ES2877090T3 - Receptor de antígenos quiméricos y células T en las que se expresa el receptor de antígenos quiméricos - Google Patents
Receptor de antígenos quiméricos y células T en las que se expresa el receptor de antígenos quiméricos Download PDFInfo
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Abstract
Receptor de antígeno quimérico que comprende un dominio de unión a antígeno; una región de bisagra; un dominio transmembrana; un dominio coestimulador; y un dominio de señalización citoplásmico, caracterizado por que el dominio de unión al antígeno se une a IL13Rα2, en el que, en el dominio de unión al antígeno, las posiciones 11, 64, 67 y 107 de la secuencia de aminoácidos indicada con la Secuencia No. 1 están sustituidas por lisina (K), ácido aspártico (D), ácido aspártico (D) y lisina (K), respectivamente.
Description
DESCRIPCIÓN
Receptor de antígenos quiméricos y células T en las que se expresa el receptor de antígenos quiméricos CAMPO TÉCNICO
[0001] La presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico que reconoce un antígeno de superficie celular de cáncer, y una célula T en la que se expresa el receptor. Específicamente, la presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico con una excelente tasa de expresión y una célula T en la que se expresa el receptor. Más específicamente, la presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico según la reivindicación 1 y una célula T en la que se expresa el receptor, comprendiendo dicho receptor de antígeno quimérico un dominio de unión a antígeno; una región de bisagra; un dominio transmembrana; un dominio coestimulador; y un dominio de señalización citoplasmático.
[0002] Además, la presente invención se refiere al receptor de antígeno quimérico y la célula T en el que se expresa el receptor, caracterizado porque se introducen adicionalmente tres glicinas entre el dominio de unión a antígeno y la región de bisagra.
[0003] Además, la presente invención se refiere al receptor de antígeno quimérico y la célula T en la que se expresa el receptor, caracterizado porque el dominio de señalización citoplásmico utiliza un dominio de señalización CD3^ de una persona normal donde está comprendido una glutamina adicional, no un dominio de señalización CD3^ de una célula T Jurkat.
[0004] Además, la presente invención se refiere al receptor de antígeno quimérico y la célula T en la que se expresa el receptor, el receptor de antígeno quimérico que comprende el dominio de unión a antígeno predeterminado, el dominio coestimuladora y el dominio de señalización citoplásmico descrito anteriormente, o la totalidad de ellos. CAMPO DE ANTECEDENTES
[0005] Las células T (en lo sucesivo, en la presente memoria descriptiva, a veces se denominan "células CAR-T") que expresan receptores de antígenos quiméricos (en lo sucesivo, en la presente memoria descriptiva, a veces se denominan "CAR") significan células T recombinantes en las que un gen que codifica un receptor que reconoce un antígeno de superficie de la célula cancerosa expresado específicamente en la superficie de la célula cancerosa se introduce en la célula T para destruir la célula cancerosa. Dr, Zelig Fshhar, et. al., que es químico e inmunólogo del Instituto de Ciencia Weizmann en Israel, había logrado producir células T provistas de receptores de antígenos quiméricos, al obtener una teoría de que cuando se fabrican artificialmente las células T con un receptor que se unen a un antígeno expresado específicamente en una célula cancerosa, se produce una respuesta inmunitaria, dirigida solo a la célula cancerosa, para destruir la célula cancerosa y, entonces, se describe este hecho en PNAS en 1989.
[0006] Sin embargo, las células CAR-T producidas en la etapa temprana, es decir, las células CAR-T de 1a generación utilizaron solo CD3Z como dominio de señalización, pero su efecto terapéutico fue insignificante, y además, hubo una desventaja de que el tiempo de duración fue corto. Así, se han realizado esfuerzos para mejorar la reactividad de las células CAR-T, y como resultado, se produjeron células CAR-T de 2a generación en las que se combinan un dominio coestimulador (CD28 o CD137/4-1BB) y CD3Z, en donde el número de células CAR-T presentes en el cuerpo aumentó significativamente en comparación con el número de células CAR-T de primera generación. Mientras tanto, las células del segundo CAR-T utilizaron un tipo de dominio coestimulador, y las células CAR-T que utilizan dos tipos del dominio coestimulador se denominan CAR-T de tercera generación. La mayoría de los estudios recientes se centran en las células CAR-T de segunda y tercera generación. Mientras tanto, con respecto a los métodos para tratar cánceres utilizando las células CAR-T, hubo un informe de que cuando se inyectaron células T citotóxicas transformadas para reconocer CD19 en tres pacientes con leucemia linfoide crónica (CCL) en etapa terminal, la leucemia se trató por completo en dos de pacientes, y la enfermedad continuó durante aproximadamente 10 meses (N. Engl J Med 2011; 365: 725-73325 de agosto de 2011, Sic. Transl. Med 10 de agosto de 2011; 3 (95): 95ra73). Las CAR-T utilizadas en este documento corresponden a la 2a generación y utilizan 4-1BB como dominio coestimulador y CD3Z como dominio de señalización. El dominio de unión al antígeno de las células CAR-T reconoce CD19, que se encuentra en la superficie de las células cancerosas de leucemia, como un antígeno.
[0007] Además, hubo un informe que cuando los pacientes con leucemia aguda fueron tratados mediante la administración de CTL019, 27 de los 30 pacientes habían experimentado una remisión completa, el 67% de todos los pacientes experimentaron una remisión completa durante 2 años, y el 78% de los pacientes sobrevivieron durante 2 años. Dado que los pacientes en cuestión eran pacientes en recaída o refractarios, este resultado fue muy sorprendente (N Engl j Med 2014; 371: 1507-1517, 16 de octubre de 2014).
[0008] En la actualidad, para los métodos terapéuticos que utilizan diversas células CAR-T, se han llevado a cabo pruebas clínicas en varios cánceres hematológicos tales como linfoma, mieloma, etc., y se espera que CAR-T estará disponible como un medicamento disponible en el mercado. Dado que el tratamiento del cáncer con células CAR-T es
un método de autoderivación, este producto no puede producirse en masa; sin embargo, se trata de un tratamiento específico para cada paciente, por lo que su efecto terapéutico es incomparablemente superior al de los fármacos anticancerosos existentes.
