JP2008544046A - 分解性結合を有する複合体と該複合体の調製に有益なポリマー試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
X3は、第三のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリは、水溶性ポリマー、
Xは、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
Reは、存在する場合、電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、およびDは、生理活性剤の残留物である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
X3は、第三のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Haは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。
ポリは、水溶性ポリマー、
Xは、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
Reは、存在する場合、電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。
(a)第一の付着部位、第二の付着部位、任意の第三の付着部位、および任意の追加の付着部位を有する芳香族部分を提供するステップと、
(b)官能基試薬を前記第一の付着部位と反応させて、活性剤のアミノ基と反応可能な官能基を有する前記第一の付着部位をもたらし、カルバメート結合などの放出可能な結合をもたらすステップと、
(c)反応基を有する水溶性ポリマーを前記第二の付着部位と、存在する場合は、前記任意の第三の付着部位と反応させて、(i)スペーサー部分を介して水溶性ポリマーを有する前記第二の付着部位をもたらすステップであって、前記スペーサー部分は、
本発明の1つ以上の実施形態において、複合体を調製するための方法が提供される。
本発明の1つ以上の実施形態において、前記複合体を投与するための方法が提供される。
本発明について詳しく記載する前に、本発明が、特定のポリマー、合成技術、活性剤等に限定されず、変化してもよいことが理解されたい。
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-OH
ここで、(m')は、一般的に、0から約4,000までであり、好ましくは、約20から約1,000までである。
-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-
ここで、(m')は、上記のように定義される。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-
ここで、(m')は上述のとおりである。
ポリaおよびポリbは、メトキシポリ(エチレングリコール)などのPEG骨格(同一または異なる)であり、
R”は、H、メチル、またはPEG骨格などの非反応性部分であり、
PおよびQは、非反応性結合である。好適な実施形態において、分岐PEGポリマーは、メトキシポリ(エチレングリコール)二置換リジンである。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
X3は、第三のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、カルバメート結合などの分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリは、水溶性ポリマー、
Xは、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
Reは、電子代替基、
(a)は、0または1、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。
本化I-Cに相当する複合体は、化Iに相当するポリマー試薬を使用して調製可能である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。本化II-Cに相当する複合体は、化IIに相当するポリマー試薬を使用して調製可能である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。
本化III-Cに相当する複合体は、化IIIに相当するポリマー試薬を使用して調製可能である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
X3は、第三のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である。本化IV-Cに相当する複合体は、化IVに相当するポリマー試薬を使用して調製可能である。
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、アミン官能基を有する生理活性剤の残留物である。
本化V-Cに相当する複合体は、化Vに相当するポリマー試薬を使用して調製可能である。
ポリは、水溶性ポリマー、
Xは、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
Reは、電子代替基、
(a)は、0または1、および
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、アミン官能基を有する生理活性剤の残留物である。
本化VI-Cに相当する複合体は、化VIに相当するポリマー試薬を使用して調製可能である。
組成中の各賦形剤の量は、賦形剤の活性および組成の特定のニーズによって異なる。典型的に、各賦形剤最適な量は、繰り返して行なわれる実験、つまり、種々の量の賦形剤(多量から少量)を含む組成物を調製し、安定性および他のパラメータを調べ、その後重大な有害影響を及ぼすことなく達成された最適性能の範囲を特定することによって決定される。
本発明の実施に際しては、明示されていない限り、当技術分野において通常の技術を有する者に理解され、文献に記載されている有機合成等の従来の技術を採用する。以下の実施例において、使用数値(分量、温度等)の正確性を確保するよう努力したが、実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。明示されていない限り、温度は摂氏、圧力は海面における大気圧またはその近傍を示す。すべての試薬は、明示されていない限り、市販されているものを使用した。すべての生成NMRは、Bruker(Billerica,MA)製の300もしくは400MHzのNMRスペクトロメータを使用した。すべての処理は、ガラス製またはガラスの内張容器中で行い、金属含有容器や装置との接触を避けた。
anh. 無水
Fmoc 9-フルオレニルメトキシ(基)カルボニル
HCl 塩酸
HEPES 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-スルホン酸ピペラジンエタン
NMR 核磁気共鳴
DCC 1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド
DMF ジホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
MW 分子量
KまたはkDa キロダルトン
SEC サイズ排除クロマトグラフィー
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
MALDI-TOF マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析
TLC 薄層クロマトグラフィー
THF テトラヒドロフラン
原料:本実施例に記載のすべての前駆体ポリマー試薬は、明示されていない限り、市販されているものである。本実施例で使用されるグルカゴン様ペプチド I(7-36、「GLP-1」)は、American Peptide Company(Sunnyvale,CA)から購入した。
可逆性PEG化のための9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(mPEG(20,000)-メチルアミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミドの調製
アロゴン雰囲気下、2,7-ジアミノフルオレン(2.45g,12.5mmol)を、1,4-ジオキサン(28mL)中に溶解した。続いて、脱イオン水(14mL)、NaOH2M(2.2eq,27.5mmol,13.8mL)およびジ-tert−ブチルジカーボネート(BOC2O)(2.5eq,31.3mmol,6.82g)を加えた。反応物を、20時間室温で激しく撹拌した。生成物が、褐色固体として沈殿した。反応物に水を加え反応を抑制し、KHSO4を1M 加えpH 3に酸性化した。生成物をクロロホルム(3X400mL)を用いて抽出し、結合有機層を1/2飽和塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、蒸発させた。生成物を、フラッシュ・クロマトグラフィー(クロロホルム中に1%メタノールで溶離させたシリカゲル60A)を用いて精製した。精製した黄色固体(5.1g,〜99%)を、TLC(ニンヒドリン染色液)を用いて純化した。1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)7.7(bs,2H,NHウレタン);7.6(d,2H,Ar);7.2(d,2H,Ar); 6.5(s,2H,Ar); 3.8(s,2H,CH2);1.5(s,18H,Boc)。
