JP2020509018A - 養子細胞移植療法と併せてインターロイキン−２受容体α，β−選択的作動薬を用いる免疫療法的治療方法 - Google Patents

Abstract

養子細胞移植療法を提供し、長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβ−バイアス作動薬を個体に投与することによる、癌を有する個体の治療を目的とする方法及び組成物が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、２０１７年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／４６５，５０６号明細書、及び２０１７年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４８０，９７１号明細書の優先権の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容は参照により全体として本明細書に援用される。

本願は、（特に）癌免疫療法の分野に関し、長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβ−バイアス（即ちＩＬ−２Ｒαβ−選択的）作動薬の個体への投与が付随する養子細胞移植療法を提供することによる癌を有する個体の治療を含む。

新規治療法は、癌治療改善のために継続的に開発されている。癌治療の最も有望な領域の１つは、癌免疫学（即ち癌免疫療法）である。癌免疫療法は、癌と戦うための患者自身の免疫系を誘導するために免疫反応を調整するように設計された多様な一連の治療ストラテジーを指す。現在の免疫療法的アプローチの中でも、（ＡＣＴとも呼ばれる）養子細胞移植療法は、ある種のタイプの癌患者を治療することにおいて有望であることが示されてきた。養子細胞療法は、単純なワクチン接種により達成され得るよりも多数の腫瘍反応性エフェクターＴ細胞を得るための腫瘍特異的なリンパ球の単離及びエクスビボ増殖を含む。患者の免疫系に腫瘍細胞の殺傷を開始させるために癌患者に腫瘍特異的なＴ細胞を点滴する。養子細胞移植は、特に転移性黒色腫において有効な臨床転帰を示している（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｒ．Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３（１０）：２３４６−２３５７（２００５）；Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（３２）：５２３３−５２３９（２００８））。養子細胞移植は、養子Ｔ細胞療法で一般的であるように自家性であってもよいし、又は同種異系であってもよい。

初期の（第一世代）養子細胞移植は、進行癌患者の治療のために高用量ＩＬ−２とともにリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を利用したが、ＩＬ−２単独での治療よりも優れているものではないことが示された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．８５（８），６２２−６３２（１９９３））。アッセイから、増殖させたＬＡＫ細胞が抗腫瘍活性を全く示さなかったことが明らかとなった（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３４（６），５２４−５３１（２００７）。

養子細胞移植の第二世代は、ＬＡＫ細胞の代わりに腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用した。ＴＩＬは、腫瘍抗原を特異的に認識し、それにより悪性細胞を排除する能力を促進し得る患者の腫瘍内に存在するＴ細胞である。しかし、殆どの癌患者において、天然のＴＩＬは、一般的には数は多いが完全に活性化されないか又は抑制されるかのいずれかであるため、腫瘍を破壊できない。或いは、腫瘍は、ＴＩＬによる認識を含め、免疫系による認識を逃れ得る。結果として、ＴＩＬ−養子細胞移植の主要な目的は、患者からＴＩＬを単離し、続いてエクスビボで刺激及び増殖を行って、多数の活性化された腫瘍特異的なＴ細胞を生成させることである。次に、増殖させたＴＩＬを患者に点滴によって戻す。転移性黒色腫に対する最初のＴＩＬ−ＡＣＴ治験において、ＴＩＬに対する刺激性増殖因子としての高用量の静脈内ＩＬ−２と一緒に自家ＴＩＬで患者を治療した。ＩＬ−２の多面的な性質並びにその短い半減期によって、インビボ残留性が限定的な、制御性Ｔ細胞並びにエフェクターＴ細胞の両方の増殖が可能になる。応答率は低く、循環中のＴＩＬの持続性は、投与の１週間後にかろうじて０．１パーセントであった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３２３（９），５７０−５７８（１９９０））。エフェクターＴ細胞及び制御ＴＩＬの刺激の持続性が乏しいことは、応答の欠如に寄与し得る。

上記治験から、抗腫瘍応答を改善する必要が示された。次世代の養子細胞移植試験は、内在性制御性Ｔ細胞を抑制する目的で、及び点滴されたＴＩＬに対する最適環境を提供するために、リンパ球を枯渇させる患者のプレコンディショニングの追加を含んでいた。しかし、これらの後者の試験から、低血圧、肺うっ血、血管漏出症及び骨髄抑制を含む患者毒性が付随することが明らかになった（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３（１０），２３４６−２３５７（２００５）。前述のものに加えて、このアプローチの別の欠点は、主に前述の毒性及び応答の欠如ゆえに、患者のドロップアウト率が非常に高いことであった。さらに、制御及びエフェクター細胞の両方が無差別に増殖させられ得るので、増殖Ｔ細胞の集団は依然として問題であった。最後に、体内での移植細胞の持続性の欠如は依然として大きな問題である。
特に上記の難題にもかかわらず、進行性転移癌において、チェックポイント阻害剤抗体を含め、有効な治療は少数しかないので、癌を治療するための養子細胞移植臨床試験での患者の登録は継続している。進行中の養子細胞移植試験には、種々のタイプの細胞増殖剤、移植細胞、患者コンディショニング、腫瘍溶解剤が含まれ；養子細胞移植を改善するためのあるアプローチには、ＴＩＬの代わりに遺伝子改変末梢Ｔ細胞の移植が含まれる。ＴＩＬプロトコールは一般的には、ＴＩＬ単離のために腫瘍組織を切除するために患者が外科的手術を受けることを必要とし；一方で、Ｔ細胞養子細胞療法は、一般的には、患者が外科的手術を回避することが可能であり、遺伝子改変用の末梢Ｔ細胞を得るために患者は白血球フェレーシスのみを必要とする。このアプローチは、どの腫瘍抗原が存在し得るかという事前の知識を要する。さらに、今まで、遺伝子操作されたＴ細胞療法（ＣＡＲ−Ｔ又はＴＣＲ）は、液性腫瘍に対してのみ有効であり、固形腫瘍には効果がなく、Ｔ細胞サブセット集団の問題が残っている。固形腫瘍は、ＴＩＬ及びインターロイキン−２にのみ応答している。これらのアプローチでさえ、増殖細胞集団が制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及びエフェクターＴ細胞を含み得るので、インターロイキン−２により増殖させた細胞集団は明らかではない。これは、制御及びエフェクターＴ細胞を等しく増殖させる、天然のインターロイキン−２の多面的性質から生じる。

Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｒ．Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３（１０）：２３４６−２３５７（２００５） Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（３２）：５２３３−５２３９（２００８） Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．８５（８），６２２−６３２（１９９３） Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３４（６），５２４−５３１（２００７） Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３２３（９），５７０−５７８（１９９０）

今まで種々のプラットフォームを網羅する効果的な養子細胞移植療法の開発において多大な努力がなされてきたにもかかわらず、新しく、より効果的な免疫療法的な養子細胞移植ストラテジー及び、この免疫細胞療法に基づくアプローチの可能性を利用するための現在の治療法の欠点の１つ以上を克服する関連治療レジメンを提供することが依然として必要とされている。従って、本開示は、持続性がより長い腫瘍殺傷表現型へと増殖Ｔ細胞集団を偏らせることが可能な養子細胞移植を利用する新しく効果的な癌免疫療法を提供することによって、これ及び他のニーズに対処しようとするものである。

第一の態様において、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与と併用する、癌を有する対象への養子細胞移植を含む方法が本明細書中で提供され、これを以下で詳細に記載する。１つ以上の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、エフェクターＴ細胞を優先的に増殖させるのに有効である。本開示は、少なくとも一部、併用治療レジメンが、１回以上のサイクル及び／又は連続的に、いずれかの順序で又は実質的に同時に投与される養子細胞療法及びエフェクターＴ細胞の長時間作用型バイアスＩＬ−２Ｒβ−活性化作動薬の投与が、一部の対象で癌を治療することにおいて特に有効であり得る、及び／又は、免疫細胞の活性及び／又は免疫細胞数を、開始させ得る、可能にし得る、増加させ得る、促進し得る、又は延長し得る、又はその結果、いずれかの単一の免疫療法アプローチのみの場合を超えて促進される程度まで、液性及び固形癌を含め、癌細胞に対する有益な応答が生じ得る（例えば、適用できる場合は、安定化、退縮、縮小、壊死など）という認識から生じる。

第二の態様において、養子細胞療法及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬を含む癌の治療のための併用療法が本明細書中で提供される。

第三の態様において、養子細胞療法の治療的有効性を促進する方法が提供されるが、この方法は、癌を有する対象に養子細胞療法を提供すること、及びＩＬ−２Ｒβ−活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬をその対象に投与することを含み、この長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、養子細胞療法に対する対象の応答を改善するのに有効である。

さらに第四の態様において、癌のための治療を受けている対象において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積を阻害する方法が提供されるが、この方法は、Ｔ細胞（例えば対象の血液又は腫瘍から回収されたもの及びインビトロで増殖させたもの）を対象の細胞（ｓｕｂｊｅｃｔ ｃｅｌｌｓ）に点滴すること、及びＩＬ−２Ｒβ−活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬を対象に投与することを含む。この長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、癌性腫瘍を治療するのに有効な量で投与され、例えば癌のマウス若しくは他の適切なインビボモデルにおいて評価する場合、治療が、養子細胞移植と併用した非長時間作用型のＩＬ−２Ｒ作動薬の投与時に観察されるものを超えて、又は単一の癌免疫治療のいずれか単独（即ち長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬又は養子細胞移植のみの投与）での治療時に観察されるものを超えて促進される量、腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇからなる群から選択される制御性Ｔ細胞の蓄積を阻害するのに有効である。

明確にするために、投与の順序に関して、用語「投与する」が養子細胞又は長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬のいずれかの送達を指すためにこの例で使用される場合、養子細胞及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、同時に又は連続的に及びあらゆる順序で投与され得る。さらに、治療は、治療の単サイクルを含んでいてもよいし、又は複数サイクルを含んでいてもよい。養子細胞移植及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与を含む治療の最初のサイクル後、治療のさらなるラウンドは、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与と併用した養子細胞移植又は長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与を伴わない養子細胞療法又は養子細胞移植を伴わない長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与を含み得る。

次の実施形態は、上記の態様のそれぞれに等しくあてはまるものであり、あてはまる場合は、別段の断りがない限り、単独及び組み合わせの両方と見なされるものとする。

１つ以上の実施形態において、対象はヒト対象である。

１つ以上のさらなる実施形態において、癌は固形癌である。例えば癌は、１つ以上の実施形態において、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、及び副腎皮質癌からなる群から選択される。

さらに１つ以上の別の実施形態において、癌は、黒色腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌及び結腸癌から選択される。

１つ以上の特定の実施形態において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。

１つ以上の実施形態において、固形癌性腫瘍を治療する場合、本方法は、１つの治療サイクル後に評価する場合、少なくとも約２５％の固形腫瘍サイズの低下をもたらすために有効である。

一部のさらなる実施形態において、癌は転移性である。

一部のさらなる実施形態において、癌は、液性癌、例えば血液の癌などである。一部の実施形態において、癌はリンパ腫又は白血病である。１つ以上の関連する実施形態において、癌は、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫から選択される白血病である。

１つ以上の実施形態において、養子細胞療法は、養子Ｔ細胞又はＮＫ細胞の点滴を含む。

１つ以上のさらなる実施形態において、養子細胞療法は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の点滴を含む。

１つ以上の実施形態において、細胞は自家細胞である。

１つ以上のさらなる実施形態において、細胞は同種異系細胞である。一部の実施形態において、同種異系細胞は、腫瘍抗原に対して標的化される。

１つ以上のさらなる実施形態において、細胞は遺伝子操作されている。

一部の実施形態において、養子細胞療法は、ＩＬ−２Ｒβ−活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与前に提供される。

