JP2006522738A - エリスロポエチン:エリスロポエチンの改造および複合糖質化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 一つもしくはそれ以上のグリコシル基をペプチドに付加もしくは除去すること、および/または修飾基をペプチドに付加する方法により、ペプチド分子を改造する。
Description
天然に存在するほとんどのペプチドは、主ペプチド鎖長に沿って選択された数のアミノ
酸へ特異的な連結を介してペプチドに結合している炭水化物部分を含む。このように多く
の天然に存在するペプチドは「糖ペプチド(glycopeptide)」と呼ばれてい
る。任意の上記ペプチドに関するグリコシル化パターンの可変性は、そのペプチドの機能
について膨大な意味を有する。例えばペプチド上のN−結合グリカン構造は、細胞または
生物中のペプチドのプロテアーゼ感受性、細胞内トラフィッキング、分泌、組織ターゲッ
ティング、生物学的半減期および抗原性を含むペプチドの様々な特性に影響を及ぼすこと
ができる。これら1以上の特性の改変は、ペプチドの天然な状況でその効力に大きく影響
し、そしてまたペプチドが治療薬の目的に生成された状況では、治療薬としてのペプチド
の効力にも影響する。
られている。ペプチド上の特別なグリカン構造はペプチドの可溶性および凝集特性、1次
ペプチド鎖のホールディング、したがってその機能的または酵素的活性、タンパク質分解
的攻撃に対するペプチドの耐性およびペプチドの不活性形から活性形への転換を導くタン
パク質分解の制御に影響を及ぼす。重要なことはグリカン分子上に存在する末端シアル酸
残基が哺乳動物の循環系でペプチドの半減期の長さに影響することである。グリカンが末
端シアル酸残基を含まないペプチドは肝臓により循環から急速に除去され、この出来事が
ペプチドの潜在的な治療的利益を無効にする。
およびO−結合グリカンに分けられる。
ニン(ここでXはプロリンおよびアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であることができ
る)を含むペプチドの1次構造中の部位のアスパラギン残基上でN−グリコシル化されて
いる。そのようなペプチドの炭水化物部分はN−結合グリカンとして知られている。N−
グリコシル化の初期の反応(event)は小胞体(ER)中で起こり、そして哺乳類、
植物、昆虫および他の高等真核生物で同一である。最初に14個の糖残基を含んでなるオ
リゴ糖が脂質担体分子上に構築される。新生ペプチドはERへ翻訳およびトランスロケー
ションされるので、全オリゴ糖鎖は膜結合グリコシルトランスフェラーゼ酵素により触媒
される反応でアスパラギン残基のアミド基に転移する。N−結合グリカンはさらにERお
よびゴルジ装置内の両方でプロセッシングされる。さらなるプロセッシングは一般に除去
および付加される糖残基について特異的なグリコシラーゼおよびグリコシルトランスフェ
ラーゼにより触媒される反応で、幾つかの糖残基の除去および他の糖残基の付加を伴う。
えば一般に、細菌中で生産されるペプチドは完全に非グリコシル化である。昆虫細胞中で
発現されるペプチドは中でも高マンノース、ポンチ(paunci)−マンノースN−結
合オリゴ糖鎖を含む。哺乳動物の細胞培養で生産されるペプチドは通常、例えば種および
細胞培養条件に依存して様々にグリコシル化される。同じ種および同じ条件下でも、時々
、グリコシル鎖における特定量の異質性に遭遇する。さらに植物細胞中で生産されるペプ
チドは、動物細胞中で生産されるものとは有意に異なるグリカン構造を含んでなる。組換
えペプチドの生産分野、特にペプチドが治療薬として使用される時のジレンマは、正しく
グリコシル化されたペプチドを生成できることであり、すなわち天然に存在するペプチド
の形態上に存在するものに似ているか、または同一のグリカン構造を有するペプチドを生
成できることである。組換え手段により生産されるほとんどのペプチドが、天然に存在す
るグリカンとは異なるグリカン構造を含んでなる。
るために提案され、それらにはとりわけ特許文献1、特許文献2、特許文献3および特許
文献4を含む。本質的にはペプチドのインビトログリコシル化に必要な多くの酵素がクロ
ーン化され、そして配列決定された。中にはこれらの酵素がインビトロで使用され、そし
て特異的な糖がペプチド上の不完全なグリカン分子に加えられた場合もある。他の例では
、発現したペプチド上へ所望の糖部分の付加が細胞内で起こるように、細胞を遺伝的に操
作して酵素および所望のペプチドの組み合わせを発現させた。
チン様糖ペプチド上での広がり(prevalence)によりムチン−型グリカンとも
呼ばれている。アスパラギン残基に結合し、そして脂質−結合中間体からのオリゴ糖のe
n bloc転移により形成されるN−グリカンとは異なり、O−グリカンは主にセリン
およびトレオニン残基に結合し、そしてヌクレオチド糖から糖の段階的付加により形成さ
れる(非特許文献1;および非特許文献2)。ペプチドの機能はそれに存在するO−結合
グリカン構造により影響され得る。例えばP−セレクチンリガンドの活性は、それに存在
するO−結合グリカン構造により影響を受ける。O−結合グリカン構造の総説については
、非特許文献3を参照にされたい。他のグリコシル化パターンはグリコシルホスファチジ
ルイノシトールをタンパク質のカルボキシル−末端カルボキシル基に連結することにより
形成される(非特許文献4;および非特許文献5)。
術分野には所望する、すなわちカスタマイズされたグリコシル化パターンを有するペプチ
ドの一般的に応用できる生産法の必要性が存在する。当該技術分野では生成するペプチド
を工業的規模で生産することができる、ペプチドのカスタマイズされたインビトログリコ
シル化について特別な必要性が存在する。この、および他の必要性が本発明により満たさ
れる。
与することは医学分野では周知である。中でもこの目的に使用されている最も知られてい
るペプチドは、糖尿病を処置するために使用されているインスリンである。酵素もそれら
の治療的利益のために使用されてきた。治療用ペプチドの使用を制限する主な要因は、ほ
とんどのペプチドの免疫原性である。患者では投与されたペプチドに対する免疫原性応答
がペプチドを中和し、かつ/または患者にアレルギー応答の発生を導き得る。治療用ペプ
チドの他の欠点には最適状態には及ばない効力および急速な排除速度(clearanc
e rate)を含む。ペプチド治療薬に固有の問題が当該技術分野では認識されており
、そしてこの問題の様々な排除法が調査された。可溶性ペプチド治療薬を提供するために
、合成ポリマーがペプチド骨格に付けられた。
ある。ペプチド治療薬を誘導化するためのPEGの使用はペプチドの免疫原性を下げ、そ
して循環からの排除時間を長くすることが示された。例えば特許文献5(Davis e
t al.)は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールに
カップリングした酵素およびペプチドホルモンのような非−免疫原性ペプチドに関する。
1モルのペプチドあたり10から100モルの間のポリマーが使用され、そして少なくと
も15%の生理学的活性が維持される。
タンパク質分解酵素の活性を、タンパク質分解酵素を高分子化インヒビターに連結するこ
とにより維持する方法に関する。結合物は医学的応用を意図している。
する非特異的結合である。例えば特許文献7は、PEGに共有結合した酵素の酵素的に活
性なポリマー−酵素結合物を開示する。同様に特許文献8は、α−1プロテアーゼインヒ
ビターと、PEGまたはメトキシポリ(エチレングリコール)("mPEG")のような
ポリマーの共有結合複合体を開示する。Abuchowski et al.,(非特許
文献6)は、mPEGのウシ血清アルブミンのアミン基への共有結合を開示する。特許文
献9はインターフェロンをポリ(エチレン無水琥珀酸)のようなジカルボン酸の無水物に
結合することにより、インターフェロンをより低い疎水性にする方法を開示する。特許文
献10はPEGおよびポリ(オキシエチル化)ポリオールの、インターフェロン−β、イ
ンターロイキン−2およびイムノトキシンのようなタンパク質への結合を開示する。特許
文献11は、リンホカインの少なくとも1つの1級アミノ基に直接結合したPEGを含有
するIL−2のような化学的に修飾したリンホカインを開示し、そして特許請求する。特
許文献12は、多糖のようなポリマー性基質に共有結合したタンパク質分解酵素の水溶性
複合体の製薬学的組成物を開示する。
酸化を介する。酸化された糖はPEG部分をペプチドに結合させるための部位として利用
する。例えばM'Timkulu(特許文献13)は、PEGを糖タンパク質へ付加する
ためにヒドラジン−またはアミノ−PEGの使用を開示する。グリコシル部分は対応する
アルデヒドに無作為に酸化され、これは続いてアミノ−PEGにカップリングされる。
プチド骨格の反応性残基に付加される。治療用ペプチドを生産するために、特異的に標識
され、容易に特性決定可能な、本質的に均一な生成物をもたらす誘導化法を利用すること
が望ましいのは明らかである。
ーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェ
ラーゼ)およびグリコシダーゼが炭水化物の合成に使用されている。グリコシダーゼはさ
らにエキソグリコシダーゼ(例えばβ−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ)およびエ
ンドグリコシダーゼ(例えばエンド−A、エンド−M)に分類される。これらの種類の各
酵素は、炭水化物を調製するために成功裏に合成的に使用されてきた。一般的な総説につ
いては、非特許文献7を参照にされたい。
ランスフェラーゼは良好な立体化学的および位置化学的制御で特異的生成物を生産するた
めに効果的である。グリコシルトランスフェラーゼはオリゴ糖を調製し、そして末端N−
およびO−結合炭水化物構造、特に哺乳動物細胞で生産されたペプチドを修飾するために
使用されてきた。例えば糖ペプチドの末端オリゴ糖は完全にシアル化および/またはフコ
シル化されてより一貫した糖構造を提供し、これは糖ペプチドの薬物動態学および種々の
他の生物学的特性を改善する。例えばβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼを使
用してラクトサミンを合成し、これは炭水化物の合成におけるグリコシルトランスフェラ
ーゼの用途の具体例である(例えば非特許文献8を参照にされたい)。さらに多くの合成
手順がシチジン−5'−モノホスホ−N−アセチルノイラミン酸からシアル酸をガラクト
ースの3−OHまたは6−OHへ転移するために、α−シアリルトランスフェラーゼを使
用した(非特許文献9を参照にされたい)。フコシルトランスフェラーゼはグアノシン−
5'−ジホスホフコースからフコース単位をサッカリド受容体の特異的なヒドロキシルへ
転移させるための合計経路で使用される。例えばIchikawaは、クローン化された
フコシルトランスフェラーゼを用いてシアリル化ラクトサミンのフコシル化が関与する方
法により、シアリルルイス−Xを調製した(非特許文献10)。治療的使用について複合
糖質合成における最近の進歩についての考察は、非特許文献11を参照にされたい。また
特許文献14;15;16;17;および18も参照にされたい。
シダーゼは通常はグリコシド結合の加水分解を触媒する。しかし適切な条件下でそれらは
この結合を形成するために使用することができる。炭水化物合成に使用するほとんどのグ
リコシダーゼはエキソグリコシダーゼであり;グリコシル転移は基質の非−還元末端で起
こる。グリコシダーゼはグリコシル−酵素中間体中のグリコシル供与体に結合し、これは
水に遮断されて加水分解産物を生じるか、または受容体により遮断されて新たなグリコシ
ドまたはオリゴ糖を生じるいずれかである。エキソグリコシダーゼを使用した経路の例は
、β−マンノシダーゼの作用により形成されるβ−マンノシド結合を含むすべてのN−結
合糖ペプチドのコア(core)となる三糖の合成である(非特許文献12)。
リコシダーゼが調製され、ここで活性部位内の標準的な求核性アミノ酸が非求核性アミノ
酸に変えられる。突然変異酵素はグリコシド結合を加水分解しないが、それらを形成する
ことはできる。そのような突然変異グリコシダーゼは、α−グリコシルフルオリド供与体
およびグリコシド受容体分子を使用してオリゴ糖を調製するために使用される(With
ers et al.,特許文献19)。
グリコシダーゼも炭水化物を調製するために使用されている。エンドグリコシダーゼの使
用に基づく方法は、単糖よりもオリゴ糖を転移する利点を有する。オリゴ糖フラグメント
は、エンド−F、エンド−Mのようなエンド−β−N−アセチルグルコサミンを使用して
基質に加えられた(非特許文献13;および非特許文献14)。
される。リボヌクレアーゼBの均一なグリコフォーム(glycoform)の合成が報
告された(非特許文献15)。リボヌクレアーゼBの高いマンノースコア(core)は
、糖ペプチドをエンドグリコシダーゼHで処理することにより開裂された。この開裂は2
つのコアGlcNAc残基間で特異的に起こる。次に四糖のシアリルルイスXが、β−1
,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−2,3−シアリルトランスフェラーゼおよ
びα−1,3−フコシルトランスフェラーゼVの順次使用により、今、均一なタンパク質
に残るGlcNAcアンカー部位で酵素的に再構築された。しかし各々の酵素的に触媒さ
れる工程は優れた収量で進行するものの、そのような手順は工業的規模での糖ペプチドの
生成に適合しなかった。
えばYamamotoおよび共同研究者(非特許文献16)は、エンドグリコシダーゼを
使用した糖ペプチド、グリコシル化ペプチドTの化学酵素的合成を報告した。N−アセチ
ルグルコサミニルペプチドは純粋に化学的な手段で合成された。このペプチドは続いてヒ
トトランスフェリンペプチドのオリゴ糖を用いて酵素的に仕上げられた(elabora
ted)。サッカリド部分はエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼで処理するこ
とによりペプチドに付加された。生成したグリコシル化ペプチドは、ペプチドTおよびN
−アセチルグルコサミニルペプチドTと比べた時、高度に安定であり、しかもタンパク質
分解に耐性であった。
の使用が調査された。例えばBrossmer et al.(特許文献20)は、シア
ル酸の蛍光−標識シチジンモノリン酸("CMP")誘導体の形成、およびシアリルトラ
ンスフェラーゼ活性のアッセイ、および細胞表面、糖タンパク質およびペプチドの蛍光−
標識のアッセイに蛍光グリコシドの使用を開示する。Gross et al.,(非特
許文献17)は、同様のアッセイを記載する。Bean et al.,(特許文献21
)は、不十分に(deficiently)グリコシル化されたタンパク質の再グリコシ
ル化を利用した、グリコシル化欠損疾患のためのアッセイを開示する。欠損タンパク質は
蛍光−標識CMPグリコシドにより再グリコシル化される。各蛍光シアル酸誘導体は、9
−位またはシアル酸内で通常はアセチル化されているアミンのいずれかで蛍光部分に置き
換えられる。蛍光シアル酸誘導体を使用するこの方法は、グリコシルトランスフェラーゼ
の存在または非−グリコシル化またはグリコシル化されていないまたは不適切にグリコシ
ル化された糖タンパク質に関するアッセイである。このアッセイは生物起源のサンプル中
の少量の酵素または糖タンパク質について行われる。修飾したシアル酸を使用して調製用
または工業的規模でグリコシル化または非−グリコシル化ペプチドを酵素的に誘導化する
ことは、従来技術では開示も示唆もされなかった。
ることに対してかなりの努力が向けられた。例えばFukudaおよび共同研究者は、定
めた構造のグリコシドを細胞表面に結合する方法を開発した。この方法は、多様なグリコ
シル基質を有する、フコースおよびフコース類似体を転移することができるフコシルトラ
ンスフェラーゼの弛緩した基質特異性を活用する(非特許文献18)。
て、糖ペプチド上のグリコシル残基を活性化するためにも使用されてきた。グリコシル残
基は典型的には、末端のガラクトース残基を対応するアルデヒドに転換するガラクトース
オキシダーゼを使用して活性化される。アルデヒドは続いてアミンを含む修飾基にカップ
リングされる。例えばCasares et al.,(非特許文献19)は、ドキソル
ビシンを組換えMHCII−ペプチドキメラの酸化されたガラクトース残基に結合させた
。
究者(非特許文献20)は、天然な基質ではアセチル基により通常は占められている位置
にケトン官能基を有するN−レブリノイルマンノサミン("ManLev")を調製した
。細胞はManLevで処理され、これによりケトン基を細胞表面に包含した。また非特
許文献21;非特許文献22;非特許文献23;および非特許文献24も参照にされたい
。
胞の不存在下では適用されなかった。さらに細胞表面の修飾法は、修飾されたグリコシル
供与体部分をペプチドへ移す酵素的包含には利用されていない。さらにいずれの細胞表面
修飾法も、工業的規模でグリコシル−修飾ペプチドを生産するために現実的ではない。
られた努力にもかかわらず、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子等のような修飾基を用
いて、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドを修飾するための工業的に現実的な方
法の必要性がいまだに存在する。特に興味深いのは、修飾ペプチドが治療薬または診断薬
としての使用を強化する改善された特性を有する方法である。本発明はこれらの、および
他の必要性を満たす。
本発明はペプチドに結合した特別なグルカン構造を有するペプチドの多数の改造方法を
含む。特別なグリカン構造を本明細書に記載するが、本発明は任意の1つの特定のグリカ
ン構造に限定されると解釈されるべきではない。加えて本明細書には特別なペプチドを記
載するが、本発明は記載するペプチドの性質に限定されるべきではなく、むしろ任意のす
べての適当なペプチドおよびその変形物を包含するべきである。
囲の文章による説明を提供する。本発明は明らかな、または本明細書を読んだ後に明らか
になるこのような態様の任意の、そしてすべての変形態様を包含する。
AAはペプチドの末端または内部アミノ酸残基であり;
X1−X2は該AAに共有結合したサッカリドであり、ここで
X1は第1グリコシル残基であり;そして
X2はX1に共有結合した第2グリコシル残基であり、ここでX1およびX2は単糖
およびオリゴ糖残基から選択される、
を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法を提供する。この方法は:
(a)X2またはその糖サブユニットを該ペプチドから除去し、これにより短縮化グリカ
ンを形成し;そして
(b)短縮化グリカンを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なく
とも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体を短縮化グリカンへ
転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
(c)X1を除去し、これによりAAを露出し;そして
(d)AAを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つの
グリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体をAAへ転移させるために適す
る条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
(e)工程(b)の前に、翻訳後修飾中にサッカリドに付加した基を除去する、
ことを含んでなる。
エステルから選択される員である。
ZはO、S、NHおよびクロスリンカーから選択される員である、
を有する。
マー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分からなる群から選択
される員であり得る。好ましくは修飾基は水溶性ポリマーであり、そしてより好ましくは
水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。さらにより好ましくはポリ
(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
ェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激
ホルモン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロ
ン−ガンマ、アルファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織
プラスミノーゲンアクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、
キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗
体、キメラ抗−HER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20
抗体、DNase、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよ
びヒト成長ホルモンからなる群から選択され得る。
X3、X4、X5、X6、X7およびX17は、単糖またはオリゴ糖残基から独立して
選択され;そして
a、b、c、d、eおよびxは、整数0、1および2から独立して選択されるが、ただ
しa、b、c、d、eおよびxから選択される少なくとも1つの員は1または2である、
を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法である。この方法は;
(a)少なくとも1つのX3、X4、X5、X6、X7またはX17、またはその糖サブ
ユニットをペプチドから除去し、これにより短縮化グリカンを形成し;そして
(b)短縮化グリカンを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なく
とも1つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体を該短縮化グリカン
ヘ転移させるために適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
化グリカンを生成する。
X8)y、
式中、
X8は単−およびオリゴ−糖から選択されるグリコシル部分であり;
yは0および1から選択される整数であり;そして
zは1から20の間の整数であり、ここで
Zは3以上である時、(マンノース)zは直鎖および分岐構造から選択される、
から成る群から選択される。
観点ではX3、X5およびX7が(マンノース)uであり、ここでuは1から20の間の
整数から選択され、そしてuが3以上である時、(マンノース)uは直鎖および分岐構造
から選択される。
リマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分からなる群から選
択される員であり得る。好ましくは修飾基は水溶性ポリマーであり、そしてより好ましく
は水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。より一層好ましくはポリ
(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
ェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プ
ロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウ
ロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、
キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−
腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群
から選択され得る。
r、sおよびtは、0および1から独立して選択される整数である、
を有するグリカンを含んでなるペプチドの無細胞のインビトロ改造方法である。この方法
は:
(a)ペプチドを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1
つのグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体をグリカンへ転移させるた
めに適する条件下で接触させ、これにより該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
飾基は水溶性ポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標的部分か
らなる群から選択される員であり得る。好ましくは修飾基が水溶性ポリマーであり、そし
てより好ましくは水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。より一層
好ましくはポリ(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子量分布を有する。
ェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プ
ロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウ
ロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、
キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−
腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群
から選択され得る。
X9およびX10は、単糖またはオリゴ糖残基から独立して選択され;そして
m、nおよびfは0および1から選択される整数である、
を有する。
X11およびX12は、独立して選択されるグリコシル部分であり;そして
rおよびxは0および1から独立して選択される整数である、
を有する。
0の間の整数から選択され、そしてqが3以上である時、(マンノース)qは直鎖および
分岐構造から選択される。
X13、X14およびX15は、独立して選択されるグリコシル残基であり;そして
g、h、i、j、kおよびpは整数0および1から独立して選択されるが、ただし少な
くとも1つのg、h、i、j、kおよびpは1である、
を有する。
独立して選択される員であり;そしてiおよびkが整数0および1から独立して選択され
るが、ただし少なくとも1つのiおよびkは1であり、そしてkが1ならばg、hおよび
jは0である。
X16は
から選択される員である、
を有する請求項1に記載の方法。
AAはペプチドの末端または内部アミノ酸残基であり;
X1は、単糖およびオリゴ糖残基から選択される、AAに共有結合したグリコシル残基
であり;そして
uは0および1から選択される整数である、
を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法である。この方法は:ペプチドを、少な
くとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つのグリコシル供与体と
、少なくとも1つのグリコシル供与体を該短縮化グリカンへ転移させるために適する条件
下で接触させ、ここで該グリコシル供与体は修飾基を含んでなり、これにより該ペプチド
を改造することを含んでなる。
そして修飾基が水溶性ポリマー、治療部分、検出可能な標識、反応性リンカー基および標
的部分からなる群から選択される員であり得る。好ましくは修飾基は水溶性ポリマーであ
り、そしてより好ましくは水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)を含んでなる。
さらにより一層好ましくは、ポリ(エチレングリコール)は本質的に均一分散である分子
量分布を有する。
ェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリトロポエチン、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アルファ−1−プ
ロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因子受容体、ウ
ロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−HER2抗体、
キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase、キメラ抗−
腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモンからなる群
から選択され得る。
ovalent conjugate)を含み、ここで修飾基は完全なグリコシル連結基
を介してペプチドの予め定めたグリコシルまたはアミノ酸残基で該ペプチドに共有結合し
ている。
ー基および標的部分からなる群から選択される員である。
有結合した単位としてペプチドに結合し、酵素が該前駆体を完全なグリコシル連結基に転
換し、これにより該結合物を形成する。
第1の完全なグリコシル連結基を介してペプチドの第1残基に共有結合した第1修飾基
、および
第2の完全なグリコシル連結基を介してペプチドの第2残基に結合した第2グリコシル
連結基、
を含んでなる。
残基および第2残基が異なる構造を有する。さらなる態様では、第1残基および第2残基
がグリコシル残基である。別の態様では、第1残基および第2残基はアミノ酸残基である
。
れる。好ましくはペプチドは完全なグリコシル連結基の受容部分を導入するために改造さ
れる。
り、別の態様では、これは本質的に均一分散である分子量分布を有することができる。
、インターフェロン−ベータ、第VIIa因子、第IX因子、濾胞刺激ホルモン、エリト
ロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン−ガンマ、アル
ファ−1−プロテアーゼインヒビター、ベータ−グルコシダーゼ、組織プラスミノーゲン
アクチベータータンパク質、インターロイキン−2、第VIII因子、キメラ腫瘍壊死因
子受容体、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体、キメラ抗−H
ER2抗体、キメラ抗−呼吸合胞体ウイルス抗体、キメラ抗−CD20抗体、DNase
、キメラ抗−腫瘍壊死因子抗体、ヒトインスリン、B型肝炎sAgおよびヒト成長ホルモ
ンからなる群から選択される。
c残基およびGalNAc残基からなる群から選択される員である。
ドとの間に共有結合物を形成する方法であって、ここでポリマーは、間に挿入され、そし
てペプチドとポリマーの両方に共有結合した完全なグリコシル連結基を介してペプチドに
結合している。この方法はペプチドを、ポリマーに共有的に連結したヌクレオチド糖およ
び該ヌクレオチド糖が基質であるグリコシルトランスフェラーゼを含んでなる混合物と、
結合物を形成するために十分な条件下で接触させることを含んでなる。
連結基が、ペプチドに共有結合したグリコシル残基に共有結合し、そして別の態様ではグ
リコシル連結基がペプチドのアミノ酸残基に共有結合する。
から選択される員を含んでなる。本発明の1態様ではポリアルキレンオキシドはポリ(エ
チレングリコール)でよい。別の態様では、ポリ(エチレングリコール)は約1〜約20
,000の、約1〜約5,000の重合度、また好ましくは約1〜約1,000の重合度
を有する。
トシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、GalNAcトランスフェ
ラーゼ、GlcNAcトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびマンノシ
ルトランスフェラーゼからなる群から選択される。1つの態様ではグルコシルトランスフ
ェラーゼは組換え的に生産され、そして別の態様ではグルコシルトランスフェラーゼは組
換え原核酵素、または組換え真核酵素である。
GDP−グリコシドからなる群から選択され、そして好ましくはUDP−ガラクトース、
UDP−ガラクトサミン、UDP−グルコース、UDP−グルコサミン、UDP−N−ア
セチルガラクトサミン、UDP−N−アセチルグルコサミン、GDP−マンノース、GD
P−フコース、CMP−シアル酸、CMP−NeuAcからなる群から選択される。
いる。
物が膜濾過により単離される。
チドと第2のグリコシル化または非−グリコシル化ペプチド、
ここで
リンカー部分は、第1ペプチドおよびリンカー部分の間に挿入され、そして両方を共有
結合した第1の完全なグリコシル連結基を介して第1ペプチドに結合し、そして
リンカー部分は、第2ペプチドおよ該リンカー部分の間に挿入され、そして両方に共有
結合した第2の完全なグリコシル連結基を介して該第2ペプチドに結合している、
との間に共有結合物を形成する方法を提供する。この方法は:
(a)第1ペプチドを、第1の完全なグリコシル連結基の前駆体および第2の完全なグリ
コシル連結基の前駆体を含んでなるリンカー部分前駆体の誘導体と接触させ;
(b)(a)からの混合物を、第1グリコシル連結基の前駆体が基質であるグリコシルト
ランスフェラーゼと、第1の完全なグリコシル連結基の前駆体を第1の完全なグリコシル
連結基に転換するために十分な条件下で接触させ、これによりリンカー部分前駆体と第1
ペプチドとの間に第1結合物を形成し;
(c)第1結合物を、第2ペプチドおよび第2の完全なグリコシル基の前駆体が基質であ
るグリコシルトランスフェラーゼと、第2の完全なグリコシル連結基の前駆体を第2のグ
リコシル連結基に転換するために十分な条件下で接触させ、これによりリンカー部分と第
1グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間、および第2グリコシル化または非
−グリコシル化ペプチドとの間に該結合物を形成する、
ことを含んでなる。
、水溶性ポリマーがポリ(エチレングリコール)を含んでなる。
チドと第2のグリコシル化または非−グリコシル化ペプチド、
ここで
リンカー部分は第1ペプチドに共有結合し、そして
リンカー部分は、第2ペプチドとリンカー部分の間に挿入され、そして両方に共有結合
した完全なグリコシル連結基を介して第2ペプチドに結合している、
との間に共有結合物を形成する方法を提供する。この方法は:
(a)第1ペプチドを、
第1ペプチド上の残基に相補的な反応性の反応性官能基、および完全なグリコシル連結
基の前駆体、
を含んでなるリンカー部分の活性化誘導体と、反応性官能基と残基との間に共有結合を形
成するために十分な条件下で接触させ、これにより第1結合物を形成し;そして
(b)第1結合物を、第2ペプチドおよび完全なグリコシル連結基の前駆体が基質である
グリコシルトランスフェラーゼと、完全なグリコシル連結基の前駆体を完全なグリコシル
連結基に転換するために十分な条件下で接触させ、これにより第1グリコシル化または非
グリコシル化ペプチドと、第2グリコシル化または非−グリコシル化ペプチドとの間にリ
ンカー部分により連結された結合物を形成する、
ことを含んでなる。
性ポリマーを含んでなる。
たは非グリコシル化ペプチドとの間の共有結合物を含んでなる製薬学的組成物であり、こ
こでポリマーは、ペプチドとポリマーとの間に挿入され、そして両ペプチドとポリマーと
に共有結合した完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合している。
み、この組成物は:修飾された糖、グリコシルトランスフェラーゼおよびペプチド受容体
基質混合物を含んでなり、ここで修飾された糖は、ポリマー、治療部分および生体分子か
ら選択されるそれに共有結合した員を有する。
を含んでなる製薬学的組成物を含む。
MSは修飾基に共有結合した糖を含んでなる修飾された糖であり;
Nuはヌクレオシドであり;そして
bは0から2の整数である、
を有する化合物である。
X、Y、Z、AおよびBは、S、OおよびNHから独立して選択される員であり;
R21、R22、R23、R24およびR25は、Hおよびポリマーから独立して選択
される員であり;
R26は、H、OHおよびポリマーから選択される員であり;
R27はCOO−およびNa+から選択される員であり;
Nuはヌクレオシドであり;そして
aは1から3の整数である、
を有する化合物を含む。
AAはペプチドの末端または内部アミノ酸残基である、
を有するペプチドの無細胞のインビトロ改造方法を提供する。この方法は;
該ペプチドを、少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼおよび少なくとも1つ
のグリコシル供与体と、少なくとも1つのグリコシル供与体を該アミノ酸残基へ転移させ
るために適する条件下で接触させ、ここでグリコシル供与体は修飾基を含んでなり、これ
により該ペプチドを改造する、
ことを含んでなる。
態様を強調するために確認される。
に結合物を形成する方法を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してG−C
SFペプチドに共有結合し、G−CSFペプチドが式:
a、b、cおよびeは、0および1から独立して選択される員であり;
dは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は
(a)G−CSFペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび該修飾基に共有結合
した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾され
たグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基の形成に適する条件下で接触させること
を含んでなる。
(b)工程(a)の前に、G−CSFペプチドをシアリダーゼと、G−CSFペプチドか
らシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、G−CSFペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよび
ガラクトース供与体と、ガラクトースをG−CSFペプチドへ転移させるために適する条
件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、G−CSFペプチドをN−アセチルガラクトサミントランスフ
ェラーゼおよびGalNAc供与体と、GalNAcをG−CSFペプチドへ転移させる
ために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、G−CSFペプチドを、合成的に作用するエンド−N−アセチ
ルガラクトサミニダーゼおよびGalNAc供与体と、GalNAc該G−CSFペプチ
ドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
糖質から選択される員である。
eが0である。あるいはaおよびeが0および1から独立して選択される員であり;そし
てb、cおよびdが0である。あるいはa、b、c、dおよびeが0および1から独立し
て選択される員である。
み、ここで修飾基は完全なグリコシル連結基を介して糖ペプチドに共有結合し、糖ペプチ
ドが:
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、aa、bb、cc、ddおよ
びeeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり、
R'はH、グリコシル残基、修飾基または複合糖質である、
から選択される式を有するグリコシル残基を含んでなる。
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼ、合成的に作用するエンド−アセチ
ルガラクトサミニダーゼおよびトランス−シアリダーゼから選択される員、および修飾基
に共有結合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでな
る修飾されたグリコシル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条
件下で接触させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去
するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合わせ
と接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシ
ル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、糖ペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼお
よびGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下
で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、糖ペプチドを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラク
トース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件下で接触させるこ
とを含んでなる。
(h)工程(b)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシ
ル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(i)工程(a)の前に、糖ペプチドをマンノシダーゼと、糖ペプチドからマンノースを
除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(j)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
、b、c、d、aaおよびbbが1であり;e、f、gおよびhが、1から4の整数から
独立して選択される員であり;i、j、k、l、m、r、s、t、uおよびccが0およ
び1から独立して選択される員であり;そしてn、o、p、q、v、w、x、y、z、d
dおよびeeが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、o、
p、q、s、u、v、w、x、y、z、cc、ddおよびeeが0であり;e、g、i、
rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてaaおよびbbが1で
ある。あるいはa、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、m、r、s、tおよびu
が、0および1から独立して選択される員であり;hが1から3の整数から独立して選択
される員であり;dd、v、w、xおよびyが0であり;そしてaaおよびbbが1であ
る。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、yおよび
ddが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり
;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j
、k、l、mおよびddが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1
から独立して選択される員であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはa、b、
c、d、e、f、g、h、i、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される
員であり;j、k、l、m、v、w、x、yおよびddが0であり;そしてaaおよびb
bが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、m、r、s、t
およびuが0および1から独立して選択される員であり;hが1から3の整数から独立し
て選択される員であり;v、w、x、yおよびddが0であり;そしてaaおよびbbが
1である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、y
およびddが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員
であり;そしてaaおよびbbが1である。あるいはn、oおよびpが0および1から独
立して選択される員であり;qが1であり;そしてz、ccおよびeeが0である。ある
いはnおよびqが0および1から独立して選択される員であり;そしてo、p、z、cc
およびeeが0である。あるいはnが0であり;qが1であり;そしてo、p、z,cc
およびeeが0である。あるいはn、o、pおよびfが0および1から独立して選択され
る員であり;qが1であり;そしてzおよびeeが0である。あるいはn、o、pおよび
qが0および1から独立して選択される員であり;そしてz、ccおよびeeが0である
。あるいはnおよびqが0および1から独立して選択される員であり;そしてo、p、z
、ccおよびeeが0である。あるいはn、o、p、q、z、ccおよびeeが0である
。
する。
あって、修飾基が完全なグリコシル連結基を介してインターフェロンベータペプチドに共
有結合し、インターフェロンベータペプチドが式:
a、b、c、d、i、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択さ
れる員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、またはグリコシル、修飾基または複合糖質基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は
(a)インターフェロンベータペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよびトラン
ス−シアリダーゼから選択される員および修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェ
ラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全な
グリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをシアリダーゼと、インター
フェロンベータペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを
含んでなる。
(c)工程(a)からの生成物を、修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全な
グリコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、上記インターフェロンベータペプチドをグリコシダーゼおよび
シアリダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをエンドグリカナーゼと、イ
ンターフェロンベータペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触
させることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをN−アセチルグルコサミン
トランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをインターフェロンベー
タペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドを、ガラクトシルトランスフ
ェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する
条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(b)の前に、インターフェロンベータペプチドをエンドグリカナーゼと、イ
ンターフェロンベータペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触
させることを含んでなる。
(i)工程(a)の前に、インターフェロンベータペプチドをマンノシダーゼと、インタ
ーフェロンベータペプチドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させるこ
とを含んでなる。
(j)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
してhが1から3の間の整数から独立して選択される員であり;a、b、c、d、e、f
、g、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される
員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてq、pが1である。あるいはa、
b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;e
、g、i、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;そしてq、pが1
である、。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t
、u、v、w、xおよびyが0であり;p、qが1であり;そしてiが0および1から独
立して選択される。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、I、j、k、l、m、r
、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてp、qが1である。あるいはa、
b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;p、qが1であ
り;そしてr、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される員
である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、r、s、tおよびuが0および
1から独立して選択される員であり;j、k、l、m、n、v、w、xおよびyが0であ
り;そしてq、pが1である。あるいはa、b、c、d、h、j、k、l、m、r、s、
tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;e、f、gが0から3の間の
整数から選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてq、pが1で
ある。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、pおよひqが0
および1から独立して選択される員であり;e、f、gおよびhが1であり;そしてn、
v、w、xおよびyが0である。
物である。
し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して第VIIa因子ペプチドに共有結合
し、第VIIa因子ペプチドが:
a、b、c、d、i、o、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選
択される員であり;
e、f、g、hおよびnは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;そして
Rは修飾基、マンノース、オリゴマンノース、シアリルルイスx(SialylLew
isx)またはシアリルルイスa(SialylLewisa)である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。
(a)第VIIa因子ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結
合した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾さ
れたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触
させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、第VIIa因子ペプチドをシアリダーゼと、第VIIa因子ペ
プチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、第VIIa因子ペプチドをガラクトシダーゼと、第VIIa因
子ペプチドからガラクトースを除去するためにに適する条件下で接触させることを含んで
なる。
(d)工程(a)の前に、第VIIa因子ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼお
よびガラクトース供与体と、ガラクトースを第VIIa因子ペプチドへ転移させるために
適する条件下で接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
、d、e、g、i、j、l、o、pおよびqが、0および1から独立して選択される員で
あり;rおよびtが1であり;f、h、k、m、s、u、v、w、xおよびyが0であり
;そしてnが0から4の整数から選択される。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h
、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して
選択される員であり;v、w、xおよびyが0であり;そしてnが0から4の整数から選
択される員である。
む。
ここで、修飾基が完全なグリコシル連結基を介して第IX因子ペプチドに共有結合し、第
IX因子ペプチドが:
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、bb、cc、dd、ee、f
fおよびggは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、g、hおよびaaは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は
(a)第IX因子ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合し
たグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグ
リコシル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させ
ることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、第IX因子ペプチドをシアリダーゼと、第IX因子ペプチドか
らシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
トランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シアル酸を生成物へ転移させるために適す
る条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(b)からの生成物を、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース
供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含
んでなる。
(e)工程(d)からの生成物を、ST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を
生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
される員であるという事実も含む。
b、cおよびdが1であり;e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択され
る員であり;aa、bb、cc、dd、ee、ff、j、k、l、m、i、n、o、p、
q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w
、x、yおよびggが0である。あるいはa、b、c、d、n、qが0および1から独立
して選択され;aa、e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択される員で
あり;bb、cc、dd、ee、ff、j、k、l、m、i、o、p、r、s、tおよび
uが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、y、zおよびgg
が0である。あるいはa、b、c、d、n、bb、cc、ddおよびffが1であり;e
、f、g、hおよびaaが1から4の整数から独立して選択される員であり;q、ee、
i、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される
員であり;そしてv、w、x、y、zおよびggが0である。あるいはa、b、c、dお
よびqが1であり;e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択される員であ
り;aa、bb、cc、dd、ee、ff、j、k、l、m、i、n、o、p、r、s、
tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてv、w、x、y、zお
よびggが0である。あるいはa、b、c、d、q、bb、cc、ddおよびffが1で
あり;aa、e、f、gおよびhが1から4の整数から独立して選択される員であり;e
e、i、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択さ
れる員であり;そしてv、w、x、y、zおよびggが0である。
も含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してFSHペプチドに共有結合し、
FSHペプチドが式:
a、b、c、d、i、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選択される
員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)FSHペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該
グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリ
コシル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させる
ことを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、FSHペプチドをシアリダーゼと、FSHペプチドからシアル
酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シ
アル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、該FSHペプチドをガラクトシダーゼと、FSHペプチドから
ガラクトースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、FSHペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組み合
わせと接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、FSHペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラ
クトース供与体と、ガラクトースをFSHペプチドへ転移させるために適する条件下で接
触させることを含んでなる。
(d)工程(a)からの生成物を、修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全な
グリコシル連結基と部分との間に結合物を形成する。
(e)工程(b)の前に、FSHペプチドをエンドグリカナーゼと、FSHペプチドから
グリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、FSHペプチドをN−アセチルアセチルグルコサミントランス
フェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをFSHペプチドへ転移させるた
めに適する条件下で接触させることを含んでなる。
合糖質から選択される員である。
b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して
選択される員であり;e、f、gおよびhが1であり;そしてv、w、xおよびyが0で
ある。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、s、t
およびuが0および1から独立して選択される員であり;v、w、xおよびyが0である
。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、xおよびyが0
であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員であ
る。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、lおよびmが0であり;i、q
、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択され;pが1であ
り;R(分岐または直鎖)はマンノースおよびオリゴマンノースから選択される員である
。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、r、s、t、u、v、w
およびyが0であり;iが0または1であり;そしてqが1である。
する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してEPOペプチドに共
有結合し、EPOペプチドが:
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立し
て選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースである、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)EPOペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグ
リコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコ
シル供与体と、該完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させるこ
とを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、EPOペプチドをシアリダーゼと、EPOペプチドからシアル
酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シ
アル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、EPOペプチドを合成的に作用するガラクトシダーゼと、EP
Oペプチドにガラクトースを付加するために適する条件下で接触させることを含んでなる
。
(e)工程(a)の前に、EPOペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラ
クトース供与体と、ガラクトースをEPOペプチドへ転移させるために適する条件下で接
触させることを含んでなる。
(f)工程(e)からの生成物をST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生
成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、EPOペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラー
ゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをEPOペプチドへ転移させるために適す
る条件下で接触させることを含んでなる。
から選択される員である。
、f、g、nおよびqが1であり;hが1から3の間の整数から選択される員であり;i
、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員
であり;そしてv、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、
j、k、l、m、q、s、u、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてe、g、i、
rおよびtが0および1から独立して選択される員である。あるいはa、b、c、d、e
、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、tおよびuが0および1
から独立して選択される員あり;そしてv、w、x、yおよびzが0である。あるいはa
、b、c、d、e、f、g、nおよびqが1であり;hが1から3の間の整数から選択さ
れる員であり;i、j、k、l、m、o、p、r、s、tおよびuが、0および1から独
立して選択される員であり;そしてv、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b
、c、d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、yおよびzが0であ
り;そしてe、g、i、n、q、rおよびtが0および1から独立して選択される。ある
いはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、yおよび
zが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される
員である。あるいはqが1であり;a、b、c、d、e、f、g、h、i、n、r、s、
tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてj、k、l、m、o、
p、v、w、xおよびzが0である。
修飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基
を介してGM−CSFペプチドに共有結合し、GM−CSFペプチドが:
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、aa、bbおよびccは、0
および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はHまたはグリコシル残基または修飾基または複合糖質である、
から選択される式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)GM−CSFペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合
した該グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾され
たグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触さ
せることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをシアリダーゼと、GM−CSFペプチ
ドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの
組み合わせと接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをエンドグリカナーゼと、、GM−CS
Fペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んで
なる。
(f)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフ
ェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをGM−CSFペプチドへ転移させ
るために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをマンノシダーゼと、GM−CSFペプ
チドからマンノース残基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、GM−CSFペプチドをST3Gal3およびシアル酸供与体
と、シアル酸を生成物に転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
、c、d、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、t、uおよびaaが0および1か
ら独立して選択される員であり;bb、e、f、g、hおよびnが1であり;そしてcc
、v、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、
o、p、q、r、s、t、uおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;
bb、e、f、g、hおよびnが0および1から独立して選択される員であり;そしてc
c、v、w、x、yおよびzが0である。あるいはcc、a、b、c、d、f、h、j、
k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、yおよびzが0であり;そしてe、g、i、
n、q、r、tおよびaaが0および1から独立して選択される員であり;そしてbbが
1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p
、zおよびccが0であり;q、r、s、t、u、v、w、x、yおよびaaが、0およ
び1から独立して選択される員であり;bbが1であり;そしてRがマンノースまたはオ
リゴマンノースである。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m
、o、q、r、s、t、u、aaおよびbbが0および1から 独立して選択される員で
あり;n、p、v、w、x、y、zおよびccが0である。
含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してインターフェロンガンマペプチド
に共有結合し、インターフェロンガンマペプチドが式:
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選
択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
(a)インターフェロンガンマペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび合成的
に作用するガラクトシダーゼから選択される員および修飾基に共有結合したグリコシルト
ランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体
と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでな
る。
(b)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをシアリダーゼと、インター
フェロンガンマペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを
含んでなる。
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをグリコシダーゼおよびシア
リダーゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをエンドグリカナーゼと、イ
ンターフェロンガンマペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触
させることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドをN−アセチルグルコサミン
トランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをインターフェロンガン
マペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、インターフェロンガンマペプチドを、ガラクトシルトランスフ
ェラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する
条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シ
アル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
から選択される員である。
d、i、j、k、l、m、q、p、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択さ
れる員であり;e、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0であ
るものを含む。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0
および1から独立して選択される員であり;p、q、e、f、gおよびhが1であり;そ
してn、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l
、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびt
が0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。a、b、c、d、
e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;q、r、s、t、u、v、w
、xおよびyが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1であり;そし
てRがマンノースまたはオリゴマンノースである。a、b、c、d、i、j、k、l、m
、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;e、f、g、
hおよびpが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である。
飾基との間に結合物を形成する方法を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介
してA−1−PIペプチドに共有結合し、A−1−PIペプチドが式:
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選
択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
(a)A−1−PIペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合
したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾された
グリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させ
ることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをシアリダーゼと、A−1−PIペプチ
ドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、こうして完全なグリ
コシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、A−1−PIペチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼの組
み合わせ物と接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをエンドグリカナーゼと、A−1−PI
ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでな
る。
(f)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフ
ェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをA−1−PIペプチドへ転移させ
るために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをマンノシダーゼと、A−1−PIペプ
チドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、A−1−PIペプチドをマンノシダーゼ、キシロシダーゼ、ヘ
キソサミニダーゼおよびその組み合わせから選択される員と、A−1−PIペプチドから
グリコシル残基を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員で
あり;そしてe、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびyが0である
。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよ
びuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、v、w、xおよびyが0
である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xお
よびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択さ
れる員である。あるいはn、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、lおよびm
が0であり;そしてq、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して
選択される員であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、
i、j、k、l、m、n、pおよびqが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびy
が0および1から独立して選択される員である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、
h、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員で
あり;p、v、w、xおよびyが0であり;そしてnおよびqが1である。
合物も提供する。
を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してベータグルコシダーゼペプチド
に共有結合し、ベータグルコシダーゼペプチドが式:
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選
択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
(a)ベータグルコシダーゼペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に
共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修
飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で
接触させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをシアリダーゼと、ベータグル
コシダーゼペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含ん
でなる。
(c)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをグリコシダーゼおよびシアリ
ダーゼの組み合わせ物と接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをエンドグリカナーゼと、ベー
タグルコシダーゼペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させ
ることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをN−アセチルグルコサミント
ランスフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを該ベータグルコシダーゼ
ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、ベータグルコシダーゼペプチドをガラクトシルトランスフェラ
ーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを生成物へ転移させるために適する条件
下で接触させることを含んでなる。
から選択される員である。
b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選
択される員であり;p、e、f、gおよびhが1であり;そしてn、v、w、xおよびy
が0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、
s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、v、w、xお
よびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v
、w、xおよびyが0であり;e、g、i、q、rおよびtが0および1から独立して選
択される員であり;そしてpが1である。あるいはn、a、b、c、d、e、f、g、h
、i、j、k、lおよびmが0であり;q、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0お
よび1から独立して選択される員であり;pが1であり;そしてRがマンノースまたはオ
リゴマンノースである。
も含む。
間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してT
PAペプチドに共有結合し、TPAペプチドが式:
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w、xおよびyは、0お
よび1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の整数から独立して選択される員であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;
R'はH、またはグリコシル残基、複合糖質または修飾基であり;そして
R"はグリコシル基、複合糖質または修飾基である、
を含んでなるグリコシルサブユニットを有する。この方法は:
(a)TPAペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび合成的に作用するグリコ
シダーゼから選択される員および修飾基に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの
基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシ
ル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、TPAペプチドをシアリダーゼと、TPAペプチドからシアル
酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、TPAペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラ
クトース供与体と、ガラクトースをTPAペプチドへ転移させるために適する条件下で接
触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、上記TPAペプチドをグリルコシダーゼおよびシアリダーゼの
組み合わせと接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、上PAペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラー
ゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをTPAプチドへ転移させるために適する
条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、TPAペプチドをエンドグリカナーゼと、TPAペプチドから
グリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(i)工程(a)の前に、TPAペプチドをマンノシダーゼ、キシロシダーゼ、ヘキソサ
ミニダーゼおよびそれらの組み合わせから選択される員と、TPAペプチドからグリコシ
ル残基を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
り;e、f、gおよびhが1から3の間の整数から選択される員であり;i、j、k、l
、m、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてn、o
、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、
n、o、s、u、v、w、xおよびyが0であり;e、g、i、rおよびtが0および1
から独立して選択される員であり;そしてqおよびpが1である。あるいはa、b、c、
d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、p、q、r、s、tおよびuが0および1か
ら独立して選択される員であり;そしてn、o、v、w、xおよびyが0である。あるい
はa、b、c、d、e、f、gおよびpが1であり;hが1から3の間の整数から選択さ
れる員であり;j、k、l、m、i、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して
選択される員であり;そしてn、o、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、
c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;e、g
、i、q、rおよびtが0および1から独立して選択される員であり;oが1であり;そ
してR"がキシロースである。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、
s、tおよびuが0および1から独立して選択される員であり;そしてe、f、gおよび
hが1であり;そしてn、o、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d
、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であ
り;iおよびqが0および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あ
るいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、o、r、s、t、u、v、w
、xおよびyが0であり;iおよびqが0および1から独立して選択される員であり;p
が0であり;そしてnが1である。
る方法も提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してIL−2プチドに共有
結合し、IL−2ペプチドが式:
a、b、cおよびeは0および1から独立して選択される員であり;
dは0であり;そして
Rは修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)IL−2ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した
グリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリ
コシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させるこ
とを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、IL−2ペプチドをシアリダーゼと、IL−2ペプチドからシ
アル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、IL−2ペプチドを合成的に作用するエンド−N−アセチルガ
ラクトサミニダーゼと、GalNAcをIL−2ペプチドに付加するために適する条件下
で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、IL−2ペプチドをN−アセチルガラクトサミントランスフェ
ラーゼおよびGalNAc供与体と、GalNAcをIL−2ペプチドへ転移させるため
に適する条件下で接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、IL−2ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガ
ラクトース供与体と、ガラクトースをIL−2ペプチドへ転移させるために適する条件下
で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
1から独立して選択される員であり;そしてb、cおよびdが0である。あるいはa、b
、c、dおよびeが0である。
る方法であり、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して該糖ペプチドに共有結合
し、該糖ペプチドが:
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、u、aa、ccおよびddは、0
および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、x、yおよびzは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;
R'はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)該糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリ
コシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシ
ル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを
含んでなる。
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去
するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクト
ース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させる
ことを含んでなる。
(e)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(f)工程(a)の前に、糖ペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼお
よびGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下
で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシ
ル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、糖ペプチドをST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル
酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(i)工程(a)の前に、糖ペプチドをマンノシダーゼと、糖ペプチドからマンノースを
除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
およびhが1から4の間の整数から独立して選択される員であり;a、b、c、d、i、
j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、t、aaおよびccが0および1から独立し
て選択される員であり;そしてv、w、x、y、zおよびがddが0である。
飾基との間に結合物を形成する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を
介して糖ペプチドに共有結合し、糖ペプチドが式:
a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、t、u、w、wwおよびzは0お
よび1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)該糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グ
リコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコ
シル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させること
を含んでなる。
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクト
ース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させる
ことを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシ
ル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
して、a、c、i、jおよびlが0および1から独立して選択される員であり;e、g、
q、r、tおよびzが1であり;そしてb、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、
v、w、xおよびyが0である。あるいはe、g、i、rおよびtが0および1から独立
して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、
w、xおよびyが0であり;そしてqおよびzが1である。
。
が完全なグリコシル連結基を介してウロキナーゼペプチドに共有結合し、ウロキナーゼペ
プチドが式:
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選
択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、グリコシル残基、複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。
(a)該ウロキナーゼペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結
合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾され
たグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触さ
せることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをシアリダーゼと、ウロキナーゼペプチ
ドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよ
びガラクトース供与体と、ガラクトースをウロキナーゼペプチドへ転移させるために適す
る条件下で接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、記ウロキナーゼペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダーゼ
の組み合わせと接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これによりの完全な
グリコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフ
ェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをウロキナーゼペプチドへ転移させ
るために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、ウロキナーゼペプチドをエンドグリカナーゼと、ウロキナーゼ
ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでな
る。
質から選択される員である。
d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選択され
る員であり;e、f、gおよびhが1であり;v、w、xおよびyが0であり;そしてp
が1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、m、q、r、s、
tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが
0であり;そしてpが1である。あるるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m、
n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが、0
および1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、
d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0で
あり;iが0または1であり;そしてqおよびpが1である。あるいはa、b、c、d、
i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが0および1から独立して選択される員で
あり;e、f、gおよびhが0、1、2、3および4からから独立して選択され;そして
n、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j
、k、l、m、n、o、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;qが1であり
;そしてnが0または1である。
る。
間に結合物を形成する方法も含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して該糖
ペプチドに共有結合し、糖ペプチドが:
a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、z、aa、bb、ccおよび
eeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、x、yおよびddは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリ
コシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシ
ル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを
含んでなる。
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去
するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドを合成的に作用するガラクトシダーゼと、ガラクト
シダーゼを糖ペプチドに付加するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクト
ース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させる
ことを含んでなる。
(f)工程(a)からの生成物を、ST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を
生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と該部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、糖ペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼお
よびGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下
で接触させることを含んでなる。
(i)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシ
ル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
抗体ペプチドの式に関して、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、r
、s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;n、v、w、xおよ
びyが0であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、
k、l、m、n、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;iおよびrが0および1
から独立して選択される員であり;そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、
f、g、h、i、j、k、l、mおよびnが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよ
びyが0および1から独立して選択される員であり;そしてzが1である。あるいはaa
、bb、ccおよびeeが0および1から独立して選択される員であり;そしてddが0
である。あるいはaaおよびeeが0および1から独立して選択される員であり;そして
bb、ccおよびddが0である。あるいはaa、bb、cc、ddおよびeeが0であ
る。
aモノクローナル抗体ペプチド結合物である。
る方法であって、修飾基が完全なグリコシル連結基を介してキメラ抗−HER2抗体ペプ
チドに共有結合し、キメラ抗−HER2抗体ペプチドが式:
a、b、c、d、i、j、k、l、q、r、s、t、uおよびzは、0および1から独
立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、xおよびyは0であり;
mは0〜20であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'は水素およびグリコシル残基および修飾基から選択される員である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)キメラ抗−HER2抗体ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基
に共有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる
修飾されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下
で接触させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、キメラ抗−HER2抗体ペプチドをガラクトシルトランスフェ
ラーゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースをキメラ抗−HER2抗体ペプチドへ
転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、キメラ抗−HER2抗体ペプチドをエンドグリカナーゼと、キ
メラ抗−HER2抗体ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触
させることを含んでなる。
から選択される員である。
よびiが、0および1から独立して選択される員であり;e、g、rおよびtが1であり
;b、d、f、h、j、k、l、m、n、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり;
そしてqおよびzが1である。あるいはiが0または1であり;qおよびzが1であり;
そしてa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w
、xおよびyが0である。あるいはe、g、i、rおよびtが0および1から独立して選
択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、x
およびyが0であり;そしてqおよびzが1である。
ある。
供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して抗−RSV Fペプチドに共有結
合し、抗−RSV Fペプチドが式:
a、b、c、d、i、j、k、l、m、p、q、r、s、t、uおよびzは、0および
1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はHおよびグリコシル残基、複合糖質および修飾基から選択される員である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)抗−RSV Fペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結
合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾され
たグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触さ
せることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、抗−RSV Fペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼお
よびガラクトース供与体と、ガラクトースを抗−RSV Fペプチドへ転移させるために
適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(b)の前に、抗−RSV Fペプチドをエンドグリカナーゼと、抗−RSV
Fペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含ん
でなる。
c、e、gおよびiが、0および1から独立して選択される員であり;rおよびtが1で
あり;b、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよびyが0であり;
そしてzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、r、
s、t、u、v、w、x、yが0であり;iおよびpが0または1から独立して選択され
;qおよびzが1であり;そしてnが0である。あるいはe、g、i、rおよびtが0お
よび1から独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n
、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてqおよびzが1である。
質から選択される員である。
であり、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して抗−CD20抗体ペプチドに共
有結合し、抗−CD20抗体ペプチドが式:
a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、t、uおよびzは、0および1か
ら独立して選択される整数であり;
e、f、gおよびhは0から4の整数から独立して選択され;
n、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、グリコシル残基、複合糖質または修飾基から選択される員である、
を含んでなるグリコシルサブユニットを有する。この方法は:
(a)抗−CD20抗体ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有
結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾さ
れたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触
させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、抗−CD20抗体ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼ
およびガラクトシル供与体と、ガラクトシル供与体を抗−CD20抗体ペプチドへ転移さ
せるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(b)の前に、抗−CD20抗体ペプチドをエンドグリカナーゼと、抗−CD
20抗体ペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを
含んでなる。
(d)工程(a)の前に、抗−CD20抗体ペプチドをマンノシダーゼと、抗−CD20
抗体ペプチドからマンノースを除去するために適する条件下で接触させることを含んでな
る。
質から選択される員である。
り、そして修飾されたグリコシル供与体が修飾されたガラクトシル供与体である。
a、c、e、gおよびiが0および1から独立して選択される員であり;r、t、qおよ
びzが1であり;そしてb、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xおよ
びyが0である。あるいはa、c、e、g、i、q、rおよびtが、0および1から独立
して選択される員であり;b、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、yが
0であり;そしてzが1である。あるいはe、g、i、q、rおよびtが0および1から
独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、
v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはiが0または1であり;
qおよびzが1であり;そしてa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、
r、s、t、u、v、w、xおよびyが0である。あるいはe、g、i、r、t、v、x
およびzが0および1から独立して選択される員であり;a、b、c、d、f、h、j、
k、l、m、n、s、u、wおよびyが0であり;そしてzが1である。あるいはa、b
、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0
であり;nおよびqが1であり;そしてiが0または1である。
提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して組換えDNaseペプチドに共
有結合し、組換えDNaseペプチドが式:
a、b、c、d、i、n、p、q、r、s、tおよびuは、0および1から独立して選
択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であり;
v、w、xおよびyは0であり;そして
Rはポリマー、複合糖質、マンノース、オリゴマンノースおよび修飾基から選択される
員である、
を有するグリコシル残基を含んでなり、該方法が
(a)組換えDNaseペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有
結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾さ
れたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触
させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをシアリダーゼと、組換えDNas
eペプチドからシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドを、ガラクトシルトランスフェラー
ゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを組換えDNaseペプチドへ転移させる
ために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをグリコシダーゼおよびシアリダー
ゼの組み合わせと接触させることを含んでなる。
(f)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(g)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをN−アセチルグルコサミントラン
スフェラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcを該組換えDNaseペプチド
へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、組換えDNaseペプチドをエンドグリカナーゼと、組換えD
Naseペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを
含んでなる。
、c、d、i、j、k、l、m、q、r、s、tおよびuが、0および1から独立して選
択される員であり;e、f、g、hおよびpが1であり;そしてn、v、w、xおよびy
が0である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、
s、tおよびuが、0および1から独立して選択される員であり;pが1であり;そして
n、v、w、xおよびyが0である。あるいはa、b、c、d、f、h、j、k、l、m
、s、u、v、w、xおよびyが0であり;そしてe、g、i、q、rおよびtが0およ
び1から独立して選択される員であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、
e、f、g、h、j、k、l、m、n、r、s、t、u、v、w、xおよびyが0であり
;iが0または1であり;そしてpが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、
h、j、k、lおよびmが0であり;i、q、r、s、t、u、v、xおよびyが0およ
び1から独立して選択される員であり;pが1であり:そしてRがマンノースまたはオリ
ゴマンノースである。
物を形成する方法を含み、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して抗TNFアル
ファペプチドに共有結合し、抗−TNFアルファペプチドが式:
a、b、c、d、i、n、o、p、q、r、s、t、uおよびzは、0および1から独
立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
j、k、lおよびmは0から20の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、xおよびyは0であり;そして
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;
R'は複合糖質または修飾基である、
を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)抗−TNFアルファペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共
有結合したグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾
されたグリコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接
触させることを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、抗−TNFアルファペプチドをガラクトシルトランスフェラー
ゼおよびガラクトース供与体と、ガラクトースを抗−TNFアルファペプチドへ転移させ
るために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、抗−TNFアルファペプチドをエンドグリカナーゼと、抗−T
NFアルファペプチドからグリコシル部分を開裂するために適する条件下で接触させるこ
とを含んでなる。
質から選択される員である。
、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、tおよ
びuが、0および1から独立して選択される員であり;nが1であり;そしてv、w、x
、yおよびzが0である。あるいはa、c、e、gおよびiが0および1から独立して選
択される員であり;rおよびtが1であり;b、d、f、h、j、k、l、m、n、s、
u、v、w、xおよびy;そしてqおよびzが1である。
ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して糖ペプチドに共有結合し、該糖ペプチド
が:
a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、z、aa、bb、ccおよび
eeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
dd、n、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である、式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合した該グリ
コシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシ
ル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを
含んでなる。
(b)工程(a)の前に、糖ぺプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去
するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物を、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シ
アル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、糖プチドをN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよ
びGlcNAc供与体と、GlcNAcを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で
接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシ
ル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
質から選択される員である。
、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から
独立して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である
。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、s、t、u、v、w
、xおよびyが0であり;iおよびrが0および1から独立して選択される員であり;そ
してzが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよ
びnが0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択さ
れる員であり;zが1である。あるいはaa、bb、ccおよびeeが0および1から独
立して選択される員であり;そしてddが0である。あるいはaaおよびeeが0および
1から独立して選択される員であり;そしてbb、ccおよびddが0である。aa、b
b、cc、ddおよびeeが0である。
を形成する方法が提供され、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介してHBsAg
ペプチドに共有結合し、HBsAgペプチドが:
aa、bb、a、b、c、d、i、n、q、r、s、tおよびuは、0および1から独
立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から6の間の整数から独立して選択される員であり;
o、p、j、k、lおよびmは0から100の間の整数から独立して選択される員であ
り;
cc、v、w、xおよびyは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、またはグリコシル残基、複合糖質、または修飾基である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。
(a)HBsAgペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合し
たグリコシルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグ
リコシル供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させる
ことを含んでなる。
(b)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをシアリダーゼと、HBsAgペプチドか
らシアル酸を除去するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをガラクトシダーゼと、HBsAgペプチ
ドからグリコシル残基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(e)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよび
ガラクトース供与体と、ガラクトースをHBsAgペプチドへ転移させるために適する条
件下で接触させることを含んでなる。
(f)工程(d)の生成物を、ST3Gal3およびシアル酸供与体と、シアル酸を生成
物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(g)工程(a)からの生成物を修飾基に反応する部分と接触させ、これにより完全なグ
リコシル連結基と部分との間に結合物を形成することを含んでなる。
(h)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをN−アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼおよびGlcNAc供与体と、GlcNAcをHBsAgペプチドへ転移させるた
めに適する条件下で接触させることを含んでなる。
(i)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをマンノシダーゼと、HBsAgペプチド
からマンノースを開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(j)工程(a)の前に、HBsAgペプチドをエンドグリカナーゼと、HBsAgペプ
チドからグリコシル基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
トおよび複合糖質から選択される員である。
、c、d、i、j、k、l、m、o、p、q、r、s、t、uおよびaaが、0および1
から独立して選択される員であり;bb、e、f、g、hおよびnが1であり;そしてc
c、v、w、x、yおよびzが0である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l、m
、n、o、p、q、r、s、t、uおよびaaが、0および1から独立して選択される員
であり;e、f、gおよびhが0、1、2、3または4から独立して選択され;cc、v
、w、x、yおよびzが0であり;そしてbbが1である。あるいはcc、a、b、c、
d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、v、w、x、yおよびzが0で
あり;そしてq、r、s、t、u、v、w、x、yおよびaaが0および1から独立して
選択される員であり;そしてbbが1である。あるいはa、b、c、d、i、j、k、l
、m、o、q、r、s、t、uおよびaaが0および1から独立して選択される員であり
;bb、e、f、g、hおよびnが1であり;そしてn、p、cc、v、w、x、yおよ
びzが0である。あるいはbb、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m
、o、p、q、r、s、t、u、v、w、x、yおよびzが0および1から独立して選択
される員であり;ccが1であり;そしてnが0または1である。あるいはa、b、c、
d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、y、zおよびccが0であ
り;bbが1であり;e、g、i、n、q、r、tおよびaaが0および1から独立して
選択される員である。a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、
p、zおよびccが0であり;q、r、s、t、u、v、w、x、yおよびaaが0およ
び1から独立して選択される員であり;そしてbbが1である。
する方法を提供し、ここで修飾基が完全なグリコシル連結基を介して糖ペプチドに共有結
合し、糖ペプチドが:
a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、z、aa、bb、ccおよび
eeは、0および1から独立して選択される員であり;
e、f、gおよびhは0から4の間の整数から独立して選択される員であり;
n、v、w、x、yおよびddは0であり;
Rは修飾基、マンノースまたはオリゴマンノースであり;そして
R'はH、グリコシル残基、修飾基および複合糖質から選択される員である、
から選択される員である式を有するグリコシル残基を含んでなる。この方法は:
(a)糖ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼおよび修飾基に共有結合したグリコ
シルトランスフェラーゼの基質であるグリコシル部分を含んでなる修飾されたグリコシル
供与体と、完全なグリコシル連結基が形成するために適する条件下で接触させることを含
んでなる。
(b)工程(a)の前に、糖ペプチドをシアリダーゼと、糖ペプチドからシアル酸を除去
するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、糖ペプチドをエンドグリカナーゼと、糖ペプチドからグリコシ
ル部分を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(c)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクト
ース供与体と、ガラクトースを糖ペプチドへ転移させるために適する条件下で接触させる
ことを含んでなる。
(d)工程(a)の生成物をシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体と、シア
ル酸を生成物へ転移させるために適する条件下で接触させることを含んでなる。
(d)工程(a)の前に、糖ペプチドをガラクトシダーゼと、糖ペプチドからグリコシル
残基を開裂するために適する条件下で接触させることを含んでなる。
、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、r、s、tおよびuが0および1から独立
して選択される員であり;n、v、w、xおよびyが0であり;そしてzが1である。あ
るいはa、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、s、t、u、v、w、x
およびyが0であり;iおよびrが0および1から独立して選択される員であり;そして
zが1である。あるいはa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、mおよびn
が0であり;r、s、t、u、v、w、xおよびyが0および1から独立して選択される
員であり;そしてzが1である。あるいはaaおよびeeが0および1から独立して選択
される員であり;そしてbb、ccおよびddが0である。あるいはaa、bb、cc、
ddおよびeeが0である。あるいはaa、bb、cc、dd、eeおよびnが0である
。
発明の詳細な記述
本発明は、特別にカスタマイズされた、または所望のグリコシル化パターンを有する糖
ペプチド分子を提供する様式で、ペプチド分子に、またはペプチド分子から糖を無細胞で
インビトロ付加および/または削除するための方法および組成物を含み、ここで糖ペプチ
ドは工業的規模で生産される。本発明の好適な態様では、そのように生産された糖ペプチ
ドは酵素反応を介してペプチドに付加された修飾糖が糖ペプチドに結合している。本発明
の重要な特徴は、任意の細胞型により生産されるペプチドを取り、そしてペプチド上にコ
アグリカン構造を生成し、その後にグリカン構造をインビトロで改造して、哺乳動物の治
療的使用に適するグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成するように改造するこ
とである。より具体的には、結合分子がペプチドに有利な特性を付与するように、本発明
に従い修飾された糖分子またはそれに結合した他の化合物を有する糖ペプチド分子を調製
することが可能である。本発明により、結合分子のペプチドへの酵素に基づく付加は位置
選択性および立体選択性の利点を有するので、結合分子はペプチドに酵素的に付加される
。したがって本明細書に提供する方法および組成物を使用することにより、ペプチドを改
造して好ましくはペプチドに結合した修飾された糖を有する望ましいグリカン構造をペプ
チドに付与することが可能である。また本発明の方法および組成物を使用することにより
、工業的規模で所望する、かつまたは修飾されたグリカン構造を有するペプチド分子を生