[Literatura de patentes]
[0009] Patente coreana abierta al público No. 10-2013-0124521
[Literatura no relacionada con patentes]
[0010] Immunol Rev, 2014, 257 (1): 107-126
N Engl J Med 2014; 371: 1507-1517, 16 de octubre de 2014
Science Translational Medicine 18 de febrero de 20115: Vol. 7, número 275, págs.275ra22
[0011] El documento US 2014/0271582 A1 da a conocer el receptor de antígeno quimérico específico de CD123 redirigido células T y métodos de su uso.
[0012] El documento WO 2010/025177 A1 da a conocer un método y composiciones para mejorar el funcionamiento del efector antitumoral de las células T.
[0013] Daofeng, L., et al., Clinical Immunology (2013) 149, 55-64 se dirige a meduloblastoma que expresa CD Id y puede ser objetivo para la inmunoterapia con células NKT.
[0014] Kowolik, CM, et al, Cancer Res., 2006; 66: (22), 15 de noviembre de 2006, 10995-11004 está dirigido a la coestimulación de CD28 proporcionada a través de un receptor de antígeno quimérico específico de CD19 que mejora la persistencia in vivo y la eficacia antitumoral de las células T transferidas adoptivamente.
[0015] Brown, CE, et al, Clin Cancer Res.; 21 (18) 15 de septiembre de 2015, 4062-4072 se dirige a la bioactividad y seguridad de las células T CD8+del receptor de antígeno quimérico redirigido por IL13Ra2en pacientes con glioblastoma recurrente.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0016] La presente invención tiene la tarea de proporcionar a las células CAR y CAR-T tasas de expresión y efectos terapéuticos significativamente excelentes en comparación con las células CAR-T conocidas convencionalmente. Más específicamente, la presente invención tiene la tarea de proporcionar, en las células CAR-T de segunda y tercera generación, un dominio coestimulador capaz de introducirse en varias células CAR-T, como el dominio coestimulador que cumple un papel principal en la función. Además, la presente invención tiene la tarea de proporcionar varios dominios de unión a antígeno capaces de unirse a un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerosa específica y también capaces de formar células CAR-T. Además, la presente invención tiene la tarea de proporcionar un procedimiento para mejorar las tasas de expresión de varias células CAR-T y los efectos terapéuticos de las mismas, con un receptor de antígeno quimérico caracterizado por tener secuencias de aminoácidos adicionales que se pueden introducir adicionalmente entre el dominio de unión a antígeno y el dominio de bisagra.
MEDIOS PARA ALCANZAR LA TAREA
[0017] Como medios para la consecución de las tareas mencionadas anteriormente, la presente invención describe la siguiente idea técnica.
[0018] Se describe un receptor de antígeno quimérico según la reivindicación 1 y una célula CAR-T en la que se expresa el receptor, comprendiendo el receptor de antígeno quimérico un dominio de unión a antígeno; una región de bisagra; un dominio transmembrana; un dominio coestimulador; y un dominio de señalización citoplásmico, caracterizado por un dominio de unión a antígeno específico como se especifica en la reivindicación 1.
EFECTO DE LA INVENCIÓN
[0019] La célula CAR-T que comprende el dominio de unión a antígeno que se describe en la presente invención tiene el efecto de que la eficacia terapéutica y tasa de expresión son significativamente excelente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0020] Las realizaciones actuales se ilustran en los dibujos con el fin de ejemplificar la presente invención. Sin embargo, cabe señalar que la presente invención no se limita a las disposiciones y procedimientos precisos de las realizaciones ilustradas en los dibujos.
La Figura 1 ilustra un vector de retrovirus y un transgén que representan los principales elementos funcionales de una realización de la célula CAR-T descrita en la presente invención. Específicamente, esta figura ilustra un vector de retrovirus de grado clínico que indica las expresiones de IL13 mutado (E11K.R64D.S67D.R107K), bisagra CD8a humana y CD8 humano/dominio transmembrana CD3 humano para impartir mayor afinidad antigénica que dos sustituyentes de aminoácidos (Glu-11, Arg-107) de IL13 y CD28 humano mutante (RLLH ^ RGGH), TNFRSF9 humano y dominio de señalización CD3 zeta de una persona sana para aumentar la tasa de expresión de CAR. Esta figura no se ilustra en una acumulación constante.
La Figura 2 muestra que la tasa de expresión aumenta después de agregar tres glicinas entre el dominio de unión al antígeno y la región bisagra, con el fin de aumentar la solubilidad de una proteína CAR para aumentar la expresión del receptor de antígeno quimérico.
La Figura 3 muestra que la tasa de expresión aumenta cuando se usa un mutante (RLLH ^ RGGH) de CD28 humano, con el fin de aumentar la expresión del receptor de antígeno quimérico de la proteína CAR.
La Figura 4 muestra el resultado del análisis de células T transformadas mediante un análisis de citometría de flujo, con el fin de verificar la pureza de las células CAR-T y la tasa de expresión de CAR producidas mediante un proceso de producción configurado para ensayo clínico. Esta figura muestra la tasa de expresión de CAR y la pureza de las células T.
La figura 5 muestra la comparación de citotoxicidad de células T, en las que se introducen IL13 (Glu-11, Arg-107) donde se sustituyen dos posiciones, e IL13 (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K) donde se sustituyen cuatro posiciones. La Figura 6 muestra el aumento de la actividad anticancerosa dependiente de la tasa de represión de CAR en la línea celular de cáncer de cerebro humano U251 de células CAR-T que consiste en IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K) .TNFRSF9. CD3Z donde se sustituyen cuatro posiciones.
La Figura 7 muestra la producción de citocinas IFN-y después de cultivar la línea celular de cáncer de cerebro humano U251 (sobreexpresión de IL13Ra2), que es una célula diana con células CAR-T que consisten en IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K) .TNFRSF9.CD3Z donde cuatro posiciones están sustituidas o HUVEC (falta de expresión de IL13Ra2) que es un control celular normal, en una proporción de 0,5:1 durante 19 horas.
La Figura 8 muestra que un aumento dependiente de la dosis (número de células T CAR+) en la secreción de citocinas IFN-y, después de cultivar la línea celular de cáncer de cerebro humano U251, que es una célula diana con células CAR-T que comprenden (IE13.E11K.P64D .367D.R107K) .TNFRSF9.CD3Z donde cuatro posiciones están sustituidas. La Figura 9A es una imagen que muestra brevemente el método del experimento de eficacia in vivo de ratón desnudo usando las células CAR-T que comprenden IL13 (E11K.R64D.S67D.R107K) TNFRSF9.CD3Z donde se sustituyen cuatro posiciones; y la Figura 9B muestra el resultado de medir el tamaño del tumor del animal 12 días después del tratamiento con la célula CAR-T o PBS.
