CN101242858B - 具有可降解键的轭合物以及用于制备这种轭合物的聚合物试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有可降解键的轭合物和用于制备这种轭合物的聚合物试剂。所述缀合物以及用于生成该轭合物的聚合物试剂包括下列的至少一种：含有可电离氢原子的芳香族部分，间隔部分，以及水溶性聚合物。本发明还提供了制备聚合物试剂和轭合物的方法，以及用于施用轭合物和组合物的方法。
Description
技术领域
本发明一般涉及用于提供轭合物的聚合物试剂，所述轭合物在聚合物与另一部分间具有可降解的键。此外，本发明还涉及所述聚合物试剂的轭合物，用于合成所述聚合物试剂的方法以及将所述聚合物试剂轭合至活性剂以及其他部分的方法等。
背景技术
科学家和临床医师在他们在试图将活性剂开发成适于给药至患者的形式中面临许多挑战。例如，多肽活性剂通常通过注射而非口服给药。这样，将多肽引入全身循环而不曝露于胃的蛋白水解环境。然而，多肽注射存在几种不足。
例如，多数多肽具有相对短的半衰期，从而需要重复注射，这通常是不方便和痛苦的。而且，有些多肽可能引起一种或多种免疫反应，结果是，患者的免疫系统试图破坏或以其它方式中和免疫原性多肽。当然，一旦多肽被破坏或以其它方式被中和，该多肽则不能发挥其所期望的药效活性。因此，活性剂如多肽的给药通常是有问题的，即使是通过注射施用这些物质。
在解决通过注射施用活性剂的问题方面，已经取得了一些成功。例如，将活性剂轭合至水溶性聚合物已得到免疫原性和抗原性降低的聚合物-活性剂轭合物。此外，这些聚合物-活性剂轭合物与其未轭合的相应物相比通常具有大幅增加的半衰期，原因是经由肾的清除的减少和/或全身循环中酶降解的减少。由于具有更长的半衰期，聚合物-活性剂轭合物需要更少频率的给药，这反过来减少了痛苦注射与健康保健专业人士不便探诊的总次数。此外，仅少许可溶的活性剂当与至水溶性聚合物轭合时表明水溶性显著增加。
由于其已证明的安全性以及FDA批准用于局部和体内应用，聚乙二醇已被轭合至活性剂。当活性剂被轭合至聚乙二醇或“PEG”聚合物时，该轭合的活性剂通常称为“PEG化的”。PEG化活性剂如PEGASYS
PEG化干扰素α-2a(霍夫曼-拉罗氏(Hoffmann-La Roche)，Nutley市，新泽西州)、PEG INTRONPEG化干扰素α-2b(先灵公司，Kennilworth市，新泽西州)以及NEULASTATM PEG非格斯亭(安进公司，Thousand Oaks市，加州)的商业成功证明，轭合形式的活性剂给药可比未轭合相应物具有显著优势。小分子如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Zalipsky(1993)Bioconjug.Chem.4(4)：296-299)和氟尿嘧啶(Ouchi等.(1992)Drug Des.Discov.9(1)：93-105)也已被PEG化。Harris等已提供了PEG化对药物影响的综述。Harris等(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2(3)：214221。
尽管已有这些成功，但是聚合物轭合至活性剂以得到商业上相关药物常常是挑战性的。例如，轭合可导致聚合物连接在活性剂上对于药理活性而言所必需的位点或其附近(例如，位于或接近结合位点)。因此，例如由于聚合物引入的空间影响，这种轭合可能具有不能接受的低活性。当活性剂少有或者没有其他适于连接聚合物的位点时，补救具有不能接受较活性轭合物的努力可能失败。因此，人们渴望另外的PEG化替代物。
有人建议解决这种或者其他问题的方法是“可逆PEG化”，其中释放原始活性剂(或者与PEG化活性剂相比具有增加活性的部分)。例如，美国专利申请公开号2005/0079155描述了应用可逆键的轭合物。如该公开文件中所述的，可逆键能够通过应用酶底物部分而实现。但是，已被指出的是，依赖于酶活性的方法是取决于酶的可用性。参见Peleg Schulman(2004)J.Med.Chem.47：4897-4904。因此，已说明期望有不依赖酶处理用于降解的另外方法。
一种用于可逆PEG化的这种方法描述了包含芴部分的聚合物试剂，所述芴部分上应用马来酰亚胺化学连接有支链聚合物。同样，参见PelegSchulman(2004)J.Med.Chem.47：4897-4904和WO 2004/089280。用于生成所述聚合物试剂的合成方法是复杂的，需要许多步骤。因此，无需这种复杂合成路线的替代聚合物试剂是所需要的。
另一个可逆轭合方法描述于美国专利号6,514,491中。在这个专利中描述的结构包括如下那些结构：其中水溶性的非肽聚合物通过单个连接点连接至芳香基团。尽管在该轭合物内提供了可降解的键，但需要提供能与轭合物形成可降解键的其他聚合物试剂。
因此，仍然需要更多的、用于提供在聚合物与另一部分之间具有可降解键的轭合物的聚合物试剂。另外，需要提供一系列聚合物试剂，用于提供具有一系列释放速率的轭合物。因此，本发明目的是解决本领域中的这些和其它需要。
发明概述
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式聚合物试剂：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以生成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式聚合物试剂：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以生成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式聚合物试剂：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以生成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式聚合物试剂：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
X3是第三间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以生成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式聚合物试剂：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以生成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了一种下式聚合物试剂：
其中：
POLY是水溶性聚合物；
X是间隔部分，它不包括
或
部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
Re，当其存在时，是电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以生成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式轭合物：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式轭合物：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了下式轭合物：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了包含如下结构的轭合物：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
X3是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了包含如下结构的轭合物：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了包含如下结构的轭合物：
其中：
POLY是水溶性聚合物；
X是间隔部分，它不包括
或
部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
Re，当其存在时，是电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了用于制备聚合物试剂的方法，该方法包括：
(a)提供带有第一连接位点、第二连接位点、任选第三连接位点以及任选其他连接位点的芳香族部分；
(b)将官能团试剂与所述第一连接位点反应，以得到带有能与活性剂氨基反应的官能团的第一连接位点，并且得到可释放的键，如氨基甲酸酯键；
(c)将带有活性基团的水溶性聚合物与所述第二连接位点和当存在时任选的第三连接位点反应，以得到(i)通过间隔部分带有水溶性聚合物的第二连接位点，其中所述间隔部分不包括部分，和(ii)当存在时通过间隔部分带有第二水溶性聚合物的任选的第三连接位点，其中所述间隔部分不包括
部分。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了根据所述制备聚合物试剂的方法而制备的聚合物试剂。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了用于制备轭合物的方法。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了应用本文所述的新聚合物试剂而制备的轭合物。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了含有所述轭合物的药物制剂。
在本发明的一种或多种实施方案中，提供了用于施用所述轭合物的方法。
附图简述
图1是胰岛素与如实施例2中所述制备的聚合物试剂的反应混合物的HPLC色谱图。
图2是如实施例2中所述制备的PEG化的1-mer轭合物的HPLC色谱图。
图3是表示如实施例2中所述可降解的PEG-胰岛素1-mer轭合物(在pH 7.35和37℃下进行的)的降解研究结果图。
图4对应于如实施例6中所述G2PEG2Fmoc20K-GLP-1反应混合物的SDS-PAGE分析。泳道1：Invitrogen标记12未染色标准品。泳道2：G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1反应混合物。
图5表示如实施例6中所述、经阳离子交换色谱法纯化单PEG化G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1的结果。
图6对应于单PEG化G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1释放GLP-1之前和之后的SDS-PAGE分析(实施例6)。泳道1：Invitrogen标记12未染色标准品。泳道2：经离子交换色谱法纯化后的单PEG化G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1轭合物。泳道3：完全释放GLP-1后的G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1轭合物。
图7A、7B表示如实施例6所述的、经离子交换色谱法纯化后单PEG化G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1轭合物(图7A)以及释放GLP-1后的G2PEG2Fmoc20K-Nter GLP-1轭合物(图7B)的反相HPLC分析。
图8示例了如实施例7中所述的、经阳离子交换色谱法纯化单PEG化G2PEG2Fmoc40K-Nter-GLP-1的结果。
图9表示GLP-1释放前后单PEG化G2PEG2Fmoc40K-Nter-GLP-1的SDS-PAGE分析结果(实施例7)。泳道1：Invitrogen标记12未染色标准品。泳道2：经离子交换色谱法纯化后的单PEG化G2PEG2Fmoc40K-Nter-GLP-1轭合物。泳道3：释放GLP-1后的G2PEG2Fmoc40K-Nter-GLP-1轭合物。
图10表示用阳离子交换色谱法纯化单PEG化G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1(实施例8)。
图11对应于经阳离子交换色谱法纯化的单PEG化G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1的SDS-PAGE分析(实施例8)。泳道1：Invitrogen标记12未染色标准品。泳道2至6：五个各自经离子交换色谱法纯化后、含有单PEG化G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1轭合物的馏分。
图12示例了经阳离子交换色谱法纯化单PEG化G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1的结果(实施例9)。
图13表示了如实施例9中所述的、G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1反应混合物以及来自一个阳离子交换色谱法纯化的馏分的SDS-PAGE分析。泳道1：Invitrogen标记12未染色标准品。泳道2：G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1的反应混合物。泳道3-5：保留体积9.37mL的峰的馏分。泳道6-10：保留体积158.3mL的峰的单PEG化G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1馏分。
图14是表示如实施例10所述的、当皮下给药至db/db小鼠时，GLP-1、G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1轭合物和G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1轭合物的比较性的血糖降低效果与时间曲线图。
图15是表示如实施例10所述的、当皮下给药至db/db小鼠时，GLP-1、G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1轭合物和G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1轭合物的比较性的血糖降低效果与时间曲线图。
图16是自实施例11中完成的实验中获得的结果曲线图。
发明详述
在详细地描述本发明之前，应当理解的是，本发明不受限于特定聚合物、合成技术、活性剂等，诸如此类可以变化。
应当注意的是，如本说明书和权利要求书中所用的，单数形式“一”、“一种”和“所述”包括复数指称对象，除非文中另有明确规定。因此，例如，提及一种“聚合物”包括一种聚合物以及两种或更多相同或不同的聚合物，提及一种“轭合物”是指一种轭合物以及两种或更多相同或不同的轭合物，提及一种“赋形剂”包括一种赋形剂以及两种或更多相同或不同的赋形剂，等等。
在描述和权利要求本发明中，将根据以下所述的定义应用如下术语。
如这里所用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”，是指包括任何水溶性聚环氧乙烷。通常，根据本发明所用的PEG包括如下的结构“-O(CH2CH2O)m-”，其中(m)是2至4000。如这里所用的，PEG还包括“-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2-”和“-(CH2CH2O)m-”，取决于末端的氧是否已被代替。当PEG进一步包括间隔部分(下面将更详细地予以描述)时，组成间隔部分的原子，当共价地连接至水溶性聚合物片段时，不会导致氧-氧键(即，“-O-O-”或过氧化物键)的形成。贯穿本说明书和权利要求书，应当牢记的是，术语“PEG”包括具有各种末端或“封端”基团等的结构。术语“PEG”还指包含多数(换言之，大于50％)-CH2CH2O-单体亚单元聚合物。至于特定的形式，PEG可以取任何数目的多种分子重量、以及如“支链”、“直链”、“分叉的”、“多官能的”等结构或几何形状，下面将更详细地描述。
术语“封端的”或“末端封闭的”在这里是可以互换使用的，以表示具有封端部分的聚合物的末端或终点。通常，尽管非必须地，封端部分包括羟基或C1-20烷氧基。因此，封端部分的实例包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和苄氧基)以及芳基、杂芳基、环、杂环等。此外，包括上述各自的饱和、不饱和、取代以及未取代形式。而且，封端基团还可以是硅烷。封端基团还可有利地包含可检测标记。当聚合物具有包含可检测标记的封端基团时，可以通过应用合适的检测仪来确定聚合物和/或该聚合物所偶联的相关部分(例如活性剂)的数量或位置。这些标记包括但不限于荧光剂、化学发光剂、酶标中所用的部分、比色剂(例如，染料)、金属离子、放射性部分，等等。合适的检测仪包括光度计、胶片、分光计，等等。
涉及聚合物或水溶性聚合物的“非天然的”是指，其作为整体在自然界尚未被发现。但是，非天然的聚合物或水溶性聚合物可以包括一种或多种天然亚单元或亚单元的部分，只要整个聚合物结构在自然界尚未被发现。
术语“水溶性聚合物”是室温下可溶于水的任何聚合物。通常，水溶性聚合物将发射至少约75％、更优选至少约95％的同一溶过滤后所发射的光。以重量计，水溶性聚合物优选地至少约35％(重量)可溶于水，更优选地至少约50％(重量)可溶于水，更优选地约70％(重量)可溶于水，并且更优选地约85％(重量)可溶于水。尽管如此，更优选的是，水溶性聚合物约95％(重量)可溶于水并且最优选的是水溶性聚合物完全溶于水。
在上下文中，本发明的水溶性聚合物(如PEG)的分子量可表示为数均分子量或重均分子量。除另有规定外，这里所有提及的分子量都是指重均分子量。两种分子量的确定，数量平均与重量平均，都可应用凝胶渗透色谱法或其它液体色谱法技术来测定。还可以应用测定分子量值的其它方法，诸如应用端基分析法或依数性(凝固点降低(freezing-pint depression)、沸点升高或渗透压)检测法以确定数均分子量，或者应用光散射技术、超离心法或粘度测定法以确定重均分子量。本发明的聚合物通常是多分散的(即，聚合物的数均分子量与重均分子量不是相等的)，具有低的多分散值，优选地小于约1.2，更优选地小于约1.15，更优选地小于约1.10，更优选地小于约1.05，并且最优选地小于约1.033。
如这里所用的，术语“羧酸”是具有
官能团[亦表示为“-COOH”或-C(O)OH]的部分，以及羧酸衍生物的部分，这种衍生物包括，例如，被保护的羧酸。因此，除非上下文另有明确规定，术语羧酸不仅包括酸形式，还包括相应的酯以及被保护的形式。至于这里所述的适于羧酸和任何其它官能团的保护基，参考Greene等“PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS(有机合成中保护基)”第三版，John Wiley and Sons公司，纽约，1999年。
术语“活性”和“活化的”，当与特定官能团一起使用时，是指易于与另一分子上的亲电试剂或亲核试剂反应的活性官能团。这不同于为了反应而需要强催化剂或非常不实用反应条件的那些基团(即，“非活性”和“惰性”基团)。
术语“被保护的”或“保护基”或“保护性基团”是指存在预防或阻滞分子中特定化学活性官能团在一定反应条件下反应的部分(即保护基)。保护基将根据保护的化学活性官能团类型和所采用的反应条件、以及分子中另外的活性或保护基团的存在(如果有)而改变。本领域已知的保护基可在Greene等，同上文献中查到。
如这里所用的，术语“官能团”或者其任何同义词是指包括其被保护的形式。
这里所用的术语“间隔”或“间隔部分”是指任选地用于将一个部分连接至另一个部分(诸如水溶性聚合物片断连接至含芳香族的部分)的一个原子和原子集合。本发明的间隔部分可以是水解稳定的或者可以包括一个或更多生理学上可水解的或酶可降解的键。
如所用的，有机基团包括，例如，烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基以及取代的芳基。
“烷基”是指烃链，通常长度范围为从约1至20个原子。这种烃链优选但非必需是饱和的，而且也可以是支链或直链的，但通常优选直链。示例性烷基基团包括乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基，等等。如这里所用的，“烷基”包括当提及三个或更多碳原子时的环烷基以及低级烷基。
“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的烷基基团，而且可以是直链或支链的，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
“环烷基”是指饱和的或不饱和的环烃链，包括桥连、稠合或螺环化合物，优选地由3至约12个、更优选地3至约8个碳原子组成。
“非干扰性取代基”是指那些当存在于分子中时通常与分子内包含的其它官能团是非反应性的基团。
例如，在“取代的烷基”中的术语“取代的”是指被一个或多个非干扰性取代基取代的部分(例如，烷基)，诸如但不限于：C3-C8环烷基，例如，环丙基、环丁基，等等；卤，例如，氟、氯、溴以及碘；氰基；烷氧基、低级苯基(例如，0-2取代的苯基)；取代的苯基；等等。“取代的芳基”是指具有一个或多个非干扰性基团作为取代基的芳基。对于苯环的取代，该取代基可以处于任何方位(即，邻位、间位或对位)。
“烷氧基”是指-O-R基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选C1-C20烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄基，等等)，优选C1-C7烷基。
如这里所用的，“烯基”是指含有至少一个双键、长度为1至15个原子的、支链或无支链的烃基，诸如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基等。
如这里所用的术语“炔基”是指包含至少一个三键的、长度为2至15个原子的、支链或无支链的烃基，乙炔基、正丁炔基、异戊炔基、辛炔基、癸炔基等。
“芳基”是指一个或多个芳环，每个环为5或6个核心碳原子。芳基包括多个芳环，这些环可以是稠合的(如在萘基中)或非稠合的(如在联苯中)。芳环还可以与一个或多个环烃、杂芳环或杂环稠合或未稠合。如这里所用的，“芳基”包括杂芳基。芳香族部分(例如，Ar1、Ar2，等)，是指包含芳基的结构。
“杂芳基”是包含一至四个杂原子的芳基基团，所述杂原子优选N、O或S，或者它们的组合。杂芳环还可与一个或多个的环烃、杂环、芳环或杂芳环稠合。
“杂环”或“杂环的”是指一个或多个的5-12个原子、优选5-7个原子的环，带有或者不带有不饱和或芳香特性，并且具有至少一个非碳环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。
“取代的杂芳基”是指具有一个或多个非干扰性基团作为取代基的杂芳基。
“取代的杂环”是指具有一个或多个由非干扰性取代基形成的侧链的杂环。
“亲电试剂”是指离子或原子或原子集合，它可以是电离的，具有一个亲电性中心，即电子在寻找的中心，能够与亲核试剂反应。
“亲核试剂”是指一个离子或原子或原子集合，它可以是电离的，具有一个亲核性中心，即在寻找亲电性中心的中心，或者结合亲电试剂。
“生理学上可裂解的”或者“可水解的”键是一种在生理条件下与水反应(即，被水解)、相对弱的键。键在水中水解的趋势不仅取决于连接两个中心原子的键的大体类型，而且取决于连接到这些中心原子的取代基。适于水解的不稳定或弱的键包括但不限于：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽以及寡核苷酸。
“可降解键”包括但不限于：生理学上可裂解的键、可水解的键以及酶可降解的键。因此，“可降解的键”是可以在生理条件下经历水解或裂解的键，所述水解或裂解通过一些其他机制(例如，酶催化的，酸催化的，碱催化的，等等)。例如，“可降解键”可涉及碱夺取质子(例如，可电离氢原子，Hα)作为驱动力的消除反应。
“酶可降解键”是指经过一种或多种酶降解的键。
“水解稳定的”键是指在水中大体上稳定的化学键，主要是共价键，换言之，在生理条件下经过延长时段不水解至任何可检测程度。水解稳定的键实例包括但不限于：碳-碳键(例如，脂链中)、醚、酰胺、氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)，等等。通常，水解稳定的键是在生理条件下表现为水解速度小于每天约1-2％的键。在大多数标准化学教科书中可查询到代表性化学键的水解速度。应当指出的是，有些键可以是水解稳定的或可水解的，取决于(例如)相邻和邻近原子以及周围条件。例如，通过将感兴趣的含有键的分子置于感兴趣的条件下并检验水解的迹象(例如，源自单个分子裂解的两个分子存在和数量)，本领域的普通技术人员可确定已知的键在规定的环境中是否是水解稳定的或可水解的。还可以应用本领域的普通技术人员已知的、用于确定给定的键是否是水解稳定或可水解的其它方法。
术语“活性剂”、“生物学上活性剂”以及“药理学上活性剂”在这里可以互换使用，并且定义为包括提供一些在体内或体外可证明的药理(通常是有益的)作用的任何物质、药物、化合物、物质的组合物或混合物。这包括食品、食品补充剂、营养品、营养药、药物、蛋白质、疫苗、抗体、维生素以及其它有益物质。如这里所用的，这些术语进一步包括在患者中产生局部或全身作用的、任何生理学上或药理学上活性物质。
“药学上可接受的赋形剂”或者“药学上可接受的载体”是指可包括在本发明的组合物中并对患者不产生显著的、不利的毒理作用的赋形剂。
“药理学上有效的量”、“生理学上有效的量”以及“治疗上有效的量”在这里可互换使用，以表示在血流或靶组织中提供期望水平的活性剂和/或轭合物所需要的聚合物-活性剂轭合物的量—通常存在于药物制品中。准确量将取决于多种因素，例如特定的活性剂、药物制品的组分以及物理特性、预定的患者群、患者考虑，等等，而且是本领域的普通技术人员基于这里所提供的以及相关文献中可获得的信息易于确定的。