成することも可能であり、これにより初めて当該技術分野に改善された治療用ペプチドを
効率的に生産するための現実的解決を提供する。
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術でおよび科学的用語は、一般に
本発明が属する分野で当業者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。一般に細胞
培養、分子遺伝学、有機化学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションで本明細書
で使用する命名法および研究手順は、当該技術分野において周知なものであり、そして普
通に使用されている。核酸およびペプチド合成については標準的な技術を使用する。これ
らの技法および手順は当該技術分野の常法および様々な一般的参考書(例えばSambr
ook et al.,1989,モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュ
アル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual
)、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州)に従い一般に行われ、これらはこの文献全体にわたって提供されて
いる。本明細書で使用する命名法および以下に記載する分析化学および有機合成で使用す
る研究手順は周知で、しかも当該技術分野では普通に使用されているものである。標準技
法およびそれらの変法を、化学合成および化学分析に使用する。
体の文法的対象を指す。例として"要素(an element)"は1または1より多
くの要素を指す。
とができる免疫グロブリン分子を称する。抗体は天然な供給源または組換え源に由来する
完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分
であることができる。抗体は典型的には四量体の免疫グロブリン分子である。本発明にお
ける抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(
ab)2、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む種々の形態で存在することができ
る(Harlow et al.、1999、抗体を使用して:ア ラボラトリーマニュ
アル(Using Antibodies:A Laboratory Manual)
、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州;Harlow et
al.、1989、抗体:ア ラボラトリーマニュアル(Antibodies:A
Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク;
Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA85:5879−5883;Bird et al.,1988,Science2
42:423−426)。
ジにより発現される抗体のような組換えDNA技術を使用して生成される抗体を意味する
。この用語は抗体をコードするDNA分子の合成により生成された抗体を意味するとも解
釈すべきであり、そしてこのDNA分子は抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸
配列を発現し、ここでDNAまたはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能であり、しか
も周知な合成DNAまたはアミノ酸配列技法を使用して既に得られている。
的分子である。例えば機能的酵素は、その酵素の特徴とする特徴的な触媒活性を示すもの
である。
ラギンを介してペプチド骨格に連結しているオリゴ糖である。N−結合オリゴ糖は「N−
グリカン」とも呼ぶ。すべてのN−結合オリゴ糖は共通するMan3GlcNAc2の五
糖コアを有する。それらはN−アセチルグルコサミン、ガラクトース、N−アセチルガラ
クトサミン、フコースおよびシアル酸のような周辺糖の存在および分岐(アンテナとも呼
ぶ)の数が異なる。場合によりこの構造はコアのフコース分子および/またはキシロース
分子を含んでもよい。
ルコア構造のみから構成されるグリカン部分を称する。用語「基本的な」が「トリマンノ
シルコア構造」の記載に含まれない時、グリカンはグリカンはそれに結合したさらなる糖
を持つトリマンノシルコア構造を構成する。場合によりこの構造はコアフコース分子およ
び/またはキシロース分子を含んでもよい。
ンノシルコア構造から構成されるグリカン構造を有する糖ペプチドを指すために使用する
。場合によりこの構造はコアフコース分子および/またはキシロース分子を含んでもよい
。
リゴ糖である。
る名前および記号で記載し、次にグリコシド結合の立体配置(αまたはβ)、環結合(1
または2)、結合に関与する還元サッカリドの環の位置(2、3、4、6または8)、そ
して次に還元サッカリドの名前または記号(すなわちGlcNAc)を記載する。各サッ
カリドは好ましくはピラノースである。標準的な糖生物学命名法に関する総説は、例えば
糖生物学の本質(Essential of Glycobiology)、Varki
et al.,編集、1999、CSHL出版を参照にされたい。
ル酸ファミリーの最も普通の員は、N−アセチル−ノイラミン酸(2−ケト−5−アセト
アミド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクトノヌロピラノソ−1−ン酸(
しばしばNeu5Ac、NeuAcまたはNANAと略記される)。このファミリーの第
2の員は、N−グリコリル−ノイラミン酸(Nue5GcまたはNeuGc)であり、こ
こでNeuAcのN−アセチル基はヒドロキシル化されている。第3のシアル酸ファミリ
ーの員は、2−ケト−3−デオキシ−ノヌロン酸(KDN)である(Nadano et
al.,(1986)J.Biol.Chem.261:11550−11557;K
anamori et al.,J.Biol.Chem.265:21811−218
19(1990))。また含まれるのは9−O−C1−C6アシル−Neu5Ac様の9
−O−ラクチル−Neu5Acまたは9−O−アセチル−Neu5Ac、9−デオキシ−
9−フルオロ−Neu5Acおよび9−アジド−9−デオキシ−Neu5Acのような9
−置換シアル酸である。シアル酸ファミリーの総説については、例えばVarki,Gl
ycobiology,2:25−40(1992);シアル酸:化学、代謝および機能
(Sialic Acid:Chemistry,Metabolism and Fu
nction)、R.Schauer、編集(スプリンガーファーラーグ、ニューヨーク
(1992))を参照にされたい。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および
使用は、1992年、10月1日に公開された国際公開第92/16640号パンフレッ
トに開示されている。
生物学的活性に必要な1以上のオリゴ糖分子を含んでなるペプチドである。
動物の健康状態は悪化し続ける動物の健康状態である。
たは「AUC」は、ゼロから無限大の時間の関数として患者の全身循環における薬剤濃度
を記載する曲線下の総面積と定義する。
t1/2」は、患者の血漿薬剤濃度が半分に減少するために必要な時間と定める。多くの
排除(clearence)メカニズム、再分布および当該技術分野で周知な他のメカニ
ズムに依存して、ペプチド薬剤に関連する1より多くの半減期が存在するかもしれない。
通常、アルファ期が再分布に関連し、そしてベータ期が排除に関連するような、アルファ
およびベータ半減期が定義されている。しかしタンパク質薬剤については、ほとんどの部
分が血流に限定され、少なくとも2つの排除半減期が存在し得る。幾つかのグリコシル化
ペプチドに関しては、急速なベータ期排除はマクロファージ上のレセプター、あるいは末
端ガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、N−アセチルグルコサミン、マンノース
またはフコースを認識する内皮細胞を介して媒介される。より遅いベータ期排除は有効半
径(effective radius)<2nm(約68kD)の分子については腎臓
の糸球体濾過を介して、および/または組織中の特異的もしくは非特異的取り込みおよび
代謝を介して起こり得る。糖PEG化(GlycoPEGylation)は末端糖(例
えばガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミン)をキャップすることができ、そし
てこれによりこれらの糖を認識するレセプターを介する急速なアルファ期排除を遮断する
。より大きな有効半径を与え、そしてこれにより分布の容量および組織の取り込みを下げ
、これにより後期ベータ期を延長することもできる。このようにアルファ期およびベータ
期半減期に及ぼす糖PEG化の明確な影響は、サイズ、グリコシル化の状態および当該技
術分野で周知な他のパラメーターに依存して変動するだろう。「半減期」のさらなる説明
は、製薬学的バイオテクノロジー(Pharmaceutical Biotechno
logy)、(1997,DFA Crommelin and RD Sindela
r、編集、ハウウッド出版、アムステルダム、第101−120頁)に見いだすことがで
きる。
は、薬剤が投薬後に患者の身体に留まる平均時間と定義する。
通常隣接する配列から取り出されたDNAフラグメント、例えば天然に存在するゲノム中
のフラグメントに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメントを称す
る。この用語は、核酸に天然に付随する他の成分、例えば通常は細胞中で付随するRNA
またはDNAまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用する。したがってこ
の用語には、例えばベクターに、自律複製プラスミドまたはウイルスに、または原核また
は真核生物のゲノムDNAに包含されるか、または他の配列から独立して別個の分子とし
て存在する(cDNAまたはゲノムもしくはPCRまたは制限酵素消化により生成される
cDNAフラグメントのような)組換えDNAを含む。またさらなるペプチド配列をコー
ドするハイブリッド核酸の一部である組換えDNAも含む。
る。すなわちポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖核酸のいずれかでよい。
ド」は典型的には短いポリヌクレオチド、一般には約50ヌクレオチド未満を指す。
クレオチド配列の左手末端は5'−末端である;2本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向
は、5'−方向を指す。新生RNA転写物に対してヌクレオチドの5'から3'付加の方
向は転写方向と称する。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖を「コード鎖」と称し;D
NA上の参照点に対して5'に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と称し;DNA
上の参照点に対して3'に位置するDNA鎖上の配列は「下流配列」と称する。
の定めた配列、またはアミノ酸の定めた配列およびそれらから生じる生物学的特性のいず
れかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳
型として役立つ遺伝子、cDNAまたはmRNAのようなポリヌクレオチド中のヌクレオ
チドの特別な配列に固有の特性を称する。すなわち核酸配列は、その核酸に対応するmR
NAの転写および翻訳が、細胞または他の生物系であるタンパク質を生産する場合、その
タンパク質をコードする。両コード鎖は、そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一で
あり、そして通常は配列表に提供され、そして遺伝子またはcDNAの転写に鋳型として
使用される非コード鎖は、その核酸またはcDNAのタンパク質または他の産物をコード
すると言うことができる。
物であり、そして同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タン
パク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。
、例えば2つのDNA分子または2つのRNA分子の間、または2つのペプチド分子の間
のサブユニット配列類似性を称する。2つの両分子中のサブユニット位置が同じモノマー
性サブユニットに占有されている時、例えば2つの各DNA分子の1つの位置がアデニン
で占められているならば、それらはその位置で相同的である。2つの配列間の相同性は対
合するか、または相同的な位置の数の直接的関数であり、例えば2つの化合物の配列で位
置の半分(例えば10個のサブユニット長のポリマー中の5箇所)が相同的ならば、2つ
の配列は50%相同的であり、90%の位置、例えば10のうちの9が対合または相同的
ならば、2つの配列は90%の相同性を共有する。例として、DNA配列3'ATTGC
C5'および3'TATGGCは50%の相同性を共有する。
ムを使用して行うことができる。例えば2つの配列を比較するために有用な数学的アルゴ
リズムは、Karlin and Altschul(1993,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 90:5873−5877)におけるように改良されたKa
rlin and Altschul(1990,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87:2264−2268)のアルゴリズムである。このアルゴリズムはA
ltschul,et al.(1990,J.Mol.Biol.215:403−4
10)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに包含され、そして例えばホームペ
ージのURL"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
/"を有するナショナル センター フォー バイオテクノロジー インフォメーション
(NCBI)の世界的なウェッブサイトからアクセスすることができる。BLASTのヌ
クレオチド調査は、以下のパラメーターを使用してNBLASTプログラムを用いて行う
ことができる(NCBIウェッブサイトで"blastn"と命名):本明細書に記載す
る核酸に対して相同的なヌクレオチド配列を得るために、ギャップペナルティー=5;ギ
ャップエクステンションペナルティー=2;ミスマッチペナルティー=3;マッチリワー
ド=1;期待値=10.0;およびワードサイズ=11。BLASTのタンパク質調査は
、以下のパラメーターを使用してXBLASTプログラム(NCBIウェッブサイトで"
blastn"と命名)またはNCBI"blastp"プログラムを用いて行うことが
できる:本明細書に記載するタンパク質分子に対して相同的なアミノ酸配列を得るために
、期待値=10.0、BLOSUM62スコアリングマトリックス。比較目的のギャップ
化アライメントを得るために、Gapped BLASTをAltschul,et a
l.(1997,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)に
記載されているように利用することができる。あるいはPSI−BlastまたはPHI
−Blastを使用して、分子間の距離関係(Id.)および共通パターンを共有する分
子間の関係を検出する反復調査を行うことができる。BLAST、Gapped化BLA
ST、PSI−BlastおよびPHI−Blastプログラムを使用する時、各プログ
ラムのデフォルトパラメーター(例えばXBLASTおよびNBLAST)を使用するこ
とができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照にされ
たい。
技術に類似する技術を使用して決定することができる。同一性の割合の計算では、多くの
場合、正確な対合をカウントする。
はリプレッサー配列(ここで少なくとも1つの配列はヘテロロガス、すなわち宿主細胞中
に通常は見いだされない)のような1以上の発現制御配列に操作可能に連結された、問題
のペプチドのコード配列を有する核酸と定義する。
二本鎖核酸部分が、2つのポリヌクレオチドの少なくとも1つがその特徴とする生理学的
効果をもう一方に及ぼすことができる様式で、核酸部分内に配列されている2つのポリヌ
クレオチドを含んでなることを意味する。例として核酸のコード領域と操作可能に連結さ
れたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。
作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。ある場合ではこの配
列はコアプロモーター配列でよく、そして他の場合ではこの配列は遺伝子産物の発現に必
要なエンハンサー配列および他の調節要素を含んでもよい。プロモーター/調節配列は、
例えば組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
様式で駆動するプロモーターである。例として、細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を
駆動するプロモーターは構成的プロモーターである。
チドに操作可能に連結された時、プロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在す
る時にのみ生きている細胞中で遺伝子産物の生産を実質的に引き起こすヌクレオチド配列
である。
クレオチドに操作可能に連結された時、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞であ
る時にのみ生きている細胞中で遺伝子産物の生産を実質的に引き起こすヌクレオチド配列
である。
送達するために使用することができる物質の組成物である。当該技術分野では数々のベク
ターが知られており、それらには限定するわけではないが線状ポリヌクレオチド、イオン
性または両イオン性化合物を付随するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含
む。このように用語「ベクター」には自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用
語は、例えばポリリシン化合物、リポソーム等のような核酸の細胞への転移を促進する非
−プラスミドおよび非−ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクタ
ーの例には、限定するわけではないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
ター、レトロウイルスベクター等を含む。
配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを称する。発現ベクター
は発現に十分なシス−作用要素を含んでなり;発現のための他の要素は宿主細胞またはイ
ンビトロ発現系により供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを包含
するコスミド、プラスミド(例えば裸の、またはリポソームに含まれた)およびウイルス
のような、当該技術分野で既知のこれらすべてを含む。
修飾を有する細胞である。そのような修飾には限定するわけではないが、遺伝的物質の挿
入、遺伝的物質の削除、およびそのような物質が安定に維持さるか、またはされなくても
染色体外の遺伝的物質の挿入に見られる。
ク質である。本明細書における用語「ペプチド」の使用は、糖部分がペプチドに結合して
いる時、ペプチドに結合した糖部分を有するペプチドを含む。
により生産される時のペプチドの形態を意味する。ペプチドが複数の細胞および/または
生物により生産される時、ペプチドは種々の天然な形態を有することができる。
れているポリマーを称するか、あるいはペプチドと呼ぶ。さらに天然には存在しないアミ
ノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含む。核酸がコー
ドしないアミノ酸も本発明で使用することができる。さらに反応性基、グリコシル化部位
、ポリマー、治療部分、生体分子等を含むように修飾されたアミノ酸も本発明に有用とな
り得る。本発明で使用するすべてのアミノ酸は、そのD−またはL−同位体のいずれかで
あり得る。L−同位体が一般に好ましい。さらに他のペプチド模造物も本発明に有用であ
る。本明細書で使用するように、「ペプチド」はグリコシル化および非グリコシル化ペプ
チドの両方を指す。またペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されたペプチ
ドも含む。一般的な総説については、Spatola,A.F.、アミノ酸、ペプチドお
よびタンパク質の化学および生化学(CHEMISTRY AND BIOCHEMIS
TRY OF AMINO ACIDS,PEPTIDES AND PROTEINS
)、B.Weinstein編集、マルセルデッカー(Marcel Dekker)、
ニューヨーク、第267(1983)頁を参照にされたい。
で説明する修飾された糖を用いて結合されている本発明の種を称する。
アミノ酸と同様な様式で機能するアノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメミノ酸類似体およびアミノ酸模造物を称する。天然に
存在するアミノ酸は遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミ
ートおよびO−ホスホセリン
である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学的構造、すなわち
水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホ
モセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを称
する。そのような類似体は修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペ
プチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミ
ノ酸模造物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するア
ミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。 本明細書で使用するアミノ酸は、以
下の表1に示すように、その完全名により、それらに対応する3文字コードにより、また
はそれらに対応する1文字コードにより表す:
ドの類似体も提供する。類似体は保存的アミノ酸配列の差異により、または配列に影響し
ない修飾により、あるいはその両方により天然に存在するタンパク質またはペプチドとは
異なることができる。例えばタンパク質またはペプチドの1次配列は変えるが、通常はそ
の機能を変えない保存的アミノ酸の変化を作成することができる。保存的アミノ酸置換に
は典型的には以下の群内の置換を含む:
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リシン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン。
化学的誘導化、例えばアセチル化またはカルボキシル化を含む。またグリコシル化の修飾
、例えばペプチドの合成およびプロセッシング中、またはさなるプロセッシング段階での
ペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより;例えばペプチドをグリコシル化
に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素に暴露す
ることにより作られるものを含む。またリン酸化アミノ酸残基を有する配列、例えばホス
ホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンも含む。
ると考える。例えば末端を誘導化してブロッキング基、すなわち「望ましくない分解」(
この用語は化合物の機能に影響を及ぼすと思われる化合物の末端で任意の種類の酵素的、
化学的または生化学的分解、すなわちその末端での化合物の順次分解を意味する)からN
−末端およびC−末端を保護し、かつ/または安定化するために適する化学置換基を含む
ことができる。
野で従来から使用されている保護基を含む。例えば適当なN−末端ブロッキング基は、N
−末端のアルキル化またはアシル化により導入することができる。適当なN−末端ブロッ
キング基の例には、C1−C5分岐もしくは非分岐アルキル基、ホルミルおよびアセチル
基のようなアシル基、ならびにアセトアミドメチル(Acm)、FmocまたはBoc基
のようなそれらの置換形を含む。アミノ酸のデスアミノ類似体も有用なN−末端ブロッキ
ング基であり、そしてペプチドのN−末端にカップリングされるか、またはN−末端残基
の代わりに使用されるかのいずれかであり得る。適当なC−末端ブロッキング基(ここで
C−末端のカルボキシル基が含まれるか、または含まれない)には、エステル、ケトンま
たはアミドを含む。エステルまたはケトン−形成アルキル基、特にメチル、エチルおよび
プロピルのような低級アルキル基、および1級アミン(−NH2)のようなアミド形成ア
ミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチル
エチルアミノ等のようなモノ−およびジ−アルキルアミノ基は、C−末端ブロッキング基
の例である。アグマチンのようなデスカルボキシル化アミノ酸類似体も有用なC−末端ブ
ロッキング基であり、そしてペプチドのC−末端残基にカップリングされるか、またはそ
れに変えて使用することができる。さらに末端の遊離アミノおよびカルボキシル基はペプ
チドから一緒に取り出して、ペプチドの活性に影響を及ぼすことなくそれらのデスアミノ
およびデスカルボキシル化形を生じることができると考えられる。
限定するわけではないが天然のL−異性体における1以上のアミノ酸をD−異性体中のア
ミノ酸に置換することを含む。このようにペプチドは1以上のD−アミノ酸残基を含んで
もよく、あるいはすべてがD−形のアミノ酸から構成されてもよい。本発明に従いペプチ
ドのレトロ−インベルソ(retro−inverso)形、例えばすべてのアミノ酸が
D−アミノ酸形に置換されている転化(inverted)ペプチドも企図する。
するために、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸で、あるいは酢酸、プロ
ピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン
酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シンナミン酸、マンデル酸、メタンスルホ
ン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機酸で処理
した本発明のペプチドは、本発明での使用に適している。
またはペプチドを治療薬としてより適するようにするために、通常の分子生物学的技術を
使用して修飾されたペプチドも含む。そのようなペプチドの類似体には、天然に存在する
L−アミノ酸以外の残基、例えばD−アミノ酸または天然には存在しない合成アミノ酸を
含有するものを含む。本発明のペプチドは本明細書に掲載する具体的な例示法の生成物に
限定されない。
である。イオン化中、SA−PEG(シアル酸−ポリ(エチレングリコール))は糖タン
パク質のN−グリカン構造から部分的に排除され得る。
sferase)」とは、供与体の糖を受容部分(acceptor moiety)に
転移する能力を有する任意の酵素/タンパク質を称する。
明の方法でペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素的に付加された天然に存在す
る、または天然には存在しない炭水化物を称する。修飾された糖は限定するわけではない
が糖ヌクレオチド(モノ−、ジ−およびトリ−ホスフェート)、活性化糖(例えばグリコ
シルハライド、グリコシルメシラート)および活性化もされず、ヌクレオチドでもない糖
を含む多数の酵素基質から選択される。
官能化される。有用な修飾基には限定するわけではないが、水溶性ポリマー、治療部分、
診断部分、生体分子等を含む。修飾基での官能化の位置は、「修飾された糖」がペプチド
に酵素的に加えられることを妨げないように選択される。
を有する部分を称する。水溶性を検出し、かつ/または定量するための方法は当該技術分
野では周知である。例として水溶性ポリマーには、ペプチド、サッカリド、ポリ(エーテ
ル)、ポリ(アミン)、ポリ(カルボン酸)等を含む。ペプチドは混合配列を有するか、
または単一アミノ酸からなる(例えばポリ(リシン))ことができる。同様にサッカリド
は混合配列であるか、または単一サッカリドサブユニット(例えばデキストラン、アミロ
ース、キトサンおよびポリ(シアル酸))からなることができる。ポリ(エーテル)の例
はポリ(エチレングリコール)である。ポリ(エチレンイミン)はポリアミンの例であり
、そしてポリ(アスパラギン)酸は代表的なポリ(カルボン酸)である。
roup)」とは、作用物質(例えば水溶性ポリマー、治療部分、生体分子)が共有結合
するグリコシル残基を指す。本発明の方法において「グリコシル連結基」は、グリコシル
化または非グリコシル化ペプチドに共有結合するようになり、これにより作用物質をペプ
チド上のアミノ酸および/またはグリコシル残基に連結する。「グリコシル連結基」は、
一般に「修飾された糖」をペプチド上のアミノ酸および/またはグリコシル残基に酵素的
に結合することにより、「修飾された糖」に由来する。「完全なグリコシル連結基(in
tact glycosyl linking group)」はグリコシル部分に由来
する連結基を称し、ここで結合物を連結する個々のサッカリドモノマーは分解、例えばメ
タ過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化されない。本発明の「完全なグリコシル連結基」はグ
リコシル単位(1つまたは複数)の付加により、または元のサッカリド構造から1以上の
グリコシル単位の除去により天然に存在するオリゴ糖に由来することができる。
標的剤(targeting agent)」は、身体の特定の組織または領域に選択的
に局在化する種を称する。局在化は分子決定基の特異的認識、標的剤または結合物の分子
サイズ、イオン的相互作用、疎水的相互作用等により媒介される。作用物質を特定の組織
または領域に標的化する他のメカニズムは、当業者により知られている。
に有用な任意の作用物質を意味し、それらには限定するわけではないが抗生物質、抗−炎
症剤、抗−腫瘍剤、サイトトキシンおよび放射性剤を含む。「治療部分」には生物活性剤
(1より多くの治療部分が担体に結合している構築物、例えば多機能剤(multiva
lent agent))のプロドラッグを含む。治療部分はペプチドおよびペプチドを
含む構築物も含む。例示ペプチドには図1および本明細書中の表5および表6に開示され
ているものを含む。
意味し、限定するわけではないがサイトトキシンおよび代謝拮抗物質、アルキル化剤、ア
ンスラサイクリン、抗生物質、抗有糸分裂剤、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アス
パラギナーゼ、コルチコステロイド、インターフェロンおよび放射性剤のような作用物質
を含む。また用語「抗腫瘍剤」の範囲内に包含されるのは、ペプチドと−腫瘍活性、例え
ばTNF−αとの結合物である。結合物は限定するわけではないが、治療用タンパク質と
本発明の糖タンパク質との間で形成されるものを含む。代表的な結合物は、PSGL−1
とTNF−αとの間で形成される結合物である。
nt)」は、細胞に有害な任意の作用物質を意味する。例にはタキソール、サイトカラシ
ンB、グラミシジンD、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、
テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノル
ビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチ
ノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラ
カイン、リドカイン、プロプラノルオールおよびピューロマイシンおよびそれらの類似体
または相同体を含む。他のトキシンには例えばリシン、CC−1065および類似体、ヅ
オカルマイシンを含む。さらに別のトキシンにはジフテリアトキシンおよび蛇毒(例えば
コブラ毒)を含む。
果的な任意の放射性同位体を含む。例には限定するわけではないが、インジウム−111
、コバルト−60およびテクネチウムを含む。さらにウラン、ラジウムおよびトリウムの
ような天然に存在する放射性同位体元素(これらは典型的には放射性同位体の混合物を表
す)は、放射性剤の適切な例である。金属イオンは典型的には有機錯化部分で錯化される
。
おり、そして本発明の化合物に包含することができる(例えばEDTA、DTPA、DO
TA、NTA、HDTA等、およびDTPP、EDTP、HDTP、NTP等のようなそ
れらのホスホネート類似体)。例えばPitt et al.、「鉄過剰負荷の処置のた
めの錯化剤の設計(The Design of Chelating Agents
for The Treatment of Iron Overload)」、生物学
および医学における無機化学(INORGANIC CHEMISTRY IN BIO
LOGY AND MEDICINE)で;Martell編集;アメリカ化学学会、ワ
シントン、D.C.、1980、第279〜312頁;Lindoy、大環リガンド錯体
の化学(THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND
COMPLEXES);ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、1989;Dugas、
生物有機化学(BIOORGANIC CHEMISTRY);スプリンガー−ファーラ
ーク、ニューヨーク、1989、およびそれらの中に含まれている参考文献を参照にされ
たい。
経路を当業者は利用することができる。例えばMeares et al.,「インビボ
のキレート−標識タンパク質およびポリペプチドの性質(Properties of
In Vivo Chelate−Tagged Proteins and Poly
peptides)」、タンパク質の修飾:食品、栄養および薬理学的観点(MODIF
ICATION OF PROTEINS:FOOD,NUTRITIONAL,AND
PHARMACOLOGICAL ASPECTS)」で、Feeney et al
.、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.、1982、第370〜387頁;Kas
ina et al.,Bioconjugate Chem.,9:108−117(
1988);Song et al.,Bioconjugate Chem.,8:2
49−255(1997)を参照にされたい。
時に結合物活性の活性を保持し、そして個体の免疫系とは非反応性の任意の物質を含む。
例には限定するわけではないが、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油/水型乳液のような乳
液、および様々な種類の湿潤剤のような標準的な製薬学的担体を含む。他の担体には、滅
菌溶液、コート錠剤を含む錠剤およびカプセルを含んでもよい。典型的にはそのような担
体は澱粉、ミルク、糖、ある種のクレー、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステア
リン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルク、植物油脂または油、ガム、グリコールの
ような賦形剤、または他の既知の賦形剤を含む。そのような担体はまた、香料および着色
用添加剤または他の材料を含んでもよい。そのような担体を含んでなる組成物は、周知な
常法により配合される。
局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内(intralesional)、鼻内ま
たは皮下投与、鞘内投与、または緩効性デバイス(例えばミニ−浸透圧ポンプ)の移植を
意味する。
含まない物質を称する。本発明のペプチド結合物について、用語「単離された」とはペプ
チド結合物を調製するために使用する混合物中の物質を通常付随する成分を実質的または
本質的に含まない物質を称する。「単離された」および「純粋な」とは互換的に使用する
。典型的には本発明の単離されたペプチド結合物は好ましくは範囲として表される純度の
レベルを有する。ペプチド結合物に関する純度範囲の下限は約60%、約70%または約
80%であり、そして純度範囲の上限は約70%、約80%、約90%または約90%よ
り高い。
される。純度範囲の下限は約90%、約92%、約94%、約96%または約98%であ
る。純度範囲の上限は約92%、約94%、約96%、約98%または約100%である
。
リルアミドゲル電気泳動、HPLCまたは類似の手段)により決定される。
の修飾された糖が、ペプチド上の多数の同一な受容体部位(acceptor site
)に付加されている、本発明のペプチド結合物群の特徴を説明する。「群の本質的な各員
」は、修飾された糖に対するペプチド結合物上の部位の「均一性」にも言及しており、そ
して少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、そしてより好ましくは少なく
とも約95%均一である本発明の結合物を称する。
。すなわち各修飾された糖が、それぞれ他の修飾された糖が結合する受容体部位と同じ構
造を有する受容体部位に結合している本発明のペプチド結合物では、ペプチド結合物は約
100%均一であると言える。均一性は典型的には範囲で表される。ペプチド結合物につ
いて均一性の範囲の下限は約60%、約70%または約80%であり、そして純度範囲の
上限は約70%、約80%、約90%または約90%より高い。
れる。均一性の範囲の下限は約90%、約92%、約94、約96%または約98%であ
る。純度範囲の上限は約92%、約94%、約96%、約98%または約100%の均一
性である。ペプチド結合物の純度は典型的には当業者に既知の1以上の方法、例えば液体
クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)、飛行スペクトロメトリーのマトリックス
支援レーザー脱離質量時間(MALDI−TOF)、キャピラリー電気泳動等により決定
される。
ally uniform glycoform)」または「実質的に単一なグリコシル
化パターン(glycosylation pattern)」とは、問題のグリコシル
トランスフェラーゼ(例えばフコシルトランスフェラーゼ)によりグリコシル化される受
容体部分の割合を指す。例えばα1,2−フコシルトランスフェラーゼの場合では、実質
的にすべての(以下に定義するように)Galβ1,4−GlcNAc−Rおよびそのシ
アリル化類似体が本発明のペプチド結合物中でフコシル化される場合、実質的に単一なフ
コシル化パターンが存在する。当業者は出発原料がグリコシル化受容体部分(例えばフコ
シル化Galβ1,4−GlcNAc−R部分)を含んでもよいと理解するだろう。すな
わち計算されるグリコシル化の割合は、本発明の方法によりグリコシル化される受容体部
分、ならびに出発原料中ですでにフコシル化された受容体部分を含む。
トランスフェラーゼについて少なくとも約40%、少なくとも約70%、少なくとも約8
0%、より好ましくは少なくとも約90%、そしてさらに好ましくは少なくとも約95%
の受容体部分がグリコシル化されることを意味する。
発明の説明
I.グリカン鎖の改造するための方法
本発明は、好ましくは修飾された糖をペプチドに付加することを含む特別にカスタマイ
ズされた、または所望のグリコシル化パターンを有するペプチド分子を提供するような様
式で、糖ペプチド分子へ、またはそれから糖をインビトロで付加および/または削除する
ための方法および組成物を含む。したがって本発明の重要な特徴は、任意の細胞型により
生産されるペプチドを取り、そしてペプチド上にコアグリカン構造を生成し、その後にグ
リカン構造をインビトロで改造して哺乳動物における治療的使用に適するグリコシル化パ
ターンを有するペプチドを生成することである。
産するための現在のインビボ法の、特にこれらのペプチドが組換えDNAの方法論を使用
して生産される時の限界から当該技術分野では周知である。さらに本発明まで、ペプチド
は工業的規模で生産できるが、ペプチド上に所望のグリカン構造を有する糖ペプチドを生
成することは可能でなかった。
る糖ペプチドを提供する様式で、ペプチド上に存在すべきではない糖部分が除去され、そ
してペプチドに付加されるべき、場合により修飾された糖を含む糖部分が付加されるよう
に、細胞により生産されるペプチドが適当な酵素およびその基質の体系的付加によりイン
ビトロで酵素的に処理される。
A.N−結合グリカンを改造する方法
1つの観点では、本発明は商業的または製薬学的に興味深いほとんどのペプチドが本明
細書でトリマンノシルコア(trimannosyl core)と呼ぶ共通する5個の
糖構造を含んでなり、これはペプチド鎖上の配列Asn−X−Ser/Thrでアスパラ
ギンにN−結合しているという事実を利用する。基本的なトリマンノシルコアは本質的に
ペプチドに結合した2個のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基および3個の
マンノース(Man)残基からなり、すなわちこれは場合によりフコース残基を含むこと
ができる場合を除き、このような5個の糖残基を含んでなり、そしてさらなる糖は含まな
い。第1GlcNAcはアスパラギンのアミド基に結合し、そして第2のGlcNAcは
β1,4−結合を介して第1に結合している。マンノース残基はβ1,4−結合を介して
第2のGlcNAcに結合し、そして2個のマンノース残基がそれぞれα1,3およびα
1,6結合を介してこのマンノースに結合している。トリマンノシルコア構造の図解的説
明は図2、左側に示す。ほとんどのペプチド上のグリカン構造はトリマンノシルコアに加
えて他の糖を含んでなるのが通例であるが、トリマンノシルコア構造は哺乳動物のペプチ
ド上のN−結合グリカンの本質的特徴を表す。
造を有するペプチドの生成を含む。系がそれ自体天然に存在するものであるか、あるいは
それらは組換えDNA法を含むかどうかにかかわらず、ペプチドを生産するために使用す
る種々の細胞系を考慮して、本発明は任意の細胞型で生産されるペプチド上のグリカン分
子が基本的なトリマンノシルコア構造に減少できる方法を提供する。いったん基本的なト
リマンノシルコア構造を生成したら、次いで本明細書に記載する方法を使用して、ペプチ
ドにペプチドの治療的効果を強化する1以上の特性を付与するペプチド上の所望するグリ
カン構造をインビトロでペプチドに生成することが可能である。
ン構造を記載するために使用することは明らかなはずである。トリマンノシルコア構造を
有する糖ペプチドは、それらに加えられたさらなる糖を有してもよく、そしてほとんどの
部分について、糖が所望するグリカン構造を有するペプチドを生じるかどうかには無関係
に、それに加えられたさらなる構造を有する。用語「基本的なトリマンノシルコア構造」
は、本明細書中のいたるところで定義している。用語「要素」が「トリマンノシルコア構
造」の記載には含まれない時、グリカンはさらにそれに付いた糖を含むトリマンノシルコ
ア構造を含んでなる。
ンノシルコア構造を含んでなるグリカン構造を有する糖ペプチドを指すために使用する。
しかし場合によりそれに結合したフコース残基を含んでもよい。本明細書に記載するよう
に、基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドは1つの最適例であり、したがって本発明の
グリカン改造方法の好適な出発原料である。
Ac残基が各α1,3およびα1,6−マンノース残基に加えられたトリマンノシルコア
を有するグリカン構造である(例えば図3の第2行の、図の左から2番目の構造を参照に
されたい)。この構造は本明細書では「Man3GlcNAc4」と呼ぶ。場合により、
この構造はコアフコース分子を含んでもよい。いったんMan3GlcNAc4構造が生
成したら、本明細書に記載する方法を使用してペプチドの治療的効果を強化する1以上の
特性を糖ペプチド上に付与する所望のグリカン構造を糖ペプチド上にインビトロで生成す
ることが可能である。
乳動物およびヒトの糖ペプチドは、トリマンノシルコア構造およびそれに結合した1以上
の糖を用いてN−結合グリコシル化される。
ペプチドに結合した糖部分を有するペプチド鎖を指す。本明細書では小さい糖ポリペプチ
ドまたは糖ペプチドを、大きな糖ポリペプチドまたは糖ペプチドから区別する識別は行わ
ない。すなわち大変わずかなアミノ酸をそれらのペプチド鎖中に有するホルモン分子(例
えばしばしばわずか3アミノ酸)および他の大変大きなペプチドも、それらが結合した糖
部分を有するならば総称用語「糖ポリペプチド」および「糖ペプチド」に含める。しかし
用語「ペプチド」の使用はペプチドが糖ペプチドであることを除外しない。
つのGlcNAc残基を含むトリマンノシルコアを有するN−結合グリカンを有するペプ
チドである。この残基はN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnT−I
)を使用してトリマンノシルコアに加えられる。第2のGlcNAc残基を加える場合、
N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII(GnT−II)を使用する。場合
によりさらなるGlcNAc残基をGnT−IVおよび/またはGnT−Vを用いて加え
てもよく、そして第3のバイセクティング(bisecting)GlcNAc残基をN
−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnT−III)を使用してトリ
マンノシルコアのβ1,4マンノースに結合することができる。場合により、この構造は
、ガラクトース残基を各非−バイセクティングGlcNAcに加えるためにβ1,4ガラ
クトシルトランスフェラーゼを用いて処理することにより延長してもよく、そしてさらに
場合により、α2,3またはα2,6−シアリルトランスフェラーゼ酵素を使用して、シ
アル酸残基を各ガラクトース残基に加えてもよい。バイセクティングGlcNAcをグリ
カンに付加することは、引き続きガラクトースおよびシアル酸残基の付加に必要ではない
;しかしラットおよびヒトGnT−III酵素の基質親和性に関して、グリカン上の1以
上のガラクトース残基の存在は、ガラクトースを含むグリカンがこれらGnT−III形
の基質ではないのでバイセクティングGlcNAcの付加を防止する。このようにバイセ
クティングGlcNAcの存在が望まれ、そしてこのような形のGnT−IIIを使用す
る場合、グリカンはバイセクティングGlcNAcの付加前に除去されるさらなるガラク
トースおよび/またはシアル酸残基を含べきであることが重要である。他のGnT−II
I形はそれらの活性にこの特異的な基質の順序を必要としない。
明細書に提供する図面に示す。「所望のグリコシル化」を有するペプチドのインビトロ生
成に関する正確な手順は、本明細書のいたるところに記載する。しかし本発明は本明細書
に開示する任意の1つのグリカン構造のみに限定されると解釈されるべきではない。むし
ろ本発明は本明細書に提供する方法論を使用して作成され得るありとあらゆるグリカン構
造を含むと解釈すべきである。
を構成するかもしれない。例えば唯一のトリマンノシルコアを有するペプチドは、ゴーシ
ェ病に関与することが示された(Mistry et al.,1966,Lancet
348:1555−1559;Bijsterbosch et al.,1996,E
ur.J.Biochem.237:344−349)。
らかとなる。
a)共通する特徴としてトリマンノシルコア構造およびそれに結合した1以上の糖の少な
くとも1以上の異種または均一な混合物を有する1以上のグリカン分子を有する糖ペプチ
ドから始めて、唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコア構造を有するか、
または唯一のグリカン構造としてMan3GlcNAc4を有する糖ペプチドの比率を上
げることが可能である。これはグリカン構造の糖の異種または均一混合物が基本的なトリ
マンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少するまで、それを開裂する適当
数の酵素を適当な順序で糖ペプチドに体系的に加えることによりインビトロで達成される
。どのようにこれがなされるかの具体例は、ペプチドが生産される細胞型、それゆえに細
胞により最初に生産されたペプチド上に存在するグリカン構造(1つまたは複数)の複雑
さの程度を含む種々の因子に大部分が依存する。どのように複雑なグリカン構造が基本的
なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少できるかを図3に提示し
、そして本明細書のいたるところで詳細に記載する。
b)細胞のグリコシル化機構が唯一のグリカン構造としてペプチド上に基本的なトリマン
ノシルコア構造を有するペプチドを生産する、天然に存在する細胞を単離することにより
、そのようなペプチドを生成することが可能である。次に選択したペプチドが唯一のグリ
カン構造としてペプチド上に基本的なトリマンノシルコア構造を有するように、選択する
ペプチドをコードするDNAを、DNAが転写、翻訳、そしてグリコシル化される細胞に
トランスフェクトする。例えば機能的GnT−I酵素を欠く細胞は数種の糖ペプチドを生
産するだろう。場合によってはこれらはトリマンノシルコアに結合したさらなる糖を伴わ
ない糖ペプチドとなることもある。しかし別の場合では、生産されるペプチドはトリマン
ノシルコアに結合した2つのさらなるマンノース残基を有することができ、Man5グリ
カンを生じる。これも本発明の改造方法に望ましい出発原料である。そのようなグリカン
構造の生成の具体例を本明細書に記載する。
c)あるいはペプチド上に唯一のグリカン構造として基本的なトリマンノシルコアまたは
Man3GlcNAc4構造を有するペプチドが生産されるように、特異的なグリコシル
化機構を付与するために細胞を遺伝的に工作することが可能である。選択したペプチドが
基本的なトリマンノシルコア構造のみを含んでなる増加した数のグリカンを有するように
、選択したペプチドをコードするDNAを、DNAが転写、翻訳、そしてグリコシル化さ
れる細胞にトランスフェクトする。例えばGnT−Iを欠くように遺伝的に工作されたあ
る種の細胞は、基本的なトリマンノシルコア構造を有するグリカンを生産するか、あるい
は細胞に依存して、結合した2つのさらなるマンノース残基が加えられたトリマンノシル
コアを有するグリカン(Man5)を生産することができる。細胞がMan5グリカン構
造を生産する時、細胞は2つのさらなるマンノース残基を開裂してトリマンノシルコアを
生成するマンノシダーゼ3を発現するようにさらに遺伝的に工作されることができる。あ
るいはこのMan5グリカンはインビトロでマンノシダーゼ3とインキューベーションし
て同じ効果を有することが可能である。
d)b)およびc)での考察から、細胞は基本的なトリマンノシルコアまたはそれに結合
したMan3GlcNAc4構造を有するペプチドのみを生産する必要はないことが容易
に明らかである。むしろb)およびc)で記載した細胞が100%の基本的なトリマンノ
シルコア構造(すなわち、それに結合したさらなる糖を持たない)、あるいは100%の
Man3GlcNAc4構造を有するペプチドを生産しなければ、細胞は実際には唯一の
グリカン構造として基本的なトリマンノシルコア構造、またはMan3GlcNAc4構
造を、それに結合したさらなる糖を有するこれらの構造に加えて組み合わせて有するペプ
チドの異種の混合物を生産する。結合したさらなる糖を有するトリマンノシルコアまたは
Man3GlcNAc4構造を有するペプチドの比率は、1つの構造を有するペプチドの
比率とは反対に、それらを生産する細胞に依存して変動するだろう。グリカンの複雑さ(
すなわちトリマンノシルコアにどの糖がどれくらい結合しているか)も、それらを生産す
る細胞に依存して変動するだろう。
e)いったん基本的なトリマンノシルコアまたは1または2個のGlcNAc残基がそれ
に結合したトリマンノシルコアを有する糖ペプチドが上記のa)、b)またはc)に従い
生産されれば、本発明に従い、さらなる糖分子をインビトロでトリマンノシルコア構造に
加えて、所望のグリコシル化を有するペプチド(すなわち、インビトロでカスタマイズさ
れたグリカン構造を有するペプチド)を生成する。
f)しかしすべてではないが幾らかの所望する糖を結合して含む基本的なトリマンノシル
コアまたはMan3GlcNAc4構造を有するペプチドが生産される場合の時は、グリ
カン構造を基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少するこ
となく、残りの所望の糖を付加することのみが必要である。したがって場合により、さら
なる糖を結合したトリマンノシルコア構造を有するグリカン構造を有するペプチドは、改
造の適当な出発原料である。
基本的なトリマンノシルコア糖ペプチドの単離
本発明の基本的なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4糖ペプチドは、必
要ならばペプチド精製の分野で周知な技術を使用して単離し、そして精製することができ
る。適当な技術にはクロマトグラフィー技法、等電点電気泳動技法、超遠心技法等を含む
。そのような任意の技法を使用して、本発明の組成物を調製することができ、ここで本発
明の糖ペプチドは通常、細胞培養基内に見いだされる他のペプチドおよび他の成分から単
離されている。精製の程度は例えば他のペプチドに関して90%または95%、あるいは
一層高い、例えば98%となり得る。例えばDeutscher et al.(編集、
1990、ペプチド精製に対する手引き(Guide to Peptide Puri
fication)、Harcourt Brace Jovanovich、サンディ
エゴ)を参照にされたい。
通常、所望の糖ペプチドを生産するために修飾することができる少ない割合の標的糖ペプ
チドを単離することを可能にするだけである。本発明では、大量の基本的なトリマンノシ
ルコア糖ペプチドおよびMan3GlcNAc4グリカンを含む他の所望する糖ペプチド
を生産することができ、次いでこれらはさらに修飾されて所望するグリコシル化を有する
大量のペプチドを生成することができる。
するレクチンを使用して達成することができる。そのような技術は糖生物学の分野では周
知である。
構造が生成されれば、次いでこのグリカン構造は哺乳動物において改善された治療的使用
を有する望ましいグリコシル化を有するペプチドを生成するためにインビトロで改造され
ることである。哺乳動物は任意の適当な種でよく、そして好ましくはヒトである。
法および組成物が、以下の開示から明らかになるだろう。
の治療的利益を無効にするというよりは促進するグリカン構造を含んでなるべきであると
いうことである。本明細書を通して開示するように、細胞中で生産されるペプチドは、所
望のグリコシル化を有し、こうして哺乳動物での治療的使用に適するペプチドが生成する
ように、グリカン上に存在すべきではない糖の開裂およびグリカン上に存在すべき糖の付
加を触媒する種々の酵素を用いて、インビトロで処理されることができる。細胞中でペプ
チドの種々のグリコ形の生成は、上に記載する。所望するグリコシル化を有するペプチド
生成の様々なメカニズムをこれから記載し、ここで出発原料、すなわち細胞により生産さ
れるペプチドは細胞型毎に異なってもよい。本開示から明らかになるように、出発原料は
そのグリカン組成に関して単一である必要はない。しかし出発原料は、大量の最終産物、
すなわち正しくグリコシル化されたペプチドが生産されるために、ある一定のグリコ形に
ついて豊富にすることが好ましい。
よび合成反応(event)には、ある点で基本的なトリマンノシルコア構造またはMa
n3GlcNAc4構造をペプチド上に生成することを含む。
修飾した糖をペプチドの少なくとも1つの選択したグリコシル残基に結合させる。本態様
は例えば、修飾された糖を、ペプチド上には存在しないか、または望ましい量で存在しな
いいずれかの選択したグリコシル残基に結合させることが望ましい時に有用である。この
ように修飾された糖をペプチドにカップリングさせる前に、選択したグリコシル残基を酵
素または化学的カップリングによりペプチドに結合させる。別の態様ではペプチドのグリ
コシル化パターンは、ペプチドから炭水化物残基を除去することにより修飾された糖の結
合前に改変させる。例えば国際公開第98/31826号パンフレットを参照にされたい
。
に行う。化学的な脱グリコシル化は好ましくはペプチド変異体を化合物であるトリフルオ
ロメタンスルホン酸または均等な化合物に暴露することにより行われる。この処理は連結
糖(N−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン)を除くほとんどすべ
ての糖の開裂をもたらすと同時に、ペプチドは完全なままである。化学的な脱グリコシル
化は、Hakimuddin et al/.1987,Arch.Biochem.B
iophys.259:52およびEdge et al.,1981,Anal.Bi
ochem.118:131に記載されている。ペプチド変異体上の炭水化物部分の酵素
的開裂は、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により、Thotaku
ra et al.,1987,Meth.Enzymol.138:350に記載され
ているように行うことができる。
分の酵素的付加は好ましくは本明細書に説明する方法の変法を使用して行い、天然のグリ
コシル単位を本発明で使用する修飾された糖に置換する。糖部分を付加する他の方法は、
米国特許第5,876,980号、同第6,030,815号、同第5.728,554
号および同第5,922,577号明細書に開示されている。
よびO−結合グリコシル化の部位;(b)グリコシルスランスフェラーゼの受容体である
末端グリコシル部分;(c)アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン;(d)遊離カ
ルボキシル基;(e)システインのもののような遊離スルフヒドリル基;(f)セリン、
トレオニンまたはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基;(g)フェニ
ルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもののような芳香族残基;あるいは(h)
グルタミンのアミド基を含む。本発明での使用法の例は、1987年9月11日に公開さ
れた国際公開第87/05330号パンフレットおよびAplin and Wrist
on CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259−306(1981
)に記載されている。
を生産するためのインビトロ酵素反応の順序に関する説明をこれから与える。以下に開示
する各酵素転換の正確な反応条件は糖生物学の当業者には周知であり、故にここでは繰り
返さない。このような種類の反応に関する反応条件の総説は、Sadler et al
.,1982,Methods in Enzymology83:458−514およ
びそれに引用されている文献を参照にされたい。
本的なトリマンノシルコア構造をGnT−I、続いてGnT−II、そしてさらにGnT
−III、およびUDP−GlcNAcを含んでなる糖供与体の存在下でインキューベー
ションすることにより、バイセクティングGlcNAcを有する完全なグリカン構造に転
換することが可能であり、ここでGlcNAcは順次、基本的なトリマンノシルコア構造
に付加されてバイセクティングGlcNAcを有するトリマンノシルコアを生成する。
クトースおよびN−アセチルノイラミン酸を含んでなる複雑なグリカン構造への転換を示
す。バイセクティングGlcNAcを含むトリマンノシルコアグリカンを最初にガラクト
シルトランスフェラーゼおよび供与体分子としてUDP−Galとインキューベーション
し、ここで2個のガラクトース残基が分子上の周辺GlcNAc残基に加えられる。次い
で酵素NeuAc−トランスフェラーゼを使用して2個のNeuAc残基を1から各ガラ
クトース残基に加える。
を示す。高マンノースグリカン(Man9)はマンノシダーゼ1の存在下で順次インキュ
ーベーションされて、Man5構造を生成し、そして次にマンノシダーゼ3の存在下でイ
ンキューベーションされて、すべて、しかし3個のマンノース残基を残してグリカンから
除去される。あるいはMan9構造のインキューベーションは、単にマンノシダーゼ3の
存在下でのインキューベーションによりトリマンノシルコア構造のみに戻し改作されても
よい。上記図2および4に提示するスキームに従い、次にこの基本的なトリマンノシルコ
アグリカンの複雑なグリカン分子への転換が可能である。
物細胞がGnT−I酵素活性を欠く時、キシロースおよびフコースはグリカンに付加され
ることはできないことに注目することが重要である。すなわちGnT−Iノック−アウト
細胞の使用は、これらの細胞がどのような「戻し改作」反応を行うことなくさらなる糖を
付加することができる基本的なトリマンノシルコアを有するペプチドを生産する点で本発
明に特定の利点を提供する。同様に、植物細胞中で生産される構造がグリカンのMan5
変形物であり、GnT−Iがこれらの細胞に存在しなければ、キシロースおよびフコース
はこの構造に付加されることができない。この場合、マンノシダーゼ3を使用してMan
5構造を基本的なトリマンノシルコア(Man3)に戻し改作することができる。本明細
書に提供する方法に従い、今、所望する糖部分をトリマンノシルコアに付加して所望する
グリカン構造を生成することが可能である。
に、例えばフコースのようなさらなる糖も存在する。さらにここでは示さないが、昆虫細
胞は9個ものマンノース残基を有する高マンノースグリカンを生産することができ、そし
てそれに結合したさらなる糖を含むかもしれない。昆虫細胞ではGnT−Iノックアウト
細胞がフコース残基をグリカンに付加することを妨げる場合もある。このように昆虫細胞
中でのペプチドの生産は、好ましくはGnT−Iノックアウト細胞で達成される。このよ
うにして生産されたグリカンは、次いで必要ならば本明細書に記載する任意の方法および
スキームを使用してインビトロで戻し改作されることができ、そしてさらなる糖を本明細
書に提供する方法およびスキームを使用してインビトロでそれらに加えてもよい。
残基を含まない複雑な炭水化物グリカン構造から基本的なトリマンノシルコア構造のイン
ビトロの酵素的生成を示す。またそれらからのバイセクティングGlcNAcを含むグリ
カン構造の生成を示す。生産することができる幾つかの中間体グリカン構造を示す。これ
らの構造は細胞により生産されることができ、あるいは本明細書に記載するインビトロ戻
し改作反応で生産されることができる。糖部分はインビトロで基本的なトリマンノシルコ
ア構造に、または所望するグリカンを生産するために任意の適当な中間体構造に付加する
ことができる。
に行うことができる一連の可能なインビトロ反応を示す。例えばMan9グリカンはマン
ノシダーゼ1を使用して改作してMan5グリカンを生成するか、あるいはこれはマンノ
シダーゼ3または1以上の微生物マンノシダーゼを使用してトリマンノシルコアに改作し
てもよい。次いでGnT−IおよびまたはGnT−IIを使用してさらなるGlcNAc
残基をグリカンに転移することができる。さらにグリカン分子がGnT−Iを持たない細
胞中で生産される時には起こらない状況を示す(影を付けた箱を参照にされたい)。例え
ばフコースおよびキシロースは、GnT−Iが活性であり、そしてGlcNAcの分子へ
の転移を促進する時にのみグリカンに付加され得る。
アンテナグリカン構造を合成するための周知法を表す。本発明の方法に従い、これらの各
構造は糖生物学の分野で周知の適切な酵素および反応条件を使用して、インビトロで合成
することが可能である。
を合成するためのスキームを示す。例えばシアリル化されていてもいなくてもよいルイス
xおよびルイスa抗原構造をインビトロで生産するためのスキームを示す。そのような構
造はペプチド上に存在する時、免疫応答をアップレギュレート(upregulatin
g)またはダウンレギュレート(downregulating)するために免疫学的な
利点をペプチドに付与することができる。さらにそのような構造は、これらの構造の型が
細胞接着ペプチド等への結合に関与するので、ペプチドを特異的な細胞に標的化するため
にも有用である。
例示スキームである。
である。コア構造は点線で囲む。この構造に含むことができる糖には、ガラクトース残基
に加えられたシアル酸残基およびGlcNAc残基に加えられたフコース残基を含む。
cNAc4構造が結合する単離および精製された糖ペプチドを提供し、この糖ペプチドを
グリコシルトランスフェラーゼ酵素およびグリコシル部分を有する供与体分子と、グリコ
シル部分を糖ペプチドに転移させるために適する条件下で接触させることにより、N−結
合グリコシル化糖ペプチドを作成する方法を提供する。次に所望のグリコシル化パターン
を有するペプチドを生産するためのトリマンノシルコア糖ペプチドまたはMan3Glc
NAc4糖ペプチドのカスタマイズ化が、当該技術分野で周知の技術を使用して所望の糖
部分の順次付加により達成される。
グリカン1次構造の決定
N−結合糖ペプチドが細胞により生産される時、本明細書のいたるところで記載するよ
うに、これは他の糖部分をそれに付加する前に共通の、一般的には基本的なトリマンノシ
ルコアまたはMan3GlcNAc4構造に減少されなければならないグリカン構造の異
種の混合物を含んでなるかもしれない。どの糖を特定のグリカン構造から除去するべきで
あるかを正確に決定するために、1次グリカン構造を同定することが必要となる場合があ
る。グリカンの1次構造を決定するための技術は当該技術分野では周知であり、そして例
えばMontreuil、「糖ペプチドの構造および生合成(Structure an
d Biosynthesis of Glycopeptides)」、医学的応用に
おける多糖(Polysaccharides in Medicinal Appli
cations)、第273〜327頁、1996、Severian Damitri
u編集、マルセルデッカー、ニューヨーク州、に詳細に記載されている。したがって糖生
物学の分野の当業者には、細胞により生産されたペプチド群を単離し、そしてそれに結合
しているグリカンの構造(1つまたは複数)を決定することは単純な事柄である。例えば
(i)加水分解、アセトリシス、ヒドラジン分解のような化学的開裂により、または亜硝
酸のデアミネーションによりいずれかでグリコシド結合を分解し(splitting)
;(ii)メチル化を完成し、続いて加水分解またはメタノリシスを行い、そして部分的
にメチル化された単糖のガス−液体クロマトグラフィーおよび質量分析を行い;そして(
iii)エキソグリコシダーゼを使用して単糖間のアノマー結合を決定し、これはまた順
次分解により1次グリカン構造の洞察も提供するための効率的な方法を利用することがで
きる。特に質量分析および核磁気共鳴(NMR)分光法の技術、特に高磁場NMRはグリ
カン1次構造を決定するために成功裏に使用されてきた。
気泳動(Fluorophore Assisted Carbohydrate El
ectrophoresis:FACE(商標))は、グリコ(Glyko)社(ノバト
、カリフォルニア州)から販売されている。FACE分析では、N−結合グリカンに関し
てはエンドHまたはN−グリカナーゼ(PNGaseF)のいずれかを用いて、あるいは
Ser/Thr結合グリカンに関してはヒドラジンを用いて、ペプチドから複合糖質が放
出される。次いでグリカンは還元末端でフルオロフォアにより非−構造識別様式で標識さ
れる。フルオロフォアで標識したグリカンは次いでポリアクリルアミドゲルでサッカリド
の荷電/質量比ならびに流体力学的容量に基づき分離される。像をUV光の下で取り、そ
してグリカンの組成は標準と比較した移動距離により決定される。オリゴ糖はエキソグリ
コシダーゼ消化によりサッカリドの順次除去による移動シフトを分析することにより、こ
の様式で配列決定することができる。
例示態様
N−結合グリコシル化の改造は、式1:
たはオリゴ糖残基であり;そして
a、b、c、d、eおよびxは(独立して選択された)0、1または2であるが、ただ
しa、b、c、d、eおよびxから選択される少なくとも1つの員は1または2である、
を参照にして最もよく説明される。
に共有結合しているグリカン構造を記載する。好適な発現系は、トリ−マンノシルコアを
含んでなるN−結合グリカンを含む外因性のペプチドを発現し、そして分泌する。本発明
の改造方法を使用して、これらペプチド上のグリカン構造は所望する任意のグリカン構造
に都合よく改造することができる。例示的な反応条件は、実施例および参考文献全体に見
いだされる。
される。グリカンの構造は中でもペプチドの生物学的活性を強化し、ペプチドに新しい生
物活性を与え、ペプチドの生物学的活性を除去し、またはとりわけ天然のペプチドのグリ
コシル化パターンにより良く近づけるために選択することができる。
のグリコシル化パターンにより良く近づける。この態様では、式1に記載するグリカン構
造は以下の部分:
X3およびX5=|−GlcNAc−Gal−SA;
aおよびc=1;
d=0または1;
b、eおよびx=0
を有するように改造される。
カン構造をこの立体配置に改造することにより、ペプチドはとりわけヒト患者中での免疫
原性が低くなり、かつ/またはより安定となる。
クティングGlcNAc残基を有するように改造される。この態様では、式1に記載する
グリカン構造は以下の部分:
X3およびX5は|−GlcNAc−Gal−SA;
aおよびc=1;
X4がGlcNAcであり;
b=1;
d=0または1;
eおよびx=0
を有するように改造される。
−媒介型細胞傷害性を含む時、Fcドメインに結合したバイセクティングオリゴ糖の存在
が抗体−依存性の細胞傷害性を著しく増すことが知られている。
うに改造される。この態様では、式1に記載するグリカン構造は以下の部分:
X3およびX5は
a、c、d=1;
b、eおよびx=0;
X6=フコース
を有するように改造される。
ることを意図する時に特に有利である。
。この結合部分は、とりわけPEG分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい。こ
の態様では、式1に記載するグリカン構造は以下の部分:
X3およびX5は|−GlcNAc−Gal−SA−R;
aおよびc=1または2;
d=0または1;
b、d、eおよびx=0;
ここでR=結合基
を有するように改造される。
ってこの態様はペプチドを、患者の血流からペプチドの排除を遅らせるPEG分子に、両
ペプチドを特異的組織または細胞を標的とさせるペプチドに、あるいは相補的な治療的使
用の別のペプチドに結合させるために有用である。
好適態様は本発明の改造方法により作成することができる多くの有用なグリカン分子のわ
ずか2〜3である。当業者は他の有用なグリカンをどのように設計するかを知っているだ
ろう。
ズハムスター卵母細胞系)で発現させる。N−結合グリカンの共通(consensus
)部位を持つペプチドがCHO細胞から発現され、そして分泌される時、N−結合グリカ
ンは図3の上段に表す構造を有する。これらすべての構造が存在することができるが、断
然最も多くの構造は右側の2つである。式1の用語において、
X3およびX5は|−GlcNAc−Gal−(SA)であり;
aおよびc=1;
b、d、eおよびx=0
である。
、ペプチドをガラクトース受容体分子およびシアル酸供与体分子に特異的であるグリコシ
ルトランスフェラーゼと接触させることにより、好適なヒト化グリカンに改造する。この
工程を図3および実施例2で具体的に説明する。別の例示態様では、CHO細胞から発現
され、そして分泌されるペプチドのN−結合グリカンを、好適なPEG化構造に改造する
。ペプチドを最初にシアル酸に特異的なグリコシダーゼと接触させて末端SA部分を除去
し、そして次いでガラクトース受容体部分およびシアル酸受容体部分に特異的であるグリ
コシルトランスフェラーゼとPEG−シアル酸−ヌクレオチド供与体分子の存在下で接触
させる。場合によりペプチドは次いでガラクトース受容体部分およびシアル酸受容体部分
に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼと、シアル酸−ヌクレオチド供与体分子の
存在下で接触させて、すべてのグリカン分子の完全なSAキャッピングを確実とする。
な昆虫細胞中で発現させる。N−結合グリカンと共通部位を持つペプチドがSF−9細胞
から発現され、そして分泌される時、N−結合グリカンは図7の上段に表す構造を有する
。式1の用語において:
X3およびX5は|−GlcNAcであり;
aおよびc=0または1;
b=0;
X6はフコースであり;
d=0、1または2;そして
eおよびx=0
である。
在し、そして時折、アンテナGlcNAcおよび/またはフコース残基(1つまたは複数
)も存在する。1つの例示態様では、昆虫細胞から発現され、そして分泌されるペプチド
のN−結合グリカンは、最初にグリカンをフコース分子に特異的なグリコシダーゼと接触
させ、次いでグリカンをトリマンノースコアの各アンテナ上のマンノース受容体分子、G
lcNAc供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Gl
cNAc分子の存在下で接触させ;次いでグリカンをGlcNAc受容体分子、Gal供
与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Gal分子の存在
下で接触させ;そして次にグリカンをガラクトース受容体分子、シアル酸供与体分子に特
異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−SA分子の存在下で接触させる
ことにより好適なヒト化グリカンに改造される。当業者は存在するならばフコース分子は
この方法の任意の時点で除去できると考えるだろう。別の例示態様では、前例のヒト化グ
リカンはグリカンをGlcNAc受容体分子、フコース供与体分子に特異的なグリコシル
トランスフェラーゼとヌクレオチド−フコース分子の存在下で接触させることにより、シ
アリル化ルイスXグリカンにさらに改造する。この工程は図10および実施例3で具体的
に説明する。
セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母で発
現させる。N−結合グリカンの共通部位を持つペプチドがS.セルビシエ(cerevi
siae)細胞から発現され、そして分泌される時、N−結合グリカンは図5の左に表す
構造を有するだろう。N−結合グリカンは常にトリマンノシルコアを有し、これはしばし
ばマンノースまたは関連する多糖を用いて1000残基まで合成される。式1の用語にお
いて、
X3およびX5=|−Man−Man−(Man)0−1000;
aおよびc=1または2;
b、d、eおよびx=0
である。
リカンは、最初にグリカンをα2マンノース分子に特異的なグリコシダーゼと接触させ、
次にグリカンをα6マンノース分子に特異的なグリコシダーゼと接触させることにより、
基本的なトリマンノースコアに改造される。この工程を図5および実施例6で具体的に説
明する。別の例示態様では、N−結合グリカンは、基本的なトリマンノースコアグリカン
をトリマンノースコアの各アンテナ上のマンノース受容体分子、GlcNAc供与体分子
に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−GlcNAc分子の存在下
で接触させ;次いでグリカンをトリマンノースコアの真ん中のマンノース受容体分子、G
lcNAc供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Gl
cNAc分子の存在下で接触させ;次いでグリカンをGlcNAc受容体分子、Gal供
与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Gal分子の存在
下で接触させ;そして次にグリカンをガラクトース受容体分子、シアル酸供与体分子に特
異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−SA分子の存在下で接触させる
ことにより、Fc媒介型の細胞毒性機能を持つ組換え抗体に適するグリカンを作成するた
めにさらに改造される。
この工程は図2、3および4で具体的に説明する。
(E.coli)細胞で発現させる。N−結合グリカンの共通部位を持つペプチドが(E
.coli)細胞で発現する時、N−結合共通部位はグリコシル化されない。例示態様で
は、ヒト化グリカン分子はペプチドをN−結合共通部位およびGlcNAc供与体分子に
特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチドGlcNAcの存在下で接触さ
せ;そしてさらに成長しているグリカンを受容体および供与体部分に特異的なグリコシル
トランスフェラーゼと、必要な供与体部分の存在下で所望のグリカン構造が完成するまで
順次接触させることにより、ペプチド骨格から構築される。N−結合グリカンを持つペプ
チドが真核細胞で発現するが、新生ペプチドをゴルジ装置に向ける正しいリーダー配列が
無い時、成熟ペプチドはグリコシル化されないらしい。この場合もペプチドは前述のペプ
チドN−結合共通部位から構築することにより、N−結合グリコシル化を与えることがで
きる。タンパク質が糖部分を用いて化学的に修飾される時、タンパク質を前述のように構
築することができる。
ないことを意味している。当業者は各例で取られる工程が状況によっては異なる順序で行
われ、同じ結果を得ることができると考えるだろう。また当業者は、異なる工程の組が同
じ生成グリカンを生産することもできると理解するだろう。好適な改造されたグリカンは
ペプチドが発現される発現系に対して全く特異的では無いと理解するだろう。改造された
グリカンは単に具体的説明であり、そして当業者は本明細書に具体的には記載していない
グリカンを作成するために、これらの例からどのように原理を取り出し、そしてそれらを
種々の発現系で生産されるペプチドに応用するかを知っている。
B.O−結合グリカンの改造方法
O−グリコシル化は種々の単糖がO−グリコシド結合でヒドロキシアミノ酸へ結合して
いることが特徴である。O−グリコシル化は動物および植物界で広く行き渡った翻訳後修
飾である。タンパク質にO−結合したグリカンの構造的複雑さは、N−結合グリカンのそ
れをはるかに越える。新たに翻訳されたペプチドのセリンまたはトレオニン残基は、ペプ
チドのGalNAcトランスフェラーゼによりゴルジのシスからトランス区画で修飾され
るようになる。O−グリコシル化の部位はグリコシルトランスフェラーゼの配列特異性に
より決定されだけでなく、異なる基質部位間の競合およびグリカンを形成する原因となる
他のグリコシルトランスフェラーゼとの競合により媒介される後成的調節によっても決定
される。
に定義された。O−結合グリカンの「コア」領域はペプチドに近いグリカン鎖の最も内側
の2または3つの糖である。骨格領域は単一な延長により形成されたグリカン鎖の長さに
主に貢献している。周辺領域は高度な構造の複雑性を現す。O−結合グリカンの構造的複
雑さはコア構造から始まる。多くの場合で、O−結合グリカン共通部位に加えた第1の糖
残基はGalNAcであり;しかし糖は中でもGlcNAc、グルコース、マンノース、
ガラクトースまたはフコースでもよい。図11は既知のO−結合グリカンコア構造および
それらのインビボ合成の原因となる酵素の図解である。
ア−α−GalNAc残基に基づく。図12に表す4つのコア構造が最も一般的である。
コア1およびコア2は哺乳動物細胞で最も豊富な構造であり、そしてコア3およびコア4
はより限定された、器管−特徴的発現系で見いだされる。O−結合グリカンはMontr
euil、糖ペプチドの構造および合成(Structure and Synthes
is of Glycopeptides)、医学的応用における多糖(Polysac
charides in Medicinal Applications)で、第27
3−327頁、1996、Severian Damitriu編集、マルセルデッカー
、ニューヨーク州、およびSchachter and Brockhausen、分岐
O−結合グリカンの生合成(The Biosynthesis of Branche
d O−Linked Glycans)、1989、実験生物学会、第1〜26頁(英
国)で総説されている。
載したものに類似の技術を使用して改造できることは明らかであろう。O−グリカンはア
スパラギン残基ではなくセリンまたはトレオニン残基に結合している点でN−グリカンと
は異なる。N−グリカンの改造に関して本明細書に記載するように、加水分解酵素を使用
してO−結合グリカン中の望ましくない糖部分を開裂し、そして次にさらに望ましい糖を
それらに付加して、カスタマイズされたO−グリカン構造をペプチド上に構築することが
できる(図11および12を参照にされたい)。
チド特異性を有する少なくとも11種の既知のα−N−アセチルガラクトサミニルトラン
スフェラーゼの任意のファミリーを使用したN−アセチルガラクトサミン(GalNAc
)の結合である。一般に各酵素により認識される受容体ペプチドは少なくとも10個のア
ミノ酸の配列を構成する。1つの特定のGalNAc−トランスフェラーゼにより認識さ
れるアミノ酸配列を含むペプチドは、それらがこの酵素を発現している細胞中で発現し、
そしてそれらがUDP−GalNAcも存在するゴルジ装置に適切に局在するならば、こ
の受容体部位でO−グリコシル化されるようになる。
い。発現している細胞に天然なα−N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ酵
素は、組換えペプチドが発現している細胞とは異なる共通配列特異性を有するかもしれな
い。
菌細胞できる発現させることができる。これらの場合、最初のGalNAc部分をインビ
トロで付加することが有利である。GalNAc部分は、いったん組換えペプチドが可溶
性の状態で回収されれば、ペプチドを適切なGalNAcトランスフェラーゼとUDP−
GalNAcの存在下で接触させることによりインビトロでペプチドに導入することがで
きる。
さらなる配列が存在し得る。そのようなアミノ酸配列はペプチドのコード配列に対する枠
内で融合したDNA配列によりコードされるか、または化学的手段により導入してもよい
。あるいはペプチドはグリカン鎖を欠いているかもしれない。場合によりペプチドはN−
および/またはO−結合グリカン鎖を有することができるが、例えばさらなるグリカン置
換を望む時、さらなるグリコシル化部位が必要である。
の天然なGalNAc受容体配列である)を融合タグとして加える。次いで融合タンパク
質は大腸菌(E.coli)中で発現し、そして精製される。次いでペプチドを組換えヒ
トGalNAc−トランスフェラーゼT3またはT6と、UDP−GalNAcの存在下
で接触させてGalNAc残基をペプチドにインビトロで転移させる。
細書に記載した方法を使用してさらに延長することができる。あるいはGalNAcトラ
ンスフェラーゼ反応は、O−3、4または6位あるいはN−2位でPEGに共有的に置換
されるUDP−GalNAcの存在下で行うことができる。複合糖質化(Glycoco
njugation)は本明細書のいたるところで詳細に記載する。新たなペプチド配列
によりペプチドに導入される抗原性は、結合するグリカンのPEG化により都合よく遮蔽
することができる。受容体部位融合技術はPEG部分を導入するだけでなく、限定するわ
けではないがトキシン、抗−感染剤、細胞傷害剤、放射性核種のキレーターおよび組織タ
ーゲッティングのような他の官能性を有するグリカンを含む他のグリカンおよび非−グリ
カン部分を導入するためにも使用することができる。
例示態様
O−結合グリコシル化の改造は、式2を参照にして最もよく具体的に説明される:
GalNAcを含んでなるグリカン構造を記載する。この構造はO−結合グリカンの最も
普通の形態を具体的に説明するために使用するが、本発明はこれらO−結合グリカンに単
に限定されると解釈されるべきではない。O−結合グリカンの他の形態は図11に具体的
に説明する。本発明に有用な好適な発現系は、GalNAc残基を含んでなるO−結合グ
リカンを有する外因性ペプチドを発現し、そして分泌する。本発明の改造方法を使用して
、これらペプチド上のグリカン構造は所望する任意のグリカン構造を生成するために都合
よく改造することができる。当業者はいったん本開示から着手すれば、当該技術分野で利
用可能なものと同じ原理、酵素および反応条件を使用してO−結合グリカンを改造できる
と考えるだろう。例示的な反応条件は、実施例中に見いだされる。
造される。グリカンの構造は中でもペプチドの生物学的活性を強化し、ペプチドに新しい
生物活性を与え、ペプチドの生物学的活性を除去または改変させ、または天然のペプチド
のグリコシル化パターンにより良く近づけるために選択することができる。
のグリコシル化パターンにより良く近づける。この態様では、式2に記載するグリカン構
造が以下の部分:
X2は|−SA;または|−SA−SAであり;
fおよびn=0または1;
X10はSAであり;
m=0
を有するように改造される。
カン構造をこの立体配置を有するように改造することにより、ペプチドはヒト患者中での
免疫原性が低くなり、かつ/またはより安定となる。
に改造される。この態様では、式2に記載するグリカン構造が以下の部分:
X2は|−SAであり;
X10はFucまたは|−GalNAc(Fuc)−Gal−SAであり;
fおよびn=1;
m=0
を有するように改造される。
している時に最も効果的である時、特に有利である。
れる。この結合部分は、とりわけPEG分子、他のペプチド、薬剤のような低分子でよい
。この態様では、式2に記載するグリカン構造が下の部分:
X2は|−SA−Rであり;
f=1;
nおよびm=0
ここでRは結合基である
を有するように改造される。
プチドを特異的組織または細胞を標的とさせるペプチドに、あるいは相補的な治療的使用
の別のペプチドに結合させるために有用である。
好適態様は本発明の改造方法を使用して作成することができる多くの有用なグリカン分子
のわずか2〜3である。当業者はいったん本発明から着手すれば他の有用なグリカンをど
のように設計するかを知るだろう。
ズハムスター細胞系)で発現させる。O−結合グリカンの共通部位を持つペプチドがCH
O細胞から発現され、そして分泌される時、O−結合グリカンの大部分が式2の用語にお
いて、
X2=|−SA;
f=1;
mおよびn=0
である構造を有することが多い。
めに改造を必要としない。別の例示態様では、CHO細胞から発現され、そして分泌され
るペプチドのO−結合グリカンは、グリカンをGalNAc受容体部分およびフコース供
与体部分に特異的であるグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−フコースの存
在下で接触させることにより、シアリル化ルイスX構造を含むように改造される。この工
程は図10および実施例3でN−結合グリカンに関して具体的に説明している。
胞中で発現させる。O−結合グリカンの共通部位を持つペプチドがほとんどのsf9細胞
から発現され、そして分泌される時、O−結合グリカンの大部分は式2の用語において、
X2=H;
f=0または1;
nおよびm=0
である構造を有する。
51−159)を参照にされたい。1つの例示態様では、昆虫細胞で発現されるペプチド
上のO−結合グリカンは、グリカンをGalNAc受容体分子およびガラクトース供与体
分子に特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Galの存在下で接触
させ;そして次にグリカンをGal受容体分子およびSA供与体分子に特異的なグリコシ
ルトランスフェラーゼとヌクレオチド−SAの存在下で接触させることにより、ヒト化グ
リカンに改造される。別の例示態様では、O−結合グリカンをさらにヒト化形態から、グ
リカンをさらにGalNAc受容体分子およびフコース供与体分子に特異的なグリコシル
トランスフェラーゼと、ヌクレオチド−フコースの存在下で接触させることにより、シア
リル化ルイスX形態に改造する。
S.セルビシエ(cerevisiae)細胞で発現させる。O−結合グリカンの共通部
位を持つペプチドがS.セルビシエ(cerevisiae)細胞から発現され、そして
分泌される時、ほとんどのO−結合グリカンは構造:
|−AA−Man−Man1−2
を有する。Gemmill and Trimble(1999,Biochim.Bi
ophys.Acta 1426:227−237)を参照にされたい。このようなO−
結合グリカンをヒトでの使用に改造するために、グリカンをアミノ酸レベルで開裂し、そ
してここから再構築することが好ましい。
であり、そしてグリカンをアミノ酸−GalNAc結合に特異的なエンドグリコシダーゼ
と接触させ;そして次いでグリカンをO−結合共通部位およびGalNAc供与体分子に
特異的なグリコシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−GalNAcの存在下で接触
させ;グリカンをGalNAc受容体分子およびガラクトース供与体分子に特異的なグリ
コシルトランスフェラーゼと、ヌクレオチド−Galの存在下で接触させ;そして次にグ
リカンをGal受容体分子およびSA供与体分子に特異的なグリコシルトランスフェラー
ゼと、ヌクレオチド−SAの存在下で接触させることにより、ヒト化グリカンに改造する
。
であり、そしてグリカンをタンパク質O−マンノースβ−1,2−N−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ(POMGnTI)と、GlcNAc−ヌクレオチドの存在下
で接触させ;次いでグリカンをヌクレオチド−Galの存在下でガラクトシルトランスフ
ェラーゼと接触させ;そして次にグリカンをヌクレオチド−SAの存在下でシアリルトラ
ンスフェラーゼと接触させることによりヒト化グリカンに改造する。
(E.coli)細胞で発現させる。O−結合グリカンの共通部位を持つペプチドが(E
.coli)細胞で発現する時、O−結合共通部位はグリコシル化されない。この場合、
所望するグリカン分子は上記のS.セルビシエ(cerevisiae)について記載し
た様式に準じて、ペプチド骨格から構築しなければならない。さらにO−結合グリカンを
有するペプチドが新生ペプチドをゴルジ装置に向けるための正しいリーダー配列無しで真
核細胞で発現する時、成熟ペプチドはグリコシル化されないらしい。この場合もO−結合
グリコシル構造は、グリカンをペプチドO−結合共通部位から直接構築することによりペ
プチドに加えることができる。さらにタンパク質が糖部分を用いて化学的に修飾される時
、タンパク質は前述のように改造される。
ないことを意味している。当業者は同じ結果を得るために各例で取られる工程を状況によ
っては異なる順序で行うことができると考えるだろう。また当業者は異なる工程の組が同
じ生成グリカンを生産することもできると理解するだろう。さらに好適な改造されたグリ
カンはペプチドが発現する発現系に対して全く特異的では無いと理解するだろう。改造さ
れたグリカンは単に具体的説明であり、そして当業者は本明細書に具体的には記載してい
ないグリカンを作成するために、これらの例からどのように原理を取り出し、そしてそれ
らを異なる発現系で生産されるペプチドに応用するかを知っている。
C.複合糖質化(Glycoconjugation)、総論
本発明はグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの結合物の調製法を提供する。本
発明の結合物はペプチドと水溶性ポリマー、治療部分、診断部分、標的部分等のような多
様な種との間で形成される。また提供されるのはリンカーアーム(linker arm
)を介して一緒に連結された2以上のペプチドを含む結合物、すなわち多機能性結合物(
multifunctional conjugate)である。本発明の多機能性結合
物は、同じペプチドの2以上のコピー、または異なる構造および/または特性を持つ多様
なペプチドの集合を含むことができる。
素的結合により形成される。修飾された糖はペプチドと糖上の修飾基との間に挿入された
時、本明細書でのいわゆる「完全なグリコシル連結基」となる。グリコシルトランスフェ
ラーゼのような酵素の優れた選択性を使用して、本方法は1以上の特異的な位置に所望す
る基を持つペプチドを提供する。すなわち本発明に従い、修飾された糖はペプチド鎖上の
選択された位置に直接結合させられるか(attached)、あるいは修飾された糖は
ペプチドの炭水化物部分につけられる(appended)。修飾された糖がペプチド炭
水化物に、およびペプチド骨格のアミノ酸残基に直接、両方で結合したペプチドも本発明
の範囲内である。
に、本発明の方法はペプチドおよび実質的に均一な誘導化パターンを有する糖ペプチドを
集成させることが可能であり;本発明で使用する酵素は、一般にペプチドの特定のアミノ
酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせに選択的である。この方法はまた修飾されたペプ
チドおよび糖ペプチドの大規模生産にも現実的である。このように本発明の方法は前以て
選択された実質的に単一な誘導化パターンを有するペプチドの大規模調製のための現実的
手段を提供する。この方法は限定するわけではないが、細胞培養細胞(例えば哺乳動物細
胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、酵母細胞または原核細胞)またはトランスジェニッ
ク植物または動物中での生産中に不完全にグリコシル化されたペプチドを含め、治療用ペ
プチドの修飾にも特によく適している。
る取り込み率の低下により、上昇した治療的半減期を有するグリコシル化および非グリコ
シル化ペプチドの結合物も提供する。さらに本発明の方法はペプチド上の抗原決定基を遮
蔽するための手段を提供し、これがペプチドに対する宿主免疫応答を下げるか、または排
除する。標的剤の選択的結合を使用して、ペプチドを特定の標的剤に特異的な特定の組織
または細胞表面レセプターを標的とするためにも使用できる。さらに治療部分を用いて特
異的に修飾された種類のペプチドを提供する。
1.結合物(conjugate)
第1の観点では、本発明はペプチドと選択部分との間に結合物を提供する。ペプチドと
選択部分との間の連結には、ペプチドと選択部分の間に挿入された完全なグリコシル連結
基を含む。本明細書で検討するように、選択部分は、サッカリド単位に結合することがで
きる本質的には任意の種であり、ペプチドに修飾された糖を付ける適切なトランスフェラ
ーゼ酵素により認識される「修飾された糖」を生じる。修飾された糖のサッカリド成分は
、ペプチドと選択部分との間に挿入された時、「完全なグリコシル連結基」となる。この
グリコシル連結基は、選択部分を用いた修飾後に適切なトランスフェラーゼの基質となる
単−またはオリゴ糖から形成される。
または正の整数である、
に相当する。「作用物質(agent)」は治療薬、生物活性剤、検出可能な標識、水溶
性部分等である。この「作用物質」はペプチド、例えば酵素、抗体、抗原等であることが
できる。リンカーは任意の広い配列の上記連結基であることができる。あるいはリンカー
は単結合または「ゼロ次リンカー(zero order linker)」でもよい。
ペプチドの同一性には限界がない。ペプチドの例を図1に提供する。
連結基を介してペプチドに共有結合する。グリコシル連結基はペプチド上のアミノ酸残基
またはグリコシル残基のどちらかに共有結合する。あるいはグリコシル連結基は糖ペプチ
ドの1以上のグリコシル単位に結合する。本発明はグリコシル連結基がアミノ酸残基およ
びグリコシル残基の両方に結合した結合物も提供する。
に加えて、本発明はそれらの置換パターンが高度に均一な結合物を提供する。本発明の方
法を使用して、本発明の結合物群の全域で本質的にすべての修飾された糖部分が、構造的
に同一のアミノ酸またはグリコシル残基の複数のコピーに結合しているペプチド結合物を
形成することが可能である。すなわち第2の観点では、本発明は完全なグリコシル連結基
を介してペプチドに共有結合する水溶性ポリマー部分の群を有するペプチド結合物を提供
する。本発明の好適な結合物では、本質的に群の各員がグリコシル連結基を介してペプチ
ドのグリコシル残基に結合し、そしてグリコシル連結基が結合するペプチドの各グリコシ
ル残基は同じ構造を有する。
分の群を有するペプチド結合物も提供する。好適な態様では、本質的に水溶性ポリマー部
分群の各員が完全なグリコシル連結基を介してペプチドのアミノ酸残基に結合し、そして
完全なグリコシル連結基を結合して有する各アミノ酸残基は同じ構造を有する。
部分、トキシン部分等に結合した上記のものに類似する結合物を提供する。上に引用した
各部分は、低分子、天然ポリマー(例えばペプチド)または合成ポリマーであることがで
きる。
コシル連結基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリンに結合させられる(スキ
ーム1)。例えばPEGリンカーの1末端をトランスフェリンに結合する完全なシアル酸
リンカーで官能化し、そしてもう1端をIL−2に結合する完全なGalNAcリンカー
で官能化する。
リア由来神経栄養増殖因子(GDNF)に結合する。これらの態様では、各結合は上記の
ようにPEG部分の各末端に完全なグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してな
される。トランスフェリンはタンパク質を血液脳関門をわたって移動させる。
(例えばアンテナ構造)完全なグリコシル連結基を含むことができ、図13〜21を参照
にされたい。本発明の結合物はセリンまたはトレオニンから始まるO−結合グリカンであ
るグリコシル連結基も含む(図10)。このように本発明の結合物は、選択部分が単価の
グリコシル連結基を介してペプチドに結合している両方の種を含む。また本発明の範囲内
に含まれるのは、1より多くの選択部分が多価連結基を介してペプチドに結合している結
合物も含む。1以上のタンパク質を一緒に結合して、それらの生物物理的および生物学的
特性を利用することができる。
選択的に局在する結合物を提供する。例示態様では、標的剤はタンパク質である。タンパ
ク質の例にはトランスフェリン(脳、血液プール)、ヒト血清(HS)−糖タンパク質(
骨、脳、血液プール)、抗体(脳、抗体−特異的抗原を含む組織、血液プール)、凝固第
V−XII因子(損傷組織、凝血、ガン、血液プール)、血清タンパク質、例えばα−酸
性糖タンパク質、フェチュイン、α−胎児タンパク質(脳、血液プール)、β2−糖タン
パク質(肝臓、アテローム硬化症斑、脳、血液プール)、G−CSF、GM−CSF、M
−CSFおよびEPO(免疫刺激、ガン、血液プール、赤血球過剰生産、神経保護)、お
よびアルブミン(半減期の上昇)。
提供する。すなわちさらなる観点では、本発明は選択部分とペプチドとの間の共有結合物
を形成する方法を提供する。したがって本発明は本発明の結合物を身体の特定の組織また
は領域を標的とさせるための方法を提供する。
リコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間に形成される。ポリマー、治療部分また
は生体分子は、間に挿入され、そしてペプチドおよび修飾基(例えば水溶性ポリマー)の
両方を共有結合する完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合させる。この方法は
ペプチドを、修飾された糖および修飾された糖が基質であるグリコシルトランスフェラー
ゼを含む混合物と接触させることを含む。反応は修飾された糖とペプチドとの間に共有結
合を形成するために十分な条件下で行う。修飾された糖の糖部分は、好ましくはヌクレオ
チド糖、活性化糖およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない糖から選択される。
供する。連結基は任意の有用な構造であり、そして直−鎖および分岐鎖構造から選択する
ことができる。好ましくはペプチドに結合するリンカーの各末端には、修飾された糖(す
なわち新生の完全なグリコシル連結基)を含む。
一緒に連結される。この構築物は上記の絵で説明する一般構造と同じである。本明細書で
記載するように、本発明の構築物は2つの完全なグリコシル連結基(すなわちs+t=1
)を含む。2つのグリコシル基を含むPEGリンカーに焦点をあてているのは明瞭さを目
的とするものであり、そして本発明のこの態様でのリンカーアームの使用の同一性に限定
すると解釈されるべきではない。
第2のグリコシル単位を用いて官能化する。第1および第2のグリコシル単位は好ましく
は異なるトランスフェラーゼの基質であり、第1および第2ペプチドのそれぞれ第1およ
び第2グリコシル単位への直交(orthogonal)結合を可能とする。実際には(
グリコシル)1−PEG−(グリコシル)2リンカーを、第1ペプチドおよび第1グリコ
シル単位が基質である第1トランスフェラーゼと接触させ、これにより(ペプチド)1−
(グリコシル)1−PEG−(グリコシル)2を形成する。次いで第1トランスフェラー
ゼおよび/または未反応ペプチドを場合により反応混合物から除去する。第2ペプチドお
よび第2グリコシル単位が基質である第2トランスフェラーゼを、(ペプチド)1−(グ
リコシル)1−PEG−(グリコシル)2結合物に加え、(ペプチド)1−(グリコシル
)1−PEG−(グリコシル)2−(ペプチド)2を形成する。当業者は上記に概説した
方法が2より多くのペプチド間の結合物を、例えば分岐PEG、樹状物、ポリ(アミノ酸
)、多糖等の使用により形成するためにも応用できると考えるだろう。
分の各末端で完全なグリコシル連結基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリン
に結合される(スキーム1)。IL−2結合物は結合物のより大きな分子量サイズにより
、IL−2単独よりも上昇したインビボ半減期を有する。さらにIL−2のトランスフェ
リンへの結合は、結合物が脳を選択的に標的とするために役立つ。例えば、PEGリンカ
ーの1つの末端をCMP−シアル酸を用いて官能化し、そしてもう1端をUDP−Gal
NAcを用いて官能化する。リンカーはGalNAcトランスフェラーゼの存在下でIL
−2と合わせられ、リンカーアームのGalNAcの、IL−2上のセリンおよび/また
はトレオニン残基への結合を生じる。
つのリンカーとの間に結合物を形成することに限定されない。さらに当業者はペプチドを
含むPEG(または他の)リンカーの末端で完全なグリコシル連結基を官能化する反応が
、同じ反応槽中で同時に起こることができるか、あるいはそれらの反応は段階的様式で行
うことができると考えるだろう。反応を段階的様式で行う時、各段階で生成される結合物
は任意に1以上の反応成分(例えば酵素、ペプチド)から精製される。
EPOが骨を標的とし、そして選択したタンパク質の循環半減期を上昇させる結合物の調
製法を示す。
反応性誘導体の使用は、本発明の範囲内である。本発明は反応性PEG類似体の同一性に
限定されない。ポリ(エチレングリコール)の多くの活性化誘導体が市販されており、そ
して文献で利用可能である。本発明に有用な基質を調製するために用いる適当な活性化P
EG誘導体を選択し、そして必要ならば合成することは、十分に当業者の能力の範囲内で
ある。Abuchowski et al.,Cancer Biochem.Biop
hys.,7:175−186(1984);Abuchowski et al.,J
.Biol.Chem.,252:3582−3586(1977);Jackson
et al.,Anal.Biochem.,165:114−127(1987);K
oide et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1
11:659−667(1983))、トレシレート(Nilsson et al.,
Methods Enzymol.,104:56−69(1984);Delgado
et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.,12:119−
128(1990));N−ヒドロキシスクシンイミド誘導化活性エステル(Buckm
ann et al.,Makromol.Chem.,182:1379−1384(
1981);Joppich et al.,Makromol.Chem.,180:
1381−1384(1979);Abuchowski et al.,Cancer
Biochem.Biophys.,7:175−186(1984);Katree
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:1487−
1491(1987);Kitamura et al.,Cancer Res.,5
1:4310−4315(1991);Boccu et al.,Z.Naturfo
rsch.,38C:94−99(1983);カーボネート(Zalipsky et
al.,ポリ(エチレングリコール)化学:生物工学的および生物医学的応用(POL
Y(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY:BIOTECHNICAL
AND BIOMEDICAL APPLICATIONS)、Harris編集、プ
レナム出版、ニューヨーク、1992、第347−370頁;Zalipsky et
al.,Biotechnol.Appl.Biochem.,15:100−114(
1992);Veronese et al.,Appl.Biochem.Biote
ch.,11:141−152(1985));イミダゾリルホルメート(Beauch
amp et al.,Anal.Biochem.,131:25−33(1983)
;Berger et al.,Blood,71:1641−1647(1988))
;4−ジチオピリジン(Woghiren et al.,Bioconjugate
Chem.,4:314−318(1993));イソシアネート(Byun et a
l.,ASAIO Journal,M649−M−653(1992))およびエポキ
シド(Noishiki et al.へ発効された米国特許第4,806,595号明
細書(1989)を参照にされたい。他の連結基にはアミノ基と活性化PEGとの間のウ
レタン結合を含む。Veronese,et al.,Appl.Biochem.Bi
otechnol.,11:141−152(1985)を参照にされたい。
ンパク質の濾過を遅らせるためにペプチドを、十分なサイズの合成もしくは天然のポリマ
ーに結合させることにより、本質的に血液プールにペプチドを標的させて、選択したペプ
チドの血液循環半減期を伸ばす方法を提供する(例えばアルブミン)。本発明のこの態様
はスキーム3で具体的に説明するが、ここでエリトロポエチン(EPO)を化学的および
酵素的修飾の組み合わせを使用してPEGリンカーを介してアルブミンに結合する。
P−シアル酸)(ここでXは反応性基:例えば活性エステル、イソチオシアネート等)で
あるような反応性PEG誘導体を用いて修飾される。PEG誘導体およびEPOは合わせ
られ、そしてCMP−シアル酸が基質であるトランスフェラーゼと接触させる。別の具体
的説明の態様では、リシンのε−アミンをPEG−リンカーのN−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルと反応させてアルブミン結合物を形成する。リンカーのCMP−シアル酸は
EPO上の適切な残基、例えばGalに酵素的に結合し、これにより結合物が形成する。
当業者は上記の方法が説明した反応パートナーに限定されないと考えるだろう。さらにこ
の方法は、例えば2以上の末端を有する分岐リンカーを利用することにより2より多くの
タンパク質部分を含む結合物を形成するために実施できる。
2.修飾された糖
修飾されたグリコシル供与体種(「修飾された糖」)は好ましくは、修飾された糖ヌク
レオチド、活性化された修飾された糖およびヌクレオチドでもなく活性化されてもいない
単なるサッカリドである修飾された糖から選択される。任意の所望する炭水化物構造が本
発明の方法を使用してペプチドに加えられる。典型的には構造は単糖であるが、本発明は
修飾された単糖の糖の使用に限定されず;オリゴ糖および多糖も有用である。
させ、これにより修飾された糖を生成する。糖は修飾部分の結合を可能とする任意の位置
で置換されるが、それでもこれは糖を、修飾された糖がペプチドに連結するために使用す
る酵素の基質として機能することを可能とする。好適な態様ではシアル酸が糖である時、
シアル酸はピルビル側の鎖上の9−位または通常はシアル酸中でアセチル化されるアミン
部分上の5−位のいずれかで修飾基に置換される。
るために利用される。本発明の方法において修飾された状態で使用される糖ヌクレオチド
の例には、ヌクレオチドモノ−、ジ−またはトリ−ホスフェートまたはそれらの類似体を
含む。好適な態様では修飾された糖ヌクレオチドは、UDP−グリコシド、CMP−グリ
コシドまたはGDP−グリコシドから選択される。さらにより一層好ましくは、修飾され
た糖ヌクレオチドは、UDP−ガラクトース、UDP−ガラクトサミン、UDP−グルコ
ース、UDP−グルコサミン、GDP−マンノース、GDP−フコース、CMP−シアル
酸またはCMP−NeuAcから選択される。糖ヌクレオチドのN−アセチルアミン誘導
体も本発明の方法で使用される。
ル酸を使用して修飾された糖ペプチドの合成法も提供する。修飾されたシアル酸を使用す
る時、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ(α2,3−結合シア
ル酸のみ)をこれらの方法に使用することができる。
飾された糖は、典型的には活性化された脱離基を含むように合成的に改変させたグリコシ
ドである。本明細書で使用する用語「活性化された脱離基」は、酵素が調節する求核性置
換反応で容易に置き換わる部分を称する。多くの活性化された糖が当該技術分野では知ら
れている。例えばVocadlo et al.,炭水化物の化学および生物学(CAR
BOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY)、第2巻、Ern
st編集、ウィリー−VCHファーラーグ;ヴァインハイム、ドイツ;Kodama e
t al.,Tetrahedron Lett.34:6419(1993);Lou
gheed et al.,J.Biol.Chem.274:37717(1999)
)を参照にされたい。
トエステル、トリフラートエステル等を含む。本発明での使用に好適な活性化された脱離
基は、グリコシドの受容体への酵素的転移を有意に立体的に妨害しないものである。した
がって活性化されたグリコシド誘導体の好適態様には、グリコシルフルオリドおよびグリ
コシルメシラートを含み、グリコシルフルオリドが特に好適である。グリコシルフルオリ
ドの中でもα−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グリコシルフ
ルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアルフルオリド
、α−N−アセチルグリコサミニルフルオリド、α−N−アセチルガラクトサミニルフル
オリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グリコシルフル
オリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド
、β−N−アセチルグルコサミニルフルオリドおよびβ−N−アセチルガラクトサミニル
フルオリドが最も好適である。
をHF/ピリジンで処理することにより遊離糖から調製することができる。これは保護さ
れた(アセチル化)グリコシルフルオリドの熱力学的に最も安定なアノマーを生じる(す
なわちα−グリコシルフルオリド)。より安定性が低いアノマー(すなわちβ−グリコシ
ルフルオリド)を所望するならば、これはアノマー性ブロミドまたはクロライドを生成す
るために前アセチル化糖をHBr/HOAcまたはHClを用いて転換することにより調
製することができる。この中間体を臭化銀のような臭化物塩と反応させて、グリコシルフ
ルオリドを生成する。アセチル化グリコシルフルオリドは、メタノール中の穏やか(触媒
的)な塩基(例えばNaOMe/MeOH)との反応により脱保護される。さらに、多く
のグリコシルフルオリドが市販されている。
ことができる。例えば、グリコシルメシラートは完全にベンジル化されたヘミアセタール
状態の糖をメシルクロライドで処理し、続いてベンジル基を除去するための触媒的水素添
加により調製することができる。
態様では1以上のアンテナの末端が修飾部分を持つ。1つの修飾部分がアンテナ構造を有
するオリゴ糖に結合する時、オリゴ糖は修飾基を「増幅」するために有用であり;ペプチ
ドに結合した各オリゴ糖単位は、修飾基の多数のコピーをペプチドに結合する。上記の図
に説明する本発明の典型的なはさみ状(chelate)の一般構造は、アンテナ構造を
利用して本発明の結合物を調製することから生じる多価種を包含する。多くのアンテナ状
サッカリド構造が当該技術分野では知られており、そして本発明は限定することなくそれ
らを用いて実施することができる。
できる。特性の例には限定するわけではないが、強化された薬物動態学、強化された薬力
学、改善された生体分布、多価種を提供すること、改善された水溶性、強化または縮小し
た親油性および組織ターゲッティングを含む。
D.ペプチド結合物
a)水溶性ポリマー
選択したペプチドの親水性は、アミン−、エステル−、ヒドロキシル−およびポリヒド
ロキシル−含有分子のような極性分子との結合により強化される。代表例には限定するわ
けではないがポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ(エチレングリコール)およびポリ
(プロピレングリコール)を含む。好適な水溶性ポリマーは本質的に非−蛍光性であるか
、あるいはアッセイで蛍光マーカーとして使用するためには不適当であるような最少量の
蛍光を発する。天然に存在しない糖であるポリマーを使用してもよい。さらに他の物質(
例えばポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレン グリコール)、ポリ(アスパル
テート)、生体分子、治療部分、診断部分等)の共有結合により修飾されている外は天然
に存在する糖の使用も意図している。別の例示態様では、治療用の糖部分をリンカーアー
ムに結合し、そして糖−リンカーアームを続いて本発明の方法を介してペプチドに結合す
る。
びポリマーを種々の種に結合する方法は、技術文献に記載されている。ポリマーを活性化
するために共通して使用する方法には、官能基の臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルア
ルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ス
ルホニルハライド、トリクロロトリアジン等での活性化を含む(R.F.Taylor,
(1991)、タンパク質の固定化.基礎および応用(PROTEIN IMMOBIL
ISATION.FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS)、マ
ルセルデッカー、ニューヨーク;S.S.Wong,(1992)、タンパク質結合およ
び架橋化の化学(CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION
AND CROSSLINKING)、CRC出版、ボカラトン;G.T.Herma
nson et al.,(1993)、固定化アフィニティーリガンド技術(IMMO
BILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES)、アカデミ
ック出版、ニューヨーク;Dunn,R.L.,et al.,編集、ポリマー性薬剤お
よび薬剤送達系(POLYMERIC DRUGS AND DELIVERY SYS
TEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、第469巻、アメリカ化学学会、ワシントン
、D.C.1991)を参照にされたい。
該技術分野では既知である。例えば米国特許第5,672,662号明細書は、直鎖もし
くは分岐ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレ
フィン性アルコール)およびポリ(アクリロモルホリン)から選択されるポリマー性酸の
活性エステルの水溶性および単離可能な結合物を開示し、ここでポリマーは約44個以上
の反復単位を有する。
ンゾトリアゾイル)カーボネートと有機溶媒中で反応させることにより、水溶性および非
ペプチド性ポリマーの水溶性の1−ベンゾトリアゾリルカルボン酸エステルの調製法を説
明する。活性エステルを使用してタンパク質またはペプチドのような生物学的な活性剤と
の結合物を形成する。
水溶性ポリマー(安定な連結を介してポリマー骨格に連結された少なくとも1つの末端を
有するポリマー骨格を含んでなり、ここで少なくとも1つの末端は、分岐部分に連結され
た近接反応基を有する分岐部分を含んでなり、ここで生物学的な活性剤が少なくとも1つ
の近接反応基に連結している)を含んでなる結合物を記載する。他の分岐ポリ(エチレン
グリコール)は、国際公開第96/21469号パンフレットに記載され、そして米国特
許第5,932,462号明細書は、反応性官能基を含む分岐末端を含む分岐PEG分子
を用いて形成された結合物を記載する。遊離反応基はタンパク質またはペプチドのような
生物学的な活性剤と反応することが可能であり、ポリ(エチレン グリコール)と生物学
的な活性種との間に結合物を形成する。米国特許第5,446,090号明細書は二官能
性PEGリンカーおよび各PEGリンカー末端にペプチドを有する結合物の形成における
その使用を記載する。
4259号パンフレットならびに米国特許第6,348,558号明細書に記載されてい
る。そのような分解性結合は本発明に応用することができる。
で知られているが、本発明まで結合物がPEG(または他のポリマー)とペプチドまたは
糖ペプチドのような別の種との間に完全なグリコシル連結基を介して形成される得ること
は認識されなかった。
である。水溶性ポリマーという用語は、サッカリド(例えばデキストラン、アミロース、
ヒアルロン酸、ポリ(シアル酸)、ヘパラン、ヘパリン等);ポリ(アミノ酸);核酸;
合成ポリマー(例えばポリ(アクリル酸)、ポリ(エーテル)、例えばポリ(エチレング
リコール);ペプチド、タンパク質等のような種を包含する。本発明は任意の水溶性ポリ
マーを用いて実施することができ、唯一の限定はポリマーが結合物の残部(remain
der)を結合することができる点を含まなければならないということだけである。
24,844号明細書、国際公開第94/18247号、同第94/04193号パンフ
レット、米国特許第5,219,564号、同第5,122,614号明細書、国際公開
第90/13540号パンフレット、米国特許第5,281,698号明細書、そしてさ
らに国際公開第93/15189号パンフレットにも見いだすことができ、そして活性化
ポリマーとペプチドとの間の結合物に関しては例えば、凝固第VIII因子(国際公開第
94/15625号パンフレット)、ヘモグロビン(国際公開第94/09027号パン
フレット)、酸素運搬分子(米国特許第4,412,989号明細書)、リボヌクレアー
ゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ(Veronese et al.,App.B
iochem.Biotech.11:141−45(1985))に見いだすことがで
きる。
そ同じ分子量であるものであり;そのようなポリマーは「単分散(homodisper
se)」である。
説明される。PEGの官能化および結合について、幾つかの総説および小論が入手可能で
ある。例えばHarris,Macronol.Chem.Phys.C25:325−
373(1985);Scouten,Methods in Enzymology
135:30−65(1987);Wong et al.,Enzyme Micro
b.Technol.14:866−874(1992);Delgado et al
.,Critical Reviews in Therapeutic Drug C
arrier Systems 9:249−304(1992);Zalipsky,
Bioconjugate Chem.6:150−165(1995);およびBha
dra,et al.,Pharmazie,57:5−29(2002)を参照にされ
たい。
、以下の式3により記載されるものを含む:
2−、HS−CH2−CH2−、
X、Y、W、U(独立して選択される)=O、S、NH、N−R';
R'、R"'(独立して選択される)=アルキル、ベンジル、アリール、アルキルアリ
ール、ピリジル、置換アリール、アリールアルキル、アシルアリール;
n=1〜2000;
m、q、p(独立して選択される)=0〜20
o=0〜20
Z=HO、NH2、ハロゲン、S−R"'、活性化エステル、
そして
V=HO、NH2、ハロゲン、S−R"'、活性化エステル、活性化アミド、−糖−ヌ
クレオチド、タンパク質。
分岐している。本発明の使用に適する分岐ポリ(エチレングリコール)分子には、限定す
るわけではないが以下の式により記載されるものを含む:
セタール、OHC−、H2N−CH2CH2−、HS−CH2−CH2−、−(CH2)
qCY−Z、−糖−ヌクレオチド、タンパク質、メチル、エチル、ヘテロアリール、アシ
ルアルキル、アシルアリール、アシルアルキルアリール:
X、Y、W、A、B(独立して選択される)=O、S、NH、N−R'(CH2)l;
n、p(独立して選択される)=1〜2000;
m、q、o(独立して選択される)=0〜20
Z=HO、NH2、ハロゲン、S−R"'、活性化エステル、
V=HO、NH2、ハロゲン、S−R"'、活性化エステル、活性化アミド、−糖−ヌ
クレオチド、タンパク質。
ングリコール(PEG)およびポリプロピレングリコール(PPG)のような水溶性ポリ
マーを用いて強化することができる。例えばPPGを用いたタンパク質の化学的修飾(P
EG化:PEGylation)はそれらの分子量サイズを上げ、そしてそれらの表面−
および官能基−接近性(accessibility)を下げるが、それぞれがタンパク
質に結合したPPGのサイズに依存する。これは血漿半減期およびタンパク質溶解的−安
定性に改善をもたらし、そして免疫原性および肝臓の取り込みを下げる(Chaffee
et al.J.Clin.Invest.89:1643−1651(1992);
Pyatak et al.,Res.Commun.Chem.Pathol Pha
rmacol.29:113−127(1980))。インターロイキン−2のPEG化
は、インビボで抗腫瘍効力を上昇させることが報告され(Katre et al.,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA.84:1487−1491(1987)
)、そしてモノクローナル抗体A7に由来するF(ab')2のPEG化は、その腫瘍へ
の局在化を向上させた(Kitamura et al.,Biochem.Bioph
ys.Res.Commun.28:1387−1394(1990))。
チドのインビボ半減期は、非−誘導化ペプチドのインビボ半減期に比べて上昇する。別の
好適な態様では、本発明の方法を使用して水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチド
の曲線下の面積は、非−誘導化ペプチドの曲線下面積に比べて上昇する。別の好適な態様
では、本発明の方法を使用して水溶性ポリマーを用いて誘導化されたペプチドの滞留時間
は、非−誘導化ペプチドの滞留時間に比べて上昇する。インビボ半減期、曲線下面積およ
び滞留時間を決定する技法は、当該技術分野では周知である。そのような技法の説明は、
J.G.Wagner、1993、製薬科学者のための薬物動態学(Pharmacok
inetics for the Pharmaceutical Scientist
)、テクノミック出版社(Technomic Publishing Company
Inc.)、ランカスター、ペンシルベニア州)に見出すことができる。
れる。上昇の割合の範囲の下限は約40%、約60%、約80、約100%、約150%
または約200%である。この範囲の上限は約60%、約80%、約100%、約150
%または約250%以上である。
10)。さらなる例示態様では、本発明はPEG化トランスフェリンを提供する(実施例
13)。
分枝ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(オレフィ
ン性アルコール)およびポリ(アクリロモルホリン)、デキストラン、澱粉、ポリ(アミ
ノ酸)等を含む。
b)水−不溶性ポリマー
本発明の結合物は1以上の水−不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの態様は、
治療用ペプチドを制御された様式で送達する賦形剤としての結合物の使用により具体的に
説明される。ポリマー性の薬剤送達系は当該技術分野では既知である。例えばDunn
et al.、ポリマー性薬剤および薬剤送達系(POLYMERIC DRUG AN
D DRUG DELIVERY SYSTEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、第
469巻、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.1991を参照にされたい。当業者
は実質的に任意の既知の薬剤送達系を本発明の結合物に応用できると考えるだろう。
ビニルアルコール)、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルア
ミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレ
ート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロ
リドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ(メチルメタクリレート
)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(イソブチル
メタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ(イソデシルメタクリレート
)、ポリ(ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチル
アクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)
、ポリ(オクタデシル アクリレート)ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(エチレン
グリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリ(ビ
ニルアセテート)、ポリビニルクロライド、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プル
ロニックおよびポリビニルフェノールおよびそれらのコポリマーを含む。
いがアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロ
ースエステルおよびニトロセルロースを含む。広い種類の合成的に修飾された天然ポリマ
ーの特に好適な員には、限定するわけではないがメチルセルロース、エチルセルロース、
ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチ
ルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースア
セテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、
セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩およびアクリル酸およびメタク
リル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーを含む。
Chemical Co.)(セントルイス、モンタナ州)、ポリサインエンス(Pol
yscience)、ウァレントン、ペンシルベニア州)、アルドリッチ(Aldric
h)(ミルウォーキー、ウィスコンシン州)、フルカ(ロンコンコーマ、ニューヨーク州
)およびバイオラッド(BioRad)(リッチモンド、カリフォルニア州)のような市
販の供給源から容易に得ることができ、あるいはこれらの供給元から得たモノマーから標
準技術を使用して合成することができる。
リラクチド、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー、ポリ(エチレンテレフタレート
)、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド−コ−カプロラクトン)、ポリ(ラ
クチド−コ−グリコリド)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それらのブレンドおよび
コポリマーを含む。特別な使用は、コラーゲン、プルロニック等を含むもののようなゲル
を形成する組成物である。
性(bioresorbable)分子を有する水不溶性材料を含む「ハイブリッド」ポ
リマーを含む。そのようなポリマーの例は、ポリマー鎖あたり生物再吸収性領域、親水性
領域および複数の架橋結合可能な官能基を有する水−不溶性コポリマーを含むものである
。
に不溶性である材料を含む。すなわちコポリマーの特定領域またはセグメントは親水性ま
たは水溶性でもよく、全体としてポリマー分子は任意の実質的な限界まで水に溶解しない
。
吸収および/または身体による正常な排出経路を介して排除され得る領域を含む。そのよ
うな代謝産物または分解産物は、好ましくは身体に対して実質的に非毒性である。
は親水性のいずれかでよい。すなわち生物再吸収性領域はポリマーが全体として水−不溶
性を保持することの優先性に基づき選択される。したがって関連する特性、すなわち含ま
れる官能基の種類、および生物再吸収性領域の相対的割合、および親水性領域は、有用な
生物再吸収性組成物が水−不溶性を保持することを確実にするように選択される。
シアルキレン)の合成的に生成される再吸収性ブロックコポリマーを含む(Cohn e
t al.、米国特許第4,826,945号明細書を参照にされたい)。これらのコポ
リマーは架橋結合されず、そして水溶性であるので身体は分解したブロックコポリマー組
成物を排出することができる。Younes et al.,J.Biomed.Mat
er.Res.21:1301−1316(1987);およびCohn et al.
