JP4719686B2 - ＧｌｙｃｏＰＥＧ化エリスロポエチン - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本発明は、各々その全体があらゆる目的のために本明細書に参照により援用されている２００３年１１月２４日付けの米国仮特許出願第６０／５２４，９８９号明細書；２００４年３月２２日付けの米国仮特許出願第６０／５５５，５０４号明細書；２００４年７月２３日付けの米国仮特許出願第６０／５９０，５７３号明細書；２００４年７月２９日付けの米国仮特許出願第６０／５９２，７４４号明細書；２００４年９月２９日付けの米国仮特許出願第６０／６１４，５１８号明細書；および米国仮特許出願第６０／６２３，３８７号明細書に基づく優先権を主張するものである。
発明の背景
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球の産生を刺激するべく造血幹細胞に作用する腎臓および肝臓によって産生されるサイトカインである。該タンパク質は２つの形態で存在し、その１つは１６５アミノ酸ペプチドであり、もう１つは１６６アミノ酸ペプチドである。１６６アミノ酸ペプチドは、１６６アミノ酸ペプチドがＣ末端の最も端に付加的なアルギニンを有するという点を除いて、１６５アミノ酸ペプチドと同じ配列を有する。成熟１６５アミノ酸ペプチドは、３つのＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−２４、Ａｓｎ−３８およびＡｓｎ−８３）および１つのＯ−グリコシル化部位（Ｓｅｒ−１２６）を含む３４ｋＤの糖タンパク質であり、一部の変異体は、５つのＮ連結されたグリコシル化部位を含む「過グリコシル化」されたものである。
エリスロポエチン合成は、動脈血酸素分圧の低下または血液の酸素親和力の増大といったような組織の低酸素状態を有効に作り出す条件によって誘発される。普通のホメオスタシス条件下で、血中のヘマトクリット値およびヘモグロビン濃度は、骨髄、脾臓および肝臓中のマクロファージによる古い赤血球の永続的な破壊を赤血球産生が埋め合わせすることで維持されている。定量的には、約２〜３×１０１１個の赤血球に相当する赤血球質量の約１％が毎日更新されている。しかしながら、血液損失または高い標高といった組織低酸素状態を効果的に発生させる状況の下では、ＥＰＯの誘発は、正常レベルより１０倍以上高く赤血球産生を刺激する可能性がある。
ＥＰＯは、赤血球産生を刺激することから、ヘマトクリット値の低減が付随する数多くの疾病および健康状態のために有効な療法である。末期腎不全患者においてヘマクリット値を回復させるための組換え型ヒトＥＰＯでの代償療法の初期試験が、約２０年前に初めて報告された（例えばウィニールス（Ｗｉｎｅａｒｌｓ）、Ｃ．Ｇ．ら、（１９８６年）Ｌａｎｃｅｔ、第２号、１１７５〜１１７８頁、およびエシュバック（Ｅｓｃｈｂａｃｈ）、Ｊ．Ｗ．ら、（１９８７年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１６号、７３〜７８頁参照）。この研究作業は、ＥＰＯの病態生理学および薬理学に関するさらなる調査に推進力を提供した（ジェルクマン（Ｊｅｌｋｍａｎｎ）、Ｗ．およびグロス（Ｇｒｏｓｓ）、Ａ．（１９８９年）Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ；スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
これらの初期の調査以降、組換え型ＥＰＯは数多くの病的状態を治療するために使用され成功をおさめてきた。例えば、外科患者に対する組換え型ヒトＥＰＯの薬理学的応用は、術後貧血の重症度を軽減しおよび持続時間を短縮することができる。組換え型ヒトＥＰＯの投与は同様に、内因性ＥＰＯの相対的欠如が貧血の発生に寄与する慢性炎症、悪性腫瘍およびエイズといったような複数の非腎臓疾患を患う患者のための有効な療法であることも証明されてきた（例えばミーンズ（Ｍｅａｎｓ）、Ｒ．Ｔ．およびクランツ（Ｋｒａｎｔｚ）、Ｓ．Ｂ．（１９９２年）Ｂｌｏｏｄ、第８０号、１６３９〜１６４７頁、およびジェルクマン、Ｗ．（１９９８年）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．、第１８号、５５５〜５５９頁参照）。さらに、ＥＰＯは、虚血性、外傷性障害、中毒性および炎症性傷害において組織保護性があることが報告されてきた（例えばブラインズ（Ｂｒｉｎｅｓ）、Ｍ．ら、（２００４年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、第１０１号、１４９０７−１４９１２頁およびブラインズ、Ｍ．Ｌ．ら、（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９７号、１０５２６−１０５３１頁）。
このような広範な原因から生じる貧血およびその他の健康状態の治療のためのＥＰＯの有用性および有効性のおかげで、組換え型ヒトＥＰＯは恐らく世界中で最もよく売れている薬物になっている。実際、推定上の売上げ高は年間５０億米ドル超にのぼる。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列の中で生産されたただ１つの組換え型ヒトＥＰＯのみが、治療薬として広範に使用されている。哺乳動物は全て類似の構造のグリカンを産生することから、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、およびヒト胎児腎臓−２９３（ＨＥＫ−２９３）が糖タンパク質治療薬の生産のための好ましい宿主細胞である。当該技術分野において既知の通り、適切なグリコシル化は、治療用ペプチドのインビボ半減期および免疫原性に影響を及ぼす非常に重要な要因である。実際グリコシル化の度合いが低いタンパク質は、「古いもの」として肝臓により認識され、従って適切にグリコシル化されたタンパク質よりも迅速に体内から除去される。
残念なことに、タンパク質グリコシルにおいて周知の失望を禁じえない側面は、微小不均一性の現象である。かくして、ＥＰＯといったようなヒト治療用糖タンパク質の生産のための好ましい宿主細胞でさえ、標準的にグリカンの精確な構造の一定範囲の変動を含むペプチドを産生する。この不均一性の程度は、グリコシル化部位間で、タンパク質間で、および細胞型間で著しく変動し得る。従って、各々が実際に全く異なる分子種である数多くのグリコフォームが標準的に、あらゆる既定の糖タンパク質調製物の中に存在する。
かくして微小不均一性の問題は、治療用糖タンパク質の大規模工業生産にとって数多くの問題を呈する。特に、各々のグリコフォームは全く異なる分子種を表わし得ることから、所望の単一のグリコフォームを精製するべく、治療用糖タンパク質の調製物を分画する必要がある。又、異なる生産バッチは糖タンパク質治療薬のバッチを含め所望のグリコフォームの百分率に関して変動しうるという事実から、さらに事は複雑になる。かくして、必ずしも予測し得ない調製物の大きな部分を廃棄せざるを得なくなるかもしれず、究極的には所望のグリコフォームの最終的収量が低くなる可能性がある。全体として、微小不均一性の問題は、哺乳類細胞培養により生産される治療用糖ペプチドがより高い生産コストを必要とし、このことは究極的に、持続性がさらに長くより有効な糖タンパク質治療薬を製造するより効率の良い方法が利用可能であった場合に必要と考えられるものよりも高い医療コストを意味することになる。
費用効果性の高い糖ペプチド治療薬を提供する問題に対する１つの解決法は、より長いインビボ半減期をもつペプチドを提供することであった。例えば、ペプチド主鎖に合成ポリマーを付着させることにより改良された薬物動態特性をもつ糖ペプチド治療薬が生産されてきた。ペプチドに抱合されたポリマーの例はポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ペプチド治療薬を誘導体化するためにＰＥＧの使用することで、ペプチドの免疫原性が低下することが実証されてきた。例えば米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールにカップリングされたペプチドホルモンおよび酵素といったような非免疫原性ポリペプチドについて開示している。免疫原性の低下に加えて、循環中のクリアランス時間は、問題のポリペプチドのＰＥＧ抱合体のサイズの増大に起因して延長される。
ＰＥＧおよびその誘導体のペプチドに対する主たる付着様式は、ペプチドアミノ酸残基を通した非特異的結合である（例えば米国特許第４，０８８，５３８号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，４１４，１４７号明細書、米国特許第４，０５５，６３５号明細書およびＰＣＴ国際公開第８７／０００５６号パンフレットを参照）。ペプチドに対するＰＥＧのもう１つの付着様式は、糖ペプチド上のグリコシル残渣の非特異的酸化を通したものである（例えば国際公開第９４／０５３３２号パンフレットを参照）。
これらの非特異的方法においては、ポリ（エチレングリコール）がペプチド主鎖上の反応性残基に対し無作為の非特異的なやり方で付加される。当然のことながら、ＰＥＧ分子の無作為な付加には、最終生成物の均質性の欠如およびペプチドの生物活性または酵素活性の減少の可能性を含めた欠点がある。従って、治療用ペプチド生産のためには、特異的に標識され、容易に特徴づけでき、基本的に均質な生成物の形成を結果としてもたらす誘導体化戦略がより優れている。かかる方法が開発されてきた。
特異的に標識され均質なペプチド治療薬は、酵素の作用を通してインビトロで生産可能である。合成ポリマーまたはその他の標識をペプチドに付着させるための標準的な非特異的方法とは異なり、酵素ベースの合成は、位置選択性および立体選択性という利点を有する。標識されたペプチドの合成において使用するための２つの主要な酵素クラスは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えばシアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ）およびグリコシダーゼである。これらの酵素は、治療用部分を含むべくその後修飾可能である糖の特異的付着のために使用可能である。代替的には、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾されたグリコシダーゼを用いて修飾型糖を直接ペプチド主鎖に転移することができる（例えば各々本明細書に参照により援用されている米国特許第６，３９９，３３６号明細書および米国特許出願公報第２００３００４００３７号、第２００４０１３２６４０号、第２００４０１３７５５７号、第２００４０１２６８３８号および第２００４０１４２８５６号明細書を参照のこと）。化学的および酵素的な合成要素を両方共組合せる方法も同様に知られている（例えば、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｒｅｓ．第３０５号、４１５−４２２頁（１９９８年）および本明細書に参照により援用されている米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号明細書を参照のこと）。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）はきわめて貴重な治療用ペプチドである。市販の形態のＥＰＯが今日使用されているが、これらのペプチドは、生産コストを増大させる糖タンパク質生成物の微小不均一性、結果として得られる単離された糖タンパク質生成物の薬物動態の低さまたはこれら２つの組合せを含めた要因に起因して最大限の有効性には及ばない。かくして、当該技術分野においては、有効性が増し薬物動態の優れた持続性のあるＥＰＯペプチドに対するニーズがなおも存在する。さらに、最大数の個体にとって有効であるためには、何度も容易に再現できる予測可能な基本的に均質な構造をもち改良された治療用薬物動態を有するＥＰＯペプチドを工業規模で生産することが可能でなくてはならない。
幸いなことに、改善された治療有効性をもつＥＰＯペプチドおよびその製造方法が現在発見されてきた。実際、本発明は、改善された薬物動態をもつＥＰＯペプチドを提供する。本発明は同様に、修飾済みＥＰＯペプチドの生産のための工業的に実用的でかつ費用効果性の高い方法をも提供している。本発明のＥＰＯペプチドは、ＰＥＧ部分、治療用部分、生体分子などといった修飾基を含む。従って本発明は、ＥＰＯが有効な療法を提供する健康状態および疾患のための改善された治療有効性と改善された薬物動態を有するＥＰＯペプチドに対するニーズを満たすものである。
発明の要約
現在、１つ以上のポリ（エチレン）グリコール部分によるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の制御された修飾が、改善された薬物動態をもつ新規のＥＰＯ誘導体を提供することが発見されている。さらに、本発明の修飾されたＥＰＯペプチドを高い信頼性で生産するための費用効果性の高い方法が発見され開発されてきた。
第１の態様では、本発明は、
Figure 0004719686
の部分を含むエリスロポエチンペプチドにおいて、式中
Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり；Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり；Ｒ１は、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分である、選択されるメンバーを含む部分であり、かつ；Ｌが結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルの中から選択されるメンバーであるリンカーであり；かくして、ＤがＯＨであるときＧがＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであるときＤがＲ１−Ｌ−ＮＨ−である、エリスロポエチンペプチドを提供している。一実施形態においては、Ｌ−Ｒ１は
Figure 0004719686
という式を有し、式中ａは０〜２０の整数である。もう１つの実施形態においては、Ｒ１は、
Figure 0004719686
から選択されるメンバーである構造を有し；式中ｅおよびｆは１〜２５００から独立して選択される整数であり、ｑは１〜２０の整数である。その他の実施形態においては、Ｒ１は、
Figure 0004719686
から選択されるメンバーである構造を有し；式中ｅ、ｆおよびｆ’は１〜２５００から独立して選択される整数であり、ｑおよびｑ’は１〜２０から独立して選択される整数である。
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、Ｒ１が、
Figure 0004719686
から選択されるメンバーである構造を有し、式中；ｅ、ｆおよびｆ’は１〜２５００から独立して選択される整数であり；ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０から独立して選択される整数である。その他の実施形態においては、Ｒ１は、
Figure 0004719686
から選択されるメンバーである構造を有し、ｅおよびｆは１〜２５００から独立して選択される整数である。
もう１つの態様においては、本発明は、
Figure 0004719686
という式を有する部分を含むペプチドを提供する。
もう１つの態様においては、該部分は、
Figure 0004719686
という式を有する。
もう１つの例示的実施形態では、該ペプチドは、
Figure 0004719686
という式に従い、式中アミノ酸が前記ペプチドのアミノ酸残基である部分を含んでいる。一部の実施形態では、アミノ酸残基はセリン、トレオニンまたはチロシンから選択されるメンバーである。好ましい実施形態においては、該アミノ酸残基は、配列番号：１の１２６位にあるセリンである。
もう１つの実施形態例では、本発明は、
Figure 0004719686
という式を有する少なくとも１つの部分を含み、式中、ｔが０または１に等しい整数であるエリスロポエチンペプチドを提供する。かくしてこの実施形態においては、修飾されたシアル酸部分は２分岐構造のいずれかの分岐上に発生し得る。
もう１つの関連する実施形態においては、本発明は、
Figure 0004719686
という式を有する少なくとも１つの部分を含むエリスロポエチンペプチドを提供する。
もう１つの実施形態においては、本発明は、
Figure 0004719686
に従った式を有する少なくとも１つの部分を含むエリスロポエチンペプチドを提供している。この実施形態においては、修飾されたシアル酸部分は、３分岐構造のいずれかの形態の分岐のうちのいずれかの１つ以上のものの上で発生し得る。
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、
Figure 0004719686
という式を有する少なくとも１つの部分を含むエリスロポエチンペプチドを提供する。この実施形態においては、修飾されたシアル酸部分は、４分岐構造の分岐のうちいずれかの１つ以上のものの上で発生し得る。
もう１つの態様では、本発明は生物活性エリスロポエチンペプチドであるエリスロポエチンペプチドを提供する。一実施形態においては、該エリスロポエチンペプチドは赤血球産生活性である。もう１つの実施形態においては、エリスロポエチンペプチドは基本的に赤血球産生活性ではない。もう１つの実施形態では、該エリスロポエチンペプチドは組織保護性をもつ。
もう１つの態様においては、本発明は
Figure 0004719686
という部分を含むＰＥＧ化エリスロポエチンの製造方法において、式中Ｒ１は、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、Ｌは、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーである方法を提供する。該方法は、
Figure 0004719686
というグリコシル部分を含む基質エリスロポエチンペプチドを、
Figure 0004719686
という式をもつＰＥＧ−シアル酸供与体部分およびトランスファに適した条件下で前記グリコシル部分のＧａｌ上に前記ＰＥＧ−シアル酸を転移する酵素と接触させる工程を含む。一実施形態においては、エリスロポエチンペプチドは適切な宿主内で発現される。一実施形態においては、宿主は哺乳類細胞であり、もう１つの実施形態では宿主細胞は昆虫細胞である。
もう１つの態様において、本発明は、必要としている対象の体内の健康状態を治療する方法において、該健康状態が対象の体内の赤血球産生の危機を特徴とする方法を提供している。該方法は、対象の体内の該健康状態を改善させるのに有効な量の本発明のエリスロポエチンペプチドを該対象に投与する工程を含んでいる。
もう１つの態様では、本発明は、哺乳動物の体内での赤血球産生を増強させる方法を提供する。該方法は、哺乳動物の体内での赤血球産生を増強させるのに有効な量の本発明のエリスロポエチンペプチドを哺乳動物に対して投与する工程を含む。
もう１つの態様では、必要としている対象の体内の組織傷害を治療する方法において、前記傷害が虚血、外傷性障害、炎症または毒性物質との接触の結果としてもたらされた損傷を特徴とし、対象の体内の前記組織傷害を改善するのに有効な量の本発明のエリスロポエチンペプチドを該対象に投与する工程を含む方法を提供している。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のエリスロポエチンペプチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む薬学製剤を提供している。
本発明の０連結されたエリスロポエチン抱合体においては、基本的に、ポリマーが結合されているアミノ酸残基の各々が同じ構造を有する。例えば、１つのペプチドがＳｅｒ連結したグリコシル残基を含む場合、集団中のペプチドの少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％またはより好ましくは９９．８％が、同じＳｅｒ残基に共有結合された同じグリコシル残基を有することになる。
本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者にとって明らかなものとなるだろう。
発明の詳細な説明および好ましい実施形態
略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレンングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセタート；Ｘｙｌ、キシロシル；およびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−ホスファート。
定義
別段の定義のないかぎり、本書で使用されている全ての技術的および科学的用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者が普通に理解するものと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順および本書で使用されている用語は、周知でかつ当該技術において普通に利用されているものである。核酸およびペプチド合成のためには、標準的技術が使用される。技術および手順は一般に当該技術分野における従来の方法および本書全体にわたり提供されているさまざまな一般的参考文献に従って実施される（一般に、本明細書に参照により援用されているサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。以下で記述されている有機合成および分析化学における実験室手順および本書で使用される用語は、当該技術分野において利用されている周知のものである。化学合成および化学分析のためには、標準的な技術またはそれを、修正したものが使用される。
本書で記述されている全てのオリゴ糖は、非還元糖類の名前または略号（すなわちＧａｌ）とそれに続くグリコシド結合の形態（αまたはβ）、環状結合（１または２）、結合に関与する還元糖類の環位置（２、３、４、６または８）そしてその後の還元糖類の名前または略号（すなわちＧｌｃＮＡｃ）で記述されている。各々の糖類は好ましくはピラノースである。標準的な糖生物学用語を再考するためには、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」、ヴァルキ（Ｖａｒｋｉ）ら編、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照のこと。
オリゴ糖は、還元末端にある糖類が実際に還元糖であるか否かに関わらず、還元末端および非還元末端を有するものとみなされる。一般に認められた用語に従うと、オリゴ糖は本書では左側に非還元末端を又右側に還元末端を伴って描かれている。
「シアル酸」という用語は、９炭素カルボキシル化糖ファミリーのいずれかのメンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセタミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（往々にしてＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される）である。該ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基が水酸化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。シアル酸ファミリーの第３のメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（ナダノ（Ｎａｄａｎｏ）ら、（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６１号、１１５５０〜１１５５７頁）；カナモリ（Ｋａｎａｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６５号、２１８１１−２１８１９頁（１９９０年））。同じく含まれるのは、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃといったような９置換シアル酸である。シアル酸ファミリーを再考するためには、例えばヴァルキ、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２号、２５−４０頁（１９９２年）；「Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｒ．ショウアー（Ｓｃｈａｕｅｒ）編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９２年）を参照のこと）。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願国際公開第９２／１６６４０号パンフレットの中で開示されている。
「ペプチド」というのは、代替的にはポリペプチドとも呼ばれる、単量体がアミノ酸でありアミノ結合を通して接合されている１つのポリマーを意味する。付加的には、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンといったような非天然アミノ酸も含まれる。遺伝子コード化されていないアミノ酸を本発明において使用することもできる。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療用部分、生物分子などを内含するように修飾されたアミノ酸を本発明において使用することも可能である。本発明で使用されるアミノ酸は全て、Ｄ−またはＬ−異性体のいずれかであり得る。Ｌ−異性体が一般に好まれる。さらに、その他のペプチドミメティックスも同様に有用である。本書で使用されているように、「ペプチド」は、グリコシル化ペプチドおよびグリコシル化ペプチドの両方を意味する。同様に内含されているのは、ペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されているペプチドである。一般的再考のためには、スパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ）、Ａ．Ｆ．「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ、ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」中、Ｂ．ワインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）を参照のこと。
「ペプチド抱合体」という用語は、本書に記されているようにペプチドが修飾型糖と抱合されている本発明の種を意味する。
「アミノ酸」という用語は、天然に発生するアミノ酸および合成アミノ酸ならびにアミノ酸類似体および天然に発生するアミノ酸と類似の要領で機能するアミノ酸ミメティックスを意味する。天然に発生するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、およびＯ−ホスフォセリンである。アミノ酸類似体というのは、天然に発生するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に発生するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸ミメティックスは、アミノ酸は一般的化学構造とは異なるものの天然に発生するアミノ酸と類似の要領で機能する構造をもつ化学的化合物を意味する。
本書で使用されているように、「修飾型糖」という用語は、本発明のプロセスにおいてペプチドのグリコシル残基またはアミノ酸上に酵素的に付加される天然に発生するまたは天然には発生しない炭水化物を意味する。修飾型糖は、糖ヌクレオチド（モノ、ジ、およびトリホスファート）、活性化糖（例えばグリコシルハロゲン化物、グリコシルメシラート）および活性化されておらず又ヌクレオチドでもない糖を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）一定数の酵素基質の中から選択される。「修飾型糖」は、「修飾基」と共有結合により機能化される。有用な修飾基としては、ＰＥＧ部分、治療用部分、診断用部分、生物分子などが含まれるがこれらに限定されるわけではない。修飾基は好ましくは天然に発生するまたは未修飾の炭水化物ではない。修飾基での機能化の座は、「修飾型糖」がペプチドに対し酵素的に添加されるのを妨げないような形で選択される。
「水溶性」という用語は、水中で検出可能な若干の溶解度を有する部分を意味する。水溶解度を検出および／または定量化するための方法は当該技術分野において周知である。水溶性ポリマーの例としては、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが含まれる。ペプチドは、単一のアミノ酸例えばポリ（リジン）から成る混合型配列を有することができる。多糖類の例としては、ポリ（シアル酸）がある。ポリ（エーテル）の一例はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）はポリアミンの一例であり、ポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。
水溶性ポリマーのポリマー主鎖はポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）であり得る。しかしながら、その他の関連するポリマーも同様に本発明の実施において使用するために適切であることそしてＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語の使用がこの点において排他的ではなく包括的であるよう意図されていることを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、アルコキンＰＥＧ、２官能性ＰＥＧ、多数の腕を有するＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわちポリマー主鎖にペンダントしている１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）または中に分解可能な連結を伴うＰＥＧを含め、そのあらゆる形態でのポリ（エチレングリコール）を内含する。
ポリマー主鎖は線形または分岐である。分岐ポリマー主鎖が当該技術分野において一般に知られている。標準的には分岐ポリマーは、中央分岐コア部分とこの中央分岐コアに連結された複数の線形ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは一般に、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールといったようなさまざまなポリオールに対する酸化エチレンの付加により調製可能な分岐形態で使用される。中央分岐部分をリジンといった複数のアミノ酸から誘導することもできる。分岐ポリ（エチレングリコール）は、Ｒがグリセロールまたはペンタエリスリトールといったようなコア部分を表わし、ｍが腕の数を表わすＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして一般的形態で表わすことができる。その全体が本明細書に参照により援用されている米国特許第５，９３２，４６２号明細書の中で記述されているものといったような多数の腕をもつＰＥＧ分子も同じくポリマー主鎖として使用可能である。
本発明のためにはその他の数多くのポリマーも適切である。２〜約３００の末端をもつ非ペプチドの水溶性ポリマー主鎖が本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）といったその他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルフォリン）、例えばその全体が本明細書に参照により援用されている米国特許第５，６２９，３８４号明細書中に記述されているもの、およびそのコポリマー、ターポリマーおよびそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ポリマー主鎖の各鎖の分子量は変動し得るが、それは標準的に約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、往々にして約６０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲内にある。
ペプチド薬物を患者に投与するという状況の下で本書で使用される「曲線下の面積」つまり「ＡＵＣ」は、ゼロから無限までの時間の関数として患者の体内の全身的循環中の薬物の濃度を描写する曲線の下の合計面積として定義づけされる。
患者に対しペプチド薬物を投与するという状況下で本書で用いられている「半減期」または「ｔ１／２」という用語は、患者の体内の薬物の血漿濃度が１／２になるのに必要とされる時間として定義される。多重クリアランス機序、再分配および当該技術分野において周知のその他の機序に応じて、ペプチド薬物に結びつけられる半減期が複数存在し得る。通常アルファ相が再分配と結びつけられベータ相がクリアランスと結びつけられるような形で、アルファおよびベータ半減期が定義される。しかしながら、大部分が血液流に閉じ込められるタンパク質薬物では、２つ以上のクリアランス半減期が存在し得る。一部のグリコシル化ペプチドについては、末端グラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースまたはフコースを認識する内皮細胞またはマクロファージ上のレセプタを通して、急速なベータ相クリアランスが媒介され得る。組織内の特異的または非特異的摂取および代謝および／または２ｎｍの有効半径（約６８ｋＤ）をもつ分子についての腎臓系球体ろ過を介して、より緩慢なベータ相クリアランスが発生する可能性もある。ＧｌｙｃｏＰＥＧ化が末端糖（例えばガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン）をキャッピングしかくして、これらの糖を認識するレセプタを介して急速なアルファ相クリアランスを遮断するかもしれない。それは同様にさらに大きい有効半径を付与しかくして分配および組織摂取体積を減少させ、ひいては晩期ベータ相を延長させることもできる。かくして、アルファ相およびベータ相半減期に対するＧｌｙｃｏＰＥＧ化の精確な影響は、当該技術分野において周知であるように、サイズ、グリコシル化状態およびその他のパラメータに応じて変動することになる。「半減期」のさらなる説明は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９７年、ＤＦＡ クロメリン（Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ）およびＲＤ シンデラー（Ｓｉｎｄｅｌａｒ）編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１０１〜１２０頁）に見い出される。
本書で使用される「糖抱合」という用語は、例えば本発明のエリスロポエチンペプチドといったポリペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に対する修飾型糖種の酵素媒介抱合を意味する。「糖抱合」の亜属は、修飾型糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）およびそのアルキル誘導体（例えばｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（例えばＨ２Ｎ−ＰＥＧ、Ｈ００Ｃ−ＰＥＧ）である「グリコール−ＰＥＧ化」である。
「大規模」および「工業規模」という用語は、互換的に用いられ、単一の反応サイクルの完了時点で少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約１グラムの糖抱合体を生産する反応サイクルを意味する。
本書で使用されている「グリコシル連結基」という用語は、修飾基（例えばＰＥＧ部分、治療用部分、生体分子）が共有結合させられているグリコシル残基を意味する。該グリコシル連結基は修飾基を抱合体の残りの部分に接合させる。本発明の方法においては、「グリコシル連結基」は、グリコシル化されたまたはグリコシル化されていないペプチドに対し共有結合した状態となり、かくして該作用物質をペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に連結させる。「グリコシル連結基」は一般に、ペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基に対する「修飾型糖」の酵素的付着によって「修飾型糖」から誘導される。グリコシル連結基は、修飾基−修飾型糖カセットの形成中に分解させられる糖類誘導型構造であり得（例えば酸化→シック塩基形成→還元）、グリコシル連結基に無傷でもあり得る。「無傷のグリコシル連結基」というのは、抱合体の残りの部分に修飾基を連結する糖類単量体が分解されない。つまり、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムなどによって酸化されないグリコシル部分から誘導される連結基を意味する。本発明の「無傷のグリコシル連結基」は、親糖類構造からの１つ以上のグリコシン単位の除去またはグリコシル単位の付加により天然に発生するオリゴ糖から誘導され得る。
本書で使用される「ターゲティング部分」という用語は、身体の特定の組織または領域内に選択的に局在化することになる種を意味する。該局在化は、分子決定因子、ターゲティング作用物質または抱合体の分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などの特異的認識により媒介される。１つの作用物質をターゲティングするその他の機序は、当業者にとっては既知のものである。ターゲティング部分の例には、抗体、抗体フラグメント、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝血因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが含まれる。
本書で使用される「治療用部分」という用語は、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒素および放射性作用物質を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）療法のために有用なあらゆる作用物質を意味する。「治療用部分」には、中で複数の治療用部分が例えば多価の作用物質といった担体に結合されている構成体である生物活性作用物質のプロドラッグが含まれる。治療用部分には又、タンパク質およびタンパク質を含む構成体も含まれる。タンパク質の例としては、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えばインターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（例えばインターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば第ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ因子）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）および抗体融合タンパク質（例えば腫瘍壊死因子レセプタ（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本書で使用されている「薬学的に受容可能な担体」には、抱合体と組合わせた場合に抱合体の活性を保持し、対象の免疫系と反応しないあらゆる材料が含まれる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液といった標準的な薬学的担体、水、水中油形エマルジョンなどのエマルジョンおよびさまざまなタイプの湿潤剤のいずれがあるが、これらに限定されるわけではない。その他の担体には同様に、無菌溶液、コーティングされた錠剤を含めた錠剤およびカプセルも含まれ得る。標準的には、かかる担体は、デンプン、牛乳、糖、或る種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物性脂肪または油、ゴム、グリコールまたはその他の既知の賦形剤といった賦形剤を含有する。かかる担体は、同様に、着香および着色用添加剤またはその他の成分をも内含し得る。かかる担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって処方される。
本書で使用する「投与」という用語は、対象に対する経口投与、座薬、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋内、病巣内、鼻腔内または皮下投与または例えば浸透圧ポンプといった徐放性デバイスの移植を意味する。投与は、非経口および経粘膜（例えば経口、経鼻、経腔、経直腸または経皮）を含むあらゆる経路によるものである。非経口投与には、例えば静脈内、筋内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内投与が含まれる。その上、注射が例えばアポトーシスの誘発といった腫瘍の治療を目的とする場合、投与は、直接腫瘍に対するおよび／または腫瘍をとり囲む組織に対するものであり得る。その他の送達様式としては、リポソーム製剤の使用、静脈内輸液、経皮パッチがあるが、これらに限定されるわけではない。
「改善」または「改善する」といった用語は、症候の軽減、緩和または縮退または患者の肉体的または精神的健康の向上といったあらゆる客観的または主観的パラメータを含めた、病状または健康状態の治療における成功のあらゆる兆候を意味する。症候の改善は、健康診断および／または精神鑑定の結果を含む客観的および／または主観的パラメータに基づくものであり得る。