La Figura 9C muestra la forma, el tamaño y el peso del tejido canceroso extraído del ratón desnudo 15 días después del tratamiento con la célula CAR-T o PBS.
La Figura 10A es una imagen de los tejidos cancerosos extraídos teñidos con anticuerpo anti-CD3 humano para teñir células T o CAR-T humanas, del ratón desnudo 15 días después del tratamiento con TMZ PBS (se administró PBS por vía intravenosa una vez, y TMZ e IL-2 se administraron por vía intraperitoneal e intravenosa una vez al día durante cuatro días).
La Figura 10B es una imagen de los tejidos cancerosos extraídos teñidos con anticuerpo anti-CD3 humano para teñir células T o CAR-T humanas, del ratón desnudo 15 días después del tratamiento con TMZ YYB103 (TMZ y célula CART-T que comprende IL13 (E11K.R640.S67D.R107K) TNFRSF9.CD3Z donde se sustituyen cuatro posiciones, se administraron por vía intravenosa una vez, y TMZ e IL-2 se administraron por vía intraperitoneal e intravenosa una vez al día durante cuatro días).
La Figura 11A es una imagen de los tejidos cancerosos extraídos teñidos con H&E del ratón desnudo 15 días después del tratamiento con TMZ PBS (PBS se administró por vía intravenosa una vez, y TMZ e IL-2 se administraron por vía intraperitoneal e intravenosa una vez al día durante cuatro días).
La Figura 11B es una imagen de los tejidos cancerosos extraídos teñidos con H&E del ratón desnudo 15 días después del tratamiento con TMZ YYB103 (TMZ y células CAR-T que comprenden IL13 (E11K.R64D.867D.R107K) TNFRSF9.CD3Z donde cuatro posiciones se sustituyeron, se administraron por vía intravenosa una vez, y TMZ e IL-2 se administraron por vía intraperitoneal e intravenosa una vez al día durante cuatro días).
La Figura 12 muestra la producción de CAR anti-angiogénico. Las terapias CAR contra el cáncer exitosas requieren no solo células CAR-T específicas de antígeno, sino también acceder las células CAR-T a las células cancerosas y mantener la función de las células CAR-T en el microambiente tumoral inmunosupresor. Por lo tanto, se produjo CAR anti-angiogénico. La Figura 12A ilustra el vector retrovírico y el transgén que representan el elemento funcional principal del CAR anti-angiogénico; la Figura 12B muestra el resultado de analizar células transformadas comprobando la expresión en la superficie celular de CAR anti-angiogénico usando un análisis de citometría de flujo.
Las figuras 13 a 16 muestran los cuatro tipos de producción de CAR, que reconocen un antígeno tumoral principal de varios cánceres. Una de las figuras respectivas ilustra el vector de retrovirus y el transgén que representan el elemento funcional principal; B de las figuras respectivas muestra el resultado del análisis de células transformadas comprobando la expresión en la superficie celular de CAR anti-angiogénico usando un análisis de citometría de flujo.
MEJOR MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
[0021] La célula CAR-T según la reivindicación 5 una célula T recombinante en la que se introduce un gen receptor de reconocimiento de una célula de cáncer como un antígeno, en donde la célula T consiste en un dominio de unión que reconoce el antígeno; una región de bisagra (o espaciador) que conecta el dominio de unión al antígeno y un dominio transmembrana; el dominio transmembrana; un dominio coestimulador; y un dominio de señalización citoplasmático.
[0022] El dominio de unión al antígeno, que es un sitio donde se suministra una señal principal y está presente fuera de la membrana celular, reconoce una célula cancerosa que expresa un antígeno particular. Por tanto, en el tratamiento del cáncer que utiliza células CAR-T, el tratamiento detallado en cuestión está determinado por el dominio de unión al antígeno. La presente invención describe, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico capaz de unirse específicamente a IL13Ra2 sobreexpresado en glioblastoma. El glioblastoma (GMB) o glioblastoma multiforme es uno de los tumores cerebrales más generales, que ocupa alrededor del 12 al 15% de los tumores cerebrales, y este es un cáncer cerebral maligno general. Dado que este cáncer es relativamente raro en comparación con un cáncer colorrectal o un cáncer de pulmón, los estudios sobre el método de tratamiento del mismo no se han realizado activamente. Las células del glioblastoma son similares a astrocitos, pero los astrocitos sirve para mantener las células nerviosas y proporcionar nutrición a los nervios y una reacción de defensa ante el daño de los tejidos cerebrales. Se cree que la anomalía genómica de las células madre o de los astrocitos inmaduros está implicada en la aparición y malignización del glioblastoma. Para el tratamiento del glioblastoma, se utilizan cirugía, radioterapia y quimioterapia. Como quimioterapia, se utilizan temozolomida, lomustina y carmustina, etc., y recientemente se han realizado pruebas clínicas, tales como el tratamiento con vacunas tumorales y el tratamiento molecular dirigido. Sin embargo, todavía no existen agentes terapéuticos útiles para el tratamiento del glioblastoma, y en particular, aunque se intentó el tratamiento del glioblastoma que sobreexpresa IL13Ra2 utilizando células CAR-T utilizando IL13 mutante donde la posición 11 se sustituye por E11Y, el grupo de la facultad de medicina de Baylor informó que el efecto terapéutico usando las células CAR-T usando IL13 mutante donde la posición 11 se sustituye por E11Y no fue bueno in vivo. Sin embargo, la célula CAR-T descrita en la presente invención exhibe el excelente efecto terapéutico del glioblastoma.
[0023] La secuencia del dominio de unión al antígeno que se une a IL13Ra2 es idéntica a la SEQ ID NO. 1, y en particular, la IL13 mutante en la que las posiciones 11,64, 67 y 107 están sustituidas por E11K.R64D.S67D.R107K, respectivamente, se describe de forma novedosa en la presente invención. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los aminoácidos sustituidos en las posiciones correspondientes pueden reemplazarse por aminoácidos que tengan la propiedad similar de los aminoácidos específicos. Por tanto, los aminoácidos pueden sustituirse por arginina (R) o histidina (H), en lugar de lisina (K), en la 11a posición; por ácido glutámico (E), en lugar de ácido aspártico (D), en las posiciones 64 y 67; e histidina (H), en lugar de lisina (K), en la posición 107.
