ES2204509T3 - Conjugados de gcsf. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado fisiológicamente activo que tiene la fórmula en la que G es un factor estimulante de colonias de granulocitos menos el o los grupos amino del mismo que forman un enlace amida con un resto de polietilenglicol en el conjugado; R es un alquilo inferior; n es un número entero de 420 a 550; y m es un número entero de 1 a 5.
Description
Conjugados de GCSF.
El factor estimulante de colonias de granulocitos
(GCSF), es una proteína farmacéuticamente activa que regula la
proliferación, diferenciación, y activación funcional de los
granulocitos neutrófilos (Metcalf, Blood 67:257 (1986); Yan et al.,
Blood 84(3):795-799 (1994); Bensinger et al.,
Blood 81(11):3158-3163 (1993); Roberts et
al., Expt'l Hematology 22:1156-1163 (1994); Neben et
al., Blood 81(7):1960-1967 (1993)). El GCSF
puede movilizar células madre y precursoras de la médula ósea y se
usa para tratar a pacientes cuyos granulocitos se han consumido por
quimioterapia, o como preludio a transplantes de médula ósea.
La Patente de EE.UU. núm. 5.214.132 describe una
muteína del GCSF humano que difiere del hGCSF nativo en las
posiciones 1, 3, 4, 5, y 17, donde en vez de los aminoácidos del
GCSF nativo, la muteína tiene en cambio Ala, Thr, Tyr, Arg, y Ser
respectivamente. (Véase también, Kuga et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 159: 103-111 (1989)). M. Okabe et al.,
(Blood 75(9): 1788-1793 (1 de Mayo de 1990))
presenta un derivado de rhGCSF, que muestra mayor actividad
específica que el rhGCSF intacto en células madre de médula ósea de
ratón y/o humana en dos ensayos. La patente de EE.UU. núm.
5.218.092 describe una muteína de GCSF humano que difiere del hGCSF
nativo en las posiciones 1, 3, 4, 5, 17, 145 y 147, donde en vez de
los aminoácidos del GCSF nativo, la muteína tiene en su lugar Ala,
Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn y Ser, respectivamente.
La biodisponibilidad de compuestos terapéuticos
proteínicos tales como GCSF, está limitada a menudo por su corta
semivida en el plasma y por su susceptibilidad a la degradación con
proteasa, impidiendo que se manifieste su máxima potencia clínica.
Estudios de otras proteínas terapéuticas han mostrado que dichas
dificultadas pueden superarse conjugando la proteína a un polímero
tal como polietilenglicol (PEG), típicamente por medio de un resto
de unión enlazado covalentemente tanto a la proteína como al
PEG.
Se ha indicado que dichas biomoléculas conjugadas
con PEG poseen propiedades clínicamente útiles (Inada et al., J.
Bioact. and Compatible Polymers, 5:343 (1990); Delgado et al.,
Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249 (1992);
y Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91 (1993)). Entre éstas
están una mejor estabilidad física y térmica, una protección contra
la susceptibilidad a la degradación enzimática, una solubilidad
aumentada, una semivida circulante in vivo más larga y un
aclaramiento reducido, una inmunogenicidad y una antigenicidad
reducidas y una toxicidad reducida.
En EP-A-0335423;
EP-A-0401384;
US-A-5281698;
EP-A-0721958; R.W. Niven et al., J.
Controlled Release 32:177-189 (1994); y
Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and
Function, 17:157-160 (1992)), se describen
conjugados GCSF-PEG que tienen estructuras
diferentes del conjugado de este invento.
En consecuencia, el invento es una nueva clase de
derivados PEG de GCSF. El conjugado de este invento tiene un enlace
amida como puede verse más adelante.
Comparado con el GCSF no modificado (es decir,
GCSF sin un PEG unido), el conjugado tiene una semivida circulante y
un tiempo de permanencia en plasma aumentados, aclaramiento
reducido, y actividad granulopoyética in vivo aumentada.
Además, comparado con los conjugados GCSF-PEG, el
conjugado de este invento tiene propiedades granulopoyéticas
superiores. Otros conjugados GCSF-PEG se describen
en la Solicitud de Patente Europea núm. EP-0335423;
la Solicitud de Patente Europea núm. EP-0401384; y
en Niven et al., Ibid. Sin embargo, el conjugado de este
invento tiene una estructura diferente de estos otros conjugados, y
tiene propiedades superiores, en particular la de exhibir alta y
prolongada actividad granulopoyética in vivo a una dosis
baja.
Un GCSF preferido de este invento es una muteína
(término derivado del acrónimo inglés de mut ant
pro tein ) de GCSF, que tiene propiedades equivalentes
o superiores al GCSF nativo y tiene los mismos usos que el GCSF. La
muteína tiene la misma secuencia de aminoácidos que el GCSF excepto
en las posiciones 1, 3, 4, 5, y 17, donde en vez de los aminoácidos
del GCSF nativo, la muteína tiene en su lugar Ala, Thr, Tyr, Arg, y
Ser respectivamente (muteína de GCSF). (Véase Figura 1). Esta
muteína se describe en la patente de EE.UU. núm. 5.214.132, que se
incorpora aquí por referencia.
El conjugado GCSF-PEG
fisiológicamente activo de este invento tiene la fórmula
También son parte de este invento las
composiciones de los conjugados reivindicados donde m y n pueden ser
números enteros diferentes para los conjugados en la
composición.
El conjugado de este invento tiene los mismos
usos que el GCSF. En particular, el conjugado de este invento es
útil para tratar a pacientes cuyos granulocitos se han consumido
por quimioterapia o como un preludio de transplantes de médula ósea,
de la misma forma en que se usa el GCSF para tratar estos procesos.
Sin embargo, el conjugado de este invento tiene propiedades
mejoradas incluyendo estabilidad superior, mayor solubilidad,
semivida circulante y tiempos de permanencia en plasma
mejorados.
Figura 1: Estructura Primaria de la muteína de
GCSF
La muteína de GCSF muestra diferencias respecto
del GCSF humano tipo salvaje en las posiciones 1, 3, 4, 5, y 17,
donde en vez de los aminoácidos del GCSF nativo, la muteína tiene
en cambio Ala, Thr, Tyr, Arg, y Ser respectivamente.
