CN108026534A - 嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的t细胞 - Google Patents

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Abstract

公开了一种嵌合抗原受体，包含：抗原结合结构域；铰链区；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域。

Description

嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的T细胞
技术领域
本发明涉及一种识别癌细胞表面抗原的嵌合抗原受体和其中表达有该受体的T细胞。具体地，本发明涉及一种具有优异的表达率的嵌合抗原受体和其中表达有该受体的T细胞。更具体地，本发明涉及一种嵌合抗原受体和其中表达有该受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包含癌细胞表面抗原结合结构域(antigen binding domain)；铰链区(hingeregion)；跨膜结构域(transmembrane domain)；共刺激结构域(costimulatory domain)和胞质信号转导结构域(signaling domain)，其特征在于，共刺激结构域由突变的CD28或TNFRSF9组成。此外，本发明涉及一种嵌合抗原受体和其中表达有该受体的T细胞，其特征在于，该抗原结合结构域与选自以下各项组成的组的抗原结合：IL13Rα2、与血管生成活性相关的抗原、EGFRvIII、EphA2、αVβ3和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1)。
此外，本发明涉及嵌合抗原受体和其中表达有该受体的T细胞，其特征在于，在抗原结合结构域和铰链区之间另外引入三个甘氨酸。
此外，本发明涉及嵌合抗原受体和其中表达有该受体的T细胞，其特征在于，该胞质信号转导结构域使用其中包含额外的谷氨酰胺的正常人的CD3ζ信号转导结构域而不是Jurkat T细胞的CD3ζ信号转导结构域。
此外，本发明涉及嵌合抗原受体和其中表达有该受体的T细胞，嵌合抗原受体包含上述预定的抗原结合结构域、共刺激结构域和胞质信号转导结构域中的任一种，或它们全部。
背景技术
表达嵌合抗原受体(本说明书中，在下文有时它被称为“CAR”)的T细胞(在本说明书中，在下文有时它被称为“CAR-T细胞”)是指这样的重组T细胞：其中编码识别在癌细胞表面上特异性表达的癌细胞表面抗原的受体的基因被引入到该T细胞中以杀伤癌细胞。作为以色列魏兹曼科学院(Weizmann Institute of Science in Israel)的化学家和免疫学家的Zelig Fshhar博士等人通过获得这样的理论成功地制备了具有嵌合抗原受体的T细胞：即当人工制造具有与在癌细胞中特异性表达的抗原结合的受体的T细胞时，发生仅针对癌细胞免疫应答，从而杀伤癌细胞，这一事实随后于1989年报道在PNAS上。
然而，早期生产的CAR-T细胞，即第一代CAR-T细胞仅使用CD3ζ作为信号转导结构域，除了其治疗效果不明显外，同样还存在持续时间短的缺点。因此，已经进行努力以改善CAR-T细胞的反应性，并且结果是产生了第二代CAR-T细胞，在第二代CAR-T细胞中，产生的共刺激结构域(CD28或CD137/4-1BB)和CD3ζ是结合的，其中存在于体内的CAR-T细胞的数量与第一代CAR-T细胞的数量相比显著增加。同时，第二代CAR-T细胞使用一种类型的共刺激结构域，而使用两种类型共刺激结构域的CAR-T细胞被称为第三代CAR-T。最近的研究大部分集中在第二代CAR-T细胞和第三代CAR-T细胞。同时，关于使用CAR-T细胞治疗癌症的方法，有报道称当转化以识别CD19的细胞毒性T细胞被注射到3例终末期慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoid leukemia，CCL)患者中时，其中两例患者的白血病得到彻底治疗，并且病情持续约10个月(N.Engl J Med 2011；365:725-733,2011年8月25日,Sic.Transl.Med2011 Aug 10；3(95):95ra73)。本文使用的CAR-T对应于第二代，使用4-1BB作为共刺激结构域并且使用CD3ζ作为信号转导结构域。CAR-T细胞的抗原结合结构域识别在白血病癌细胞表面发现的CD19作为抗原。
此外，有报道称，当通过给予CTL019治疗患有急性白血病患者时，30例患者中有27例完全缓解，所有患者中有67％的患者完全缓解2年，并且78％的患者存活2年。鉴于受试者患者是复发性或难治性患者，这个结果是非常令人惊讶的(N Engl j Med 2014；371:1507-1517,2014年10月16日)。