在本发明的聚合物上下文中“多官能的”是指其中包含3个或更多官能团的聚合物，其中所述官能团可以是相同或不同的。本发明的多官能聚合物通常包含约3-100个官能团，或者3-50个官能团，或者3-25个官能团，或者3-15个官能团，或者3至10个官能团，或者在所述聚合物中包含3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。“双官能的”聚合物是指其中包含两个相同(即，同双官能的)或不同(即，异双官能的)官能团的聚合物。
在提及聚合物的几何学或整体结构时，“支链”是指具有2个或更多聚合物“臂”的聚合物。支链聚合物可具有2个聚合物臂、3个聚合物臂、4个聚合物臂、8个聚合物臂或者更多个。一种特定类型的高度支链化聚合物是树枝状聚合物或者树枝体(Dendrimer)，基于本发明的目的，认为其具有不同于支链聚合物的结构。
“树枝体”或树枝状聚合物是球形、尺寸单分散的聚合物，其中所有的键都是从中心焦点或核心呈现放射状，具有规则的分支形式和重复单元，每个重复单元都提供一个分支点。树枝体表现某些树枝状态特性，诸如核心包裹，使得它们区别于其它类型的聚合物。
这里所述的碱性或酸性反应物包括其中性的、带电荷的及任何相应的盐形式。
术语“患者”，是指患有或易于患有病状的活的有机体，并包括人类和动物，所述病状可通过施用本发明所提供的轭合物来预防或者治疗。
如这里所用的，术语“可电离的氢原子”“(Hα)”是指在碱(通常为氢氧化物或胺碱)存在下可被除掉氢原子。通常，“可电离的氢原子”“(Hα)”是连接至碳原子的氢原子，反过来，该碳原子被连接到以某种方式稳定碳负离子的、一个或多个芳香族部分或者其他基团，所述碳负离子形成于作为质子的可电离氢原子丧失(或者导致所述碳负离子的过渡态)。
如这里所用的，“药物释放速度”是指全身中聚合物-活性剂轭合物总量的一半裂解成活性剂和聚合物残基的速度(规定为半衰期)。
“任选的”和“任选地”是指随后描述的状况可以发生或者可以不发生，这样，所述描述包括了其中所述状况发生的情况以及未发生的情况。
如这里所用的，“卤”标志符(例如，氟、氯、碘、溴，等等)通常用于当卤素被连接至分子时，而后缀“化物”(例如，氟化物、氯化物、碘化物、溴化物，等等)用于当卤素以其独立的离子形式存在时(例如，如当离去基脱离分子时)。
在本发明讨论的上下文中，应当认识到，除非上下文另有规定，针对一个结构或式所提供的变量的定义适用于不同结构中重复的相同变量。因此，例如，针对聚合物试剂的“POLY”、“间隔部分”、“Re1”等定义同样地可适用于这里所提供的轭合物。
如前所述，本发明包括(除了其它的之外)聚合物试剂，该试剂用于提供在聚合物与另一个部分之间具有可降解键的轭合物。虽然不希望受理论束缚，但我们认为，轭合物以如下方式降解：最小化或全部消除用于形成所述轭合物的聚合物试剂的任何残基或者“标记”。因而，在这里所述聚合物试剂与含有氨基的活性剂反应所生成的轭合物水解之后，有可能再生或回收最初未缀合且未修饰形式的活性剂。
如这里所讨论的以及如这里提供的式所证明的，本发明的聚合物试剂包括一种或多种水溶性聚合物(例如，如在这里所提供的各式中所提出的“POLY1”和“POLY2”)、带有可电离氢原子Hα的含有芳香族部分(例如，如在这里所提供的各式中所提出的“
”)以及能与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团[例如，如在这里所提供的各式中所提出的“(FG)”]。另外，所述聚合物试剂的各种组分可以通过任选的间隔部分(例如，如在这里所提供的各式中所提出的“X”、“X1”、“X2”以及“X3”)连接至其余的聚合物试剂。此外，一个、两个、三个、四个或者更多个电子改变基团(例如，如在这里所提供的各式中所提出的“Re”、“Re1”、“Re2”、“Re3”、“Re4”等)可被连接至含芳香族部分(在聚合物试剂与轭合物之中)。
在说明本发明的示例性聚合物试剂前，首先讨论实施方案的水溶性聚合物、芳香族部分、能与活性剂的氨基反应以形成可降解键(如氨基甲酸酯键)的官能团、电子改变基团以及间隔部分。下面所述的水溶性聚合物、芳香族部分、电子改变基团以及间隔部分不仅适用于聚合物试剂，也适用于应用所述聚合物试剂所形成的、相应的轭合物。
关于给定的水溶性聚合物，每个水溶性聚合物(例如，POLY1、POLY2和POLY3)可以包括任何聚合物，只要该聚合物是水溶性且非肽类的。尽管优选聚乙二醇，但这里所用的水溶性聚合物可以是，例如，其它的水溶性聚合物如其它的聚(烷撑二醇)，如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇与丙二醇的共聚物等，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羟基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰基吗啉)，如美国专利号5,629,384中所述的。水溶性聚合物可以是前述的任何均聚物、共聚物、三元共聚物、非随机嵌段聚合物以及随机嵌段聚合物。此外，水溶性聚合物可以是直链，还可以是其他的形式(例如，支链的，分叉的，等)，如下面进一步详细描述的。在存在于整体结构内时，水溶性聚合物具有1至约300个末端。
在聚合物试剂含有两个或更多水溶性聚合物的情况下，在整体结构中的每个水溶性聚合物可以是相同或不同的。但是，优选的是，在整体结构中的所有水溶性聚合物都是相同类型的。例如，优选的是，在给定结构中的所有水溶性聚合物都各自是聚乙二醇。
尽管任一水溶性聚合物的重均分子量可以变化，但是，任何给定水溶性聚合物的重均分子量通常在下列范围内：100道尔顿至约150,000道尔顿。然而，示例性范围包括下列范围内的重均分子量：约880道尔顿至约5,000道尔顿；范围为大于5,000至约100,000道尔顿；范围为约6,000道尔顿至约90,000道尔顿；范围为约10,000道尔顿至约85,000道尔顿；范围为大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿；范围为约20,000道尔顿至约85,000道尔顿；范围为约53,000道尔顿至约85,000道尔顿；范围为约25,000道尔顿至约120,000道尔顿；范围为约29,000道尔顿至约120,000道尔顿；范围为约35,000道尔顿至约120,000道尔顿；范围为约880道尔顿至约60,000道尔顿；范围为约440道尔顿至约40,000道尔顿；范围为约440道尔顿至约30,000道尔顿；范围为约40,000道尔顿至约120,000道尔顿。对于任何给定的水溶性聚合物，优选的是分子量在一个或多个这些范围内的PEG。
水溶性聚合物的示例性重均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约440道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约16,000道尔顿、约17,000道尔顿、约18,000道尔顿、约19,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、约75,000道尔顿。本发明还可以使用具有上述任何的总重均分子量的、支链形式的水溶性聚合物(例如，由两个20,000道尔顿聚合物组成的支链40,000道尔顿水溶性聚合物)。
在本发明一种或多种的实施方案中，聚合物试剂包括水溶性聚合物，其尺寸范围适合由其形成的轭合物以期望速度释放。例如，具有相对慢的释放速度的轭合物可由如下聚合物试剂制备：所述聚合物试剂的尺寸适于(a)在轭合物降解前延长循环，以及(b)体内中等快速清除轭合物降解后的水溶性聚合物剩余物。同样，当轭合物具有相对快的释放速度时，那么该聚合物试剂通常具有更低的分子量。
当PEG被用作聚合物试剂中的水溶性聚合物时，该PEG通常包括许多(OCH2CH2)单体[或(CH2CH2O)单体，取决于PEG的定义]。如整个说明书所用的，重复单元的数量由“(OCH2CH2)n”中的下标“n”确定。因此，(n)值落入一个或多个的下列范围内：2至约3400，约4至约1500，约100至约2300，约100至约2270，约136至约2050，约225至约1930，约450至约1930，约1200至约1930，约568至约2727，约660至约2730，约795至约2730，约795至约2730，约909至约2730，以及约1,200至约1,900。对于其中分子量是已知的任何给定聚合物，通过聚合物的总重均分子量除以重复单体的分子量，可能确定重复单元的数量(即，“n”)。
每个水溶性聚合物通常是生物相容的且非免疫原的。关于生物相容性，一种物质被认为是生物相容的，条件是如临床医师(例如内科医师)所评价的，所述物质单独或与另一种物质(例如，活性剂)联合应用于活组织(例如，对患者给药)的相关有益作用超出了任何有害的作用。关于非免疫原性，一种物质被认为非免疫原的，条件是所述物质单独或与另一种物质联合应用于活组织时不产生免疫反应(例如，形成抗体)，或者当产生免疫反应时，这种反应如临床医师所评价的不被视为临床上显著的或重要的。特别优选的是，这里所述的水溶性聚合物以及该聚合物与活性剂的轭合物是生物相容的和非免疫原的。
在一种有用的形式中，游离的或非结合的PEG是直链聚合物，各末端为羟基：
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-OH
其中，(m′)范围通常是O至约4,000，优选地约20至约1,000。
上述的聚合物，α-、ω-二羟基聚乙二醇，可以简单形式表示为HO-PEG-OH，应当理解的是，该-PEG-符号可代表如下的结构单元：
-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-
其中，(m′)定义如上。
用于本发明中的另一类型的游离或非结合的PEG是甲氧基-PEG-OH，或简称mPEG，其中一个末端是相对惰性的甲氧基基团，而另一个末端是羟基基团。mPEG的结构规定如下。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)m′-CH2CH2-
其中，(m′)定义如上。
多臂的或支链PEG分子，如美国专利号5,932,462中所描述的，也可用作PEG聚合物。例如，PEG可具有如下结构：
其中，polya和polyb是PEG骨架(相同或不同)，诸如甲氧基聚乙二醇；
R″是非活性部分，例如H、甲基或PEG骨架；并且
P和Q是非活性键。在优选的实施方案中，直链PEG聚合物是赖氨酸双取代的甲氧基聚乙二醇。
此外，PEG可包括分叉PEG。游离的或非结合的分叉PEG的实例以下式表示：
其中，X是间隔部分，且每个Z是通过规定长度的原子链连接至CH的被活化的末端基团。将Z官能团连接至分支碳原子的原子链用作束缚基团，并且可包括，例如，烷基链、醚链、酯链、酰胺链及其组合。美国专利号6,362,254公开了能够用于本发明的各种分叉PEG结构。
PEG聚合物可包括悬垂PEG分子，其具有沿PEG长度共价连接而不是位于PEG链末端的活性基团如羧基。该悬垂活性基团可直接地或者通过间隔部分如亚烷基连接至PEG。
除了上述形式的PEG，还可以制备聚合物中具有一个或多个弱或可降解键的聚合物试剂中的每个水溶性聚合物，包括任何上述的聚合物。例如，可以制备聚合物中具有可以水解的酯键的PEG。如下所示，这种水解导致聚合物裂解成较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→-PEG-CO2H+HO-PEG-
在聚合物骨架中用作可降解键的其他可水解降解的键包括：碳酸酯键；亚胺键，其源自，例如，胺与醛的反应(参见，例如，Ouchi等。(1997)Polymer Preprints 38(1)：582-3)；磷酸酯键，其形成于，例如，醇与磷酸酯基团反应；腙键，其通常形成于酰肼与醛的反应；缩醛键，其通常形成于醛与醇的反应；原酸酯键，其形成于，例如，甲醛与醇的反应；酰胺键，其由氨基(例如，在聚合物如PEG末端上的)与另一个PEG链的羧基形成；氨基甲酸酯键，其形成于，例如，带有末端异氰酸酯基团的PEG与PEG醇的反应；肽键，其由氨基(例如，位于聚合物如PEG末端上的)与肽的羧基形成；以及寡核苷酸键，其由例如亚磷酰胺(例如在聚合物末端上的)与寡核苷酸的5′羟基形成。
对于本领域的普通技术人员而言，应当理解的是，术语聚乙二醇或PEG代表或者包括了所有上述形式的PEG。
本领域的普通技术人员应当认识到，有关大体上水溶性的聚合物的上述讨论绝不是穷尽的，而只是示例性的，而且涵盖具有上述品质的所有聚合物材料。如这里所使用的，术语“水溶性聚合物”是指水溶性聚合物的分子或已被连接至另一个部分的残基。
每个水溶性聚合物都被连接(直接地或者通过包含一个或多个原子的间隔部分)至带有可电离氢原子的、包含芳香族部分。因此，包含芳香族部分用作一个或多个水溶性聚合物的连接点。
不希望被理论所束缚，认为将包含芳香族部分用作一个或多个水溶性聚合物的连接点是有利的。明确地说，通过将每个水溶性聚合物连接(直接地或者通过间隔部分)至包含芳香族部分，与芳香族相关的常见毒性作用可通过水溶性聚合物提供的空间或阻滞效应而减少。这种空间或阻滞效应可减少或消除当施用某些芳香物质时可能发生的潜在损害性代谢过程。因此，目前所述的、具有两个或更多水溶性聚合物的聚合物试剂可提供被认为具有减少毒性的轭合物。认为这种优势区别于其他的聚合物试剂(及相应的轭合物)，其中，例如，将单个支链水溶性聚合物连接至含芳香族部分。
尽管可以应用大多数带有可电离氢原子的任何含有芳香的部分，但是该含有芳香族部分必须提供一个或多个用于连接各种组分的位点。此外，必须认识到，该含芳香族部分自身不必是完全芳香性的。例如，含芳香族部分可以包含一个或多个单独的芳香族部分，任选地，所述芳香族部分彼此直接地或通过含有一个或多个原子的间隔部分连接。
在一些实例中，带有可电离氢原子的芳香族部分可采用下列结构的其中一种形式：
其中：Ar1是第一芳香族部分；Ar2是第二芳香族部分，X3是间隔部分，而且Z是电子改变基团，相对于H。这种电子改变基团将在下面进一步详细地说明。优选的Z基团包括，但不限于，-CF3，-CH2CF3，-CH2C6F5，-CN，-NO2，-S(O)R，-S(O)芳基，-S(O2)R，-S(O2)芳基，-S(O2)OR，-S(O2)O芳基，-S(O2)NHR，-S(O2)NH芳基，-C(O)R，-C(O)芳基，-C(O)OR，-C(O)NHR，等等，其中，R是H或有机基团。
示例性芳香族部分(其可被一个或多个电子改变基团进一步取代，如这里将进一步说明的)包括下列的(这里，在每种情况中，感兴趣的可电离氢原子是被连接至相邻一个或多个芳香环的脂肪族碳的氢，即它是苄型的或类苄型的)：
在一种或多种实施方案中，带有可电离氢原子的含芳香族部分任选地包括一个或多个电子改变基团(“Re”、“Re1”、“Re2”等)。电子改变基团是给电子的(并因此称作“给电子基团”)或者吸电子的(并因此称作“吸电子基团”)的基团。当被连接至带有可电离氢原子的含有芳香族部分时，给电子基团有能力将电子安置于远离自己而更接近所述含芳香族部分或在所述含芳香族部分内。当被连接至带有可电离氢原子的含有芳香族部分时，吸电子基团有能力将电子安置于朝向自己而远离所述含芳香族部分。在确定给定基团是使电子远离自己还是朝向自己的过程中，氢用作对比的标准。
不希望被理论所束缚，通过改变带有可电离氢原子的含芳香族部分的电子位置(即，“电子密度”)，电子改变基团影响可电离氢原子电离的简易性。因此，我们认为，吸电子基团增强了可电离氢原子的酸性，而给电子基团减弱了可电离氢原子的酸性。影响可电离氢原子酸性的给电子和吸电子基团包括：包含在连接这里所提供结构的各种成分的间隔部分(例如，X1、X2、X3等)内的基团。
示例性吸电子基团包括卤(例如、溴、氟、氯和碘)、硝基、羧基、酯、甲酰基、酮基、偶氮基、酰胺羰基、酰胺磺酰基、甲酰胺基、磺氧基、磺酰胺、脲基以及芳基。示例性给电子基团包括羟基、低级烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基等)、低级烷基(如，甲基、乙基等)、氨基、低级烷氨基、二-低级烷氨基、芳氧基(如苯氧基等)、芳烷氧基(如苯氧基等)、氨基芳基(如p-二甲氨基苯基等)、巯基以及烷硫基。
在一种或多种实施方案中，含芳香族部分可包括(除了一个或多个水溶性聚合物之外)一个、二个、三个、四个或更多电子改变基团。其中含有芳香族部分包括两个电子改变基团的示例性实例示于下面的结构中：
其中，
是含有芳香族部分，Ar1是第一芳香族部分，Ar2是第二芳香族部分，Re1是第一电子改变基团，Re2是第二电子改变基团，而可能存在的可电离氢原子(即，Hα)、一个或多个水溶性聚合物以及任何其他组成未显示。当每个Re1和Re2不同时，(a)Re1和Re2可以是不同的吸电子基团，(b)Re1和Re2可以是不同的给电子基团，(c)或者Re1和Re2可以是一个是吸电子基团而另一个是给电子基团。但是，在许多情况下，每个Re1和Re2是相同的。
通常但非必需地，带有可电离氢原子的含有芳香族部分上电子改变基团的安置，通常取决于经过芳香亲电或亲核取代过程而添加的电子改变基团的优选进入点。例如，带有芴环的，电子改变基团通过亲电芳香取代而添加的通常位置是“2”和“7”位。如果这些位置被间隔部分(其被连接至水溶性聚合物)所占据，芴环上其他位置将基于如下因素而被取代：(a)间隔部分(例如，X1和X2)的导向能力，以及(b)空间的影响。但是，当“2”和“7”位不能利用时，而且特别是当α碳，即芴中的“9”-位(即，碳带有可电离氢原子Hα)被取代时，通常芴环的“4”和“5”位代表更可能的连接位点。为了说明，芴环中的位置确定于下列结构：
其中，POLY1、POLY2、X1、X2、R1、R2、Hα以及(FG)各自如下面式I所定义的。尽管关于芴环的电子改变基团以及其他基团的示例性位置已谈及，但是当前所讨论的电子改变基团的位置安排也适用于其他的芳香系统。本领域的普通技术人员可以确定在其他环体系中位置的安排。
如前所述，电子改变基团可根据特定电子改变基团的性质以不同的方式影响含芳香族部分的可电离氢原子的酸性。例如，由于“1”和“8”位上电子改变基团接近如上所示芴环中的可电离氢原子，因此这些位置上的电子改变基团通过键(诱导)效应而具有最大影响。然而，当POLY1-X1-和POLY2-X2-连接于2和7位时，在4或5位上添加电子改变基团就更加可能，原因如上所述(即，间隔部分的导向效应以及空间效应)。通过共振效应而与环相互作用的电子改变基团，如酰胺基、羧基、硝基以及烷氧基，可在距α氢有效距离处提供共振效应。因此，其安置相对靠近可电离氢原子可以是较不重要的。从另一角度讲，将相对靠近的位置(例如“1”和“4”位)保持未被取代是有利的，因为在这些位置上电子改变基团的空间效应可能将阻碍最终将被除去的可电离氢原子。而且，尽管关于芴环的电子改变基团以及其他基团的示例性位置已谈及，但是当前所讨论的位置安置也适用于其他的芳香系统；本领域的普通技术人员可以确定在其他环体系中位置的安置。
为了更好地理解用本发明聚合物试剂所形成轭合物的释放反应(而且也为了证明电子改变基团在所述反应过程中的效应)并不想受任何理论束缚，提供了释放过程的可能机制。利用芴部分作为含芳香族部分，可能机制的示意图表示如下。在示意图中，表示了本发明的示例性轭合物，其中，氨甲酰胺酯键将活性剂(“药物”)残基连接至分子的剩余部分。变量“POLY1”、“POLY2”、“X1”、“X2”、“R1”以及“R2”为如前所定义的。
释放过程通常由碱性分子、离子或在迁移过程中有能力接受质子的物质(“B：”如示意图中所示)攻击而发起。在体内，这可能是几种离子物质或具有几个碱性原子的蛋白质的任何一种。发生消除以形成取代的富烯部分(或者当采用非芴结构时的相应结构)，由此释放活性剂或“药物”物质，他们最初被连接至羧基基团，在生理条件下迅速失去。
释放过程可以是协同的或者逐步的。无论质子除去步骤的确切性质如何，碳负离子作为中间体而形成，或者涉及具有碳负离子特性的过渡态。因此，被连接至芳香环(其阻碍碳负离子的形成)的给电子基团将阻碍碳负离子形成的过程，因而减小释放速度。相反，有助于碳负离子物质的形成并稳定碳负离子过渡态的吸电子基团将加速碳负离子形成过程，因而增加释放速度。
有利地，通过将一个或多个电子改变基团包括到含芳香族部分，有可能的是，更接近地提供所期望的活性剂释放速度。通过将一个或多个吸电子基团包括到含芳香族部分，相信释放将增加，而一个或多个给电子基团的存在相信将减小释放的速度。因此，我们认为，一个或多个电子改变基团的存在能够提供释放反应中可能涉及的带电荷中间体或过渡态的相对稳定性或不稳定性。因此，通过将一个或多个这种电子改变基团包括到含芳香族部分，可能更高地定制所期望的、被轭合至本发明聚合物试剂的最初活性剂的释放速度。
通过如下过程可能确定这种电子改变基团会对轭合物的药物释放速度产生何种影响：制备具有所述电子改变基团的聚合物试剂，应用该聚合物试剂制备轭合物，检验轭合物的药物释放速度与时间，并且将药物释放速度与用对照聚合物试剂制备的轭合物相比较。
为了确定轭合物体外的相对释放速度，可制备并研究轭合物。参见下面的实施例5。甘氨酸轭合物的制备说明于下面的路线中(其中，m-PEGO和OPEG-m各自定义为-O-CH2CH2-(OCH2CH2)n-OCH3，其中每个n是4至1500)。
通过观察在接近中性pH缓冲介质中的反应，研究这种轭合物在模拟的体内条件下的释放速度。通过跟踪含富烯部分随时间的出现，可以计算导致释放的反应的半衰期。这种释放速度可以定量地与电子改变基团的数量和/或类型不同的其他甘氨酸轭合物的释放速度相对比。这样，可确定用于任何给定物质的释放速度。
这里所述的聚合物试剂官能团是能够与活性剂氨基反应生成可降解键(如氨基甲酸酯键)的基团。关于特定的官能团，本发明不受限定，只要该官能团能够与活性剂氨基反应以生成可降解键(如氨基甲酸酯键)。能够与活性剂氨基反应的官能团包括选自下述组的那些基团：活性碳酸酯如N-琥珀酰亚氨基、1-苯并三唑基、咪唑、碳酸酯卤化物(如碳酸酯氯化物和碳酸酯溴化物)、苯酚盐(如对-硝基苯酚盐)等等。同样，作为特殊情况，如果可用的活性剂的活性氨基转化成异氰酸酯或异硫氰酸酯基团，那么聚合物试剂的官能团可以是羟基，因为这些组分的反应提供了可降解的氨基甲酸酯键。
间隔部分(例如，“X”、“X1”、“X2”、“X3”，等)是将分子的一部分连接至另一部分的任何原子或原子组合。然而，为了本发明目的，当原子组合非常接近一个聚合物并且原子组合只是另一个单体以至于所述间隔部分仅代表了聚合物链的延伸时，该原子组合不是间隔部分。例如，给定的部分结构“POLY-X-”和POLY定义为“CH3O(CH2CH2O)m-”，其中(m)是2至4000，且X定义为间隔部分，该间隔部分不能定义为“-CH2CH2O-”，因为这样的定义只是代表聚合物的延伸。然而，在这种情况下，可接受的间隔部分可定义为“-CH2CH2-”。
示例性间隔部分包括但不限于：-C(O)-，-S(O2)-，-S(O)-，-NH-S(O2)-，-S(O2)-NH-，-CH＝CH-，-O-CH＝CH-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-C(S)-，-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-，-O-CH2-，-CH2-O-，-O-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-O-，-S-CH2-，-CH2-S-，-S-CH2-CH2-，-CH2-S-CH2-，-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-CH2-，-CH2-S-CH2-CH2-，-CH2-CH2-S-CH2-，-CH2-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-S-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-S-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-S-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH＝CH-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH2-，-CH2-C(O)-O-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-，-C(O)-O-CH2-CH2-，-NH-C(O)-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-，-NH-CH2-，-NH-CH2-CH2-，-CH2-NH-CH2-，-CH2-CH2-NH-CH2-，-C(O)-CH2-，-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-，-NH-C(O)-O-[CH2]h-(OCH2CH2)j-，二价环烷基基团，-O-，-S-，氨基酸，-N(R6)-，以及任何上述两种或多种的组合，其中，R6是H或者选自烷基、取代烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代芳基的有机基团，(h)是零至六，而且(j)是零至20。其他特定的间隔部分具有如下结构：-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，和-O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，其中随每个亚甲基的下标值表示结构中所含亚甲基的数目，例如，(CH2)1-6是指该结构可含有1，2，3，4，5或6个亚甲基。另外，任何上述的间隔部分可进一步包括包含1至20个环氧乙烷单体单元[即，--(CH2CH2O)1-20]的环氧乙烷寡聚物链。换言之，环氧乙烷寡聚物链可存在于间隔部分之前或之后，并且任选地在包含两个或更多原子的间隔部分的任何两个原子之间。而且，如果寡聚物相邻于聚合物片段而且只代表聚合物片段的延伸，则该寡聚物链不被视为间隔部分的部分。最后，应当注意的是，一些间隔部分包含也用作电子改变基团的原子或原子组；在这种情况下，包含一个或多个另外的、“离散的”(即，不是间隔部分的一部分)电子改变基团可以不是所期望的或必须的。