Figura 2: Reactivos de Pegilación
( Pegilación es un término derivado del acrónimo de
p oli e tilen g licol (PEG), y
significa reacción con PEG)
Figura 3: Separación de muteína de GCSF no
modificada y modificada con PEG de 20 kDa. Un perfil de elución
típica para la mezcla de reacción con PEG.
Columna: 1-2 ml Fractogel® EMD
SO_{3} 650S.
Tampón de equilibración: Acetato de amonio 10 mM,
pH 4,5
Tampones de elución: 1. NaCl 0,15 M en tampón de
equilibración
\hskip3.075cm2. NaCl 0,5 M en tampón de equilibración
Figura 4: Actividad de la muteína de
GCSF-PEG en el día 5 después de una sola
inyección.
Se inyectaron subcutáneamente ratones C57BL/6J
hembras con 25,2 \mug de los conjugados de muteína de GCSF
pegilada; el quinto día después de la administración, se recogieron
muestras de sangre venosa del seno retroorbital. Se determinaron el
hemograma completo Coulter y la fórmula leucocitaria; los recuentos
de neutrófilos resultantes se normalizaron frente a un vehículo
control para cada experimento. Los datos mostrados representan la
media \pm D.T. de 4 ratones por grupo.
Figura 5: Aumento en los niveles de PMN en
función de la masa de PEG (kDa) en conjugados
PEG-muteína de GCSF unidos por amida y urea. Para
los conjugados hechos con reactivo SPA, se cumple que PMN =
0,277PM+3,95. Para los conjugados hechos con reactivo urea, se
cumple que PMN = 0,152 PM+2,74.
Figura 6: Actividad de la muteína de
GCSF-PEG en el día 7 después de una sola
inyección.
Se inyectaron subcutáneamente ratones C57BL/6J
hembras con 25,2 \mug de los conjugados de muteína de GCSF
pegilada; el séptimo día después de la administración, se
recogieron muestras de sangre venosa retroorbital. Se determinaron
el hemograma completo Coulter y la fórmula leucocitaria; los
niveles de neutrófilos resultantes se normalizaron frente al
vehículo de control para cada experimento. Los datos mostrados
representan la media \pm D.T. de 4 ratones por grupo.
Figura 7: Análisis de colonias tras la
movilización de PBSC murinas
Figura 8: Análisis de colonias tras la
movilización de PBSC murinas
Figura 9: Análisis de colonias tras la
movilización de PBSC murinas
Figura 10: Análisis de colonias tras la
movilización de PBSC murinas
Figura 11: Análisis de colonias tras la
movilización de PBSC murinas
El invento reivindicado es un conjugado
GSCF-PEG fisiológicamente activo que tiene la
fórmula
donde G es un factor estimulante de colonias de
granulocitos menos los grupos amino del mismo que participan en un
enlace amida con un resto de polietilenglicol como se muestra en la
fórmula I, R es un alquilo inferior, n es un número entero de 420 a
550, y m es un número entero de 1 a
5.
Los números n y m se seleccionan tal que el
conjugado resultante de Fórmula I tiene una actividad fisiológica
equiparable a la GCSF no modificado, cuya actividad puede
representar la misma que, más que, o una fracción de la actividad
correspondiente del GCSF no modificado. n representa el número de
restos de óxido de etileno en la unidad PEG. Una sola subunidad PEG
de OCH_{2}CH_{2} tiene un peso molecular de aproximadamente 44
daltons. m representa el número de unidades PEG unidas a la molécula
de GCSF. Un conjugado de este invento puede tener una, dos, tres,
cuatro, cinco o seis unidades PEG por molécula de GCSF. Así, el peso
molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular del GCSF)
depende de los números n y m.
n puede tener un valor de 420 a 550, produciendo
un conjugado en que cada unidad PEG tiene un peso molecular promedio
de aproximadamente 18 kilodaltons a aproximadamente 25 kilodaltons
por unidad PEG. Preferiblemente, n tiene un valor de 450 a 490,
produciendo un conjugado en que cada unidad PEG tiene un peso
molecular promedio de aproximadamente 20 kilodaltons. m puede tener
un valor de 1, 2, 3, 4, ó 5. Un m preferido es 1-4,
y un m especialmente preferido es 2. El intervalo de peso molecular
de la parte PEG de los conjugados de este invento es de
aproximadamente 18 kilodaltons (n=420, m=1) a aproximadamente 125
kilodaltons (n=550, m=5). Cuando n es de 420 a 550 y m es un número
entero de 1 a 4, el intervalo de peso molecular de la parte PEG de
los conjugados de este invento es de aproximadamente 18 kilodaltons
(n=420, m=1) a aproximadamente 97 kilodaltons (n=550, m=4). Un peso
molecular de "aproximadamente" un cierto número significa que
está dentro de un intervalo razonable que contiene a ese número
como se determina por técnicas analíticas convencionales.
En un conjugado preferido n es 450 a 490 y m es
1-4, en cuyo caso el intervalo de peso molecular de
la parte PEG de los conjugados es de aproximadamente 20 kilodaltons
(n=450, m=1) a aproximadamente 86 kilodaltons (n=490, m=4). En otro
conjugado preferido n es 420 a 550 y m es 2, en cuyo caso el
intervalo de peso molecular de la parte PEG de los conjugados es de
aproximadamente 37 kilodaltons (n=420) a aproximadamente 48
kilodaltons (n=550). En un conjugado especialmente preferido, n es
450 a 490 y m es 2, en cuyo caso el intervalo de peso molecular de
la parte PEG de los conjugados es de aproximadamente 40 kilodaltons
(n=450) a aproximadamente 43 kilodaltons (n=490).
R puede ser cualquier alquilo inferior, por lo
que se entiende un grupo alquilo que tiene de uno a seis átomos de
carbono tal como metilo, etilo, isopropilo, etc. Se incluyen
alquilos ramificados. Un alquilo preferido es metilo.