「療法」という用語は、疾病の素因を有するもののまだその疾病の症候を体験または呈示していない動物において該疾病または健康状態の発生を防止することも（予防的治療）、疾病を阻害すること（その発達を減速させるまたは阻む）、疾病の症候または副作用の緩和を提供すること（緩和医療を含む）、および疾病を緩和すること（疾病の退行をひき起こす）を含めた、疾病または健康状態の「治療行為」または「治療」を意味する。
「有効量」または「〜するのに有効な量」または「治療上有効な量」または文法的に等価のあらゆる用語は、１つの疾病を治療するために動物に対し投与された場合に、その疾病に対する治療をもたらすのに充分である量を意味する。
「組織保護性ある」という用語は、標準的に組織または器官による虚血／低酸素状態、外傷性傷害、毒性および／または炎症の体験に付随する細胞損傷の効果に対する組織の防御を意味する。細胞損傷はアポトーシスおよび／または壊死（すなわち毒性細胞死）を導く可能性がある。かくして「組織保護性」効果は、組織が、既定の外傷性傷害性、炎症性、毒性または虚血性傷害に通常付随する一定のアポトーシスおよび／または毒性細胞死を体験しないように守る。例えば、ＥＰＯは、ゲッ歯類モデルにおいて中央脳動脈閉塞後の梗塞部域を削減させる（サイレン（Ｓｉｒｅｎ）Ａ．Ｌ．ら、（２００１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９８号、４０４４〜４０４９頁）。かくしてかかる条件下ではＥＰＯは、通常虚血性傷害（例えば虚血性卒中）に付随する壊死および／またはアポトーシスを有効に減少させることにより「組織保護性」効果を提供する。「組織保護性」という語は同様に、網膜症といったような変性疾患または神経変性疾患に付随する細胞損傷効果およびその後の細胞死に対する組織の防御をも意味する。
「単離された」という用語は、その材料を生産するのに使用される成分を実質的にまたは基本的に含まない材料を意味する。本発明のペプチド抱合体については、「単離された」という用語は、該ペプチド抱合体を調製するために使用される混合物中で該材料に通常随伴する成分を実質的にまたは基本的に含まない材料を意味する。「単離された」および「純粋な」という用語は互換的に使用される。標準的には、本発明の単離されたペプチド抱合体は、好ましくは一つの範囲として表現される純度レベルを有する。ペプチド抱合体についての純度範囲の下限は約６０％、約７０％または約８０％であり、純度範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
ペプチド抱合体は約９０％超の純度をもち、これらの純度も又好ましくは１つの範囲として表現される。純度範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度範囲の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％純度である。
純度は、当該技術分野において認知されたあらゆる分析方法によって決定される（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣまたは類似の手段）。
本書で使用されている「集団の基本的に各々のメンバー」という用語は、ペプチドに対して添加された選択される百分率の修飾型糖が該ペプチド上の多数の同一アクセプタ部位に付加されている本発明のペプチド抱合体の集団の特徴を記述する。「集団の基本的に各々のメンバー」は、修飾型糖に抱合されたペプチド上の部位の「均質性」に触れるものであり、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは少なくとも約９５％の均質性をもつ本発明の抱合体を意味する。
「均質性」という用語は、修飾型糖が抱合されるアクセプタ部分の集団全体にわたる構造的一貫性を意味する。かくして、その他の各々の修飾型糖が抱合されているアクセプタ部位と同じ構造をもつアクセプタ部位に各々の修飾型糖が抱合されている本発明のペプチド抱合体においては、ペプチド抱合体は約１００％均質であると言われる。均質性は標準的には１つの範囲として表現される。該ペプチド抱合体のための均質性範囲の下限は約６０％、約７０％または約８０％であり、純度範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
ペプチド抱合体が約９０％以上の均質性を有する場合、その均質性も同様に、好ましくは１つの範囲として表現される。均質性の範囲の下限は約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の上限は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％均質性である。ペプチド抱合体の純度は標準的には、当業者にとって既知の１つ以上の方法、例えば液体クロマトグラフィ質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、飛行分光分析のマトリクス支援レーザー脱着質量時間（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリ電気泳動などによって決定される。
糖ペプチド種に言及する場合の「実質的に均一のグリコフォーム」または「実質的に均一のグリコシル化パターン」という用語は、問題のグリコシルトランスフェラーゼ（例えばフコシルトランスフェラーゼ）によりグリコシル化されるアクセプタ部分の百分率を意味する。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシリアル化類似体の実質的に全て（以下で定義する通り）が本発明のペプチド抱合体内でフコシル化されている場合、実質的に均一のフコシル化パターンが存在する。当業者であれば、出発材料がグリコシル化されたアクセプタ部分（例えばフコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含有し得るということを理解するだろう。かくして、計算されたグリコシル化百分率は、本発明の方法によりグリコシル化されるアクセプタ部分ならびに出発材料内ですでにグリコシル化されたアクセプタ部分を内含することになる。
「実質的に均一な」という上述の定義における「実質的に」という用語は、一般に、特定のグリコシルトランスフェラーゼのアクセプタ部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約９０％そしてさらに一層好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されていることを意味している。
置換基が、左から右に書かれたその従来の化学式により特定されている場合には、これらは同様に、右から左へと構造を書くことの結果として得られると思われる化学的に同一の置換基も包含し、例えば−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−も列挙するように意図されている。
単独のまたはもう１つの置換基の一部としての「アルキル」という用語は、相反する記述のないかぎり、完全飽和、モノまたはポリ未飽和でありうる直鎖または分岐鎖または環式炭化水素ラジカルまたはそれらの組合せを意味し、指定された炭素原子の数をもつ２価および多価のラジカルを内含し得る（すなわちＣ１−Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素ラジカルの例としてはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロへキシル、（シクロへキシル）メチル、シクロプロピルメチルといった基、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。未飽和アルキル基は、１つ以上の２重結合または３重結合を有するものである。未飽和アルキル基の例には、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、３−プロピニル、３−ブチニルおよび高級相同体および異性体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。「アルキル」という用語は、別段の記載のないかぎり、同様に「ヘテロアルキル」といったような以下でさらに詳しく定義されているアルキルの誘導体を含むようにも意図されている。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と呼ばれる。
単独のまたはもう１つの置換基の一部としての「アルキレン」という用語は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示される（ただしこれらに限定されるわけではない）アルカンから誘導された２価のラジカルを意味し、さらに、以下で「ヘテロアルキレン」として記述されている基を内含する。標準的には、アルキル（またはアルキレン）基は１〜２４個の炭素原子を有することになり、本発明では１０個以下の炭素原子をもつ基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、さらに短鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語はその従来の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基または硫黄原子を介して分子の残りの部分に付着されたアルキル基を意味する。
単独のまたはもう１つの用語と組合わせた形での「ヘテロアルキル」という用語は、別段の記述のないかぎり、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳから成る群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子と記述された数の炭素原子から成り、窒素および硫黄原子が任意選択で酸化され得、窒素原子が任意選択で４級化され得る、安定した直鎖または分岐鎖または環式炭化水素ラジカルまたはそれらの組合せを意味する。ヘテロ原子、Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉはヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が該分子の残りの部分に付着されている位置に置くことができる。例としては、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、が含まれるがこれらに限定されるわけではない。例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３およびＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３といったような最高２つのヘテロ原子が連続したものであり得る。同様にして、単独のまたはもう１つの置換基の一部としての「ヘテロアルキレン」という用語は、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−により例示されるように（ただしこれらに限定されるわけではない）、ヘテロアルキルから誘導された２価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子は同様に鎖末端のいずれかまたは両方（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）を占有することもできる。さらに又、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、連結基の式が書かれている方向により連結基のいかなる配位も暗示されることはない。例えば式−Ｃ（Ｏ２）Ｒ’は−Ｃ（Ｏ２）Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方共を表わす。
単独のまたはその他の用語と組合せた形での「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、別段の記述のないかぎり、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式バージョンを表わす。付加的には、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は複素環が分子の残りの部分に付着されている位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロへキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるがこれらに限定されるわけではない。ヘテロシクロアルキルの例には１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、などが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
単独のまたはもう１つの置換基の一部としての「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、別段の記述のない限りフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。付加的には、「ハロアルキル」といったような用語にはモノハロアルキルおよびポリハロアルキルが含まれるように意図されている。例えば、「ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」という用語は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを内含するように意図されている（ただしこれらに限定されるわけではない）。
「アリール」という用語は、別段の記述のない限り、共に融合されるかまたは共有結合により連結されている単一環または多重環（好ましくは１〜３環）であり得るポリ未飽和芳香族置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、窒素および硫黄原子が任意に酸化され窒素原子が任意に四級化されている、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を意味する。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通して分子の残りの部分に付着され得る。アリールおよびヘテロアリール基の限定的意味のない例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１、４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルが含まれる。上述のアリールおよびヘテロアリール環系の各々の置換基は、以下で記述する受容可能な置換基の群から選択される。
簡単に言うと、その他の用語（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組合わせた形で使用される「アリール」という用語は、上述の通りのアリールおよびヘテロアリールの両方の環を内含する。かくして、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）によって置き換えられたアルキル基を内含するアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）にアリール基が付着しているラジカルを含むように意図されている。
上述の用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）の各々は、指示されたラジカルの置換形態および非置換形態の両方を含むように意図されている。各々のタイプのラジカルについての好ましい置換基が、以下で提供されている。
（往々にしてアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含む）アルキルおよびヘテロアルキルラジカルに対する置換基は包括的に「アルキル基置換基」と呼ばれ、これらは、かかるラジカル中の合計炭素原子数をｍ’としてゼロから（２ｍ’＋１）までの範囲内の数で−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、ＳＲ’、−ハロゲン−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよびＮＯ２から選択されるさまざまな基のうちの１つ以上のもの（ただしこれらに限定されるわけではない）であり得る。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は各々好ましくは独立して水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基またはアリールアルキル基を意味する。例えば、本発明の化合物が２個以上のＲ基を含む場合、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のうちの２つ以上のものが存在するときＲ基の各々は独立してこれらの基の各々として選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に付着される場合、これらは窒素原子と組合わされて５、６または７員の環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むように意図されているがこれらに限定されるわけではない。置換基についての以上の論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（例えば−ＣＦ３およびＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）といったような、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基を内含するように意図されていることを理解するであろう。
アルキルラジカルについて記述された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基についての置換基は包括的に「アリール基置換基」と呼ばれる。該置換基は例えば、ゼロから芳香族環系上の開原子価の合計数までの範囲内の数で、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよびＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択され、ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は好ましくは独立して水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択されている。例えば本発明の化合物が２個以上のＲ基を含む場合、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のうちの２つ以上のものが存在するときＲ基の各々は独立してこれらの基の各々として選択される。以下のスキームでは、Ｘという記号は、上述の「Ｒ」を表わす。
アリールまたはヘテロアリールの隣接する原子上の置換基の２つを、−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（なお式中ＴおよびＵは独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは０〜３の整数である）の置換基と置き換えることが可能である。代替的には、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つを任意選択でＡ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−という式の置換基（なお式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜４の整数である）で置換えることもできる。このように形成された新しい環の単結合の１つを任意選択で、２重結合と置き換えることができる。代替的には、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つを、−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−という式の置換基（なお式中ｓおよびｄは独立して０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ２）ＮＲ’−である）で置き換えることもできる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは独立して水素または置換または非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
本書で使用されている「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むように意図されている。
導入
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球合成の主要調節因子として役立つ糖タンパク質である。エリスロポエチンは、腎臓の中で産生され、骨髄の中で前駆体細胞を刺激してそれらを成熟赤血球へと分割、分化させることによって作用する。ＥＰＯは１６５または１６６アミノ酸の糖タンパク質として存在し得る。１６６アミノ酸変異体は、タンパク質のＣ末端に付加的なアルギニン残基が存在することにより１６５アミノ酸変異体と識別される。
組換え型ＥＰＯは、時として、慢性腎不全、ジドビジン治療中のＨＩＶ感染患者および化学療法中のガン患者に付随する貧血症を含む、さまざまな形態の貧血症の治療において有効な治療剤として利用可能である。糖タンパク質は静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）注射のいずれかとして非経口的に投与される。
治療目的で使用される組換え型エリスロポエチンの有効性を改善するために、本発明は、グリコシル化されたおよびグリコシル化されていないエリスロポエチンペプチドの抱合体を提供する。該抱合体はさらに、治療用部分、診断用部分、ターゲティング部分などといったさまざまな種とのさらなる抱合により修飾可能である。
本発明の抱合体は、グリコシル化されたまたはグリコシル化されていないペプチドに対する修飾型糖の酵素的付着によって形成される。グリコシル化部位は、例えば糖抱合などによりペプチドに対して修飾基を抱合するための座を提供する。修飾基の例としては、例えばメトキシ−ポリ（エチレングリコール）といったポリ（エチレングリコール）などの水溶性ポリマーがある。ＥＰＯペプチドの修飾は、患者の循環内の組換え型ＥＰＯの安定性および保持時間を改善するかまたは組換え型ＥＰＯの抗原性を低減させることができる。
本発明の方法により、実質的に均質な誘導体化パターンをもつ糖ペプチドとペプチドを組み合わせることが可能となる。本発明において使用される酵素は一般にペプチドの特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の組合せまたは特定のグリコシル残基について選択的である。該方法は同様に、修飾されたペプチドおよび糖ペプチドの大規模生産のためにも実用的である。かくして、本発明の方法は、その選択される均一の誘導体化パターンをもつ糖ペプチドの大規模調製のための実用的手段を提供する。
本発明は同様に、例えばクリアランス率の低減、または免疫または細網内皮系（ＲＥＳ）による摂取率の低下に起因して治療的半減期が延長されたグリコシル化されたおよびグリコシル化されていないペプチドの抱合体をも提供する。その上、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基をマスキングし、かくして該ペプチドに対する宿主免疫応答を低減または削除するための手段を提供する。特定のターゲティング作用物質に特異的なものである特定組織または細胞表面レセプタに対しペプチドをターゲティングするためにもターゲティング作用物質の選択的付着を使用することができる。
抱合体
第１の態様においては、本発明は選択される修飾基とＥＰＯペプチドの間の抱合体を提供する。
ペプチドと修飾基の間の連結は、ペプチドと選択される部分の間に介在させられたグリコシル連結基を含む。本書に論述されているように、選択される部分は、基本的に、糖類単位に付着され、ペプチド上に修飾型糖を付加する適切なトランスフェラーゼ酵素によって認識される「修飾型糖」を結果としてもたらすことのできるあらゆる種である。修飾型糖の糖類構成要素は、ペプチドと選択される部分の間に介在させられた時点で、例えば「無傷グリコシル連結基」といった「グリコシル連結基」となる。グリコシル連結基は、修飾基での修飾の後、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に対し修飾型糖を付加する酵素のための基質であるあらゆる単糖またはオリゴ糖から形成される。
グリコシル連結基は、修飾基の添加の前またはその間に分解的に修飾される糖類部分であるかまたはそれを内含し得る。例えばグリコシル連結基は、例えばメタ過ヨウ素酸塩の作用を介して無傷の糖類を対応するアルデヒドへと酸化分解させることによって産生され、後に対応するアミンへと還元される適切なアミンでシック塩基へとその後転換される糖類残基から誘導可能である。
本発明の抱合体は標準的に
Figure 0004719686
という一般的構造に対応することになり、ここで記号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは正の非ゼロ整数であり、ｔは０または正の整数のいずれかである。「作用物質」は治療用作用物質、生物活性作用物質、検出可能な標識、水溶性部分（例えばＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧおよびｍ−ＰＰＧ）などである。「作用物質」はペプチド例えば酵素、抗体、抗原などであり得る。リンカーは、広い連結基アレイのいずれかであり得る（後述）。代替的には、リンカーは単結合または「ゼロ次リンカー」であってよい。
一実施形態例においては、選択される修飾基は、例えばｍ−ＰＥＧといった水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーは、グリコシル連結基を介してペプチドに共有結合させられる。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に対し共有結合させられる。本発明は同様にアミノ酸残基およびグリコシル残基がグリコシル連結基で修飾されている抱合体を提供する。
水溶性ポリマーの例としては、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）などのポリ（エチレングリコール）である。本発明で使用されるポリ（エチレングリコール）は、いずれかの特定の形態または分子量範囲に限定されない。非分岐ポリ（エチレングリコール）分子については、分子量は好ましくは５００〜１００，０００の間である。好ましくは２０００〜６０，０００、そして好ましくは約５０００〜約３０，０００の分子量が使用される。
もう１つの実施形態においては、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上のＰＥＧ部分が付着している分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，３４２，９４０号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，９１９，４５５号明細書；米国特許第６，１１３，９０６号明細書；米国特許第５，１８３，６６０号明細書；国際公開第０２／０９７６６号号パンフレット；コデラ（Ｋｏｄｅｒａ）Ｙ．、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第５号、２８３〜２８８頁（１９９４年）；およびヤマサキ（Ｙａｍａｓａｋｉ）ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第５２号、２１２５〜２１２７頁、１９９８年に記述されている。好ましい実施形態においては、分岐ＰＥＧの各々のポリ（エチレングリコール）の分子量は、約４０，０００ダルトン以上である。
酵素的に添加されたグリコシル連結基を通して形成される抱合体を提供することに加えて、本発明は、その置換パターンがきわめて均質である抱合体を提供する。本発明の方法を用いると、本発明の抱合体の一集団全体にわたり修飾型糖部分の基本的に全てが構造的に同一のアミノ酸またはグリコシル残基の多数のコピーに付着させられているペプチド抱合体を形成することができる。かくして、第２の態様では、本発明は、無傷グリコシル連結基を通してペプチドに対し共有結合されている水溶性ポリマー部分の一集団を有するペプチド抱合体を提供する。本発明の好ましい抱合体においては、該集団の各々のメンバーがグリコシル連結基を介してペプチドのグリコシル残基に結合され、グリコシル連結基が付着しているペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有している。
同様に提供されているのは、グリコシル連結基を通して共有結合された水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチド抱合体である。好ましい実施形態においては、グリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸残基に対し水溶性ポリマー部分の集団の基本的に全てのメンバーが結合されており、グリコシル連結基が付着している各々のアミノ酸残基は同じ構造を有している。
本発明は同様に、ペプチドが無傷グリコシル連結基を介して治療用部分、診断用部分、ターゲティング部分、毒素部分などに対して抱合されている上述のものと類似した抱合体をも提供する。以上で列挙された部分の各々は、小分子、天然ポリマー（例えばポリペプチド）または合成ポリマーであり得る。
基本的に、本発明の抱合体の成分として、任意の配列をもつあらゆるエリスロポエチンペプチドを使用することができる。一実施形態例では、ペプチドは以下の配列を有する：
Figure 0004719686
もう１つの実施形態例では、ペプチドは以下の配列を有する：
Figure 0004719686
以上に記した配列には、Ｃ７−Ｃ１６１に１つとＣ２９−Ｃ３３にもう１つの計２つのシスルフィド結合が存在する。システイン残基は、以上で太字のイタリックで示されている。
好ましくは、いずれの末端も誘導体化されない。
本発明のペプチドは少なくとも１つのＮ連結またはＯ連結されたグリコシル化部位を含み、これは、ＰＥＧ部分を内含するグリコシル残基でグリコシル化される。ＰＥＧは、無傷グリコシル連結基を介してペプチドに共有結合している。グリコシル連結基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基のいずれかに共有結合している。代替的には、グリコシル連結基は糖ペプチドの単数または複数のグリコシル単位に付着している。本発明は同様に、グリコシル連結基がアミノ酸残基とグリコシル残基の両方に付着している抱合体をも提供している。
ＰＥＧ部分は、無傷グリコシルリンカーに直接または例えば置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキルといった非グリコシルリンカーを介して付着している。
好ましい実施形態においては、エリスロポエチンペプチドは、式Ｉに示されている部分を含む。
式Ｉ
Figure 0004719686
式Ｉでは、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮから選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ１−Ｌ−およびＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ１は、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分である、選択されるメンバーを含む部分であり、かつＬが結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルの中から選択されるメンバーであるリンカーであり、かくして、ＤがＯＨであるときＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。
組成物
上述の通り、本発明は、修飾基を担持する糖類、これらの種の活性化された類似体、およびペプチドおよび脂質といったような種と本発明の修飾型糖類の間で形成された抱合体を提供する。
修飾型糖
本発明は、修飾型糖、修飾型糖ヌクレオチドおよび修飾型糖の抱合体を提供する。本発明の修飾型糖化合物においては、糖部分は好ましくは糖類、デオキシ−糖類、アミノ−糖類またはＮ−アシル−糖類である。「糖類」およびその等価物、「サッカリル」、「糖」および「グリコシル」という用語は、単量体、２量体、オリゴマーおよびポリマーを意味する。糖部分は同様に、修飾基で官能化される。修飾基は、標準的に、糖上のアミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル、例えば一級ヒドロキシル部分との抱合を通して、糖部分に抱合される。一実施形態例においては、修飾基は、その反応性誘導体とアミンの反応を通して形成されるアミド、ウレタンまたは尿素などを通して、糖上にアミン部分を通して付着させられる。
本発明の抱合体の糖コアとしては、あらゆる糖を利用することができる。本発明の組成物を形成する上で有用な糖コアの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコースおよびシアル酸が含まれるがこれらに限定されるわけではない。その他の有用な糖としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミン類似体などといったアミノ糖が含まれる。糖コアは、天然に見い出される構造であり得、そうでなければそれを修飾して修飾基を抱合するための部位を提供することもできる。例えば、１つの実施形態においては、本発明は、９−ヒドロキシ部分がアミンで置き換えられているシアル酸誘導体を提供する。アミンは、選択される修飾基の活性化された類似体で容易に誘導体化される。
以下の論述においては、本発明はシアル酸の選択される誘導体の使用を基準として例示される。当業者であれば、論述の焦点が例示を明確にすることにあることそして記されている構造および組成物が一般に糖類基、修飾型糖類基、活性化済みの修飾型糖類基および修飾型糖類基の抱合体の属にあてはまるものであることを認識するであろう。
実施形態例においては、本発明は、
Figure 0004719686
という式をもつ修飾型糖アミン［なお式中Ｇはグリコシル部分、Ｌは結合またはリンカーそしてＲ１は修飾基である］を提供する。結合の例としては、例えばＮＨ２、ＳＨまたはＯＨといったグリコシル部分上の反応基と修飾基上の相補的反応性をもつ基の間で形成される結合がある。かくして、結合の例としてはＮＨＲ１、ＯＲ１、ＳＲ１などが含まれる。例えばＲ１がカルボン酸部分を含む場合、この部分を活性化し、グリコシル残基の上のＮＨ２部分とカップリングさせＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１という構造をもつ結合を付与することができる。同様にして、ＯＨおよびＳＨ基を対応するエーテルまたはチオエーテル誘導体に転換することも可能である。
リンカーの例にはアルキルおよびヘテロアルキル部分が含まれる。リンカーには、例えば−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などのアシルベースの連結基といった連結基が含まれる。連結基は、例えばグリコシル部分とリンカー（Ｌ）の間またはリンカーと修飾基（Ｒ１）の間といったように本発明の種の成分の間で形成される結合である。その他の連結基はエーテル、チオエーテルおよびアミンである。例えば、１つの実施形態においては、リンカーはグリシン残基といったようなアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部分は、グリコシル残基上のアミンとの反応により対応するアミドに転換され、グリシンのアミンは、修飾基の活性化カルボン酸または炭酸塩との反応により対応するアミドまたはウレタンに転換される。
もう１つのリンカー例は、ＰＥＧ部分またはアミノ酸残基で官能化されたＰＥＧ部分である。ＰＥＧは、１つのＰＥＧ末端でアミノ酸残基を通してグリコシル基に結合され、もう一方のＰＥＧ末端を通してＲ１に結合されている。代替的にはアミノ酸残基はＲ１に結合され、アミノ酸に結合していないＰＥＧ末端はグリコシル基に結合される。Ｌ−Ｒ１のための種の例は、−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨ｝ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｏ（ＣＨ２）ｄＮＨ｝ｔＲ１という式を有し、式中指標ｓおよびｔは独立して０または１である。指標ａ、ｂおよびｄは独立して０〜２０の整数であり、ｃは１〜２５００の整数である。その他の類似のリンカーは、ＮＨ部分が例えば−Ｓ、−ＯおよびＣＨ２により置換えられている種に基づくものである。
より特定的には、本発明は、Ｌ−Ｒ１が
ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、
ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、
ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｃＯ（ＣＨ２）ｄＮＨＲ１、
ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、
ＮＨ（ＣＨ２）ａＮＨＲ１、およびＮＨＲ１である化合物を提供する。これらの式においては、指標のａ、ｂおよびｄは独立して０〜２０、好ましくは１〜５の整数の中から独立して選択されている。指標ｃは１〜２５００の整数である。
一実施形態例では、Ｇはシアル酸であり、本発明の選択される化合物は以下の式を有する。
Figure 0004719686
当業者であれば、上述の化合物の例の中のシアル酸部分を、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、そのＮ−アセチル誘導体などを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）任意のその他のアミノ−糖類で置換えることができるということを認識するだろう。
もう１つの例においては、糖の一級ヒドロキシル部分が修飾基で官能化される。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルを対応するアミンに転換し官能化させて本発明に従った化合物を提供することができる。この実施形態に従った式には次のものが含まれる。
Figure 0004719686
さらなる実施形態例においては、本発明は、上述のもののようなリンカー修飾基カセットを担持する対応するアミン部分に６−ヒドロキシル位が転換されている修飾型糖を提供する。これらの修飾型糖のコアとして使用できるサッカリル基の例としては、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎなどが含まれる。この実施形態に従った代表的な修飾型糖は、
Figure 0004719686
という式を有し、ここでＲ３〜Ｒ５およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３から独立して選択されるメンバーである。Ｒ６は上述の通りのＯＲ１、ＮＨＲ１またはＬ−Ｒ１である。
本発明の選択される抱合体はマンノース、ガラクトースまたはグルコースまたはマンノース、ガラクトースまたはグルコースの原子空間配置をもつ種に基づいている。これらの抱合体の一般式は以下の通りである：
Figure 0004719686
もう１つの実施形態例においては、本発明は、対応するヌクレオチド糖として活性化される上述の通りの化合物を提供する。その修飾された形態で本発明において使用される糖ヌクレオチドの例としては、一、二または三リン酸ヌクレオチドまたはその類似体が含まれる。好ましい実施形態においては、修飾型糖ヌクレオチドはＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシドまたはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらに一層好ましくは、修飾型糖ヌクレオチドの糖ヌクレオチド部分はＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。一実施形態例においては、ヌクレオチドホスファートはＣ−１に付着させられる。
かくして、グリコシル部分がシアル酸である実施形態例においては、本発明は以下の式をもつ化合物を提供する。
Figure 0004719686
［なお式中Ｌ−Ｒ１は上述の通りであり、Ｌ１−Ｒ１は修飾基に結合されたリンカーを表わす。Ｌの場合と同様、Ｌ１に従ったリンカー種の例には結合、アルキルまたはヘテロアルキル部分が含まれる。これらの実施形態に従った修飾型糖ヌクレオチド化合物の例が図１および図２に記されている。
もう１つの実施形態例においては、本発明は、例えばペプチド、脂質およびアグリコンなどの基質と本発明の修飾型糖の間、より特定的には糖ペプチドまたは糖脂質のグリコシル残基と修飾型糖の間で形成される抱合体を提供する。この実施形態においては、修飾型糖の糖部分は、基質と修飾基の間に介在させられるグリコシル連結基となる。グリコシル連結基の例としては、連結基を形成する単数または複数のグリコシル部分が化学物質（例えばメタ過ヨウ酸ナトリウム）または酵素的プロセス（例えばオキシダーゼ）によって分解されない無傷グリコシル連結基がある。本発明の選択される抱合体には、例えばマンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミノ−糖類のアミン部分に付着させられる修飾基を内含する。このモチーフに従った修飾基−無傷グリコシル連結基カセットの例は、以下の式を有するものといったようなシアル酸構造に基づいている：