[0024] IL13(E11K.R64D.S67D.R107K) donde se han mutado las cuatro posiciones, que se describe en la presente invención, y análogo sustituido con un aminoácido que tiene la misma propiedad en la misma posición tienen afinidad a antígeno mejorada.
[0025] El dominio de unión a antígeno de la presente invención puede producirse para unirse a un antígeno expresado en diversas células cancerosas, así como a IL13Ra2 sobreexpresado en glioblastoma. Por ejemplo, se describen un dominio de unión a antígeno (SEQ ID NO.2) capaz de unirse a un antígeno asociado con una actividad angiogénica; un dominio de unión a antígeno (SEQ ID NO. 3) que se une a EGFRvlII, que es un antígeno tumoral principal de glioblastoma y cáncer de pulmón, etc.; un dominio de unión a antígeno (SEQ ID NO. 4) que se une a EphA2 que es un antígeno tumoral de glioblastoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, etc.; un dominio de unión a antígeno (SEQ ID NO. 5) que se une a aVp3 que es un marcador resistente de la severidad del carcinoma e inhibidores de receptor de tirosina quinasa (RTKI) tales como erlotinib de cáncer de páncreas, cáncer de pulmón y cáncer de mama; un dominio de unión a antígeno (SEQ ID NO. 6) que se une glypican1 sobreexpresado en cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de mama, etc. Las Figuras 12 a 16 muestran los cinco tipos de producción de CAR que comprenden los dominios de unión al antígeno anteriores. Las figuras respectivas ilustran el vector retrovírico y el transgén que representan el elemento funcional principal y muestran el resultado de analizar las células transformadas comprobando la expresión de la superficie celular de CAR anti-angiogénico usando un análisis de citometría de flujo.
[0026] La característica adicional de la presente invención radica en la introducción adicional de tres glicinas entre el dominio de unión al antígeno y la región bisagra, con el fin de aumentar la solubilidad de una proteína CAR para aumentar la expresión del receptor de antígeno quimérico. Según el estudio de los presentes inventores, la diferencia de solubilidad entre el receptor en el que se introducen tres glicinas entre el dominio de unión al antígeno y la región de bisagra y el receptor en el que no se introducen tres glicinas mostró aproximadamente 10 veces, y esta diferencia conduce a una gran diferencia en la tasa de expresión con respecto a la producción de células CAR-T, y la diferencia de la tasa de expresión finalmente está directamente relacionada con el efecto terapéutico. Por esta razón, esto puede considerarse un desarrollo técnico muy avanzado. Además, dichas tres glicinas (G) se pueden sustituir por alanina (A), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I) que son aminoácidos que tienen una propiedad similar.
[0027] Otra característica de la presente invención radica en el uso de un dominio coestimulador específico. En las células CAR-T, cuando un dominio de unión a antígeno y un antígeno se unen entre sí, la señal activa una respuesta inmune de las células T a través del dominio de señalización citoplásmico (CD3Z). El dominio coestimulador, que es un sitio donde se suministra una señal coestimuladora, desempeña un papel en el suministro de una señal tal que la célula CAR-T que reconoce la unión de un antígeno específico al dominio de unión al antígeno causa una respuesta inmune para ayudar a la proliferación y persistencia en el cuerpo por más tiempo . Mientras tanto, dicho dominio coestimulador es un componente que no estaba presente en la célula CAR-T de primera generación, y la segunda célula CAR-T usa un dominio coestimulador, y la célula CAR-T de tercera generación usa dos dominios coestimuladores. La célula CAR-T mejora la proliferación y la persistencia en el cuerpo por más tiempo en el dominio coestimulador dentro de las células a lo largo de las generaciones, tales como 1ra generación, 2da generación, 3ra generación, etc., y por lo tanto, las células se han desarrollado en recombinación con genes, de modo que se producen muchas células CAR-T contra la célula cancerosa en el cuerpo incluso después de inyectar una pequeña cantidad de células, y las células pueden permanecer en el cuerpo durante mucho tiempo incluso después de la inyección. Es decir, en el caso de la primera generación, hubo una limitación de señalización porque comprende solo CD3Z sin el dominio coestimulador, pero en la 2da y 3ra generación se introduce adicionalmente 4-1BB u OX40, etc. para mejorar proliferación y persistencia en el cuerpo por más tiempo.
[0028] Además, los presentes inventores utilizaron el dominio coestimuladoro que genera un mutante en la posición predeterminada de CD28 de tal manera que por la mejora de la tasa de expresión de las células CAR-T, el efecto terapéutico se puede exhibir incluso si se utilizan menos células CAR-T y, además, los inventores han descubierto que mediante el uso de dos dominios coestimuladores en los que se combinan CD28 mutado y TNFRSF9, se mejora la "proliferación y persistencia en el cuerpo", lo que da como resultado una mayor eficacia terapéutica.
[0029] Por consiguiente, la característica técnica adicional de la presente invención reside en un receptor de antígeno quimérico y una célula CAR-T en la que se expresa el receptor, el receptor de antígeno quimérico que consiste en un dominio de unión a antígeno; un dominio transmembrana; un dominio coestimulador y un dominio de señalización citoplásmico, en el que el dominio coestimulador comprende CD28 o TNFRSF9, o c D28 y TNFRSF9. Aquí, CD28 puede comprender un mutante (las secuencias Nos. 6 a 9 están sustituidas de RLLH a RGGH) para aumentar la expresión del receptor de antígeno quimérico. Las secuencias de aminoácidos del tipo salvaje de CD28 y TNFRSF9, que pueden estar comprendidas como el dominio coestimulador de la presente invención, se indican con las Secuencias Nos. 7 y 8. Además, en el CD28 mutado (las Secuencias Nos. 6 a 9 están sustituidas de RLLH a RGGH), el aminoácido sustituido es glicina (G), pero este se puede reemplazar por un aminoácido similar al mismo, por ejemplo, alanina (A), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I). La región de bisagra de la presente invención es una porción que conecta el dominio de unión al antígeno y el dominio transmembrana, y esto también se denomina espaciador. La región de bisagra tiene el propósito de expandir el dominio de unión al antígeno de la membrana de la célula T. Como región de bisagra de la presente invención, se puede usar una región de bisagra típicamente utilizada en el campo técnico pertinente y, por ejemplo, la región de bisagra se puede derivar de la región de bisagra CD8 (SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10). Como se mencionó anteriormente, otra característica técnica de la presente invención radica en tres glicinas introducidas adicionalmente entre el dominio de unión al antígeno y la región bisagra.