目前，对于使用各种CAR-T细胞的治疗方法，已经进行了各种血液癌症如淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)等的临床试验，并且预计CAR-T将成为市场上可获得的可用药物。由于使用CAR-T细胞的癌症治疗是自源方法，因此该产品不能大规模生产；然而，这是患者特异性治疗，因此其治疗效果之高是现有的抗癌药物无法相比的。
[专利文献]
韩国专利申请公开号10-2013-0124521
[非专利文献]
Immunol Rev,2014,257(1):107-126
N Engl J Med 2014；371:1507-1517,2014年10月16日
Science Translational Medicine 18 Feb 20115:第7卷，第275期，第275ra22页
发明内容
与常规已知的CAR-T细胞相比，本发明的任务是提供具有显著优异的表达率和治疗效果的CAR和CAR-T细胞。更具体地，本发明的任务是在第二代CAR-T细胞和第三代CAR-T细胞中提供能够被引入到各种CAR-T细胞中的共刺激结构域，作为在功能上起主要作用的共刺激结构域。此外，本发明的任务是提供能够与在特定癌细胞的表面上表达的抗原结合且还能够形成CAR-T细胞的各种抗原结合结构域。此外，本发明的任务是提供一种用于改善各种CAR-T细胞的表达率及其治疗效果的方法，其中嵌合抗原受体的特征在于具有另外的氨基酸序列，所述氨基酸序列可被另外地引入到抗原结合结构域和铰链区之间。
实现任务的手段
作为用于实现上述任务的手段，本发明描述了以下技术构思。
公开了嵌合抗原受体和其中表达有该受体的CAR-T细胞，该嵌合抗原受体包含抗原结合结构域；铰链区；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域，其特征在于，独立地包含特异性共刺激结构域或特异性抗原结合结构域，以及在抗原结合结构域和铰链区之间添加的特定氨基酸序列，或者在于该胞质信号转导结构域使用其中包含额外的谷氨酰胺的正常人的CD3ζ信号转导结构域而不是Jurkat T细胞的CD3ζ信号转导结构域，或者通过包含它们的组合。
发明效果
本发明中描述的包含抗原结合结构域的CAR-T细胞；或共刺激结构域；或信号转导结构域具有治疗效力和表达率显著优异的效果。
附图说明
为了举例说明本发明的目的，在附图中示出了当前的实施方式。然而，应该注意，本发明不限于附图中示出的实施方式的精确布置和方法。
图1示出呈现(representing)在本发明中所描述的CAR-T细胞的一个实施方式的主要功能要素的逆转录病毒载体和转基因。具体地，该图示出临床级逆转录病毒载体，其呈现突变的IL13(E11K.R64D.S67D.R107K)、人类CD8α铰链和人类CD8/人类CD3跨膜结构域的表达，以赋予比IL13的两个氨基酸替换(Glu-11、Arg-107)和突变体人CD28(RLLH→RGGH)、人TNFRSF9和健康人的CD3ζ信号转导结构域更高的抗原亲和力，以提高CAR表达率。该图并没有以不断积累的形式例示。
图2示出在抗原结合结构域和铰链区之间添加三个甘氨酸后表达率增加，以增加CAR蛋白质的溶解度从而增加嵌合抗原受体的表达。
图3示出当使用人CD28的突变体(RLLH→RGGH)时增加表达率以增加CAR蛋白质的嵌合抗原受体的表达。
图4示出使用流式细胞术分析法来分析转化的T细胞的结果，以验证CAR-T细胞的纯度和通过用于临床试验的生产过程设置产生的CAR的表达率。该图示出CAR表达率和T细胞纯度。
图5示出引入其中两个位置被替换的IL13(Glu-11、Arg-107)和其中四个位置被替换的IL13(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K)的T细胞的细胞毒性的比较。
图6示出由其中四个位置被替换的IL13(E11K.R64D.S67D.R107K).TNFRSF9.CD3ζ组成的CAR-T细胞的人脑癌细胞系U251中的CAR抑制率依赖的抗癌活性增加。
图7示出以0.5:1的比例、用其中四个位置被替换的IL13(E11K.R64D.S67D.R107K).TNFRSF9.CD3ζ组成的CAR-T细胞培养人脑癌细胞系U251(IL13Rα2过表达)(其是靶标细胞)或者HUVEC(缺乏IL13Rα2表达)(其是正常细胞对照)19小时后的IFN-γ细胞因子产生。
图8示出在用包含其中四个位置被替换的IL13(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K).TNFRSF9.CD3ζ的CAR-T细胞培养人脑癌细胞系U251(其是靶标细胞)后在IFN-γ细胞因子分泌方面的剂量依赖性(CAR+T细胞数)的增加。