优选的X和X1间隔部分包括那些选自下述组的间隔部分：-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-，-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-，-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-，-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-，-NH-C(O)-CH2-，-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-O-，-O-CH2-C(O)-NH-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-。优选的X2间隔部分包括那些选自下述组的间隔部分：-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-，CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-，-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-，-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-，-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-，-NH-C(O)-CH2-，-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-O-，-O-CH2-C(O)-NH-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-。
当存在时，整体结构中的每个间隔部分可以是相同或不同于整体结构中任何其他间隔部分。至于X1和X2，有时优选X1和X2是相同的。
优选的对应于X、X1和/或X2的间隔部分包括酰胺羧基、羧基酰胺基、磺酰胺、酯和酰脲基。
在一些实施方案中，优选的是，间隔部分(特别是式VI和VI-C的X)满足下列的一个或多个：缺少硫原子(例如，缺少“-S-”)；缺少磷原子；是大于四个原子的链；和不包括-CO-CH2-NH-CO-，-CO-CH(CH3)-NH-CO-和-CO-CH2-NH-CO-NH。在一些实施方案中，优选的是，间隔部分(特别是式VI和VI-C的X)是原子或原子组，条件是该原子或原子组缺少硫和磷原子，而且不是：-NH-CO-O-，-NH-CO-CH2-NH2-CO-NH-，-NH-CO-，-NH-CH2-，-NH-CO-NH-，-NH-CS-NH-，-CO-O-，-CO-NH-，和-CH2-NH-。在一些实施方案中，间隔部分(特别是式VI和VI-C的X)不是-R5-R6，其中R5选自-NH-，-S-，-CO-，-COO-，-CH2-，-SO2-，-SO3-，-PO2-和-PO3-，而且R6是键或选自下述组的基团：-CO-，-COO-，-CH2-，-CH(CH3)-，-CO-NH-，-CS-NH，-CO-CH2-NH-CO-，-CO-CH(CH3)-NH-CO-，-CO-CH2-NH-CO-NH-，-CO-R8-(其中R8是直链的或支链亚烷基)，含马来酰胺基的基团，和含三嗪基的基团。
在一些情况中，间隔部分和/或任何电子改变基团可以包括直接键合到含芳香族部分的酰胺官能度(即，其中酰胺的氮共价地键合定向至含芳香族部分)。但是，在一些实施方案中，优选的是，间隔部分和/或任何电子改变基团都不包括直接键合到含芳香族部分的酰胺官能度(即，-NH-C(O)-或-C(O)-NH-)。
现在，更详细地讨论本发明的示例性聚合物试剂。应当牢记的是，虽然任何式或结构中(无论是聚合物试剂、轭合物还是任何其他式或结构)未特别显示立体化学，但所提供的式和结构涵盖两种对映体以及含有等量(即，外消旋混合物)和非等量的各个对映体混合物的组合物。因此，例如，其中存在单个电子改变基团(Re1)的式IIc的聚合物试剂包括两种对映体及其混合物。
本发明的示例性聚合物试剂具有如下的结构：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团。
当对应于式I的聚合物试剂没有离散的电子改变基团时[即，对于式I，当(a)和(b)都是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，
和(FG)各自如前关于式I所定义的。
当对应于式I的聚合物试剂具有单个离散的电子改变基团时[即，对于式I，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，
(FG)，和Re1各自如前关于式I所定义的。
当对应于式I的聚合物试剂具有两个离散的电子改变基团时[即，对于式I，当(a)和(b)都是1时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，
(FG)，Re1和Re2各自如前关于式I所定义的。
在有些情况下，聚合物试剂可以包括仅通过带有可电离氢原子的碳原子彼此相连的单独芳香族部分。这样的聚合物试剂具有下式：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
当对应于式II的聚合物试剂没有离散的电子改变基团时[即，对于式II，当(a)和(b)都是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，和(FG)各自如前关于式II所定义的。
当对应于式II的聚合物试剂具有单个离散的电子改变基团时[即，对于式II，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，每个POLY1，POLY2，X1，X2，Ar1，Ar2，Hα，R1，R2，Re1，和(FG)各自如前关于式II所定义的。
当对应于式II的聚合物试剂具有两个离散的电子改变基团时[即，对于式II，当(a)和(b)都是1时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，Ar1，Ar2，Hα，R1，R2，(FG)，Re1，和Re2各自如前关于式II所定义的。
在另一些情况下，聚合物试剂可以包括通过带有可电离氢原子的碳原子以及另一个直接键彼此相连的单独芳香族部分。这样的聚合物试剂具有下式：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
当对应于式III的聚合物试剂没有离散的电子改变基团时[即，对于式III，当(a)和(b)都是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，和(FG)各自如前关于式III所定义的。
当对应于式III的聚合物试剂具有单个离散的电子改变基团时[即，对于式III，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，Re1，和(FG)各自如前关于式III所定义的。
当对应于式III的聚合物试剂具有两个个离散的电子改变基团时[即，对于式III，当(a)和(b)都是1时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，Re1，Re2，和(FG)各自如前关于式III所定义的。
在另一些情况下，聚合物试剂可以包括通过带有可电离氢原子的碳原子以及一个或多个间隔部分彼此相连的单独芳香族部分。这样的聚合物试剂具有下式：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
X3是第三间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
当对应于式IV的聚合物试剂没有离散的电子改变基因时[即，对于式IV，当(a)和(b)都是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，X3，R1，R2，Ar1，Ar2，和(FG)各自如前关于式IV所定义的。
当对应于式IV的聚合物试剂具有单个离散的电子改变基团时[即，对于式IV，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，X3，R1，R2，Ar1，Ar2，Re1和(FG)各自如前关于式IV所定义的。
当对应于式IV的聚合物试剂具有两个离散的电子改变基团时[即，对于式IV，当(a)和(b)都是1时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，X3，Ar1，Ar2，Hα，R1，R2，Re1，Re2和(FG)各自如前关于式IV所定义的。
优选的聚合物试剂包含如下结构：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团，所述可降解键如氨基甲酸酯键。
当对应于式V的聚合物试剂没有离散的电子改变基团时[即，对于式V，当(a)和(b)都是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，Hα，R1，R2和(FG)各自如前关于式V所定义的。
当对应于式V的聚合物试剂具有单个离散的电子改变基团时[即，对于式V，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，Hα，R1，R2，Re1和(FG)各自如前关于式V所定义的。
当对应于式V的聚合物试剂具有两个离散的电子改变基团时[即，对于式V，当(a)和(b)都是1时]，得到下式的聚合物试剂：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，和(FG)各自如前关于式V所定义的。
另一个优选的聚合物试剂是如下结构：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，(a)，(b)和(FG)各自如前关于式V所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。
另一个优选的聚合物试剂是如下结构的：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2和(FG)各自如前关于式V所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。
另一个优选的聚合物试剂是如下结构：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2和(FG)各自如前关于式V所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。
另一个优选的聚合物试剂是如下结构的：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，(a)，(b)和(FG)各自如前关于式V所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。
通常，在式I，Ia，Ic，Ib，II，IIa，IIc，IIb，III，IIIa，IIIc，IIIb，IV，IVa，IVc，IVb，V，Va，Vb，Vc，Vd，Ve，Vf和Vg的每个聚合物试剂中的每个POLY1和POLY2都是相同的。但是，有可能的是，存在其中每个POLY1和POLY2是不同的聚合物试剂。此外，每个POLY1和POLY2通常(但非必要地)是聚(环氧烷)如聚乙二醇。而且，对于给定的聚乙二醇，每个聚乙二醇可用封端部分进行末端封端，所述封端部分选自羟基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。但是，优选的末端封端基团包括甲氧基。用作式I，Ia，Ic，Ib，II，IIa，IIc，IIb，III，IIIa，IIIc，IIIb，IV，IVa，IVc，IVb，V，Va，Vb，Vc，Vd，Ve，Vf和Vg中POLY1与POLY2的每个聚乙二醇的示例性重均分子量包括下列的一种或多种：范围为约120道尔顿至约6,000道尔顿；范围为约6,000道尔顿至约100,000道尔顿；范围为约10,000道尔顿至约85,000道尔顿；范围为约20,000道尔顿至约85,000道尔顿。用作式I，Ia，Ic，Ib，II，IIa，IIc，IIb，III，IIIa，IIIc，IIIb，IV，IVa，IVc，IVb，V，Va，Vb，Vc，Vd，Ve，Vf和Vg中POLY1与POLY2的给定聚乙二醇的示例性构造包括直链和支链。用于每个式I，Ia，Ic，Ib，II，IIa，IIc，IIb，III，IIIa，IIIc，IIIb，IV，IVa，IVc，IVb，V，Va，Vb，Vc，Vd，Ve，Vf和Vg的示例性首个第二间隔部分包括独立选自下述组的X1和X2间隔部分：-NH-C(O)-CH2-，-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-O-，-O-CH2-C(O)-NH-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-。对于式I，Ia，Ic，Ib，II，IIa，IIc，IIb，III，IIIa，IIIc，IIIb，IV，IVa，IVc，IVb，V，Va，Vb，Vc，Vd，Ve，Vf和Vg，同样优选的是，每个R1和R2是H，但也涵盖低级烷基(如甲基和乙基)。此外，对于存在于任何式I，Ia，Ic，Ib，II，IIa，IIc，IIb，III，IIIa，IIIc，IIIb，IV，IVa，IVc，IVb，V，Va，Vb，Vc，Vd，Ve，Vf和Vg中的任何电子改变基团，每个电子改变基团优选地是卤、低级烷基、芳基、取代芳基、取代芳烷基(arylakyl)、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR、-C(O)NHR等，其中Ar是芳基而且R是H或有机基团。
另一个示例性聚合物试剂具有下式：
其中：
POLY是水溶性聚合物；
X是间隔部分，它不包括或
部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
Re是电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团。
另一个示例性聚合物试剂包含如下结构：
其中，POLY，X，R1，R2，(a)和(FG)各自如上面关于式VI所定义的
对应于式VI和VIa的聚合物试剂通常(但非必要地)具有POLY是聚(环氧烷)如聚乙二醇。而且，聚乙二醇可以使用封端部分末端封端，所述封端部分选自羟基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。但是，优选的末端封端基团包括甲氧基。用作式VI和VIa中POLY的聚乙二醇的示例性重均分子量包括下列的一种或多种：范围为约120道尔顿至约6,000道尔顿；范围为约6,000道尔顿至约100,000道尔顿；范围为约10,000道尔顿至约85,000道尔顿；范围为约20,000道尔顿至约85,000道尔顿。用作式VI和VIa中POLY的聚乙二醇的示例性构造包括直链和支链。用于式VI和Via的示例性第二间隔部分包括选自下述组的间隔部分：-NH-C(O)-CH2-，-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-O-，-O-CH2-C(O)-NH-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-，-C(O)-NH-CH2-CH2-O-，和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-。对于式VI和VIa，每个R1和R2优选地是H，但也涵盖低级烷基(如甲基和乙基)。对于式VIa，优选的是，Re是卤、低级烷基、芳基、取代芳基、取代芳烷基(arylakyl)、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR、-C(O)NHR等，其中Ar是芳基而且R是H或有机基团
在一些实施方案中，优选的是，用于式VI的芳香族部分(以及用式VI-C代表的相应轭合物)不是下列中的一种：
本发明的聚合物试剂实例包括下列的：
和
其中，每个(n)是4至1500。
本发明的聚合物试剂可以任何数量的方式来制备。因此，这里所提供的聚合物不受受限于其制备中所用的特定技术或方法。然而，用于制备目前所述聚合物试剂的示例性方法将在下文详细地讨论。
在一种用于制备聚合物试剂的方法中，该方法包括：(a)提供带有第一连接位点，第二连接位点和任选的第三连接位点的含芳香族部分；(b)将官能团试剂与所述第一连接位点反应，以得到带有能够与活性剂氨基反应的官能团的第一连接位点，并且得到可降解的键，诸如氨基甲酸酯；和(c)将带有活性基团的水溶性聚合物与所述第二连接位点和任选的第三连接位点(当存在时)反应，以得到(i)通过间隔部分带有水溶性聚合物的第二连接位点，其中所述间隔部分不包括
部分，和(ii)当存在时，通过间隔部分带有水溶性聚合物的任选的第三连接位点，其中所述间隔部分不包括
部分。在有些实例中，(b)在步骤(c)前实施，而在另外的实例中，(c)在步骤(b)前实施。
因此，在用于制备聚合物试剂的这种方法中，必需的步骤是(a)提供带有第一连接位点，第二连接位点和任选的第三连接位点的含芳香族部分。在合成制备的上下文中，应当理解的是，“提供”材料是指获取该材料(通过，例如，合成它或商业途径获得它)。为了说明的目的，示例性的含芳香族部分是9-羟甲基-2，7-二氨基芴，如下所示。
这种含芳香族部分，9-羟甲基-2，7-二氨基芴，是具有如下三个连接位点的含芳香族部分的一个实例：9位上的羟基以及分别在2和7位上的氨基。含芳香族部分可以碱或盐的形式而提供。对于9-羟甲基-2，7-二氨基芴，可以使用二盐酸化物形式。
已提供了含芳香族部分之后，方法中的另一个步骤通常包括带有活性基团的水溶性聚合物与含芳香族部分上的连接位点反应的步骤。这里，用于将水溶性聚合物连接至含芳香族部分上的一个或多个连接位点的、现有技术已知的任何方法都可以应用，而且该方法不限于特定手段。例如，胺活性PEG(诸如N-琥珀酰亚胺酯封端的mPEG，其形成于，例如，N-羟基琥珀酰亚胺和CH3O-CH2CH2-(OCH2CH2)-OCH2CH2-OCH2COOH与作为缩合剂的二环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺(DIC)以及任选地在碱存在的条件下的反应)可与带有含芳香族部分(如9-羟甲基-2，7-二氨基芴)的胺反应。
在一些实例中，带有活性基团的水溶性聚合物与含芳香族部分的反应导致所有可能连接位点被水溶性聚合物连接其上。在这种情况下，除掉至少一个水溶性聚合物是必要的，这样可以获得与官能团试剂反应的一个连接位点。因此，例如，前一段落中所述的N-琥珀酰亚胺酯封端的mPEG与9-羟甲基-2，7-二氨基芴反应得到混合物，该混合物包括(a)带有两个水溶性聚合物的物质，在两个胺位点上各一个，和(b)带有三个水溶性聚合物的物质，在两个胺位点上各一个，并在羟基位点上一个。这里，通过应用尺寸排除色谱法，除掉并收集较高分子量物质是可能的。此外，有可能的是，将混合物处理至高pH[例如，将混合物处理至氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)]，然后应用离子交换色谱法(IEC)处理混合物。在每一种情况下，所得到的是通常含有带有两个水溶性聚合物的9-羟甲基-2，7-二氨基芴的组合物，所述水溶性聚合物在两个胺位点上各一个。从而可获得用于与官能团试剂反应的第三羟基位点。
最后的步骤是含芳香族部分的活性位点与官能团试剂反应。优选的方法是带有两个水溶性聚合物(在两个氨基位点上各一个)的含羟基的9-羟甲基-2，7-二氨基芴与三光气反应，随后用N-羟基琥珀酰亚胺处理。这样，能与活性剂的氨基反应以形成可降解键如氨基甲酸酯键(在此情况下为“活化的碳酸酯”)的官能团在含有羟基的活性位点上形成。
所述方法的步骤发生于适宜的溶剂中。本领域的普通技术人员可确定任何特定溶剂是否适于任何给定的反应。但是，通常，溶剂优选地是非极性溶剂或极性非质子溶剂。非极性溶剂的非限制性实例包括苯、二甲苯、二氧六环、四氢呋喃(THF)、叔丁醇和甲苯。特别优选的非极性溶剂包括甲苯、二甲苯、二氧六环、四氢呋喃和叔丁醇。示例性极性非质子溶剂包括但不限于：DMSO(二甲基亚砜)、HMPA(六甲基磷酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMA(二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)。
一种替代方法始于芴二胺，一种易于获得的原料。反应示意图(显示了足以提供轭合物的合成步骤)表示如下。
在这种方法中，羧基甲基封端的PEG(“PEG-CM”获自NektarTherapeutics)可与芴二胺反应以提供中间体，该中间体可随后用于与活性剂一起形成轭合物(“药物-NH2”)。芴二胺具有两个连接至芳香核的酰胺基，因此对可电离氢原子(即，Hα)的酸性(即，pKa值)具有轻微的影响(相对于这些基团取代的氢)。因此，药物的释放速度是中等至缓慢。
同样地，在另一个基于胺试剂如商业上可获得的mPEG丙酸酯“mPEG-SPA”的方法中，合成稍微不同，但是药物释放上净结果是极小的。这种方法(显示了足以提供轭合物的合成步骤)的示意图表示如下。
在药物释放速度方面差异是最小的，因为与mPEG-CM和mPEG-SPA反应所得到的芳香环取代基是相似的。
通过增大胺基团、用如琥珀酸酐或戊二酸酐的试剂反应以获得末端羧酸，任何人可较大地修改合成方法。这种方法(显示了足以提供轭合物的合成步骤)的示意图表示如下。
在这个方法中，结果允许使用PEG胺而非PEG羧酸或活化酯作为PEG化试剂。因此，有可能实现另一种用于合成试剂的方法，但是关于药物释放速度的净结果大致没有改变，因为芳香环取代基保留酰胺基团。
如果上述三个试剂的一个或多个芳香环在某些合成阶段通过进一步取代而增大，则可以使药物释放速度发生显著变化。例如，可以用例如磺酸基或硝基进行环取代。强吸电子的的这些基团的每一种将对可电离氢原子(Hα)的酸性(pKa值)产生显著的影响。
说明影响最终试剂-药物轭合物中药物释放速度能力的另一个实例表示如下。
这里，起始芴衍生物含有羧酸基团。这种易得的原料可经受允许在远端芳香环中引入氨基基团的反应条件。然后，应用类似于在上述实例中的化学，有可能提供在一个芳香环上具有酰胺基团而在另一个环上具有甲酰胺基团的试剂。环取代基的这种组合相比于上述那些具有两个酰胺基团的实例是净吸电子的，因此，对可电离氢原子(Hα)的酸性(pKa值)影响使药物释放速度被提高。
应用不同类型的酰胺键可取得对药物释放速度的更显著提高。应用如下所示的系列反应可制备磺酰胺(显示了足以提供轭合物的合成步骤)。
被连接至每个环的磺酰基，是高度电负性基团，影响可电离氢原子(Hα)的酸性(pKa值)。因此，这些轭合物的药物释放速度相对快。
在另一个实例中，描述了具有快速释放速度的药物轭合物(显示了足以提供轭合物的合成步骤)。
在这样情况下，应用商业上可获得的异氰酸酯原料，将酰脲基团和磺酰胺基团连接至芳香核。酰脲基团，类似于上面的酰胺基团，具有轻微的效应，而磺酰胺基团则具有强的效应。净结果是，从这种试剂制备的轭合物具有介于刚讨论的双磺酰胺基与更早讨论的另一个轭合物之间的释放速度。
有些合成路线超过其他路线的一个优点是，任选应用离子交换色谱法以纯化中间阶段的试剂。因为在整个路线中可能生成几种杂质，所以纯化对于方法是非常有利的。
下面显示了通过在制备戊二酸酐修饰二氨基芴中的中间阶段的吸电子磺酸基团的化学反应而插入的实例，根据上述合成，“m-PEG”和“PEG-m”代表甲氧基聚(乙二醇)。
在这样情况下，有可能的是，封闭羟基以预防硫酸酯的形成，然后应用氯磺酸完成亲电性芳香族的磺化过程。可能得到单-和二磺化产物的混合物。这种混合物(如果它形成的话)易于纯化以提供非常纯状态的任一形式。同样，由于该合成没有已设计好的、任选的色谱法分离步骤，所以这样提供了除去可能从更早步骤一直带有的中性杂质的机会。
下面的示意图中表示了应用磺酰基提高α氢酸性并作为添加聚合物链位点的实例。在这样情况下，在商业上可获得的醇中，芳香族部分含有单个吡啶环，其作为制备聚合物试剂的起点。芳香环中氮的存在使得这种环比苯环更具吸电子性，因此提高了α氢的酸性。然而，可以进一步提高α氢的酸性以使其相对更易除去。连接磺酰基提高了氢的酸性。在下面的示意图中提供了要求添加磺酰基的步骤[其中，diBTC是二(苯并三唑基)碳酸酯，且BTC是苯并三唑基]。
上述的方法证明了在单个环的芳香族部分上添加电子改变基团而且用于含有单个水溶性聚合物的聚合物试剂。在有些实施方案中优选的是两个水溶性聚合物，而其他实施方案优选引入单个水溶性聚合物(例如，当需要聚合物试剂的总尺寸相对地较小时)。
可以类似的方式添加其他电子改变基团。例如，通过在硫酸存在下组合硝酸的芳香硝化，得到连接至芳香体系的硝基(即，-NO2)。此外，卤化方法如在金属催化剂(如铁)存在下将卤素与芳香体系组合，得到连接至芳香体系的卤代基团。至于其中存在金属离子的卤化方法，优选的是(因为这里所述的原因)，首先完成将卤代基团添加至芳香体系的步骤，然后除去任何金属离子，然后将一个或多个水溶性聚合物连接至芳香体系。此外，烷基化和酰化的方法如弗瑞德-克来福特反应可以用于通过在金属催化剂(如铝)存在的条件下将卤代烷(例如，异丁基氯)或酰卤(例如，丙酰氯)添加到芳香体系而将电子改变烷基或酰基(分别地)添加至芳香体系。同样，由于通常需要金属催化剂以实现这种反应，因此，优选的是首先完成将卤代基团添加至芳香体系的步骤，然后除去任何金属离子，然后将一个或多个水溶性聚合物连接至芳香体系。
在制备和处理聚合物试剂(以及制备和处理相应的轭合物)的过程中，防止带入金属离子是优选的。例如，由于熟知的是金属离子将被PEG络合，因此，避免金属离子是优选的。此外，已知金属离子能催化PEG链氧化。特别地，当PEG被连接至电子富集的芳香体系时，络合至PEG链的金属离子的存在可提供一条途径，用于电子从芳香核转移至PEG-金属离子复合物而且利于PEG链裂解。因此，本发明包括其中大致不含金属离子的方法和组合物。