一部の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、ポリエチレングリコールに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む。さらに一部のさらなる実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、インターロイキン−２、例えば、４、５及び６つの、又は４、５、６及び７つのポリエチレングリコールポリマーに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む。さらに一部の別の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、平均約６つのポリエチレングリコールポリマーに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む。１つ以上のさらなる実施形態において、アルデスロイキンに放出可能に共有結合しているポリエチレングリコールポリマーは、分枝状ポリマーである。

一部の実施形態において、養子細胞療法は、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与とともに（治療の１回のラウンド中に）１回行われ、その後、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与のさらなるラウンドが続く。

長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬に対する１つ以上の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む組成物中に含まれる。

さらなる態様及び実施形態を次の記載及び特許請求の範囲で示す。

図１Ａ〜１Ｈは、例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２（以下に記載、「ＲＳＬＡＩＬ−２」は、放出可能にＰＥＧが付加されたインターロイキン−２分子を指す）の単回投与又は実施例２で詳述するようなアルデスロイキンの５日用量での治療後の、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおける免疫細胞変化を示す。示される時点において動物から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離し、免疫細胞集団をフローサイトメトリーにより評価した。各々のデータ点は個々のマウス腫瘍を表し、線は平均値を表す。データを各々の時点における３〜４つのレプリケートを用いる２〜４つの独立試験から組み合わせた。図１Ａは、ビヒクル（白丸）、アルデスロイキン（黒四角）及びＲＳＬＡＩＬ−２（黒三角）の各々による治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中のＣＤ８Ｔ細胞の総割合を示し；図１Ｂは、ビヒクル（白丸）、アルデスロイキン（黒四角）及びＲＳＬＡＩＬ−２（黒三角）の各々による治療後の様々な時点における腫瘍中のメモリーＣＤ８Ｔ細胞の割合を示し；図１Ｃは、ビヒクル（白丸）、アルデスロイキン（黒四角）及びＲＳＬＡＩＬ−２（黒三角）の各々による治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中の活性化ＮＫ細胞の割合を示し；図１Ｄ及び１Ｅは、治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中のＣＤ４Ｔ細胞の割合を示し；図１Ｆは、治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中のＣＤ４Ｔｒｅｇ細胞の割合を示し；図１Ｇは、治療後の総ＣＤ４細胞のＴｒｅｇ細胞の割合を示し；図１Ｈは、治療後の総ＣＤ８細胞とＴｒｅｇ細胞との比を提供する。 図２は、実施例３に記載の非修飾ＩＬ−１（アルデスロイキン、黒逆三角）と比較したＲＳＬＡＩＬ−２（黒四角）（及びその放出活性コンジュゲートＩＬ−２形態、黒丸）の腫瘍薬物動態を実証するグラフである。 図３は、ｐｍｅｌ−１養子細胞移植と併用したＲＳＬＡＩＬ−２又はＩＬ−２の抗腫瘍活性を高悪性度マウス黒色腫モデルにおいて調べた実施例５で使用される投与ストラテジーを記載する模式図である。 図４は、実施例５に記載の実験についてＳＥＭ対時間により決定した場合の、平均腫瘍体積（ｍｍ^３）のプロットを提供する。水平軸の下の矢印によって投与レジメンの模式図を提供する。説明文：黒丸：ＡＣＴ＋ビヒクル；黒四角：ＡＣＴ＋ＩＬ−２；黒三角：ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２。図４で示される結果から分かり得るように、養子細胞移植と併用して投与する場合、ＲＳＬＡＩＬ−２は、より低い投与頻度での養子細胞移植併用ＩＬ−２と比較した場合、顕著な腫瘍成長遅延をもたらした（ＩＬ−２併用ＡＣＴと比較した場合、ｐ＜０．０００１）；（＃ビヒクルと比較してｐ＜０．０００１（ボンフェローニ検定を使用したペアワイズ比較）。 図５は、実施例５に記載の実験に対してＮ＝１２／群で、１０００ｍｍ^３の腫瘍体積に達するための時間を内挿することにより各腫瘍成長曲線に対して評価した場合の腫瘍成長遅延を示す（^＊ＡＣＴ＋ＩＬ−２と比較してｐ＜０．０００１；＃ビヒクルと比較してｐ＜０．０００１（Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）。 図６Ａ及び６Ｂは、インビボ生体発光イメージング実験について実施例５に記載のような、ルシフェラーゼを発現するｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞の養子細胞移植後１９日目までの、脾臓（図６Ａ）及び腫瘍（図６Ｂ）の関心領域（ＲＯＩ）における連続画像の定量化を提供する（カウント／ピクセル）。図面の説明文は図６Ａ及び図６Ｂの両方に対して同じである：上のプロット、黒三角：示されるとおりのＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２；中央のプロット、黒四角：ＡＣＴ＋ＩＬ−２；下のプロット、黒丸：ＡＣＴ＋ビヒクル。ＩＬ−２（アルデスロイキン）の複数回の治療を伴う場合でさえも応答が減衰するＡＣＴ／ＩＬ−２療法とは対照的に、ＡＣＴ／ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法で持続性応答が観察されたので、これらの画像から、インターロイキン−２、アルデスロイキンではなく、ＲＳＬＡＩＬ−２などの薬剤の投与と併用した養子細胞移植療法の有効性が明らかになる。 図７Ａ〜７Ｃは、腫瘍における制御性Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞での（即ちＩＬ−２もしくはＲＳＬＡＩＬ−２のいずれかと、又は対照ビヒクルとの）養子細胞移植併用療法の効果をフローサイトメトリーにより評価した実施例５に記載のような種々の治療群に対する腫瘍における免疫細胞数のプロットである。特に、図７Ａは、治療群のそれぞれに対する腫瘍におけるＴｈｙ１．１ ＣＤ８細胞数を示す（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図７Ｂは、治療群のそれぞれに対する腫瘍におけるＣＤ４ Ｔ ｒｅｇ数を示す（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図７Ｃは、上記のような治療群のそれぞれに対する腫瘍におけるＴｒｅｇに対するＣＤ８細胞数の比率を提供する。これらのデータは、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２の併用に対して脾臓において観察されるものよりも大きい腫瘍におけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ細胞の比を示し、このことから、正常組織が顕著には影響を受けないことが示唆される。さらに、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２の併用について、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、ＡＣＴ＋ＩＬ−２の併用で達成されるものよりも実質的に高く、ＲＳＬＡＩＬ−２の投与回数はより少ない。 図８Ａ〜８Ｃは、実施例５で詳述するようなフローサイトメトリーにより評価した場合、脾臓での制御性Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対する（即ちＩＬ−２もしくはＲＳＬＡＩＬ−２のいずれか、又は対照ビヒクルとの）ＡＣＴ併用療法の効果を示す。具体的に、図８Ａは、治療群のそれぞれに対する脾臓におけるＴｈｙ １．１ ＣＤ８細胞数を示す（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図８Ｂは、治療群のそれぞれに対する脾臓におけるＣＤ４ Ｔ ｒｅｇ数を示す（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図８Ｃは、上記のような治療群のそれぞれに対する脾臓におけるＴｒｅｇに対するＣＤ８細胞数の比を提供する。 図９は、実施例５に記載のような治療群のそれぞれに対する治療後５日目での脾臓細胞回復を示すグラフ表示である。 図１０は、実施例５に記載のような養子細胞移植後のＩＬ−２又はＲＳＬＡＩＬ−２のいずれかの投与後１２日目の腫瘍のＩＨＣ（免疫組織化学）である。マウス抗ＣＤ８抗体を用いてホルマリン固定／パラフィン包埋組織上で免疫組織化学染色を行い；ＨＡＬＯ画像分析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ）を使用して分析を行った。この図面は、群あたり３匹の異なるマウスの腫瘍におけるＣＤ８浸潤を示す。第一のカラム（「ｐｏｓ」）はＣＤ８染色を示し、第二のカラム（「ｐｏｓ ｈａｌｏ」）は、ＨＡＬＯソフトウェアにより分析したスライドであり、カラー画像において、青点は陰性細胞であり、黄色から赤色の点はＣＤ８陽性細胞であり（黄色はＣＤ８低発現であり、赤色は高発現）、第三のカラムは、ＣＤ８Ｔ細胞に対して陽性である領域の５×拡大率である。カラム４及び５は、それぞれ、抗体抗ＣＤ８の陰性染色、正常染色及びＨＡＬＯ分析である。カラム６はＨ＆Ｅ染色である。カラム１の暗い領域は、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法に対するカラー画像におけるカラム２の黄色及び赤色の点に対応する。この図面は、２群間のＣＤ８発現における注目すべき差異を示し、ＣＤ８発現レベルは、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法について顕著により高い。ＩＨＣは、非ポリマー修飾ＩＬ−２、アルデスロイキンでの治療と比較した場合の、長時間作用型バイアスＩＬ−２Ｒβ−インターロイキン−２（ＲＳＬＡＩＬ−２）で治療の場合の、腫瘍内ＣＤ８Ｔ細胞の持続性を示す。 図１１は、実施例５に記載のような養子細胞移植後、ＩＬ−２（アルデスロイキン）又はＲＳＬＡＩＬ−２のいずれかの１回投与後９日目の組織損傷ＣＤ８Ｔ細胞の欠如を示す、正常、非腫瘍組織（腎臓及び肝臓）のＩＨＣである。マウス抗ＣＤ８抗体を用いてホルマリン固定／パラフィン包埋組織上で免疫組織化学染色を行い；ＨＡＬＯ画像分析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ）を用いて分析を行った。 図１２は、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の調製における使用に対する例示的なインターロイキン−２配列を提供する。

用語
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれる。

本開示のある特徴を記載し、及び特許請求するにあたり、特に記載のない限り以下に記載する定義に従い以下の用語を使用する。

「水溶性非ペプチドポリマー」は、室温で水に対して少なくとも３５％（重量基準）可溶であるポリマーを指す。しかしながら、好ましい水溶性非ペプチドポリマーは、好ましくは、水に対して７０％超（重量基準）、より好ましくは９５％超（重量基準）可溶である。典型的には、「水溶性」ポリマーの未ろ過水溶液調製物は、ろ過後の同じ溶液により透過される光の量の少なくとも７５％を透過する。好ましくは、このような未ろ過水溶液調製物は、ろ過後の同じ溶液により透過される光の量の少なくとも９５％を透過する。水に対して少なくとも９５％（重量基準）可溶であるか又は水に対して完全に可溶である水溶性ポリマーが最も好ましい。「非ペプチド性」であることに関して、ポリマーは、それが有するアミノ酸残基が３５％未満（重量基準）含有するとき非ペプチド性である。

用語「単量体」、「単量体サブユニット」及び「単量体ユニット」は、本明細書では同義的に使用され、ポリマーの基本構造繰り返し単位の１つを指す。ホモポリマーの場合、単一の繰り返し構造単位がポリマーを形成する。コポリマーの場合、２つ以上の構造単位が−あるパターンで又はランダムに−繰り返すことでポリマーを形成する。本開示との関連において使用される好ましいポリマーはホモポリマーである。水溶性非ペプチドポリマーは、連続的に結合された１つ以上の単量体を含んで単量体の鎖を形成する。

「ＰＥＧ」又は「ポリエチレングリコール」は、本明細書で使用されるとき、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含することが意図される。特に指示されない限り、「ＰＥＧポリマー」又はポリエチレングリコールは、実質的に全ての（好ましくは全ての）単量体サブユニットがエチレンオキシドサブユニットであるものであり、しかしながらポリマーは、例えばコンジュゲーション用に、個別のエンドキャッピング部分又は官能基を含有してもよい。本開示で使用されるＰＥＧポリマーは、１つ以上の末端酸素が例えば合成変換中に置換されたか否かに応じて、以下の２つの構造のうちの一方を含み得る：「−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−」又は「−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−１ＣＨ_２ＣＨ_２−」。前述のとおり、ＰＥＧポリマーについては、変量（ｎ）は典型的に約３〜４０００の範囲であり、末端基及びＰＥＧ全体の構造は様々であり得る。