Figure 0004719686
この式中、Ｒ１、Ｌ１およびＬ２は以上で記述した通りである。
さらにもう１つの実施形態例においては、抱合体は、中で修飾基がサッカリル部分の６炭素位にリンカーを通して付着しているサッカリル部分の１位と基質の間に形成される。かくして、この実施形態に従った抱合体の例は、
Figure 0004719686
という式を有し、ここでラジカルは上述の通りである。当業者であれば、上述の修飾されたサッカリル部分を同じく２、３、４または５個の炭素原子に抱合させることができる、ということを認識するであろう。
この実施形態に従った実施形態例には
Figure 0004719686
という式を有する化合物が含まれ、式中、Ｒ基および指標は上述の通りである。
本発明は同様に、６炭素位置においてＬ−Ｒ１で修飾される糖ヌクレオチドを提供する。この実施形態に従った種の例には、
Figure 0004719686
が含まれ、ここでＲ基およびＬは上述の通りの部分を表わす。指標「ｙ」は０、１または２である。
本発明のさらなるヌクレオチド糖の例は、ＧＤＰマンノースの原子空間配置を有する種に基づいている。この実施形態に従った種の一例は、
Figure 0004719686
という構造を有する。
さらにもう１つの実施形態例では、本発明は、ＵＤＰガラクトースの原子空間配置に基づく抱合体を提供する。この実施形態に従った化合物の例は、以下の構造を有する：
Figure 0004719686
もう１つの実施形態例においては、ヌクレオチド糖は、グルコースの原子空間配置に基づいている。この実施形態に従った種の例は、
Figure 0004719686
という式を有する。
修飾基Ｒ１、は水溶性ポリマー、非水溶性ポリマー、治療剤、診断用作用物質などを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）一定数の種のうちのいずれかである。修飾基の例の性質について以下でさらに詳述する。
修飾基
水溶性ポリマー
数多くの水溶性ポリマーは、当業者にとって既知のものであり、又本発明を実施する上で有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えばポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えばポリ（アクリル酸）、ポリ（エステル）、例えばポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などといったような種を包含する。本発明は、ポリマーが抱合体の残りのものを付着させることのできる箇所を含んでいなければならないということを唯一の限定として、あらゆる水溶性ポリマーで実施可能である。
ポリマーの活性化のための方法は同様に、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書にも、そして国際公開第９３／１５１８９号パンフレット内にさらに多く見出すことができ、活性化されたポリマーとペプチドの間の抱合については、例えば凝固因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素担持分子（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リポヌクレアーゼおよびスーパーオキシド・ジスムターゼ（ヴェロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１１号、１４１〜４５頁（１９８５年））に見い出すことができる。
好ましい水溶性ポリマーは、ポリマー試料中の実質的な割合の複数のポリマー分子がほぼ同じ分子量を有するようなものである。このようなポリマーは「ホモ分散」である。
本発明について、ポリ（エチレングリコール）抱合体を基準にしてさらに例示する。ＰＥＧの官能化および抱合に関するいくつかの概説およびモノグラフが入手可能である。例えばハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５、３２５〜３７３頁（１９８５年）；スクーテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１３５号、３０〜６５頁（１９８７年）；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．第１４号、８６６〜８７４頁（１９９２年）；デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第９号、２４９〜３０４頁（１９９２年）；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．第６号、１５０〜１６５頁（１９９５年）；およびバドラ（Ｂｈａｄｒａ）ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、第５７号、５〜２９頁（２００２年）を参照のこと。反応性ＰＥＧ分子を調製し反応性分子を用いて抱合体を形成するための経路が当該技術分野において知られている。例えば米国特許第５，６７２，６６２号は、線形または分岐ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン系アルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性で単離可能な抱合体を開示している。
米国特許第６，３７６，６０４号明細書は、有機溶媒中でジ（１−ベンゾトリアゾイル）カルボナートとポリマーの末端ヒドロキシルを反応させることにより水溶性非ペプチドポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカルボナートエステルを調製するための方法について記述している。活性エステルは、タンパク質またはペプチドといったような生物学的に活性な作用物質と抱合体を形成するために使用される。
国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、安定した連結を通してポリマー主鎖に連結された少なくとも１つの末端をもつポリマー主鎖を含む活性化された水溶性ポリマーおよび生物学的に活性な作用物質を含む抱合体において、少なくとも１つの末端が分岐する部分に連結された近位反応基を有する分岐する部分を含み、ここで生物学的に活性な作用物質が近位反応基の少なくとも１つに連結されている抱合体について記述している。その他の分岐ポリ（エチレングリコール）については国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記述されており、米国特許第５，９３２，４６２号明細書は、反応性官能基を含む分岐末端を含む分岐ＰＥＧ分子で形成された抱合体について記述する。遊離反応基は、ポリ（エチレングリコール）と生物学的に活発な種の間で抱合体を形成するタンパク質またはペプチドといったような生物学的に活性な種と反応するように利用可能である。米国特許第５，４４６，０９０号明細書は、２機能ＰＥＧリンカーおよびＰＥＧリンカー末端の各々においてペプチドを有する抱合体を形成する上でのその使用について記述している。
分解可能なＰＥＧ連結を内含する抱合体については国際公開第９９／３４８３３号パンフレットおよび国際公開第９９／１４２５９号パンフレットならびに米国特許第６，３４８，５５８号明細書中に記述されている。このような分解可能な連結は、本発明において応用可能である。
当該技術分野において認められた上述のポリマー活性化方法は、本書で記述する分岐ポリマーの形成においてと同様、例えば糖、糖ヌクレオチドなどのその他の種にこれらの分岐ポリマーを抱合させるために、本発明の状況下で有用である。
本発明において有用なポリ（エチレングリコール）分子の例としては、
Figure 0004719686
という式をもつものが含まれ（ただしこれらに限定されるわけではない）、式中Ｒ８はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、例えばアセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ２）ｑ、または−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ）Ｚ１である。指標「ｅ」は１〜２５００の整数を表わす。指標ｂ、ｄおよびｑは独立して０〜２０の整数を表わす。記号ＺおよびＺ１は独立してＯＨ、ＮＨ２、遊離基、例えばイミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハロゲン化物、Ｓ−Ｒ９、活性化されたエステルのアルコール部分；−（ＣＨ２）ｐＣ（Ｙ１）Ｖ、または−（ＣＨ２）ｐＵ（ＣＨ２）ｓＣ（Ｙ１）ｖを表わす。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ１０を表わす。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ１、Ａ１およびＵは独立して部分Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ１１を表わす。記号ＶはＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１２、活性化されたエステルのアルコール成分、活性化されたアミドのアミン成分、糖−ヌクレオチドおよびタンパク質を表わす。記号ｐ、ｑ、ｓおよびｖは０〜２０の整数から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換のヘテロアリールを表わす。
その他の実施形態例では、ポリ（エチレングリコール）分子は以下の中から選択される：
Figure 0004719686
本発明の抱合体を形成する上で有用なポリ（エチレングリコール）は、線形または分岐のいずれかである。本発明で使用するのに適した分岐ポリ（エチレングリコール）分子は、
Figure 0004719686
という式により記述されるものを含み（ただしこれらに限定されるわけではない）、式中Ｒ８およびＲ８’は上述のＲ８について定義された基から独立して選択されるメンバーである。Ａ１およびＡ２は、以上でＡ１について定義されている基から独立して選択されるメンバーである。指標ｅ、ｆ、ｏおよびｑは上述の通りである。ＺおよびＹは上述の通りである。Ｘ１およびＸ１’はＳ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨから独立して選択されるメンバーである。
その他の実施形態例においては、分岐ＰＥＧはシステイン、セリン、またはジ−リジンコアに基づいている。かくして、さらなる分岐ＰＥＧには、次のものが含まれる：
Figure 0004719686
さらにもう１つの実施形態においては、分岐ＰＥＧ部分はトリ−リジンペプチドに基づいている。トリリジンは、モノ、ジ、トリまたはテトラ−ＰＥＧ化され得る。この実施形態に従った種の例は：
Figure 0004719686
という式を有し、式中ｅ、ｆおよびｆ’は１〜２５００の独立して選択される整数であり、ｑ、ｑ’およびｑ’’は１〜２０の独立して選択される整数である。
本発明の実施形態例においては、ＰＥＧはｍ−ＰＥＧ（５ｋＤ、１０ｋＤまたは２０ｋＤ）である。分岐ＰＥＧ種の例としては、ｍ−ＰＥＧが２０ｋＤｍ−ＰＥＧであるセリンまたはシステイン−（ｍ−ＰＥＧ）２がある。
当業者には明白であるように、本発明の中で有用である分岐ポリマーは上述のテーマに対する変形形態が含まれる。例えば、上述のジ−リジン−ＰＥＧ抱合体は３つのポリマーサブユニットを含むことができ、３番目は以上の構造中に未修飾として示されているα−アミンに結合されている。同様にして、３つまたは４つのポリマーサブユニットで官能化されたトリ−リジンの使用は本発明の範囲内に入る。
本発明に従った特定の実施形態には、
Figure 0004719686
および炭酸塩およびこれらの種の活性エステル例えば、
Figure 0004719686
が含まれる。
本書に記されている化合物を調製する上で有用である線形および分岐ＰＥＧを活性化するのに適したその他の活性化または離脱基には、
Figure 0004719686
が含まれるがこれらに限定されるわけではない。これらのおよびその他の種で活性化されるＰＥＧ分子および活性化されたＰＥＧの製造方法が国際公開第０４／０８３２５９号パンフレットの中に記されている。
当業者であれば、分岐ポリマーのｍ−ＰＥＧの腕のうちの単数または複数のものを、異なる末端を伴うＰＥＧ部分例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２−Ｃ１０−アルキルなどにより置き換えできるということがわかるだろう。さらに、上述の構造は、側鎖の官能基とα−炭素原子の間にアルキルリンカーを挿入すること（または炭素原子を除去すること）によって直ちに修飾される。かくして、「ホモ」誘導体および高級相同体ならびに低級相同体が本発明で有用な分岐ＰＥＧのためのコアの範囲内に入る。
本書に記されている分岐ＰＥＧ種は、以下のスキーム中で記されているもののような方法で容易に調製される：
Figure 0004719686
なお式中、ＸａはＯまたはＳ、ｒは１〜５の整数、指標ｅおよびｆは独立して選択される１〜２５００の整数である。
かくして、このスキームに従うと、天然および非天然アミノ酸は、側鎖ヘテロ原子Ｘａをアルキル化することにより１を形成する、このケースではトシラートである活性化されたｍ−ＰＥＧ誘導体と接触させられる。単官能化されたｍ−ＰＥＧアミノ酸は、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体と共にＮ−アシル化条件に付され、かくして分岐ｍ−ＰＥＧ２を組立てる。当業者であればわかるように、トシラート離脱基を、例えばハロゲン、メシラート、トリフラートなどのあらゆる適切な離脱基で置き換えることができる。同様にして、アミンをアシル化するために利用される反応性炭酸塩を活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミドなどで置き換えることができ、又ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどといった脱水剤を用いてインサイチュで酸を活性化させることができる。
実施形態例においては、修飾基はＰＥＧ部分であるが、適切な連結を通してグリコシル部分の中に、例えば水溶性ポリマー、非水溶性ポリマー、治療用部分などといったあらゆる修飾基を取込むことが可能である。修飾型糖は、酵素的手段、化学的手段またはその組合せにより形成され、かくして修飾型糖を産生する。実施形態例においては、糖は、修飾用部分の付着を可能にしそれでもなお糖がペプチドに対する修飾型糖のカップリングの能力をもつ酵素のための基質として機能できるようにするあらゆる位置で活性アミンで置換される。実施形態例においては、ガラクトサミンが修飾型糖である場合、アミン部分は６位で炭素原子に付着されている。
本発明は同様に、中で糖部分が修飾されているヌクレオチド糖をも提供している。修飾型糖ヌクレオチドの例には、糖上でアミン部分を通して修飾される糖質が担持されている。例えば糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体である修飾型糖ヌクレオチドも同じく、本発明の方法において有用である。例えば、サッカリルアミン（修飾基無し）をペプチド（またはその他の種）に酵素的に抱合させ、それに続いて遊離サッカリルアミン部分を所望の修飾基に抱合させることができる。代替的には、修飾型糖ヌクレオチドは、例えばペプチド、糖ペプチド、脂質、アグリコン、糖脂質などの上でサッカリルアクセプタに修飾型糖を転移する酵素のための基質として機能することができる。
糖類コアがガラクトースまたはグルコースである一実施形態においては、Ｒ５はＮＨＣ（Ｏ）Ｙである。
一実施形態例においては、修飾型糖は６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分に基づいている。以下でＮ−アセチルガラクトサミンについて示されているように、６−アミノ糖部分は、標準的方法によって容易に調製される。
Figure 0004719686
以上のスキームにおいては指標ｎは１〜２５００、好ましくは１０〜１５００、より好ましくは１０〜１２００の整数を表わす。記号「Ａ」は、活性化基、例えばハロ、活性化されたエステルの１成分（例えばＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル）、炭酸塩の１成分（例えばｐ−ニトロフェニルカルボナート）などを表わす。当業者であれば、この方法および類似の方法によりその他のＰＥＧアミドヌクレオチドが容易に調製されるということを認識することだろう。
その他の実施形態例においては、アミド部分がウレタンまたは尿素といったような基により置き換えられる。
さらなる実施形態においては、Ｒ１は分岐ＰＥＧ、例えば上述の種のうちの１つである。本実施形態に従った化合物の例としては、以下のものが含まれる：
Figure 0004719686
なお式中Ｘ４は１つの結合または０である。
さらに、以上で論述した通り、本発明は、直鎖または分岐のいずれかである水溶性ポリマーで修飾されるヌクレオチド糖を提供する。例えば、以下で示す式を有する化合物は、本発明の範囲内に入る：
Figure 0004719686
なお式中、Ｘ４は０または１つの結合である。
同様にして、本発明は、６位における炭素が修飾されているような修飾型糖のヌクレオチド糖を提供する：
Figure 0004719686
なお式中、Ｘ４は１つの結合または０である。
同様に提供されているのは、本発明の組成物を内含するペプチドおよび糖ペプチド、脂質および糖脂質の抱合体である。例えば、本発明は以下の式を有する抱合体を提供する：
Figure 0004719686
非水溶性ポリマー
以上で論述しているものと類似のもう１つの実施形態においては、修飾型糖は水溶性ポリマーではなく非水溶性ポリマーを含んでいる。本発明の抱合体は単数または複数の非水溶性ポリマーを含んでいてもよい。本発明のこの実施形態は、制御された形で治療用ペプチドを送達するためのビヒクルとしての抱合体の使用によって例示されている。ポリマー薬物送達系が、当該技術分野において知られている。例えばダン（Ｄｕｎｎ）ら、編「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．１９９１年を参照のこと。当業者であれば、本発明の抱合体に対し実質的にあらゆる既知の薬物送達系を応用することができるということがわかるだろう。
代表的な非水溶性ポリマーとしてはポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタラート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリ（エチルメタクリラート）、ポリ（ブチルメタクリラート）、ポリ（イソブチルメタクリラート）、ポリ（ヘキシルメタクリラート）、ポリ（イソデシルメタクリラート）、ポリ（ラウリルメタクリラート）、ポリ（フェニルメタクリラート）、ポリ（メチルアクリラート）、ポリ（イソプロピルアクリラート）、ポリ（イソブチルアクリラート）、ポリ（オクタデシルアクリラート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタラート）、ポリ（ビニルアセタート）、ポリビニルクロリド、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニクスおよびポリビニルフェノールおよびそのコポリマーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本発明の抱合体内で有用である合成的に修飾された天然ポリマーとしては、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエステル、セルロースエステルおよびニトロセルロースが含まれるがこれらに限定されるわけではない。広い合成的に修飾された天然ポリマークラスの特に好ましいメンバーとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセタート、プロピオン酸セルロース、酢酸セルロースブチラート、酢酸セルロースフタラート、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリルおよびメタクリルエステルおよびアルギン酸のポリマーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
本書で論述されているこれらのおよびその他のポリマーは、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ、ペンシルバニア州）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウイスコンシン州）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ニューヨーク州）、およびバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）といったような商業的供給源から容易に得ることができ、そうでなければ標準的技術を用いてこれらの供給業者から得られる単量体から合成可能である。
本発明の抱合体内で有用な代表的生物分解可能なポリマーにはポリラクチド、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタラート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、その配合物およびコポリマーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。特に有用であるのは、コラーゲン、プルロニクスなどを含むものといったゲルを形成する組成物である。
本発明において有用なポリマーには、その構造の少なくとも１部分の内部に生体再吸収可能な分子を有する非水溶性材料を内含する「ハイブリッド」ポリマーが含まれる。かかるポリマーの一例は、１つのポリマー鎖につき１つの生体再吸収可能な領域、１つの親水性領域および複数の架橋可能な官能基を有する非水溶性コポリマーを含むポリマーである。
本発明の目的で、「非水溶性材料」には、水または含水環境中で実質的に不溶である材料が含まれる。かくしてコポリマーの或る種の領域またはセグメントは親水性であるかさらには水溶性であり得るものの、ポリマー分子に全体として、いかなる実質的量でも水中には溶解しない。
本発明の目的では、「生体再吸収可能な分子」という用語には、身体により代謝または崩壊され再吸収されかつ／または正常な排泄経路を通して除去される能力をもつ領域が含まれる。かかる代謝生成物または崩壊生成物は好ましくは実質的に体に対し非毒性である。
コポリマー組成物が全体として水溶性にされないかぎり、生体再吸収可能な領域は疎水性かまたは親水性のいずれかであり得る。かくして、生体再吸収可能な領域は、ポリマーが全体として非水溶性にとどまるという選好性に基づいて選択される。従って、相対的特性すなわち生体再吸収可能な領域および親水性領域により含有される官能基の種類および相対的割合は、有用な生体再吸収可能な組成物が必ず非水溶性にとどまるように選択される。
再吸収可能なポリマーの例としては、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に産生された再吸収可能なブロックコポリマーが含まれる（コーン（Ｃｏｈｎ）ら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書を参照のこと）。これらのコポリマーは架橋されず水溶性を有し、従って身体は分解されたブロックコポリマー組成物を排泄することができる。ユーネス（Ｙｏｕｎｅｓ）ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．第２１号、１３０１〜１３１６頁（１９８７年）；およびコーンら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．第２２号、９９３〜１００９頁（１９８８年）。
現在好まれている生体再吸収可能なポリマーには、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カルボナート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、多糖類およびそれらの混合物から選択される単数または複数の成分およびその混合物が含まれる。さらにより一層好ましくは、生体再吸収可能なポリマーはポリ（ヒドロキシ）酸成分を内含する。ポリ（ヒドロキシ）酸のうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリブチル酸、ポリ吉草酸およびそのコポリマーおよび混合物が好まれる。
インビボで吸収される（「生体再吸収される」）フラグメントを形成することに加えて、本発明の方法において使用するための好ましいポリマーコーティングは同様に、排泄可能でかつ／または代謝可能なフラグメントを形成することができる。
本発明ではさらに高次のコポリマーも使用することができる。１９８４年３月２０付けのケーシー（Ｃａｓｅｙ）ら、の米国特許第４，４３８，２５３号明細書は、ポリ（グリコール酸）およびヒドロキシル末端のポリ（アルキレングリコール）のトランスエステル化から産生された三ブロックコポリマーについて開示している。このような組成物は、再吸収可能な単繊維縫合糸としての使用のために開示されている。かかる組成物の可とう性は、コポリマー構造内にテトラ−Ｐ−トリルオルトカルボナートといったような芳香族オルトカーボナートを取込むことによって制御される。
乳酸および／またはグリコール酸に基づくその他のポリマーも同様に利用可能である。例えば１９９３年４月１３日付けのスピヌー（Ｓｐｉｎｕ）の米国特許第５，２０２，４１３号明細書は、オリゴマージオールまたはジアミン残基のいずれかの上にラクチドおよび／またはグリコリドを開環重合しそれに続いてジイソシアナート、ジアシルクロリドまたはジクロロシランといった二官能化合物を用いて鎖拡張することによって産生されるポリアクチドおよび／またはポリグリコリドの逐次的に順序付けされたブロックを有する生物分解性多重ブロックコポリマーを開示している。
本発明において有用であるコーティングの生体再吸収可能な領域は、加水分解および／または酵素的に分割可能となるように設計され得る。本発明の目的では、「加水分解により分割可能な」という用語は、水または含水環境中での加水分解に対するコポリマー特に生体再吸収可能な領域の感受性を意味する。類似の要領で、本書で使用されている通りの「酵素的に分割可能な」という用語は、内因性または外因性酵素による分割に対するコポリマー特に生体再吸収可能な領域の感受性を意味する。
体内に導入された時点で、該親水性領域は、排泄可能なおよび／または代謝可能なフラグメントへと処理され得る。かくして、該親水性領域は例えばポリエステル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、多糖類、炭水化物、ペプチド、タンパク質およびそれらのコポリマー並びに混合物を含むことができる。さらに、親水性領域は同様に、例えばポリ（アルキレン）オキシドでもありうる。かかるポリ（アルキレン）オキシドは例えばポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドおよびそれらの混合物並びにコポリマーを内含し得る。
ヒドロゲルの成分であるポリマーは同様に、本発明においても有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収する能力をもつポリマー材料である。ヒドロゲル形成化合物の例としては、ポリアクリル酸、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラギーナンおよびその他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、並びにそれらの誘導体などが含まれるがこれらに限定されるわけではない。安定性、生物分解性および生体再吸収性を備えたヒドロゲルを産生することができる。その上、ヒドロゲル組成物は、これらの特性のうちの１つ以上のものを示すサブユニットを含むことができる。
架橋を通してその無欠性を制御できる生体適合性あるヒドロゲル組成物が既知であり、本発明の方法において使用するために現在好まれている。例えばヒューベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）らの１９９５年４月２５日付け米国特許第５，４１０，０１６号明細書および１９９６年６月２５日付け米国特許第５，５２９，９１４号明細書では、２つの加水分解不安定拡張部分の間にはさまれた水溶性中央ブロックセグメントを有する架橋されたブロックコポリマーである水溶性系が開示されている。かかるコポリマーはさらに、光重合性アクリラート官能基でエンドキャッピングされる。架橋された時点で、これらの系はヒドロゲルとなる。かかるコポリマーの水溶性中央ブロックは、ポリ（エチレングリコール）を内含し得る。一方加水分解不安定性拡張部分は、ポリグリコール酸またはポリ乳酸といったようなポリ（α−ヒドロキシ酸）であり得る。ソーニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第２６号、５８１〜５８７頁（１９９３年）を参照のこと。
もう１つの好ましい実施形態においては、ゲルは熱可逆性ゲルである。プルロニクス、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン尿素ヒドロゲルおよびその組合せといった成分を含む熱可逆性ゲルが現在好まれている。
さらにもう１つの実施形態例では、本発明の抱合体は、リポソームの成分を含む。リポソームは、例えば１９８５年６月１１日付けのエプシュタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）らの米国特許第４，５２２，８１１号明細書内で記述されているように、当業者にとって既知の方法に従って調製可能である。例えば、後に蒸発させられて容器の表面上に乾燥した脂質の薄いフィルムを残す無機溶媒の中に適切な脂質（例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリンおよびコレステロール）を溶解させることにより、リポソーム製剤を調製することができる。活性化合物およびその薬学的に受容可能な塩の水溶液を次に容器内に導入する。その後、容器を手で回転させて容器の側面から脂質材料を遊離させ、脂質凝集体を分散させ、かくしてリポソーム懸濁液を形成する。
上述の微粒子および微粒子の調製方法は一例として提供されているものであり、これらは本発明中で有用である微粒子の範囲を画定することを意図したものではない。異なる方法によって製造される数々の微粒子が本発明において有用なものであるということが当業者にとって明らかとなるだろう。水溶性ポリマーの状況の下で以上で論述されている直鎖および分岐の両方の構造的形式が、非水溶性ポリマーに関しても一般にあてはまる。かくして例えば、システイン、セリン、ジリジンおよびトリリジン分岐コアが２つの非水溶性ポリマー部分で官能化され得る。これらの種を産生するのに用いられる方法は、一般に水溶性ポリマーを産生するのに用いられるものときわめて類似している。
方法
上述の抱合体に加えて、本発明はこれらの抱合体およびその他の抱合体を調製するための方法を提供している。さらに、本発明は、疾病を発生するリスクの高い対象または疾病をもつ対照に対して本発明の抱合体を投与することにより疾病状態を予防し、治ゆし改善する方法を提供する。
かくして、本発明は選択される部分とペプチド、糖脂質またはアグリコン（例えばセラミドまたはスフィンゴシン）の間で共有結合抱合体を形成する方法を提供する。例示を明確にするため、本発明は、ペプチドと本発明の活性化された修飾型糖の修飾されたグリコシル部分の間で形成された抱合体を基準として例示される。当業者であれば、本発明が、その活性化された修飾型糖を用いてアグリコンおよび糖脂質の抱合体を形成する方法をも同様に包含しているということがわかるだろう。
実施形態例においては、抱合体は水溶性ポリマー、治療用部分、ターゲティング部分または生体分子と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドの間で形成される。ポリマー、治療用部分または生体分子は、ペプチドと修飾基（例えば水溶性ポリマー）の両方の間に介在させられこれらに対し共有結合によって連結されたグリコシル連結基を介してペプチドに抱合させられる。該方法は、修飾型糖を基質（例えばペプチド、アグリコン、糖脂質）に抱合する例えばグリコシルトランスフェラーゼといった酵素および修飾型糖を含有する混合物とペプチドを接触させる工程を含む。反応は、修飾型糖とペプチド（またはその他の基質）の間に共有結合を形成するのに適した条件の下で実施される。修飾型糖の糖部分は好ましくは、ヌクレオチド糖から選択される。
アクセプタペプチドは、標準的には新たに合成されるかまたは、原核細胞（例えば細菌細胞例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内または哺乳動物、酵母、昆虫、真菌または植物細胞といった真核細胞内で組換えにより発現される。ペプチドは、全長タンパク質またはフラグメントのいずれかであり得る。その上、ペプチドは、野生型または突然変異を受けたペプチドであり得る。１つの実施形態例においては、ペプチドは、ペプチド配列に対し１つ以上のＮまたはＯ連結型グリコシル化部位を付加する突然変異を含む。
本発明の方法は同様に、組換えにより産生される不完全にグリコシル化されたペプチドの修飾をも提供する。数多くの組換えにより産生された糖タンパク質は不完全にグリコシル化され、例えば免疫原性、ＲＥＳによる認識といった望ましくない特性を有しうる炭水化物残基を曝露する。本発明の方法における修飾型糖を利用して、ペプチドを例えば水溶性ポリマー、治療剤などと同時にさらにグリコシル化し誘導体化することができる。修飾型糖の糖部分は、完全にグリコシル化されたペプチドの中のアクセプタに適切に抱合されることになる残基または望ましい特性をもつもう１つの糖部分であり得る。
当業者であれば、本発明があらゆる供給源からの実質的にあらゆるペプチドまたは糖ペプチドを用いて実施できるということがわかるだろう。本発明を実施するのに用いることのできるペプチドの例は、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットおよびその中に記された参考文献中で記されている。
本発明の方法により修飾されるペプチドは合成または野生型ペプチドであり得、そうでなければ部位特異的突然変異誘発といった当該技術分野において既知の方法により産生される、突然変異を受けたペプチドであり得る。ペプチドのグリコシル化は、標準的にはＮ連結型またはＯ連結型である。Ｎ−連結の例は、アスパラギン残基の側鎖に対する修飾型糖の付着である。Ｘがプロリン以外のあらゆるアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。かくしてポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ連結型グリコシル化というのは、ヒドロキシアミノ酸好ましくはセリンまたはトレオニンのヒドロキシ側鎖に対する１つの糖（例えばＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）の付着を意味するが、例えば５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンなどの通常でないまたは非天然のアミノ酸を使用することも可能である。
その上、ペプチドに対する付加に加えて、本発明の方法は、その他の生物学的構造（例えばグリコシル化部位を含有する糖脂質、脂質、スフィンゴイド、セラミド、全細胞など）を用いて実施することができる。
ペプチドまたはその他の構造に対するグリコシル化部位の添加は、それが１つ以上のグリコシル化部位を含有するような形でアミノ酸配列を改変させることによって都合良く達成される。該添加は同様に、（Ｏ連結型グリコシル化部位について）ペプチドの配列内で好ましくはセリンまたはトレオニン残基といった−ＯＨ基を提示する１つ以上の種を取込むことによっても実施可能である。該添加は、ペプチドの突然変異または完全化学合成により行なうことができる。ペプチドアミノ酸配列は好ましくは、特に、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成されるように予め選択される塩基においてペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通して改変される。ＤＮＡ突然変異は好ましくは当該技術分野において既知の方法を用いて行なわれる。
実施形態例においては、ポリヌクレオチドをシャッフリングすることによりグリコシル化部位が添加される。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドをＤＮＡシャッフリングプロトコルで変調させることができる。ＤＮＡシャッフリングは関連する遺伝子のプールの無作為断片化とそれにつづくポリメラーゼ連鎖反応様のプロセスによるフラグメントの再組立てによって実施される反復的組換えと突然変異のプロセスである。例えばステッマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１号、１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）；ステッマー、Ｎａｔｕｒｅ、第３７０号、３８９〜３９１頁（１９９４年）；および米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８３７，４５８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書および同第５，８１１，２３８号明細書を参照のこと。
本発明を実施するのに用いることのできるペプチドの例、グリコシル化部位を付加または除去する方法およびグリコシル構造またはサブ構造を付加または除去する方法が、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットおよびそれに関連する米国特許およびＰＣＴ出願に詳述されている。
本発明は同様に、ペプチドに対して１つ以上の選択されるグリコシル残基を添加（または除去）しその後修飾型糖をペプチドの選択されるグリコシル残基の少なくとも１つに抱合させる手段をも提供する。本実施形態は例えば、ペプチド上に存在しないかまたは所望の量では存在しないかのいずれかである選択されるグリコシル残基に修飾型糖を抱合させることが望まれる場合に有用である。かくして、ペプチドに対し修飾型糖をカップリングする前に、選択されるグリコシル残基は酵素または化学的カップリングによりペプチドに抱合される。もう１つの実施形態においては、糖ペプチドのグリコシル化パターンは、糖ペプチドからの炭水化物残基の除去によって、修飾型糖の抱合の前に改変される。国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照のこと。
糖ペプチド上に存在するあらゆる炭水化物部分の添加または除去は、化学的または酵素的に達成される。化学的脱グリコシル化は好ましくは化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価の化合物に対するポリペプチド変異体の曝露によってもたらされる。この処置の結果、ペプチドを無傷の状態に保ちながら、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いて大部分または全ての糖が分割されることになる。化学的脱グリコシル化は、ハキマディン（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第２５９号、５２頁（１９８７年）によっておよびエッジ（Ｅｄｇｅ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１１８号、１３１頁（１９８１年）によって記述されている。ポリペプチド変異体上の炭化水素部分の酵素的分割は、トタクラ（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１３８号、３５０頁（１９８７年）により記述されている通りさまざまなエンドおよびエキソ−グルコシダーゼを使用することによって達成可能である。
グリコシル部分の化学的付加は、当該技術分野が認めているあらゆる方法によって実施される。糖部分の酵素的付加は好ましくは、本発明で使用される修飾型糖を未変性グリコシル単位で置換して本書に記されている方法の修飾を用いて達成される。糖部分を付加するその他の方法が米国特許第５，８７６，９８０号；第６，０３０，８１５号；第５，７２８，５５４号および第５，９２２，５７７号明細書中で開示されている。