图9A是简要示出使用包含其中四个位置被替换的IL13(E11K.R64D.S67D.R107K)TNFRSF9.CD3ζ的CAR-T细胞的裸鼠体内效力实验方法的图像；而图9B示出在用CAR-T细胞或PBS处理后12天测量动物的肿瘤尺寸的结果。
图9C示出在用CAR-T细胞或PBS处理后15天从裸鼠取出的癌组织的形状、大小和重量。
图10A是来自用TMZ+PBS(PBS为每天静脉内给予一次，而TMZ和IL-2为每天腹膜内和静脉内给予一次，持续4天)处理15天后的裸鼠的、用抗人CD3抗体染色以染色人CAR-T或T细胞的去除的癌组织的图像。
图10B是来自用TMZ+YYB103(TMZ和包含其中四个位置被替换的IL13(E11K.R64D.S67D.R107K)TNFRSF9.CD3ζ的CAR-T细胞为每天静脉内给予一次，而TMZ和IL-2为每天腹膜内和静脉内给予一次，持续4天)处理后15天的裸鼠的、用抗人CD3抗体染色以染色人CAR-T或T细胞的去除的癌组织的图像。
图11A是来自用TMZ+PBS(PBS为每天静脉内给予一次，而TMZ和IL-2为每天腹膜内和静脉内给予一次，持续4天)处理后15天的裸鼠的、用H&E染色的去除的癌组织的图像。
图11B是来自用TMZ+YYB103(TMZ和包含其中四个位置被替换的IL13(E11K.R64D.S67D.R107K)TNFRSF9.CD3ζ的CAR-T细胞为每天静脉内给予一次，而TMZ和IL-2为每天腹膜内和静脉内给予一次，持续4天)处理15天后裸鼠的、用H&E染色的去除的癌组织的图像。
图12示出抗血管生成CAR的产生。成功的抗癌CAR疗法不仅需要抗原特异性CAR-T细胞，还需要CAR-T细胞接近癌细胞并维持在免疫抑制性肿瘤微环境中的CAR-T细胞功能。因此，产生了抗血管生成CAR。图12A例示呈现抗血管生成CAR的主要功能要素的逆转录病毒载体和转基因；图12B示出使用流式细胞术分析法来分析转化的细胞对抗血管生成CAR的细胞表面表达的检查的结果。
图13至图16示出四种CAR产生，它们靶向各种癌症的主要肿瘤抗原。相应附图中的A例示代表主要功能要素的逆转录病毒载体和转基因；相应附图中的B示出使用流式细胞术分析法来分析转化的细胞对抗血管生成CAR的细胞表面表达的检查的结果。
具体实施方式
根据本发明的CAR-T细胞是其中引入了将癌细胞识别为抗原的受体基因的重组T细胞，其中T细胞由以下各项组成：识别抗原的抗原结合结构域；连接抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区(或间隔子)；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域。
作为其中传递主要信号的位点并存在于细胞膜外部的抗原结合结构域识别表达特定抗原的癌细胞。因此，在使用CAR-T细胞的癌治疗中，由抗原结合结构域决定详细的治疗对象。本发明描述了例如，能够与胶质母细胞瘤中的过表达的IL13Rα2特异性结合的嵌合抗原受体，但抗原结合结构域不特别局限于此。胶质母细胞瘤(GMB)或多形性胶质母细胞瘤是最常见的脑肿瘤之一，其占脑肿瘤约12％至15％，并且这是一般恶性脑癌。由于这种癌症与结直肠癌或肺癌相比相对少见，因此对其治疗方法的研究尚未积极进行。胶质母细胞瘤的细胞与星形胶质细胞相似，但是星形胶质细胞起着维持神经细胞，并且给予神经营养和防御对脑组织有损伤的反应的作用。认为干细胞或未成熟的星形胶质细胞的基因组异常与胶质母细胞瘤的发生和恶化有关。对于胶质母细胞瘤的治疗，使用手术、放射疗法和化学疗法。作为化学疗法，使用替莫唑胺、洛莫司汀和卡莫司汀等，而近来进行了如肿瘤疫苗治疗、分子靶向治疗的临床试验。然而，对于胶质细胞瘤的治疗仍没有有用的治疗剂，并且特别地，尽管对胶质细胞瘤的治疗尝试利用了使用其中第11位被E11Y替换的突变体IL13的CAR-T细胞过表达IL13Rα2，但贝勒医学院组(Baylor college of medicine group)报道称，利用使用其中第11位被E11Y替换的突变体IL13的CAR-T细胞的治疗效果在体内并不好。然而，在本发明中所描述的CAR-T细胞表现出对胶质母细胞瘤的优异治疗效果。
与IL13Rα2结合的抗原结合结构域的序列与SEQ ID NO.1相同，并且特别地在本发明中新描述了第11位、第64位、第67位、第107位分别被E11K.R64D.S67D.R107K替换的突变体IL13。然而，应该注意，在相应位置中替换的氨基酸可以用具有与特定氨基酸类似性质的氨基酸替换。因此，在第11位中，氨基酸可以用精氨酸(R)或组氨酸(H)而不是赖氨酸(K)替换；在第64位和第67位中，用谷氨酸(E)而不是天冬氨酸(D)替换；并且在第107位中，用组氨酸(H)而不是赖氨酸(K)替换。
