高分子修飾基と修飾基を分子の残部に連結させるリンカーＬとの双方を含む。上で考察のように、Ｌは線状または分岐構造でありうる。同様に、高分子修飾基は分岐状または線状でありうる。

水溶性高分子
多数の水溶性高分子は当業者に既知であり、かつ本発明の実施において有用である。水溶性高分子という用語は、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えばポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成高分子（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えばポリ（エチレングリコール））；ペプチド、タンパク質などの種を包含する。本発明は、高分子が接合体の残部が付着されうる点を含まなければならないという唯一の制限を有する任意の水溶性高分子を用いて実施されうる。

高分子を活性化するための方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、およびさらには国際公開第９３／１５１８９号パンフレットにおいても見られ、かつ活性化高分子とペプチドとの接合における方法は、例えば凝固第ＶＩＩＩ因子（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロンビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ヴェロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１〜４５頁（１９８５年））において見出されうる。

典型的な水溶性高分子は、高分子の試料中のかなりの割合の高分子がほぼ同じ分子量であり、かかる高分子は「ホモ分散性（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）」である。

本発明は、ポリ（エチレングリコール）接合体の参照によりさらに例示される。ＰＥＧの官能化および接合に関するいくつかのレビューおよびモノグラフが有効である。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３頁（１９８５年）；スコウテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０〜６５頁（１９８７年）；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４頁（１９９２年）；デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ」 ９：２４９〜３０４頁（１９９２年）；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５頁（１９９５年）；およびバードラ（Ｂｈａｄｒａ）ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５７：５〜２９頁（２００２年）を参照のこと。反応性ＰＥＧ分子を調製しかつ反応性分子を用いて接合体を形成するための手段は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号明細書は、線状または分岐状ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択される高分子酸の活性エステルの水溶性でかつ分離可能な接合体を開示している。

米国特許第６，３７６，６０４号明細書は、高分子の末端ヒドロキシルを有機溶媒中のジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネートと反応させることにより水溶性および非ペプチド性高分子の水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルを調製するための方法を示している。活性エステルを用いることで、タンパク質またはペプチドなどの生物活性物質との接合体が形成される。

国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、生物活性物質と安定な結合を介して高分子骨格に連結される少なくとも１つの末端を有する高分子骨格を含む活性化水溶性高分子とを含む接合体について記載しており、ここで少なくとも１つの末端は分岐部分に連結される近接反応基（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ）を有する分岐部分を含み、ここで生物活性物質は少なくとも１つの近接反応基に連結される。他の分岐ポリ（エチレングリコール）が国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号明細書は反応性官能基を含む分岐末端を含む分岐ＰＥＧ分子と形成される接合体について記載している。遊離反応基はタンパク質またはペプチドなどの生物活性種と反応可能であり、これによりポリ（エチレングリコール）と生物活性種の間で接合体が形成される。米国特許第５，４４６，０９０号明細書は、二官能性ＰＥＧリンカーおよびＰＥＧリンカーの各末端でペプチドを有する接合体の形成におけるその使用について記載している。

分解可能なＰＥＧ結合を含む接合体は、国際公開第９９／３４８３３号パンフレット、国際公開第９９／１４２５９号パンフレット、および米国特許第６，３４８，５５８号明細書にて記載されている。かかる分解可能な結合は本発明にて適用可能である。

上記の高分子活性化に関する当該技術分野で認められた方法は、本明細書に示される分枝高分子の形成における本発明と関連して、さらにこれらの分枝高分子の他の種、例えば糖類、糖ヌクレオチドなどに対する接合において用いられる。

典型的な水溶性高分子は、ポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明で用いられるポリ（エチレングリコール）は、任意の特定の形態または分子量範囲に限定されない。非分岐ポリ（エチレングリコール）分子においては、分子量は好ましくは５００〜１００，０００である。好ましくは２０００〜６０，０００および好ましくは約５，０００〜約４０，０００の分子量が用いられる。

他の典型的な実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、以下

から選択される。

別の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上の付着されるＰＥＧ部分を有する分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧの例が、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，３４２，９４０号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，９１９，４５５号明細書；米国特許第６，１１３，９０６号明細書；米国特許第５，１８３，６６０号明細書；国際公開第０２／０９７６６号パンフレット；コデラ Ｙ．（Ｋｏｄｅｒａ Ｙ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５：２８３〜２８８頁（１９９４年）；およびヤマサキ（Ｙａｍａｓａｋｉ）ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２：２１２５〜２１２７頁、１９９８年にて記載されている。好ましい実施形態では、分岐ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は４０，０００ダルトン以下である。

代表的な高分子修飾部分は、側鎖を含有するアミノ酸、例えばセリン、システイン、リジン、および小ペプチド、例えばｌｙｓ−ｌｙｓに基づく構造を含む。典型的な構造は、

を含む。当業者は、ジ−リジン構造内の遊離アミンもまたＰＥＧ部分を有するアミドまたはウレタン結合を介してＰＥＧ化可能であることを理解するであろう。

さらに別の実施形態では、高分子修飾部分は、トリ−リジンペプチドに基づく分岐ＰＥＧ部分である。トリ−リジンは、モノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−ＰＥＧ化可能である。この実施形態に従う典型的な種は、化学式

（式中、指数ｅ、ｆおよびｆ’は１〜２５００の整数から独立して選択され、指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は１〜２０の整数から独立して選択される）
を有する。

当業者には明らかになるように、本発明で有用な分枝高分子は、上記趣旨に関する変異体を含む。例えば、上に示されるジ−リジン−ＰＥＧ接合体は３種の高分子サブユニットを含む可能性があり、ここで３つ目は上記構造における非修飾として示されるα−アミンに結合する。同様に、所望の様式で高分子修飾部分で標識された３種または４種の高分子サブユニットで官能化されたトリ−リジンの使用は本発明の範囲内にある。

高分子修飾部分は、グリコシルコアとの反応において活性化されうる。活性化種（例えばカーボネートおよび活性エステル）の典型的な構造は、

を含む。

本明細書に示される化合物の調製において用いられる線状および分岐状ＰＥＧの活性化に適する他の活性化基または離脱基は、

の種を含むがこれらに限定されない。これらや他の種で活性化されるＰＥＧ分子および活性化ＰＥＧを作製する方法については、国際公開第０４／０８３２５９号パンフレットにて示される。

当業者は、上に示される分枝高分子における１つまたは複数のｍ−ＰＥＧアームが異なる末端、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１０−アルキルなどを有するＰＥＧ部分で置換されうることを理解するであろう。さらに、上記構造は、アルキルリンカーをα−炭素原子とアミノ酸側鎖の官能基の間に挿入する（または炭素原子を除去する）ことにより容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体およびより高級な相同体、ならびにより低級の相同体は、本発明で有用な分岐ＰＥＧにおけるコアの範囲内にある。

本明細書に示される分岐ＰＥＧ種は、

（式中、Ｘ^ｄはＯまたはＳ、ｒは１〜５の整数である。指数ｅおよびｆは１〜２５００の整数から独立して選択される）
のスキームに示されるなどの方法により容易に調製される。典型的な実施形態では、これらの指数の一方または双方は、高分子の分子量が約１０ｋＤ、１５ｋＤまたは２０ｋＤであるように選択される。

したがって、このスキームに従い、天然または非天然アミノ酸を活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合にはトシレートと接触させることで、側鎖ヘテロ原子Ｘ^ｄのアルキル化により１が形成される。モノ−官能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸は、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体を有するＮ−アシル化状態に提示されることにより、分岐ｍ−ＰＥＧ２を構築する。当業者は、トシレート離脱基が任意の適切な離脱基、例えばハロゲン、メシレート、トリフレートなどと置換されうることを理解するであろう。同様に、アミンをアシル化するのに用いられる反応性カーボネートは活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシサクシニミドなどと置換されうるか、または酸はジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの脱水剤を用い、ｉｎ ｓｉｔｕで活性化されうる。

他の典型的な実施形態では、尿素部分はアミドなどの基と置換される。

本明細書で考察のように、本発明の接合体で有用なＰＥＧは線状または分岐状でありうる。本発明のこの実施形態に従うペプチド接合体を含有する分岐ＰＥＧを形成するのに用いられる典型的な前駆体は、化学式

を有する。本発明のこの実施形態に従うペプチド接合体を含有する分岐ＰＥＧを形成するのに用いられる別の典型的な前駆体は、化学式

（式中、指数ｍおよびｎは０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１はＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである）
を有する。

この化学式に従う分枝高分子種は、本質的に純粋な水溶性高分子である。Ｘ^３’はイオン性反応性官能基（例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ_２ＰＯ_４、ＨＳＯ_３、ＮＨ_２、およびこれらの塩など）または例えば、以下の他の反応性官能基を含む部分である。Ｃは炭素である。Ｘ^５、Ｒ^１６およびＲ^１７は、非反応基（例えばＨ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）および高分子アーム（例えばＰＥＧ）から独立して選択される。Ｘ^２およびＸ^４は、好ましくは生理的条件下で本質的に非反応性である結合断片であり、それらは同じかまたは異なる場合がある。典型的なリンカーは、芳香族性部分もエステル部分も含まない。あるいは、これらの結合は、例えばエステル、ジスルフィドなど、生理的に関連がある条件下で分解するように設計される１つまたは複数の部分を含みうる。Ｘ^２およびＸ^４は、高分子アームＲ^１６およびＲ^１７をＣに連結させる。Ｘ^３’がリンカー、糖またはリンカー−糖カセット上で相補的反応性を有する反応性官能基と反応する場合、Ｘ^３’は結合断片Ｘ^３の成分に変換される。

Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４において典型的な結合断片は独立して選択され、かつＳ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２Ｓ、ＣＨ_２Ｏ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ、（ＣＨ_２）_ｏＯ、（ＣＨ_２）_ｏＳまたは（ＣＨ_２）_ｏＹ’−ＰＥＧ（式中、Ｙ’はＳ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは１〜５０の整数である）を含む。典型的な実施形態では、結合断片Ｘ^２およびＸ^４は異なる結合断片である。

典型的な実施形態では、前駆体（化学式ＩＩＩ）またはその活性化誘導体は、Ｘ^３’と糖部分上で相補的反応性を有する基、例えばアミンの間での反応を介して糖、活性化糖または糖ヌクレオチドと反応することによりそれらに結合する。あるいは、Ｘ^３’はリンカーＬに対する前駆体上の反応性官能基と反応する。化学式ＩおよびＩＩのＲ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の１つまたは複数は、分枝高分子の修飾部分、またはＬを介して結合されるこの部分を含みうる。

典型的な実施形態では、部分

はリンカーアームＬである。この実施形態では、典型的なリンカーは、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸類似体またはアミノ酸模倣体、あるいは１つまたは複数のかかる種から形成される小ペプチドから誘導される。例えば、本発明の化合物中に見出される特定の分枝高分子は、化学式

を有する。

Ｘ^ａは、分枝高分子の修飾部分の前駆体上の反応性官能基、例えばＸ^３’および糖部分、またはリンカーに対する前駆体上の反応性官能基の反応により形成される結合断片である。例えばＸ^３’がカルボン酸である場合、それは活性化されかつアミノ−糖類（例えば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ_２、ＧｌｃＮＨ_２、ＭａｎＮＨ_２など）からのペンダント状のアミン基に直接結合される可能性があり、それによりアミドであるＸ^ａが形成される。さらなる典型的な反応性官能基および活性化された前駆体が下記に記載される。指数ｃは１〜１０の整数を示す。他の記号は、上で考察された記号と同じ同一性を有する。

別の典型的な実施形態では、Ｘ^ａは別のリンカー

（式中、Ｘ^ｂは第２の結合断片であり、Ｘ^ａとして示される基から独立して選択され、かつＬ^１はＬと同様、結合、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルである）
で形成される連結部分である。

Ｘ^ａおよびＸ^ｂにおける典型的な種は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨを含む。

別の典型的な実施形態では、Ｘ^４はＲ^１７に対するペプチド結合であり、それはアミノ酸、ジ−ペプチド（例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ）またはトリ−ペプチド（例えばＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）であり、α−アミン部分および／または側鎖ヘテロ原子は高分子修飾部分で修飾される。

さらに典型的な実施形態では、本発明のペプチド接合体は、例えば、

（式中、様々な記号で示される基の同一性は上で考察された記号と同じである。Ｌ^ａはＬおよびＬ^１について上で考察された結合またはリンカー、例えば置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキル部分である）から選択される化学式を有するＲ^１５部分である部分を含む。典型的な実施形態では、Ｌ^ａは、示されるように高分子修飾部分で官能化されるシアル酸の側鎖の部分である。典型的なＬ^ａ部分は、１つまたは複数のＯＨまたはＮＨ_２を含む置換またはは非置換アルキル鎖を含む。

さらに別の典型的な実施形態では、本発明は、例えば、化学式

を有するＲ^１５部分である部分を有するペプチド接合体を提供する。様々な記号で示される基の同一性は上で考察された記号と同じである。当業者が理解するように、化学式ＶＩＩおよびＶＩＩＩにおけるリンカーアームは、本明細書に示される他の修飾糖類に等しく適用可能である。典型的な実施形態では、化学式ＶＩＩおよびＶＩＩＩの種は、本明細書に示されるグリカン構造に付着されるＲ^１５部分である。

さらに別の典型的な実施形態では、ＥＰＯペプチド接合体は、

（式中、基の同一性は上で考察のとおりである）から選択されるメンバーである化学式を有するＲ^１５部分を含む。Ｌ^ａにおける典型的な種は、−（ＣＨ_２）_ｊＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｈＣ（Ｏ）ＮＨ−（式中、指数ｈおよびｊは０〜１０の整数から独立して選択される）である。さらなる典型的な種は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。指数ｍおよびｎは０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。

典型的な実施形態では、グリコシル連結基は、以下の化学式：

に従う構造を有する。

上記の本発明の実施形態は、高分子が水溶性高分子、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、例えばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）である場合の種を参照することによりさらに例示される。当業者は、以下のセクションでは例示を明確にすることに重点が置かれ、かつ典型的な高分子としてＰＥＧを用いて示される様々なモチーフがＰＥＧ以外の高分子が用いられる場合の種に等しく適用可能であることを理解することになる。

任意の分子量、例えば１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、または８０ｋＤａのＰＥＧが本発明で有用である。

典型的な実施形態では、Ｒ^１５部分は基

から選択されるメンバーである化学式を有する。上記の各構造では、リンカー断片−ＮＨ（ＣＨ_２）_ａ−は存在しても存在しなくてもよい。

他の典型的な実施形態では、ペプチド接合体は基

から選択されるＲ^１５部分を含む。

上記の各化学式では、指数ｅおよびｆは１〜２５００の整数から独立して選択される。さらなる典型的な実施形態では、ｅおよびｆを選択することで、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、または８０ｋＤａのＰＥＧ部分が提供される。記号Ｑは、置換もしくは非置換アルキル（例えばＣ_１〜Ｃ_６アルキル、例えばメチル）、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはＨを示す。

他の分枝高分子は、ジ−リジン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、例えば

およびトリ−リジンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、例えば

に基づく構造を有する。上記の各図面では、指数ｅ、ｆ、ｆ’およびｆ’’は１〜２５００から独立して選択される整数を示す。指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は１〜２０から独立して選択される整数を示す。

別の典型的な実施形態では、修飾基

は、

（式中、ＱはＨおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅおよびｆは１〜２５００から独立して選択される整数であり、指数ｑは０〜２０から選択される整数である）
から選択されるメンバーである化学式を有する。

別の典型的な実施形態では、修飾基

は、

（式中、ＱはＨおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆおよびｆ’は１〜２５００から独立して選択される整数であり、ｑおよびｑ’は１〜２０から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである化学式を有する。

別の典型的な実施形態では、分枝高分子は、以下の化学式

（式中、指数ｍおよびｎは０〜５０００から独立して選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである）
に従う構造を有する。