選択されるグリコシル残基のための付着点の例としては、以下のものが含まれるがこれらに限定されるわけではない；（ａ）Ｎ−連結型グリコシル化のためのコンセンサス部位およびＯ連結型グリコシル化のための部位；（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプタである末端グリコシル部分；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離カルボキシル基；（ｅ）システインのものといったような遊離スルフヒドリル基；（ｆ）セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンのものといったような遊離ヒドロキシル基；（ｇ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのものといったような芳香族残基；または（ｈ）グルタミンのアミド基。本発明において有用な方法の例は、１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号パンフレットおよびアルピン（Ａｐｌｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）、ＣＲＣ ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．２５９〜３０６頁（１９８１年）中に記述されている。
一実施形態においては、本発明は連結基を通して２つ以上のペプチドを連結するための方法を提供する。連結基は、有用なあらゆる構造のものであってよく、直鎖および分岐鎖構造から選択され得る。好ましくは、１つのペプチドに付着されるリンカーの各末端は、修飾型糖（すなわち発生期の無傷のグリコシル連結基）を内含する。
本発明の方法の例においては、２つのペプチドは、ポリマーリンカー（例えばＰＥＧリンカー）を含むリンカー部分を介して互いに連結される。構成体は上述の画像（Ｃａｒｔｏｏｎ）の中で記されている一般的構造に適合している。本書で記述されているように、本発明の構成体は、２つの無傷のグリコシル連結基（すなわちｓ＋ｔ＝１）を内含する。２つのグリコシル基を内含するＰＥＧリンカーに焦点が合わせられることの目的は明確さにあり、これが本発明のこの実施形態において有用なリンカーの腕の同一性に対する限定となると解釈されるべきではない。
かくして、ＰＥＧ部分は第１の末端で第１のグリコシル単位でそして第２の末端で第２のグリコシル単位で官能化されている。第１および第２のグリコシル単位は好ましくは異なるトランスフェラーゼのための基質であり、それぞれ第１および第２のグリコシル単位に対する第１および第２のペプチドの直交する付着を可能にする。実際には、（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２リンカーは第１のペプチドおよび、第１のグリコシル単位がその基質であり第１のトランスフェラーゼと接触させられ、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２を形成する。トランスフェラーゼおよび／または未反応ペプチドはその後任意選択で反応混合物から除去される。第２のペプチドおよび第２のグリコシル単位がその基質である第２のトランスフェラーゼは、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２抱合体に付加され、（ペプチド）１−（グリコシル）１−ＰＥＧ−（グリコシル）２−（ペプチド）２を形成する。グリコシル残基の少なくとも１つは、直接的または間接的にＯ連結される。当業者であれば、以上で概略的に示した方法が同様に、例えば分岐ＰＥＧ、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖などの使用による２つ以上のペプチドの間での抱合体の形成にも同様に応用可能である、ということがわかるだろう。
修飾型糖の調製
一般に、糖部分または糖部分リンカーカセットおよびＰＥＧまたはＰＥＧリンカーカセット基は、標準的に連結プロセスにより新しい有機官能基または非反応性種へと変換される反応基を使用することで互いに連結される。糖反応性官能基は、糖部分上の任意の位置にある。本発明を実施するのに有用な反応基および反応クラスは一般に、生物抱合体化学の技術分野において周知のものである。反応性糖部分と共に利用可能な現在好まれている反応クラスは、比較的穏やかな条件で進行するものである。これらには、求核置換反応（アシルハロゲン化物、活性エステルとアミンおよびアルコールの反応）、求電子置換反応（例えばエナミン反応）および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合に対する付加（例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらのおよびその他の有用な反応が例えばマーチ（Ｍａｒｃｈ）、「ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年；ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６年；およびフィーネイ（Ｆｅｅｎｅｙ）ら、「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９８２年の中で論述されている。
糖の核からペンダントする有用な反応性官能基または修飾基には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾルエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）カルボキシル基およびさまざまな誘導体；
（ｂ）例えばエステル、エーテル、アルデヒドなどに転換され得るヒドロキシル基；
（ｃ）例えばアミン、カルボキシラートアニオン、チオールアニオン、カルバニオンまたはアルオキシドイオンといったような求核基でハロゲン化物が後に変位させられて、ハロゲン原子の官能基における新しい基の共有結合を結果としてもたらす可能性のあるハロアルキル基；
（ｄ）例えばマレイミド基といったようなディールス−アルダー反応に関与する能力をもつ求ジエン基；
（ｅ）例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムといったようなカルボニル誘導体の形成を介してまたは、グリニャール付加またはアルキルリチウム付加といった機序を介して後続する誘導体化が可能となるようなアルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するべくアミンと後に反応するためのハロゲン化スルホニル基；
（ｇ）例えばジスルフィドに転換されるかまたはハロゲン化アシルと反応し得るチオール基；
（ｈ）例えばアシル化、アルキル化または酸化可能であるアミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば付加環化、アシル化、マイケル付加を受け得るアルケン；
（ｊ）例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応し得るエポキシド。
反応性糖の核または修飾基を組立てるのに必要な反応に関与しないまたはこれと干渉しないように選択することが可能である。代替的には、反応性官能基を、保護基の存在により反応に関与しないように保護することが可能である。当業者であれば、選択される１組の反応条件と干渉しないように特定の官能基をいかにして保護するかがわかる。有用な保護基の例については、例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年を参照のこと。
以下の論述においては、本発明を実施する上で有用である修飾型糖の一定数の特定の例が記されている。実施形態例においては、修飾基が付着されている糖の核としてシアル酸誘導体が利用される。シアル酸誘導体に論述の焦点をあてているのは、例示を明確にする目的のためにすぎず、これを本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。当業者であれば、一例としてシアル酸を用いて記されているものと類似の要領で、さまざまなその他の糖部分を活性化し誘導体化することができるということを認識することだろう。例えば、当該技術分野により認識された方法で容易に修飾されるいくつかの糖基質を挙げるだけでも、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびフコースなどを修飾するための数多くの方法が利用可能である。例えばエルハラビ（Ｅｌｈａｌａｂｉ）ら、第６号、９３頁（１９９９年）；およびシャファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第６５号、２４頁（２０００年））を参照のこと。
実施形態例においては、本発明の方法により修飾されるペプチドは、哺乳動物の細胞（例えばＣＨＯ細胞）または遺伝子導入動物の体内で産生される糖ペプチドであり、従って不完全にシアリル化されたＮおよび／またはＯ連結型オリゴ糖鎖を含有する。シアル酸が欠如し末端ガラクトース残基を含有する糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化、ＰＰＧ化されるかまたはその他の形で修飾済みシアル酸により修飾され得る。
スキーム１では、アミノグリコシド１は、保護されたアミノ酸（例えばグリシン）誘導体の活性エステルで処理されて、糖アミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加体へと転換する。付加体はアルドラーゼで処理されて、α−ヒドロキシカルボキシレート２を形成する。化合物２は、ＣＭＰ−ＳＡシンテターゼの作用により対応するＣＭＰ誘導体に転換され、その後ＣＭＰ誘導体は接触水素化されて化合物３を産生する。グリシン付加体の形成を介して導入されたアミンは、活性化されたＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えばＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）と化合物３を反応させることによるＰＥＧ付着の座として利用され、それぞれ４または５といった種を産生する。
スキーム１
Figure 0004719686
表１は、ＰＥＧ部分を用いて誘導体化された糖−リン酸塩の代表的例を示している。表１の化合物のうちのいくつかは、スキーム１の方法により調製される。その他の誘導体は当該技術分野により認められた方法により調製される。例えばケプラー（Ｋｅｐｐｌｅｒ）ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１１号、１１Ｒ頁（２００１年）；およびチャーター（Ｃｈａｒｔｅｒ）ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１０号、１０４９頁（２０００年））を参照のこと。その他のアミン反応性ＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は市販されているか、または当業者にとって容易にアクセス可能な方法により調製可能である。
Figure 0004719686
本発明を実施する上で有用な修飾型糖リン酸塩は、その他の位置でならびに上述の位置で置換され得る。現在好まれているシアル酸置換が、式ＩＩに記されている。
Figure 0004719686
なお式中、Ｘは、各ＲがＲ１〜Ｒ５から独立して選択されるメンバーであるものとして好ましくは−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ２−および−Ｎ（Ｒ）２から選択される連結基である。記号Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢは各々Ｘの同一性について上述された群の中から選択される基を表わす。Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢは、各々独立して選択され、従ってこれらは同じでも異なるものでもあり得る。記号Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、ＰＥＧ部分、治療用部分、生体分子またはその他の部分を表わす。代替的には、これらの記号は、ＰＥＧ部分、治療用部分、生体分子またはその他の部分に結合されるリンカーを表わす。
本書で開示されている抱合体に付着された部分の例には、ＰＥＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧ、カルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療用部分、診断用部分、マンノース−６−ホスファート、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−ホスファート、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、分岐型オリゴ糖類、ペプチドなどが含まれるがこれらに限定されるわけではない。糖類部分に対しさまざまな修飾基を抱合する方法は、当業者にとって容易に利用可能なものである（（「ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ、編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．１９９２年；ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ、編、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、第６８０号、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９７年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「ＢｌＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６年；およびＤｕｎｎら、編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、第４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．１９９１年）。
リンカー基（架橋基）
本発明の方法において使用するための修飾型糖の調製には、糖残基に対するＰＥＧ部分の付着そして好ましくはグリコシルトランスフェラーゼのための基質である安定した付加体の形成が含まれる。かくして、例えばＰＥＧおよび糖を抱合するために架橋剤とＰＥＧおよび糖部分の反応により形成されるものといったリンカーを使用することが往々にして好まれる。炭水化物部分に修飾基を付着させるために使用可能な２官能性化合物の例には、２官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが含まれるがこれらに限定されるわけではない。その他の分子に炭水化物を連結させるための一般的なアプローチが文献の中で既知である。例えばリー（Ｌｅｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８号、１８５６頁（１９８９年）；バチア（Ｂｈａｔｉａ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７８号、４０８頁（１９８９年）；ジャンダ（Ｊａｎｄａ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１２号、８８８６頁（１９９０年）およびベドナルスキ（Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ）ら、国際公開第９２／１８１３５号パンフレットを参照のこと。以下の論述においては、反応基は、発生基の修飾型糖の糖部分上で良性であるものとして処理される。論述の焦点は例示を明確にすることにある。当業者であれば、該論述が修飾基上の反応基に関わるものであることを認識するだろう。
戦略の１例には、ヘテロ２官能性架橋剤ＳＰＤＰ（ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートを用いた糖上への保護されたスルフヒドリルの取込みとそれに続く修飾基上へのもう１つのスルフヒドリルでのジスルフィド結合の形成のためのスルフヒドリルの脱保護が関与する。
ＳＰＤＰがグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する修飾型糖の能力に対し有害な影響を及ぼす場合、ジスルフィド結合を形成するために、２−イミノチオランまたはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）といった数々のその他の架橋剤のうちの１つが使用される。２−イミノチオランは一級アミンと反応し、一瞬にしてアミン含有分子上に脱保護されたスルフヒドリルを取込む。ＳＡＴＡは同様に一級アミンと反応するが、保護されたスルフヒドリルを取込み、これはその後、ヒドロキシルアミンを用いて脱アセチル化されて、遊離スルフヒドリルを生成する。各々のケースにおいて、取込まれたスルフヒドリルは、その他のスルフヒドリルまたは保護されたスルフヒドリル例えばＳＰＤＰと自由に反応して、所要のジスルフィド結合を形成する。
上述の戦略は、本発明において有用なリンカーの一例であるが、限定的な意味はない。ペプチドに対し修飾基を架橋するための異なる戦略において使用可能なその他の架橋剤が、入手可能である。例えば、ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジドおよびＴＰＭＰＨ（（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプトープロピオノヒドラジド）が穏やかな過ヨウ素酸塩処理により予め酸化された炭水化物部分と反応し、かくして架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩で生成されたアルデヒドの間にヒドラゾン結合を形成させる。ＴＰＣＨおよびＴＰＭＰＨは糖上に２−ピリジルチオン保護されたスルフヒドリル基を導入し、これは、ＤＴＴと脱保護され得、次に後続して、成分間のジスルフィド結合の形成といったような抱合のために使用可能である。
安定した修飾型糖を産生するためにジスルフィド結合が不適当であるとわかった場合には、成分間のより安定した結合を取込むその他の架橋剤を使用することができる。ヘテロ２官能性架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−ガマ−マルイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）およびＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は一級アミンと反応し、かくしてマレイミド基を成分上に導入する。マレイミド基はその後、前述の架橋剤により導入され得るその他の成分上のスルフヒドリルと反応して、成分間の安定したチオエーテル結合を形成することができる。成分間の立体障害が成分の活性またはグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する修飾型糖の能力のいずれかと干渉する場合には、成分間に長いスペーサの腕を導入し前述の架橋剤（すなわちＳＰＤＰ）のうちのいくつかの誘導体を内含する架橋剤を使用することができる。かくして、有用である適切な架橋剤が豊富に存在する。その各々は、最適なペプチド抱合体および修飾型糖の産生に対してそれが有する効果に応じて選択される。
分子内化学架橋で修飾型糖の成分を修飾するためにさまざまな試薬が使用される（架橋用試薬および架橋手順を再考するには、全て本明細書に参照により援用されているウオルド（Ｗｏｌｄ）、Ｆ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２５号、６２３〜６５１頁、１９７２年；ウィトール（Ｗｅｅｔａｌｌ）、Ｈ．Ｈ．、およびコーニー（Ｃｏｏｎｅｙ）、Ｄ．Ａ．「ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ」中、（ホルセンバーグ（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ）およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）編）３９５〜４４２頁、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ジー（Ｊｉ）、Ｔ．Ｈ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第９１号、５８０〜６０９頁、１９８３年；マットソン（Ｍａｔｔｓｏｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．第１７号、１６７〜１８３頁、１９９３年を参照のこと）。好ましい架橋用試薬がさまざまなゼロ長、ホモ２官能性およびヘテロ２官能性の架橋試薬から誘導される。ゼロ長架橋用試薬には、外因性材料の導入が全く無い状態で２つの内因性化学基の直接的抱合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する作用物質はこのカテゴリに入る。もう１つの例は、カルボジイミド、エチルクロロフォルマート、ウッドワーズ試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホナート）およびカルボニルジイミダゾールといったようなアミド結合を形成するべくカルボキシルおよび一級アミノ基の縮合を誘発する試薬である。これらの化学的試薬に加えて、ゼロ長架橋用試薬として酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチド−γ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）を使用することができる。この酵素は、通常基質として一級アミノ基を用いてタンパク質結合したグルタミニル残基のカルボキサミド基においてアシルトランスファ反応の触媒として作用する。好ましいホモおよびヘテロ−２官能性試薬は、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドールまたは非特異的基に対する反応性を有しうる２つの同一のまたは２つの異なる部位を包含する。
ｉ．架橋用試薬における好ましい特異的部位
１ アミノ反応基
１つの好ましい実施形態においては、架橋剤上の部位はアミノ反応基である。アミノ反応基の限定的な意味のない有用な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、イソシアナート、アシルハライド、アリールアジド、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルデヒドおよび塩化スルホニルが含まれる。
ＮＨＳエステルは、好ましくは修飾型糖成分の一級（芳香族を含む）アミノ基と反応する。ヒスチジンのイミダゾール基は反応のために一次アミンと競合するものとして知られているが、反応生成物は不安定で容易に加水分解される。該反応には、アミドを形成するためのＮＨＳエステルの酸性カルボキシル上のアミンの求核性攻撃が関与し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを放出する。かくしてもとのアミノ基の正の電荷は失なわれる。
修飾型糖成分のアミン基との反応のためには、イミドエステルが最も特異的なアシル化試薬である。７と１０の間のｐＨで、イミドエステルは一級アミンとのみ反応する。一級アミンは求核的にイミダートを攻撃して中間体を生成し、この中間体は高いｐＨでアミジンへ、そして低いｐＨで新しいイミダートへと崩壊する。新しいイミダートはもう１つの一級アミンと反応して２つのアミノ基を架橋するが、これは２官能的に反応する推定上単官能性のイミダートの１ケースである。一級アミンとの反応の主たる生成物は、もとのアミンよりも強い塩基であるアミジンである。従ってもとのアミノ基の正の電荷は保持される。
イソシアナート（またはイソチオシアナート）は、修飾型糖成分の一級アミンと反応して安定した結合を形成する。スルフヒドリル、イミダゾールおよびチロシル基とのその反応は、比較的不安定な生成物を提供する。
親和性成分の求核性アミンが例えばｐＨ８．５といったわずかにアルカリ性の条件下で酸性カルボキシル基を攻撃するアミノ特異的試薬としてアシルアジドも使用される。
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンといったようなハロゲン化アリールが、修飾型糖成分のアミノ基およびチロシン基だけでなくスルフヒドリルおよびイミダゾール基とも優先的に反応する。
モノおよびジカルボン酸のｐ−ニトロフェニルエステルも同様に有用なアミノ反応基である。試薬特異性は非常に高いものではないが、αおよびεアミノ基が最も急速に反応するように思われる。
グルタルアルデヒドといったアルデヒドが修飾型糖の一級アミンと反応する。アルデヒドのアルデヒドとアミノ基の反応時点で不安定なシッフ塩基が形成されるが、グルタルアルデヒドは安定した架橋で修飾型糖を修飾する能力をもつ。標準的架橋条件のｐＨであるｐＨ６〜８で、環状ポリマーは脱水を受け、α−β不飽和アルデヒドポリマーを形成する。しかしながら、シッフ塩基は、もう１つの２重結合に抱合された場合に安定している。両方の２重結合の共振相互作用は、シッフ連結の加水分解を妨げる。その上、高い局所的濃度にあるアミンはエチレン２重結合を攻撃して安定したマイケル付加生成物を形成することができる。
芳香族塩化スルホニルは、修飾型糖成分のさまざまな部位と反応するが、アミノ基との反応は最も重要であり、その結果安定したスルホンアミド連結がもたらされる。
２．スルフヒドリル−反応基
もう１つの好ましい実施形態においては、該部位はスルフヒドリル反応基である。スルフヒドリル反応基の限定的意味のない例としては、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ピリジルスルフィドおよびチオフタルイミドが含まれる。
マレイミドは、修飾型糖のスルフヒドリル基と優先的に反応して安定したチオエーテル結合を形成する。これらは同様に、ヒスチジンのイミダゾール基および一級アミノ基と、はるかに緩慢な速度で反応する。しかしながら、ｐＨ７では単純なチオールの反応速度が対応するアミンのものよりも１０００倍高いことから、このｐＨではマレイミド基をスルフヒドリル特異的基とみなすことができる。
ハロゲン化アルキルはスルフヒドリル基、スルフィド、イミダゾールおよびアミノ基と反応する。しかしながら中性〜わずかにアルカリ性のｐＨで、ハロゲン化アルキルは主としてスルフヒドリル基と反応して安定したチオエーテル結合を形成する。より高いｐＨでは、アミノ基との反応が有利になる。
ピリジルジスルフィドはジスルフィド交換を介して遊離スルフヒドリルと反応して混合型ジスルフィドが得られる。その結果、ピリジルジスルフィドが最も特異的なスルフヒドリル反応基となる。
チオフタルイミドは遊離スルフヒドリル基と反応してジスルフィドを形成する。
３． カルボキシル−反応性残基
もう１つの実施形態においては、カルボキシル反応性試薬として、水および有機溶媒の両方において可溶であるカルボジイミドが使用される。これらの化合物は、遊離カルボキシル基と反応して、偽尿素を形成し、これは次に利用可能なアミンにカップリングしてアミド連結を生成することができ、カルボジイミドでカルボキシル基を修飾する方法を教示している（ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２０号、４８３６〜４８４２頁、１９８１年）。
ｉｉ．架橋用試薬中の好ましい非特異的部位
部位特異的反応性部分の使用に加えて、本発明は、糖を修飾基に連結するための非特異的反応基の使用について考慮している。
非特異的架橋剤の例としては、適切なエネルギーの光子の吸収時点で反応種に転換される、暗所で完全に不活性である光活性化可能な基が含まれる。１つの好ましい実施形態においては、光活性化可能な基は、アジドの加熱または光分解の時点で生成されるニトレンの前駆体から選択される。電子不足のニトレンは極めて反応性が高く、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−ＨおよびＣ＝Ｃを含むさまざまな化学的結合と反応することができる。３タイプのアジド（アリール、アルキルおよびアシル誘導体）を利用することができるものの、アリールアジドが現在好まれている。光分解の時点でのアリールアジドの反応性は、Ｃ−Ｈ結合よりもＮ−ＨおよびＯ−Ｈ結合で優れている。電子不足のアリールニトレンは、急速に環拡大してデヒドロアゼピンを形成し、これは、Ｃ−Ｈ挿入生成物を形成するのではなくむしろ求核試薬と反応する傾向をもつ。アリールアジドの反応性は、環内のニトロまたはヒドロキシ基といったような電子求引置換基の存在により増大させることができる。このような置換基は、アリールアジドの吸収最大値をより長い波長まで押しやる。非置換のアリールアジドは、２６０〜２８０ｎｍの範囲内の吸収最大値を有するが一方ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは３０５ｎｍを超えて多大な光を吸収する。従って、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、非置換アリールアジドよりも親和性成分にとって有害性の低い光分解条件を利用できるようにすることから、最も好ましいものである。
もう１つの好ましい実施形態においては、光活性化可能な基がフッ素化アリールアジドから選択される。フッ素化アリールアジドの光分解生成物はアリールニトレンであり、その全てがＣ−Ｈ結合挿入を含めてこの基の特徴的反応を高い効率で受ける（ケーナ（Ｋｅａｎａ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第５５号、３６４０〜３６４７頁、１９９０年）。
もう１つの実施形態においては、ベンゾフェノン残基から光活性化可能基が選択される。ベンゾフェノン試薬は一般に、アリールアジド試薬よりも高い架橋収量を提供する。
もう１つの実施形態においては、光活性化可能基は、光分解時点で電子不足のカルベンを形成するジアゾ化合物から選択される。これらのカルベンは、Ｃ−Ｈ結合内への挿入、（芳香族系を含む）二重結合に対する付加、求核中心への水素誘引および配位を受け、炭素イオンを提供する。
さらにもう１つの実施形態においては、光活性化可能基はジアゾピルバートから選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルジアゾピルバートのｐ−ニトロフェニルエステルは脂肪族アミンと反応し、アルデヒドを形成するべく紫外線光分解を受けるジアゾピルビン酸アミドを提供する。光分解を受けたジアゾピルバート修飾された親和性成分は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド形成架橋のように反応することになる。
ｉｉｉ．ホモ２官能性試薬
１．一級アミンとの反応性をもつホモ２官能性架橋剤
アミン反応性架橋剤の合成、特性および利用分野については文献中で商業的に記述されている（架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと）。数多くの試薬が利用可能である（例えばピアース・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州；シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州；モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）。
ホモ２官能性ＮＨＳエステルの限定的意味のない好ましい例としては、ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルタラート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルタラート（スルホ−ＤＳＴ）、ビス−２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス−２−（スルホスクシンイミドオキシ−カルボニルオキシ）エチルスルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート（ＤＳＰ）、およびジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート（スルホ−ＤＳＰ）が含まれる。ホモ２官能性イミドエステルの限定的意味のない例としては、ジメチルマロニミデート（ＤＭＭ）、ジメチルスクシンイミダート（ＤＭＳＣ）、ジメチルアジピミダート（ＤＭＡ）、ジメチルピメルイミダート（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミダート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−オキシジプロピオンイミダート（ＤＯＤＰ）、ジメチル−３，３’−（メチレンジオキシ）ジプロピオンイミダート（ＤＭＤＰ）、ジメチル−，３’−（ジメチレンジオキシ）ジプロピオンイミダート（ＤＤＤＰ）、ジメチル−３，３’−（テトラメチレンジオキシ）−ジプロピオンイミダート（ＤＴＤＰ）およびジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）が含まれる。
ホモ２官能性イソチオシアナートの限定的意味のない好ましい例には、ｐ−フェニレンジイソチオシアナート（ＤＩＴＣ）および４，４’−ジイソチオシアノ−２、２’−ジスルホン酸スチルベン（ＤＩＤＳ）が含まれる。
ホモ２官能性イソシアナートの限定的な意味のない好ましい例には、キシレン−ジイソシアナート、トルエン−２，４−ジイソシアナート、トルエン−２−イソシアナート−４−イソチオシアナート、３−メトキシジフェニルメタン−４，４’−ジイソシアナート、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−アゾフェニルジイソシアナートおよびヘキサメチレンジイソシアナートが含まれる。
ホモ２官能性ハロゲン化アリールの限定的な意味のない好ましい例には１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）および４，４’−ジフルオロ−３、３’−ジニトロフェニル−スルホンが含まれる。
ホモ２官能性脂肪族アルデヒド試薬の限定的な意味のない好ましい例には、グリオキサル、マロンジアルデヒドおよびグルタルアルデヒドが含まれる。
ホモ２官能性アシル化試薬の限定的な意味のない好ましい例には、ジカルボン酸のニトロフェニルエステルが含まれる。
ホモ２官能性芳香族塩化スルホニルの限定的な意味のない好ましい例には、フェノール−２，４−ジスルホニルクロリドおよびα−ナフトール−２，４−ジスルホニルクロリドが含まれる。
付加的なアミノ反応性ホモ２官能性試薬の限定的な意味のない好ましい例には、アミンと反応してビスカルバマートを提供するエリスリトールビスカーボナートが含まれる。
２． 遊離スルフヒドリル基との反応性をもつホモ２官能性架橋剤
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献中で記述されている（架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと）。数多くの試薬が市販されている（例えばピアース・ケミカル・カンパニー、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州；シグマ・ケミカル・カンパニー、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州；モレキュラー・プローブ社、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）。
ホモ２官能性マレイミドの限定的な意味のない好ましい例には、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−フェニレン）ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミドおよびビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルが含まれる。
ホモ２官能性ピリジルスルフィドの限定的な意味のない好ましい例には、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）が含まれる。
ホモ２官能性ハロゲン化アルキルの限定的な意味のない好ましい例には、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α，α’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、α，α’−ジブロモ−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｂ−ブロモエチル）ベンジルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ（ブロモアセチル）フェニルトヒドラジンおよび１，２−ジ（ブロモアセチル）アミノ−３−フェニルプロパンが含まれる。
３．ホモ２官能性光活性化可能架橋剤
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献中で記述されている（架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと）。いくつかの試薬が市販されている（例えばピアース・ケミカル・カンパニー、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州；シグマ・ケミカル・カンパニー、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州；モレキュラー・プローブ社、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）。
ホモ２官能性光活性化可能架橋剤の限定的な意味のない好ましい例には、ビス−β−（４−アジドサリチルアミド）エチルジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ジ−Ｎ−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）−シスタミン−Ｓ，Ｓ−ジオキシド（ＤＮＣＯ）および４，４’−ジチオビスフェニルアジドが含まれる。
ｉｖ．ヘテロ２官能性試薬
１．ピリジルジスルフィド部分を伴うアミノ反応性ヘテロ２官能性試薬
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献中で記述されている（架橋手順および試薬の再考については、以上を参照のこと）。これらの試薬の数多くが市販されている（例えばピアース・ケミカル・カンパニー、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州；シグマ・ケミカル・カンパニー、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州；モレキュラー・プローブ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）。
ピリジルジスルフィド部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを伴うヘテロ２官能性の試薬の限定的な意味のない好ましい例には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノアート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドヘキサノアート（スルホ−ＬＣＳＰＤＰ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）およびスルホスクシンイミジル６−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミドヘキサノアート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）が含まれる。
２．マレイミド部分を伴うアミノ反応性ヘテロ２官能性試薬
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献に記述されている。マレイミド部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを伴うヘテロ２官能性試薬の限定的な意味のない好ましい例には、スクシンイミジルマレイミジルアセタート（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルプロピオナート（ＢＭＰＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル６−マレイミジルヘキサノアート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルベンゾアート（ＳＭＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、およびスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）が含まれる。
３．ハロゲン化アルキル部分を伴うアミノ反応性ヘテロ２官能性試薬
かかる試薬の合成、特性および利用分野については文献に記述されている。ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性ＮＨＳエステルを伴うヘテロ２官能性試薬の限定的な意味のない好ましい例には、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−６−（ヨードアセチル）アミノヘキサノアート（ＳＩＡＸ）、スクシンイミジル６−（６−（（ヨードアセチル）−アミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサノアート（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル−６−（（（４−（ヨードアセチル）−アミノ）−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノヘキサノアート（ＳＩＡＣＸ）およびスクシンイミジル−４（（ヨードアセチル）−アミノ）メチルシクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＩＡＣ）が含まれる。