,J.Biomed.Mater.Res.22:993−1009(1988)を参照
にされたい。
リ(ラクトン)、ポリ(アミド)、ポリ(エステル−アミド)、ポリ(アミノ酸)、ポリ
(無水物)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(カーボネート)、ポリ(ホスファジン)、
ポリ(ホスホエステル)、ポリ(チオエステル)、多糖およびそれらの混合物から選択さ
れる1以上の成分を含む。より好ましくはさらに生物再吸収性ポリマーにはポリ(ヒドロ
キシ)酸成分を含む。ポリ(ヒドロキシ)酸の中で、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ
カルプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸およびそれらのコポリマーおよび混合物が好ましい
。
、本発明の方法での使用に好適なポリマー性コーティングも、排出可能かつ/または代謝
可能なフラグメントを生成することができる。
効されたCasey et al.、米国特許第4,438,253号明細書は、ポリ(
グリコール酸)およびヒドロキシル−末端化ポリ(アルキレングリコール)のエステル交
換反応から生産されるトリ−ブロックコポリマーを開示する。そのような組成物は再吸収
性モノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。そのような組成物の柔
軟性は、テトラ−p−トリルオルトカーボネートのような芳香族オルトカーボネートをコ
ポリマー構造に包含させることにより制御される。
例えば1993年4月13日に発効されたSpinu、米国特許第5,202,413号
明細書は、ラクチドおよび/またはグリコリドのオリゴジオールまたはジアミン残基への
開環重合、続いてジイソシアネート、ジアシルクロライドまたはジクロロシランのような
二官能性化合物を用いた鎖延長により生産されたポリラクチドおよび/またはポリグリコ
リドを順次に配置した(ordered)ブロックを有する生分解性マルチ−ブロックコ
ポリマーを開示する。
開裂できるように設計することができる。本発明の目的のために、「加水分解的に開裂可
能な」とは、水中または水を含む環境下で加水分解に対するコポリマー、特に生物再吸収
性領域の感受性を指す。同様に本明細書で使用する「酵素的に開裂可能な」とは、内因性
または外因性酵素による開裂に対するコポリマー、特に生物再吸収性領域の感受性を指す
。
理され得る。すなわち親水性領域には例えばポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポ
リオール、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキル オ
キサゾリン)、多糖、炭水化物、ペプチド、タンパク質およびそれらのコポリマーおよび
混合物を含むことができる。さらに親水性領域は例えばポリ(アルキレン)オキシドであ
ることもできる。そのようなポリ(アルキレン)オキシドには、例えばポリ(エチレン)
オキシド、ポリ(プロピレン)オキシドおよびそれらの混合物およびコポリマーを含むこ
とができる。
を吸収することができるポリマー性材料である。ヒドロゲル形成化合物の例には限定する
わけではないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カラゲーナンおよび他の多糖、ヒドロキ
シエチレンメタクリル酸(HEMA)ならびにそれらの誘導体等を含む。安定で、生分解
性の、そして生物再吸収性であるヒドロゲルを生成することができる。さらにヒドロゲル
組成物は1以上のこれらの特性を現すサブユニットを含むことができる。
ヒドロゲル組成物が知られており、そして現在、本発明の方法で使用するために好適であ
る。例えば1995年4月25日に発効されたHubbell et al.、米国特許
第5,410,016号明細書および1996年6月25日に発効された米国特許第5,
529,914号明細書は、2つの加水分解的に不安定な延長物の間に挟まれた水溶性の
中央ブロックセグメントを有する架橋結合したブロックコポリマーである水溶性の系を開
示する。そのようなコポリマーは光重合性アクリレート官能基を用いてさらにエンド−キ
ャップ化されている。架橋結合する時、これらの系はヒドロゲルになる。そのようなコポ
リマーの水溶性の中央ブロックには、ポリ(エチレングリコール)を含むことができ;一
方加水分解的に不安定な延長物はポリグリコール酸またはポリ乳酸のようなポリ(α−ヒ
ドロキシ酸)であることができる。Sawhney et al.,Macromole
cules 26:581−587(1993)を参照にされたい。
ン、ヒアルロン酸、多糖、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよ
びそれらの組み合わせのような成分を含む熱可逆性ゲルが現在好適である。
えば1985年、6月11日に発効されたEppstein et al.、米国特許第
4,522,811号明細書に記載されているように、当該技術分野で既知の方法に従い
調製することができる。例えばリポソーム配合物は適当な脂質(1つまたは複数)(ステ
アロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイル ホスファチジルコリン、アラ
カドイルホスファチジルコリンおよびコレステロールのような)を無機溶媒に溶解し、こ
れを次いで蒸発させ、容器の表面上の乾燥脂質の薄いフィルムを残しておくことにより調
製することができる。次いで活性化合物またはその製薬学的に許容され得る塩の水溶液を
容器に注ぐ。次いで容器を手で旋回して、容器の側面から脂質材料を解放し(free)
、そして脂質凝集物を分配し、これによりリポソーム懸濁液を形成する。
明で使用する微粒子の範囲を定めることを意図しない。当業者は異なる方法により作成さ
れる多くの微粒子を本発明に使用できると考えるだろう。
c)生体分子
別の好適な態様では、修飾された糖は生体分子を持つ。さらに好適な態様では、生体分
子は機能的タンパク質、酵素、抗原、抗体、核酸(例えばシングルヌクレオチドまたはヌ
クレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび1−およびより多い鎖の核酸
)、レクチン、レセプターまたはそれらの組み合わせである。
として使用するには不適切な最少量の蛍光を発する。他の生体分子は蛍光でもよい。別の
物体(例えばPEG、生体分子、治療部分、診断部分等)の共有結合により修飾されてい
る外は天然に存在する糖の使用が適当である。例示態様では、生体分子である糖部分をリ
ンカーアームに結合し、そして糖−リンカーアームカセットを続いて本発明の方法を介し
てペプチドに結合する。
天然な供給源から単離することができ、またはそれらは合成法により生成することができ
る。ペプチドは天然なペプチドまたは突然変異したペプチドであることができる。突然変
異は化学的な突然変異誘発法、部位−特異的突然変異誘発法または当業者に既知の突然変
異を導入する他の手段により行うことができる。本発明の実施で有用なペプチドには例え
ば、酵素、抗原、抗体およびレセプターを含む。抗体はポリクローナルまたはモノクロー
ナルでよく;完全またはフラグメントのいずれかであることができる。ペプチドは任意に
方向付けされた進化(directed evolution)のプログラムの産物であ
る。
れらの分子は糖残基成分または架橋結合剤に利用可能な反応基により結合することができ
る。例えばペプチドは反応性アミン、カルボキシル、スルフヒドリルまたはヒドロキシル
基を介して結合することができる。反応基はペプチド末端またはペプチド鎖に対して内部
に存在することができる。核酸は塩基(例えばエキソ環式アミン)上の反応基または糖部
分の利用可能なヒドロキシル基(例えば3'−または5'−ヒドロキシル)を介して結合
することができる。ペプチドおよび核酸鎖はさらに1以上の部位で誘導化されて、適切な
反応基を鎖に付けることが可能となる。例えばChrisey et al.,Nucl
eic Acids Res.24:3031−3039(1996)を参照にされたい
。
異的組織に向け、これによりその組織に送達される非誘導化ペプチドの量に比べてペプチ
ドのその組織への送達を強化する。さらなに好適な態様では、選択した時間内に特異的な
組織へ送達される誘導化ペプチドの量は、誘導化により少なくとも約20%、より好まし
くは少なくとも約40%、そしてより好ましくは少なくともさらに約100%まで強化す
る。現在、標的化に応用するために好適な生体分子には抗体、ホルモンおよび細胞表面レ
セプターのリガンドを含む。
ーフェロンである。ヒトではインターフェロンは、ウイルスまたは二本鎖RNAで誘導し
た後にヒトの1次繊維芽細胞により分泌される抗ウイルス糖タンパク質である。インター
フェロンは治療薬として、例えば抗ウイルス剤および多発性硬化症の処置に興味深い。イ
ンターフェロン−βを考察した参考文献については、例えばYu, et al., J. Neuroimmuno
l., 64(1):91-100(1996); Schmidt, J., J. Neurosci. Res., 65(1): 59-67(2001); Wend
er, et al., Folia Neuropathol., 39(2):91-93 (2001); Martin, et al. Springer Semi
n. Immunopathol., 18(1):1-24(1996); Takane, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 29
4(2):746-752 (2000); Sburlati, et al., Biotechnol . Prog., 14:189-192 (1998); Do
dd, et al., Biochimica et Biophysica Acta, 787:183-187(1984); Edelbaum, et al.,
J. Interferon Res., 12:449-453 (1992); Conradt, et al., J. Biol. Chem., 262(30):
14600-14605(1987); Civas, et al., Eur. J. Biochem., 173:311-316(1988); Demolder,
et al., J. Biotechnol., 32:179-189(1994); Sedmak, et al., Interferon Res., 9(Su
ppl 1): S61-S65 (1989); Kagawa, et al., J. Biol. Chem., 263(33): 17508-17515 (19
88); Hershenson, et al., U.S. Patent No. 4,894,330; Jayaram, et al., J. Interfer
on Res., 3(2): 177-180(1983); Menge, et al., Develop. Biol. Standard., 66: 391-4
01 (1987); Vonk, et al., J. Interferon Res., 3(2): 169-175 (1983); and Adolf, et
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eost. Agents, 3(1): 13-19(1989); Habib, et al., Am. Surg., 67(3): 257-260 (3/200
1); および Sugyiama, et al., Eur. J. Biochem., 217: 921-927 (1993)を参照にされた
い。
ペプチドに結合する。リンカーアームには完全なグリコシル連結基を含み、これを通して
本発明の方法を介して第2ペプチドに連結する。リンカーアームも場合により第2の完全
なグリコシル連結基も含み、これを通してインターフェロンに結合する。
は糖タンパク質ホルモンである。例えばSaneyoshi, et al., Biol. Reprod., 65: 1686-1
690 (2001); Hakola, et al., J. Endocrinol., 158: 441-448 (1998); Stanton, et al.
, Mol. Cell. Endocrinol., 125:133-141 (1996); Walton, et al., J. Clin. Endocrino
l. Metab., 86(8): 3675-3685 (08/2001); Ulloa-Aguirre, et al., Endocrine, 11(3):
205-215 (12/1999); Castro-Fernadez, et al. I, J. Clin. Endocrinol. Matab., 85(12
): 4603-4610 (2000); Prevost, Rebecca R., Pharmacotherapy, 18(5): 1001-1010 (199
8); Linskens, et al., The FASEB Journal, 13: 639-645 (04/1999); Butnev, et al.,
Biol. Reprod., 58:458-469 (1998); Muyan, et al., Mol. Endo., 12(5): 766-772 (199
8); Min, et al., Endo. J., 43(5): 585-593 (1996); Boime, et al., Recent Progress
in Hormone Research, 34: 271-289 (1999); および Rafferty, et al., J. Endo., 145
: 527-533 (1995)を参照にされたい。FSH結合物はインターフェロンについて上に記載
した様式に準じて形成することができる。
素に対する反応を媒介し、そして赤血球の生産を刺激することが知られている。関連する
参考文献については、Cerami et al.,Seminars in Onco
logy,28(2)(Suppl8):66−70(04/2001)を参照にされた
い。例示のEPO結合物は、インターフェロンの結合物に準じて形成される。
を提供する。G−CSFはニュートロポイエティック(neutropoietic)前
駆細胞の機能的に成熟した好中球への増殖、分化および活性化を刺激する糖タンパク質で
ある。注入されたG−CSFは身体から急速に排除されることが知られている。例えばN
ohynek,et al.,Cancer Chemother.Pharmacol
.,39:259−266(1997);Lord et al.,Clinical
Cancer Research,7(7):2085−2090(07/2001);
Rotondaro,et al.,Molecular Biotechnology
,11(2):117−128(1999);およびBoenig,et al.,Bo
ne Marrow Transplantation,28:259−264(200
1)を参照にされたい。G−CSFの例示結合物は、インターフェロンの結合物について
上に記載したように調製される。当業者は多くの他のタンパク質が、限定するわけではな
いが表6(本明細書のいたるところに記載する)および図1、および個々の修飾スキーム
が提示されている図27〜51に掲げるペプチドを含む本発明の方法および組成物を使用
して、インターフェロンに結合することができると考えるだろう。
オチン化されたペプチドは、1以上の修飾基を持つアビジンまたはストレプトアビジン部
分の結合により仕上げられる。
胞内コンパートメントへ向けるために選択され、これにより組織に送達される非誘導化ペ
プチドの量に比べて細胞内コンパートメントへのペプチドの送達を強化する。さらに好適
な態様では、選択した時間内に特異的な細胞区画へ送達される誘導化ペプチドの量を誘導
化により、少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、そしてさらにより
好ましくは少なくとも約100%まで強化する。別の特に好適な態様では生体分子は、い
ったん内面化されると加水分解することができる開裂可能なリンカーによりペプチドに連
結される。細胞内ターゲッティングの応用に現在好適な生体分子には、トランスフェリン
、ラクトトランスフェリン(ラクトフェリン)、メラノトランスフェリン(p97)、セ
ルロプラスミンおよび二価のカチオン輸送体を含む。意図する連結には限定するわけでは
ないが、タンパク質−糖−リンカー−糖−タンパク質、タンパク質−糖−リンカー−タン
パク質およびそれらの多価形態、および薬剤がとりわけ低分子、ペプチド、脂質を含むタ
ンパク質−糖−リンカー−薬剤を含む。
のようなヒトの広い種々の疾患を処置する目的に望ましい。そのような手順は薬剤のより
少ない副作用およびより高い効率で達成される。これらの送達系の設計は様々な原理に頼
るものであった。総説については、Garnett,Advanced Drug De
livery Reviews 53:171−216(2001)を参照にされたい。
面抗原の発見により、定めることができる表面抗原を提示している腫瘍細胞を特異的に標
的とし、そして殺す治療的取り組みを開発することが可能となった。悪性疾患の処置にお
いてヒトの臨床試験で効果が証明された3つの主要のクラスの治療用モノクローナル抗体
(MAb)がある:(1)非結合MAb、これは成長阻害および/またはアポトーシスを
直接誘導するか、あるいは抗腫瘍細胞傷害性を媒介するために宿主の防御メカニズムを間
接的に活性化する;(2)薬剤を結合したMAb、これは有力な細胞傷害性トキシンを腫
瘍細胞に優先的に送達し、したがって従来の化学療法に普通は付随する全身性の細胞傷害
性を最少とする;および(3)放射性同位体を結合したMAb、これは腫瘍に殺菌用量の
放射線を送達する。Reff et al.,Cancer Control 9:15
2−166(2002)による総説を参照にされたい。
給源から得たトキシンに結合して、イムノトキシンと呼ばれるキメラタンパク質を形成す
ることができる。頻繁に使用される植物トキシンは2種類に分類される:(1)リシン、
アブリン、アメリカヤドリギ レクチン、およびモデクシン(modeccin)のよう
なホロトキシン(またはクラスIIリボソーム不活性化タンパク質)、および(2)アメ
リカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(PAP)、サポリン、Bryodin1、ボウガ
ニン(bouganin)およびゲロニン(gelonin)のようなヘミトキシン(ク
ラスIリボソーム不活性化タンパク質)。よく使用される細菌トキシンには、ジフテリア
トキシン(DT)およびシュードモナスのエキソトキシン(PE)を含む。Kreitm
an,Current Pharmaceutical Biotechnology
2:313−325(2001)。
に修飾したトキシンに化学的に結合したMAbを含む。例にはCD5を標的とする抗−B
4−ブロック化リシン;およびCD22を標的とするRFB4−脱グリコシル化リシンA
鎖を含む。より最近開発された組換えイムノトキシンは、組換えDNA技術を使用してタ
ンパク質トキシンに融合させた腫瘍抗原に対して向けられた抗体の可変領域からなるキメ
ラタンパク質である。トキシンはまた、正常組織結合部位は除去するが、その細胞傷害性
を保持するために、頻繁に遺伝的に修飾される。造血性ガン、グリオーマおよび胸部、結
腸、卵巣、膀胱および胃腸管のガンを含む種々の悪性疾患を処置するために、イムノトキ
シンの標的として多数の分化抗原、過剰発現したレセプターまたはガン−特異的抗原、例
えばCD19、CD22、CD20、IL−2レセプター(CD25)、CD33、IL
−4レセプター、EGFレセプターおよびその突然変異体、ErB2、ルイス炭水化物、
メソセリン(mesothelin)、トランスフェリンレセプター、GM−CSFレセ
プター、Ras、Bcr−Ab1およびc−Kitが同定された。例えばBrinkma
nn et al.,Expert Opin.Biol.Ther.1:693−70
2(2001);Perentesis and Sievers,Hematolog
y/Oncology Clinics of North Amereica 15:
677−701(2001)を参照にされたい。
の特異性および効力で処置する別の手段として使用される。最もよく使用される治療用の
同位体は、131Iおよび90Yのような高エネルギー−エミッターである。最近、21
3Bi−標識抗−CD33ヒト化MAbも、フェイズIのヒト臨床試験で試験された。R
eff et al.,同上。
めに、リツキシマブ(rituximab:Rituxan(商標))、組換えキメラ抗
−CD20MAbの使用が1997年にFDAにより認可された。それからヒトのガンの
処置に治療的使用が認められた他のMAbには:アレムツズマブ(alemtuzuma
b:Campath−1H(商標))、CD52に対するヒト化ラット抗体;およびジェ
ンツズマブ オゾガマイシン(gemtuzumab ozogamicin:Mylo
targ(商標))、カリーチマイシン(calichemicin)−結合ヒト化マウ
ス抗CD33MAbを含む。現在、FDAはまた細胞傷害剤または照射、例えば放射標識
Zevalin(商標)およびBexxar(商標)の部位特異的送達を目的にするため
の数種の他のMAbの安全性および効力も調査している。Reff et al.,同上
。
である。これは血液脳関門が高分子の拡散を妨害する中枢神経系(CNS)の疾患を処置
する場合に特に関心のある事柄である。治療薬のCNSへの効率的送達のために、血液脳
関門をバイパスするための幾つかの取り組みが開発された。
に有用な道具を提供した。トランスフェリンにより血漿中で輸送される鉄は、ほとんどす
べての種類の細胞に必須な成分である。脳は代謝プロセスに鉄を必要とし、そして脳の毛
細管内皮細胞に位置するトランスフェリンレセプターを通して、レセプターが媒介するト
ランスサイトーシスおよびエンドサイトーシスを介して鉄を受容する。Moor and
Morgan,Cellular and Molecular Neurobiol
ogy 20:77−95(2000)。トランスフェリン−トランスフェリンレセプタ
ー相互作用に基づく送達系が、ペプチド、タンパク質およびリポソームを脳に効率的に送
達するために確立された。例えばペプチドは脳によるより多い取り込みを達成するために
、トランスフェリンレセプターに対して向けられたMabにカップリングすることができ
る、Moos and Morgan、同上。同様に、トランスフェリンレセプターに向
けられたMAbにカップリングした時、血液脳関門全域の塩基性繊維芽細胞増殖因子(b
FGF)の輸送が強化される。Song et al.,The Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeut
ics 301:605−610(2002);Wu et al.,Journal
of Drug Targeting 10:239−245(2002)。さらに化学
療法剤、ドキソルビシンのC6グリオーマへの効果的輸送のためのリポソーム送達系が報
告され、ここでトランスフェリンはリポソームPEG鎖の遠位末端に結合された。Eav
arone et al.,J.Biomed.Mater.Res.51:10−14
(2000)。多数の米国特許もトランスフェリン−トランスフェリンレセプター相互作
用に基づき血液−脳関門をバイパスする送達法に関する。例えば米国特許第5,154,
924号;同第5,182,107号;同第5,527,527号;同第5,833,9
88号;同第6,015,555号明細書を参照にされたい。
国特許第5,672,683号、同第5,977,307号明細書および国際公開第95
/02421号パンフレットは、血液脳関門をわたる神経製剤を送達する方法に関し、こ
こで薬剤は脳の毛細管内皮細胞レセプターと反応性のリガンドとの融合タンパク質の状態
で投与される;国際公開第99/00150号パンフレットは、血液脳関門をわたる薬剤
の輸送が、ヒトのインスリンレセプターに対して向けられたMAbとの結合により促進さ
れる薬剤送達系を記載する;国際公開第89/10134号パンフレットは、脳へ親水性
の神経ペプチドを導入する手段として、比較的高速で血液脳関門をわたることができるペ
プチドおよびトランスサイトーシスできない親水性の神経ペプチドを含むキメラペプチド
を開示する;国際公開第01/60411 A1号パンフレットは、製薬学的な有効成分
を脳に容易に輸送することができる製薬学的組成物を提供する。有効成分は結合物として
使用されるヒバーネーション(hibernation)−特異的タンパク質に結合させ
、そして甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモンの生産を促進する物質と共に投与される。
さらに血液脳関門をバイパスするために、別の薬剤送達経路が調査された。例えば結合を
必要としない治療薬の鼻内送達は別の送達法の可能性を示した(Frey,2002,D
rug Delivery Technology,2(5):46−49)。
フェリンレセプター相互作用は、多くの腫瘍細胞がそれらの表面上にトランスフェリンレ
セプターを過剰発現するので、特定の腫瘍細胞の特異的標的化にも有用である。この方法
はトランスフェリン結合物を介してK562細胞に生物活性高分子を送達するために(W
ellhoner et al.,The Journal of Biologica
l Chemistry 266:4309−4314(1991))、そしてトランス
フェリン結合物を介して腸細胞−様Caco−2細胞にインスリンを送達するために(S
hah and Shen,Journal of Pharmaceutical S
ciences 85:1306−1311(1996))使用されてきた。
ンのような種々の鉄輸送タンパク質の機能、および二価のカチオン輸送体およびそれらの
発現パターンについてより知られるようになったので、鉄輸送メカニズムに関与する幾つ
かのタンパク質(例えばメラノトランスフェリン)またはそれらのフラグメントは、血液
脳関門をわたる治療薬の輸送、または特異的組織のターゲッティングを支援するために同
様に効果的であることが分かった(国際公開第02/13843A2号、同第02/13
873A2号パンフレット)。薬剤送達において、結合物としての鉄の取り込みが関与す
るトランスフェリンおよび関連タンパク質の使用に関する総説は、Li and Qia
n,Medical Research Reviews 22:225−250(20
02)を参照にされたい。
またはそれらの関連タンパク質との間の相互作用を越える。例えば石化(mineral
ized)した組織へのタンパク質の送達を改善するために、タンパク質が骨を探す(b
one−seeking)アミノビホスフェートと結合した骨−特異的送達系が記載され
た。Uludag and Yang,Biotechnol.Prog.18:604
−611(2002)。この話題に関する総説は、Vyas et al.,Criti
cal Reviews in Therapeutic Drug Carrier
System 18:1−76(2001)を参照にされたい。
できる。適当なリンカーには、例えば酸−触媒型の解離により開裂され得る、あるいは非
−開裂性のホモ−およびヘテロ二官能性架橋結合試薬を含む(例えば、Srinivas
achar and Neville,Biochemistry 28:2501−2
509(1989);Wellhoner et al.,The Journal o
f Biological Chemistry 266:4309−4314(199
1)を参照にされたい)。ビオチンおよびアビジン/ストレプトアビシンのような多くの
既知の結合パートナー間の相互作用も、治療薬と治療薬の特異的かつ効果的送達を確実と
する結合パートナーとを連結する手段として使用することができる。本発明の方法を使用
して、タンパク質は分子を結合物として細胞内コンパートメントへ送達するために使用す
ることができる。リガンド結合後に内面化される、特異的な細胞表面レセプターに結合す
るタンパク質、ペプチド、ホルモン、サイトカイン、低分子等は、結合した治療用化合物
の細胞内ターゲッティングに使用することができる。典型的にはレセプター−リガンド複
合体は、特異的な細胞コンパートメントへ送達される細胞内小胞中に内面化され、これら
のコンパートメントには限定するわけではないがレセプターにより標的化される細胞内の
位置に依存して核、ミトコンドリア、ゴルジ、ER、リソソームおよびエンドソームを含
む。レセプターリガンドを所望する分子に結合することにより、薬剤はレセプター−リガ
ンド複合体で運ばれ、そしてレセプターにより通常は標的とされる細胞内の位置へ送達さ
れる。したがって薬剤は疾患の処置が必要とされている細胞の特異的な細胞内の位置へと
送達され得る。
ができる。標的化タンパク質には限定するわけではないが増殖因子(とりわけEPO、H
GH、EGF、神経成長因子、FGF)、サイトカイン(とりわけGM−CSF、G−C
SF、インターフェロンファミリー、インターロイキン)、ホルモン(とりわけFSH、
LH、ステロイドファミリー、エストロゲン、コルチコステロイド、インスリン)、血清
タンパク質(とりわけアルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、ヒト血清タンパ
ク質、抗体および抗体のフラグメント)、およびビタミン(とりわけ葉酸、ビタミンC、
ビタミンA)を含む。ほとんどの細胞型上のレセプターに特異的な標的化剤も利用可能で
ある。
−タンパク質およびそれらの多価の形態、タンパク質−糖−リンカー−タンパク質および
それらの多価の形態、タンパク質−糖−リンカー−治療薬(ここで治療薬には限定するわ
けではないが低分子、ペプチドおよび脂質を含む)を含む。幾つかの態様では、いったん
内面化されれば加水分解され得る加水分解可能なリンカーを使用する。酸性pHを有する
エンドソームまたはリソソーム中にタンパク質結合物が内面化される場合、酸に不安定な
リンカーを使用することは有利となり得る。いったんエンドソームまたはリソソーム中に
内面化されれば、リンカーは加水分解され、そして治療薬が標的剤から放出される。
細胞を標的することが望まれる酵素にリンカーを介して連結される。患者は例えばその特
定の酵素について酵素代替療法を必要とすることができる。特に好適な態様では、酵素は
リソソーム蓄積疾患の患者に欠けているものである(表4を参照にされたい)。いったん
循環に入れば、トランスフェリン−酵素結合物はトランスフェリンレセプターに結合し、
そして早期にエンドソームにより内面化される(Xing et al.,1998,B
iochem.J.336:667;Li et al.,2002,Trends i
n Pharmacol.Sci.23:206;Suhaila et al.,19
98,J.Biol.Chem.273:14355)。トランスフェリンに関する他の
企図する標的剤には、限定するわけではないがラクトトランスフェリン(ラクトフェリン
)、メラノトランスフェリン(p97)、セルロプラスミンおよび二価カチオン輸送体を
含む。
によりエンドソームに入る。いったん入れば、ジストロフィンが加水分解可能なリンカー
により放出され、これは次いで必要とされる細胞内コンパートメントに取り込まれること
ができる。この態様は、トランスフェリンに結合された機能的ジストロフィンペプチドを
用いて、遺伝的に欠損性のジストロフィン遺伝子および/またはタンパク質を補充するこ
とにより筋ジストロフィーの患者を処置するために使用することができる。
E.治療部分
別の好適な態様では、修飾された糖は治療部分を含む。当業者は治療部分と生体分子の
範疇の間で重複する部分があると考えるだろう;多くの生体分子が治療特性または潜在性
を有する。
はその使用が実験的であるか、またはその活性もしくは作用メカニズムが調査中の薬剤で
あることができる。治療部分は所定の疾患状態で証明された作用を有することができ、あ
るいは所定の疾患状態で望まれる作用を示すと仮定されるだけであることができる。好適
な態様では、治療部分は選択した組織と相互作用するそれらの能力についてスクリーニン
グされている化合物である。本発明の方法を実施するために有用な治療部分は、種々の薬
理学的活性を有する薬剤の広範な種類からの薬剤を含む。幾つかの態様では、糖ではない
治療部分を使用することが好ましい。この好適例の例外は、PEG、生体分子、治療部分
、診断分子等のような別の物体と共有結合することにより修飾された糖である。別の例示
態様では、治療用の糖部分をリンカーアームと結合させ、そして続いて糖−リンカーアー
ムカセットを本発明の方法を介してペプチドに結合させる。
ermanson,バイオコンジュゲート技術(BIOCONJUGATE TECHN
IQUES)、アカデミック出版、サンディエゴ、1996;およびDunn et a
l.,編集、ポリマー性薬剤および薬剤送達系(POLYMERIC DRUGS AN
D DRUG DELIVERY SYSTEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、第
469巻、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.1991を参照にされたい。
させる。条件の例には、限定するわけではないが、選択されたpH(例えば胃、腸、エン
ドサイトーシスの液胞)、活性な酵素の存在(例えばエステラーゼ、プロテアーゼ、レダ
クターゼ、オキシダーゼ)、光、熱等を含む。多くの開裂可能な基が当該技術分野では知
られている。例えばJung et al., Biochem. Biophys. Acta, 761: 152-162 (1983); Josh
i et al., J. Biol. Chem., 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol.,
124: 913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Biochem., 155: 141-147 (1986); Park
et al., J. Biol. Chem., 261: 205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol., 143:
1859-1867 (1989)を参照にされたい。
SAIDS)を含む。NSAIDSは例えば以下の範疇から選択することができる:(例
えばプロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体
およびオキシカム(oxicams));ヒドロコルチゾン等を含むステロイド性抗−炎
症剤;アジュバント:抗−ヒスタミン剤(例えばクロロフェニラミン(chlorphe
niramine)、トリプロリジン(triprolidine));鎮咳剤(例えば
デキストロメトルファン(dextromethorphan)、コデイン(codei
n)、カラミフェン(caramiphen)、およびカルベタペンタン(carbet
apentane);止痒剤(例えばメトジラジン(methdilazine)および
トリメプラジン(trimeprazine);抗コリン作用剤(例えばスコポラミン(
scopolamine)、アトロピン(atropine)、ホマトロピン(homa
tropine)、レボドパ(levodopa);嘔吐抑制剤および抗めまい剤(例え
ばシクリジン(cyclizine)、メクリジン(meclizine)、クロルプロ
マジン(chlorpromazine)、ブクリジン(buclizine);食欲減
退剤(例えばベンズフェタミン(benzphetamine)、フェンテルミン(ph
entermine)、クロルフェンテルミン(chlorphentermine)お
よびフェンフルラミン(fenfluramine);中枢刺激剤(例えばアンフェタミ
ン(amphetamine)、メタンフェタミン(methamphetamine)
、デクストロアンフェタミン(dextroamphetamine)およびメチルフェ
ニデート(methylphenidate));抗不整脈剤(例えばプロパノルオール
(propanolol)、プロカインアミド(procainamide)、ジソピラ
ミド(disopyramide)、キニジン(quinidine)、エンカイニド(
encainide);β−アドレナリン遮断薬(例えばメトプロロール(metopr
olol)、アセブトロール(acebutolol)、ベタキソロール(betaxo
lol)、ラベタロール(labetalol)およびチモロール(timolol);
強心剤(例えばミルリノン(milrinone)、アムリノン(amrinone)お
よびドブタミン(dobutamine);降圧剤(例えばエナラプリル(enalap
ril)、クロニジン(clonidine)、ヒドララジン(hydralazine
)、ミノキシジル(minoxidil)、グアナドレル(guanadrel)、グア
ネチジン(guanethidine);利尿剤(例えばアミロライド(amilori
de)およびヒドロクロロチアジド(hydrochlorothiazide);冠血
管拡張薬(例えばジルチアゼム(diltiazem)、アミオダロン(amiodar
one)、イソクスプリン(isoxspurine)、ナイリドリン(nylidri
n)、トラゾリン(tolazoline)およびベラパミル(verapamil);
血管収縮薬(例えばジヒドロエルゴタミン(dihydroergotamine)、エ
ルゴタミン(ergotamine)およびメチルセルギド(methylsergid
e);抗潰瘍剤(例えばラニチジン(ranitidine)およびシメチジン(cim
etidine);麻酔薬(例えばリドカイン(lidocaine),ブピバカイン(
bupivacaine)、クロロプロカイン(chloroprocaine)、ジブ
カイン(dibucaine);抗鬱剤(例えばイミプラミン(imipramine)
、デシプラミン(desipramine)、アミトリプチリン(amitryptil
ine)、ノルトリプチリン(nortryptiline);精神安定剤および鎮静剤
(例えばクロルジアゼポキシド(chlordiazepoxide)、ベナシチジン(
benacytyzine)、ベンズキナミド(benzquinamide)、フルラ
ゼパム(flurazepam)、ヒドロキシジン(hydroxyzine)、ロキサ
ピン(loxapine)およびプロマジン(promazine));抗精神病薬(例
えばクロルプロチキセン(chlorprothixene)、フルフェナジン(flu
phenazine)、ハロペリドール(haloperidol)、モリンドン(mo
lindone)、チオリダジン(thioridazine)およびトリフルオペラジ
ン(trifluoperazine);抗微生物剤(抗バクテリア、抗菌・カビ、抗原
生生物および抗ウイルス剤)。
技術分野で周知のキーホールリンペットヘモシアニン結合物、モノホスホリル脂質A、マ
イコプラズマ−由来リポペプチドMALP−2、コレラトキシンBサブユニット、大腸菌
(Esherichia coli)熱不安定性トキシン、破傷風トキソイドに由来する
ユニバーサルTヘルパーエピトープ、インターロイキン−12、CpGオリゴデオキシヌ
クレオチド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、シクロデキストリン、スク
ワレン、アルミニウム塩、髄膜炎菌の外膜小胞(OMV)、モンタニド(montani
de)ISA、TiterMax(商標)(モンタナ州、セントルイスのシグマから入手
可能)、ニトロセルロース吸着、QuilAのような免疫−刺激複合体、Gerbu(商
標)アジュバント(ゲルブ バイオテクニーク(Gerbu Biotechnik)、
キルヒバルド、ドイツ)、トレオニルムラミルジペプチド、チモシン アルファ、ブピバ
カイン、GM−CSF、不完全フロインドアジュバント、MTP−PE/MF59(チバ
/ガイギー(Ciba/Geigy)、バーゼル、スイス)、ポリホスファゼン、セッケ
ンボクの木(Quillaja saponaria)に由来するサポニンおよびSyn
texアジュバント製剤(バイオカイン(Biocine)、エミリーヴァレ、カリフォ
ルニア州)から選択することができる。
ロン剤、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン
、アミカシン、トリクロサン、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン
、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタムブトー
ル、ヘキサミジンイソチオネート、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、
カナマイシン、リネオマイシン、メタサイクリン、メタンアミド、ミノサイクリン、ネオ
マイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミ
コナゾールおよびアマンタジンの製薬学的に許容され得る塩を含む。
ばロイプロリド(leuprolide)またはフルタミド(flutamide))、
殺細胞剤(例えばアドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド
、ブスルファン、シスプラチン、β−2−インターフェロン)抗−エストロゲン剤(例え
ばタモキシフェン)、代謝拮抗物(例えばフルオロウラシル、メトトレキセート、メルカ
プトプリン、チオグアニン)を含む。またこの分類に含まれるのは、診断および治療の両
方のための放射性同位体に基づく作用物質およびリシンのような結合トキシン、ゲルダナ
マイシン、ミタンシン(mytansin)、CC−1065、C−1027、デュオカ
ルマイシン、カリーチマイシンおよび関連する構造およびそれらの類似体である。
リド、メゲステロール、オクトレチドまたはソマトスタチン);筋弛緩剤(例えばシンナ
メドリン(cinnamedrine)、シクロベンザプリン(cyclobenzap
rine)、フラボキセート(flavoxate)、オルフェナドリン(orphen
adrine)、パパヴェリン(papaverine)、メベヴェリン(mebeve
rine)、イダヴェリン(idaverine)、リトドリン(ritodrine)
、ジフェノキシレート(diphenoxylate)、ダントロレン(dantrol
ene)およびアズモレン(azumolen));抗痙剤;骨−活性剤(例えばジホス
ホネートおよびホスホノアルキルホスフィネート剤化合物);内分泌調節(modula
ting)物質(例えば、避妊薬(例えばエチノジオール(ethinodiol)、エ
チニルエストラジオール、ノレチンドロン(norethindrone)、メストラノ
ール(mestranol)、デソゲステレル(desogestrel)、メドロキシ
プロゲステロン(medroxyprogesterone))、糖尿病の調節物質(例
えばグリブリド(glyburide)またはクロルプロパミド(chlorpropa
mide)、テストラクトンまたはスタノゾロールのような同化産物、アンドロゲン類(
例えばメチルテストステロン、テストステロンまたはフルオキシメステロン)、抗利尿物
(例えばデスモプレッシン(desmopressin)およびカルシトニン(calc
itonin))であることができる。
ココルチコイド(例えばトリアムシノロン、ベタメサゾン等)、およびノレチンドロン、
エチノジオール、ノレエチンドロン、レボノルゲストレルのようなプロゲステロン;甲状
腺剤(例えばリオチロニン(liothyronine)またはレボチロキシン(lev
othyroxine)または抗−甲状腺剤(例えばメチマゾール(methimazo
le));抗過プロラクチン血症剤(例えばカベルゴリン(cabergoline);
ホルモンサプレッサー(例えばダナゾール(danazol)またはゴセレリン(gos
erelin))、子宮収縮剤(例えばメチルエルゴノビン(methylergono
vine)またはオキシトシン(oxytocin)およびミオプロストール(miop
rostol)、アルプロスタジル(alprostadil)またはジノプロストーン
(dinoprostone)のようなプロスタグランジンである。
amide)および/またはクロモリン(cromolyn)のようなマスト細胞安定化
剤、ステロイド(例えばトリアムシノロン(triamcinolone)、ベクロメタ
ゾン(beclomethazone)、コルチゾン(cortisone)、デキサメ
タゾン(dexamethasone)、プレドニゾロン(prednisolone)
、メチルプレドニゾロン(methylprednisolone)、ベクロメタゾン(
beclomethasone)またはクロベタゾル(clobetasol))、ヒス
タミンH2アンタゴニスト(例えばファモチジン(famotidine)、シメチジン
(cimetidine)、ラニチジン(ranitidine))、免疫抑制剤(例え
ばアザチオプリン(azathioprine)、シクロスポリン(cyclospor
in))等を含む。
(ketoprofen)およびケトロラク(ketorolac)のような抗炎症活性
を有する群も使用する。本発明と一緒に使用する他の薬剤は、当業者には明らかである。
F.修飾された糖の調製法
本発明の結合物を形成するために有用な修飾された糖を本明細書で検討する。この検討
は説明の簡明さのために水溶性ポリマーで修飾された糖の調製に焦点をあてる。特にこの
検討はポリ(エチレングリコール)部分を含む修飾された糖の調製に焦点をあてる。当業
者は本明細書に記載する方法が修飾された糖の調製に広く応用可能であり、したがってこ
の検討は本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないと考えるだろう。
性種に転移される反応基の使用を介して一緒に連結される。糖の反応性官能基(1つまた
は複数)は、糖部分の任意の位置に位置する。本発明の実質に有用な反性基および反応の
種類は、一般にバイオコンジュゲート(bioconjugate)化学の分野で周知な
ものである。反応性糖部分を用いて利用可能な現在好適な種類の反応は、比較的穏和な条
件下で進行するものである。これらには限定するわけではないが、求核性置換(例えばア
ミンおよびアルコールとアシルハライド、活性エステルとの反応)、求電子置換(例えば
エナミン反応)、および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加(例えばマ
イケル反応、ディールス−アルダー付加)を含む。これらのおよび他の有用な反応は、例
えばSmith and March、進歩した有機化学(ADVANCED ORGA
NIC CHEMISTRY)、第5版、ジョン ウィリー&サンズ、ニューヨーク、2
001;Hermanson、バイオコンジュゲート技術(BIOCONJUGATE
TECHNIQUES)、アカデミック出版、サンディエゴ、1996;およびFeen
ey et al.,タンパク質の修飾:化学シリーズの進歩(MODIFICATIO
N OF PROTEINS:Advances in Chemistry Seri
es)、第198巻、アメリカ化学学会、ワシントン、D.C.、1982で検討されて
いる。
けではないが以下を含む:
(a)カルボキシル基およびそれらの種々の誘導体、限定するわけではないが、N−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハライ
ド、アシルイミダゾール、チオエステル、p−ニトロフェニルエステル、アルキル、アル
ケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含む;
(b)例えばエステル、エーテル、アルデヒド等に転換できるヒドロキシル基;
(c)ハロアルキル基、ここでハライドは例えばアミン、カルボキシレートアニオン、チ
オールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンのような求核性基に後で置き
換わることができ、これによりハロゲン原子の官能基で新たな基の共有結合をもたらす;
(d)ディールス−アルダー反応に参加することができるジエノフィル基、例えばマレイ
ミド基;
(e)後の誘導化が例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムのような
カルボニル誘導体の形成を介して、あるいはグリニャール付加またはアルキルリチウム付
加のようなメカニズムを介して可能となるようなアルデヒドまたはケトン基;
(f)例えばスルホンアミドを形成するために、アミンとの後の反応のためのスルホニル
ハライド基;
(g)例えばジスルフィドに転換されるか、またはアルキルおよびアシルハライドと反応
することができるチオール基;
(h)例えばアシル化、アルキル化または酸化され得るアミンまたはスルフヒドリル基;
(i)例えば付加環化、アシル化、マイケル付加等を受けることができるアルケン;およ
び
(j)例えばアミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。
us)または修飾基の集成に必要な反応に参加せず、または妨害しないように選択するこ
とができる。あるいは反応性官能基は保護基の存在により反応へ参加することから保護す
ることができる。当業者は選択した組の反応条件を妨害しないように、どのように特定の
官能基を保護するかを理解している。例えば有用な保護基は、Greene et al
.、有機合成における保護基(PROTECTIVE GROUPS IN ORGAN
IC SYNTHESIS)、ジョン ウィリー&サンズ(John Wiley &
Sons)、ニューヨーク、1991を参照にされたい。
例示態様ではシアル酸誘導体を糖の核として利用して、これに修飾基を結合する。シアル
酸誘導体についての検討に焦点をあてるのは、具体的説明の明瞭性のみのためであり、本
発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者は例としてシアル酸を使用して
説明した様式に準じて、種々の他の糖部分を活性化し、そして誘導化することができると
考えるだろう。例えばガラクトース、グルコース、N−アセチルガラクトサミンおよびフ
コースを修飾して、当該技術分野で認識されている方法により容易に修飾される幾つかの
糖基質を挙げるために多数の方法を利用することができる。例えばElhalabi e
t al.,Curr.Med.Chem.6:93(1999):およびSchafe
r et al.,J.Org.Chem.65:24(2000)を参照にされたい。
胞)またはトランスジェニック動物で生産されるペプチドであり、すなわちN−および/
またはO−結合オリゴ糖鎖を含み、これらは不完全にシアル化されている。シアル酸を欠
き、そして末端ガラクトース残基を含む糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、PEG化、PPG化
またはそうではなく修飾されたシアル酸を用いて修飾することができる。
誘導体の活性化エステルを用いて処理し、糖のアミン残基を対応する保護されたアミノ酸
アミド付加物に転換する。付加物をアルドラーゼを用いて処理してシアル酸2を形成する
。化合物2をCMP−SAシンテターゼの作用により対応するCMP誘導体へ転換し、続
いてCMP誘導体の触媒的水素付加により化合物3を生成する。グリシン付加物の形成を
介して導入されたアミンは、化合物3を活性化PEGまたはPPG誘導体と反応させるこ
とによりPEGまたはPPG結合の位置として利用して(例えばPEG−C(O)NHS
、PPG−C(O)NHS)、それぞれ4または5を生成する。
する。表2の相当の化合物がスキーム1の方法により調製される。他の誘導体は技術的に
認識されている方法により調製される。例えばKeppler et al.,Glyc
obiology 11:11R(2001);およびCharter et al.,
Glycobiology 10:1049(2000)を参照にされたい。他のアミン
反応性PEGおよびPPG類似体は市販されているか、または当業者が容易に入手できる
方法により調製することができる。
の位置でも置換され得る。現在好適なシアル酸の置換を式5に説明する。
択される連結基であり、ここで各RはR1〜R5から独立して選択される員である。記号
Y、Z、AおよびBは、各々がXの同一性について上に説明した基から選択される基を表
す。X、Y、Z、AおよびBはそれぞれ独立して選択され、したがってそれらは同じかま
たは異なることができる。記号R1、R2、R3、R4およびR5はH、ポリマー、水溶
性ポリマー、治療部分、生体分子または他の部分を表す。記号R6はH、OHまたはポリ
マーを表す。あるいはこれらの記号はポリマー、水溶性ポリマー、治療部分、生体分子ま
たは他の部分に結合したリンカーを表す。
のためにマンノサミンが同時にアシル化そして活性化される。
ロロ−誘導化シアル酸を形成する。対応するヌクレオチド糖はシアル酸誘導体を適当なヌ
クレオチドトリホスフェートおよびシンテターゼと接触させることにより調製する。シア
ル酸部分のクロロ基をチオ−PEGのような求核性PEG誘導体に置き換える。
ルボキシレートを用いてアシル化し、対応するアミド−アルキル−カルボン酸を生成し、
これを続いてシアル酸誘導体に転換する。このシアル酸誘導体をヌクレオチド糖に転換し
、そしてカルボン酸を活性化し、そしてアミノ−PEGのような求核性PEG誘導体と反
応させる。
ン酸を、1級ヒドロキシル基を対応するp−トルエンスルホン酸エステルに転換すること
により活性化し、そしてメチルエステルを開裂する。活性化されたノイラミン酸は対応す
るヌクレオチド糖に転換され、そして活性基はチオ−PEGのような求核性PEG種に置
き換える。
護ノイラミン酸誘導体の1級ヒドロキシル部分を、クロロ−PEGのような求電子性PE
Gを使用してアルキル化する。続いてメチルエステルを開裂し、そしてPEG−糖をヌク
レオチド糖に転換する。
とができる。誘導化されたグリカンそれ自体が本発明の範囲内である。すなわちスキーム
9はPEG化ガラクトースヌクレオチド糖への例示合成経路を提供する。ガラクトースの
1級ヒドロキシル基は対応するトルエンスルホン酸エステルのように活性化され、これは
続いてヌクレオチド糖に転換される。
を調製する例示経路を説明する。すなわちガラクトサミンをヌクレオチド糖に転換し、そ
してガラクトサミンのアミン部分を活性なPEG誘導体で官能化する。
はガラクトース−2−アミンであり、これをヌクレオチド糖に転換する。ヌクレオチド糖
のアミン部分は、メトキシ−PEG(mPEG)カルボン酸のようなPEG誘導体を結合
するための位置である。
体(例えばアシル−PEG、アシル−アルキル−PEG、アルキル−アシル−PEGカル
バモイル−PEG、アリール−PEG、アルキル−PEG)、PPG誘導体(例えばアシ
ル−PPG、アシル−アルキル−PPG、アルキル−アシル−PPGカルバモイル−PP
G、アリール−PPG)、ポリアスパラギン酸、ポリグルタメート、ポリリシン、治療部
分、診断部分、マンノース−6−ホスフェート、ヘパリン、ヘパラン、SLex、マンノ
ース、マンノース−6−ホスフェート、シアリルルイスX、FGF、VFGF、タンパク
質(例えばトランスフェリン)、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、デキストラン
、修飾されたデキストラン、アミロース、ビスホスフェート、ポリ−SA、ヒアルロン酸
、ケリタン、アルブミン、インテグリン、アンテナ状オリゴ糖、ペプチド等を含む。種々
の修飾基をサッカリド部分に結合する方法は、当業者が容易に入手できるものである(ポ
リ(エチレングリコールの化学:生物工学的および生物医学的応用(POLY(ETHY
LENE GLYCOL CHEMISTRY:BIOTECHNICAL AND B
IOMEDICAL APPLICATIONS)、J.Milton Harris編
集、プレナム出版社、1992;ポリ(エチレングリコール)の化学および生物学的応用
(POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLO
GICAL APPLICATIONS)、J.Milton Harris編集、AC
Sシンポジウムシリーズ、No.680、アメリカ化学学会、1997;Hermans
on、バイオコンジュゲート技術(BIOCONJUGATE TECHNIQES)、
アカデミック出版、サンディエゴ、1996;およびDunn et al.編集、ポリ
マー性薬剤および薬剤送達系(POLYMERIC DRUGS AND DRUG D
ELIVERY SYSTEMS)、ACSシンポジウムシリーズ、No.469、アメ
リカ化学学会、ワシントン、D.C.1991)。
糖、ヌクレオチド糖および誘導体の精製
上記の方法により生成されたヌクレオチド糖および誘導体は、精製せずに使用すること
ができる。しかし通常、生成物を回収することが好ましい。薄または厚層(thick
layer)クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、または膜濾過のような標準的な周知技法を使用することができる。膜濾過を使用
すること、より好ましくは逆浸透膜を使用することが好ましく、または回収のためにはこ
れから、そして本明細書に引用する技術文献で検討するように1以上のカラムクロマトグ
ラフィー技術を使用することが好適である。例えば膜濾過(ここで膜は約3000〜約1
0,000の分子量カットオフを有する)を使用して、10,000Da未満の分子量を
有する試薬についてタンパク質を取り出すために使用することができる。次に膜濾過また
は逆浸透を使用して塩を除去し、かつ/または生成物サッカリドを精製するために使用す
ることができる(例えば国際公開第98/15581号パンフレットを参照にされたい)
。ナノフィルター(nanofilter)膜は1種の逆浸透膜であり、これは使用する
膜に依存して1価の塩を通すが、多価の塩および約100から約2,000ダルトンより
大きい非電荷溶質は保持する。このように典型的な応用では、本発明の方法により調製さ
れるサッカリドは膜内に保持され、そして混入する塩は通過する。
G.架橋性基
本発明の方法で使用するための修飾された糖の調製には、修飾基の糖残基への結合、そ
してグリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物の形成を含む。このように
修飾基を糖へ結合するために架橋剤を使用することが好ましいことが多い。修飾基を炭水
化物部分に結合するために使用することができる二官能性化合物の例には、限定するわけ
ではないが二官能性ポリ(エチレングリコール)、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエス
テル等を含む。炭水化物を他の分子に連結するための一般的取り組みは、技術文献にて知
られている。例えば、Lee et al.,Biochemistry 28:185
6(1989);Bhatia et al.,Anal.Biochem.178:4
08(1989);Janda et al.,J.Am.Chem.Soc.112:
8886(1990)およびBednarski et al.、国際公開第92/18
135号パンフレットを参照にされたい。以下の考察は反応基が新生の修飾された糖の糖
部分上で良性(benign)として処置される。この考察に焦点をあてるのは具体的説
明の明瞭性のためである。当業者はこの考察が修飾基上の反応基にも関連すると考えるだ
ろう。
−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート)を使用して、保護されたスルフヒドリルの糖
への包含、そして次に修飾基上の別のスルフヒドリルとジスルフィド結合を形成するため
にスルフヒドリルの脱保護が関与する。
悪影響を及ぼす場合、2−イミノチオランまたはN−スクシンイミジルS−アセチルチオ
アセテート(SATA)のような多数のクロスリンカーの1つを使用して、ジスルフィド
結合を形成する。2−イミノチオランは1級アミンと反応し、即座に非保護スルフヒドリ
ルをアミノ−含有分子に包含する。SATAも1級アミンと反応するが保護されたスルフ
ヒドリルを包含し、これは後にヒドロキシルアミンを使用して脱アセチル化されて遊離の
スルフヒドリルを生成する。各々の場合で、包含されたスルフヒドリルは他のスルフヒド
リルまたは保護されたスルフヒドリルとSPDPのように自由に反応し、必要なジスルフ
ィド結合を形成する。
飾基をペプチドに架橋するための様々な方法に使用できる他のクロスリンカーを入手する
ことができる。例えばTPCH(S−(2−チオピリジル)−L−システインヒドラジド
およびTPMPH(S−(2−チオピリジル)メルカプト−プロピオノヒドラジド)は、
穏和な過ヨウ素酸塩処理により前以て酸化された炭水化物部分と反応し、このようにクロ
スリンカーのヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩が生成したアルデヒドとの間にヒドラゾン結
合を形成する。TPCHおよびTPMPHは2−ピリジルチオン保護スルフヒドリル基を
糖に導入し、これはDTTで脱保護することができ、そして次いで成分間にジスルフィド
結合を形成するように結合物に使用される。
成分間により安定な結合を包含する他のクロスリンカーを使用することができる。ヘテロ
二官能性クロスリンカーGMBS(N−ガンマ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイ
ミド)およびSMCC(スクシンイミジル4−(N−マレイミド−メチル)シクロヘキサ
ン)は1級アミンと反応し、これがマレイミド基を成分上に導入する。続いてマレイミド
基は前に挙げたクロスリンカーにより導入することができる他の成分上のスルフヒドリル
と反応し、このようにして成分間に安定なチオエーテル結合を形成する。成分間の立体障
害がいずれかの成分の活性または修飾された糖がグリコシルトランスフェラーゼの基質と
して作用する能力を妨害する場合、成分間に長いスペーサーアームを導入し、そして前に
挙げた幾つかのクロスリンカー(例えばSPDP)の誘導体を含むクロスリンカーを使用
することができる。このように有用な適当なクロスリンカーが豊富に存在し:その各々が
最適なペプチド結合物および修飾された糖の生成に及ぼす効果に依存して選択される。
架橋試薬および架橋結合手順の総説に関しては:Wold,F.Meth.Enzymo
l.25:623−651,1972;Weetall,H.H.,and Coone
y,D.A.:薬剤としての酵素(ENZYME AS DRUGS)で、(Holce
nberg and Roberts編集)、第395〜442頁、ウィリー、ニューヨ
ーク、1981;Ji,T.H,Meth.Enzymol.91:580−609,1
983:Mattson et al.,Mol.Biol.Rep.17:167−1
83,1993を参照にされたい(これらすべては引用により本明細書に編入する))。
好適な架橋剤は種々のゼロ−長(zero−length)、ホモ−二官能性およびヘテ
ロ−二官能性架橋試薬に由来する。ゼロ−長架橋試薬には、外因性の物質の導入が無い、
2つの必須の化学基の直接的結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する試薬は、こ
の範疇に属する。別の例はカルボキシルと1級アミノ基の縮合を導入してアミド結合を形
成する、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード(Woodward'
s)試薬K−(2−エチル−5−フェニルイソオキサゾリウム−3'−スルホネート)お
よびカルボニルイミダゾールのような試薬である。これらの化学試薬に加えて、酵素トラ
スングルタミナーゼ(グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ;EC2
.3.2.13)をゼロ−長の架橋試薬として使用することができる。この酵素は通常、
基質として1級アミノ基を用いて、タンパク質−結合グルタミン残基のカルボキサミド基
でアシル転移反応を触媒する。好適なホモ−およびヘテロ−二官能性試薬はそれぞれ2つ
の同一または2つの似ていない部位を含み、これらはアミノ、スルフヒドリル、グアニジ
ノ、インドールまたは非特異的基と反応性となり得る。
2.架橋試薬中の好適な特異的部位
a.アミノ−反応基
1つの好適な態様では、クロス−リンカー上のこの部位はアミノ−反応基である。アミ
ノ−反応基の有用な非限定的例には、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル
、イミドエステル、イソシアネート、アシルハライド、アリールアジド、p−ニトロフェ
ニルエステル、アルデヒドおよびスルホニルクロライドを含む。
る。ヒスチジンのイミダゾール基は1級アミンと反応を競合するが、反応生成物は不安定
であり、そして容易に加水分解される。この反応にはNHSエステルの酸カルボキシル上
でアミンの求核的攻撃が関与し、アミドを形成してN−ヒドロキシスクシンイミドを放出
する。このようにして元のアミノ基の正電荷が失われる。
試薬である。7から10の間のpHで、イミドエステルは1級アミンとのみ反応する。1
級アミンは求核的にイミデートを攻撃し、高pHでアミジンに、または低pHで新しいイ
ミデートに分解する中間体を生成する。この新たな中間体は別の1級アミンと反応させる
ことができ、これにより単官能性イミデートが二官能的に反応すると仮定する場合、2つ
のアミノ基を架橋する。1級アミノとの反応の主な生成物は、元のアミンよりも強力な塩
基であるアミジンである。したがって元のアミノ基の正電荷が保持される。
して、安定な結合を形成する。スルフヒドリル、イミダゾールおよびチロシル基とそれら
の反応は、比較的不安定な生成物を生じる。
がわずかにアルカリ性の条件下、例えばpH8.5で酸性カルボキシル基を攻撃する。
れた糖成分のアミノ基およびチロシンのフェノール性基と優先的に反応するが、スルフヒ
ドリルおよびイミダゾール基とも反応する。
る。試薬の特異性はそれほど高くないが、α−およびε−アミノ基は最も急速に反応する
ようである。
安定なシッフ塩基がアミノ基とアルデヒドのアルデヒドとの反応で形成されるが、グルタ
ルアルデヒドは安定な架橋により修飾糖を修飾することができる。pH6〜8で(このp
Hは典型的な架橋条件である)、環式ポリマーは脱水を受けてα−β不飽和アルデヒドポ
リマーを形成する。しかしシッフ塩基は別の二重結合と結合した時に安定である。両二重
結合の共鳴的相互作用は、シッフ結合の加水分解を防止する。さらに高い局所的濃度でア
ミンはエチレン二重結合を攻撃して安定なマイケル付加生成物を形成することができる。
スルホンアミド結合を生じるアミノ基との反応が最も重要である。
b.スルフヒドリル−反応基
別の好適な態様では、部位はスルフヒドリル−反応性基である。スルフヒドリル−反応
基の有用な非限定的例には、マレイミド、アルキルハライド、ピリジルジスルフィドおよ
びチオフタルイミドを含む。
テル結合を形成する。それらはまた、より一層遅い反応速度でヒスチジンの1級アミノ基
およびイミダゾール基とも反応する。しかしpH7では、このpHで単純なチオールの反
応速度は対応するアミンの反応速度よりも1000倍大きいので、マレイミド基はスルフ
ヒドリルに特異的な基と考えられる。
応する。しかし中性からわずかにアルカリ性のpHで、アルキルハライドは主にスルフヒ
ドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。より高pHではアミノ基との反
応が有利である。
混合ジスルフィドを与える。結果としてピリジルジスルフィドは最も特異的なスルフヒド
リル−反応基である。
c.カルボキシル−反応性残基
別の態様では、水および有機溶媒に可溶性のカルボジイミドをカルボキシル−反応試薬
として使用する。これらの化合物は遊離のカルボキシル基と反応してプソイドウレアを形
成し、次にこれは利用可能なアミンにカップリングしてアミド結合を形成することができ
る。カルボジイミドを用いてカルボキシル基を修飾する手順は、当該技術分野では周知で
ある(Yamada et al.,Biochemistry 20:4836−48
42,1981を参照にされたい)。
3.架橋試薬中の好適な非特異的部位
部位−特異的な反応性部分に加えて、本発明は糖を修飾基に連結するための非特異的な
反応性基も企図する。
otoactivatable)基を含み、これは適切なエネルギーの光子を吸収すると
反応性種に変換される。好適な態様では、光活性化可能な基は、アジドの加熱または光分
解で生成するニトレンの前駆体から選択される。電子−欠損ニトレンは極めて反応性であ
り、そしてN−H、O−H、C−HおよびC=Cを含む種々の化学結合と反応することが
できる。3種類のアジド(アリール、アルキルおよびアシル誘導体)を使用することがで
きるが、アリールアジドが現在好適である。光分解でのアリールアジドの反応性は、C−
H結合よりもN−HおよびOHでより良い。電子−欠損アリールニトレンは急速に環が拡
大してデヒドロアゼピンを形成し、これはC−H挿入生成物を形成するよりは求核性物質
と反応する傾向がある。アリールアジドの反応性は環中のニトロまたはヒドロキシル基の
ような電子−吸引置換基の存在により上げることができる。そのような置換はより長い波
長にアリールアジドの最大吸収を支援する(push)。非置換アリールアジドは260
〜280nmに範囲の最大吸収を有し、一方、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは
305nmを越えて有意な光を吸収する。したがってヒドロキシおよびニトロアリールア
ジドは、非置換アリールアジドよりも親和性成分に関してより害が少ない光分解条件を使
用するので最も好ましい。
れる。フッ素添加されたアリールアジドの光分解産物はアリールニトレンであり、そのす
べてが高い効率でのC−H結合の挿入を含むこの基に特徴的な反応を受ける(Keana
et al.,J.Org.Chem.55:3640−3647,1990)。
ン試薬は一般にアリールアジド試薬よりも高い架橋結合収量を与える。
欠損カルベンを形成する。これらのカルベンはC−H結合への挿入、二重結合への付加(
芳香族系を含む)、水素誘引および求核中心への配位を含む種々の反応を受け、炭素イオ
ンを与える。
−ニトロフェニルジアゾピルベートのp−ニトロフォニルエステルは脂肪族アミンと反応
してジアゾピルビン酸アミドを与え、これは紫外線の光分解を受けてアルデヒドを形成す
る。光分解したジアゾピルベートで修飾された親和性成分はホルムアルデヒドまたはグル
タルアルデヒドのように反応して架橋を形成する。
4.ホモ二官能性試薬
a.第一アミンと反応性のホモ二官能性クロスリンカー
アミン−反応性クロス−リンカーの合成、特性および応用は、技術文献で工業的使用の
ために記載されている(架橋の手順および試薬の総説については上記を参照にされたい)
。多くの試薬が利用可能である(例えば、ピアスケミカル(Pierce Chemic
al)社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントルイス、モンタナ州
;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
ト(DSG)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ビス(スルホスクシンイミジ
ル)スベレート(BS)、ジスクシンイミジルタルトレート(DST)、ジスルホスクシ
ンイミジルタルトレート(スルホ−DST)、ビス−2−(スクシンイミドオキシカルボ
ニルオキシ)エチルスルホン(BSOCOES)、ビス−2−(スルホスクシンイミドオ
キシカルボニルオキシ)エチルスルホン(スルホ−BSOCOES)、エチレングリコー
ルビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、エチレングリコールビス(スルホ
スクシンイミジルスクシネート)(スルホ−EGS)、ジチオビス(スクシンイミジルプ
ロピオネート)(DSP)およびジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)
(スルホ−DSP)を含む。ホモ二官能性イミドエステルの好適な非−限定的例には、ジ
メチルマロンイミデート(DMM)、ジメチルスクシンイミデート(DMSC)、ジメチ
ルアジピミデート(DMA)、ジメチルピメリミデート(DMP)、ジメチルスベリミデ
ート(DMS)、ジメチル−3,3'−オキシジプロピオンイミデート(DODP)、ジ
メチル−3,3'−(メチレンジオキシ)ジプロピオンイミデート(DMDP)、ジメチ
ル−3'−(ジメチレンジオキシ)ジプロピオンイミデート(DDDP)、ジメチル−3
,3'−(テトラメチレンジオキシ)−ジプロピオンイミデート(DTDP)およびジメ
チル−3,3'−ジチオビスプロピオンイミデート(DTBP)を含む。
シアネート(DITC)、および4,4'−ジイソチオシアノ−2,2'−ジスルホン酸
スチルベン(DIDS)を含む。
トルエン−2,4−ジイソシアネート、トルエン−2−イソシアネート−4−イソチオシ
アネート、3−メトキシジフェニルメタン−4,4'−ジイソシアネート、2,2'−ジ
カルボキシ−4,4'−アゾフェニルジイソシアネートおよびヘキサメチレンジイソシア
ネートを含む。
−ジニトロベンゼン(DFDNB)、および4,4'−ジフルオロ−3,3'−ジニトロ
フェニル−スルホンを含む。
ジアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む。
ステルを含む。
4−ジスルホニルクロライドおよびα−ナフトール−2,4−ジスルホニルクロライドを
含む。
ビスカルバメートを与えるエリトリトールビスカルボネートを含む。
b.遊離スルフヒドリル基と反応性のホモ二官能性クロスリンカー
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている(架橋の手順お
よび試薬の総説については上記を参照にされたい)。多くの試薬が市販されている(例え
ば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントルイス
、モンタナ州;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
、N,N'−(1,3−フェニレン)ビスマレイミド、N,N'−(1,2−フェニレン
)ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミドおよびビス(N−マレイミドメチル)エー
テルを含む。
'−ピリジルジチオ)プロピオンアミドブタン(DPDPB)を含む。
,4'−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α,α'−ジヨード−p−キシレンスルホ
ン酸、α,α'−ジブロモ−p−キシレンスルホン酸、N,N'−ビス(b−ブロモメチ
ル)ベンジルアミン、N,N'−ジ(ブロモアセチル)フェニルヒドラジンおよび1,2
−ジ(ブロモアセチル)アミノ−3−フェニルプロパンを含む。
c.ホモ二官能性の光活性化可能なクロスリンカー
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている(架橋の手順お
よび試薬の総説については上記を参照にされたい)。数種の試薬が市販されている(例え
ば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントルイス
、モンタナ州;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
4−アジドサリチルアミド)エチルジスルフィド(BASED)、ジ−N−(2−ニトロ
−4−アジドフェニル)−シスタミン−S,S−ジオキシド(DNCO)および4,4'
−ジチオビスフェニルアジドを含む。
5.ヘテロ二官能性試薬
a.ピリジルジスルフィド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている(架橋結合の手
順および試薬の総説については上記を参照にされたい)。多くの試薬が市販されている(
例えば、ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州;シグマケミカル社、セントル
イス、モンタナ州;モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州)。
試薬の好適な非限定的例には、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロ
ピオネート(SPDP)、スクシンイミジル6−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン
アミドヘキサノエート(LC−SPDP)、スルホスクシンイミジル6−3−(2−ピリ
ジルジチオ)プロピオンアミドヘキサノエート(スルホ−LCSPDP)、4−スクシン
イミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMP
T)およびスルホスクシンイミジル6−α−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルア
ミドヘキサノエート(スルホ−LC−SMPT)を含む。
b.マレイミド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている。マレイミド部
分およびアミノ−反応性NHSエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定的例に
は、スクシンイミジルマレイミジルアセテート(AMAS)、スクシンイミジル3−マレ
イミジルプロピオネート(BMPS)、N−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミ
ドエステル(GMBS)N−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステ
ル(スルホ−GMBS)スクシンイミジル6−マレイミジルヘキサノエート(EMCS)
、スクシンイミジル3−マレイミジルベンゾエート(SMB)、m−マレイミドベンゾイ
ル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、m−マレイミドベンゾイル−N
−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ−MBS)、スクシンイミジル4−
(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、スル
ホスクシンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレ
ート(スルホ−SMCC)、スクシンイミジル 4−(p−マレイミドフェニル)ブチレ
ート(SMPB)およびスルホスクシンイミジル 4−(p−マレイミドフェニル)ブチ
レート(スルホ−SMPB)を含む。
c.アルキルハライド部分を持つアミノ−反応性ヘテロ二官能性試薬
そのような試薬の合成、特性および応用は、技術文献に記載されている。アルキルハラ
イド部分およびアミノ−反応性NHSエステルを持つヘテロ二官能性試薬の好適な非限定
的例には、N−スクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIA
B)、スルホスクシンイミジル−(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(スルホ−
SIAB)、スクシンイミジル−6−(ヨードアセチル)アミノヘキサノエート(SIA
X)、スクシンイミジル−6−(6−((ヨードアセチル)−アミノ)ヘキサノイルアミ
ノ)ヘキサノエート(SIAXX)、スクシンイミジル−6−(((4−ヨードアセチル
)−アミノ)−メチル)−シクロヘキサン−1−カルボニル)アミノヘキサノエート(S
IACX)およびスクシンイミジル−4((ヨードアセチル)−アミノ)−メチルシクロ
ヘキサン−1−カルボキシレート(SIAC)を含む。
試薬の好適な例には、N−ヒドロキシスクシンイミジル 2,3−ジブロモプロピオネー
ト(SDBP)を含む。SDBPは、クロスリンカーをアミノ基に結合することにより親
和性成分に分子内クロスリンカーを導入する。1級アミン基に対するジブロモプロピオニ
ル部分の反応性は、反応温度により制御される(McKenzie et al.,Pr
otein Chem.7:581−592(1988))。
テロ二官能性試薬の好適な非限定的例には、p−ニトロフェニルヨードアセテート(NP
IA)を含む。
許第5,965,106号明細書を参照にされたい。特定の応用のための適切な架橋剤を
選択する能力は、当業者の能力の範囲内である。
d.開裂性リンカー基
さらなる態様では、リンカー基には開裂して糖残基から修飾基を放出することができる
基が提供される。多くの開裂性基が当該技術分野では知られている。例えばJung et al.,
Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol. Chem. 265: 1
4518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol. 124: 913-920 (1980); Bouizar et a
l., Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Park et al., J. Biol. Chem. 261: 205-2
10 (1986); Browning et al., Immunol. 143: 1859-1867 (1989)を参照にされたい。さら
に広範な開裂性の二官能性(ホモ−およびヘテロ−二官能性の両方)リンカー基がピアス
のような供給元から市販されている。
酸塩等のような試薬を使用して開裂することができる。さらに特定の好適な基はエンドサ
イトーシスされる反応でインビボで開裂される(例えばシス−アコニチル;Shen e
t al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.102:104
8(1991)を参照にされたい)。好適な開裂性基は、ジスルフィド、エステル、イミ
ド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシルおよびベンゾイン基からなる群から選択
される員である開裂性部分を含んでなる。
e.修飾された糖のペプチドへの結合
修飾された糖は、結合を媒介する適切な酵素を使用してグリコシル化または非グリコシ
ル化ペプチドに結合される。好ましくは修飾された供与体の糖(1つまたは複数)、酵素
(1つまたは複数)および受容体ペプチド(1つまたは複数)の濃度は、受容体が消費さ
れるまでグリコシル化が進行するように選択される。以下に検討する考察は、シアリルト
ランスルフェラーゼの内容について説明すると同時に、一般に他のグリコシルトランスフ
ェラーゼ反応に応用することできる。
知られており、そして一般に本発明に応用することができる。例示方法は例えば、国際公
開第96/32491号パンフレット、Ito et al.,Pure Appl.C
hem.65:753(1993)、および米国特許第5,352,670号、同第5,
374,541号および同第5,545,553明細書に記載されている。
組み合わせを使用して実施される。例えばシアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシ
ルトランスフェラーゼの組み合わせを使用することができる。1以上の酵素を使用するそ
れらの態様では、酵素および基質は好ましくは最初の反応混合物で合わせられるか、また
は第2の酵素反応用の酵素および試薬はいったん第1酵素反応が完了したら、またはほぼ
完了したら反応媒質に加えられる。2つの酵素反応を1つの反応槽で順次行うことにより
、中間体種が単離される手順よりも全体的な収量が改善する。さらに過剰な溶媒および副
産物の洗浄および廃棄が減少する。
好適な態様では、1つの酵素がエンドグリコシダーゼである。別の好適な態様では、1つ
の酵素がエキソグリコシダーゼである。さらに好適な態様では、2より多くの酵素を使用
して本発明の修飾された糖タンパク質を集成する。酵素は、修飾された糖をペプチドに加
える前または後の任意の時点で、ペプチド上のサッカリド構造を改変させるために使用す
る。
そしてペプチドのサッカリド構造に加えられる最後の糖は修飾されていない糖である。代
わりに修飾された糖がグリカン構造の内部にあり、したがってグリカン上に最終的な糖は
必要ない。例示態様では、ガラクトシルトランスフェラーゼはGal−PEGのUDP−
Gal−PEGからグリカンへの転移を触媒することができ、続いてST3Gal3およ
びCMP−SA(これは「キャッピング」する非修飾シアル酸をグリカンに加えるために
役立つ)の存在下でインキューベーションする(図22A)。
、そして少なくとも2つの修飾された糖がペプチド上のグリカン構造に加えられる。この
様式で、2以上の異なる複合糖質をペプチド上の1以上のグリカンに加えることができる
。この方法は、2以上の機能的に異なる修飾された糖を有するグリカン構造を生成する。
例示態様では、ペプチドとGnT−I、IIとUDP−GlcNAc−PEGとのインキ
ューベーションは、GlcNAc−PEG分子をグリカンに付加するために役立ち;次い
でガラクトシルトランスフェラーゼとUDP−Galのインキューベーションは、Gal
残基をそれに付加するために役立ち;そしてST3Gal3とCMP−SA−Man−6
−ホスフェートのインキューベーションは、SA−マンノース−6−ホスフェート分子の
グリカンへの付加に役立つ。この反応順序で、PEG化グリカンの機能的特徴ならびにマ
ンノース−6−ホスフェート標的化活性を有するグリカン鎖をもたらす(図22B)。
であり、そしてここでも異なる修飾された糖がペプチド上のN−結合およびO−結合グリ
カンに加えられる。この態様は2つの異なる修飾された糖がペプチドのグリカンに加えら
れるようになる時、しかしペプチド上の修飾された糖を互いに空間的に離すことが重要で
ある時に特に有用である。例えば修飾された糖が、限定するわけではないがPEGおよび
リンカー分子のような他の分子を含む嵩高の分子を含んでなる時、この方法が好ましいか
もしれない。修飾された糖はペプチド上のグリカン構造に同時に加えるか、またはそれら
を順次加えてもよい。例示態様では、ST3Gal3およびCMP−SA−PEGとのイ
ンキューベーションは、シアル酸−PEGをN−結合グリカンに加えるために役立つが、
ST3Gal1およびCMP−SA−ビスホスホネートとのインキューベーションはシア
ル酸−ビスホスホネートをO−結合グリカンへ加えるために役立つ(図22C)。
。グリコシダーゼは典型的には突然変異体であり、これはグリコシル結合を破壊というよ
うは形成するように工作されている。突然変異体のグリカナーゼは時折、グリコシンター
ゼと呼ばれるが、典型的には活性部位の酸性アミノ酸残基にアミノ酸残基の置換を含む。
例えばエンドグリカナーゼがエンド−Hである時、置換される活性部位の残基は典型的に
は130位のAsp、132位のGlu、またはそれらの組み合わせである。アミノ酸は
一般にセリン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンに置換される。トランスシアリ
リダーゼのようなエキソグリコシダーゼも有用である。
より反応を触媒する。これらの態様では、グリコシル供与体分子(例えば所望するオリゴ
−またはモノ−サッカリド構造)が脱離基を有し、そして反応は供与体分子をタンパク質
上のGlcNAc残基へ加えることにより進行する。例えば脱離基はフルオリドのような
ハロゲンであることができる。別の態様では脱離基はAsnまたはAsn−ペプチド部分
である。さらなる態様では、グリコシル供与体分子上のGlcNAc残基が修飾される。
例えばGlcNAc残基は1,2オキサゾリン部分を含んでなることができる。
。特定酵素の触媒量は、その酵素基質の濃度ならびに温度、時間、pH値のような反応条
件に従い変動する。予め選択した基質濃度および反応条件下での所定の酵素の触媒量を決
定する手段を、当業者は周知である。
度までの範囲で変動することができる。好適な温度範囲は約0℃から約55℃、そしてよ
り好ましくは約30℃から約37℃である。別の例示態様では、本方法の1以上の成分が
好熱性酵素を使用して高温で行われる。
望の結合物を形成する。結合物の中にはしばしば数時間後に検出できるものもあり、回収
可能な量は通常、24時間以内に得られる。当業者は反応速度は多数の可変性因子(例え
ば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒容量)に依存し、これは選択する系
に至適化されると理解している。
に、工業的規模では一般に少なくとも1グラムの完成され、精製された結合物が生産され
る。
より例示される。例示する修飾されたシアル酸はPEGで標識される。以下の検討をPE
G−修飾シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に焦点をあてるのは具体的説明の明
瞭さのためであり、本発明がこれら2つのパートナーの結合に限定されることを意味する
ものではない。当業者はこの検討が一般にシアル酸以外の修飾されたグリコシル部分の付
加に応用できることを理解している。さらにこの検討は他の水溶性ポリマー、治療部分お
よび生体分子を含むPEG以外の作用物質を含むグリコシル単位の修飾にも等しく応用で
きる。
選択的導入に使用することができる。この方法はPEG、PPG、または遮蔽された反応
性官能基を含む修飾された糖を利用し、そして適切なグリコシルトランスフェラーゼまた
はグリコシンターゼと組み合わせる。所望する炭水化物結合を作るグリコシルトランスフ
ェラーゼを選択し、そして供与体基質として修飾された糖を利用することにより、PEG
またはPPGをペプチド骨格に、糖ペプチドに既存の糖残基に、またはペプチドに加えら
れた糖残基に直接導入することができる。
天然に存在する構造として、または組換え的に、酵素的にまたは化学的にそこに配置され
たものとして存在する。適当な受容体には例えばGalβ1,4GlcNAc、Galβ
1,4GalNAc、Galβ1,3GalNAc、ラクト−N−テトラオース、Gal
β1,3GlcNAc、Galβ1,3Ara、Galβ1,6GlcNAc、Galβ
1,4Glc(ラクトース)のようなガラクトシル受容体、および当業者に知られている
他の受容体を含む(例えば、Paulson et al.,J.Biol.Chem.