精製した2,7-ジ(Boc-アミノ)フルオレン(5g,12.5mmol)(上記ステップAにて調製)を、ギ酸エチル(50mL)および無水THF(60mL)中に弱火で加熱しながら溶解した(注:ギ酸エチルは、ギ酸を除去するため、K2CO3上に保存した)。溶液を氷浴中で冷却し、鉱油中60%水素化ナトリウムを少量ずつ加えた(5.5eq,69mmol,2.75g)。反応物を、徐々に室温に温め、その後還流冷却器に取付け、50℃に加熱した。2時間後、反応物を氷浴中で冷却し、脱イオン水(50mL)を徐々に加え、反応を抑制した。水層を氷酢酸でpH5に調節し、酢酸エチル(2X400mL)で抽出した。結合有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物(黒褐色固体)を、フラッシュ・クロマトグラフィー(クロロホルム中に1-5%メタノールで段階状勾配溶離させたシリカゲル 60A)で精製した。純度によって異なる、収量(4.8g,〜90%)の黄色から褐色固体を得た。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)11.0(s,0.9H,enol);9.3(2s,1.9H,NHウレタン);7.2-8.3(m,Ar,C10H enol);6.5(2s,0.1H,NHウレタン);4.1(m,0.3H,CH);1.5(s,18H,Boc)。
アロゴン雰囲気下、9-ホルミル-2,7-ジ(Boc-アミノ)フルオレン(0.47g,1.1mmol)を、無水メタノール(MeOH)(5mL)に溶解した。NaBH4(1.2eq,1.3mmol,0.05g)を反応物に加え、室温で5時間撹拌した。反応物を脱イオン水で希釈し、氷酢酸でpH5に酸性化した。反応物を酢酸エチル(2X100mL)で抽出し、有機層を飽和NaHCO3(4X20mL)および塩水(3X20mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、 濾過し、蒸発させた。粗生成物である橙色固体を、フラッシュ・クロマトグラフィー(クロロホルム中に1-5% メタノールで勾配溶離させたシリカゲル60A(代替物として、ジクロロメタン「DCM」中に15-20%酢酸エチルで勾配溶離させてもよい))で精製した。生成物として、黄色固体(0.39,83%)を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)7.9(s,0.5H,NHウレタン);7.7(s,2H,Ar);7.6(d,2H,Ar);7.4(d,2H, Ar); 4.0(m,1H,CH);3.9(m,2H,CH2);1.6(s,18H,Boc)。
9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(Boc-アミノ)フルオレン(0.39g,0.9mmol)を、1,4-ジオキサン中に溶解した。0℃で、濃縮HCl(2.5 mL)を加え、反応物を0℃で2時間、室温で1時間撹拌した。反応溶媒を、減圧下(45℃)で除去した。生成物をメタノール中に溶解し、蒸発させた(2回)。生成物をメタノール(8mL)中に溶解し、ジエチルエーテルを徐々に加え沈殿させ、冷却した(反復)。生成物として、TLC(クロロホルム/メタノール/酢酸 85:15:3,ニンヒドリン染色液)で単一の斑点を示す橙赤色固体(0.25g,91%)を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)8.1(d,2H,Ar); 7.8(s,2H,Ar);7.5(d,2H,Ar);4.3(t,1H,CH);4.0(d,2H,CH2)。
無水トルエン(80mL)中、mPEG-CM(20,000)(MW=19,458;20g,1.03 mmol,3.5eqのmPEG-CM)を、ロータリエバポレータを用いて、60℃で減圧下共沸蒸留させた。アロゴン雰囲気下、固形物を無水ジクロロメタン(40mL)中に溶解した後、無水N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(3.5eq,1.03mmol,139mg)および1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(3.7eq,1.09mmol,224mg)を加えた。別のフラスコに、9-ヒドロキシメチル-2,7-ジアミノフルオレン二塩酸塩(1eq,0.294mmol,88mg)および4-ジメチルアミノピリジン(2.2eq,0.65mmol,79mg)を、無水DMF(2.5mL)中に溶解した。DCC反応物を数分間(5から15分)撹拌した後、9-ヒドロキシメチル-2,7-ジアミノフルオレンのDMF溶液を、定量的にDCC反応物に転移させた。室温で27時間反応物を撹拌し、減圧下で溶媒を蒸発させた。濃厚なシロップ状物を、弱火で加熱しながら、乾燥イソプロピル(基)アルコール(「IPA」,400mLを徐々に加え)中に溶解した。室温で放置し、PEG生成物を沈殿させた。0℃で30分間撹拌しながら、さらにIPA(100mL)を加えた。沈殿物を濾過し、低温IPA/ジエチルエーテル7:3(80mL)およびジエチルエーテルで洗浄した。粗生成物(淡黄色粉末、9-(mPEG(20,000)メチルエステル)-メチル-2,7-ジ(mPEG(20,000)-メチルアミド)フルオレン)を、高真空下で乾燥させた(収量18.3g)。
無水アセトニトリル(10mL)中、9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(mPEG(20,000)-メチルアミド)フルオレン(0.5g,0.013mmol)を、ロータリエバポレータを用いて、減圧下50℃で共沸蒸留させた。固形物を無水DCM(2mL,「CH2Cl2」)中に溶解した後、トリホスゲンを加えた(反応物から過剰なホスゲンガスが下部トラップで 捕捉されるよう配慮した)(1.4eq,0.018mmol,5mg)。数分後、無水ピリジン(2eq,0.026mmol,DCM中のピリジン2μL[2μLピリジン/50μL DCM])を加えた。徐々に温めながら(40℃)、1.5時間後殆どの反応溶媒および過剰なホスゲン(排出口にある下部トラップを使用)が蒸発した。シロップ状物を無水DCM(2mL)中に溶解した後、N-ヒドロキシスクシンイミド(5.3eq,0.068mmol,8mg,「NHS」)および無水ピリジン(DCM中の上記(2:50)溶液のうち3.2eq,0.041mmol,83μL)を加えた。4時間後、溶媒をアルゴン流下蒸発させた。シロップ状物を、無水IPA中に溶解し、室温で沈殿させた。沈殿物を濾過し、低温IPAおよびジエチルエーテルで洗浄した。真空下残留溶媒を蒸発させ、極淡黄色粉末を得た。HPLCによって、収量0.4g(80%)、置換率73%のNHS炭酸塩を得た。1H-NMR(CD2Cl2):δ(ppm)8.9(s,2H,NHアミド);7.9(s,2H,Ar);7.7(m,4H,Ar);4.7(d,2H,CH2);4.3(t,1H,CH);4.1(s,4H,CH2C=O);2.8(s,4H,CH2CH2NHS)。
カルバミン酸FMOCPEG240,000を有するインスリンのPEG化
A.PEG化
実施例1にて調製したポリマー試薬(9-ヒドロキシ-2,7-ジ(mPEG(20,000)-メチルアミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミド)を−20℃で保存し、デシケータで室温に温めた。インスリン(8.9mg)を検量し、1mLDMSO中に溶解した。モル比を3:1(PEG:インスリン)とした。184.6mgの9-ヒドロキシ-2,7-ジ(mPEG(20,000)-メチルアミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミドを検量し、1mLアセトニトリル中に溶解した後、インスリンに加えた。反応物を窒素下で1時間撹拌した後、20 mM 酢酸pH3.0で1:5に希釈することによって反応を抑制し、反応混合物のpHをpH 3.1に下げた。低pHによって、分解性複合体が安定する。
陽イオン交換を使用し、2インスリン部位にPEG化を有する複合体である2-merPEGインスリン複合体から、1インスリン部位にPEG化を有する複合体1-merに精製した。20mL SP650カラムおよびAKTA Basic System(Amersham Biosciences,Piscataway NJ)を使用して、PEG 複合体を精製した。開始バッファーは、20mMHAc/NaAc(酢酸/酢酸ナトリウム)、pH3.1、溶離イオンバッファーは、20mM HAc/NaAc、1M NaCl、pH3.1とした。流量は10mL/分、試料導入量はインスリン量9mgとした。精製方法を表1に記載する。