本发明可以应用制备这里所述聚合物试剂的这些和其他方法。
一旦被制备，聚合物试剂可被分离。可以应用已知的方法来分离聚合物试剂，但是特别优选的是应用色谱法，例如尺寸排除色谱法。可选或附加地，该方法包括聚合物试剂一旦形成就对其纯化的步骤。同样地，可以应用标准的本领域已知纯化方法来纯化聚合物试剂。
本发明的聚合物试剂对水分和氧是敏感的，且最佳地被储存于惰性环境(如氩气中或氮气中)以及低温的条件下。这样，减少或者完全避免了与例如环境氧相关的潜在降解过程。在有些情况下，为了避免氧化降解，可在储存前将抗氧化剂如丁基化羟基甲苯(BHT)加入聚合物试剂。此外，优选的是，将与储存条件相关水分的量减到最少，以减少与水相关的潜在破坏反应，例如活性酯的水解。而且，优选的是保持储存环境黑暗，以预防涉及光的某些降解过程。因此，优选的储存条件包括下列的一种或多种：在干燥氩气或另一种干燥惰性气体下储存；在低于约-15℃温度下储存；在避光下储存；以及与适量(例如，每百万份约50份至500份)抗氧化剂如BHT一起储存。
上述的聚合物试剂用于轭合生物学上活性剂。例如，活性剂的氨基(例如，伯胺)与能够与活性剂氨基反应的官能团反应，以形成可降解的键，诸如氨基甲酸酯键。因此，本发明包括与这里所述任何聚合物试剂形成的轭合物。
示例性轭合物包括下式的那些轭合物：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
是带有可电离氢原子Hα的含有芳基的部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
对应于这个式I-C的轭合物可使用对应于式I的聚合物试剂来制备。
当对应于式I-C的轭合物没有离散电子改变基团时[即，对于式I-C，当(a)和(b)都是零时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，
Y1，Y2，和D各自如前关于式I-C所定义的。对应于这种式Ia-C的轭合物可使用对应于式Ia的聚合物试剂来制备。
当对应于式I-C的轭合物有单个离散电子改变基团时[即，对于式I-C，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式轭合物：
其中，每个POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Y1，Y2，D，和Re1各自如前关于式I-C所定义的。对应于这种式Ic-C的轭合物可应用对应于式Ic的聚合物试剂而制备。
当对应于式I-C的轭合物有两个离散电子改变基团时[即，对于式I-C，当(a)和(b)都是1时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，
Y1，Y2，D，Re1和Re2各自如前关于式I-C所定义的。对应于这种式Ib-C的轭合物可应用对应于式Ib的聚合物试剂而制备。
在有些情况下，轭合物可包括仅通过带有可电离氢原子的碳原子彼此相连的单独芳香族部分。这样的聚合物试剂具有下式：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。对应于这种式II-C的轭合物可应用对应于式II的聚合物试剂而制备。
当对应于式II-C的轭合物没有离散电子改变基团时[即，对于式II-C，当(a)和(b)都是零时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，Y1，Y2，和D各自如前关于式II-C所定义的。对应于这种式IIa-C的轭合物可应用对应于式IIa的聚合物试剂而制备。
当对应于式II的轭合物有单个离散电子改变基团时[即，对于式II，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，Ar1，Ar2，Hα，R1，R2，Re1，Y1，Y2和D各自如前关于式II-C所定义的。对应于这种式IIc-C的轭合物可应用对应于式IIc的聚合物试剂而制备。
当对应于这种式II-C的轭合物有两个离散电子改变基团时[即，对于式II-C，当(a)和(b)都是1时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，Ar1，Ar2，Hα，R1，R2，Y1，Y2，D，Re1和Re2各自如前关于式II-C所定义的。对应于这种式IIb-C的轭合物可应用对应于式IIb的聚合物试剂而制备。
在另一些情况下，轭合物可以包括通过带有可电离氢原子的碳原子以及另一个直接键彼此相连的单独芳香族部分。这样的轭合物具有下式：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
对应于这种式III-C的轭合物可应用对应于式III的聚合物试剂而制备。
当对应于式III-C的轭合物没有离散电子改变基团时[即，对于式III-C，当(a)和(b)都是零时]，得到下式轭合物产生：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，Y1，Y2和D各自如前关于式III-C所定义的。对应于这种式IIIa-C的轭合物可应用对应于式IIIa的聚合物试剂而制备。
当对应于式III-C的轭合物有单个离散电子改变基团时[[即，对于式III-C，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式轭合物产生：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，Re1，Y1，Y2和D各自如前关于式III-C所定义的。对应于这种式IIIc-C的轭合物可应用对应于式IIIc的聚合物试剂而制备。
当对应于式III-C的轭合物有两个离散电子改变基团时[即，对于式III-C，当(a)和(b)都是1时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Ar1，Ar2，Re1，Re2，Y1，Y2和D各自如前关于式III-C所定义的。对应于这种式IIIb-C的轭合物可应用对应于式IIIb的聚合物试剂而制备。
在另一些情况下，轭合物可以包括通过带有可电离氢原子的碳原子以及一个或多个间隔部分彼此相连的单独芳香族部分。这样的轭合物具有下式：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
X3是第三间隔部分；
Ar1是第一芳香族部分；
Ar2是第二芳香族部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。对应于这种式IV-C的轭合物可应用对应于式I的聚合物试剂而制备。
当对应于式IV-C的轭合物没有离散电子改变基团时[即，对于式IV-C，当(a)和(b)都是零时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，X3，R1，R2，Ar1，Ar2，Y1，Y2和D各自如前关于式IV-C所定义的。对应于这种式IVa-C的轭合物可应用对应于式IVa的聚合物试剂而制备。
当对应于式IV-C的轭合物有单个离散电子改变基团时[即，对于式IV-C，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，X3，R1，R2，Ar1，Ar2，Re1，Y1，Y2和D各自如前关于式IV-C所定义的。对应于这种式IVc-C的轭合物可应用对应于式IVc的聚合物试剂而制备。
当对应于式IV-C的轭合物有两个离散电子改变基团时[即，对于式IV-C，当(a)和(b)都是1时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，X3，Ar1，Ar2，Hα，R1，R2，Re1，Re2，Y1，Y2和D各自如前关于式IV-C所定义的。对应于这种式IVb-C的轭合物可应用对应于式IVb的聚合物试剂而制备。
优选的聚合物试剂包含如下结构：
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是带有氨基官能团的生物活性剂残基。对应于这种式V-C的轭合物可应用对应于式V的聚合物试剂而制备。
当对应于式V-C的轭合物没有离散电子改变基团时[即，对于式V-C，当(a)和(b)都是零时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，Hα，R1，R2，Y1，Y2和D各自如前关于式V-C所定义的。对应于这种式Va-C的轭合物可应用对应于式Va的聚合物试剂而制备。
当对应于式V-C的轭合物有单个离散电子改变基团时[即，对于式V-C，当(a)是1而(b)是零时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，Hα，R1，R2，Re1，Y1，Y2和D如前关于式V-C所定义的。对应于这种式Vc-C的轭合物可应用对应于式Vc的聚合物试剂而制备。
当对应于式V-C的轭合物有两个离散电子改变基团时[即，对于式V-C，当(a)和(b)都是1时]，得到下式轭合物：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，Y1，Y2和D各自如前关于式V-C所定义的。对应于这种式Vb-C的轭合物可应用对应于式Vb的聚合物试剂而制备。
另一个优选的轭合物是如下结构：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，(a)，(b)，Y1，Y2和D各自如前关于式V-C所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。对应于这种式Vd-C的轭合物可应用对应于式Vd的聚合物试剂而制备。
另一个优选的轭合物是如下结构的：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，Y1，Y2和D各自如前关于式V-C所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。对应于这种式Ve-C的轭合物可应用对应于式Ve的聚合物试剂而制备。
另一个优选的轭合物是如下结构的：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，Y1，Y2和D各自如前关于式V-C所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。对应于这种式Vf-C的轭合物可应用对应于式Vf的聚合物试剂而制备。
另一个优选的轭合物是如下结构的：
其中，POLY1，POLY2，X1，X2，R1，R2，Hα，Re1，Re2，Y1，Y2和D各自如前关于式V-C所定义的，条件是当(a)是零时Re1是H，而且当(b)是零时Re2是H。对应于这种式Vg-C的轭合物可应用对应于式Vg的聚合物试剂而制备。
本发明另一个示例性轭合物具有如下式子：
其中：
POLY是水溶性聚合物；
X是间隔部分，它不包括
或
部分；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
Re，当其存在时，是电子改变基团；
(a)是零或者1；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是带有氨基官能团的生物活性剂残基。对应于这种式VI-C的轭合物可应用对应于式VI的聚合物试剂而制备。
另一个示例性轭合物包含如下结构：
其中，POLY，X，R1，R2，Y1，Y2和D各自如前关于式VI所定义的。对应于这种式VIa-C的轭合物可应用对应于式VIa的聚合物试剂而制备。
本发明轭合物的实例包括：
其中每个(n)是4至1500。
可被这里所述聚合物试剂轭合的生物学活性剂是含胺的生物学活性剂。在一些实施方案中，生物学活性剂是小分子(例如，分子量小于约3,500道尔顿的生物学活性剂)。在另一些实施方案中，生物学活性剂是大分子，诸如多肽，具有大于约3,500道尔顿的分子量。药理学活性多肽代表了一种优选类型的生物学活性剂。应当理解的是，就本发明的目的而言，术语“多肽”是寡肽和蛋白质的通称。对于多肽，聚合物试剂偶合的胺可以在N-末端或者多肽内氨基酸(如赖氨酸)的含胺侧链上。
本发明还提供了制备轭合物的方法，其包括在适于聚合物与生物学活性剂之间形成共价键连接的条件下将本发明的聚合物试剂与生物学活性剂接触的步骤。通常，将等摩尔的量(就适宜与活性基团反应的基团所需数量而言)或摩尔过量的聚合物加至活性剂或表面(surface)。例如，可将聚合物试剂以约1∶1(聚合物试剂∶活性剂)、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1或10∶1的摩尔比加至靶活性剂。使轭合反应进行至大体上不再发生轭合，这一般可通过监测反应随时间的进程来确定。通过在各个时间点从反应混合物取出等分试样并且用SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱或任何其他适合的分析方法分析反应混合物，可监测反应进程。一旦所形成的轭合物的量或剩余未被轭合的聚合物的量达到稳定状态，那么可认为该反应是完成的。通常，轭合反应需要大约数分钟至数小时(例如，5分钟至24小时或更多)的时间。得到的产物混合物优选但非必然地经纯化，以分离除掉过量的试剂、未被轭合的反应物(例如活性剂)、不想要的多重轭合物质、以及游离的或未反应的聚合物。然后，应用分析方法如MALDI、毛细管电泳、凝胶电泳和/或色谱法对得到的轭合物进行鉴定。
关于聚合物-活性剂轭合物，将轭合物进行纯化以获得/分离不同的轭合物质。可选择地且更优选地，为得到更低分子量(例如，小于约20千道尔顿，更优选地小于10千道尔顿)的聚合物，可将产物混合物纯化以实现每个活性剂的水溶性聚合物片段分布。例如，可将产物混合物纯化以实现范围为每个活性剂(例如多肽)1至5个PEG的平均值。用于最终轭合物反应混合物的纯化策略取决于许多因素，包括，例如：所用聚合物的分子量、特定的活性剂、期望的用药方案、以及单个轭合物的残余活性和体内特性。
如需要，可使用凝胶过滤色谱法将具有不同分子量的轭合物分离。就是说，使用凝胶过滤色谱法来分馏不同数值的聚合物：活性剂比率(例如，1-mer、2-mer、3-mer等，其中“1-mer”是指聚合物：活性剂为1，“2-mer”是指聚合物：活性剂为2，等等)，基于它们不同的分子量(这里的不同实际上对应于水溶性聚合物片段的平均分子量)。例如，在示例性反应中，将100kDa蛋白质随机轭合至具有约20kDa分子量的聚合物试剂，得到的反应混合物可能包括未被修饰的蛋白质(MW 100kDa)、单-PEG化蛋白质(MW 120kDa)、二-PEG化蛋白质(MW 140kDa)等。尽管这种方法可用于分离具有不同分子量的PEG或其他聚合物轭合物，但是这种方法用于分离在蛋白质内具有不同聚合物连接位点的位置异构体通常是无效的。例如，凝胶过滤色谱法可用于相互分离PEG1-mer、2-mer、3-mer等的混合物，但每个回收的PEG-mer组合物可能含有连接至在活性剂内不同活性氨基基团(例如，赖氨酸残基)的PEG。
适于实现这种类型分离的凝胶过滤柱包括可从Amersham Biosciences(皮斯卡塔韦，新泽西州)获得的SuperdexTM和SephadexTM柱。特定柱的选择将取决于所期望的分馏范围。一般应用适宜的缓冲剂如磷酸盐、醋酸盐等来实现洗脱。可用许多不同的方法分析收集的馏分，所述方法例如：(i)针对蛋白质含量的280nm处光密度(OD)，(ii)牛血清蛋白(BSA)蛋白质分析，(iii)针对PEG含量的碘检验[Sims等.(1980)Anal.Biochem，107：60-63]，以及(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，随后用碘化钡染色。
应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱(Amersham Biosciences或Vydac)的反相色谱法或应用离子交换柱(例如可从AmershamBiosciences获得的SepharoseTM离子交换柱)的离子交换色谱法，实现位置异构体的分离。可以应用任一方法来分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(位置异构体)。
在轭合和任选地另外的分离步骤之后，可将轭合物混合物浓缩，无菌过滤并于低温(通常约-20℃至约-80℃)储存。可选择地，可将含有或者没有残留缓冲剂的轭合物冻干，而且以冻干粉储存。在一些实例中，优选的是，将用于轭合的缓冲剂如醋酸钠替换为挥发性缓冲剂如碳酸铵或醋酸铵，所述挥发性缓冲剂在冻干过程中易于除掉，以便冻干粉中没有残余的缓冲剂。可选择地，可采用制剂缓冲剂来利用缓冲剂替换步骤，这样冻干轭合物是以适于重新溶解成制剂缓冲剂的形式并且最终用于对哺乳动物给药。
如这里所述用于偶合至聚合物的生物学活性剂可以是下列的任何一种或多种。适合的药剂可以选自，例如，催眠剂及镇静剂、精神兴奋剂、安定剂、呼吸道药物、抗惊厥剂、肌肉松弛剂、抗帕金森剂(多巴胺拮抗剂)、镇痛剂、抗炎剂、抗焦虑药(抗焦虑剂)、食欲抑制剂、抗偏头痛剂、肌肉收缩剂、抗感染药(抗生素、抗病毒药、抗真菌剂、疫苗)、抗关节炎药、抗疟药、止吐药、抗癫痫药(anepileptics)、支气管扩张剂、细胞因子、生长因子、抗癌药、抗血栓剂、抗高血压药、心血管药、抗心律失常药、抗氧化剂、抗哮喘剂、激素类药剂(包括避孕药)、拟交感神经药、利尿剂、脂类调节剂、抗雄性激素剂、抗寄生虫药、抗凝剂、肿瘤药、抗肿瘤药、降血糖剂、营养剂及补充剂、生长补充剂、抗肠炎剂、疫苗、抗体、诊断剂以及造影剂。
更特殊地，活性剂可落入多个结构类的其中一类，所述结构类包括但不限于：小分子(优选地非水溶性小分子)、肽、多肽、蛋白质、多糖、甾体、核苷酸、寡核苷酸、聚核苷酸、脂肪、电解质等。优选地，如这里所述用于偶合至聚合物的生物学活性剂拥有本身的氨基基团，或者可选择地，被修饰成含有至少一个适合轭合至如这里所述聚合物的活性氨基。
本发明还包括药物制品，其包含如这里所提供的、与药物赋形剂组合的轭合物。通常，轭合物本身是固体形式(例如，沉淀物)，它可与以固体或液体形式的适宜药物赋形剂组合。
示例性赋形剂包括但不限于选自下述组的赋形剂：碳水化合物、无机盐、抗菌剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱或其组合。
碳水化合物(如糖)、衍生糖(如糖醇)、糖醛酸、酯化的糖和/或糖聚合物可以赋形剂存在。特定的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉籽糖、松三糖、麦芽糊精、右旋糖酐、淀粉等；糖醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇等。
所述赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，例如枸橼酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢钠及其组合。
所述制品还可包括用于防止或阻止微生物生长的抗菌剂。适于本发明的抗菌剂的非限定性实例包括苯扎氯铵、苯索氯铵、苄醇、西吡氯铵、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞及其组合。
抗氧化剂也可存在于本制品中。抗氧化剂是用于防止氧化，从而防止轭合物或制品其他成分变质。适用于本发明的抗氧化剂包括，例如，抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠及其组合。
表面活性剂可作为赋形剂而存在。示例性表面活性剂包括：聚山梨酸酯类如“吐温20”和“吐温80”以及普朗尼克类如F68和F88(两者都可获得自BASF，Mount Olive市，新泽西州)；山梨糖醇酯；脂类，诸如磷脂(如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱)、磷脂酰乙醇胺(但是优选地不是以脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；甾体，如胆固醇；以及螯合剂，如EDTA、锌及其他这种适宜的阳离子。
酸或碱可作为赋形剂而存在于本制品中。可应用的酸的非限定性实例包括那些选自下述组的酸：盐酸、醋酸、磷酸、枸橼酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合。适宜的碱包括但不限于：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、枸橼酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合。
药物制品包括了所有类型的制剂，而且特别是那些适于注射的制剂，例如，可以重新溶解的粉末以及悬浮剂和溶液。组合物中轭合物(即，如这里所述的在活性剂与聚合物之间形成的轭合物)的量根据多种因素而改变，然而，当将组合物储存在单位剂量容器(例如，管形瓶)中时最佳地是治疗有效剂量。此外，可将药物制品储藏在注射器中。为了确定哪个量产生临床所期望的端点，可通过递增量的轭合物的重复给药来实验确定治疗有效剂量。
在组合物中任何单个赋形剂的量会根据赋形剂的活性和组合物的特殊需要而改变。通常，任何单个赋形剂的最佳量是经过常规的实验而确定的，即通过制备含有不同量(范围为从低到高)赋形剂的组合物，检验稳定性和其他参数，然后确定获得最佳效果并无明显副作用时的范围。
然而，通常，赋形剂以约1％重量至约99％重量的量而存在于组合物，优选地约5％重量至98％重量，更优选地约15％重量至95％重量的赋形剂，最优选地浓度小于30％重量。
上述的这些药物赋形剂以及其他的赋形剂都记载于″Remington：TheScience&Practice of Pharmacy(药物科学与实践)”，第19版.，Williams&Williams，(1995年)，the″Physician’s Desk Reference(医师案头参考″，第52版，Medical Economics，Montvale，新泽西州(1998年)，和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)，第3版，美国制药协会，华盛顿特区，2000年。
本发明的药物制品通常但非必要地通过注射给药，因而通常是施用前即配的液态溶液或混悬液。药物制品还可采用其他形式如糖浆剂、乳膏、软膏、片剂、粉剂等。还可包括其他给药模式，如肺部、直肠、透皮、经粘膜、口服、鞘内、皮下、动脉内给药等。
如前所述，可将轭合物以静脉注射或更不优选地以肌肉内或以皮下注射来胃肠外给药。适于胃肠外给药的制剂包括即可注射的溶液、使用前用溶剂混合的干燥粉末、即可注射的混悬液、使用前用载体混合的干燥非水溶性组合物、以及施用前稀释的乳液和液体浓缩物，及其他。
本发明还提供了用于将如这里所提供的轭合物对患者给药的方法，所述患者患有的疾病对轭合物治疗有响应。所述的方法包括给药，一般通过注射治疗有效量的轭合物(优选地作为药物制品的部分而提供)。所述给药方法还可用于治疗可通过施用特定轭合物而治疗或预防的任何病况。本领域的普通技术人员理解特定轭合物可有效地治疗哪种病况。施用的实际剂量将根据如下因素而变化：患者的年龄、体重和总体病况以及待治疗病况的严重度、健康保健专业人士的判断以及所施用的轭合物。对于本领域的普通技术人员而言，治疗有效量是已知的，和/或被记载于相关参考文本和文献中。通常地，治疗有效量的范围为约0.001mg至100mg，优选地剂量为0.01mg/天至75mg/天，更优选地剂量为0.10mg/天至50mg/天。
任何给定轭合物的单位剂量(同样，优选地作为药物制品的部分而提供)可根据临床医师的判断、患者的需要等而以各种给药方案来给药。具体给药方案是本领域普通技术人员已知的或应用常规方法可实验确定的。示例性给药方案包括但不限于：每日给药五次，每日四次、每日三次，每日两次，每日一次，每周三次，每周两次，每周一次，每月两次，每月一次，及其任何组合。一旦达到临床终点，则停止组合物的给药。
应当理解的是，尽管已结合优选的具体实施方案描述了本发明，但是上面的描述以及下面的实验意在说明而不是限制本发明的范围。对于本发明所属领域的普通技术人员而言，在本发明范围内的其他方面、优点和变化是显而易见的。
实验部分
除另有说明外，本发明的实施将采用有机合成等的常规技术，这是本领域的普通技术人员所理解的且在文献中阐明的。在下面的实施例中，已努力确保所用数值(例如，量、温度等)的准确度，但是应当考虑到某些实验误差和偏差。除另有说明外，温度是摄氏度，压力是等于或接近海平面大气压。除另有说明外，所有试剂都是商业途径获得的。所有产生的NMR都获得自Bruker(Billerica，马萨诸塞州)制造的300或400MHz NMR光谱仪。所有的工艺过程都是在玻璃或玻璃衬里容器中实现的，而且避免与含有金属的容器或设备接触。
mPEG-CM CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-CH2-C(O)-OH)
anh. 无水的
Fmoc 9-芴基甲氧羰基
HCl 盐酸
HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
NMR 核磁共振
DCC 1，3-二环己基碳二亚胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
MW 分子量
K或kDa 千道尔顿
SEC 尺寸排除色谱法
HPLC 高效液相色谱法
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
TLC 薄层色谱法
THF 四氢呋喃
材料：除非另有说明，在这些实施例中所涉及的前体聚合物试剂都是商业上可获得的。在这些实施例中所用的胰高血糖素样肽I(7-36，(GLP-1))是购自美国肽公司(American Peptide Company)(Sunnyvale，加州)。
实施例1
制备用于可逆PEG化的9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺
路线1.