253:5617−5624(1978)を参照にされたい)。
チドのインビボ合成で存在する。そのようなペプチドは、ペプチドのグリコシル化パター
ンの前修飾無しで特許請求する方法を使用してシアリル化することができる。あるいは本
発明の方法を使用して、適切な受容体を含まないペプチドをシアリル化することができ;
最初にペプチドを当該技術分野で既知の方法により受容体を含むように修飾する。例示態
様では、GalNAc残基をGalNAcトランスフェラーゼの作用により加える。
受容体(例えばGlcNAc)に結合することにより集成する。この方法には修飾される
ペプチドを適当量のガラクトシルトランスフェラーゼ(例えばgalβ1,3またはga
lβ1,4)および適当なガラクトシル供与体(例えばUDP−ガラクトース)を含む反
応混合物とインキューベーションすることを含む。反応は実質的に完了するまで進行する
ように行うか、あるいは反応は前以て選択した量のガラクトース残基が加えられた時に終
了する。選択したサッカリド受容体を集成する他の方法は、当業者には明らかである。
rimmed」されて、シアリルトランスフェラーゼの受容体または適当な受容体を得る
ために1以上の適切な残基を加えることができる部分のいずれかを露出する。グリコシル
トランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼのような酵素(例えば米国特許第5,7
16,812号明細書を参照にされたい)は、付加および改作反応に有用である。「改作
」およびN−結合およびO−結合グリカンの改造に関する詳細な検討は、本文献のいたる
ところに提供されている。
例示される。これに焦点をあてるのは具体的説明の明瞭さのためである。当業者はこの検
討は修飾される糖が治療部分、生体分子等を持つ態様にも等しく関連すると考えるだろう
。
説明し、これは高マンノースが第1世代の2アンテナ構造に戻し改作されるスキームを説
明する。水溶性ポリマーを持つ修飾された糖は、「戻し改作(trimming bac
k」により露出した1以上の糖残基に結合される。1つの態様では水溶性ポリマーは水溶
性ポリマーに結合したGlcNAc部分を介して加えられる。修飾されるGlcNAcは
2アンテナ構造の1または両末端マンノース残基に付けられる。あるいは非修飾GlcN
Acを分岐種の1または両末端に加えることができる。
c残基に結合するガラクトース残基を有する修飾された糖を介して、2アンテナ構造の1
または両方の末端マンノース残基に加えられる。あるいは非修飾Galを1または両方の
末端GlcNAc残基に加えることができる。
られる。
マンノース構造がマンノースに「戻し改作」され、それから2アンテナ構造が分岐する。
1例では、水溶性ポリマーがポリマーで修飾されたGlcNAcを介して加えられる。あ
るいは非修飾GlcNAcをマンノースに加え、続いて結合した水溶性ポリマーを持つG
alを加える。さらに別の態様では、非修飾GlcNAcおよびGal残基を順次マンノ
ースに加え、続いて水溶性ポリマーで修飾したシアル酸部分を加える。
ンノースをGlcNAcに「戻し改作」し、これに第1マンノースを結合させる。Glc
NAcは水溶性ポリマーを持つGal残基に結合する。あるいは非修飾GalをGlcN
Acに加え、続いて水溶性糖で修飾したシアル酸を加える。さらなる例では、末端Glc
NAcをGalに結合し、そして続いてGlcNAcを水溶性ポリマーを持つ修飾された
フコースでフコシル化する。
ドのAsnに結合した第1GlcNAcに戻し改作される。1例では、GlcNAc−(
Fuc)a残基のGlcNAcを、水溶性ポリマー持つGlcNAcに結合させる。別の
例では、GlcNAc−(Fuc)a残基のGlcNAcを、水溶性ポリマーを持つGa
lで修飾する。さらに別の態様では、GlcNAcをGalで修飾し、続いて水溶性ポリ
マーで修飾したシアル酸をGalに結合する。
の説明は、前述の各図面に提供されている。
方法を使用して「戻し工作」し、そして実質的に任意の所望する構造の炭水化物残基に構
築することが可能である。修飾された糖は上記に説明したように炭水化物部分の末端に加
えることができ、あるいはこれはペプチドコアと炭水化物の末端との間の中間体となるこ
とができる。
により元となるガラクトシル残基のすべてまたはほとんどを露出する(unmaskin
g)。あるいはペプチドもしくは糖ペプチドをガラクトース残基、あるいはガラクトース
単位で終了したオリゴ糖残基で標識する。ガラクトース残基を露出または付加した後、適
切なシアリルトランスフェラーゼを使用して修飾されたシアル酸を加える。この取り組み
をスキーム12にまとめる。
存在する。遮蔽した反応基は好ましくは、修飾されたシアル酸をペプチドに結合するため
に使用する条件に影響を受けない。修飾されたシアル酸のペプチドへの共有結合後、遮蔽
を除き、そしてペプチドをPEG、PPG、治療部分、生体分子または他の作用物質と結
合させる。作用物質は、修飾された糖残基上の露出した反応基との反応により特異的様式
でペプチドに結合する。
グリコシルトランスフェラーゼと使用することができる(表3)。上で検討したように、
PEG化またはPPG化構造の導入に必要な糖ペプチドの末端糖は、発現中に天然に導入
できるか、あるいは適切なグリコシダーゼ(1つまたは複数)、グリコシルトランスフェ
ラーゼ(1つまたは複数)またはグリコシダーゼ(1つまたは複数)およびグリコシルト
ランスフェラーゼ(1つまたは複数)の混合を使用して発現後に生成することができる。
ルトランスフェラーゼと反応させ、これにより修飾されたガラクトースを適切な末端N−
アセチルグルコサミン構造に転移させる。糖ペプチドの末端GlcNAc残基は、哺乳動
物、昆虫、植物または真菌のような発現系で起こるように発現中に生成され得るが、糖ペ
プチドを必要に応じてシアリダーゼおよび/またはグリコシダーゼおよび/またはグリコ
シルトランスフェラーゼで処理することにより生成することもできる。
−GlcNAcを糖ペプチドのマンノース残基に転移するために利用する。さらなる例示
態様では、N−および/またはO−結合グリカン構造を糖ペプチドから酵素的に除去して
アミノ酸または末端グリコシル残基を露出し、次いでこれを修飾された糖に結合する。例
えばエンドグリカナーゼを使用して糖ペプチドのN−結合構造を除去して、末端GlcN
Acを糖ペプチド上のGlcNAc−結合−Asnとして露出する。UDP−Gal−P
EGおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG−またはPPG−ガ
ラクトース官能基を露出したGlcNAc上に導入する。
リコシルトランスフェラーゼを使用してペプチド骨格に直接加える。この例示態様はスキ
ーム14で説明する。本発明を実施するために有用なグリコシルトランスフェラーゼの例
には、限定するわけではないがGalNAcトランスフェラーゼ(GalNAcT1−1
4)、GlcNAcトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトラ
ンスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ等を含
む。この取り組みの使用は、炭水化物を欠くペプチド上へ、あるいは既存の糖ペプチド上
への修飾された糖の直接的付加を可能とする。両方の場合で、修飾された糖の付加はグル
コシルトランスフェラーゼの基質特異性により定められるペプチド骨格上の特異的な位置
で起こり、そして化学的な方法を使用したタンパク質のペプチド骨格の修飾中に起こる様
式のような無作為の様式では起こらない。適当なアミノ酸配列をペプチド鎖に工作するこ
とにより、多くの作用物質がグルコシルトランスフェラーゼの基質ペプチド配列を欠くタ
ンパク質または糖ペプチドに導入され得る。
された糖がペプチドに結合した後に利用することができる。例示態様では、酵素(例えば
フコシルトランスフェラーゼ)を使用してグルコシル単位(例えばフコース)をペプチド
に結合した末端修飾糖に付加(append)する。別の例では酵素反応を利用して修飾
された糖が結合できなかった部位を「キャップ」する。あるいは化学反応を利用して結合
した修飾糖の構造を改変させる。例えば結合した修飾糖を、修飾糖が結合しているペプチ
ド成分との結合を安定化または不安定化する作用物質と反応させる。別の例では、修飾さ
れた糖の成分をそのペプチドへの結合後に脱保護する。当業者は修飾された糖がペプチド
に結合した後の段階で本発明の方法に有用な多数の酵素的または化学的手順があると考え
るだろう。修飾された糖−ペプチド結合物のさらなる仕上げ(elaboration)
は、本発明の範囲内である。
マンノース−6−ホスフェートでのペプチドの標的化
例示態様では、ペプチドを少なくとも1つのマンノース−6−ホスフェート部分で誘導
化する。マンノース−6−ホスフェート部分はペプチドを細胞のリソソームに標的し、そ
して例えばリソソーム蓄積疾患(lysosomal storage disease
)の治療に治療用タンパク質をリソソームに標的するために有用である。
素をコードする遺伝子の欠損の結果である40を越える疾患群である。次いで酵素産物、
例えば糖および脂質は新たな生成物に再使用される。これら各疾患はリソソーム中の酵素
レベルに影響を及ぼす遺伝する常染色体またはX−結合劣性形質から生じる。一般に影響
を受けている個体の細胞および組織中には、影響を受けた酵素の生物学的または機能的活
性が無い。表4は代表的蓄積疾患および疾患に関連する酵素的欠失の一覧を提供する。そ
のような疾患では、酵素機能の欠乏が身体の細胞中のリソソームに脂質または炭水化物基
質の進行的な全身性の沈積を生じ、最終的には器官の機能損失および死を引き起こす。遺
伝的病因論、臨床的発現、分子生物学およびリソソーム蓄積疾患の可能性は、Scriv
er et al.編集、遺伝疾患の代謝および分子的基礎(THE METABOLI
C AND MOLECULAR BASIS OF INHERITED DISEA
SE)、7.sup.th.Ed、Vol.II、マグローヒル(1995)に詳細に記
載されている。
することがリソソーム蓄積疾患を処置する貴重な取り組みであると最初に提案した(De
Duve,Fed.Proc.23:1045(1964))。その時から、酵素代替
治療が様々なリソソーム蓄積疾患を処置するために有益になり得るという種々の研究が提
案された。最高の成功は、胎盤から(Ceredase(商標))またはより最近では組
換え的(Cerezyme(商標))に調製した外因性酵素(β−グルコセレブロシダー
ゼ)で処置したI型ゴーシェ病を持つ個体で示された。酵素代替はファブリー病ならびに
他のリソソーム蓄積疾患を処置するためにも有益であることが示唆された。例えばDaw
son et al.,Ped.Res.7(8):684−690(1973)(イン
ビトロ)およびMapes et al.,Science 169:987(1970
)(インビボ)を参照にされたい。酵素代替治療の臨床試験は、正常血漿(Mapes
et al.,Science 169:987−989(1970))、胎盤から精製
したα−ガラクトシダーゼA(Brady et al.,N.Eng.J.Med.2
79:1163(1973));または脾臓または血漿から精製したα−ガラクトシダー
ゼA(Desnick et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
76:5326−5330(1979))の潅流を使用したファブリー患者について報告
され、そしてファブリー病の直接的酵素代替の生物化学的効力が証明された。これらの研
究は反復した酵素代替により病理学的な糖脂質蓄積を排除し、または有意に減少するため
の可能性を示す。例えば1つの実験では(Desnick et al.,同上)、精製
された酵素の静脈内注入で、蓄積される脂質物質、グロボトリアシルセラミドの血漿レベ
ルに一過性の減少がもたらされた。
的に活性なリソソーム酵素を、欠乏細胞に提供するための方法の必要性が存在する。最近
、組換え的な方法でこれらの必要性に取り組んだ、例えば米国特許第5,658,567
号、同第5,580,757明細書;Bishop et al.,Proc.Natl
.Acad.Sci.USA83:4859−4863(1986);Medin et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7917−7922(
1996);Novo,F.J.,Gene Therapy.4:488−492(1
997);Ohshima et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA94:2540−2544(1997);およびSugimoto et al.,
Human Gene Therapy 6:905−916(1995)を参照にされ
たい。マンノース−6−ホスフェートは治療用ペプチドがリソソームを標的とすることを
媒介し、本発明は十分量の生物学的に活性なリソソームペプチドを欠損細胞に送達するた
めの組成物および方法を提供する。
よるペプチドを提供する(図23および図24)。ペプチドは組換え的または化学的に調
製することができる。さらにペプチドは完全に天然な配列であるか、または例えば短縮化
、延長により修飾することができ、あるいは置換または欠失を含んでもよい。本発明の方
法を使用して改造されるタンパク質の例は、グルコセレブロシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、α−ガラクトシダーゼA、酸性−α−グルコシダーゼ(酸性マルターゼ)を含む。臨
床的に使用する代表的な修飾されたペプチドには、限定するわけではないがCereda
se(商標)、Cerezyme(商標)およびFabryzyme(商標)を含む。修
飾され、そして臨床的に関連するペプチド上のグリコシル基も、本発明の方法を利用して
改変させることができる。マンノース−6−ホスフェートはグリコシル連結基を介してペ
プチドに結合させる。例示態様では、グリコシル連結基はシアル酸に由来する。シアル酸
−由来グリコシル連結基の例は表2に説明し、ここで1以上の"R"部分がマンノース−
6−ホスフェートまたは結合した1以上のマンノース−6−ホスフェート部分を有するス
ペーサー基である。修飾されたシアル酸部分は好ましくはペプチドの表面に結合したオリ
ゴ糖の末端残基である(図25)。
分、またはさらなる標的部分のような部分を用いて誘導化することができる。これらのお
よび他の基を結合する方法は本明細書で説明する。例示態様では、マンノース−6−ホス
フェート以外の基を、表2に従い誘導化されたシアル酸誘導体を介してペプチドに結合さ
せ、ここで1以上の"R"部分がマンノース−6−ホスフェート以外の基である。
分を調製する。対応するヌクレオチド糖を調製し、そしてCbz基は触媒的水素添加によ
り除去する。生成するヌクレオチド糖は、利用可能な反応性アミンを有し、これを活性化
マンノース−6−ホスフェート誘導体と接触させて、本発明の方法の実施に有用であるマ
ンノース−6−ホスフェート誘導化ヌクレオチド糖を提供する。
誘導体の例は、2−ブロモ−ベンジル−保護ホスホトリエステルを対応するトリフラート
にその場で転換し、そしてトリフラートと反応性酸素を含有する部分を有するリンカーと
を反応させ、糖とリンカーとの間にエーテル結合を形成することにより形成される。ベン
ジル保護基は触媒的水素添加により除去され、そしてリンカーのメチルエステルは加水分
解され、対応するカルボン酸を提供する。カルボン酸は当該技術分野で既知の方法により
活性化される。活性化手順の例は、カルボン酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル
への転換に依る。
アル酸をピルビル部分の操作によりアミンに転換する。このように1級ヒドロキシルをス
ルホン酸エステルに転換し、そしてアジ化ナトリウムと反応させる。アジドを対応するア
ミンに触媒的に還元する。続いて糖はヌクレオチド類似体に転換し、そしてアミン基を介
して上記のように調製したリンカーアーム−誘導化マンノース−6−ホスフェートにカッ
プリングする。
ンスフェリン、(血液脳関門をわたり、そしてエンドソームにペプチドを送達するために
)、カルニチン(ペプチドを筋肉細胞に送達するために)、およびホスホネート、例えば
ビスホスホネート(ペプチドを骨および他の炭酸カルシウムを含む組織を標的とさせるた
めに)を含む他の標的部分で誘導化することができる。標的部分および治療用ペプチドは
本明細書に記載する任意の方法または当該技術分野で既知の方法により結合される。
る。この態様では、少なくとも1つの治療用ペプチドまたは標的剤が本発明の方法に従い
、リンカー部分に完全なグリコシル連結基を介してカップリングされる。例示態様では、
リンカー部分にはポリ(エチレングリコール)のようなポリ(エーテル)を含む。別の例
示態様ではリンカー部分は、結合物を身体中の標的とする組織または領域に送達した後、
インビボで分解されて標的剤から治療用ペプチドを放出する少なくとも1つの結合を含む
。
リコホームの改変を介して治療部分のインビボ分布が改変される。例えば治療用ペプチド
はシアル酸(またはその誘導体)でグリコシル基の末端ガラクトース部分をキャッピング
することにより、網内系による取り込みからそらすことができる(図23および26)。
末端Galを覆うシアリル化は、肝臓のアシアロ糖タンパク質(ASGP)レセプターに
よるペプチドの取り込みを回避し、そしてシアリル化が無い複雑なグリカン鎖のみを有す
るペプチドに比べてペプチドの半減期を伸ばすことができる。
II.本発明のペプチド/糖ペプチド
1つの態様では、本発明は基本的なトリマンノシルコアを主要なグリカン構造としてペ
プチドに結合して有する1つのペプチドの多数のコピーを含んでなる組成物を提供する。
好適な態様では、ペプチドは治療用分子である。ペプチドの天然な形態は複雑なN−結合
グリカンを含んでなることができ、あるいは高マンノースグリカンでよい。ペプチドは哺
乳動物のペプチドでよく、そして好ましくはヒトのペプチドである。幾つかの態様では、
ペプチドは免疫グロブリン、エリスロポエチン、組織型アクチベーターペプチドおよびそ
の他からなる群から選択される(図1を参照にされたい)。
(例えば抗体、MHC分子、T細胞レセプター等)、細胞間レセプター(例えばインテグ
リン、ホルモンまたは増殖因子のレセプター等)レクチン、およびサイトカイン(例えば
インターロイキン)を含む。さらなる例にはとりわけ、組織プラスミノーゲンアクチベー
ター(TPA)、レニン、第VIII因子およびIX因子のような凝固因子、ボンベシン
、トロンビン、造血増殖因子、コロニー刺激因子、ウイルス抗原、補体ペプチド、α1−
アンチトリプシン、エリトロポエチン、P−セレクチン糖ペプチドリガンド−1(PSG
L−1)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、抗−トロンビンIII、インター
ロイキン、インターフェロン、ペプチドAおよびC、フィブリノーゲン、hercept
in(商標)、レプチン、グリコシダーゼを含む。ペプチドの一覧は例であり、排他的で
あると考えるべきではない。むしろ本明細書に提供する開示から明らかなように、本発明
の方法は所望するグリカン構造を形成することができる任意のペプチドに応用可能である
。
分を含むキメラペプチドを含むキメラペプチドの修飾にも有用である。
、あるいはそれらは部位指向的突然変異誘発法のような当該技術分野で既知の方法により
生成される突然変異したペプチドであることができる。ペプチドのグリコシル化は典型的
にはN−結合またはO−結合である。N−結合の例は、修飾された糖のアスパラギン残基
の側鎖への結合である。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリンおよびアスパラギン
−X−トレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸である)は、アスパラギン
側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。このようにペプチド中のこ
れらトリペプチド配列のいずれかの存在が潜在的なグリコシル化部位を作成する。本明細
書のいたるところで開示するように、O−結合グリコシル化は、1つの糖(例えばN−ア
セチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、GlcNAc、グルコース、フコー
スまたはキシロース)の、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはトレオニンのヒ
ドロキシ側鎖への結合を指すが、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリシンも
使用することができる。
れる名前を有するペプチド、および例示ペプチドとして他の具体的なペプチドを使用する
が、これらの例は具体的ペプチドに限定するものではない。以下の例示態様はすべてのペ
プチド均等物および任意のペプチドの変異体を含むことを意図している。そのような変異
体には限定するわけではないが、N−結合およびO−結合グリコシル化部位の付加または
削除、および加えたグリコシル化部位との融合タンパク質を含む。当業者は以下の態様お
よびそこに開示されている基本的方法が多くのペプチドに応用でき、等しく成功すると考
えるだろう。
の方法を提供する。図27A〜27Gは、本明細書に開示する方法論を使用してこれがど
のようになされるかの幾つかの例を説明する。図27Bでは、哺乳動物細胞系で発現した
G−CSFペプチドをシアリダーゼを使用して戻し改作する。このように露出した残基は
、それに適切な供与体およびST3Gal1を使用してシアル酸−ポリ(エチレングリコ
ール)部分(PEG部分)の付加により修飾される。図27Cは昆虫細胞で発現したG−
CSFペプチドを修飾するための例示スキームを説明する。このペプチドは、それに適切
な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトース部分を加えるこ
とにより修飾する。ガラクトース残基は、シアル酸−PEG誘導体を介してST3Gal
1の作用を通してPEGで官能化される。図27Dでは、細菌が発現したG−CSFをN
−アセチルガラクトサミン供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ
と接触させる。このペプチドはPEG化シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラー
ゼを使用してPEGで官能化する。図27Eでは、哺乳動物細胞が発現したG−CSFを
レブリン酸で修飾したシアル酸供与体と接触させ、反応性ケトンをシアル酸供与体に加え
る。ペプチド上のグリカン上のグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−または
アミン−PEGのような部分で誘導化する。図27Fでは細菌が発現したG−CSFを、
ペプチドをエンド−GalNAc酵素と、これが加水分解的様式ではなく合成的に機能す
る条件下で接触させ、これによりPEG−Gal−GalNAc分子をそれらの活性化誘
導体から加える。図27Gは細菌が発現したG−CSFの別の改造経路を提供する。ポリ
ペプチドはPEG化N−アセチルガラクトサミン残基を用いて、ポリペプチドをN−アセ
チルガラクトサミントランスフェラーゼおよび適切なPEG化N−アセチルガラクトサミ
ンの供与体と接触させることにより誘導化する。
C(IFNα14C)を修飾する方法を提供する。様々なIFNα形態を本明細書のいた
るところに開示する。図28Bでは哺乳動物細胞で発現したIFNα14Cを最初にシア
リダーゼで処理してそれらの上のシアル酸単位を戻し改作し、そして次いでこの分子をS
T3Gal3およびPEG化シアル酸供与体を使用してPEG化する。図28Cでは最初
にN−アセチルグルコサミンを昆虫もしくは真菌細胞で発現したIFNα14Cに加え、
ここで反応はGnT−Iおよび/またはIIの作用を介してN−アセチルグルコサミン供
与体を使用して行う。次いでポリペプチドはガラクトシルトランスフェラーゼおよびPE
G化−ガラクトースの供与体を使用してPEG化される。図28Dでは酵母で発現したI
FNα14Cを最初にエンド−Hで処理してその上のグリコシル単位を戻し改作する。こ
の分子はガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクト
シル化し、そして次にこれをST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用して
PEG化する。図28Fでは哺乳動物細胞により生産されたIFNα14Cが、ST3G
al3およびPEG化−シアル酸の供与体を使用して修飾されてPEG部分が少しづつ動
かれされる(inched)。図28Gでは昆虫または真菌細胞で発現したIFNα14
Cは、最初に1以上のGnT I、II、IVおよびV、およびN−アセチルグルコサミ
ン供与体を使用してN−アセチルグルコサミンが加えられる。このタンパク質は次いで適
切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次
いでIFNα14CはST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG
化される。図28Hでは酵母が生産したIFNα14Cを最初にマンノシダーゼで処理し
てマンノシル基を戻し改作する。次いでN−アセチルグルコサミンが、N−アセチルグル
コサミンの供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用して加えられる
。さらにIFNα14Cは適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用し
てガラクトシル化される。次いでポリペプチドはST3Gal3およびPEG−シアル酸
の供与体を使用してPEG化される。図28IではNSO細胞が発現したIFNα14C
を、適切な末端残基をレブリン酸で修飾したシアル酸供与体でキャッピングすることによ
り修飾し、これにより反応性ケトンをシアル酸供与体に付加する。ペプチドのグリコシル
残基へ加えた後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する
。図28Jでは哺乳動物細胞により発現されたIFNα14Cが、PEG−シアル酸の供
与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してPEG化される。図28K
では哺乳動物細胞により生産されたIFNα14Cが最初にシアリダーゼを用いて末端シ
アル酸残基を戻し改作され、そして次に分子はトランス−シアリダーゼおよびPEG化シ
アル酸−ラクトース複合体を使用してPEG化される。図28Lでは哺乳動物系で発現し
たIFNα14Cがシアル酸の供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使
用してシアル化される。図28Mでは昆虫または真菌細胞で発現したIFNα14Cに、
最初に適切な供与体およびGnTIおよび/またはIIを使用してN−アセチルグルコサ
ミンが加えられる。次いで分子をガラクトシルトランスフェラーゼおよびリンカーを介し
て反応性シアル酸で誘導化したガラクトース供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカ
ーおよびガラクトース残基を介して反応性シアル酸に結合させる。ついでポリペプチドを
ST3Gal3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基
を介してトランスフェリンが連結するようになる。図28Nでは昆虫または酵母細胞のい
ずれかで発現したIFNα14Cを、最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基
を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびリンカーを介して反
応性シアル酸で誘導化されたガラクトース供与体と接触させて、ポリペプチドにリンカー
およびガラクトース残基を介して反応性シアル酸を結合させる。ついで分子をST3Ga
l3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してト
ランスフェリンが連結するようになる。
aまたは2b(IFNα)を修飾する方法を提供する。図28Pでは哺乳動物細胞で生産
されたIFNαを最初にシアリダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、そして次
いでST3Gal3およびPEG化シアル酸供与体を使用してPEG化する。図28Qで
は昆虫細胞で発現したIFNαを最初に適切な供与体およびガラクトシルトランスフェラ
ーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal1およびPEG化シアル酸
供与体を使用してPEG化する。図28Rは細菌中で発現したIFNαの別の改造方法を
提供する:PEG化N−アセチルガラクトサミンは、適切な供与体およびN−アセチルガ
ラクトサミントランスフェラーゼを使用してタンパク質に加える。図28Sでは哺乳動物
細胞で発現したIFNαを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体を用いて適切な末端残
基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプ
チドのグリコシル残基に加えた後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような
部分で誘導化する。図28Tでは細菌で発現したIFNαを、加水分解的様式の代わりに
合成的に機能する修飾された酵素であるエンド−N−アセチルガラクトサミダーゼを使用
して、およびPEG部分で誘導化したN−アセチルガラクトサミン供与体を使用してPE
G化する。図28UではN−アセチルガラクトサミンを最初に、適当な供与体およびN−
アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してIFNαに加え、そして次いでシ
アリルトランスフェラーゼおよびPEG化シアル酸供与体を使用してPEG化する。図2
8Vでは哺乳動物系で発現したIFNαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を
戻し改作し、そして次に適当な供与体およびST3Gal1および/またはST3Gal
3を使用してPEG化する。図28Wでは哺乳動物細胞で発現したIFNαを最初にシア
リダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでこのポリペプチドをST3Ga
l1およびリンカーで連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチド
をリンカーおよび2番目のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。続
いてポリペプチドをST3Gal3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのよう
にしてトランスフェリンがシアル酸残基を介して結合するようになる。図28Yでは哺乳
動物細胞で発現したIFNαを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し
、そして次にST3Gal1およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。
図28Zでは昆虫細胞により生産されたIFNαを、ガラクトシルトランスフェラーゼお
よびPEG化ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図28AAでは細菌が発現
したIFNαに、最初に適切な供与体およびN−アセチルガラクトサミントランスフェラ
ーゼを使用してアセチルガラクトサミンを加える。このタンパク質は次いで、シアリルト
ランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図28C
Cでは細菌で発現したIFNαが別の手順で修飾される;PEG化N−アセチルガラクト
サミンを、N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼによりPEG化N−アセチル
ガラクトサミンの供与体を使用してタンパク質に加える。図28DDでは細菌で発現した
IFNαを別のスキームで改造する。ポリペプチドを最初にN−アセチルガラクトサミン
トランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸を用いて誘導化されたN−ア
セチルガラクトサミンの供与体と接触させて、IFNαをリンカーおよびN−アセチルガ
ラクトサミンを介して反応性のシアル酸に結合させる。次いでIFNαをST3Gal3
およびアシアロトランスフェリンと反応させて、これがシアル酸残基を介してトランスフ
ェリンに連結するようになる。次いでIFNαはST3Gal3およびシアル酸供与体を
使用してシアル酸残基でキャッピングされる。細菌が発現したIFNαを修飾するさらな
る方法を図28EEに開示し、ここでIFNαは最初にNHS−CO−リンカー−SA−
CMPに暴露され、そして次いでリンカーを介して反応性シアル酸に連結される。これは
続いてST3Gal3およびトランスフェリンを使用してトランスフェリンに結合する。
N−β)の修飾法を提供する。図29Bでは哺乳動物系で発現したIFN−βを最初にシ
アリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでタンパク質はST3Ga
l3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図29Cは昆虫細胞に
より生産されたIFN−βを修飾するためのスキームである。最初にN−アセチルグルコ
サミンを、適切な供与体およびGnT−iおよび/または−IIを使用してIFN−βに
加える。次いでタンパク質はガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼ
を使用してガラクトシル化される。最後にIFN−βはST3Gal3およびPEG−シ
アル酸の供与体を使用してPEGされる。図29Dでは酵母で発現したIFN−βを最初
にエンド−Hで処理してそのグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでガラクトース供与
体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでS
T3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図29Eでは哺
乳動物細胞で生産されたIFN−βを、ST3Gal3およびPEG部分ですでに誘導化
したシアル酸の供与体を使用してPEG化することにより修飾する。図29Fでは昆虫細
胞で発現したIFN−βは最初に、N−アセチルグルコサミン供与体を使用して1以上の
GnT I、II、IVおよびVによりN−アセチルグルコサミンが加えられ、そして次
にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化
され、そして次にST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化さ
れる。図29Gでは酵母で発現したIFN−βを最初にマンノシダーゼで処理してマンノ
シル単位を戻し改作し、次いでN−アセチルグルコサミン供与体および1以上のGnT
I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンが加えられる。このタンパ
ク質はさらにガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラ
クトシル化され、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸供与体を使用して
PEG化される。図29Hでは哺乳動物細胞が発現したIFN−βを、レブリン酸で修飾
したシアル酸供与体で適切な末端残基でキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体
に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジ
ン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図29Iでは哺乳動物系で発現し
たIFN−βを、PEG−シアル酸の供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラー
ゼを使用してPEG化する。図29Jでは哺乳動物細胞により発現されたIFN−βを最
初にシアリダーゼで処理してその末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでトランスシアリ
ダーゼおよびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図29Kでは哺乳動物
細胞で発現したIFN−βを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作
し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そし
て次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図29Lでは
哺乳動物細胞で発現したIFN−βを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理
してグリコシル鎖を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3またはシアリ
ルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図29
Mでは哺乳動物細胞で発現したIFN−βを最初にシアリダーゼで処理してグリコシル単
位を戻し改作する。これを次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用
してPEG化し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル
化する。図29Nでは哺乳動物細胞で発現したIFN−βを、レブリン酸で修飾したシア
ル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加える
ことにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−また
はアミン−PEGのような部分で誘導化する。図29Oでは哺乳動物細胞で発現したIF
N−βを、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシア
リル化する。図29Qでは昆虫細胞により発現されたIFN−βに、最初にN−アセチル
グルコサミンの供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−ア
セチルグルコサミンを加え、そしてさらにPEG−ガラクトースの供与体およびガラクト
シルトランスフェラーゼを使用してさらにPEG化する。図29Rでは酵母で発現したI
FN−βを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラ
クトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そ
して次いでST3Gal3およびPEG化−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。
図29Sでは哺乳動物系で発現したIFN−βを最初にST3Gal3およびリンカーを
介して連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよ
び第2のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸と連結する。次いでポリペプチドを
ST3Gal3および脱シアリル化トランスフェリンと接触させ、そしてこのようにして
シアル酸残基を介してトランスフェリンが結合するようになる。次いでIFN−βはシア
ル酸供与体およびST3Gal3を使用してさらにシアリル化される。
子を修飾するための方法を提供する。図30Bでは哺乳動物系により生産された第VII
またはVIIa因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そ
して次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図
30Cでは哺乳動物細胞により発現された第VIIまたはVIIa因子を最初にシアリダ
ーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPE
G化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。さらにポリペプチドをST3Gal3お
よびシアル酸供与体でシアリル化する。図30Dは哺乳動物細胞により生産される第VI
IまたはVIIa因子の別の修飾スキームを提供する:ポリペプチドを最初にシアリダー
ゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作し
、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクト
シル化し、そして次にST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG
化する。
〜31Gに含まれる。図31Bでは哺乳動物細胞により生産された第IX因子を最初にシ
アリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでPEG化シアル酸の
供与体を使用してST3Gal3でPEG化する。図31Cでは哺乳動物細胞により発現
された第IX因子を最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、これ
を次いでST3Gal3およびPEG化−シアル酸供与体を使用してPEG化し、そして
さらにST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。哺乳動物細胞が
生産した第IX因子の改造の別のスキームは、図31Dに見いだすことができる。ポリペ
プチドを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでガラクト
ース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、さらに
シアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化し、そして次いでPEG化シ
アル酸の供与体およびST3Gal1を使用してPEG化する。図31Eでは哺乳動物系
で発現した第IX因子が、PEG−シアル酸の供与体を使用してST3Gal3により触
媒されるシアリル化の方法を通してPEG化される。図31Fでは哺乳動物細胞で発現し
た第IX因子を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピング
し、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることにより修飾する。ペプチドのグリコシル
残基への付加後、ケトンはヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化され
る。図31Gは第IX因子のさらなる修飾法を提供する。哺乳動物細胞で生産されたポリ
ペプチドは、PEG−シアル酸の供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを
使用してPEG化される。
A〜32Jは幾つかの例を提示する。図32Bでは、FSHが哺乳動物系で発現し、そし
てシアリダーゼで処理されて末端シアル酸残基が戻し改作され、続いてST3Gal3お
よびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化されることにより修飾される。図32
Cでは哺乳動物細胞で発現したFSHを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基
を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG
化し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図
32Dは哺乳動物系で発現したFSHを修飾するスキームを提供する。ポリペプチドをシ
アリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してそのシアル酸およびガラクトース残基を戻
し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用して
ガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用
してPEG化する。図32Eでは哺乳動物系で発現したFSHを以下の手順で修飾する:
FSHを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal
3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal3お
よびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図32Fは哺乳動物細胞により生産され
たFSHの別の修飾例を提供する:ポリペプチドを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与
体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に加えることによ
り修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン
−PEGのような部分で誘導化する。図32Gでは哺乳動物系で発現したFSHを別の手
順で修飾する:ポリペプチドは、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェ
ラーゼを使用したシアル酸の付加を用いて改造される。図32HではFSHを昆虫細胞で
発現させ、そして以下の手順で修飾する:N−アセチルグルコサミンを適切なN−アセチ
ルグルコサミン供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用して最初に
FSHに加え;次いでFSHはPEG−ガラクトースの供与体およびガラクトシルトラン
スフェラーゼを使用してPEG化される。図32Iは酵母により生産されたFSHの修飾
スキームを表す。このスキームに従い、FSHを最初にエンドグリカナーゼで処理してグ
リコシル基を戻し改作し、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを
使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与
体でPEG化する。図32Jでは哺乳動物細胞により発現されたFSHを最初に、ST3
Gal3およびリンカーを介した2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチド
をリンカーおよび2番目のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。次
いでポリペプチドをST3Gal1およびCHOで生産された脱シアリル化絨毛性ゴナド
トロピン(CG)と接触させ、そしてこのようにしてCGが第2シアル酸残基を介して連
結するようになる。ついでFSHはシアル酸供与体およびST3Gal3および/または
ST3Gal1を使用してシアリル化される。
〜33Jは、野生型および突然変異EPOペプチドの両方の改造に関する幾つかの例を説
明する。図33Bでは、種々の哺乳動物系で発現したEPOが、発現したタンパク質をシ
アリダーゼと接触させて末端シアル酸残基を除去することにより改造される。生成したペ
プチドを、シアリルトランスフェラーゼおよびPEG部分で誘導化したCMP−シアル酸
と接触させる。図33Cでは昆虫細胞で発現したEPOが、GnT Iおよび/またはG
nT、IIを使用してN−アセチルグルコサミンを用いて改造される。次いでガラクトー
スがガラクトシルトランスフェラーゼを使用してペプチドに加えられる。PEG基は、改
造されたペプチドをシアリルトランスフェラーゼおよびPEG部分で誘導化されたCMP
−シアル酸と接触させることにより改造されたペプチドに加えられる。図33Dでは哺乳
動物細胞系で発現したEPOが、シアリダーゼの作用を介して末端シアル酸を除去するこ
とにより改造される。ガラクトースはガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトー
ス供与体を使用して新たに露出した末端に加えられる。N−結合グリコシル単位の末端ガ
ラクトース残基は、ST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアル酸で「キャッ
プ化」される。末端ガラクトース残基は、適切なシアル酸供与体およびST3Gal1を
使用してPEG部分を持つシアル酸で官能化される。図33Eでは哺乳動物細胞系で発現
したEPOを、PEG−誘導化シアル酸部分でN−結合グリコシル残基を官能化すること
により改造する。ペプチドをST3Gal3および適切な修飾されたシアル酸供与体と接
触させる。図33Fでは昆虫細胞系で発現したEPOが、ペプチドをN−アセチルグルコ
サミン供与体および1以上のGnTI、GnTIIおよびGnTVと接触させることによ
り、1以上の末端N−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造される。次い
でペプチドはPEG化ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼと接触
させることによりPEG化される。図33Gでは昆虫細胞系で発現したEPOを、適切な
N−アセチルグルコサミン供与体および1以上のGnTI、GnTIIおよびGnTVを
使用して、末端N−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造する。加水分解
的様式ではなく合成的に作用するように作られたガラクトシダーゼを利用して、活性化P
EG化ガラクトース供与体をN−アセチルグルコサミン残基に加える。図33Hでは哺乳
動物細胞で発現した突然変異EPOを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末
端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより改造する
。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGの
ような部分で誘導化する。図33Iは哺乳動物細胞系で発現した突然変異EPOの例示改
造経路を説明する。PEGは、PEG−修飾シアル酸およびα2,8−シアリルトランス
フェラーゼを使用してグリコシル残基へ加える。図33Jは哺乳動物細胞系で発現した突
然変異EPOに関する別の例示改造経路を説明する。シアル酸はシアル酸供与体およびα
2,8−シアリルトランスフェラーゼでグリコシル残基に加えられる。
ロニー刺激因子(GM−CSF)の修飾法を提供する。図34Bでは哺乳動物細胞で発現
したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次
いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図34C
では哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基
を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG
化し、そして次いでシアル酸供与体およびST3Gal1および/またはST3Gal3
を使用してさらにシアリル化する。図34DではNSO細胞で発現したGM−CSFを最
初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次
いでシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化し、そして次いでST3
Gal1およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図34Eでは、哺乳
動物細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改
作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そ
して次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化する。図3
4Fは哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で
適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより
修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−
PEGのような部分で誘導化する。図34Gでは哺乳動物細胞で発現しGM−CSFを、
シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する
。図34Iでは昆虫細胞で発現したGM−CSFが、適当な供与体および1以上のGnT
I、II、IVおよびVを使用したN−アセチルグルコサミンの付加、続いて適当な供与
体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したPEG化ガラクトースの付加により
修飾される。図34Jでは酵母が発現したGM−CSFを最初にエンドグリカナーゼおよ
び/またはマンノシダーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、そして続いてガラク
トシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する
。図34Kでは哺乳動物細胞で発現したGM−CSFを最初にシアリダーゼで処理してシ
アル酸残基を戻し改作し、そして続いてST3Gal3およびシアル酸供与体を使用して
シアリル化する。次いでポリペプチドをST3Gal1およびリンカーを介して連結され
た2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第2のシアル
酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。ポリペプチドはさらにST3Gal
3およびトランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてトランスフェリンと連結す
るようになる。
。図35A〜35Nは幾つかの例を含む。図35Bでは、種々の哺乳動物細胞で発現した
IFNγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして続いて
ST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図35Cでは
哺乳動物系で発現したIFNγを最初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し
改作する。次いでポリペプチドをST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用
してPEG化し、そしてさらにST3Gal3およびシアル酸の供与体を使用してシアリ
ル化する。図35Dでは哺乳動物細胞が発現したIFNγを最初にシアリダーゼおよびα
−ガラクトシダーゼで処理してシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。次いで
ポリペプチドはガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガ
ラクトシル化される。次いでIFNγはPEG−シアル酸の供与体およびST3Gal3
を使用してPEG化される。図35Eでは哺乳動物系で発現したIFNγを最初にシアリ
ダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはST3Gal
3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化され、そしてさらにST3Gal
3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。図35Fは哺乳動物系で発現した
IFNγを修飾するための別の方法を記載する。タンパク質はレブリン酸で修飾したシア
ル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加す
ることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−ま
たはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図35Gは哺乳動物細胞で発現したIF
Nγは、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用したシアル
酸の付加により改造される。図35Iでは昆虫または真菌細胞で発現したIFNγが、適
切な供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグル
コサミンを付加することにより修飾される。このタンパク質はさらに、PEG化ガラクト
ースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したPEG部分の付加により
修飾される。図35Jは酵母で発現したIFNγを修飾するための方法を提供する。ポリ
ペプチドを最初にエンドグリカナーゼで処理してサッカリド鎖を戻し改作し、そして次に
ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化す
る。次にIFNγはPEG化シアル酸の供与体およびST3Gal3を使用してPEG化
される。図35Kでは哺乳動物細胞により生産されたIFNγが以下のように修飾される
:ポリペプチドを最初にST3Gal3およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘
導化されたシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基
を介して反応性ガラクトースに結合させる。ついでポリペプチドをガラクトシルトランス
フェラーゼおよびエンドグリカナーゼで前処理したトランスフェリンと接触させ、そして
これによりトランスフェリンがガラクトース残基を介して連結するようになる。図35L
に具体的に説明するスキームでは、哺乳動物系で発現したIFNγがST3Gal3の作
用を介して修飾され:PEG化シアル酸が適当な供与体からIFNγに転移する。図35
Mは昆虫または真菌細胞で発現したIFNγを修飾する例であり、ここでポリペプチドの
PEG化はGnT Iおよび/またはIIを使用してPEG化N−アセチルグルコサミン
を供与体からIFNγに転移することにより達成される。図35Nでは哺乳動物系で発現
したIFNγが、適当な供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用した
PEG化シアル酸の付加により改造される。
ー)の修飾法を提供する。そのような例の幾つかは図36A〜36Oに見いだすことがで
きる。図36Bでは、種々の哺乳動物細胞で発現したα1アンチ−トリプシンを最初にシ
アリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。次いでPEG化シアル酸残基がCM
P−SA−PEGのような適当な供与体およびST3Gal3のようなシアリルトランス
フェラーゼを使用して加えられる。図36Cではα1アンチ−トリプシン修飾の別のスキ
ームを示す。哺乳動物系で発現したα1アンチ−トリプシンを最初にシアリダーゼで処理
してシアル酸残基を戻し改作する。次いでPEGで誘導化されたシアル酸残基が、適当な
供与体およびST3Gal3のようなシアリルトランスフェラーゼを使用して加えられる
。続いて分子はシアル酸供与体およびST3Gal3を使用したシアル酸残基の付加によ
りさらに修飾される。図36Dでは、哺乳動物細胞が発現したα1アンチ−トリプシンを
最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで処理して末端シアル酸およびα−結合
ガラクトース残基を戻し改作する。次いでポリペプチドはガラクトシルトランスフェラー
ゼおよび適当なガラクトース供与体を使用してガラクトシル化される。さらにPEGで誘
導化したシアル酸が、PEG化シアル酸供与体を使用してST3Gal3の作用により加
えられる。図36Eでは哺乳動物系で発現したα1アンチ−トリプシンは最初に、シアリ
ダーゼを使用して末端シアル酸残基が戻し改作される。次いでPEGが、PEG化シアル
酸をCMP−SA−PEGのような供与体からα1アンチ−トリプシンへ転移することを
媒介するST3Gal3の作用を介してN−結合グリコシル残基に加えられる。引き続き
より多くのシアル酸残基を、シアル酸供与体およびST3Gal3を使用して結合させる
。図36Fはα1アンチ−トリプシンを改造する別の方法を具体的に説明する。哺乳動物
細胞で発現したα1アンチ−トリプシンを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切
な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾
する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PE
Gのような部分で誘導化する。図36Gはα1アンチ−トリプシン修飾の別の方法を開示
する。哺乳動物発現系から得たα1アンチ−トリプシンは、シアル酸供与体およびα2,
8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル酸の付加により改造する。図36Iで
はα1アンチ−トリプシンが昆虫または酵母細胞で発現し、そしてポリペプチドをUDP
−N−アセチルグルコサミンおよび1以上のGnT I、II、IVまたはVと接触させ
ることにより、末端N−アセチルグルコサミン残基を付加することにより改造される。つ
いでこのポリペプチドは、PEG化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフ
ェラーゼを使用してPEG部分を用いて修飾される。図36Jは酵母細胞で発現したα1
アンチ−トリプシンを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作する
。これを次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラ
クトシル化する。次にポリペプチドはST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を
使用してPEG化される。図36Kではα1アンチ−トリプシンが哺乳動物系で発現する
。ポリペプチドを最初にST3Gal3およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘
導化されたシアル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基
を介して反応性ガラクトースに結合させる。ついでポリペプチドをガラクトシルトランス
フェラーゼおよびエンドグリカナーゼで前処理したトランスフェリンと接触させ、そして
これによりトランスフェリンがガラクトース残基を介して連結するようになる。図36M
では酵母で発現したα1アンチ−トリプシンを最初にエンドグリカナーゼで処理してその
グリコシル基を戻し改作する。次いでタンパク質はガラクトシルトランスフェラーゼおよ
びPEG部分を持つガラクトースの供与体を使用してPEG化する。図36Nでは植物細
胞で発現したα1アンチ−トリプシンをヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼおよびキシ
ロシダーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、そして続いてN−アセチルグルコサミ
ントランスフェラーゼおよび適当な供与体を使用して、PEG部分で誘導化されたN−ア
セチルグルコサミンで修飾する。図36Oでは哺乳動物細胞で発現したα1アンチ−トリ
プシンを、ST3Gal3およびPEGで誘導化したシアル酸の供与体を使用してPEG
化シアル酸残基を加えることにより修飾する。
ルコシダーゼCerezyme(商標)またはCeredase(商標))の修飾法を提
供する。図37Bでは、哺乳動物系で発現したCerezyme(商標)を最初にシアリ
ダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびP
EG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図37Cでは哺乳動物細胞で発現した
Cerezyme(商標)を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、
次いでST3Gal3およびマンノース−6−ホスフェートで誘導化した反応性シアル酸
を使用してマンノース−6−ホスフェート基を結合させ、次いでST3Gal3およびシ
アル酸供与体を使用してシアリル化する。図37DではNSO細胞が発現したCerez
yme(商標)を最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してグリコシル基を
戻し改作し、そして次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラー
ゼを使用してガラクトシル化する。次いでマンノース−6−ホスフェート部分がST3G
al3およびマンノース−6−ホスフェートで誘導化した反応性シアル酸を使用して分子
に加えられる。図37Eでは、哺乳動物細胞で発現したCerezyme(商標)を最初
にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、これを次いでST3Gal3およ
びPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次いでST3Gal3および
シアル酸供与体を使用してシアリル化する。図37Fでは、哺乳動物細胞で発現したCe
rezyme(商標)を、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャ
ッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドの
グリコシル残基への付加後、ケトンを1以上のマンノース−6−ホスフェート基のような
部分で誘導化する。図37Gは哺乳動物細胞で発現したCerezyme(商標)を、シ
アル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。
図37Iでは昆虫細胞で発現したCerezyme(商標)は、最初に適当な供与体およ
び1以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンが加え
られ、そして次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体
を使用してPEG化される。図37Jでは酵母で発現したCerezyme(商標)を最
初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与
体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次にST
3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図37Kでは哺乳
動物細胞で発現したCerezyme(商標)を、最初にST3Gal3およびリンカー
を介して連結した2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよ
び第2のシアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。ついでポリペプチド
をST3Gal3および脱シアリル化トランスフェリンと接触させ、そしてこれによりト
ランスフェリンが連結するようになる。次いでこのポリペプチドはシアル酸供与体および
ST3Gal3を使用してシアリル化される。
の突然変異体の修飾法を提供する。幾つかの具体的修飾スキームを図38A〜38Wに提
示する。図38Bは1つの修飾手順を具体的に説明する:TPAが哺乳動物細胞により発
現された後、これを1以上のマンノシダーゼ(1つまたは複数)およびシアリダーゼで処
理してマンノシルおよび/またはシアル酸残基を戻し改作する。次いで末端N−アセチル
グルコサミンを、ポリペプチドと適切なN−アセチルグルコサミンおよび1以上のGnT
I、II、IVおよびVとを接触させることにより加える。TPAはさらにガラクトー
ス供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次い
でPEGは、ST3Gal3により触媒されるシアル化により、そしてPEG部分で誘導
化されたシアル酸の供与体を使用して分子に結合させる。図38Cでは、TPAが昆虫ま
たは真菌細胞で発現する。修飾には、適切なN−アセチルグルコサミンの供与体およびG
nT Iおよび/またはIIを使用したN−アセチルグルコサミンの付加:ガラクトース
供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したガラクトシル化:およびST3
Gal3およびPEGで誘導化されたシアル酸の供与体を使用したシアリル化によるPE
Gの結合工程を含む。図38Dでは、TPAが酵母で発現し、そして続いてエンドグリカ
ナーゼで処理されてサッカリド鎖を戻し改作する。ポリペプチドは、供与体からTPAへ
のPEG−ガラクトースの転移を触媒するガラクトシルトランスフェラーゼの作用を介し
てさらにPEG化される。図38Eでは、TPAが昆虫または酵母細胞で発現する。つい
でポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改
作する。さらにPEG部分は、ガラクトシルトランスフェラーゼにより媒介される適当な
供与体からTPAへのPEG−ガラクトースの転移を介して分子へ結合させる。図38F
は昆虫または酵母系から得たTPAの異なる修飾法を提供する:ポリペプチドは、N−ア
セチルグルコサミンの供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用したN−アセチ
ルグルコサミンの付加、続いてガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG化ガラクト
ースの供与体を使用したガラクトシル化により改造される。図38Gは昆虫または酵母細
胞で発現したTPAの別の改造スキームを提供する。末端N−アセチルグルコサミンは、
N−アセチルグルコサミンの供与体およびGnT Iおよび/またはIIを使用して加え
る。加水分解的様式というよりむしろ合成的に作用するように修飾されたガラクトシダー
ゼを利用して、適切な供与体からN−アセチルグルコサミン残基へPEG化ガラクトース
を加える。図38Iでは、哺乳動物系で発現したTPAを最初にシアリダーゼおよびガラ
クトシダーゼで処理してシアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。ポリペプチド
はさらに、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反
応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基
への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図
38Jでは、哺乳動物系で発現したTPAをこのスキームに従い改造する:最初にポリペ
プチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作する:
次いでシアル酸残基をシアル酸供与体およびST3Gal3を使用して末端ガラクトシル
残基に結合させる:さらにTPAは、ガラクトシルトランスフェラーゼにより触媒される
供与体からN−アセチルグルコサミニル残基へのPEG化ガラクトースの転移を介してP
EG化される。図38KではTPAが植物細胞で発現する。この例の修飾手順は以下の通
りである:TPAを最初にヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼおよびキシロシダーゼで
処理してそのグリコシル基を戻し改作する;次いでPEG化N−アセチルグルコサミンを
、適当な供与体およびN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼを使用してTPAに
加える。図38Mでは、哺乳動物細胞で発現したTPA突然変異体(TNK TPA)を
改造する。末端シアル酸残基を最初にシアリダーゼを使用して戻し改作する;次いでポリ
ペプチドがPEG化されるようにST3Gal3を使用してPEG化シアル酸を供与体か
らTNK TPAへ転移する。図38Nでは、哺乳動物系で発現したTNK TPAを最
初にシアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作する。次いでタンパク質を、供
与体としてCMP−SA−PEGおよびST3Gal3を使用してPEG化し、そしてさ
らにシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化する。図38Oでは、N
SO細胞が発現したTNK TPAを最初にシアリダーゼおよびα−ガラクトシダーゼで
処理して末端シアル酸およびガラクトース残基を戻し改作する。ついでTNK TPAは
、ガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化
される。この改造スキームの最終工程は、PEG部分で誘導化されたシアル酸を、シアリ
ルトランスフェラーゼまたはST3Gal3を使用して供与体からTNK TPAへ転移
することである。図38QではTNK TPAが哺乳動物系で発現し、そして最初にシア
リダーゼで処理されて末端シアル酸残基が戻し改作される。次いでタンパク質はST3G
al3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してシアリル化される。次いでタンパク質
はシアル酸供与体およびST3Gal3を使用してシアリル化される。図38Rでは哺乳
動物系で発現したTNK TPAを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端
残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。
ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのよ
うな部分で誘導化する。図38Sでは哺乳動物細胞で発現したTNK TPAを異なる方
法を介して修飾する:ポリペプチドは、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトラン
スフェラーゼを使用したシアル酸の付加により改造する。図38Uでは、昆虫細胞で発現
したTNK TPAを、適当な供与体および1以上のGnT I、II、IVおよびVを
使用してN−アセチルグルコサミンの付加により改造する。このタンパク質はさらに、P
EG化ガラクトースの供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用したPEG部
分の付加により修飾される。図38Vでは、TNK TPAは酵母で発現する。ポリペプ
チドを最初にエンドグリカナーゼで処理してそのグリコシル鎖を戻し改作し、そして次い
でPEGで誘導化したガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用
してPEG化する。図38WではTNK TPAが哺乳動物系で生産される。ポリペプチ
ドを最初に、ST3Gal3およびリンカーを介して反応性ガラクトースで誘導化したシ
アル酸の供与体と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよびシアル酸残基を介して反応
性ガラクトースに結合させる。次いでポリペプチドをガラクトシルトランスフェラーゼお
よびCHOで生産された抗−TNF IGキメラと接触させて、これによりキメラはガラ
クトース残基を介して連結するようになる。
する。図39A〜39Gは幾つかの例を提供する。図39Bは2段階の修飾スキームを提
供する:哺乳動物細胞により生産されたIL−2を最初にシアリダーゼで処理してその末
端シアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シアル酸の供
与体を使用してPEG化する。図39Cでは、昆虫細胞が発現したIL−2を最初にガラ
クトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。
続いてIL−2を、ST3Gal3およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化
する。図39Dでは細菌で発現したIL−2を、適切な供与体およびN−アセチルガラク
トサミントランスフェラーゼを使用してN−アセチルガラクトサミンで、続いてPEG−
シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼを用いたPEG化工程で修飾する。図
39Eでは、哺乳動物系により生産されたIL−2を修飾する別のスキームを提供する。
ポリペプチドを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピング
し、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシ
ル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化す
る。図39Fは大腸菌(E.coli)で発現したIL−2の改造例を具体的に説明する
。ポリペプチドは、PEG基で誘導化した反応性N−アセチルガラクトサミン複合体およ
び加水分解的酵素というよりはむしろ合成的酵素として機能するように修飾された酵素を
使用してPEG化する。図39Gでは、細菌が発現したIL−2を適切な供与体およびN
−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してPEG化N−アセチルガラクト
サミンの付加により修飾する。
提供する。図40Bでは哺乳動物細胞で発現した第VIII因子を最初にシアリダーゼで
処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル
酸の供与体を使用してPEG化する。図40Cでは、哺乳動物細胞で発現した第VIII
因子を最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3
および適切な供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal1およびシアル酸供
与体を使用してさらにシアリル化する。
G化シアル酸の供与体を使用してPEG化の1工程により修飾する。図40Fは哺乳動物
細胞により発現された第VIII因子の別の修飾例を提供する。タンパク質は、ST3G
al1およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図40Gでは哺乳動
物細胞が発現した第VIII因子を別のスキームに従い改造する:これはα2,8−シア
リルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化される。図
40Iでは哺乳動物細胞により生産された第VIII因子を、レブリン酸で修飾したシア
ル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加す
ることにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−ま
たはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図40Jでは哺乳動物細胞で発現した第
VIII因子を、最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作する。ついでこれ
をガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPE
G化する。図40Kでは哺乳動物系で発現した第VIII因子を、最初にST3Gal3
およびシアル酸供与体を使用してシアリル化し、ついでエンド−Hで処理してグリコシル
基を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクト
ースの供与体でPEG化する。図40Lでは哺乳動物系で発現した第VIII因子を、最
初にマンノダーゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作し、次いで適当な供与体およ
びGnT Iおよび/またはIIを使用してN−アセチルグルコサミン基を加え、そして
次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してP
EG化する。図40Mでは哺乳動物細胞で発現した第VIII因子を最初にマンノダーゼ
で処理してマンノシル単位を戻し改作し、次いでN−アセチルグルコサミントランスフェ
ラーゼおよび適当な供与体を使用してN−アセチルグルコサミン基を加える。これはさら
にガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化
され、そして次にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。図
40Nでは第VIII因子が哺乳動物細胞で生産され、そして以下のように修飾される:
これは最初にマンノダーゼで処理して末端マンノシル基を戻し改作する。次いでPEG化
N−アセチルグルコサミン基が、GnTIおよびPEG化N−アセチルグルコサミンの適
当な供与体を使用して加えられる。
法を提供する。図41Bでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを最初にシアリダーゼ
で処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびPEG化シア
ル酸の供与体を使用してPEG化する。図41Cでは、哺乳動物細胞で発現したウロキナ
ーゼを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3
およびPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次にST3Gal3およ
びシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図41Dでは哺乳動物系で発現したウロキ
ナーゼを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作
し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガ
ラクトシル化し、そして次いでST3Gal3またはシアリルトランスフェラーゼおよび
PEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図41Eでは哺乳動物細胞で発現し
たウロキナーゼを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、次いでST
3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化し、そして次にST3G
al3およびシアル酸供与体を使用してさらにシアリル化する。図41Fでは哺乳動物細
胞で発現したウロキナーゼを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基を
キャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチ
ドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部
分で誘導化する。図41Gでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを、シアル酸供与体
およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。図41Iでは
昆虫細胞で発現したウロキナーゼを以下の工程で修飾する:最初にN−アセチルグルコサ
ミンを、N−アセチルグルコサミンの適当な供与体および1以上のGnT I、II、I
VおよびVを使用してポリペプチドに加え:次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよ
びPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化ガラクトースを加える。図41Jで
は酵母で発現したウロキナーゼを最初にエンドグリカナーゼで処理してグリコシル基を戻
し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用して
ガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用
してPEG化する。図41Kでは哺乳動物細胞で発現したウロキナーゼを、最初にST3
Gal3およびリンカーを介して連結された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポ
リペプチドをリンカーおよび第2シアル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させ
る。次いでポリペプチドをST3Gal1および哺乳動物細胞で生産された脱シアリル化
ウロキナーゼと接触させ、そしてこれによりウロキナーゼの第2分子と連結するようにな
る。次いで全分子はさらにシアル酸供与体およびST3Gal1および/またはST3G
al3を使用してシアリル化される。図41Lは単離したウロキナーゼを最初にスルホヒ
ドロラーゼで処理してスルフェート基を除去し、そして次にシアリルトランスフェラーゼ
およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図41Mでは単離したウロキ
ナーゼを最初にスルホヒドロラーゼおよびヘキソサミニダーゼで処理してスルフェート基
およびヘキソサミン基を除去し、そして次にガラクトシルトランスフェラーゼおよびPE
G−ガラクトースの供与体を使用してPEG化する。
法を提供する。図42Bでは哺乳動物系で発現したDNaseIを以下の工程で修飾する
:最初にタンパク質をシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する;次いでタン
パク質をST3Gal3でPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図42C
では、哺乳動物細胞で発現したDNaseIを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残
基を戻し改作し、次いでST3Gal3でPEG−シアル酸供与体を使用してPEG化し
、そして次にST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図42D
では哺乳動物系で発現したDNaseIを最初にシアリダーゼおよびガラクトシダーゼに
暴露してグリコシル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびα−ガラクトシル
トランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3またはシ
アリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図
42Eでは哺乳動物細胞で発現したDNaseIを最初にシアリダーゼで処理してシアル
酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸供与体を使用してP
EG化し、そして次にST3Gal3でシアル酸供与体を使用してシアリル化する。図4
2Fでは哺乳動物細胞で発現したDNaseIを、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体
で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することによ
り修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン
−PEGのような部分で誘導化する。図42Gでは哺乳動物細胞で発現したDNaseI
を、シアル酸供与体およびα2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化
する。図42Iでは昆虫細胞で発現したDNaseIには、最初に適当な供与体および1
以上のGnT I、II、IVおよびVを使用してN−アセチルグルコサミンが加えられ
る。次いでタンパク質は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトース
の供与体を使用してPEG化される。図42Jでは酵母で発現したDNaseIを最初に
エンドグリカナーゼで処理してグリコシル単位を戻し改作し、次いでガラクトース供与体
およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST
3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図42Kでは哺乳
動物細胞で発現したDNaseIを、最初にST3Gal3およびリンカーを介して連結
された2つの反応性シアル酸残基と接触させて、ポリペプチドをリンカーおよび第2シア
ル酸残基を介して1つの反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペプチドをST3Ga
l1および脱シアリル化α1−プロテアーゼインヒビターと接触させ、そしてこれにより
シアル酸残基を介してインヒビターと連結するようになる。次いでポリペプチドはさらに
適当な供与体およびST3Gal1および/またはST3Gal3を使用してシアリル化
される。
ように突然変異させたインスリンを修飾する方法を提供する。図43Bでは哺乳動物系で
発現したインスリンを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして
次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸供与体を使用してPEG化する。図43C
では昆虫細胞で発現したインスリンを、適当な供与体およびGnT Iおよび/またはI
Iを使用してPEG化N−アセチルグルコサミンの付加により修飾する。図43Dでは酵
母で発現したインスリンを最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作し、次い
でガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPE
G化する。図43Fでは哺乳動物細胞で発現したインスリンを、最初にシアリダーゼで処
理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal1およびPEG−シアル酸
の供与体を使用してPEG化する。図43Gでは昆虫細胞で発現したインスリンを、適当
な供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG化ガラクトースの付加
により修飾する。図43Hでは細菌で発現したインスリンに最初に、適当な供与体および
N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してN−アセチルガラクトサミン
を加える。次いでポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼおよびPEG−シアル酸の
供与体を使用してPEG化する。図43Jでは細菌で発現したインスリンが異なる方法を
通して修飾される:PEG化N−アセチルガラクトサミンを、適当な供与体およびN−ア
セチルガラクトサミントランスフェラーゼを使用してタンパク質に加える。図43Kでは
細菌で発現したインスリンを以下の別のスキームに従い修飾する:ポリペプチドを最初に
N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介した反応性シアル酸
で誘導化した反応性N−アセチルガラクトサミンと接触させて、ポリペプチドをリンカー
およびN−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いでポリペ
プチドをST3Gal3およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、それゆえにトラ
ンスフェリンに連結するようになる。次いでポリペプチドはST3Gal3およびシアル
酸供与体を使用してシアリル化される。図43Lでは細菌で発現したインスリンをさらに
別の方法を使用して修飾する:ポリペプチドは最初にNHS−CO−リンカー−SA−C
MPに暴露されて、リンカーを介して反応性シアル酸残基に連結するようになる。次いで
ポリペプチドはST3Gal3およびアシアロトランスフェリンを使用してトランスフェ
リンに連結される。次いでポリペプチドはST3Gal3およびシアル酸供与体を使用し
てさらにシアリル化される。
reS2およびS)を修飾する方法を提供する。図44BではM−抗原が哺乳動物系で発
現され、そして最初にシアリダーゼで処理されてシアル酸残基を戻し改作し、そして続い
てST3Gal3およびリンカーを介して脂質Aに連結した反応性シアル酸を使用して脂
質Aに結合することにより修飾される。図44Cでは哺乳動物細胞で発現したM−抗原を
、シアリダーゼで処理して末端シアル酸残基を戻し改作し、次いでST3Gal1および
リンカーを介しトキシンに連結した反応性シアル酸を使用してリンカーを介して破傷風ト
キシンに結合し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル
化する。図44Dでは哺乳動物系で発現したM−抗原を最初にガラクトシダーゼで処理し
てガラクトシル残基を戻し改作し、そして次いでST3Gal3およびシアル酸供与体を
使用してシアリル化する。次いでポリペプチドは、ST3Gal1および適当な供与体を
使用して加えたKLHでシアル酸を誘導化する。図44Eでは酵母で発現したM−抗原を
最初にマンノダーゼで処理してマンノシル残基を戻し改作し、そして次いでGnT Iお
よびジフテリアトキシンに連結したN−アセチルグルコサミンの供与体を使用してジフテ
リアトキシンに結合させる。図44Fでは哺乳動物細胞が発現したM−抗原を、レブリン
酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッピングし、反応性ケトンをシアル
酸供与体に付加することにより修飾する。ペプチドのグリコシル残基への付加後、ケトン
をヒドラジン−またはアミン−PEGのような部分で誘導化する。図44Gでは哺乳動物
系から得たM−抗原が、シアル酸供与体およびポリα2,8−シアリルトランスフェラー
ゼを使用したシアリル化により改造される。図44Iでは昆虫細胞で発現したM−抗原を
、GnT IIおよびナイセリア(Neisseria)タンパク質に連結したN−アセ
チルグルコサミンの適当な供与体を使用することによりナイセリア(Neisseria
)タンパク質に結合させる。図44Jでは酵母が発現したM−抗原を、最初にエンドグリ
カナーゼで処理してグリコシル鎖を戻し改作し、そして次いでガラクトシルトランスフェ
ラーゼおよびナイセリア(Neisseria)タンパク質に連結されたガラクトースの
適切な供与体を使用してナイセリア(Neisseria)タンパク質に結合する。図4
4Kは酵母で発現したM−抗原の修飾の別の例である。ポリペプチドを最初にマンノダー
ゼで処理して末端マンノシル残基を戻し改作し、そして次いでGnT Iおよび/または
IIを使用してN−アセチルグルコサミンを加える。続いてポリペプチドを、ガラクトー
ス供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次
いでシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッ
ピングする。
およびそれらの変異体)を修飾する方法を提供する。図45BではN−結合部位を含むよ
うに突然変異させたか、または哺乳動物により生産されたN−結合部位を有する天然に存
在するアイソフォーム(すなわち胎盤の酵素)のいずれかのヒト成長ホルモンを、最初に
シアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして続いてST3Gal3を用い
て、そしてPEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図45Cでは昆虫細胞で
発現したヒト成長ホルモンが、GnT Iおよび/またはIIおよびPEG化N−アセチ
ルグルコサミンの適切な供与体を使用してPEG化N−アセチルグルコサミンの付加によ
り修飾される。図45Dでは、ヒト成長ホルモンを酵母で発現させ、エンド−Hで処理し
てグリコシル基を戻し改作し、そしてさらにPEG化ガラクトースの供与体を使用してガ
ラクトシルトランスフェラーゼを用いてPEG化する。図45Fでは哺乳動物系で発現し
たヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパク質を、最初にシアリダーゼで処理してシアル酸
残基を戻し改作し、そして続いてPEG−シアル酸の供与体およびST3Gal1を使用
したPEG化により修飾する。図45Gでは昆虫細胞で発現したヒト成長ホルモン−ムチ
ン融合タンパク質を、ガラクトシルトランスフェラーゼでPEG化ガラクトースの供与体
を使用したPEG化により改造する。図45Hではヒト成長ホルモン−ムチン融合タンパ
ク質が細菌で生産される。N−アセチルガラクトサミンが最初にN−アセチルガラクトサ
ミントランスフェラーゼの作用によりN−アセチルガラクトサミンの供与体を使用して融
合タンパク質に加えられ、続いてPEG−シアル酸の供与体およびシアリルトランスフェ
ラーゼを使用して融合タンパク質をPEG化する。図45Iでは細菌が発現したヒト成長
ホルモン−ムチン融合タンパク質の別の修飾スキームを記載する:融合タンパク質は、P
EG化N−アセチルガラクトサミンの供与体を使用してN−アセチルガラクトサミントラ
ンスフェラーゼの作用を介してPEG化される。図45Jはヒト成長ホルモン−ムチン融
合タンパク質のさらなる改造スキームを提供する。融合タンパク質を最初にN−アセチル
ガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介して反応性シアル酸で誘導化した
N−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、融合タンパク質をリンカーおよびN
−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合させる。次いで融合タンパク質
をシアリルトランスフェラーゼおよびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、このよう
にしてシアル酸残基を介してトランスフェリンが連結するようになる。次いで融合タンパ
ク質は、ST3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアル酸残基でキャッピングす
る。図45Kでは、細菌で生産されたヒト成長ホルモン(N)の修飾についてさらに別の
スキームを与える。ポリペプチドを最初にNHS−CO−リンカー−SA−CMPと接触
させ、そしてリンカーを介して反応性シアル酸とカップリングされるようになる。次いで
ポリペプチドをST3Gal3およびアシアロ−トランスフェリンと接触させ、そしてシ
アル酸残基を介してトランスフェリンと連結するようになる。次いでポリペプチドはST
3Gal3およびシアル酸供与体を使用してシアリル化される。
ンパク質(TNFR−IgG、またはEnbrel(商標))を改造する方法を提供する
。図46Bは哺乳動物系で発現したTNFR−IgGが最初にシアル酸供与体およびシア
リルトランスフェラーゼ、ST3Gal1でシアリル化され;次いで融合タンパク質がガ
ラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼでガラクトシル化され;次いで
融合タンパク質がST3Gal3の作用およびPEGで誘導化されたシアル酸の供与体を
介してPEG化される修飾手順を具体的に説明する。図46Cでは哺乳動物細胞で発現し
たTNFR−IgGを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作する。続い
てPEG部分は、ST3Gal1により触媒される反応で供与体から融合タンパク質へP
EG化シアル酸を転移することによりTNFR−IgGに結合させる。図46DではTN
FR−IgGが哺乳動物系で発現され、そしてPEG−ガラクトース供与体を使用したガ
ラクトシルトランスフェラーゼにより媒介されるガラクトシル化法を介したPEGの付加
により修飾される。図46EではTNFR−IgGが哺乳動物系で発現される。融合タン
パク質の改造における第1工程は、シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、
ST3Gal1を使用したO−結合シアル酸残基の付加である。続いてPEG化ガラクト
ースを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG部分を有するガラクトースの適当
な供与体を使用して融合タンパク質に加える。図46Fでは哺乳動物細胞で発現したTN
FR−IgGを最初に、レブリン酸で修飾したシアル酸供与体で適切な末端残基をキャッ
ピングし、反応性ケトンをシアル酸供与体に付加することにより修飾する。融合タンパク
質のグリコシル残基への付加後、ケトンをヒドラジン−またはアミン−PEGのような部
分で誘導化する。図46Gでは哺乳動物細胞で発現したTNFR−IgGは、PEG化シ
アル酸をPEG部分を持つシアル酸の供与体から融合タンパク質へ転移する反応を触媒す
る2,8−シアリルトランスフェラーゼにより改造する。
標)結合物の生成法を提供する。図47BではHereceptin(商標)を哺乳動物
系で発現させ、そして最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼ
を使用してガラクトシル化する。次いでHereceptin(商標)は、反応性シアル
酸−トキシン複合体を使用してST3Gal3の作用を通してシアル酸を介してトキシン
に結合させる。図47Cでは哺乳動物細胞または真菌のいずれかで生産されたHerec
eptin(商標)は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび反応性ガラクトース−ト
キシン複合体を使用してガラクトシル化の工程を通してトキシンに結合させる。図47D
はHereceptin(商標)結合物の別の作成スキームを含む:真菌で生産されたH
ereceptin(商標)を最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻し改作し、
次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシ
ル化し、そして次いでST3Gal3および反応性シアル酸−放射性同位体複合体を使用
することによるシアリル化により放射性同位体と結合させる。
合物の生成法を提供する。図48Bでは哺乳動物細胞で発現したSynagis(商標)
を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクト
シル化し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化さ
れる。図48Cでは哺乳動物または真菌細胞で発現したSynagis(商標)は、ガラ
クトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの供与体を使用してPEG化す
る。図48Dは発現したSynagis(商標)を最初にエンド−Hで処理してグリコシ
ル基を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを
使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与
体を使用してPEG化する。
結合物の生成法を提供する。図49Bでは哺乳動物系で発現したRemicade(商標
)を最初にガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラク
トシル化し、次いでST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化
する。図49Cでは哺乳動物系で発現したRemicade(商標)は、適当な供与体お
よびガラクトシルトランスフェラーゼを使用してPEG化ガラクトースの付加により修飾
する。図49Dは真菌で発現したRemicade(商標)を最初にエンド−Hで処理し
てグリコシル鎖を戻し改作し、次いでガラクトース供与体およびガラクトシルトランスフ
ェラーゼを使用してガラクトシル化し、そして次いでST3Gal3および放射性同位体
で誘導化した反応性シアル酸を使用して放射性同位体に結合する。
roを修飾する方法を提供する。図50A〜50Lはそのような例を含む。図50Bでは
哺乳動物系で発現したReoproを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し
改作し、そしてST3Gal3およびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する
。図50Cでは昆虫細胞で発現したReoproを、適当な供与体およびGnT Iおよ
び/またはIIを使用したPEG化N−アセチルグルコサミンの付加により修飾する。図
50Dでは酵母で発現したReoproを最初にエンド−Hで処理してグリコシル基を戻
し改作する。続いてタンパク質はガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラク
トースの供与体を使用してPEGする。図50Fでは哺乳動物細胞で発現したReopr
oを最初にシアリダーゼで処理してシアル酸残基を戻し改作し、そして次いでST3Ga
l1で、PEG化シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図50Gでは昆虫細胞で発
現したReoproを、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびPEG−ガラクトースの
供与体を使用してPEG化により修飾する。図50Hでは細菌で発現したReoproは
最初に、N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよび適当な供与体を使用して
N−アセチルグルコサミンが加えられる。次いでタンパク質はシアリルトランスフェラー
ゼおよびPEG−シアル酸の供与体を使用してPEG化する。図50Jでは細菌で発現し
たReoproが異なるスキームで修飾される:これはPEG化N−アセチルガラクトサ
ミンの供与体を使用して、N−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの作用を介し
たPEG化である。図50Kでは細菌で発現したReoproを別の方法で修飾する:最
初にポリペプチドをN−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼおよびリンカーを介
して反応性シアル酸で誘導化したN−アセチルガラクトサミンの供与体と接触させて、ポ
リペプチドをリンカーおよびN−アセチルガラクトサミンを介して反応性シアル酸に結合
させる。次いでポリペプチドはST3Gal3およびアシアロ−トランスフェリンと接触
させ、これによりシアル酸残基を介してトランスフェリンに連結するようになる。次いで
ポリペプチドは適当な供与体およびST3Gal3を使用してシアル酸残基でキャッピン
グする。図50Lでは細菌で発現したReoproのさらなる修飾スキームを提供する。
ポリペプチドを最初にNHS−CO−リンカー−SA−CMPに暴露して、リンカーを介
して反応性シアル酸に連結するようにする。次いでポリペプチドはST3Gal3および
アシアロ−トランスフェリンと接触させ、そしてこのようにしてシアル酸残基を介してト
ランスフェリンと連結するようにする。次いでポリペプチドは適切な供与体およびST3
Gal3を使用してシアル酸残基でキャッピングする。
。図51A〜51Gはその幾つかの例を提示する。図51Bでは種々の哺乳動物系で発現
したRituxan(商標)は、最初に適切なガラクトース供与体およびガラクトシルト
ランスフェラーゼを使用してガラクトシル化される。次いでペプチドは、シアル酸供与体
およびST3Gal3を使用してトキシン部分で誘導化したシアル酸で官能化される。図
51Cでは哺乳動物細胞または真菌細胞で発現したRituxan(商標)を、ガラクト
シルトランスフェラーゼおよびガラクトース供与体を使用してガラクトシル化し、これは
薬剤部分を含有するペプチドガラクトースを提供する。図51Dでは真菌系で発現したR
ituxan(商標)を改造する別の例を提供する。ポリペプチドのグリコシル基を最初
にエンド−Hを使用して戻し改作する。次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよびガ
ラクトース供与体を使用してガラクトースを加える。続いて放射性同位体を、放射同位体
−複合化シアル酸供与体およびシアリルトランスフェラーゼ、ST3Gal3を介して分
子に結合させる。図51FではRituxan(商標)を哺乳動物系で発現させ、そして
最初にガラクトシルトランスフェラーゼおよび適切なガラクトース供与体を使用してガラ
クトシル化し;PEG部分を持つシアル酸を、次いでST3Gal3およびPEG化シア
ル酸供与体を使用して分子に結合させる。図51Gに示すように、真菌、酵母または哺乳
動物細胞で発現したRituxan(商標)は以下の方法で修飾することもできる:最初
にポリペプチドをα−およびβ−マンノシダーゼで処理して末端マンノシル残基を除去す
る;次いでGlcNAcを、GnT−I、IIおよびGlcNAc供与体を使用して分子
に結合させ、次いでガラクトシルトランスフェラーゼおよび放射性同位体を結合すること
ができる錯化部分にカップリングしたガラクトースの供与体を使用したガラクトシル化に
より放射性同位体を結合する。
A.N−結合グルコシル化部位の作成または排除
本発明は、ペプチド上のグリカン鎖(1つまたは複数)の部位が天然なペプチドグリカ
ン鎖から改変されたペプチドの使用を意図する。典型的にはN−結合グリカン鎖はアスパ
ラギン残基で1次ペプチド構造に連結され、ここでアスパラギン残基は小胞体(ER)内
の膜−結合グリコシルトランスフェラーゼにより認識されるアミノ酸配列内にある。典型
的には1次ペプチド構造上の認識部位は配列アスパラギン−X−セリン/トレオニでンあ
り、ここでXはプロリンおよびアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸であることができる
。この認識部位は典型的なものであるが、本発明はさらに、N−結合鎖が天然なまたは組
換えグリコシルトランスフェラーゼを使用して加えられた他の認識部位にN−結合グリカ
ン鎖を有するペプチドを包含する。
コシル化認識部位が除去されるか、あるいはさらに1以上のさらなるN−グリコシル化認
識部位が作成される突然変異した1次ペプチド配列を作成することは十分に当業者の技術
範囲内である。最も単純な場合では、アスパラギン残基をペプチドの1次配列から除去し
、これによりグリカンの結合部位を除去し、このようにして成熟ペプチドから1つのグリ
カンを除去することができる。例えばアスパラギン−セリン−セリンの配列をもつ天然な
認識部位は、配列ロイシン−セリン−セリンを有するように遺伝的に操作して、この位置
でのN−結合グリコシル化部位を排除することができる。
らなる認識残基が存在しないように、認識部位中の残基を改変することにより除去するこ
とができる。例えばアスパラギン−セリン−セリンの天然な配列をアスパラギン−セリン
−リシンに突然変異させて、これによりその位置でのN−グリコシル化部位を排除するこ
とができる。上記の典型的な認識部位以外の残基を含んでなるN−結合グリコシル化部位
の場合では、当業者は適切なグリコシルトランスフェラーゼにより認識されるために必要
な配列および残基を決定し、そして次に適切なグリコシルトランスフェラーゼがもはやそ
の部位を認識しないように少なくとも1つの残基を突然変異させることができる。換言す
ると、グリコシル化部位の作成または除去、あるいは両方を行い、これにより改変された
グリコシルパターンを有するペプチドを生成するために、ペプチドの1次配列を操作する
ことは十分に当業者の技術範囲内である。したがって本発明はグリカン改造の唯一の配列
として本明細書に提供する1次ペプチド配列に限定されると解釈するべきではなく、むし
ろグリカン改造に適する任意かつすべてのペプチド配列を含むと解釈するべきである。
突然変異させて別のアミノ酸残基をコードするコドンを生成するように、ペプチドの1次
配列をコードする核酸配列を改変させる。核酸配列を改変させる技術は当該技術分野で一
般的であり、そして例えば任意の周知な分子生物学マニュアルに記載されている。
成することができる。例えば核酸分子はホスホロアミダイト法のようなプロトコールを使
用する「遺伝子機械」で合成することができる。化学的に合成した二本鎖DNAが核酸ま
たはそのフラグメントの合成のような応用に必要な場合、各相補鎖を別個に合成する。短
い核酸(60〜80塩基対)の生成は技術的には単純であり、そして相補鎖を合成し、そ
して続いてそれらをアニーリングすることにより行うことができる。長い核酸(>300
塩基対)の生成については、化学的なDNA合成中の各サイクルのカップリング効率がめ
ったに100%とはならないので特別な方法が必要かもしれない。この問題を克服するた
めに、合成遺伝子(二本鎖)を、20〜100ヌクレオチド長の一本鎖であるフラグメン
トからの組み立て形態で集成する。ポリヌクレオチド合成に関する総説は、例えばGli
ck and Pasternak(モレキュラーバイオテクノロジー、組換えDNAの
原理および応用:Molecular Biotechnology,Principl
es and Applications of Recombinant DNA)、
1994、ASM出版)、Itakura et al.,(1984,Annu,Re
v.Biochem.53:323)、およびClimie et al.,(1990
,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 87:633)を参照にされたい
。
することができる。明らかであるように、この技術は典型的には一本鎖および二本鎖状態
の両方で存在するファージベクターを使用する。部位指向的突然変異誘発法に有用な典型
的なベクターには、M13ファージのようなベクターを含む。これらのファージは容易に
入手可能であり、そしてそれらの使用は当業者にとって周知である。二本鎖プラスミドも
部位指向的突然変異誘発法に日常的に使用され、これは問題の核酸をプラスミドからファ
ージへ移す工程を排除する。
DNA配列を含む一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクターの二本鎖を融解するこ
とにより行なわれる。所望の突然変異した配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーを一
般には合成的に調製する。このプライマーを次いで一本鎖ベクターとアニーリングし、そ
して突然変異を持つ鎖の合成を完成するために大腸菌(E.coli)ポリメラーゼIク
レノーフラグメントのようなDNA重合酵素に供する。これによりヘテロ二本鎖が形成さ
れ、ここで1つの鎖がもとの非突然変異配列をコードし、そして2番目の鎖が所望の突然
変異を持つ。このヘテロ二本鎖ベクターを次いで大腸菌(E.coli)細胞のような適
切な細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用し、そして突然変異した配列
の配列を持つ組換えベクターを含むクローンを選択する。突然変異したオリゴヌクレオチ
ドを包含するクローンを濃縮するための遺伝子選択スキームは、Kunkel et a
l.(1987,Kunkel et al.,Methods Enzymol.15
4:367−382)により考案された。あるいはPCR(商標)と市販されているTa
qポリメラーゼのような熱安定性酵素との使用を、増幅したDNAフラグメントに突然変
異誘発性のオリゴヌクレオチドプライマーを包含させるために使用し、これは次いで適切
なクローニングまたは発現ベクターにクローン化することができる。Tomic et
al.(1990,Nucl.Acids Res.,12:1656)およびUpen
der et al.(1995,Biotechniques,18:29−31)の
PCR(商標)媒介突然変異誘発法の手順は、そのようなプロトコールの2例を提供する
。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを使用するPCR(商標)を使用して
、リン酸化された突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを増幅したDNAフラグメントに包
含させることもでき、これは次いで適当なクローニングまたは発現ベクターにクローン化
することができる。Michael(1994,Biotechniques,16:4
10−412)により記載された突然変異誘発法の手順は、そのようなプロトコールの1
例を提供する。
示されているモチーフの内容が重要であることを示唆している。別の取り組みでは、イン
ビボでグリコシル化され、そして活性、安定性またはペプチドの他の特性に対して有利で
ある新規なN−結合部位を同定するために、新規N−結合共通部位を有する突然変異ペプ
チドのライブラリーを作成する。
はAsn−X−Ser/Thr(ここでXは任意のアミノ酸であることができる)である
。Asnのカルボキシル末端側から2つの目のアミノ酸位をコードするヌクレオチド配列
は、当業者に知られている標準的な手順を使用してSerおよび/またはThr残基をコ
ードするように突然変異させることができる。上記のように、すべてのAsn−X−Se
r/Thr部位がグリカンの付加により修飾されるわけではない。したがって各組換え突
然変異糖タンパク質は真菌、酵母または動物または哺乳動物発現系で発現され、そしてN
−結合グリカン鎖の付加に関して分析されなければならない。グリコシル化部位を特性決
定するための技術は当業者には周知である。さらに突然変異した組換え糖タンパク質の生
物学的機能は、調査する特定のタンパク質に関して標準的なアッセイを使用して決定する
ことができる。このようにペプチドの1次配列を操作し、そしてそれに含まれる新規なグ
リコシル化部位を同定し、そしてさらにペプチドの生物学的活性に及ぼす新規部位の効果
を決定することは簡単な問題となる。
るヌクレオチド配列は、当業者に知られている標準的な手順を使用してAsnをコードす
るように突然変異させることができる。新規なグリコシル化部位が作成されたかどうか、
およびこの部位がペプチドの生物学的活性に及ぼす効果を決定する手順は上に記載してい
る。
B.O−結合グリコシル化部位の作成または排除
ペプチドにO−結合グリコシル化部位を付加することは、ペプチドの始めの1次アミノ
酸配列に比べてペプチドの1次アミノ酸配列が1以上のさらなるO−結合グリコシル化部
位を含むように、ペプチドの1次アミノ酸配列を改変させることにより都合よく行う。ペ
プチドにO−結合グリコシル化部位を加えることは、OH基が接近可能となり、そしてO
−結合グリコシル化に利用できるようになるように、ペプチドの配列内に−OH基、好ま
しくはセリンまたはトレオニン残基を含んでなる1以上のアミノ酸種をペプチドに包含さ
せることにより行うこともできる。ペプチド内のN−結合グリコシル化部位の改変の検討
と同様に、ペプチドの1次アミノ酸配列は好ましくはヌクレオチドレベルで改変する。ペ
プチドをコードするDNA配列中の特別なヌクレオチドは、所望のアミノ酸が配列にコー
ドされるように改変することができる。DNA中の突然変異(1つまたは複数)は好まし
くは、上記のホスホロアミダイト法のDNA合成および部位指向的突然変異誘発法の技術
のような当該技術分野で既知の方法を使用して作成される。
分子に、1または幾つかのコピーで分子の5'または3'末端に加えることができる。次
いで改変されたDNA配列を真菌、酵母または動物もしくは哺乳動物発現系の任意の1つ
で発現させ、そしてペプチドへの配列の付加およびこの配列が機能的なO−結合グリコシ
ル化部位であるか否かが分析される。簡単に説明すると合成ペプチドの受容体配列をヌク
レオチド分子の5'または3'末端に導入する。原理的には、この型の配列の付加は適当
な発現系で発現した時に生じる糖タンパク質に対して破壊性が低い。次いで改変したDN
AはCHO細胞または他の適切な発現系で発現させ、そしてこれにより発現したタンパク
質をO−結合グリコシル化部位の存在について調査する。さらにグリカン鎖の存在または
不存在を決定することができる。
むペプチドのライブラリーを作成することによりペプチド中に見いだすことができる。例
えばN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼによるN−アセチルガラクトサミ
ン付加のための共通アミノ酸配列は、使用する特異的なトランスフェラーゼに依存する。
ペプチドのアミノ酸配列を走査して、O−結合グリカン鎖の付加の可能性部位を生じるよ
うに突然変異させることができるアミノ酸の連続する基を同定することができる。これら
の突然変異はすでに記載したような当業者には知られている標準的手順を使用して生成す
ることができる。見いだされたグリコシル化部位が実際にグリコシル化されるかどうかを
決定するために、次に各組換え突然変異ペプチドを適当な発現系で発現させ、そして続い
てO−結合グリカン鎖の部位および/または存在の付加について分析する。
C.ペプチドの化学合成
本発明に有用なペプチドの1次構造は細胞に基づく発現系で最も効率的に生成され得る
が、ペプチドが合成的に生成できることも本発明の範囲内である。ペプチドの化学合成は
当該技術分野では周知であり、そして限定するわけてはないが段階的な固相合成、および
溶液中または固相上でのフラグメント縮合を含む。古典的な段階的固相合成には、所望の
ペプチド鎖のカルボキシ−末端アミノ酸に対応するアミノ酸を固体支持体に共有結合し、
そしてペプチド鎖を、活性化カルボキシル基を有する活性化アミノ酸誘導体の段階的カッ
プリングにより、アミノ末端に向けて延長することを含む。完全に保護された固相結合ペ
プチド鎖の集成体が完成した後、ペプチド−固相の共有結合を適当な化学により開裂し、
そして保護基を除去して生成物であるペプチドを得る。R.Merrifield、固相
ペプチド合成:テトラペプチドの合成(Solid Phase Peptide Sy
nthesis:The Synthesis of Tetrapeptide)、J
.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963)を参照にされたい
。より長いペプチド鎖ほど、高純度の十分に規定された生成物を得ることが難しくなる。
複雑な混合物の生産のために、段階的な固相合成法にはサイズに限界がある。一般に10
0の連続するアミノ酸残基またはそれ以上の十分に規定されたペプチドが、段階的な固相
合成を介して日常的に調製されることはない。
て固相からの開裂、そしてこれら最大に保護されたセグメントの精製を含む。保護された
セグメントは固相に結合した最初のセグメントまで1つずつ縮合される。
古典的な溶液合成により合成することができる。これらの合成法は当業者には周知である
(例えばMerrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(196
3)、Stewart et al.、「固相ペプチド合成(Solid Phase
Peptide Synthesis)」(第2版)、(ピアスケミカル社、1984)
、Bayer and Rapp,Chem.Pept.Prot.3:3(1986)
、Atherton et al.,固相ペプチド合成:実践的とりくみ(Solid
Phase Peptide Synthesis:A Practical Appr
oach(IRL出版、1989)、Fields and Colowick、「固相
ペプチド合成(Solid−Phase Peptide Synthesis)」、M
ethods in Enzymology 第289巻(アカデミック出版1997)
、およびLloyd−Williams et al.、ペプチド合成の化学的取り組み
およびペプチド(Chemical Approaches to the Synth
esis of Peptides and Peptides)(CRC出版社、19
97)を参照にされたい)。「天然な化学的連結」および「発現したペプチドの連結」の
ような全化学合成法における変更も標準的である(例えばDawson et al., Science 266:
776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94: 7845 (1997), Dawson,
Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 67
05 (1998), and Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998))を参照にされ
たい)。また有用であるのは、カリフォルニア州、サウスサンフシンシスコのグリフォン
サイエンス(Gryphon Science)により開発された固相ペプチド合成法
である。米国特許第6,326,468号、同第6,217,873号、同第6,174
,530号および同第6,001,364号明細書を参照にされたい(これらすべては全
部、引用により本明細書に編入する)。
D.翻訳後修飾
当業者はペプチドがN−結合および/またはO−結合グリカンを付加される上に、翻訳
後修飾も受け得ると考えるだろう。グリコシル化以外の翻訳後修飾を有するペプチドは、
ペプチドの所望する生物学的活性または機能を保持または改善するかぎり、本発明でペプ
チドとして使用できることを意図している。そのような翻訳後修飾は通常、インビボで起
こる天然な修飾、またはペプチドにインビトロで行われる操作された修飾であることがで
きる。意図する既知の修飾には限定するわけではないがアセチル化、アシル化、ADP−
リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたは
ヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノ
シトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋
結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキ
シル化、グリコシル化、GPIアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、
ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、セレノイル化、硫黄化、アルギニレーションのようなトランスファー−RNAが媒介
するアミノ酸のペプチドへの付加、およびユビキチン化を含む。多くのこれらの修飾を行
うために使用され得る酵素は当該技術分野では周知であり、そして中でもベーリンガーマ
ンハイム(Boehringer Mannheim)(インディアナポリス、イリノイ
州)およびシグマケミカル社(セントルイス、モンタナ州)のような会社から市販されて
いる。
きた。幾つかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質結合、硫黄化、グルタミン
酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP−リボシル化は、ペプチ
ド−構造および分子的特性(Peptides−Structure and Mole
cular Properties)、第2版、T.E.Creighton、W.H.