反応混合物のHPLC分析を図1に示す。図2は、PEG化1-mer複合体(または、モノPEG化複合体)のHPLC分析を示す。PEG化1-mer複合体の純度は98.1%で、2-merは1.9%である。
生体内遊離試験を、精製複合体を用いて行った。試験は、温度調節機能付きオートサンプラー(Agilent Technologies,Inc., Palo Alto,CA)Agilent1100を使用して実施した。HPLC法を使用して、天然タンパク質の遊離および複合体の減少を分析した。1-mer複合体(または、モノPEG化複合体)を10:1で、10X PBS(リン酸エステル緩衝化生理食塩水)バッファー(pH7.35)内で希釈した。37℃で培養し、適時一定分量を除去した。時間0を、PBS希釈前とし、1-mer複合体のHPLC結果を使用した。各時点は、5時間、15時間、28時間、次いで、8日間、1日時点とした。図3は、その結果をまとめたものである。
9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(mPEG(10,000)-グルタル酸アミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミド(または、「G2PEG2Fmoc20k-NHS」)の調製
9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(mPEG(10,000)-グルタル酸アミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミドの合成を、以下の構造式2に図式的に表す。
アロゴン雰囲気下、9-ヒドロキシメチル-2,7-ジアミノフルオレン 二塩酸塩(実施例1のステップAからDに記載の調製)を脱イオン水中に溶解し、飽和NaHCO3でpH8に調製した。混合物を塩水で半分に希釈し、沈殿物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過、蒸発させ、9-ヒドロキシメチル-2,7-ジアミノフルオレン(褐色粉末、単離収率84%)を得た。
無水トルエン(100mL)中、mPEG-NH2(10,000)(Mn=10,200;クロマトグラフィーにより精製、12.75g、1.25mmol)を、ロータリエバポレータを用いて、減圧下50℃で共沸蒸留した。アロゴン雰囲気下、固形物を無水DCM(50mL)中に溶解した。無水DMF(5mL)中、9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(グルタル酸アミド)フルオレン(1eq.,0.5mmol,0.225g)および無水N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(2.2eq,1.1mmol,149mg)溶液を、PEG溶液(2.5mLDMF(すすぎ用))に定量的に加えた。その後、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(2.4eq,1.2mmol,248mg)を反応溶液に加えた。反応物を室温で24時間撹拌し、溶媒を減圧下蒸発させた。濃厚なシロップ状物を、弱火で加熱しながら、乾燥IPA(500mL、徐々に加え)中に溶解した。PEG生成物を、室温で放置し、沈殿させた。沈殿物を、10℃で10間冷却、濾過し、低温IPA(200mL)、その後ジエチルエーテル(200mL)で洗浄した。粗生成物(黄色がかった白色粉末)を、高真空下乾燥させ、その後脱イオン水中に溶解した。PEG溶液のイオン交換クロマトグラフィーを、POROS媒体(0.1L,Boehringer-Mannheim,GmbH,Mannheim Germany)を使用して行い、水で溶離させた。中性PEGを含む画分を回収した。精製生成物は、mPEG-NH2(10,000)(HPLC分析)を含んでいなかった。収量5.5g(53%)、置換率85%以上を得た。1H-NMR(CD2Cl2):δ(ppm)8.6(s,2H,ArNHアミド);7.9(s,2H,Ar);7.6(m,4H,Ar);6.4(bs,2H,NHアミド);4.1(m,1H,CH);4.0(d,2H,CH2);3.6(s,PEG骨格);3.3(s,3H,-OCH3);2.4(t,4H,CH2);2.3(t,4H,CH2);2.0(m,4H,CH2)。
無水アセトニトリル(100mL)中、9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(mPEG(10,000)-グルタル酸アミド)フルオレン(5.3g,0.25mmol)を、ロータリエバポレータを用いて、減圧下50℃で共沸蒸留した。固形物を無水DCM(27mL)中に溶解し、トリホスゲン(1.4eq,0.36mmol,106mg)を追加した(反応物から過剰なホスゲンガスが下部トラップで捕捉されるよう配慮した)。数分後、無水ピリジン(2eq,0.51mmol,41μL)を加えた。1.5時間後、殆どの反応溶媒および過剰なホスゲン(排出口の下部トラップを使用)は、徐々に温めることにより(40℃)蒸発した。シロップ状物を無水DCM(15mL)中に溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド(5.3eq,1.35mmol,155mg,「NHS」)を加えた。15分後、無水ピリジン(3.2eq,0.81mmol,66μL)を加えた。反応物を2時間撹拌し、溶媒を減圧下蒸発させた。シロップ状物を無水IPA(200mL)中に溶解し、室温で沈殿させた。沈殿物を濾過し、低温IPAおよびジエチルエーテル(150mL(10mgBHTを含む))で洗浄した。残留溶媒を真空下蒸発させ、黄色がかった白色粉末を得た。HPLCによって、収量5.1g(95%)、置換率〜70%のNHS炭酸塩を得た。
9-ヒドロキシメチル-4-(mPEG(10,000)-カルボキシアミド)-7-(mPEG(10,000)グルタル酸アミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミドの調製
9-ヒドロキシメチル-4-(mPEG(10,000)-カルボキシアミド)-7-(mPEG(10,000)-グルタル酸アミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミドの合成を、以下の構造式4に図式的に表す。
Parr水素化瓶(Parr Instrument Company,Moline IL)中に、7-ニトロ-4-フルオレンカルボン酸(8.0g,0.031mol)[Helvetica Chimica Acta(1984)67, 2009-2016記載のようにジフェン酸から調製、またはSigma-Aldrich,St.Louis,MOからも市販されている]をアルゴン(Ar)で浄化した1MNaOH(250mL、必要に応じて若干温める)に溶解した。20%Pd/C(含水50%)5重量%(400mg)を慎重に加えた後、Parr瓶を、Parr器具を用いて3回真空/充填を繰り返し、水素雰囲気を確保した。懸濁液を、20psi水素ガス下で18時間振盪し、その後残留水素を減圧下除去した。懸濁液を、セリット層を通して濾過し、水を加えすすぎ、その後酢酸でpH4に調節した。生成物を、塩水および酢酸エチル(3´800mL)で抽出した。各有機層を、少量の塩水で洗浄した。結合有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。酢酸除去の補助として、トルエンを加え、減圧下で蒸発させた(必要に応じて、2-3回繰り返す)。1日以上、高真空下で最終蒸発を行った。収量6.1g(86%)を得た。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)8.1(d,1H,Ar);7.62(d,1H,Ar);7.58(d,1H,Ar);7.2(t,1H,Ar);6.8(s,1H,Ar);6.5(d,1H,Ar);3.8(s,2H,CH2);1.9(s,<0.25H,HOAc)。
4-カルボン酸-7-アミノフルオレン(8.6g,0.038mol)を、無水THF(150mL)中に溶解し、グルタル酸無水物(97%,4.94g,0.042mol)を加えた。反応物を4.5時間撹拌し、アミンの不在をTLC(ニンヒドリン染色液、90:10:3酢酸エチル/メタノール/酢酸、または同等物)で確認した。反応混合物をヘキサン(150mL)で希釈、冷却、濾過し、1:1低温THF/ヘキサン、その後ヘキサン洗浄した。残留溶媒を減圧下で蒸発させた。収量7.2g(55%)を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)8.4(d,1H,Ar);8.0(s,1H,Ar);7.8(d,1H,Ar);7.7(d,1H,Ar);7.5(d,1H,Ar);7.4(t,1H,Ar);4.0(s,2H,CH2);2.5(t,2H,CH2);2.4(t,2H,CH2);2.0(m,2H,CH2)。