Por GCSF se entiende la proteína natural o
recombinante, preferible humana, como se obtiene de cualquier fuente
convencional tal como tejidos, síntesis de proteínas, cultivo
celular con células naturales o recombinantes. Dicho término abarca
cualquier proteína que tiene la actividad de GCSF, tal como muteínas
o proteínas modificadas de otra manera. Obtener y aislar GCSF a
partir de fuentes naturales o recombinantes es bien conocido
(Véase, por ejemplo, Patentes EE.UU. núms. 4.810.643, y 5.532.341,
los contenidos de las cuales se incorporan aquí por referencia). Un
conjugado de GCSF preferido es un conjugado con Muteína de GCSF
como se describe en la patente de EE.UU. núm. 5.214.132.
El conjugado fisiológicamente activo de Fórmula I
tiene actividad de GCSF, por lo que se entiende cualquier fracción o
múltiplo de cualquier actividad conocida de GCSF, como se determina
por diversos ensayos conocidos en la técnica. En particular, el
conjugado de este invento tiene actividad de GCSF como se muestra
por la capacidad de aumentar el recuento de PMN. Esta es una
actividad conocida del GCSF. Dicha actividad en un conjugado puede
determinarse por ensayos bien conocidos en la técnica, por ejemplo,
los ensayos descritos debajo (Véase también: Asano et al., Jpn.
Pharmacol. Ther. (1991) 19:2767-2773; Yamasaki et
al., J. Biochem. (1994) 115:814-819; y Neben et
al., Blood (1993) 81:1960).
El conjugado de Fórmula I se produce por unión
covalente de un GCSF con un reactivo ácido succinimidilpropiónico de
la fórmula
El reactivo de fórmula II puede obtenerse por
métodos convencionales, según procedimientos conocidos (Véase
patente de EE.UU. núm. 5.672.662, los contenidos de la cual se
incorporan aquí por referencia). n es la misma que en la fórmula I
anterior, y está seleccionada para producir un conjugado del peso
molecular deseado. Se prefieren dichos reactivos en que n es de 450
a 490 (PM=20 kDa). Otros pesos moleculares pueden obtenerse variando
n para los materiales iniciales PEG-alcohol para el
reactivo de la Fórmula II, por métodos convencionales. El reactivo
SPA de fórmula II en pesos moleculares de 5, 10, 15 y 20 kDa, puede
obtenerse de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama).
El reactivo de fórmula II puede conjugarse al
GCSF por métodos convencionales. La unión es por medio de un enlace
amida. Específicamente, el reactivo de Fórmula II reacciona ante
todo con uno o más de los grupos amino primarios (por ejemplo
N-terminal y las cadenas laterales de lisina) del
GCSF para formar un enlace amida entre el GCSF y la cadena
principal del polímero de PEG. El NH mostrado en la Fórmula I se
deriva de este(os) grupo(s) amino primario(s)
del GCSF que reaccionan con el reactivo de Fórmula II para formar
un enlace amida. En menor grado, el reactivo de Fórmula II puede
reaccionar también con el grupo hidroxi de la Serina en la posición
66 del GCSF para formar un enlace éster entre el GCSF y la cadena
principal del polímero de PEG. Las condiciones de reacción son
convencionales para una persona experta, y se proporcionan en
detalle debajo.
La unión de los reactivos al GCSF puede lograrse
por métodos convencionales. Pueden usarse PEG de cualquier PM
seleccionado de este invento (n). Por ejemplo, la reacción puede
llevarse a cabo en disolución a un pH de 5 a 10, a temperatura de
4ºC a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas,
utilizando una relación molar de reactivo a proteína de 4:1 a 30:1.
Las condiciones de reacción pueden seleccionarse para dirigir la
reacción hacia producir predominantemente un grado deseado de
sustitución. En general, una baja temperatura, un bajo pH (por
ejemplo pH 5) y un corto tiempo de reacción tienden a disminuir el
número de PEG unidos (menor m). Una alta temperatura, un pH neutro
a alto (por ejemplo pH\geq7) y un mayor tiempo de reacción
tienden a aumentar el número de PEG unidos (mayor m). Por ejemplo,
en el caso del reactivo de 5 kDa de fórmula II, a pH 7,3 y a una
relación molar reactivo a proteína de 30:1, una temperatura de 4ºC
y un tiempo de reacción de 30 minutos produjeron predominantemente
el conjugado mono-PEG; una temperatura de 4ºC y un
tiempo de reacción de 4 horas produjeron predominantemente el
conjugado di-PEG; y una temperatura ambiente y un
tiempo de reacción de 4 horas produjeron predominantemente el
conjugado tri-PEG. La reacción se terminó
acidificando la mezcla de reacción y congelando a -20ºC. En
general, se prefieren un pH de 7 a 7,5, y una relación molar
reactivo a proteína de 4:1 a 6:1.
Pueden usarse métodos de purificación tales como
cromatografía de intercambio de cationes para separar conjugados por
diferencia de carga, que separa eficazmente conjugados en sus
diversos pesos moleculares. Por ejemplo, la columna de intercambio
de cationes puede cargarse y luego lavarse con acetato sódico
\sim20 mM, pH \sim4, y luego eluirse con un gradiente lineal de
NaCl (0 M a 0,5 M) tamponado a un pH de 3 a 5,5, preferiblemente a
pH \sim4,5. El contenido de las fracciones obtenidas por
cromatografía de intercambio de cationes puede identificarse por
peso molecular usando métodos convencionales, por ejemplo,
espectroscopia de masas, SDS-PAGE, u otros métodos
conocidos para separar entidades moleculares por peso molecular.
Después y de acuerdo con esto se identifica una fracción que
contiene el conjugado de Fórmula I con el número (m) deseado de PEG
unidos, se purifica para liberarlo del GCSF no modificado y de
conjugados que tienen otros números de PEG unidos.