A.制备2，7-二(Boc-氨基)芴
在氩气环境下，将2，7-二氨基芴(2.45g，12.5mmol)溶于1，4-二氧六环(28mL)。依次加入去离子水(14mL)，NaOH 2M(2.2当量，27.5mmol，13.8mL)和二碳酸二叔丁酯(BOC2O)(2.5当量，31.3mmol，6.82g)。室温剧烈地搅拌反应物20小时，产物沉淀为棕色固体。加入水淬灭反应并且用KHSO41M酸化至pH 3。用氯仿萃取产物(3×400mL)并且用1/2饱和盐水洗涤合并的有机层，经Na2SO4干燥并蒸发。用快速色谱法纯化产物：硅胶60
以1％甲醇的氯仿溶液洗脱。经TLC(水合茚三酮染色)，已纯化黄色固体(5.1g，～99％)是纯的。1H-NMR(CDCl3)：6(ppm)7.7(bs，2H，NH氨基甲酸乙酯)；7.6(d，2H，Ar)；7.2(d，2H，Ar)；6.5(s，2H，Ar)；3.8(s，2H，CH2)；1.5(s，18H，Boc)。
B.制备9-甲酰-2，7-二(Boc-氨基)芴
将已纯化2，7-二(Boc-氨基)芴(5g，12.5mmol)(制备自步骤A，上面)，溶于甲酸乙酯(50mL)和无水THF(60mL)并缓慢加热。(注：甲酸乙酯经K2CO3储存以除掉甲酸。)将溶液在冰浴中冷却而且将含60％氢化钠的矿物油分批地加入(5.5当量，69mmol，2.75g)。将反应物缓慢地升温至室温，然后在安装回流冷凝器后加热至50℃。两小时后，将反应物在冰浴中冷却并且通过缓慢地加入去离子水(50mL)而淬灭。用冰乙酸将水层调节至pH 5和用乙酸乙酯萃取(2×400mL)。用Na2SO4干燥合并的有机层，过滤和在减压下蒸发。用快速色谱法纯化粗品(深棕色固体)：硅胶60
以1-5％甲醇的氯仿溶液逐步梯度洗脱。产率(4.8g，～90％)，黄色至棕色固体，取决于纯度。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)11.0(s，0.9H，烯醇)；9.3(2s，1.9H，NH氨基甲酸乙酯)；7.2-8.3(m，Ar，C10H烯醇)；6.5(2s，0.1H，NH氨基甲酸乙酯)；4.1(m，0.3H，CH)；1.5(s，18H，Boc)。
C.制备9-羟甲基-2，7-二(Boc-氨基)芴
将9-甲酰-2，7-二(Boc-氨基)芴(0.47g，1.1mmol)在氩气环境下溶于无水甲醇中(MeOH)(5mL)。加入NaBH4(1.2当量，1.3mmol，0.05g)并且室温搅拌反应物5小时。用去离子水稀释反应物而且用冰乙酸酸化至pH 5。用乙酸乙酯(2×100mL)萃取反应物然后用饱和NaHCO3(4×20mL)和盐水(3×20mL)洗涤有机层。有机层经MgSO4干燥，过滤并蒸发。用快速色谱法纯化粗品，橙色固体：硅胶60
，1-5％甲醇的氯仿溶液梯度洗脱(可替换的、用15-20％乙酸乙酯的二氯甲烷，″DCM″，溶液梯度洗脱)。产品为黄色固体(0.39，83％)。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)7.9(s，0.5H，NH氨基甲酸乙酯)；7.7(s，2H，Ar)；7.6(d，2H，Ar)；7.4(d，2H，Ar)；4.0(m，1H，CH)；3.9(m，2H，CH2)；1.6(s，18H，Boc)。
D.制备二盐酸9-羟甲基-2，7-二氨基芴
将9-羟甲基-2，7-二(Boc-氨基)芴(0.39g，0.9mmol)溶于1，4-二氧六环中。在0℃加入浓HCl(2.5mL)并且在0℃搅拌反应物2小时和室温1小时。减压下除掉反应溶剂(45℃)。将产物溶于甲醇中并蒸发(2次)。将产物溶于甲醇(8mL)而且通过缓慢加入乙醚和冷却(重复)而沉淀。产物为红橙色固体(0.25g，91％)，经TLC检验显示为单斑点(氯仿/甲醇/乙酸85∶15∶3，水合茚三酮染色)。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)8.1(d，2H，Ar)；7.8(s，2H，Ar)；7.5(d，2H，Ar)；4.3(t，1H，CH)；4.0(d，2H，CH2)。
E.制备9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴
将在无水甲苯(80mL)中的mPEG-CM(20,000)(mPEG-CM具有MW＝19,458；20g，1.03mmol，3.5当量)在旋转蒸发仪上、于60℃下减压共沸蒸馏。在氩气环境下，将固体溶于无水二氯甲烷(40mL)中，随后加入无水N-羟基苯并三唑(HOBt)(3.5当量，1.03mmol，139mg)以及1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)(3.7当量，1.09mmol，224mg)。在另外的烧瓶中，将二盐酸9-羟甲基-2，7-二氨基芴(1当量，0.294mmol，88mg)和4-二甲氨基吡啶(2.2当量，0.65mmol，79mg)溶于无水DMF(2.5mL)中。在搅拌DCC反应物数分钟(5-15分钟)之后，将9-羟甲基-2，7-二氨基芴的DMF溶液定量地转移至DCC反应物中。在减压蒸发溶剂前，室温搅拌反应物27小时。随着稍微加热，将粘稠糖浆溶于干燥异丙醇(″IPA，″400mL，缓慢的添加)。经室温静置，PEG产物沉淀。加入额外的IPA(100mL)同时0℃搅拌30分钟。过滤得到的沉淀物而且用冷的IPA/乙醚7∶3(80mL)和乙醚洗涤。将粗品(淡黄色粉末，9-(mPEG(20,000)甲基酯)-甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴)高-真空下干燥(产量18.3g)。
在氩气环境下，将粗品(18.3g)溶于去离子水而且用NaOH 1M调节至pH 12±0.1。室温搅拌水解反应混合物3小时。用10％磷酸调节pH至3.0。(经硅藻土层过滤水溶液并且用水漂洗)将NaCl(60g)溶于该水溶液，然后用DCM(2×150mL)萃取。经MgSO4干燥合并的有机层，过滤并减压蒸发。将粗品溶于去离子水中，而且用离子交换树脂脱盐。在DEAE琼脂糖凝胶(0.9L)上进行PEG溶液的离子交换色谱，用水洗脱。收集含有PEG的馏分。经纯化的产品(淡黄色粉末)不含mPEG-CM(20,000)(HPLC分析)。产量7.3g，64％(表示回收的PEG材料总量)，取代75％或更好(表示回收量的PEG百分数，具有所期望的官能度)。1H-NMR(CD2Cl2)：δ(ppm)8.9(s，2H，NH酰胺)；7.9(s，2H，Ar)；7.7(m，4H，Ar)；4.1(m，5H，CH2C＝O，CH)；4.0(d，2H，CH2)；3.6(s，PEG骨架)；3.3(s，3H，-OCH3)。
F.制备9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚
胺
将在无水乙腈中(10mL)的9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴(0.5g，0.013mmol)在旋转蒸发仪上、减压下、共沸地于50℃蒸馏。将所得固体溶于无水DCM(2mL，″CH2Cl2″)，然后添加三光气。(采取防护，以用碱捕获器捕获来自反应的过量光气)(1.4当量，0.018mmol，5mg)。经数分钟后，加入无水吡啶(2当量，0.026mmol，2μL在DCM中的吡啶[2μL吡啶/50μL DCM])。在一个半小时的时候，大多数反应物溶剂和过量光气(在通风口上使用碱捕获器)随着缓慢升温(40℃)而被蒸发。将得到的糖浆溶于无水DCM(2mL)中，随后加入N-羟基琥珀酰亚胺(5.3当量，0.068mmol，8mg，″NHS″)和无水吡啶(3.2当量，0.041mmol，83μL在DCM中的上面(2∶50)溶液)。4小时后，在氩气流下蒸发溶剂。将糖浆溶于无水IPA中并室温沉淀。过滤沉淀物并且用冷的IPA和乙醚冲洗。真空下蒸发残余溶剂以得到淡淡的黄色粉末。产量0.4g，80％，经HPLC，取代73％NHS碳酸酯。1H-NMR(CD2Cl2)：δ(ppm)8.9(s，2H，NH酰胺)；7.9(s，2H，Ar)；7.7(m，4H，Ar)；4.7(d，2H，CH2)；4.3(t，1H，CH)；4.1(s，4H，CH2C＝O)；2.8(s，4H，CH2CH2NHS)。
应用这样相同的方法，通过取代具有20,000之外分子量的mPEG-CM聚合物试剂可制备具有其他分子量的聚合物试剂。
实施例2
用FMOC PEG2 40K氨基甲酸酯PEG化胰岛素
A.PEG化
将实施例中制备的聚合物试剂，9-羟基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺，于-20℃储存而且在干燥器中升温至室温。称取胰岛素(8.9mg)并溶于1mL DMSO。应用摩尔比为3∶1(PEG∶胰岛素)。称取184.6mg的9-羟基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺并溶于1mL乙腈中，然后加入胰岛素中。在氮气下，搅拌反应物1小时，然后通过用20mM乙酸、pH 3.0使其稀释1∶5而淬灭，将反应混合物pH降至pH 3.1。低pH稳定了可降解轭合物。
B.纯化
应用阳离子交换来纯化1-merPEG-胰岛素轭合物，它是在一个胰岛素位点上有PEG化的轭合物，不同于2-mer，是在两个胰岛素位点上有PEG化的轭合物。应用20mL SP650柱和KTA碱性系统(Amersham Biosciences，皮斯卡塔韦市，新泽西州)来纯化PEG轭合物。初始缓冲液是20mMHAc/NaAc(乙酸/乙酸钠)、pH 3.1，和洗脱缓冲液是20mM HAc/NaAc、1MNaCl、pH 3.1。流速为10mL/min，和载样量为9mg胰岛素含量。纯化方法列于表1。
表1
用于可降解PEG胰岛素轭合物的纯化方法
| 体积(ml) | 主要方法109％B |
| 0 | 0 |
| 60 | 0 |
| 220 | 40 |
| 240 | 100 |
| 300 | 100 |
| 301 | 0 |
| 361 | 0 |
C.已纯化轭合物的表征和定量
反应混合物的HPLC分析示于图1。图2表示了PEG化1-mer轭合物(或单PEG化轭合物)的HPLC分析。PEG化1-mer轭合物的纯度为98.1％，含有1.9％的2-mer。
D.已纯化轭合物的降解研究
对已纯化轭合物进行了体外释放研究。在带有恒温自动取样的安捷伦1100(安捷伦技术公司，帕罗阿托市，加州)上进行检测。应用HPLC方法来分析天然蛋白质的释放以及轭合物的减少。将1-mer轭合物(或单PEG化轭合物)稀释10∶1成为10X PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水)缓冲液，pH 7.35。将它于37℃孵化，而且取出计时点的等份试样。计时0被视为在PBS稀释前，因此HPLC产生自所用的1-mer轭合物。采用的计时点为5小时、15小时、和28小时，然后是每天1次，共8天。汇编结果示于图3。
应用Prism分析软件(GraphPad软件公司，圣迭戈市，加州)绘制样品中在每个计时点的每个组分相对百分比。将数据拟合为非线性方程，而且这个方程是用于估算半衰期，缓冲液中1-mer轭合物为4.5天。
实施例3
制备9-羟甲基-2，7-二(mPEG(10,000)-酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺(或″G2PEG2Fmoc20k-NHS″)
9-羟甲基-2，7-二(mPEG(10,000)-酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺的合成图示地表示于路线2，如下。
路线2.
A.制备9-羟甲基-2，7-二(酰胺基戊二酸)芴
在氩气环境下，将二盐酸9-羟甲基-2，7-二氨基芴(制备描述于实施例1中的步骤A至D)溶于去离子水中而且用饱和NaHCO3调节至pH 8。用盐水以各半的方式稀释得到的混合物，然后用乙酸乙酯萃取沉淀物。经Na2SO4干燥乙酸乙酯层，过滤并蒸发得到9羟甲基-2，7-二氨基芴(棕色粉末，84％分离后产率)。
将9-羟甲基-2，7-二氨基芴(0.38g，1.7mmol)溶于无水四氢呋喃(″THF，″10mL)中然后加入戊二酸酐(97％，2.2当量3.7mmol，0.435g)。搅拌反应物4.5小时，然后用TLC(水合茚三酮，90∶10∶3乙酸乙酯/醇/乙酸)来确定不存在胺。用己烷(10mL)稀释反应混合物，过滤并且用1∶1THF/己烷然后用己烷洗涤将粗品溶于最小量的甲醇(1mL)和THF(10mL)中然后添加己烷(10mL)而沉淀。将混合物冷却(4℃)，过滤，和用1∶1THF/己烷再用己烷洗涤。产量为0.59g黄橙色粉末(77％)。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)7.9(s，2H，Ar)；7.7(d，2H，Ar)；7.5(dd，2H，Ar)；4.0(t，1H，CH)；3.9(d，2H，CH2)；2.5(t，4H，CH2)；2.4(t，4H，CH2)；2.0(m，4H，CH2)。
B.制备9-羟甲基-2，7-二(mPEG(10,000)-酰胺基戊二酰胺)芴
将在无水甲苯(100mL)中的mPEG-NH2(10,000)(Mn＝10,200；色谱纯，12.75g，1.25mmol)在旋转蒸发仪上、减压下、共沸地于50℃蒸馏。在氩气环境下，将固体溶于无水DCM(50mL)中。将溶于无水DMF(5mL)中的9-羟甲基-2，7-二(酰胺基戊二酸)芴(1当量，0.5mmol，0.225g)以及无水N-羟基苯并三唑(HOBt)(2.2当量，1.1mmol，149mg)定量地加至PEG溶液(2.5mL DMF去冲洗)。然后将1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)(2.4当量，1.2mmol，248mg)加入反应物溶液。室温搅拌反应物24小时，然后减压下蒸发溶剂。随着稍微加热，将粘稠的糖浆溶于干燥的IPA(500mL，慢慢的添加)。经室温静置，PEG产物沉淀。将沉淀物冷却至10℃十分钟，过滤和用冷的IPA(200mL)洗涤然后用乙醚(200mL)。在高真空下，干燥粗品(类白色粉末)，然后溶于去离子水中。在POROS介质(0.1L，勃林格殷格翰-曼海姆公司，曼海姆市德国)进行PEG溶液的离子交换色谱法，用水洗脱。收集含有中性PEG的馏分。已纯化的产品不含mPEG-NH2(10,000)(HPLC分析)。产量5.5g，53％，取代85％或更佳。1H-NMR(CD2Cl2)：δ(ppm)8.6(s，2H，ArNH酰胺)；7.9(s，2H，Ar)；7.6(m，4H，Ar)；6.4(bs，2H，NH酰胺)；4.1(m，1H，CH)；4.0(d，2H，CH2)；3.6(s，PEG骨架)；3.3(s，3H，-OCH3)；2.4(t，4H，CH2)；2.3(t，4H，CH2)；2.0(m，4H，CH2)。
C.制备9-羟甲基-2，7-二(mPEG(10,000)-酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥
珀酰亚胺
将在无水乙腈(100mL)中的9-羟甲基-2，7-二(mPEG(10,000)-酰胺基戊二酰胺)芴(5.3g，0.25mmol)在旋转蒸发仪上、减压下、共沸地于50℃蒸馏。将所得固体溶于无水DCM(27mL)中，随后加入三光气(1.4当量，0.36mmol，106mg)(采取防护，以用碱捕获器捕获来自反应的过量光气)。数分钟后，加入无水吡啶(2当量，0.51mmol，41μL)。一个半小时后，随着稍微加热(40℃)，大多数的反应物溶剂以及过量的光气(在通风口应用碱捕获器)被蒸发。将得到的糖浆溶于无水DCM(15mL)中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(5.3当量，1.35mmol，155mg，″NHS″)。15分钟后，加入无水吡啶(3.2当量，0.81mmol，66μL)。搅拌反应物2小时，然后减压下蒸发溶剂。将得到的糖浆溶于无水IPA(200mL)，然后室温沉淀。将沉淀物过滤并且用冷的IPA和乙醚(150mL，含有10mg BHT)冲洗。真空下蒸发残留溶剂，从而得到类白色粉末。产量5.1g，95％，经HPLC检测，取代～70％NHS碳酸酯。
应用这种相同的方法，制备另一个聚合物试剂，只是具有重均分子量约20,000mPEG-NH2(色谱纯)取代了mPEG-NH2(10,000)。得到的聚合物试剂具有总分子量约40,000道尔顿。如此制备的聚合物试剂被称为9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺(或者″G2PEG2Fmoc40k-NHS″)。
应用这种相同的方法，制备另一个聚合物试剂，只是具有重均分子量约30,000mPEG-NH2(应用常规的方法以高纯度而制备的)取代了mPEG-NH2(10,000)。得到的聚合物试剂具有总分子量约60,000道尔顿。如此制备的聚合物试剂被称为9-羟甲基-2，7-二(mPEG(30,000)-酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺(或″G2PEG2Fmoc60k-NHS″)
实施例4
制备9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(mPEG(10,000)酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺
9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(mPEG(10,000)酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺的合成示意性地表示于路线3，如下。
路线3.