在本发明中描述的其中四个位置发生突变的IL13(E11K.R64D.S67D.R107K)和在相同位置用具有相同性质的氨基酸替换的类似物具有改善的抗原亲和力。
可以生产本发明的抗原结合结构域以与在各种癌细胞中表达的抗原以及在胶质母细胞瘤中过表达的IL13Rα2结合。例如，在本发明中描述了能够与血管生成活性相关的抗原结合的抗原结合结构域(SEQ ID NO.2)；与作为胶质母细胞瘤和肺癌等的主要肿瘤抗原EGFRvIII结合的抗原结合结构域(SEQ ID NO.3)；与作为胶质母细胞瘤、乳癌、前列腺癌等的肿瘤抗原的EphA2结合的抗原结合结构域(SEQ ID NO.4)；与作为癌干细胞特性(carcinoma stemness)的抗性标志物(resistant marker)的αVβ3和受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)如胰腺癌、肺癌和乳癌的厄洛替尼结合的抗原结合结构域(SEQ ID NO.5)；与在胰腺癌、胶质母细胞瘤、乳癌等中的过表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1结合的抗原结合结构域(SEQ ID NO.6)。图12至图16示出包含上述抗原结合结构域的5种CAR产生。相应附图例示呈现主要功能要素的逆转录病毒载体和转基因并且示出使用流式细胞术分析法来分析转化的细胞对抗血管生成CAR的细胞表面表达的检查的结果。
本发明的进一步的特征在于在抗原结合结构域和铰链区之间另外引入三个甘氨酸，以增加CAR蛋白质的溶解度从而增加嵌合抗原受体的表达。根据本发明人的研究，显示其中在抗原结合结构域与铰链区之间引入3个甘氨酸的受体与其中不引入3个甘氨酸的受体之间的溶解度的差异为约10倍，并且该差异导致在关于CAR-T细胞产生的表达率方面的显著差别，并且表达率的差异最终与治疗效果直接相关。出于这个原因，这可被认为是非常先进的技术发展。此外，所述三个甘氨酸(G)可被作为具有相似性质的氨基酸的丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)替换。
本发明的又一个特征在于使用特定的共刺激结构域。在CAR-T细胞中，当抗原结合结构域和抗原彼此结合时，信号通过胞质信号转导结构域(CD3ζ)激活T细胞免疫应答。共刺激结构域是其中传递共刺激信号的位点，在传递信号中起作用，使得识别与抗原结合结构域结合的特异性抗原的CAR-T细胞引起免疫应答以帮助体内的增殖和持久性更长。同时，这样的共刺激结构域是在第一代CAR-T细胞中不存在的成分，第二代CAR-T细胞使用一个共刺激结构域，而第三代CAR-T细胞使用两个共刺激结构域。在如第1代、第2代、第3代等的各代的细胞内的共刺激结构域中，CAR-T细胞改善体内的增殖并使持久性更长，因此开发了与基因重新组合的细胞，使得即使在注射少量细胞之后仍在体内制造了许多抗癌细胞的CAR-T细胞，并且即使在注射之后细胞仍可在体内持续较长时间。即，在第一代的情况下，存在信号转导方面的限制，因为它仅包含CD3ζ而没有共刺激结构域，而在第二代和第三代中，另外引入了4-1BB或OX40等，从而得以改善在体内的增殖并且持久性更长。
此外，本发明人使用在CD28的预定位置产生突变体的共刺激结构域，使得通过改善CAR-T细胞的表达率，即使使用较少的CAR-T细胞也能够表现出治疗效果，此外，本发明人发现通过使用其中组合了突变的CD28和TNFRSF9的两个共刺激结构域，“在体内的增殖和持久性”得到改善，获得治疗效力的增加。
因此，本发明的其他技术特征在于嵌合抗原受体和其中表达有该受体的CAR-T细胞，该嵌合抗原受体由以下各项组成：抗原结合结构域；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域，其中共刺激结构域包含CD28或TNFRSF9，或CD28和TNFRSF9。此处，CD28可以包含用于增加嵌合抗原受体的表达的突变(序列编号6至序列编号9被从RLLH替换为RGGH)。用序列编号7和序列编号8表示可以作为本发明的共刺激结构域被包含的野生型CD28和TNFRSF9的氨基酸序列。此外，在突变的CD28(序列编号6至序列编号9被从RLLH替换为RGGH)中，替换的氨基酸是甘氨酸(G)，但它可以被与其相似的氨基酸替换，例如丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。本发明的铰链区是连接抗原结合结构域和跨膜结构域的部分，这也被称为间隔子。铰链区具有从T细胞膜扩展抗原结合结构域的目的。作为本发明的铰链区，可以使用在相关技术领域中通常使用的铰链区，例如铰链区可以来源于CD8铰链区(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)。如上所述，本发明的另一个技术特征在于在抗原结合结构域和铰链区之间另外引入的三个甘氨酸。