También es parte de este invento una composición
de conjugados donde se incluyen conjugados que tienen diferentes
valores de m en relaciones específicas. Una composición preferida
de este invento es una mezcla de conjugados donde m=1, 2, 3 y 4. El
porcentaje de conjugados donde m=1 es 18-25%, el
porcentaje de conjugados donde m=2 es 50-66%, el
porcentaje de conjugados donde m=3 es 12-16%, y el
porcentaje de conjugados donde m=4 es hasta 5%. Dicha composición se
produce haciendo reaccionar el reactivo de pegilación con GCSF en
una relación molar de 4 a 6:1 (exceso de reactivo). La reacción se
deja proceder a 4ºC a 8ºC durante 20 horas a pH cercano a 7,5. A
final de la reacción se añade ácido acético. El conjugado se
purifica entonces para liberarlo de la proteína no modificada
residual, del exceso de reactivo de pegilación y de otras impurezas
y componentes tamponadores presentes durante la reacción. Junto con
proteína pegilada, se producen como subproducto de reacción,
N-hidroxisuccinimida y ácido
polietilenglicol-carboxílico.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para
ilustrar el invento descrito aquí, y no lo limitan de ningún modo.
Se usa Muteína de GCSF en estos ejemplos. Otras especies de GCSF
también pueden conjugarse a PEG por los métodos ejemplificados.
Los reactivos enlazadores GABAamida, contienen 2
cadenas de PEG de 6 ó 12 kDa cada una. Véase Figura
2-A para las estructuras.
Se produjeron enlazadores amida de cinco y 10
kDa. Véase Figura 2-B para la estructura.
Este reactivo fue un ácido succinimidilpropiónico
(SPA) comercial, preparado con moléculas PEG de 5, 10, 15 y 20 kDa,
y su estructura general se ilustra en la Figura
2-C.
Este reactivo se preparó con moléculas PEG de 5,
10 y 25 kDa, y la estructura típica se ilustra en la Figura
2-D.
Se produjeron enlazadores uretano de diez y 20
kDa y la estructura se muestra en la Figura
2-E.
Como indica la estructura de este reactivo PEG de
36 kDa preparado comercialmente, ilustrada en la Figura
2-G, un extremo del reactivo PEG está terminalmente
bloqueado con un grupo t-butilo. Este reactivo fue
el PEG de mayor P.M. usado en este ejemplo.
Esta estructura de reactivo de pegilación puede
verse en la Figura 2-F. El P.M. del PEG usado en
este reactivo fue de 20 kDa.
Los siguientes reactivos fueron proporcionados
por Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokyo, Japón): 1) la muteína de
G-CSF llamada Muteína de GCSF, Muteína de GCSF
conjugada a un reactivo metoxipolietilenglicol
(m-PEG) ramificado que comprende 2 cadenas de
m-PEG de 6 ó 12 kDa cada una
(PEG-GABA-NHS, véase Fig. 2A),
Muteína de GCSF conjugada a un reactivo éster/amida lineal de
m-PEG de 5 y 10 kDa (véase Fig. 2B). Los reactivos
de m-PEG-ácido
succinimidilpropiónico-NHS
(PEG-SPA), que tienen pesos moleculares de 5, 10,
15 y 20 kDa, se compraron en Shearwater Polymers, (Huntsville,
Alabama, véase Fig. 2C). Los siguientes reactivos de pegilación de
proteína se prepararon en Hoffmann-La Roche, Inc: 1)
enlazador m-PEG-urea (5, 10 y 25
kDa, véase Fig. 2D), 2), enlazador
m-PEG-uretano (10 y 20 kDa, véase
Fig. 2E), enlazador
m-PEG-tiouretano (10 y 20 kDa, véase
Fig., 2F). El reactivo enlazador
t-butil-m-PEG-uretano
con un P.M. promedio de 36 kDa se obtuvo de DDI Pharmaceuticals,
Inc. (Mountainview, CA, véase Fig. 2G).
Los factores que afectan a las reacciones de
pegilación son 1) pH, 2) temperatura, 3) tiempo de reacción, 4)
relación molar proteína a reactivo PEG, y 5) concentración de
proteína. Controlando uno o más de estos factores, se puede dirigir
la reacción a producir predominantemente conjugados con mono-, di-,
tri-PEG, etc. Por ejemplo, las condiciones de
reacción para el reactivo SPA-PEG 5000
(N-hidroxisuccinimida) de Shearwater Polymer fue 1)
pH 7,3 2) temperatura de 4ºC, para mono- y di-PEG, y
temperatura ambiente para tri-PEG, 3) tiempo de
reacción para mono-PEG, 30 minutos; para di- y
tri-PEG, 4 horas y 4) relación molar proteína a
reactivo de 1:30. Para todos los reactivos, las condiciones de
reacción óptimas para producir las especies PEG deseadas se
determinaron individualmente. Se muestran en la Tabla 1. La reacción
se terminó acidulando la mezcla de reacción y congelando a
-20ºC.
La mezcla de reacción, que contenía
aproximadamente 5 mg de proteína, se diluyó de 10 a 20 veces con
agua y el pH se ajustó a 4,5 con ácido acético glacial. La muestra
diluida se aplicó entonces a una columna de 1-2 ml
de Fractogel EMD SO_{3} - 650S (EM Separations, Gibbstown, Nueva
Jersey) previamente envasada, que se equilibró con acetato de amonio
10 mM, pH 4,5. El reactivo no absorbido y los subproductos de
reacción se separaron en el flujo. La muteína de GCSF modificada se
eluyó con un gradiente en una etapa usando NaCl 0,15 M en el tampón
de equilibración. La Muteína de GCSF no modificada restante en la
columna se eluyó en una etapa con NaCl 0,5 M en el tampón de
equilibración. La mezcla separada del conjugado Muteína de GCSF PEG
se esterilizó por filtración con un filtro 0,2 \mum y se almacenó
congelada a -20ºC.
Las concentraciones de proteína de los conjugados
purificados de Muteína de GCSF y PEG se determinaron usando un valor
A_{280} de 0,86, para una disolución 1 mg/ml.
\newpage
Este análisis se realizó usando geles de
poliacrilamida al 12 y 15% o geles de gradiente de poliacrilamida al
8-16%, bajo condiciones reductoras, según Laemmli,
Nature 227:680-685, 1970.
La composición porcentual de cada especie (mono-,
di-, tri-, etc.) en las diversas mezclas de reacción de Muteína de
GCSF-conjugado PEG, se determinó a partir de medidas
densiométricas de geles SDS-PAGE teñidos con azul de
Coomassie (véase Tabla 2).