[0030] El dominio transmembrana de la presente invención juega un papel como un ancla de CAR molecular y al mismo tiempo un papel en el suministro de una señal recibida desde el dominio de unión a antígeno al dominio coestimulador y el dominio de señalización citoplásmico. El dominio transmembrana no se limita al dominio transmembrana de la presente invención, y se pueden usar dominios transmembrana típicos usados para la producción de CAR y, por ejemplo, se puede usar el dominio transmembrana CD8/CD3 humano (SEQ ID NO. 11, SEQ ID N° 12).
[0031] Como dominio de señalización citoplásmico de la presente invención, se usó un dominio de señalización CD3^ de una persona normal donde se comprende una glutamina adicional, no un dominio de señalización CD3^ de una célula T Jurkat, y glutamina adicional significa glutamina (Q) en la posición 50 en SEQ ID NO. 13.
[0032] La idea técnica de la presente invención incluye tanto el uso de las mencionadas características técnicas solas como el uso de la combinación de las mismas. Es decir, la implementación de las características técnicas de la presente invención incluye todas las células CAR-T que comprenden el sitio de unión al antígeno predeterminado descrito en la presente invención; las células CAR-T en las que se introducen adicionalmente tres glicina entre el dominio de unión al antígeno y la región bisagra; y las células CAR-T que comprenden el dominio coestimulador descrito en la presente invención.
[0033] Las secuencias de ácido nucleico de polipéptido que constituyen los dominios descritos en la presente memoria pueden obtenerse utilizando los métodos recombinantes conocidos en el campo técnico pertinente, y por ejemplo, se pueden obtener mediante el cribado de la biblioteca de células que expresan el gen usando la técnica estándar, o inducir un gen de un vector conocido para que comprenda el mismo gen, o aislar directamente de células o tejidos que comprenden el mismo gen. Alternativamente, el gen interesado se puede generar por síntesis, no por clonación.
[0034] El método para introducir y expresar un gen en las células ha sido conocido en el campo técnico pertinente. El vector de expresión se puede introducir rápidamente en las células huésped mediante cualquier método conocido en el campo técnico pertinente. Por ejemplo, en la presente invención, las células CAR-T pueden producirse uniendo un fragmento del gen de CAR finalmente producido a un vector de expresión de retrovirus MFG escindido con XhoI/NotI. Debe entenderse que la presente invención comprende varios mutantes para cada uno de los componentes de la estructura.
[0035] Los cánceres a tratar puede incluir tumores no sólidos (por ejemplo, tumores hematológicos, por ejemplo, la leucemia y el linfoma), así como glioblastoma, o pueden incluir tumores sólidos.
[0036] Como tal, se necesitan varios pasos para producir células CAR-T recombinantes e inyectar las células en pacientes con cáncer. Las células T se aíslan de la sangre de los pacientes, y a continuación el ADN diseñado con CAR se introduce en las células T usando un vector de expresión, y las células CAR-T se proliferan y a continuación se inyectan de nuevo en el paciente.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
[0037] En lo sucesivo, la presente invención se especifica a través de los ejemplos. Sin embargo, cabe indicar que los siguientes ejemplos no pretenden limitar el alcance técnico de la presente invención en ningún sentido.
Ejemplo 1: Construcción de un vector de expresión que tiene 2a generación (YYB-103, IL13.E11K.P64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z) y 3a generación (YYB-103A, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9. CD3Z) receptores de antígenos quiméricos que se unen específicamente a IL13Ra2 sobreexpresado en células cancerosas
[0038] El presente inventor produjo IL13 mutante (E11K.R64D.S67D.R107K) con el fin de impartir una mayor afinidad antigénica que dos sustituciones de aminoácidos (Glu-11, Arg-107) de IL13, y produjo receptores de antígenos quiméricos que comprenden un dominio de coestimulación (TNFRSF9) y dos dominios de coestimulación (CD28, TNFRSF9) del dominio de señalización citoplásmica de la célula CAR-T (Figura 1). En la presente invención, se agregaron tres glicinas entre el dominio de unión al antígeno y la región de bisagra para aumentar la solubilidad de una proteína CAR para aumentar la expresión del receptor de antígeno quimérico (Figura 2). El dominio de señalización citoplásmico de CD28 usado en la presente invención comprende secuencias de ADN de CD28 humano mutante (RLLH ^ RGGH) para aumentar la solubilidad de una proteína CAR para aumentar la expresión del receptor de antígeno quimérico (Figura 3). Se usó el dominio de señalización de CD3Z humano de una persona normal sana, no un dominio de señalización de CD3Z de una célula T Jurkat. IL13 humano (P35225.1), CD3 humano (P20963-1), CD8a humano (P01732), CD28 humano (P10747), TNFRSF9 humano (Q07011) y la secuencia señal de la cadena ligera kappa humana (HuVHCAMP) se optimizaron utilizando la literatura científica y base de datos disponible públicamente, se produjeron los receptores de antígenos quiméricos de segunda y tercera generación (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z y YYB-103A, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3Z) que consistían en ADN sintético optimizado con codones (Figura 1). La estructura completa comprende la secuencia de unión al ribosoma consenso de kozak, la secuencia señal de la cadena ligera kappa humana (HuVHCAMP), la secuencia de la proteína madura IL13.E11K.R64D.S67D.R107K humana (IL13 humana (E11K.R64D.S67D.R107K)), una adición de tres glicinas (GGG) entre el dominio de unión al antígeno y la región de bisagra para aumentar la solubilidad de una proteína CAR para aumentar la expresión del receptor de antígeno quimérico (Figura 2), la región bisagra de CD8a humano, CD8 humano/Dominio transmembrana CD3, el dominio coestimulador del citosol CD28 transformado en mutante (RLLH ^ RGGH), el dominio coestimulador del citosol TNFRSF9, el dominio de señalización citoplásmica CD3Z de la persona sana y la porción de escisión Xhol/NotI. Las secuencias completas de YYB-103 y YYB-103A están representadas en las Secuencias Nos. 14 y 15. Un fragmento del gen de CAR finalmente producido se unió a un vector de expresión de retrovirus MFG escindido con XhoI/NotI (Emtage PC, etc., Clin Cancer Res, 200814L8112-8122) (Figura 1). En el presente ejemplo, para comparar la actividad de los receptores de antígenos quiméricos, se produjeron adicionalmente receptores de antígenos quiméricos de tercera generación (YYB-103B, IL13(E11K.R107K).28.TNFRSF9.CD3^) de IL13 con dos sustituciones de aminoácidos (Glu-11, Arg-107).