化学式ＩＩＩａは化学式ＩＩＩのサブセットである。化学式ＩＩＩａで記載される構造はまた、化学式ＩＩＩにより包含される。

上記化学式に従う別の典型的な実施形態では、分枝高分子は、以下の化学式

に従う構造を有する。典型的な実施形態では、Ａ^１およびＡ^２は各々−ＯＣＨ_３またはＨである。

具体的な実施形態では、修飾糖はシアル酸であり、本発明で有用な選択された修飾糖化合物は、化学式

指数ａ、ｂおよびｄは０〜２０の整数である。指数ｃは１〜２５００の整数である。上記の構造はＲ^１５の成分でありうる。
を有する。

別の具体的な実施形態では、糖の１級ヒドロキシル部分は修飾基で官能化される。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルを対応するアミンに変換しかつ官能化することで、本発明に従う化合物がもたらされうる。この実施形態に従う化学式は、

を含む。上記構造はＲ^１５の成分でありうる。

さらなる典型的な実施形態では、本発明は、修飾糖類を提供し、ここでは６−ヒドロキシル位置が、例えば上記のリンカー−修飾基カセットを担持する対応するアミン部分に変換される。これらの修飾糖類のコアとして使用可能な典型的なサッカリル基は、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどを含む。この実施形態に従う代表的な修飾糖は、化学式

（式中、Ｒ^３〜Ｒ^５およびＲ^７はＨ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_３から独立して選択されるメンバーである。Ｒ^６はＯＲ^１、ＮＨＲ^１またはＬ−Ｒ^１であり、上記のとおりである）
を有する。

本発明は、当業者が理解するように、ＰＥＧの参照により前セクションで例示されるが、多数の高分子修飾部分が本明細書で示される化合物および方法にて用いられる。

選択された実施形態では、Ｒ^１またはＬ−Ｒ^１は分岐ＰＥＧ、例えば上記の種のうちの１種である。典型的な実施形態では、分岐ＰＥＧ構造はシステインペプチドに基づく。この実施形態に従う具体的な修飾糖類は、

（式中、Ｘ^４は結合またはＯである）を含む。上記の各構造では、アルキルアミンリンカー−（ＣＨ_２）_ａＮＨ−は存在しても存在しなくてもよい。上記の構造は、Ｒ^１５／Ｒ^１５’の成分であってもよい。

本明細書で考察のように、本発明で有用な高分子−修飾シアル酸はまた線状構造でありうる。したがって、本発明は、

（式中、指数ｑおよびｅは上で考察のとおりである）などの構造から誘導されるシアル酸部分を含む接合体を提供する。

典型的な修飾糖類は、水溶性または水不溶性高分子で修飾される。有用な高分子の例が下記にさらに例示される。

別の典型的な実施形態では、ペプチドは、昆虫細胞から誘導され、マンノースコアにＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌを添加することにより再構築され、線状ＰＥＧ部分を担持するシアル酸を用いてグリコＰＥＧされて、それにより化学式：

（式中、指数ｔは０〜１の整数であり、指数ｓは１〜１０の整数を示し、かつ指数ｆは１〜２５００の整数を示す）
を有する少なくとも１つの部分を含むＥＰＯペプチドが得られる。

水不溶性高分子
別の実施形態では、修飾糖類は、上で考察されたものと同様、水溶性高分子ではなく水不溶性高分子を含む。本発明の接合体はまた、１種または複数種の水不溶性高分子を含みうる。本発明のこの実施形態は、接合体を賦形剤として使用することで例示され、その場合、治療用ペプチドが制御される様式で送達される。高分子薬剤送達系については当該技術分野で既知である。例えば、ダン（Ｄｕｎｎ）ら編「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ 第４６９巻、アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、１９９１年を参照のこと。当業者は、実質的に任意の既知の薬剤送達系が本発明の接合体に適用可能であることを理解するであろう。

Ｒ^１、Ｌ−Ｒ^１、Ｒ^１５、Ｒ^１５’および他の基における上記モチーフは、水不溶性高分子に等しく適用可能であり、当業者にとって極めて身近な化学反応を最大限に用いることで線状および分岐状構造に取り込まれうる。

代表的な水不溶性高分子は、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニール、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールならびにこれらの共重合体を含むがこれらに限定されない。

本発明の接合体にて用いられる合成的に修飾された天然高分子は、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースを含むがこれらに限定されない。合成的に修飾された天然高分子の広範なクラスの特に好ましいメンバーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、ならびにアクリルおよびメタクリルエステルおよびアルギン酸の高分子を含むがこれらに限定されない。

本明細書で考察されるこれらや他の高分子は、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｅｃａｌ Ｃｏ．）（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）、ポリサイエンシーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ワレントン（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ）、ペンシルバニア州）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ワイオミング州）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（ロンコンコマ（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ）、ニューヨーク州）、およびバイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）などの商用ソースから容易に入手可能であり、それ以外でも標準技術を用いてこれらの供給元から入手された単量体から合成可能である。

本発明の接合体において用いられる代表的な生分解性高分子は、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびその共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアンヒドリド、ポリオルソエステル、これらの混合物および共重合体を含むがこれらに限定されない。例えばコラーゲン、プルロニックなどを含むゲルを形成する組成物が特に有用である。

本発明で有用な高分子は、少なくとも一部のそれらの構造内に生体再吸収性分子を有する水不溶性物質を含む「ハイブリッド」高分子を含む。かかる高分子の例として、水不溶性共重合体を含むものが挙げられ、高分子鎖ごとにそれは生体再吸収性領域、親水性領域および複数の架橋可能な官能基を有する。

本発明の目的のため、「水不溶性物質」は、実質的に水または水を含有する環境に不溶性の物質を含む。したがって、共重合体の特定の領域またはセグメントが親水性を示すかまたはさらに水溶性を示しうるが、総じて高分子は、任意の実質的測定によると水に溶解しない。

本発明の目的のため、「生体再吸収性分子」という用語は、身体により、代謝または分解可能であるとともに再吸収されかつ／または通常の排泄経路を介して除去されうる領域を含む。かかる代謝産物または分解産物は、好ましくは身体に対して実質的に非毒性である。

生体再吸収性領域は、総じて共重合体組成物に水溶性が与えられない限り、疎水性または親水性を示しうる。それ故、生体再吸収性領域は、高分子が総じて水不溶性を残すという優先度に基づいて選択される。したがって、相対的特性、すなわち含有される官能基の種類および生体再吸収性領域と親水性領域の相対比率が、有用な生体再吸収性組成物が確実に水不溶性であり続けるように選択される。

典型的な再吸収可能な高分子は、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に生成される再吸収可能なブロック共重合体を含む（コーン（Ｃｏｈｎ）ら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書を参照）。これらの共重合体は架橋されることがなく、水溶性を示すので身体が分解されたブロック共重合体組成物を排泄しうる。ユネス（Ｙｏｕｎｅｓ）ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１〜１３１６頁（１９８７年）；およびコーン（Ｃｏｈｎ）ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３−１００９年（１９８８年）を参照のこと。

ここで好ましい生体再吸収性高分子は、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、多糖類およびこれらの混合物から選択される１つまたは複数の成分を含む。さらにより好ましくは、生体再吸収可能な高分子は、ポリ（ヒドロキシ）酸成分を含む。ポリ（ヒドロキシ）酸のうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸ならびにこれらの共重合体および混合物が好ましい。

インビボで吸収される（「生体再吸収される」）断片の形成に加え、本発明の方法で有用な好ましい高分子コーティングは、排泄可能な断片および／または代謝可能な断片も形成しうる。

より高級な共重合体も本発明において使用されうる。例えば、カセイ（Ｃａｓｅｙ）ら、米国特許第４，４３８，２５３号明細書（１９８４年３月２０日に交付）は、ポリ（グリコール酸）とヒドロキシル末端が付加したポリ（アルキレングリコール）のエステル交換から生成される三ブロック共重合体について開示している。かかる組成物は、再吸収可能なモノフィラメント糸としての使用において開示される。かかる組成物の可撓性は、テトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートなどの芳香族オルトカーボネートの共重合体構造への取り込みにより制御される。

乳酸および／またはグリコール酸に基づく他の高分子もまた利用可能である。例えば、スピニュ（Ｓｐｉｎｕ）、米国特許第５，２０２，４１３号明細書（１９９３年４月１３日に交付）は、ラクチドおよび／またはグリコリドのオリゴマージオール上またはジアミン残基上への開環重合、それに続くジイソシアネート、塩化ジアシルまたはジクロロシランなどの二官能性化合物での鎖伸長によって生成される規則正しく連続したブロック状のポリラクチドおよび／またはポリグリコリドを有する生分解性多重ブロック共重合体について開示している。

本発明に有用なコーティングの生体再吸収性領域を、加水分解的かつ／または酵素的に切断可能であるように設計可能である。本発明の目的のため、「加水分解的に切断可能な」とは、共重合体、特に生体再吸収性領域における水中または水を含有する環境内での加水分解に対する感受性を示す。同様に、本明細書で用いられる「酵素的に切断可能な」とは、共重合体、特に生体再吸収性領域における内因性または外因性酵素による切断に対する感受性を示す。

親水性領域は、身体内部に置かれる場合、排泄可能および／または代謝可能な断片になるまで処理可能である。したがって、親水性領域は、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、多糖類、炭水化物、ペプチド、タンパク質ならびにこれらの共重合体および混合物を含みうる。さらに、親水性領域はまた、例えばポリ（アルキレン）オキシドでありうる。かかるポリ（アルキレン）オキシドは、例えばポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドならびにこれらの混合物および共重合体を含みうる。

ヒドロゲルの成分である高分子もまた本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収可能な高分子物質である。ヒドロゲル形成化合物の例として、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギーナンおよび他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにこれらの誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。安定な生分解性および生体再吸収性を示すヒドロゲルの生成が可能である。さらに、ヒドロゲル組成物は、これらの特性のうちの１つまたは複数を示すサブユニットを含みうる。

完全性が架橋により制御可能な生体適合性ヒドロゲル組成物が知られており、ここでは本発明の方法における使用において好ましい。例えばハベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）ら、米国特許第５，４１０，０１６号明細書（１９９５年４月２５日に交付）および米国特許第５，５２９，９１４号明細書（１９９６年６月２５日に交付）は、２つの加水分解的に不安定な延在部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）の間でサンドイッチされた水溶性の中央ブロックセグメントを有する架橋ブロック共重合体の水溶系について開示している。かかる共重合体は、光重合可能なアクリレートの機能性により、さらにエンドキャッピングされる。これらの系は、架橋される場合、ヒドロゲルになる。かかる共重合体の水溶性の中央ブロックがポリ（エチレングリコール）を含みうる一方、加水分解的に不安定な延在部はポリグリコール酸またはポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）でありうる。ソーニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２６：５８１〜５８７頁（１９９３年）を参照のこと。

別の好ましい実施形態では、ゲルは熱可逆性ゲルである。ここでは、プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびこれらの組み合わせなどの成分を含有する熱可逆性ゲルが好ましい。

さらに別の典型的な実施形態では、本発明の接合体はリポソームの成分を含有する。リポソームは、例えばエプスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載される、当業者に既知の方法に従って調製可能である。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を無機溶媒に溶解し、次いでそれを蒸発させて容器の表面上に乾燥脂質の薄膜を残存させることにより調製可能である。次いで、活性化合物の水溶液またはその医薬的に許容できる塩が容器に導入される。次いで、容器を手動で回転させ、脂質物質を容器の側面から遊離させ、かつ脂質凝集体を分散させることにより、リポソーム懸濁液が形成される。

上記の微粒子および微粒子を調製する方法は一例として提供されるものであり、それらは本発明で有用な微粒子の範囲を規定しようとするものではない。異なる方法により作製された多数の微粒子が本発明で有用であることは、当業者にとって明らかなことになろう。水溶性高分子と関連して上で考察された構造形式である直鎖および分岐鎖は、一般に水不溶性高分子に対しても同様に適用可能である。したがって、例えばシステイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分岐コアは、２つの水不溶性高分子部分で官能化されうる。これらの種を生成するのに用いられる方法は、一般に水溶性高分子の生成に用いられる方法に酷似している。

方法
上で考察された接合体に加え、本発明はこれらや他の接合体を調製するための方法を提供する。さらに、本発明は、疾患を発症するリスクがある被験者または疾患を有する被験者に本発明の接合体を投与することによって病状を予防、治療または改善する方法を提供する。

典型的な実施形態では、接合体は、高分子修飾部分、治療部分、標的化部分または生体分子とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの間に形成される。高分子は、グリコシル連結基を介してペプチドに接合され、同連結基はペプチド（またはグリコシル残基）と修飾基（例えば水溶性高分子）の双方の間に挿入され、かつそれらに共有結合される。本方法は、ペプチドを、修飾糖および修飾糖を基質に接合させる酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼを含有する混合物に接触させるステップを含む。反応は、修飾糖とペプチドの間の共有結合の形成に適する条件下で行われる。修飾糖の糖部分は、好ましくはヌクレオチド糖から選択される。

典型的な実施形態では、例えば上に示される修飾糖は、対応するヌクレオチド糖として活性化される。本発明で修飾形態で用いられる典型的な糖ヌクレオチドは、ヌクレオチド一リン酸塩、ヌクレオチド二リン酸塩もしくはヌクレオチド三リン酸塩またはそれらの類似体を含む。好ましい実施形態では、修飾糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、修飾糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。典型的な実施形態では、リン酸ヌクレオチドはＣ−１に付着される。

したがって、グリコシル部分がシアル酸であるという具体的な実施形態では、本発明の方法は、化学式

（式中、Ｌ−Ｒ^１は上で考察のとおりであり、Ｌ^１−Ｒ^１は修飾基に結合されるリンカーを示す）を有する化合物を用いる。Ｌと同様、Ｌ^１に従う典型的なリンカー種は、結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分を含む。

さらに、上で考察のように、本発明は、直鎖状または分岐鎖状の水溶性高分子で修飾されるヌクレオチド糖の使用について提起する。例えば、下記に示される化学式を有する化合物は、本発明の範囲内で接合体を調製するのに有用である。

（式中、Ｘ^４はＯまたは結合である）

本発明はまた、６−炭素位置でのＬ−Ｒ^１で修飾される糖ヌクレオチドの使用について提示する。この実施形態に従う典型的な種は、

（式中、Ｒ基、およびＬは上で考察された部分を示す。指数「ｙ」は０、１または２である）を含む。典型的な実施形態では、ＬはＮＨとＲ^１の間の結合である。塩基は核酸塩基である。

６−位置での炭素が修飾される場合の本発明で有用な典型的なヌクレオチド糖は、ＧＤＰマンノース、例えば

（式中、Ｘ^５は結合またはＯである。指数ｉは０または１を示す。指数ａは１〜２０の整数を示す。指数ｅおよびｆは独立して１〜２５００の整数を示す。上で考察されたように、Ｑは、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである）の立体化学構造を有する種を含む。当業者が理解するように、ＳがＯと置換されたセリン誘導体はまた、この一般のモチーフの範囲内に含まれる。

さらなる典型的な実施形態では、本発明は、修飾糖がＵＤＰガラクトースの立体化学構造に基づく場合の接合体を提供する。本発明で有用な典型的なヌクレオチド糖は、構造

を有する。

別の典型的な実施形態では、ヌクレオチド糖はグルコースの立体化学構造に基づく。この実施形態に従う典型的な種は、化学式

を有する。

一般に、糖部分または糖部分−リンカーカセットおよびＰＥＧまたはＰＥＧ−リンカーカセット基は、反応基の使用を介して互いに連結され、ここで反応基は典型的にはプロセスを新規の有機官能基または非反応性の種に連結させることにより形質転換される。糖反応性官能基は、糖部分上の任意の位置に位置している。本発明の実施において有用な反応の反応基およびクラスは、一般にバイオコンジュゲート化学に関する当該技術分野で周知のものである。反応性糖部分の場合に得られる現行で好ましい反応のクラスは、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらは、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えばエナミン反応）ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加）を含むがこれらに限定されない。これらや他の有用な反応は、例えば、マーチ（Ｍａｒｃｈ）、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８５年；ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびフィーネイ（Ｆｅｅｎｅｙ）ら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１９８巻、アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、１９８２年において考察されている。