A.制备4-甲酸-7-氨基芴
在Parr加氢瓶(Parr仪器公司，莫林市伊利诺伊州)中，将7-硝基-4-芴甲酸(8.0g，0.031mol)[如Helvetica Chimica Acta(1984)67，2009-2016中所述的、由联苯酸制备，还可以从密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich商业上获得]溶于氩气吹扫的1M NaOH(250mL，必要时微微加温)中。在小心地加入5％重量比的20％Pd/C(以50％水湿润的)(400mg)，在Parr仪器上，将Parr瓶抽真空/充气3次，以确保氢气环境。在20psi氢气下，摇动混悬液18小时，然后在减压下除掉剩余的氢气。经一层硅藻土过滤该混悬液，用另外的水漂洗，然后用乙酸调节至pH4。用盐水和乙酸乙酯(3×800mL)萃取产物。用少量盐水洗涤每个有机层。经Na2SO4干燥合并的有机层，过滤并蒸发至干。加入甲苯，然后在减压下蒸发，以有助于除去乙酸(必要时重复2-3次)。最终的蒸发是在高真空下1天以上。产量为6.1g(86％)1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)8.1(d，1H，Ar)；7.62(d，1H，Ar)；7.58(d，1H，Ar)；7.2(t，1H，Ar)；6.8(s，1H，Ar)；6.5(d，1H，Ar)；3.8(s，2H，CH2)；1.9(s，＜0.25H，HOAc)。
B.制备4-甲酸-7-(酰胺基戊二酸)芴
将4-甲酸-7-氨基芴(8.6g，0.038mol)溶于无水THF(150mL)中，然后加入戊二酸酐(97％，4.94g，0.042mol)。搅拌反应物4.5小时，而且用TLC确定不含胺(水合茚三酮染色，90∶10∶3乙酸乙酯/甲醇/乙酸，或者类似的)。用己烷(150mL)稀释反应混合物，冷却，过滤和用1∶1冷的THF/己烷洗涤然后再用己烷。减压下蒸发残留溶剂。产量为7.2g(55％)。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)8.4(d，1H，Ar)；8.0(s，1H，Ar)；7.8(d，1H，Ar)；7.7(d，1H，Ar)；7.5(d，1H，Ar)；7.4(t，1H，Ar)；4.0(s，2H，CH2)；2.5(t，2H，CH2)；2.4(t，2H，CH2)；2.0(m，2H，CH2)。
C.制备9-甲酰基-4-甲酸-7-(酰胺基戊二酸)芴
将二酸，4-甲酸-7-(酰胺基戊二酸)芴(7.16g，0.021mol)，溶于无水DMF(200mL)和甲酸乙酯(经K2CO3储存，350mL)中。小心地、分为几份地加入叔丁醇钾(95％，19.9g，0.169mol)。将反应物于45℃温和地回流30分钟，然后室温搅拌2.5小时。将所得溶液在冰浴中冷却，然后加入1M HCl(500mL)和盐水(350mL)。用乙酸乙酯(3×700mL)萃取产物。用盐水洗涤有机层，然后经Na2SO4干燥。滤去干燥剂，然后减压下蒸发溶剂。产量为＞7.8g(100％)而且含有残余的DMF。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)11.5(d，0.5H，甲酰基)；11.4(d，0.5H，甲酰基)；10.0(d，1H，NH)；8.4-7.3(m，7H，Ar)；2.4(t，2H，CH2)；2.3(t，2H，CH2)；1.8(m，2H，CH2)。
D.制备9-羟甲基-4-甲酸-7-(酰胺基戊二酸)芴
将9-甲酰基-4-甲酸-7-(酰胺基戊二酸)芴(7.8g，0.021mol)溶于无水甲醇(MeOH)(150mL)中。随着烧瓶在室温浴中，将硼氢化钠(6.0g，0.159mol)小心地、分为几份添加。在2小时和4小时，小心地加入额外份的硼氢化钠(2.0g，0.053mol)。7小时后，减压下蒸发溶剂，将剩余物溶于水，然后用1M HCl酸化。用盐水和乙酸乙酯(4×700mL)萃取黄色沉淀物。用盐水(2×)洗涤每个乙酸乙酯层，合并和经Na2SO4干燥。蒸发溶剂，然后用甲醇/氯仿将粗品重结晶。得到4.9g(63％)黄色晶体。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)8.4(d，1H，Ar)；8.0(s，1H，Ar)；7.85(d，1H，Ar)；7.83(d，1H，Ar)；7.5(dd，1H，Ar)；7.4(t，1H，Ar)；4.1-3.9(m，2H，CH2，CH)；2.5(t，2H，CH2)；2.4(t，2H，CH2)；2.0(m，2H，CH2)。
E.制备9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(mPEG(10,000)酰胺基
戊二酰胺)芴
将在无水甲苯(750mL)中mPEG-NH2(10,000)(Mn＝9,418；色谱纯，75g，0.008mol，亦称作″mPEG(10k)-NH2″)在旋转蒸发仪上、减压下、共沸地于50℃蒸馏。在氩气环境下，将得到的固体溶于无水DCM(CH2Cl2)(300mL)。将溶于无水DMF(33mL)中的9-羟甲基-4-甲酸-7-(酰胺基戊二酸)芴(1.3g，0.0036mol)和无水N-羟基苯并三唑(HOBt)(1.0g，0.0076mol)定量地加入PEG溶液(20mL DMF用于漂洗)。然后将1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)(1.65g，0.008mol)加至反应物溶液。室温搅拌反应物16小时，然后减压下蒸发溶剂。随着稍微加热，将得到粘稠糖浆溶于干燥的IPA(3.6L，慢慢的添加)中。室温静置，PEG产物沉淀出来。将沉淀物冷却至10℃、10分钟，过滤和用冷的IPA(400mL)冲洗，然后用乙醚(400mL)。在高真空下干燥粗品(类白色粉末)，然后溶于去离子水中。在POROS介质(1L)上进行PEG溶液的离子交换色谱法，用水洗脱。收集含有中性PEG的馏分，进而用DEAE Sepharose介质(0.5L)进一步纯化。未发现已纯化产物含有mPEG-NH2(10,000)或单PEG酸产物(HPLC分析).得到55g，79％(取代95％)。1H-NMR(CD2Cl2)：δ(ppm)8.7(s，1H，ArNH酰胺)；8.0(s，1H，Ar)；7.9(d，1H，Ar)；7.7(d，1H，Ar)；7.5(d，1H，Ar)；7.4(d，1H，Ar)；7.3(t，1H，Ar)；6.7(bs，1H，NH酰胺)；6.4(bs，1H，NH酰胺)；4.0(m，3H，CH，CH2)；3.6(s，PEG骨架)；3.3(s，6H，-OCH3)；2.4(t，2H，CH2)；2.3(t，2H，CH2)；2.0(m，2H，CH2)。
F.制备9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(mPEG(10,000)酰胺基
戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺
将在无水甲苯(140mL)中的9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(mPEG(10,000)酰胺基戊二酰胺)芴(14g，0.00072mol)在旋转蒸发仪上、减压下、共沸地于45℃蒸馏。将得到的固体溶于无水DCM(56mL，外加7mL漂洗)并且用注射器转移至新制备的三光气(用碱捕获器捕获来自反应的过量光气。)(0.214g，0.00072mol)和无水吡啶(0.057g，0.00072mol，以在CH2Cl2(～5mL)中的溶液而添加)溶液中。在1小时的时候，开始快速氩气流(维持室温)以蒸发过量的光气(在通风口应用碱捕获器)。在氩气吹扫30分钟后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.43g，0.0037mol)而且搅拌10分钟。加入无水吡啶(0.285g，0.0036mol，以在CH2Cl2(～25mL)中的溶液而添加)。继续氩气流，以便于1.5小时后蒸发大多数的反应物溶剂。将得到的粘稠糖浆溶于无水IPA(700mL)并于室温沉淀。过滤沉淀物，而且用冷的IPA和乙醚冲洗(100mL含有10mg BHT)。真空下蒸发残留溶剂得到类白色粉末。经HPLC，得到产物13.5g，96％，取代87％NHS碳酸酯。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)8.7(s，1H，NH Ar酰胺)；7.9(m，2H，Ar)；7.6(m，2H，Ar)；7.5(d，1H，Ar)；7.3(t，1H，Ar)；6.8(bs，1H，NH)；6.4(bs，1H，NH)；4.7(m，2H，CH2)；4.3(t，1H，CH)；3.6(s，PEG骨架)；3.3(s，6H，-OCH3)；2.8(s，4H，CH2CH2)；2.5(t，2H，CH2)；2.3(t，2H，CH2)；2.0(m，2H，CH2)。
应用这种相同的方法，制备另一种聚合物试剂，只是具有重均分子量20,000的mPEG-NH2(色谱纯)取代了mPEG-NH2(10,000)。得到的聚合物试剂具有约40,000道尔顿的总分子量。
应用这种相同的方法，制备另一种聚合物试剂，只是具有重均分子量30,000的mPEG-NH2(应用常规方法、以高纯度而制备的)取代了mPEG-NH2(10,000)。得到的聚合物试剂具有约60,000道尔顿的总分子量。
实施例5
制备含有示例性聚合物试剂的甘氨酸轭合物以及释放数据
将如实施例1中所述制备的9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺(10mg，～70％活化NHS)溶于1％甘氨酸+25mMHEPES pH7.4的缓冲溶液(25μL)中，用涡旋混和，而且室温反应30分钟以形成轭合物溶液。其后，将轭合物溶液的两个等份试样处理如下：将一个等分试样用25mM HEPES pH 7.4(1.25mL)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射；将另一个等分试样用25mM HEPES pH 8.2(缓冲液)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射。
将如实施例3中所述制备的G2PEG2Fmoc20k-NHS溶于1％甘氨酸+25mM HEPES pH7.4的缓冲溶液(25μL)中，用涡旋混和，而且室温反应30分钟以形成轭合物溶液。其后，将轭合物溶液的两个等份试样处理如下：将一个等分试样用25mM HEPES pH 7.4(1.25mL)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射；将另一个等分试样用25mM HEPES pH 8.2(缓冲液)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射。
将如实施例3中所述制备的G2PEG2Fmoc40k-NHS溶于1％甘氨酸+25mM HEPES pH7.4的缓冲溶液(25μL)中，用涡旋混和，而且室温反应30分钟以形成轭合物溶液。其后，将轭合物溶液的两个等份试样处理如下：将一个等分试样用25mM HEPES pH 7.4(1.25mL)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射；将另一个等分试样用25mM HEPES pH 8.2(缓冲液)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射。
将如实施例4中所述制备的9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(mPEG(10,000)酰胺基戊二酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺溶于1％甘氨酸+25mM HEPES pH7.4的缓冲溶液(25μL)中，用涡旋混和，而且室温反应30分钟以形成轭合物溶液。其后，将轭合物溶液的两个等份试样处理如下：将一个等分试样用25mM HEPES pH 7.4(1.25mL)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射；将另一个等分试样用25mM HEPESpH 8.2(缓冲液)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射。
将如实施例4中所述制备的4，7-CAC-PEG2-Fmoc20K-NHS溶于1％甘氨酸+25mM HEPES pH7.4的缓冲溶液(25μL)中，用涡旋混和，而且室温反应30分钟以形成轭合物溶液。其后，将轭合物溶液的两个等份试样处理如下：将一个等分试样用25mM HEPES pH 7.4(1.25mL)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射；将另一个等分试样用25mMHEPES pH 8.2(缓冲液)稀释，37℃培育并且在HPLC系统上以各种间隔注射。
根据一级速度定律，关于t1/2值的释放数据获得自符合ln([轭合物])与时间曲线的线性斜率。
37℃，9-羟甲基-2，7-二(mPEG(10,000)-甲基酰胺)芴-甘氨酸氨基甲酸酯轭合物的释放数据：pH7.4，t1/2＝9.9天；pH8.2，t1/2＝5.5天(用于一个实验)。
37℃，G2PEG2Fmoc20k-甘氨酸氨基甲酸酯轭合物的释放数据：pH 7.52±0.13，t1/2＝14.8±2.8天；pH 8.14±0.04，t1/2＝7.0±1天(其中，±范围说明2个实验)。
37℃，G2PEG2Fmoc40k-甘氨酸氨基甲酸酯轭合物的释放数据：pH 7.52±0.13，t1/2＝12.2±2.6天；pH 8.14±0.04，t1/2＝6.7±0.1天(其中，±范围说明2个实验)。
37℃，9-羟甲基-4-(甲酰胺基mPEG(10,000)-7-(酰胺基戊二酰胺mPEG(10,000))芴-甘氨酸氨基甲酸酯轭合物的释放数据：pH 7.52±0.13，t1/2＝4.0±1天；pH 8.14±0.04，t1/2＝1.95±0.15天(其中，±范围说明2个实验)。
37℃，4，7-CAC-PEG2-Fmoc20K-甘氨酸氨基甲酸酯轭合物的释放数据：pH 7.4，t1/2＝18.0±0.1天；pH 8.2，t1/2＝7.5±0.1天(其中，±范围说明2个实验)。
实施例6
制备示例性聚合物-蛋白质轭合物：制备G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1
将一种说明性聚合物试剂，G2PEG2Fmoc20k-NHS，共价地连接至示例性多肽，GLP-1，N-末端，以提供该蛋白质的前药形式，其中连接了可释放的PEG-部分。聚合物试剂的两臂性质提供了给药后稳定性增加的GLP-1部分，因此提供了一种缓释制剂，籍此通过水解将GLP-1从轭合物释放出来，从而提供了天然或未修饰的GLP-1前体。下面提供了G2PEG2Fmoc20k-Nter GLP-1的结构(在该结构中，“GLP-1”代表GLP-1的残基)。其他的多肽和蛋白质可以是对GLP-1的取代。
聚合物试剂，G2PEG2Fmoc20k-NHS，是根据实施例3中上面所述的而制备的。
制备50mg GLP-1(标示的1.2276×10-5mol)(GLP-1实际纯度为98.5％(经HPLC检测)，而肽的含量为82.2％)在25mL 20mM乙酸钠缓冲液pH5.50中的溶液，然后加入876.8mg的G2PEG2Fmoc20k-NHS(3.0692×10-5mol)并搅拌。室温搅拌溶液16小时，因此，形成了G2PEG2Fmoc20k-Nter-G LP-1，一种PEG化GLP-1轭合物。然后用20mMHAc酸化反应混合物至pH 4.30。用SDS-PAGE分析监测反应(图4)。
纯化G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1以便获得GLP-1的单PEG化轭合物，根据在
KTA碱性体系(图5)上的阳离子交换色谱法，应用流动相pH4.30的20mM乙酸钠缓冲液(溶液A)和pH4.30的含有1M NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(溶液B)。柱子是75mL树脂-填充HiTrapTM SPHP，可从AmershamBiosciences获得，填充了SP琼脂糖凝胶高效离子交换介质，也可从Amersham Biosciences获得，而且在色谱柱中的流动速度为14mL/分钟。首先将待纯化的溶液装载至色谱柱。然后，应用梯度，用流动相洗脱所载的产品。应用了如下的梯度：对于保留体积0mL至550mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积550mL至1041mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积1041mL至1093mL，10％含溶液B的流动相；对于保留体积1093mL至1338mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积1338mL至1486mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积1486mL以上，0％含溶液B的流动相。在215nm处监测洗脱液的UV吸收。收集保留体积为689.3mL、对应于G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1(单PEG化形式)峰的馏分(图5)并冻干。将冻干粉溶于pH4.3的25mL 20mM乙酸钠缓冲液，而且，在相同的阳离子交换色谱条件下再次重复纯化工艺。产量：179.4mg。
用SDS-PAGE(图6，道2)和反相HPLC(图7A)分析已纯化的G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1。用SDS-PAGE分析(图6，道3)和反相HPLC(图7B)还研究了在水性介质[50mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶液，pH 10，于50℃过夜]中G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1轭合物的可裂解性质，从而观测到GLP-1从轭合物中完全释放。色谱柱为100mm×2.1mm IDBetasil C18柱，具有5μm粒子，可从热电子公司(Thermo Electron Corp)获得。反相HPLC应用了0.1％TFA去离子水溶液(溶液C)和0.1％TFA乙腈溶液(溶液D)的流动相，操作于37℃。用于反相HPLC的梯度如下：对于时间0.00至20.00分钟，35％含溶液D的流动相；对于时间20.00至21.00分钟，55％含溶液D的流动相；对于时间21.00至23.00分钟，80％含溶液D的流动相；对于时间23.00至24.00分钟，80％含溶液D的流动相；对于时间24.00至25.00分钟，35％含溶液D的流动相；对于时间25.00以上，35％含溶液D的流动相。
用MALDI-TOF分析，然后应用源自金黄色葡萄球菌(Straphylococcusaureus)V8的蛋白内切酶，蛋白酶酶解轭合物，确定了G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1轭合物(一种单PEG化物质)的N-末端PEG化位点(His7)。
实施例7
制备示例性聚合物-蛋白质轭合物：制备G2PEG2Fmoe40k-Nter-GLP-1
聚合物试剂，G2PEG2Fmoc40k-NHS，是根据实施例3中上面所述的而制备的。
制备50mg GLP-1(标示的1.2276×10-5mol)(GLP-1实际纯度为98.5％(经HPLC检测)，而肽的含量为82.2％)在25mL 20mM乙酸钠缓冲液pH5.50中的溶液，然后加入1.4971gm的G2PEG2Fmoc40k-NHS(3.0692×10-5mol)并搅拌。室温搅拌溶液15小时，因此，形成了G2PEG2Fmoc40k-Nter-G LP-1，一种PEG化GLP-1轭合物。用2N HAc酸化反应混合物至pH 4.00，然后用pH4.00的50mL 20mM乙酸钠缓冲液稀释。
通过在
KTA碱性体系(图8)上的阳离子交换色谱法，纯化G2PEG2Fmoc40k-Nter-GLP-1以便获得GLP-1的单PEG化轭合物。柱子是75mL树脂-填充HiTrapTM SP HP，可从Amersham Biosciences获得，填充了SP琼脂糖凝胶高效离子交换介质，也可从Amersham Biosciences获得，而且在色谱柱中的流动速度为14mL/分钟。用于纯化的流动相包括pH4.00的20mM乙酸钠缓冲液(溶液A)和pH4.00含有1M NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(溶液B)。首先将待纯化的溶液装载至色谱柱。然后，应用梯度，用流动相洗脱所载的产品。应用了如下的梯度：对于保留体积0mL至550mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积550mL至1041mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积1041mL至1093mL，10％含溶液B的流动相；对于保留体积1093mL至1338mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积1338mL至1486mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积1486mL以上，0％含溶液B的流动相。在215nm处监测洗脱液的UV吸收。收集保留体积为668.4mL、对应于单G2PEG2Fmoc40k-Nter-GLP-1峰的馏分(图8)并冻干。将冻干粉溶于pH4.0的25mL 20mM乙酸钠缓冲液，而且，在相同的阳离子交换色谱条件下再次重复纯化工艺。将668mL处收集的馏分冻干。
用SDS-PAGE(图9，泳道2)分析已纯化的G2PEG2Fmoc40k-Nter-GLP-1。用SDS-PAGE分析(图9，泳道3)还研究了在水性介质[50mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶液，pH 10，于50℃过夜]中G2PEG2Fmoc40k-Nter-GLP-1轭合物的可裂解性质，从而观测到GLP-1从轭合物中完全释放。
实施例8
制备示例性聚合物-蛋白质轭合物：制备G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1
将示例性可释放聚合物试剂，G2PEG2Fmoc20k-NHS，共价地且可释放地连接至GLP-1的赖氨酸位置，这里称作GLP-1的“内部”PEG化。
制备30mg GLP-1(标示的7.3658×10-6mol)(GLP-1实际纯度为98.5％(将HPLC检测)，而肽的含量为82.2％)在24.5mL 20mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH10.0中的溶液，然后加入276.3mg的G2PEG2Fmoc20k-NHS(1.1049×10-5mol，根据实施例3中以上所述的而制备的)并搅拌。室温搅拌溶液10分钟。然后，用2N HAc酸化反应混合物至pH 4.30。
为了获得以单PEG化形式的G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1，将反应混合物分成五个等分试样，然后用在
KTA碱性体系上的阳离子交换色谱法将每个等分试样各个纯化。色谱柱是5mL树脂-填充HiTrapTM SP HP，可从Amersham Biosciences获得，而且色谱柱中的流动速度为5mL/分钟。用于纯化的流动相是pH4.30的20mM乙酸钠缓冲液(溶液A)和pH4.30含有1M NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(溶液B)。流动相是应用梯度而运行的。应用了如下的梯度：0mL至118.6mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积118.6mL至219.1mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积219.1mL至229.2mL，10％含溶液B的流动相；对于保留体积229.2mL至269.4mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积269.4mL至279.4mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积279.4mL以上，0％含溶液B的流动相。在215nm处监测洗脱液的UV吸收。在每个纯化运行中，收集保留体积为150.4mL、对应于G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1峰的单PEG化GLP-1馏分(图10)。然后，用SDS-PAGE分析来自每个纯化运行的已纯化G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1(以单PEG化GLP-1形式)(图11)。将收集的馏分合并和冻干。产量：41mg。
实施例9
制备示例性聚合物-蛋白质轭合物：制备G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1
将示例性可释放聚合物试剂，G2PEG2Fmoc40k-NHS，共价地且可释放地连接至GLP-1的赖氨酸位置，这里称作GLP-1的“内部”PEG化。
制备50mg GLP-1(标示的1.2276×10-5mol)(GLP-1实际纯度为98.5％(将HPLC检测)，而肽的含量为82.2％)在45mL 20mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH10.0中的溶液，然后加入898.0mg的G2PEG2Fmoc40k-NHS(1.8414×10-5mol，根据实施例3中以上所述的而制备的)并搅拌。室温搅拌溶液10分钟。然后，用2N HAc酸化反应混合物至pH 4.00。
为了获得以单PEG化形式的G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1，将已酸化的反应混合物(50mL)分成10个等分试样，然后用在
KTA碱性体系上的阳离子交换色谱法将每个5mL等分试样纯化。色谱柱是5mL树脂-填充HiTrapTM SP HP，可从Amersham Biosciences获得，而且色谱柱中的流动速度为5mL/分钟。用于纯化的流动相是pH4.00的20mM乙酸钠缓冲液(溶液A)和pH4.00含有1M NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(溶液B)。流动相是应用梯度而运行的。应用了如下的梯度：0mL至118.6mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积118.6mL至219.1mL，0％含溶液B的流动相；对于保留体积219.1mL至229.2mL，10％含溶液B的流动相；对于保留体积229.2mL至269.4mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积269.4mL至279.4mL，100％含溶液B的流动相；对于保留体积279.4mL以上，0％含溶液B的流动相。在215nm处监测洗脱液的UV吸收。在每个纯化运行中，收集保留体积为158.3mL、对应于G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1峰的单PEG化GLP-1馏分(图12)。然后，用SDS-PAGE分析来自每个纯化运行的已纯化G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1(以单PEG化GLP-1形式)(图13)。将收集的馏分合并、超滤并冻干。产量：187.5mg。
实施例10
小鼠体内实验以检验示例性GLP-1聚合物轭合物的降低血糖作用
雄性患糖尿病小鼠(BKS.Cg-+Lepr db/+Lepr db/01aHsd)购自Harlan制药公司(Harlan Laboratories，Ltd.)(耶路撒冷，以色列)。将8-9周龄的动物(30-40gm)安置于鼠笼(每笼两个动物)，而且在实验开始前至少习服48小时。
在以上的实施例中描述了制备G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1(实施例6)，G2PEG2Fmoc40k-Nter-GLP-1(实施例7)，G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1(Example 8)，和G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1(实施例9)。准确地称取每个化合物，置于玻璃管形瓶中，而且溶于正常生理盐水中，以便制备适于用药(基于GLP-1等价物)以及100μL注射体积的浓度。
实验分为两个阶段：可行性阶段和评价阶段
在可行性阶段，首先评价应用患糖尿病db/db小鼠来检验GLP-1有效性的可行性。在完成可行性阶段中，使用几组小鼠，其中在每一组中使用四只小鼠。收集每只小鼠在给药前2-3天的基线葡萄糖水平数据。这样做是为了确定在动物组中的任何异常值。在治疗日(0天)，对每个动物进行称重。自尾部静脉采集计时0天血样(5至10μL)。应用葡萄糖分析仪检测葡萄糖水平(mg/dL)。然后，在背部皮肤下，对每个动物皮下(SC)用药。检验项目的数量和给药的剂量(60和120μg/小鼠)是基于动物的平均体重，而且用药的总体积不超过10mL/kg。然后，将动物放回它们的笼子。通过针刺/毛细管，在下列计时点取走5至10μL(＜0.5％的2mL血液体积，对于35g小鼠而言)血样：-3，-2，-1，0，0.04，0.16，0.33，1.0，1.16天。检验每个采集血样的葡萄糖水平。在实验末期，二氧化碳窒息使得动物人道地安乐死。
在评价阶段，应用自可行性阶段获得的结果，以便于选择用于3-5天获得缓慢传输GLP-1作用所需的适宜剂量。在完成评价阶段中，每组使用八只小鼠。收集每只小鼠在给药前三天的基线葡萄糖水平数据。在治疗日(0天)，对每个动物进行称重。自尾部静脉采集计时0天血样(5至10μL)。应用葡萄糖分析仪检测葡萄糖水平(mg/dL)。然后，在背部皮肤下，对每个动物皮下(SC)用药。检验项目的数量和给药的剂量是基于动物的平均体重，而且用药的总体积不超过10mL/kg。然后，将动物放回它们的笼子。通过针刺/毛细管，在下列计时点取走5至10μL(＜0.5％的2mL血液体积，对于35g小鼠而言)血样：-3，-2，-1，0，0.04，0.16，0.33，0.5，1，2，3，6天。检验每个采集血样的葡萄糖水平。在用药后的最初四小时，将食物移开动物。在实验末期，二氧化碳窒息使得动物人道地安乐死。
下面的表2描述了用于每组动物的试验化合物以及剂量
表2
用于每组动物的试验化合物和剂量
| 治疗 | 批号或参照号 | 每组小鼠的数量 | 剂量(μg) |
| 阴性对照(盐水) | 百特公司，批号C645028 | 8 | - |
| 阳性对照2(GLP-1) | 美国肽公司，批号T05128191 | 8 | 60，120 |
| G2PEG2Fmoc20K-Lys(26或34)-GLP1 | ZH 071805 | 8 | 420 |
| G2PEG2Fmoc40K-Lys(26或34)-GLP1 | ZH 072305 | 8 | 420 |
| G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP1 | ZH 082405ZH 092105 | 8 | 420 |
| G2PEG2Fmoc40K-Nter-GLP1 | ZH 082505 CP2F1ZH 082505 CP2F2 | 8 | 420 |
收集并分析来自实验的数据。应当注意的是，动物承受了单次皮下用药。如图14中所示，GLP-1以及每个G2PEG2Fmoc20K-Lys-GLP-1(在图中指定为“PEG20-Lys-GLP1”)和G2PEG2Fmoc40K-Lys-GLP-1(在图中指定为“PEG40-Lys-GLP1”)轭合物的降低血液葡萄糖作用得到确认。从药效(PD)检测可以看到，GLP-1从小鼠中被迅速清除，但是GLP-1轭合物释放肽超过3至4天。换言之，本发明示例性GLP-1可降解轭合物的作用有些类似于分子泵，随着时间通过体内水解而释放完整的GLP-1。被共价地连接的亲水性聚合物(即PEG)的作用不仅是稳定在体内的GLP-1(即，通过保护蛋白质防止酶的降解)，而且通过缓慢地将蛋白质以超过延长3至4天释放进入血流中而延长了它的循环半衰期。还观察到，当与20千道尔顿PEG轭合物相比时，40千道尔顿PEG轭合物具有较小的但是延长的PD作用。
来自图14的数据提示：(a)GLP-1是通过扩散和通过自PEG化轭合物水解而从注射位点释放进入小鼠血液的；和(b)赖氨酸轭合的PEG-GLP1降低血液葡萄糖的活性可归因于完整轭合物的活性与肽自个体轭合物表观体内释放的组合。
图15说明了GLP-1和G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1(在图中指定为“PEG20-His-GLP1”)以及G2PEG2Fmoc40K-Nter-GLP-1(在图中指定为“PEG40-His-GLP1”的降低血液葡萄糖作用。从药效(PD)检测可以证明，GLP-1从小鼠中被迅速清除，但是PEG GLP-1轭合物释放肽超过3至4天。还观察到，当与PEG20千道尔顿轭合物相比时，PEG40千道尔顿轭合物具有较小的但是延长的PD作用。