二塩基酸である4-カルボン酸-7-(グルタル酸アミド)フルオレン(7.16g,0.021mol)を、無水DMF(200mL)およびギ酸エチル(K2CO3上に保存、350mL)中に溶解した。カリウムtert-ブトキシド(95%,19.9g,0.169mol)を、数回に分けて慎重に加えた。反応物を、45℃で30分間緩やかに還流させ、その後室温で2.5時間撹拌した。溶液を氷浴中で冷却し、その後1M HCl(500mL)および塩水(350mL)を加えた。生成物を、酢酸エチル(3´700mL)で抽出した。有機層を塩水で洗浄し、その後Na2SO4上で乾燥させた。乾燥物を濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。収量>7.8g(100%)および含有残留DMFを得た。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)11.5(d,0.5H,ホルミル);11.4(d,0.5H,ホルミル);10.0(d,1H,NH);8.4-7.3(m,7H,Ar);2.4(t,2H,CH2);2.3(t,2H,CH2);1.8(m,2H,CH2)。
9-ホルミル-4-カルボン酸-7-(グルタル酸アミド)フルオレン(7.8g,0.021mol)を無水メタノール(MeOH)(150mL)中に溶解した。室温浴中のフラスコに、水素化ホウ素ナトリウム(6.0g,0.159mol)を数回に分けて慎重に加えた。2時間および4時間後に水素化ホウ素ナトリウム(2.0g,0.053mol)をさらに慎重に加えた。7時間後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を水に溶解し、その後1MHClで酸性化した。黄色沈殿物を、塩水および酢酸エチル(4´700mL)で抽出した。各酢酸エチル層を、塩水(2´)で洗浄、結合し、Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗生成物をメタノール/クロロホルムから再結晶させた。収量4.9g(63%)の黄色結晶を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)8.4(d,1H,Ar);8.0(s,1H,Ar);7.85(d,1H,Ar);7.83(d,1H,Ar);7.5(dd,1H,Ar);7.4(t,1H,Ar);4.1-3.9(m,2H,CH2,CH);2.5(t,2H,CH2);2.4(t,2H,CH2);2.0(m,2H,CH2)。
無水トルエン(750mL)中、mPEG-NH2(10,000)(Mn=9,418;クロマトグラフィーで精製、75g、0.008mol、「mPEG(10k)-NH2」とも表される)を、ロータリエバポレータを用いて、減圧下50℃で共沸蒸留した。アロゴン雰囲気下、固形物を無水DCM(CH2Cl2)(300mL)中に溶解した。無水DMF(33mL)中の、9-ヒドロキシメチル-4-カルボン酸-7-(グルタル酸アミド)フルオレン(1.3g,0.0036mol)および無水N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1.0g,0.0076mol)溶液を、定量的にPEG溶液(すすぎ用20mL DMF)に加えた。その後、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(1.65g,0.008mol)を反応溶液に加えた。反応物を室温で16時間撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。濃厚なシロップ状物を、弱火で加熱しながら、乾燥IPA(3.6L、徐々に加え)中に溶解した。PEG生成物を室温で放置し、沈殿させた。沈殿物を10℃で10分間冷却、濾過し、低温IPA(400mL)、その後ジエチルエーテル(400mL)で洗浄した。粗生成物(黄色がかった白色粉末)を、高真空下乾燥させ、その後脱イオン水中に溶解した。PEG溶液のイオン交換クロマトグラフィーを、POROS媒体(1L)を用いて行い、水で溶離した。中性PEGを含む画分を回収し、DEAESepharose媒体(0.5L)でさらに精製した。精製生成物には、mPEG-NH2(10,000)またはモノPEG酸生成物(HPLC分析)を含まれていなかった。収量55g(79%)(置換率95%)を得た。1H-NMR(CD2Cl2):δ(ppm)8.7(s,1H,ArNHアミド);8.0(s,1H,Ar);7.9(d,1H,Ar);7.7(d,1H,Ar);7.5(d,1H,Ar);7.4(d,1H,Ar);7.3(t,1H,Ar);6.7(bs,1H,NHアミド);6.4(bs,1H,NHアミド);4.0(m,3H,CH,CH2);3.6(s,PEG骨格);3.3(s,6H,-OCH3);2.4(t,2H,CH2);2.3(t,2H,CH2);2.0(m,2H,CH2)。
無水トルエン(140mL)中、9-ヒドロキシメチル-4-(mPEG(10,000)-カルボキシアミド)-7-(mPEG(10,000)グルタル酸アミド)フルオレン(14g,0.00072mol)を、ロータリエバポレータを用いて、減圧下45℃で共沸蒸留した。固形物を、無水DCM(56mL(すすぎ用7mL))中に溶解し、注射器で新たに調製したトリホスゲン(下部トラップを使用して、反応物から過剰なホスゲンガスを捕捉した)(0.214g,0.00072mol)および無水ピリジン(0.057g、0.00072mol、溶液としてCH2Cl2(〜5mL)に添加)溶液に移動した。1時間後、急速アルゴン流(室温を維持)を開始し、過剰なホスゲン(排出口の下部トラップを使用)を蒸発させた。アルゴン浄化30分後、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(0.43g,0.0037mol)を加え、10分間撹拌した。無水ピリジン(0.285g、0.0036mol、溶液としてCH2Cl2(〜25mL)に添加)を加えた。アルゴン流を継続し、1.5時間後、殆どの反応溶媒が蒸発した。濃厚なシロップ状物を、無水IPA(700mL)中に溶解し、室温で沈殿させた。沈殿物を濾過し、低温IPAおよびジエチルエーテル(100mL(10mgBHT含有))で洗浄した。残留溶媒を真空下蒸発させ、黄色がかった白色粉末を得た。HPLCによって、収量13.5g(96%)、置換率87%のNHS炭酸塩を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)8.7(s,1H,NH Arアミド);7.9(m,2H,Ar);7.6(m,2H,Ar);7.5(d,1H,Ar);7.3(t,1H,Ar);6.8(bs,1H,NH);6.4(bs,1H,NH);4.7(m,2H,CH2);4.3(t,1H,CH);3.6(s,PEG骨格);3.3(s,6H,-OCH3);2.8(s,4H,CH2CH2);2.5(t,2H,CH2);2.3(t,2H,CH2);2.0(m,2H,CH2)。
典型的なポリマー試薬を有するグリシン複合体の調製と放性データ
実施例1にしたがって調製した9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(mPEG(20,000)-メチルアミド)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミド(10mg,〜70%活性NHS)を、1%グリシン+25m MHEPESpH7.4(25μL)のバッファー溶液中に溶解し、渦流で混合し、室温で30分間反応させ、複合溶液を生成した。その後、複合溶液を2つの分割量として、以下のように処理した。一方は、25m MHEPESpH7.4(1.25mL)で希釈し、37℃で培養し、HPLC系上に種々の間隔で注入し、他方は、25mM HEPES pH8.2(バッファー)で希釈し、37℃で培養し、HPLC系上に種々の間隔で注入した。
模範的ポリマー-タンパク質複合体の調製:
G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1の調製
例示的ポリマー試薬G2PEG2Fmoc20k-NHSは、例示的ポリペプチドGLP-1のN-末端に共有結合し、放出可能なPEG-部分が結合されたタンパク質のプロドラッグ構造を提供した。二本のアームを有するポリマー試薬の性質によって、投与後のGLP-1部分の安定性が増し、その結果放出機能が持続され、GLP-1が加水分解によって複合体から放出され、天然または未修飾GLP-1前駆体を提供する。G2PEG2Fmoc20k-Nter-GLP-1の構造を以下に示す(構造中、「GLP-1」はGLP-1の残留物を示す)。その他のポリペプチドおよびタンパク質は、GLP-1と置換可能である。
典型的なポリマー-タンパク質複合体の調製:
G2PEG2Fmoc40k-Nter-GLP-1の調製
模範的ポリマー-タンパク質複合体の調製:
G2PEG2Fmoc20k-Lys-GLP-1の調製
典型的な放出可能ポリマー試薬G2PEG2Fmoc20k-NHSは、GLP-1のリシン位置に解放可能なように共有結合された(本明細書においてはGLP-1の「内部」PEG化と称する)。
模範的ポリマー-タンパク質複合体の調製:
G2PEG2Fmoc40k-Lys-GLP-1の調製
模範的放出可能ポリマー試薬G2PEG2Fmoc40k-NHSは、GLP-1のリシン位置に解放可能なように共有結合された(本明細書においてはGLP-1の「内部」PEG化と称する)。