糖核または修飾基からのペンダント状の有用な反応性官能基は、
（ａ）Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むがこれらに限定されないカルボキシル基およびその様々な誘導体、
（ｂ）例えばエステル、エーテル、アルデヒドなどに変換可能な水酸基、
（ｃ）ハロゲン化物が後に、例えばアミン、カルボン酸塩アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基と置換され、それによりハロゲン原子の官能基で新たな基の共有結合をもたらしうる、ハロアルキル基、
（ｄ）例えばマレイミド基などのディールス−アルダー反応に関与しうるジエノフィル基、
（ｅ）後の誘導体化が、例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成あるいはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加などの機構を介して可能である、アルデヒド基またはケトン基、
（ｆ）後のアミンとの反応により、例えばスルホンアミドを形成する、ハロゲン化スルホニル基、
（ｇ）例えばジスルフィドに変換されうるかまたはハロゲン化アシルと反応されうるチオール基、
（ｈ）例えばアシル化、アルキル化または酸化されうるアミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えばシクロ付加、アシル化、マイケル付加などを経ることが可能なアルケン、ならびに
（ｊ）例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応しうるエポキシド
を含むがこれらに限定されない。

反応性官能基を、反応性の糖核または修飾基を構築するのに必要な反応に関与またはそれと干渉しないように選択してもよい。あるいは、反応性官能基を、保護基の存在を介して反応への関与から保護してもよい。当業者は、特定の官能基を選択された反応条件一式と干渉しないように保護する方法について理解している。有用な保護基の例として、例えばグリーネ（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、）ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１年を参照のこと。

修飾糖類
本発明では、修飾糖および修飾糖ヌクレオチドの使用により修飾糖類の接合体が形成される。本発明で有用な修飾糖化合物では、糖部分は、好ましくは糖類、デオキシ糖、アミノ−糖類、またはＮ−アシル糖類である。「糖類」およびその等価物である「サッカリル」、「糖」および「グリコシル」という用語は、単量体、二量体、オリゴマーおよび高分子を示す。糖部分はまた修飾基で官能化される。修飾基は、典型的には糖上でのアミン、スルフヒドリル部分またはヒドロキシル部分、例えば１級ヒドロキシル部分との接合を介して糖部分に接合される。典型的な実施形態では、修飾基はアミンと修飾基の反応誘導体との反応を介して形成される糖上のアミン部分、例えばアミド、ウレタンまたは尿素を介して付着される。

本発明の接合体のグリコシル連結基の糖コアとして、任意の糖を使用可能である。本発明の組成物の形成に有用な典型的な糖コアは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、およびシアル酸を含むがこれらに限定されない。他の有用な糖類は、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミン類似体などのアミノ糖を含む。糖コアは天然に見出される構造であってよく、またはそれを修飾することで修飾基を接合するための部位を生成してもよい。

以下の考察においては、本発明の実施に有用な修飾糖類における多数の具体例が示される。典型的な実施形態では、シアル酸誘導体が修飾基の付着対象の糖核として用いられる。シアル酸誘導体についての考察では、あくまで例示を明確にすることに重点が置かれ、それが本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、種々の他の糖部分が例としてシアル酸を用いて示されるものと同様に活性化および誘導体化されうることを理解するであろう。例えば、当該技術分野で認められた方法により容易に修飾される糖基質として挙げられるいくつかの例、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびフコースを修飾するのに、極めて多くの方法を用いることが可能である。例えば、エルハラビ（Ｅｌｈａｌａｂｉ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３（１９９９年）；およびシャファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４（２０００年）を参照のこと。

典型的な実施形態では、修飾糖は６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分に基づく。Ｎ−アセチルガラクトサミンについて下記に示されるように、６−アミノ−糖部分は、標準の方法により容易に調製される。

上記スキームにおいて、指数ｎは１〜２５００の整数を示す。典型的な実施形態では、この指数は高分子の分子量が約１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａまたは８０ｋＤａであるように選択される。記号「Ａ」は、活性化基、例えばハロ、活性化エステルの成分（例えばＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル）、カーボネートの成分（例えばｐ−ニトロフェニルカーボネート）などを示す。当業者は、他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖がこの方法や類似方法により容易に調製されることを理解するであろう。

アクセプタペプチドは、典型的には新たに合成されるか、あるいは原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞）内または哺乳類、酵母、昆虫、真菌もしくは植物細胞などの真核細胞内で組換え発現される。ペプチドは完全長のタンパク質または断片であってもよい。さらに、ペプチドは野生型または変異ペプチドであってもよい。典型的な実施形態では、ペプチドは１つもしくは複数のＮ−またはＯ−連結グリコシル化部位をペプチド配列に付加する変異を含む。

本発明の方法はまた、組換え生成される不完全にグリコシル化されたペプチドの修飾を提供する。多数の組換え生成された糖タンパク質は、不完全にグリコシル化されることで、望ましくない特性、例えば、免疫原性、ＲＥＳによる認識を有しうる炭水化物残基が暴露される。本発明の方法における修飾糖を用いることで、ペプチドは、例えば水溶性高分子、治療薬、または同種のものにより、同時にさらにグリコシル化および誘導体化されうる。修飾糖の糖部分は、所望の特性を有する別の糖部分または完全にグリコシル化されたペプチド内のアクセプタに適切に接合されることになる残基でありうる。

当業者は、本発明を任意のソース由来の実質的に任意のペプチドまたはグリコペプチドを用いて実行可能であることを理解するであろう。本発明を実施可能にする典型的なペプチドは、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、およびその中に示される参考文献にて示されている。

本発明の方法により修飾されるペプチドは合成または野生型ペプチドであってよく、またはそれらは部位特異的変異誘発などの当該技術分野で既知の方法により生成される変異ペプチドであってもよい。ペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−連結またはＯ−連結でありうる。典型的なＮ−連結は、修飾糖のアスパラギン残基の側鎖への付着である。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である場合）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素による付着における認識配列である。したがって、ポリペプチド内でこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、グリコシル化部位が生成される可能性がある。Ｏ−連結グリコシル化は、１種の糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）のヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはトレオニンのヒドロキシ側鎖への付着を示すが、異常アミノ酸または非天然アミノ酸、例えば５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用可能である。

さらに、ペプチドに加え、他の生物学的構造（グリコシル化部位を有する、例えば糖脂質、脂質、スフィンゴイド、セラミド、全細胞など）を用いて本発明の方法を実行してもよい。

グリコシル化部位のペプチドまたは他の構造への付加が、アミノ酸配列を１つまたは複数のグリコシル化部位を有するように改変することによって便宜的に行われる。付加は、−ＯＨ基を提示する１つまたは複数の種、好ましくはセリンまたはトレオニン残基を（Ｏ−連結グリコシル化部位における）ペプチドの配列内に取り込むことによってもなされうる。付加は、変異またはペプチドの完全な化学合成によりなされうる。ペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化により、特に所望のアミノ酸に翻訳することになるコドンが生成されるようにペプチドをコード化するＤＮＡを予め選択された塩基で変異させることにより改変される。ＤＮＡ変異は、好ましくは当該技術分野で既知の方法を用いて行われる。

典型的な実施形態では、グリコシル化部位はポリヌクレオチドのシャッフリングにより付加される。ＤＮＡシャッフリングプロトコルを用い、候補ペプチドをコード化するポリヌクレオチドを調節してもよい。ＤＮＡシャッフリングは、関連遺伝子プールのランダム断片化、それに続くポリメラーゼ鎖反応様プロセスによる断片の再構築によって行われる、反復組換えおよび変異のプロセスである。例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９〜３９１頁（１９９４年）；および米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８３７，４５８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書および米国特許第５，８１１，２３８号明細書を参照のこと。

本発明の実施に用いる典型的なペプチド、グリコシル化部位を付加または除去する方法、およびグリコシル構造または部分構造の付加または除去については、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットならびに関連の米国およびＰＣＴ出願において詳細に記載されている。

本発明はまた、１つまたは複数の選択されたグリコシル残基のペプチドへの付加（またはそれからの除去）、その後の少なくとも１つの選択されたペプチドのグリコシル残基への修飾糖の接合を利用する。本実施形態は、例えば、ペプチド上に存在しないかまたは望ましい量で存在しない、選択されたグリコシル残基に修飾糖を接合するのに望ましい場合に有用である。それ故、選択されたグリコシル残基は、修飾糖のペプチドへの共役に先立ち、酵素共役または化学共役によりペプチドに接合される。別の実施形態では、グリコペプチドのグリコシル化パターンは、修飾糖の接合に先立ち、炭水化物残基のグリコペプチドからの除去により改変される。例えば国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照のこと。

グリコペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の付加または除去が化学的または酵素的に行われる。典型的な化学的脱グリコシル化が、ポリペプチド変異体のトリフルオロメタンスルホン酸化合物、または等価化合物への暴露によりもたらされる。この処理の結果、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分またはすべての糖類が切断される一方、ペプチドは無傷のままである。化学的脱グリコシル化については、ハキムジン（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２頁（１９８７年）およびエッジ（Ｅｄｇｅ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１頁（１９８１年）で記載されている。ポリペプチド変異体上での炭水化物部分の酵素的切断が、トタクラ（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０頁（１９８７年）で記載のように種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により行われうる。

典型的な実施形態では、ペプチドは、ペプチド上での糖接合または再構築ステップの実施に先立ち、ノイラミニダーゼで本質的に完全に脱シアリル化される。ペプチドは、糖接合または再構築後、場合によりシアリルトランスフェラーゼを用いて再シアリル化される。典型的な実施形態では、再シアリル化は本質的にシアリルアクセプタの集団内の各々の（例えば、８０％超、好ましくは８５％超、９０％超、好ましくは９５％超およびより好ましくは９６％超、９７％超、９８％超または９９％超）末端サッカリルアクセプタにて生じる。好ましい実施形態では、糖類は実質的に均一なシアリル化パターン（すなわち実質的に均一なグリコシル化パターン）を有する。

グリコシル部分の化学的付加は任意の当該技術分野で認められた方法により行われる。糖部分の酵素的付加は、好ましくは本明細書に示される方法を改良したものを用いて行われ、それにより天然グリコシル単位が本発明で用いられる修飾糖に置換される。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第５，８７６，９８０号明細書、米国特許第６，０３０，８１５号明細書、米国特許第５，７２８，５５４号明細書、および米国特許第５，９２２，５７７号明細書にて開示されている。

選択されたグリコシル残基における典型的な付着点は、（ａ）Ｎ−連結グリコシル化におけるコンセンサス部位およびＯ−連結グリコシル化における部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼにおけるアクセプタである末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン、（ｄ）遊離カルボキシル基、（ｅ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｆ）遊離水酸基、例えばセリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの、（ｇ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの、あるいは（ｈ）グルタミンのアミド基を含むがこれらに限定されない。本発明で有用な典型的な方法は、１９８７年９月１１日に公表された国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、ならびにアプリン（Ａｐｌｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）、ＣＲＣ ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。

一実施形態では、本発明は２つ以上のペプチドを連結基を介して連結するための方法を提供する。連結基は任意の有用な構造を有し、直鎖および分岐鎖構造から選択されうる。好ましくは、ペプチドに付着されるリンカーの各末端は、修飾糖（すなわち初期の無傷グリコシル連結基）を含む。

典型的な本発明の方法では、２つのペプチドは、高分子（例えばＰＥＧリンカー）を含むリンカー部分を介して互いに連結される。作成物は、上記の図面に示される一般構造に一致する。本明細書に記載のように、本発明の作成物は２つの無傷グリコシル連結基を含む（すなわちｓ＋ｔ＝１）。２つのグリコシル基を含むＰＥＧリンカーについては明確化することに重点が置かれ、それは本発明のこの実施形態で有用なリンカーアームの同一性を限定するものとして解釈されるべきではない。

したがって、ＰＥＧ部分は、第１のグリコシル単位を有する第１の末端および第２のグリコシル単位を有する第２の末端で官能化される。第１および第２のグリコシル単位は、好ましくは異なるトランスフェラーゼに対する基質であり、それらは第１および第２のペプチドの各々の第１および第２のグリコシル単位への直交性の付着（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を可能にする。実際には、（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２リンカーは、第１のグリコシル単位は基質である場合の第１のペプチドおよび第１のトランスフェラーゼと接触され、それにより（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２が形成される。次いで、トランスフェラーゼおよび／または未処理のペプチドが、場合により反応混合物から除去される。第２のグリコシル単位が基質である場合の第２のペプチドおよび第２のトランスフェラーゼは（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２接合体に付加され、それにより（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２−（ペプチド）^２が形成され、少なくとも１つのグリコシル残基は直接的または間接的にＯ−連結である。当業者は、上で概説された方法が、例えば分岐ＰＥＧ、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖類または同種のものの使用による、３個以上のペプチド間の接合体の形成にも適用可能であることを理解するであろう。

典型的な実施形態では、本発明の方法により修飾されるペプチドは、哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）内またはトランスジェニック動物内で生成されるグリコペプチドであり、それ故、Ｎ−および／またはＯ−連結オリゴ糖鎖を有し、それらは不完全にシアリル化される。シアル酸が不足しかつ末端ガラクトース残基を有するグリコペプチドのオリゴ糖鎖を、ＰＥＧ化するか、ＰＰＧ化するかまたはそれ以外では修飾シアル酸で修飾することが可能である。

スキーム１では、アミノグリコシド１が保護されたアミノ酸（例えばグリシン）誘導体の活性エステルで処理されることで、糖アミン残基が対応する保護されたアミノ酸アミド付加体に変換される。付加体がアルドラーゼで処理されることで、α−ヒドロキシカルボン酸塩２が形成される。化合物２は、ＣＭＰ−ＳＡシンセターゼの活性により対応するＣＭＰ誘導体に変換され、その後、ＣＭＰ誘導体の接触水素化により化合物３が生成される。グリシン付加体の形成を介して導入されるアミンは、化合物３を活性化ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えばＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と反応させることによるＰＥＧ付着の座として用いられ、それによりそれぞれ４または５などの種が生成される。

修飾糖類のペプチドへの接合
ＰＥＧ修飾糖類は、接合を媒介するのに適する酵素を用いてグリコシル化または非グリコシル化ペプチドに接合される。好ましくは、修飾ドナーである糖、酵素およびアクセプタペプチドの濃度が、アクセプタが消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。以下で考察される検討事項は、シアリルトランスフェラーゼとの関連で示される一方、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。

所望のオリゴ糖構造を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼを用いる多数の方法は既知であり、一般に本発明に適用可能である。典型的な方法が、例えば、国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、イトウ（Ｉｔｏ）ら、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁（１９９３年）、米国特許第５，３５２，６７０号明細書、米国特許第５，３７４，５４１号明細書、米国特許第５，５４５，５５３号明細書、公有の米国特許第６，３９９，３３６号明細書および米国特許第６，４４０，７０３号明細書、ならびに公有の公表されたＰＣＴ出願である国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、国際公開第０４／０３３６５１号パンフレット、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレットに記載され、これらは参照により本明細書中に援用される。

本発明は、グリコシルトランスフェラーゼの単独使用またはグリコシルトランスフェラーゼの併用により実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの併用が可能である。２つ以上の酵素を用いる実施形態では、酵素および基質は好ましくは初期反応混合物中で結合されるか、または一旦第１の酵素反応が完了またはほぼ完了すると、第２の酵素反応における酵素および試薬は反応媒体に添加される。単一の容器内での２つの酵素反応を連続的に実施することにより、中間種が単離される手順よりも全収率が改善される。さらに、余分の溶媒および副産物の浄化および処分が削減される。