Freeman and Company、ニューヨーク(1993)のようなほとんど
の基本的な教科書に記載されている。この主題については、Wold,F.、ペプチドの
翻訳後の共有的修飾(Post−translational Covalent Mo
dification of Peptides)、B.C.Johnson編集、アカ
デミック出版、ニューヨーク、1−12(1983);Seifer et al.,(
Meth.Enzymol.182:626−646(1990))およびRattan
et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48−62(1992)
)によるような多くの詳細な総説が入手可能である。
る有機誘導化剤を用いてペプチドの標的とするアミノ酸残基と反応させることにより、イ
ンビトロで分子に導入することもできる。最も一般的に誘導化される残基はシステイン、
ヒスチジン、リシン、アルギニン、チロシン、グルタミン、アスパラギンおよびアミノ末
端残基である。プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリンおよびトレオニン残基の
ヒドロキシル基のリン酸化、リシン、ヒスチジンのアルファ−アミノ基およびヒスチジン
側鎖のメチル化、N−末端アミンのアセチル化およびC−末端カルボキシル基のアミド化
。そのような誘導化された部分は溶解性、吸収、生物学的半減期等を改善する。この部分
はまた、ペプチド等の望ましくない副作用も排除または弱めることができる。
分子担体に架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤にはグルタルアルデヒ
ド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、1,1−ビ
ス(−ジアゾロアセチル)−2−フェニルエタンおよび二官能性マレイミドを含む。メチ
ル−3−[9p−アジドフェニル)]ジチオプロピオイミデートのような誘導化剤は、光
の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生じる。あるいは臭化シ
アンで活性化した炭水化物および米国特許第3,969,287号および同第3,691
,016号明細書に記載されている反応性物質のような反応性の水不溶性マトリックスを
ペプチドの固定化に使用してもよい。
E.融合ペプチド/ペプチド
本発明に有用なペプチドは融合ペプチドを含んでなることができる。融合ペプチドは2
つのペプチドの生物学的および/または機能的特性が1つのペプチド分子内に組み合わさ
れることが望まれる場合、特に有利である。そのような融合ペプチドは、治療用および工
業的応用の新規かつ有用な分子を作成するために、天然には見いだされない生物学的活性
および機能の組み合わせを提示することができる。問題の生物学的活性には限定するわけ
ではないが酵素活性、レセプターおよび/またはリガンド活性、免疫原性モチーフおよび
構造的ドメインを含む。
知である。例えばヒトα−インターフェロン−ヒト融合ペプチドがすでに作成され、ここ
で生成したペプチドはアルブミンの長期循環寿命と組合わされたα−インターフェロンの
治療的利益を有し、これにより減少した投与頻度、および患者に副作用の可能性が低下し
た治療用組成物が作られる。ヒトゲノムサイエンス(Human Genome Sci
ence)社からのAlbuferon(商標)および米国特許第5,766,883号
明細書を参照にされたい。他の融合ペプチドには、本明細書のいたるところに記載する抗
体分子を含む。
F.より小さな「生物学的に活性な」分子の生成
本発明で使用するペプチドは天然なペプチドの変異体でよく、ここで天然なペプチドの
フラグメントが完全長の天然なペプチドの代わりに使用される。さらにプレ−プロ−およ
びプレ−ペプチドを企図する。変異体ペプチドは天然なペプチドよりもサイズが小さくて
もよく、そしてより大きなペプチドの1以上のドメインを含んでなってもよい。特別なペ
プチドドメインの選択は、ペプチド中の特定のドメインの生物学的活性が望まれるが、ペ
プチドの他のドメインの生物学的活性は望まない時に有利となり得る。またペプチドの所
望する治療的効果を強化することができるペプチドの短縮化および内部削除も含む。その
ような任意な形のペプチドは、ペプチドの所望する活性が保存される限り、本発明に有用
となることを意図している。
とができる。ヒトのアルブミンの場合、天然なアルブミンペプチドのわずか63%を含ん
でなる短縮化形態が、血漿容量増量剤として有利であることが分かった。短縮化アルブミ
ンペプチドは、天然なヒト血清アルブミンあるいは組換えヒト血清アルブミンの2分の1
から3分の2の個々のペプチド用量が均等なコロイド浸透効果(colloid osm
otic effect)に必要とされるだけなので、治療目的のために天然なペプチド
よりも良いと考えられている。米国特許第5,380,712号明細書(この内容は全部
、引用により本明細書に編入する)を参照にされたい。
的活性を有することが見いだされた。IL−2の治療的効力は、血管漏出症候群により支
配される種々の副作用により制限される。全α−ヘリックスに対応する残基1〜30から
成るより短く化学的に合成したペプチドの変形物は正しく折り畳まれ、そして天然なIL
−2の生物学的的活性を副作用を伴うこと無しに含むことが分かった。
G.新規ペプチドの生成
本発明のペプチドは天然なペプチドの1次配列に由来するものでよく、または当業者に
知られている多くの手段を使用して工作することができる。そのように工作したペプチド
は、天然なペプチドに比べて強化された、または新規な特性から設計され、かつ/または
選択されることができる。例えばペプチドは、上昇した酵素反応速度、上昇したまたは低
下した基質もしくはリガンドへの結合親和性、上昇または低下したレセプターへの結合親
和性、基質、リガンド、レセプターまたは他の結合パートナーに対する改変された特異性
、上昇または低下したインビトロおよび/またはインビボの安定性、あるいは動物におい
て上昇または低下した免疫原性を有するように工作することができる。
H.突然変異
1.合理的な設計の突然変異
本発明の方法に有用なペプチドは、所望する生物学的活性または機能を強化し、ペプチ
ドの望ましくない特性を縮小し、かつ/またはペプチドに新規活性または機能を加えるた
めに突然変異させることができる。「合理的なペプチド設計」はそのような改変されたペ
プチドを生成するために使用することができる。いったんペプチドのアミノ酸配列および
構造を知り、そして所望する突然変異を計画すれば、突然変異は突然変異させることを望
むアミノ酸残基をコードする対応する核酸コドンに対して最も都合良く作成することがで
きる。当業者は一般的(universal)な遺伝子コード、および選択した発現系で
のコドン優先性の知識に基づき、どのように核酸配列を改変すべきかを容易に決定するこ
とができる。コドン中の突然変異は翻訳中にペプチドに重合化されるアミノ酸残基を変化
させるために作ることができる。あるいはコドンは対応するコードされるアミノ酸残基は
同じであるが、コドンの選択が所望のペプチド発現系により適するように突然変異させる
ことができる。例えばシス−残基を別のアミノ酸に置き換えて成熟ペプチドからジスルフ
ィド結合を除去してもよく、触媒ドメインを突然変異させて生物学的活性を改変してもよ
く、そして一般にペプチドのアイソフォームを工作することができる。そのような突然変
異はとりわけ点突然変異、削除、挿入および短縮であることができる。
。上で検討した部位指向的突然変異誘発法はコドンの指向的突然変異によく適している。
オリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発法もSambrook et al.,(200
1、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular C
loning:A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー、ニューヨーク、15.51頁から始まる)により詳細に検討されている
。体系的な削除、挿入および短縮化は、当該技術分野で周知な他の方法の中でもリンカー
挿入突然変異誘発法、ヌクレアーゼBal31での消化、およびリンカー走査(link
er−scanning)突然変異誘発法を使用して作成することができる(Sambr
ook et al.、2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュ
アル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク)。
に成功裏に使用されてきた。例えば酵素の安定性はα−アミラーゼ中のアスパラギン残基
の除去(Declerck et al.,2000,J.Mol.Biol.301:
1041−1057)、プロリンのようなより硬い構造的要素のα−アミラーゼ(Iga
rashi et al.,1999,Biosci.Biotechnol.Bioc
hem.63:1535−1540)およびD−キシロースイソメラーゼ(Zhu et
al.,1999,Peptide Eng.12:635−638)への導入により
向上した。さらに疎水的接触の導入が3−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(Ak
anuma et al.,1999,Eur.J.Biochem.260:499−
504)およびシュードモナス種(Pseudomonas)種から得たギ酸デヒドロゲ
ナーゼ(Rojkova et al.,1999,FEBS Lett.445:18
3−188)を安定化した。これら突然変異の安定化効果の背後にあるメカニズムは、一
般に多くのペプチドに応用することができる。これらのおよび同様の突然変異は、本発明
の方法で改造されるペプチドに関して有用になると予想する。
2.ランダム変異導入(Random mutagenesis)技術
本発明の方法に有用な新規ペプチドは、核酸のコード配列にランダムな突然変異を導入
する技術を使用して生成することができる。次いで核酸は望ましい発現系で発現され、そ
して生成したペプチドを問題の特性について評価する。ランダムな突然変異をDNA配列
に導入するための技術は当該技術分野では周知であり、そしてPCR突然変異誘発法、飽
和(saturation)突然変異誘発法および縮重オリゴヌクレオチド法を含む。S
ambrook and Russell(2001、モレキュラークローニング、ア
ラボラトリーアプローチ、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州)およびAusubel et al.(2002、分子生物学の現
在の手法(Current Protocols in Molecular Biol
ogy)、ジョン ウィリー&サンズ、ニューヨーク州)を参照にされたい。
な突然変異をDNAのクローン化したフラグメントに導入する(Leung et al
.,1989,Technique 1:11−15)。これはランダムの突然変異をD
NA配列に導入する大変有力で、しかも比較的迅速な方法である。突然変異させるDNA
領域は、例えば改変したdGTP/dATP比を使用することにより、およびMn2+を
PCR反応に加えることにより、TaqDNAポリメラーゼによるDNA合成の忠実度が
下がる条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅させる。増幅したDNA
フラグメントのプールは適切なクローニングベクターに挿入してランダムな突然変異ライ
ブラリーを提供する。
に導入することを可能とする(Mayers et al.,1985,Science
229:242)。この技術には例えばインビトロでの化学的処理または一本鎖DNAの
照射による突然変異の作成、そして相補的DNA鎖の合成を含む。突然変異の頻度は処理
の厳しさを調節(modulating)することにより調節することができ、そして本
質的にすべての可能な塩基置換を得ることができる。この手順には突然変異フラグメント
に関する遺伝子選択が関与しないので、中性の置換ならびに機能を改変する置換の両方が
得られる。点突然変異の分布は保存された配列要素に片寄らない。
できる。縮重オリゴヌクレオチド配列の化学的合成は、自動化DNA合成器で行うことが
でき、そして合成遺伝子は次に適切な発現ベクターに連結することができる。縮重オリゴ
ヌクレオチドの合成は当該技術分野では知られている(例えばNarang,SA(19
83)Tetrahedron39:3;Itakura et al.(1981)組
換えDNA(Recombinant DNA)、Proc 3rd、クリーブランド
シンポ。高分子(Macromolecules)編集、AG ヴァルトン、アムステル
ダム:エルセビア(Elsevier)273−289頁;Itakura et al
.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura e
t al.(1984)Science198:1056;Ike et al.(19
83)Nucleic Acids Res.11:477を参照にされたい。そのよう
な技術は他のペプチドの方向性のある進化(directed evolution)に
も使用された(例えばScott et al.(1990)Science249:3
86−390;Roberts et al.(1992)PNAS89:2429−2
433;Devlin et al.(1990)Science249:404−40
6;Cwirla et al.(1990)PNAS87:6378−6382;なら
びに米国特許第5,223,409号、同第5,198,346号および同第5,096
,815号明細書を参照にされたい)。
a.方向付けされる進化(Directed evolution)
本発明の方法で有用なペプチドは、「方向付けされる進化」の技術を使用して生成する
こともできる。ペプチドの構造の知識を必要とする部位指向的突然変異誘発技術とは対照
的に、今ではペプチドの構造的特徴の知識無しで改善された特性を持つペプチドが得られ
る突然変異のライブラリーを作成する方法が存在する。これらの方法は一般に「方向付け
される進化」の技術として知られ、そして問題のペプチドをコードする核酸配列を循環的
(recursive round)な突然変異、スクリーニングそして増幅に供する点
でこれまでのランダムな変異誘導手順とは異なる。
変異をランダムに作成する突然変異法により生成される。点突然変異技術には限定するわ
けではないが、「誤−傾向(error−prone)PCR(商標)」(Caldwe
ll and Joyce,1994:PCR Methods Appl.2:28−
33;およびKe and Madison,1997,Nucleic Acids
Res.2:3371−3372)、反復オリゴヌクレオチド−指向的突然変異誘発法(
repeated oligonucleotide−directed mutage
nesis)(Reidhaar−Olson et al.,1991,Method
s Enzymol,208:564−586)、および前記の任意なランダム変異導入
法を含む。
使用である。問題の核酸を、ゲノムが典型的には欠損性DNA修復遺伝子をコードする突
然変異誘発細胞株の中で培養する(米国特許第6,365,410号明細書、Selif
onova et al.,2001,Appl.Environ.Microbiol
.67:3645−3649;Long−McGie et al.,2000,Bio
tech.Bioeng.68:121−125;ジェネンコール インターナショナル
社(Genencor International Inc.)、パロアルト、カリフ
ォルニア州を参照にされたい)。
に飽和突然変異誘発法を使用しても行うことができる(Gene Site Satur
ation Mutagenesis(商標)、ディバーサ社(Diversa Cor
p)、サンディエゴ、カリフォルニア州)。この種の飽和突然変異誘発法では、多様化さ
れるべき核酸配列長を覆うように設計された縮重プライマーを使用して、PCR反応でポ
リメラーゼをプライムする。この様式では、アミノ酸のコード配列の各コドンを突然変異
させて、残りは一般的な各19個のアミノ酸をコードするようにする。この技術は核酸コ
ード配列の特別な領域に突然変異、削除および挿入を導入するためにも使用できると同時
に、残りの核酸分子を手付かずにしておく。遺伝子飽和技術に関する手順は当該技術分野
では周知であり、そして米国特許第6,171,820号明細書に見いだすことができる
。
b.DNAシャフリング(shuffling)
本発明の方法に有用な新規ペプチドは、遺伝子−シャフリング、モチーフ−シャフリン
グ、エキソン−シャフリングおよび/またはコドン−シャフリング(集合的に「DNAシ
ャフリング」と呼ぶ)を使用して生成することもできる。DNAシャフリング技術は本発
明に有用なペプチドの活性をモジュレートするために使用することができ、そして改変し
た活性を有するペプチドを生成するために使用することができる。一般に米国特許第5,
605,793号;同第5,811,238号;同第5,830,721号;同第5,8
34,252号;および同第5,837,458号明細書、およびStemmer et al. (1994
, Nature 370(6488):389-391); Crameri et al. (1998, Nature 391 (6664): 288-291);
Zhang et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(9): 4504-4509); Stemmer et al.
(1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (22): 10747-10751), Patten et al. (1997, Cu
rr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33); Harayama, (1998, Trends Biotechnol. 16(2): 7
6-82); Hansson, et al., (1999, J. Mol. Biol. 287:265-76); and Lorenzo and Blasco
(1998, Biotec hniques 24(2): 308-13)
を参照にされたい(これら各々は、引用により本明細書に編入する)。
セグメントの相同的または部位特異的組換えを集合することが関与する。DNAシャフリ
ングはヒト免疫不全ウイルス1型タンパク質(Pekrun et al.2002,J
.Virol.76(6):2924−35)、トリアジンヒドロラーゼ(Railla
rd et al.2001,Chem Biol8(9):891−898)、マウス
白血病ウイルス(MLV)タンパク質(Powell et al.2000,Nat
Biotechnol 18(12):1279−1282)、およびインドールグリセ
ロールホスフェートシンターゼ(Merz et al.2000,Biochemis
try 39(5):880−889)の新規変化を生成するために使用されて来た。
り天然な組換えを模することによる生体分子の多様性を作成するために開発された(St
emmler,1994,Nature 370:389−391;およびStemml
er,1994,PNAS 91:10747−10751)。一般にこの方法では関連
する遺伝子群を断片化し、そして変性の循環サイクル、再ハイブリダイゼーション、そし
て続いてTaqポリメラーゼによる5'突出部の延長に供する。各サイクルでフラグメン
トの長さが増し、そしてDNA組換えは異なる遺伝子に由来するフラグメントが互いにハ
イブリダイズする時に起こる。DNAの最初の断片化は通常、ヌクレアーゼ消化、典型的
にはDNaseを使用して達成されるが(Stemmlerの参考文献、同上を参照にさ
れたい)、切断(interrupted)PCR合成により行うこともできる(米国特
許第5.965,408号明細書、引用により全部、本明細書に編入する;ディバース社
、サンディエゴ、カリフォルニア州を参照にされたい)。DNAシャフリング法は各回の
シャフリングにより、生成される有利な突然変異の指向的な組換えが達成され、したがっ
てペプチドの改善された表現型について自己選択がある点で、ランダムな点突然変異法よ
りも有利である。
明は、Stemmler,1994,Nature 370:389−391およびSt
emmler,1994,PNAS 91:10747−10751に見いだされる。D
NAシャフリング技術は米国特許第6,180,406号、同第6,165,793号、
同第6,132,970号、同第6,117,679号、同第6,096,548号、同
第5,837,458号、同第5,834,252号、同第5,830,721号、同第
5,811,238号および同第5,605,793号明細書にも記載されている(これ
らはすべて引用により全部、本明細書に編入する)。
1例では、エキソンシャフリングでペプチドの特別なドメインをコードするエキソンまた
はエキソンの組み合わせがキメラオリゴヌクレオチドを使用して増幅される。増幅された
分子は次いで自己−プライミングアッセンブリー(self−priming PCR
assembly)により組換えられる(Kolkman and Stemmler,
2001,Nat.Biotech.19:423−428)。別の例では一過性の鋳型
ライブラリー構築に関するランダムなキメラ誘発法(random chimerage
nesis:RACHITT)の技術を使用して、1本鎖の元のDNAフラグメントを完
全長の1本鎖の鋳型にアニーリングする(Coco et al.,2001,Nat.
Biotechnol.19:354−359)。さらに別の例では、付着伸長法(st
aggered extension process:StEP)、大変省略されたア
ニーリング/延長サイクルでの熱サイクリングを使用して、フランキングプライマーから
DNA重合を反復して切断する(Zhao et al.,1998,Nat.Biot
echnol.16:258−261)。CLERYとして知られている技術では、酵母
を対象としてインビトロのファミリーシャフリングをインビボの相同的組換えと組み合わ
せる(Abecassis et al.,2000,Nucleic Acids R
es.28:E88;)。遺伝子間組換えを最大にするために、各核酸の相補鎖からの1
本鎖DNAをDNaseで消化し、そしてアニーリングする(Kikuchi et a
l.,2000,Gene 243:133−137)。次いで開裂可能な配列により連
結されている可変長の2つの短縮化核酸の平滑末端を連結して、相同的組換え無しに遺伝
子融合を生成する(Sieber et al.,2001,Nat.Biotechn
ol.19:456−460;Lutz et al.,2001,Nucleic A
cids Res.29:E16;Ostermeier et al.,1999,N
at.Biotechnol.17:1205−1209;Lutz and Benk
ovic,2000,Curr.Opin.Biotechnol.11:319−32
4)。小さい配列相同性を持つ核酸間の組換えは一般に、DNAフラグメントのエキソヌ
クレアーゼが媒介する平滑末端化、そしてフラグメントを一緒に連結してそれらを組換え
ることによっても強化された(米国特許第6,361,974号明細書、引用により全部
、本明細書に編入する)。本発明は本発明の方法に有用なペプチドおよび/または酵素の
生物学的特性を強化する手段として、上記の各々、およびすべての変異の使用を意図する
。
ールに加えて、今では選択したペプチドの遺伝子シャフリングおよび選択手順を請け負う
商業的サービスも利用することができる。マキシジェン(Maxygen:レッドウッド
シティ、カリフォルニア州)は、カスタムDNAシャフリングライブラリーを作成するた
めの商業的サービスを提供する。さらにこの会社は、遺伝子シャフリングおよび選択する
ペプチドファミリーの選択を含むカスタマイズされた方向付けされる進化の手順も行う。
州)、プラスミドシャフリングに関連したサービスを提供する。オプティジェニックスは
新たな特性を有する突然変異をその中に得るために、遺伝子ファミリーを使用する。問題
の核酸をアスペルギルス(Aspergillus)発現系中のプラスミドにクローン化
する。次いで関連するファミリーのDNAを発現系に導入し、そしてファミリーの保存さ
れた領域中の組換えが宿主中で起こる。次いで生成した突然変異DNAが発現し、そして
それらから生産されたペプチドを、所望の特性の存在および望ましくない特性の不存在に
ついてスクリーニングする。
c.スクリーニング手順
「進化」の各循環後、突然変異した遺伝子により発現された所望のペプチドを問題の特
性についてスクリーニングする。次いで「候補」遺伝子を増幅し、そして次回のDNAシ
ャフリング用にプールする。使用するスクリーニング手順は、「進化」したペプチドおよ
び問題の特性に高度に依存する。中でもとりわけペプチド安定性、生物学的活性、抗原性
のような特性は、当該技術分野で周知な手順を使用して選択することができる。本発明の
方法に有用な好適ペプチドの生物学的活性に関する個々のアッセイは、本明細書のいたる
ところに記載する。
d.技術の組み合わせ
当業者には突然変異および選択の上記技術は、本発明の方法に有用な最高に可能なペプ
チド分子を生成するために、互いに、そしてさらなる手順と組み合わせることができると
考えるだろう。すなわち本発明はペプチドの生成に関して任意の1つの方法に限定される
ことはなく、そして本明細書に記載するありとあらゆる方法論を包含すると解釈すべきで
ある。例えば点突然変異を核酸配列に導入する手順を最初に行い、続いて循環的DNAシ
ャフリング、選択および増幅を行うことができる。初期の点突然変異の導入を使用して、
それを欠く遺伝子群に多様性を導入し、次回のDNAのシャフリングおよびスクリーニン
グにより有利な点突然変異を選択し、そして組み合わせることができる。
III.グリコシダーゼおよびグリコトランスフェラーゼ
A.グリコシダーゼ
グリコシダーゼは受容体分子として水を使用し、そしてそのままで典型的なグリコシド
−加水分解酵素であるグリコシルトランスフェラーゼである。グリコシダーゼは、反応混
合物の熱力学または動力学を制御することによりインビトロでグリコシド結合を形成する
ために使用することができる。変更された反応条件でも、グリコシダーゼ反応はうまく作
用することが難しく、そしてグリコシダーゼは可逆的なトランスグリコシラーゼ反応およ
び競合する加水分解反応の結果、低い合成収量を与える傾向がある。
いは加水分解中に破壊される結合で立体化学を逆転することにより機能することができ、
それぞれ「維持(retaining)」グリコシダーゼまたは「逆転(inverti
ng)」グリコシダーゼのいずれかに分類される。維持グリコシダーゼは活性部位に存在
する2つの重要なカルボン酸部分を有し、1つのカルボキシレートは酸/塩基触媒として
作用し、そしてもう1つは求核性として作用するが、逆転グリコシダーゼは1つのカルボ
ン酸が酸として、そしてもう1つが塩基として作用する。
あり、それらには簡略化HPLCプロトコール(Jacob and Scudder,
1994,Methods in Enzymol.230:280−300)を含む。
グリコシダーゼおよびグリコシダーゼ処理の一般的考察は、糖生物学、実践的取り組み(
Glycobiology,A Practical Approach)、(1993
,Fukuda and Kobata編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨー
ク)に見いだせる。
シダーゼ、エンドグリカナーゼ、マンノシダーゼ(すなわちαおよびβ、ManI、Ma
nIIおよびManIII)、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、アグロバクテリウム種(
Agrobacterium sp.)のβ−グリコシダーゼ、セルロモナス フィミ(
Cellulomonas fimi)のマンノシダーゼ2A、フミコーラ インソレン
ス(Humicola insolens)のグリコシダーゼ、スルホロブス ソルファ
タリカス(Sulfolobus solfataricus)のグリコシダーゼおよび
バチルス リケニホルミス(Bacillus licheniformis)のグリコ
シダーゼを含む。
本発明の方法に有用な多くのα−フコシダーゼの特異性は当該技術分野では周知であり、
そしてまた多種のフコシダーゼが市販されている(とりわけグリコ(Glyko)、ノバ
ト、カリフォルニア州;プロザイム(PROzyme)、サンレアンドロ、カリフォルニ
ア州;カルビオケム−ノババイオケム(Calbiochem−Novabiochem
)社、サンディエゴ、カリフォルニア州)。興味深いα−フコシダーゼには限定するわけ
ではないが、タルボ コルナタス(Turbo cornutus)、カロニア ランパ
ス(Charonia lampas)、バチルス フルミナンス(Bacillus
fulminans)、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger
)、クロストリジウム パーフリンゲンス(Clostridium perfring
ens)、ウシ腎臓(グリコ)、ニワトリ肝臓(Tyagarajan et al.,
1996,Glycobiology 6:83−93)に由来するα−フコシダーゼ、
およびザントモナス マニホティス(Xanthomonas manihotis)(
グリコ、プロザイム)由来のα−フコシダーゼIIを含む。ニワトリ肝臓のフコシダーゼ
はN−結合グリカンからコアフコースの除去に特に有用である。
B.グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは活性化糖(供与体NDP−糖)のタンパク質、糖ペプ
チド、脂質または糖脂質への、あるいは成長しているオリゴ糖の非還元末端への付加を段
階的様式で触媒する。N−結合糖ペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質−結合オリ
ゴ糖供与体Dol−PP−NAG2Glc3Man9をenブロック転移で、続いてコア
の改作を介して合成される。この場合、「コア」サッカリドの性質は後の結合とは幾分異
なる。大変多数のグリコシルトランスフェラーゼが当該技術分野で知られている。
糖を利用できる限り任意のものでよい。そのような酵素の例はガラクトシルトランスフェ
ラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニ
ルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マ
ンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランス
フェラーゼ等のようなルロアール経路のグリコシルトランスフェラーゼを含む。
コシルトランスフェラーゼをクローン化することができ、あるいは任意の供給源から単離
することができる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼ、およびそれらのポ
リヌクレオチド配列も知られている。例えばTaniguchi et al.,200
2,グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック(Handbook
of glycosyltransferases and related gen
es)、スプリンガー、東京、を参照にされたい。
できるグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列も、GenBank
、Swiss−Prot、EMBLおよびその他を含む様々な公開されているデーターベ
ースに見いだすことができる。
がガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランス
フェラーゼ、N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラ
ーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン
酸トランスフェラーゼおよびオリゴ糖トランスフェラーゼを含む。適当なグリコシルトラ
ンスフェラーゼには真核生物ならびに原核生物から得られるものを含む。
は細胞系カルチャーに由来するmRNAの逆転写物をスクリーニングすることにより、適
切な細胞に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、あるいはこれ
らの手法の組み合わせにより得ることができる。mRNAまたはゲノムDNAのスクリー
ニングは、グリコシルトランスフェラーゼの核酸配列から生成したオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用して行うことができる。プローブは限定するわけではないが蛍光基、放射性
原子または化学発光基のような検出可能な標識で既知の手順に従い標識し、そして通例の
ハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。あるいはグリコシルトランス
フェラーゼの核酸配列から生成されるPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、グ
リコシルトランスフェラーゼの核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)手法を使用し
て得ることができる。Mullis et al.に対する米国特許第4,683,19
5号明細書およびMullisに対する米国特許第4,683,202号明細書を参照に
されたい。
るDNAを含むベクターで形質転換した宿主細胞で合成することができる。ベクターは複
製可能なDNA構築物である。ベクターはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードす
るDNAを増幅し、かつ/またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするDNA
を発現させるいずれかのために使用する。発現ベクターは複製可能なDNA構築物であり
、ここでグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするDNA配列が、適切な宿主中で
グリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を行うことができる適切な制御配列に操作可能
に連結されている。そのような制御配列の必要性は選択した宿主および選択した形質転換
法に依存して変動する。一般に制御配列には転写プロモーター、転写を制御する任意のオ
ペレーター配列、適当なmRNAリボゾーム結合部位をコードする配列、および転写およ
び翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。
必要なすべてのものは、通常は複製起点により付与される宿主中で複製する能力、および
形質転換体の認識を容易にするための遺伝子の選択である。
1.フコシルトランスフェラーゼ
幾つかの態様では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシ
ルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは当業者に知られている。フ
コシルトランスフェラーゼの例には、L−フコースをGDP−フコースから受容体の糖の
ヒドロキシ部位へ転移する酵素を含む。非−ヌクレオチド糖から受容体へ転移するフコシ
ルトランスフェラーゼも本発明で使用される。
4)GlcNAcβ−基のGlcNAcである。この反応に適当なフコシルトランスフェ
ラーゼには、最初にヒトの乳から特性決定されたGalβ(1→3,4)GlcNAcβ
1−α(1→3,4)フコシルトランスフェラーゼ(FTIII E.C.No.2.4
.1.65)、(Palcic et al.,Carbohydrate Res.1
90:1−11(1989);Prieels,et al.,J.Biol.Chem
.256:10456−10463(1981);およびNunez,et al.,C
an.J.Chem.59:2086−2095(1981)を参照にされたい)、およ
びヒトの血清で見いだされたGalβ(1→4)GlcNAcβ−αフコシルトランスフ
ェラーゼ(FTIV、FTV、FTVI)を含む。FTVII(E.C.No.2.4.
1.65)、シアリルα(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβフコシルトランス
フェラーゼも特性決定された。Galβ(1→3,4)GlcNAcβ−α(1→3,4
)フコシルトランスフェラーゼの組換え形も特性決定された(Dumas,et al.
,Bioorg.Med.Letters 1:425−428(1991)およびKu
kowska−Latallo,et al.,Genes and Developm
ent 4:1288−1303(1990)を参照にされたい)。他のフコシルトラン
スフェラーゼの例には例えば、α1,2フコシルトランスフェラーゼ(E.C.No.2
.4.1.69)を含む。酵素的フコシル化はMollicone et al.,Eu
r.J.Biochem.191:169−176(1990)または米国特許第5,3
74,655号明細書に記載されている方法により行うことができる。
2.ガラクトシルトランスフェラーゼ
別の態様群では、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼで
ある。ガラクトシルトランスフェラーゼの例にはα(1,3)ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ(E.C.No.2.4.1.151、Dabkowski et al.,Tr
ansplant Proc.25:2921(1993)およびYamamoto e
t al.,Nature345:229−233(1990)を参照にされたい)、ウ
シ(GenBank j04989、Joziasse et al.,J.Biol.
Chem.264:14290−14297(1989))、マウス(GenBank
m26925;Larsen et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci
.USA 86:8227−8231(1989)、ブタ(GenBank L3615
2;Strahan et al.,Immunogenetics 41:101−1
05(1995)を含む。別の適当なα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液
のB抗原群の合成に関与するものである(E.C.2.4.1.37、Yamamoto
et al.,J.Biol.Chem.265:1146−1151(1990)(
ヒト))。
であり、これには例えばEC2.4.1.90(LacNAcシンテターゼ)およびEC
2.4.1.22(ラクトースシンテターゼ)、ウシ(D'Agostaro et a
l.,Eur,J.Biochem.183:211−217(1989))、ヒト(M
asri et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1
57:657−663(1988))、マウス(Nakazawa et al.,J.
Biochem.104:165−168(1988))、ならびにEC.2.4.1.
38およびセラミド ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC2.4.1.45、Sta
hl et al.,J.Neurosci.Res.38:234−242(1994
))を含む。他の適当なガラクトシルトランスフェラーゼには例えば、α1,2ガラクト
シルトランスフェラーゼ(例えばシゾサッカロミセス ポンベ(Schizosacch
aromyces pombe)に由来、Chapell et al.,Mol.Bi
ol.Cell 5:519−528(1994)を参照にされたい)を含む。さらに適
当なグリコシルトランスフェラーゼについては、Taniguchi et al.(2
002、グリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子のハンドブック、プリンガー、
東京)、Guo et al.(2001,Glycobiology,11(10):
813−820)およびBreton et al.(1998,J.Biochem.
123:1000−1009)を参照にされたい。
ようなタンパク質の生産も周知である。例えば米国特許第4,761,371号明細書を
参照にされたい。1つの方法は十分なサンプルの収集、次いで酵素のアミノ酸配列をN−
末端シークエンシングにより決定することを含む。次いでこの情報を使用して完全長の(
膜に結合した)トランスフェラーゼをコードするcDNAクローンを単離し、これは昆虫
細胞系Sf9中で発現して完全に活性な酵素の合成をもたらす。次いで酵素の受容体特異
性を、16種のタンパク質における既知のグリコシル化部位の周辺のアミノ酸の半定量的
分析、続いて合成ペプチドのインビトロのグリコシル化の実験により決定する。この作業
では特定のアミノ酸残基がグリコシル化ペプチドセグメント中で過剰に提示され(ove
rrpresented)、そしてグリコシル化されたセリンおよびトレオニン残基周辺
の特異的位置の残基が、受容体効率に他のアミノ酸部分よりも顕著な効果を有し得ること
が示された。
3.シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞および本発明の反応混合物に有用な別の種
類のグリコシルトランスフェラーゼである。本発明の使用に適するシアリルトランスフェ
ラーゼの例には、ST3GalIII(例えばラットまたはヒトST3GalIII)、
ST3GalIV、ST3GalI、ST6GalI、ST3GalV、ST6GalI
I、ST6GalNAcI、ST6GalNAcIIおよびST6GalNAcIIIを
含む(本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Tsuji et
al.,Glycobiology,6:v−xiv(1996)に記載されている)。
α(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.6)と呼ぶα(2,3)
シアリルトランスフェラーゼの例は、シアル酸をGalβ1→3Glc二糖またはグリコ
シドの非還元末端のGalへ転移する。Van den Eijnden et al.
,J.Biol.Chem.256:3159(1981)、Weinstein et
al.,J.Biol.Chem.257:13845(1982)およびWen e
t al.,J.Biol.Chem.267:21011(1992)を参照にされた
い。別の例のα2,3シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.4)は、シアル
酸を二糖またはグリコシドの非還元末端のGalへ転移する。Rearick et a
l.,J.Biol.Chem.254:4444(1979)およびGillespi
e et al.,J.Biol.Chem.267:21004(1992)を参照に
されたい。さらなる酵素の例にはGal−β−1,4−GlcNAcα−2,6−シアリ
ルトランスフェラーゼを含む(Kurosawa et al.Eur.J.Bioch
em.219:375−381(1994)を参照にされたい)。
ゼは完全にシアリル化された炭水化物構造上の末端シアル酸の下にある最も多くの終わり
から2番目の配列である配列Galβ1,4GlcNAc−、Galβ1,3GlcNA
c−またはGalβ1,3GalNAc−にシアル酸を転移させることができる(表7を
参照にされたい)。2,8−シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を本発明の方法に
有用なα2,3Galβ1,4GlcNAcに転移させることができる。
あり、これはα(2,3)シアリルトランスフェラーゼ(EC2.4.99.6)とも呼
ばれる。この酵素はシアル酸をGalβ1,3GlcNAcまたはGalβ1,4Glc
NAcグリコシドのGalへ転移させることを触媒し(例えばWen et al.,J
.Biol.Chem.267:21011(1992);Van den Eijnd
en et al.,J.Biol.Chem.256:3159(1991)を参照に
されたい)、そして糖ペプチド中のアスパラギン−結合オリゴ糖のシアリル化の原因であ
る。シアル酸はGalと結合して2つのサッカリド間にα−結合を形成する。サッカリド
間の結合(連結)は、NeuAcの2−位とGalの3−位との間である。この特別な酵
素はラットの肝臓(Weinstein et al.,J.Biol.Chem.25
7:13845(1982));ヒトcDNA(Sasaki et al.(1993
)J.Biol.Chem.268:22782−22787;Kitagawa &
Paulson(1994)J.Biol.Chem.269:1394−1401)、
およびゲノム(Kitagawa et al.(1996)J.Biol.Chem.
271:931−938)から単離することができる。DNA配列も既知であり、組換え
発現によるこの酵素の生産を促進する。好適な態様では、特許請求するシアリル化法はラ
ットのST3GalIIIを使用する。
ピロバクター ジェジュニ(Camphylobacter jejuni)から単離さ
れるものを含む。例えば国際公開第99/49051号パンフレットを参照にされたい。
ドの経済的かつ効率的な大規模シアリル化法に有用である。このような他の酵素の有用性
を見いだすための単純な試験として、様々な量の酵素(1〜100mU/mgタンパク質
)をアシアロ−α1AGP(1〜10mg/mlで)と反応させて、糖ペプチドをシアリ
ル化する問題のシアリルトランスフェラーゼの能力を、ウシのST6Gal、ST3Ga
lIIIまたは両シアリルトランスフェラーゼのいずれかと比較する。あるいは他の糖ペ
プチドまたは糖ペプチド、またはペプチド骨格から酵素的に放出されるN−結合オリゴ糖
を、この評価のためにアシアロ−α1AGPの代わりに使用することができる。ST6G
alIよりも効率的に糖ペプチドのN−結合オリゴ糖をシアリル化する能力を持つシアリ
ルトランスフェラーゼは、ペプチドをシアリル化するための現実的な大規模法に有用であ
る(本開示においてST3GalIIIについて具体的に説明するように)。
4.他のグリコシルトランスフェラーゼ
当業者は他のグリコシルトランスフェラーゼを、シアリルトランスフェラーゼについて
詳細に記載したように同様なトランスフェラーゼサイクルで置き換え得ることができると
理解するだろう。特にグリコシルトランスフェラーゼは例えばグルコシルトランスフェラ
ーゼ、例えばAlg8(Stagljov et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 91:5977(1994))またはAlg5(Heesen e
t al.,Eur.J.Biochem.224:71(1994))であることもで
きる。
N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼには限定するわけではないが、α(1
,3)N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β(1,4)N−アセチルガ
ラクトサミニルトランスフェラーゼ(Nagata et al.,J.Biol.Ch
em.267:12082−12089(1992)およびSmith et al.,
J.Biol.Chem.269:15162(1994))およびペプチドN−アセチ
ルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(Homa et al.,J.Biol.Ch
em.268:12609(1993))を含む。適当なN−アセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼにはGnTI(2.4.1.101、Hull et al.,BBR
C176:608(1991))、GnTII、GnTIII(Ihara et al
.,J.BioChem.113:692(1993))、GnTIV、GnTV(Sh
oreibah et al.,J.Biol.Chem.268:15381(199
3))およびGnTVI、O−結合N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(B
ierhuizen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8
9:9326(1992))、N−アセチルグルコサミン−1−ホスフェートトランスフ
ェラーゼ(Rajput et al.,Biochem J.285:985(199
2))およびヒアルロナン シンターゼを含む。
る。適当なマンノシルトランスフェラーゼにはα(1,2)マンノシルトランスフェラー
ゼ、α(1,3)マンノシルトランスフェラーゼ、α(1,6)マンノシルトランスフェ
ラーゼ、β(1,4)マンノシルトランスフェラーゼ、Dol−P−Manシンターゼ、
OCh1およびPmt1を含む(Kornfelds et al.,Annu.Rev
.Biochem.54:631−664(1985)を参照にされたい)。
al.,Biochem J.288:817−822(1992);およびElbai
n,et al.、米国特許第6,168,937号明細書を参照にされたい。
.,JACS114:9283(1992)、Wong et al.,J.Org.C
hem.57:4343(1992)およびIchikawa et al.、炭水化物
および炭水化物ポリマー(CARBOHYDRATES AND CARBOHYDRA
TE POLYMERS)、Yaltami編集(ATL出版、1993)に記載されて
いる。
リコシルトランスフェラーゼには多くのグラム陰性細菌により生産されるリポオリゴ糖(
LOS)の合成に関与する酵素を含む。LOSは典型的には、ヒト上皮細胞の表面または
宿主の分泌に見いだされる複合糖質を模する末端グリカン配列を有する(Preston
et al.、Critical Reviews in Microbiology
23(3):139−180(1996))。そのような酵素には限定するわけではない
が、β1,6ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ1,3ガラクトシルトランスフェ
ラーゼを含む大腸菌(E.coli)およびネズミチフス菌(Salmonella t
yphimurium)のような種のrfaオペロンのタンパク質(例えばEMBL寄託
番号M80599およびM86935(大腸菌(E.coli));EMBL寄託番号S
56361(ネズミチフス菌(S.typhimurium)を参照にされたい)、グル
コシルトランスフェラーゼ(スイス−プロット寄託番号P25740(大腸菌(E.co
li))、β1,2−グルコシルトランスフェラーゼ(rfaJ)(スイス−プロット寄
託番号P27129(大腸菌(E.coli))およびスイス−プロット寄託番号P19
817(ネズミチフス菌(S.typhimurium))、およびβ1,2−N−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼ(rfaK)(EMBL寄託番号U00039(
大腸菌(E.coli))を含む。アミノ酸配列が既知の他のグリコシルトランスフェラ
ーゼには、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸菌(E.c
oli)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、サルモ
ネラ エンテリカ(Salmonella enterica)、腸炎エルシニア(Ye
rsinia enterocolitica)、マイコバクテリウム レプロサム(M
ycobacterium leprosum)のような微生物で特徴付けられたrfa
Bのようなオペロン、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)
のrh1オペロンにコードされるものを含む。
−β−1,4−N−アセチル−D−グルコサミニル−β−1,3−D−ガラクトシル−β
−1,4−D−グルコース、およびPk血液型の三糖配列、D−ガラクトシル−α−1,
4−D−ガラクトシル−β−1,4−D−グルコースを含む構造の生産に関与するグリコ
シルトランスフェラーゼであり、これらは粘膜病原菌である淋菌(Neisseria
gonorrhoeae)および髄膜炎菌(N.meningitidis)のLOSで
同定された(Scholten et al.,J.Med.Microbiol.41
:236−243(1994))。グリコシルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌
(N.meningitidis)および淋菌(N.gonorrhoeae)由来の遺
伝子は、髄膜炎菌(N.meningitidis)のイムノタイプL3およびL1(J
ennings et al.,Mol.Microbiol.18:729−740(
1995))、および淋菌(N.gonorrhoeae)突然変異体のF62(Got
shlich,J.Exp.Med.180:2181−2190(1994))から同
定されたこれらの構造の生合成に関与した。髄膜炎菌(N.meningitidis)
では、3つの遺伝子、lgtA、lgtBおよびlgEからなる位置がラクト−N−ネオ
テトラオース鎖に最後の3つの糖を付加するために必要であるグリコシルトランスフェラ
ーゼ酵素をコードする(Wakarchuk et al.,J.Biol.Chem.
271:19166−73(1996))。最近、lgtBおよびlgtA遺伝子産物の
酵素活性が証明され、それらの提案されたグリコシルトランスフェラーゼ機能について直
接的な証拠が提供された(Wakarchuk et al.,J.Biol.Chem
.271(45):28271−276(1996))。淋菌(N.gonorrhoe
ae)では2つのさらなる遺伝子、β−D−GalNAcをラクト−N−ネオテトラオー
ス構造の末端ガラクトースの3位に加えるlgtD、および短縮化LOSのラクトース要
素に末端α−Galを加えるlgtCがあり、これによりPk血液型抗原構造を作成する
(Gotshlich(1994)、同上)。髄膜炎菌(N.meningitidis
)では、別のイムノタイプL1もPk血液型抗原を発現し、そしてlgtC遺伝子を持つ
ことが示された(Jennings et al.,(1995)、同上)。ナイセリア
(Neisseria)のグリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子も、米国特許
第5,545,553号明細書(Gotschlich)に記載されている。ヘリコバク
ター ピロリ(Helicobacter pylori)に由来するα1,2−フコシ
ルトランスフェラーゼおよびα1,3−フコシルトランスフェラーゼに関する遺伝子も特
性決定された(Martin et al.,J.Biol.Chem.272:213
49−21356(1997))。また本発明で使用するのはカンピロバクター ジェジ
ュニ(Camphylobacter jejuni)のグリコシルトランスフェラーゼ
である(Taniguchi et al.,2002、グリコシルトランスフェラーゼ
および関連遺伝子のハンドブック、スプリンガー、東京を参照にされたい)。
B.スルホトランスフェラーゼ
本発明は、例えばヘパリン、硫酸ヘパラン、カラゲニン(carragenen)のよ
うな硫黄化多糖および関連化合物を含む硫黄化した分子を含むペプチドの生産法を提供す
る。適当なスルホトランスフェラーゼには例えば、コンドロイチン−6−スルホトランス
フェラーゼ(Fukuta et al.,J.Biol.Chem.270:1857
5−18580(1995)により記載されたニワトリcDNA;GenBank寄託番
号D49915)、グルコサミノグリカンN−アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ
/N−スルホトランスフェラーゼ1(Dixon et al.,Genomics 2
6:239−241(1995);UL18918)、およびグルコサミノグリカンN−
アセチルグルコサミンN−デアセチラーゼ/N−スルホトランスフェラーゼ2(Orel
lana et al.,J.Biol.Chem.269:2270−2276(19
94)およびEriksson et al.,J.Biol.Chem.269:10
438−10443(1994)に記載されたマウスcDNA;GenBank寄託番号
U2304に記載されたヒトcDNA)を含む。
C.細胞−結合グリコシルトランスフェラーゼ
別の態様では、本発明の方法で採用する酵素は細胞−結合グリコシルトランスフェラー
ゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが知られているが(例えば米国特
許第5,032,519号明細書を参照にされたい)、グリコシルトランスフェラーゼは
細胞に付随する時は一般に膜に結合している状態である。これまでに研究された多くの膜
に結合酵素は内在性のタンパク質であると考えられ;すなわちそれらは超音波により膜か
ら放出されず、そして可溶化に界面活性剤を要する。表面のグリコシルトランスフェラー
ゼは脊椎動物および無脊椎動物の細胞上の表面で同定され、そしてこれら表面のトランス
フェラーゼが生理学的条件下で触媒活性を維持していることも認識された。しかし細胞表
面のグリコシルトランスフェラーゼのより認識されている機能は細胞間の認識である(R
oth,1990,超細胞現象に対する分子的取り組み(Molecular Appr
oaches to Supracellular Phenomena)。
れた。例えばLarsen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA86:8227−8231(1989)は、細胞表面のオリゴ糖構造およびそれらの
コグネイトグルコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化cDNA配列を単
離する遺伝的取り組みを報告する。UDP−ガラクトース;β−D−ガラクトシル−1,
4−N−アセチル−D−グルコサミニドα−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼを
を発現することが知られているマウスの細胞系から単離したmRNAから作成したcDN
AライブラリーをCOS−1細胞にトランスフェクトした。次いでトランスフェクトした
細胞を培養し、そしてα1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイ
した。
89:2713−2717(1992)は、β−ラクタマーゼを大腸菌(Escheri
chia coli)の外面に足掛けする(anchoring)方法を開示する。(i
)外膜タンパク質のシグナル配列、(ii)外膜タンパク質の膜−拡張区分(spann
ing section)、および(iii)完全な成熟β−ラクタマーゼ配列からなる
三者(tripartite)融合が生産され、活性な表面結合β−ラクタマーゼ分子を
生じる。しかしFranciscoの方法は原核細胞系にのみ限定され、著者により認識
されているように、正しく機能するには完全な三者融合を必要とする。
D.融合酵素
別の例示態様では、本発明の方法は所望の糖ペプチド結合物の合成に関与する1より多
くの酵素活性を有する融合ペプチドを利用する。融合ペプチドは例えば、アクセサリー酵
素の触媒的に活性なドメインに連結されたグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性
なドメインからなることができる。アクセサリー酵素の触媒ドメインは、例えばグリコシ
ルトランスフェラーゼの供与体であるヌクレオチド糖の形成における工程を触媒するか、
あるいはグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応を触媒することができる
。例えばグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドはフレイム内で、
ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドに結合され得る。生成
した融合ペプチドは次いでヌクレオチド糖合成を触媒するだけでなく、アクセプター分子
への糖部分の転移も触媒する。融合ペプチドは1つの発現可能なヌクレオチド配列に連結
された2以上のサイクル酵素であることができる。別の態様では融合ペプチドは2以上の
グリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインを含む。例えば米国特許5,6
41,668第号明細書を参照にされたい。本発明の修飾された糖ペプチドは、様々な適
切な融合ペプチドを利用して容易に設計し、そして製造することができる(例えば国際公
開第99/31224号パンフレットとして1999年6月24日に公開されたPCT特
許出願PCT/CA98/01180を参照にされたい)。
E.固定化酵素
細胞に結合した酵素に加えて、本発明は固体および/または可溶性支持体上に固定化さ
れた酵素の使用も提供する。例示態様では、本発明の方法に従い完全なグリコシルリンカ
ーを介してPEGに結合されたグリコシルトランスフェラーゼを提供する。PEG−リン
カー−酵素結合物は、場合により固体支持体に結合される。本発明の方法において固体に
支持された酵素の使用は、反応混合物の処理および反応生成物の精製を簡単にし、そして
また酵素の容易な回収を可能とする。このグリコシルトランスフェラーゼ結合物は本発明
の方法に利用する。他の酵素および支持体の組み合わせも当業者には明らかであろう。
F.グリコシルトランスフェラーゼの突然変異誘発法
本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ
、スルホトランスフェラーゼおよび任意の他の酵素の新規形態は、これまでに記載した任
意の方法ならびに当該技術分野で周知の他の方法を使用して作成することができる。特に
興味深いのは、改変された受容体特異性および/または供与体特異性を持つトランスフェ
ラーゼである。また興味深いのは、中でもより高い転換速度およびより高い安定性を持つ
酵素である。
ができる。本発明で使用するトランスフェラーゼおよびグルコシダーゼ配列ならびに3次
構造の多くは知られているので、これらの酵素は突然変異の合理的な設計に理想的である
。例えば酵素の触媒部位を突然変異させて酵素の供与体および/または受容体特異性を改
変することができる。
構造に関するデータにより、これらの酵素はドメイン交換が関与する突然変異にも理想的
なものとなる。グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼヒドロラーゼはモジ
ュラー酵素(modular enzyme)である(Bourne and Henr
issat,2001,Current Opinion in Structural
Biology 11:593−600)。グリコシルトランスフェラーゼはそれらの
構造に基づき2つのファミリーに分類される:GT−AおよびGT−B。GT−Aファミ
リーのグリコシルトランスフェラーゼは2つの似ていないドメインを含んでなり、1つは
ヌクレオチド結合に関与し、そしてもう1つは受容体結合に関与する。このように1つの
遺伝子に由来するドメインをコードするDNA配列を、第2の遺伝子に由来するドメイン
とフレイム内で都合よく融合して、新たな受容体/供与体特異性を持つタンパク質をコー
ドする新たな遺伝子を作成することができる。そのようなドメインの交換にはさらに炭水
化物モジュールおよび他のアクセサリードメインを含むことができる。
用するグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼの新規な形態を作成するため
にも使用することができる。
IV.インビトロおよびインビボの発現系
A.糖ペプチドを生産するための細胞
グリコシルトランスフェラーゼの作用はペプチドのグリコシル化に重要であり、すなわ
ち所定の細胞型での1組のグリコシルトランスフェラーゼの発現における差異は、その細
胞で生産される所定のペプチドのグリコシル化パターンに影響を及ぼす。宿主細胞に依存
的なペプチドのグリコシル化の総説に関しては、Kabata and Takasak
i、「細胞表面の炭水化物の構造および生合成(Structure and Bios
ynthesis of Cell Surface Carbohydrates)」
、細胞表面の炭水化物および細胞生育(Cell Surface Carbohydr
ates and Cell Development)で、1991、第1〜24頁、
編集.Minoru Fukuda、CRC出版、ボカ ラトン、フロリダ州を参照にさ
れたい。
を生成するために必要な改造の程度に対してのみ関係がある。例えば所望のグリコシル化
を有するペプチドを生成するために、インビトロで必要な酵素的消化反応の回数および順
序および酵素的合成反応の回数および順序は、特定の細胞型により生産されるペプチド上
のグリカンの構造に依存して変動する。本発明は本明細書に開示する任意の細胞型を含む
任意の1つの特定の細胞型に由来するペプチドの生産に限定されるとは全く解釈されるべ
きではなく、本発明の威力およびペプチドが生成される細胞系の独立性を確立する幾つか
の細胞系の検討をこれから提示する。
ロモーター要素、ターミネーター要素およびこの2つの間に操作可能に連結されたペプチ
ドのコード配列を含んでなる発現カセットに包含されなければならない。次いで発現カセ
ットをベクターに操作可能に連結する。この末端に向けてアダプターまたはリンカーを使
用してヌクレオチドフラグメントを連結することができ、あるいは便利な制限部位、余分
なヌクレオチドの除去、制限部位の除去等を提供するために他の操作が関与してもよい。
このために、インビトロの突然変異誘発法、プライマー修復、制限、アニーリング、再置
換、例えばトランジッションおよびトランスバージョンを含むことができる。シャトルベ
クターは細胞中で複製に必要な遺伝子要素を有する。ベクターの中には原核細胞中でのみ
複製できるもの、あるいは原核および真核細胞の両方で複製できるものがある。そのよう
なプラスミド発現ベクターは1以上の複製系、好ましくは発現の目的で酵母宿主細胞内で
、そしてクローニングの目的で原核宿主内で安定に維持されることができる2つの複製系
で維持される。今では多様な特性を持つ多くのベクターが市販されている。ベクターは通
常、プラスミドまたはファージであるが、コスミドまたはミニ−染色体でもよい。都合が
良いことに、多くの市販されているベクターはすでに存在する発現カセットにプロモータ
ーおよびターミネーター、および問題のペプチド用のコード配列を挿入できるマルチ−リ
ンカー部位を有する。次いで発現カセットを含むシャトルベクターは大腸菌(E.col
i)中で形質転換され、ここでベクターは細胞分裂中に複製して選択した発現系の宿主細
胞を形質転換するのに十分なベクターの調製物を生成する。上記の方法は当業者には周知
であり、そして行なわれるプロトコールはSambrook et al.(2001,
モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー
ラボラトリー、ニューヨーク)に見いだすことができる。
れる。形質転換のプルトコールは細胞の種類およびベクターの性質に依存する。形質転換
体を適当な栄養培地中で成長させ、そして適当な場合には内因性DNAの維持を選択圧下
で維持する。発現が誘導性である場合、成長により酵母宿主が高密度の細胞を生じること
ができるようになり、次いで発現が誘導される。分泌した成熟したヘテロロガスなペプチ
ドは通常の手段により回収することができ、そしてクロマトグラフィー、電気泳動、透析
、溶媒−溶媒抽出等により精製され得る。
順に関する技術は、Sambrook et al.(2001、モレキュラークローニ
ング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コ
ールドスプリングハーバー、ニューヨーク州);Glover et al.,(198
5、DNAクローニング:実践的取り組み(DNA Cloning:A Practi
cal Approach)、第IおよびII巻);Gait et al.,(198
5、オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)
);Hames and Higgins(1985、核酸ハイブリダイゼーション(N
ucleic Acid Hybridization));Hames and Hi
ggins(1984、転写および翻訳(Transcription and Tra
nslation));Freshney et al.,(1986、動物細胞培養(
Animal Cell Culture));Perbel、(1986、固定化細胞
および酵素(Immobilized Cells And Enzymes)、IRL
出版);Perbel、(1984、分子クローニングに関する実践的指針(A Pra
ctical Guide To Molecular Cloning));Ausu
bel et al.(2002、分子生物学の現在のプロトコール(Current
Protocols in Molecular Biology)、ジョン ウィリー
&サンズ社)に見いだすことができる。
B.真菌および酵母
酵母で生産されたペプチドはグリコシル化されており、そしてそこに存在するグリカン
構造は主に高マンノース構造である。N−グリカンの場合では、酵母で生産されたグリカ
ン構造は、9以上ものマンノース残基を含むことができ、この残基はそれに結合したさら
なる糖を含んでも、含まなくてもよい。酵母細胞により生産されるペプチド上のこの型の
グリカンの例を、図5の左側に示す。マンノース残基の番号およびそれに結合したさらな
る糖の型および複雑さに関係なく、酵母細胞で生産されたペプチドの成分としてN−グリ
カンは、図5に示すトリマンノシルコア構造を含んでなる。酵母細胞で生産されたペプチ
ド上のグリカン構造が高マンノース構造である時、当業者が利用可能なマンノシダーゼ酵
素を使用してグリカンのトリマンノシルコアを含んでなる残基を除き、分子からすべての
マンノース残基をインビトロで除去することは単純なことであり、これにより結合した基
本的なトリマンノシルコア構造を有するペプチドを生成する。ここで今、当該技術分野で
利用可能な技術を使用し、そして本開示から着手すれば、インビトロで酵素的にさらなる
糖部分を基本的なトリマンノシルコア構造に加え、所望のグリカン構造をトリマンノシル
コアに結合して有するペプチドを生成することは簡単である。同様に酵母細胞により生産
されたペプチドが、結合した他の複雑な糖に加えて高マンノース構造を含んでなる時、余
分なマンノース残基を含めさらなる糖のすべてを酵素的に開裂して基本的なトリマンノシ
ルコア構造に到達することは簡単な事柄である。いったん基本的なトリマンノシルコアが
生成されれば、所望のグリコシル化を有するペプチドの生成は本明細書に提供する指針に
従い可能となる。
osporogenous)、および不完全菌類(Blastomycetes)に属す
る酵母を意図している。無胞子酵母は2つのファミリー、スペルモフィトラ科(Sper
mophthoraceae)およびサッカロミセス科(Saccharomyceta
ceae)に分類される。後者は4つのサブファミリー、シゾサッカロミセス科(Sch
izosaccharomycoideae)(例えばシゾサッカロミセス(Schiz
osaccharomyces)属)、ナドゾニア科(Nadsonioideae)、
リポミセス科(Lipomycoideae)およびサッカロミセス科(Sacchar
omycoideae)(例えばピヒア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluy
veromyces)、およびサッカロミセス(Saccharomyces)属)から
なる。担子胞子酵母にはロイコスポリジウム(Leucosporidium)、ロドス
ポリジウム(Rhodosporidium)、スポリディオボルス(Sporidio
bolus)、フィロバシジウム(Filobasidium)およびフィロバシジーラ
(Filobasidiella)属を含む。不完全菌類に属する酵母は2つのファミリ
ー、スポロボロミセス科(Sporobolomycetaceae)(例えば、スポロ
ボロミセス(Sporobolomyces)、ブレラ(Bullera)属)およびク
リプトコッカス科(Cryptococcaceae)(例えばカンジダ(Candid
a)属)に分類される。本発明で特に興味深いのは、サッカロミセス(Saccharo
myces)、ピヒア(Pichia)、アスペルギルス(Aspergillus)、
トリコデルマ(Trichoderma)、クルイベロミセス(Kluyveromyc
es)属、特にK.ラクティス(lactis)およびK.ドロソフィラム(droso
philum)、カンジダ(Candida)、ハンセニューラ(Hansenula)
、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Ya
rrowia)およびクリソポリウム(Chrysoporium)属内の種である。酵
母の分類は将来、変わるかもしれないので、本発明の目的のための酵母は、Skinne
r et al.編集、1980)、酵母の生物学および活性(Bilogy and
Activities of Yeast)(Soc.App.Bacteriol.S
ymp.Series No.9)に記載されてように定義されるものである。
している。例えばBacila et al.編集(1978、酵母の生化学および遺伝
学(Biochemistry and Genetics of Yeast)、アカ
デミック出版、ニューヨーク);およびRose and Harrison.(198
7、酵母(The Yeasts)(第2版)、アカデミック出版、ロンドン)を参照に
されたい。外因性のDNAを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野で周知である。酵
母の形質転換のためには広範な種々の方法がある。スフェロプラスト形質転換はHinn
en et al(1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1
919−1933);Beggs,(1978,Nature275(5676):10
4−109);およびStinchcomb et al.,(欧州特許出願公開第45
,573号明細書;引用により本明細書に編入する)により教示され、電気穿孔はBec
ker and Gaurante,(1991,Methods Enzymol.1
94:182−187)により教示され、酢酸リチウムはGietz et al.(2
002,Methods Enzymol.350:87−96)およびMount e
t al.(1996,Methods Mol Biol.53:139−145)に
より教示されている。非サッカロミセス(Saccharomyces)酵母の形質転換
系の総説に関しては、Wang et al.(Crit Rev Biotechno
l.2001;21(3):177−218)を参照にされたい。酵母の遺伝子操作に関
する一般的手順については、Barr et al.,(1989、酵母の遺伝子操作(
Yeast genetic enginerring)、バターワース、ボストン)を
参照にされたい。
チドの翻訳後修飾プロセッシングおよび成熟ペプチドの回収および純度を強化するように
突然変異および/または選択された酵母および真菌の株が存在する。外因性ペプチドの発
現は、インスリンの発現により具体的に説明されるように細胞の分泌経路に向けることも
できる(Kjeldsen,2000,Appl.Microbiol.Biotech
nol.54:277−286、およびその中の参考文献を参照にされたい)。一般に酵
母細胞から外因性ペプチドの分泌を引き起こすためには、キラートキシン(Stark
and Boyd,1986、EMBO J.1995−2002)、またはアルファフ
ェロモン(Kurjan and Herskowitz,1982,Cell 30:
933;Brake et al.,1988,Yeast 4:S436)の遺伝子の
もののような酵母遺伝子に由来する分泌シグナルを使用することができる。
992,糸状菌の応用分子遺伝学(Applied Molecular Geneti
cs of Filamentous Fungi)、ブラッキー アカデミック アン
ド プロフェッショナル(Blackie Academic and Profess
ional)、ニューヨーク)に見いだすことができる。適切なベクターに関するガイダ
ンスは、Martinelli and Kinghorn(1994,アルペルギルス
:50年(Aspergillus:50 years)、エルセビア、アムステルダム
)に見いだすことができる。
1.サッカロミセス(Saccharomyces)
サッカロミセス(Saccharomyces)では、ペプチドを生産するために使用
する適当な酵母ベクターにはYRp7(Struhl et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA76:1035−1039,1978)、YEp13(B
roach et al.,Gene 8:121−133,1979)、POTベクタ
ー(Kawasaki et al.,米国特許第4,931,373号明細書、これは
引用により本明細書に編入する)、pJDB249およびpJDB219(Beggs,
Nature 275:104−108,1978)およびそれらの誘導体を含む。酵母
での使用に好適なプロモーターは、酵母の解糖遺伝子の発現に関するプロモーター(Hi
tzeman et al.,J.Biol.Chem.255:12073−1208
0,1980;Alber and Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen
et.1:419−434,1982;Kawasaki,米国特許第4,599,31
1号明細書)、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al.、
化学品のための微生物の遺伝子工学(Genetic Engineering of
Microorganisms for Chemicals)、Hollaender
et al.,(編集)、第355頁、プレナム出版、ニューヨーク、1982;Am
merer,Meth.Enzymol.101:192−201,1983)、および
ADH2−4cプロモーター(Russell et al.,Nature 304:
652−654,1983;Irani and Kilgore,米国特許出願第07
/784,653号明細書、カナダ国特許第1,304,020号明細書および欧州特許
第284 044号明細書、これらは引用により本明細書に編入する)を含む。発現単位
は転写ターミネーターも含むことができる。好適な転写ターミネーターはTPI1ターミ
ネーター(Alber and Kawasaki,同上)である。
t al.(1979)Gene 8:17−24;pC1(Brake et al.
(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:4642−4646
)、およびYrp17(Stnichomb et al.(1982)J.Mol.B
iol.158:157)を含む。さらにプラスミド発現ベクターは高または低コピー数
プラスミドでよく、コピー数は一般に約1〜約200の範囲である。高コピー数酵母ベク
ターの場合、一般に1つの宿主中に少なくとも10、好ましくは少なくとも20、そして
通常は約150コピーを越えない。選択したヘテロロガスなペプチドに依存して、高また
は低コピー数ベクターのいずれかが、ベクターおよび組換えペプチドが宿主に及ぼす効果
に依存して望ましい。例えばBrake et al.(1984)Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 81:4642−4646を参照にされたい。本発明のD
NA構築物はベクターに組み込むことにより酵母ゲノムに組み込んでもよい。そのような
ベクターの例は当該技術分野で知られている。例えばBotstein et al.(
1979)Gene 8:17−24を参照にされたい。
野の技術内である。特に興味深いのは、サッカロミセス(Saccharomyces)
のS.セルビシエ(cerevisiae)、S.カールスベルゲンシス(carlsb
ergensis)、S.ジアスタティカス(diastaticus)、S.ドウグラ
シー(douglasii)、S.クルイベリ(kluyveri)、S.ノルベンシス
(norbensis)およびS.オビホルミス(oviformis)種である。所望
のペプチドを発現させるために酵母宿主細胞を選択する時、適当な宿主細胞は、中でも良
好な分泌能力、低いタンパク質分解活性、および全体的な成長力(vigor)を有する
ことが示されたものを含むことができる。酵母および他の微生物は一般に様々な供給源か
ら入手可能であり、それらにはカリフォルニア州、バークレーのカリフォルニア大学、生
物物理学および医学物理学部(Department of Biophysics a
nd Medical Physics)、酵母遺伝子ストックセンター(Yeast
Genetic Stock Center);およびバージニア州、マナッサスのアメ
リカンタイプカルチャーコレクションを含む。総説に関しては、Strathern e
t al.編集.(1981、酵母、サッカロミセスの分子生物学(The Molec
ular Biology of the Yeast Saccharomyces)
、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク州)をに参照にされたい。
2.ピヒア
組換えペプチドの生産のための宿主としてピヒア メタノリカ(Pichia met
hanolica)の使用は、PCT出願、国際公開第97/17450号、同第97/
17451号、同第98/02536号および同第98/02565号パンフレットに開
示されている。P.メタノリカ(methanolica)の形質転換に使用するDNA
分子は一般に、形質転換前に好ましくは直線化される二本鎖の環状プラスミドとして調製
される。P.メタノリカ(methanolica)でのペプチド生産には、プラスミド
中のプロモーターおよびターミネーターは、P.メタノリカ(methanolica)
のアルコール利用遺伝子(AUG1またはAUG2)のようなP.メタノリカ(meth
anolica)遺伝子のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターにはジヒ
ドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)およびカタ
ラーゼ(CAT)遺伝子のもの、ならびに米国特許第5,252,726号明細書に開示
されているものを含む。DNAの宿主染色体への組み込みを容易にするために、宿主DN
A配列により両末端を挟まれたプラスミドの全発現セグメントを有することが好ましい。
ピヒア メタノリカ(Pichia methanolica)での使用に好適な選択マ
ーカーは、ホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC;EC
4.1.1.21)をコードするP.メタノリカ(methanolica)ADE2遺
伝子であり、これはade2宿主細胞がアデニンの不存在下で成長することを可能とする
。メタノールの使用を最少にすることが望まれる大規模な工業的方法には、両方のメタノ
ール利用遺伝子(AUG1およびAUG2)が削除されている宿主細胞が好ましい。分泌
するペプチドの生産には、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4およびPRB1)を欠く宿
主細胞が好適である。目的のペプチドをコードするDNAを含むプラスミドを、P.メタ
ノリカ(methanolica)細胞に導入することを容易にするために、電気穿孔を
使用する。指数的に減少する、2.5〜4.5kV/cm、好ましくは約3.75kV/
cmの場の強さを有するパルス電場、および1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ
秒の時間定数(t)を使用して、電気穿孔によりP.メタノリカ(methanolic
a)細胞を形質転換することが好ましい。抗体フラグメントの大規模生産のためのピヒア
パストリス(Pichia pastoris)の使用に関する総説は、Fische
r et al.(1999,Biotechnol.Appl Biochem.30
(Pt2):117−120)を参照にされたい。
3.アスペルギルス(Aspergillus)
アスペルギルス(Aspergillus)種でペプチドを発現させる方法は当該技術
分野では周知であり、それらには限定するわけではないが引用により全部、本明細書に編
入するCarrez et al., 1990, Gene 94: 147-154; Contreras, 1991, Bio/Technology 9:3
78-381; Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474; Tilburn e
t al., 1983, Gene 26: 205-221; Kelly and. Hynes, 1985, EMBO J. 4:475-479; Ballan
ce et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 112: 284-289; Buxton et al., 1985,
Gene 37: 207-214, and U.S. Pat. No. 4,935,349に記載されているものを含む。アスペ
ルギルス(Aspergillus)で有用なプロモーターの例は、米国特許第5,25
2,726号明細書に見いだされる。ペプチドの発現に有用なアスペルギルス(Aspe
rgillus)の株は、米国特許第4,935,349号明細書に見いだされる。外因
性ペプチドの工業的生産は、アスペルギルス ニガー(Aspergillus nig
er)およびアスペルギルス オリーゼ(Aspergillus oryzae)につ
いてノボエンザイム(Novoenzymes)から入手可能である。
4.トリコデルマ(Trichoderma)
トリコデルマ(Trichoderma)は所望のペプチドを発現させるために、他の
種の組換え宿主細胞に優るある一定の利点を有する。この微生物は大量に成長させること
が容易であり、そしてグリコシル化する能力を有し、そして組換え哺乳動物ペプチドを培
地に高い収量で効率よく分泌し、ペプチドの単離を比較的容易とする。さらに発現したペ
プチド上のグリコシル化パターンは、他の系で発現されるものよりもヒトペプチドに類似
している。しかしこれらの細胞から発現したペプチド上のグリカン構造にも差異が存在す
る。例えば末端シアル酸残基は、グリカン構造の末端のこれらの部分の存在が哺乳動物の
血流からペプチドの排除を遅らせるので、哺乳動物系におけるペプチドの治療的機能に対
して重要である。シアリル化分子が生物学的半減期を上昇させる背後にあるメカニズムは
、レクチンによるそれらの認識の低下にあると考えられる(Drickamer,198
8,J.Biol.Chem.263:9557−9560)。しかし一般に真菌細胞は
末端シアル酸残基をペプチド上のグリカンに加えず、故に真菌細胞で合成されたペプチド
はシアル酸が除かれている。本発明に従い、この欠如は本明細書のいたるところに詳細に
記載する本発明のインビトログリカン改造方法を使用して補修する(remedied)
ことができる。
ma)種には、QM6a、ALKO2442またはCBS383.78(セントラールビ
ュロー、フォーア シンメルカルチャー(Centraalbureau voor S
chimmelcultures)、オースターストラート 1、私書箱273、374
0 バールン社(AG Baarn)、オランダ)、またはATCC13631(アメリ
カンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニア州、10852、米国、型
)のようなT.レーゼイ(reesei);T.ビリデ(viride)(CBS189
.79のような(det.W.Gams);CBS816.68のようなT.ロンギブラ
キアタム(longibrachiatum)(型);T.シュードコニンギー(pse
udokoningii)(MUCL19358のような;Mycotheque de
l'Universite Catholique de Louvain);T.サ
チュルニスポラム(saturnisporum)CBS330.70(型);T.ハル
ジアナム(harzianum) CBS316.31(det.W.Gams);T.