実例的GLP-1ポリマー複合体の血糖値降下効果試験のためのマウスの生体内実験
オスの糖尿病マウス(BKS.Cg-+Lepr db/+Lepr db/01aHsd)をHarlan Laboratories, Ltd.(Jerusalem, Israel)から購入した。8から9週齢のマウス(30から40gm)をマウス用ケージに入れ(ケージにつき2匹)、実験開始前に少なくとも48時間環境順化させた。
G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1の生体内放出特性
G2PEG2Fmoc20K-Nter-GLP-1の生体内放出特性を特定した。
9-ヒドロキシメチル-4-(mPEG(10,000)-カルボキシアミド)-7-(3-(mPEG(10,000))カルバモイル-プロピル)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミド
(または、「4,7-CAC-PEG2-Fmoc20K-NHS」)の調製
9-ヒドロキシメチル-4-(mPEG(10,000)-カルボキシアミド)-7-(3-(mPEG(10,000))カルバモイル-プロピル)フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミドの合成を、以下の構造式4に図式的に示す。
アルゴン浄化した乾燥丸底フラスコ中で、無水1,2-ジクロロエタン(60mL)中に無水AlCl3(26.9g,0.202mol)を懸濁させた。4-フルオレンカルボン酸(10.0g,0.048mol)を、懸濁液に加えた。反応フラスコを室温浴に入れ、無水コハク酸(5.72g,0.057mol)を慎重に加えた。反応物を5時間撹拌し、その後0℃に冷却した。3M HClを少しずつ徐々に加え、反応を慎重に抑制した(注意!反応物は、HClを急に加えると激しく反応する可能性がある)。最終的に十分混合された懸濁液は酸性であり、追加のHCl溶液に反応しなかった。有機溶媒を減圧下で除去し、生成物を濾過し、水でよく洗浄した。粗生成物を、温めたNaOH溶液(約<1M NaOH)中に溶解、濾過し、濃縮HClを加え沈殿させた。生成物を濾過し、水で洗浄し、その後P2O5の存在下、減圧下で乾燥させた。生成物として、淡黄色固体(14.3g,97%)を得た。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)8.4(d,1H,Ar);8.2(s,1H,Ar);8.0(d,1H,Ar);7.8(m,2H,Ar);7.5(t,1H,Ar);4.1(s,2H,CH2);2.6(t,2H,CH2)2.5(DMSO下、CH2)。
アルゴン浄化したフラスコ中で、7-(3-カルボキシ-プロピオニル)-4-フルオレンカルボン酸(14.0g,0.045mol)を、ジエチレングリコール(200mL)中に懸濁させた。フラスコを室温油浴に入れ、その後NaOH(18g,0.450mol)およびヒドラジン水和物80%溶液(13.6mL,0.223mol)を連続的に加えた。反応混合物を徐々に110℃に加熱し、約2時間還流させた。加熱過程で、水を除去し、反応温度を200℃に上昇させた。3時間反応温度200℃を保った後、反応物を約60℃に冷却した。反応混合物を慎重に水(約1L)に注ぎ入れ、混合物を濃縮HClでpH2に酸性化した。生成物を濾過し、水で洗浄した。生成物を温めたNaOH溶液(0.5M)中に溶解し、HClでpH2に酸性化させることによって沈殿させた。生成物を濾過し、水で洗浄した。生成物として、黄色がかった白色固体(10.9g,82%)を得た。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)8.3(d,1H,Ar);7.7(m,2H,Ar);7.4(s,1H,Ar);7.4(t,1H,Ar);7.2(d,1H,Ar);3.9(s,2H,CH2);2.7(t,2H,CH2);2.3(t,2H,CH2);1.9(m,2H,CH2)。
アルゴン浄化した還流冷却器付き乾燥フラスコ中で、7-(3-カルボキシ-プロピル)-4-フルオレンカルボン酸(4.0g,0.0135mol)を、40℃の無水DMF(120mL)中に溶解した。ギ酸エチル(40mL、無水K2CO3上に保存)を加えた後、カリウムtert-ブトキシド95%(12.8g、0.108mol、2分割にして添加)を加えた。溶解度を促進するため、無水DMF(80mL)、無水THF(5mL)およびギ酸エチル(25mL)を種々の間隔で加えながら、反応物を約40℃から50℃で4時間撹拌した。その後、反応物をさらに17時間室温で撹拌した。ギ酸エチルを減圧下で蒸発させた。反応物を水(150mL)で反応抑制し、濃縮HClでpH2に酸性化した。生成物を、酢酸エチル(600mL、その後200mL)で2回抽出した。結合有機層を3回塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。未反応出発原料を一部含む粗生成物(4.7g,〜100%、純度80%)を得た。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)11.4(s,1H,ホルミル);8.3−7.0(m,7H,Ar);2.7(m,2H,CH2);2.3(m,2H,CH2);1.9(m,2H,CH2)。
アルゴン浄化したフラスコ中で、粗9-ホルミル-7-(3-カルボキシ-プロピル)-4-フルオレンカルボン酸(4.0g,0.0123mol)を、無水メタノール(50mL)中に溶解した。フラスコを室温浴中に入れ、水素化ホウ素ナトリウム(2.3g,0.0615mol)を、反応物に少しずつ慎重に加えた(注意!可燃性のガスが発生する可能性がある)。反応物を2時間撹拌し、水素化ホウ素ナトリウムをさらに加えた(1.2g,0.031mol)。さらに6時間後、反応物を少量の水で処理した。有機溶媒を減圧下で一部除去し、混合物を濃縮HClで酸性化した。塩水を加え、生成物を酢酸エチル(300mLおよび100mL)で2回抽出した。結合有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物(3.3g,83%)を、フラッシュ・クロマトグラフィー(50:50:2の酢酸エチル/クロロホルム/氷酢酸で溶離したシリカゲル60A)で精製した。精製生成物として、橙色固体(1.7g,43%)を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)8.3(d,1H,Ar);7.8(m,2H,Ar);7.6(s,1H,Ar);7.4(t,1H,Ar);7.2(m,1H,Ar);4.0(m,2H,CH2);3.9(m,1H,CH);2.8(t,2H,CH2);2.4(t,2H,CH2);2.0(m,2H,CH2)。
無水トルエン(250mL)中、mPEG-NH2(10,000)(Mn=9,418;クロマトグラフィーにより精製、25.8g、0.0026mol、「mPEG(10k)-NH2」とも表される)を、ロータリエバポレータを用いて、減圧下45℃で共沸蒸留させた。固形物を、不活性雰囲気下、無水DCM(CH2Cl2)(130mL)中に溶解した。無水DMF(12.5mL)中の、9-ヒドロキシメチル-7-(3-カルボキシ-プロピル)-4-フルオレンカルボン酸(0.38g,0.0012mol)および無水N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(0.33g,0.0025mol)溶液を、定量的にPEG溶液(5mLDMFtorinse)に加えた。その後、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(0.54g,0.0026mol)を反応溶液に加えた。反応物を室温で21時間撹拌し、溶媒を減圧下蒸発させた。濃厚なシロップ状物を、弱火で加熱しながら、乾燥IPA(900mL、徐々に加え)中に溶解した。室温でジエチルエーテル(400mL)を加え、PEG生成物を沈殿させた。沈殿物を10℃まで10分間冷却し、濾過し、低温IPA(300mL)、その後ジエチルエーテル(300mL)で洗浄した。粗生成物(黄色がかった白色粉末)を高真空下乾燥させ、その後脱イオン水中に溶解した。PEG溶液のイオン交換クロマトグラフィーを、POROS媒体(500mL)を使用して行い、水で溶離させた。中性PEGを含む画分を回収し、さらにDEAESepharose媒体(200mL)で精製した。精製生成物中に、mPEG-NH2(10,000)またはモノPEG酸性生成物は含まれていなかった(HPLC分析)。収量17g(71%)(置換率95%)を得た。1H-NMR(CD2Cl2):δ(ppm)7.9(d,1H,Ar);7.7(d,1H,Ar);7.5(s,1H,Ar);7.4(m,1H,Ar);7.3(t,1H,Ar);7.2(d,1H,Ar);6.7(bs,1H,アミド);6.2(bs,1H,アミド);4.1(m,2H,CH2);3.8(m,1H,CH);3.6(s,PEG骨格);3.3(s,6H,-OCH3);2.7(m,2H,CH2);2.2(m,2H,CH2);1.9(水+m,2H,CH2)。