アミノ反応性ＮＨＳエステルおよびジハロゲン化アルキル部分を伴うヘテロ２官能性試薬の好ましい例はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオナート（ＳＤＢＰ）である。ＳＤＢＰは、そのアミノ基を抱合することにより親和性成分に対し分子内架橋を導入する。一級アミン基に向かってのジブロモプロピオニル部分の反応性は、反応温度により制御される（マッケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．第７号、５８１〜５９２頁（１９８８年））。
ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性ｐ−ニトロフェニルエステル部分を伴うヘテロ２官能性試薬の限定的な意味のない好ましい例には、ｐ−ニトロフェニルヨードアセタート（ＮＰＩＡ）が含まれる。
その他の架橋剤も当業者にとって既知のものである。例えばポマト（Ｐｏｍａｔｏ）らの米国特許第５，９６５，１０６号明細書を参照のこと。特定の利用分野のために適切な架橋剤を選択することは、当業者の能力範囲内に入る。
ｖ．分割可能なリンカー基
さらにもう１つの実施形態においては、リンカー基には糖残基から修飾基を放出するために分割可能な基が備わっている。数多くの分割可能基が当該技術分野において知られている。例えばユング（Ｊｕｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第７６１号、１５２〜１６２頁（１９８３年）；ジョーシ（Ｊｏｓｈｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６５号、１４５１８〜１４５２５頁（１９９０年）；ザルリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１２４号、９１３〜９２０頁（１９８０年）；ブイザール（Ｂｏｕｉｚａｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１５５号、１４１〜１４７頁（１９８６年）；パーク（Ｐａｒｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６１号、２０５〜２１０頁（１９８６年）；ブローニング（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４３号、１８５９〜１８６７頁（１９８９年）を参照のこと。その上、ピアースといったような供給業者から広範囲の分割可能な２官能性（ホモおよびヘテロ２官能性の両方）リンカー基が市販されている。
チオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩などといったような試薬、光、熱を用いて、分割可能な部分の例を分割することができる。その上、或る種の好ましい基は、細胞内化されたのに応答してインビボで分割される（例えばシス−アコニチル；シェン（Ｓｈｅｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１０２号、１０４８頁（１９９１年））を参照のこと）。好ましい分割可能基には、ジスルフィド、エステル、イミド、カルボナート、ニトロベンジル、フェナシルおよびベンゾイン基から成る群から選択されるメンバーである分割可能な部分が含まれる。
ペプチドに対する修飾型糖の抱合
ＰＥＧ修飾型糖は、抱合を媒介するため適切な酵素を用いてグリコシル化または非グリコシル化ペプチドに対し抱合される。好ましくは、修飾されたドナー糖、酵素およびアクセプタペプチドの濃度は、アクセプタが消費されるまでグリコシル化が続行するような形で選択される。以下で論述される考慮事項は、シアリルトランスフェラーゼという状況下で記されているもののその他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に全般的に適用可能である。
所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを用いる数多くの方法が知られており、概して本発明に適用可能である。例えば方法の例は、本明細書に参照により援用されている国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、イトウ（Ｉｔｏ）ら、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．第６５号、７５３頁（１９９３年）、米国特許第５，３５２，６７０号明細書、同第５，３７４，５４１号明細書、同第５，５４５，５５３号明細書および共通所有の米国特許第６，３９９，３３６号明細書および同第６，４４０，７０３号明細書の中で記述されている。
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはその組合せを用いて実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組合せを使用することができる。複数の酵素を使用する実施形態においては、酵素および基質は好ましくは初期反応混合物中で組合わされ、そうでなければ第１の酵素反応がひとたび完了またはほぼ完了した時点で第２の酵素反応のための酵素および試薬が反応媒質に添加される。単一の容器中で順次２つの酵素反応を行なうことにより、中間種が単離される手順全体にわたり、全体的収量が改善される。その上、余剰の溶媒および副生成物の一掃および処分は削減される。
好ましい実施形態においては、第１および第２の酵素の各々がグリコシルトランスフェラーゼである。もう１つの好ましい実施形態においては、１つの酵素はエンドグリコシダーゼである。付加的な好ましい実施形態においては、本発明の修飾型糖タンパク質を組立てるために２つ以上の酵素が用いられる。酵素はペプチドに対する修飾型糖の添加の前または後いずれかの任意の時点でペプチド上の糖類構造を改変させるために用いられる。
もう１つの実施形態においては、該方法は、１つ以上のエキソまたはエンドグリコシダーゼを使用する。グリコシダーゼは標準的に、グリコシル結合を破断させるのではなくむしろそれらを形成するように工学処理された突然変異体である。突然変異グリカナーゼは標準的に、活性部位酸性アミノ酸残基のアミノ酸残基での置換を内含している。例えばエンドグリカナーゼがエンド−Ｈである場合、置換された活性部位残基は標準的に１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕ、またはそれらの組合せとなる。アミノ酸は一般にセリン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンと置き換えられる。
突然変異体酵素は、通常エンドグリカナーゼ加水分解工程の逆反応と類似したものである合成工程により反応を触媒する。これらの実施形態においては、グリコシルドナー分子（例えば所望のオリゴ−またはモノ−糖類構造）は離脱基を含有し、反応はタンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基に対するドナー分子の添加を伴って続行する。例えば離脱基は、フッ化物といったようなハロゲンであり得る。その他の実施形態においては、離脱基はＡｓｎまたはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらにもう１つの実施形態においては、グリコシルドナー分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は１，２オキサゾリン部分を含み得る。
好ましい実施形態においては、本発明の抱合体を産生するために利用される酵素の各々は触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値といったような反応条件に応じて変動する。予め選択される基質濃度および反応条件下で既定の酵素についての触媒量を決定するための手段は、当業者にとって周知のものである。
上述のプロセスが実施される温度は、凍結直前の温度から最も感応性の高い酵素が変性する温度までの範囲内であり得る。好ましい温度範囲は約０℃〜約５５℃であり、より好ましくは約２０℃〜約３０℃である。もう１つの実施形態例においては、本方法の１つ以上の成分は、好温性酵素を用いて高温で実施される。
反応混合物は、アクセプタがグリコシル化されかくして所望の抱合体を形成するのに充分な時間維持される。抱合体の一部は往々にして数時間後に検出され、回収可能な量は通常２４時間以内またはそれ以前に得られる。当業者であれば、反応速度が、選択されるシステムについて最適化される一定数の可変的要因（例えば酵素濃度、ドナー濃度、アクセプタ濃度、温度、溶媒体積）によって左右されることがわかる。
本発明は同様に、修飾型ペプチドの工業規模の生産をも提供する。本書で使用されているように、工業規模では一般に少なくともとも１グラムの完成した精製済み抱合体が生産される。
以下の論述においては、本発明は、グリコシル化ペプチドに対する修飾型シアル酸部分の抱合によって例示される。修飾型シアル酸の例はＰＥＧで標識される。以下の論述の焦点がＰＥＧ−修飾型シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に置かれているのは、例示を明確にするためであり、本発明がこれら２つのパートナの抱合に限定されることを暗示する意図をもつものではない。当業者であれば、該論述が一般にシアル酸以外の修飾型グリコシル部分の付加に対し適用可能であることがわかる。その上、該論述は、その他のＰＥＧ部分、治療用部分および生体分子を含むＰＥＧ以外の作用物質でのグリコシル単位の修飾にも同等に適用可能である。
酵素的アプローチをペプチドまたは糖ペプチド上へのＰＥＧ化またはＰＰＧ化された炭水化物の選択的導入のために使用することができる。該方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧまたはマスキングされた反応性官能基を含有する修飾型糖を利用し、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組合せられる。所望の炭水化物連結を作ることになるグリコシルトランスフェラーゼを選択し、ドナー基質として修飾型糖を利用することにより、ＰＥＧまたはＰＰＧを直接ペプチド主鎖上、糖ペプチドの既存の糖残基上またはペプチドに対し添加された糖残基上に導入することができる。
シアリルトランスフェラーゼのためのアクセプタは、天然に発生する構造としてかまたは組換えによって、酵素によってまたは化学的にそこに置かれたものとして、本発明の方法により修飾されるべきペプチド上に存在する。適切なアクセプタとしては、例えばＧａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１、３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１、３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、３Ａｒａ、Ｇａｌβ１、６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４Ｇｌｃ（ラクトース）といったガラクトシルアクセプタおよび当業者にとって既知のその他のアクセプタ（例えばポールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５３号、５６１７〜５６２４頁（１９７８年）参照）が含まれる。
一実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼのためのアクセプタは、糖ペプチドのインビボ合成時点で修飾されるべき糖ペプチド上に存在する。かかる糖ペプチドは、糖ペプチドのそのグリコシル化パターンを予め修正することなく、請求対象の方法を用いてシアリル化され得る。代替的には、本発明の方法は、適切なアクセプタを内含しないペプチドをシアリル化するために使用可能である。まず最初に当業者にとって既知の方法によりアクセプタを内含するようにペプチドが修飾される。１つの実施形態例においては、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によりＧａｌＮＡｃ残基が添加される。
１つの実施形態例においては、ガラクトシルアクセプタは、例えばＧｌｃＮＡｃといったペプチドに連結された適切なアクセプタにガラクトース残基を付着させることによって組立てられる。該方法は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）および適切なガラクトシルドナー（例えばＵＤＰ−ガラクトース）を適切な量だけ含有する反応混合物と共に修飾されるべきペプチドをインキュベートする段階を含む。該反応は実質的に完了するまで続行され、そうでなければ代替的には予め選択される量のガラクトース残基が添加された時点で反応が終結される。選択される糖類アクセプタを組立てるその他の方法は、当業者にとって明白なものとなるだろう。
さらにもう１つの実施形態においては、糖ペプチド連結されたオリゴ糖類はまず最初に、適切なアクセプタを得るべく１つ以上の適切な残基を添加できる部分またはシアリルトランスフェラーゼ用アクセプタのいずれかを曝露する目的で、全体的または部分的に「トリミング」される。付着およびトリミング反応のためには、グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼといった酵素（例えば米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照）が有用である。
以下の論述においては、本発明の方法は、付着したＰＥＧ部分を有する修飾型糖の使用によって例示されている。該論述は、例示を明確にすることに焦点があてられている。当業者であれば、該論述が、治療用部分、生体分子などを修飾型糖が担持しているような実施形態にも同じく関連するということを認識することだろう。
修飾型糖の高マンノースの添加に先立って炭水化物残基が「トリミング」される本発明の実施形態例においては、高マンノースが第１世代の２分岐構造に戻るようトリミングされる。ＰＥＧ部分を担持する修飾型糖が、該「トリムバック」によって曝露された糖残基のうちの１つ以上のものに抱合される。一実施例においては、ＰＥＧ部分に抱合されたＧｌｃＮＡｃ部分を介してＰＥＧ部分が付加される。修飾されたＧｌｃＮＡｃは、２分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に付着される。代替的には、未修飾ＧｌｃＮＡｃを、分岐種の末端の１つまたは両方に対して付加することができる。
もう１つの実施例においては、末端マンノース残基上に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基に抱合されるガラクトース残基を有する修飾型糖を介して、２分岐構造の末端マンノース残基の一方または両方に、ＰＥＧ部分が付加される。代替的には、未修飾Ｇａｌを一方または両方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に付加することができる。
さらにもう１つの実施例では、修飾型シアル酸を用いてＧａｌ残基上にＰＥＧ部分が付加される。
もう１つの実施形態例においては、高マンノース構造が、２分岐構造の分岐が発するマンノースまで「トリムバック」される。１実施例では、ＰＥＧ部分は、ポリマーで修飾されたＧｌｃＮＡｃを介して付加される。代替的には、マンノースに対し未修飾ＧｌｃＮＡｃが付加され、その後、付着されたＰＥＧ部分を伴うＧａｌが続く。さらにもう１つの実施形態においては、未修飾ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌ残基は、マンノースに対し逐次添加され、その後ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸部分が続く。
さらなる実施形態例においては、高マンノースは、最初のマンノースが付着されているＧｌｃＮＡｃに「トリムバック」される。ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＧ部分を担持するＧａｌ残基に抱合される。代替的には、未修飾Ｇａｌが、ＧｌｃＮＡｃに付加されその後、水溶性糖で修飾されたシアル酸が付加される。さらにもう１つの実施例においては、末端ＧｌｃＮＡｃはＧａｌと抱合され、ＧｌｃＮＡｃはその後、ＰＥＧ分子を担持する修飾済みフコースでフコシル化される。
ペプチドのＡｓｎに付着された第１のＧｌｃＮＡｃに高マンノースをトリムバックさせることも可能である。一つの実施例では、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは水溶性ポリマーを担持するＧｌｃＮＡｃと抱合される。もう１つの例においては、ＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）ａ残基のＧｌｃＮＡｃは、水溶性ポリマーを担持するＧａｌで修飾される。さらにもう１つの実施形態においては、ＧｌｃＮＡｃはＧａｌで修飾され、その後ＰＥＧ部分で修飾されたシアル酸のＧａｌに対し抱合される。
その他の実施形態例は、その各々が本明細書に参照により援用されている共同所有の米国特許出願公開第２００４０１３２６４０号明細書；同第２００４００６３９１１号明細書；同第２００４０１３７５５７号明細書；米国特許出願第１０／３６９，９７９号明細書；同第１０／４１０，９１３号明細書；同第１０／３６０，７７０号明細書；同第１０／４１０，９４５号明細書およびＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６３号明細書の中に記されている。
上述の実施例は、本書に記されている方法の能力の例示を提供している。本書で記述されている方法を使用すると、実質的に任意の所望の構造の炭水化物残基を「トリムバック」し構築することが可能である。修飾型糖は、上述のように炭水化物部分の末端に付加されてもよいし、そうでなければ、炭水化物の末端とペプチドコアの間の中間体であってもよい。
一実施形態例においては、既存のシアル酸はシアリダーゼを用いて糖ペプチドから除去され、かくして下にあるガラクトシル残基の全てまたは大部分のマスキングを除去する。代替的には、ペプチドまたは糖ペプチドがガラクトース残基またはガラクトース単位内で終結するオリゴ糖類残基で標識される。ガラクトース残基の曝露または付加の後、修飾型シアル酸を付加するために適切なシアリルトランスフェラーゼが使用される。該アプローチはスキーム２に要約されている。
Figure 0004719686
スキーム３で要約されているさらにもう１つのアプローチにおいては、マスキングされた反応性官能基がシアル酸上に存在する。マスキングされた反応基は好ましくは、エリスロポエチンに修飾型シアル酸を付着させるのに使用される条件によって影響されない。ペプチドに対する修飾型シアル酸の共有結合の後、マスクが除去され、ペプチドはＰＥＧといったような作用物質と抱合される。該作用物質は、修飾型糖残基上のマスキング除去された反応基とのその反応により特定的にペプチドに抱合される。
Figure 0004719686
糖ペプチドのオリゴ糖類側鎖の末端糖に応じて、あらゆる修飾型糖をその適切なグリコシルトランスフェラーゼと共に使用することができる（表２）。上述のように、ＰＥＧ化された構造の導入のために必要とされる糖ペプチドの末端糖は、発現中に天然に導入され得、そうでなければ、適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの混合物を用いて発現後に産生させることもできる。
Figure 0004719686
さらなる実施形態例では、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧが牛乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させられ、かくして修飾型ガラクトシダーゼを適切な末端Ｎ−アセチルグルコサミン構造へと転移する。糖ペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳動物、昆虫、植物または真菌といった発現系内で発生し得るように、発現中に産生され得るが、同様に必要に応じてシアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで糖ペプチドを処理することにより産生することもできる。
もう１つの実施形態例においては、遺伝子Ｔ１−５といったようなＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが、糖ペプチド上の末端マンノース残基に対し、ＰＥＧ化−ＧｌｃＮを転移するべく利用される。さらなる実施形態例においては、Ｎおよび／またはＯ−連結型グリカン構造が糖ペプチドから酵素により除去されアミノ酸または末端グリコシル残基を曝露し、これはその後修飾型糖と抱合される。例えば、糖ペプチド上のＧｌｃＮＡｃ連結型Ａｓｎとして末端ＧｌｃＮＡｃを曝露するべく糖ペプチドのＮ連結型構造を除去するためにエンドグリカナーゼが使用される。曝露されたＧｌｃＮＡｃ上にＰＥＧ−ガラクトース官能基を導入するために、ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼが使用される。
一変形実施形態においては、修飾型糖は、ペプチド主鎖に対して糖残基を転移するものとして知られているグリコシルトランスフェラーゼを用いてペプチド主鎖に直接付加される。この実施形態例はスキーム４に記されている。本発明を実施する上で有用なグリコシルトランスフェラーゼの例には、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ１−１４）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが含まれるがこれらに限定されるわけではない。このアプローチを使用することにより、いずれかの炭水化物が欠如しているペプチド上への又代替的には既存の糖ペプチド上への修飾型糖の直接的付加が可能となる。両方のケースにおいて、修飾型糖の付加は、化学的方法を用いてタンパク質のペプチド主鎖の修飾中に起こるような無作為な形でではなくグリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって画定されるようにペプチド主鎖上の特異的位置で起こる。ポリペプチド鏡内に適切なアミノ酸配列を工学処理することによって、グリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列が欠如するタンパク質または糖ペプチド内に数々の作用物質を導入することが可能である。
Figure 0004719686
以上で記した実施形態例の各々において、修飾型糖のペプチドに対する抱合の後に、１つ以上の付加的な化学的または酵素的修飾工程を利用することができる。１つのＥＥＧにおいては、ペプチドに付着された末端修飾型糖上にグリコシル単位（例えばフコース）を追加するために酵素（例、フコシルトランスフェラーゼ）が使用される。もう１つの例においては、修飾型糖が抱合できなかった部位を「キャッピング」するために、酵素反応が利用される。代替的には、抱合された修飾型糖の構造を改変するために、化学反応が利用される。例えば、抱合された修飾型糖は、該修飾型糖が付着されているペプチド成分とのその連続を安定化または不安定化する作用物質と反応させられる。もう１つの例においては、修飾型糖の一成分がペプチドに対するその抱合体の後に脱保護される。当業者であれば修飾型糖がペプチドに抱合された後の段階で本発明の方法において有用である数々の酵素的および化学的手順が存在するということを認識することだろう。修飾型糖−ペプチド接合体のさらなる精緻化は、本発明の範囲内に入る。
ｉ．酵素
糖トランスファ
アシル連結型抱合体の形成という状況下で上述した酵素に加えて、抱合体および出発基質（例えばペプチド、脂質）のグリコシル化パターンを、その他の酵素を利用する方法により精緻化し、トリムバックまたはその他の形で修飾することができる。アクセプタに糖ドナーを転移する酵素を使用してペプチドおよび脂質を作り出す方法がディフリー（Ｄｅ Ｆｒｅｅｓ）の２００３年４月１７日に公開された国際公開第０３／０３１４６４Ａ２号パンフレット中で詳細に論述されている。当該方法において有用な選択される酵素の簡単な要約を以下に記す。
グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、糖ペプチド、脂質または糖脂質に対するまたは成長するオリゴ糖類の非還元末端に対する、活性化された糖（ドナーＮＤＰ−糖）の段階的な付加を触媒する。Ｎ連結型糖ペプチドが、ｅｎブロックトランスファとそれに続くコアのトリミングにおいて、トランスフェラーゼおよび脂質連結型オリゴ糖類ドナーＤｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９を介して合成される。この場合、「コア」糖類の性質はその後の付着と幾分か異なっている。非常に数多くのグリコシルトランスフェラーゼが当該技術分野において知られている。
本発明において使用されるべきグリコシルトランスフェラーゼは、糖ドナーとして修飾型糖を利用することができるかぎり、任意のものであってもよい。かかる酵素の例としてはルロアール経路グリコシルトランスフェラーゼ、例えばガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなどが含まれる。
グリコシルトランスフェラーゼ反応が関与する酵素的糖類合成のためには、グリコシルトランスフェラーゼをクローニングさせるかまたは任意の供給源から単離することができる。そのポリヌクレオチド配列と同様、多くのクローニングされたグリコシルトランスフェラーゼが既知である。例えば、「Ｔｈｅ ＷＷＷ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。アミノ酸配列をそこから演繹することができるグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列およびグリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列は同様に、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬおよびその他を含むさまざまな公に利用可能なデータベースの中に見い出すこともできる。
本発明の方法において利用可能なグリコシルトランスフェラーゼにはガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼが含まれるがこれらに限定されるわけではない。適切なグリコシルトランスフェラーゼには、真核生物ならびに原核生物から得られるものが含まれる。
グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、化学的合成によって、適切な細胞または細胞系裂培養からのｍＲＮＡの逆写しをスクリーニングすること、適切な細胞からゲノミックライブラリをスクリーニングすることまたはこれらの手順の組合せによって、得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノミックＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から生成されたオリゴヌクレオチドプローブで実施され得る。プローブは、螢光基、放射性原子または化学発光基といったような検出可能な基で既知の手順に従って標識され、従来のハイブリダイゼーション検定の中で使用され得る。代替的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を用いることによりグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列を得ることができ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から産生される。マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに対する米国特許第４，６８３，１９５号明細書およびマリスに対する米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照のこと。
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主細胞の中で合成され得る。グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを増幅するためおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現するためにベクターが使用される。発現ベクターは、適切な宿主内でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現をもたらす能力をもつ適切な制御配列に対して、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列が操作可能な形で連結されている複製可能なＤＮＡである。かかる制御配列に対するニーズは、選択される宿主および選ばれた形質転換方法に応じて変動することになる。一般に、制御配列は、転写プロモータ、転写を制御するための任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリポソーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の終端を制御する配列を内含する。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされるのは、通常は複製起点によって付与される宿内で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子だけである。
実施形態例においては、本発明は、原核性酵素を利用する。かかるグリコシルトランスフェラーゼには、数多くのグラム陰性菌によって産生されるリポオリゴ糖類（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素が含まれる（プレストン（Ｐｒｅｓｔｏｎ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２３号（３）、１３９−１８０頁（１９９６年））。かかる酵素には、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばＥＭＢＬ登録番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（Ｅ．ｃｏｌｉ）；ＥＭＢＬ登録番号Ｓ５６３６１号（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２５７４０（Ｅ．ｃｏｌｉ）、β１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２７１２９号（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１９８１７号（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））およびβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬ登録番号Ｕ０００３９（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍといったような種のｒｆａオペロンのタンパク質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。アミノ酸配列がわかっているその他のグリコシルトランスフェラーゼには、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｓｕｍ、といった生体内で特徴づけされてきたｒｆａＢといったオペロンおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのｒｈ１オペロンによりコードされるものが含まれる。
本発明において使用するのに同様に適しているのは、粘膜病原体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＬＯＳ内で同定されてきたラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース、およびＰＫ血液型三糖類配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含有する構造の産生に関与するグリコシルトランスフェラーゼである（ショルテン（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第４１号、２３６〜２４３頁（１９９４年））。これらの構造の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードするＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の遺伝子は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫型Ｌ３およびＬ１（ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第１８号、７２９〜７４０頁（１９９５年））およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ突然変異体Ｆ６２（ゴシュリッヒ（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８０号、２１８１〜２１９０頁（１９９４年））から同定されてきた。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいては、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢおよびｌｇＥという３つの遺伝子から成る遺伝子座が、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖内の糖のうちの最後の３つの付加に必要とされるグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（ワカーチャック（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１号、１９１６６〜７３頁（１９９６年））。最近になって、ＩｇｔＢおよびＩｇｔＡ遺伝子生成物の酵素活性が実証され、その提案されたグリコシルトランスフェラーゼ機能についての最初の直接的証拠が提供された（ワカーチャックら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１号（４５）、２８２７１〜２７６頁（１９９６年））。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいては、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造の末端ガラクトースの３位にβ−Ｄ−ＧａｌＮＡｃを付加するＩｇｔＤおよびトランケートされたＬＯＳのラクトース要素に対し末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加してＰｋ血液型抗原構造を作り出すＩｇｔＣという２つの付加的な遺伝子が存在する（ゴシュリッヒ（１９９４年）、前掲書）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいては、別の免疫型Ｌ１が同様にＰｋ血液型抗原を発現し、ＩｇｔＣ遺伝子を担持することが示されてきた（ジェニングスら、（１９９５年）、前掲書）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａグリコシルトランスフェラーゼおよび付随する遺伝子は、米国特許第５，５４５，５５３号明細書（ゴッツュリッヒ（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ））内で記述されている。Ｆｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉからのα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼのための遺伝子も特徴づけされてきた（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２号、２１３４９〜２１３５６頁（１９９７年））。同様に本発明において有用であるのは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのグリコシルトランスフェラーゼである（例えばｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｕｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照のこと）。
フコシルトランスフェラーゼ
一部の実施形態においては、本発明の方法において使用されるグリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者にとって既知のものである。フコシルトランスフェラーゼの例としては、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースからアクセプタ糖のヒドロキシ位まで転移する酵素がある。非ヌクレオチド糖をアクセプタに転移するフコシルトランスフェラーゼも同様に、本発明において有用である。
一部の実施形態においては、アクセプタ糖は、例えば、オリゴ糖類グリコシド内のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−基内のＧｌｃＮＡｃである。この反応のための適切なフコシルトランスフェラーゼには、ヒトの乳汁から最初に特徴づけされたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩＥ．Ｃ．Ｎｏ２．４．１．６５）が含まれ（パルシック（Ｐａｌｃｉｃ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．第１９０号、１〜１１頁（１９８９年）；プリイールス（Ｐｒｉｅｅｌｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５６号、１０４５６〜１０４６３頁（１９８１年）；およびヌネッツ（Ｎｕｎｅｚ）ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．第５９号、２０８６〜２０９５頁（１９８１年）を参照のこと）、かつヒトの血清中に見い出されるＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）が含まれる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ２．４．１．６５）、シアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼも同様に特徴づけされてきた。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え形も同様に特徴づけされてきた（デュマス（Ｄｕｍａｓ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、第１号、４２５〜４２８頁（１９９１年）およびクコウスカ・ラタロ（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ）ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第４号、１２８８〜１３０３頁（１９９０年）を参照のこと）。その他のフコシルトランスフェラーゼの例には、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ２．４．１．６９）が含まれる。酵素フコシル化は、モリコーネ（Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１９１号、１６９〜１７６頁（１９９０年）または米国特許第５，３７４，６５５号明細書の中で記述されている方法によって実施可能である。フコシルトランスフェラーゼを産生するのに使用される細胞は同様に、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素系も含むことになる。
ガラクトシルトランスフェラーゼ