La masa total de PEG sustituido en diversos
preparados se determinó a partir del peso molecular promedio de PEG,
de la identificación de conjugados individuales PEG (mono-, di-,
etc.) basándose en la movilidad electroforética, del número de
moléculas PEG unidas, y de la composición porcentual basada en
medidas densiométricas de geles de SDS-PAGE teñidos
con azul de Coomassie. La masa total de PEG de un preparado
particular es la suma de las masas de los PEG individuales. La masa
de un PEG individual se calcula a partir de la siguiente
ecuación:
Masa de PEG = P.M. de PEG x
nº moléculas PEG x % de
composición
donde
P.M. de PEG \sim 5, 10, 20 kDa, etc.
nº Moléculas PEG = 1, 2, 3 para mono, di, tri,
respectivamente.
También se ha usado la espectrometría de masas
(MALDI-TOF) en la determinación de la masa total de
PEG. En este ejemplo, el espectro de masas permitió la
identificación y la determinación del peso molecular de los
conjugados individuales de PEG. El P.M. del PEG vinculado a cada
conjugado de PEG es el P.M. total de los conjugados individuales de
PEG menos el P.M. de la muteína de GCSF (18,9 kDa). Estos valores
multiplicados por el % de composición dan las masas individuales de
PEG; su suma es la masa total de PEG.
Ambos métodos se han utilizado para determinar
las masas PEG de diversos preparados. Los resultados se resumen en
la Tabla 2.
Los niveles de endotoxina se determinaron usando
el método LAL, según las instrucciones del fabricante (Associates of
Cape Cod, Inc., Woods Hople, Massachussets).
El bioensayo in vitro en células
M-NFS-60 y el ensayo in vivo
en ratones C57BL/6J hembras se realizaron como se ha descrito
previamente. (Véase Asano et al., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991)
19:2767-2773).
Generalmente, los resultados indican que los
reactivos menos reactivos, tales como el enlazador urea, requieren
mayor pH, temperatura, y relación molar proteína:reactivo, además de
tiempo de reacción más largo, para obtener la cantidad deseada de
conjugación (véase Tablas 1 y 2).
Un perfil típico de elución se muestra en la
Figura 4. Además de la cromatografía de intercambio de cationes,
pueden necesitarse etapas adicionales tal como cromatografía de
penetración en gel, para eliminar trazas de contaminantes y
endotoxinas, y para realizar el intercambio de tampón del producto
final para el almacenaje. El método fuerte de separación por
intercambio de cationes se ha elevado a una escala de 30 mg para
los conjugados SPA (amida) de 20 kDa y uretano de 20 kDa. Se
obtienen recuperaciones casi cuantitativas con este
procedimiento.
Los resultados de composición porcentual y masa
de PEG se resumen en la Tabla 2. Según la experiencia, en el caso de
conjugados de PEG de alto P.M. (por ejemplo, diPEG SPA de 20 kDa y
GABA de 12 kDa), la identificación de las especies de PEG basadas
en la movilidad electroforética para determinar el % de composición
de una mezcla de reacción no es muy segura. Para determinar la masa
de PEG, y la identificación de conjugados de PEG de alto P.M. y alto
grado de sustitución se necesita una combinación de análisis
SDS-PAGE, SP-HPLC y
MALDI-TOF MS. Sin embargo, los conjugados
monopegilados y PEG derivados de reactivos PEG de bajo P.M. (por
ejemplo, 5 kDa), pueden identificarse con precisión bastante a
partir de sus perfiles SDS-PAGE respectivos.
Usando el método LAL, se detectó <1 EU/mg de
endotoxina en todos los conjugados PEG excepto en el derivado del
reactivo de uretano. En este conjugado de PEG, se detectó
endotoxina sólo después de la dilución. Se ha confirmado que esto
no es debido a contaminación durante la dilución y por lo tanto,
algún material desconocido en esta muestra puede haber causado una
inhibición en el ensayo LAL, a concentración más alta de proteína.
Tras la dilución de la muestra, y diluyendo posteriormente el
material inhibidor, se observó un resultado positivo en
endotoxina.
Las bioactividades in vitro e in
vivo de todos los conjugados de PEG con Muteína de GCSF se
enumeran en la Tabla 2. Generalmente, se observa una relación
inversa entre la actividad in vitro y el grado de
sustitución, además del P.M. del PEG. En cambio, se observa un
aumento en la actividad in vivo al aumentar el P.M. del PEG
sustituido. Esto también ha sido observado por otros colegas
(Satako-Ishikawa et al., Cell Struct Funct.
17(3):157-60, 1992). Se ha postulado que la
unión química de moléculas de PEG a la cadena principal del
polipéptido de la muteína de GCSF produce alguna forma de cambios
conformacionales que afecta adversamente a las interacciones
receptor/ligando disminuyendo así la afinidad del enlace. Además, el
tiempo de incubación relativamente corto del ensayo in vitro
es probablemente insuficiente para que se alcance la actividad
pico. Por otro lado, el ensayo in vivo en ratones es mucho
más largo (días) y se termina varios días después de la inyección
del fármaco. Este tiempo de incubación más largo, combinado con la
semivida circulante aumentada de la muteína de
GCSF-PEG, compensa cualquier pérdida en la afinidad
del enlace debida a la pegilación. El resultado final es la
obtención de la máxima bioactividad in vivo. Otra hipótesis
es que la muteína de GCSF-PEG está actuando como un
profármaco cuando se inyecta en ratones. En esta situación, el
resto PEG de la muteína de GCSF-PEG de alguna manera
se está dividiendo, dando por resultado un resto sostenido de
cantidades diminutas de Muteína de GCSF libre, lo que explica el
mantenimiento y aumento de la actividad in vivo. Sin
embargo, la hipótesis del profármaco no explica la actividad basal
in vivo observada, 7 días después de la dosis inicial. El
mecanismo del profármaco es improbable porque el enlace amida entre
la proteína y el PEG es estable y difícilmente divisible.
Entre los 15 conjugados de PEG con Muteína de
GCSF estudiados, las actividades in vivo de
P-12GA-1, SPA de 20kDa, uretano de
20 kDa y uretano de 36 kDa, fueron significativamente mayores que
el resto de los preparados (Véase Figura 4 y Tabla 2).