ポリマーの幾何学的配置又は全体構造に関して「分枝状」は、分岐点又は中央構造特徴部から延在する２つ以上のポリマー「アーム」又は「鎖」を有するポリマーを指す。

「生理学的に切断可能な」又は「加水分解可能な」又は「分解可能な」結合は、生理学的条件下で、及び加水分解の何らかの適切な方法下で、一般的には水と反応する（即ち加水分解される）比較的不安定な結合である。水中で結合が加水分解する傾向は、所与の分子内の２個の原子を連結する一般的なタイプの連結だけでなく、これらの原子及び全体的な分子構造に連結される置換基にも依存し得る。加水分解に不安定な又は弱い結合としては、典型的に、限定はされないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、オリゴヌクレオチド、チオエステル、及びカーボネートが挙げられる。

「酵素分解性の結合」は、１つ以上の酵素により分解を受ける結合を意味する。

「安定な」結合（ｌｉｎｋａｇｅ）又は結合（ｂｏｎｄ）は、水中で実質的に安定な化学結合、即ち、長期間にわたり生理学的条件下でいかなる認め得る程度の加水分解も受けない結合を指す。加水分解に安定な結合の例としては、限定はされないが、一般的に以下が挙げられる：炭素−炭素結合（例えば脂肪族鎖中の）、エーテル類、アミド類、アミン類など。概して、安定な結合は、生理学的条件下で１日約１〜２％未満の加水分解速度を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解速度は、多くの標準的な化学テキストブックを参照することができる。

例えばポリエチレングリコール部分の文脈における、インターロイキン−２などの活性部分に共有結合的に放出可能に連結される共有「放出可能な」連結は、何らかの適切な機序によって、活性部分からポリエチレングリコール部分を放出するか又は脱離させる（即ち脱ＰＥＧ化）ものである。

本明細書で使用されるとき、用語「癌を治療すること」は、絶対的な用語であることを意図するものではなく、例えば腫瘍サイズを縮小するか又は癌細胞数を減少させるか、癌を寛解状態にするか、又は癌細胞のサイズもしくは細胞数の成長を防ぐことなどを含み得る。いくつかの状況において、本開示による治療は、予後の改善につながる。

本明細書で使用されるとき、語句「治療を必要とする対象」は、癌と診断されている個体又は対象を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「促進する」は、例えば応答促進の文脈では、ある一定のベースラインと比較した場合の、例えば本明細書中で開示されるような、対象の、又は腫瘍細胞の、治療への応答能の改善を指す。例えば、応答促進は、治療に対する応答性の何らかの１つ以上の指標に基づいた、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％又はそれを超える応答性の向上を含み得る。本明細書で使用されるとき、「促進する」は、例えばこのような比較に対するある種の基礎と比較した場合、治療に対して有利に応答する対象の数を促進することも指し得る。

語句「治療的有効」、「治療有効量」、「有効量」又は「有効な量で」は、Ｔ細胞応答を促進するのに十分な量又は投与量などであるが限定されない、所望の生理学的応答を促進するための十分な量又は投与量を指す。

「実質的に」又は「本質的に」とは、ほぼ全体的に又は完全に、例えばある所与の分量の９５％以上を意味する。

「薬学的に許容可能な賦形剤」又は「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書に記載される組成物中に含まれ得る成分であって、対象に重大な有害毒性効果を引き起こさない成分を指す。

用語「患者」、又は「対象」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に提供されるとおりの化合物又は組成物又は併用の投与により予防又は治療することのできる病態、例えば癌に罹患している又はそれに罹り易い生物を指し、ヒト及び動物の両方が含まれる。対象には、限定されるものではないが、哺乳動物（例えばマウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、好ましくはヒトである。

概要
有効抗腫瘍応答を誘導するための有望な治療にもかかわらず、養子細胞療法後、初期応答後に癌性腫瘍が再発することが多い。さらに、養子Ｔ細胞移植に対する現在のプロトコールは一般に、Ｔ細胞増殖を刺激し、維持するためにサイトカイン又は他の薬剤などの免疫刺激物質を必要とするが、このような刺激剤は、エフェクターＴ細胞及び制御性Ｔ細胞の両方を刺激し得る。現在の養子細胞移植ストラテジーに付随する欠点の少なくとも一部に対処するための試みにおいて、本明細書中で、エクスビボで増殖させた腫瘍反応性Ｔ細胞及びＩＬ−２Ｒβ−活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬を癌がある対象に投与することを含む方法が提供される。長い間、高用量ＩＬ−２などのサイトカインが養子細胞移植と併用されてきた一方で、このような治療の結果、毛細血管漏出症、点滴された細胞の持続性の欠如及び低応答率などの患者毒性が報告されている。さらに、臨床的に承認されているＩＬ−２は、腫瘍におけるＴｒｅｇが所望の抗腫瘍応答を妨害する免疫抑制につながり得るように、それぞれＩＬ−２Ｒβγ及びＩＬ−２Ｒαβγ複合体を結合させることを通じて、腫瘍殺傷ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（ＣＤ８Ｔ）並びに制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の両方を増殖させる。従って、これら及び他の欠点に照らして、抗腫瘍特性が改善されている、耐久性があり、再現性があり、有効な養子細胞移植に基づく癌療法を提供するために、さらなる強化が必要とされる。従って、本開示は、例示的なインビボ動物モデルで示されるように、少なくとも部分的には、長時間作用型ＩＬ−２Ｒ作動薬及びより具体的にはＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の細胞に基づく治療及び投与を含む特に有利な治療薬の併用の探索に基づく。

Ｉｌ−２は、アルファ（ＩＬ２Ｒα、ＣＤ２５）、ベータ（ＩＬ２Ｒβ、ＣＤ１２２）及び共通のガンマ鎖受容体（γ_ｃ’ＣＤ１３２）を含有する受容体シグナリング複合体を通じて免疫細胞増殖及び活性化を刺激する。高用量において、ＩＬ−２はヘテロ二量体ＩＬ２Ｒβγ受容体に結合し、腫瘍殺傷ＣＤ８＋メモリーエフェクターＴ（ＣＤ８Ｔ）細胞の所望の拡大をもたらす。しかしながら、ＩＬ２はそのヘテロ三量体受容体ＩＬ２Ｒαβγにもより大きな親和性で結合し、それが免疫抑制ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大し、それが癌免疫療法についての不所望な効果をもたらし得る。従って、ＩＬ−２促進性癌免疫ストラテジーに付随する１つ以上の欠点を克服するための試みにおいて、本明細書中で、ＩＬ−２Ｒαβ−バイアス作動薬及び特に長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβ−バイアス作動薬の投与と養子細胞移植との併用治療モダリティが提供される。理論により縛られるものではないが、出願者らは、免疫抑制性Ｔｒｅｇを活性化するのに寄与するＩＬ−２Ｒαサブユニットと相互作用する領域が遮蔽される（即ちその活性が抑制又は減弱化される）長時間作用型インターロイキン−２分子、即ち長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβ−バイアス作動薬を利用することによって、特に、本開示及び裏付けとなる実施例から明らかになるであろうように、優れた治療効果を達成するために養子細胞移植誘導性Ｔ細胞応答を選択的に拡大させ得ることを発見した。

養子細胞移植療法
エクスビボで増殖させた腫瘍反応性Ｔ細胞を、即ち癌特異的な免疫反応を刺激するために投与することを含む治療方法が本明細書中で提供される。本明細書中で提供される組成物及び方法は、特に、臨床及び研究の両方の適用で利用される。本明細書中に記載の方法に従い、種々の養子細胞移植療法を行い得、本開示は、この点に限定されない。理論により縛られるものではないが、養子細胞移植、例えばＴ細胞移植及び本明細書中で提供されるような長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβ−バイアス作動薬の免疫活性化の相補的機序ゆえに、所望のＴ細胞反応を刺激するためにＩＬ−２経路を介して（即ち、養子細胞移植とともに、長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβ−バイアス作動薬を投与することを介して）抗腫瘍薬の転帰の改善が達成され得ると考える。

本明細書中で提供される方法において、何らかの適切な養子細胞移植療法を使用し得、本開示はこの点で限定されない。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｔｈ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００８ Ａｐｒ；８（４）：２９９−３０８を参照。例えば、養子Ｔ細胞又はＮＫ細胞療法が使用され得る。例えば、選択後、腫瘍特異的な宿主Ｔ細胞を腫瘍抗原又は細胞とエクスビボで組み合わせ、増殖させ、対象に再点滴し得る。点滴前に、例えば、内因性制御性Ｔ細胞を抑制し、点滴されたＴ細胞にとって最適化された環境を提供するために、リンパ球を枯渇させる骨髄非破壊的化学療法（ＮＭＣ）を使用して、患者のプレコンディショニングも行い得；或いは、シクロホスファミド又は何らかの他の適切なコンディショニング剤を使用し得る。このようなプレコンディショニングは、ホメオスタシス性のサイトカインに対して移植細胞と競合するＴｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）及びリンプトサイト（ｌｙｍｐｔｏｃｙｔｅ）を排除するか又は実質的に数を減少させるためである。宿主細胞は、リンパ節、例えば鼠径部、腸間膜、浅遠位腋窩（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｄｉｓｔａｌ ａｕｘｉｌｉａｒｙ）など；骨髄；脾臓；又は末梢血などの種々の供給源から、並びに腫瘍、例えば腫瘍浸潤リンパ球から単離され得る。細胞は、同種異系であってもよいし、又は好ましくは自家であってもよい。エクスビボ刺激について、宿主細胞は、当技術分野で公知のように、無菌的に取り出され、何らかの適切な培地中で懸濁される。細胞を刺激し、種々のプロトコール、特に抗ＣＤ３、Ｂ７、抗ＣＤ２８などの組み合わせのいずれかを使用して増殖させる。宿主Ｔ細胞のエクスビボ増殖のための適切なプロトコールは、“Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２０１０，Ａｒｔ．ＩＤ ２６０２６７に記載されている。

例えば、養子細胞移植は、（ｉ）ヒトなどの哺乳動物対象から自家リンパ球を得て、（ｉｉ）自家リンパ球を培養して増殖リンパ球を作製し、（ｉｉ）増殖リンパ球を対象（即ち患者）に投与することにより行われ得る。好ましくは、リンパ球は、腫瘍由来であり、例えばそれらはＴＩＬであり、治療しようとする対象から単離される（即ち自家移植）。自家養子細胞療法は、（ｉ）自家リンパ球を培養して増殖リンパ球を作製し；（ｉｉ）骨髄非破壊的なリンパ球を枯渇させる化学療法剤（ＮＭＣ）を対象に投与し；（ｉｉｉ）ＮＭＣ投与後に増殖リンパ球を投与することによっても行われ得る。自家ＴＩＬは、例えば摘除された腫瘍の間質から、例えば腫瘍を機械的に又は酵素的に（例えばコラゲナーゼ又はＤＮａｓｅを使用して）脱凝集させることによって得ることができる。或いは、例えば細胞が、混合リンパ球腫瘍細胞培養で濃縮されるか又は自家抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされる抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作される場合、それらは血液由来であり得る。