もう１つの実施形態群においては、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼの例は、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えばダブコウスキー（Ｄａｂｋｏｗｓｋｉ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．第２５号、２９２１頁（１９９３年）およびヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３４５号、２２９〜２３３頁（１９９０年）、ウシ（（ＧｅｎＢａｎｋ ｊ０４９８９、ジョジアス（Ｊｏｚｉａｓｓｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６４号、１４２９０〜１４２９７頁（１９８９年））、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ ｍ２６９２５、ラルセン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６号、８２２７〜８２３１頁（１９８９年））、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ３６１５２；ストラーハン（Ｓｔｒａｈａｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、第４１号、１０１〜１０５頁（１９９５年）参照）。もう１つの適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原（ＥＣ２．４．１．３７、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６５号、１１４６〜１１５１頁（１９９０年）（ヒト））の合成に関与するものである。さらにもう１つのガラクトシルトランスフェラーゼの例は、コアＧａｌ−Ｔ１である。
同様に本発明の方法において使用するのに適しているのは、例えばＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンセターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンセターゼ）（ウシ（ダゴスタロ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１８３号、２１１〜２１７頁（１９８９年））、ヒト（マスリ（Ｍａｓｒｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１５７号、６５７〜６６３頁（１９８８年））、マウス（ナカザワ（Ｎａｋａｚａｗａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１０４号、１６５〜１６８頁（１９８８年））ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、スタール（Ｓｔａｈｌ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．第３８号、２３４〜２４２頁（１９９４年））を含むβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼである。その他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼには、例えばα１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来、シャペル（Ｃｈａｐｅｌｌ）ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、第５号、５１９〜５２８頁（１９９４年））が含まれる。
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、本発明の組換え型細胞および反応混合物において有用であるグリコシルトランスフェラーゼのもう１つのタイプである。組換え型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は同様に、シアリルトランスフェラーゼのためのシアル酸供与体であるＣＭＰシアル酸を産生することになる。本発明において使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例としては、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（例えばラットまたはヒトＳＴ３ＧａｌＩＩＩ）、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ（本書で使用されるシアリルトランスフェラーゼの学名は、ツジ（Ｔｓｕｊｉ）ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６、ｖ〜ｘｉｖ（１９９６年）で記述されている通りである）が含まれる。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と呼ばれるα（２，３）シアリルトランスフェラーゼの一例は、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ２糖類またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌまで転移する。ファン・デン・イェンデン（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５６号、３１５９頁（１９８１年）、ワインスタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７号、１３８４５頁（１９８２年）およびウェン（Ｗｅｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７号、２１０１１頁（１９９２年）を参照のこと。もう１つのα２，３−シアリルトランスフェラーゼの例（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアル酸を２糖類またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌへと転移する。リーリック（Ｒｅａｒｉｃｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５４号、４４４４頁（１９７９年）およびギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７号、２１００４頁（１９９２年）を参照のこと。さらなる酵素例にはＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼが含まれる（クロサワ（Ｋｕｒｏｓａｗａ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２１９号、３７５〜３８１頁（１９９４年）を参照のこと）。
好ましくは、糖ペプチドの炭水化物のグリコシル化については、シアリルトランスフェラーゼはシアル酸を、完全にシアリル化された炭水化物構造上の末端シアル酸の基礎を成す最も一般的な最後から２番目の配列である配列Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃまで転移する能力をもつことになる（表２参照）。
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請求された方法において有用であるシアリルトランスフェラーゼの一例は、同様にα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも呼ばれるＳＴ３ＧａｌＩＩＩである。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌに対するシアル酸のトランスファを触媒し（例えばウェンら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７号、２１０１１頁（１９９２年）；ファン・デン・イェンデンら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５６号、３１５９頁（１９９１年）を参照）、糖ペプチドにおけるアスパラギン連結形オリゴ糖類のシアリル化を担当する。シアル酸は２つの糖類の間のα−連結の形成を伴ってＧａｌに連結される。糖類間の結合（連結）はＮｅｕＡＣの２位とＧａｌの３位の間にある。この特定の酵素は、ラットの肝臓（ワインスタインら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７号、１３８４５頁、（１９８２年））；「ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ」（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら、（１９９３年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８号、２２７８２〜２２７８７頁；キタガワおよびポールソン（Ｋｉｔａｇａｗａ ＆ Ｐａｕｌｓｏｎ）（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９号、１３９４−１４０１頁））から単離でき、ゲノミック（キタガワら、（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１号、９３１〜９３８頁）ＤＮＡ配列が知られており、組換え型発現によるこの酵素の産生を容易にしている。好ましい実施形態においては、請求対象のシアリル化方法ではラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩが用いられる。
本発明において有用なその他のシアリルトランスフェラーゼ例には、α（２，３）を含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｍｉから単離されたものが含まれる。例えば国際公開第９９／４９０５１号パンフレットを参照のこと。
表２で列挙されているもの以外のシアリルトランスフェラーゼも同様に、商業的に重要な糖ペプチドのシアリル化のための経済的で効率の良い大規模プロセスにおいて有用である。これらのその他の酵素の有用性を見い出す単純な試験として、ウシのＳＴ６ＧａｌＩ，ＳＴ３ＧａｌＩＩＩまたは両方のシアリルトランスフェラーゼとの関係において糖ペプチドをシアリル化する問題のシアリルトランスフェラーゼの能力と比較するために、さまざまな量の各酵素（１〜１００ｍＵ／ｍｇのタンパク質）が反応させられる。代替的には、この評価のために、アシアローα１、ＡＧＰの代りにその他の糖ペプチドまたはペプチド主鎖から酵素的に放出されたＮ連結型オリゴ糖類または糖ペプチドを使用することができる。ＳＴ６ＧａｌＩよりも効率良く糖ペプチドのＮ連結型オリゴ糖類をシアリル化する能力をもつシアリルトランスフェラーゼが、ペプチドシアリル化のための実用的大規模プロセスにおいて有用である。
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは本発明を実施する上で、特にペプチドのＯ連結型グリコシル化部位のアミノ酸にＧａｌＮＡｃ部分を結合させるために有用である。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼにはα（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７号、１２０８２〜１２０８９頁（１９９２年）およびスミスら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９号、１５１６２頁（１９９４年））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ホーマ（Ｈｏｍａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８号、１２６０９頁（１９９３年））が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
遺伝子工学によるクローニングされた遺伝子からの酵素ＧａｌＮＡｃＴ１−ＸＸといったタンパク質の生産は周知である。例えば米国特許第４，７６１，３７１号明細書を参照のこと。１つの方法には、充分な試料の収集が関与し、その後酵素のアミノ酸配列がＮ末端配列決定によって判定される。この情報は、その後、昆虫細胞系列Ｓｆ９内での発現の結果完全に活性な酵素の合成をもたらした全長（膜結合）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離するために使用される。酵素のアクセプタ特異性はその後、１６の異なるタンパク質内の既知のグリコシル化部位をとり囲むアミノ酸の半定量的分析とそれに続く合成ペプチドのインビトログリコシル化研究を用いて決定される。この作業は、或る種のアミノ酸残基がグリコシル化ペプチド内で大きな割合を占めていること、およびグリコシル化セリンおよびトレオニン残基をとり囲む特異的位置にある残基がその他のアミノ酸部分よりもさらに顕著な影響をアクセプタ効率に対して有し得ることを実証した。
細胞結合したグリコシルトランスフェラーゼ
もう１つの実施形態においては、本発明の方法において利用される酵素は、細胞結合したグリコシルトランスフェラーゼである。数多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが知られている（例えば米国特許第５，０３２，５１９号明細書を参照）ものの、グリコシルトランスフェラーゼは一般に、細胞と会合した場合に膜結合形態をしている。これまでに研究された膜結合酵素の多くは、固有のタンパク質であると考えられている。すなわち、これらは音波処理により膜から放出されず、可溶化のために洗浄剤を必要としない。表面グリコシルトランスフェラーゼは、脊椎動物および無脊椎動物細胞の表面上で同定されてきており、これらの表面トランスフェラーゼが生理学的条件下で触媒活動を維持することも認識されてきた。しかしながら、細胞表面グリコシルトランスフェラーゼのより広く認められている機能は、細胞内認識についてのものである（ロス（Ｒｏｔｈ）、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ ｔｏ ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ」、１９９０年）。
細胞により発現されたグリコシルトランスフェラーゼを改変するための方法が開発されてきた。例えばラーセン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６号、８２２７〜８２３１頁（１９８９年）は、細胞表面オリゴ糖類構造およびその同起源のグリコシルトランスフェラーゼの発現を判定するクローニングされたｃＤＮＡ配列を単離するための遺伝子アプローチを報告している。ＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニミドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するものとして知られているマウス細胞系列から単離されたｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがＣＯＳ−１細胞内にトランスフェクションされた。トランスフェクションを受けた細胞は次に培養され、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性について検定された。
フランシスコ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９号、２７１３〜２７１７頁（１９９２年）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの外表面に対しβ−ラクタマーゼを定着させる方法を開示している。（ｉ）外部膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外部膜タンパク質の膜貫通区分および（ｉｉｉ）完全な成熟β−ラクタマーゼ配列から成る３分割融合が産生され、その結果、活性表面結合型β−ラクタマーゼ分子がもたらされる。しかしながら、フランシスコの方法は、原核細胞系のみに限定されており、著者が認めているように、適切に機能するためには完全な３分割融合が必要である。
スルホトランスフェラーゼ
本発明は同様に、例えばヘパリン、硫酸ヘパラン、カラゲネンおよび関連する化合物といった硫酸化多糖を含む硫酸化分子を内含するペプチドを生産するための方法をも提供する。適切なスルホトランスフェラーゼには、例えばコンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（フクタ（Ｆｕｋｕｔａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０号、１８５７５−１８５８０頁（１９９５年）に記述されたニワトリのｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ４９９１５）、グルコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第２６号、２３９〜２４１頁（１９９５年）；ＵＬ−１８１９８）およびグルコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（オレラナ（Ｏｒｅｌｌａｎａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９号、２２７０〜２２７６頁（１９９４年）およびエリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９号、１０４３８〜１０４４３頁（１９９４年）中に記述されたマウスのｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２３０４中に記述されたヒトのｃＤＮＡ）が含まれる。
グリコシダーゼ
本発明は、同様に野生型および突然変異体のグリコシダーゼの使用をも包含している。ガラクトシルアクセプタ分子にα−グリコシルフッ化物を結合することを通して、突然変異体β−ガラクトシダーゼ酵素が２糖類の形成を触媒することが実証されてきた（（ウィザーズ（Ｗｉｔｈｅｒｓ）、２００１年９月４日付けの米国特許第６，２８４，４９４号明細書））。本発明において有用であるその他のグリコシダーゼには、例えばβ−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトース−アミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ／シアリダーゼが含まれる。
固定化酵素
本発明は同様に、固体および／または可溶性支持体の上に固定化されている酵素の使用をも提供している。１つの実施形態例においては、本発明の方法に従って無傷のグリコシルリンカーを介してＰＥＧに抱合されるグリコシルトランスフェラーゼが提供されている。ＰＥＧリンカー酵素抱合体は任意選択で固体支持体に付着されている。本発明の方法における固体支持型酵素の使用は、反応混合物の練成および反応生成物の精製を単純化し、同様に酵素の容易な回収をも可能にする。グリコシルトランスフェラーゼ抱合体は、本発明の方法において利用される。酵素および支持体のその他の組合せは、当業者には明白であろう。
融合タンパク質
その他の実施形態例においては、本発明の方法は、所望の糖ペプチド抱合体の合成に関与する複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば付属酵素の触媒活性ドメインに接合されているグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインで構成され得る。付属酵素触媒ドメインは、例えばグリコシルトランスフェラーゼのためのドナーであるヌクレオチド糖の形成における１工程の触媒として作用するかまたは、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応の触媒として作用することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに枠内で接合させることが可能である。このとき結果として得られる融合タンパク質は、ヌクレオチド糖の合成のみならず、アクセプタ分子への糖部分のトランスファを触媒することができる。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列内に連結される２つ以上のサイクル酵素であり得る。その他の実施形態においては、融合タンパク質は、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含んでいる。例えば５，６４１，６６８号明細書を参照のこと。本発明の修飾型糖ペプチドは、さまざまな適切な融合タンパク質を利用して、容易に設計および製造され得る（例えば、１９９９年６月２４日付けで国際公開第９９／３１２２４号パンフレットとして公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０号明細書を参照のこと）。
エリスロポエチン抱合体の精製
上述のプロセスによって産生される生成物は、精製せずに使用可能である。しかしながら、通常は該生成物を回収することが好まれる。薄層または厚層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたは膜ろ過といったようなグリコシル化糖類の回収のための周知の技術を使用することができる。以下でおよび本書で引用されている文献内で論述されているように、回収のためには膜ろ過、より好ましくは逆浸透膜を利用したもの、または１つ以上のカラムクロマトグラフィ技術を使用することが好ましい。例えば、グリコシルトランスフェラーゼといったようなタンパク質を除去するために、膜が約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する膜ろ過を使用することができる。このとき、塩を除去しかつ／または生成糖類を精製するためにナノろ過または逆浸透を使用することができる（例えば国際公開第９８／１５５８１号パンフレットを参照のこと）。ナノフィルタ膜は、使用される膜に応じて約１００〜約２０００ダルトンよりも大きい非荷電性溶質を保持するものの一価の塩を通す逆浸透膜クラスのものである。かくして標準的な利用分野においては、本発明の方法により調製された糖類は膜内に保持されることになり、汚染性塩は通過することになる。
修飾型糖タンパク質が第１の工程として細胞内で産生される場合、例えば遠心分離または限外ろ過により宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかが除去される。任意選択で、タンパク質は、市販のタンパク質濃度フィルタを用いて濃縮され得、その後、イムノアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換カラム分画（例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）上またはカルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含有するマトリクス上）、ブルー−セファロース、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、またはプロテインＡセファロース上のクロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィ、シリカクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、追加の脂肪族基を伴うシリカゲル）、例えばセファデックス分子ふるいを用いたゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフィ、選択的にポリペプチドを結合するカラム上のクロマトグラフィおよびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈降の中から選択される１つ以上の工程によりその他の不純物からポリペプチド変異体が分離される。
培養中に産生される修飾型糖ペプチドは通常、細胞、酵素などからの初期抽出により単離され、その後１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィの工程が行なわれる。付加的には、修飾型糖タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィにより精製可能である。最後に、ＨＰＬＣを最終的精製工程のために利用することができる。
上述の工程のいずれにおいてもタンパク質分解を阻害するため、例えばメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）といったプロテアーゼ阻害物質を含み入れることができ、又偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含み入れることができる。
もう１つの実施形態の中では、本発明の修飾型糖ペプチドを産生する系からの上清が、例えばアミコンまたはミリポア・ペリコン限外ろ過ユニットといった市販のタンパク質濃縮フィルタを用いて最初に濃縮される。濃縮工程の後、濃縮物は、適切な精製マトリクスに適用され得る。例えば、適切なアフィニティマトリクスには、適切な支持体に結合されたレクチンまたは抗体分子である該ペプチド用リガンドが含まれ得る。代替的には、例えばペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリクスまたは基質といったアニオン交換樹脂を利用することが可能である。適切なマトリクスには、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは一般にタンパク質精製において利用されるその他のタイプのものが含まれる。代替的には、カチオン交換工程を利用することができる。適切なカチオン交換器には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリクスが含まれる。
最終的に、例えばペンダントメチルまたはその他の脂肪族基を有するシリカゲルといったような疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質を利用する１つ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程が、ポリペプチド変異体組成物をさらに精製するために利用可能である。さまざまな組合せでの上述の精製工程の一部分または全てを利用して均質な修飾型糖タンパク質を提供することもできる。
大規模発酵の結果得られる本発明の修飾型糖ペプチドは、アーダル（Ｕｒｄａｌ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．第２９６号、１７１頁（１９８４年）によって開示されているものと類似の方法により精製可能である。この参考文献では、分取ＨＰＬＣカラム上での組換え型ヒトＩＬ−２の精製のための２つの逐次的ＲＰ−ＨＰＬＣ工程について記述されている。代替的には、アフィニティクロマトグラフィといったような技術を利用して修飾型糖タンパク質を精製することができる。
薬学組成物
もう１つの態様においては、本発明は薬学組成物を提供する。薬学組成物は、薬学的に受容可能な希釈剤および、非天然発生ＰＥＧ部分、治療用部分または生体分子およびグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの間の共有結合による抱合体を内含する。ポリマー、治療用部分または生体分子は、ペプチドおよびポリマー、治療用部分または生体分子の間に介在するしその両方に共有結合によって連結された無傷のグリコシル連結基を介してペプチドに抱合される。
本発明の薬学組成物は、さまざまな薬物送達系における使用に適している。本発明において使用するための適切な製剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルバニア州、第１７版、（１９８５年）の中に見い出される。薬物送達の方法について簡単に再考するためには、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９号、１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照のこと。
薬学組成物は、例えば局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋内投与を含む任意の適切な投与方法向けに処方することができる。皮下注射といったような非経口投与のためには、担体は好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろうまたは緩衝液を含む。経口投与のためには上述の担体またはマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムといったような固体担体のうちの任意のものを利用することができる。本発明の薬学組成物用の担体としては、生物分解性ミクロスフェア（例えばポリアセタート・ポリグリコラート）を利用することができる。適切な生物分解性ミクロスフェアは例えば、米国特許第４，８９７，２６８号明細書および５，０７５，１０９号明細書中で開示されている。
一般に、薬学組成物は、非経口投与例えば静脈内投与される。かくして、本発明は、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなどといった受容可能な担体中に溶解したまたは懸濁した化合物を含む非経口投与向けの組成物を提供する。該組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、緊張力調整剤、湿潤剤、洗浄剤などといった、生理的条件を近似するのに必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質を含有し得る。
これらの組成物は従来の滅菌技術により滅菌され得るかまたは無菌ろ過され得る。結果として得られた水溶液は、そのままで使用するべく包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は投与に先立ち無菌水性担体と組合わせる。調製物のｐＨは標準的には３〜１１の間、より好ましくは５〜９の間、最も好ましくは７〜８となる。
一部の実施形態においては、本発明の糖ペプチドは、標準的小胞形成脂質から形成されたリポソームの中に取込まれ得る。さまざまな方法が、例えばスゾーカ（Ｓｚｏｋａ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．第９号、４６７頁（１９８０年）、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書および同第４，８３７，０２８号明細書に記述されているように、リポソームを調製するために利用可能である。さまざまなターゲティング剤（例えば本発明のシアリルガラクトシド）を用いたリポソームのターゲティングは、当該技術分野において周知である（例えば米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号明細書を参照のこと）。
ターゲティング剤をリポソームにカップリングするための標準的方法を使用することができる。これらの方法には一般に、ターゲティング剤の付着のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミンといった脂質成分または本発明の脂質誘導体化糖ペプチドといった誘導体化された脂肪親和性化合物のリポソーム内への取込みが関与している。
ターゲティングの機序は一般に、標的部分が例えば細胞表面レセプタといった標的との相互作用のために利用可能となるような形でリポソームの表面上にターゲティング剤が位置づけされることを必要とする。本発明の炭水化物は、当業者にとって既知の方法（例えばそれぞれ長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸での炭水化物の上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を用いてリポソームが形成される前に、脂質分子に付着され得る。代替的には、リポソームを、膜の形成時点で膜内にコネクタ部分がまず最初に取込まれるような形で作り出すこともできる。コネクタ部分は、膜の中にしっかりと埋込まれ定着させられている親油性部分を有していなくてはならない。それは同様に、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分も有していなくてはならない。反応性部分は、それが、後に付加されるターゲティング剤または炭水化物と安定した化学的結合を形成するために化学的に適切なものとなるように選択される。一部のケースでは、コネクタ分子に標的剤を直接付着させることが可能であるが、大部分のケースで、化学的架橋として作用するべく第３の分子を用い、かくして小胞表面から離れて３次元的に拡張される標的剤または炭水化物と膜内にあるコネクタ分子を連結するのがより適切である。
本発明の方法により調製された化合物は、診断用試薬としても使用可能である。例えば、炎症の疑いがある患者において炎症または腫瘍転移の部域を位置特定するために標識化合物を用いることができる。この用途のためには、化合物を１２５Ｉ、１４Ｃまたはトリチウムで標識することができる。
本発明の薬学組成物の中で使用される活性成分は、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増大させるようにする生物学的特性をもつＧｌｙｃｏＰＥＧ化エリスロポエチンおよびその誘導体である。本発明のリポソーム分散は、慢性腎不全に付随する貧血症を含めたさまざまな形態の貧血症、ジドビジン治療を受けているＨＩＶ感染患者および化学療法中のガン患者といったような、赤血球産生が低いかまたは不良であることを特徴とする血液障害を治療するにあたり、非経口製剤として有用である。これは又、鎌状赤血球病、ベータサラセミア、嚢胞性線維症、妊娠および月経異常といった血液学的不順、未熟児早期貧血、脊髄損傷、宇宙飛行、急性失血、加齢などのさまざまな疾病状態、障害および状況の治療においても応用できる。好ましくは、本発明のＥＰＯ組成物は、非経口的に投与される（例えばＩＶ、ＩＭ、ＳＣまたはＩＰ）。有効投薬量は、治療対象の健康状態および投与経路に応じて大きく変動するものと予想されるが、体重１ｋｇあたり約０．１（約７ｕ）から１００（約７０００Ｕ）μｇの活性材料の範囲内にあると予想されている。貧血状態の治療のための好ましい用量は、一週間に３回、約５０〜約３００単位／ｋｇである。本発明は、増強されたインビボ滞留時間をもつエリスロポエチンを提供することから、本発明の組成物が投与される場合、記述された投薬量は任意に削減される。
以下の実施例は、請求対象の発明を限定するためではなく、本発明の抱合体および方法を例示する目的で提供される。
実施例１
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６’−ＣＨＯの調製
１ｍＭのＣｕＳＯ４溶液（２０ｍＬ）および２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４溶液（ｐＨ６．０；２０ｍＬ）の中にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌｅｓ）を溶解させた。その後ガラクトースオキシダーゼ（２４０Ｕ；２４０μＬ）およびカタラーゼ（１３０００Ｕ；１３０μＬ）を添加し、酸素が充填されたバルーンを反応系に備えつけ、７日間室温で攪拌した。反応混合物をその後ろ過し（スピンカートリッジ；ＭＷＣＯ５Ｋ）、ろ液（約４０ｍＬ）を、必要となるまで４℃で保管した。ＴＬＣ（シリカ；ＥｔＯＨ／水（７／２）；Ｒｆ＝０．７７；アニスアルデヒド染色液で可視化）。
実施例２
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６’−ＮＨ２の調製
０℃で以上からのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６’−ＣＨＯ溶液（２ｍＬまたは約２０ｍｇ）に対して、酢酸アンモニウム（１５ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌｅｓ）およびＮａＢＨ３ＣＮ（１ＭのＴＨＦ溶液；０．１７ｍＬ、０．１７ｍｍｏｌｅｓ）を添加し、一晩室温まで暖めた。水を伴うＧ−１０カラムを通して反応液をろ過し、生成物を収集した。適切な画分を凍結乾燥させ、凍結状態で保管した。ＴＬＣ（シリカ：エタノール／水（７／２）；Ｒｆ＝０．７２；ニンヒドリン試薬で可視化）。
実施例３
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１ＫＤａ）の調製
ＤＭＦ（６ｍＬ）とピリジン（１．２ｍＬ）中に、ガラクトサミニル−１−ホスファート−２−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１ＫＤａ）（５８ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌｅｓ）を溶解させた。その後、ＵＭＰ−モルホリダート（６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌｅｓ）を添加し、４８時間７０℃で、結果としての混合物を攪拌した。反応混合物を通して窒素をバブリングさせることにより、溶媒を除去し、逆相クロマトグラフィにより残渣を精製した（Ｃ−１８シリカ、１０〜８０％の間の階段勾配、メタノール／水）。所望の画分を収集し、減圧下で乾燥させて５０ｍｇ（７０％）の白色固体を生成した。ＴＬＣ（シリカ、プロパノール／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ、（３０／２０／２）、Ｒｆ＝０．５４）。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：計測値、１４８５、１５２９、１６１８、１７０６。
実施例４
システイン−ＰＥＧ２（２）の調製
Figure 0004719686
４．１． 化合物１の合成
アルゴン下で無水エタノール（２０Ｌ）中のＬ−システイン（９３．７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）溶液に対し、水酸化カリウム（８４．２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、粉末として）を添加した。混合物を３０分間室温で攪拌し、次に、２時間にわたり複数の分量で分子質量２０キロダルトン（Ｔｓ：１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ−Ｏ−トシラートを添加した。混合物を５日間室温で攪拌し、回転蒸発により濃縮した。残渣を水（３０ｍＬ）で希釈し、室温で２時間攪拌して、いずれかの余剰の２０キロダルトンｍＰＥＧ−Ｏ−トシラートを破壊する。その後溶液を酢酸で中和し、ｐＨをｐＨ５．０に調整し、逆相クロマトグラフィ（Ｃ−１８シリカ）カラム上に装てんした。メタノール／水の勾配でカラムを溶出させ（生成物は約７０％のメタノールで溶出する）、生成物溶出を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を収集し水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクロマトグラフィ（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧ Ｂｅａｄｓ、３００ｍｌ、水酸化物形態；水対水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）に付し、適切な画分のｐＨを酢酸で６．０まで低下させた。このとき、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上で捕捉し、上述の通りのメタノール／水の勾配で溶出させた。生成物の画分をプールし、濃縮し、水中で再溶解させ、凍結乾燥して４５３ｍｇ（４４％）の白色固体を得た（１）。化合物の構造データは以下の通りであった；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ ２−Ｓ）、３．０５（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．１８（ｑ、１Ｈ、（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３８（ｓ、３Ｈ、ＣＨ ３Ｏ）、３．７（ｔ、ＯＣＨ ２ＣＨ ２Ｏ）、３．９５（ｑ、１Ｈ、ＣＨＮ）。生成物の純度をＳＤＳＰＡＧＥによって確認した。
４．２． 化合物２（システイン−ＰＥＧ２）の合成
溶液が塩基性になるまで無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中に溶解した化合物１の溶液（４４０ｍｇ、２２μｍｏｌ）に対して、トリエチルアミン（約０．５ｍＬ）を滴下にて添加した。室温で１時間にわたり、複数の分量で、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の２０キロダルトンのｍＰＥＧ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルカルボナート（６６０ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ、３０．８μｍｏｌ）の溶液を添加した。２４時間にわたり、室温で反応混合物を攪拌した。その後回転蒸発により溶媒を除去し、水（１００ｍＬ）中に残渣を溶解させ、１．０ＮのＮａＯＨで９．５にｐＨを調整した。塩基性溶液を２時間室温で攪拌し、その後ｐＨ７．０まで酢酸で中和した。その後、溶液を逆相クロマトグラフィ（Ｃ−１８シリカ）カラム上に装てんした。メタノール／水の勾配でカラムを溶出させ（生成物は約７０％のメタノールで溶出する）、生成物溶出を蒸発光散乱により監視し、適切な画分を収集し水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクロマトグラフィ（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧ Ｂｅａｄｓ、３００ｍｌ、水酸化物形態；水対水／酢酸−０．７５Ｎの勾配）に付し、適切な画分のｐＨを酢酸で６．０まで低下させた。このとき、この溶液を逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上で捕捉し、上述の通りのメタノール／水の勾配で溶出させた。生成物の画分をプールし、濃縮し、水中で再溶解させ、凍結乾燥して５７５ｍｇ（７０％）の白色固体を得た（２）。化合物の構造データは以下の通りであった：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）δ２．８３（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ ２−Ｓ）、２．９５（ｔ、２Ｈ、Ｏ−Ｃ−ＣＨ ２−Ｓ）、３．１２（ｑ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ ３Ｏ）、３．７１（ｔ、ＯＣＨ ２ＣＨ ２Ｏ）。生成物の純度をＳＤＳＰＡＧＥによって確認した。