Sobre todo, se observa una relación directa entre
el P.M. de la molécula de PEG y un aumento de actividad in
vivo. Esto se ilustra en la Figura 5, donde el aumento en los
niveles de PMN se expresa en función de la masa total de PEG en los
conjugados de PEG unidos por amida (SPA) y por urea.
Después de una cuidadosa evaluación de la química
de conjugación, las propiedades biológicas y los resultados del
diseño de fármacos entre los 15 conjugados de PEG, los tres
elegidos para la evaluación adicional son: 1)
P-12GA-1, 2) SPA de 20 kDa y 3)
uretano de 20 kDa. Los conjugados de mono-, di- y
tri-PEG derivados de SPA de 20 kDa presentes en la
mezcla de reacción purificada por SP, se evaluaron en una
comparación cabeza con cabeza que mostró que los tres mantenían alta
actividad granulopoyética en ratones C57BL/6J hembras durante 5 días
con una sola dosis de 25,2 \mug (Tabla 3 y Figura 4). En
contraste, se necesitaron dosis diarias de Muteína de GCSF no
modificada para mantener actividades similares (no se muestran
datos). En todos los casos salvo en dos (SPA de 20 kDa y
P-12GA-1), la actividad in
vivo volvió a niveles normales en el día 7 después de la dosis
inicial de los ratones (Figura 6). Los conjugados, tanto SPA de 20
kDa como P-12GA-1, exhibieron
actividad aumentada a la menor dosis de 8,4 \mug y volvieron a
niveles normales en el día 7 (véase Tabla 3). El dato de
composición porcentual (Tabla 3) indica que los preparados, tanto
SPA de 20 kDa como P-12GA-1,
contienen aproximadamente 50% de dímero y el 50% restante se
distribuye entre el monómero y el trímero. El reactivo uretano de 20
kDa produce predominantemente mono-PEG bajo las
condiciones experimentales usadas (véase Tabla 3). La actividad
in vitro de todos los conjugados PEG evaluados, incluyendo
el derivado de uretano predominantemente monomérico, sigue el patrón
general de una relación inversa entre el grado de sustitución,
además del P.M. de PEG. La actividad biológica in vivo de
los conjugados de PEG evaluados mostró una relación directa con el
P.M. del PEG sobre el intervalo de peso molecular evaluado (Figura
5).
Entre los 15 conjugados de PEG con Muteína de
GCSF examinados, los preparados de unión
P-12GA-1, SPA de 20kDa y uretano de
20kDa exhibieron buenos perfiles de actividad in vivo. La
muteína de GCSF-PEG de 20 kDa exhibió las mejores
propiedades totales, incluyendo la rentabilidad de producción.
Se realizó la modificación de la muteína de
G-CSF con ácido
metoxi-PEG-succinimidilpropiónico
(SPA) de 20 kDa como sigue. El reactivo PEG se disolvió en agua
destilada a una concentración de \sim200 mg/ml y se añadió a la
disolución de muteína de G-CSF (\sim5 mg/ml) en
una relación molar de 4:1 a 6:1 (exceso de reactivo). La reacción
se dejó proceder a 4ºC a 8ºC durante 20 horas a pH \sim7,5. Al
final de la reacción, se añadió ácido acético glacial para parar la
reacción. La muteína de GCSF pegilada (también llamada PEGG) se
purificó entonces para separarla de la muteína no modificada
residual, del exceso de reactivo PEG, y de otras impurezas y
componentes tamponadores presentes durante la modificación. Junto
con la proteína pegilada, se producen
N-hidroxisuccinimida y ácido
polietilenglicol-carboxílico como subproductos de
reacción.
El PEGG se purificó usando cromatografía de
intercambio de cationes seguido de ultrafiltración. La columna de
intercambio de cationes se cargó y lavó con acetato sódico 20 mM,
pH 4,0. La elución con un gradiente lineal de cloruro sódico separó
el PEGG de todos los demás componentes en la mezcla de reacción.
Posteriormente, se usó ultrafiltración/diafiltración para concentrar
el PEGG a \sim4,0 mg/ml y para cambiar el tampón a acetato sódico
20 mM, cloruro sódico 50 mM, pH 6,0.
Cinco pegilaciones y las operaciones de
purificación llevadas a cabo bajo las condiciones enumeradas
anteriormente, se analizaron usando cromatografía de intercambio de
cationes, y esto ha demostrado la reproducibilidad de la reacción
de pegilación de la muteína de G-CSF. Se demostró
que la reacción de pegilación es reproducible en operaciones de
hasta 2,5 g (rendimiento final de PEGG) bajo las siguientes
condiciones óptimas: relación de SPA-PEG de 20 kDa:
muteína de 4 a 6:1; pH \sim7,5, 4ºC, 20 horas. La composición
porcentual promedio de la mezcla de PEGG se determinó que era 21,7%
de mono-PEGG (% RSD = 16,6), 60,3% de
di-PEGG (% RSD = 6,6), 15,1% de
tri-PEGG (% RSD = 4,0), y 2,9% de
tetra-PEGG (% RSD = 26,1), como se muestra en la
Tabla 4.
| Número de | Mono-PEGG (%RSD, | Di-PEGG (%RSD, | Tri-PEGG (%RSD, | Tetra-PEGG (%RSD, |
| marcha | cinco determinaciones) | cinco determinaciones) | cinco determinaciones) | cinco determinaciones) |
| 1 | 21,9% (8,0) | 60,3% (2,2) | 15,1% (2,2) | 2,7% (4,7) |
| 2 | 27,5% (2,3) | 54,4% (1,0) | 15,7% (0,8) | 2,4% (1,2) |
| 3 | 18,2% (7,1) | 65,5% (0,6) | 14,3% (6,6) | 2,0% (9,3) |
| 4 | 21,7% (2,7) | 60,1% (1,0) | 14,8% (0,5) | 3,5% (Q,9) |
| 5 | 19,2% (1,8) | 61,3% (0,9) | 15,7% (3,7) | 3,8%(4,5) |
| Composición | 21,7 (16,6) | 60,3% (6,6) | 15,1% (4,0) | 2,9% (26,1) |
| promediada |
Se han desarrollado técnicas para movilizar tanto
células madre primitivas como precursores comprometidos procedentes
de la médula ósea, y para expandir células precursoras circulantes
en sangre periférica. Estas células estimuladas pueden ser capaces
de mediar el injerto temprano y sostenido siguiendo la irradiación
letal y el transplante de médula ósea o células madre. Neben, S.