Ejemplo 2: Producción de células T transformadas en receptores de antígenos quiméricos de 2a generación (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z) y 3a generación (YYB-103A, IL13.E11K.K64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9 .CD3Z) que se unen específicamente a IL13Ra2 sobreexpresado en células cancerosas.
[0039] El clon de PG13 con título alto, que expresa CAR, se produjo infectando temporalmente células phoenix-empo y phoenix-eco con el vector de expresión de retrovirus YYB-103 o YYB-103A producido en el Ejemplo 1, y posteriormente se transdujeron células PG13 con stock de vector acelular de células phoenix-empo y phoenix-eco infectadas. Se obtuvo un clon único con un título alto mediante un citómetro de flujo después de teñir células PG13/YYB-103 usando un anticuerpo monoclonal anti-IL-13 (BD Pharmingene). El clon único de PG13/YYB-103 con un título alto se produjo mediante la segunda subclonación de acuerdo con el ensayo de dilución límite. El subclón
PG13/YYB-103-13 mostró la expresión de CAR establemente alta y se seleccionó para transducir células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de seres humanos. La eficiencia de transducción de PBMC/YYB-103-13 se verificó con un anticuerpo monoclonal anti-iL-13 (BD Pharmingen) mediante un análisis de citometría de flujo. El sobrenadante de las células PG13/YYB-103-13 comprende retrovirus y se recoge para la modificación genética de PBMC. Las PBMC se separaron mediante centrifugación poniendo sangre completa obtenida de un donante humano sano en Ficoll Paque (GE Healthcare). Las PBMC separadas se cultivaron agregando anticuerpo monoclonal anti-CD3 (eBioscience) 100 ng/ml bajo la condición de IL-2 humana (NOVARTIS) 100 UI/ml para activar la fracción de células T (BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22: 79-84). Después de 2 a 3 días de activación, la mayoría de las células eran células T y comprendían células asesinas naturales en una proporción de 0-2%. Después de 2 a 3 días de la etapa de activación, las células T se sometieron a transducción dos veces durante 2 días usando sobrenadante retroviral y se lavaron, y a continuación las células proliferaron durante 4 a 7 días en un matraz. Las células se cultivaron en un dispositivo de plataforma de agitación (sistema de biorreactor WAVE) durante 12 a 14 días. La IL-2 se mantuvo en una cantidad de 100 UI/ml. La célula CAR-T modificada de tal manera se utilizó para el experimento de análisis (Figura 4).
Ejemplo experimental 1: verificación de la tasa de expresión de CAR de la superficie de la célula T transformada en un receptor de antígeno quimérico
Método experimental (análisis de citometría de flujo)
[0040] Para la citometría de flujo (> 30.000 eventos), se utilizaron equipos BD LSRII (Becton Dickinson) y software BD FACSDiva (Becton Dickinson). Específicamente, antes de añadir un anticuerpo monoclonal anti-IL-13 humana conjugado con PE (BD Pharmingen), la célula se lavó una vez con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 2%. Después del lavado, la célula se hizo reaccionar con los anticuerpos respectivos durante 30 minutos a 4 ° C en el estado en el que se bloqueó la luz y a continuación se lavó una vez y, posteriormente, se comprobó la tasa de expresión del CAR de superficie de la célula T transducida. Además, para verificar la expresión en la superficie celular de IL13Ra2 e IL13Ra1, se utilizaron anticuerpos anti-IL13Ra humano (R&D Systems), anticuerpo secundario de burro anti-ficoeritrina IgG de cabra (R&D Systems) y anti-IL13Ra ficoeritrina humana (R&D Systems), y como control, se incluyó el anticuerpo de isotipo.
Resultado experimental
[0041] Para verificar que CAR específica de IL13Ra2 (YYB-103, IL13.L11K.R107K.TNFRSF9.CD3Z; YYB-103A, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3Z; YYB-103B, IL13. E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3Z) producida en el Ejemplo 1 se expresó en la superficie de las células T, se llevó a cabo el cultivo de las células T durante 12 a 14 días según el Ejemplo 2 y a continuación se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo de acuerdo con el método experimental. Como resultado del análisis, las tasas de expresión de los receptores de antígenos quiméricos expresados en la superficie de las células T vivas fueron del 90,5% al 92,8% en los siete (7) donantes de sangre. Cuando se mantuvo el cultivo, la expresión del receptor de antígeno quimérico específico de IL13Ra2 se mantuvo estable durante 4 semanas, sin activación o transducción adicional de células T. Además, en la célula cultivada, se analizaron las proporciones de células T completas, células T CD4, células T CD8, células B y monocitos. Como resultado, se confirmó que existían células B en una cantidad de 0,5 a 1,2% y no existen monocitos.
Ejemplo 3: Medición de la citotoxicidad y secreción de IFN-y de célula T transformado a receptores de antígeno quimérico de 2a generación (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z) y 3a generación (YYB-103A, 1L13.E11K. R64D.R67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z) que se unen específicamente a IL13Ra2 sobreexpresado en células cancerosas
[0042] Se midieron la citotoxicidad específica de IL13Ra2 y la secreción de IFN-y usando la célula CAR-T producida en el Ejemplo 2. Para medir la citotoxicidad específica de IL13Ra2 y la secreción de IFN-y, se utilizaron U251 que es una línea celular humana de glioblastoma que sobreexpresa IL13Ra2, y HUVEC primarias que no expresan IL13Ra2, como control celular normal.