Ｔ細胞などの腫瘍浸潤リンパ球を含むリンパ球の増殖は、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかにより遂行され得る。例えば、Ｔ細胞は、フィーダーリンパ球及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１又はそれらの組み合わせの存在下で非特異的なＴ細胞受容体刺激を使用して増殖させ得る。非特異的なＴ細胞受容体刺激物は、例えばマウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（例えばＬＳ Ｂｉｏ，Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡから入手可能）の刺激量を含み得る。或いは、Ｔ細胞は、（エピトープなどのその抗原部分を含む）１つ以上の抗原によるインビトロでの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激により迅速に増殖させ得、これは、場合により、Ｔ細胞増殖因子、例えばインターロイキン−２又はインターロイキン−１５などの存在下でヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチドなど、任意選択によりベクターから発現され得、インターロイキン−２が好ましい。インビトロ誘導性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞上に対してパルス処理される癌の同じ抗原での再刺激により迅速に増殖する。或いは、Ｔ細胞は、照射済み自家リンパ球で、又は照射済みＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びインターロイキン−２で再刺激され得る。

増殖させたＴＩＬの特異的な腫瘍反応性は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって、例えば腫瘍細胞との同時培養後にサイトカイン（例えばインターフェロン−ガンマ）放出を測定することによって、試験され得る。例えば、養子細胞移植は、細胞の迅速な増殖前にＣＤ８＋Ｔ細胞に対して培養ＴＩＬを濃縮することを含み得る。インターロイキン−２を含有する培地中でのＴＩＬの培養後、Ｔ細胞では、ＣＤ４＋細胞を枯渇させ、例えばＣＤ８マイクロビーズ分離を使用してＣＤ８＋細胞について濃縮する。一部の実施形態において、自家Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進するＴ細胞増殖因子は、自家Ｔ細胞と同時に、又は自家Ｔ細胞に続いてのいずれかで対象に投与される。Ｔ細胞増殖因子は、自家Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進する何らかの適切な増殖因子であり得る。適切なＴ細胞増殖因子の例としては、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びＩＬ−２１が挙げられ、これらは、単独で使用してもよいし、又はＩＬ−２及びＩＬ−７、ＩＬ−２及びＩＬ−１５、ＩＬ−７及びＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５又はＩＬ−１２及びＩＬ２など、種々の組み合わせで使用してもよい。

養子細胞療法は、遺伝子修飾された末梢Ｔ細胞、即ち、一般的にはＭＨＣ制限Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は非ＭＨＣ制限合成キメラ抗原受容体のいずれかからなる抗原特異的な受容体の遺伝子移入により形成される腫瘍標的化Ｔ細胞を使用しても行われ得る（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２１（２），２１５−２２３（２００９）；Ｋａｌｏｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１１；３：９５ｒａ７３；及びＧｒｕｐｐ ＳＡ，ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６８：１５０９−１５１８も参照）。このアプローチを使用して、非常に貪欲な抗腫瘍Ｔ細胞を同定し、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする遺伝子をクローニングし、レトロウイルスに挿入する。次に、レトロウイルス上清を作製し、Ｔ細胞受容体を正常リンパ球に挿入するために使用する。次に、蛍光活性化細胞分類分析によって、及びＨＬＡ−Ａ２⁻８８８黒色腫株ではなくＨＬＡ−Ａ２^＋５２６黒色腫株のインビトロでの認識によって、Ｔ細胞受容体の発現を非形質導入（ＵｎＴｄ）及び形質導入（Ｔｄ）細胞において比較する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２００８ Ａｐｒ；８４（４）：２９９−３０８）。Ｑａｓｉｍ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．９，ｅａａｊ２０１３（２０１７）に記載のものなど、ユニバーサルタイプのＴ細胞も使用され得る。例えば、レンチウイルス形質導入と組み合わせてＴＡＬＥＮ介在性細胞操作を使用してユニバーサルＣＡＲ１９ Ｔ細胞を作製し、養子細胞療法で使用し得る。この細胞は、非ヒト白血球抗原適合ドナー細胞のレンチウイルス形質導入及びＴ細胞受容体α鎖及びＣＤ５２遺伝子座の同時転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）介在性遺伝子編入により作製される。

次に、点滴により、例えば静脈内もしくは動脈内点滴又は他の適切な送達形態により、増殖させた細胞を宿主に投与し、これは、一般的には約３０〜約６０分間続くが、より短いか又はより長い持続時間が必要とされ得る。例えば、約１ｘ１０^１０個のリンパ球〜約１５ｘ１０^１０個のリンパ球が一般的には投与される。投与の他の経路としては、腹腔内、くも膜下腔内及びリンパ内注射が挙げられる。場合により種々の薬学的に許容可能な添加物、結合剤、充填剤、担体、保存剤、安定化剤、乳化剤、緩衝液などのいずれかを含み得る適切な培地中で増殖させた細胞を提供する。希釈剤及び賦形剤としては、水、食塩水及びグルコースが挙げられる。代表的な培地としては、例えば約５．５〜８．０の正常ｐＨ範囲を有するＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，Ｔｙｐｅ １，ＵＳＰ；ヒト血清又は胎児ウシ血清を含有する組織培養培地；又は異種成分不含及び血清不含培地、例えばＰＲＩＭＥ−ＸＶ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＸＳＦＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などが挙げられるが限定されない。市販培地としては、ＲＰＭＩ １６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＡＩＭ Ｖ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）及びＸ−ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が挙げられる。

長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬
本明細書に記載される方法は、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与を含む。これに関連して、本開示は、その作動薬が同じインビトロモデルにおけるＩＬ−２Ｒαβへの結合親和性よりも少なくとも５倍高い（より好ましくは少なくとも１０倍高い）ＩＬ−２Ｒβへのインビトロ結合親和性を呈し、非修飾ＩＬ−２よりも少なくとも１０倍有効なインビボ半減期（ＩＬ−２のインビボ消失に基づく半減期）を有する限り、いかなる特定の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬にも限定されない。例として、ＩＬ−２に対する親和性を基準として計測することが可能である。この点で、実施例１で言及し、以下に記載のＲＳＬＡＩＬ−２分子は、ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒαβに対する親和性の約６０倍の低下を示すが、ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する親和性は僅か約５倍しか低下していない。従って、例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬はＲＳＬＡＩＬ−２である。

長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の非限定例は、国際公開第２０１２／０６５０８６号パンフレット及び同第２０１５／１２５１５９号パンフレットに記載されている。例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は本出願の実施例１に言及されるＲＳＬＡＩＬ−２であり、放出可能ＰＥＧは下記で示されるとおりの２，７，９−置換フルオレンをベースとし、ポリ（エチレングリコール）鎖は、中央のフルオレン環の２及び７位からアミド結合（フルオレン−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ〜）を介して延在して、分枝状ＰＥＧを与える。フルオレニルをベースとする分枝状ＰＥＧ部分は、インターロイキン−２部分のアミノ基に放出可能に共有結合される。ＩＬ−２部分アミノ基とフルオレニルに基づく分枝状ＰＥＧ部分との間の結合は、フルオレン環の９位への、メチレン基（−ＣＨ_２−）を介して連結されるカルバメート結合である。この一般的構造を有する放出可能なＰＥＧは、一般的には、ＩＬ−２に共有結合されるＰＥＧ部分をゆっくりと放出させるために生理的条件下でβ脱離反応を経る。投与後、連続的にＰＥＧ部分が放出されると考えられる。

この点で、一部の好ましい実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、以下の式、式Ｉ：
（式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、各「ｎ」は約３〜約４０００の整数である）により包含される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む。各「ｎ」に対する代表的な範囲（即ち各ＰＥＧ「アーム」）としては、例えば約４０〜約５５０の整数又は約６０〜約５００の整数又は約１１３〜約４００の整数が挙げられる。好ましい実施形態において、約で示される直鎖状ＰＥＧアームのそれぞれにおける「ｎ」は約２２７である。

１つ以上の実施形態において、前の段落で示されるような式を有する長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、以下の式、式ＩＩ：
（式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、「ｍ」（ＩＬ−２に結合するポリエチレングリコール部分の数を指す）は、１、２、３、７及び＞７からなる群から選択される整数である）により包含される化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、（モル濃度量に対して）１０％以下、好ましくは（モル濃度量に対して）５％以下のものを含有する組成物を含む組成物中に含まれる。

一部の実施形態において、例えば、式Ｉに関連して、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、ＩＬ−２に放出可能に結合する平均約６個の分枝状ポリエチレングリコール部分を保持する。一部のさらなる実施形態において、例えば式Ｉに関して、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、一般に、不活性プロドラッグ、即ち投与時に不活性であると考えられ、インビボでのポリエチレングリコール部分の徐放の理由で、最初に投与されるコンジュゲートよりも結合するＰＥＧ部分が少なく、腫瘍部位での濃度保持を達成するのに有効であるインターロイキン−２の活性コンジュゲート形態を提供する。

ＲＳＬＡＩＬ−２のさらなる例示的な組成物は、分子の全てのポリマー部分が約２５０ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する上記の式に係る化合物を含む。さらなる好適な範囲としては、約１，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンから選択される範囲、約５，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン〜約５５，０００ダルトンの範囲、約１５，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの範囲、及び約２０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量が挙げられる。

ポリエチレングリコールポリマー部分のさらなる例示的な重量平均分子量としては、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンが挙げられる。一部の実施形態において、ポリエチレングリコールポリマーの重量平均分子量は約２０，０００ダルトンである。

上記のとおり、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。典型的には、かかる塩は薬学的に許容可能な酸又は酸等価物との反応によって形成される。これに関連して用語「薬学的に許容可能な塩」は、概して、比較的非毒性の無機酸及び有機酸付加塩を指し得る。これらの塩は、投与媒体又は剤形製造過程においてインサイチューで、又は別途本明細書に記載されるとおりの長時間作用型インターロイキン−２を好適な有機酸又は無機酸と反応させて、そのようにして形成された塩を単離することにより調製し得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、シュウ酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）「薬学的塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ）」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。従って、記載されるとおりの塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来してもよく；又は酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などの有機酸から調製されてもよい。

前述のＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬に関して、用語「ＩＬ−２」は、本明細書で使用されるとき、ヒトＩＬ−２活性を有する部分を指す。用語、「残基」は、ＩＬ−２の残基の文脈では、上記の式に示されるとおり、ＩＬ−２分子のうち１つ以上の共有結合部位においてポリエチレングリコールなどのポリマー剤との共有結合後に残る部分を指す。非修飾ＩＬ−２がポリエチレングリコールなどのポリマーに共有結合すると、その１つ以上のポリマーとの連結に付随する１つ以上の共有結合の存在によってＩＬ−２は僅かに変化することが理解されるであろう。ポリエチレングリコール部分などの別の分子に結合するＩＬ−２のこの僅かに改変された形態は、本明細書中で、一部の例においてＩＬ−２の「残基」と呼ばれ得るが、ＩＬ−２のポリエチレングリコールコンジュゲートに関して、このようなコンジュゲートにおけるＩＬ−２への言及が、例えばＩＬ−２分子内のアミノ基（例えばリジン）が１つ以上のＰＥＧ部分に共有結合されるＩＬ−２のこのような僅かに改変された形態を包含することを理解されたい。