ビルガタム(virgatum)(T.シュードコニンギー(pseudokoning
ii))ATCC24961を含む。最も好ましくは宿主はT.レーゼイ(reesei
)であり、そしてより好ましくはこれはT.レーゼイ(reesei)のQM9414(
ATCC26921)、RUT−C−30(ATCC56765)およびQM9414に
由来するVTT−D−79125株のような高度に生産的な突然変異体(Nevalai
nen、テクニカル リサーチ センター オブ フィンランド(Technical
Research Centre of Finland)公報26、(1985)、エ
スポー、フィンランド)である。
4234号明細書、Harkki(1989,Bio/Technology 7:59
6−601)およびUusitalo(1991,J.Biotech.17:35−5
0)に教示されている技術を含め当該技術分野で既知の技術を使用して行う。トリコデル
マ(Trichoderma)の培養は、工業的規模の発酵技術でのこれまでの豊富な経
験により支持されている;例えばFinkelstein,1992,糸状菌のバイオテ
クノロジー:技術および産物(Biotechnology of Filamento
us Fungi:Technology and Products)、バターワース
−ヘイネマン出版、ストーンハム、マサチューセッツ州を参照にされたい。
5.クルイベロミセス(Kluyveromyces)
クルイベロミセス(Kluyveromyces)属に属する酵母は、組換えペプチド
の生産に宿主微生物として使用されてきた。この属の酵母により生産されるペプチドは特
にキモシン(欧州特許第96430号明細書)、タウマチン(欧州特許第96910号明
細書)、アルブミン、インターロイキン−1β、TPA、TPA、TIMP(欧州特許第
361991号明細書)および治療的機能を有するアルブミン誘導体(欧州特許第413
622号明細書)である。クルイベロミセス(Kluyveromyces)属の中で特
に興味深い種にはK.ラクティス(lactis)を含む。
当該技術分野で周知である。クルイベロミセス(Kluyveromyces)でのヒト
組換えペプチドの発現および分泌のためのベクターは、組換えペプチドの形質転換および
発現のための生産体として当該技術分野(Yeh,J.Cell.Biochem.Su
ppl.14C:68,Abst.H402;Fleer,1990,Yeast6(特
集):S449)で既知である(Ito et al.,1983,J.Bacteri
ol.153:163−168;van den Berg,1990,Bio/Tec
hnology 8:135−139;米国特許第5,633,146号明細書、国際公
開第8304050A1号パンフレット、欧州特許第0096910号、同第02414
35号、同第0301670号、同第0361991号明細書、すべて引用により全部、
本明細書に編入する)。遺伝子ターゲッティングおよびプラスミドシャフルによるクルイ
ベロミセス ラクティス(Kluyveromyces lactis)の線状DNAプ
ラスミドの遺伝子操作の総説に関しては、Schaffrath et al.(199
9,FEMS Microbiol Lett.178(2):201−210)を参照
にされたい。
6.クリソポリウム(Chrysoporium)
真菌の属であるクリソポリウム(Chrysoporium)は最近、外来組換えペプ
チドの発現に使用された。外来ペプチドを発現するために当業者がクリソポリウム(Ch
rysoporium)を使用することができる手順の記載は、国際公開第00/205
55号明細書に見いだされる(これは引用により全部、本明細書に編入する)。発現系に
特に適する種は限定するわけではないが、C.ボトリオイデス(botryoides)
、C.カルミカエリー(carmichaelii)、C.クラッシツニカタム(cra
ssitunicatum)、C.ヨーローパ(europae)、C.エボルセアンヌ
イ(evolceannui)、F.ファスチジウム(fastidium)、C.フィ
リホルメ(filiforme)、C.ゲロギエ(gerogiae)、C.グロビフェ
ラム(globiferum)、C.グロビフェラム 変種 アーチクラタム(glob
iferum var.articulatum)、C.グロビフェラム 変種 ニベウ
ム(globiferum var.niveum)、C.ヒルンド(hirundo)
、C.ヒスパニカム(hispanicum)、C.ホルミー(holmii)、C.イ
ンジカム(indicum)、C.イノプス(inops)、C.ケラチノフィラム(k
eratinophilum)、C.クレイセリー(kreiselii)、C.クズロ
ビアナム(kuzurovianum)、C.リグノラム(lignorum)、C.ロ
バタム(lobatum)、C.ラックノヴェンセ(lucknowense)、C.ラ
ックノヴェンセ(lucknowense)Garg27K、C.メディウム(medi
um)、C.メディウム 変種 スピッセスセンス(medium var.spiss
escens)、C.メフィチカム(mephiticum)、C.メルダリウム(me
rdarium)、C.メルダリウム 変種 ロゼウム(merdarium var.
roseum)、C.マイナー(minor)、C.パンニコーラ(pannicola
)、C.パルバム(parvum)、C.パルバム 変種 クレセンス(parvum
var.crescens)、C.ピロサム(pilosum)、C.ペオドメルデリウ
ム(peodomerderium)、C.ピリホルミス(pyriformis)、C
.クィーンズランディカム(queenslandicum)、C.シグレリ(sigl
eri)、C.スルフレウム(sulfureum)、C.シンクロナム(synchr
onum)、C.トロピカム(tropicum)、C.ウンダラタム(undulat
um)、C.バレレナレンス(vallenarense)、C.ベスペルチリウム(v
espertilium)およびC.ゾナタム(zonatum)を含む。
7.その他
シュワニオマイセス(Schwanniomyces)を形質転換する方法は欧州特許
第394538号明細書に開示されている。アクレモニウム クリソゲナム(Acrem
onium chrysogenum)を形質転換する方法は、米国特許第5,162,
228号明細書に開示されている。ニューロスポーラ(Neurospora)を形質転
換する方法は、米国特許第4,486,533号明細書に開示されている。またシゾサッ
カロミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)に特異的
な発現系も知られている(欧州特許第385391号明細書)。分裂酵母シゾサッカロミ
セス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)でペプチドを発
現させるための一般的方法は、Giga−Hama and Kumagai(1997
、分裂酵母:シゾサッカロミセス ポンベでの外来遺伝子発現(Foreign gen
e expression in fission yeast:Schizosacc
haromyces pombe)、スプリンガー、ベルリン)に見いだすことができる
。
C.哺乳動物系
上記のように、哺乳動物細胞は典型的にはトリマンノシルコアに結合したさらなる糖の
数および配列について変動するN−グリカン構造のヘテロロガスな混合物を生産する。典
型的には哺乳動物細胞は図4右側に示すような複雑なグリカン構造を有するペプチドを生
産する。本発明の方法を使用して、最初に1次グリカン構造を同定し、次にグリカン構造
を改造するためにはどの糖が除去されるなけれければならないかを決定することにより、
哺乳動物細胞で生産されたペプチドをインビトロで改造して、所望のグリコシル化を有す
るペプチドを生成することができる。本明細書で検討するように、除去される糖によりど
の開裂酵素が使用されるかが決定され、すなわ改造方法の正確な工程は最初の基質として
使用される1次グリカン構造に依存して変動するだろう。哺乳動物細胞で一般に生産され
るグリカン構造を改造するための実例スキームは図3に示す。哺乳動物細胞でのN−グリ
カン生合成経路は十分に特徴付けられた(Moremen,1994,Glycobio
logy4:113−125を参照にされたい)。グリカン合成に必要な酵素の多くが同
定され、そしてチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系Lec23(アルファ−グ
ルコシダーゼI欠損)およびLec18(新規GlcNAc−TVIII)を含め、この
酵素的経路を欠く突然変異体細胞系が単離された。これらの突然変異体細胞により生産さ
れるペプチドのグリコシル化パターンは、正常CHO細胞に対して改変されている。本明
細書で検討するように、これらおよび他の突然変異体細胞におけるグリコシル化の欠損は
、複雑なグリカン構造を欠くペプチドを生産する目的に活かすことができる。例えばLe
c23細胞により生産されたペプチドはシアル酸残基を欠き、すなわち基本的なトリマン
ノシルコアまたはMan3GlcNac4にグリカン構造を減少させるために必要な酵素
的操作が少ない。このようにこれらの細胞で生産されるペプチドはグリカン改造用の好適
な基質として役立つ。当業者は既知の方法、例えばStanley et al.,19
90,Somatic Cell Mol.Genet.,16:211−223に記載
されている方法に基づき、他のグリコシル化−欠損細胞系を単離し、そして同定すること
ができる。同定された、または未だ同定されていないグリコシル化−欠損細胞系の使用は
、本明細書に記載する改造方法のための好適なペプチド基質を生成する目的で本発明に含
まれる。
て当該技術分野では周知である。現在、多くの哺乳動物発現ベクターがとりわけノバジェ
ン(Novagen)社(マジソン、ウィスコンシン州)、ジーンセラピーシステム(G
ene Therapy System)(サンディエゴ、カリフォルニア州)、プロメ
ガ(Promega)(マジソン、ウィスコンシン州)、クローンテック(ClonTe
ch)社(パロ アルト、カリフォルニア州)およびストラタジーン(Stratage
ne)(ラ ジョラ、カリフォルニア)を含む会社から市販されている。
物細胞系は不死化した哺乳動物から抽出した腫瘍細胞(すなわちそれらは培養中、本質的
に無限に複製できる)に由来する。これらの細胞系には限定するわけではないがCHO(
チャイニーズハムスター卵巣、例えばCHO−K1;ATCC No.CCL61)およ
びそれらの変異体、NS0(マウス 骨髄腫)、BNK、BNK570(ATCC No
.CRL10314)、BHK(ATCC No.CRL1632)、Per.C6(商
標)(不死化ヒト細胞、Crucell N.V.,ライデン、オランダ)、COS−1
(ATCC No.CRL1650)、COS−7(ATCC No.CRL1651)
、HEK293、マウスL細胞、Tリンパ球細胞系、BW5147細胞およびMDCK(
Madin−Darby イヌ腎臓)、HeLa(ヒト)、A549(ヒト肺癌腫)、2
93(ATCC No.CRL1573;Graham et al.,1977,Ge
n.Virol.36:59−72)、BGMK(バッファローグリーンモンキーの腎臓
)、Hep−2(ヒト類表皮咽頭癌腫)、LLC−MK2(アフリカグリーンモンキーの
腎臓)、McCoy、NCI−H292(ヒト肺粘膜類表皮癌腫管)、RD(横紋筋肉腫
)、Vero(アフリカグリーンモンキーの腎臓)、HEL(ヒト胚性肺)、ヒト胎児L
ung−Chang、MRC5(ヒト胚性肺)、MRHF(ヒト包皮)、およびWI−3
8(ヒト胚性肺)を含む。幾つかの場合では、治療用ペプチドが発現される細胞は処置す
る患者のものでよく、あるいはそれらは別の関連または非関連哺乳動物に由来するもので
もよい。例えば繊維芽細胞は哺乳動物の皮膚組織から単離し、そして培養し、そしてイン
ビトロで形質転換させることができる。この技術はトランスカリオティック セラピー(
Transkaryotic Therapies)社(ケンブリッジ、マサチューセッ
ツ州)から市販されている。ほとんどすべての現在使用されている細胞系はアメリカンタ
イプカルチャーコレクション(ATCC、マナッサス、バージニア州)およびバイオウィ
ッタカー(BioWhittaker)(ウォーカーズヴィル、メリーランド州)から入
手可能である。
形質転換させることができる。そのような技術には限定するわけではないが、とりわけリ
ン酸カルシウム形質転換(Chen and Okayama, 1988; Graham and van der Eb, 1973; Cors
aro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603), ジエチルアミノエチル (DEAE)
-デキストラン トランスフェクション (Fujita et al., 1986; Lopata et al., 1984; S
elden et al., 1986,), 電気窄孔 (Neumann et al., 1982,; Potter, 1988,;Potter et a
l., 1984,; Wong and Neuman, 1982), カチオン性脂質試薬のトランスフェクション (Elr
oy-Stein and Moss, 1990; Feigner et al., 1987; Rose et al., 1991; Whitt et al.,
1990; Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15:73; Ciccarone et al., 1993, Focus 15:
80), レトロウイルス (Cepko et al., 1984; Miller and Baltimore, 1986; Pear et al.
, 1993; Austin and Cepko, 1990; Bodine et al., 1991; Fekete and Cepko, 1993; Lem
ischka et al., 1986; Turner et al., 1990; Williams et al., 1984; Miller and Rosm
an, 1989, BioTechniques 7:980-90; Wang and Finer , 1996, Nature Med. 2:714-6),
ポリブレン (Chaney et al, 1986; Kawai and Nishizawa, 1984), マイクロインジェクシ
ョン (Capecchi, 1980), およびプロトプラスト融合 (Rassoulzadegan et al., 1982; Sa
ndri-Goldin et al., 1981; Schaffer, 1980)を含む。一般に形質転換技術に関しては、
Sambrook et al.(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラト
リーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク)およびAu
subel et al.(2002、分子生物学の現在のプロトコール、ジョン ウィ
リー&サンズ、ニューヨーク)を参照にされたい。
定な形質転換に適合させられた(総説に関しては、Koat and Condreay
,2002,Trends Biotechnol.20:173−180、およびそこ
に引用されている参考文献を参照にされたい)。培養した哺乳動物細胞中の組換えペプチ
ドの生産が、例えば米国特許第4,713,339号、同;第4,784,950号;同
第4,579,821号;および同第4,656,134号明細書に開示されている。セ
ルトレンド(Cell Trends)(ミドルタウン、メリーランド州)を含む数社が
、哺乳動物細胞の形質転換および培養のサービスを提供している。哺乳動物細胞を培養す
る技術は当該技術分野で周知であり、そしてさらにHauser et al.(199
7,哺乳動物細胞のバイオテクノロジー(Mammalian Cell Biotec
hnology)、ウォルター デ グルイャー(Walter de Gruyer)
社、ホーソーン、ニューヨーク州)、およびSambrook et al.(2001
、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバ
ーおよびそこに引用されている参考文献)に見いだされる。
D.昆虫
昆虫細胞、そして特に培養した昆虫細胞は、シアリル化されることが稀で、そして通常
は結合したさらなるフコース残基を持つかまたは持たないかもしれないマンノース残基を
含んでなるN−結合グリカン構造を有するペプチドを発現する。培養した昆虫細胞で生産
されるペプチド上に存在するグリカン構造の型の例は、図7およびそれらのマンノースグ
リカンに示す。
よく樹立されるようになった(Altmann et al.,1999,Glycoc
onjugate J.16:109−123)。ペプチドのホールディングおよび翻訳
後プロセッシングに関して、昆虫細胞は唯一、哺乳動物細胞に次ぐ。しかし上記のように
昆虫細胞中でのペプチドのN−グリコシル化は、多くの観点で哺乳動物細胞でのN−グリ
コシル化とは異なり、特に昆虫細胞は3個だけ、または時にわずか2個のマンノース残基
を含むオリゴ糖を含んでなる短縮化されたグリカン構造を頻繁に生成する点で異なる。こ
れらの構造はさらにフコース残基で置換されているかもしれない。
残基を適切なフコシダーゼ酵素を使用して除去することにより、インビトロで改造されて
所望のグリコシル化を持つペプチドを生成することができる。ペプチドがフコース残基の
除去後に基本的なトリマンノシルコア構造を含んでなる場合、所望のグリコシル化を有す
るペプチドを生成するために必要なすべてのことは、適切な糖をトリマンノシルコア構造
にインビトロで付加することである。ペプチドがフコース残基の除去後のグリカン構造に
2個のマンノース残基のみを含む場合、第3のマンノース残基をマンノシルトランスフェ
ラーゼ酵素およびGDP−マンノースのような適切な供与体分子を使用して加え、そして
その後に適切な残基を加えて所望するグリコシル化を有するペプチドを生成する。
には周知である。昆虫細胞中でペプチドを発現させるためのバキュロウイルス系の使用に
対する手順を提供する数冊の本が出版された。これらの本には限定するわけではないが、
Richardson(バキュロウイルス発現プロトコール(Baculovirus
Expression Protocols)、1998,Methods in Mo
lecular Biology、39巻、ヒュマナ出版)、O'Reilly et
al.(1994、バキュロウイルス発現ベクター:ア ラボラトリーマニュアル(Ba
culovirus Expression Vector:A Laboratory
Manual)、オックスフォード大学出版)、およびKing and Posse
e(1992、バキュロウイルス発現系:ア ラボラトリーガイド(Baculovir
us Expression System:A Laboratory Guide)
、チャップマン&ホール(Chapman&Hall))を含む。さらにLucklow
(1993,Curr.Opin.Biotechnol.4:564−572)および
Miller(1993,Curr.Opin.Genet.Dev.3:97−101
)のような報告もある。
らの特許には限定するわけではないが、米国特許第6,210,966号明細書(グルタ
ミンを欠き、そしてアンモニウム塩を含む昆虫細胞に関する培養基)、米国特許第6,0
90,584号明細書(組換えペプチドを生産するためのBVACs(バキュロウイルス
人工染色体)の使用)、米国特許第5,871,986号明細書(哺乳動物細胞中で組換
え核酸を発現させるためのバキュロウイルスの使用)、米国特許第5,759,809号
明細書(昆虫細胞中でのペプチドの発現法および昆虫を殺す方法)、米国特許第5,75
3,220号明細書(システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルス、その生産法
、およびそれを使用することによる経済的なペプチドの生産法)、米国特許第5,750
,383号明細書(バキュロウイルスクローニングシステム)、米国特許第5,731,
182号明細書(哺乳動物細胞中で組換え核酸を発現させるための非−哺乳動物DNAウ
イルス)、米国特許第5,728,580号明細書(昆虫細胞系で単一細胞懸濁液を誘導
する方法および培養基)、米国特許第5,583,023号明細書(修飾されたバキュロ
ウイルス、その調製法および遺伝子発現ベクターとしてのその応用)、米国特許第5,5
71,709号明細書(修飾されたバキュロウイルスおよびバキュロウイルス発現ベクタ
ー)、米国特許第5,521,299号明細書(バキュロウイルス感染を検出するための
オリゴヌクレオチド)、米国特許第5,516,657号明細書(分泌および膜−結合ペ
プチドを発現させるためのバキュロウイルスベクター)、米国特許第5,475,090
号明細書(宿主昆虫のウイルス感染を強化するペプチドをコードする遺伝子)、米国特許
第5,472,858号明細書(昆虫の幼虫での組換えペプチドの生産)、米国特許第5
,348,886号明細書(細菌での組換え真核ウイルスの生産法)、米国特許第5,3
22,774号明細書(組換えバキュロウイルス発現系での原核リーダー配列)、米国特
許第5,278,050号明細書(昆虫系での組換え遺伝子のプロセッシングおよび分泌
の効率を改善するための方法)、米国特許第5,244,805号明細書(バキュロウイ
ルス発現ベクター)、米国特許第5,229,293号明細書(組換えバキュロウイルス
)、米国特許第5,194,376号明細書(組換えペプチドを高レベルで生産すること
ができるバキュロウイルス発現系)、米国特許第5,179,007号明細書(組換えペ
プチド精製のための方法およびベクター)、米国特許第5,169,784号明細書(バ
キュロウイルス二重プロモーター発現ベクター)、米国特許第5,162,222号明細
書(安定に形質転換された昆虫細胞または組換えバキュロウイルスでの組換え核酸の発現
のためのバキュロウイルス初期プロモーターの使用)、米国特許第5,155,037号
明細書(昆虫系での組換え核酸のプロセッシングおよび分泌の効率を改善するために有用
な昆虫シグナル配列)、米国特許第5,147,788号明細書(バキュロウイルスベク
ターおよび使用法)、米国特許第5,110,729号明細書(培養した細胞中でバキュ
ロウイルスベクターを使用してペプチドを生産する方法)、米国特許第5,077,21
4号明細書(安定に形質転換された昆虫細胞で組換え遺伝子を発現するためのバキュロウ
イルス初期プロモーターの使用)、米国特許第5,023,328号明細書(鱗翅目AK
Hシグナル配列)および米国特許第4,879,236号および同第4,745,051
明細書(組換えバキュロウイルス発現ベクターを生産する方法)を含む。前述のすべての
特許は引用により全部、本明細書に編入する。
系は当業者には周知である。問題の昆虫細胞系は限定するわけではないが、中でも一般に
双翅目および鱗翅目の昆虫細胞、Sf9およびそれらの変異体(ヤガ(Spodopte
ra frugiperda)、アメリカヒトリガ(Estigmene acrea)
、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、カイコガ(Bombyx
mori)、マラコソマ ジシットリ(Malacosoma disstri)、キイ
ロショウジョウバエ属のKc1およびSL2系および蚊を含む。
E.植物
ペプチド生産体としての植物細胞は、別口の話題を提示する。植物により生産されるN
−結合グリカンはトリマンノシルコア構造を含んでなり、この五糖骨格は図6に示すよう
に数個の異なるさらなる糖を含んでなることができる。例えば例として、トリマンノシル
コア構造はβ1,2結合キシロース残基およびα1,3結合フコース残基に置き換えられ
る。さらに植物細胞はMan5GlcNAc2構造も生産することができる。植物細胞中
で生産されたペプチドはしばしば、グリカン構造上のコアα1,3フコースおよびキシロ
ースの存在の結果として高度に抗原性であり、そして末端シアル酸残基の不存在から哺乳
動物に導入された時、血流から迅速に排除される。したがってこれらのペプチドは本明細
書で提供する方法を使用して改造されない限り、それらは一般には哺乳動物の治療薬とし
ては適さないと考えられる。植物細胞中で発現した幾つかのモノクローナル抗体がマウス
で非−免疫原性であることが判明したが、これはグリカン鎖がこれらの抗体中のFc領域
に埋め込まれたので免疫原性ではなかったらしい(Chargelegue et al
.,2000,Transgenic Res.9(3):187−194)。
可能であり、ここでペプチド上に存在する増加した数のグリカン構造が基本的なトリマン
ノシルコア構造またはMan3GlcNAc4構造を含んでなる。これはフコシダーゼを
含む適切なグリコシダーゼの組み合わせを使用して、基本的なトリマンノシルコア構造ま
たはMan3GlcNAc4構造に到達するまでインビトロでさらなる糖を開裂すること
により達成される。これらの開裂反応には、哺乳動物に導入した時に最終的なペプチドの
抗原性を縮小させるために、構造からフコースまたはキシロース残基の除去も含むべきで
ある。フコースおよびキシロース残基をトリマンノシルコア構造に付加することを阻害す
る突然変異を有する植物細胞は、当該技術分野では知られている(von Schaew
en et al.,1993,Plant Physiology 102:1109
−1118)。フコースおよびキシロースを欠いたグリカンを有するペプチドを生産する
ためのこれらの細胞の使用は本発明の意図するところである。基本的なトリマンノシルコ
アまたはMan3GlcNAc4構造の生産で、さらなる糖がそれらに結合されて、哺乳
動物での治療薬的使用に適する所望のグリコシル化を有するペプチドに達することができ
る。
えている。潜在的に植物は組換えペプチドのより廉価な供給源を提供することができる。
植物での組換えペプチドの生産コストは、同じペプチドを大腸菌(E.coli)で生産
するコストよりも10から50倍低くできると予想された。動物と較べて植物でのコドン
利用頻度にわずかな差異があるものの、これらは組換えDNA配列を調整することにより
相補できる(Kusnadi et al.,1997,Biotechnol.Bio
eng.56:473−484;Khoudi et al.,1999,Biotec
hnol.Bioeng.135−143;Hood et al.,1999,Adv
.Exp.Med.Biol.464:127−147を参照されたい)。さらにペプチ
ド合成、分泌および翻訳後修飾は植物のグリコシル化にわずかな差異があるだけで、植物
と動物で大変似ている(Fischer et al.,2000,J.Biol.Re
gul.Homest.Agents 14:83−92を参照にされたい)。次いでト
ランスジェニック植物からの産物は動物病原体、微生物トキシンおよび発癌性配列の混入
も少ないと思われる。
ック植物に加えて、ペプチドはトランスジェニック植物細胞培養(Lee et al.
,1997,Mol.Cell.7:783−787)、および組換え植物ウイルスを接
種した非−トランスジェニック植物でも生産され得る。植物細胞の遺伝子形質転換に関す
るプロトコールを記載する数冊の本が出版された:Potrykus(1995、植物へ
の遺伝子転移(Gene transfer to plants)、スプリンガー、ニ
ューヨーク)、Nickoloff(1995、植物細胞の電気穿孔および電気融合プロ
トコール(Plant cell electroporation and elec
trofusion protocols)、ヒューマナ出版、トトワ、ニューヨーク)
およびDraper(1988、植物遺伝子形質転換(Plant genetic t
ransformation)、オックスフォード出版、ボストン)。
法が使用されている。これらの方法は限定するわけではないがアグロバクテリウム(Ag
robacterium)形質転換(Bechtold and Pelletier, 1998; Escudero and Hohn
, 1997; Hansen and Chilton, 1999; Touraev et al., 1997), バイオリスティックス(
ミクロプロジェクティル(microprojectiles)) (Finer et al., 1999; Hansen and Chilt
on, 1999; Shilito, 1999), プロトプラストの電気窄孔 (Fromm et al., 1985, Ou-Lee e
t al., 1986; Rhodes et al., 1988; Saunders et al., 1989; Trick et al., 1997), ポ
リエチレン グリコール処理 (Shiltio, 1999; Trick et al., 1997), 植物内 マイクロ
インジェクション (Leduc et al., 1996; Zhou et al., 1983), 種子 インビビッション
(Trick et al., 1997), レーザー ビーム (1996), およびシリコン カーバイド ウイ
スカ (Thompson et al., 1995;米国特許出願第20020100077号明細書、引用
により全部、本明細書に編入する)を含む。
造方法で使用されるペプチドを発現するために特に興味深い植物には、限定するわけでは
ないが、Arabidopsis thalliana, ナタネ (Brassica spp.; Ruiz and Blumwald, 2002, P
lanta 214:965-969)), ダイズ (Glycine max), ヒマワリ (Helianthus unnuus), ギニア
アブラヤシ (Elaeis guineeis), アメリカホドイモ (ラッカセイ, Arachis hypogaea;
Deng et al., 2001, Cell. Res. 11:156-160), ココヤシ (Cocus nucifera), キャスター
(Ricinus communis), ベニバナ (Carthamus tinctorius), カラシナ (Brassica spp. an
d Sinapis alba), コリアンダー, (Coriandrum sativum), カボチャ (Cucurbita maxima;
Spencer and Snow, 2001, Heredity 86(Pt 6): 694-702), 亜麻子/亜麻 (Linum usitat
issimum; Lamblin et al., 2001, Physiol Plant 112:223-232), ブラジル ナッツ (Ber
tholletia excelsa), ホホバ (Simmondsia chinensis), トウモロコシ (Zea mays; Hood
et al., 1999, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147; Hood et al., 1997, Mol. Breed. 3
:291-306; Petolino et al., 2000, Transgenic Research 9:1-9), アルファルファ (Kho
udi et al., 1999, Biotechnol. Bioeng. 64:135-143), タバコ (Nicotiana tabacum; Wr
ight et al., Transgenic Res. 10:177-181; Frigerio et al., 2000, Plant Physiol. 1
23:1483-1493; Cramer et al., 1996, Ann. New York Acad. Sci. 792:62-8-71; Cabanes
-Macheteau et al., 1999, Glycobiology 9:365-372; Ruggiero et al., 2000, FEBS Let
t. 469:132-1 36), キャノーラ (Bai et al., 2001, Biotechnol. Prog. 17:168- 174; Z
hang et al., 2000, J. Anim. Sci. 78: 2868-2878)), ジャガイモ (Tacket et al., 199
8, J. Infect. Dis. 182:302-305; Richter et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18:1167-1
171; Chong et al., 2000, Transgenic Res. 9:71-78), アルファルファ (Wingdorovitz
et al., 1999, Virology 255:347-353), エンドウ (Pisum sativum; Perrin et al., 200
0, Mol. Breed. 6:345-352), コメ (Oryza sativa; Stoger et al., 2000, Plant Mol. B
iol. 42:583-590), ワタ (Gossypium hirsutum; Kornyeyev et al., 2001, Physiol Plan
t 113:323-331), オオムギ (Hordeum vulgare; Petersen et al., 2002, Plant Mol Biol
49:45-58); コムギ (Triticum spp.; Pellegrineschi et al., 2002, Genome 45:421-43
0) およびインゲン (Vicia spp.; Saalbach et al., 1994, Mol Gen Genet 242: 226-236
)を含む。
は最初にペプチドをコードするDNAで形質転換され、その後、植物を再生させる。これ
には典型的には各植物種に至適化された組織培養手順が関与する。植物を再生するプロト
コールはすでに多くの種について当該技術分野で周知である。さら他の種に関するプロト
コールは、日常的な実験を使用して当業者により開発され得る。植物の再生に関する手順
を記載する多数の研究用マニュアルが利用可能であり、それらには限定するわけではない
がSmith(2000、植物組織培養:技法および実験(Plant tissue
culture:techniques and experiments)、アカデミ
ック出版、サンディエゴ)、Bhojwani and Razdan(1996、植物
組織培養:理論および実践(Plant tissue culture:theory
and practice)、エルセビア サイエンス出版、アムステルダム)、Is
lam(1996、植物組織培養(Plant tissue culture)、オッ
クスフォード&IBH出版社、ニューデリー、インド)、Dodds and Robe
rts(1995、植物組織培養における実験(Experiments in pla
nt tissue culture)、ニューヨーク;ケンブリッジ大学出版、ケンブ
リッジ、イギリス)、Bhojwani(植物組織培養:応用および限界(Plant
tissue culture:applications and limitati
ons)、エルセビア、アムステルダム、1990)、Trigiano and Gr
ay(2000、植物組織培養の概念および実験実習(Plant tissue cu
lture concepts and laboratory exercises)
、CRC出版、ボカ ラトン、フロリダ州)およびLindsey(1991、植物組織
培養マニュアル:基礎および応用(Plant tissue culture man
ual:fundamentals and applications)、クルヴァー
アカデミック(Kluwer Academic)、ボストン)を含む。
にするために幾つかの系が開発された。1つの方法は合成されるペプチドを種子の内胚乳
に向け、ここからペプチドを容易に抽出することができる(Wright et al.
,2001,Transgenic Res.10:177−181,Guda et
al.,2000,Plant Cell Res.19:257−262;および米国
特許第5.767,379号明細書、これらは引用により全部、本明細書に編入する)。
別の取り組みは組換えペプチドと澱粉、粉または油のような従来の植物産物とを同時抽出
することである。油−種子のナタネでは、植物中で発現させた時にオレオシン−ヒュルデ
ィン(hurudin)の融合ペプチドは種子の油体に結合し、そして油と一緒に植物の
種子から抽出することができる(Parmenter,1995,Plant Mol.
Biol.29:1167−1180;米国特許第5,650,554号、同第5,79
2,922号、同第5,948,682号および同第6,288,304号明細書、なら
びに米国特許出願第2002/0037303号明細書、これらすべてが引用により全部
、本明細書に編入される)。この取り組みに関する変更では、オレオシンを外因性の問題
の同時発現ペプチドに親和性を有するペプチドに融合させる(米国特許第5,856,4
52号明細書、引用により全部、本明細書に編入する)。
状況と同様、それに結合したグリカン構造を持たないペプチドを生じる。しかしそのよう
なペプチドの収量はこれらの植物細胞オルガネラで発現させた時に格段に大きく、すなわ
ちこの種の発現系は他の系に優る利点を有することができる。外因性ペプチドの高等植物
中のプラスチド発現に関する技術の一般的総説については、Hager and Bec
k(2000,Appl.Microbiol.Biotechnol.54:302−
310およびそれに引用されている文献)を参照にされたい。プラスチド発現はタバコ(
例えばStaub et al.,2000,Nat.Biotechnol.18:3
33−338を参照にされたい)で特に成功した。
F.トランスジェニック動物
動物(例えば哺乳動物)の受精卵への組換えDNAの導入は、トランスジェニック動物
技術で標準的な多数の技術を使用して行うことができる。例えばHogan et al
.,マウス胚の操作;ア ラボラトリーマニュアル(Manipulating the
Mouse Embryo:A Laboratory Manual)、コールドス
プリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、1
986;および米国特許第5,811,634号明細書(これは引用により全部、本明細
書に編入する)を参照にされたい。最も普通には組換えDNAは前核マイクロインジェク
ションにより胚に導入されるGordon et al., 1980, PNAS 77: 7380-7384; Gordon and Ru
ddle, 1981, Science 214:1244-1246; Brinster et al., 1981, Cell 27:223-231; Costa
ntini and Lacy, 1981, Nature 294:92-94)。マイクロインジェクションは広範な様々な
種に応用可能な利点を有する。着床前の胚もレトロウイルスで形質転換することができる
(Jaenisch and Mintz, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 71:1250-1254; Jaenisc
h et al., 1976, Hamatol Bluttransfus. 19:341-356; Stuhlmann et al., 1984, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:7151-7155)。レトロウイルスが媒介する形質転換は1コピ
ーの組換え核酸を細胞へ加える利点があるが、高度なモザイク現象を生じる。最も最近で
は、胚性幹細胞が媒介する技法が使用され(Gossler et al.,1986,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,83:9065−9069)、全染
色体セグメントの転移(Lavitrano et al.,1989,Cell 57
:717−723)およびインビトロ受精と組み合わせた配偶子トランスフェクション(
Lavitrano et al.,1989,Cell 57:717−723)も使
用された。これらの技法を開示した研究手順に関する数冊の本が出版された:Cid−A
rregui and Garcia−Caaranca(1998,マイクロインジェ
クションおよびトランスジェネシス:方法およびプロトコール(Microinject
ion and Transgenesis:Strategies and Prot
ocols)、スプリンガー、ベルリン)、Clarke(2002、トランスジェネシ
ス技法:原理およびプロトコール(Transgenesis Techniques:
Principles and Protocols)、ヒューマナ出版、トトワ、ニュ
ージャージー州)およびPinkert(1994、トランスジェニック動物技法:ア
ラボラトリーハンドブック(Transgenic Animal Technolog
y:A Laboratory Handbook)、アカデミック出版、サンディエゴ
)。
て次いで卵を得た同じ種の偽妊娠動物に移す(Hogan et al.,同上)。哺乳
動物の場合、1回の実験あたり典型的には125個の卵を注入し、そのおよそ3分の2が
この手順で生き残る。20個の生きている卵を偽妊娠哺乳動物に移し、その4〜10個が
生きている子孫に生育する。典型的には10〜30%の子孫(マウスの場合)が組換えD
NAを持つ。
外因性ペプチドは動物の産物中に蓄積し、そこから動物を傷つけずに回収できる。好適な
態様では、外因性ペプチドは乳、卵、毛髪、血液および尿に蓄積する。
畜および酪農動物である。特に好適な動物はヤギ、ヒツジ、ラクダ、雌ウシ、ブタ、ウマ
、牡ウシおよびラマである。乳の中に組換えペプチドを蓄積するトランスジェニック雌ウ
シを作出する方法は周知である:Newton(1999,J.Immunol.Met
hods231:159−167)、Ebert et al.(1991,Biote
chnology 9:835−838)および米国特許第6,210,736号、同第
5,849,992号、同第5,843,705号、同第5,827,690号、同第6
,222,094号明細書(これらすべては引用により全部、本明細書に編入する)を参
照にされたい。所望する組換えペプチドを生産するトランスジェニック哺乳動物の子孫(
generation)は、マサチューセッツ州、フラミンガムのGTCバイオセラピュ
ーティックス(Biotherapeutics)から販売されている。
、アヒルおよび七面鳥を含む。他の興味深い動物には限定するわけではないが、鳥類の他
の種、魚、爬虫類および両生類を含む。レトロウイルス形質転換による組換えDNAのニ
ワトリへの導入は、当該技術分野では周知である:Thoraval et al. (1995, Transgenic
Research 4:369-376), Bosselman et al., (1989, Science 243: 533-535), Petropoulos
et al. (1992, J. Virol. 66: 3391-3397)、米国特許第5,162,215号明細書(
引用により全部、本明細書に編入する)。組換えDNAを用いたニワトリの成功裏の形質
転換も達成され、ここでDNAは胚盤葉細胞に導入され、そしてそのようにしてトランス
フェクトされた胚盤葉細胞が胚に導入された:Brazolot et al. (1991, Mol. Reprod. De
v. 30:304-312), Fraser, et al. (1993, Int. J. Dev. Biol. 37:381-385), and Petitt
e et al. (1990, Development 108: 185-189)。トランスジェニックニワトリが所望のペ
プチドを発現するかどうかを評価するために、高処理技法が開発された(Harvey
et al.,2002,Poult.Sci.81:202−212、米国特許第6,
423,488号明細書、引用により全部、本明細書に編入する)。組換えDNAを用い
たニワトリのレトロウイルス形質転換を使用して、外因性ベータ−ラクタマーゼがニワト
リの卵白中に蓄積した(Harvey et al.,2002,Nat.Biotec
hol.20(4):396−399)。ニワトリが生産する卵中の外因性ペプチドの生
産物は、ジョージア州、アテネのアビジェニックス(AviGenics)から販売され
ている。
G.細菌
細菌で組換え的に発現したペプチドは一般にグリコシル化されていない。しかしペプチ
ドをグリコシル化することができる細菌系は明らかになりつつあり、したがって将来はグ
リコシル化された組換えペプチドを細菌で生産することができるかもしれない。
はないが大腸菌(E.coli)およびバチルス(Bacillus)種を含む。
腸菌(E.coli)に基づく発現系に関するプロトコールは、とりわけ米国特許出願第
20020064835号明細書、米国特許第6,245,539号、同第5,606,
031号、同第5,420,027号、同第5,151,511号明細書およびRE33
,653号明細書に見いだされる。細菌を形質転換するための方法には限定するわけでは
ないが、塩化カルシウム(Cohen et al.,1972,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA.,69:2110−2114;Hanahan,1983,
J.Mol.Biol.166:557−580;Mandel and Higa,1
970,J.Mol.Biol.53:159−162)および電気穿孔(Shigek
awa and Dower,1988,Biotechniques 6:742−7
51)、およびSambrook et al.,2001(同上)に記載されているも
のを含む。微生物の形質転換および発現系に関する実験室用のプロトコールの総説は、S
aunders and Saunders(1987、バイオテクノロジーに応用され
る微生物遺伝学:遺伝子転移および操作の原理および技法(Microbial Gen
etics Applied to Biotechnology:Principal
es and Techniques of Gene Transfer and M
anipulation)、クルーム ヘルム、ロンドン)、Puahler(1993
、微生物の遺伝子工学(Genetic Engineering of Microo
rganism)、ヴァインヘイム、ニューヨーク)、Lee et al.,(199
9、代謝工学(Metabolic Engineering)、マルセルデッカー、ニ
ューヨーク)、Adolph(1996、微生物のゲノム法(Microbial Ge
nome Methods)、CRC出版、ボカ ラトン)、およびBirren an
d Lai(1996、非哺乳動物ゲノム分析:実践的指針(Nonmammalian
Genomic Analysis:A Practical Guide)、アカデ
ミック出版、サンディエゴ)を参照にされたい。
、Balbas(2001,Mol.Biotechnol.19:251−267)を
参照にされたい。今では数社が大腸菌(E.coli)のRosetta(商標)株のよ
うな哺乳動物ペプチドの発現系のために選択された細菌株を提供している(ノバジェン社
、マジソン、ウィスコンシン州;細菌細胞で通常使用されていない真核コドンの強化され
た発現、および強化されたジスルフィド結合の形成を含む)。
H.細胞工学
本開示から、細胞により生産される出発原料が均一なほど、より効率的に所望のグリコ
シル化を有する大量のペプチドがインビトロで生成されることは明白である。すなわち本
明細書で開示するインビトロの酵素的反応の出発原料として、均一にグリコシル化された
ペプチドを生産するための宿主細胞の遺伝子工学は、ヘテロロガスな組のグリカン構造を
結合して有するペプチド出発原料を使用することよりも有意な利点を提供する。本発明で
使用するために好適な1つのペプチド出発原料は、基本的なトリマンノシルコア構造のみ
からなる1次グリカン分子を有するペプチドである。別の好適な出発原料はMan3Gl
cNAc4である。改造方法の後、好適なペプチドは所望のグリコシル化、すなわち改善
された臨床的効力を有する最大量のペプチドを生じるようになる。しかし他のグリカン出
発原料も、例えば高マンノースグリカンは一連のマンノシダーゼを使用してインビトロで
基本的なトリマンノシルコア構造に容易に減少されるので、本明細書に記載する方法での
使用に適する。本明細書のいたるところに記載するように、基本的なトリマンノシルコア
構造またはMan3GlcNAc4が生成されるようにすべての過剰な糖部分が開裂可能
であるならば、他のグリカン出発原料も使用することができる。このように本発明のペプ
チドを生産するために、遺伝的に工作した細胞を使用する目的は、出来る限り均一なグリ
カン構造を結合して有するペプチドを生成することであり、ここでグリカン構造はインビ
トロで改造されて所望のグリコシル化を有するペプチドを生成することができる。これに
よりこのようなペプチドの生産コストに劇的な減少をもたらす。この方法を使用して生産
された糖ペプチドは、大部分が同じN−結合グリカン構造を有するので、生産後修飾プロ
トコールはバッチ毎の一貫性がより高い最終産物を生成するために標準化し、そして至適
化することができる。結果として、最終的に完成された−鎖(chain)生成物は、現
在入手可能なものよりも異質性が低くなり得る。この生成物は従来技術の生成物よりも改
善された生物学的半減期および生物学活性を有する。あるいは所望により本発明は、例え
ば異なる糖部分の付加をもたらす反応条件を選択することにより、限定され、そして特異
的な異質性を導入するために使用することができる。
ルコア構造またはMan3GlcNAc4からなるグリカン構造を有するペプチドを生産
する細胞である。最少限、遺伝的に工作された細胞により生産されるこれらの好適な構造
の比率は、改造プロトコールの後に望ましいグリコシル化を有するペプチドを生じるため
に十分でなければならない。
リマンノシルコア糖ペプチドまたはMan3GlcNAc4糖ペプチドの生産をもたらす
酵素活性の適切な付加/削除を同定するために、最初に微生物により生産される内因性お
よび組換え糖ペプチドの両方のグリコシル化パターンを決定する。これは典型的にはグリ
コシルトランスフェラーゼ反応の基質としてトリマンノシル糖ペプチドを使用する酵素活
性の削除、およびより短い鎖を生成するためにより複雑なN−結合グリカンを分解する酵
素活性の挿入を伴う。さらに遺伝的に工作された細胞は高マンノースグリカンを生成する
ことができ、これはマンノシダーゼにより開裂されて所望の出発グリカン構造を生成する
ことができる。マンノシダーゼは細胞中、インビボで活性であることができ(すなわち、
細胞はそれらを生産するように遺伝的に工作することができる)、あるいはそれらは生産
後の反応にインビトロで使用することができる。
主細胞に関する技法は周知である。例えばAltmann et al. (1999, Glycoconjugate J. 16
:109-123), Ailor et al. (2000, Glycobiology 10(8): 837-847), Jarvis et al., (In
vitrogen Conference, March, 1999, abstract), Hollister and Jarvis, (2001, Glycob
iology 11(1): 1-9), and Palacpac et al., (1999, PNAS USA 96: 4697), Jarvis et al
., (1998. Curr. Opin. Biotechnol. 9:528-533), Gerngross(米国特許出願20020
137134第号明細書)を参照にされたい、これらすべてが昆虫または植物細胞をグリ
コシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクションすることにより、昆虫または植
物発現系を「哺乳動物化する(mammalianize)」ための技術を開示する。
変する技法も存在する。大腸菌(E.coli)は、インビボでオリゴ糖を生産するよう
に、細菌である髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)およびアゾ
リゾビウム(Azorhizobium)に由来する種々のグリコシルトランスフェラー
ゼで工作された(Bettler et al.,1999,Glycoconj.J.
16:205−212)。髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)
のβ1,3NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼlgtA遺伝子を過剰に発現す
るように遺伝的に工作された大腸菌(E.coli)は、外因性ラクトースを効率的にグ
リコシル化する(Priem et al.,2002,Glycobiology 1
2:235−240)。
oshida et al.,1999,Glycobiology,9(1);53−
58;Kalsner et al.,1995,Glycoconj.J.12:36
0−370;Schwientek and Ernst,1994,Gene 145
(2):299−303;Chiba et al.,1995,Biochem J,
308:405−409)。
なトリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を有するように、糖ペプチド群
をグリコシル化する細胞を提供する。好ましくは細胞は基本的なトリマンノシルコアのみ
からなるグリカン構造を有するペプチドを生産する。最少限、基本的なトリマンノシルコ
アまたはMan3GlcNAc4構造を有するペプチドの比率は、改造方法後に所望のグ
リコシル化を有するペプチドを生じるために十分である。細胞は1以上のヘテロロガスな
核酸発現単位を導入され、その各々は1以上の問題のペプチドをコードする1以上の核酸
配列を含んでなることができる。問題の糖ペプチドの天然な形態は、1以上の複雑なN−
結合グリカンを含んでなることができ、あるいは単に高マンノースグリカンであり得る。
ウス、ラット、ウサギ、ハムスターのような哺乳動物細胞または他の型の哺乳動物細胞で
よい。細胞が哺乳動物細胞である時、哺乳動物細胞は非−ヒトトランスジェニック哺乳動
物に由来するか、またはその中に含まれ、ここで哺乳動物中の細胞は、所望の糖ペプチド
分子の生産に必要な所望の糖ペプチドおよび種々のグリコシル化およびグリコシダーゼ酵
素をコードする。加えて細胞は真菌細胞、好ましくは酵母細胞でよく、あるいは細胞は昆
虫または植物細胞でよい。同様に細胞が植物細胞である時、植物細胞はトランスジェニッ
ク植物に由来するか、またはその中に含まれ、ここで植物は所望の糖ペプチド分子の生産
に必要な所望の糖ペプチドおよび種々のグリコシル化およびグリコシダーゼ酵素をコード
する。
ゼ酵素および/または1以上のヘテロロガスなグリコシダーゼ酵素を発現する真核細胞で
よく、ここで宿主細胞中での組換え糖ペプチドの発現は、1次グリカン構造としてペプチ
ドに結合した基本的なトリマンノシルコアを有する組換え糖ペプチドの生産をもたらす。
素は、例えばTaniguchi et al.(2002,グリコシルトランスフェラ
ーゼおよび関連遺伝子のハンドブック、スプリンガー、ニューヨーク)で利用可能なグリ
コシルトランスフェラーゼのリストに含まれる既知のグリコシルトランスフェラーゼ酵素
からなる群から選択することができる。
ゼ2、マンノシダーゼ3および限定するわけではないが微生物のマンノシダーゼを含む他
のマンノシダーゼからなる群から選択することができる。本発明の方法に有用な酵素に関
するさらなる開示は、本明細書のいたるところに提供している。
ランスフェラーゼ酵素および/または1以上の内因性グリコシダーゼ酵素は、宿主細胞で
の組換え糖ペプチドの発現が1次グリカン構造として結合した基本的なトリマンノシルコ
アを有する組換え糖ペプチドの生産をもたらすように不活性化されている。
び/またはグリコシダーゼ酵素を発現することができると同時に、1以上の内因性グリコ
シルトランスフェラーゼ酵素および/またはグリコシダーゼ酵素が不活性化されている。
内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素および/またはグリコシダーゼ酵素は、限定す
るわけではないがアンチセンス技法および核酸を宿主細胞のゲノムに挿入することが関与
する技法を含む当業者に既知の技法を使用して不活性化することができる。幾つかの態様
では、内因性酵素はGnT−Iからなる群から選択することができ、マンノシダーゼ、キ
シロシルトランスフェラーゼ、コアα1,3フコシルトランスフェラーゼ、セリン/トレ
オニンO−マンノシルトランスフェラーゼ等の選択であることができる。
4型となるように、天然にペプチドをグリコシル化する発現系を利用することができる。
トリマンノシルコアを生産する細胞型の例は、Sf9細胞である。他のそのような発現系
は、天然にまたは組換え的に細胞で発現した糖ペプチドを分析し、所望のグリコシル化特
性を現す糖ペプチドを選択することにより同定することができる。本発明は、本発明のペ
プチドを生産するためにありとあらゆるそのような細胞を含むと解釈すべきである。
V.改造されたグリカンおよび/または複合糖質化ペプチドの精製
修飾された糖タンパク質が細胞内で生産され、または分泌される場合、第1工程として
特定の屑、宿主細胞、分解したフラグメントを、例えば遠心または超遠心により除去し;
場合によりタンパク質は市販されているタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮すること
ができ、続いてペプチド変異体はイムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換
カラム分画(例えばジエチルアミノエチル(DEAE)またはカルボキシメチルもしくは
スルホプロピル基を含むマトリックス)、Blue−Sepharose、CM Blu
e−Sepharose、MONO−Q、MONO−S、レンチルレクチン−Sepha
rose、WGA−Sepharose、ConA−Sepharose、Ether
Toyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopea
rlまたはプロテインA Sepharoseでのカラムクロマトグラフィー、SDS−
PAGE−クロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、
逆相HPLC(RP−HPLC)、ゲル濾過(例えばSephadex分子篩またはサイ
ズ−排除クロマトグラフィー)、ペプチドを選択的に結合するカラムでのクロマトグラフ
ィー、およびエタノール、pHまたは硫酸アンモニウム沈殿、膜濾過および種々の技法か
ら選択される1以上の工程により他の不純物から分離することができる。
の濃縮、塩析、水性イオン−交換またはサイズ−排除クロマトグラフィー工程により単離
される。さらに修飾糖タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより精製するこ
とができる。次いで最終精製工程にHPLCを使用することができる。
ルホニルフルオリド(PMSF)を前述の任意工程に含めることができ、そして偶発的な
混入物の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。
るタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン(Amicon)またはミリポアペリコン
(Millipore Pellicon)超遠心ユニットを使用して濃縮する。濃縮工
程後、濃縮物を適当な精製マトリックスに乗せる。例えば適当なアフィニティーマトリッ
クスは適当な支持体に結合したペプチド用のリガンド、レクチンまたは抗体分子を含んで
なることができる。あるいはアニオン−交換樹脂、例えばペンダントDEAE基を有する
マトリックスまたは支持体を使用することができる。適当なマトリックスにはアクリルア
ミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般的に使用され
ている他の種類のものを含む。あるいはカチオン−交換工程を使用してもよい。適当なカ
チオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んでなる種々の不溶性
マトリックスを含む。スルホプロピル基が特に好適である。
するシリカゲルを使用した1以上のRP−HPLC工程を使用してさらにペプチド変異体
組成物を精製することができる。前述の精製工程の幾つかまたは全ては、種々に組み合わ
せて使用して均一な修飾糖タンパク質を提供することもできる。
Chromatog.296:171(1984)により開示された方法に類似する方法
により精製することができる。この参考文献は調製用HPLCカラムで組換えヒトIL−
2を精製するために、2つの順次のRP−HPLC工程を記載する。あるいはアフィニテ
ィークロマトグラフィーのような技法を使用して修飾糖タンパク質を精製することができ
る。
VI.好適なペプチドおよび好適なペプチドをコードする核酸
本発明は種々のペプチドおよびタンパク質、および同様な分子またはそれらのフラグメ
ントをコードする単離された核酸を含む。そのようなペプチドには限定するわけではない
が、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、ヒトインターフェロンアルファ(IF
N−アルファ)、ヒトインターフェロンベータ(IFN−ベータ)、ヒト第VII因子(
第VII因子)、ヒト第IX因子(第IX因子)、ヒト濾胞刺激ホルモン(FSH)、ヒ
トエリトロポエチン(EPO)、ヒト顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−
CSF)、ヒトインターフェロンガンマ(IFN−ガンマ)、ヒト−アルファ−1プロテ
アーゼインヒビター(アルファ−1アンチトリプシンまたはアルファ−1−トリプシンイ
ンヒビター、A−1−P1としても知られている)、グルコセレブロシダーゼ、ヒト組織
型アクチベーター(TPA)、ヒトインターロイキン−2(IL−2)、ヒト第VIII
因子(第VIII因子)、ヒトIgG免疫グロブリンFc部分に融合した75kDa腫瘍
壊死因子レセプター(ENBREL(商標)またはETANERCEPT(商標)(キメ
ラTNFR)として商業的に知られている)、ヒトウロキナーゼ(ウロキナーゼ)、糖タ
ンパク質IIb/IIIaおよびビトロネクチンアルファvベータ3レセプターに特異的
に結合するヒト/マウスキメラモノクローナル抗体のFabフラグメント(REOPRO
(商標)またはABCIXIMAB(キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa)として
商業的に知られている)、ヒトHER2に特異的に結合するマウス/ヒトキメラモノクロ
ーナル抗体(HERCEPTIN(商標)(キメラ抗−HER2)として商業的に知られ
ている)、呼吸合胞体ウイルスのA抗原部位またはFタンパク質に特異的に結合するヒト
/マウスキメラ抗体(SYNAGIS(商標)またはPALIVIZUMAB(キメラ抗
−RSV)として商業的に知られている)、ヒトB−細胞上のCD20に特異的に結合す
るキメラヒト/マウスモノクローナル抗体(RITUXAN(商標)またはRITUXA
MAB(商標)(キメラ抗−CD20)として商業的に知られている)、ヒト組換えDN
ase(DNase)、ヒト腫瘍壊死因子に特異的に結合するキメラヒト/マウスモノク
ローナル抗体(REMICADE(商標)またはINFLIXIMAB(キメラ抗−TN
F)として商業的に知られている)、ヒトインスリン、B型肝炎ウイルスの表面抗原(a
dwサブタイプ;HBsAg)、およびヒト成長ホルモン(HGH)等を含む。
意の修飾された形態(ヌクレオチド配列が無細胞である時、または細胞に付随する時、ヌ
クレオチド配列をより安定にするDNAまたはRNAの化学的修飾を含む)をコードする
RNAまたはDNA配列を含むと解釈するべきである。非限定的な例として、少なくとも
1つのホスホロチオエート修飾を含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌク
レアーゼに対して強化された耐性を付与することが知られている。修飾オリゴヌクレオチ
ドの具体例には、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖
アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖
間(「骨格」)結合を含むものを含む。さらにモルホリノ骨格構造(米国特許第5,03
4,506号明細書)またはポリアミド骨格構造(Nielsen et al.,19
91,Science254:1497)を有するオリゴヌクレオチドも使用することが
できる。
たは細胞でヌクレオチド配列が発現される効率を強化することもできる。ヌクレオチド配
列の修飾のありとあらゆる組み合わせが本発明では企図されている。
きではない。本明細書のいたるところにより詳細に記載するように、いったん本発明を着
手すれば、当業者には本発明のペプチドをコードする他の核酸が本明細書に記載する手順
(例えば部位指向的突然変異誘発法、フレイムシフト突然変異等)、および当該技術分野
で周知の手順に従うことにより得られるのは明らかである
またペプチドのフラグメントをコードする単離された核酸も含み、ここでペプチドのフ
ラグメントはペプチドの所望する生物学的活性を保持している。さらに好適なペプチドを
コードする核酸の例を具体的な配列番号と関連して本明細書に開示するが、本発明は本明
細書に開示する具体的な核酸には限定されることは全くないと解釈すべきである。むしろ
本発明は核酸が本明細書に開示する所望の生物学的活性を有するペプチドをコードするよ
うに、本明細書に開示する配列と十分な同一性の割合を有するありとあらゆる核酸分子を
含むと解釈するべきである。また完全長よりも短い単離された核酸も意図し、ここでそれ
によりコードされるペプチドの生物学的活性は保持されている。1つの核酸ともう1つの
核酸との間の同一性の割合を決定する方法は、任意の特に好適なペプチドの生物学的活性
を決定するためのアッセイとして本明細書のいたるところに開示する。
.、(1989、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドス
プリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク)およびAusubel et al
.(1997、分子生物学の現在のプロトコール、グリーン&ウィリー、ニューヨーク)
のような当該技術分野で周知な組換えDNA法を使用して、本発明のペプチドの誘導体、
突然変異体または変異体を生成するための多数の他の手順を使用することができる。ペプ
チドをコードするDNA配列を改変することによりペプチドまたはポリペプチド中にアミ
ノ酸の変化を導入するための手順は当該技術分野では周知であり、そしてSambroo
k et al.(1989、同上);Ausubel et al.(1997、同上
)にも記載されている。
子、FSH、EPO、GM−CSF、IFN−ガンマ、A−1−P1、グルコセレブロシ
ダーゼ、TPA、IL−2、第VIII因子、キメラTNFR、ウロキナーゼ、キメラ抗
−糖タンパク質IIb/IIa、キメラ−抗−HER2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−
CD20、DNase、キメラ抗−TNF、ヒトインスリン、HBsAgおよびHGHを
コードする核酸を含み、ここで標識ペプチドをコードする核酸はそれに共有結合している
。すなわち本発明は、標識ペプチドをコードする核酸配列が本発明のペプチドをコードす
る核酸に共有結合しているキメラ核酸を包含する。そのような標識ペプチドは当該技術分
野では周知であり、そして例えばグリーン蛍光タンパク質(GFP)、myc、myc−
ピルベートキナーゼ(myc−PK)、His6、マルトース結合タンパク質(MBP)
、インフルエンザウイルス赤血球凝集素標識ポリペプチド、フラッグ標識ポリペプチド(
FLAG)、およびグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)標識ポリペプチド
を含む。しかし本発明は上記に掲載した標識ペプチドをコードする核酸に限定すべきもの
とは全く解釈されない。むしろこれらの標識ペプチドに実質的に類似する様式で機能する
ことができるペプチドをコードする任意の核酸配列を、本発明に含むと解釈すべきである
。
に、および/または生物全体(例えば哺乳動物の胚)に局在させ、細胞から分泌された本
発明のペプチドを検出し、そして細胞中でのペプチドの役割(1つまたは複数)を研究す
るために使用することができる。さらに標識ペプチドの付加により「標識」されたペプチ
ドの単離および精製が容易になるので、本発明のペプチドが生産され、そして容易に精製
され得る。
ベータ、第VII因子、第IX因子、FSH、EPO、GM−CSF、IFN−ガンマ、
A−1−P1、グルコセレブロシダーゼ、TPA、IL−2、第VIII因子、キメラT
NFR、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa、キメラ−抗−HER
2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−CD20、DNase、キメラ抗−TNF、ヒトイン
スリン、HBsAgおよびHGH。
異体」および「変異体」を包含すると解釈され、この誘導体、突然変異体および変異体は
1以上のアミノ酸が改変されている(またはそれをコードするヌクレオチド配列を指す時
は、1以上の塩基対が改変されている)ので、生成するペプチド(またはDNA)は本明
細書に引用する配列とは同一ではないが、そのペプチドがG−CSF、IFN−アルファ
、IFN−ベータ、第VII因子、第IX因子、FSH、EPO、GM−CSF、IFN
−ガンマ、A−1−P1、グルコセレブロシダーゼ、TPA、IL−2、第VIII因子
、キメラTNFR、ウロキナーゼ、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa、キメラ−
抗−HER2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−CD20、DNase、キメラ抗−TNF
、ヒトインスリン、HBsAgおよびHGHの生物学的/生化学的特性を有するという点
で本明細書に開示するペプチドと同じ生物学的特性を有する。
ドのフラグメントを含む。本発明に有用な任意のペプチドの完全長形態よりも小さいもの
を単離し、そして本明細書に提供するアッセイを使用して単離したどのフラグメントが所
望の生物学的活性を保持するか、したがって本発明に有用なペプチドであるかを決定する
ことは当業者の技術範囲内である。
血産出力の上昇、プロテアーゼ阻害、免疫系の調節、抗原の結合、成長、疾患の処置の軽
減、DNA開裂等のような、限定するわけではなく含む本明細書に記載する生物学的アッ
セイおよび環境においてペプチドが機能する能力を含むと解釈されるべきである。
A.G−CSF
本発明はG−CSF上のグリカン構造を修飾する方法を包含する。G−CSFは活性化
T−細胞、マクロファージ、内皮細胞およびストロマの繊維芽細胞により生産されるサイ
トカインとして当該技術分野では周知である。G−CSFは主に骨髄に作用して炎症性白
血球の生産を増加し、そしてさらに内分泌ホルモンとして機能して炎症機能中に消費され
る好中球の補充を開始する。またG−CSFは化学療法後の骨髄代用に臨床的応用を有す
る。
ると示されてきたが、組換え細胞からG−CSFを生産するための現在の方法は、比較的
短い生物学的寿命、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコシル化パターン、機能の
損失を有する生成物、および同じ効果を達成するためにより大量およびより頻繁な投与の
両方の必要性の増加をもたらす。
番号1および配列番号2(それぞれ図52Aおよび52B)に示す。本発明はG−CSF
を、特に有力かつ機能的な生物学的分子として機能するG−CSFの能力に関係するよう
に飾する方法を包含する。当業者は本開示および本明細書の教示をもってすれば、本発明
がG−CSFを修飾するための組成物および方法を提供することを容易に理解するだろう
。
本発明を限定することは全く意味せずに、G−CSF変異体はすでに米国特許第6,16
6,183号明細書に記載され、ここでG−CSFはリシン残基の天然な補体を含んでな
り、そしてさらに1または2個のポリエチレングリコール分子に結合したものが記載され
ている。さらに米国特許第6,004,548号、同第5,580,755号、同第5,
582,823号および同第5,676,941号明細書は、1以上のシステイン残基が
17、36、42、64および74位でアラニンあるいはセリンに置き換えられたG−C
SF変異体を記載する。米国特許第5,416,195号明細書は、17位のシステイン
、27位のアスパラギン酸、および65および66位のセリンがそれぞれセリン、セリン
、プロリンおよびプロリンに置き換えられたG−CSF分子を記載する。別の変異体は当
該技術分野で周知であり、そして例えば米国特許第5,399,345号明細書に記載さ
れている。
て例えば米国特許第4,810,643号明細書に記載されているような方法を使用して
アッセイすることができる。例として活性は放射能−標識チミジンの取り込みアッセイを
使用して測定することができる。簡単に説明すると、健康なドナーに由来するヒトの骨髄
をFicoll−Hypaqueでの密度カットに供し(1.077g/ml、ファルマ
シア(Pharmacia)、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)、そして低密度細
胞を、10%ウシ胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を含むIscoveの培地(ギブ
コ(GIBCO)、ラジョラ、カリフォルニア州)に懸濁する。約2X104個のヒト骨
髄細胞を対照培地またはG−CSFまたは本発明のいずれかと、96−ウェル平底プレー
ト中で約37℃で空気中5%CO2で約2日間、インキューベーションする。次いでカル
チャーは約4時間、0.5μCi/ウェルの3H−チミジン(ニューイングランドヌクレ
アー(New England Nuclear)、ボストン、マサチューセッツ州)で
パルスをかけ、そして取り込みを例えばVentua,et al.(1983,Blo
od 61:781)に記載されているように測定する。対照化合物で処理した骨髄細胞
と比べて、3H−チミジンのヒト骨髄細胞への包含の上昇は、活性なそして能力のあるG
−CSF化合物の指標である。
B.IFNアルファおよびIFNベータ
本発明はさらに、IFNアルファおよびIFNベータの改造および修飾法を包含する。
IFNアルファは重量が約18kDaの約20個のペプチドのファミリーの一部である。
IFNアルファおよびIFNベータは集合的にI型インターフェロンとして知られるが、
同じ細胞レセプターに結合し、そして類似の応答を誘導する。I型IFNは中でも、ウイ
ルス複製を阻害し、NK細胞の溶解能力を上げ、MHC分子の発現を調節し、そして細胞
増殖を阻害する。I型IFNはウイルス感染、特に肝炎ウイルスの治療として、および多
発性硬化症の治療として使用されてきた。
疾患の治療の両方に有用な化合物である。しかしそれらは天然なグリコシル化の補体を含
んでなる天然なサイトカインと比べて、体内での能力および機能の低下、および限定され
た半減期により阻まれている。
番号3および配列番号4(それぞれ図53Aおよび53B)として説明する。IFNベー
タは約20kDaの単一の遺伝子産物を含んでなり、その核酸およびアミノ酸配列は、本
明細書では配列番号5および配列番号6(それぞれ図54Aおよび543B)として表す
。本発明は本明細書のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に限定されない。当業者はIFN
アルファの多くの変異体が天然な、および工作された誘導体として両方が存在すると容易
に考えるだろう。同様に、IFNベータはより有利な治療的プロフィールを達成すること
を試みるために修飾された。修飾されたI型IFNの例は当該技術分野では周知であり(
表8を参照にされたい)、そして例えば米国特許第6,323,006号明細書(ここで
システイン−60がチロンシに置換されている)、米国特許第4,737,462号、同
第4、588,585号、同第5,545,723号および同第6,127,332号明
細書(ここで種々のアミノ酸の置換を持つIFNベータが記載されている)に記載されて
いる。さらに米国特許第4,966,843号、同第5,376,567号、同第5,7
95,779号明細書は、IFNアルファ−61およびIFN−アルファ−76を記載す
る。米国特許第4,748,233号および同第4,695,543号明細書は、IFN
アルファgx−1を記載し、一方米国特許第4,975,276号明細書はIFNアルフ
ァ54を記載する。米国特許第4,695,623号、同第4,897,471号、同第
5,661,009号および同第5,541,293号明細書はすべて共通IFNアルフ
ァ配列を記載し、提出日までに知られているすべての変異体を表す。このI型IFNおよ
びその変異体のリストは網羅的であること全く意味せず、当業者は本発明が既知の、また
は将来見いだされるIFNベータおよびIFNアルファ分子、誘導体および変異体を包含
すると容易に理解するだろう。
43号明細書およびSambrook et al.(2001、モレキュラークローニ
ング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニ
ューヨーク)およびAusubel et al.(1997、分子生物学の現在のプロ
トコール、グリーン&ウィリー、ニューヨーク)に記載されている技法を使用して容易に
行われる。
者には周知である。例えばRubinstein et al.,(1981,Jour
nal of Virology 37:755−758)に記載されているアッセイは
、細胞群に及ぼすウイルス感染の細胞病理学効果を測定することにより、I型IFNの効
果を決定するために一般的に使用されている。この方法はIFN型の生物学的機能をアッ
セイするために当該技術分野で知られている多くの1つにすぎない。
C.第VIIa因子
さらに本発明は第VII因子の改造および修飾法を包含する。血液凝固経路は、多くの
出来事(event)を含んでなる複雑な反応である。この経路の中間の出来事が第VI
I因子であり、これは組織因子およびカルシウムイオンの存在下で第X因子をXa因子に
転換することにより(第VIIa因子への活性化で)、血液凝固の外因系経路に参加する
プロ酵素である。次に第Xa因子は、第Va因子、カルシウムイオンおよびリン脂質の存
在下でプロトロンビンをトロンビンに転換する。第X因子から第Xa因子への活性化は、
内因系および外因系の血液凝固経路の両方により分けられる(shared)出来事であ
り、したがって第VIIa因子は第VIII因子の欠損またはインヒビターを有する患者
の処置に使用することができる。また第VIIa因子が内因系の経路にも参加できること
を示唆する証拠もあるので、血液凝固における第VII因子の役割の突出および重要性が
増している。
、この因子は血液中を不活性なプロ酵素として循環する。第VII因子のVIIaへの活
性化は、第XIIa因子のような数種の血漿プロテアーゼにより触媒され得る。第VII
因子の活性化は、少なくとも1つのジスルフィド結合により一緒に保たれる重鎖および軽
鎖の形成をもたらす。さらに第VIIa因子に転換されることができない修飾された第V
II因子分子が記載され、そしてこれらは血液凝固、血栓症等のような場合に抗−凝固薬
として有用である。血液凝固経路における第VII因子の重要性、および上昇または減少
した凝固レベルの両方の処置としての使用を仮定すると、より長い生物学的半減期、上昇
した能力および一般に野生型の第VII因子により似ている治療プロフィールを有する分
子が、健康なヒトで合成され、そして分泌されれば、血液凝固障害の処置に有益でしかも
有用となるだろう。
細書に配列番号7および配列番号8(それぞ図55Aおよび55B)として提示されてい
る。本発明は本明細書で説明する第VII因子の核酸およびアミノ酸配列に全く限定され
ないと解釈されるべきである。第VII因子の変異体も例えば米国特許第4,784,9
50号および同第5,580,560号明細書に記載され、ここでリシン−38、リシン
−32、アルギニン−290、アルギニン−341、イソロイシン−42、チロシン−2
78およびチロシン332が種々のアミノ酸に置き換えられている。さらに米国特許第5
,861,374号、同第6,039,944号、同第5、833,982号、同第5,
788,965号、同第6,183,743号、同第5,997,864号および同第5
,817,788号明細書は、第VIIa因子の形態に開裂されない第VII因子変異体
を記載する。当業者は、血液凝固経路およびその中での第VII因子の役割については周
知であり、したがって天然に存在するか、または上記のように工作された多くの変異体が
本発明に含まれることを認識するだろう。
米国特許第4,784,950号明細書に記載されている。簡単に説明すると、第VII
因子、またはその変異体の発現は、大腸菌(E.coli)、CHO細胞、BHK細胞、
昆虫細胞を含む様々な原核および真核系で、バキュロウイルス発現系を使用して行うこと
ができ、そのすべてが当該技術分野では周知である。
周知な方法を使用して行うことができる。非限定的な例として、Quick et al
.(出血性疾患および血栓症(Hemorragic Disease and Thr
ombosis)、第2版、リート フェビガー(Leat Febiger)、フィラ
デルフィア、1966)は、本発明の方法に従い調製した第VII因子分子の生物学的活
性を測定するために有用な1段階凝固アッセイを記載している。
D.第IX因子
本発明はさらに第IX因子を改造および/または修飾するための方法を包含する。上記
のように第IX因子は血液凝固カスケードで活性で(vital)ある。体内での第IX
因子の欠損は、血友病(B型)の型の特徴である。この疾患の処置は通常、ヒト血漿タン
パク質の第IX因子濃縮物の静脈内輸血に限られている。しかし時間および経費の現実的
な欠点に加えて、血液濃縮物の輸血にはウイルス性肝炎、後天的免疫不全症候群の伝播、
または受容者に対する血栓塞栓性疾患の危険性を含む。
組換え細胞から第IX因子を生産する現在の方法(米国特許第4,770,999号明細
書)は、生成物にやや短い生物学的半減期、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコ
シル化パターン、機能損失、同じ効果等を達成するためにより大量かつ頻繁な投与の必要
性の増加をもたらす。
ぞれ図56Aおよび56B)に説明する。本発明は本明細書に説明する配列に全く限定さ
れない。第IX因子の変異体は例えば米国特許第4,770,999号、同第5,521
,070号明細書(ここでチロシンが第一位でアラニンに置換されている)、米国特許第
6,037,452号(ここで第XI因子はアルキレンオキシド基に結合している)、お
よび米国特許第6,046,380号明細書(ここで第IX因子をコードするDNAが少
なくとも1つのスプライス部位で修飾されている)に記載されているように、当該技術分
野で周知である。本明細書で示すように第IX因子の変異体も当該技術分野では周知であ
り、そして本開示はこれらの既知のまたは将来開発もしくは見いだされる変異体を包含す
る。
使用して、またはさらに例えばBiggs(1972,ヒト血液凝固止血および血栓症(
第1版)(Human Blood Coagulation Haemostasis
and Thrombosis)、オックスフォード、ブラックウェル、サイエンティ
フィック、第614頁)に記載されているような1段階の活性化部分トロンボプラスチン
時間アッセイのような周知方法を使用して行うことができる。簡単に説明すると、本発明
の方法により開発された第IX分子の生物学的活性をアッセイするために、このアッセイ
は等容量の活性化部分トロンボプラスチン試薬、B型血友病患者から単離した第IX因子
欠損血漿を用いて、当該技術分野で周知の滅菌瀉血技法、および標準として正常プール血
清またはサンプルを使用して行うことができる。このアッセイでは1単位の活性を、1ミ
リリットルの正常プール血清に存在する量と定める。さらに正常に対して第IX因子欠損
患者に由来する血漿の凝固時間を下げる第IX因子の能力に基づく生物学的活性に関する
アッセイが、例えばProctor and Rapaport(1961,Amer.