Marcus, K y Mauch, P: Mobilization of hematopoietic stem and
progenitor cell subpopulations from the marrow to the blood of mice
following cyclophosphamide and/or granulocyte colony- stimulating
factor. Blood 81:1960 (1993). El reclutamiento de células
madre de sangre periférica (PBSC) puede ayudar a acortar la
recuperación hematopoyética en pacientes con hipoplasia de médula
ósea inducida por quimioterapia o en los que sufren otros
tratamientos mieloablativos. Roberts, AW y Metcalf, D: Granulocyte
colony-stimulating factor induces selective
elevations of progenitor cells in the peripheral blood of mice.
Experimental Hematology 22:1156 (1994). Se han usado
tanto factores de crecimiento como fármacos quimioterapéuticos para
estimular la movilización. Bodine, D: Mobilization of peripheral
blood "stem" cells: where there is smoke, is there fire?
Experimental Hematology 23:293 (1995). Tras la
estimulación de PBSC, se cosechan las células movilizadas mediante
leucaféresis y se conservan en frío hasta el momento en que se
necesiten. Los protocolos clínicos actuales hacen llamamiento a la
recogida repetida de concentrados de PBSC mediante leucaféresis
tras una quimioterapia normalizada de dosis alta (CHT) y una
dosificación diaria repetida o infusión continua con factores de
crecimiento, durando a veces dos semanas o más. Brugger, W, Bross,
K, Frisch, J, Dern, P, Weber, B, Mertelsmann, R y Kanz, L:
Mobilization of peripheral blood progenitor cells by sequential
administration of Interleukin-3 and
granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor following polychemotherapy
with etoposide, ifosfamide, and cisplatin. Blood
79:1193 (1992). Los estudios descritos más abajo se
realizaron con dos modelos de ratón de movilización de PBSC, el
primero en ratones normales, y el segundo en un modelo de
quimioterapia. Los experimentos demuestran la eficacia aumentada de
la muteína de G-CSF pegilada de acuerdo con este
invento (PEGG), comparada con la de NEUPOGEN
(G-CSF), para efectuar la movilización de células
madre. También queda claramente establecida la superioridad de la
muteína pegilada en un régimen de dosificación significativamente
reducido y más efectivo.
Estos estudios evaluaron la capacidad de
expansión de PBSC murinas inmaduras movilizadas, estimuladas in
vitro con múltiples factores de crecimiento en un ensayo de la
colonia de agar de siete días. Además de la capacidad de formar
colonias, se realizó un hemograma completo más un recuento absoluto
de neutrófilos (ANC) en la sangre de todos los ratones. También se
determinaron los niveles de G-CSF en suero. Tras la
optimización del ensayo, se realizaron varios experimentos de
tiempo, y se examinaron altas y bajas dosis de
G-CSF. Los modelos experimentales incluyeron la
movilización inducida por G-CSF y ciclofosfamida
(Citoxano), además de un tratamiento de combinación usando tanto CHT
como la citocina.
En todos los experimentos se usaron ratones
C57BL/6J hembras de 6 a 10 semanas de edad, comprados a The Jackson
Laboratory. Los ratones se inyectaron IP en el día -1 con o bien
Citoxano 200 mg/kg, o vehículo salino (PBS) tamponado con fosfato.
En el día 0, los animales se inyectaron con SC con 0,1 ml de, o
bien NEUPOGEN (GCSF), PEGG (muteína pegilada unido a SPA de 20 kDa,
nº lote P20W3), o vehículo PBS que contiene 1% de suero de ratón
normal. A los ratones que recibieron Neupogen, se dieron
inyecciones diarias de la misma dosis, mientras que todos los demás
ratones recibieron vehículo. En el día del sacrificio, se recogió
sangre periférica de los senos retroorbitales de ratones
anestesiados en tubos que contenían EDTA. Para cada grupo, se
añadió un pequeño volumen de sangre total reunida para triplicar las
placas de cultivo de tejido de 35 mm^{2} que contenía 1000 U/ml
de Interleucina-3 de ratón recombinante (rm), 100
ng/ml de factor de células madre de rm, y 1000 U/ml de
Interleucina-6 de rm, en un total de 1 ml de medio
RPMI 1640 enriquecido con suero bovino fetal al 15% y agar Difco al
0,35%. Los cultivos de agar solidificado se incubaron durante una
semana a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en
aire. Las colonias se enumeraron usando un microscopio de disección
estéreo bajo iluminación de campo oscuro.
En el primer estudio mostrado, los ratones
normales recibieron inyecciones diarias de 25 \mug/ratón de
NEUPOGEN en los días 0-5, o una sola inyección de 25
\mug/ratón de PEGG en el día 0. Los ratones se sacrificaron en
los días 3-7. Como se ve en la Figura 7, la
movilización, demostrada por la formación de colonias, aumentó
significativamente en los ratones inyectados con NEUPOGEN en los
días 3 y 4, pero empezaron a volver gradualmente a niveles
iniciales a partir del día 5 (a pesar de las inyecciones de
NEUPOGEN a lo largo del día 5). Los ratones inyectados con PEGG,
por otro lado, demostraron números de colonias más altamente
evaluados, que permanecieron en niveles meseta a lo largo del día
7.
El paradigma para el modelo de quimioterapia fue
similar. Los ratones en los grupos CHT recibieron una inyección de
Citoxano en el día -1. Algunos ratones recibieron entonces sólo
vehículo en días posteriores, mientras otros recibieron un
tratamiento de combinación de, o bien inyecciones diarias de
NEUPOGEN en los días 0-5, o una sola inyección de
PEGG en el día 0. La Figura 8 muestra un pico en los ratones
tratados con Citoxano en el día 4, con una vuelta gradual a niveles
iniciales en días posteriores. Tanto los grupos con pico en el día
5 de NEUPOGEN como de PEGG, demostraron números de colonias
altamente elevados. Sin embargo, los valores de Citoxano+PEGG
permanecieron significativamente muy elevados por encima de los
observados en el grupo Citoxano+NEUPOGEN a lo largo de los días 6 y
7. La Figura 9 demuestra el efecto sinérgico de la terapia de
combinación comparada con la de Citoxano o G-CSF
sólo.