例えば、国際公開第２０１２／０６５０８６号パンフレットに記載の配列番号１〜４のいずれか１つに対応するアミノ酸配列を有するタンパク質は、実質的にそれと相同のいずれかのタンパク質又はポリペプチドであるので、例示的なＩＬ−２タンパク質であると見なされる。これらの例示的なインターロイキン−２配列も本明細書で提供され、次のもの：シグナルペプチド配列を含むヒトインターロイキン−２、ヒトインターロイキン−２、アルデスロイキン及びインターロイキン−２特異的な作動薬（ＢＡＹ５０−４７９８とも呼ばれる）が挙げられる。用語「実質的に相同」とは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が１つ以上の置換、欠失、又は付加だけ参照配列と異なるが、その正味の効果は参照配列と対象配列との間に有害な機能的相違をもたらさないものであることを意味する。本明細書の目的上、９５パーセントより高い相同性、等価な生物学的活性（必須ではないが等価な生物学的活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同と見なされる。相同性を決定する目的上、成熟配列のトランケーションは無視しなければならない。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−２」には、例えば部位特異的突然変異誘発によるとおり意図的に修飾されるか、又は突然変異を通じて偶発的に修飾されたタンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、１〜６つのさらなるグリコシル化部位を有する類似体、タンパク質のカルボキシ端側末端に少なくとも１つのさらなるアミノ酸を有する類似体であって、そのさらなる１つ以上のアミノ酸が少なくとも１つのグリコシル化部位を含む類似体、及び少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類似体も含まれる。この用語には、天然の部分及び組換え生成された部分の両方が含まれる。加えて、ＩＬ−２は、ヒト供給源、動物供給源、及び植物供給源に由来し得る。ある例示的で好ましいインターロイキン−２は、アルデスロイキンと呼ばれる組み換えＩＬ−２である。アルデスロイキン（配列番号３）は、グリコシル化されていない点でネイティブＩＬ−２とは異なるが、それは、これがＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来であるからであり、Ｎ末端アラニンがなく、アミノ酸位置１２５でシステインが置換されてセリンを保持する。

化合物の放射標識、そのインビボ投与、及びそのクリアランスの決定が関わるものなどの従来手法を用いて、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬であると提案される化合物が「長時間作用型」であるかどうかを決定することができる。本明細書における目的上、ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の性質は、典型的には、マウスにおいて評価しようとする作動薬の投与後の様々な時点でフローサイトメトリーを用いてリンパ球のＳＴＡＴ５リン酸化を計測することにより決定される。参考として、ＩＬ−２では約２４時間までにシグナルが失われるが、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬についてはそれより長い期間持続する。例示として、ＲＳＬＡＩＬ−２の組成物についてシグナルは数日間持続する。

ここで本明細書に記載される長時間作用型作動薬のＩＬ−２Ｒβバイアスを考慮して、実施例２は、ＲＳＬＡＩＬ−２の例示的組成物についての受容体バイアスに関連するインビトロ及びインビボデータの両方を提供する。実施例２に記載されるとおり、マウス黒色腫腫瘍モデルにおいて、ＩＬ−２と比較した場合のＲＳＬＡＩＬ−２についてのＣＤ８／制御性Ｔ細胞の比は、ＩＬ２受容体アルファと比べたＩＬ−２受容体ベータの優先的な活性化を裏付ける。例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬、例えばＲＳＬＡＩＬ−２は、例えばＴｒｅｇと比べてエフェクターＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞を優先的に活性化させ、拡大するために有効である。

さらに、代表的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬、例えばＲＳＬＡＩＬ−２は、ＩＬ−２と比べて増加した腫瘍曝露、好ましくは有意に増強された腫瘍曝露、例えばＩＬ−２の等価物について正規化した場合、少なくとも５０倍増加した曝露、又は少なくとも１００倍増加した曝露、又は少なくとも２００倍増加した曝露、又は少なくとも３００倍増加した曝露、又は少なくとも４００倍増加した曝露、又は少なくとも５００倍増加した曝露を提供する。例示として、マウス黒色腫腫瘍モデルにおけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を実施例３に記載する。それに記載されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ−２は、例えばＩＬ−２と比べて５００倍（ＩＬ−２等価物に基づき正規化）、有意に増強された腫瘍曝露を提供することが見出された。

方法
本明細書に記載される長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の特徴の少なくとも１つ以上に基づき、エクスビボで培養し、増殖させた、自家もしくは同種異系の抗腫瘍Ｔ細胞又は本明細書中に記載のような他の細胞を投与することにより長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与前に癌患者において免疫応答を誘導し、続いて、免疫抑制Ｔｒｅｇの活性化を担うＩＬ２Ｒαサブユニットと相互作用する領域が遮断される長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を投与して、それにより優れた治療有効性を達成するために有効な方法が本明細書中に提供される。

本明細書に記載される方法によれば、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬はＩＬ−２Ｒβ活性化量で提供される。当業者は、どのくらいの所与の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬がＩＬ−２Ｒβにおける臨床的に有意味なアゴニスト活性をもたらすのに十分であるかを決定することができる。例えば、当業者は文献を参照してもよく、及び／又は一連の漸増量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を投与して、どの１つ以上の量がＩＬ−２Ｒβの臨床的に有意味なアゴニスト活性をもたらすかを決定してもよい。或いは、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の活性化量を、上記に記載されるインビボＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを用いて決定する（投与後にインビボで決定する）ことができ、ここではピーク時点でＮＫ細胞の１０％を上回るＳＴＡＴ５リン酸化を誘導するのに十分な量が活性化量と見なされる。

しかしながら、１つ以上の例において、ＩＬ−２Ｒβ活性化量は、タンパク質の量で表現される以下の範囲の１つ以上により包含される量である：約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ；約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ；約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ。一部の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、０．７ｍｇ／ｋｇ以下の用量において投与する。特定の例示的な投与量範囲には、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ又は約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．７ｍｇ／ｋｇ未満が含まれる。

確認のために言えば、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬に関して、活性化の量及び程度は大きく異なり得、養子細胞移植療法と合わせた場合になおも有効であり得る。即ち、ＩＬ−２Ｒβでごく最小限の作動薬活性を十分に長期間にわたり呈する長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の量は、養子細胞療法と併用して投与する場合に本明細書に記載される方法が臨床的意義のある応答を可能とする限り、なおも長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬であり得る。一部の例において、養子細胞移植療法が付随する場合、（例えば）相乗的相互作用及び応答に起因して、ＩＬ−２Ｒβの作動薬活性は最小限だけ要求され得る。

１つ以上の実施形態において、養子細胞移植は、長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与前に行われる。例えば、養子細胞移植に基づく細胞点滴は、長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与前、１時間まで、２時間まで、３時間まで、４時間まで、５時間まで、６時間まで、７時間まで、８時間まで、９時間まで、１０時間まで、１１時間まで、１２時間まで、１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、８日まで、９日まで、１０日まで、１１日まで、１２日まで、１３日まで、１４日まで、１５日まで、１６日まで、１７日まで、１８日まで、１９日まで、２０日まで、２１日まで、２２日まで、２３日まで、２４日まで、２５日まで、２６日まで、２７日まで、２８日まで、２９日まで、１か月まで、３か月まで、６か月まで、又は何らかのそれらの組み合わせですぐに行われ得る。

本明細書に記載される治療方法は、患者ケアを監督する臨床医がその治療方法を有効であると見なす限り継続され得る。治療方法が有効であることの指標となる非限定的パラメータには、以下のいずれか１つ以上が含まれる：腫瘍縮小（重量及び／又は容積の点で）；個別の腫瘍コロニーの数の減少；腫瘍消失；及び無進行生存。腫瘍サイズの変化は、任意の好適な方法、例えばイメージングにより決定することができる。様々な診断イメージングモダリティ、例えばコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、二重エネルギーＣＤＴ、陽電子放出断層撮影及びＭＲＩを用いることができる。

長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の実際の用量、並びに本明細書中に記載される方法に関連する投与レジメンは、対象の年齢、体重及び全身状態並びに治療下の癌の種類及び進行、医療専門家の判断、並びに投与される特定の養子細胞移植療法及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬に応じて異なる。

養子細胞移植及び長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与の頻度及びスケジュールに関して、当業者は適切な頻度を決定することが可能であろう。例えば臨床医は、治療サイクルにおいて、養子細胞移植と同時に又は好ましくは養子細胞移植後のいずれかでの長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与と併用して養子細胞移植を行い得る。例えば一部の治療モダリティにおいて、長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬を養子細胞移植の７日以内に（例えば１、２、３、４、５、６又は７日目のいずれか１日に）投与する。一部の例において、長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬を養子細胞移植の４日以内、例えば１、２、３又は４日目のいずれか１日に投与する。ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の長時間作用性質に基づき、このような化合物は、典型的には、比較的低頻度で（例えば３週間に１回、２週間に１回、８〜１０日に１回、週に１回など）投与する。

治療過程に関連する例示的な時間の長さには、約１週間；約２週間；約３週間；約４週間；約５週間；約６週間；約７週間；約８週間；約９週間；約１０週間；約１１週間；約１２週間；約１３週間；約１４週間；約１５週間；約１６週間；約１７週間；約１８週間；約１９週間；約２０週間；約２１週間；約２２週間；約２３週間；約２４週間；約７ヵ月；約８ヵ月；約９ヵ月；約１０ヵ月；約１１ヵ月；約１２ヵ月；約１３ヵ月；約１４ヵ月；約１５ヵ月；約１６ヵ月；約１７ヵ月；約１８ヵ月；約１９ヵ月；約２０ヵ月；約２１ヵ月；約２２ヵ月；約２３ヵ月；約２４ヵ月；約３０ヵ月；約３年；約４年；約５年が含まれる。一般的には、患者に１ラウンドの養子細胞移植が提供され、続いて１回以上、長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が投与されるが、一部の例においては、養子細胞移植の１回以上のさらなるサイクルが行われ得る。

本明細書に記載される治療方法は、典型的には、患者ケアを監督する臨床医がその治療方法を有効である、即ち患者が治療に応答していると見なす限り継続される。治療方法が有効であることの指標となる非限定的なパラメータには、以下の１つ以上が含まれ得る：腫瘍縮小（重量及び／又は容積及び／又は外観の点で）；個別の腫瘍コロニーの数の減少；腫瘍消失；無進行生存；好適な腫瘍マーカーによる適切な応答（該当する場合）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞数の増加、Ｔ細胞数の増加、メモリーＴ細胞数の増加、セントラルメモリーＴ細胞数の増加、制御性Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの数の低下。

本明細書中で提供される方法は、（特に）癌に罹患している患者の治療に有用である。例えば、患者は、養子細胞移植単独、並びに長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬との併用に応答性であり得るが、その併用に対してより応答性が高くなる。さらなる例として、患者は、養子細胞移植又は長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬のいずれかに対して非応答性であり得るが、併用には応答性である。またさらなる例として、患者は、養子細胞移植又は長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬のみのいずれかに対して非応答性であり得るが、その併用に対して応答性である。

長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与は、典型的には注射によるものである。肺内、鼻内、頬側、直腸、舌下及び経皮など、他の投与方法もまた企図される。本明細書で使用されるとき、用語「非経口」には、皮下、静脈内、動脈内、腫瘍内、リンパ管内、腹腔内、心臓内、くも膜下腔内、及び筋肉内注射、並びに点滴注射が含まれる。上記のとおり、養子細胞及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、別個に投与することができる。或いは、初回用量として、又は治療過程全体にわたり、又は投与レジメンの様々な段階において、養子細胞移植及び長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与の提供が同時であることが所望される場合（及び細胞及び長時間作用型のＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が、一緒に、及びある所与の製剤中で適合する）、単回剤形／製剤の点滴（例えば両方の免疫学的成分を含有する静脈内製剤の静脈内投与）により同時投与を達成し得る。

ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の患者への投与は、例えばＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬（例えばＲＳＬＡＩＬ−２）及び希釈剤を含む組成物の注射を通じて達成し得る。可能な希釈剤に関して、希釈剤は、注射用静菌水、水中デキストロース５％、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、乳酸加リンゲル溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

本明細書中に記載の治療の併用は、養子細胞移植との併用のための説明書を付随する長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬を含むキット形態でも提供され得る。上記のように、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬は、任意選択により１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を伴う単回投与組成物中に含まれ得る。好適な薬学的に許容可能な賦形剤には、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，７^ｔｈｅｄ．，Ｒｏｗｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２に記載のものが含まれる。キット成分は、液体又は固体形態のいずれかであり得る。ある好ましい実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、固体形態である。好ましい固体形態は、例えば５重量パーセント未満の水、又は好ましくは２重量パーセント未満の水を含有する固体乾燥形態であるものである。固体形態は一般に水性希釈剤中での再構成に適切であり、水性希釈剤もキット中で提供され得る。