好ましい実施形態では、第１および第２の酵素の各々はグリコシルトランスフェラーゼである。別の好ましい実施形態では、一酵素としてエンドグリコシダーゼが挙げられる。さらなる好ましい実施形態では、３種以上の酵素を用いることで本発明の修飾糖タンパク質が構築される。それら酵素を用いることで、修飾糖のペプチドへの付加の前後にペプチド上の糖類構造があらゆる点で改変される。

別の実施形態では、方法は１つまたは複数のエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを利用する。グリコシダーゼは、典型的にはグリコシル結合の破裂ではなく形成のために設計される変異体である。変異グリカナーゼは、典型的にはアミノ酸残基と活性部位の酸性アミノ酸残基との置換を含む。例えば、エンドグリカナーゼがエンド−Ｈである場合、置換された活性部位残基は、典型的には位置１３０のＡｓｐ、位置１３２のＧｌｕまたはそれらの組み合わせということになる。アミノ酸は、一般にセリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンと置換される。

変異酵素は、通常エンドグリカナーゼ加水分解ステップの逆反応に類似する合成ステップにより反応を触媒する。これらの実施形態では、グリコシルドナー分子（例えば所望のオリゴ糖類または単糖類構造）は離脱基を有し、かつ反応はタンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基へのドナー分子の付加に伴い進行する。例えば、離脱基はフッ化物などのハロゲンであってもよい。他の実施形態では、離脱基はＡｓｎまたはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらなる実施形態では、グリコシルドナー分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は１，２オキサゾリン部分を含みうる。

好ましい実施形態では、本発明の接合体を生成するのに用いられる各酵素は触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件に応じて変化する。予め選択された基質濃度および反応条件の下での所定の酵素における触媒量を決定するための手段は当業者に周知である。

上記プロセスが実施される温度は、凍結よりやや高温から最も高感度な酵素が変性する温度の範囲でありうる。好ましい温度範囲は約０℃〜約５５℃、およびより好ましくは約２０℃〜約３７℃、例えば約３０℃である。別の典型的な実施形態では、本方法の１つまたは複数の要素が好熱性酵素を用いて高温で実施される。

反応混合物は、アクセプタがグリコシル化され、それにより所望の接合体が形成されるのに十分な期間にわたり維持される。接合体の一部は数時間後に検出されうることが多く、通常は回収可能な量が得られるのは２４時間以内の間である。当業者は、反応速度が多数の変動要因（例えば、酵素濃度、ドナー濃度、アクセプタ濃度、温度、溶媒容量）に依存し、それらは選択系において最適化されることを理解している。

本発明はまた、修飾ペプチドの工業規模の生成を提供する。本明細書で用いられる工業規模では、一般に少なくとも１グラムの最終精製接合体が生成される。

以下の考察では、本発明は修飾シアル酸部分のグリコシル化ペプチドに対する接合として例示される。典型的な修飾シアル酸はＰＥＧで標識される。ＰＥＧ修飾シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に関する以下の考察は、例示を明確にすること、ならびに本発明がこれらの２つのパートナーの接合に限定されるように意味づけようとしないことに注目している。当業者は、その考察が一般にシアル酸以外の修飾グリコシル部分の付加に適用できることを理解している。さらに、同考察は他のＰＥＧ部分、治療部分、および生体分子を含むＰＥＧ以外の作用物質を用いたグリコシル単位の修飾に等しく適用可能である。

酵素的アプローチを、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化炭水化物のペプチドまたはグリコペプチド上への選択的導入において用いてもよい。その方法では、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を有する修飾糖類が用いられ、かつ適切なグリコシルトランスフェラーゼまたは糖合成酵素を併用する。所望の炭水化物結合を作ることになるグリコシルトランスフェラーゼを選択しかつ修飾糖をドナー基質として使用することにより、ＰＥＧまたはＰＰＧをペプチド骨格上か、グリコペプチドの既存の糖残基上かまたはペプチドに付加されている糖残基上に直接導入してもよい。

典型的な実施形態では、シアリルトランスフェラーゼにおけるアクセプタは天然構造としていずれか修飾されることになるペプチド上に存在するか、または組換え的、酵素的または化学的にそこに配置される。適切なアクセプタは、例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシルアクセプタ、および当業者に既知の他のアクセプタを含む（例えば、ポールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７〜５６２４頁（１９７８年）を参照）。典型的なシアリルトランスフェラーゼが本明細書に示されており、例えば図９を参照のこと。

一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼにおけるアクセプタがグリコペプチドのインビボ合成時に修飾されることになるグリコペプチド上に存在する。かかるグリコペプチドを、予めグリコペプチドのグリコシル化パターンの修飾を行うことなく、特許請求される方法を用いてシアリル化してもよい。あるいは、本発明の方法を用いて適切なアクセプタを含まないペプチドをシアリル化してもよく、まずペプチドを修飾することで、当業者に既知の方法によりアクセプタが含まれる。典型的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃ残基がＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用により付加される。

典型的な実施形態では、ガラクトシルアクセプタは、ガラクトース残基をペプチドに連結される適切なアクセプタ、例えばＧｌｃＮＡｃに付着させることにより構築される。その方法は、修飾されるべきペプチドを、適量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばＧａｌβ１，３またはＧａｌβ１，４）および適切なガラクトシルドナー（例えばＵＤＰ−ガラクトース）を含有する反応混合物とともにインキュベートするステップを含む。反応は実質的に完了するまでの進行が許容され、あるいは予め選択された量のガラクトース残基が付加される場合、反応は終結される。選択された糖類アクセプタを構築する他の方法は、当業者には明らかであろう。

さらに別の実施形態では、グリコペプチドと連結されたオリゴ糖の全部または一部をまず「トリミング」し、シアリルトランスフェラーゼにおけるアクセプタまたは１つまたは複数の適切な残基が適切なアクセプタが得られるように付加しうる部分が暴露される。。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼ（例えば米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照）などの酵素が反応物の付着およびトリミングにおいて有用である。この方法の別の実施形態では、ペプチドのシアル酸部分は本質的に完全に除去され（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）、修飾シアル酸のアクセプタが暴露される。

以下の考察では、本発明の方法は、ＰＥＧ部分を付着させる修飾糖類の使用により例示される。考察は例示を明確にすることに注目している。当業者は、同考察が同様に、修飾糖が治療部分、生体分子または同種のものを担持する場合の実施形態に関連することを理解するであろう。

修飾糖の付加に先立ち炭水化物残基が「トリミングされる」場合の本発明の典型的な実施形態では、高級マンノースが第一世代の二分岐構造に逆トリミングされる（ｔｒｉｍｍｅｄ ｂａｃｋ）。ＰＥＧ部分を担持する修飾糖が、「逆トリミング」により暴露される１つまたは複数の糖残基に接合される。一例では、ＰＥＧ部分がＰＥＧ部分に接合されたＧｌｃＮＡｃ部分を介して付加される。修飾ＧｌｃＮＡｃは、二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に付着される。あるいは、非修飾ＧｌｃＮＡｃを分岐種の末端の一方または両方に付着してもよい。

別の典型的な実施形態では、ＰＥＧ部分が、ガラクトース残基を有する修飾糖を介して二分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に付加され、それは末端マンノース残基上に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基に接合される。あるいは、非修飾Ｇａｌを一方または両方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に付加してもよい。

さらなる例では、ＰＥＧ部分が、例えば上で考察された修飾シアル酸を用いてＧａｌ残基上に付加される。

別の典型的な実施形態では、高級マンノース構造が二分岐構造を分岐させるマンノースに「逆トリミングされる」。一例では、ＰＥＧ部分が高分子で修飾されたＧｌｃＮＡｃを介して付加される。あるいは、非修飾ＧｌｃＮＡｃがマンノースに付加された後、Ｇａｌが付着されたＰＥＧ部分を有する。さらに別の実施形態では、非修飾のＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基がマンノースに連続的に付加された後、シアル酸部分がＰＥＧ部分で修飾される。

高級マンノース構造を基本のトリ−マンノシルコアに逆トリミングしてもよい。

さらなる典型的な実施形態では、高級マンノースは第１のマンノースの付着対象であるＧｌｃＮＡｃに「逆トリミングされる」。ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＧ部分を担持するＧａｌ残基に接合される。あるいは、非修飾ＧａｌがＧｌｃＮＡｃに付加された後、水溶性糖で修飾されたシアル酸が付加される。さらなる例では、末端ＧｌｃＮＡｃはＧａｌと接合され、次いでＧｌｃＮＡｃはＰＥＧ部分を担持する修飾フコースでフコシル化される。

高級マンノースはまた、ペプチドのＡｓｎに付着された第１のＧｌｃＮＡｃに逆トリミングされうる。一例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）_ａ残基のＧｌｃＮＡｃは水溶性高分子を担持するＧｌｃＮＡｃと接合される。別の例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）_ａ残基のＧｌｃＮＡｃは水溶性高分子を担持するＧａｌで修飾される。さらなる実施形態では、ＧｌｃＮＡｃはＧａｌで修飾された後、ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸のＧａｌに接合される。

他の典型的な実施形態は、公有の米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号明細書；米国特許出願公開第２００４００６３９１１号明細書；米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号明細書；米国特許出願第１０／３６９，９７９号明細書；米国特許出願第１０／４１０，９１３号明細書；米国特許出願第１０／３６０，７７０号明細書；米国特許出願第１０／４１０，９４５号明細書およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）にて示される。

上記実施例は、本明細書に示される方法における能力を例示する。本明細書に記載の方法を用いることで、実質的に任意の所望の構造の炭水化物残基を「逆トリミング」しかつ構築することが可能である。修飾糖は上記の炭水化物部分の末端に付加されうるか、またはペプチドコアと炭水化物の末端の間の中間体でありうる。

典型的な実施形態では、既存のシアル酸がシアリダーゼを用いてグリコペプチドから除去され、それにより内在するガラクトシル残基のすべてまたは大部分がマスクされない。あるいは、ペプチドまたはグリコペプチドがガラクトース残基またはガラクトース単位にて終結するオリゴ糖残基で標識される。ガラクトース残基の暴露後または付加後、適切なシアリルトランスフェラーゼを用いることで修飾シアル酸が付加される。

別の典型的な実施形態では、シアル酸をシアル酸上に転移させる酵素が用いられる。この方法をシアリル化グリカンをシアリダーゼで処理せずに実施することで、グリカン残基がシアル酸下で暴露されうる。典型的な高分子で修飾されたシアル酸は、ポリ（エチレングリコール）で修飾されたシアル酸である。シアル酸および修飾シアル酸部分をグリカンのシアル酸残基上に付加するかまたはグリカン上の既存のシアル酸残基をこれらの種と交換する他の典型的な酵素は、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを含む。

さらなるアプローチでは、マスクされた反応官能性がシアル酸上に存在する。マスクされた反応基は、好ましくは修飾シアル酸のエリスロポエチンへの付着に用いられる条件により影響を受けない。修飾シアル酸のペプチドへの共有結合後、マスクは除去され、かつペプチドはＰＥＧなどの作用物質と接合される。作用物質は、修飾糖残基上のマスクされていない反応基との反応により特定の様式でペプチドに接合される。

任意の修飾糖は、グリコペプチドのオリゴ糖側鎖の糖類末端に応じて、その適切なグリコシルトランスフェラーゼとともに使用可能である。上で考察のように、ＰＥＧ化構造の導入に必要なグリコペプチドの末端糖は、発現の間に自然に導入されうるか、あるいは発現後に適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼの混合物を用いて生成可能である。

さらなる典型的な実施形態では、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧがβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応することで、修飾ガラクトースが適切な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造に転移する。グリコペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳類、昆虫、植物または菌類などの発現系内で生じうるように発現の間に生成可能であるが、必要に応じてグリコペプチドをシアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで処理することによっても生成可能である。

別の典型的な実施形態では、ＧＮＴ１−５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを用いることで、ＰＥＧ化−ＧｌｃＮＡｃがグリコペプチド上の末端マンノース残基に転移する。さらに典型的な実施形態では、Ｎ−および／またはＯ−連結グリカン構造がグリコペプチドから酵素的に除去されることで、アミノ酸または末端グリコシル残基が暴露され、後に修飾糖と接合される。例えば、エンドグリカナーゼを用いることで、グリコペプチドのＮ−連結構造が除去され、末端ＧｌｃＮＡｃがグリコペプチド上でＧｌｃＮＡｃと連結されたＡｓｎとして暴露される。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼを用いることで、ＰＥＧ−ガラクトースの機能性が暴露されたＧｌｃＮＡｃ上に導入される。

別の実施形態では、修飾糖は、糖残基をペプチド骨格に転移させるものとして知られるグリコシルトランスフェラーゼを用いてペプチド骨格に直接付加される。本発明の実施に有用である典型的なグリコシルトランスフェラーゼは、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ１−１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどを含むがこれらに限定されない。このアプローチの利用により、任意の炭水化物が不足しているペプチド上、あるいは既存のグリコペプチド上への修飾糖類の直接付加が可能になる。いずれの場合でも、修飾糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性で規定されるようにペプチド骨格上の特定の位置で生じ、化学的方法を用いたタンパク質のペプチド骨格の修飾の間に生じるようなランダムな様式では生じない。適切なアミノ酸配列のポリペプチド鎖内への設計により、多数の作用物質をグリコシルトランスフェラーゼの基質ペプチド配列が不足しているタンパク質またはグリコペプチドに挿入してもよい。

上記の典型的な実施形態の各々においては、修飾糖のペプチドへの接合後に１つまたは複数のさらなる化学的または酵素的修飾ステップを用いてもよい。典型的な実施形態では、酵素（例えばフコシルトランスフェラーゼ）を用いることで、グリコシル単位（例えばフコース）がペプチドに付着された末端修飾糖上に付加される。別の例では、酵素反応を用いることで、修飾糖における接合に失敗した対象の部位が「キャッピング」される。あるいは、化学反応を用いることで、接合された修飾糖の構造が改変される。例えば、接合された修飾糖は、その修飾糖が付着されらペプチド成分との連結を安定化または不安定化する作用物質と反応する。別の例では、修飾糖の成分がそのペプチドへの接合後に脱保護される。当業者は、修飾糖のペプチドへの接合後の段階で、本発明の方法において有用な酵素的および化学的手順が多数存在することを理解するであろう。さらに、修飾糖−ペプチド接合体については本発明の範囲内で詳述される。

本発明の接合体を調製するための酵素および反応条件が、本願の親特許ならびに共有の公表されたＰＣＴ特許出願の国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、国際公開第０４／０３３６５１号パンフレット、国際公開第０４／０９９２３１号パンフレットにて詳細に考察されている。

実施例２で示される選択された実施形態では、昆虫細胞内で発現されるＥＰＯペプチドが、再構築されたグリコペプチド上のグリカンがＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌグリコシル残基を含むように再構築される。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌの付加は、単一の容器内で別々の反応としてまたは単一の反応として生じうる。この実施例では、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩおよびＧａｌ−トランスフェラーゼＩが用いられる。修飾シアリル部分はＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩを用いて付加される。

実施例３で例示される別の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌおよび修飾Ｓｉａの付加もまた、上記の酵素を用いて単一の反応容器内で生じうる。実施例４は、酵素的再構築およびグリコＰＥＧ化の各ステップが個別に実施される場合の方法を示す。

ペプチドが哺乳類細胞内で発現される場合、異なる方法が用いられる。実施例５では、ペプチドはペプチド上のシアル酸を修飾シアル酸と交換してＳｉａ−Ｌ−Ｒ^１を形成するかまたは修飾シアル酸をペプチド上のシアル酸上に直接転移させてＳｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１を形成するシアリルトランスフェラーゼとペプチドを接触させることにより、接合に先立つ再構築の必要性を伴わずに接合される。この方法で用いられる典型的な酵素はＣＳＴ−ＩＩである。シアル酸をシアル酸に付加する他の酵素は当業者に既知であり、かかる酵素の例が図９に示される。