这组(图14)数据提示：(a)GLP-1是通过扩散和通过自PEG化轭合物水解而从注射位点释放进入小鼠血液的；和(b)组氨酸轭合的PEG-GLP1没有活性，而且观察到的降低血液葡萄糖活性是肽从轭合物释放的结果。
本实验证明了，如这里所述的一种PEG化GLP-1注射剂可用于控制糖尿病，超出大于45小时的延长周期。本实验还证明了当被轭合到GLP-1时G2PEG2Fmoc的缓释性质。本实验还表明了GLP-1可以在N-末端上PEG化，从而提供用于胃肠外给药的产品。
实施例11
G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1的体外释放状况
G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1的体外释放状况予以确定。
如实施例6中所述而制备了G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1(以单PEG化GLP-1的形式)并且用于评价蛋白质的释放。
用于确定G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1体外释放状况的条件包括：在磷酸盐缓冲盐水中的2mg/mL G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1(当PEG化GLP-1形式)，pH 7.4，37℃，以及在各个计时点的所采的样品，而且检验“游离的”或未轭合的GLP-1的存在。用反相HPLC在215nm处监测GLP-1的释放。
图16给出的实验结果是图表的形式，其中Y＝At/Amax(At是在t(小时)时间释放的GLP-1的HPLC峰面积，而Amax是达到最大释放的GLP-1的HPLC峰面积)。由于反应动力学因曲线的线性而表示一级反应，因此可以导出ln1/(1-Y)＝kt，其中k斜率，t1/2＝ln2/k。
实施例12
制备9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(3-(mPEG(10,000))氨基甲酰基-丙基)芴-N-羟基琥珀酰亚胺；(或″4，7-CAC-PEG2-Fmoc20K-NHS″)
在下面的路线4中示意性地表示了9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(3-(mPEG(10,000))氨基甲酰基-丙基)芴-N-羟基琥珀酰亚胺的制备。
路线4
A.制备7-(3-羧基-丙酰基)-4-芴甲酸
在干燥、氩气吹扫过的圆底烧瓶中，将无水AlCl3(26.9g，0.202mol)混悬于无水1，2-二氯乙烷(60mL)中。将4-芴甲酸(10.0g，0.048mol)加至混悬液。将反应烧瓶置于室温浴，而且小心地添加琥珀酸酐(5.72g，0.057mol)。搅拌反应物5小时，然后冷却至0℃。通过小心地、逐份地添加3M HCl，小心地淬灭反应(注意！当加入HCl太快时，反应物可能剧烈地反应)。最终混合均匀的混悬液是酸性的，而且不与额外的HCl溶液反应。减压下除去有机溶剂，而且将产物过滤，用水冲洗干净。将粗品溶于温热的NaOH溶液(大约地≤1M NaOH)，过滤并且通过添加浓HCl而沉淀。将产物过滤，用水洗涤，然后在存在P2O5、减压的条件下干燥。产物为淡黄色固体(14.3g，97％)。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)8.4(d，1H，Ar)；8.2(s，1H，Ar)；8.0(d，1H，Ar)；7.8(m，2H，Ar)；7.5(t，1H，Ar)；4.1(s，2H，CH2)；2.6(t，2H，CH2)2.5(在DMSO条件下，CH2)。
B.制备7-(3-羧基-丙基)-4-芴甲酸
在氩气吹扫的烧瓶中，将7-(3-羧基-丙酰基)-4-芴甲酸(14.0g，0.045mol)混悬于二乙二醇(200mL)中。将烧瓶置于室温油浴中，然后依次加入NaOH(18g，0.450mol)和80％水合肼溶液(13.6mL，0.223mol)。缓慢地加热反应混合物至110℃并且回流2小时。在加热过程中，随着水的除去，将反应温度升至200℃。在200℃反应温度3小时之后，冷却反应物至大约60℃。小心地将反应混合物倾至水(大约1L)中，然后用浓HCl酸化该混合物至pH2。过滤产物并用水冲洗。将产物溶于温热的NaOH溶液(0.5M)中，然后用HCl酸化至pH2而沉淀。过滤产物并用水冲洗。产品为一种类白色固体(10.9g，82％)。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)8.3(d，1H，Ar)；7.7(m，2H，Ar)；7.4(s，1H，Ar)；7.4(t，1H，Ar)；7.2(d，1H，Ar)；3.9(s，2H，CH2)；2.7(t，2H，CH2)；2.3(t，2H，CH2)；1.9(m，2H，CH2)。
C.制备9-甲酰基-7-(3-羧基-丙基)-4-芴甲酸
在装有回流冷凝器、氩气吹扫的干燥烧瓶中，将7-(3-羧基-丙基)-4-芴甲酸(4.0g，0.0135mol)于400℃溶于无水的DMF(120mL)中。加入甲酸乙酯(40mL，经无水K2CO3储存的)，然后加入95％的叔丁醇钾(12.8g，0.108mol，以2份添加)。随着以各种间隔加入DMF(80mL)、无水THF(5mL)和甲酸乙酯(25mL)以有助于溶解度，在大约40℃-50℃搅拌反应物4小时。搅拌反应物4小时。然后室温下再搅拌反应物17小时。减压下蒸发甲酸乙酯。用水(150mL)淬灭反应，而且用浓HCl酸化至pH2。用乙酸乙酯(600mL然后200mL)萃取产物两次。用盐水洗涤合并的有机层3次，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。粗品(4.7g，～100％，纯度80％)含有一些未反应的原料。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)11.4(s，1H，formyl)；8.3-7.0(m，7H，Ar)；2.7(m，2H，CH2)；2.3(m，2H，CH2)；1.9(m，2H，CH2)。
D.制备9-羟甲基-7-(3-羧基-丙基)-4-芴甲酸
在氩气吹扫的烧瓶中，将粗品9-甲酰基-7-(3-羧基-丙基)-4-芴甲酸(4.0g，0.0123mol)溶于无水甲醇(50mL)中。将烧瓶置于室温浴，然后按份地、小心地将硼氢化钠(2.3g，0.0615mol)反应中(注意！可燃气体的发出)。搅拌反应物2小时，然后加入另外一份硼氢化钠(1.2g，0.031mol)。再经过6小时后，用少量的水处理反应物。减压下部分地除去有机溶剂，然后用浓HCl酸化该混合物。加入盐水，而且用乙酸乙酯(300mL和100mL)萃取产物两次。用盐水洗涤合并有机层、经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。用快速色谱法：硅胶60
，用50∶50∶2的乙酸乙酯/氯仿/冰乙酸洗脱，纯化粗品(3.3g，83％)。已纯化产物为橙色固体(1.7g，43％)。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)8.3(d，1H，Ar)；7.8(m，2H，Ar)；7.6(s，1H，Ar)；7.4(t，1H，Ar)；7.2(m，1H，Ar)；4.0(m，2H，CH2)；3.9(m，1H，CH)；2.8(t，2H，CH2)；2.4(t，2H，CH2)；2.0(m，2H，CH2)。
E.制备9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(3-(mPEG(10,000))氨基
甲酰基-丙基)芴
将在无水甲苯(250mL)中的mPEG-NH2(10,000)(Mn＝9,418；色谱纯，25.8g，0.0026mol，亦指定为“mPEG(10k)-NH2”)在旋转蒸发仪上、减压下、共沸地于45℃蒸馏。在惰性气体环境下，将所得固体溶于无水DCM(CH2Cl2)(130mL)中。将溶解于无水DMF(12.5mL)中的9-羟甲基-7-(3-羧基-丙基)-4-芴甲酸(0.38g，0.0012mol)以及无水的N-羟基苯并三唑(HOBt)(0.33g，0.0025mol)定量地加至PEG溶液(5mL DMF漂洗)。然后，将1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)(0.54g，0.0026mol)加至反应溶液。室温搅拌反应物21小时，然后减压下蒸发溶剂。随着轻轻加热，将得到的粘稠糖浆溶于干燥的IPA(900mL，慢慢的添加)。室温加入乙醚(400mL)，PEG产物沉淀。将沉淀物冷却至10℃、10分钟，过滤然后用冷的IPA(300mL)冲洗，然后用乙醚(300mL)。高真空下，干燥粗品(类白色粉末)，然后溶于去离子水中。在POROS介质(500mL)上进行PEG溶液的离子交换色谱，用水洗脱。收集含中性PEG的馏分，用DEAE琼脂糖凝胶介质(200mL)进一步纯化。未发现已纯化产物中含有mPEG-NH2(10,000)或单PEG酸产物(HPLC分析)。产量17g，71％(取代95％)。1H-NMR(CD2Cl2)：δ(ppm)7.9(d，1H，Ar)；7.7(d，1H，Ar)；7.5(s，1H，Ar)；7.4(m，1H，Ar)；7.3(t，1H，Ar)；7.2(d，1H，Ar)；6.7(bs，1H，酰胺)；6.2(bs，1H，酰胺)；4.1(m，2H，CH2)；3.8(m，1H，CH)；3.6(s，PEG骨架)；3.3(s，6H，-OCH3)；2.7(m，2H，CH2)；2.2(m，2H，CH2)；1.9(水+m，2H，CH2)。
F.制备9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(3-(mPEG(10,000))氨基
甲酰基-丙基)芴-N-羟基琥珀酰亚胺
将在无水甲苯(50mL)中的9-羟甲基-4-(mPEG(10,000)-甲酰胺)-7-(3-(mPEG(10,000))氨基甲酰基-丙基)芴(2.9g，0.00015mol)在旋转蒸发仪上、减压下、共沸地于45℃蒸馏。将得到的固体溶于无水DCM(15mL，外加1mL漂洗)并且用注射器转移至新制备的三光气(用碱捕获器捕获来自反应的过量光气)。(0.047g，0.00016mol)和无水吡啶(0.013g，0.00016mol，以在CH2Cl2(～0.9mL)中的溶液而添加)溶液中。在1小时的时候，开始快速氩气流(维持室温)以蒸发过量的光气(在通风口应用碱捕获器)。在氩气吹扫30分钟后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.09g，0.00078mol)而且搅拌10分钟。加入无水吡啶(0.059g，0.00075mol，以在CH2Cl2(～4.5mL)中的溶液而添加)。继续氩气流，以便于1.5小时后蒸发大多数的反应物溶剂。将得到的粘稠糖浆溶于无水IPA(150mL)并于室温沉淀。过滤沉淀物，而且用冷的IPA和乙醚冲洗(30mL含有5mg BHT)。真空下蒸发残留溶剂得到类白色粉末。经HPLC，得到产物2.7g，90％，取代76％NHS碳酸酯。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)7.9(m，1H，Ar)；7.7(m，1H，Ar)；7.5(m，2H，Ar)；7.4(m，1H，Ar)；7.2(m，1H，Ar)；6.8(bs，1H，酰胺)；6.1(bs，1H，酰胺)；4.7(m，2H，CH2)；4.3(t，1H，CH)；3.6(s，PEG骨架)；3.3(s，6H，-OCH3)；2.7(s，4H，CH2CH2)；2.7(m，2H，CH2)；2.2(t，2H，CH2)；2.0(m，2H，CH2)。
实施例13
制备9-羟甲基-2，7-芴二甲酸，一种用于制备9-羟甲基-2，7-(双-mPEG10K-甲酰胺)-芴-N-羟基琥珀酰亚胺(2，7-C2-PEG2-Fmoc20K-NHS)的中间体
在下面的路线5中示意性地表示了9-羟甲基-2，7-芴二甲酸的合成
路线5
A.制备2，7-芴二甲酸
在氩气吹扫的烧瓶中，将9-芴酮-2，7-二甲酸(10.0g，0.037mol)混悬于二乙二醇(75mL)中。将烧瓶置于室温油浴中，然后依次加入NaOH(6.2g，0.155mol)和80％的水合肼溶液(7.4mL，0.12mol)。将反应混合物缓慢地加热至110℃而且回流四小时。冷却反应混合物，小心地倾至水中，然后用浓HCl酸化至pH2。过滤产物并用水冲洗。将产物溶于温热的NaOH溶液(0.5M，温热的)中，然后用HCl酸化至pH2而沉淀。过滤产物并用水冲洗。产品为一种黄色固体(9.0g，96％)。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)8.2(s，2H，Ar)；8.1(m，2H，Ar)；8.0(m，2H，Ar)；4.1(s，2H，CH2)。
B.制备2，7-芴二甲酸双苄酯
在氮气吹扫的干燥烧瓶中，将2，7-芴二甲酸(8.0g，0.031mol)混悬于无水的DMF(400mL)中。将无水苄醇(82mL，0.788mol)、DMAP(0.58g，0.0047mol)和盐酸EDAC(16g，0.082mol)室温加至反应混合物。搅拌24小时后，加温反应混合物，然后通过加入极稀的HCl(1.5L)而淬灭。冷却该混悬液，过滤并且用水洗。将产物溶于温热的丙酮(800mL)并趁热过滤。减压下蒸发滤液至干(产量5.9g，43％)(路线5中的“Bz”代表苄基)。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)8.3(s，2H，Ar)；8.2(m，2H，Ar)；8.1(m，2H，Ar)；7.5-7.4(m，10H，Bz)；5.4(s，4H CH2)；4.1(s，2H，Ar)。
C.制备9-甲酰基-2，7-芴二甲酸双苄酯
在氩气吹扫的干燥烧瓶中，将2，7-芴二甲酸双苄酯(3.0g，0.0065mol)室温下溶于无水THF(60mL)中。加入甲酸苄酯(4.2mL，0.035mol，经无水K2CO3储存的)，随后加入95％叔丁醇钾(2.7g，0.023mol)。搅拌反应物3小时，然后用添加水淬灭反应而且用HCl酸化至pH2。减压下部分地蒸发有机溶剂。用乙酸乙酯(600mL然后200mL)萃取产物两次。用盐水洗涤合并的有机层三次，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。用己烷和甲醇洗涤粗品(1.9g，60％)。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)11.9(s，～1H，甲酰基)；8.8(s，1H，Ar)；8.5(s，1H，Ar)；8.4(s，1H，Ar)；8.2(m，2H，Ar)；7.9(m，2H，Ar)；7.5-7.4(m，10H，Bz)；5.4(s，4H，Ar)。
D.制备9-甲酰基-2，7-芴二甲酸
在Parr加氢瓶(Parr仪器公司，莫林市伊利诺伊州)中，将9-甲酰基-2，7-芴二甲酸双苄酯(3.0g，0.0061mol)溶于无水THF(350mL)中。在小心地加入20％重量比的20％Pd/C(湿润的，含50％水)(600mg)之后，在Parr仪器上，将Parr瓶抽气/充气3次，以确保氢气环境。在20-30psi氢气下，摇动混悬液60小时，然后减压下除掉剩余的氢气。经一层硅藻土过滤该混悬液，用另外的THF漂洗，然后蒸发。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)9.0(s，1H，Ar)；8.5-8.1(m，6H，Ar)。
E.制备9-羟甲基-2，7-芴二甲酸
将小样品的9-甲酰基-2，7-芴二甲酸(5-10mg)溶于含少量THF的水中。加入过量的硼氢化钠，而且使得反应2小时。通过小心地添加1M HCl而淬灭反应，直至酸性的。用乙酸乙酯萃取产物，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)8.4(s，2H，Ar)；8.2(m，2H，Ar)；8.0(m，2H，Ar)；4.2(t，1H，CH)；4.0(d，2H，CH2)。
实施例14
制备9-羟甲基-2，7-二(3-羧基-丙基)芴，一种用于制备9-羟甲基-2，7-双-(3-(mPEG10K氨基甲酰基-丙基))芴-N-羟基琥珀酰亚胺；(2，7-CA2-PEG2-Fmoc20K-NHS)
在下面的路线6中示意性地表示了2，7-二(3-羧基-丙基)芴的合成。
路线6
A.制备2，7-二(3-羧基-丙酰基)芴
在氩气吹扫过的干燥圆底烧瓶中，将无水AlCl3(98g，0.735mol)混悬于无水1，2-二氯乙烷(140mL)中。在另一个烧瓶中，将芴(23g，0.138mol)溶于无水的1，2-二氯乙烷(125mL)中，然后加至AlCl3混悬液。将反应烧瓶置于室温浴，而且小心地添加琥珀酸酐(34.5g，0.345mol)。搅拌反应16小时，然后通过加至冷的3M HCl而特别小心地淬灭(注意！当加入HCl太快时，反应物可能剧烈地反应)。最终混合均匀的混悬液是酸性的，而且对额外的HCl溶液不起反应。减压下除去有机溶剂，然后过滤产物，用水洗干净。将粗品溶于温热的NaOH溶液(大约地≤1M NaOH)，过滤并且通过添加浓HCl而沉淀。将产物过滤，用水洗涤，然后在存在P2O5、减压的条件下干燥。产物为淡黄色固体(49.3g，97％).1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)8.3(s，2H，Ar)；8.2(m，2H，Ar)；8.1(m，2H，Ar)；4.1(s，2H，CH2)；3.5(t，4H，CH2)；2.8(t，4H，CH2)。
B.制备2，7-二(3-羧基-丙基)芴
在氩气吹扫的烧瓶中，将2，7-二(3-羧基-丙酰基)芴(12.8g，0.035mol)混悬于二乙二醇(150mL)中。将烧瓶置于室温油浴中，然后依次加入NaOH(14g，0.35mol)和80％的水合肼溶液(13.1mL，0.21mol)。缓慢地加热反应混合物至110℃而且回流大约2小时。在加热过程中，随着水的除去，将反应温度升至200℃。在200℃反应温度3小时之后，冷却反应至大约60℃。小心地将反应混合物倾至水(500mL)中，然后用浓HCl酸化该混合物至pH2。过滤产物并用水冲洗。将产物溶于温热的NaOH溶液(0.5M)中，然后用HCl酸化至pH2而沉淀。过滤产物并用水冲洗。(产量10.9g，92％).1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)12.0(s，2H，COOH)；7.8(m，2H，Ar)；7.4(s，2H，Ar)；7.2(m，2H，Ar)；3.9(s，2H，CH2)；2.7(t，4H，CH2)；2.3(t，4H，CH2)；1.8(m，4H，CH2)。
C.制备2，7-二(3-羧基-丙基)芴双苄酯
在氮气吹扫的干燥烧瓶中，将2，7-二(3-羧基-丙基)芴(3.0g，0.009mol)溶于无水DMF(50mL)。将无水苄醇(23mL，0.22mol)，DMAP(0.27g，0.0022mol)和盐酸EDAC(4.5g，0.023mol)室温下加至反应混合物。在搅拌21小时后，将反应混合物升温，然后通过加入极稀的HCl(400mL)而淬灭。冷却混悬液，过滤并水洗。将产物溶于温热的丙酮并趁热过滤。减压下蒸发滤液至干(产量3.8g，78％).1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)7.7(m，2H，Ar)；7.4(m，12H，Ar)；7.1(m，2H，Ar)；5.1(s，4H，CH2)；3.8(s，2H，CH2)；2.7(t，4H，CH2)；2.4(t，4H，CH2)；1.9(m，4H，CH2)。
D.制备9-甲酰基-2，7-二(3-羧基-丙基)芴双苄酯
在氩气吹扫的干燥烧瓶中，将2，7-二(3-羧基-丙基)芴双苄酯(2.0g，0.0039mol)室温下溶于无水的THF(40mL)中。加入甲酸苄酯(2.3mL，0.019mol，经无水K2CO3储存)，随后添加95％的叔丁醇钾(1.5g，0.013mol)。搅拌反应4小时，然后通过加水淬灭反应和用HCl酸化至pH2。减压下部分地蒸发有机溶剂。用乙酸乙酯萃取产物两次。用盐水洗涤合并有机层两次，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。用己烷滴定(titurated)粗品(有些甲酸苄酯残留).1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)11.0(s，～1H，formyl)；8.0(s，1H，Ar)；7.9(s，1H，Ar)；7.7(m，2H，Ar)；7.6(s，1H，Ar)；7.4-7.2(m，Bz)；7.0(m，2H，Ar)；5.0(s，4H，CH2)；2.7(m，4H，CH2)；2.4(m，4H，CH2)；1.9(m，4H，CH2)。
实施例15
制备9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)-磺酸-芴-N-羟基琥珀酰亚胺
在氩气吹扫的干燥烧瓶中，将9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺(1g，0.026mmol)溶于无水的DCM(10mL)中。将氯磺酸(0.05mL在50mL三氟乙酸中，2.1mL)溶液加至反应混合物。再经过数小时后，将另外的氯磺酸(0.287mL)加至反应，并搅拌5小时以上。减压下蒸发溶剂，然后溶于DCM中。减压下再次蒸发溶剂。经HPLC分析，粗品表明磺酸修饰结构的存在。1H-NMR(d6-DMSO)：δ(ppm)8.2(bs，1H，NH酰胺)；7.6(m，1H，Ar)；7.5(m，1H，Ar)；7.2(t，1H，Ar)；6.7(s，1H，Ar)；6.5(d，1H，Ar)；5.3(bs，1H，NH酰胺)；3.8(s，2H，CH2)；3.5(s)；3.3(bs，PEG骨干)；在粗品中存在低于2.5ppm的额外污染物位移。
可将磺酸电子改变基团添加至聚合物试剂而不是本发明所包括的9-羟甲基-2，7-二(mPEG(20,000)-甲基酰胺)芴-N-羟基琥珀酰亚胺(包括在实验中所描述的那些聚合物试剂)。
Claims (46)
1.下式V的聚合物试剂：
其中：
POLY1是具有重均分子量的范围为大于5,000至约100,000道尔顿的第一水溶性聚(环氧烷)；
POLY2是具有重均分子量的范围为大于5,000至约100,000道尔顿的第二水溶性聚(环氧烷)；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；并且
(FG)是能够与活性剂的氨基反应以形成可降解键的官能团。
2.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中，POLY1和POLY2各自为聚乙二醇。
3.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中每个聚乙二醇具有范围为大于5,000道尔顿至约6,000道尔顿的重均分子量。
4.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中每个聚乙二醇具有范围为约6,000道尔顿至约100,000道尔顿的重均分子量。
5.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中所述第一间隔部分选自：-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-，并且所述第二间隔部分选自-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-。
6.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中R1是H且R2是H。
7.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中所述能够与活性剂的氨基反应的官能团选自：N-琥珀酰亚氨基、1-苯并三唑基、咪唑、咪唑、卤化物或苯酚盐的碳酸酯。
8.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中所述能够与氨基反应的官能团是N-琥珀酰亚氨基的碳酸酯。
9.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中(a)是零且(b)是零。
10.如权利要求1所述的聚合物试剂，其中，(a)是1，(b)是零，并且所述第一电子改变基团选自卤、低级烷基、芳基、取代的芳基、取代的芳烷基、烷氧基、芳氧基、烷基硫基、芳基硫基、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR和-C(O)NHR，其中Ar是芳基且R是H或有机基团。
11.如权利要求1所述的聚合物试剂，其选自：
其中，对于每个结构而言，每个(n)是约136至约2050。
12.如权利要求1所述的聚合物试剂，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050。
13.如权利要求1所述的聚合物试剂，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050。
14.如权利要求1所述的聚合物试剂，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050。
15.如权利要求1所述的聚合物试剂，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050。
16.如权利要求1所述的聚合物试剂，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050。
17.如权利要求1所述的聚合物试剂，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050。
18.下式V-C的轭合物：
(式V-C)
POLY1是具有重均分子量的范围为大于5,000至约100,000道尔顿的第一水溶性聚(环氧烷)；
POLY2是具有重均分子量的范围为大于5,000至约100,000道尔顿的第二水溶性聚(环氧烷)；
X1是第一间隔部分；
X2是第二间隔部分；
Hα是可电离氢原子；
R1是H或有机基团；
R2是H或有机基团；
(a)是零或者1；
(b)是零或者1；
Re1，当其存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当其存在时，是第二电子改变基团；和
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
D是生物活性剂残基。
19.如权利要求18所述的轭合物，其中，POLY1和POLY2各自为聚乙二醇。
20.如权利要求18所述的轭合物，其中每个聚乙二醇具有范围为大于5,000道尔顿至约6,000道尔顿的重均分子量。
21.如权利要求18所述的轭合物，其中每个聚乙二醇具有范围为约6,000道尔顿至约100,000道尔顿的重均分子量。
22.如权利要求18所述的轭合物，其中所述第一间隔部分选自：-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-，并且所述第二间隔部分选自：-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-和-O-CH2-CH2-NH-C(O)-。
23.如权利要求18所述的轭合物，其中，R1是H且R2是H。
24.如权利要求18所述的轭合物，其中，Y1是O且Y2是O。
25.如权利要求18所述的轭合物，其中所述生物活性剂是多肽。
26.如权利要求18所述的轭合物，其中，(a)是零且(b)是零。
27.如权利要求18所述的轭合物，其中，(a)是1，(b)是零，并且所述第一电子改变基团选自卤、低级烷基、芳基、取代的芳基、取代的芳烷基、烷氧基、芳氧基、烷基硫基、芳基硫基、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR和-C(O)NHR，其中Ar是芳基且R是H或有机基团。
28.如权利要求18所述的轭合物，其选自：
其中，对于每个结构而言，每个(n)是约136至约2050，并且D是生物活性剂残基。
29.如权利要求18所述的轭合物，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050，并且D是生物活性剂残基。
30.如权利要求18所述的轭合物，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050，并且D是生物活性剂残基。
31.如权利要求18所述的轭合物，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050，并且D是生物活性剂残基。
32.如权利要求18所述的轭合物，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050，并且D是生物活性剂残基。
33.如权利要求18所述的轭合物，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050，并且D是生物活性剂残基。
34.如权利要求18所述的轭合物，其为下式：
其中，每个(n)是约136至约2050，并且D是生物活性剂残基。
35.一种用于制备聚合物试剂的方法，其包括：
(a)提供带有第一连接位点、第二连接位点和第三连接位点的芳香族部分；
(b)将官能团试剂与所述第一连接位点反应以得到带有能够与活性剂氨基基团反应的官能团的第一连接位点，并且得到可水解的氨基甲酸酯；
(c)将带有活性基团的多个水溶性聚合物与所述第二连接位点和所述第三连接位点反应以得到：(i)通过间隔部分带有水溶性聚合物的第二连接位点，和(ii)通过间隔部分带有第二水溶性聚合物的第三连接位点。
36.如权利要求35所述的方法，其中步骤(b)是在步骤(c)之前进行的。
37.如权利要求35所述的方法，其中步骤(c)是在步骤(b)之前进行的。
38.一种用于制备轭合物的方法，该方法包括：在轭合条件下将根据权利要求1所述的聚合试剂与含有胺的生物活性剂反应。
39.一种轭合物，其根据权利要求38所述的方法而制备。
40.一种药物组合物，其包含权利要求39所述的轭合物和药学可接受赋形剂。
41.如权利要求40所述的药物组合物，其是冻干的形式。
42.如权利要求40所述的药物组合物，其进一步包括液体稀释剂。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述液体稀释剂选自：注射用抑菌水、5％右旋糖水溶液、磷酸缓冲盐水、林格氏溶液、盐水溶液、无菌水、去离子水或者其组合。
44.如权利要求40所述的药物组合物，其是单位剂量的形式。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其装于玻璃管形瓶中。
46.根据权利要求18所述轭合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
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| EP2175878A4 (en) * | 2007-07-11 | 2014-12-03 | Belrose Pharma Inc | POLYMER DRUG DISPENSING SYSTEM WITH A MULTIPLE SUBSTITUTED AROMATIC PART |
| WO2009045539A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Oligomer-corticosteroid conjugates |
| CA2704234A1 (en) * | 2007-11-09 | 2009-05-14 | Baxter International Inc. | Modified recombinant factor viii and von willebrand factor and methods of use |
| WO2010014258A2 (en) * | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates having a releasable linkage |
| WO2010021718A1 (en) * | 2008-08-19 | 2010-02-25 | Nektar Therapeutics | Complexes of small-interfering nucleic acids |
| AU2009282747B2 (en) | 2008-08-22 | 2015-04-02 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Polymeric benzyl carbonate-derivatives |
| JP5435536B2 (ja) * | 2008-09-04 | 2014-03-05 | 学校法人神奈川大学 | 光分解性ブロックコポリマー |
| EP2344199A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-07-20 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of thymosin alpha 1 peptides |