J.Clin.Path.36:212)に記載されているように行うことができる。
E.FSH
本発明はさらFSHを改造および/または修飾する方法を含む。ヒトの生殖機能は部分
的には、共通する92アミノ酸糖タンパク質アルファサブユニットを有するが、ホルモン
−特異的ベータサブユニットが異なるヘテロ二量体のヒト糖タンパク質ホルモンのファミ
リーにより制御されている。このファミリーには濾胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成
ホルモン(LH)、チロトロピンまたは甲状腺−刺激ホルモン(TSH)およびヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン(hCG)を含む。ヒトFSHおよびLHは治療的に使用されて、ヒ
ト女性において生殖に関する様々な代謝的な観点を調節する。例えば尿から部分精製され
たFSHは、無排卵症候群または黄体期欠損の無排卵女性の小胞成熟を刺激するために臨
床的に使用されている。黄体形成ホルモン(LH)およびFSHは、インビトロの受精の
ために卵胞の生育の刺激に組み合わせて使用されている。生殖サイクルにおけるFSHの
役割は十分によく知られているので治療的使用が可能であるが、部分的には天然な供給源
からの調製物の異質性および不純さから困難に遭遇した。
が、上述のようにその臨床的効力はタンパク質のグリコシル化の一貫性の無さから妨げら
れている。したがってFSHを改造する方法が生殖科学に大変有益となるのは明らかと思
われる。
細書でそれぞれ配列番号11および配列番号12(アルファサブユニット)およびそれぞ
れ配列番号13および配列番号14(ベータサブユニット)として表す(それぞれ図57
Aおよび57B)。当業者には本発明が、当該技術分野で周知であるFSHの変異体のよ
うに本明細書に表す配列に限定されないと容易に考えるだろう。非限定的例として、米国
特許第5,639,640号明細書は2つの異なるアミノ酸配列を含んでなるベータサブ
ユニットを記載し、そして米国特許第5,338,835号明細書はヒト絨毛性性腺刺激
ホルモンのベータサブユニットに由来する約27個のアミノ酸のさらなるアミノ酸配列を
含んでなるベータサブユニットを記載する。したがって本発明は天然のまたは人の手によ
り工作されたFSH変異体(すべて当該技術分野では周知である)を含んでなる。
であり、そして技術文献に豊富に記載されている(米国特許第4,840,896号、同
第4,923,805号、同第5,156,957号明細書)。さらに本発明の改造され
たFSH分子の生物学的活性を評価する方法は当該技術分野では周知であり、そして例え
ば米国特許第4,589,402号明細書(ここでFSHが受精、卵の生産および妊娠率
に及ぼす効果を測定する方法が、非ヒト霊長類およびヒト個体の両方について記載されて
いる)に記載されている。
F.EPO
本発明はさらEPOを改造および/または修飾する方法を含んでなる。EPOは約34
kDaの酸性糖タンパク質であり、そして3つの天然な形態で存在することができる:ア
ルファ、ベータおよびアシアロ。アルファおよびベータ形は炭水化物成分がわずかに異な
るが、同じ能力、生物学的活性および分子量を有する。アシアロ形はアルファまたはベー
タ形であり、末端シアル酸が除去されている。EPOは身体が健康な状態である時は血漿
中に大変低濃度で存在し、ここで組織は既存の数の赤血球から十分な酸素を受容する。こ
の正常濃度は通常は加齢を通して失われる赤血球細胞の代替を刺激するために十分である
。循環中のエリトロポエチンの量は、循環中の血液細胞による酸素輸送が低下する時の低
酸素の条件下で増加する。低酸素は出血による大量の血液損失、照射に過剰暴露された赤
血球細胞の破壊、高山病または長期の意識不明による酸素取り込みの低下、または様々な
状態の貧血によるより引き起こされ得る。したがってEPOは、照射療法後の赤血球細胞
の補充、貧血および他の生命を脅かす状態に有用な化合物である。
は天然な、したがってより効果的なサッカリド成分を持つEPOの生産に有用である。現
在合成されているようにEPOは完全なグリコシル化補体を欠くので、したがって体内で
のその短い半減期により、より頻繁に、そしてより高用量で投与されなければならない。
明細書でそれぞれ配列番号15および配列番号16に表す(それぞれ図58Aおよび58
B)。当業者には本明細書で説明する配列がEPOをコードし、そして含んでなる配列の
単なる一例であると容易に理解するだろう。例として、米国特許第6,187,564号
明細書は2以上のEPOペプチドのアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質を記載し、
米国特許第6,048,971号および同第5,614,184号明細書は、101、1
03、104および108位でアミノ酸置換を有する突然変異体EPO分子を記載する。
米国特許第5,106,954号明細書は短縮化されたEPO分子を記載し、そして米国
特許第5,888,772号明細書は33、139および166位に置換を持つEPO類
似体を記載する。したがって当業者は本発明が技術文献および当該技術分野で十分に記載
されたEPOおよびEPO誘導体および変異体を全部、包含すると認識するだろう。
第4,703,008号、同第5,688,679号および同第6,376,218号明
細書に例示されるように、EPOは原核および真核発現系で発現することができる。EP
Oの生物学的活性を測定する方法も、等しく当該技術分野では周知である。例としてKr
ystalアッセイ(Krystal,1983,Exp.Hematol.11:64
9−660)を使用して、本発明の方法に従い調製したEPOの活性を測定することがで
きる。簡単に説明すると、アッセイはエリトロポエチンが完全なマウス脾臓細胞に及ぼす
効果を測定する。マウスはエリトロポエチン−反応性赤血球細胞の子孫細胞の生産を刺激
するために、フェニルヒドラジンで処置される。処置後、脾臓を摘出し、完全な脾臓細胞
を単離し、そして様々な量の野生型エリトロポエチンまたは本明細書に記載するエリトロ
ポエチンタンパク質とインキューベーションする。一晩インキューベーションした後、3
H−チミジンを加え、そして細胞内DNAの取り込みを測定する。3H−チミジンの取り
込み量は、エリトロポエチンと細胞レセプターとの間の相互作用を介してエリトロポエチ
ンが刺激する血液細胞生産の指標である。本発明のエリトロポエチンのタンパク質濃度な
らびに野生型エリトロポエチンの濃度は、当該技術分野で周知の競合的ラジオイムノアッ
セイ法により定量される。比活性は、ラジオイムノアッセイにより免疫沈降可能なタンパ
ク質として測定された時、ミリグラムで除算されたKrystalアッセイで測定した国
際単位として算出する。
G.GM−CSF
本発明はGM−CSFを修飾する方法を包含する。GM−CSFは活性化T−細胞、マ
クロファージ、内皮細胞およびストロマの繊維芽細胞により生産されるサイトカインとし
て当該技術分野では周知である。GM−CSFは主に骨髄に作用して炎症性白血球の生産
を増加し、そしてさらに内分泌ホルモンとして機能して炎症機能中に消費される好中球の
補充を開始する。さらにGM−CSFはマクロファージ活性化因子であり、そしてランゲ
ルハンス細胞の樹状細胞への分化を促進する。G−CSFと同様に、GM−CSFは化学
療法後の骨髄代用にも臨床的応用を有する。
が、組換え細胞からのG−CSFを生産するための現在の方法は比較的短い生物学的寿命
、免疫原性を導く可能性がある不適切なグリコシル化パターン、機能の損失を有する生成
物、および同じ効果等を達成するためにより大量およびより頻繁な投与の両方の必要性の
増加をもたらす。
列番号17および配列番号18(それぞれ図59Aおよび59B)に示す。本発明はGM
−CSF、特に有力かつ機能的な生物学的分子として機能するGM−CSFの能力に関係
するように修飾する方法を包含する。当業者は本開示および本明細書の技術をもってすれ
ば、本発明がGM−CSFを修飾するための組成物および方法を提供することを容易に理
解するだろう。
し本発明を限定することは全く意味せずにGM−CSF変異体はすでに国際公開第86/
06358号パンフレットに記載され、ここでタンパク質は選択的な(alternat
ive)4次構造に修飾されている。さらに米国特許第6,287,557号明細書は、
遺伝子治療の応用のためにヘルペスウイルスのゲノムに連結されたGM−CSFの核酸配
列を記載する。さらに欧州特許出願公開第0288809号明細書(国際公開第87/0
2060号パンフレットに対応する)は、IL−2およびGM−CSFを含んでなる融合
タンパク質を報告する。IL−2配列は、融合タンパク質の酸開裂後に、N−またはC−
末端配列修飾のいずれかを有するGM−CSFが生成できるように、GM−CSFのN−
またはC−末端配列であることができる。したがってGM−CSF誘導体、突然変異体お
よび変異体は当該技術分野では周知であり、そして本発明の方法の中に包含される。
して例えば米国特許第4,810,643号明細書に記載されているような方法を使用し
てアッセイすることができる。例として活性は放射能−標識チミジン取り込みアッセイを
使用して測定することができる。簡単に説明すると、健康なドナーに由来するヒトの骨髄
をFicoll−Hypaqueでの密度カットに供し(1.077g/ml、ファルマ
シア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)、そして低密度細胞を、10%ウシ胎児血
清、グルタミンおよび抗生物質を含むIscoveの培地(ギブコ、ラジョラ、カリフォ
ルニア州)に懸濁する。約2X104個のヒト骨髄細胞を対照培地またはGM−CSFま
たは本発明のいずれかと、96−ウェル平底プレート中で約37℃で空気中5%CO2で
約2日間、インキューベーションする。次いでカルチャーは約4時間、0.5μCi/ウ
ェルの3H−チミジン(ニューイングランドヌクレアー、ボストン、マサチューセッツ州
)でパルスをかけ、そして取り込みを例えばVentua,et al.(1983,B
lood 61:781)に記載されているように測定する。対照化合物で処理した骨髄
細胞と比べて、3H−チミジンのヒト骨髄細胞への包含の上昇は、活性な、そして活力の
あるGM−CSF化合物の指標である。
H.IFN−ガンマ
IFN−ガンマを修飾および/または改造する方法を包含することは、本発明の目的で
ある。IFN−ガンマはII型インターフェロンとしても知られているが、IFNアルフ
ァおよびIFNベータとは対照的に、約21〜24kDaの2つのサブユニットを含んで
なるホモ二量体糖タンパク質である。サイズの変動は、当該技術分野で知られている種々
の発現系で組換え的に再生した時、通常は複製しない可変性のグリコシル化パターンによ
るものである。IFN−ガンマはマクロファージの有力なアクチベーターであり、MHC
クラスI分子の発現、そして程度は低いがMHCクラスII分子刺激物を上昇させる。さ
らにIFN−ガンマはT−細胞の分化およびB−細胞中でのアイソタイプスイッチを促進
する。IFN−ガンマはまた好中球、NK細胞、および食細胞が媒介する排除を導く抗体
応答の刺激物としてもよく知られている。IFN−ガンマは、結核症およびリーシュマニ
アのような細胞内病原体による感染と関連して使用される処置として、および種々の癌お
よび他の新形成のような、顕著な特徴として異常な細胞増殖を伴う状態に有用な抗−増殖
性治療剤としても提案された。
に現在使用されている系に由来するグリコシル化の変動により、治療薬の能力、効力、生
物学的半減期、および他の重要な因子は最善の状態では可変的である。本発明はこの重要
な欠点を正す方法を包含する。
19および配列番号20に示す(それぞれ図60Aおよび60B)。本明細書で説明する
配列は、本発明を限定するものでは全くないことは容易に理解される。対照的にIFN−
ガンマの変異体、誘導体および突然変異体は当業者には周知である。例として米国特許第
6,083,724号明細書は、組換えトリIFN−ガンマを記載し、そして米国特許第
5,770,191号明細書は、ヒトIFN−ガンマのC−末端変異体を記載する。さら
に米国特許第4,758,656号明細書は新規IFN−ガンマ誘導体および種々の発現
系でそれらを合成する方法を記載する。したがって本発明は本明細書のいたるところに開
示するIFN−ガンマの配列に限定されず、当該技術分野で周知なすべての誘導体、変異
体、突然変異体等を包含する。
系、ならびに植物および昆虫細胞調製物を含み、その方法は当業者に知られている。例と
して米国特許第4,758,656号明細書は大腸菌(E.coli)でIFN−ガンマ
誘導体を発現させる系を記載し、一方米国特許第4,889,803号明細書はチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞およびSV40プロモーターを使用する発現系を記載する。
は、当業者には周知である。IFN−ガンマ発現の生物学的アッセイは、例えば米国特許
第5,807,774号明細書に見いだすことができる。簡単に説明すると、IFN−ガ
ンマを、IL−3,c−kitリガンドおよびIL−1、IL−6またはG−CSFのい
ずれかのようなサイトカインの組み合わせにより刺激したCD34++CD38−細胞(
ウェルあたり100個の細胞)のカルチャーに加えて、CD34++CD38−細胞の増
殖を誘導する。細胞増殖および2次コロニー形成細胞の生成は用量依存的様式で大いに阻
害され、5000U/ミリリットルのIFN−ガンマでほぼ完全な阻害が起こる。IFN
−ガンマの阻害効果に対する確認試験として、対照としてIFN−ガンマ抗体の添加を行
うことができる。
I.アルファ−プロテアーゼインヒビター(α−アンチトリプシン)
本発明はさらに、アルファ−アンチトリプシンとしても知られているアルファ−プロテ
アーゼインヒビター(A−I−PI、α−1−アンチトリプシンまたはα−1−トリプシ
ンインヒビター)の改造方法を含む。A−I−PIは53kDaの分子量を有する糖タン
パク質である。A−I−PIは内因性のセリンプロテアーゼによる組織破壊の制御に役割
を有し、そして血漿中で最も有名なセリンプロテアーゼインヒビターである。特にA−I
−PIは好中球エラスターゼを含む種々のエラスターゼを阻害する。エラスターゼは組織
を破壊するプロテアーゼであり、そしてその活性が肺組織で調節されない時、特に問題を
生じる。このプロテアーゼは外来タンパク質を分解することにより機能する。しかしAP
Iがエラスターゼ活性を調節するために十分な量で存在しない時、エラスターゼは肺組織
を分解する。早晩、この平衡失調が慢性の肺組織傷害および気腫をもたらす。実際に、A
−1−PIの遺伝的欠損は、肺気腫の未成熟な発生を伴うことが示された。A−1−PI
の補充はこの状態の気腫の治療に成功裏に使用された。さらにA−1−PIの欠損は嚢胞
性繊維症および関節炎のような他の疾患の悪化にも関与し、この場合、白血球は感染と戦
うために肺または関節に移動する。
特に好中球エラスターゼとの間の平衡失調が疾患状態の進行を引き起こす疾患を処置する
ために使用できるだろう。抗ウイルス活性もA−1−PIに起因した。この観点で本発明
は論理上、肺の空気の永久的な交換に、安全で、効果的で、しかも有力であるA−1−P
Iの生産に有用となる。
2に説明する(それぞれ図61Aおよび61B)。当業者に理解されるように、A−1−
PIの天然な、および工作された変異体が存在し、そして本発明に包含される。例として
米国特許第5,723,316号明細書は、356〜361位にアミノ酸置換を有し、そ
してさらに約3個のアミノ酸のN−末端延長を含んでなるA−1−PI誘導体を記載する
。米国特許第5,674,708号明細書は、1次アミノ酸配列の358位にアミノ酸置
換を持つA−1−PI類似体を記載する。当業者は本発明が既知の、または今後見いださ
れるA−1−PI変異体、誘導体および突然変異体を包含すると容易に認識するだろう。
野では周知であり、そして例えば米国特許第5,674,708号および同第5,723
,316号明細書に記載されている。簡単に説明すると生物学的活性は、例えばDelM
ar et al.,(1979,Anal.Biochem.99:316)に記載さ
れているように、基質N−suc−Ala−−Ala−−Pro−−Phe−p−ニトロ
アニリド(90%DMSO中、0.1mlの10mM溶液)のキモトリプシンが触媒する
加水分解の阻害を測定することにより、アンチキモトリプシン活性に関するアッセイを使
用して測定することができる。典型的なキモトリプシンアッセイは、1.0ミリリットル
中に:100mM Tris−Clバッファー、pH8.3、0.005(容量/容量)
% TritonX−100、ウシ膵臓キモトリプシン(18キロモル)および本発明の
A−1−PIを含む。アッセイ混合物を室温で5分間、プレ−インキューベーションし、
基質(90%DMSO中、0.01mlの10mM溶液)を加え、そして残りのキモトリ
プシン活性を、p−ニトロアニリンの放出により生じる410nmでの吸収の変化の割合
により決定する。光学的吸収の測定は、温度制御サンプル区画を備えた分光光度計を使用
して25℃で行う。
J.グルコセレブロシダーゼ
本明細書に記載する本発明はさらに、グルコセレブロシダーゼを修飾する方法を含む。
グルコセレブロシダーゼは糖脂質であるグルコセレブロシドをグルコースおよびセラミド
へ加水分解することを触媒するリソソームの糖タンパク質酵素である。グルコセレブロシ
ダーゼの変異体は、Cerezyme(商標)およびCeredase(商標)として市
販されており、ゴーシェ病の処置に治療薬として認可されている。Ceredase(商
標)は完全なN−結合構造を有するグルコセレブロシダーゼの胎盤に由来する形態である
。Cerezyme(商標)は497アミノ酸長で、CHO細胞で発現されたグルコセレ
ブロシダーゼの組換え変異体である。Cerezymeの4N−結合グリカンはトリマン
ノースコアで終結するように修飾された。
らの細胞、通常、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはベビーハムスター腎臓細胞のよ
うな齧歯類の細胞のグリコシル化パターンを反映し、これはヒトのグリコシル化パターン
とは劇的に異なり、中でも免疫原性および能力の欠如を導く。
4に説明する(それぞれ図62Aおよび62B)。しかし当業者には明らかであるように
、本明細書で提示する配列は原型配列であり、そして本発明を限定するものではない。実
際にグルコセレブロシダーゼの変異体は周知であり、そして例えば米国特許第6,015
,703号明細書に記され、これはグルコセレブロシダーゼ同族体およびその変異体の強
化された生産を記載する。さらに米国特許第6,087,131号明細書は、別のグルコ
セレブロシダーゼ変異体のクローニングおよびシークエンシングを記載する。既知の、ま
たは将来見いだされるこれらおよび他の誘導体、変異体および突然変異体を包含すること
は本発明の意図するところである。
米国特許第6,015,703号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法に従い調
製されたグルコセレブロシダーゼ分子の生物学的効力のアッセイも同様に当該技術分野で
は周知であり、そして評価のためのマウスのゴーシェ病モデルおよびグルコセレブロシダ
ーゼ治療薬の使用は、例えばMarshall et al.,(2002,Mol.T
her.6:179)に記載されている。
K.TPA
本発明はさらに組織−型アクチベーター(TPA)の改造方法も包含する。TPAはプ
ラスミノーゲンを活性化して、フィブリン(血栓のタンパク質物質の主成分)を溶解する
プラスミンを形成する。TPA調製物は、心筋梗塞および脳梗塞を引き起こす血栓症の血
栓溶解処置において血栓に対して大変高い選択性を有する血栓溶解剤として開発された。
得る目的で、様々な修飾されたTPAが遺伝子工学により生産されてきた。原核生物から
生産された修飾TPAの形態は天然のTPAとは異なりグリコシル化されていない。TP
Aは、一般に水に溶解することが極端に難しいタンパク質である。特に修飾されたTPA
は天然なTPAよりも水に溶解することが難しく、修飾されたTPAの調製を大変難しく
している。このように修飾されたTPAは患者に投与する時に水に溶解することが難しい
。しかし修飾されたTPAはフィブリンに対して上昇した親和性および血液中でのより長
い半減期のような種々の利点を有する。本発明の目的は修飾されたTPAの可溶性を上昇
させることである。
本明細書に説明する(それぞれ図63Aおよび63B)。上記のようにTPAの変異体は
治療的応用に構築され、そして使用されてきた。例えば米国特許第5,770,425号
明細書はフィブリンドメインの幾つか、またはすべてが削除されたTPA変異体を記載す
る。さらに米国特許第5,736,134号明細書は、276位のアミノ酸に対する修飾
が開示されているTPAを記載する。当業者は本開示および本明細書の教示をもってすれ
ば、本発明が本明細書に説明するTPA配列ならびに技術文献に精通した人に周知なそれ
ら変異体を含んでなることを容易に認識するだろう。
て例えば米国特許第5,753,486号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法
に従い調製したTPA分子の生物学的特性を測定するアッセイも、当該技術分野では同様
に周知である。簡単に説明すると、本明細書のいたるところに開示するように合成したT
PA分子は、Carlsen et al.(1988,Anal.Biochem.1
68:428)の方法に従い、飽和濃度のプラスミノーゲンの存在下でフィブリンを溶解
するそれらの能力についてアッセイすることができる。インビトロの血塊溶解アッセイは
、微遠心(microcentrifugal)分析機を使用した比濁法により組織−型
アクチベーターの活性を測定する。トロンビンおよびTPAの混合物をフィブリノーゲン
およびプラスミノーゲンの混合物中で遠心して血塊形成を開始し、そして引き続き血塊を
溶解する。生成した吸収 対 時間のプロフィールを分析してアッセイの終点を決定する
。TPA変異体の活性はTPAの標準曲線と比較する。アッセイを通じて使用するバッフ
ァーは、0.01(容量/容量)%TWEEN80および0.01(重量/容量)%のア
ジ化ナトリウムを含有する0.06Mリン酸ナトリウム、pH7.4である。ヒト トロ
ンビンは約33単位/mlの濃度である。フィブリノーゲン(2.0mg/mlの血塊性
タンパク質)を湿った氷上で冷却してフィブロネクチンを沈殿させ、そして次いで重力に
より濾過する。Glu−プラスミノーゲンは1mg/mlの濃度である。分析機のチャン
バーの温度は37℃に設定する。ローダーは、標準曲線用のサンプルとして20マイクロ
リットルのTPA(約500ナノグラム/ミリリットル〜約1.5マイクログラム/ミリ
リットル)を、または標準曲線の範囲内で溶解を引き起こす濃度で20マイクロリットル
の変異体TPAを分配するように設定する。第2試薬として20マイクロリットルのトロ
ンビン、および1次試薬として200マイクロリットルの50:1(容量/容量)のフィ
ブリノーゲン:プラスミノーゲン混合物。吸収/時間プログラムは5分間のインキュベー
ション時間、340−ナノメーターのフィルターおよび90秒間隔の読み取りで使用する
。
L.IL−2
本発明はさらにIL−2を改造および修飾する方法を包含する。IL−2はTリンパ球
の主要な増殖因子であり、そして細胞傷害性CD8T細胞およびNK細胞を刺激すること
により液性および細胞性免疫応答を上昇させる。したがってIL−2は腫瘍およびウイル
ス感染に対する防御メカニズムにおいて重要である。IL−2は転移性メラノーマおよび
腎腺癌に対する治療にも使用され、そして臨床試験で多くの形態の癌に使用されてきた。
さらにIL−2は、CD4カウントの有意な上昇を導くHIVに感染した患者にも使用さ
れてきた。
て証明した成功を考慮すれば、本発明の方法はより長い生物学的半減期、上昇した能力、
そして一般に健康なヒトで合成分泌されるような野生型のIL−2に似た治療プロフィー
ルを有するIL−2分子を開発するために有用ということになるだろう。
で配列番号27および配列番号28に示す(それぞれ図64Aおよび64B)。本発明は
本明細書に説明するIL−2の核酸およびアミノ酸配列に限定されると全く解釈されるべ
きではない。IL−2の変異体は例えば米国特許第6,348,193号明細書に記載さ
れ、ここで88位のアスパラギンがアルギニンに置換され、そして米国特許第5,206
,344号明細書では、種々のアミノ酸置換を持つIL−2変異体を含んでなるポリマー
が記載されている。本発明はこれらのIL−2変異体および当該技術分野で周知なその他
を包含する。
許第5,417,970号明細書に記載されている。簡単に説明すると、IL−2または
その変異体の発現は、大腸菌(E.coli)、CHO細胞、BHK細胞、昆虫細胞を含
む種々の原核および真核系の両方で、バキュロウイルス発現系を使用して行うことができ
、それらすべてが当該技術分野では周知である。
進めることができる。末梢血リンパ球は、例えばA.Boyum et al.(Met
hods in Enzymology,1984,Vol.108,page88、ア
カデミック出版社)に記載された方法により、Ficoll−Hypaque(ファルマ
シア、ピスカタウェイ、ニュージージー州)勾配での遠心により、赤血球および顆粒球か
ら分離することができる。続いてリンパ球は、RRMI1640(ギブコ−BRL、ラジ
ョラ、カリフォルニア州)に熱(56℃で1時間)不活性化した10%ABヒト血清(C
TSパーパン(Purpan)、トゥールーズ、フランス)、2mM ピルビン酸ナトリ
ウム、5mM HEPES、4mM L−グルタミン、100U/ml ペニシリン、1
00μg/mlストレプトマイシンおよび0.25μg/mlのアンホテリシンを加えて
なる培養基(完全培地)で約3回洗浄する。
し、そして残りの細胞を完全培地にミリリットル当たり約5〜10X105細胞の濃度で
懸濁し、そして平方センチメートルあたり約1〜2X105細胞の密度で培養フラスコに
播種した。次いでフラスコを37℃で5%CO2の雰囲気中で約1時間インキューベーシ
ョンし、その後、非−接着リンパ球は培養フラスコをゆるやかに撹拌した後、吸引により
回収する。
明のIL−2の存在下、完全培地中で約48時間、上記のインキューベーター中で培養す
る。次いで細胞を1回洗浄する。
ogy 129:51−64;1984,Science:223,703−707)に
より記載されているように、NK細胞の細胞傷害性に対して耐性のヒトTリンパ系C81
66−45/C63(HT1細胞)の標的細胞と約4時間接触させた後に評価する。6X
105HT1細胞を約200μCiの51Cr(クロム酸ナトリウム、アマーシャム、ア
ーリントンハイツ、イリノイ州)で、37℃で約1時間、血清を含まない完全培地中で放
射−標識し、次いで数回洗浄する。標的細胞およびエフェクティブ細胞は丸底マイクロタ
イタープレートに、エフェクティブ細胞 対 標的細胞の比率を変動させながら分配する
(50:1、10:1、1:1)。マイクロタイタープレートを遠心し、そして上記のよ
うにインキューベーションした後、各ウェルからの上清を回収し、そして放射性をガンマ
カウンターを使用して測定する。細胞傷害性は死んだ標的細胞により放出された51Cr
の量から決定する。非−特異的細胞傷害性は、エフェクティブ細胞の不存在下で、標的細
胞から天然に放出された放射性の量から決定する。
方法のうちの1つであり、そして本発明を限定するとは解釈すべきではない。
M.第VIII因子
本発明はさらに第VIII因子の改造および修飾法を包含する。第VIIおよび第IX
因子について前に記載したように、第VIII因子は血液凝固経路の重要な成分である。
ヒト第VIII因子(抗血友病因子;FVIII:C)は2つのペプチド(80kDaの
軽鎖分子量、およびグリコシル化状態に依存して90から220kDaまで可変の重鎖分
子量)からなるヒト血漿タンパク質である。これは凝固経路の必須なコファクターであり
、そして第X因子がその活性状態(第Xa)因子に転換するために必要である。第VII
I因子は、2050aaペプチドの二量体であるフォン ビルブラント(von Wil
librand)因子(aka FVIII:RP)との非共有複合体として血漿中を循
環する(米国特許第6,307,032号明細書を参照にされたい)。正常の20%未満
の第VIII因子の血液濃度は、血友病Aと呼ばれる出血性障害を引き起こす。1%未満
の第VIII因子の血液レべルは、重篤な出血障害を生じ、最も共通する症状である天然
な関節出血を伴う。
出血性障害の処置に相当有力な治療薬である。重鎖のグリコシル化により、組換え細胞か
ら第VIII因子を調製する現在の方法は、天然な第VIII因子ほど効果的な生成物を
もたらさない。ヒト血漿からの精製法は効果が低く、そして組換え第VIII因子を調製
するよりも難しい粗組成物をもたらす。本発明はこの状況の改善を求める。
30にそれぞれ表す(それぞれ図65Aおよび65B)。当該技術分野では例えば米国特
許第5,668,108号明細書に記載されているように(ここで1241位のアスパラ
ギン酸がグルタミン酸に置き換えられ、関連する核酸も変わる)、第VIII因子のおび
ただしい数の変異体が存在する。米国特許第5,149,637号明細書はグリコシル化
されているか、または非グリコシル化のC−末端画分を含んでなる第VIII因子変異体
を記載し、そして米国特許第5,661,008号明細書はアミノ酸1649〜2332
に少なくとも3個のアミノ酸残基で連結したアミノ酸1〜740を含んでなる第VIII
因子変異体を記載する。したがって第VIII因子の変異体、誘導体、修飾および複合体
は当該技術分野では周知であり、そして本発明に包含される。
許第5,633,150号、同第5,804,420号および同第5,422,250号
明細書に例示されるように原核および真核細胞を含む。
当業者は第VII因子および第IX因子を評価するために本明細書に記載したアッセイが
第VIII因子にも応用可能であることを認識するだろう。
N.ウロキナーゼ
本発明はウロキナーゼを改造および/または修飾する方法も含む。ウロキナーゼはプラ
スミノーゲンをプラスミンに活性化するセリンプロテアーゼである。このタンパク質は内
皮および腎臓を含む種々の組織中で合成され、そして尿中に微量分泌される。精製された
ウロキナーゼは2つの活性形態、高分子量形(HUK:約50kDa)および低分子量形
(LUK:約30kDa)で存在する。LUKはHUKから最初の135アミノ酸を放出
するリシン35以降のタンパク質分解により、HUKから誘導されることが示された。H
UKまたはLUKは、プロウロキナーゼと呼ばれる1本鎖前駆体の、リシン158とイソ
ロイシン159との間のタンパク質分解的加水分解によりタンパク質分解的に活性な形に
転換されて、二本鎖の活性化形(これはHUKまたはLUKをいずれかに対応し続ける)
を生じるはずであるという従来の見識が維持された。この加水分解的切断から生じるタン
パク質分解的に活性なウロキナーゼ種は、1つのジスルフィド結合により一緒に保持され
る2つのアミノ酸鎖を含む。活性化切断により形成された2つの鎖をAまたはA1鎖(そ
れぞれHUKまたはLUK)と呼び、そしてB鎖は分子のプロテアーゼドメインを含んで
なる。 ウロキナーゼは効果的な血栓溶解剤であることが示されてきた。しかしこれは天
然には微量でしか生産されないので、効果的な投薬用量のための酵素のコストは高い。ウ
ロキナーゼは組換え細胞培養で生産され、そしてウロキナーゼをコードするDNAは適当
なベクターおよび宿主微生物と一緒に知られている。ウロキナーゼを含んでなる現在の組
成物およびウロキナーゼを組換え的に生産する方法はグリコシル化パターンが欠如した産
物により阻まれ、そしてウロキナーゼの活性化を取り巻く複雑なタンパク質分解的開裂を
考慮すると、この異型のグリコシル化は効果が低く、そして能力が低い生成物を導く。
び配列番号34に表す(それぞれ図66Aおよび66B)。ウロキナーゼの変異体は当該
技術分野では周知であり、したがって本発明は本明細書に説明する配列に限定されない。
実際に当業者は例えば米国特許第5,219,569号、同第5,648,253号およ
び同第4,892,826号明細書に記載されているウロキナーゼ変異体が機能的部分と
して存在し、したがって本明細書に包含されることを容易に認識するだろう。
分野では周知である。非限定的な例として、様々な系でのウロキナーゼの発現が米国特許
第5,219,569号明細書に詳細に記載されている。本発明の方法に従い調製された
ウロキナーゼの活性および機能性を測定するためアッセイは本明細書で説明され、そして
技術文献を通して記載され、そしていたるところにあまねく記載されている他のプラスミ
ノーゲンのアッセイおよびフィブリン関連アッセイに類似している。本明細書に記載する
ように合成したウロキナーゼ分子の活性を測定するためのアッセイの1例は、例えば1.
25%アガロース、4.1mg/mlヒトフィブリノーゲン、0.3単位/mlのトロン
ビンおよび0.5μg/mlのダイズトリプシンインヒビターを含んでなるフィブリンプ
レートを使用するPloug,et al.(1957,Biochim.Biophy
s.Acta24:278−282)に記載されているアッセイであることができる。
O.ヒトDNase
本発明はさらに組換えヒトDNaseを改造および/または修飾する方法を包含する。
ヒトDNaseIは治療薬として試験され、そしてインビトロで嚢胞性線維症の粘液の粘
度を低下させることが示された。化膿した粘液は約10〜13mg/mlのDNAを含む
と測定され、イオン性ポリマーが気道流体の流動学的特性に影響を及ぼすと予想された。
したがってウシ膵臓DNaseI(DNAを分解する酵素)が粘液溶解剤として何年も前
に試験されたが、抗原性および/または混入プロテアーゼにより誘導される副作用から臨
床的実施には入らなかった。組換えヒトDNaseは現在、嚢胞性線維症のような疾患の
症状を緩和するために治療薬として使用されている。
え、ほとんどが現在使用されている哺乳動物発現系により伝えられた不適切なグリコシル
化により低下した効力による。本発明はDNaseを改造する方法を記載し、上昇した効
力およびより良い治療的結果を導く。
び配列番号40に提示する(それぞれ図67Aおよび図67B)。DNaseを含んでな
るペプチドの変異体は当該技術分野では周知である。例として米国特許第6,348,3
43号明細書は1次構造全体にわたり多数のアミノ酸置換を持つヒトDNaseを記載す
る。さらに米国特許第6,391,607号明細書は9、14、74、75および205
位に多数のアミノ酸置換を持つDNaseの超活性変異体を記載する。この例および当該
技術分野で他の周知の変異体、または将来見いだされる変異体は本発明に包含する。
び真核系で記載された。例えばPCT特許出願、国際公開第90/07572号パンフレ
ットはかなり詳細にこれらの方法を記載する。
該技術分野で周知である。例として、しかし本発明を限定するとは全く意味せずに、ヒト
DNaseIのDNA−加水分解活性を測定するアッセイを本明細書に提示する。簡単に
説明すると、2種類のプラスミド消化アッセイを使用する。第1アッセイ(「スーパーコ
イル化DNA消化アッセイ」)は、スーパーコイル化二本鎖プラスミドDNAの、弛緩し
た(ニック入り)、線状および分解形への転換を測定する。第2アッセイ(「線状DNA
消化アッセイ」)は、線状の二本鎖プラスミドDNAの分解形への転換を測定した。具体
的には、本発明の方法に従い調製したDNaseを、25mM HEPES、pH7.1
、100μg/mlウシ血清アルブミン、1mM MgCl2、2.5mM CaCl2
、150mM NaCl中に、25マイクログラム/ミリリットルのスーパーコイル化プ
ラスミドDNAまたはEcoR −消化線状化プラスミドDNAのいずれかを含んでなる
160マイクロリットルの溶液に加え、そしてサンプルを室温でインキューベーションす
る。様々な時間で、反応混合物のアリコートを取り出し、そして25mM EDTAをキ
シレンシアノール、ブロモフェノールブルーおよびグリセロールと一緒に加えることによ
り止める。止めたサンプル中のプラスミドDNAの完全性はアガロースゲルでのサンプル
の電気泳動により分析する。電気泳動後、ゲルはエチジウムブロミドの溶液で染色し、そ
してゲル中のDNAを紫外線光により視覚化する。スーパーコイル形、弛緩形および線形
のプラスミドDNAの相対的量は、ゲルを蛍光造影機で走査し(モレキュラーダイナミッ
クス(Molecular Dynamics)モデル575FluorImager)
、そしてゲルのバンド中の異なる状態に対応するDNA量を定量することにより決定する
。
P.インスリン
本発明はさらにインスリンの改造方法を含む。インスリンは、血中グルコースレベルを
調節するために膵臓のベータ小島細胞がインスリンを生産しないI型糖尿病に最も効果的
な処置であることは周知である。糖尿病の系統および非制御血中グルコースには、循環器
系および足の問題、および失明、挙げることはしないが糖尿病の悪化からもたらされるか
、または悪化のいずれかである他の様々な合併症を含む。
尿病の処置に使用された。インスリンは今では組換え的に生産されているが、成熟分子の
短い、51アミノ酸配列は多数のスルフィド結合を含んでなる複雑な構造である。インス
リンを組換え的に生産する現在の方法は、健康な非−糖尿病個体で生産されるような天然
なタンパク質との類似性を欠く生成物を生じる。本発明はこの弱点を修復することを試み
る。
列番号44に描かれている(それぞれ図68Aおよび68B)。インスリンの変異体は当
該技術分野を通して豊富に存在する。米国特許第6,337,194号明細書はインスリ
ン融合タンパク質同族体を記載し、米国特許第6,323,311号明細書はジカルボン
酸の環式無水物を含んでなるインスリン誘導体を記載し、そして米国特許第6,251,
856号明細書は多数のアミノ酸置換および親油性基を含んでなるインスリン誘導体を記
載する。当業者はインスリン誘導体の以下の例が網羅的では全くなく、単に当該技術分野
で周知な誘導体の小さい実例を表すだけであると認識するだろう。したがって本発明は既
知のおよびこれから見いだされるインスリン誘導体を含んでなる。
mbrook et al.(1989、モレキュラークローニング:ア ラボラトリー
マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク)に記載され
ているような分子生物学的技法を使用して行うことができる。
術分野では周知である。例えばグルコース抑制のインビボモデルは、本発明の方法を使用
して合成されたインスリンの生物学的活性を評価するために使用することができる。この
目的に有用であるのはラットモデルである。動物は実験前に一晩絶食させ(16時間)、
次いでペントバルビタールナトリウムまたはケタミンのような他の適当な麻酔剤を腹腔内
投与することにより麻酔をかける。各動物は特定のインスリン誘導体(20μg/ml/
kg)のi.v.注射(尾の静脈)を受ける。血液サンプルは頸静脈から注射の15およ
び5分前、および注射から15、30、60、90、120、180および240分後に
採血する。血中グルコースレベルは、種々の商業的提供源から入手可能な血液グルコース
モニターで測定する。
Q.B型肝炎ワクチン(HBsAg)
本発明はさらにB型肝炎ワクチン(HbsAgまたはB型肝炎sAg)で使用する抗原
を改造する方法を含んでなる。HBsAgはB型肝炎S−タンパク質の組換え的に生産さ
れる表面抗原であり、そしてB型肝炎ウイルス(とりわけ肝硬変および癌腫を含む肝臓疾
患を引き起こす危険なウイルスを増やし、そして世界中で年間に百万人以上の死をもたら
す)に対する免疫応答を誘導するために使用される。現在HBsAgワクチンは防御およ
び中和免疫応答を誘導するために、6カ月間の間隔で3回投与される。
を反映する。本発明はHBsAgを改造するための方法を提供し、とりわけ改善された免
疫原性、ウイルスに対して改善された親和性を有する抗体等をもたらす。
鎖配列は、本明細書中に配列番号45および配列番号46として説明する(それぞれ図6
9Aおよび69B)。ヌクレオチドは1203塩基長である。アミノ酸は400残基長で
ある。最後の226アミノ酸残基は小さいS−抗原であり、これはグラクソスミスクライ
ン(GlaxoSmithKline)のワクチンおよびメルク(Merck)のワクチ
ンに使用されている。小さいS−抗原から上流の55個のアミノ酸はプレ−S出発コドン
である。プレS+S領域は中央S抗原であり、これはアベンティス パスツール(Ave
ntis Pasteur)のワクチンに使用されている。第1出発コドンからプレ−S
出発コドンまでは残りのS−タンパク質を含んでなり、そして大きいS−タンパク質と呼
ばれている。これはワクチンに使用されているHBsAgの1例であるが、GenBan
k Acc No.に例示されているように他のサブタイプも周知である:AF4152
22、AF415221、AF415220およびAF415219。本明細書に提示さ
れた配列は単に当該技術分野で知られているHBsAgの例である。同様な抗原がB型肝
炎ウイルスの他の株から単離され、そしてワクチン候補として抗原性および能力を評価さ
れたかもしれないし、またはされなかったかもしれない。したがって本発明は既知の、ま
たは今後見いだされるB型肝炎ワクチンS−タンパク質表面抗原を包含する。
第5,851,823号明細書に記載されている。ワクチンの免疫原性に関するアッセイ
は当該技術分野では周知であり、そして中和抗体を生産するための種々の試験を含んでな
り、そしてELISA、中和アッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降等のような技法を
使用する。簡単に説明すると、効果的な抗−HBsAg抗体を検出するためのサンドイッ
チELISAが記載されている。Enzygnost HBsAgアッセイ(アベンティ
ス ベーリング(Behring)、キングオブプルシア、ペンシルバニア州)をそのよ
うな方法に使用する。ウェルは抗−HBsでコートされる。血清血漿または精製したタン
パク質および適切な対照をウェルに加え、そしてインキューベーションする。洗浄後、H
BsAgに対するペルオキシダーゼ−標識抗体を残りの抗原決定基と反応させる。非結合
酵素−結合抗体を洗浄により除き、そして固体相上の酵素活性を当該技術分野で周知な方
法により測定する。過酸化水素および発色源の酵素的に触媒される反応は、希釈した硫酸
を加えることにより止める。色の強度はサンプルのHBsAg濃度に比例し、そして未知
のサンプルの色の強度は、付随する負および正の対照血清の色の強度と分光的に比較する
ことにより得られる。
R.ヒト成長ホルモン
本発明はさらにヒト成長ホルモン(HGH)の改造方法を包含する。ヒト下垂体で分泌
されるHGHのアイソフォームは、191個のアミノ酸からなり、そして約21,500
の分子量を有する。胎盤で作られるHGHのアイソフォームはグリコシル化形である。H
GHは、とりわけ一次成長(linear growth)(体細胞発生)、哺乳期、マ
クロファージの活性化およびインスリン−様および糖尿病原性効果を含む正常なヒトの成
長および発生の調節に大いに関与している。
の結果として変動する。HGHを含んでなる組成物は臨床的な状況、特に萎縮発育症で使
用されてきたが、効力は組換え的に生産されるHGHのグリコシル化構造により制限され
ている。
ていたるところに説明する(それぞれ図70Aおよび70B)。当業者はHGHの変異体
、誘導体および突然変異体が周知であることを認識している。例は10、14、18、2
1、167、171、174、176および179位のアミノ酸残基が置換されている米
国特許第6,143,523号明細書に見いだすことができ、そして米国特許第5,96
2,411号明細書はHGHのスプライス変異体を記載する。本発明は、当該技術分野で
知られている、またはこれから見いだされるこのようなHGH変異体を包含する。
記載されている。とりわけ原核、真核、昆虫細胞系、植物、およびインビトロ翻訳系での
HGHの発現法は、当該技術分野では周知である。
な方法を使用してアッセイすることができる。例えば米国特許第5,734 024号明
細書は、発現したHGHの生物学的機能を測定する方法を記載する。
S.抗体
本発明はさらに、キメラTNFR、キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa、キメラ
抗−HER2、キメラ抗−RSV、キメラ抗−CD20およびキメラ抗−TNFを含む種
々のキメラ抗体調製物を改造する方法を含んでなる。キメラ抗体調製物は、IgG抗体に
由来するヒトのFc部分および抗原に特異的なモノクローナル抗体に由来する可変領域を
含んでなる。他の調製物はレセプター、例えばヒトIgGFc部分に融合した75kDa
のTNFレセプターを含んでなる。これらの分子はさらに、ヒトおよびマウスに由来する
軽および重鎖を含んでなるFabフラグメントを含む。キメラTNFRは、慢性関節リウ
マチのような炎症性疾患の処置に有用である。キメラ抗−糖タンパク質IIb/IIIa
は、心臓異常、血液凝固および血小板機能障害の処置に有用である。キメラ抗−HER2
は胸部癌の処理として有用であり、キメラ抗−RSVは呼吸合胞体ウイルスの処理に有用
であり、キメラ抗−CD20は非−ホジキンリンパ腫の処置に有用であり、そしてキメラ
抗−TNFはクローン病の処置に有用である。
で生産された組換えタンパク質の比較的短い半減期により、投与はかなり頻繁で、しかも
かなり高用量でなければならない。キメラ抗体のほとんどがヒトであり、したがって免疫
系により「自己」とみなされると同時に、それらは天然ではないグリコシル化パターン故
に分解、そして破壊される。本発明はこの問題を修復し、これら新規薬剤の効力を大いに
上昇させることを提案する。
抗体およびそれらの作成法
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的なエピトープに特異的な結合する
ことができる免疫グロブリン分子を称する。抗体は天然な供給源に由来するか、または組
換え源に由来する完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリン
の免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体で
ある。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、Fab
およびF(ab)2を含む種々の形態、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体で存在する
ことができる(Harlow et al.,1999,抗体を使用して(Using
Antibodies):ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー出版、ニューヨーク州;Harlow et al.,1989,抗体:ア
ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク;Houston
et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:58
79−5883;Bird et al.,1988,Science242:423−
426)。
ージにより発現された抗体のような組換えDNA技法を使用して作成された抗体を意味す
る。この用語は抗体をコードするDNA分子の合成により作成された抗体を意味すると解
釈され、そしてこのDNA分子が抗体ペプチドまたは抗体を特定するアミノ酸配列を発現
し、ここでDNAまたはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能で、しかも周知な合成D
NAまたはアミノ酸配列技法を使用して得られた。
抗体は、例えばHarlow et al.(1988,抗体:ア ラボラトリーマニュ
アルで、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)、およびTuszynki e
t al.(1988,Blood,72:109−115)に記載されているような周
知のモノクローナル抗体調製手順を使用して調製することができる。望ましいペプチドの
量は、化学的合成技法を使用しても合成することができる。あるいは所望するペプチドを
コードするDNAをクローン化し、そして大量のペプチドを作成するために適する細胞中
で適当なプロモーター配列から発現させることができる。ペプチドに対するモノクローナ
ル抗体は、本明細書で参照にしたような標準的な手順を使用して、ペプチドで免疫感作し
たマウスから作成する。
術分野で利用可能であり、そして例えばWright et al.(1992,Cri
tical Rev.in Immunol.12(3,4):125−168およびそ
こに引用されている参考文献に記載されている技術を使用してクローン化し、そして配列
決定することができる。さらに本発明の抗体はWright et al.,(同上)お
よびそこに引用されている参考文献、およびGu et al.(1997,Throm
bosis and Hematocyst 77(4):755−759)に記載され
ている技術を使用して「ヒト化」することができる。
えば発現すべき所望のペプチドを、例えば所望の抗体をファージ表面に発現するハイブリ
ドーマから単離したmRNAから得る。mRNAのcDNAコピーを逆転写酵素により生
産する。免疫グロブリンフラグメントを特定するcDNAはPCRにより得、そして生成
したDNAを適当なバクテリオファージベクターにクローン化して、免疫グロブリン遺伝
子を特定するDNAを含んでなるバクテリオファージのDNAライブラリーを作成する。
ヘテロロガスなDNAを含んでなるバクテリオファージのライブラリーを作成する手順は
当該技術分野では周知であり、そして例えばSambrook and Russell
(2001、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリ
ングハーバー、ニューヨーク州)に記載されている。
抗体が向けられる抗原に結合できる様式で、ペプチドがその表面上で表示されるように工
作することができる。このように特異的な抗体を発現するバクテリオファージが対応する
抗原を発現する細胞の存在下でインキューベーションされる時、バクテリオファージは細
胞に結合するだろう。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。そのよ
うな難しい(panning)技術は当該技術分野では周知であり、そして例えばWri
ght et al.,(同上)に記載されている。
に開発された(Burton et al.,1994,Adv.Immunol.57
:191−280)。本質的に、cDNAライブラリーは抗体−生産細胞の1群から得た
mRNAから作成する。mRNAは再配列した免疫グロブリン遺伝子をコードし、そして
すなわちcDNAはそれをコードする。増幅したcDNAをM13発現ベクターにクロー
ン化して、表面上にヒト抗体フラグメントを発現するファージのライブラリーを作成する
。問題の抗体を表示するファージは抗原の結合により選択し、そして細菌中で増殖させて
可溶性のヒト免疫グロブリンを生産させる。このように従来のモノクローナル抗体合成と
は対照的に、この手順はヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくヒト免疫グロブリン
をコードするDNAを不滅化する。
抗体分子のグリカンの改造
ペプチドの1クラス、すなわち免疫グロブリンの特異的なグリコシル化は、これらペプ
チドの生物学的活性に特に重要な効果を有する。本発明はIgGクラスの免疫グロブリン
のみに限定されると解釈すべきではなく、抗体のIgA、IgEおよびIgMクラスの免
疫グロブリンも含むと解釈すべきである。
むしろ本発明は例えば抗体のフラグメント、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体等を含む
すべての型の抗体分子を含むと解釈すべきである。
なる。免疫グロブリンの総説に関しては、;Harlow et al.,1988,抗
体:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、および
Harlow et al.,1999,抗体を使用して:ア ラボラトリーマニュアル
、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州を参照にされたい。免
疫グロブリン分子のエフェクター部分は分子のFc部分に存在し、そして免疫グロブリン
のそのコグネイト細胞レセプターへの効率的結合に一部、寄与している。免疫グロブリン
分子、特に分子のFc部分のCH2ドメイン中の不適切なグリコシル化は、免疫グロブリ
ンの生物学的活性に影響を及ぼす。
IgGがIgG分子のCH2ドメイン中のアスパラギン(Asn)297でN−グルカン
のトリマンノシルコアの分岐マンノースの4−O位に結合したN−アセルチルグルコサミ
ン(GlcNAc)残基を含むか否かに支配されている。この残基は「バイセクティング
(bisecting)GlcNAc」として知られている。バイセクティングGlcN
Acを天然なまたは組換えIgG分子もしくはIgG−Fc含有キメラ構築物のN−グリ
カン鎖に加える目的は、分子のFc部分のFc免疫エフェクター機能を至適化することに
ある。そのようなエフェクター機能には、抗体−依存性細胞傷害(ADCC)およびFc
γRレセプターへの効率的結合を必要とする他の生物学的効果、および補体のC1成分へ
の結合を含むことができる。IgG分子の最大の免疫エフェクター機能を達成するために
、バイセクティングGlcNAcの重要性が記載された(Lifely et al.,
1995,Glycobiology 5(8):813−822;Jeffris e
t al.,1990,Biochem.J.268(3):529−537)。
リカンは、ヒトおよび動物血漿中で循環中していることが分かったIgG分子、骨髄腫細
胞、ハイブリドーマ細胞および種々のトランスフェクトされた不死化哺乳動物および昆虫
細胞系により生産されるIgGについて構造的に特性が決定された。すべての場合でN−
グリカンは高マンノース鎖または完全(Man3、GlcNAc4、Gal2、NeuA
c2、Fucl)またはバイセクティングGlcNAcを持つか持たない可変性の不完全
な2アンテナ鎖のいずれかである(Raju et al.,2000,Glycobi
ology 10(5):477−486;Jeffris et al.,1998,
Immunological.Rev.163L59−76;Lerouge et a
l.,1998,Plant Mol.Biol.38:31−48;James et
al.,1995,Biotechnology13:592−596)。
。免疫グロブリン分子は限定するわけではないが、モノクローナル抗体、合成抗体、キメ
ラ抗体、ヒト化抗体等を含む任意の免疫グロブリン分子でよい。抗体分子を生成し、そし
てそれらを特徴付けるための具体的方法は、本明細書のいたるところに記載する。好まし
くは免疫グロブリンはIgGであり、そしてより好ましくはIgGはヒト化またはヒトI
gG、最も好ましくはIgG1である。
のAsn297でN−グリカンのトリマンノシルコアの分岐マンノースの4−O位にグリ
コシド結合で連結するために、インビトロの試薬としてβ1,4−マンノシル−糖ペプチ
ドβ1,4−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、GnT−III:EC2.4
.1.144を使用することを具体的に意図している。しかし本明細書に提供される開示
から、本発明がバイセクティングGlcNAcを免疫グロブリン分子に提供するためにこ
の酵素の使用だけを含むと解釈すべきではないことは明らかである。むしろ抗体分子のグ
リコシル化パターンは、抗体分子が強化された生物学的活性、すなわち他の特性、例えば
安定性等の強化の可能性に加えて、エフェクター機能を有するように調節することが可能
であることが見いだされた。
性細胞傷害性を目的として、Asn(297)N−結合グリカンからフコース分子を除去
する一般的方法を提供する(Shields et al.,2002,J.Biol.
Chem.277:26733−26740を参照にされたい)。この方法は抗体分子を
、抗体グリカン(1つまたは複数)上のフコース分子(1つまたは複数)の結合に適当な
フコシダーゼと接触させることを必要とする。あるいは組換え抗体を、CHO細胞のLe
c13変異体のようなフコシルトランスフェラーゼを発現する細胞で発現させることがで
きる。抗体のグリカン(1つまたは複数)からのフコースの除去は単独で、あるいはバイ
セクティングGlcNAcを付加するような他のグリカン改造方法と組み合わせて行うこ
とができる。GnT−Iを欠く細胞中での抗体の発現もコアフコースを欠いたFcグリカ
ンを生成し、これは本発明によりさらに修飾することができる。
分子の調製物において、Fc免疫エフェクター機能を強化する目的で、バイセクティング
GlcNAcの一般的導入法を提供する。この方法ではIgG分子の群は、グリカン鎖が
GnT−IIIの受容体となるようなグリコシル化の状態になることが必要である。これ
は3つの方法の任意の1つにより達成される:1)GnT−IIIの基質であるN−グリ
カン鎖を持つIgGを分泌する宿主発現系の選択または遺伝子操作による;2)エキソグ
リコシダーゼ処理後に残るグリカン構造(1つまたは複数)がGnT−IIIの受容体と
なるような、IgGグリコフォーム群をエキソグリコシダーゼで処理することによる;3
)上記1)および2)におけるような宿主選択およびエキソグリコシダーゼ処理の幾つか
の組み合わせに加えて、GnT−IIIの受容体を作成するためにGnT−IおよびGn
T−IIによる連続的なGlcNAcの付加。
Acをトリマンノシルコアのα1,3マンノース枝にGnT−Iにより付加するための基
質を作成するためには、1以上のα−マンノシダーゼで消化する必要がある。この基質は
基本的なトリマンノシルコア、Man3GlcNAc2であることができる。このコア構
造をUDP−GlcNAcを糖供与体として使用して、GnT−I、続いてGnT−II
、続いてGnT−IIIで順次処理することにより、図2に示すようなMan3GlcN
Ac5を生成する。場合によりこの構造はβ1,4ガラクトシルトランスフェラーゼを用
いた処理により延長することができる。必要ならばガラクトシル化オリゴ糖は、α2,3
−またはα2,6−シアリルトランスフェラーゼを用いてさらに延長して、完全な2アン
テナ状構造を達成することができる。この方法を使用して、2アンテナ状グリカン鎖は、
開発中の任意の治療用IgGの最適なFc免疫エフェクター機能に必要性であるように改
造することができる(図4)。
胞によるもしくはトランスジェニック動物による組換え産物として分泌されるIgGは、
多くは完全な(NeuAc2、Gal2、GlcNAc4、Man3、±Fucl)(図
4)およびバイセクティングGlcNAcを含むかまたは含まない変動性の不完全な形態
を含む2アンテナ状グリコフォームのスペクトルを含む(Raju et al.,20
00,Glycobiology 10(5):477−486;Jeffris et
al.,1998,Immunological Rev.163:59−76)。バ
イセクティングGlcNAcがそのように生産された免疫グロブリン分子の群全体に存在
することを確実とするために、分子の混合物を以下のエキソグリコシダーゼと連続的に、
または混合物で処理することができる:ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−
グルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼ。生成したトリマンノシルコアは次いで上記のよ
うにグリコシルトランスフェラーゼを使用して改造することができる。
より「植物体」として貯蔵されるIgGを特性決定した。β1,2結合キシロースおよび
/またはα1,3結合フコースを含むN−グリカンを有するトランスジェニック植物中で
生産されるIgG分子は、トリマンノシルコアまたはMan3GlcNAc4構造を作成
するために上記エキソグリコシダーゼに加えて、エキソグリコシダーゼで処理してそれら
残基を除去することができ、次いでそれらをグリコシルトランスフェラーゼで処理して上
記のようにN−グリカンを改造する。
、抗体のエフェクター機能を至適化するために正しい順序で適用される、適切なグリコシ
ルトランスフェラーゼの適用である。1つの例示態様では、バイセクティングGlcNA
cは、バイセクティングGlcNAcが必要なIgG分子または他のIgG−Fc−キメ
ラ構築物のグリカンに導入される。別の例示態様では、コアフコースがIgG分子または
他のIgG−Fc−キメラ構築物のグリカンから除去される。
TNFレセプター−IgG Fc融合タンパク質
75kDaのヒトTNFレセプターのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、本明細書で
それぞれ配列番号31および配列番号32として説明する(それぞれ図71Aおよび71
B)。キメラ抗−HER2の軽および重可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号3
5および配列番号36として説明する(それぞれ図72Aおよび72B)。キメラ抗−R
SVの軽および重可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号38および配列番号37
として説明する(それぞれ図73Aおよび73B)。抗−TNFの非−ヒト可変領域のア
ミノ酸配列を、本明細書中でそれぞれ配列番号41および配列番号42として説明する(
それぞれ図74Aおよび74B)。ヒトIgGのFc部分のヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を、配列番号49および配列番号50として説明する(それぞれ図75Aおよび75
B)。
MAb抗−糖タンパク質IIb/IIIa
マウス抗−糖タンパク質IIb/IIIa抗体の可変領域のアミノ酸配列を、配列番号
52(マウス成熟可変軽鎖、図76)および配列番号54(マウス成熟可変重鎖、図77
)で説明する。これらのマウス配列は、米国特許第5,777.085号明細書に見いだ
される手順に従い、ヒトIgGアミノ酸配列の配列番号51(ヒト成熟可変軽鎖、図78
)、配列番号53(ヒト成熟可変重鎖、図79)、配列番号55(ヒト軽鎖、図80)お
よび配列番号56(ヒト重鎖、図81)と組み合わせて、キメラヒト化マウス抗−糖タン
パク質IIb/IIIa抗体を作成することができる。他の抗−糖タンパク質IIb/I
IIaヒト化抗体は、米国特許第5,877,006号明細書に見いだされる。抗−糖タ
ンパク質IIb/IIIa MAb 7E3を発現する細胞系は、ATCC(マナッサス
、バージニア州)から寄託番号HB−8832で商業的に得ることができる。
MAb抗−CD20
キメラ抗−CD20抗体の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号59(マウス可変領域
軽鎖の核酸配列、図82A)、配列番号60(マウス可変領域軽鎖のアミノ酸配列、図8
2B)、配列番号61(マウス可変領域重鎖の核酸配列、図83A)および配列番号62
(マウス可変領域重鎖のアミノ酸配列、図83B)に説明する。マウス抗体をヒト化する
ために、ヒトIgG重および軽定常ドメインを含むTCAE8(配列番号57、図84A
−84E)を都合よく使用することができる。上記マウス可変領域コードDNAを、米国
特許第5,736,137号明細書に与えられた使用説明に従いTCAE8ベクターにク
ローニングすることにより、哺乳動物細胞系で形質転換した時、キメラ抗−CD20抗体
を発現するベクターが作成される(配列番号58、図85A−85E)。他のヒト化抗−
CD20抗体は、米国特許第6,120,767号明細書に見いだされる。抗−CD20
MAb C273を発現する細胞系は、ATCC(マナッサス、バージニア州)から寄託
番号HB−9303で商業的に得ることができる。
よび他のキメラ抗体の結合部分の例であると直ちに考えるだろう。さらにキメラまたは「
ヒト化」抗体を構築するための方法は当該技術分野では周知であり、そして例えば米国特
許第6,329,511号および同第6,210,671号明細書に記載されている。本
開示および当該技術分野を通して周知な方法と組み合わせて、当業者は本発明が本明細書
に開示した配列に限定されないことを認識するだろう。
,511号明細書に詳細に記載されている。発現系は原核、真核等であることができる。
さらにバキュロウイルス発現系を使用した昆虫細胞でのキメラ抗体の発現が、Putli
tz et al.(1990.Bio/Technology 8:651−654)
に記載されている。したがって融合またはキメラタンパク質をコードする核酸の発現法は
当該技術分野では周知であり、そして例えばSambrook et al.(2001
、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー出版、ニューヨーク)およびAusubel et al.(1997、
分子生物学の現在のプロトコール、グリーン&ウィリー、ニューヨーク)に記載されてい
る。
には同様に基本的操作である。競合アッセイによる抗体の親和性を決定する方法は、Be
rzofsky(J.A.Berzofsky and I.J.Berkower、1
984、基本的免疫学(Fundamental Immunology)、(W.E.
Paul編集)、ラベン(Raven)出版(ニューヨーク)、595)に詳細に記載さ
れている。簡単に説明すると、キメラ抗体の親和性はそれが由来するモノクローナル抗体
の親和性と、放射−ヨード化モノクローナル抗体を使用して比較する。
VII.製薬学的組成物
別の観点では、本発明は製薬学的組成物を提供する。製薬学的組成物には、製薬学的に
許容され得る希釈剤および天然には存在しない、水溶性ポリマー、治療部分または生体分
子とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間の共有結合物を含む。ポリマー、
治療部分または生体分子は、ペプチドとポリマー、治療部分または生体分子との間に挿入
され、そして両方を共有結合する完全なグリコシル連結基を介してペプチドに結合される
。
適する製剤は、レミングトンの製薬科学(Remington's Pharmaceu
tical Science)、メース(Mace)出版社、フィラデルフィア、ペンシ
ルバニア州、第17版、(1985)に見いだせる。薬剤送達に関する方法の簡単な総説
については、Langer,Science249:1527−1533(1990)を
参照にされたい。
内を含む任意の適切な投与様式に配合することができる。皮下注射のような非経口投与に
は、担体は好ましくは水、塩水、アルコール、脂肪、蝋またはバッファーを含んでなる。
経口投与には任意の上記の担体またはマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マ
グネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロースお
よび炭酸マグネシウムのような固体担体を使用することができる。生分解性微小球(例え
ばポリラクテートポリグリコレート)を本発明の製薬学的組成物に担体として使用するこ
ともできる。適当な生分解性微小球は、例えば米国特許第4,897,268号および同
第5,075,109号明細書に開示されている。
されうる担体、好ましくは水性担体、例えば水、緩衝化水、塩水、PBS等に溶解または
懸濁された化合物を含んでなる非経口投与用の組成物を提供する。組成物はpH調整およ
び緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤、界面活性剤等のような生理学的状態に近づけるため必
要な製薬学的に許容され得る補助物質を含むことができる。
い。生成した水溶液はそのまま使用するために包装されることができ、または凍結乾燥さ
れ、凍結乾燥された調製物は滅菌水性担体と投与前に合わせられる。調製物のpHは典型
的には3から11の間、より好ましくは5から9、そして最も好ましくは7から8である
。
ームに包含することができる。様々な方法が、例えばSzoka et al.,Ann
.Rev.Biopys.Bioeng.9:467(1980)、米国特許第4,23
5,871号、同第4,501,728号および同第4,837,028号明細書に記載
されているようにリポソームを調製するために利用可能である。様々な標的化剤(例えば
本発明のシアリルガラクトシド)を使用したリポソームの標的化は当該技術分野で周知で
ある(例えば米国特許第4,957,773号および同第4,603,044号明細書を
参照にされたい)。
らの方法は一般に、標的化剤の結合を活性化することができるホスファチジルエタノール
アミンのような脂質成分、または本発明の脂質−誘導化ペプチドのような誘導化された親
油性化合物のリポソームへの包含が関与する。
に利用できるような様式で、標的化剤をリポソームの表面上に配置することが必要である
。本発明の炭水化物は当業者に既知の方法(例えば炭水化物上に存在するヒドロキシル基
の、長鎖アルキルハライドまたは脂肪酸を用いたそれぞれアルキル化またはアシル化)を
使用して、リポソームが形成される前に脂質分子に結合することができる。あるいはリポ
ソームはコネクター部分を最初に、膜を形成する時点で膜に包含させるような様式に工夫
することができる。コネクター部分は親油性部分を持たなければならず、コネクター部分
は膜中に堅く包埋され、そしてしっかり固定される。これはまた反応性部分を持たなけれ
ばならず、反応性部分はリポソームの水性表面上で化学的に利用可能である。反応性部分
はこれが安定な化学結合を後に加える標的化剤または炭水化物と形成するために、化学的
に適するように選択される。場合により標的剤をコネクター分子に直接付けることも可能
であるが、ほとんどの場合で化学的ブリッジとして作用するための第3分子を使用するこ
とが適当であり、すなわち膜中にあるコネクター分子を、3次元的に小胞表面から離れて
伸びる標的剤または炭水化物に連結する。本発明のペプチドの投与の投薬範囲は、免疫応
答の症状がある程度の抑制を示す、所望する効果を生じるために十分に多い量である。投
薬用量は副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に投薬用量は動物の年齢、状態
、性別および疾患の程度で変動し、そして当業者により決定され得る。投薬用量は反対の
徴候の出来事で、個々の医師により調整されることができる。
は、結合物に対するポリマーの使用、複合体、またはペプチドの吸収により達成すること
ができる。制御された送達は、適当な高分子(例えばポリエステル、ポリアミノカルボキ
シメチルセルロースおよび硫酸プロタミン)および高分子の濃度ならびに放出を制御する
ための包含法を選択することにより果たすことができる。放出制御調製物により作用期間
を制御するための別の可能な方法は、ペプチドをポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲ
ル、ポリ(乳酸)またはエチレンビニル酢酸コポリマーのようなポリマー性材料の粒子に
包含させることである。
法により、または界面重合法により調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキ
シメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ(メチメタクリレート
)マイクロカプセルに、あるいはコロイド状薬剤送達系、例えばリポソーム、アルブミン
微小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルに、またはマクロエマルジョ
ンに封入することが好適である。そのような教示は、レミングトンの製薬科学(第16版
、A.Oslo編集、マック、イーストン、ペンシルバニア州、1980)に開示されて
いる。
たは天然のポリマー、および水中油型のエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム
および再封入赤血球(reseales erythrocyte)を含む脂質に基づく
系、のような標的可能な薬剤送達系での使用によく適している。これらの系は集合的にコ
ロイド状薬剤送達系として知られている。典型的にはそのような分散したペプチドを含有
するコロイド状粒子は、直径約50nm〜2μmである。コロイド状粒子のサイズは、そ
れらが注射によるように静脈内に、またはエーロゾルとして投与できるようにする。コロ
イド系の調製物に使用する材料は典型的には、濾過滅菌を介して滅菌可能な、非毒性の、
生分解可能な、例えばアルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシチン、
リン脂質およびダイズ油である。ポリマー性のコロイド系はマイクロカプセル化のコアセ
ルベーションに類似する方法により調製される。
脂質が水性媒質にゆるやかに分散した時、それらは膨潤し、水和し、そして脂質二重層を
分ける水性媒質の層を含むマルチラメラ同心二重層小胞(multilamellar
concentric bilayer vesicle)を天然に形成する。そのよう
な系は通常、多重層リポソームまたは多重層小胞(MLV)と呼ばれ、そして約100n
mから約4μmの範囲の直径を有する。MLVが超音波処理される時、直径が約20〜約
50nmの範囲の小1枚膜リポソーム(SUVS)が形成され、これはSUVのコアに水
溶液を含む。
コリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンのようなホスファ
チジル化合物を含む。特に有用であるのは、ジアシルホスファチジルグリセロールであり
、ここで脂質部分は14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含み、そし
て飽和されている。具体的例のリン脂質には卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイル
ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
チドの不安定性(lability)、生成されるリポソーム群の均一性およびサイズ、
ペプチド−対−脂質比、調製物の浸透不安定性、および製剤の製薬学的な許容性のような
変数を考慮すべきである。Szoka,et al.,Annual Review o
f Biophysics and Bioengineering,9:467(19
80);Deamer,et al.,リポソーム(LIPOSOME)で、マルセルデ
ッカー、ニューヨーク、1983、27:Hope et al.,Chem.Phys
.Lipids,40:89(1986)。
肉内、皮下、腹腔内、血管内、局所的、空隙内、経皮的、鼻内、および吸入のような種々
の方法で投与することができる。ペプチドの濃度は特定の応用、疾患の性質、投与頻度等
により変動するだろう。標的化送達系−カプセル化ペプチドは、適当な他の化合物および
水性の生理学的に許容され得る媒体、例えば塩水、リン酸緩衝化生理食塩水等を含んでな
る製剤で提供され得る。
る。例えば標識した化合物は炎症を有することが疑われる患者の炎症または腫瘍の転移の
領域を決めるために使用することができる。この使用のために、化合物は125I、14
Cまたはトリチウムで標識することができる。
実験例
本発明をこれから以下の実施例を参照にして記載する。これらの実施例は具体的説明の
目的のみに提供し、そして本発明がこれらの実施例に限定されるべきでは全くなく、むし
ろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更を包含すると解
釈すべきである。
A.グリコシル化
この実施例で提示するこの実験に使用する材料および方法をこれから記載する。
1.TP10のシアリル化およびフコシル化
この実施例は、シアリルルイスX部分を用いたTP10の調製および強化された生物学
的活性の分析を説明する。
小血管内に炎症性の反応を誘発する可能性がある。天然に生じる組織傷害は、炎症および
凝固カスケードの両方の活性化により増幅する。発作のマウスモデルでは、P−セレクチ
ンおよびICAM−1の発現増加が白血球の動員(recruitment)を促進する
。sCR1は補体受容体−1(CR−1)の細胞外ドメインの組換え形である。sCR−
1は補体活性化の有力なインヒビターである。sCR1sLeX(CD20)は、選択的
に(alternately)グリコシル化されてシアリル化ルイスX抗原を表示する選
択的にグリコシル化されたsCR1形態である。以前は、工作されたLec11 CHO
細胞中でインビボで発現され、そしてグリコシル化されたsCR−1sLeXが虚血性の
大脳微小血管およびC1q−発現ニューロンに正しく局在することが見いだされ、これに
より好中球および血小板の蓄積を阻害し、そして大脳の梗塞容量を減少させた(Huan
g et al.,1999,Science 285:595−599)。本実施例で
は、グリカンを改造することによりインビトロで調製されたsCR1sLeXが、インビ
ボでグリコシル化されたsCRsLeXと同様の強化された生物学的活性を現した。
型的なCHO細胞のグリコシル化を有するTP10ペプチドを生産し、すべてではないが
多くのグリカンがシアル酸でキャップされている。
M)およびST3Gal3(0.1U/mL)を32℃で、50mM Tris、0.1
5M NaCl、0.05%アジ化ナトリウム、pH7.2中で48時間、インキューベ
ーションした。放射性標識したCMPシアル酸を少量のアリコートに加えて取り込みを監
視した。TP10はSEC HPLCによりヌクレオチド糖から分離した。24時間およ
び48時間で分析したサンプルは、反応が24時間後には完了したことを示した。次いで
反応混合物を凍結した。反応生成物をフルオロフォア支援炭水化物電気泳動(Fluor
ophore Assisted Carbohydrate Electrophor
esis)(FACE(商標);グリコ社、ノバト、カリフォルニア州)分析にかけた(
図86)。
ル化または後シアリル化TP10ペプチドは、各処置で(n=3)尾の静脈注射を介して
3匹のラットに与えた。14の血液サンプルを0〜50時間で採血した。血液中の後シア
リル化TP10ペプチドの濃度は、前シアリル化TP10よりも0時間以降、いつも高か
った(図87)。シアル酸の付加は出発原料に比べて、薬物動態学的曲線の血漿濃度−時
間曲線下の面積(AUC)を二倍にした(図88)。
P10)を解凍し、そしてGDP−フコースを5mMまで、MnCl2を5mMまで、そ
してFTVI(フコシルトランスフェラーゼ)を0.05U/mLまで加えた。反応物は
32℃で48時間インキューベーションした。反応生成物をフルオロフォア支援炭水化物
電気泳動((FACE(商標);グリコ社、ノバト、カリフォルニア州)分析にかけた(
図89)。少量のアリコートに放射性標識したGDP−フコースを加え、取り込みを監視
した。TP10はSEC HPLCによりヌクレオチド糖から分離した。24時間および
48時間で分析したサンプルは、反応が24時間後には完了したことを示した。E−セレ
クチンへの結合を測定するインビトロアッセイは、フコースの付加が生物学的に活性なE
−セレクチンリガンドを生成できることを示す(図90)。
2.組換え糖タンパク質のシアリル化
この実施例では、数種の組換えペプチドのシアリル化形態の調製を説明する。
はそれらが組換えラットST3GalIIIによりシアリル化される能力について調査さ
れた。これら各々の糖タンパク質について、シアリル化は市販品としての各糖タンパク質
の開発において、貴重な方法となるであろう。
7℃の間の温度で24時間行った。シアリル化の程度は糖タンパク質−結合オリゴ糖に取
り込まれた14C−NeuAcの量を測定することにより確立した。各タンパク質に関す
る反応条件については表9を参照にされたい。
−NeuAcの生成を指す(20mM NeuAcおよび2mM CMP)。バッファー
は0.1M HEPES、pH7.5であった。
ル化が各々の場合で達成されたことを示す。本質的に利用可能な末端ガラクトースの推定
に基づき、完全なシアリル化が得られた。表10はシアリル化反応の結果を示す。様々な
実験を比較する基礎として、1mgのタンパク質あたり酵素量を使用した(mU/mg)
。示す幾つかの実施例では、mgのタンパク質あたりわずか7〜13mUのST3Gal
IIIが24時間後に本質的に完全なシアリル化を与えるために必要であった。
オリゴ糖上の末端(露出)Gal含量。
2遊離放射性標識前駆体からゲル濾過により分離した後に、14C−NeuAcの取り込
みにより測定された取り込まれたNeuAc。
3%Rxnは理論的な最大値として末端Gal含量に基づく反応の%完成を示す。
4アンチトロンビンIII。
5α1アンチトリプシン。
ル化を与え、そして1070mU/mgのタンパク質が約85〜90%のシアリル化を与
えるウシST6Galを用いた実験で詳細に報告した結果とは顕著な対照をなす。Pau
lson et al.(1977)J.Biol.Chem.252:2363−23
71;Paulson et al.(1978)J.Biol.Chem.253:5
617−5624。別の群によるラットα2,3およびα2,6シアリルトランスフェラ
ーゼの実験は、アシアロ−AGPの完全なシアリル化に、150〜250mU/mgタン
パク質の酵素濃度が必要であることが明らかとなった(Weinstein et al
.(1982)J.Biol.Chem.257:13845−13853)。これらの
初期の実験と一緒にすると、ST6GalIシアリルトランスフェラーゼは、完全なシア
リル化を達成するために50mU/mgより高く、そして最高150mU/mgが必要で
あることを示唆した。
ンパク質のシアリル化には予想されるよりもはるかに少ない酵素が必要であるとを示す。
1キログラムの規模の反応については、初期の実験が示した100,000〜150,0
00単位の代わりに約7,000単位のST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼ
が必要となる。天然な供給源からのこれら酵素の精製は禁じられており、1〜2カ月の作
業の後の大規模調製についてわずか1〜10単位の収量である。ST6GalIおよびS
T3GalIIIシアリルトランスフェラーゼの両方が組換えシアリルトランスフェラー
ゼとして生産され、2つの酵素で等レベルの発現が達成されると仮定すると、ST3Ga
lIIIシアリルトランスフェラーゼに対して14〜21倍より大きな発酵規模(または
それ以上)が、ST6GalIシアリルトランスフェラーゼでは必要となるだろう。ST
6GalIシアリルトランスフェラーゼについては、酵母で0.3U/リットルの発現レ
ベルが報告された(Borsig et al.(1995)Biochem.Biop
hys.Res.Commun.210:14−20)。ST3GalIIIシアリルト
ランスフェラーゼの1000U/リットルの発現レベルが、アスペルギルス ニガー(A
spergillus niger)で達成された。現行の発現レベルで、ST6Gal
Iシアリルトランスフェラーゼを使用して1kgの糖タンパク質をシアリル化するために
十分な酵素を生産するためには、300〜450,000リットルの酵母の発酵が必要で
ある。対照的にアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)の10
リットル未満の発酵が、ST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼを使用した1k
gの糖タンパク質のシアリル化には必要となるだろう。このように大規模シアリル化反応
のためのST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼを生産するために必要とされる
発酵能力は、ST6Galを生産するために必要とされるものより10〜100倍低くな
るだろう;シアリルトランスフェラーゼの生産コストは比例して減少するだろう。
3.シアリルルイスXを作成するためのフコシル化
この実施例は、N−結合シアリルルイスX抗原を持つ組織組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター(TPA)の調製を説明する。
を含むことが多いが、完全なシアリル化を確実にするために、最初にインビトロでシアリ
ル化を行うことが有利である。適当なバッファー(最も好ましくはpH5.5から9の間
、例えばTris緩衝化塩溶液、pH7.2)中のTPAを、CMPシアル酸およびシア
リルトランスフェラーゼと、シアル酸を欠く任意のグリカンがシアリル化された種に転換
するために十分な時間、インキューベーションする。典型的な条件は1mg/mL TP
A、3mM CMPシアル酸、0.02U/mLST3Gal3、32℃で24時間とな
るだろう。微生物の成長は滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリウムを包含するどち
らかにより止めることができる。TPA濃度は最も好ましくは0.1mg/mLからペプ
チドの溶解限界の範囲である。CMP−SAの濃度も、利用可能な部位を越えて過剰にあ
るように十分となるべきであり、そして50μMから50mMまでの範囲、そして2℃か
ら40℃までの温度となるだろう。完全な反応に必要な時間は温度、受容体基質に対する
酵素の相対的量、供与体基質濃度、およびpHに依存するだろう。2,3結合でシアル酸
を加えることができる他のシアリルトランスフェラーゼにはST3Gal4を含み;微生
物トランスフェラーゼも使用することができる。
フコース、0.02U/mL FTVI、5mM MnCl2、32℃で24時間、Tr
is緩衝化塩中となるだろう。微生物の成長は滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリ
ウムを包含することにより抑えることができる。TPA濃度は最も好ましくは0.1mg
/mLからペプチドの溶解限界の範囲である。GDP−フコースの濃度も、利用可能な部
位を越えて過剰にあるように十分となるべきであり、そして50μMから50mMまでの
範囲、そして2℃から40℃までの温度となるだろう。完全な反応に必要な時間は温度、
受容体基質に対する酵素の相対的量、供与体基質濃度、およびpHに依存するだろう。シ
アリルルイスxを作成することができる他のフコシルトランスフェラーゼにはFIVII
、FTV、FTIIIを含み;ならびに微生物トランスフェラーゼも使用することがで
きる。
4.高マンノースのトリ−マンノースコア構造への改作;CHOで生産された組織プラス
ミノーゲンアクチベーター
この実施例は、高マンノースグリカンからの戻し改作によりトリマンノースコアを持つ
組織プラスミノーゲンアクチベータの調製を説明する。
(CHO)細胞で生産され、そして少量の高マンノースN−結合オリゴ糖を含む。マンノ
ースは種々の特異的マンノシダーゼを使用して改作される(trimmed down)
ことができる。第1段階はMan9GlcNAc2(Fuc0−1)からMan5Glc
NAc2(Fuc0−1)を生成することである。これはマンノシダーゼIを使用して行
うことができる。GlcNAcT1(GlcNAcトランスフェラーゼI)を使用してG
lcNAc1Man5GlcNAc2(Fuc0−1)を作成するか、またはマンノシダ
ーゼIIIを使用してMan3GlcNAc2(Fuc0−1)を作成する。Man3G
lcNAc2(Fuc0−1)から、GlcNAc1Man3GlcNAc2(Fuc0
−1)はGlcNAcTIを使用して生成することができ、あるいはGlcNAc1Ma
n5GlcNAc2(Fuc0−1)から、GlcNAc1Man3GlcNAc2(F
uc0−1)はマンノシダーゼIIを使用して生成することができる。次いでGlcNA
c1Man3GlcNAc2(Fuc0−1)は、GlcNAcトランスフェラーゼII
(GlcNAcTII)を使用してGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc0−
1)に転換される。次いで2つの末端GlcNAc残基をGalTIを使用してガラクト
シル化し、次いでSA−PEGでST3GalIIIを使用してシアリル化する。
る材料には必要である。
5.GlcNAcのEPOへの付加
この実施例は、GlcNAc残基のトリマンノシルコア上への付加を説明する。
(プロテインサイエンス(Protein Sciences)、メリデン、コネチカッ
ト州)。EPOのトリ−マンノシルグリコフォームから「トリ−マンノシルコア+2Gl
cNAc」への100%の転換(ピーク1、図91のP1)は、32℃で100mU/m
lのGlcNAcT−Iおよび100mU/mlのGlcNAcT−IIと24時間、以
下の反応最終濃度でインキューベーションすることにより達成された:
100mM MES pH6.5、または100mM Tris pH7.5
5mM UDP−GlcNAc
20mM MnCl2
100mU/ml GlcNAcT−I
100mU/ml GlcNAcT−II
1mg/ml EPO(精製され、Sf9細胞で発現した、
プロテインサイエンスから購入)
グリコフォームの分析。このアッセイはK−R Anumula and ST Dh
ume,Glycobiology8(1998)685−69のわずかな変法である。
N−グリカナーゼ(PNGase)放出N−グリカンを、アントラニル酸で還元的に標識
した。還元的にアミノ化したN−グリカンをShodex Asahipak NH2P
−50 4Dアミノカラム(4.6mmx150mm)に注入した。2つの溶媒を分離に
使用した:A)水中、5(容量/容量)%酢酸、1%テトラヒドロフラン、および3%ト
リエチルアミン、およびB)アセトニトリル中、2%酢酸および1%テトラヒドロフラン
。次いでカラムを70%Bで2.5分間のイソクラティック溶出、続いて97.5分間に
わたり70から5%Bに進行する直線勾配、そして最後に5%Bで15分間のイソクラフ
ィック溶出により溶出した。溶出したピークは、230nmの励起、そして420nmの
発光波長で蛍光検出を使用して検出した。
反応の生成物は26.3分の保持時間を有する。出発原料はコアGlcNAcを持つ排他
的なトリマンノシルコアであった(図91)。
6.高マンノースN−グリカンのハイブリッドおよび複合(complex)N−グリカ
ンへの改造:ウシ膵臓RNase
この実施例はハイブリッドまたは複雑なN−グリカンを持つウシ膵臓RNaseの調製
について説明する。RNaseの高マンノースN−結合グリカンを酵素的に消化し、そし
てハイブリッドN−結合グリカンを作成するために仕上げる(elaborated)。
さらにRNaseの高マンノースN−結合グリカンを酵素的に消化して、複合N−結合グ
リカンを作成するために仕上げる。
リコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用してハイブリッドまたは複合形態に修飾
することができる。この例はモデル基質として単純なN−グリカンを使用してそのような
試みがもたらした結果をまとめる。
ノ酸残基からなる糖ペプチドである。これは高マンノース構造で修飾された1つのN−グ
リコシル化部位を有する。その単純さおよび低分子量(13.7kDa〜15.5kDa
)故に、リボヌクレアーゼBは高マンノース構造からハイブリッドまたは複合N−結合オ
リゴ糖へN−グリカンを改造する可能性を証明する良い候補である。RNaseBのMA
LDI−TOFスペクトルおよびN−グリカナーゼによるRNaseBから開裂されたオ
リゴ糖のHPLCプロフィール(図92)は、非−修飾ペプチドの小部分以外、ペプチド
のN−グリコシル化部位の大部分が5〜9マンノース残基からなる高マンノースオリゴ糖
で修飾されていることを示した。
グリカンは、図93に示すようにα1,2−マンノシダーゼ、GlcNAcT−I(β−
1,2−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、GalT−I(β1,4−
ガラクトシルトランスフェラーゼ)およびα2,3−シアリルトランスフェラーゼ/また
はα2,6−シアリルトランスフェラーゼの組み合わせを使用してハイブリッドN−グリ
カンに転換した。
。
reesei)からクローン化された単一のα1,2−マンノシダーゼにより触媒された
Man5−9GlcNAc2−Rから得た(図94)。RNaseB(1g、約67マイ
クロモル)を30℃で45時間、15mUの組換えT.レーゼイ(reesei)のα1
,2−マンノシダーゼと、10mLの総容量のMESバッファー(50mM、pH6.5
)中でインキューベーションした。Man6−9GlcNAc2−タンパク質構造は、組
換えマンノシダーゼにより高効率でMan5GlcNAc2−タンパク質に成功裏に転換
された。
llus saitoi)から精製した単一のα1,2−マンノシダーゼにより触媒され
たMan5−9GlcNAc2−Rから得た(図95)。RNaseB(40μg、約2
.7ナノモル)を37℃で42.5時間、25μUの市販のA.サイトイ(saitoi
)のα1,2−マンノシダーゼ(グリコまたはカルビオケム)と、20μlの総容量のN
aOAcバッファー(100mM、pH5.0)中でインキューベーションした。Man
6−9GlcNAc2−タンパク質構造は、市販のマンノシダーゼによりMan5Glc
NAc2−タンパク質に成功裏に転換された。しかしGlcNAc−タンパク質に対応す
る新規ピークがスペクトル中に表れ、調製物中にエンドグリコシダーゼHの混入の可能性
を示す。数種の哺乳動物アルファ−マンノシダーセがこの工程を行うために必要であった
が、真菌のα1,2−マンノシダーゼはすべてのα1,2−結合マンノース残基を除去す
るために大変効率的であった。
た(図96)。RNaseB(600μg、約40ナノモル)を含むT.レーゼイ(re
esei)のα1,2−マンノシダーゼ反応後の反応混合物を、非−精製組換えGlcN
AcT−I(34mU)と、MnCl2(20mM)およびUDP−GlcNAc(5m
M)を含有する400μlの総容量のMESバッファー(50mM、pH6.5)中で、
37℃で42時間、インキューベーションした。GlcNAc残基は組換えGlcNAc
T−IによりMan5GlcNAc2−タンパク質に定量的に加えられた。
g、約8ナノモル)を含むGnT−I反応後の反応混合物を37℃で20時間、3.3m
Uの組換えGalT−1と、UDP−Gal(7.5mM)およびMnCl2(20mM
)を含有する100μlの総容量のTris−HClバッファー(100mM、pH7.
3)中でインキューベーションした。Gal残基を約98%のGlcNAc−Man5G
lcNAc2−タンパク質に、組換えGalT1により加えた。
フェラーゼを使用したシアル酸の付加であった(図98)。例としてST3GalIII
、α2.3−シアリルトランスフェラーゼを使用した。RNaseB(13μg、約0.
87ナノモル)を含むGalT−I反応後の反応混合物を37℃で16時間、8.9mU
の組換えST3GalIIIと、CMP−シアル酸(5mM)およびMnCl2(20m
M)を含有する20μlの総容量のTris−HClバッファー(100mM、pH7.