本発明の接合体を調製する別の方法が実施例６に示される。哺乳類系にて発現されるペプチドは、シアリダーゼを用いて脱シアリル化される。暴露されたＧａｌ残基は、Ｏ−連結グリカンに特異的なシアリルトランスフェラーゼを用いて修飾シアル酸でシアリル化されることで、Ｏ−連結の修飾グリカンを有するＥＰＯペプチドをもたらす。脱シアリル化された修飾ＥＰＯペプチドは、場合により、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩなどのシアリルトランスフェラーゼを用いて部分的または完全に再シアリル化される。

別の態様では、本発明は、本発明のＰＥＧ化エリスロポエチンを作製する方法を提供する。本方法は、（ａ）

から選択されるグリコシル基を含む基質エリスロポエチンペプチドを化学式

を有するＰＥＧ−シアル酸ドナーと前記ドナーからのＰＥＧ−シアル酸の前記グリコシル基のＧａｌおよびＳｉａから選択されるメンバー上への前記転移に適する条件下で転移させる酵素とに接触させるステップを含む。典型的な修飾シアル酸ドナーは、リンカー部分を介して高分子、例えば直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）部分で修飾されるＣＭＰ−シアル酸である。

典型的な実施形態では、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは化学式

を有する。

別の典型的な実施形態では、ＰＥＧ−シアル酸ドナーは化学式

を有する。

さらなる典型的な実施形態では、ＥＰＯペプチドはグリコＰＥＧ化または再構築に先立ち適切な発現系にて発現される。典型的な発現系はＳｆ−９／バキュロウイルスおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。

典型的な実施形態では、本発明は、ｐＨが５．５〜８．０である場合のグリコＰＥＧ化ＥＰＯを作製する方法を提供する。別の典型的な実施形態では、本発明は、金属すなわちＭｎＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２が反応混合物中に存在しない場合のグリコＰＥＧ化ＥＰＯを作製する方法を提供する。さらに別の典型的な実施形態では、本発明は、反応物のヌクレオチド糖すなわちＣＭＰ、ＧＤＰが反応混合物中に存在しない場合のグリコＰＥＧ化ＥＰＯを作製する方法を提供する。さらに別の典型的な実施形態では、本発明は、キレート剤すなわちＥＤＴＡが反応混合物中に存在しない場合のグリコＰＥＧ化ＥＰＯを作製する方法を提供する。

さらなる典型的な実施形態では、全部のＰＥＧ化糖が反応混合物に一度に添加される。別の典型的な実施形態では、全部のＰＥＧ化糖が連続的に添加される。

エリスロポエチン接合体の精製
上記プロセスにより生成される生成物を精製せずに用いてもよい。しかし、通常は生成物ならびに１種または複数種の中間体、例えばヌクレオチド糖、分岐状および線状ＰＥＧ種、修飾糖類および修飾ヌクレオチド糖を回収することが好ましい。薄層または厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは膜濾過などのグリコシル化糖類を回収するための標準の周知の技術を用いてもよい。以下に考察のように、また本明細書にて引用される文献によると、膜濾過を用いることが好ましく、回収を目的として逆浸透膜、または１つまたは複数のカラムクロマトグラフィー技術を用いることがより好ましい。例えば、膜が約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する場合の膜濾過を用いることで、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することが可能である。次いで、ナノ濾過または逆浸透を用いることで、塩を除去しかつ／または糖類生成物を精製することが可能である（例えば、国際公開第９８／１５５８１号パンフレットを参照）。ナノフィルター膜は、一価塩を通過させるが多価塩、かつ用いられる膜による約１００超〜約２，０００ダルトンの非荷電溶質を保持する逆浸透膜のクラスである。したがって、典型的な応用では、本発明の方法により調製される糖類は膜内に保持され、かつ混入塩が通過することになる。

もし第１ステップとしてペプチドが細胞内で生成される場合、微粒子残渣である宿主細胞または溶解した断片が除去される。グリコＰＥＧ化後、ＰＥＧ化ペプチドは当該技術分野で認められた方法、例えば遠心分離または限外濾過により精製され、場合により、タンパク質を市販のタンパク質濃縮フィルターで濃縮した後、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換カラム分別（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）上またはカルボキシメチル基もしくはスルホプロピル基を有するマトリックス上）、ブルー−セファロース、ＣＭブルー−セファロース、モノ−Ｑ、モノ−Ｓ、レンティルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、エーテルトーヨーパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、ブチルトーヨーパール、フェニルトーヨーパール、またはタンパク質Ａセファロース上でのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基が付加されたシリカゲル）、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）分子ふるいまたはサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲル濾過、ポリペプチドと選択的に結合するカラム上でのクロマトグラフィー、ならびにエタノール沈殿または硫酸アンモニウム沈殿から選択される１つまたは複数のステップにより、ポリペプチド変異体を他の不純物から分離することが可能である。

培養にて生成される修飾グリコペプチドは通常、細胞、酵素などからの初期抽出により単離された後、１つまたは複数の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーステップが行われる。さらに、修飾糖タンパク質を親和性クロマトグラフィーにより精製可能である。最後に、最終精製ステップにてＨＰＬＣを利用可能である。

タンパク質加水分解を阻害するためにプロテアーゼ阻害剤、例えばメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）を先行するステップのいずれかに含めることが可能であり、かつ外来の汚染物質の成長を阻止するために抗生物質または防腐剤を含めることが可能である。

別の実施形態の範囲内では、本発明の修飾グリコペプチドを生成する系からの上清が、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）製またはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製のペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過ユニットを用いて濃縮される。濃縮ステップ後、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用可能である。例えば、適切な親和性マトリックスは、適切な支持体に結合されたペプチドに対するリガンド、レクチンまたは抗体分子を含有しうる。あるいは、アニオン交換樹脂、例えばペンダント状のＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基質を使用可能である。適切なマトリックスは、タンパク質精製にて一般に用いられるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または他のタイプを含む。あるいは、カチオン交換ステップを利用可能である。適切な陽イオン交換体は、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。スルホプロピル基は特に好ましい。

精製に用いられる他の方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、水酸化リン灰石クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびブルーセファロース上のクロマトグラフィーを含む。これらや他の有用な方法が共譲渡された米国仮特許番号（代理人整理番号４０８５３−０１−５１６８−Ｐ１、２００５年５月６日に出願）に例示されている。

ポリペプチド接合体組成物をさらに精製するため、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダント状のメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つまたは複数のＲＰ−ＨＰＬＣステップを利用可能である。先行する精製ステップの一部または全部を様々に併用することで、均質または本質的に均質の修飾糖タンパク質を得ることも可能である。

大規模発酵から得られる本発明の修飾グリコペプチドを、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１頁（１９８４年）で開示された方法に類似の方法により精製可能である。この参考文献は、分取ＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＩＬ−２の精製における２つの連続的なＲＰ−ＨＰＬＣステップについて記載している。あるいは、修飾糖タンパク質を精製するため、親和性クロマトグラフィーなどの技術を利用可能である。

典型的な実施形態では、公有の共譲渡された米国仮特許番号（代理人整理番号４０８５３−０１−５１６８−Ｐ１、２００５年５月６日に出願）に示された方法により精製がなされる。

医薬組成物
別の態様では、本発明は医薬組成物を提供する。医薬組成物は、医薬的に許容できる希釈剤および非天然のＰＥＧ部分、治療部分または生体分子とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの間の共有結合接合体を含む。高分子、治療部分または生体分子は、ペプチドと高分子、治療部分または生体分子の間に挿入されかつそれら双方に共有結合される無傷グリコシル連結基を介してペプチドに接合される。

本発明の医薬組成物は、種々の薬剤送達系における使用に適する。本発明で用いられる適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メイス・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ペンシルバニア州、第１７版（１９８５年）の中に見出される。薬剤送達のための方法に関する短いレビューについては、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照のこと。

医薬組成物を、例えば局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与を含む、投与の任意の適切な様式に対して調合可能である。皮下注射などの非経口投与においては、担体は、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含有する。経口投与においては、任意の上記担体またはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、およびマグネシウムカーボネートなどの固体担体を使用可能である。生分解性ミクロスフィア（例えば、ポリ乳酸塩、ポリグリコール酸塩）を本発明の医薬組成物における担体としても使用可能である。適切な生分解性ミクロスフィアは、例えば米国特許第４，８９７，２６８号明細書および米国特許第５，０７５，１０９号明細書に開示されている。

一般に、医薬組成物は非経口投与、例えば静脈内投与される。したがって、本発明は、許容できる担体、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝用水、生理食塩水、ＰＢＳなどの中に溶解または懸濁される化合物を含有する非経口投与用組成物を提供する。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、浸潤剤、洗浄剤など、生理的条件に近づけるのに必要な医薬的に許容できる補助剤を含有しうる。

これらの組成物は、従来の滅菌技術により殺菌可能であるか、または無菌濾過可能である。得られる水溶液は、使用においてそのままパッケージング可能であるか、または凍結乾燥可能であり、ここで凍結乾燥された調製物は投与に先立ち無菌の水性担体と結合される。製剤のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９および最も好ましくは７〜８ということになる。

一部の実施形態では、本発明のグリコペプチドを標準の小胞形成脂質から形成されるリポソームに取り込むことが可能である。リポソームを調製するため、例えばスゾカ（Ｓｚｏｋａ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、米国特許第４，５０１，７２８号明細書および米国特許第４，８３７，０２８号明細書に記載のように種々の方法の利用が可能である。種々の標的化剤（例えば本発明のシアリルガラクトシド）を用いるリポソームの標的化は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号明細書および米国特許第４，６０３，０４４号明細書を参照）。

標的化剤をリポソームに共役するための標準的方法を用いてもよい。これらの方法は、一般にホスファチジルエタノールアミンなどの脂質成分のリポソームへの取り込みを含み、同成分は標的化剤または本発明の脂質−誘導体化グリコペプチドなどの誘導体化された親油性化合物を付着するために活性化されうる。

標的化機構では、一般に、標的部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用において使用可能な方法で標的化剤がリポソーム表面上に位置づけられる必要がある。本発明の炭水化物を、リポソームが当業者に既知の方法を用いて形成される前に脂質分子に付着させることが可能である（例えば、長鎖アルキルハロゲン化物または脂肪酸で炭水化物上に見られる水酸基の各アルキル化またはアシル化）。あるいは、リポソームを、コネクタ部分がまず膜の形成時に膜に取り込まれるような方法で構築することが可能である。コネクタ部分は親油性部分を有する必要があり、同部分は膜内に強固に埋め込まれるとともに固定される。それはまた反応性部分を有する必要があり、同部分はリポソームの水性表面上で化学的利用が可能である。反応性部分は、標的化剤または炭水化物と安定な化学結合を形成するのに化学的に適するように選択され、後に付加される。ある場合には、標的剤をコネクタ分子に直接付着することは可能であるが、たいていの場合、第３の分子を用いて化学的架橋として作用させることにより、膜に内在するコネクタ分子を小胞表面から外部に三次元的に延在した標的剤または炭水化物と連結することの方が適切である。

本発明の方法により調製される化合物には、診断試薬としての用途を見出すことも可能である。例えば、標識化合物を用いることで、炎症を有する疑いがある患者における炎症または腫瘍転移の領域の位置が示される。この用途においては、化合物を^１２５Ｉ、^１４Ｃ、または三重水素で標識してもよい。

本発明の医薬組成物中で用いられる活性成分は、骨髄細胞における網状赤血球および赤血球の生成増大を誘発する生物学的特性を有するグリコＰＥＧ化エリスロポエチンおよびその誘導体である。

本発明の製剤は、慢性腎不全患者、ジドビジン（ｚｉｄｏｖｉｄｉｎｅ）で治療されたＨＩＶ感染患者、および化学療法中の癌患者に関連した貧血を含む様々な形態の貧血など、赤血球生成の低さまたは欠陥により特徴づけられる血液疾患の治療における非経口製剤として有用である。それはまた、鎌型赤血球病、β−サラセミア、嚢胞性線維症、妊娠および月経不順、未熟児早期貧血、脊髄障害、宇宙飛行、急性失血、老化など、血液学的不整（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｔｙ）における種々の病状、障害および症状の治療における適用を有しうる。好ましくは、本発明のＥＰＯ組成物は非経口投与される（例えばＩＶ、ＩＭ、ＳＣまたはＩＰ）。有効用量が、治療される症状および投与経路に応じて大幅に変化すると想定されるが、活性物質の約０．１（約７Ｕ）〜１００（約７０００Ｕ）μｇ／ｋｇ体重の範囲内であると想定される。貧血症状の治療における好ましい用量は、週に３回、約５０〜約３００単位／ｋｇである。本発明がインビボで増大した滞留時間を有するエリスロポエチンを提供することから、本発明の組成物が投与される場合、上記用量は場合により低下する。

別の実施形態では、本発明は、治療を必要とする被験者における組織損傷を治療する方法を提供する。典型的な損傷は、虚血、外傷、炎症または毒性物質との接触に起因する損傷により特徴づけられるものを含む。本方法は、被験者における組織損傷を改善するのに有効な量の本発明の高分子修飾エリスロポエチンペプチドを被験者に投与するステップを含む。保護または治療の典型的なクラスは、神経保護（例えば、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の変性神経障害の治療）を含む。組織保護においてＥＰＯを用いる方法は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，５３１，１２１号明細書を参照のこと。本発明の修飾ＥＰＯは、腎機能障害、癌、および網膜症などの疾患を有する患者の治療においても用いられる。さらなる典型的な実施形態では、本方法で用いられるＥＰＯペプチドは、赤血球を生成しないまたは本質的に赤血球を生成しない活性ペプチドである。

本発明の組成物の調製に用いられる種における調製方法が、一般に、様々な特許公報、例えば米国特許出願公開第２００４／０１３７５５７号明細書、国際公開第０４／０８３２５８号パンフレットおよび国際公開第０４／０３３６５１号パンフレットにて示される。本発明の接合体および方法を例示するものの特許請求される発明を限定しないものとして、以下の例が提供される。

エリスロポエチン製剤
本発明の態様は、本発明の高分子修飾ＥＰＯペプチドを含有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）製剤を提供する。通常、本発明のＥＰＯ製剤は、例えばＥＰＯペプチド濃度に基づき、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの本発明の高分子修飾ＥＰＯペプチドを含有する。あるいは、本発明のＥＰＯ製剤は、少なくとも約１０単位、５０単位、もしくは１００単位／μｇの本発明の高分子修飾ＥＰＯペプチドまたは少なくとも約１０００単位、２０００単位、もしくは５０００単位／μｇのＥＰＯペプチドを含有する。

一実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は実質的に安定であり、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による測定によると、それが有する凝集は最小レベルまたは検出不能なレベルである。例えば、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集は、ＳＥＣによる測定によると、５℃、１８℃、または室温、例えば３０℃までで１、２または３か月までにわたり全く検出可能なレベルではない。あるいは、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集は、ＳＥＣによる測定によると４０℃で３週、４週、または５週までにわたり２５％、２２％、２０％、１５％、１０％、８％、５％、３％、２．５％、または１．５％未満である。

本発明によると、ＥＰＯ製剤の安定性は、製剤中のトリ−＋テトラ−ＰＥＧ化ＥＰＯペプチド、すなわちＰＥＧ部分を含有する修飾シアル酸部分が製剤中のＥＰＯペプチド上のグリコシル残基の３つまたは４つの分岐に付着される場合における分布によっても測定可能である。一実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると、５℃、１８℃、または室温、例えば３０℃までで３週、４週、５週、２か月、または３か月までにわたり２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％未満減少する。別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量における減少は全く顕著なものではなく、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると５℃で３か月までにわたり１％、０．５％、０．１％、０．０５％未満、または０％である。