無水トルエン(50mL)中、9-ヒドロキシメチル-4-(mPEG(10,000)-カルボキシアミド)-7-(3-(mPEG(10,000))カルバモイル-プロピル)フルオレン(2.9g,0.00015mol)を、ロータリエバポレータを用いて、減圧下45℃で共沸蒸留させた。固形物を無水DCM(15mL(すすぎ用1mL))中に溶解し、注射器で新たに調製したトリホスゲン(下部トラップで、反応物から過剰なホスゲンガスを捕捉した)(0.047g,0.00016mol)および無水ピリジン(0.013g、0.00016mol、溶液としてCH2Cl2(〜0.9mL)に添加)溶液に移動した。1時間後、急速アルゴン流(室温を維持)を開始し、過剰なホスゲン(排出口の下部トラップを使用)を蒸発させた。アルゴン浄化30分後、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)(0.09g,0.00078mol)を加え、10分間撹拌した。無水ピリジン(0.059g、0.00075mol、溶液としてCH2Cl2(〜4.5mL)に添加)を加えた。アルゴン流を継続し、1.5時間後、殆どの反応溶媒が蒸発した。濃厚なシロップ状物を、無水IPA(150mL)中に溶解し、室温で沈殿させた。沈殿物を濾過し、低温IPAおよびジエチルエーテル(30mL(5mgBHT含有))で洗浄した。残留溶媒を真空下蒸発させ、黄色がかった白色粉末を得た。HPLCによって、収量2.7g(90%)、置換率76%のNHS炭酸塩を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)7.9(m,1H,Ar);7.7(m,1H,Ar);7.5(m,2H,Ar);7.4(m,1H,Ar);7.2(m,1H,Ar);6.8(bs,1H,アミド);6.1(bs,1H,アミド);4.7(m,2H,CH2);4.3(t,1H,CH);3.6(s,PEG骨格);3.3(s,6H,-OCH3);2.7(s,4H,CH2CH2);2.7(m,2H,CH2);2.2(t,2H,CH2);2.0(m,2H,CH2)。
9-ヒドロキシメチル-2,7-(ビス-mPEG10K-カルボキシアミド)-フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミド(2,7-C2-PEG2-Fmoc20K-NHS)の調製のための中間体9-ヒドロキシメチル-2,7-フルオレンジカルボン酸の調製
9-ヒドロキシメチル-2,7-フルオレンジカルボン酸の合成を、以下の構造式5に図式的に表す。
アルゴン浄化したフラスコ中で、9-フルオレノン-2,7-ジカルボン酸(10.0g,0.037mol)を、ジエチレングリコール(75mL)中に懸濁させた。フラスコを室温油浴に入れ、その後NaOH(6.2g,0.155mol)およびヒドラジン水和物80%溶液(7.4mL,0.12mol)を連続的に加えた。反応混合物を110℃に徐々に加熱し、約4時間還流させた。反応混合物を冷却し、慎重に水に注ぎ入れ、濃縮HClでpH2に酸性化した。生成物を濾過し、水で洗浄した。生成物を温めたNaOH溶液(0.5M、温かい)中に溶解し、HClでpH2に酸性化し、沈殿させた。生成物を濾過し、水で洗浄した。生成物として、黄色固体(9.0g,96%)を得た。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)8.2(s,2H,Ar);8.1(m,2H,Ar);8.0(m,2H,Ar);4.1(s,2H,CH2)。
窒素浄化した乾燥フラスコ中で、2,7-フルオレンジカルボン酸(8.0g,0.031mol)を無水DMF(400mL)中に溶解した。無水ベンジルアルコール(82mL,0.788mol)、DMAP(0.58g,0.0047mol)およびEDAC塩酸塩(16g,0.082mol)を、反応混合物に室温で加えた。24時間撹拌後、反応混合物を温め、十分希釈したHCl(1.5L)を加え反応を抑制した。懸濁液を冷却、濾過し、水で洗浄した。生成物を温めたアセトン(800mL)中に溶解し、温めながら濾過した。濾液を、減圧下蒸発乾固した(収量5.9g、43%)(構造式5の「Bz」は、ベンジルを示す)。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)8.3(s,2H,Ar);8.2(m,2H,Ar);8.1(m,2H,Ar);7.5-7.4(m,10H,Bz);5.4(s,4HCH2);4.1(s,2H,Ar)。
アルゴン浄化した乾燥フラスコ中で、2,7-フルオレンジカルボン酸ジベンジルエステル(3.0g,0.0065mol)を、室温で無水THF(60mL)中に溶解した。ギ酸ベンジル(4.2mL、0.035mol、無水K2CO3上で保存)を加えた後、カリウムtert-ブトキシド95%(2.7g,0.023mol)を加えた。反応物を3時間撹拌し、その後反応物に水を加え反応を抑制し、HClでpH2に酸性化した。有機溶媒を、一部減圧下で蒸発させた。生成物を、酢酸エチル(600mL、その後200mL)で2回抽出した。結合有機層を塩水で3回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。粗生成物を、ヘキサンおよびメタノールで洗浄した(1.9g,60%)。1H-NMR(d6-DMSO):d(ppm)11.9(s,〜1H,ホルミル);8.8(s,1H,Ar);8.5(s,1H,Ar);8.4(s,1H,Ar);8.2(m,2H,Ar);7.9(m,2H,Ar);7.5-7.4(m,10H,Bz);5.4(s,4H,Ar)。
Parr水素化瓶(Parr Instrument Company, MolineIL)に、9-ホルミル-2,7-フルオレンジカルボン酸ジベンジルエステル(3.0g,0.0061mol)を、無水THF(350mL)中に溶解した。20%Pd/C(50%含水)20重量%(600mg)を慎重に加えた後、Parr瓶を、Parr器具を用いて3回真空/充填を繰り返し、水素雰囲気を確保した。懸濁液を、20から30psi水素ガス下で約60時間振動させ、その後残留水素を減圧下除去した。懸濁液を、セリット層を通して濾過し、さらにTHFを加えすすぎ、蒸発させた。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)9.0(s,1H,Ar);8.5から8.1(m,6H,Ar)。
少量の9-ホルミル-2,7-フルオレンジカルボン酸(5-10mg)試料を、少量のTHFとともに水に溶解した。過剰な水素化ホウ素ナトリウムを加え、2時間反応させた。酸性になるまで1MHClを慎重に加えながら、反応を抑制した。生成物を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)8.4(s,2H,Ar);8.2(m,2H,Ar);8.0(m,2H,Ar);4.2(t,1H,CH);4.0(d,2H,CH2)。
9-ヒドロキシメチル-2,7-ビス-(3-(mPEG10Kカルバモイル-プロピル))フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミド(2,7-CA2-PEG2-Fmoc20K-NHS)の調製のための中間体9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(3-カルボキシ-プロピル)フルオレンの調製
9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(3-カルボキシ-プロピル)フルオレンの合成を、以下の構造式6に図式的に示す。
アルゴン浄化した乾燥丸底フラスコ中で、無水AlCl3(98g,0.735mol)を、無水1,2-ジクロロエタン(140mL)中に懸濁させた。別のフラスコに、フルオレン(23g,0.138mol)を無水1,2-ジクロロエタン(125mL)中に溶解し、その後AlCl3懸濁液に加えた。反応フラスコを、室温浴に入れ、無水コハク酸(34.5g,0.345mol)を慎重に加えた。反応物を16時間撹拌し、その後低温3M HClに徐々に加え、極めて慎重に反応を抑制した(注意!HClを急に加えると、反応物が激しく反応する可能性がある)。最終的に十分混合された懸濁液は酸性であり、追加のHCl溶液に反応しなかった。有機溶媒を減圧下で除去し、生成物を濾過し、水でよく洗浄した。粗生成物を、温めたNaOH溶液(約<1M NaOH)中に溶解、濾過し、濃縮HClを加え沈殿させた。生成物を濾過し、水で洗浄し、その後P2O5の存在下、減圧下で乾燥させた。生成物として、淡黄色固体(49.3g,97%)を得た。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)8.3(s,2H,Ar);8.2(m,2H,Ar);8.1(m,2H,Ar);4.1(s,2H,CH2);3.5(t,4H,CH2);2.8(t,4H,CH2)。