| US20110206633A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-08-25 | Nektar Therapectics | Polymer conjugates of cd-np peptides |
| US20120195847A1 (en) * | 2008-09-19 | 2012-08-02 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of biphalin peptides |
| CA2737040C (en) | 2008-09-19 | 2017-05-02 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of therapeutic peptides |
| EP2334336A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-06-22 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of osteocalcin peptides |
| US20110237524A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-09-29 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of aod-like peptides |
| WO2010033221A1 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of protegrin peptides |
| EP2334338A2 (en) * | 2008-09-19 | 2011-06-22 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of c-peptides |
| WO2010033222A2 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Netkar Therapeutics | Polymer conjugates of ziconotide peptides |
| EP2337585A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-06-29 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of glp-2-like peptides |
| US20110171160A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-07-14 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of kiss1 peptides |
| WO2010033223A1 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of opioid growth factor peptides |
| EP2344200A2 (en) * | 2008-09-19 | 2011-07-20 | Nektar Therapeutics | Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use |
| US20110165113A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-07-07 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of v681-like peptides |
| JP4966434B2 (ja) | 2008-10-15 | 2012-07-04 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 結合抗体の存在下における組換え血液凝固因子のｐｅｇ化 |
| JP5775820B2 (ja) * | 2008-10-21 | 2015-09-09 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ | 遊離可能ｐｅｇ試薬を有するプロドラッグｐｅｇタンパク質結合体において活性成分（インビトロ脱ペグ化）を決定する方法 |
| WO2010132693A2 (en) | 2009-05-13 | 2010-11-18 | Nektar Therapeutics | Oligomer-containing pyrrolidine compounds |
| DK2459224T3 (en) | 2009-07-27 | 2016-07-25 | Baxalta GmbH | Blodstørkningsproteinkonjugater |
| ES2856055T3 (es) | 2009-07-27 | 2021-09-27 | Baxalta GmbH | Glicopolisialilación de proteínas diferentes de las proteínas de coagulación de la sangre |
| US9173953B2 (en) | 2009-07-31 | 2015-11-03 | Ascendis Pharma As | Prodrugs containing an aromatic amine connected by an amido bond to a linker |
| WO2011035065A1 (en) | 2009-09-17 | 2011-03-24 | Nektar Therapeutics | Monoconjugated chitosans as delivery agents for small interfering nucleic acids |
| KR101828613B1 (ko) | 2009-09-29 | 2018-02-12 | 넥타르 테라퓨틱스 | 올리고머-칼슘 모방체 컨쥬게이트 및 관련 화합물 |
| US8722732B2 (en) | 2009-09-29 | 2014-05-13 | Nektar Therapeutics | Oligomer-calcimimetic conjugates and related compounds |
| JP2011079776A (ja) * | 2009-10-07 | 2011-04-21 | Doshisha | 歯周病予防剤 |
| KR101969601B1 (ko) | 2010-07-30 | 2019-04-17 | 박스알타 인코퍼레이티드 | 옥심 결합용 친핵성 촉매 |
| EP3578205A1 (en) | 2010-08-06 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
| CA2813466A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids that disrupt major groove binding partner interactions |
| WO2012054861A1 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Nektar Therapeutics | Glp-1 polymer conjugates having a releasable linkage |
| WO2012054822A1 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Nektar Therapeutics | Pharmacologically active polymer-glp-1 conjugates |
| WO2012064845A2 (en) * | 2010-11-09 | 2012-05-18 | Nektar Therapeutics | G-csf polymer conjugates having a releasable linkage |
| EA037083B1 (ru) | 2010-11-12 | 2021-02-03 | Нектар Терапьютикс | Иммуномодулирующий конъюгат, включающий il-2 и водорастворимые полимеры |
| PL2654794T3 (pl) | 2010-12-22 | 2020-07-27 | Baxalta GmbH | Materiały i sposoby sprzęgania rozpuszczalnej w wodzie pochodnej kwasu tłuszczowego z białkiem |
| EP2654797B1 (en) | 2010-12-23 | 2017-11-08 | Nektar Therapeutics | Polymer-des-ethyl sunitinib conjugates |
| US9827326B2 (en) | 2010-12-23 | 2017-11-28 | Nektar Therapeutics | Polymer-sunitinib conjugates |
| CA2831613A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
| EP3808378A1 (en) | 2011-05-27 | 2021-04-21 | Baxalta GmbH | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
| CA2842323A1 (en) | 2011-07-18 | 2013-01-24 | Arts Biologics A/S | Long acting biologically active luteinizing hormone (lh) compound |
| WO2013020079A2 (en) | 2011-08-04 | 2013-02-07 | Nektar Therapeutics | Conjugates of an il-11 moiety and a polymer |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| CN110511939A (zh) | 2011-10-03 | 2019-11-29 | 现代泰克斯公司 | 修饰的核苷、核苷酸和核酸及其用途 |
| EP2791160B1 (en) | 2011-12-16 | 2022-03-02 | ModernaTX, Inc. | Modified mrna compositions |
| EP2833923A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-24 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS |
| US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| EP2846822A2 (en) | 2012-05-11 | 2015-03-18 | Prorec Bio AB | Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders |
| AU2013204754C1 (en) | 2012-05-16 | 2018-10-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage |
| UA116217C2 (uk) | 2012-10-09 | 2018-02-26 | Санофі | Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону |
| PT2922554T (pt) | 2012-11-26 | 2022-06-28 | Modernatx Inc | Arn modificado nas porções terminais |
| AU2013366691A1 (en) | 2012-12-21 | 2015-07-09 | Sanofi | Exendin-4 derivatives |
| EP2971010B1 (en) | 2013-03-14 | 2020-06-10 | ModernaTX, Inc. | Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| JP2016530294A (ja) | 2013-09-03 | 2016-09-29 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | キメラポリヌクレオチド |
| EP3041938A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
| SG11201602503TA (en) | 2013-10-03 | 2016-04-28 | Moderna Therapeutics Inc | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| TW201609799A (zh) | 2013-12-13 | 2016-03-16 | 賽諾菲公司 | 雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑 |
| EP3080150B1 (en) | 2013-12-13 | 2018-08-01 | Sanofi | Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists |
| TW201609797A (zh) | 2013-12-13 | 2016-03-16 | 賽諾菲公司 | 雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑 |
| TW201609796A (zh) | 2013-12-13 | 2016-03-16 | 賽諾菲公司 | 非醯化之艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物 |
| MX2016010870A (es) | 2014-02-21 | 2016-10-26 | Nektar Therapeutics (India) Pvt Ltd | Agonistas il-2rbeta-selectivos en combinacion con un anticuerpo anti-ctla-4 o un anticuerpo anti-pd-1. |
| MA39711A (fr) | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Nektar Therapeutics | Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère |
| TW201625670A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑 |
| TW201625669A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑 |
| TW201625668A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物 |
| US9932381B2 (en) | 2014-06-18 | 2018-04-03 | Sanofi | Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists |
| US20170204152A1 (en) | 2014-07-16 | 2017-07-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
| US20170210788A1 (en) | 2014-07-23 | 2017-07-27 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of intrabodies |
| AR105319A1 (es) | 2015-06-05 | 2017-09-27 | Sanofi Sa | Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico |
| TW201706291A (zh) | 2015-07-10 | 2017-02-16 | 賽諾菲公司 | 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物 |
| JP7407511B2 (ja) | 2015-10-08 | 2024-01-04 | ネクター セラピューティクス | ＩＬ－２Ｒβ選択的作動薬と長時間作用型ＩＬ－１５作動薬との併用 |
| JP6921833B2 (ja) | 2015-10-22 | 2021-08-18 | モデルナティーエックス， インコーポレイテッド | ヒトサイトメガロウイルスワクチン |
| BR112018008078A2 (pt) | 2015-10-22 | 2018-11-13 | Modernatx Inc | vacina de vírus influenza de amplo espectro |
| CN117731769A (zh) | 2015-10-22 | 2024-03-22 | 摩登纳特斯有限公司 | 用于水痘带状疱疹病毒(vzv)的核酸疫苗 |
| KR20180096592A (ko) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | 모더나티엑스, 인크. | 호흡기 세포융합 바이러스 백신 |
| EP4349404A2 (en) | 2015-10-22 | 2024-04-10 | ModernaTX, Inc. | Respiratory virus vaccines |
| TN2018000155A1 (en) | 2015-10-22 | 2019-10-04 | Modernatx Inc | Herpes simplex virus vaccine |
| PT3394093T (pt) | 2015-12-23 | 2022-05-30 | Modernatx Inc | Métodos de utilização de polinucleotídeos que codificam ligandos ox40 |
| MA43587A (fr) | 2016-01-10 | 2018-11-14 | Modernatx Inc | Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4 |
| EP3517544A4 (en) | 2016-09-23 | 2020-06-03 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | INSULIN ANALOG HAVING REDUCED INSULIN RECEPTOR BINDING FORCE AND USE THEREOF |
| EP3568162A1 (en) | 2017-01-10 | 2019-11-20 | Nektar Therapeutics | Multi-arm polymer conjugates of tlr agonist compounds and related immunotherapeutic treatment methods |
| CA3055040A1 (en) | 2017-03-01 | 2018-09-07 | Nektar Therapeutics | Immunotherapeutic tumor treatment method using an interleukin-2 receptor alpha, beta-selective agonist in combination with adoptive cell transfer therapy |
| JP2020511513A (ja) | 2017-03-23 | 2020-04-16 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | インスリン受容体との結合力が減少されたインスリンアナログの結合体及びその用途 |
| TWI788340B (zh) | 2017-04-07 | 2023-01-01 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 抗icos促效劑抗體及其用途 |
| CA3072320A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Nektar Therapeutics | Immunotherapeutic tumor treatment method |
| CN109589415B (zh) | 2017-09-30 | 2022-02-18 | 天津键凯科技有限公司 | 一种聚乙二醇-多肽和蛋白类药物的结合物 |
| WO2019183551A1 (en) | 2018-03-23 | 2019-09-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibodies against mica and/or micb and uses thereof |
| AU2019358201A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-05-20 | Nektar Therapeutics | Method of making releasable polymeric reagents |
| TW202033555A (zh) | 2018-11-16 | 2020-09-16 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 抗nkg2a抗體及其用途 |
| CN111995513B (zh) * | 2019-05-27 | 2022-11-01 | 天津键凯科技有限公司 | 一种9-羟甲基-芴二酸的制备方法 |
| WO2022103983A2 (en) * | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Sutro Biopharma, Inc. | Fluorenylmethyloxycarbonyl and fluorenylmethylaminocarbonyl compounds, protein conjugates thereof, and methods for their use |
| US20220233689A1 (en) | 2020-12-28 | 2022-07-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating tumors |
| AU2021411486A1 (en) | 2020-12-28 | 2023-06-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibody compositions and methods of use thereof |
| WO2022212876A1 (en) | 2021-04-02 | 2022-10-06 | The Regents Of The University Of California | Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof |
| WO2023161350A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | Io Biotech Aps | Nucleotide delivery of cancer therapy |
| WO2023235847A1 (en) | 2022-06-02 | 2023-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibody compositions and methods of use thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1249846A2 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-16 | Korea Research Institute Of Chemical Technology | Polyalkylene oxide prorgens having hyper-branches and low dielectric-constant insulators using them |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58208743A (ja) | 1982-05-28 | 1983-12-05 | Fuji Photo Film Co Ltd | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| JP3051145B2 (ja) | 1990-08-28 | 2000-06-12 | 住友製薬株式会社 | 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド |
| US5629384A (en) * | 1994-05-17 | 1997-05-13 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| WO1997033323A1 (en) * | 1996-03-04 | 1997-09-12 | Uniax Corporation | Polyfluorenes as materials for photoluminescence and electroluminescence |
| US6313242B1 (en) * | 1996-05-20 | 2001-11-06 | Fina Technology, Inc. | Stereorigid bis-fluorenyl metallocenes |
| EP1061954B1 (en) | 1998-03-12 | 2004-06-09 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups |
| JP4108827B2 (ja) | 1998-05-28 | 2008-06-25 | 大日本印刷株式会社 | 無機質系化粧板 |
| DK1157037T3 (da) | 1999-01-29 | 2003-11-24 | Hoffmann La Roche | GCSF-konjugater |
| US6413507B1 (en) | 1999-12-23 | 2002-07-02 | Shearwater Corporation | Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol) |
| EP1149827B1 (en) * | 2000-04-26 | 2003-12-10 | Sony International (Europe) GmbH | End-capped polyfluorenes, films and devices based thereon |
| IL139400A0 (en) * | 2000-11-01 | 2001-11-25 | Yeda Res & Dev | Long-acting cytokine derivatives and pharmaceutical compositions comprising them |
| MXPA03007392A (es) | 2001-02-20 | 2003-12-04 | Enzon Inc | Enlazantes polimericos ramificados terminalmente y conjugados polimericos que contienen los mismos. |
| DE60223496T2 (de) | 2001-02-20 | 2008-10-02 | Enzon, Inc. | Endgruppenverzweigte polymere verbindungsgruppen und diese enthaltende polymere konjugate |
| DE10228103A1 (de) | 2002-06-24 | 2004-01-15 | Bayer Cropscience Ag | Fungizide Wirkstoffkombinationen |
| US6693136B1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-17 | Abbott Laboratories | Fluorenes and anthracenes that inhibit P2X3 and P2X2/3 containing receptors |
| US7087229B2 (en) * | 2003-05-30 | 2006-08-08 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers |
| US20050079155A1 (en) * | 2003-03-20 | 2005-04-14 | Xencor, Inc. | Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages |
| SI1620118T1 (sl) * | 2003-04-08 | 2014-11-28 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Reverzibilna pegilirana zdravila |
| US20070027073A1 (en) * | 2003-04-08 | 2007-02-01 | Menachem Rubinstein | Long-acting derivatives of pyy agonists |
| US7563748B2 (en) | 2003-06-23 | 2009-07-21 | Cognis Ip Management Gmbh | Alcohol alkoxylate carriers for pesticide active ingredients |
| CA2534298C (en) | 2003-08-01 | 2013-12-31 | Nobex Corporation | Aryl carbamate oligomers for hydrolyzable prodrugs and prodrugs comprising same |
| EP1654004A2 (en) * | 2003-08-08 | 2006-05-10 | Novo Nordisk A/S | Synthesis and application of new structural well defined branched polymers as conjugating agents for peptides |
| US20060121055A1 (en) * | 2004-12-06 | 2006-06-08 | Becton, Dickinson And Company, Inc. | Compositions with enhanced immunogenicity |
| WO2006138572A2 (en) | 2005-06-16 | 2006-12-28 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates |
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| US20160243036A1 (en) | 2015-02-25 | 2016-08-25 | Intelgenx Corp. | Film dosage forms containing amorphous active agents |
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|---|---|---|---|---|
| EP1249846A2 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-16 | Korea Research Institute Of Chemical Technology | Polyalkylene oxide prorgens having hyper-branches and low dielectric-constant insulators using them |
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