通常、本発明のＥＰＯ製剤における安定性は、本発明の高分子修飾ＥＰＯペプチドの濃度に関連する。製剤中の高分子修飾ＥＰＯペプチドの濃度が上昇するにつれ、凝集のレベルが高くなる。高分子修飾ＥＰＯペプチドの凝集を、ｐＨを例えば約６．５で制御することにより低下させてもよい。一実施形態では、製剤中のＥＰＯペプチドの濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ以下である場合、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集はＳＥＣによる測定によると５℃または室温まで、例えば３０℃で３か月までにわたり全く検出可能なレベルではないか、あるいは本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集はＳＥＣによる測定によると４０℃で５週までにわたり３％、２．６％、１．６％または１．５％未満である。別の実施形態では、製剤中のＥＰＯペプチドの濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ以下である場合、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると、５℃、室温、例えば３０℃または４０℃で５週または３か月までにわたり８％、６．８％、６％、５％、４％、２．７％、１．６％、１％、０．９％、０．５％、０．１％未満、または０％減少する。

さらに別の実施形態では、製剤中のＥＰＯペプチドの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以下である場合、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集はＳＥＣによる測定によると５℃で３か月までにわたり全く検出可能なレベルではないか、あるいは本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集はＳＥＣによる測定によると４０℃で５週までにわたり２５％、２２％、１５％、１０％、９％、または８％未満である。さらに別の実施形態では、製剤中のＥＰＯペプチドの濃度が０．５ｇ／ｍｌ以下である場合、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると、５℃、室温、例えば３０℃または４０℃で５週または３か月までにわたり１５％、１２％、１１．１％、５．８％、５．７％、６．２％、１．７％、１．２％、０．６％、０．１％未満、または０％減少する。

ＥＰＯ製剤の安定性は、ＥＰＯ製剤のｐＨ範囲にも関連しうる。一実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集は、ＥＰＯ製剤のｐＨがそれぞれ５．５、６、または６．５である場合、ＳＥＣによる測定によると４０℃で５週までにわたり２．６％、１．６％、または１．５％未満である。別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集は、ＥＰＯ製剤のｐＨがそれぞれ５．５、６、または６．５である場合、ＳＥＣによる測定によると３０℃で３か月までにわたり４．６％、１．８％、または０．９％未満である。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集は、ＥＰＯ製剤のｐＨがそれぞれ５．５、６、または６．５である場合、ＳＥＣによる測定によると４０℃で５週までにわたり２２．２％、９．８％、または８．１％未満である。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有する凝集は、ＥＰＯ製剤のｐＨが約５．５〜約６．５、例えばｐＨが５．５、６、または６．５である場合、ＳＥＣによる測定によると５℃または室温、例えば３０℃で３か月までにわたり検出不能なレベルである。

さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＥＰＯ製剤のｐＨがそれぞれ５．５、６、または６．５である場合、ＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると４０℃で５週までにわたり６．８％、２．７％、または１．６％未満減少する。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＥＰＯ製剤のｐＨが約５．５〜約６．５、例えばｐＨが５．５、６、または６．５である場合、その減少は全く顕著なものではなく、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると５℃で３か月までにわたり１％、０．５％、０．１％、０．０５％未満、または０％である。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＥＰＯ製剤のｐＨがそれぞれ５．５、６、または６．５である場合、ＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると室温、例えば３０℃で３か月までにわたり６％、０．９％未満、または０％減少する。

さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＥＰＯ製剤のｐＨがそれぞれ５．５、６、または６．５である場合、ＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると４０℃で５週までにわたり１１．１％、５．８％、または５．７％未満減少する。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＥＰＯ製剤のｐＨが約５．５〜約６．５、例えばｐＨが５．５、６、または６．５である場合、その減少は全く顕著なものではなく、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると５℃で３か月までにわたり１％、０．５％、０．１％、０．０５％未満、または０％である。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤が有するトリ−＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ含量は、ＥＰＯ製剤のｐＨがそれぞれ５．５、６、または６．５である場合、ＲＰ−ＨＰＬＣによる測定によると室温、例えば３０℃で３か月までにわたり６．２％、１．７％、または１．２％未満減少する。

本発明の別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は約４〜約８、約５〜約７または約５．５〜約６．５のｐＨ範囲を有する。一般に、本発明のＥＰＯ製剤のｐＨ範囲は、製剤で用いられる緩衝液系に関連するが、後に考察のように、ｐＨ範囲は製剤中の種々の他の成分、例えば等張化剤によっても影響を受けることになる。一実施形態では、酢酸塩緩衝液が製剤にて用いられる場合、ＥＰＯ製剤のｐＨ範囲は約５．５である。別の実施形態では、クエン酸塩緩衝液が用いられる場合、ＥＰＯ製剤のｐＨ範囲は約６〜約６．５である。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は、例えば約５ｍＭ〜約１Ｍ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭまたは約５ｍＭ〜約２０ｍＭの緩衝液を含有する。一般に、本発明のＥＰＯ製剤の調製において選択される緩衝液は、酢酸塩、カーボネート、クエン酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩およびトリスを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の任意の数の塩を含有しうる。特に、クエン酸塩緩衝液および界面活性剤を含有する製剤は、凝集や加水分解に対する優れた安定性などの所望の特性を有する。一部の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液およびより好ましくは約５ｍＭ〜約２５ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含有する。典型的なＥＰＯ製剤は、約１０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含有する。コハク酸塩を含有する製剤はクエン酸塩製剤よりも酸化される傾向があまり高くない点で有用である。

一実施形態では、ＥＰＯ製剤の調製における緩衝液は、約４〜約８のｐＨ範囲の、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩またはコハク酸塩である。別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤用の緩衝液は、約５．５〜約６．５のｐＨ範囲の、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩またはコハク酸塩である。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤中の緩衝液は、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度の酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムである。本明細書で開示される任意の緩衝液をＥＰＯ製剤中で単独使用または併用してもよい。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は、例えば製剤の張力を等張性に調整する１種または複数種の等張化剤を含有する。一実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤に適する等張化剤は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、ヒスチジン、アルギニン、およびグリシンを含むがこれらに限定されない任意の適切な作用物質でありうる。別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤における等張化剤は、例えば約７０ｍＭ〜約１５０ｍＭの塩化ナトリウムである。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤における等張化剤は、例えば０ｍＭ超〜約３００ｍＭ、約６５ｍＭ〜約１２０ｍＭのスクロースである。本発明の典型的な実施形態では、塩化ナトリウムとスクロースの双方が、ＥＰＯ製剤の安定性に対する相乗効果を意図して等張化剤として用いられる。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は、例えば約０．００１％〜１％、約０．０１％〜約０．５％、または約０．００５％〜約０．０１％の１種または複数種の界面活性剤を含有する。一実施形態では、ＳＤＳ、ポリソルベートまたはプルロニックなどの界面活性剤が本発明のＥＰＯ製剤中で用いられる。別の実施形態では、例えば約０．００５％〜約０．０１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０としても知られる）が本発明のＥＰＯ製剤中で用いられる。Ｔｗｅｅｎ−２０および緩衝液を含有する製剤は、特に望ましい特性を有し、その凝集および加水分解速度の観点で優れた安定性を示す。本発明の一部の実施形態では、約０．００１％〜約０．１％のＴｗｅｅｎ−２０が用いられる。より好ましくは、約０．００５％〜約０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０が本発明のＥＰＯ製剤中で用いられ、かつ典型的な実施形態では、約０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０が用いられる。さらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は、界面活性剤として約１％〜約２０％の範囲の量のＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を含有する。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は少なくとも１種の安定剤を含有する。安定剤により、折り畳まれた状態のタンパク質が、当該技術分野で既知の種々の機構、例えば選択的水和、折り畳まれていない種の疎水性パッチのマスキング、分子間イオン相互作用の阻害、タンパク質分子への結合、または空気／液体界面への暴露の間におけるタンパク質分子の酸化の阻止により安定化しうる。本発明の実施形態にて使用可能な安定剤の例として、二糖類、アミノ酸、グリセロール、アルブミンまたはＰＥＧが挙げられる。目的の典型的なアミノ酸には、グリシン、リジン、ヒスチジン、およびアルギニンが挙げられる。本発明の一部の実施形態では、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭのアミノ酸が用いられる。任意のこれらの安定剤をＥＰＯ製剤中で単独使用または併用してもよい。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は、ＥＤＴＡまたはペンテト酸などの金属キレート剤を含有する。ＥＰＯ製剤中での金属キレート剤の存在は、タンパク質を金属イオンを含む酸化およびそれに起因する分解から保護しうる。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は抗酸化剤を含有する。例えば、抗酸化剤の存在は、ＥＰＯ製剤の酸化の度合いを低減し、その分解を低減しうる。本発明の実施形態にて使用可能な抗酸化剤の例として、アスコルビン酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）、システイン、メチオニン、チオグリセロールまたはチオグリコール酸が挙げられる。

本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＥＰＯ製剤は、長期の保存および処理の期間における製剤中での微生物の成長を阻止する抗菌防腐剤を含有する。

本発明の接合体および方法を例示するために以下の実施例が提供されるが、特許請求される発明を限定するものではない。

実施例１
システイン−ＰＥＧ_２（２）の調製

１．１ 化合物１の合成
水酸化カリウム（粉末として８４．２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で無水メタノール（２０Ｌ）中のＬ−システイン（９３．７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで分子量２０キロダルトン（Ｔｓ；１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ−Ｏ−トシレートを数回に分けて２時間かけて添加した。混合物を室温で５日間撹拌し、回転蒸発により濃縮した。残留物を水（３０ｍＬ）で希釈し、室温で２時間撹拌し、任意の過剰な２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−トシレートを破壊した。次いで、溶液を酢酸で中和し、ｐＨをｐＨ５．０に調整し、逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラム上に充填した。カラムをメタノール／水の勾配で溶出させ（約７０％メタノールで生成物を溶出）、溶出生成物を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を回収し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクロマトグラフにかけ（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧビーズ、３００ｍＬ、水酸化物形態；水の勾配を水／酢酸−０．７５Ｎ）、適切な画分のｐＨを酢酸を用いて６．０に低下させた。次いで、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上で捕捉し、上記のメタノール／水の勾配で溶出した。生成物画分を貯蔵し、濃縮し、水中に再溶解し、凍結乾燥して４５３ｍｇ（４４％）の白色固体（１）を得た。化合物における構造データは以下の通りであった。^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）δ２．８３（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ_２−Ｓ）、３．０５（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．１８（ｑ、１Ｈ、（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３８（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３Ｏ）、３．７（ｔ、ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）、３．９５（ｑ、１Ｈ、ＣＨＮ）。生成物の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥにより確認した。

１．２ 化合物２（システイン−ＰＥＧ２）の合成
トリエチルアミン（約０．５ｍＬ）を、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）中に溶解した化合物１（４４０ｍｇ、２２μｍｏｌ）の溶液に溶液が塩基性になるまで滴下添加した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）中の２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（６６０ｍｇ、３３μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシサクシニミド（３．６ｍｇ、３０．８μｍｏｌ）の溶液を数回に分けて室温で１時間かけて添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、溶媒を回転蒸発により除去し、残留物を水（１００ｍＬ）中に溶解し、ｐＨを１．０Ｎ ＮａＯＨを用いて９．５に調整した。塩基性溶液を室温で２時間撹拌し、次いで酢酸を用いてｐＨ７．０に中和した。次いで、溶液を逆相クロマトグラフィー（Ｃ−１８シリカ）カラム上に充填した。カラムをメタノール／水の勾配で溶出させ（約７０％メタノールで生成物を溶出）、溶出生成物を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を回収し、水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクロマトグラフにかけ（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧビーズ、３００ｍＬ、水酸化物形態；水の勾配を水／酢酸−０．７５Ｎ）、適切な画分のｐＨを酢酸を用いて６．０に低下させた。次いで、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上で捕捉し、上記のメタノール／水の勾配で溶出した。生成物画分を貯蔵し、濃縮し、水中に再溶解し、凍結乾燥して５７５ｍｇ（７０％）の白色固体（２）を得た。化合物における構造データは以下の通りであった。^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）δ２．８３（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ_２−Ｓ）、２．９５（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ_２−Ｓ）、３．１２（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３Ｏ）、３．７１（ｔ、ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）。生成物の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥにより確認した。

実施例２
以下の例は、昆虫細胞内で発現されるＥＰＯペプチドを修飾する方法について詳述する。

１ポットでのＧｎＴ１およびＧａｌＴ１反応
２．１ １ポットでの反応
１ポットでのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１およびガラクトーストランスフェラーゼ−１反応を、５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．０２％ナトリウムアジド、３０ｍＵ／ｍＬの精製ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１、２００ｍＵ／ｍＬの精製ガラクトーストランスフェラーゼ−１および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５またはＭＥＳ ｐＨ６．５の中で昆虫由来のＥＰＯ（１ｍｇ／ｍＬ）を３２℃で１６時間インキュベートすることにより実施した。

２．２ スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５上でのＥＰＯの精製
スーパーデックス７５カラムを、流速５ｍＬ／分、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液 ｐＨ６．５の中で平衡化した。ステップ２．１（上記）から得たＥＰＯ生成物をカラム上に充填し、平衡化緩衝液で溶出した。溶出液における２８０ｎｍでの吸光度および伝導度について監視した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてどの貯蔵されたピーク画分がＥＰＯを含有するかを判定し、次の実験にてそれを用いた。

２．３ ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ反応
ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ反応を、０．５ｍＭ ＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸−２０キロダルトン−ＰＥＧ、０．０２％ナトリウムアジド、２００ｍＵ／ｍＬの精製ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５またはＭＥＳ ｐＨ６．５の中で１ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ−Ｇａｌ（ステップ２．２から得たもの、上記）を３２℃で１６時間インキュベートすることにより実施した。

実施例３
１ポットでのＧｎＴ１、ＧａｌＴ１およびＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ（ＣＭＰ−ＮＡＮ−２０ＫＰＥＧ使用）反応
昆虫細胞内で発現されたＥＰＯ（１ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ６．５の中の糖ヌクレオチドおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸−２０Ｋｄ ＰＥＧを有する３０ｍＵ／ｍＬのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１、２００ｍＵ／ｍＬのガラクトーストランスフェラーゼ−１および５００ｍＵ／ｍＬのＳＴ３ＧａｌＩＩＩとともにインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。２ステップの酵素的再構築反応にて得られた結果と同様、３つのバンドのＰＥＧ化ＥＰＯが１ポットの３種の酵素製剤中に見られる。

実施例４
二分岐ＰＥＧ−ＥＰＯの生成
４．１ ＧｌｃＮＡｃのｒＥＰＯへの付加
ｐＨ７．２での０．１Ｍトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２および０．０２％ナトリウムアジドの中の昆虫細胞（１ｍｇ／ｍＬ）内で発現された組換えＥＰＯを、３ｍＭ ＵＳＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５０ｍＵ／ｍｇのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１および５０ｍＵ／ｍｇのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−ＩＩとともに３２℃で２４時間インキュベートした。

４．２ ガラクトースの添加
ステップ８．１（上記）のＧｌｃＮＡｃ標識ペプチドに、３ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌおよび０．２Ｕ／ｍｇのガラクトーストランスフェラーゼ−１を添加した。混合物を３２℃で３６時間インキュベートした。ガラクトシル化された生成物を、トリス−緩衝生理食塩水中、スーパーデックス７５カラム上でゲル濾過クロマトグラフィーにより単離した。精製生成物を１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

４．３ シアル酸またはシアル酸ＰＥＧの添加
ｐＨ７．２での０．１Ｍトリス、０．１Ｍ ＮａＣｌの中のステップ４．２（上記）から得たガラクトシル化された生成物（１ｍｇ／ｍＬ）を、２００ｍＵ／ｍｇのＳＴ３ＧａｌＩＩＩおよび０．５ｍＭのＣＭＰ−シアル酸またはＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（ＰＥＧが５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは３０ｋＤａの分子量を有する場合）とともに３２℃で２４時間インキュベートした。

実施例５
ＣＳＴ−ＩＩによるＮ−連結の３０ＫのＰＥＧ化
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞（５ｍｇ、０．１６６μｍｏｌ、５ｍＬ）内で発現された、グリコシル化されたＥＰＯを濃縮し、緩衝液をトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＣａＣｌ_２＋０．００５％ ＮａＮ_３）と交換して最終容量を５ｍＬにした。次いで、ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（３０キロダルトン、２５ｍｇ、０．８３３μｍｏｌ；３０ＫダルトンのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧの構造については図３Ｂを参照）、０．２５ｍＬ、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．２５ｍＬ、およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来の二官能性シアリルトランスフェラーゼ、ＣＳＴ−ＩＩ（１．４Ｕ／ｍＬ、０．５ｍＬ、０．７Ｕ）を添加した。生成混合物を３２℃で４８時間振とうした。