ここに記載した方法、キット及び関連組成物は、本明細書に記載される方法により治癒又は予防し得る任意の病態、例えば癌に罹患している患者の治療に使用することができる。癌は液性癌又は固形癌であり得る。例示的な状態は、癌、例えば、黒色腫、腎臓癌、非小細胞肺乳癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）（例えばトリプルネガティブ乳癌）、膀胱癌、頭頸部癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、脳癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び白血病などである。

一部の特定の実施形態において、治療すべき癌は固形癌である。

また一部のさらなる実施形態において、治療すべき癌は、例えば、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌及び副腎皮質癌から選択される。

また１つ以上のさらなる実施形態において、癌は、黒色腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌及び結腸癌から選択される。

１つ以上の特定の実施形態において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。トリプルネガティブ乳癌は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子増幅を欠く非常に悪性度の高い腫瘍である。

本方法、キット及び組成物は、例えば対象の応答を改善することによって、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与によって、養子細胞移植の治療有効性を促進するために有用である。増強された応答は、治療の間、単一の治療ラウンド後、２〜３つの治療サイクル後など任意の好適な時点において、及び多数の好適な方法のいずれか、例として、腫瘍の縮小（部分奏効）、即ち腫瘍サイズ又は容積の評価、腫瘍の消失、疾患進行の低下（癌は進行していない）、及び１つ以上の腫瘍試験マーカーの分析により適宜評価することができる。一部の例において、養子細胞移植単独で、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬単独でのいずれかでの治療、又は養子細胞移植及び対応する非長時間作用型のＩＬ−２（例えば同等数のＩＬ−２等価物を達成するように投与される）の併用治療と、養子細胞移植及びＲＳＬＡＩＬ−２などの長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬での治療とを比較する場合、５０％最大腫瘍成長間の時間遅延に関して治療の有効性の指標を測定し得る。比較は、ヒト患者において、又は好適な動物モデル、例えば好適なマウス癌モデルなどに実施することができる。

本明細書中で提供される方法、キット、組成物及び組み合わせは、治療を受けている対象において腫瘍成長を低下させるか又はサイズ（もしくは体積）を縮小させるためにも有用である。樹立腫瘍を有する対象への治療有効量の、例えば本明細書中で提供されるものなどの長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与と併用して養子細胞移植を使用する治療は、１つ以上の実施形態において、対象において腫瘍成長を低下させるか又はサイズを縮小させるために有効である。例えば一部の実施形態において、１つ以上の治療サイクルは、腫瘍サイズを治療前の腫瘍サイズと比較する場合に約２５％だけ、又は約３０％だけ、又は約４０％だけ、又は約５０％だけ、又はさらには約６０％だけ、又は約７０％以上だけ低下させるために有効である。

さらに一部の別の実施形態において、本明細書に提供される方法、キット、組成物、及び組み合わせは、癌の治療を受ける対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積を阻害するために有効である。一部の実施形態において、本方法は、例えば対応する癌の癌マウスモデルにおいて評価する場合、腫瘍中のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇからなる群から選択される制御性Ｔ細胞（即ち前述の細胞型のいずれか１つ以上）の蓄積を、ＡＣＴ単独、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬単独のいずれかの投与時又はＡＣＴ及び対応する非長時間作用型のＩＬ−２（例えば同等数のＩＬ−２等価物を達成するために投与される）の併用治療時に観察されるものと比べて増強される量だけ阻害するために有効である。

さらに一部の別の実施形態において、本明細書に提供される方法、キット、組成物、及び組み合わせは、対象におけるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞活性及び／又は増殖を刺激するために有効である。一部の実施形態において、本方法は、例えば対応する癌の癌マウスモデルにおいて評価する場合、対象におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加に有効である。さらに一部の他の実施形態において、本方法は、例えば対応する癌の癌マウスモデルにおいて評価する場合、対象におけるＮＫ細胞数を増加させるために有効である。

実施例について見ると、実施例４及び５は、侵襲性マウス黒色腫モデルにおいて養子細胞移植と併用したＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性の評価を記載する。このような実施例で詳述するように、養子細胞移植と併用した例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２での治療は、（特に）腫瘍にＴ細胞をロバストに移動させ、それらが耐久的に持続することが分かった。さらに、その効果は、養子細胞移植／非長時間作用型ＩＬ−２の併用で同様に治療した群と比較したときに非常に顕著であった。（対照及びＡＣＴ／ＩＬ−２の併用と比較した場合に）腫瘍成長遅延がＡＣＴ／ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法群について顕著に促進されただけでなく、脾臓中のＴ細胞増殖が向上し、ＲＳＬＡＩＬ−２治療群に対して腫瘍ホーミングも観察された。これらの結果から示唆されるように、養子細胞療法及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２の併用は、エフェクター細胞に対して偏りがあり、これは長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の単回投与後だけでなく、複数回投与後にも持続する。さらに、このエフェクター細胞への偏りは、正常組織と比較したとき、特異的に腫瘍において観察され、イメージング、フローサイトメトリー及びＩＨＣを含む独立した分析方法により裏付けられるように、インターロイキン−２治療と併用した養子細胞移植と比較した場合に顕著である。さらに、エフェクター細胞の持続性は、投与後の時点の長さによって、及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬（ＩＬ−２の投与と比較、続く投与により応答が低下）の複数回投与後に維持されるロバストな応答によっても示される。本明細書中に記載の併用免疫療法は、多くのＡＣＴに基づく療法とは対照的に、外部から送達されたエフェクター細胞の腫瘍部位での程度及び持続性（即ち保持）を向上させるために有効であり、それによって抗腫瘍効果が高まる。

このようにして、またさらなる態様において、本明細書中で、対象において外部から導入されたエフェクターＴ細胞の保持率を向上させる方法が提供され、この方法は、（ｉ）対象の癌性腫瘍から得て、培養し、エクスビボで増殖させたリンパ球を癌性腫瘍がある対象に導入すること、及び（ｉｉ）ＩＬ−２Ｒβ−活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬を対象に投与することを含み、それにより、その結果、ステップ（ｉ）のみからのリンパ球、即ち長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与なし、での対象の治療時に腫瘍部位で保持される導入リンパ球数と比較した場合に、又は非長時間作用型のインターロイキン−２（例えば同等数のＩＬ−２等価物を達成するために投与される）の投与と併用したステップ（ｉ）からのリンパ球での対象の治療時に腫瘍部位で保持される導入リンパ球数と比較した場合に、腫瘍部位で保持される導入リンパ球の数が多くなる。

腫瘍部位で保持される導入リンパ球数は、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与後のいずれかの適切な時点で、例えば長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の初回投与後、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目などに測定され得る。一部の好ましい実施形態において、導入リンパ球数は、細胞数を評価するためのいずれかの適切な方法を使用して、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の初回投与後、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目又は１６日目のいずれか１日に測定される。適切な方法としては、画像分析、フローサイトメトリー及びＩＨＣが挙げられるが限定されない。

本明細書において参照される全ての論文、書籍、特許、特許公報及び他の刊行物は、全体として参照により援用される。本明細書の教示と参照によって援用される技術との間に不一致が生じた場合、その教示の意味及び本明細書の定義が（特に本明細書に添付される特許請求の範囲で用いられる用語に関して）優先するものとする。例えば、本願及び参照によって援用される刊行物が同じ用語を別様に定義する場合、定義が載せられている文書の教示の範囲内でその用語の定義が維持されるものとする。

前述の説明並びに以下の例は例示を意図するもので、本開示の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本開示が関係する技術分野の当業者には、本発明の範囲内の他の態様、利点及び変形例が明らかであろう。

材料及び方法
アルデスロイキンのものと同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＩＬ−２をクローニングし、発現させ、使用して本明細書でＲＳＬＡＩＬ−２と称される例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬を調製した。

ＲＳＬＡＩＬ−２は、国際公開第２０１５／１２５１５９号パンフレットの実施例１の手順に従うと得ることが可能な組成物を指し、概してマルチＰＥＧ化形態のＩＬ−２を含む組成物であって、ここでコンジュゲートの形成に用いられるＰＥＧ試薬の結合は投与後に遊離可能である。以下実施例１も参照のこと。

実施例１
ＭＰＥＧ２−Ｃ２−ＦＭＯＣ−２０ＫＤ−ＮＨＳによるＲＩＬ−２のＰＥＧ化
１．４４ｍｇ／ｍｌの精製ｒＩＬ−２（１０６．４ｍＬ）を第１の容器に入れ、続いて５３．６ｍＬの製剤化緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、５％トレハロース）を加えた。ｐＨを測ると４．６２であり、温度を測ると２１．２℃であった。ＰＥＧ試薬のＣ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ−２０Ｋ（国際公開第２００６／１３８５７２号パンフレットに記載されるとおり利用可能）（１３．１ｇ）を第２の容器に入れ、続いて７３．３ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌを加えた。得られた溶液を手動で２５分間かき混ぜた。第１の容器にホウ酸ナトリウム（０．５Ｍ、ｐＨ９．８）を加えてｐＨを約９．１に上昇させ、次にＰＥＧ試薬が入った第２の容器の内容物を１〜２分間かけて第１の容器に加えた。次に８．１ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌを第２の容器に入れることによってリンスステップを行い、第１の容器に内容物を加えた。コンジュゲーション反応では、最終的なｒＩＬ−２濃度は０．６ｍｇ／ｍＬであり、ホウ酸ナトリウム濃度は１２０ｍＭであり、ｐＨは９．１±０．２であり、温度は２０〜２２℃であった。試薬の活性（置換レベル）を調整した後のＰＥＧ試薬とｒＩＬ−２とのモル比は３５：１であった。コンジュゲーション反応を３０分間進行させ、７５ｍＬの２Ｎ酢酸の添加による酸性化反応（ｐＨをほぼ４に降下させる）により停止させた。生成物を上記のとおりイオン交換クロマトグラフィーにより精製して主として４ｍｅｒ、５ｍｅｒ及び６ｍｅｒ（ｒ−ＩＬ−２に放出可能に共有結合しているＰＥＧ試薬の数を指す（８ｍｅｒ及びそれより高度なＰＥＧ化は、クロマトグラフィーに関連する洗浄ステップの間に取り除かれた）の組成物を提供した。この組成物は、本明細書で「ＲＳＬＡＩＬ−２」と称する。

実施例２
ＲＳＬＡＩＬ−２の受容体バイアス及び関連免疫療法特性
ＩＬ−２受容体に対する結合親和性及び免疫刺激プロファイルに関連する受容体バイアス：ＲＳＬＡＩＬ−２のＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒβへの親和性を表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００）により直接計測し、臨床的に利用可能なＩＬ−２（アルデスロイキン）と比較した。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して抗ヒト抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＣＭ−５センサーチップの表面に結合させた。次にヒトＩＬ−２Ｒα−Ｆｃ又はＩＬ−２Ｒβ−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかをこの表面にわたって捕捉リガンドとして使用した。酢酸塩緩衝液ｐＨ４．５に、５ｍＭから始まるＲＳＡＩＬ−２及びその活性ＩＬ−２コンジュゲート代謝産物（１−ＰＥＧ及び２−ＰＥＧ−ＩＬ−２）の段階希釈物を作成した。これらの希釈物をリガンドに５分間結合させて、結合した反応単位（ＲＵ）を濃度に対してプロットし、ＥＣ５０値を決定した。各ＩＬ−２受容体サブタイプに対する各アイソフォームの親和性をＩＬ−２と比べた倍数変化として計算した。