アルゴン浄化したフラスコ中で、2,7-ジ(3-カルボキシ-プロピオニル)フルオレン(12.8g,0.035mol)を、ジエチレングリコール(150mL)中に懸濁させた。フラスコを室温油浴に入れ、その後NaOH(14g,0.35mol)およびヒドラジン水和物80%溶液(13.1mL,0.21mol)を連続的に加えた。反応混合物を徐々に110℃に加熱し、約2時間還流させた。反応温度を200℃に上昇させ、その加熱過程で、水を除去した。3時間反応温度を200℃に保った後、反応物を約60℃まで冷却した。反応混合物を慎重に水(500mL)に注ぎ入れ、混合物を濃縮HClでpH2に酸性化した。生成物を濾過し、水で洗浄した。生成物を温めたNaOH溶液(0.5M)中に溶解し、HClでpH2に酸性化させることによって沈殿させた。生成物を濾過し、水で洗浄した(収量10.9g、92%)。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)12.0(s,2H,COOH);7.8(m,2H,Ar);7.4(s,2H,Ar);7.2(m,2H,Ar);3.9(s,2H,CH2);2.7(t,4H,CH2);2.3(t,4H,CH2);1.8(m,4H,CH2)。
窒素浄化した乾燥フラスコ中で、2,7-ジ(3-カルボキシ-プロピル)フルオレン(3.0g,0.009mol)を、無水DMF(50mL)中に溶解した。無水ベンジルアルコール(23mL,0.22mol)、DMAP(0.27g,0.0022mol)およびEDAC塩酸塩(4.5g,0.023mol)を、反応混合物に室温で加えた。21時間撹拌後、反応混合物を温め、十分希釈したHCl(400mL)を加え反応を抑制した。懸濁液を冷却、濾過し、水で洗浄した。生成物を温めたアセトン中に溶解し、温めながら濾過した。濾液を、減圧下蒸発乾固した(収量3.8g、78%)。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)7.7(m,2H,Ar);7.4(m,12H,Ar);7.1(m,2H,Ar);5.1(s,4H,CH2);3.8(s,2H,CH2);2.7(t,4H,CH2);2.4(t,4H,CH2);1.9(m,4H,CH2)。
アルゴン浄化した乾燥フラスコ中で、2,7-ジ(3-カルボキシ-プロピル)フルオレンジベンジルエステル(2.0g,0.0039mol)を、室温で無水THF(40mL)中に溶解した。ギ酸ベンジル(2.3mL、0.019mol、無水K2CO3上に保存)を加えた後、カリウムtert-ブトキシド95%(1.5g,0.013mol)を加えた。反応物を4時間撹拌し、その後水を加え反応を抑制し、HClでpH2に酸性化した。有機溶媒を、一部減圧下で蒸発させた。生成物を、酢酸エチルで2回抽出した。結合有機層を、3回塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した.粗生成物を、ヘキサンで滴定した(一部ギ酸ベンジル残留)。1H-NMR(d6-DMSO):δ(ppm)11.0(s,〜1H,ホルミル);8.0(s,1H,Ar);7.9(s,1H,Ar);7.7(m,2H,Ar);7.6(s,1H,Ar);7.4から7.2(m,Bz);7.0(m,2H,Ar);5.0(s,4H,CH2);2.7(m,4H,CH2);2.4(m,4H,CH2);1.9(m,4H,CH2)。
9-ヒドロキシメチル-2,7-ジ(mPEG(20,000)-メチルアミド)-スルホン酸-フルオレン-N-ヒドロキシスクシンイミドの調製
Claims (70)
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ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である、
化Iのポリマー試薬。 -
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である、
化IIの請求項1に記載のポリマー試薬。 -
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である、
化IIIの請求項1に記載のポリマー試薬。 -
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
X3は、第三のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である、
化IVの請求項1に記載のポリマー試薬。 -
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である、
化Vの請求項1に記載のポリマー試薬。 -
ポリは、水溶性ポリマー、
Xは、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
Reは、存在する場合、電子代替基、および
(FG)は、活性剤のアミノ基と反応して、分解性結合を生成可能な官能基である、
化VIのポリマー試薬。 -
- ポリ1およびポリ2の各々は、ポリ(エチレングリコール)である、請求項1、2、3、4、および5のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- ポリは、ポリ(エチレングリコール)である、請求項6に記載のポリマー試薬。
- 各ポリ(エチレングリコール)は、約120ダルトンから約6,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項1、2、3、4、および5のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- 前記ポリ(エチレングリコール)は、約120ダルトンから約6,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項6に記載のポリマー試薬。
- 各ポリ(エチレングリコール)は、約6,000ダルトンから約100,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項1、2、3、4、および5のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- 前記ポリ(エチレングリコール)は、約6,000ダルトンから約100,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項6に記載のポリマー試薬。
- 前記第一のスペーサー部分は、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、および-O-CH2-CH2-NH-C(O)-から成る前記基から選択され、前記第二のスペーサー部分は、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-,、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-,、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、および-O-CH2-CH2-NH-C(O)-から成る基から選択される、請求項1、2、3、4、および5のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- R1はHで、R2はHである、請求項1、2、3、4、5、および6のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- 活性剤のアミノ基と反応可能な前記官能基は、N-スクシンイミジル、1-ベンゾトリアゾリル、イミダゾール、イミダゾール、ハロゲン化物、およびフェノラートの炭素塩から成る前記基から選択される、請求項1、2、3、4、5、および6のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- アミノ基と反応可能な前記官能基は、N-スクシンイミジルの炭素塩である、請求項1、2、3、4、5、および6のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- (a)は0で、(b)はゼロである、請求項1、2、3、4、および5のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- (a)はゼロである、請求項6に記載のポリマー試薬。
- (a)は1で、(b)はゼロであり、ならびに前記第一の電子代替基は、ハロ、低級アルキル、アリール、置換アリール、置換アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR、および-C(O)NHRから成る前記基から選択され、Arはアリールであり、RはHまたは有機ラジカルである、請求項1、2、3、4、および5のいずれか1つに記載のポリマー試薬。
- (a)は1で、前記電子代替基は、ハロ、低級アルキル、アリール、置換アリール、置換アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR、および-C(O)NHRから成る前記基から選択され、Arはアリールであり、RはHまたは有機ラジカルである、請求項6に記載のポリマー試薬。
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- 各(n)は4から1500である、以下化学式の請求項5に記載のポリマー試薬。
- 各(n)は4から1500である、以下化学式の請求項5に記載のポリマー試薬。