反応終了時、混合物を限外濾過により１ｍＬの最終容量にまで濃縮し、次いで緩衝液を２５ｍＭ ＮａＯＡｃ＋０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−８０（ｐＨ６．０）と交換して２．５ｍＬにした。溶出剤として２５ｍＭ ＮａＯＡｃ＋２Ｍ ＮａＣｌ＋０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−８０（ｐＨ６．０）を用い、Ｑ−セファロース（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＩＥＸクロマトグラフィーを実施した。ピーク２を回収し、限外濾過により１．５ｍＬにまで濃縮し、次いで溶出剤として１ＸＰＢＳ（ｐＨ５．５＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）を用い、スーパーデックス−２００での精製（カラム：スーパーデックス２００、１６／６０ＧＬ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を施した。ピーク２を回収し、１．５ｍＬにまで濃縮した。この生成物質を無菌濾過し、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ（０．７５％ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用いて２．５ｍＬの最終容量になるまで調合した。タンパク質濃度２６４μｇ／ｍＬ；６６０μｇのタンパク質を得た（ＢＣＡ測定）。

実施例６
以下の実施例は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いてＯ−連結の４０キロダルトンＰＥＧに連結したＥＰＯを調製するための方法を例示する。

６．１ 脱シアリル化
このステップでは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）内で成長したＥＰＯを脱シアリル化した。ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ結合は、下記ステップ６．２では修飾シアル酸ＰＥＧの転移におけるアクセプタとしての役割を果たす。

ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現された、グリコシル化されたＥＰＯ溶液１０ｍＬ（１０ｍｇ、０．３３μｍｏｌ）はトリス緩衝液（２０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ７．２）で緩衝液交換し、１０ｍＬの最終容量を得た。次いで、アルスロバクター・ウレアファキエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）由来の７５０ｍＵの２、３、６、８−ノイラミダーゼを溶液に添加した。生成混合物を３２℃で４８時間振とうした。このステップの生成物をプロトコルの次のステップにて直接用いた（下記参照）。

６．２ Ｏ−連結の４０ＫのＰＥＧ化
このステップでは、ＳＴ３Ｇａｌ２を用い、修飾シアル酸−ＰＥＧ部分を上記ステップ６．１から得た脱シアリル化されたＥＰＯに転移させる。

ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（４０キロダルトン、３３ｍｇ、０．８２５μｍｏｌ；４０キロダルトンのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの構造については図３Ａを参照）、Ｏ−グリカンに特異的なシアリルトランスフェラーゼ（１．４Ｕ／ｍＬ、３００ｍＵ）（ＳＴ３ＧａｌＩまたはＳＴ３ＧａｌＩＩ）、および０．２５ｍＬの１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２を上記混合物の半分に添加した。この混合物を３２℃で４８時間振とうした。４８時間後、反応混合物を限外濾過（ＭＷＣＯ ５Ｋ）により２．８ｍＬにまで濃縮し、次いで緩衝液を２５ｍＭ ＮａＯＡｃ＋０．００１％ Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ６．０）と交換して最終容量を３ｍＬにした。最終生成物をＳＰ（５ｍＬ）上で３回（３回の注入、各々１ｍＬ）イオン交換精製した。ＰＥＧ化ＥＰＯ（ピーク２）を回収し、限外濾過により濃縮し、ＳＥＣ精製において最終容量を２ｍＬにした。スーパーデックス２００上での精製により、反応の最終ステップにおいて所望のタンパク質：ＥＰＯ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ（４０Ｋ）の解像度が得られた。

６．３ ＣＨＯ−ＥＰＯ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ（４０Ｋ）の末端シアリル化
プロセスのこのステップでは、シアル酸を修飾シアル酸残基を担持しないグリコシル構造の末端に付加した。

結合されたＰＥＧ化ＥＰＯ（上記ステップｂにおける反応物から約２ｍｇ）を限外濾過（ＭＷＣＯ ５Ｋ）により濃縮し、次いで緩衝液をトリス緩衝液（０．０５Ｍトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＣａＣｌ_２＋０．００５％ＮａＮ_３）と交換し、最終容量を２ｍＬにした。次いで、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ；１．５ｍｇ、２．４μｍｏｌ）、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（８．９Ｕ／ｍＬ、１０μｌ、０．０８９Ｕ）および５０μｌの１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２を添加した。生成混合物を３２℃で２４時間振とうし、次いで１ｍＬの最終容量になるまで濃縮した。この溶液に、溶出剤として１ＸＰＢＳ（ｐＨ５．５＋０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−８０）を用い、スーパーデックス２００での精製を直接施した。ピーク１を回収し、１０ｍＬに希釈した。タンパク質濃度は５２．８ｕｇ／ｍＬであった（ＢＣＡ）。全体で５２８μｇのタンパク質を得た。

実施例７
この実施例では、静脈内投与した、ＣＨＯに由来するＥＰＯとＣＨＯに由来するＥＰＯのグリコＰＥＧ化変異体の薬物動態特性をＥＬＩＳＡアッセイを用いて比較した。

ＣＨＯに由来するＥＰＯの２つの非ＰＥＧ化バッチ、本発明の方法によって生成した３０ＫのＰＥＧ化されたＣＨＯに由来するエリスロポエチン、および本発明の方法によって生成した４０ＫのＰＥＧ化されたＣＨＯに由来するエリスロポエチンにおける薬物動態を、ラットへの単回で３０μｇ／ｋｇの静脈内投与後にＥＬＩＳＡにより比較した。測定は、ユウロピウム検出を用いる一般に認められたＥＬＩＳＡ手順に従った。

７．１ 結果
各プレート由来の標準タンパク質からのユウロピウムの計数値を用い、標準線形回帰曲線および方程式を生成した。方程式を用い、各試料ウェルにおいてユウロピウム計数値をそれに相当するＥＰＯ量に変換した。

結果を図６に示す。検出限界は、非ＰＥＧ化ＥＰＯについては約０．４ｎｇ／ｍＬおよび３０キロダルトンおよび４０キロダルトンのＰＥＧ化ＥＰＯの双方については約０．８ｎｇ／ｍＬである。

実施例８
この実施例では、皮下投与した、ＣＨＯに由来するエリスロポエチン（ＥＰＯ）、高グリコシル化された非グリコＰＥＧ化ＥＰＯ、昆虫細胞で成長されたグリコＰＥＧ化ＥＰＯ、およびＣＨＯ細胞に由来するグリコＰＥＧ化ＥＰＯの薬物動態特性をＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。

非グリコＰＥＧ化されたＣＨＯに由来するＥＰＯ、非ＰＥＧ化され高グリコシル化されたＣＨＯに由来するＥＰＯ、グリコＰＥＧ化された昆虫細胞に由来するＥＰＯ；１０ＫのＮ−連結のＰＥＧ化された昆虫細胞に由来するエリスロポエチン、および４０キロダルトンのＯ−連結のＰＥＧ化されたＣＨＯに由来するエリスロポエチンの薬物動態を、ラットへの単回で１０μｇ／ｋｇの皮下投与後にＥＬＩＳＡにより比較した。

８．１薬物動態学的結果
これらの実験結果を図８に示し、ＥＰＯのｎｇ／ｍＬでの平均量およびラット血清試料における各ＥＰＯ変異体群に対する注射_{時間＝０時間}後の異なる時点での標準偏差を示す。非ＰＥＧ化ＥＰＯおよびＰＥＧ化ＥＰＯにおける検出限界は約０．３ｎｇ／ｍＬである。

実施例９
精製した１０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯおよび２０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯを、アミコン−ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ−ｕｌｔｒａ）−４限外濾過チューブを４℃、３，０００ｇで用い、１ｍｇ／ｍｌに回転濃縮（ｓｐｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）した。次いで、それらを１０倍の２０ｍＭの万能緩衝液（４ｍＭのグリシン、４ｍＭのクエン酸、４ｍＭのヘペス（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）、４ｍＭのＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリン］エタンスルホン酸一水和物）および４ｍＭのトリス塩酸塩（トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタンＨＣｌ）（フィッシャー（ｆｉｓｈｅｒ）、ロット番号０４０６６５）をｐＨ４〜ｐＨ８に調整）に希釈し、ｐＨ４〜ｐＨ８のｐＨ範囲、各々０．５単位を有する０．１ｍｇのＰＥＧ−ＥＰＯを取得した。

次いで、溶液を０．２２μｍのシリンジフィルタ（ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）−ＧＶ）を通して濾過し、５００μｌの分割量を２ｍｌのＨＰＬＣバイアル内に満たした。次いで、異なるｐＨを有するＰＥＧ−ＥＰＯ試料を５℃および４０℃インキュベーター内に入れた。２週目および４週目の時点で、ＰＥＧ−ＥＰＯの安定性をＵＶスキャン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ）により分析した。

吸収スペクトルを、１０ｍｍのキュベットおよび４６２６ｎｍ／分の走査速度を用い、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製ウルトラスペック４３００プロスペクトロスコピー（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ４３００ ｐｒｏ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）により取得した。ＰＥＧ−ＥＰＯの濃度を、方程式

を用い、ＵＶ_２８０での吸収により判定した。

ＵＶスキャン実験の結果は、５℃および４０℃での２週間のインキュベーション後、タンパク質の欠損は全く有意でないことを示した。

実施例１０
１０Ｋおよび２０ＫのＥＰＯ−ＰＥＧ試料を４０℃で０、２および４週間インキュベートし、インキュベートした試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験では、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した４〜２０％のトリス−グリシンポリアクリルアミドゲルを用いた。つまり、４Ｘローディング緩衝液１０μｌを３０μｌの試料と混合し、６０℃で５分間加熱した。次いで、混合物を室温まで冷却し、短時間の遠心分離により遠沈させた後、混合物３０μｌをゲルに負荷した。低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、１００ｍＭ ＤＴＴをローディング緩衝液に添加した。電気泳動を２００Ｖで１時間実行し、ゲルをセイフブルー（Ｓａｆｅｂｌｕｅ）クーマシー染色溶液で染色した。その後、ゲルを５％ ＢａＣｌ_２溶液に５分間漬けた後、１／１０Ｎヨウ素溶液４ｍｌを添加しヨウ素染色を行った。次いで、銀染色をワコ（ＷＡＫＯ）ＩＩ銀染色キットを用いて行った。

インキュベーション前、インキュベーションに先立つクーマシー、ヨウ素または銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいては分解されたバンドを全く観察できなかった。４０℃で２週間後、１０Ｋおよび２０Ｋの双方のＰＥＧ−ＥＰＯ試料において明確なｐＨ依存性の分解パターンが出現した。より低いｐＨ（４および５）では、６４Ｋと３６Ｋの間の明確なＭＷを有するバンドが観察された。１０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯ試料では、約４５Ｋの明確なＭＷを有するバンドが特に有意であった。ヨウ素染色では、それらのバンドでＰＥＧ分子の存在が示された。１０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯ試料においては２０Ｋの明確なＭＷを有するバンドおよび２０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯ試料においては４０Ｋの明確なＭＷを有するバンドがヨウ素染色ゲル中で観察された。それらがクーマシー染色または銀染色したゲル中に見られないという事実は、４０℃でインキュベートしたｐＨ４の試料中での遊離シアル酸−ＰＥＧの存在を示唆していた。異なる分解経路が、より高いｐＨ（７以上）の試料において見出された。ｐＨ７、７．５および８の１０Ｋの試料においては、凝集体バンドが明白であった。凝集体バンドが低下したゲル中で消失したことは、これらの凝集体バンドに関するジスルフィド結合の性質を示している。２０Ｋの試料のいずれにおいても、観察された凝集体バンドは全く有意ではなかった。２週目の試料に関しては、４週目の試料の場合と同じ傾向が観察された。要するに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、１０Ｋおよび２０Ｋの双方の試料中では５以下のｐＨで加水分解が生じ、１０Ｋの試料中では７以上のｐＨで凝集が生じることを示した。凝集については、２０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯは１０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯよりも安定であった。

実施例１１
ＲＰ−ＨＰＬＣをゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ−３カラム上で実行した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを、０．５ｍｌ／分の流速を有する移動相としてｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌを用い、ＴＳＫ Ｇ５０００ＰＷｘｌカラム上で実行した。

ＲＰ−ＨＰＬＣ実験では、様々なｐＨでの１０Ｋおよび２０Ｋの試料全部が４℃で同じＰＥＧ化特性を示した。しかし、４０℃でインキュベートした場合、より低ｐＨの試料（ｐＨ４、５）で有意な分解が生じた。一部のトリ−ＰＥＧ分子、すなわちＰＥＧ分子がグリコシル残基の３つの分岐に付着されるＮ−連結のＰＥＧ化アイソフォームが、保持時間が短縮したジ−ＰＥＧ／モノ−ＰＥＧまたは他の種に変換され、それは４０℃でインキュベートした低ｐＨの試料の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる遊離（非グリコシル化）ＰＥＧの観察結果と一致した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりｐＨが５以下または７以上の場合にＰＥＧ−ＥＰＯの不安定性が示されたことから、ｐＨ５．５、６および６．５の試料の結果を比較することに重点を置いた。

１０Ｋおよび２０Ｋの双方のＰＥＧ−ＥＰＯにおける４℃の試料中で凝集体は検出できなかった。ｐＨ５．５、６および６．５の試料中では、ｐＨ６およびｐＨ６．５の試料が有する凝集体はｐＨ５．５の試料の場合よりも少なかった。１０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯにおいては、ｐＨ６．５の試料中での凝集体のレベルはｐＨ６の試料中でのレベルよりも低かった。

実施例１２
１０ＫのＰＥＧ−ＥＰＯ製剤を、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０および６．５の、ＮａＣｌおよびＴｗｅｅｎ２０を有する酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）およびクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０および６．５）の中でさらに試験した。ＰＥＧ−ＥＰＯの数種の製剤における安定性について、様々な濃度および緩衝液、いくつかの温度にて試験した。試験対象のＰＥＧ−ＥＰＯ試料の濃度は０．２ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌであった。ＰＥＧ−ＥＰＯ試料を、０．００５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０を有するｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０を有するｐＨ６の１０ｍＭクエン酸塩／１３６ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０を有するｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸塩／１３６ｍＭ ＮａＣｌの３種のうちの１種の緩衝液中で試験した。ＰＥＧ−ＥＰＯ製剤（０．２ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌ）を、４℃、３０℃で３か月までの間および４０℃で５週までの間保存した。トリ＋テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯの分布を下記の表１および２に示す。

Ｔ＝５℃およびＴ＝３０℃で、製剤のうちでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出可能な凝集体またはクリップ（分解生成物）を示したものは全くなかった。Ｔ＝４０℃でのｐＨ６．５の製剤は、ｐＨ５．５およびｐＨ６の製剤よりも多量の共有結合凝集体ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出可能なクリップバンドを示した。

製剤中のＳＥＣ−ＨＰＬＣで検出された凝集体含量を表６および７に示す。ＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析した０．２ｍｇ／ｍｌの製剤においては５℃または３０℃で３か月後に凝集体が検出されなかった一方、４０℃で５週間でのｐＨ５．５、ｐＨ６およびｐＨ６．５の製剤において各々２．６％、１．６％、１．５％の凝集体が測定された。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析した０．５ｍｇ／ｍｌの製剤においては５℃で凝集体が検出されなかった一方、４０℃で５週間でのｐＨ５．５、ｐＨ６およびｐＨ６．５の製剤において各々２２．２％、９．８％、８．１％の凝集体が測定された。３０℃で３か月間、０．５ｍｇ／ｍｌの製剤について４．６％、１．８％および０．９％の凝集体が検出された。