実施例５
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１ＫＤａ）の調製
ＤＭＦ（６ｍＬ）とピリジン（１．２ｍＬ）中に、ガラクトサミニル−１−ホスファート−２−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＭｅ（１キロダルトン）（５８ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌｅｓ）を溶解させた。その後、ＵＭＰ−モルホリダート（６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌｅｓ）を添加し、４８時間７０℃で、結果としての混合物を攪拌した。反応混合物を通して窒素をバブリングさせることにより、溶媒を除去し、逆相クロマトグラフィにより残渣を精製した（Ｃ−１８シリカ、１０〜８０％の間の階段勾配、メタノール／水）。所望の画分を収集し、減圧下で乾燥させて５０ｍｇ（７０％）の白色固体を生成した。ＴＬＣ（シリカ、プロパノール／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ、（３０／２０／２）、Ｒｆ＝０．５４）。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：計測値、１４８５、１５２９、１６１８、１７０６。
実施例６
ＧｎＴ１およびＧａｌＴ１のワンポット内反応
６．１． ワンポット内反応
１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．０２％のアジ化ナトリウム、３０ｍＵ／ｍＬの精製ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１および２００ｍＵ／ｍＬの精製ガラクトーストランスフェラーゼ−１を含有するｐＨ６．５のＭＥＳまたはｐＨ７．５のトリスＨＣｌ１００ｍＭの中でＥＰＯ（１ｍｇ／ｍＬ）を１６時間３２℃でインキュベートすることによって、ワンポットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１およびガラクトーストランスフェラーゼ−１反応を実施した。
６．２ スーパーデックス上でのＥＰＯの精製
５ｍＬ／分の流速で１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．５のＭＥＳ緩衝液１００ｍＭ中でスーパーデックス７５カラムを平衡化した。工程６．１（上述）からのＥＰＯ生成物をカラム上に装てんし、平衡化緩衝液で溶出した。溶出液を２８０ｎｍの吸収度および伝導度について監視した。プールされたどのピーク画分がＥＰＯを含有し、さらなる実験において使用されるかを判定するのにＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。
６．３ ＳＴ３ＧａｌＧａｌ−ＩＩＩ反応
１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸−２０キロダルトン−ＰＥＧ、０．０２％のアジ化ナトリウムおよび２００ｍＵ／ｍＬの精製済みＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩを含有するｐＨ６．５のＭＥＳまたはｐＨ７．５のトリスＨＣｌ１００ｍＭ中で１ｍｇ／ｍＬにＥＰＯ−Ｇａｌ（以上の工程６．２からのもの）を１６時間３２℃でインキュベートすることにより、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ反応を実施した。
実施例７
ＧｎＴ１、ＧａｌＴ１およびＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（ＣＭＰ−ＮＡＮ−２０ＫＰＥＧを使用）ワンポット内反応
ｐＨ６．５のＭＥＳ緩衝液１００ｍＭ中で糖ヌクレオチドおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸−２０ＫｄＰＥＧを伴う５００ｍＵ／ｍＬのＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、２００ｍＵ／ｍＬのガラクトーストランスフェラーゼ−１および３０ｍＵ／ｍＬのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１と共にＥＰＯ（１ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。２段階酵素再編成反応中で得られた結果と同様に、１ポット３酵素調製物の中にＰＥＧ化されたＥＰＯの３つのバンドが見られる。
実施例８
２分岐ＰＥＧ−ＥＰＯの産生
８．１ ｒＥＰＯに対するＧｌｃＮＡｃの添加
ｐＨ７．２で０．１Ｍのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｎＣｌ２および０．０２％のアジ化ナトリウム中のバキュロウイルス（１ｍｇ／ｍＬ）内で発現された組換え型ＥＰＯを、２４時間３２℃で３ｍＭのＵＳＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５０ｍＵ／ｍｇのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−１および５０ｍＵ／ｍｇのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ−ＩＩと共にインキュベートした。
８．２ ガラクトースの添加
３ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌおよび０．２Ｕ／ｍｇのガラクトーストランスフェラーゼ−１を、工程８．１（上述）のＧｌｃＮＡｃ標識されたペプチドに添加した。混合物を３２℃で３６時間インキュベートした。トリス緩衝生理食塩水中のスーパーデックス７５カラム上のゲルろ過クロマトグラフィによりガラクトシル化された生成物を単離した。精製された生成物を１ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
８．３ シアル酸またはシアル酸ＰＥＧの添加
ｐＨ７．２の０．１Ｍのトリス、０．１ＭのＮａＣｌ中の工程８．２（上述）からのガラクトシル化された生成物（１ｍｇ／ｍＬ）を、２００ｍＵ／ｍｇのＳＴ３ＧａｌＩＩＩおよび０．５ｍＭのＣＭＰシアル酸またはＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（ここでＰＥＧは５キロダルトン、１０キロダルトンまたは２０キロダルトンの分子質量をもつ）と共に２４時間３２℃でインキュベートした。
実施例９
ＣＳＴ−ＩＩによるＮ連結型３０Ｋ ＰＥＧ化
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞（５ｍｇ、０．１６６μｍｏｌ、５ｍｌ）中で発現された状態でグリコシル化されたＥＰＯを濃縮し、トリス緩衝液（５０ｍＭのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００１ＭのＣａＣｌ２＋０．００５％のＮａＮ３）で最終体積５ｍｌとなるまで緩衝液を交換した。次に、ＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧ（３０キロダルトン、２５ｍｇ、０．８３３μｍｏｌ；３０ＫダルトンＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧの構造については図３Ｂを参照）、０．２５ｍＬの１００ｍＭのＭｎＣｌ２０．２５ｍｌおよびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｍｉからの二官能性シアリルトランスフェラーゼ（１．４Ｕ／ｍＬ、０．５ｍｌ、０．７Ｕ）を添加した。結果としての混合物を４８時間３２℃で揺動させた。
反応の終了時点で、混合物を限外ろ過により１ｍＬの最終体積まで濃縮し、次に２５ｍＭのＮａＯＡｃ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｐＨ６．０）で２．５ｍｌまで緩衝液交換した。溶離剤として２５ｍＭのＮａＯＡｃ＋２ＭのＮａＣｌ＋０．００５％のＴｗｅｅｎ−８０（ｐＨ６．０）を用いてＱ−セファロースＩＥＸクロマトグラフィを実施した。ピーク２を収集し、限外ろ過により１．５ｍｌまで濃縮し、その後溶離剤として１×ＰＢＳ（ｐＨ５．５＋０．００５％のＴｗｅｅｎ８０）を用いてスーパーデックス−２００精製（カラム：スーパーデックス２００、１６／６０ＧＬ、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に付した。ピーク２を収集し、１．５ｍｌまで濃縮させた。結果としてのこの材料を無菌ろ過し、１０ｍＭのＮａＯＡｃ（０．７５％のＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用いて２．５ｍＬの最終体積になるよう処方した。タンパク質濃度２６４μｇ／ｍｌ；６６０μｇのタンパク質が得られた（ＢＣＡ判定）。
実施例１０
以下の実施例はＳＴ３ＧａｌＩＩＩを用いてＯ連結型４０キロダルトンＰＥＧ連結型ＥＰＯを調製するための方法を例示している。
１０．１ 脱シアリル化
この工程において、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）内で成長させられたＥＰＯを脱シアリル化した。ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ連結は、以下の工程１０．２における修飾型シアル酸ＰＥＧのトランスファのためのアクセプタとして役立つ。
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞内で発現された状態でグリコシル化されたＥＰＯ溶液１０ｍｌ（１０ｍｇ、０．３３μｍｏｌ）をトリス緩衝液（２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．２）で緩衝液交換して、１０ｍｌの最終体積を得た。その後、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓからの７５０ｍＵの２，３，６，８−ノイラミダーゼを溶液に添加した。結果として得た混合物を４８時間３２℃で揺動した。この工程の生成物を、プロトコルの次の工程で直接使用した（以下参照）。
１０．２ Ｏ連結型４０Ｋ ＰＥＧ化
この工程では、Ｏ−シアリルトランスフェラーゼを用いて、上述の工程１０．１からの脱シアリル化されたＥＰＯへと修飾型シアル酸−ＰＥＧ部分を転移する。
上述の混合物の半分に対して、ＣＭＰシアル酸−ＰＥＧ（４０キロダルトン、３３ｍｇ、０．８２５μｍｏｌ；４０キロダルトンのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの構造については図３Ａを参照）、Ｏ−シアリルトランスフェラーゼ（１．４Ｕ／ｍｌ、３００ｍＵ）および０．２５ｍＬの１００ｍＭのＭｎＣｌ２を添加した。この混合物を４８時間３２℃で揺動させた。４８時間後、反応混合物を限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）により２．８ｍｌまで濃縮し、次に最終体積３ｍｌとなるまで２５ｍＭのＮａＯＡｃ＋０．００１％のＴｗｅｅｎ−８０、ｐＨ６．０）で緩衝液交換した。ＳＰ（５ｍＬ）で３回（３回の注入、各１ｍｌずつ）、最終生成物をイオン交換で精製した。ＰＥＧ化されたＥＰＯ（ピーク２）を収集し、ＳＥＣ精製のため最終体積２ｍｌとなるまで限外ろ過により濃縮した。スーパーデックス２００上での精製により、反応の最終工程のための所望のタンパク質すなわちＥＰＯ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ（４０Ｋ）の分解が得られた。
１０．３ ＣＨＯ−ＥＰＯ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ（４０Ｋ）の完全末端シアリル化
プロセスのこの工程においては、修飾型シアル酸残基を担持しないグリコシル構造の末端にシアル酸を添加した。
組合せ型ＰＥＧ化ＥＰＯ（上述の工程ｂ内の反応からの約２ｍｇ）を、限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）により濃縮し、次にトリス緩衝液（０．０５Ｍのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００１ＭのＣａＣｌ２＋０．００５％のＮａＮ３）で２ｍＬの最終体積になるまで緩衝液交換した。その後、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ；１．５ｍｇ、２．４μｍｏｌ）、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（８．９Ｕ／ｍＬ、１０μｌ、０．０８９Ｕ）および５０μｌの１００ｍＭ ＭｎＣｌ２を添加した。結果としての混合物を２４時間３２℃で揺動させ、次に１ｍｌの最終体積まで濃縮した。この溶液を、溶離剤として１×ＰＢＳ（ｐＨ５．５＋０．００５％のＴｗｅｅｎ８０）を用いて直接スーパーデックス２００精製に付した。ピーク１を収集し、１０ｍｌまで希釈した。タンパク質濃度５２．８μｇ／ｍｌ（ＢＣＡ）。合計５２８μｇのタンパク質を得た。最終ペプチド生成物の概略的表示が図４Ａに示されている。
実施例１１
この実施例においては、ＥＬＩＳＡ検定を用いて、静脈内投与されたＣＨＯ由来のＥＰＯ（概略的表示が図５に示されている）およびＣＨＯ由来のＥＰＯのＧｌｙｃｏＰＥＧ化変異体の薬物動態プロファイルを比較した。
ＣＨＯ由来のエリスロポエチンの２つのＰＥＧ化されていないバッチ、本発明の方法で産生された３０ＫのＰＥＧ化されたＣＨＯ由来のエリスロポエチン（図４Ｂ）、および本発明の方法で産生された４０ＫのＰＥＧ化されたＣＨＯ由来のエリスロポエチン（図４Ａ）の薬物動態を、ラットの体内への単一の３０μｇ／ｋｇの静脈内用量の後にＥＬＩＳＡによって比較した。
１１．１ ＥＬＩＳＡ平板の調製
１ウェルあたり１００μＬの割合で、９６ウェルの平板中にヒトＥＰＯに対する捕捉抗体を送り出した。平板を平板密封テープでカバーし、３７℃で２時間インキュベートした。０．２％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含有するトリス−緩衝生理食塩水で２回洗浄することにより、捕捉抗体を平板から除去した。三回目の洗浄の後、平板に対し３％の牛乳遮断溶液（ＴＢＳＴプラス３％の牛乳）を添加し、平板を平板密封テープでカバーし一晩４℃でインキュベートした。
午前中に、ＴＢＳＴで３回洗浄することによって遮断溶液を除去した。ラット血漿試料および標準タンパク質をラット血漿で適宜希釈し、１００μＬ／ウェルの割合でウェル内に送り出した。平板を平板密封テープでカバーし、４℃で一晩インキュベートした。
次の朝、標準タンパク質を用いて、その薬物動態がテストされているＥＰＯタンパク質の各々について標準線形回帰を生成した。標準タンパク質の逆相ＨＰＬＣ分析を完了し、検出されたタンパク質に対応するピーク下の面積を計算することによって濃度を決定した。
１１．２ 試験試料の調製および添加
各々の試験試料を希釈させ、希釈された試料を１００μＬ／ウェルの割合でＥＬＩＳＡ平板内に送り出した。その後、平板を平板密封テープでカバーし、４℃で一晩インキュベートした。
１１．３ ユーロピウム計数の測定
午前中に、ラット血清試料を除去し、平板をＴＢＳＴで３回洗浄した。ユーロピウムで予め標識されゲルろ過カラムを通して精製された検出抗体、マウス抗−ＥＰＯを、ＥＬＩＳＡ平板に適用した。１００ｒｐｍの攪拌下で１時間、平板を室温にてインキュベートした。
ＴＢＳＴで６回平板を洗浄することにより、検出抗体を除去した。２００μＬ／ウェルの割合で平板に対し増強溶液を添加し、室温で２０分間、平板をインキュベートした。ユーロピウム計数プログラムを用いてウオーレス（Ｗａｌｌａｃ）平板読取り装置で螢光を読取った。
１１．４ 結果
１１．４ａ 標準線形回帰の生成
標準線形回帰曲線および等式を生成するために、各平板からの標準タンパク質由来のユーロピウム計数を使用した。等式を用いてユーロピウム計数を各試料ウェルについての等価ＥＰＯ数量に転換した。
１１．４ｂ 薬物動態結果
結果は、図６に示されている。検出の限界は非ＰＥＧ化ＥＰＯについて約０．４ｎｇ／ｍＬ、３０キロダルトンと４０キロダルトンの両方のＰＥＧ化ＥＰＯについて約０．８ｎｇ／ｍＬである。
３０キロダルトンのＰＥＧ化されたＣＨＯ由来のＥＰＯ、および４０キロダルトンのＰＥＧ化されたＣＨＯ由来のＥＰＯは、その非ＰＥＧ化対応物に対してはるかに優れた静脈内クリアランスパラメータを明らかに示す。図を見ればわかるように、さまざまなＥＰＯイソ型は、４０キロダルトンのＰＥＧ化されたＣＨＯ由来のＥＰＯ約３０キロダルトンのＰＥＧ化されたＣＨＯ由来のＥＰＯ＞＞＞非ＰＥＧ化対応物とランク付けされた。
実施例１２
この実施例では、ＥＬＩＳＡ検定を用いて、皮下投与されたＣＨＯ由来のエリスロポエチン（ＥＰＯ）、過グリコシル化非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯ、昆虫細胞成長型ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯおよびＣＨＯ細胞由来のＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯの薬物動態プロファイルを、ＥＬＩＳＡ検定を用いて判定した。
ラットに単一の１０μｇ／ｋｇの皮下用量を与えた後、ＥＬＩＳＡにより、非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＣＨＯ由来ＥＰＯ、非ＰＥＧ化高グリコシル化ＣＨＯ由来ＥＰＯ、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化昆虫細胞由来ＥＰＯ；１０ＫのＮ連結型ＰＥＧ化昆虫細胞由来エリスロポエチン（概略的表示は図７に示されている）および４０キロダルトンのＯ連結型ＰＥＧ化ＣＨＯ由来エリスロポエチン（図４Ａ参照）の薬物動態を比較した。
ＥＬＩＳＡ平板を、実施例１０に記述されている通りに調製し遮断した。標準タンパク質も調製し、ユーロピウム計数も上述の通りに判定した。
１２．１ ラット試料の調製と添加
皮下（Ｓ．Ｃ．）注入の後、等価のＩ．Ｖ．（静脈内）注入の場合に見られたものと比較して、循環内のＥＰＯの量は低下した。Ｓ．Ｃ．注入したＥＰＯタンパク質の血漿濃度を標準的に、注入から３０分〜４８時間の間で検出した。
１２．２ 薬物動態結果
これらの実験の結果は図８に示されている。図８は、各ＥＰＯ変異体グループについての注入時間＝０時後の異なる時点におけるラット血清試料中のｎｇ／ｍＬ単位のＥＰＯの平均量および標準偏差を示す。検出限界は非ＰＥＧ化ＥＰＯおよびＰＥＧ化ＥＰＯについて約０．３ｎｇ／ｍＬである。
昆虫細胞内で成長させられた１０ＫのＰＥＧ化ＥＰＯおよび４０キロダルトンのＰＥＧ化ＣＨＯ−ＥＰＯの場合において、吸収は漸進的であるように思われ、これらのＥＰＯ変異体の多くがピーク血清レベル（Ｃｍａｘ）をはるかに超えてひきつづき吸収されている状況を生み出している。
昆虫細胞内で成長させられた１０ＫのＰＥＧ化ＥＰＯ変異体は、注入から２４〜３６時間後の時間範囲でＣｍａｘに達する。一方、４０キロダルトンのＰＥＧ化ＣＨＯ−ＥＰＯ変異体は、注入後４０〜６０時間でＣｍａｘに達する。さらに、現行の注入済み用量で注入後９６時間で、ＰＥＧ化された変異体がかなりのレベルで存在した。
血清ランク順位ｔ１／２は以下の通りである：
４０キロダルトンのＰＥＧ化されたＣＨＯ−ＥＰＯ＞昆虫細胞内で成長させられた１０ＫのＰＥＧ化ＥＰＯ変異体＞過グリコシル化ＣＨＯ−ＥＰＯ＞＞非ＰＥＧ化ＣＨＯ−ＥＰＯ。
実施例１３
２つの非ＰＥＧ化ＥＰＯ変異体（ＡおよびＢ）の相対的活性を、培養中のＥＰＯレセプタ担持ＴＦ１細胞の増殖の刺激に関して、２つのＧｌｙｃｏＰＥＧ化変異体（３０キロダルトンおよび４０キロダルトンのＰＥＧ）および過グリコシル化ＰＥＧに対し比較した。この検定におけるＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯペプチドの活性は、過グリコシル化ＥＰＯ変異体と類似である。
実施例１４
さまざまな濃度の未ＰＥＧ化ＥＰＯ（ＡおよびＢ）とＧｌｙｃｏＰＥＧ化３０キロダルトンおよび４０キロダルトンＰＥＧ変異体による組換え型キメラＥＰＯレセプタに対する同位体標識されたＥＰＯの結合の阻害。レセプタ親和性（Ｋｉ）は、未ＰＥＧ化ＥＰＯおよびＧｌｙｃｏＰＥＧ化変異体について類似している。
本書で記述されている実施例および実施形態は例示のみを目的としていること、そしてそれに照らし合わせたさまざまな修正または変更が当業者に示唆されることになり又、本出願の精神および範囲および添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきである。本書で引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が全ての目的のために本明細書に参照により援用されている。
本発明の実施において有用な一部の修飾型糖ヌクレオチドの例を示す。 本発明の実施において有用なさらなる修飾型糖ヌクレオチドの例を示す。 本発明の実施において有用な修飾型シアル酸ヌクレオチドの例を示す。Ａ；４０キロダルトンのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧの構造。Ｂ；３０キロダルトンのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧの構造。 チャイニーズハムスター卵巣細胞から単離したＧｌｙｃｏＰＥＧ化されたＥＰＯイソ型の例の概略的表示を提示す。Ａ；４０キロダルトンのＯ連結型ＰＥＧ化グリコフォームの例。Ｂ；複数の３０キロダルトンのＮ連結型ＰＥＧ化グリコフォームの１つ。ＰＥＧ分子を含む修飾型シアル酸部分は、Ｎ連結型グリコシル残基のいずれかの分岐のうちのいずれか１つ以上のものの上で起こり得る。さらに、この図は、任意のグリコシル化ＥＰＯ分子がモノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−分岐Ｎ連結型グリコシル残基のあらゆる混合物を含み得、かつ分岐のうちのいずれか１つ以上のものかさらに本発明の修飾型シアル酸部分を含み得るという点で、例示的である。 ＣＨＯ由来のＥＰＯペプチドをその非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化形態で例示している。図４（上述）の説明文中で論述されているように、この図は、任意のグリコシル化ＥＰＯ分子がモノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−分岐Ｎ連結型グリコシル残基の任意の混合物を含みうるという点で例示的である。 ２つのＣＨＯ由来の非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯ形態および２つの異なるＣＨＯ由来のＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯ形態の薬物動態を比較する実験の結果を示す。 本発明に従った昆虫由来のＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯペプチドを例示している。 ＣＨＯ由来の非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯ形態、昆虫由来の非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯ形態とそれらの対応するＧｌｙｃｏＰＥＧ化形態の薬物動態を比較する実験の結果を示す。 ２つの形態の非ＧｌｙｃｏＰＥＧ化ＥＰＯ（ＡおよびＢ）対２つのＧｌｙｃｏＰＥＧ化変異体（図４ＡおよびＢの３０キロダルトンと４０キロダルトン変異体）および過グリコシル化ＥＰＯ変異体の、培養中のＥＰＯレセプタ担持ＴＦ１細胞の増殖の刺激における相対的活性を示す。 さまざまな濃度の２つの非ＰＥＧ化ＥＰＯ変異体（ＡおよびＢ）と２つのＧｌｙｃｏＰＥＧ化変異体（図４ＡとＢの３０キロダルトンと４０キロダルトンの変異体）による組換え型キメラＥＰＯレセプタに対する同位体標識されたＥＰＯの結合の阻害を示す。

Claims (57)

  1. 以下の部分を含むエリスロポエチンペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
    Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
    Ｒ１は、分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、かつ
    Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルの中から選択されるメンバーであるリンカーであり、
    ＤがＯＨであるときＧはＲ1−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−であり、
    前記分岐ポリ（エチレングリコール）残基は、以下のメンバーから選択される式で表される：
    Figure 0004719686
    （式中、ｑ１は０〜２０から選択される整数であり；
    ｑ、ｑ’及びｑ''は１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数であり；及び
    ｅ、ｆ及びｆ’は１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。））
  2. Ｒ１−Ｌ−が、以下の式で表される、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中、ａは０〜２０の整数である。）
  3. Ｒ１が、以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド
    。
    Figure 0004719686
    （式中、ｅおよびｆは１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは０〜２０の整数である。）
  4. Ｒ１が、以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
  5. Ｒ１が、以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中、ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
  6. 前記部分が、以下の式で表される、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
  7. 前記部分が、以下の式で表される、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
  8. 前記部分が、以下の式で表される、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中、ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基である。）
  9. 前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項８に記載のペプチド。
  10. 配列番号：１のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のペプチド。
  11. 前記アミノ酸残基が配列番号：１の１２６位のセリンである、請求項１０に記載のペプチド。
  12. 前記ペプチドが、以下から選択される式に従う少なくとも一つの前記部分を含む、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中、ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基であり、ｔは０または１に等しい整数である。）
  13. 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１２に記載のペプチド。
  14. 前記ペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有し、その２４位、３８位及び８３位のアスパラギン残基からなる群より選択される１以上のアスパラギン残基に、前記部分が結合している、請求項１３に記載のペプチド。
  15. 前記ペプチドが、以下の式に従う少なくとも一つの前記部分を含む、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基であり、ｔは０または１に等しい整数である。）
  16. 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１５に記載のペプチド。
  17. 前記ペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有し、その２４位、３８位及び８３位のアスパラギン残基からなる群より選択される１以上のアスパラギン残基に、前記部分が結合している、請求項１６に記載のペプチド。
  18. 前記ペプチドが、以下から選択される式に従う少なくとも一つの前記部分を含む、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    （式中、ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基であり、ｔは０または１に等しい整数である。）
  19. 前記ペプチドが、以下から選択される式に従う少なくとも一つの前記部分を含む、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    （式中ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基であり、ｔは０または１に等しい整数である。）
  20. 前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１９に記載のペプチド。
  21. 前記ペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有し、その２４位、３８位及び８３位のアスパラギン残基からなる群より選択される１以上のアスパラギン残基に、前記部分が結合している、請求項２０に記載のペプチド。
  22. 生物活性を有するエリスロポエチンペプチドである、請求項１から２１のいずれか１項に記載のペプチド。
  23. 赤血球産生活性を有する、請求項２２に記載のペプチド。
  24. 基本的に赤血球産生活性を有しない、請求項２２に記載のペプチド。
  25. 組織保護作用を有する、請求項２２に記載のペプチド。
  26. 前記ポリ（エチレングリコール）残基が、基本的にホモ分散となる分子量を有する、請求項１に記載のペプチド。
  27. 前記ポリ（エチレングリコール）残基が、メトキシポリ（エチレングリコール）を含む、請求項１に記載のペプチド。
  28. 前記部分が、下記式から選択される、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    （式中、ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基を示し、ｔは０又は１を示す。）
  29. 前記部分が、下記式から選択される、請求項１に記載のペプチド。
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    Figure 0004719686
    及び
    Figure 0004719686
    （式中、ＡＡは前記ペプチドのアミノ酸残基を示し、ｔは０又は１を示す。）
  30. ポリ（エチレングリコール）を含む、下記式で表される部分を含むエリスロポエチンペプチド。
    Figure 0004719686
    （式中、ｎはポリ（エチレングリコール）の分子量が４０ｋＤａになるように選択される。）
  31. 前記ペプチドは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有し、その１２６位のセリン残基に、前記部分が結合している、請求項３０に記載のペプチド。
  32. 請求項１から３１のいずれか１項に記載のエリスロポエチンペプチドと、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
  33. 以下の部分を含むＰＥＧ化エリスロポエチンペプチドの製造方法であって、
    Figure 0004719686
    （式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
    Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
    Ｒ１は、分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、かつ
    Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルの中から選択されるメンバーであるリンカーであり、
    ＤがＯＨであるときＧはＲ1−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−であり、
    （ａ）Ｎ結合型糖を有するエリスロポエチンペプチドと、下記式で示されるＰＥＧ−シアル酸を含むＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
    Figure 0004719686
     前記ＰＥＧ−シアル酸をＮ結合型糖上に転移するＣＳＴ−ＩＩと、を該転移反応に適切な条件下で接触させる工程と、を含み、
    前記分岐ポリ（エチレングリコール）残基が、下記式で示されるメンバーから選択される、方法。
    Figure 0004719686
     （式中、ｑ １ は０〜２０から選択される整数であり；
    ｑ、ｑ’及びｑ''は１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数であり；及び
    ｅ、ｆ及びｆ’は１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。））
  34. 前記ペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有し、その２４位、３８位及び８３位のアスパラギン残基からなる群より選択される１以上のアスパラギン残基に、前記Ｎ結合型糖が結合している、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記Ｎ結合型糖が、配列番号：１の２４位のアミノ酸残基に結合している、請求項３４に記載の方法。
  36. 工程（ａ）の前に、
    （ｂ）適切な宿主中で前記基質エリスロポエチンペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させる工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記宿主が哺乳類細胞である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記エリスロポエチンペプチドが、ＣＨＯ細胞中で発現される際にグリコシル化される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ポリ（エチレングリコール）残基が、基本的にホモ分散となる分子量を有する、請求項３３に記載の方法。
  41. 以下の部分を含むＰＥＧ化エリスロポエチンペプチドの製造方法であって、
    Figure 0004719686
    （式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
    Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
    Ｒ１は、分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり、かつ
    Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルの中から選択されるメンバーであるリンカーであり、
    ＤがＯＨであるときＧはＲ1−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであるときＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−であり、
    （ａ）以下の糖部分を含む基質エリスロポエチンペプチドと、
    Figure 0004719686
     下記式で示されるＰＥＧ−シアル酸を含むＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
    Figure 0004719686
     前記ＰＥＧ−シアル酸を前記糖部分のＧａｌ上に転移する酵素と、を該転移反応に適切な条件下で接触させる工程を含み、
    前記分岐ポリ（エチレングリコール）残基が、下記式で示されるメンバーから選択される、方法。
    Figure 0004719686
    （式中、ｑ１は０〜２０から選択される整数であり；
    ｑ、ｑ’及びｑ''は１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数であり；及び
    ｅ、ｆ及びｆ’は１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。））
  42. 前記ポリ（エチレングリコール）は、分子量が５００〜１００，０００Ｄａである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ポリ（エチレングリコール）は、分子量が２０００〜６０，０００Ｄａである、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記ポリ（エチレングリコール）は、分子量が５０００〜３０，０００Ｄａである、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記ポリ（エチレングリコール）は、分子量が４０，０００Ｄａである、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記ＰＥＧ−シアル酸ドナー部分が、下記式で示され、
    Figure 0004719686
     該部分がポリ（エチレングリコール）を有する、請求項４１に記載の方法。
    （式中、ｎはポリ（エチレングリコール）の分子量が４０ｋＤａになるように選択される。）
  47. 前記酵素は、Ｏ−シアリルトランスフェラーゼである、請求項４１に記載の方法。
  48. 前記酵素は、ＳＴ３Ｇａｌ１である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記糖部分は、配列番号：１の１２６位のアミノ酸に結合している、請求項４１から４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 工程（ａ）の後に、
    （ｂ）工程（ａ）によって得られた構造と、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ及びシアル酸ドナーと、を接触させる工程をさらに含む、請求項４１から４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 工程（ａ）の前に、
    （ｂ）適切な宿主中で、基質エリスロポエチンペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させる工程をさらに含む、請求項４１から５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記宿主が哺乳類細胞である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ポリ（エチレングリコール）残基が、基本的にホモ分散となる分子量を有する、請求項４１に記載の方法。
  55. 請求項１に記載のペプチドの使用であって、哺乳類において赤血球産生を増大させる医薬の製造のための、使用。
  56. 請求項１に記載のペプチドの使用であって、貧血症の治療のための医薬の製造のための使用であり、
    前記貧血症は、加齢による貧血症、未熟児早期貧血、慢性腎不全の付随する貧血、がん化学療法に伴う貧血、抗ＨＩＶ剤による治療に伴う貧血、鎌状赤血球病に伴う貧血、ベータサラセミアに伴う貧血、嚢胞性線維症に伴う貧血、妊娠に伴う貧血、月経異常に伴う貧血、脊髄損傷に伴う貧血、宇宙飛行に伴う貧血、及び急性失血に伴う貧血からなる群より選択される貧血症である、使用。