本发明的跨膜结构域起到CAR分子的接头的作用，同时起到将从抗原结合结构域接收的信号传递到共刺激结构域和胞质信号转导结构域的作用。跨膜结构域不限于本发明的跨膜结构域，可以使用用于CAR生产的典型跨膜结构域，例如，可以使用人CD8/CD3跨膜结构域(SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12)。
作为本发明的胞质信号转导结构域，使用其中包含额外的谷氨酰胺的正常人的CD3ζ信号转导结构域而不是Jurkat T细胞的CD3ζ信号转导结构域，并且额外的谷氨酰胺意指SEQ ID NO.13中的第50位的谷氨酰胺(Q)。
本发明的技术构思包括使用单独的上述技术特征和使用它们的组合。即，本发明的技术特征的实现包括包含本发明中描述的预定抗原结合位点的所有CAR-T细胞；其中在抗原结合结构域和铰链区之间另外引入三个甘氨酸的CAR-T细胞和包含本发明中描述的共刺激结构域的CAR-T细胞。
可以使用相关技术领域中已知的重组方法来获得构成本说明书中描述的结构域的多肽的核酸序列，例如，可以通过使用标准技术从表达该基因的细胞中筛选文库或诱导来自已知载体的基因以包含相同基因，或者从包含相同基因的细胞或组织直接分离来获得。可替代地，感兴趣的基因可以通过合成而不是克隆产生。
在相关的技术领域中已知将基因引入和表达的方法。可以通过相关技术领域已知的任何方法将表达载体快速引入宿主细胞中。例如，在本发明中，可通过将最终产生的CAR基因片段连接到用XhoI/NotI切割的MFG逆转录病毒表达载体上来产生CAR-T细胞。应该理解，本发明包括用于该结构的每个组分的任何各种突变体。
待治疗的癌症可以包括非实体瘤(例如，血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)以及胶质母细胞瘤，或者可以包括实体瘤。
因此，产生重组CAR-T细胞并将细胞注入癌症患者中需要几个步骤。从患者血液中分离T细胞，然后用表达载体将设计有CAR的DNA引入T细胞中，使CAR-T细胞增殖，然后注射回患者体内。
实施本发明的方式
在下文中，通过实施例来具体说明本发明。然而，请注意，以下实施例并不意图以任何含义限制本发明的技术范围。
实施例1：具有与癌细胞中过表达的IL13Rα2特异性结合的第2代(YYB-103，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)和第3代(YYB-103A，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)嵌合抗原受体的表达载体的构建
本发明人制备了突变体IL13(E11K.R64D.S67D.R107K)以赋予比IL13的两个氨基酸替换(Glu-11、Arg-107)更高的抗原亲和力，并制备了包含CAR-T细胞的胞质信号转导结构域的一个共刺激结构域(TNFRSF9)和两个共刺激结构域(CD28，TNFRSF9)的嵌合抗原受体(图1)。在本发明中，在抗原结合结构域和铰链区之间添加三个甘氨酸以增加CAR蛋白质的溶解度从而增加嵌合抗原受体的表达(图2)。用于本发明的CD28胞质信号转导结构域包含用于增加CAR蛋白质的溶解度的突变体(RLLH→RGGH)人CD28DNA序列(图3)。使用健康正常人的人CD3ζ信号转导结构域而不是Jurkat T细胞的CD3ζ信号转导结构域。使用科学文献和公开的数据库优化人IL13(P35225.1)、人CD3(P20963-1)、人CD8α(P01732)、人CD28(P10747)、人TNFRSF9(Q07011)和人κ轻链信号序列(HuVHCAMP)，产生由密码子优化合成的DNA组成的第2代和第3代嵌合抗原受体(YYB-103，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ和YYB-103A，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ)(图1)。完整的结构包括kozak共有核糖体结合序列，人κ轻链信号序列(HuVHCAMP)、人IL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟蛋白质序列(人IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))，为了增加CAR蛋白质的溶解度以增加嵌合抗原受体的表达而在抗原结合结构域和铰链区之间添加三个甘氨酸(GGG)(图2)、人CD8α的铰链区、人CD8/CD3跨膜结构域、转化为突变体(RLLH→RGGH)的细胞溶质CD28的共刺激结构域、细胞溶质TNFRSF9的共刺激结构域、健康人的CD3ζ胞质信号转导结构域和Xhol/NotI切割部分。