実施例１３
ＰＥＧ−ＥＰＯ製剤の凍結融解および撹拌の間での安定性を試験するため、０．００５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０（０．４および０．２ｍｇ／ｍｌ）を伴う場合または０．００５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０（０．５８ｍｇ／ｍｌ）を伴わない場合でのｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でＰＥＧ−ＥＰＯを調製した。凍結融解サイクルを、試料を−２０℃での凍結と４℃での３回の融解により実行した。撹拌実験を、４℃または３０℃、２００ｒｐｍで１日、２日および６日かけて実施した。

ＰＥＧ−ＥＰＯ製剤は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験により判定したところ、凍結融解法サイクルおよび撹拌を通じて安定であった。Ｔｗｅｅｎ−２０を伴わない場合に調製した０．５８ｍｇ／ｍｌの試料の場合、６日間撹拌した結果、凝集体含量が０．４％増加した。他の試料においては全く分解が観察されなかった。

本明細書に記載の実施例および実施形態はあくまで図示目的であり、その観点での様々な改良または変化が、当業者に対して提示され、かつ本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることになると理解されている。本明細書で引用されるすべての出版物、特許および特許出願は、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。

図面の簡単な説明
本発明の実施において有用な典型的な修飾シアル酸ヌクレオチドを図示する。Ａ．典型的な分岐状（例えば３０ｋＤａ、４０ｋＤａ）ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ糖ヌクレオチドの構造。Ｂ．線状ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（例えば１０ｋＤａ）の構造。 チャイニーズハムスター卵巣細胞から単離された典型的なグリコＰＥＧ化ＥＰＯアイソフォームを図示したものである。Ａ．典型的なＯ−またはＮ−連結ＰＥＧ化グライコフォーム。Ｂ．昆虫細胞から単離され、再構築され、グリコＰＥＧ化された典型的なＥＰＯアイソフォームを図示したもの。図２Ａおよび図２Ｂは、任意のグリコシル化ＥＰＯ分子が１分岐、２分岐、または４分岐のＮ−連結グリコシル残基の任意の混合物を含む場合があり、かつ任意の１つまたは複数の分岐が修飾シアル酸部分をさらに含む場合がある点で典型的である。さらに、修飾グリカンを任意の１つまたは複数のＮ−またはＯ−連結グリコシル化部位に制限なく位置づけ可能である。各指数は０および１から独立して選択され、Ｒ^１５は本明細書に記載のとおりである。ペプチドは分岐状または線状ＰＥＧ部分を含む少なくとも１つのＲ^１５部分を含む。記号

が見られるこの図面や他の各図面では、それはペプチド鎖の表示において不連続であることを示し、図面の大きさに依存したものである。同表示はそれに続くライン上につながる。同記号はペプチド配列内での実際の切断を意味するものではない。
非グリコＰＥＧ化形態の典型的なＣＨＯに由来するＥＰＯペプチドを図示する。該図は、任意のグリコシル化ＥＰＯ分子が１分岐、３分岐、または４分岐のＮ−連結グリコシル残基の任意の混合物を含む場合があり、かつ任意の１つまたは複数の分岐が本発明の修飾シアル酸部分をさらに含む場合がある点で典型的である。さらに、該図は、修飾グリカンを任意の１つまたは複数のＮ−またはＯ−連結グリコシル化部位に制限なく位置づけ可能であることを図示する。 ２種のＣＨＯに由来する非グリコＰＥＧ化ＥＰＯ形態と２種の異なるＣＨＯに由来するグリコＰＥＧ化ＥＰＯ形態との薬物動態における比較実験の結果を示す。 本発明に記載の昆虫由来の、再構築され、グリコＰＥＧ化されたＥＰＯペプチドを図示する。 ＣＨＯに由来する非グリコＰＥＧ化ＥＰＯ形態、昆虫由来の非グリコＰＥＧ化ＥＰＯ形態と、それらの対応するグリコＰＥＧ化形態との薬物動態における比較実験の結果を示す。 培養物中でのＥＰＯ受容体を担持するＴＦ１細胞の増殖の刺激における、２種の形態の非グリコＰＥＧ化ＥＰＯ（ＡおよびＢ）に対する２種のグリコＰＥＧ化変異体（図２Ａおよび２Ｂにおける３０キロダルトンおよび４０キロダルトンの変異体）および高グリコシル化ＥＰＯ変異体の相対活性を示す。 様々な濃度の２種の非ＰＥＧ化ＥＰＯ変異体（ＡおよびＢ）および２種のグリコＰＥＧ化変異体（図２Ａおよび２Ｂにおける３０キロダルトンおよび４０キロダルトンの変異体）による、同位体標識されたＥＰＯの組換えキメラＥＰＯ受容体に対する結合の阻害を示す。 修飾シアル酸を有するグリコＰＥＧ化ペプチドに対して用いられるシアリルトランスフェラーゼを示す表である。 本発明の典型的な実施形態でのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ｋＤａにおける生成プロセスの概略図である。活性化ＰＥＧ試薬（ｍＰＥＧ−３０ｋＤａ−ニトロフェニルカーボネート）と修飾ＥＰＯペプチド（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）との反応後、反応生成物は、後続する精製ステップのためにタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＴ）カスケードを用いた限外濾過により脱塩および調整がなされる。第２のステップでペプチドがＱ−セファロース樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより精製され、、次いで、追加の限外濾過ステップを実施することで脱塩されたＥＰＯ−ペプチド溶液が得られる。最終ステップでは、生成物は凍結乾燥され、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ｋＤａが得られる。

Claims (73)

1. エリスロポエチンペプチドを含有するエリスロポエチン製剤であって、前記エリスロポエチンペプチドが前記ペプチドのアミノ酸残基に付着されるグリコシル連結基を含み、前記グリコシル連結基が、化学式
   

   

   （式中、
   Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＯ⁻またはＯＲ^７であり、
   Ｒ^７はＨ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを示し、
   Ｒ^３およびＲ^４はＨ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーであり、
   Ｒ^８およびＲ^９はＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択され、
   Ｌ^ａは結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり、
   Ｒ^１６およびＲ^１７は独立して選択される高分子アームであり、
   Ｘ^２およびＸ^４は、高分子部分Ｒ^１６およびＲ^１７をＣに連結する独立して選択される結合断片であり、
   Ｘ^５は非反応基である）
   を有する修飾シアリル残基を含み、かつ
   前記エリスロポエチン製剤が、５℃以下の温度で３か月後にＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定された前記エリスロポエチンペプチドの凝集の検出可能なレベルを全く示さないか、または
   前記エリスロポエチン製剤が、５℃以下の温度で３か月後にＲＰ−ＨＰＬＣにより測定されたトリ−およびテトラ−ＰＥＧエリスロポエチンペプチドの実質的な低下を全く示さない、エリスロポエチン製剤。
2. 前記部分
   

   

   が、
   

   

   （式中、
   ＱはＨおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択され、
   ｅおよびｆは１〜２５００から独立して選択される整数であり、かつ
   ｑは０〜２０の整数である）
   から選択されるメンバーである化学式を有する請求項１に記載の製剤。
3. 前記部分が、
   

   

   （式中、
   ＱはＨおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択され、
   ｅ、ｆおよびｆ’は１〜２５００から独立して選択される整数であり、かつ
   ｑおよびｑ’は１〜２０から独立して選択される整数である）
   から選択されるメンバーである化学式を有する請求項２に記載の製剤。
4. 前記グリコシルリンカーが化学式
   

   

   を有するグリコシル基を含む請求項１に記載の製剤。
5. 前記グリコシル基が化学式
   

   

   （式中、ｔは０または１である）
   を有する請求項４に記載の製剤。
6. 前記アミノ酸残基に付着される前記グリコシル連結基が化学式
   

   

   （式中、ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基である）
   を有する請求項５に記載の製剤。
7. 前記アミノ酸残基がセリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである請求項６に記載の製剤。
8. 前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項７に記載の製剤。
9. 前記アミノ酸残基が配列番号１の位置１２６のセリンである請求項８に記載の製剤。
10. 前記ペプチドが、アミノ酸残基に付着される少なくとも１つの前記グリコシル連結基を含み、前記グリコシル連結基が
    

    

    （式中、
    Ｒ^１５は前記修飾シアリル残基であり、かつ
    ｐは１〜１０の整数である）
    から選択される化学式を有するグリコシル基を含む請求項１に記載の製剤。
11. 前記ペプチドのアミノ酸残基に付着される前記少なくとも１つのグリコシル連結基が
    

    

    （式中、
    ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基であり、
    ｔは０または１に相当する整数であり、
    ｐは１〜１０の整数であり、かつ
    各Ｒ^１５’はＨ、ＯＨ、シアル酸、前記修飾シアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａ^ｐから独立して選択されるメンバーであり、ここで、
    Ｓｉａ^ｐは前記修飾シアリル残基であり、
    少なくとも１つのＲ^１５’は前記修飾シアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａ^ｐから選択されるメンバーである）
    およびこれらの組み合わせから選択される化学式を有する請求項１０に記載の製剤。
12. 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である請求項１１に記載の製剤。
13. 前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有し、ここで前記アミノ酸残基がＮ２４、Ｎ３８、Ｎ８３、およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーのアスパラギン残基である請求項１２に記載の製剤。
14. 前記グリコシル連結基がＮ２４に付着される請求項１３に記載の製剤。
15. 前記ペプチドがエリスロポエチン活性を示すエリスロポエチンペプチドである請求項１に記載の製剤。
16. 前記ペプチドが本質的にエリスロポエチン活性を示さない請求項１に記載の製剤。
17. 前記ペプチドが組織保護的である請求項１６に記載の製剤。
18. 緩衝液をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
19. 酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、およびトリスからなる群から選択される緩衝液をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
20. 前記緩衝液が酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、またはコハク酸塩である請求項１に記載の製剤。
21. 前記製剤のｐＨが約５〜約７である請求項１に記載の製剤。
22. 前記製剤のｐＨが約５．５〜約６．５である請求項１に記載の製剤。
23. 前記緩衝液が酢酸塩でありかつ前記製剤のｐＨが約５．５である請求項１に記載の製剤。
24. 前記緩衝液がクエン酸塩でありかつ前記製剤のｐＨが約６〜約６．５である請求項１に記載の製剤。
25. 前記緩衝液が約５ｍＭ〜約１００ｍＭである請求項１に記載の製剤。
26. 前記緩衝液が約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項１に記載の製剤。
27. 前記製剤の張力を等張性に調整する等張化剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
28. 塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、ヒスチジン、アルギニン、およびグリシンからなる群から選択される等張化剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
29. 塩化ナトリウムをさらに含有する請求項１に記載の製剤。
30. 界面活性剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
31. ＳＤＳ、ポリソルベートおよびプルロニクスからなる群から選択される界面活性剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
32. ポリソルベート２０をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
33. 約０．００１％〜１％の範囲内の界面活性剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
34. 約０．００５％〜約０．０１％の範囲内の界面活性剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
35. 安定剤、金属キレート試薬、抗酸化剤、または抗菌防腐剤をさらに含有する請求項１に記載の製剤。
36. 前記安定剤が二糖類、アミノ酸、グリセロール、アルブミン、およびＰＥＧからなる群から選択される請求項３５に記載の製剤。
37. 前記金属キレート試薬がＥＤＴＡまたはペンテト酸である請求項３５に記載の製剤。
38. 前記抗酸化剤がアスコルビン酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシルトルエン、システイン、メチオニン、チオグリセロール、およびチオグリコール酸からなる群から選択される請求項３５に記載の製剤。
39. 約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの前記エリスロポエチンペプチド、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム、約１００ｍＭ〜２００ｍＭの塩化ナトリウム、および約０．００５％〜約０．０１％のポリソルベート２０を含有する請求項１に記載の製剤。
40. エリスロポエチンペプチドを含有するエリスロポエチン製剤であって、前記エリスロポエチンペプチドが前記ペプチドのアミノ酸残基に付着されるグリコシル連結基を含み、前記グリコシル連結基が化学式
    

    

    （式中、
    Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＯ⁻またはＯＲ^７であり、
    Ｒ^７はＨ、置換もしくは非置換アルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキルを示し、
    Ｒ^３およびＲ^４はＨ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーであり、
    Ｒ^８およびＲ^９はＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択され、
    ｓは１〜２０の整数であり、
    ｆは１〜２５００の整数であり、かつ
    ＱはＨおよび置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである）
    を有する修飾シアリル残基を含み、かつ
    前記エリスロポエチン製剤が、５℃以下の温度で３か月後にＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定された前記エリスロポエチンペプチドの凝集の検出可能なレベルを全く示さないか、または
    前記エリスロポエチン製剤が、５℃以下の温度で３か月後にＲＰ−ＨＰＬＣにより測定されたトリ−およびテトラ−ＰＥＧエリスロポエチンペプチドの実質的な低下を全く示さない、エリスロポエチン製剤。
41. 前記修飾シアリル残基が化学式
    

    

    を有する請求項４０に記載の製剤。
42. ＱがＨおよびＣＨ_３から選択される請求項４０に記載の製剤。
43. 前記グリコシル連結基が化学式
    

    

    を有する請求項４２に記載の製剤。
44. ｓが１でありかつｆが約２００〜約３００の整数である請求項４３に記載の製剤。
45. 前記アミノ酸残基がセリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである請求項４０に記載の製剤。
46. 前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項４５に記載の製剤。
47. 前記アミノ酸残基が配列番号１の位置１２６のセリンである請求項４６に記載の製剤。
48. 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である請求項４０に記載の製剤。
49. 前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有し、かつ前記アミノ酸残基がＡｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３、およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーのアスパラギン残基である請求項４８に記載の製剤。
50. 前記グリコシル連結基がＡｓｎ２４に付着される請求項４９に記載の製剤。
51. Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３の各々がそれに付着される前記グリコシル連結基を有する請求項４９に記載の製剤。
52. 緩衝液をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
53. 酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、およびトリスからなる群から選択される緩衝液をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
54. 前記緩衝液が酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、またはコハク酸塩である請求項４０に記載の製剤。
55. 前記製剤のｐＨが約５〜約７である請求項４０に記載の製剤。
56. 前記製剤のｐＨが約５．５〜約６．５である請求項４０に記載の製剤。
57. 前記緩衝液が酢酸塩でありかつ前記製剤のｐＨが約５．５である請求項４０に記載の製剤。
58. 前記緩衝液がクエン酸塩でありかつ前記製剤のｐＨが約６〜約６．５である請求項４０に記載の製剤。
59. 前記緩衝液が約５ｍＭ〜約１００ｍＭである請求項４０に記載の製剤。
60. 前記緩衝液が約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項４０に記載の製剤。
61. 前記製剤の張力を等張性に調整する等張化剤をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
62. 塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、ヒスチジン、アルギニン、およびグリシンからなる群から選択される等張化剤をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
63. 塩化ナトリウムをさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
64. 界面活性剤をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
65. ＳＤＳ、ポリソルベートおよびプルロニクスからなる群から選択される界面活性剤をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
66. ポリソルベート２０をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
67. 約０．００１％〜１％の範囲内の界面活性剤をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
68. 約０．００５％〜約０．０１％の範囲内の界面活性剤をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
69. 安定剤、金属キレート試薬、抗酸化剤、または抗菌防腐剤をさらに含有する請求項４０に記載の製剤。
70. 前記安定剤が二糖類、アミノ酸、グリセロール、アルブミン、およびＰＥＧからなる群から選択される請求項６９に記載の製剤。
71. 前記金属キレート試薬がＥＤＴＡまたはペンテト酸である請求項６９に記載の製剤。
72. 前記抗酸化剤がアスコルビン酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシルトルエン、システイン、メチオニン、チオグリセロール、およびチオグリコール酸からなる群から選択される請求項６９に記載の製剤。
73. 約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの前記エリスロポエチンペプチド、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム、約１００ｍＭ〜２００ｍＭの塩化ナトリウム、および約０．００５％〜約０．０１％のポリソルベート２０を含有する請求項４０に記載の製剤。

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