3)中でインキューベーションした。シアル酸残基を約90%のGal−GlcNAc−
Man5GlcNAc2−タンパク質に、組換えST3GalIIIにより供与体として
CMP−SAを使用して加えた。収量は反応条件を調整することによりさらに改善するこ
とができる。
いことには、GalT1およびST3GalIIIは1ポット反応で組み合わせることが
できる。別個の反応と比べて同様な収量が得られた。RNaseB(60μg、約4ナノ
モル)を含むGlcNAcT−I反応後の反応混合物を37℃で20時間、1.7mUの
組換えGalT1、9.8mUの組換えST3GalIIIと、UDP−Gal(7.5
mM)、CMP−シアル酸(5mM)およびMnCl2(20mM)を含有する60μl
の総容量のTris−HClバッファー(100mM、pH7.3)中でインキューベー
ションした。
れた。RNaseB(6.7μg、約0.45ナノモル)を含むGalT−I反応後の反
応混合物をH2Oに対して1時間、室温で透析し、そして37℃で15.5時間、55m
Uの組換えST3GalIIIと、CMP−SA−PEG(10KDa)(0.25mM
)およびMnCl2(20mM)を含有する20μlの総容量のTris−HClバッフ
ァー(50mM、pH7.3)中でインキューベーションした。PEG−修飾シアル酸残
基はGal−GlcNAc−Man5GlcNAc2−ペプチドに、組換えST3Gal
IIIにより成功裏に加えられた。収量は反応条件を調整することによりさらに改善する
ことができる。
GlcNAcβ1,2−Man3GlcNAc2−ペプチド中間体を得る。図100に示
すように、Man5GlcNAc2−ペプチドからこの中間体への反応を行うために少な
くとも4つの可能な経路がある。
ペプチドは、1つのGlcNAcを加えるGlcNAcトランスフェラーゼI(GlcN
AcT−I、酵素2)の基質である。GlcNAcMan5GlcNAc2−ペプチドの
末端α1,3−およびα1,6−結合マンノース残基を、ゴルジα−マンノシダーゼII
(ManII、酵素5)により除去する。この経路は高等な生物で行われるN−結合オリ
ゴ糖のプロセッシングに関する天然な経路の一部である。
、次いでGlcNAcをGlcNAcT−I(酵素2)により加える。天然の受容体Ma
n5GlcNAc2−R以外では、GlcNAcT−IはMan3GlcNAc2−Rも
その基質として認識し、そして1つのGlcNAcをマンノースコア構造に加えて、Gl
cNAcMan3GlcNAc2−ペプチドを形成する。
いてGlcNAcをGlcNAcT−Iにより加え、そして末端α1,3−結合マンノー
スをα1,3−マンノシダーゼにより除去する。得られた実験データから、GlcNAc
T−IはこのMan4GlcNAc2−ペプチドを受容体として認識し、そして1つのG
lcNAc残基を加えてGlcNAcMan4GlcNAc2−ペプチドを形成する。
ゼにより除去し、続いてGlcNAcT−I反応を行う。次いで末端α1,6−結合マン
ノースをα1,6−マンノシダーゼにより除去することができる。
ノースに加える原因である)、およびGlcNAcT−II(第2のGlcNAcβ1,
2−結合をマンノースコアのα1,6−マンノースに加える原因である)の機能後、Gl
cNAc2Man3GlcNAc2−ペプチドをGalT1およびシアリルトランスフェ
ラーゼにより処理して、2アンテナ状の複合N−グリカンを形成することができる。Gl
cNAcT−IV、GlcNAcT−Vおよび/またはGlcNAcT−VIのような他
のGlcNAcトランスフェラーゼ(図100および図101)も、GlcNAc2Ma
n3GlcNAc2−ペプチドをグリコシル化することができる。GalT1およびシア
リルトランスフェラーゼによるさらなるグリコシル化は、多アンテナ状の複合N−グリカ
ンを形成する。酵素GlcNAcT−IIIはバイセクティングGlcNAcの挿入を触
媒し、したがってManII、GlcNAcT−II、GlcNAcT−IVおよびGl
cNAcT−Vの作用を防止する。
7.多アンテナ状の複合グリカンを持つEPOの調製
この実施例は、昆虫細胞が発現したEPOからPEG化された2アンテナ状EPO、お
よび3アンテナ状のシアリル化されたEPOの調製を説明する。
ト州)からの組換えヒトエリトロポエチン(rhEPO)をグリカン分析に供し、そして
生成したグリカンは主にコアフコースを持つトリマンノシルコアであり、わずかな割合の
グリカンが1つのGlcNAcも有する(EPO1)ことが示された。
hEPO(1mg/mL)をGnT−IおよびGn−II、5mM UDP−glcNA
c、20mM MnCl2および0.02%アジ化ナトリウムと、100mM MES
pH6.5中で32℃で24時間インキューベーションした。ロットAは20mgのEP
Oおよび100mU/mLのGnT−Iおよび60mU/mLのGnT−IIを含んだ。
ロットBは41mgのEPOおよび41mU/mLのGnT−I+50mU/mLのGn
T−IIを含んだ。反応後、サンプルはゲル濾過(PD10カラム、ファルマシアLKB
バイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)により脱塩した。
Anumula and Dhume,Glycobiology8(1998)685
−69のわずかな変法である。還元的にアミノ化したN−グリカンを、Shodex A
sahipak NH2P−50 4Dアミノカラム(4.6mmx150mm)に注入
した。2つの溶媒を分離に使用した、A)水中、5(容量/容量)%酢酸、1%テトラヒ
ドロフラン、および3%トリエチルアミン、およびB)アセトニトリル中、2%酢酸およ
び1%テトラヒドロフラン。次いでカラムを70%Bで2.5分間のイソクラティック溶
出、続いて100分間にわたり70から5%Bに進行する直線勾配、そして最後に5%B
で20分間のイソクラティック溶出により溶出した。溶出したピークは、230nmの励
起、そして420nmの発光波長で蛍光検出を使用して検出した。非−シアリル化N−結
合グリカンは、23〜34分のLC範囲にあり、モノシアル化は34〜42分、ジシアリ
ル化は42〜52分、トリシアリル化は55〜65分、そしてテトラシアリル化は68〜
78分にある。
lcNAcを持つ2アンテナ状の構造(1つのGlcNAcを有するバランス)に転換さ
れたことが分かった。ロットBは所望の生成物に97%転換されたことが示された(図1
02Aおよび102B)。
成物からEPO(ロットBの1mg/mL)を、PD−10カラムで脱塩し、そして続い
て濃縮した後、10mU/mLのGnT−Vおよび5mM UDP−GlcNAcと、5
mM MnCl2および0.02%アジ化ナトリウムを含有する100mM MES p
H6.5中で32℃にて24時間インキューベーションした。2AA HPLC分析では
転換が92%の効率で起こったことが示された(図103)。
O(1mg/mL)を0.1U/mLのGalT1、5mM UDP−ガラクトース、5
mM MnCl2と32℃にて24時間インキューベーションした。
還元的に標識したEPOからのPNGase放出N−グリカンの小アリコートを、水上に
浮いたMF−ミリポア膜フィルター(0.025μm孔、47mm直径)で45分間、透
析した。透析したアリコートをスピードバック(speedvac)中で乾燥させ、少量
の水に再溶解し、そして水/アセトニトリル(50:50)に溶解した2,5−ジヒドロ
キシ安息香酸(10g/L)溶液と混合した。混合物を標的上で乾燥させ、そして直線/
陰−イオンモードで操作したアプライドバイオシステムズ(Applied Biosy
stems)のDE−Pro MALDI−TOFマススペクトロメトリーを使用して分
析した。オリゴ糖を観察された質量−対−荷電比および文献の手順に基づき割り当てた。
位に定量的に加えられたことを示した(図104)。上記からのガラクトシル化EPOを
次いでSuperdex1.6/60カラムでのゲル濾過により50mM Tris、0
.15M NaCl、pH6中で精製した。
mg/mL)をST3Gal3(0.05U/mL)およびCMP−SA(3mM)と、
0.02%のアジ化ナトリウムを含む50mM Tris、150mM NaCl、pH
7.2中でインキューベーションした。別個のアリコートは放射性標識CMP−SAを含
んだ。生じた取り込み標識および遊離標識は、イソクラティックなサイズ排除クロマトグ
ラフィー/HPLCにより、0.5mL/分で45%MeOH、0.1%TFA(7.8
mmx30cmカラム、粒子サイズ5μm、TSK G2000SWXL、トーソーハー
ス(Toso Haas)、アンシステクノロジーズ(Ansys Technolog
ies)、レイクフォレスト、カリフォルニア州)中にて分離した。この手順を使用して
、12%のカウントが取り込まれた(360マイクロモル、33マイクロモルのEPOで
、すなわち約10.9モル/モル)。理論的(3N−結合部位、3−アンテナ状)は約9
モル/モルの取り込みである。これらはこの方法の限界に相当する。ST3Gal3の代
わりにST6Gal1を用いた同一反応では、5.7%の放射性標識、すなわちST3G
al3に比べて約48%がガラクトシル化EPOに取り込まれた。
B.グリコPEG化
8.CMP−SA−PEGの調製
この実施例はCMP−SA−PEGの調製を説明する。
ピラノースの調製。N−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル(3.125g、10.2ミリモル)を、D−マンノサミン−HCl(2
g、9.3ミリモル)およびトリエチルアミン(1.42mL、10.2ミリモル)を含
む溶液(10mLのMeOHおよび6mLのH2Oに溶解)に加えた。反応物を室温で1
6時間撹拌し、そしてロト蒸発(rotoevaporation)を使用して濃縮した
。クロマトグラフィー(シリカ、10%MeOH/CH2Cl2)は1.71g(50%
収率)の生成物を白色固体として得た:Rf=0.62 (シリカ;CHCl3:MeOH:H2O,6/4/1); 1HNM
R(CD3OD, 500 MHz)3.24- 3.27(m, 2H), 3.44(t, 1H), 3.55(t, 1H), 3.63-3.66 (m, 1H),
3.76-3.90 (m, 6H), 3.91 (s, 2H), 4.0 (dd, 2H), 4,28(d, 1H, J=4.4), 4.41 (d, 1H,
J=3.2), 5.03 (s, 1H), 5.10 (m, 3H), 7.29-7.38 (m, 10H)。
−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネートの調製。2−(N−ベンジルオ
キシカルボキサミド)グリシルアミド−2−デオキシ−D−マンノピラノース(1.59
g、4.3ミリモル)を、0.1M HEPES(12mL、pH7.5)およびピルビ
ン酸ナトリウム(4.73g、43ミリモル)の溶液に溶解した。ノイラミン酸アルドラ
ーゼ(0.1M NaClを含有する45mLの10mMリン酸緩衝化溶液、pH6.9
中、540Uの酵素)、および反応物混合物を37℃で24時間加熱した。次いで反応混
合物を遠心し、そして上清をクロマトグラフィーにかけた(C18シリカ、H2O(10
0%)から30% MeOH/水への勾配)。適切な画分をプールし、濃縮し、そして残
渣をクロマトグラフィーにかけた(シリカ、10%MeOH/CH2Cl2からCH2C
l2/MeOH/H2O 6/4/1への勾配)。適切な画分を集め、濃縮し、そして残
渣を水に再懸濁した。凍結乾燥後、生成物(1.67g、87%収率)を白色固体として
得た:Rf=0.26 (シリカ, CHCl3/MeOH/H2O 6/4/1); 1HNMR (D2O, 500MHz) 1.82 (t, 1H),
2.20 (m, 1H), 3.49 (d, 1H), 3.59 (dd, 1H), 3.67-3.86 (m, 2H), 3.87 (s, 2H), 8.89
-4.05 (m, 3H), 5.16 (s, 2H), 7.45 (m, 5H)。
ピラノスロネートの調製。5−(N−ベンジルオキシカルボキサミド)グリシルアミド−
3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート(1.
66g、3.6ミリモル)を、20mLの50%水/メタノールに溶解した。フラスコを
繰り返し真空とし、そしてアルゴン下に置き、次いで10%Pd/C(0.225g)を
加えた。繰り返し真空にした後、次いで水素(約1気圧)をフラスコに加え、そして反応
混合物を18時間撹拌した。反応混合物はセライト(celite)を通して濾過し、ロ
ータリーエバポレーションにより濃縮し、そして凍結乾燥させて1.24g(100%収
率)の生成物を白色固体として得た:Rf=0.25 (シリカ, IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR
(D2O, 500 MHz) 1.83 (t, 1H, J=9.9), 2.23 (dd, 1H, J=12.9, 4.69), 3.51-3.70 (m, 2
H), 3.61 (s, 2H), 3.75-3.84 (m, 2H), 3.95-4.06 (m, 3H)。
ド)グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌ
ロピラノスロネート]の調製。20mLのH2Oに溶解した5−グリシルアミド−3,5
−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート(0.55g
、1.70ミリモル)の溶液を、Tris(1.38g、11.4ミリモル)、1M M
gCl2(1.1mL)およびBSA(55mg)の溶液に加えた。溶液のpHを1M
NaOH(2mL)で8.8に調整し、そしてCTP−2Na+(2.23g、4.2ミ
リモル)を加えた。反応混合物のpHは、必要に応じて1M NaOHを送るpHコント
ローラーで制御してpH8.8を維持した。融合タンパク質(シアリルトランスフェラー
ゼ/CMP−ノイラミン酸シンテターゼ)を溶液に加え、そして反応混合物を室温で撹拌
した。2日後、さらなる量の融合タンパク質を加え、そして反応物をさらに40時間撹拌
した。反応混合物をEtOH中で沈殿させ、そして沈殿物を冷EtOHで5回洗浄して、
2.3グラムの白色固体を得た。約1.0gの粗生成物を1,4−ジオキサン(4mL)
、H2O(4mL)および飽和NaHCO3(3mL)に溶解し、そして2mlのジオキ
サンに溶解したFMOC−Cl(308mg、1.2ミリモル)の溶液を滴下した。室温
で16時間撹拌した後、反応混合物はロータリーエバポレーションにより約6mLに濃縮
し、そしてクロマトグラフィー(C18シリカ、100%H2Oから30%MeOH/H
2Oへの勾配)を使用して精製した。適切な画分を合わせ、そして濃縮した。残渣を水に
溶解し、そして凍結乾燥して253mgの白色固体を得た:Rf=0.50 (シリカ, IPA/H2O/N
H4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) 1.64 (dt, 1H, J=12.0, 6.0), 2.50 (dd, 1H, J=1
3.2, 4.9), 3.38 (d, J=9.67, 1H), 3.60 (dd, J=11.65, 6.64, 1H), 3.79 (d, J=4.11,
1H), 3.87 (dd, J=12.24, 1.0, 1H), 3.97 (m, 2H), 4.07 (td, J=10.75, 4.84, 1H), 4.
17 (dd, J=10.68, 1.0, 1H), 4.25 (s, 2H), 4.32 (t, J=4.4, 1H), 4.37(t, J=5.8 1H),
4.6-4.7 (m,溶媒ピークにより不明瞭), 5.95 (d, J=4, 1H), 6.03 (d, J=7.4, 1H), 7.4
3-7.53 (m, 3H), 7.74 (m, 2H), 7.94 (q, J=7, 3H). MS (ES); 理論値 C35H42N5O18P ([
M-H]-), 851.7; 測定値 850.0。
D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネートの調製)。ジイソプロピルア
ミン(83μL、0.587マイクロモル)を、水(3mL)およびメタノール(1mL
)に溶解したシチジン−5'−モノホスホリル−[5−(N−フルオレニルメトキシカル
ボキサミド)グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−
2−ノヌロピラノスロネート](100mg、0.117ミリモル)の溶液に加えた。反
応混合物を室温で16時間撹拌し、そして反応メタノールを反応混合物からロータリーエ
バポレーションにより除去した。粗反応混合物は水を使用してC18シリカゲルカラムを
通して濾過し、そして溶出液を集め、そして凍結乾燥して(87mg、100%)の生成
物を白色固体として得た:Rf=0.21 (シリカ,IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500
MHz) 1.66 (td, 1H, J=5.3), 2.50 (dd, 1H, J=13.2, 4.6), 3.43 (d, J=9.58, 1H), 3.6
3 (dd, J=11.9, 6.44, 1H), 3.88 (dd, J=11.8, 1.0, 1H), 3.95 (td, J=9.0, 2.3, 1H),
4.10 (t, J=10.42, 1H), 4.12 (td, J=10.34, 4.66, 1H), 4.18 (d, J=10.36, 1H), 4.2
4 (m, 2H), 4.31 (t, J=4.64, 1H), 4.35 (t, 1H), 6.00 (d, J=4.37, 1H), 6.13 (d, J=
7.71, 1H), 7.98 (d, J=7.64, 1H). MS (ES); 理論値 C21 H32 N5O11P ([M-H]-), 629.47
; 測定値 627.9。
KDa)−3−オキシプロピオンアミド)−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−
D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート]の調製。ベンジルトリアゾ
ール−1−イルオキシ−トリス(ジメチルアミノ)−ホスホニウム ヘキサフルオロホス
フテェート(BOP、21mg、48マイクロモル)を、無水DMF(700μL)およ
びトリエチルアミン(13μL、95マイクロモル)に溶解したメトキシポリオキシエチ
レン−(1KDaの平均分子量)−3−オキシプロピオン酸(48mg、48マイクロモ
ル)溶液に加えた。30分後、シチジン−5'−モノホスホリル−(5−グリシルアミド
−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート
)(30mg、48マイクロモル)、水(400μL)およびトリエチルアミン(13μ
L、95マイクロモル)を含む溶液を加えた。この溶液を20分間、室温で撹拌し、そし
て次いでクロマトグラフィーにかけた(C18シリカ、メタノール/水の勾配)。適切な
画分を集め、濃縮し、残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して白色固体として40mg(
50%収率)を得た:Rf=0.36 (シリカ, IPA/H2O/NH4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500MHz)
1.66 (td, 1H, J=5.3), 2.50 (dd, 1H, J=13.2, 4.6), 2.64(t, J=5.99, 3H) 3.43 (d, J
=9.58, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.71 (s, 70H), 3.79 (m, 3.71 ピークにより不明瞭)、3.82
(t, J=6.19, 1H) 3.88 (dd, J=11.8, 1.0, 1H), 3.95 (td, J=9.0, 2.3, 1H), 3.98 (t,
J=5.06, 1H), 4.12 (td, J=10.34, 4.66, 1H), 4.18 (d, J=10.36, 1H), 4.23 (d, J=4.
85, 2H), 4.31 (t, J=4.64, 1H), 4.35 (t, 1H), 6.00 (d, J=4.55, 1H), 6.13 (d, J=7.
56, 1H), 7.98 (d, J=7.54, 1H). MS (MALDI), 観測値 [M-H]; 1594.5, 1638.5, 1682.4,
1726.4, 1770.3, 1814.4, 1858.2, 1881.5, 1903.5, 1947.3。
0KDa)−オキシカルボキサミド)−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−
グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート]の調製。シチジン−5'−モノ
ホスホリル−(5−グリシルアミド−3,5−ジデオキシ−β−D−グリセロ−D−ガラ
クト−2−ノヌロピラノスロネート)(2.5mg、4マイクロモル)および水(180
μL)を、トリエチルアミン(1.1μL、8マイクロモル)を含有する無水DMF(8
00μL)中の(メトキシポリオキシエチレン−(10KDa、平均分子量)−オキシカ
ルボニル−(N−オキシベンゾトリアゾール)エステル(40mg、4マイクロモル)の
溶液に加え、そして反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を水(8mL)で希
釈し、そして逆層フラッシュクロマトグラフィーにより精製した(C18シリカ、メタノ
ール/水の勾配)。適切な画分を合わせ、濃縮し、残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥し
て白色固体として20mgの生成物(46%収率)を得た:Rf=0.35 (シリカ, IPA/H2O/N
H4OH 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz)δ1.66(td, 1H), 2.50(dd, 1H), 2.64 (t, 3H) 3.5
5-3.7 (m, 3.71ピークのより不明瞭)、3.71(s, 488H), 3.72-4.0 (m, 3.71ピークのより
不明瞭), 4.23 (m, 3H), 4.31 (t, 1H), 4.35 (t, 1H), 6.00 (d, J=4.77, 1H), 6.12 (d
, J=7.52, 1H), 7.98 (d, J=7.89, 1H). MS (MALDI), 観測値 [MCMP+Na]; 10780。
9.ヒト下垂体由来FSHのグリコPEG化
この実施例は本発明の結合物の集成体を説明する。濾胞刺激ホルモン(FSH)は脱シ
アリル化し、そしてCMP−(シアル酸)−PEGを結合した。
オケム、カタログ番号869001)1mgを、500μLの50mM Tris−HC
l、pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2に溶解した。この溶液37
5μLを小さいプラスチック製の試験管に移し、そして263mUのノイラミニダーゼI
I(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)をそれに加えた。反応混合物
は15時間、32℃で穏やかに振盪した。反応混合物を、50mM Tris−HCl、
pH7.4、150mM NaClおよび0.05%NaN3で前平衡化したN−(p−
アミノフェニル)オキサミン酸−アガロースゲル結合体、600μLに加え、そして6.
5時間、4℃で穏やかに回転した。懸濁液を2分間、14,000rpmで遠心し、そし
て上清を集めた。ビーズを0.5mLのバッファーで5回洗浄し、そしてすべての上清を
プールした。酵素溶液を15時間、4℃で2リットルの溶液(50mM Tris−HC
l、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3を含有する)を用いて透析し(7
000MWCO)、そして4時間、4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1
M NaCl、0.05%NaN3で2回、透析した。次いで溶液を2μg/μLにSp
eed Vacで濃縮し、そして−20℃で保存した。反応サンプルをIEFゲルで分析
した(pH3〜7)(インビトロゲン:Invitrogen)(図105)。
リル化したFSH(100μg、50μL)およびCMP−シアル酸またはCMP−SA
−PEG(1kDaまたは10kDa)(0.05マイクロモル)を、0.5mLのプラ
スチック製試験管中の13.5μLのH2O(NaOHでpH8に調整)に溶解した。試
験管を簡単にボルテックス混合し、そして40mUのST3Gal3(36.5μL)を
加えた(総容量100μL)。試験管を再度、ボルテックス混合し、そして24時間、3
2℃で穏やかに振盪した。反応は−80℃に凍結することにより止めた。15μgの反応
サンプルをSDS−PAGE(図106)、IEFゲル(図107)およびMALDI−
TOFにより分析した。天然なFSHはSDS−PAGEにより分析した(図108)。
ベックス(Novex)のTris−グリシン8〜16%1mmゲルをインビトロゲンか
ら購入した。7.5μL(15μg)のFSH反応サンプルを5μLの50mM Tri
s−HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05% NaN3バッファーで希
釈し、15μLのサンプル添加バッファーおよび1μLの9M μ−メルカプトエタノー
ルと混合し、そして6分間、85℃で加熱した。ゲルはインビトロゲンの指示に従い泳動
し、そしてコロイダルブルーステイン(Colloidal Blue Stain)(
インビトロゲン)で染色した。
のサンプル添加バッファーと混合した(図105)。次いでサンプルは等電点電気泳動ゲ
ル(pH3−7)(インビトロゲン)に乗せた(図108)。ゲルはインビトロゲンの指
示に従い泳動そして固定し、次いでコロイダルブルーステインにより染色した。
10.CHO細胞で組換え的に生産された組換えFSHのグリコPEG化
この実施例は本発明の結合物の集成体を説明する。ジシアリル化FSHにCMP−(シ
アル酸)−PEGを結合した。
ン(rFSH)をこれらの実験に使用した。7,500IUのゴナル−F(Gonal−
F)を8mLの水に溶解した。FSH溶液を50mM Tris−HCl、pH7.4、
0.15M NaCl、5mM CaCl2中で透析し、そして500μLにCentr
icon Plus20遠心フィルター中で濃縮した。この溶液の一部(400μL)(
〜0.8mgFSH)を小さいプラスチック製試験管に移し、そして275mUのノイラ
ミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)をそれに加えた
。反応混合物は16時間、32℃で混合した。反応混合物を、前洗浄したN−(p−アミ
ノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体(800μL)に加え、そして24時間、
4℃で穏やかに回転した。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集めた。
ビーズを0.6mLのTris−EDTAバッファーで3回洗浄し、0.4mLのTri
s−EDTAバッファーで1回、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1
回洗浄し、そしてすべての上清をプールした。上清は4℃で2リットルの50mM Tr
is−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対して透析し、そし
て50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対
してさらに2回透析した。次いで透析した溶液はCentricon Plus20遠心
フィルター中で420μLに濃縮し、そして−20℃で保存した。
109)により分析した。ノベックスのTris−グリシン8〜16%1mmゲルをイン
ビトロゲンから購入した。サンプル(7.5μ、15μg)サンプルは、5μLの50m
M Tris−HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05% NaN3バッ
ファーで希釈し、15μLのサンプル添加バッファーおよび1μLの9M β−メルカプ
トエタノールと混合し、そして6分間、85℃で加熱した。ゲルはインビトロゲンの指示
に従い泳動し、そしてコロイダルブルーステイン(インビトロゲン)で染色した。等電点
電気泳動ゲル(pH3−7)はインビトロゲンから購入した。サンプル(7.5μL、1
5μg)を5μLのTrisバッファーで希釈し、そして15μLのサンプル添加バッフ
ァーと混合した。ゲルはインビトロゲンの指示に従い乗せ、泳動し、そして固定した。ゲ
ルをコロイダルブルーステインにより染色した。天然な、および脱シアリル化FSHは水
に対して透析し、そしてMALDI−TOFにより分析した。
、54μL)およびCMP−SA−PEG(1kDaまたは10kDa)(0.05マイ
クロモル)を、0.5mLのプラスチック製試験管中の28μLのTris−HCl、0
.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2に溶解した。試験管を簡単にボル
テックス混合し、そして20mUのST3Gal3を加えた(総容量100μL)。試験
管を再度、ボルテックス混合し、24時間、32℃で穏やかに混合し、そして反応は−8
0℃に凍結することにより止めた。この反応のサンプルを上記のようにSDS−PAGE
ゲル(図110)、IEFゲル(図111)およびMALDI−TOF MSにより分析
した。
パク質のN−グリカン構造から排除される。天然なFSHは13928にピークを与えた
;AS-rFSH (13282); 再シアリル化 r-FSH (13332); PEG100-rFSH (13515; 14960 (1); 16
455 (2); 17796 (3); 19321 (4)); および PEG 10000 (23560 (1); 24790 (2); 45670 (3
); および 56760 (4))。
11.グリコPEG化FSHの薬物動態学的実験
この実施例は非−PEG化FSHと比べて、本発明の方法に従い調製したグリコPEG
化濾胞刺激ホルモン(FSH)の薬物動態学的特性の試験を説明する。
)は、標準的条件を使用して放射性ヨウ素化し(アマーシャム バイオサイエンス、アー
リントンハイツ、イリノイ州)、そして0.1%BSAを含有するリン酸緩衝化生理食塩
水に配合した。リン酸バッファーで適切な濃度に希釈した後、各試験FSHタンパク質(
それぞれ0.4μg)をメスのSprague Dawleyラット(250〜300g
体重)に静脈内注射し、そして0〜80時間の時点で採血した。血液サンプル中の放射活
性は、ガンマカウンターを使用して分析し、そして標準的方法を使用して薬物動態学を分
析した(図112)。FSHはFSH−PEG(1KDa)よりもかなり急速に血液から
排除され、これは次いでFSH−PEG(10KDa)よりも幾分く排除された。
12.FSHペプチドのバイオアッセイ
この実施例は培養したセルトリー(Sertori)細胞に基づく濾胞刺激ホルモン(
FSH)活性に関するバイオアッセイを説明する。このアッセイは複合糖質化を含むグリ
カン改造後のFSHの生物活性を測定するために有用である。
から得られた培養したセルトリー細胞に加えられた時、生産されるエストラジオールの量
との間に存在する用量−応答関係に基づく。外因性テストステロンはFSHの存在下で1
7β−ヒストラジオールに転換される。
用した。屠殺後、精巣を被膜剥離し、そして組織はコラゲナーゼ(1mg/ml)、トリ
プシン(1mg/ml)、ヒアルロニダーゼ(1mg/ml)およびDNase(5μg
/ml)中で5〜10分間、インキューベーションすることにより分散させた。細管フラ
グメントはフラスコの底に沈み、そしてPBSで洗浄した(1x)。細管フラグメントは
20分間、同じ酵素を含有する媒質で再インキューベーションした:コラゲナーゼ(1m
g/ml)、トリプシン(1mg/ml)、ヒアルロニダーゼ(1mg/ml)およびD
Nase(5μg/ml)。
ェルあたり5x105細胞を分散させた。37℃および5%CO2で48時間のインキュ
ーベーション後、新しい培地を細胞に加えた。無血清培地の組成:DMEM(1容量)、
ハムの(Ham's)F10栄養混合物(1容量)、インスリン 1μg/ml、トラン
スフェリン 5μg/ml、EGF 10ng/ml、T4 20pg/ml、ヒドロコ
ルチゾン10−8M、レチン酸 10−6M。
ンキューベーションからなる。変動の平均アッセイ内係数は9%であり、そして変動の平
均アッセイ間係数は11%である。
tems)、ミネアポリス、ミネソタ州)を使用して、FSH、FSH−SA−PEG(
1KDa)およびFSH−SA−PEG(10KDa)とのインキューベーション後のエ
ストラジオールレベルを定量した。
れ、そしてキットの使用説明書により調製した)、またはサンプルを17B−エストラジ
オールELisaプレート(1つまたは複数)のウェルにピペットで加えた:50μlの
17B−エストラジオール結合物(キットにより提供され、そしてキットの使用説明書に
より調製した)を各ウェルに加えた;50μlの17B−エストラジオール抗体溶液(キ
ットにより提供され、そしてキットの使用説明書により調製した)を各ウェルに加えた;
プレートを2時間、室温で200rpmにてインキューベーションした;液体を各ウェル
から吸引した;ウェルを4回、洗浄溶液を使用して洗浄した;すべての液体をウェルから
除去した;200μlのpNPP基質(キットにより提供され、そしてキットの使用説明
書により調製した)をすべてのウェルに加え、そして45分間インキューベーションした
;50μlの停止溶液(キットにより提供され、そしてキットの使用説明書により調製し
た)を加え、そしてプレートを405nmで読んだ(図113)。FSH−PEG(10
KDa)は1μg/mlでセルトリー細胞の穏やかな刺激を現したが、FSH−PEG(
1KDa)は非PEG化FSHよりも最高50%多くセルトリー細胞を刺激した。
13.トランスフェリンのグリコPEG化
この実施例はアシアロトランスフェリンの調製およびPEG−CMP−シアル酸でのそ
のシアリル化を説明する。
を500μLの50mM NaOAc、5mM CaCl2、pH5.5に溶解した。こ
の溶液に、500mUのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio ch
olerae)を加え、そして反応混合物を20.5時間、37℃で穏やかに振盪した。
反応混合物を、前洗浄したN−(p−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体
(600μL)に加え、そして24時間、4℃で穏やかに回転させてビーズを洗浄した。
混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集めた。反応混合物は100μLの
30mM EDTAを、20時間、4℃で穏やかに回転させた洗浄ビーズに加えることに
より5mM EDTAに合わせた。上清を2分間、10,000rpmで遠心し、そして
上清を集めた。ビーズを0.35mLの50mM NaOAc、5mM CaCl2、5
mM EDTA、pH5.5で5回洗浄し、そしてすべての上清をプールした。酵素溶液
は4℃で2回、15mM Tris−HCl、1M NaCl、pH7.4中で透析した
。0.3mLのトランスフェリン溶液(全部で3.3mL)を除去し、そして水に対して
2回、透析した。残りは4℃でさらに2回、リン酸緩衝化生理食塩水に透析した。透析し
た溶液は−20℃で保存した。タンパク質サンプルはIEF電気泳動により分析した。サ
ンプル(9μL、25μg)を16μLのTrisバッファーで希釈し、そして25μL
のサンプル添加バッファーと混合し、そして等電点電気泳動ゲル(pH3−7)に乗せた
。ゲルは標準的な手順を使用して泳動し、そして固定した。ゲルをコロイダルブルーステ
インにより染色した。
250μg)およびCMP−シアル酸またはCMP−SA−PEG(1kDaまたは10
kDa)(0.05マイクロモル)を、1.5mLのプラスチック製試験管中の69μL
の50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.
2に溶解した。試験管を簡単にボルテックス混合し、そして100mUのST3Gal3
を(90μL)加えた(総容量250μL)。試験管を再度、ボルテックス混合し、そし
て24時間、32℃で穏やかに混合した。反応は−80℃に凍結することにより止めた。
ノベックスのTris−グリシン8〜16%1mmゲルをSDS−PAGE分析に使用し
た(図114)。サンプル(25μL、25μg)は、25μLのサンプル添加バッファ
ーおよび0.4μLのβ−メルカプトエタノールと混合し、そして6分間、85℃で加熱
した。ゲルは標準条件を使用して泳動し、そしてコロイダルブルーステインで染色した。
IEFゲルも上記のように行った図115)。サンプルを水に対して透析し、MALDI
−TOFにより分析した。
スフェリン(78197);再シアリル化トランスフェリン(79626/80703)
;SA−PEG 1kを含む(79037(1);80961(2);82535(3)
;84778(4));SA−PEG 5kを含む(90003(2);96117(3
);96117(4));SA−PEG 10kを含む(100336(2);1114
21(3);122510(4))。
14.BHK細胞で生産された組換え第VIIa因子のグリコPEG化
この実施例はCHO細胞で作られた組換え第VIIa因子のPEG化を説明する。
ーの腎臓細胞)で生産された。第VIIa因子(14.2mg)を1mg/mlでバッフ
ァー溶液(pH7.4、0.05M Tris、0.15M NaCl、0.001M
CaCl2、0.05% NaN3)に溶解し、そして300mU/mLのシアリダーゼ
(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)−アガロース結合体と3日間、
32℃でインキューベーションした。反応を監視するために、反応の少量のアリコートを
適当なバッファーで希釈し、そしてインビトロゲンの手順に従いIEFゲルを行った(図
116)。混合物を3,500rpmで遠心し、そして上清を集めた。樹脂を3回(3×
2mL)、上記バッファー溶液(pH7.4、0.05M Tris、0.15M Na
Cl、0.05% NaN3)で洗浄し、そして合わせた洗浄液をCentricon−
Plus−20で濃縮した。残る溶液は0.05M Tris(pH7.4)、0.15
M NaCl、0.05% NaN3とバッファー交換して14.4mLの最終容量とし
た。
たr第VIIa因子溶液を2つの7.2mlの等量サンプルに分けた。各サンプルに、C
MP−SA−5−PEG(1KDa)(7.4mg)またはCMP−SA−5−PEG(
10kDa)(7.4mg)のいずかれを加えた。ST3Gal3(1.58U)を両方
の試験管に加え、そして反応混合物を32℃で96時間インキューベーションした。反応
はインビトロゲンにより記載された試薬および条件を使用して、SDS−PAGEゲルに
より監視した。反応が完了した時、反応混合物をトーソー ハースTSK−Gel−30
00調製用カラムを使用して、PBSバッファー(pH7.1)を使用して精製し、そし
てUV吸収に基づき画分を集めた。生成物を含む合わせた画分を4℃でCentrico
n−Plus−20遠心フィルター(ミリポア、ベットフォード、マサチューセッツ州)
中で濃縮し、そして濃縮した溶液を再配合して1.97mgの第VIIa因子−PEGを
得た(ビシンクロニン酸タンパク質アッセイ、BCAアッセイ、シグマ−アルドリッチ、
セントルイス、ミズーリ州)。反応生成物は、インビトロゲンにより供給された手順およ
び試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析した。サンプルを水に対
して透析し、そしてMALDI−TOFにより分析した。図117は天然な第VIIa因
子に関するMALDIの結果を示す。図118は、1KDaPEGでPEG化された第V
IIa因子に関するMALDIの結果を含み、ここで1KDaPEGでPEG化された第
VIIa因子のピークが明らかである。図119は、10KDaPEGでPEG化された
第VIIa因子に関するMALDIの結果を含み、ここで10KDaPEGでPEG化さ
れた第VIIa因子のピークが明らかである。図120はすべての反応生成物のSDS−
PAGE分析を表し、ここで第VII因子−SA−PEG(10−KDa)のバンドが明
らかである。
15.CHO細胞で生産された第IX因子のグリコPEG化
この実施例はアシアロ第IX因子の調製およびPEG−CMP−シアル酸を用いたその
シアリル化を説明する。
細胞で作成した。6000IUのr第IX因子を全部で12mlのUSP H2Oに溶解
した。この溶液をCentricon−Plus−20、さらに6mLのUSP H2O
を含むPL−10遠心フィルターに移した。溶液を2mLに濃縮し、そして15mLの5
0mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2、
0.05%NaN3で希釈し、そして再濃縮した。希釈/濃縮を4回繰り返してバッファ
ー交換を効率的に行って3.0mLの最終容量とした。この容液から2.9mL(約29
mgのr第IX因子)を小さいプラスチック製試験管に移し、そしてこれに530mUの
α2−3,6,8−ノイラミニダーゼ−アガロース結合体(ビブリオ コレラ:Vibr
io cholerae、カルビオケム、450μL)を加えた。反応混合物を26.5
時間、32℃で穏やかに回転させた。混合物を2分間、10,000rpmで遠心し、そ
して上清を集めた。アガロースビーズ(ノイラミニダーゼを含む)を6回、0.5mLの
50mM Tris−HCl、pH7.12、1M NaCl、0,05% NaN3で
洗浄した。プールした洗浄液および上清を2分間、10,000rpmで再遠心して残存
するアガロース樹脂を除去した。プールした脱シアリル化タンパク質溶液を同バッファー
で19mLに希釈し、そしてCentricon Plus20 PL−10遠心フィル
ター中で〜2mLに濃縮した。溶液を2回、15mLの50mM Tris−HCl、p
H7.4、0.15M NaCl、0.05%NaN3で希釈し、そして2mLに再濃縮
した。最後に脱シアリル化されたr第IX因子溶液は3mLの最終容量(〜10mg/m
L)にTrisバッファーで希釈した。天然な、および脱シアリル化r第IX因子のサン
プルは、IEF電気泳動により分析した。等電点電気泳動ゲル(pH3−7)は、最初に
10μLのTrisバッファーで希釈し、そして12μLのサンプル添加バッファーと混
合した1.5μL(15μg)のサンプルを使用して泳動した。標準的手順を使用してゲ
ルを乗せ、泳動し、そして固定した。ゲルはコロイダルブルーステインにより染色し(図
121)、脱シアリル化第IX因子に関するバンドを示した。
第IX因子(29mg、3mL)を、2つの15mLの遠心管中の2つの1.5mL(1
4.5mg)サンプルに分けた。各溶液を12.67mLの50mM Tris−HCl
、pH7.4、0.15M NaCl、0.05%NaN3で希釈し、そしてCMP−S
A−PEG−1kまたは10k(7.25マイクロモル)のどちらかを加えた。試験管を
穏やかに上下して混合し、そして2.9UのST3Gal3(326μL)を加えた(1
4.5mLの総容量)。試験管を再度、上下し、そして65時間、32℃で穏やかに回転
した。反応は−20℃で凍結することにより止めた。反応の10μgのサンプルをSDS
−PAGEにより分析した。PEG化タンパク質はトーソー ハース Biosep G
3000SW(21.5×30cm、13μm)HPLCカラムで、ダルベッコのリン酸
緩衝化生理食塩水、pH7.1(ギブコ)、6mL/分を使用して精製した。反応および
精製は、SDSPageおよびIEFゲルを使用して監視した。ノベックスのTris−
グリシン4−20%1mmゲルに、2μLの50mM Tris−HCl、pH7.4、
150mM NaCl、0.05%NaN3バッファーで希釈し、そして12μLのサン
プル添加バッファーおよび1μLの0.5MDTTと混合し、そして85℃で6分間加熱
した後の10μL(10μg)のサンプルを乗せた。ゲルはコロイダルブルーステインに
より染色し(図122)、PEG(1KDaおよび10kDa)−SA−第IX因子に関
するバンドを示した。
16.第IX因子の直接シアリル−グリコPEG化
この実施例は、事前のシアリダーゼ処理無しのペプチドのシアリル−グリコPEG化の
調製を説明する。ここで第IX因子は例示ペプチドである。
5mLの20mM ヒスチジン、2%シュクロースを含む520mM グリシンバッファ
ー、0.05%NaN3および0.01%ポリソルベート80、pH5.0に溶解した。
次いでCMP−SA−PEG(10KDa)(27.8mg、3.5マイクロモル)をこ
の溶液に加え、反応混合物を上下して穏やかに混合し、そして1.4UのST3Gal3
を加えた。反応混合物を19時間、32℃で穏やかに回転し、そして反応を凍結により止
めた。反応混合物は、インビトロゲンにより記載された展開および染色(コロイダルブル
ー)条件を使用してSDS−PAGEゲルにより分析した。簡単に説明すると、サンプル
(10μL)を12μLのサンプル添加バッファーおよび2μLの0.5M DTTと混
合し、そして6分間、85℃で加熱した(図123、レーン8、9および10)。生成物
はSuperdex200 10/20カラム(アマーシャム、ウプサラ、スウェーデン
)カラムで、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、pH7.1(ギブコ)、6mL/分
で精製した。図(図123はHPLCで精製したPEG化第IX因子のバンド(レーン5
)を含む。
17.グリコPEG化第IX因子のシアル酸キャッピング
この実施例は、シアリル−グリコPEG化ペプチドのシアル酸キャッピングの手順を説
明する。ここで第IX因子は例示ペプチドである。
0KDa)。精製したr第IX因子−PEG(10KDa)(2.4mg)を、Cent
ricon(商標)Plus20PL−10(ミリポア社、ベッドフォード、マサチュー
セッツ州)遠心フィルター中で濃縮し、そしてバッファーを50mM Tris−HCl
、pH7.2、0.15M NaCl、0.05%NaN3に交換して1.85mLの最
終容量とした。タンパク質溶液を372μLの同Trisバッファーで希釈し、そして7
.4mgのCMP−SA(12マイクロモル)を固体で加えた。溶液は上下することによ
り穏やかに混合し、そして0.1UのST3Gal1および0.1UST3Gal3を加
えた。反応混合物を42時間、32℃で穏やかに回転した。
−グリシン4−12%1mmゲルをインビトロゲンにより記載されているように行い、そ
してコロイダルブルーを使用して染色した。簡単に説明すると、サンプル、10μL(1
0μg)を12μLのサンプル添加バッファーおよび1μLの0.5M DTTと混合し
、そして6分間、85℃で加熱した(図123、レーン4)。
18.哺乳動物または昆虫系で発現したタンパク質のグリコPEG化:EPO、インター
フェロンαおよびインターフェロンβ
この実施例は哺乳動物または昆虫系で発現したPEG化ペプチドの調製を説明する。
されるペプチドは、ガラクトースで終結するグリカンを持つ必要がある。哺乳動物発現系
からのほとんどのペプチドは、最初に除去される必要がある末端シアル酸を有する。
順には、1mg/mL溶液のペプチド(Tris−緩衝化塩溶液中、pH7.2、5mM
CaCl2を加えて含む)を、0.2U/mLの固定化シアリダーゼ(ビブリオ コレ
ラ:Vibrio cholerae由来、カルビオケム)と32℃で24時間インキュ
ーベーションすることを含む。微生物の成長は、滅菌濾過または0.02%のアジ化ナト
リウムを包含することにより止めることができる。次いで樹脂を遠心または濾過により取
り出し、次いで洗浄してトラップされたペプチドを回収する。この時点で、EDTAを溶
液に加えて樹脂から浸出したシアリダーゼは阻害することができる。
ータは、酵母、植物または昆虫細胞のような非哺乳動物系でも発現させることができる。
CMP−シアル酸PEGを使用してグリコPEG化されるペプチドは、ガラクトースで終
結するグリカンを持つ必要がある。例えば昆虫細胞で発現されるペプチド上のN−グリカ
ンのほとんどは、トリマンノシルコアである。これらのグリカンはそれらがシアリルトラ
ンスフェラーゼの受容体である前に、最初にガラクトースで終結するグリカンに改築され
る。
−glcNAc、0.05U/mL GLCNACT I、0.05U/mL GLCN
ACT IIを含むTris−緩衝化塩溶液、pH7.2中のペプチド(1mg/mL)
を32℃で24時間、または反応が実質的に完了するまでインキューベーションする。微
生物の成長は、滅菌濾過または0.02%のアジ化ナトリウムを包含することにより止め
ることができる。バッファー交換をしてUDPおよび他の低分子を除去した後、UDP−
ガラクトースおよびMnCl2をそれぞれ5mMまで加え、ガラクトシルトランスフェラ
ーゼを0.05U/mLまで加え、そして32℃で24時間、または反応が実質的に完了
するまでインキューベーションする。微生物の成長は、滅菌濾過または0.02%のアジ
化ナトリウムを包含することにより止めることができる。このペプチドはこれでグリコP
EG化の準備ができている。
、酵素的に所望するO−グリカンGal−GalNAcを生成することができる。必要な
らば、セリンまたはトレオニンに連結したGalNAcを、適当なペプチドGalNAc
トランスフェラーゼ(例えばGalNAc T1、GalNAc T2、T3、T4等)
およびUDP−GalNAcを使用して加えることができる。また必要ならば、ガラクト
ースをガラクトシルトランスフェラーゼおよびUDP−ガラクトースを使用して加えるこ
とができる。
02%アジ化ナトリウム中の末端ガラクトースを持つ糖ペプチド(1mg/mL)を、C
MP−SA−PEG(0.75mM)および0.4U/mLシアリルトランスフェラーゼ
(EPOおよびインターフェロンベータ上のN−グリカンにはST3Gal3またはST
3Gal4;インターフェロンアルファ上のO−グリカンについてはST3Gal4また
はST3Gal1)と、32℃で24時間インキューベーションする。使用できる他のト
ランスフェラーゼには、フォトバクテリウム ダムセーラ(Photobacteriu
m damsella)に由来する2,6−シアリルトランスフェラーゼを含む。受容体
ペプチド濃度は、最も好ましくは0.1mg/mLからペプチドの溶解度の限界までの範
囲である。CMP−SA−PEGの濃度は利用可能な部位を越えて過剰にあるように十分
であるべきであるが、PEGによるペプチドの溶解度の問題を引き起こすほど高いべきで
はなく、そして50μMから5mMまでの範囲でよく、そして温度は2℃から40℃の範
囲でよい。反応が完了するために必要な時間は、温度、受容体基質に対する酵素の相対的
量、供与体基質濃度およびpHに依存するだろう。
19.昆虫細胞で生産されたEPOのグリコPEG化
この実施例は昆虫細胞が発現したEPOからPEG化2アンテナ状EPOの調製法を説
明する。
州)に由来する組換えヒトエリトロポエチン(rhEPO)をグリカン分析に供し、そし
て得られたグリカンは、コアフコースを含む主にトリマンノシルコアであり、少ない割合
で単一GlcNAcを有するグリカンも存在することが示された(図124)。
rhEPO(1mg/mL)をGnT−IおよびGnT−II、5mM UDP−glc
NAc、20mM MnCl2および0.02%アジ化ナトリウムと、100mM ME
S pH6.5中で32℃にて24時間インキューベーションした。ロットAは20mg
のEPOおよび100mU/mLのGnT−Iおよび60mU/mLのGnT−IIを含
んだ。ロットBは41mgのEPOおよび41mU/mLのGnTI+50mU/mLの
GnT−IIを含んだ。反応後、サンプルはゲル濾過(PD10カラム、ファルマシアL
KBバイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)により脱塩した。
lcNAcを持つ2アンテナ状構造(1つのGlcNAcを有するバランス)に転換され
たことを明らかにした。ロットBは所望の生成物に97%転換されたことが示された(図
102Aおよび102B)。
処理してGlcNAcの付加を完成した。反応は150mM NaCl、EPOmg/m
l、1mM UDP−GlcNAc、5mM MnCl2、0.02%アジ化ナトリウム
および0.02U/mlGnTIIを含む50mM Tris pH7.2中で、32C
にて4時間行った。EPOのガラクトシル化は3mMまでのUDP−ガラクトースおよび
0.5U/mlまでのGalTを添加して行い、そしてインキューベーションを32Cに
て48時間続行した。
中、Superdex1.6/60カラムでのゲル濾過により精製した。次いでEPOを
含むピークを2AA HPLCにより分析した。HPLCデータに基づき、グリカンの〜
85%が2個のガラクトースを含み、そしてグリカンの〜15%がガラクトシル化反応後
にガラクトースを持たなかった。
M NaCl、0.5mg/ml EPO、200mU/ml ST3Gal3および0
.5mM CMP−NANまたはCMP−NAN−PEG(1KDa)またはCMP−N
AN−PEG(10KDa)のいずれかを含む100mM Tris、pHで、48時間
、32Cで行った。2個のガラクトース残基を有するほとんどすべてのグリカンが、CM
P−NANとの反応後に完全にシアリル化された(2個のシアル酸/グリカン)。MAL
DI−TOF分析はHPLCデータを確認した。
−NAN−PEG(10KDa)を使用したPEG化反応については、反応混合物のアリ
ートをSDS−PAGEにより分析した(図125)。EPOペプチドの分子量は各糖の
付加で増加し、そしてPEG化反応後には分子量がさらに劇的に増加した。
rling et al,1996,J.Pharm.Biomed.Anal.14:
1455−1469から調整)は、多レベルのEPOに対するTF−1細胞系の反応性に
基づく。TF−1細胞は骨髄腫前駆体細胞の増殖および分化を調査するために良い系を提
供する。この細胞系はT.Kitamura et al.により1987年10月に重
篤な再生不良性貧血の35歳の日本人男性に由来するヘパリン処理した骨髄吸引サンプル
で樹立された。これらの細胞はインターロイキン3または顆粒球−マクロファージコロニ
ー刺激因子(GM−CSF)に完全に依存している。
%+GM−CSF(12ng/ml)中で成長させ、そして37C5%CO2でインキュ
ーベーションした。細胞を5000細胞/ml(培地)の濃度に懸濁し、そして200μ
lを96ウェルプレートに分配した。細胞を種々の濃度のEPO(0.1μg/ml〜1
0μg/ml)と48時間インキューベーションした。次に25μlのMTT(シグマM
5655)を5mg/mlで加え、プレートを37℃で20分〜4時間インキューベーシ
ョンし、100μlのイソプロパノール/HCl溶液(100mlのイソプロパノール+
333μlのHCl 6N)を加え、570nm、および630nmまたは690nmの
ODを読み、そして570nmの読み取りから630nmまたは690nmの読み取りを
引くことによりMTT生存能アッセイを行った。
G化されたEPOをインビトロのEPO生物活性試験に供した時の結果を含む。1KDa
のPEGでグリコPEG化されたEPOは、両方とも約5μg/mlの濃度である時に非
グリコPEG化EPOとほとんど同じ活性を有した。10KDaのPEGでグリコPEG
化されたEPOは、両方とも約5μg/mlの濃度である時に非グリコPEG化EPOの
約半分の活性を有した。
20.CHO細胞で生産されたインターフェロンαのグリコPEG化
アシアロ−インターフェロンαの調製。CHO細胞から生産されたインターフェロンα
を2.5mg/mLで50mM Tris 50mM Tris−HCl pH7.4、
0.15M NaCl、5mM CaCl2に溶解し、そして500μLにCentri
con Plus20遠心フィルター中で濃縮する。この溶液を300mU/mLのノイ
ラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)と16時間、
32℃インキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当な
バッファーで希釈し、そしてIEFゲルを行う。次いで反応混合物を、前洗浄したN−(
p−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体(800μL/mL反応容量)に
加え、そして洗浄したビーズを24時間、4℃で穏やかに回転する。混合物を10,00
0rpmで遠心し、そして上清を集める。ビーズをTris−EDTAバッファーで3回
洗浄し、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回、そして0.2mLのTri
s−EDTAバッファーで1回洗浄し、すべての上清をプールする。上清は4℃で50m
M Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対して透析
し、そして50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%Na
N3に対してさらに2回透析する。次いで透析した溶液はCentricon Plus
20遠心フィルターを使用して濃縮し、そして−20℃で保存する。IEFゲルに関する
条件は、インビトロゲンにより提供される手順および試薬に従い泳動する。天然な、およ
び脱シアリル化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF
MSにより分析する。
リル化インターフェロンアルファを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、
0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM
CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST3Gal1と32℃で2日間イ
ンキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリ
コートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、
PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラム
でのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−
ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH
7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そし
てUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手
順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、お
よび脱シアリル化インターフェロン−アルファのサンプルを水に対して透析し、そしてM
ALDI−TOF MSにより分析する。
ァ2,3−シアリル化O−結合グリカンを含むCHOで生産されたインターフェロン−ア
ルファを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0
.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PE
Gおよび0.1U/mLのCST−IIと32℃で2日間インキューベーションする。シ
アル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PE
G−蛍光リガンドを加え;ペプチドへの取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7
.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標
識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用
して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソ
ー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を
集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS
−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化インターフェ
ロン−アルファのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより
分析する。
合GlcNAcのみを含むインターフェロン−アルファを2.5mg/mLで、50mM
Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2に溶解す
る。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのST6Glc
NAcIまたはIIと32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取
り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを
加え;ペプチドへの取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してト
ーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペ
プチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日
後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG300
0SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成
物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびI
EF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化インターフェロン−アルファのサ
ンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
21.CHO細胞で生産されたG−CSFのグリコPEG化
アシアロ−顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)の調製。CHO細胞で生産された
G−CSFを2.5mg/mLで50mM Tris 50mM Tris−HCl、p
H7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2に溶解し、そして500μLにC
entricon Plus20遠心フィルター中で濃縮する。この溶液を300mU/
mLのノイラミニダーゼII(ビブリオ コレラ:Vibrio cholerae)と
16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコ
ートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルを行う。次いで反応混合物は前洗浄
したN−(p−アミノフェニル)オキサミン酸−アガロース結合体(800μL/mL反
応容量)に加え、そして洗浄したビーズを24時間、4℃で穏やかに回転する。混合物を
10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。ビーズをTris−EDTAバッフ
ァーで3回洗浄し、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回、そして0.2m
LのTris−EDTAバッファーで1回洗浄し、すべての上清をプールする。上清は4
℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に
対して透析し、そして50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.
05%NaN3に対してさらに2回透析する。次いで透析した溶液はCentricon
Plus20遠心フィルターを使用して濃縮し、そして−20℃で保存する。IEFゲ
ルに関する条件は、インビトロゲンにより提供される手順および試薬に従い泳動する。天
然な、および脱シアリル化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI
−TOF MSにより分析する。
を2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05
%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよ
び0.1U/mLのST3Gal1と32℃で2日間インキューベーションする。シアル
酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−
蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)
を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から
分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定
量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハ
ースG3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める
。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PA
GEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な、およびPEG化G−CSFのサンプ
ルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
ル化O−結合グリカンを含むCHO細胞で生産されたG−CSFを2.5mg/mLで、
50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2
に溶解する。この溶液を1mM CMP−シアル酸−PEGおよび0.1U/mLのCS
T−IIと32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監
視するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプ
チドへの取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハ
ースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの
蛍光標識の取り込みは、イン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混
合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製
カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、イン
ビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を
使用して分析する。天然な、およびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、
そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
みを含むG−CSFを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M
NaCl、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM CMP−シ
アル酸−PEGおよび0.1U/mLのST6GalNAcIまたはIIと32℃で2日
間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取り込みを監視するために、反応の小
アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識
は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カ
ラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。ペプチドへの蛍光標識の取り込みは、イ
ン−ラインの蛍光検出器を使用して定量する。2日後、反応混合物はPBSバッファー(
pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、
そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給され
る手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。天然な
、およびPEG化G−CSFのサンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF
MSにより分析する。
22.CHO細胞で生産されたEPOのO−結合グリカンのグリコPEG化
O−結合EPO−SA−PEG(10kDa)の調製。元々CHO細胞で生産されたア
シアロ−EPOを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M Na
Cl、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を5mM CMP−SAお
よび0.1U/mL ST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シア
ル酸のN−結合グリカンへの取り込みを監視するために、反応の小アリコートにCMP−
SA−14Cを加え;ペプチドは、メタノール、水を使用してトーソー ハースG300
0SW分析カラムでのゲル濾過により分離し、そして生成物は放射能検出器を使用して検
出する。反応が完了した時、溶液はCentricon−20フィルターを使用して濃縮
する。残る溶液はCMP−SAがもはや検出できなくなるまで0.05M Tris(p
H7.2)、0.15M NaCl、0.05%NaN3とバッファーと交換して7.2
mLの最終容量とする。次いで残りを0.05M Tris(pH7.2)、0.15M
NaCl、0.05%NaN3に2.5mg/mLタンパク質で再懸濁する。溶液はO
−結合部位をグルコシル化するために、1mMのCMP−SA−PEG(10KDa)お
よびST3Gal1と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−PEGの取
り込みを監視するために反応の小アリコートは、トーソー ハースTSK−gel−30
00分析カラムを使用したゲル濾過により分離し、PBSpH7.0で溶出し、そしてU
V検出により分析する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.0
)を使用してトーソー ハースTSK−gel−3000調製カラムを使用して精製し、
UV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順
および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水
に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
23.抗体のグリコPEG化
この実施例は、抗体分子のO−結合グリカンをPEG化するための手順を説明する。こ
こでEnbrel(商標)は例として使用するが、当業者はこの手順が多くの抗体分子に
使用できると考えるだろう。
化されたO−結合グリカンを持つか、または持たないいずれかのEnbrel(商標)(
TNF−レセプター−IgG1−キメラ)を、2.5mg/mLで、50mM Tris
−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05%NaN3、pH7.
2に溶解する。この溶液を5mMのUDP−ガラクトースおよび0.1U/mLのガラク
トシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてFc領域グルカン
をガラクトースでキャップする。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小ア
リコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識
は、メタノールおよび水でトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過によ
り遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン検出器を
使用して定量する。
および0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シ
アル酸−リンカー−PEGの取り込みを監視するために、ペプチドはPBSバッファー(
pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW分析カラムでゲル濾過により分
離する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してト
ーソー ハースTSK−Gel−3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV
吸収に基づき画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そ
して凍結乾燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に
従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析
し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
24.Remicade(商標)抗体のグリコPEG化
この実施例は、PEG分子をFc領域グリカンに導入することにより組換え抗体分子を
グリコPEG化するための手順を説明する。ここでRemicade(商標)、TNF−
R:IgGFc領域融合タンパク質は例示ペプチドである。
l(商標)を、2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaC
l、5mM MnCl2、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を1m
MのUDP−ガラクトース−PEG(10KDa)および0.1U/mLのガラクトシル
トランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてFc領域グルカンにPE
Gを導入する。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C
−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッフ
ァー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過
により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射
能検出器を使用して定量する。
ハースTSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づ
き画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そして凍結乾
燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS
−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そして
MALDI−TOF MSにより分析する。
25.GlcNAc−ASN構造の生成およびPEG化:酵母で生産されたTPA
この実施例は、酵母で発現されたTPAのようなペプチド上のPEG化GlcNAc−
ASN構造の調製を説明する。
この組換え糖タンパク質は最初にエンドグリコシダーゼHで処理してペプチドのアスパラ
ギン(Asn)残基上にGlcNAc構造を生成する。
はガラクトース−PEGで、それぞれUDP−ガラクトースまたはUDP−ガラクトース
−6−PEG、およびGalT1のようなガラクトシルトランスフェラーゼを使用して修
飾する。1例では、ガラクトース−PEGは末端残基である。2例目はガラクトースがさ
らにSA−PEGでCMP−SA−PEG供与体およびST3GalIIIのようなシア
リルトランスフェラーゼを使用して修飾される。別の態様では、ペプチド/タンパク質骨
格上のGlcNAc−Asn構造が上記のようにガラクトシル化およびシアリル化され、
そしてさらにCMP−SA−PEGおよびカンピロバクター ジェジュニ(Campyl
obacter jejuni)cst−II遺伝子によりコードされる酵素のようなα
2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化される。
26.GlcNAc−ASN構造の生成およびPEG化:サッカロミセス(Saccha
romyces)で生産されたGM−CSF
この実施例は、PEG化されたGlcNAc−Asn構造を持つ組織アクチベーターの
調製を説明する。
と予想される。N−結合グリカンは分枝マンナン型であるはずである。この組換え糖タン
パク質は、エンドグリコシダーゼH、エンドグリコシダーゼ−F1、エンドグリコシダー
ゼ−F2、エンドグリコシダーゼ−F3、エンドグリコシダーゼ−Mからなる群から選択
されるエンドグリコシダーゼ単独で、またはマンノシダーゼI、IIおよびIIIと組み
合わせて処理してペプチド/タンパク質骨格上のアスパラギン(Asn)残基上にGlc
NAc結節(nub)を生成する。
はガラクトース−PEGで、それぞれUDP−ガラクトースまたはUDP−ガラクトース
−6−PEG、およびGalT1のようなガラクトシルトランスフェラーゼを使用して修
飾される。1例では、ガラクトース−PEGは末端残基である。2例目はガラクトースが
さらにSA−PEGでCMP−SA−PEG供与体およびST3GalIIIのようなシ
アリルトランスフェラーゼを使用して修飾される。別の態様では、ペプチド/タンパク質
骨格上のGlcNAc−Asn構造がガラクトシル化され、そして上記のようにシアリル
化され、次いでCMP−SA−PEGおよびカンピロバクター ジェジュニ(Campy
lobacter jejuni)cst−II遺伝子によりコードされる酵素のような
α2,8−シアリルトランスフェラーゼを使用してさらにシアリル化される。
C.低分子の複合糖質化(Glyco−conjugation)
27.CMP−SA−レブリネートの合成
この実施例はCMP−SA−レブリネートの合成手順を説明する。
ホルメート(100μL、0.77ミリモル)を、レブリン酸(86μL、0.84ミリ
モル)、無水THF(3mL)およびトリエチルアミン(127μL、0.91ミリモル
)の溶液に滴下した。この溶液を3時間、室温で撹拌し、次いでD−マンノサミンヒドロ
クロライド(151mg、0.7ミリモル)、トリエチルアミン(127μL、0.91
ミリモル)、THF(2mL)および水(2mL)を含む溶液に滴下した。反応混合物を
15時間撹拌し、次いでロータリーエバポレーションにより濃縮乾固した。クロマトグラ
フィー(シリカ、5〜15%のMeOH/CH2Cl2の段階勾配)を使用して生成物を
単離し、0.156g(73%収率)の白色固体を得た:Rf= 0.41 (シリカ, CHCl3/MeOH
/ 水 6/4/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) 2.23 (s, 3H), 2.24 (s, 3H), 2.57 (td, J=6.54,
3.68, 2H) 2.63 (t, J=6.71, 2H), 2.86-2.90 (m, 4H),3.42 (m, 1H), 3.53 (t, J=9.76
, 1H), 3.64 (t, J=9.43, 1H), 3.80-3.91 (m, 4H), 4.04 (dd, J=9.79, 4.71, 1H), 4.3
1 (dd, J=4.63, 1.14, 1H), 4.45 (dd, J=4.16, 1.13, 1H), 5.02 (d, J=1.29, 1H), 5.1
1 (s, J=1.30, 1H), MS (ES); 理論値 C11H19NO7, 277.27; 測定値 [M+1] 277.9。
ピラノスロネートの調製。ピルビン酸ナトリウム(0.616g、5.6ミリモル)およ
びN−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ(50U)を、2−レブリンアミド−2−デオ
キシ−D−マンノピラノース(0.156g、0.56ミリモル)の溶液(0.1M H
EPES、pH7.5中)に加えた。反応混合物を37℃に20時間加熱し、その後、凍
結した。次いで反応混合物はC18シリカを通して濾過し、凍結し、そして凍結乾燥させ
た。粗固体はフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、最初に10〜40%MeOH/C
H2Cl2、次いでCH2Cl2/MeOH/H2O 6/4/0.5を使用する)を使
用して精製した。適切な画分を合わせ、そして濃縮して45mg(80%収率)の白色固
体を得た:Rf=0.15 (シリカ, CHCl3/MeOH/水 6/4/1); 1H NMR (D2O, 500MHz)81.82 (t, J
=11.9, 1H), 2.21 (dd, J=13.76, 4.84, 1H), 2.23 (s, 3H), 2.57 (app q, J=6.6, 2H),
2.86-2.95 (m, 2H), 3.15-3.18 (m, 1H), 3.28-3.61 (複合, 1H), 3.60 (dd, J=11.91,
6.66, 1H), 3.75 (td, J=6.65, 2.62, 1H), 3.84 (dd, J=11.89, 2.65, 1H), 3.88-4.01
(複合, 2H), 4.04 (td, J=11.8, 4.67, 1H), MS (ES); 理論値 C14H23NO10, 365.33; 測
定値 ([M-1]-), 363.97。
D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート)の調製。5−レブリンアミ
ド−3,5−ジデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−2−ノヌロピラノスロネート(
50mg、137マイクロモル)を2mLの100mM HEPES pH7.5バッフ
ァーに溶解し、そして1MのMnCl2(300μL、300マイクロモル)を加えた。
CTP−2Na+(79mg、1.5マイクロモル)を5mLのHEPESバッファーに
溶解し、そして糖に加えた。シアリルトランスフェラーゼ/CMP−ノイラミン酸シンテ
ターゼ融合酵素(11U)を加え、そして反応混合物を室温で45時間撹拌した。反応混
合物を10,000MWCOフィルターに通して濾過し、そして濾液(これは反応の生成
物を含む)をさらに精製せずに直接使用した:Rf=0.35(シリカ、IPA/水/N
H4OH 7/2/1)。
28.CHO細胞で生産されるグルコセレブロシダーゼ−マンノース−6−ホスフェート
この実施例はマンノース−6−ホスフェートをCHO細胞で生産されたグルコセレブロ
シダーゼのようなペプチドに複合糖質化する手順を説明する。
ゼを2.5mg/mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl pH7.4
、0.15M NaClに溶解し、これを300mU/mLのシアリダーゼ−アガロース
結合体と16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の
小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルおよびSDS−PAGEを
インビトロゲンの手順に従い行う。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を
集める。ビーズはTris−EDTAバッファーで3回、0.4mLのTris−EDT
Aバッファーで1回、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1回洗浄する
。すべての上清をプールする。上清は4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、
1M NaCl、0.05%NaN3に対して透析し、そしてさらに2回、50mM T
ris−HCl、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対して透析する。
次いで透析した溶液はCentricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮
する。反応の生成物はインビトロゲンにより供給される手順および試薬に従い、SDS−
PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてM
ALDI−TOF MSにより分析する。
順1)。上からのアシアロ−グルコセレブロシダーゼを2.5mg/mLで、50mM
Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する
。この溶液を1mMのCMP−シアル酸−リンカー−Man−6−ホスフェートおよび0
.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−
リンカー−Man−6−ホスフェートの取り込みを監視するために、反応の小アリコート
にCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBS
バッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースTSK−Gel−3000分析カ
ラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。蛍光標識のペプチドへの取り込みは、イ
ン−ライン蛍光検出器を使用して定量する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッ
ファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース TSK−Gel−3000調製カラ
ムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビト
ロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用
して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分
析する。
順2)。CHOで生産されたが不完全にシアリル化されているグルコセレブロシダーゼを
2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.05%
NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を1mMのCMP−シアル酸−リンカー−M
an−6−ホスフェートおよび0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキ
ューベーションする。シアル酸−リンカー−Man−6−ホスフェートの取り込みを監視
するために、反応の小アリコートにCMP−SA−PEG−蛍光リガンドを加え;ペプチ
ドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハース
TSK−Gel−3000分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。蛍光標
識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン蛍光検出器を使用して定量する。反応が完了
した時、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハース T
SK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集
める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−
PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてM
ALDI−TOF MSにより分析する。
29.ミトラマイシンの抗体への複合糖質化
この実施例は、ミトラマイシンのような低分子を哺乳動物細胞で生産された抗体分子の
Fc領域グリカンへ複合糖質化するため手順を説明する。ここで抗体Herceptin
(商標)を使用するが、当業者はこの方法が多くの他の抗体に使用できると考えるだろう
。
ptin(商標)を2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M N
aCl、5mM MnCl2、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を
1mMのUDP−ガラクトース−リンカー−ミトラマイシンおよび0.1U/mLのガラ
クトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてミトラマイシン
をFc領域のグリカンに導入する。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小
アリコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標
識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析
カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは
、イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
ハース TSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基
づき画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そして凍結
乾燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSD
S−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そし
てMALDI−TOF MSにより分析する。
30.ゲルダナマイシンの抗体への複合糖質化
この実施例は、ゲルダナマイシンのような低分子をCHO細胞で生産されたRitux
an(商標)のような抗体のFc領域グリカンへ複合糖質化するための手順を説明する。
ここで抗体Rituxan(商標)を使用するが、当業者はこの方法が多くの他の抗体に
使用できると考えるだろう。
n(商標)を2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl
、5mM MnCl2、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を1mM
のUDP−ガラクトース−リンカー−ゲルダナマイシンおよび0.1U/mLのガラクト
シルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションしてゲルダナマイシンを
Fc領域のグリカンに導入する。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小ア
リコートに14C−ガラクトース−UDPリガンドを加え;ペプチドへの標識の取り込み
は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カ
ラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、
イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
ハース TSK−Gel−3000調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基
づき画分を集める。生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、バッファー交換し、そして凍結
乾燥する。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSD
S−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そし
てMALDI−TOF MSにより分析する。
D.ペプチドの複合糖質化(Glyco−conjugation)
31.トランスフェリン−GDNF
この実施例はタンパク質の複合糖質化、そして特にトランスフェリンをGDNFに複合
糖質化する手順について説明する。トランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDP
−はトランスフェリンから調製する。ガラクトース残基をGNDFグリカンから除去し、
そしてトランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPをGNDFグリカンにガラク
トシルトランスフェラーゼを使用して結合する。
DNFを2.5mg/mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl、pH7
.4、0.15M NaClに溶解し、そして300mU/mLのベータ−ガラクトシダ
ーゼ−アガロース結合体と16時間、32℃でインキューベーションする。反応を監視す
るために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルをインビ
トロゲンの手順に従い行う。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める
。上清は4℃で50mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl、0.05%
NaN3に対して透析し、そしてさらに2回、50mM Tris−HCl pH7.4
、1M NaCl、0.05%NaN3に対して透析する。透析した溶液は次いでCen
tricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮し、そして−20℃で保存す
る。IEFゲルの条件はインビトロゲンにより提供される手順および試薬に従い泳動する
。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOFにより分析する。
リンを2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl、0.
05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液をCMP−シアル酸−リンカー−Ga
l−UDP(1モル当量のヌクレオチド糖をトランスフェリンに加えるモル量)および0
.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸の
取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−SA−UDPリガンドを加え
;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー
ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離標識から分離する。放射能標
識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射能検出器を使用して定量する。
トランスフェリングリカンをキャップするために)と32℃で2日間インキューベーショ
ンする。ペプチドへの取り込みは、イン−ラインUV検出器を使用して定量する。2日後
、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000
SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物
は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIE
F分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF
MSにより分析する。
トランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPを2.5mg/mLで、50mM
Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05%NaN3、
pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mLのアガラクト−GDNFおよび0.
1U/mLのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキューベーションす
る。ガラクトースの取り込みを監視するために、反応の小アリコートに14C−ガラクト
ース−UDPリガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBSバッファー(pH
7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により遊離
標識から分離する。放射性標識のペプチドへの取り込みは、イン−ライン放射能検出器を
使用して定量する。
ルトランスフェラーゼ(未反応トランスフェリングリカンをキャップするために)と32
℃で2日間インキューベーションし、続いて5mMのCMP−SAおよび0.1U/mL
のST3Gal3を加える。さらに2日後、反応混合物はPBSバッファー(pH7.1
)を使用したトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精製し、UV吸収に
基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬
に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透
析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
32.グルコセレブロシダーゼ−トランスフェリン
この実施例はタンパク質の複合糖質化、そして特にトランスフェリンをグルコセレブロ
シダーゼに複合糖質化する手順について説明する。GlcNAc−ASN構造をグルコセ
レブロシダーゼ上に構築し、そしてトランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDP
はGNDF GlcNAc−ASN構造にガラクトシルトランスフェラーゼを使用して結
合する。
細胞で生産されたCerezyme(商標)(グルコセレブロシダーゼ)を2.5mg/
mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M N
aClに溶解し、そして300mU/mLのエンド−H−アガロース結合体と16時間、
32℃でインキューベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当
なバッファーで希釈し、そしてIEFゲルおよびSDS−PAGEをインビトロゲンの手
順に従い行う。混合物を10,000rpmで遠心し、そして上清を集める。ビーズはT
ris−EDTAバッファーで3回、0.4mLのTris−EDTAバッファーで1回
、そして0.2mLのTris−EDTAバッファーで1回洗浄し、そしてすべての上清
をプールする。上清は4℃で50mM Tris−HCl、pH7.4、1M NaCl
、0.05%NaN3に対して透析し、そしてさらに2回、50mM Tris−HCl
、pH7.4、1M NaCl、0.05%NaN3に対して透析する。次いで透析した
溶液はCentricon Plus20遠心フィルターを使用して濃縮する。反応の生
成物はインビトロゲンにより供給される手順および試薬に従い、SDS−PAGEおよび
IEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TO
F MSにより分析する。
のトランスフェリン−SA−リンカー−Gal−UDPを2.5mg/mLで、50mM
Tris−HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05%NaN3
、pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mLのGlcNAc−グルコセレブロ
シダーゼおよび0.1U/mのガラクトシルトランスフェラーゼと32℃で2日間インキ
ューベーションする。グルコセレブロシダーゼの取り込みを監視するために、ペプチドは
、PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラ
ムでのゲル濾過により分離し、そしてU吸収により生成物を検出する。反応混合物はPB
Sバッファー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW調製カラムを使
用して精製し、UV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより
供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する
。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
33.EPO−トランスフェリン
この実施例はタンパク質のO−結合グリカンへの複合糖質化、そして特にトランスフェ
リンをEPOに複合糖質化する手順について説明する。シアル酸残基はEPOのO−結合
グリカンから除去し、そしてEPO−SA−リンカー−SA−CMPを調製する。EPO
−SA−リンカー−SA−CMPをアシアロトランスフェリンにST3Gal3で複合糖
質化する。
)を2.5mg/mLで、50mM Tris50mM Tris−HCl pH7.4
、0.15M NaClに溶解し、これを300mUのシアリダーゼ(ビブリオ コレラ
:Vibrio cholera)−アガロース結合体と16時間、32℃でインキュー
ベーションする。反応を監視するために、反応の小アリコートを適当なバッファーで希釈
し、そしてインビトロゲンの手順に従いIEFゲルを行う。混合物を10,000rpm
で遠心し、そして上清を集める。上清は約2.5mg/mLのEOP濃度に50mM T
ris−HCl、0.15M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2中で濃縮する
。この溶液を5mMのCMP−シアル酸および0.1U/mLのST3Gal3と32℃
で2日間インキューベーションする。シアル酸の取り込みを監視するために、反応の小ア
リコートにCMP−SA−蛍光リガンドを加え;ペプチドへ取り込まれた標識は、PBS
バッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲ
ル濾過により遊離標識から分離する。反応が完了した時、反応混合物はPBSバッファー
(pH7.1)を使用したトーソー ハース G3000SW調製カラムを使用して精製
し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供給
される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。サ
ンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
5M NaCl、0.05%NaN3、pH7.2中のO−結合アシアロ−EPO2.5
mg/mL。この溶液を1mMのCMP−シアル酸−リンカー−SA−CMPおよび0.
1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキューベーションする。シアル酸−リ
ンカー−SA−CMPの取り込みを監視するために、ペプチドはPBSバッファー(pH
7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により分離
する。
G3000SW調製カラムを使用して精製し、そしてUV吸収に基づき画分を集める。反
応の生成物は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGE
およびIEF分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI
−TOF MSにより分析する。
ンカー−SA−CMPは2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M
NaCl、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mL
のアシアロ−トランスフェリンおよび0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間
インキューベーションする。トランスフェリンの取り込みを監視するために、ペプチドは
PBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラム
でのゲル濾過により分離し、そして生成物をUV吸収により検出する。反応が完了した時
、溶液を5mMのCMP−SAおよび0.1U/mLのST3Gal3(未反応のトラン
スフェリングリカンをキャップするために)と32℃で2日間インキューベーションする
。反応混合物はPBSバッファー(pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000
SW調製カラムを使用して精製し、そして画分をUV吸収に基づき集める。反応の生成物
は、インビトロゲンにより供給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIE
F分析を使用して分析する。サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF
MSにより分析する。
34.EPO−GDNF
この実施例はペプチドの複合糖質化の手順、そして特にEPO−SA−リンカー−SA
−GDNFの調製について説明する。
SA−CMPは2.5mg/mLで、50mM Tris−HCl、0.15M NaC
l、0.05%NaN3、pH7.2に溶解する。この溶液を2.5mg/mLのGDN
F(NSOで生産)および0.1U/mLのST3Gal3と32℃で2日間インキュー
ベーションする。GDNFの取り込みを監視するために、ペプチドはPBSバッファー(
pH7.1)を使用してトーソー ハースG3000SW分析カラムでのゲル濾過により
分離し、そして生成物をUV吸収により検出する。反応が完了した時、溶液を5mMのC
MP−SAおよび0.1U/mLのST3Gal3(未反応のGDNFグリカンをキャッ
プするために)と32℃で2日間インキューベーションする。反応混合物はPBSバッフ
ァー(pH7.1)を使用したトーソー ハースG3000SW調製カラムを使用して精
製し、そして画分をUV吸収に基づき集める。反応の生成物は、インビトロゲンにより供
給される手順および試薬に従いSDS−PAGEおよびIEF分析を使用して分析する。
サンプルを水に対して透析し、そしてMALDI−TOF MSにより分析する。
本明細書に編入する。
の精神および範囲から逸脱することなく当業者により考案され得ることは明らかである。
添付する特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および均等な変更物を含むと解釈さ
れるものとする。
明は図面に表す態様のまさにその組み合わせ方および手段に限定されない。
Claims (77)
- ペプチドに共有結合しているグリコ結合分子を有する、一つまたはそれ以上のグリカンを含むEPOペプチド。
- 前記一つまたはそれ以上のグリカンがモノ触角のグリカンである請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記一つまたはそれ以上のグリカンがビ触角のグリカンである請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記一つまたはそれ以上のグリカンがトリ触角のグリカンである請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記一つまたはそれ以上のグリカンが少なくともトリ触角のグリカンである請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記一つまたはそれ以上のグリカンが、モノもしくは多触角のグリカンの混合物を含む、少なくとも二つののグリカンからなる請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記一つまたはそれ以上のグリカンが、N連結グリカンおよびO連結グリカンから選ばれるものである請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記一つまたはそれ以上のグリカンが、N連結グリカンおよびO連結グリカンから選ばれる、少なくとも二つののグリカンからなる請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記ペプチドが、原核細胞および真核細胞から構成される群から選ばれる細胞中で発現されるものである請求項1記載のEPOペプチド。
- 前記真核細胞が、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞および真菌細胞から構成される群から選ばれるものである請求項9記載のEPOペプチド。
- 前記真菌細胞が酵母細胞である請求項10記載のEPOペプチド。
- EPOペプチド、少なくとも一つのグリカンおよび少なくとも一つの該グリカンに共有結合したポリ(エチレングリコール)分子、ここで該ポリ(エチレングリコール)分子がグリコシルトランスフェラーゼを用いて該EPOペプチドに加えられる、を含むグリコPEG化EPOペプチド。
- 少なくとも一つのモノ触角のグリカンを含んでなる請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- すべての前記グリカンがN連結でモノ触角である請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- すべての前記グリカンが、N連結で、前記ポリ(エチレングリコール)を含む前記グリカンの少なくとも一つである請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記グリカンの一つ以上が前記ポリ(エチレングリコール)を含むものである請求項15記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- すべての前記グリカンがN連結であり、すべての前記グリカンが前記ポリ(エチレングリコール)を含むものである請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 少なくとも三つのモノ触角グリカンがこれらに共有結合しているポリ(エチレングリコール)を含むものである請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- EPOペプチドが三つまたはそれ以上のグリカンからなるグリコPEG化EPOペプチド。
- 少なくとも前記グリカンの一つがこれらに共有結合した前記ポリ(エチレングリコール)を含んでなる請求項19記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記グリカンの一つ以上がこれらに共有結合した前記ポリ(エチレングリコール)を含んでなる請求項18記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記グリカンのすべてがこれらに共有結合した前記ポリ(エチレングリコール)を含んでなる請求項18記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が、フコース(Fuc)、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース(Gal)およびシアル酸(SA)からなる群から選択される糖部分の少なくとも一つに連結している請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記シアル酸がN−アセチルノイラミン酸である請求項23記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記EPOペプチドがO連結グリカンを含まないものである請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記EPOペプチドが少なくとも一つのO連結グリカンを含むものである請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記O連結ペプチドがこれらに共有結合しているポリ(エチレングリコール)を含んでなる請求項26記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記EPOペプチドが細胞内で組み替え的に発現されているものである請求項27記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記細胞が、昆虫の細胞、真菌細胞、および哺乳動物の細胞から構成される群から選ばれるものである請求項28記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記真菌細胞が酵母細胞である請求項29記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記細胞が昆虫の細胞である請求項29記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記細胞が酵母細胞である請求項29記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記細胞が哺乳動物の細胞である請求項29記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記哺乳動物の細胞がCHO細胞である請求項33記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が約1kDa,2kDa,5kDa,10kDa,20kDa,30kDa,および40kDaからなる群から選択される分子量を有するものである請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が20kDaの分子量を有するものである請求項35記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記EPOペプチドが天然産のEPOペプチドおよび変異EPOペプチドからなる群から選択されるものである請求項12記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記変異EPOペプチドが、Arg139からAla139、Arg143からAla143、およびLys154からAla154からなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するSEQ ID NO:73のアミノ酸列を含むものである請求項37記載のグリコPEG化EPOペプチド。
- (a)EPOペプチドをポリ(エチレングリコール)に共有結合した糖ヌクレオチドとグリコシルトランスフェラーゼの混合物に、該ポリ(エチレングリコール)を該EPOペプチドに転移するのに十分な条件下で接触させる、
段階を含む、グリコPEG化EPOペプチドを造る方法。 - 糖ヌクレオチドの糖が、フコース(Fuc)、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース(Gal)およびシアル酸(SA)からなる群から選択されるものである請求項39の方法。
- 前記シアル酸がN−アセチルノイラミン酸(NAN)である請求項40記載の方法。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が約1kDa,2kDa,5kDa,10kDa,20kDa,30kDa,および40kDaからなる群から選択される分子量を有するものである請求項39記載の方法。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が20kDaの分子量を有するものである請求項42記載の方法。
- 前記EPOペプチドが細胞内で組み替え的に発現されているものである請求項39記載の方法。
- 前記細胞が、昆虫の細胞、真菌細胞、および哺乳動物の細胞から構成される群から選ばれるものである請求項44記載の方法。
- 前記細胞が昆虫の細胞である請求項45記載の方法。
- 前記細胞が酵母細胞である請求項45記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物の細胞である請求項45記載の方法。
- 前記哺乳動物の細胞がCHO細胞である請求項45記載の方法。
- 前記EPOペプチドが天然産のEPOペプチドおよび変異EPOペプチドから構成される群から選択されるものである請求項39記載の方法。
- 前記変異EPOペプチドが、SEQ ID NO:73の列を有するものである請求項50記載の方法。
- 前記変異EPOペプチドが、Arg139からAla139、Arg143からAla143、およびLys154からAla154からなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するSEQIDNO:73のアミノ酸列を含むものである請求項50記載の方法。
- 段階(a)の前に、(b)前記EPOペプチドを、該GlcNAcと該EPOの間の結合を形成するのに十分な条件下でヌクレオチド−GlcNAcが基質である、ヌクレオチドーN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)分子およびN−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ(GnT)、ここで該GnTがGnTI,GnTII,GnTIII,GnTIV,GnTV,およびGnTVIからなる群から選択される、からなる混合物と接触させる請求項39の方法。
- 前記混合物がGnTI,GnTII,GnTIII,GnTIV,GnTV,およびGnTVIからなる群から選択される一つのGnTを含むものである請求項53の方法。
- 前記GnTが、GnTIである請求項54の方法。
- 前記GnTが、GnTIIである請求項54の方法。
- 前記グリコPEG化EPOペプチドが少なくとも一つのモノ触角グリカンを含む請求項39記載の方法。
- 前記糖ヌクレオチドの糖がガラクトースであり、前記グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ(GalTI)である請求項39記載の方法。
- 段階(a)の前で、しかし段階(b)の後で、(c)前記EPOペプチドを、ガラクトース(Gal)ヌクレオチドとガラクトシルトランスフェラーゼI(GalTI)との混合物に、ガラクトースを該EPOペプチドに転移するに十分な条件下で、接触させる請求項53記載の方法。
- 段階(a)において、前記糖ヌクレオチドの糖がシアル酸であり、前記グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである請求項39記載の方法。
- 前記シアル酸がN−アセチルノイラミン酸(NAN)である請求項60記載の方法。
- 前記シアリルトランスフェラーゼがα(2,3)シアリルトランスフェラーゼ、α(2,6)シアリルトランスフェラーゼおよび(2,8)シアリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項60に記載の方法。
- 請求項39の方法により造られるグリコPEG化EPOペプチド。
- SEQ ID NO:73の列であるグリコPEG化EPOペプチド。
- SEQ ID NO:73の列を含み、さらに該列において変異を含むグリコPEG化EPOペプチド。
- (a)EPOペプチドを、ポリ(エチレングリコール)に共有結合した糖ヌクレオチドとフコシルトランスフェラーゼであるグリコシルトランスフェラーゼの混合物に、該ポリ(エチレングリコール)を該EPOペプチドに転移するのに十分な条件下で接触させる、
段階を含む、グリコPEG化EPOペプチドを造る方法。 - 前記フコシルトランスフェラーゼがフコシルトランスフェラーゼI、フコシルトランスフェラーゼIII、フコシルトランスフェラーゼIV、フコシルトランスフェラーゼV、フコシルトランスフェラーゼVI、フコシルトランスフェラーゼVIIからなる群から選択される請求項66記載の方法。
- 請求項66の方法により造られるグリコPEG化EPOペプチド。
- 前記EPOペプチドがCHO細胞中で発現される請求項66記載の方法。
- 哺乳動物に、ペプチドについたグリコ共有結合分子をもつ一つまたはそれ以上のグリカンを有するEPOペプチドを、投与することからなり、該哺乳動物においてヘマトクリット濃度を増加するに有効な量で投与されるものである、
貧血症をもつ哺乳動物を処置する方法。 - 前記哺乳動物が人間である請求項70記載の方法。
- EPOと少なくとも一つのグリカンと少なくとも一つの該グリカンに共有結合しているポリ(エチレングリコール)分子を含むグリコPEG化EPOペプチドの有効量を投与することからなり、該ポリ(エチレングリコール)分子がグリコシルトランスフェラーゼを用いて該EPOペプチドに加えられ、該EPOペプチドが該哺乳動物においてヘマトクリット濃度を増加するに有効な量で投与されるものである、
哺乳動物にエリスロポエチン治療を施す方法。 - 前記哺乳動物が人間である請求項72記載の方法。
- 哺乳動物に、EPOペプチドと少なくとも一つのグリカンと少なくとも一つの該グリカンに共有結合しているポリ(エチレングリコール)分子を含むグリコPEG化EPOペプチドを投与することからなり、該ポリ(エチレングリコール)分子がグリコシルトランスフェラーゼを用いて該EPOペプチドに加えられ、該EPOペプチドが該哺乳動物においてヘマトクリット濃度を増加するに有効な量で投与されるものである、
貧血症をもつ哺乳動物を処置する方法。 - 前記哺乳動物が人間である請求項74記載の方法。
- 前記貧血症が化学療法に関連している請求項75記載の方法。
- 患者に、EPOペプチドと少なくとも一つのグリカンと少なくとも一つの該グリカンに共有結合しているポリ(エチレングリコール)分子を含むグリコPEG化EPOペプチドを投与することからなり、該ポリ(エチレングリコール)分子がグリコシルトランスフェラーゼを用いて該EPOペプチドに加えられ、該EPOペプチドが該患者においてヘマトクリット濃度を増加するに有効な量で投与されるものである、
腎臓透析患者を治療する方法。
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