在序列编号14和15中表示YYB-103和YYB-103A的整个序列。将最终产生的CAR基因片段与用XhoI/NotI切割的MFG逆转录病毒表达载体(Emtage PC等,Clin Cancer Res,200814L8112-8122)连接(图1)。在本实施例中，为了比较嵌合抗原受体的活性，另外制备IL13的两个氨基酸替换(Glu-11、Arg-107)的第3代嵌合抗原受体(YYB-103B，IL13(E11K.R107K).28.TNFRSF9.CD3ζ)(SEQ ID NO.16)。
实施例2：转化为与癌细胞中过表达的IL13Rα2特异性结合的第2代(YYB-103，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)和第3代(YYB-103A，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ)嵌合抗原受体的T细胞的产生
通过用实施例1中产生的逆转录病毒表达载体YYB-103或YYB-103A暂时感染phoenix-empo和phoenix-eco细胞产生具有表达CAR的高效价的PG13克隆，随后使用来自感染的phoenix-empo和phoenix-eco细胞的非细胞载体原种转导PG13细胞。在使用抗IL-13单克隆抗体(BD Pharmingene)染色PG13/YYB-103细胞后，通过流式细胞仪获得具有高效价的单克隆。根据极限稀释测定法通过第二亚克隆产生具有高效价的PG13/YYB-10单克隆。亚克隆PG13/YYB-103-13表现出稳定高的CAR表达，并被选择用于转导人的外周血单核细胞(PBMC)。使用流式细胞术分析，用抗IL-13单克隆抗体(BD Pharmingen)检查PBMC/YYB-103-13的转导效率。PG13/YYB-103-13细胞的上清液包含逆转录病毒并收集用于PBMC的基因修饰。通过将从健康人供体获得的全血置于Ficoll Paque(GE Healthcare)中、使用离心分离PBMC。通过在人IL-2(NOVARTIS)100IU/mL的条件下加入抗CD3单克隆抗体(eBioscience)100ng/mL来培养分离的PBMC以激活T细胞部分(BL Levine,Cancer Gene Therapy,2015,22:79-84)。在激活2至3天后，大部分细胞为T细胞，并且以0-2％的比例包含自然杀伤细胞。在激活步骤2至3天后，使用逆转录病毒上清液在2天内对T细胞进行2次转导，并且洗涤，然后在烧瓶中使细胞增殖4至7天。将细胞在搅拌平台装置(WAVE生物反应器系统)中培养12至14天。将IL-2维持在100IU/mL的量。用这种方式修饰的CAR-T细胞用于分析实验(图4)。
实验实施例1：转化为嵌合抗原受体的T细胞表面的CAR表达率的检查
实验方法(流式细胞分析)
对于流式细胞术(>30,000个事件)，使用BD LSRII设备(Becton Dickinson)和BDFACSDiva软件(Becton Dickinson)。具体地，在加入PE结合的抗人IL-13单克隆抗体(BDPharmingen)之前，将细胞用含有2％牛血清白蛋白的PBS洗涤一次。洗涤后，在4℃下在光线被阻挡的状态下使细胞与各自的抗体反应30分钟，然后洗涤一次，此后检查转导的T细胞表面CAR的表达率。此外，为了验证IL13Rα2和IL13Rα1的细胞表面表达，使用抗人IL13Rα抗体(R&D systems)、驴抗山羊IgG藻红蛋白二抗(R&D systems)和抗人IL13Rα藻红蛋白(R&Dsystems)，并且作为对照，包含同种型抗体。
实验结果
为了验证在实施例1中产生的IL13Rα2特异性CAR(YYB-103,IL13.E11K.R107K.TNFRSF9.CD3ζ；YYB-103A,IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ；YYB-103B,IL13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ)在T细胞表面上表达，根据实施例2进行T细胞培养12-14天，然后根据实验方法进行流式细胞术分析。作为分析的结果，在七(7)个献血者中，活T细胞表面上表达的嵌合抗原受体的表达率为90.5％至92.8％。在维持培养时，IL13Rα2特异性嵌合抗原受体的表达稳定维持4周，无需额外的T细胞激活或转导。此外，在培养的细胞中，分析了全部T细胞、CD4T细胞、CD8T细胞，B细胞和单核细胞的比例。结果，证实了B细胞以0.5-1.2％的量存在，并且不存在单核细胞。