- 各(n)は4から1500である、以下化学式の請求項5に記載のポリマー試薬。
- 各(n)は4から1500である、以下化学式の請求項5に記載のポリマー試薬。
- 各(n)は4から1500である、以下化学式の請求項5に記載のポリマー試薬。
- 各(n)は4から1500である、以下化学式の請求項5に記載のポリマー試薬。
- 各(n)は4から1500である、以下化学式の請求項6に記載のポリマー試薬。
-
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である、
化I-Cの複合体。 -
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である、
化II-Cの請求項30に記載の複合体。 -
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である、
化III-Cの請求項30に記載の複合体。 -
ポリ1は、第一の水溶性ポリマー、
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
X3は、第三のスペーサー部分、
Ar1は、第一の芳香族部分、
Ar2は、第二の芳香族部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である、
化IV-Cの請求項30に記載の複合体。 -
ポリ2は、第二の水溶性ポリマー、
X1は、第一のスペーサー部分、
X2は、第二のスペーサー部分、
Hαは、イオン性水素原子、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
(b)は、0または1、
Re1は、存在する場合、第一の電子代替基、
Re2は、存在する場合、第二の電子代替基、および
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である、
化V-Cの請求項30に記載の複合体。 -
ポリは、水溶性ポリマー、
Xは、
R1は、Hまたは有機ラジカル、
R2は、Hまたは有機ラジカル、
(a)は、0または1、
Reは、存在する場合、電子代替基、
Y1は、OまたはS、
Y2は、OまたはS、および
Dは、生理活性剤の残留物である、
化VI-Cの複合体。 -
- ポリ1およびポリ2の各々は、ポリ(エチレングリコール)である、請求項30、31、32、33、および34のいずれか1つに記載の複合体。
- ポリは、ポリ(エチレングリコール)である、請求項35に記載の複合体。
- 各ポリ(エチレングリコール)は、約120ダルトンから約6,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項30、31、32、33、および34のいずれか1つに記載の複合体。
- 前記ポリ(エチレングリコール)は、約120ダルトンから約6,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項35に記載の複合体。
- 各ポリ(エチレングリコール)は、約6,000ダルトンから約100,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項30、31、32、33、および34のいずれか1つに記載の複合体。
- 前記ポリ(エチレングリコール)は、約6,000ダルトンから約100,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項35に記載の複合体。
- 前記第一のスペーサー部分は、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-,、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、および-O-CH2-CH2-NH-C(O)-から成る前記基から選択され、前記第二のスペーサー部分は、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-、-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)1-3-NH-C(O)-、-C(O)-NH-(CH2CH2O)1-3-CH2-CH2-NH-C(O)-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-CH2-O-、および-O-CH2-CH2-NH-C(O)-から成る前記基から選択される、請求項30、31、32、33、および34のいずれか1つに記載の複合体。
- R1はHで、R2はHである、請求項1、2、3、4、5、および6のいずれか1つに記載の複合体。
- Y1はOで、Y2はOである、請求項30、31、32、33、34、および35のいずれか1つに記載の複合体。
- 前記生理活性剤はポリペプチドである、請求項30、31、32、33、34、および35のいずれか1つに記載の複合体。
- (a)は0で、(b)はゼロである、請求項30、31、32、33、および34のいずれか1つに記載の複合体。
- (a)はゼロである、請求項35に記載の複合体。
- (a)は1で、(b)はゼロであり、ならびに前記第一の電子代替基は、ハロ、低級アルキル、アリール、置換アリール、置換アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR、および-C(O)NHRから成る前記基から選択され、Arはアリールであり、RはHまたは有機ラジカルである請求項30、31、32、33、および34のいずれか1つに記載の複合体。
- (a)は1で、前記電子代替基は、ハロ、低級アルキル、アリール、置換アリール、置換アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、CF3、-CH2CF3、-CH2C6F5、-CN、-NO2、-S(O)R、-S(O)Ar、-S(O2)R、-S(O2)Ar、-S(O2)OR、-S(O2)OAr、-S(O2)NHR、-S(O2)NHAr、-C(O)R、-C(O)Ar、-C(O)OR、および-C(O)NHRから成る前記基から選択され、Arはアリールであり、RはHまたは有機ラジカルである、請求項35に記載の複合体。
-
- 各(n)は4から1500であり、Dは生理活性剤の残留物である、以下化学式の請求項30に記載の複合体。
- 各(n)は4から1500であり、Dは生理活性剤の残留物である、以下化学式の請求項30に記載の複合体。
- 各(n)は4から1500であり、Dは生理活性剤の残留物である、以下化学式の請求項30に記載の複合体。
- 各(n)は4から1500であり、Dは生理活性剤の残留物である、以下化学式の請求項30に記載の複合体。
- 各(n)は4から1500であり、Dは生理活性剤の残留物である、以下化学式の請求項30に記載の複合体。
- 各(n)は4から1500であり、Dは生理活性剤の残留物である、以下化学式の請求項30に記載の複合体。
- 各(n)は4から1500であり、Dは生理活性剤の残留物である、以下化学式の請求項35に記載の複合体。
- ポリマー試薬を調製するための方法であって、
(a)第一の付着部位、第二の付着部位、および第三の付着部位を有する芳香族部分を提供するステップと、
(b)官能基試薬を前記第一の付着部位と反応させて、活性剤のアミノ基と反応可能な官能基を有する前記第一の付着部位をもたらし、加水分解性カルバミン酸塩をもたらすステップと、
(c)反応基を有する複数の水溶性ポリマーを、前記第二の付着部位および第三の付着部位と反応させて、(i)スペーサー部分を介して水溶性ポリマーを有する前記第二の付着部位、および(ii)スペーサー部分を介して第二の水溶性ポリマーを有する前記第三の付着部位をもたらすステップと、
を含む方法。 - ステップ(b)は、ステップ(c)の前に実行される、請求項59に記載の方法。
- ステップ(c)は、ステップ(b)の前に実行される、請求項59に記載の方法。
- 複合体を調製するための方法であって、請求項1、2、3
、4、5、または6のいずれか1つに準じて、ポリマー試薬をアミン含有生理活性剤と複合条件下で反応させるステップを含む、方法。 - 請求項62の方法によって調製される複合体。
- 請求項63の複合体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む製薬組成。
- 凍結乾燥剤形である請求項64の製薬組成。
- 液体の希釈剤をさらに含む、請求項64に記載の製薬組成。
- 前記液体の希釈剤は、注射用静菌水、デキストロース5%の水、リン酸緩衝生理食塩水、Ringer溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、およびその組み合わせから成る前記基から選択される、請求項66に記載の製薬組成。
- 単位剤形である、請求項64に記載の製薬組成。
- ガラス製の薬瓶に収容される、請求項68に記載の製薬組成。
- 請求項30、31、32、33、34、および35のいずれか1つに準じて複合体の治療的有効量を患者に投与するステップを含む、複合体を送達する方法。
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