Ejemplo experimental 1: verificación de citotoxicidad para glioblastoma que sobreexpresa IL13Ra2
Método experimental
[0043] Con el fin de medir la citotoxicidad de la célula CAR-T específica de IL13Ra2 efectora (efectora de CAR+ T específica de IL13Ra2), se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad usando un kit de DELFIA (Perkin Elmer). Específicamente, las células efectoras de células CAR-T se usaron de 12 a 14 días después de la activación celular a anti-CD3, y el experimento se llevó a cabo tres veces bajo la condición en que la célula efectora se colocó en una placa de 96 pocillos en la que la célula diana IL13Ra2 existía en una proporción de 5:1 (efector:diana) y una proporción de 0,625: 1 (efector:diana) y reaccionó durante 2 horas a 37 °C. En la placa de 96 pocillos utilizada en este experimento de análisis, se añadieron 5.000 células diana por pocillo, y se utilizó U251, que es una línea celular de glioblastoma que sobreexpresa IL13Ra2, como célula diana utilizada, y HUVEC primaria como control celular normal.
Resultado experimental
[0044] Se analizó si la célula cancerosa diana (U251) que sobreexpresa IL13Ra2 fue efectivamente destruida por las células T CAR específicas de IL13Ra2 producidas según la presente invención (YYB-103, IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z; YYB-103A, IL13.E11K.R64D. S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3Z; YYB-103B, 1L13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.c D3Z). Como método experimental, se utilizó el método de comparar y analizar la citotoxicidad cultivando la célula cancerosa diana (U251) y la célula normal (HuVEC) antes mencionada junto con las respectivas células CAR-T activadas. Tal como se ilustra en la Figura 5, en todos los casos, se obtuvo el resultado de que cuando se expresaba CAR específica para IL13Ra2, la expresión de CAR inducía la muerte de las células del glioblastoma U251 que expresaban IL13Ra2 en un nivel alto, en comparación con las células T activadas que no eran transducidas (Figura 5). Específicamente, en el caso de la célula T que expresa YYB-103 (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z), YYB-103A (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3Z) y YYB-103B (IL13.E11K.R107K.28TNFRSF9.CD3Z) CAR producida en el Ejemplo 2 de la presente invención, a medida que aumentaba la relación E:T, la citotoxicidad aumentaba gradualmente; sin embargo, en el caso de las células T que no expresaban CAR, la citotoxicidad rara vez aumentaba. Además, como resultado de comparar CAR YYB-103B (IL13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3Z), en la que se sustituyeron dos aminoácidos de IL13, y YYB-103 (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K .TNFRSF9. CD3Z) y YYB-103A (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3Z), en las que se sustituyeron cuatro aminoácidos de IL13, que se utilizaron para impartir mayor afinidad antigénica, en el caso de YYB-103B en el que solo se sustituyeron dos aminoácidos, se mostró 67,4% de citotoxicidad en la relación E:T de 5:1, pero cuando se utilizaron YYB-103 y YYB-103A en los que se utilizó IL13.E11K.R64D.S67D.R107K mutante en el que se sustituyeron cuatro aminoácidos de IL13, se mostró un 85,6% y un 87,7% de citotoxicidad, respectivamente. Esto muestra que la citotoxicidad de la célula T en la que se introdujo el mutante IL13.E11K.R64D.S67D.R107K en la que se sustituyeron cuatro aminoácidos de IL13 es superior tanto en la 2a generación como en la 3a generación en comparación con la citotoxicidad de la célula T en la que se introdujo IL13.E11K.R107K mutante en el que se sustituyeron dos aminoácidos de IL13.
[0045] A partir del resultado experimental de usar, como control normal de las células, células HUVEC que no expresan IL13Ra2 pero mínimamente expresa IL13Ra1, como objeto a ser comparado con las células diana, se confirmó que la célula CAR-T (12,3 -14% de citotoxicidad) específica para IL13Ra2 tiene una citotoxicidad muy débil (Figura 5). Esto muestra que debido a la propiedad de la célula HUVEC que expresa IL13Ra1 y no expresa IL13Ra2, el receptor de antígeno quimérico usado en el experimento se une específicamente a IL13Ra2. A través del presente ejemplo experimental, se demostró que la célula T del receptor de antígeno quimérico específico de IL13Ra2 no presenta toxicidad para una célula normal (HUVEC) y puede destruir significativamente la célula cancerosa diana (U251) que expresa IL13Ra2.
Ejemplo experimental 2: Medición del cambio de la actividad anticancerosa según la tasa de expresión de CAR Método experimental
[0046] Con el fin de medir el cambio de actividad contra el cáncer de acuerdo con la tasa de expresión de CAR específica de IL13Ra2, se llevó a cabo el análisis de citotoxicidad. Específicamente, se utilizó IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFSFR9.CD3Z de segunda generación, que es YYB-103, como célula efectora para la célula CAR-T, y como célula diana se utilizó la línea celular U251 que sobreexpresa IL13Ra2. Para el análisis de citotoxicidad, la proporción de la célula efectora y la célula diana fue 0,625:1 y 5:1, y la proporción de células T que expresan CAR fue 0-70%. El método detallado del análisis de citotoxicidad es el mismo que el método experimental del Ejemplo Experimental 2.
Resultado experimental
[0047] En caso de que las células T que expresan CAR específica de IL13Ra2 no existan, se mostraron 16,4% y 2,5% de citotoxicidad, respectivamente, en la proporción de 5:1 y 0,625:1. Sin embargo, se puede demostrar que a medida que aumentaba la proporción de células T que expresaban CAR específica de IL13Ra2, la citotoxicidad aumentó, y se demostró que cuando la proporción de células T que expresaban CAR específica de IL13Ra2 era del 70%, 86% y 26 % de la citotoxicidad se mostró respectivamente en las proporciones de 5: 1 y 0,625: 1 y, por lo tanto, las células T del receptor de antígeno quimérico específico de IL13Ra2 pueden destruir la célula cancerosa diana específica de IL13Ra2 (U251) (Figura 6).
Ejemplo experimental 3: Verificación de la producción de citocinas (IFN-y) de células T transformadas en receptor de antígeno quimérico específico de IL13Ra2
Método experimental
[0048] Se pusieron 200 |il de un medio de cultivo por pocillo en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos y se añadió una célula diana (1 x 10A5). Para medir la citotoxicidad de acuerdo con la tasa de expresión de CAR, se
colocaron células T activadas no transducidas y 10-70% de células CAR-T específicas para IL13Ra2 en la placa de cultivo tisular de 96 pocillos preparada con el efector (1 * 10A5), y se cultivaron al mismo tiempo a través del experimento duplicado. Además, para verificar si la célula CAR-T muestra un aumento de la actividad anticancerosa dependiente del número, se realizó una dilución en serie de 7500 CAR-T y a continuación se puso en el efector y se cultivó al mismo tiempo a través del experimento por duplicado. Transcurridas 19 horas desde el cultivo, se llevó a cabo el experimento de análisis de IFN-y utilizando el sobrenadante del cultivo con analizador ELISA (R & D Systems) según las directrices del fabricante del analizador (figuras 7 y 8).