实施例3：转化为与癌细胞中过表达的IL13Rα2特异性结合的第2代(YYB-103，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)和第3代(YYB-103A，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)嵌合抗原受体的T细胞的细胞毒性和IFN-γ分泌的测量
使用实施例2中产生的CAR-T细胞测量IL13Rα2特异性细胞毒性和IFN-γ分泌。为了测量IL13Rα2特异性细胞毒性和IFN-γ分泌，使用过表达IL13Rα2的胶质母细胞瘤人细胞系U251和作为正常细胞对照的不表达IL13Rα2的原代HUVEC。
实验实施例1：过表达IL13Rα2的胶质母细胞瘤的细胞毒性检查
实验方法
为了测量IL13Rα2特异性CAR-T细胞效应物(IL13Rα2-特异性CAR+T细胞效应物)的细胞毒性，使用DELFIA(Perkin Elmer)试剂盒进行细胞毒性测定。具体地，在细胞激活之后，将CAR-T细胞效应物细胞用于抗CD3时间为12至14天，并且在其中将效应物细胞置于其中IL13Rα2靶标细胞以5:1(效应物:靶标)的比例和0.625:1(效应物:靶标)的比例存在的96孔板中的条件下进行三次实验并在37℃下反应2小时。在该分析实验中使用的96孔板中，每孔添加5,000个靶标细胞，并且过表达IL13Rα2的胶质母细胞瘤细胞系U251用作使用的靶标细胞，而原代HUVEC用作正常细胞对照。
实验结果
分析过表达IL13Rα2的靶标癌细胞(U251)是否被根据本发明产生的IL13Rα2-特异性CAR(YYB-103，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ；YYB-103A，IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ；YYB-103B,IL13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ)T细胞有效杀伤。作为实验方法，使用通过与相应的激活CAR-T细胞一起培养上述靶标癌细胞(U251)和正常细胞(HuVEC)来比较和分析细胞毒性的方法。如图5所示，在所有情况下，获得的结果是，当表达对IL13Rα2特异性的CAR时，与未被转导的激活的T细胞相比，CAR表达以高水平诱导表达IL13Rα2的胶质母细胞瘤U251细胞的杀伤(图5)。具体地，在表达本发明实施例2中产生的YYB-103(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)、YYB-103A(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)和YYB-103B(IL13.E11K.R107K.28TNFRSF9.CD3ζ)CAR的T细胞的情况下，随着E:T比例增加，细胞毒性逐渐增加；然而，在不表达CAR的T细胞的情况下，细胞毒性很少增加。此外，作为比较YYB-103B(IL13.E11K.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ)CAR(其中IL13的两个氨基酸被替换)和YYB-103(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ)以及YYB-103A(IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.28.TNFRSF9.CD3ζ)(其中IL13的四个氨基酸被替换，其用于赋予更高的抗原亲和力)的结果，在其中只有2个氨基酸被替换的YYB-103B的情况下，在E:T比例为5:1时显示出67.4％的细胞毒性，但当使用YYB-103和其中IL13的四个氨基酸被替换的突变体IL13.E11K.R64D.S67D.R107K的YYB-103A时，分别显示出85.6％和87.7％的细胞毒性。这表明其中引入其中IL13的四个氨基酸被替换的突变体IL13.E11K.R64D.S67D.R107K的T细胞的细胞毒性在第2代和第3代中均优于其中引入其中IL13的两个氨基酸被替换的突变体IL13.E11K.R107K的T细胞的细胞毒性。
作为与靶标细胞进行比较的对象，从使用不表达IL13Rα2但最低限度表达IL13Rα1的HUVEC细胞作为正常细胞对照的实验结果，确认对IL13Rα2特异性的CAR-T细胞具有非常弱的细胞毒性(12.3-14％的细胞毒性)(图5)。这表明，由于表达IL13Rα1而不表达IL13Rα2的HUVEC细胞的性质，实验中使用的嵌合抗原受体特异性结合IL13Rα2。通过本实验实施例证明，IL13Rα2特异性嵌合抗原受体T细胞不显示对正常细胞(HUVEC)的毒性，并且可以显著杀伤表达IL13Rα2的靶标癌细胞(U251)。