Un segundo estudio se muestra en las Figuras 10 y
11. Ratones normales que reciben inyecciones diarias de una dosis
inferior de 3 \mug/ratón de NEUPOGEN durante 10 días
consecutivos, demostraron un nivel relativamente bajo de
movilización "multifásica" en todo el curso de tiempo
examinado. Los animales inyectados con una sola dosis de
\hbox{3 \mu g/}ratón de PEGG manifestaron
aproximadamente cinco veces ese número de células precursoras
movilizadas en la circulación periférica en el día 4, aunque el
efecto fue una sola descarga, que ocurrió esencialmente dentro de
los 6 días.
En los ratones inyectados con Citoxano, una sola
dosis de 3 \mug/ratón de PEGG indujo aproximadamente a una
cantidad equivalente de movilización de PBSC como 30 \mug/ratón
de NEUPOGEN inyectado en 10 dosis diarias de
\hbox{3
\mu g/}día (Fig. 11). Tanto los grupos con pico en
movilización de células precursoras en el día 5, como la magnitud
de los picos, fue idéntica. La única diferencia pareció ser un
efecto persistente ligeramente más largo de NEUPOGEN. Los números
de colonias en el modelo CHT fueron 4-10 veces más
altos que en el modelo de ratón normal.
Estos experimentos demuestran dos ventajas
potenciales distintas de la muteína pegilada sobre el NEUPOGEN.
Primero, es evidente la mayor eficacia de PEGG comparado a NEUPOGEN
en la capacidad de inducir la movilización de PBSC, tanto en
ratones normales como en tratados con quimioterapia. Segundo, se ha
observado que la muteína pegilada es más eficaz que el NEUPOGEN en
ratones, usando un régimen de dosis reducido y más eficaz que el
utilizado corrientemente con el producto clínico.
Claims (21)
1. Un conjugado fisiológicamente activo que tiene
la fórmula
en la que G es un factor estimulante de colonias
de granulocitos menos el o los grupos amino del mismo que forman un
enlace amida con un resto de polietilenglicol en el conjugado; R es
un alquilo inferior; n es un número entero de 420 a 550; y m es un
número entero de 1 a
5.
2. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que R es metilo.
3. El conjugado según la reivindicación 2, en el
que n es de 450 a 490.
4. El conjugado según la reivindicación 2, en el
que m es un número entero de 1 a 4.
5. El conjugado según la reivindicación 4, en el
que m es 2.
6. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que el factor estimulante de colonias de granulocitos es Muteína de
GCSF que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 1.
7. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que n es de 450 a 490.
8. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que m es un número entero de 1 a 4.
9. El conjugado según la reivindicación 8, en el
que m es 2.
10. El conjugado según la reivindicación 1, en el
que el factor estimulante de colonias de granulocitos es la Muteína
de GCSF que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 1.
11. El conjugado según la reivindicación 1, que
tiene una semivida circulante más larga y mayor actividad
granulopoyética in vivo que el factor estimulante de la
colonia de granulocitos no conjugado correspondiente.
12. El conjugado según la reivindicación 11, en
el que el factor estimulante de colonias de granulocitos es la
Muteína de GCSF que tiene la secuencia que se muestra en la Figura
1.
13. Un conjugado según la reivindicación 1, en el
que R es metilo; n es un número entero de 450 a 490; m es 2; y G es
la Muteína de GCSF que tiene la secuencia que se muestra en la
Figura 1 menos los grupos amino del mismo que forman un enlace
amida con un resto de polietilenglicol en el conjugado.
14. Una composición que comprende conjugados
fisiológicamente activos que tienen la fórmula
en la que G en cada uno de los conjugados es un
factor estimulante de colonias de granulocitos menos el o los
grupos amino del mismo que forman un enlace amida con un resto de
polietilenglicol en los conjugados; R en cada uno de los conjugados
es independientemente un alquilo inferior; n en cada uno de los
conjugados es independientemente un número entero de 420 a 550; en
cada uno de los conjugados m es independientemente un número entero
de 1 a 4; el porcentaje de conjugados donde m es 1 es de dieciocho
a veinticinco por ciento; el porcentaje de conjugados donde m es 2
es de cincuenta a sesenta y seis por ciento; el porcentaje de
conjugados donde m es 3 es de doce a dieciséis por ciento; y el
porcentaje de conjugados donde m es 4 es hasta cinco por
ciento.
15. La composición según la reivindicación 14, en
la que R es metilo en cada uno de los conjugados.
16. La composición según la reivindicación 14, en
la que n y R son los mismos en cada uno de los conjugados.
17. La composición según la reivindicación 14, en
la que n es de 450 a 490.
18. La composición según la reivindicación 14, en
la que en cada uno de los conjugados, el factor estimulante de
colonias de granulocitos es la Muteína de GCSF que tiene la
secuencia que se muestra en la Figura 1.
19. Una composición según la reivindicación 14,
en la que R es metilo; n en cada uno de los conjugados es el mismo y
es un número entero de 450 a 490; G es la Muteína de GCSF que tiene
la secuencia que se muestra en la Figura 1 menos los grupos amino
del mismo que forman un enlace amida con un resto de
polietilenglicol en el conjugado; en cada uno de los conjugados m
es independientemente un número entero de 1 a 4; el porcentaje de
conjugados donde m es 1 es de dieciocho a veinticinco por ciento;
el porcentaje de conjugados donde m es 2 es de cincuenta a sesenta y
seis por ciento; el porcentaje de conjugados donde m es 3 es de
doce a dieciséis por ciento; y el porcentaje de conjugados donde m
es 4 es hasta cinco por ciento.
20. Un método para producir un conjugado
GCSF-PEG que tiene una semivida circulante más larga
y mayor actividad granulopoyética in vivo que el GCSF no
conjugado correspondiente, cuyo método consiste en enlazar
covalentemente un reactivo de la fórmula
al GCSF para producir dicho
conjugado.
21. Un método según la reivindicación 20, en el
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