Resultado experimental
[0049] En general, la célula T activada genera citocina que es útil en su crecimiento y activación, y entre ellas, IFN-Y es secretada por las células CD8, células T CD4 y las células NK, etc., y desempeña un papel importante en las respuestas inmunes y adaptativas inherentes. En particular, esto tiene un papel importante en el traslado de las células T al sitio del tumor, así como en la inhibición de la aparición del cáncer. A través del presente ejemplo experimental, se demostró si la generación de IFN-y aumenta cuando la célula T que expresa CAR específica de IL13Ra2 se encuentra con una célula diana. De acuerdo con el método experimental, la célula T que expresa CAR específica de IL13Ra2 se cultivó al mismo tiempo que la célula diana (célula HUVEC, célula U251), y a continuación se cuantificó el IFN-y mediante el análisis ELISA.
[0050] La Figura 7 muestra un aumento de IFN-y cuando se une al antígeno IL13Ra2 de acuerdo con la proporción de transducción del receptor de antígeno quimérico producido, y se puede entender que los aspectos de generación de IFN-y varían dependiendo de la proporción de la célula CAR-T. En el caso de utilizar U251, que es la célula cancerosa diana, la célula T en la que el receptor de antígeno quimérico no se transdujo rara vez generó IFN-y. En el caso del linfocito T en el que se transdujo el receptor de antígeno quimérico, la generación de IFN-y aumentó hasta en un 30% de proporción, y dado que la generación ya no se incrementó, se determina que el 30% de proporción de célula CAR-T es suficiente para destruir la célula cancerosa diana. Dado que en el caso de HUVEC, que es una línea celular que no sobreexpresa IL13Ra2, incluso si aumenta la proporción de CAR-T, la generación de IFN-y no aumenta, parece que la generación de IFN-y por CAR-T es específica del antígeno IL13Ra2. La Figura 8 muestra un aumento de IFN-y según el número de células T CAR en dos donantes, YY6 e YY7, a medida que aumenta el número de células, aumenta el IFN-y. Esto muestra que al destruir la célula cancerosa, la célula CAR-T depende del número de células.
Ejemplo 4: Evaluación de la eficacia in vivo usando YYB-103
[0051] Con el fin de evaluar si YYB-103 exhibe realmente eficacia in vivo, una célula de cáncer se inyectó por vía subcutánea en un ratón desnudo para inducir tumor, y después de tratar con YYB-103, se confirmaron el cambio del tamaño del tumor y la persistencia de célula CAR-T en el tejido tumoral.
Ejemplo experimental 1: Producción de un ratón desnudo de tumor usando la línea celular U251 y verificación de la eficacia de YYB-103
[0052] La línea celular U251 se inyectó por vía subcutánea en un ratón desnudo. Después de 9 días, el PBS de control y el grupo de tratamiento YYB-103 se administraron por vía intravenosa una vez. La temozolomida (TMZ) y la IL-2 se administraron por vía intraperitoneal e intravenosa al grupo de control y al grupo experimental una vez al día durante cuatro días. Se midió el tamaño de los tumores después de 12 días de tratamiento, y 15 días después del tratamiento se realizó una autopsia para la medición del peso del tejido tumoral y el análisis histológico (Figura 9) Resultado experimental
[0053] Como resultado de medir el tamaño del tumor después de 12 días de tratamiento para medir la eficacia de YYB-103 que se administró en el modelo animal de ratón desnudo de tumor subcutáneo establecido, en el grupo de control, el tamaño del tumor se redujo en aproximadamente un 44%, desde 234,8 mm3 hasta 132,4 mm3. Sin embargo, en el caso de administrar YYB-103 como grupo de tratamiento, el tamaño del tumor se redujo en aproximadamente un 78%, de 288,2 mm3 a 64,6 mm3. A partir de esto, se puede ver que el grupo de tratamiento mostró el efecto terapéutico aproximadamente 1,8 veces en comparación con el grupo de control (Figura 9B). Como resultado de la medición del peso del tejido tumoral, obtenido mediante la realización de una autopsia después de 15 días del tratamiento, se puede observar que el peso del tejido tumoral del ratón desnudo tratado con el grupo de tratamiento, YYB-103, era más ligero que el peso del tejido tumoral del ratón tratado con el grupo de control (Figura 9C). Junto con esto, cuando se trató con YYB-103, mostró que la angiogénesis se inhibe en el tejido tumoral, a diferencia del tejido tumoral tratado con el grupo de control (Figura 11A y Figura 11B).
[0054] Con el fin de verificar que los YYB-103 persiste en el tejido del tumor después de 15 días del tratamiento, se llevó a cabo tinción utilizando un anticuerpo anti-CD3 humano que es marcador de células T humanas. Como resultado, mostró que el tejido tumoral tratado con el grupo de control no se tiñó porque el ratón estaba libre de células T humanas (Figura 10A).
Claims (5)
1. Receptor de antígeno quimérico que comprende un dominio de unión a antígeno; una región de bisagra; un dominio transmembrana; un dominio coestimulador; y un dominio de señalización citoplásmico, caracterizado por que el dominio de unión al antígeno se une a IL13Ra2,
en el que, en el dominio de unión al antígeno, las posiciones 11, 64, 67 y 107 de la secuencia de aminoácidos indicada con la Secuencia No. 1 están sustituidas por lisina (K), ácido aspártico (D), ácido aspártico (D) y lisina (K), respectivamente.
2. Receptor de antígeno quimérico, según la reivindicación 1, caracterizado por que se introducen adicionalmente tres glicinas entre el dominio de unión al antígeno y la región de bisagra.
3. Receptor de antígeno quimérico, según la reivindicación 1, indicado con la secuencia n° 14.
4. Receptor de antígeno quimérico, según la reivindicación 1, indicado con la secuencia n° 15.
5. Célula CAR-T en la que se expresa el receptor de antígeno quimérico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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