ＲＳＬＡＩＬ−２のインビトロ結合及び活性化プロファイルは、ＰＥＧ化がアルデスロイキンと比べてＩＬ２とＩＬ２Ｒαとの相互作用を妨害することを示唆し；これらの効果がインビボで免疫細胞サブタイプのプロファイルをバイアスするかどうかを決定するための調査を実施した。ＲＳＬＡＩＬ−２又はＩＬ２のいずれかの投与後の腫瘍中のＣＤ８Ｔ及びＴｒｅｇ細胞の数は、ＩＬ２の多面的効果がＩＬ２／ＩＬ２Ｒα界面におけるポリ（エチレングリコール）（ＲＳＬＡＩＬ−２中として）へのＩＬ２のコンジュゲーションに起因してシフトしたかどうかの重要な尺度である。この課題に対処するため、皮下Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫腫瘍を担持するマウスを単一用量のＲＳＬＡＩＬ−２又は５回用量のアルデスロイキンにより治療し、腫瘍微小環境中の免疫細胞をフローサイトメトリーにより定量した。結果を図１Ａ〜１Ｇに示す。

アルデスロイキン治療マウスの腫瘍中で総及びメモリーＣＤ８細胞は腫瘍浸潤リンパ球の割合として増加し；しかしながら、これらの効果は一過的であり、ビヒクルと比べて５日目に有意性を達成した。対照的に、有意な（Ｐ＜０．０５）及び持続される総及びメモリーＣＤ８Ｔ細胞刺激は単一ＲＳＬＡＩＬ−２投与後に達成され、メモリーＣＤ８（７日目）及び総ＣＤ８（７及び１０日目）の割合がアルデスロイキンと比べて優れていた。ＲＳＬＡＩＬ−２及びアルデスロイキン治療の両方は、治療開始５及び７日後に増加した活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をもたらしたが、この効果は１０日目までに縮小した。腫瘍浸潤リンパ球のＣＤ４細胞の割合は、５日目にビヒクルと比べてＲＳＬＡＩＬ−２治療後に縮小した。１０日目、ＲＳＬＡＩＬ−２は、ビヒクル及びアルデスロイキンと比較して少数のＣＤ４細胞割合をもたらした。ＣＤ４細胞集団を、Ｔｒｅｇ集団を定義するＦｏｘＰ３^＋サブセットについてさらに分析した。ＲＳＬＡＩＬ−２投与は全ての時点においてＴｒｅｇの割合を低下させ、ＰＥＧ鎖から生じるＩＬ２Ｒαサブユニットへの接近の低下と一致した。対照的に、アルデスロイキンによるＴｒｅｇ低下は穏やかであり、５日目に有意性を達成した。ＣＤ８Ｔ細胞の増加及びＴｒｅｇの低下は、７日目までに腫瘍中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の顕著な上昇をもたらした。ＲＳＬＡＩＬ−２、アルデスロイキン、及びビヒクルについてのＣＤ８／Ｔｒｅｇの比はそれぞれ４４９、１８、及び４であり、ＲＳＬＡＩＬ−２についてのＩＬ２受容体アルファと比べたＩＬ２受容体ベータの優先的な活性化を裏付けた。

免疫組織化学染色を実施し、ＣＤ８Ｔ細胞は数が増加しただけでなく、腫瘍細胞が散在したことを裏付けた。これらの結果は、ＲＳＬＡＩＬ−２が、腫瘍中のＴｒｅｇの等しい刺激なしで非修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）について見られるものよりもロバストなインビボメモリーエフェクターＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導するために有効であることを示し、インビトロＩＬ２Ｒβ選択的結合プロファイルと一致する。即ち、ＲＳＬＡＩＬ−２はＴｒｅｇと比べてエフェクターＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞を優先的に活性化させ、拡大するために有効である。

実施例３
ＲＳＬＡＩＬ−２の腫瘍曝露
本試験の目的は、アルデスロイキンと比較した場合の、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を評価することであった。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞（１匹の動物当たり１×１０^６個）を右脇腹中に皮下移植した。移植７日後、２００ｍｍ^３の腫瘍が計測された場合、動物にＲＳＬＡＩＬ−２（２ｍｇ／ｋｇ×１）又はアルデスロイキン（３ｍｇ／ｋｇ、毎日×５）を投与した。腫瘍を回収し（観察時間当たりｎ＝４）、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）及び０．２５％酢酸を含有する氷冷ＰＢＳ中で均一化し、遠心分離して上清を得た。腫瘍組織中のＲＳＬＡＩＬ−２レベルを定量するため、上清をｐＨ９緩衝液中で３７℃において一晩インキュベートすることによりＰＥＧをＩＬ２から放出させた。ヒトＩＬ２に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡによりＩＬ２を計測した。ＡＵＣを計算するため、ノンコンパートメントモデルを使用してデータをＰｈｅｏｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎによりフィットさせた。１日目のＡＵＣに基づき５を乗算してアルデスロイキン後のＡＵＣを推定した。

図２に示されるとおり、腫瘍アルデスロイキンレベルはＣ_ｍａｘに急速に達し、次に急速に降下し、各々の投与２４時間後の＜４ｎｇ／ｇの濃度及び０．０９±０．０２μｇ／時間／ｇの１日ＡＵＣをもたらした。対照的に、ＲＳＬＡＩＬ−２は、単一投与８日後まで腫瘍中で検出可能であり、３０±６．９μｇ／時間／ｇのＡＵＣを達成した。ＡＵＣに基づき、ＲＳＬＡＩＬ−２を使用して７．５倍少量のＩＬ２等価物を投与した場合であっても（３ｍｇ／ｋｇ 毎日×５＝１５ｍｇ／ｋｇ対２ｍｇ／ｋｇ）、ＲＳＬＡＩＬ−２の単一用量は５日用量のアルデスロイキンと比較して６７倍高い曝露をもたらした。従って、ＩＬ２等価物に基づき曝露を正規化すると、ＲＳＬＡＩＬ−２はアルデスロイキンと比べて５００倍の曝露増加を達成した。ＲＳＬＡＩＬ−２の活性コンジュゲートＩＬ−２形態（２−ＰＥＧ−ＩＬ２及び１−ＰＥＧ−ＩＬ２の全体）も定量し、５日目まで腫瘍中で検出可能のままであり、２３±４．４μｇ／ｇのＡＵＣを生じさせた。従って、活性コンジュゲートＩＬ２への曝露はアルデスロイキンと比較して５０倍高く、換言すると等価用量のアルデスロイキンと比べて３８０倍の曝露増加であった。従って、ＲＳＬＡＩＬ−２の腫瘍曝露は、アルデスロイキンについての２つの５日サイクルについての１日２回と比較してマウスにおける９日に１回の投与を可能とした。

実施例４
高悪性度マウス黒色腫モデルにおけるＡＣＴと併用したＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性の評価
ｐｍｅｌ−１ ＡＣＴ／ＢＬ６黒色腫腫瘍モデルを使用して、ＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を試験し、腫瘍特異的なＴＣＲトランスジェニックＴ細胞におけるその効果を評価した。Ｄ６（６日目）における５００ｃＧｙの線量のイオン化放射線でのリンパ球枯渇後、０日目（Ｄ０）に、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植した。Ｄ７に、ＡＣＴ（１μｇ／ｍｌ抗原ｇｐ１００でインビトロにて活性化したＴリンパ球）＋ＲＳＬＡＩＬ−２（０．８ｍｇ／ｋｇ、ｑ９ｄｘ３、ｉ．ｖ．）の併用、又はＣ５７／ＢＬ６Ｔ細胞＋ＰＢＳ（ビヒクル対照）でマウスを治療した。ビヒクル対照マウス（ｎ＝１２）の腫瘍は、治療後１２日で１５００ｍｍ^３エンドポイントまで急速に成長したが、一方でＲＳＬＡＩＬ−２／ＡＣＴ併用群（ｎ＝１２）では３５日で１／１２のみがエンドポイントに達した。生体発光イメージングを使用して、抗原特異的なＴ細胞のインビボでの分布及び腫瘍ホーミングを可視化した。興味深いことに、ＲＳＬＡＩＬ−２／ＡＣＴ投与後、レポーターＴ細胞がＤ７まで脾臓で保持され、Ｄ９で腫瘍への移動が見られ得、Ｄ１２で生体発光のピークに達し、従来のＩＬ−２治療マウスで通常観察される５日と比較して遅れていた。ビヒクル対照動物の場合のＤ７に対して、Ｄ２０までシグナルが保持された。これらのデータから、ＡＣＴと併用したＲＳＬＡＩＬ−２が、高悪性度Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおいて、忍容性に優れ、ロバストな抗腫瘍応答を提供することが示唆される。ＲＳＬＡＩＬ−２及びＡＣＴ療法での治療により、Ｔ細胞が腫瘍へとロバストに移動し、そこでＴ細胞が耐久的に存続する。ＲＳＬＡＩＬ−２のロバストで長時間持続する効果は、細胞に基づく治療とのその併用を裏付ける。

同様の研究をキメラマウス／ヒトＭＨＣ分子を発現するように操作されたＢ１６−Ａ２／Ｋマウス黒色腫又はＥＬ−４−Ａ２／Ｋマウスリンパ腫の腫瘍で行う。

実施例５
マウス黒色腫モデルにおけるＡＣＴと併用したＲＳＬＡＩＬ−２又はＩＬ−２の抗腫瘍活性の評価
Ｄ−７（−７日目）に、Ｃ５７／ＢＬ６マウスの皮下にＢ１６Ｆ１０（０．５×１０^６個／動物）同系マウス黒色腫細胞株を移植し、Ｄ−１（−１日）に５００ｃＧｙ線量のイオン化放射線でリンパ球を枯渇させた。Ｄ０（０日目）に、ＡＣＴ（１μｇ／ｍｌ ｇｐ１００によりインビトロで活性化したｐｍｅｌ−１ ｇｐ１００ ＴＣＲトランスジェニックＴリンパ球）及びＲＳＬＡＩＬ−２（０．８ｍｇ／ｋｇ、ｑ９ｄｘ３、ｉ．ｖ．）の併用で、又はＩＬ−２（アルデスロイキン、０．４ｍｇ／ｋｇ、ｑｄＸ３、９日ごと、３サイクル、ｉ．ｐ．）又はビヒクルでマウスを治療した。２回目及び３回目の治療サイクルにはＡＣＴを含めなかった。ビヒクル対照は実施例４と同じであった。図３は、使用した投与ストラテジーの模式的な説明を提供する。

図４で示される結果から分かり得るように（ＳＥＭ対時間により判定した場合の平均腫瘍体積（ｍｍ^３）のプロット）、ＡＣＴと併用して投与した場合のＲＳＬＡＩＬ−２は、投与頻度をより少なくしてＡＣＴと併用したＩＬ−２と比較したとき、腫瘍成長遅延が有意であった（ＩＬ−２と併用したＡＣＴと比較した場合、ｐ＜０．０００１）；（＃ビヒクルと併用したＡＣＴと比較してｐ＜０．０００１（ボンフェローニ検定を使用したペアワイズ比較）。プロットを考える場合、黒丸はＡＣＴ＋ビヒクルを表し（上のプロット）；黒四角はＡＣＴ＋ＩＬ−２を表し（中央のプロット）；黒三角はＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２を表す（下のプロットは約２５日目の後まで注目すべき腫瘍成長が基本的にない。

図５で例示されるように腫瘍成長遅延をさらに評価し、１０００ｍｍ^３の腫瘍体積を達成するための時間を内挿することによって、腫瘍成長遅延を各腫瘍成長曲線に対して評価した（^＊ＡＣＴ＋ＩＬ−２と比較してｐ＜０．０００１；＃ビヒクルと比較してｐ＜０．０００１（Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）；Ｎ＝１２／群。最も左端のプロットは、ビヒクルと併用してＡＣＴを投与した治療群を表し；中央のプロットは、ＩＬ−２と併用してＡＣＴを投与した治療群を表し；最も右端のプロットは、ＲＳＬＡＩＬ−２と併用してＡＣＴを投与した治療群を表し、他の２つの治療群と比較した場合、最も注目すべき腫瘍成長遅延が明らかになる。見ると分かるように、ＲＳＬＡＩＬ−２及びＡＣＴの併用の場合に最も顕著な腫瘍成長遅延が観察された。