  57. 請求項１に記載のペプチドの使用であって、組織傷害の治療のための医薬の製造のための使用であり、
    前記組織傷害は、虚血、外傷、炎症、及び毒性物質との接触による傷害からなる群より選択される傷害である、使用。
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Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7399613B2 (en) * 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7696163B2 (en) * 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
US7803777B2 (en) 2003-03-14 2010-09-28 Biogenerix Ag Branched water-soluble polymers and their conjugates
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
CA2524936A1 (en) 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
WO2005072371A2 (en) * 2004-01-26 2005-08-11 Neose Technologies, Inc. Branched polymeric sugars and nucleotides thereof
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US20080318850A1 (en) * 2003-12-03 2008-12-25 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated Factor Ix
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060182692A1 (en) 2003-12-16 2006-08-17 Fishburn C S Chemically modified small molecules
PL1694363T3 (pl) * 2003-12-16 2014-07-31 Nektar Therapeutics Monodyspersyjne kompozycje PEGylowanego naloksolu
ES2560657T3 (es) 2004-01-08 2016-02-22 Ratiopharm Gmbh Glicosilación con unión en O de péptidos G-CSF
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
DK2586456T3 (en) 2004-10-29 2016-03-21 Ratiopharm Gmbh Conversion and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
EP1858543B1 (en) 2005-01-10 2013-11-27 BioGeneriX AG Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060246544A1 (en) * 2005-03-30 2006-11-02 Neose Technologies,Inc. Manufacturing process for the production of peptides grown in insect cell lines
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20080255026A1 (en) 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
CN102719508A (zh) * 2005-08-19 2012-10-10 诺和诺德公司 糖基聚乙二醇化的因子vii和因子viia
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP1984013B1 (en) * 2006-02-01 2012-01-25 BioGeneriX AG Modifications of cst-ii for increased protein expression
US8754192B2 (en) 2006-04-11 2014-06-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Compositions comprising homogeneously glycosylated erythropoietin
WO2007136752A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Glycofi, Inc. Erythropoietin compositions
EP2049144B8 (en) * 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
ES2569066T3 (es) * 2006-07-25 2016-05-06 Lipoxen Technologies Limited Conjugación N-terminal de ácido polisiálico a proteínas
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
LT2068907T (lt) * 2006-10-04 2018-01-10 Novo Nordisk A/S Glicerolio sujungti pegilinti sacharidai ir glikopeptidai
WO2008073620A2 (en) * 2006-11-02 2008-06-19 Neose Technologies, Inc. Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines
WO2008097461A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-14 Amgen Inc Hepcidin and hepcidin antibodies
WO2008115440A1 (en) * 2007-03-15 2008-09-25 Synageva Biopharma Corp. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
US20090053167A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides
WO2008150996A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 University Of Wyoming Degradable thermoresponsive poly(ethylene glycol) analogue materials
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
CA2711503A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
WO2009094551A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
MX2010009154A (es) 2008-02-27 2010-09-09 Novo Nordisk As Moleculas conjugadas del factor viii.
ES2487846T3 (es) 2008-05-01 2014-08-25 Amgen, Inc. Anticuerpos anti-hepcindina y métodos de uso
TWI421093B (zh) * 2008-07-31 2014-01-01 Pharmaessentia Corp 胜肽－聚合物綴合物
CN104922669A (zh) 2008-11-13 2015-09-23 通用医疗公司 用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
US8715963B2 (en) * 2010-02-24 2014-05-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for increasing N-glycosylation site occupancy on therapeutic glycoproteins produced in Pichia pastoris
RS54291B2 (sr) 2010-06-07 2023-12-29 Amgen Inc Uređaj za isporuku lekova
PL2621496T5 (pl) 2010-09-30 2019-05-31 Astrazeneca Ab Krystaliczny koniugat naloksol-peg
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
CA3145238A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
CA2851521C (en) 2011-10-14 2020-09-22 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2013166053A2 (en) * 2012-04-30 2013-11-07 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Homogenous and fully glycosylated human erythropoietin
AU2013348071B2 (en) 2012-11-21 2018-05-24 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2014143815A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
TWI592183B (zh) 2013-03-15 2017-07-21 安美基公司 本體輪廓可調適之自動注射器裝置
CA2904357C (en) 2013-03-15 2020-09-22 Intrinsic Lifesciences Llc Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
LT2976117T (lt) 2013-03-22 2021-02-25 Amgen Inc. Purkštuvas ir surinkimo būdas
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
BR112016008946B1 (pt) 2013-10-24 2022-12-27 Amgen Inc Injetores e método para montar os injetor
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
EP3139977B1 (en) 2014-05-07 2021-02-17 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
SG11201609966SA (en) 2014-06-03 2016-12-29 Amgen Inc Drug delivery system and method of use
US10323088B2 (en) 2014-09-22 2019-06-18 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
CN107530403A (zh) 2014-11-06 2018-01-02 药华医药股份有限公司 用于长效型干扰素的剂量方案
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
CA3048520A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
SG11201908058UA (en) 2017-03-07 2019-09-27 Amgen Inc Needle insertion by overpressure
KR102619150B1 (ko) 2017-03-09 2023-12-27 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
JP2020511499A (ja) 2017-03-20 2020-04-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 赤血球生成刺激タンパク質のインビトロでの糖鎖改変のための方法
SI3600491T1 (sl) 2017-03-28 2023-11-30 Amgen Inc. Sistem in postopek za sestavljanja droga bata in brizge
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. ELECTRONIC DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A CAP ACTIVATED BY A SWITCH ASSEMBLY
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
EP3658203B1 (en) 2017-07-25 2022-08-31 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
MA50527A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Système et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368338B2 (en) 2017-11-16 2024-07-25 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12109389B2 (en) 2018-07-31 2024-10-08 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660B2 (en) 2018-09-28 2024-09-26 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN117159846A (zh) 2018-10-02 2023-12-05 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
CA3112214A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
MX2021002791A (es) 2018-10-15 2021-05-12 Amgen Inc Proceso de ensamblaje de plataforma para un dispositivo de administracion de farmacos.
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US12103983B2 (en) * 2018-12-03 2024-10-01 Hipep Laboratories Compound and angiogenic agent comprising same
CA3137360A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
CA3241577A1 (en) * 2021-12-20 2023-06-29 Shaji Joseph Chemical synthesis of cytidine-5'-monophospho-n-glycyl-sialic acid
WO2023133283A1 (en) * 2022-01-07 2023-07-13 Cornell University Compositions and methods for solubilizing glycosyltransferases
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003533487A (ja) * 2000-05-15 2003-11-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 新しい薬剤組成物
JP2006522738A (ja) * 2002-10-09 2006-10-05 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド エリスロポエチン：エリスロポエチンの改造および複合糖質化
JP2006523211A (ja) * 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1479268A (en) * 1973-07-05 1977-07-13 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
CH596313A5 (ja) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
US4385260A (en) * 1975-09-09 1983-05-24 Beckman Instruments, Inc. Bargraph display
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4438253A (en) * 1982-11-12 1984-03-20 American Cyanamid Company Poly(glycolic acid)/poly(alkylene glycol) block copolymers and method of manufacturing the same
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4565653A (en) * 1984-03-30 1986-01-21 Pfizer Inc. Acyltripeptide immunostimulants
EP0229108B1 (en) 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JPS6238172A (ja) * 1985-08-12 1987-02-19 株式会社　高研 抗血栓性医用材料の製造方法
IT1213029B (it) * 1986-01-30 1989-12-07 Bracco Ind Chimica Spa Chelati di ioni metallici paramagnetici.
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4925796A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
IL82834A (en) * 1987-06-09 1990-11-05 Yissum Res Dev Co Biodegradable polymeric materials based on polyether glycols,processes for the preparation thereof and surgical artiicles made therefrom
US5104651A (en) * 1988-12-16 1992-04-14 Amgen Inc. Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf
US6166183A (en) * 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
DE68929551T2 (de) 1988-12-23 2008-03-06 Genentech, Inc., South San Francisco Menschliche DNase
US5194376A (en) * 1989-02-28 1993-03-16 University Of Ottawa Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5154924A (en) * 1989-09-07 1992-10-13 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5182107A (en) * 1989-09-07 1993-01-26 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5527527A (en) * 1989-09-07 1996-06-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5672683A (en) 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
DE4009630C2 (de) * 1990-03-26 1995-09-28 Reinhard Prof Dr Dr Brossmer CMP-aktivierte fluoreszierende Sialinsäuren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
US5951972A (en) * 1990-05-04 1999-09-14 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues
US5219564A (en) * 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
US5410016A (en) * 1990-10-15 1995-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers
US5212075A (en) 1991-04-15 1993-05-18 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for introducing effectors to pathogens and cells
US5352670A (en) * 1991-06-10 1994-10-04 Alberta Research Council Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5858751A (en) * 1992-03-09 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for producing sialyltransferases
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
CA2110543A1 (en) * 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
AU6029594A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5202413A (en) * 1993-02-16 1993-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alternating (ABA)N polylactide block copolymers
US5374541A (en) * 1993-05-04 1994-12-20 The Scripps Research Institute Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides
WO1994026906A2 (en) * 1993-05-14 1994-11-24 The Upjohn Company CLONED DNA ENCODING A UDP-GALNAc:POLYPEPTIDE,N-ACETYLGALACTOS AMINYLTRANSFERASE
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5492841A (en) * 1994-02-18 1996-02-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents
US5432059A (en) * 1994-04-01 1995-07-11 Specialty Laboratories, Inc. Assay for glycosylation deficiency disorders
US5629384A (en) * 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US5834251A (en) * 1994-12-30 1998-11-10 Alko Group Ltd. Methods of modifying carbohydrate moieties
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6030815A (en) * 1995-04-11 2000-02-29 Neose Technologies, Inc. Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5922577A (en) * 1995-04-11 1999-07-13 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US5728554A (en) * 1995-04-11 1998-03-17 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6015555A (en) * 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
WO1996040731A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Pegylated modified proteins
CO4560502A1 (es) 1995-07-27 1998-02-10 Cytec Tech Corp Una emulsion de apresto para mejorar la efectividad del apresto y metodo para uso en la fabricacion de papel
AU718439B2 (en) * 1995-09-21 2000-04-13 Genentech Inc. Human growth hormone variants
US5716812A (en) * 1995-12-12 1998-02-10 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby
SI0964702T1 (sl) 1996-08-02 2007-02-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Polipeptidi, ki imajo posamezen kovalentno vezan N-terminalni vodotopni polimer
JP2001507215A (ja) 1997-01-16 2001-06-05 サイテル コーポレイション 組換え糖タンパク質のインビトロでの実用的なシアリル化
US6183738B1 (en) * 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
AU7669598A (en) 1997-06-24 1999-01-04 Jun Piao Teng An automatic retracted non-reusable syringe
AU8269898A (en) 1997-06-27 1999-01-19 Regents Of The University Of California, The Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
US20030027257A1 (en) * 1997-08-21 2003-02-06 University Technologies International, Inc. Sequences for improving the efficiency of secretion of non-secreted protein from mammalian and insect cells
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
EP0924298A1 (en) * 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
DK1061954T3 (da) * 1998-03-12 2004-10-18 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivater med proximale reaktive grupper
DE19852729A1 (de) * 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
CA2370469A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 Astrazeneca Ab Assay for detecting phospho-n-acetylmuramyl-pentapeptide translocase activity
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6716626B1 (en) * 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
US6348558B1 (en) * 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
EP1259563B2 (en) * 1999-12-22 2016-08-10 Nektar Therapeutics Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of water soluble polymers.
AU2352201A (en) 1999-12-30 2001-07-16 Maxygen Aps Improved lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
AU2001232337A1 (en) 2000-02-18 2001-08-27 Kanagawa Academy Of Science And Technology Pharmaceutical composition, reagent and method for intracerebral delivery of pharmaceutically active ingredient or labeling substance
ATE329925T1 (de) * 2000-03-16 2006-07-15 Univ California Chemoselektive anknüpfung durch verwendung eines phosphins
AU2001263149A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-26 Neose Technologies, Inc. In vitro fucosylation recombinant glycopeptides
WO2002000879A2 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
WO2002002597A2 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Maxygen Aps Peptide extended glycosylated polypeptides
AU2001283740A1 (en) 2000-08-17 2002-02-25 University Of British Columbia Chemotherapeutic agents conjugated to p97 and their methods of use in treating neurological tumours
AU2001285020A1 (en) 2000-08-17 2002-02-25 Synapse Technologies, Inc. P97-active agent conjugates and their methods of use
AU3323002A (en) * 2000-12-20 2002-07-01 Hoffmann La Roche Erythropoietin conjugates
US6531121B2 (en) * 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
MXPA03007619A (es) 2001-02-27 2003-12-04 Maxygen Aps Nuevas moleculas similares a interferon beta.
US7265084B2 (en) * 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7696163B2 (en) * 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
CN102180944A (zh) * 2001-10-10 2011-09-14 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
US7297511B2 (en) * 2001-10-10 2007-11-20 Neose Technologies, Inc. Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha
US7399613B2 (en) * 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
AU2004236174B2 (en) * 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US8008252B2 (en) * 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7157277B2 (en) * 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
JP2005510229A (ja) * 2001-11-28 2005-04-21 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド アミダーゼを用いる糖タンパク質のリモデリング
US7473680B2 (en) * 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
US20060035224A1 (en) * 2002-03-21 2006-02-16 Johansen Jack T Purification methods for oligonucleotides and their analogs
AU2003275952A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-07 Glycozym Aps Inactivated ga1 - nac - transferases, methods for inhibitors of such transferases and their use
US20050064540A1 (en) * 2002-11-27 2005-03-24 Defrees Shawn Ph.D Glycoprotein remodeling using endoglycanases
EP1613261A4 (en) * 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
CA2524936A1 (en) * 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
US9005625B2 (en) * 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US20060198819A1 (en) * 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US7956032B2 (en) * 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2005056760A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated follicle stimulating hormone
ES2560657T3 (es) * 2004-01-08 2016-02-22 Ratiopharm Gmbh Glicosilación con unión en O de péptidos G-CSF
EP1799249A2 (en) * 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP1797192A1 (en) * 2004-09-29 2007-06-20 Novo Nordisk Health Care AG Modified proteins
US20090054623A1 (en) * 2004-12-17 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. Lipo-Conjugation of Peptides
WO2006074279A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation using saccharyl fragments
EP2386571B1 (en) * 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20080255026A1 (en) * 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
EP1926817A2 (en) * 2005-09-14 2008-06-04 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor vii polypeptides
US20090048440A1 (en) * 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US20070102607A1 (en) * 2005-11-07 2007-05-10 Tuang-Hock Koh Monitor support device
US8377151B2 (en) * 2006-07-19 2013-02-19 Zackery Allen McMurry Process for producing a renewable biofuel from waste water treatment plants
ITMI20061624A1 (it) * 2006-08-11 2008-02-12 Bioker Srl Mono-coniugati sito-specifici di g-csf
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
LT2068907T (lt) * 2006-10-04 2018-01-10 Novo Nordisk A/S Glicerolio sujungti pegilinti sacharidai ir glikopeptidai
CN101796063B (zh) * 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
US20090053167A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003533487A (ja) * 2000-05-15 2003-11-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 新しい薬剤組成物
JP2006522738A (ja) * 2002-10-09 2006-10-05 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド エリスロポエチン：エリスロポエチンの改造および複合糖質化
JP2006523211A (ja) * 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物

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