インビボ生体発光イメージング：養子移植したリンパ球のインビボ生体発光イメージング（ＢＬＩ）を行った。Ｐｍｅｌ−１トランスジェニックＴ細胞に対してレトロウイルス−ホタルルシフェラーゼを用いて形質導入を行い、ＡＣＴに対して可視化できるようにするために使用した。ＡＣＴ／ビヒクル又はＡＣＴ／ＩＬ−２群とは対照的に、ＡＣＴ／ＲＬＳＡＩＬ−２併用の場合、５及び１４日目の代表的図面、５匹反復マウス／群、から、脾臓でのＴ細胞増殖及び腫瘍への移動及び腫瘍での存続が明らかになった。

図６Ａ及び６Ｂは、ルシフェラーゼを発現するｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞のＡＣＴ後、１９日目までの脾臓（図６Ａ）及び腫瘍（図６Ｂ）の関心のある領域（ＲＯＩ）における連続画像の定量化を提供する（カウント／ピクセル）。図６Ａ：上のプロット、黒三角：示されるとおりのＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２；中央のプロット、黒四角：ＡＣＴ＋ＩＬ−２；下のプロット、黒丸：ＡＣＴ＋ビヒクル；図６Ｂ：上のプロット、黒三角：示されるとおりのＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２；中央のプロット、黒四角：ＡＣＴ＋ＩＬ−２；下のプロット、黒丸：ＡＣＴ＋ビヒクル）。

単回ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２治療は、ＩＬ−２＋ＡＣＴ又はビヒクルの３回の１日用量と比較した場合、５日目から９日目に、脾臓においてＴ細胞増殖を統計学的に有意に増加させることを示した（図６Ａ）。経時的なルシフェラーゼシグナルは、５日目から７日目のＡＣＴ＋ＩＬ−２又はＡＣＴ＋ビヒクル治療群と比較した場合、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２治療群において腫瘍浸潤エフェクターＴ細胞のより強いピークを示した。ＲＳＬＡＩＬ−２の２回目の投与を９日目に行ったところ、１２日目から１７日目に、脾臓において（図６Ａ）及び腫瘍（図６Ｂ）においてエフェクターＴ細胞の第２の増殖が惹起された。対照的に、２回目のＩＬ−２治療後、脾臓又は腫瘍での増殖はなかった（^＊＊ＩＬ−２＋ＡＣＴと比較してｐ＜０．０００１、＃ＡＣＴ＋ビヒクルと比較してｐ＜０．０００１、テューキー検定を用いたペアワイズ比較、ｎ＝５、平均±ＳＥ）。

腫瘍及び脾臓免疫学的分析：治療後５日目に腫瘍及び脾臓を回収した（単回投与ＲＳＬＡＩＬ−２及びＩＬ−２のｑｄｘ３）。フローサイトメトリーによって制御性Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＲＳＬＡＩＬ−２の効果を評価した。図７Ａ〜７Ｂは、腫瘍におけるある種のタイプの免疫細胞数を例示するプロットであり；図７Ｃは、治療群のそれぞれに対してＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（腫瘍）を与える。同様に、図８Ａ〜８Ｂは、脾臓における免疫細胞数を示すプロットであり、一方で図８Ｃは、治療群のそれぞれに対するＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（脾臓）を与える。

より具体的には、図７Ａは、治療群それぞれに対する腫瘍におけるＴｈｙ１．１ＣＤ８細胞数を例示する（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図７Ｂは、治療群のそれぞれに対する腫瘍中のＣＤ４ Ｔ ｒｅｇの数を例示する（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図７Ｃは、上記のような治療群のそれぞれに対する、腫瘍におけるＴｒｅｇに対するＣＤ８細胞数の比を与える。

ここで脾臓に移ると、図８Ａは、治療群のそれぞれに対する、脾臓中のＴｈｙ１．１ＣＤ８細胞の数を例示する（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図８Ｂは、治療群のそれぞれに対する、脾臓中のＣＤ４ Ｔ ｒｅｇ数を例示する（バーあたり、左から右に、ＡＣＴ＋ビヒクル；ＡＣＴ＋ＩＬ−２及びＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２）。図８Ｃは、上述のような治療群のそれぞれに対する、脾臓におけるＴｒｅｇに対するＣＤ８細胞の数の比を与える。

腫瘍において、免疫細胞の絶対数を腫瘍重量（グラム）に対して正規化し、グラフにした。結果に基づき、ＡＣＴ＋ＩＬ−２又はＡＣＴ＋ビヒクル治療群と比較したとき、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２治療がｐｍｅｌ−１ ＣＤ８Ｔ細胞を増加させ、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を増幅させたことが分かった。ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、ＲＳＬＡＩＬ−２治療群については、脾臓よりも腫瘍においてより大きかった。独立ｔ検定（^＊＊、ｐ＜０．０５、バーは比較を示す、ｎ＝３）。

照射後の脾臓細胞回復は、治療後５日目の脾臓細胞数の判定時にＡＣＴ＋ＩＬ−２治療群と比較した場合、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２治療群について急速であったことも観察された。即ち、ＲＳＬＡＩＬ−２は、照射後に急速な脾臓細胞再増殖を誘導した。独立ｔ検定（^＊＊、ｐ＜０．０００１、バーは比較を示す）。図９参照。

マウス抗ＣＤ８抗体を用いてホルマリン固定／パラフィン包埋組織において免疫組織化学染色を行い；ＨＡＬＯ画像分析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ）を使用して分析を行った。図１０は、１２日目の腫瘍のＩＨＣ（免疫組織化学）である。図面は、群あたり３匹の異なるマウスの腫瘍におけるＣＤ８浸潤を示す。第１のカラム（「ｐｏｓ」）はＣＤ８染色を示し、第２のカラム（「ｐｏｓ ｈａｌｏ」）は、ＨＡＬＯソフトウェアにより分析したスライドであり、カラー画像において、青い点は陰性細胞であり、黄色から赤色の点はＣＤ８陽性細胞であり（黄色はＣＤ８低発現、赤色は高発現）、第３のカラムは、ＣＤ８Ｔ細胞に対して陽性の領域の５×拡大図である。カラム４及び５は、それぞれ抗体抗ＣＤ８の陰性染色、正常染色及びＨＡＬＯ分析である。カラム６はＨ＆Ｅ染色である。カラム１の暗色エリアは、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法に対するカラー画像のカラム２の黄色及び赤色の点に対応する。この図面は、２つの群間のＣＤ８発現の注目すべき差を示しており、ＡＣＴ＋ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法の場合にＣＤ８発現レベルが著しく高い。ＩＨＣは、非ポリマー修飾ＩＬ−２、アルデスロイキンでの治療と比較したときの、長時間作用型バイアス型ＩＬ−２Ｒβ−インターロイキン−２（ＲＳＬＡＩＬ−２）での治療の場合の腫瘍内ＣＤ８Ｔ細胞の持続性を示す。

図１１は、実施例５に記載のような、養子細胞移植の後の、ＩＬ−２（アルデスロイキン）又はＲＳＬＡＩＬ−２のいずれかの１回投与後９日目の組織損傷ＣＤ８Ｔ細胞の欠如を示す、正常、非腫瘍組織（腎臓及び肝臓）のＩＨＣである。

Claims (32)

1. 癌を有する対象を治療するための方法であって、
   （ｉ）前記対象から回収し、エクスビボで培養し、増殖させた腫瘍特異的な宿主Ｔ細胞を前記対象に投与することと、
   （ｉｉ）長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬のＩＬ−２Ｒβ−活性化量を前記対象に投与することと、
   を含む方法。
2. ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が、連続的にいずれかの順序で、又は実質的に同時に行われる、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｉ）がステップ（ｉｉ）の前に行われる、請求項１に記載の方法。
4. ステップ（ｉｉ）がステップ（ｉ）の前に行われる、請求項１に記載の方法。
5. ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が実質的に同時に行われる、請求項１に記載の方法。
6. ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）が両方とも治療の１日目に行われる、請求項５に記載の方法。
7. ステップ（ｉｉ）が、治療の１〜７日目のいずれか１日に行われる、請求項３に記載の方法。
8. 治療過程にわたる、前記回収し、培養し、増殖させた腫瘍特異的な宿主Ｔ細胞の前記対象への単回投与を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 治療過程にわたる、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬のＩＬ−２Ｒβ活性化量の前記対象への複数回投与を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記回収し、培養し、増殖させた腫瘍特異的な宿主Ｔ細胞が点滴により投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記腫瘍特異的な宿主Ｔ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記対象がヒトである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記癌が固形癌である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記癌が液性癌である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記癌が転移性である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が、４〜７個のポリエチレングリコール部分に放出可能に共有結合されるアルデスロイキンを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が、４〜６個のポリエチレングリコール部分に放出可能に共有結合されるアルデスロイキンを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ポリエチレングリコール部分が分枝状である、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
19. 前記分枝状ポリエチレングリコール部分が、中央のフルオレン環の２−及び７−位から延在するポリエチレングリコール鎖を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が、式Ｉ
    （式中、ＩＬ−２はインターロイキン−２であり、各「ｎ」は独立に、約３〜約４０００の整数である）
    による化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 各「ｎ」が、約４０〜約５５０の整数である、請求項２０に記載の方法。
22. 各「ｎ」が約２２７である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が、約１０％（モル濃度量）以下の式ＩＩ
    （式中、ＩＬ−２がインターロイキン−２であるとき、「ｍ」は、１、２、３、７及び＞７からなる群から選択される整数である）
    による化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 式Ｉによる長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が、ＩＬ−２に放出可能に結合する平均約６個の分枝状ポリエチレングリコール部分を保持する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が、前記回収し、培養し、増殖させた腫瘍特異的な宿主Ｔ細胞の前記対象への投与の４日以内に最初に投与される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬が注射により投与される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の初回投与後少なくとも１０日である時点で測定した場合、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与がない、ステップ（ｉ）のみによる前記対象の治療時に前記対象の腫瘍部位で保持される腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞の数と比較したときに、又は、同等数のＩＬ−２等価物を達成するために投与されるインターロイキン−２の投与と併用した、ステップ（ｉ）からの前記回収し、培養し、増殖させた腫瘍特異的なＴ細胞での前記対象の治療時に前記対象の腫瘍部位で保持される腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞の数と比較したときに、より多数の腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞が前記対象の腫瘍部位で保持される結果を得るのに有効である、請求項１〜１３及び１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記時点が、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の初回投与後、１０、１１、１２、１３、１４又は１５日目である、請求項２７に記載の方法。
29. 結果として、ステップ（ｉ）又はステップ（ｉｉ）のいずれかのみに従い投与が行われる場合に観察される治療に対する応答を超えて促進される有益な応答治療が得られる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
30. 治療に対する前記有益な応答が適切な動物モデルに基づく、請求項２８に記載の方法。
31. 治療の前記方法が、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ−バイアス作動薬の投与がない、ステップ（ｉ）単独による前記対象の治療時に、又は、同等数のＩＬ−２等価物を達成するために投与されるインターロイキン−２の投与と併用した、ステップ（ｉ）からの、前記回収し、培養し、増殖させた腫瘍特異的なＴ細胞での前記対象の治療時に観察されるものと比べて増強される量だけ、前記対象の腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇｓからなる群から選択される制御性Ｔ細胞の蓄積を阻害するのに有効である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
32. 制御性Ｔ細胞の蓄積の前記阻害がインビボ癌モデルにおいて評価される、請求項３１に記載の方法。