实验实施例2：根据CAR表达率测量抗癌活性变化
实验方法
为了根据IL13Rα2特异性CAR的表达率来测量抗癌活性变化，进行细胞毒性分析。具体地，将第2代IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFSFR9.CD3ζ(YYB-103)用作CAR-T细胞的效应物细胞，而使用过表达IL13Rα2的U251细胞系作为靶标细胞。对于细胞毒性分析，效应物细胞与靶标细胞的比例为0.625:1和5:1，并且表达CAR的T细胞的比例为0-70％。细胞毒性分析的详细方法与实验实施例2的实验方法相同。
实验结果
在其中不存在表达IL13Rα2特异性CAR的T细胞的情况下，在5:1和0.625:1的比例下分别显示16.4％和2.5％的细胞毒性。然而，可以看出，随着表达IL13Rα2-特异性CAR的T细胞的比例增加，细胞毒性增加，并且证明当表达IL13Rα2-特异性CAR的T细胞的比例在5:1和0.625:1的比例下时，分别显示为70％、86％和26％的细胞毒性，因此IL13Rα2特异性嵌合抗原受体T细胞可以杀伤IL13Rα2特异性靶标癌细胞(U251)(图6)。
实验实施例3：转化为IL13Rα2特异性嵌合抗原受体的T细胞的细胞因子(IFN-γ)的产生的检查
实验方法
在96孔组织培养板中，每孔放入200ul的培养基，并加入靶标细胞((1×10^5)。为了根据CAR表达率测量细胞毒性，将未转导的激活的T细胞和10-70％的对IL-13Rα2特异性的CAR-T细胞放入制备的具有效应物(1×10^5)的96孔组织培养板中，同时通过重复实验培养。此外，为了验证CAR-T细胞是否显示数量依赖性抗癌活性增加，从7500的CAR-T进行连续稀释，然后将其放入效应物中并同时通过重复实验进行培养。在培养19小时后，根据分析仪制造商的指导(图7和图8)，使用培养上清液用ELISA分析仪(R&D systems)进行IFN-γ分析实验。
实验结果
通常，激活的T细胞产生有助于其生长和激活的细胞因子，并且在它们之中，IFN-γ是由CD8细胞、CD4T细胞和NK细胞等分泌的，并且在固有免疫和适应性免疫反应中起重要作用。特别地，这在将T细胞移动到肿瘤部位以及抑制癌症发生中起重要作用。通过本实验实施例，证明了当表达IL13Rα2特异性CAR的T细胞遇到靶标细胞时IFN-γ的产生是否增加。根据实验方法，将表达IL13Rα2特异性CAR的T细胞与靶标细胞(HUVEC细胞、U251细胞)同时培养，然后通过ELISA分析对IFN-γ进行定量。
图7显示根据所产生的嵌合抗原受体的转导比，当与IL13Rα2抗原结合时增加的IFN-γ，并且可以理解，IFN-γ的产生方面取决于CAR-T细胞的比例而变化。在使用U251(其是靶标癌细胞)的情况下，其中未转导嵌合抗原受体的T细胞几乎不产生IFN-γ。在其中转导了嵌合抗原受体的T细胞的情况下，IFN-γ的产生增加最高达30％比例，并且假定产生不再增加，确定的是30％比例的CAR-T细胞足以杀伤靶标癌细胞。假定在HUVEC(其是不过表达IL13Rα2的细胞系)的情况下，即使CAR-T的比例增加，IFN-γ的产生也不增加，看来好像由CAR-T产生IFN-γ对IL13Rα2抗原是特异性的。图8显示在两个供体YY6和YY7中根据CAR+T细胞数量的增加的IFN-γ，随着细胞数量增加，IFN-γ也增加。这表明在杀伤癌细胞方面，CAR-T细胞依赖于细胞的数量。
实施例4：使用YYB-103评估体内效力
为了评估YYB-103是否在体内显示实际的效力，将癌细胞皮下注射到裸鼠中以诱导肿瘤，在用YYB-103治疗后，肿瘤组织中的肿瘤尺寸的变化和CAR-T细胞的持久性得到证实。
实验实施例1：使用U251细胞系产生肿瘤裸鼠并检查YYB-103的效力
将U251细胞系皮下注射到裸鼠中。9天后，静脉内给予一次对照PBS和治疗组YYB-103。将替莫唑胺(TMZ)和IL-2腹膜内和静脉内给予至对照组和实验组，每天一次，持续4天。在治疗12天后测量肿瘤的大小，并在治疗15天后，进行尸体检查以测量肿瘤组织的重量和进行组织学分析(图9)。
实验结果
作为测定治疗12天后肿瘤尺寸以测量给予到建立的皮下肿瘤裸鼠动物模型中的YYB-103的效力的结果，在对照组中，肿瘤尺寸减小约44％，从234.8mm3到132.4mm3。然而，在给予YYB-103的治疗组的情况下，肿瘤尺寸减小约78％，从288.2mm3到64.6mm3。由此可见，与对照组相比，治疗组显示出约1.8倍的治疗效果(图9B)。作为测量在治疗15天后通过进行尸体检查获得的肿瘤组织的重量的结果，可以看出用治疗组YYB-103治疗的裸鼠的肿瘤组织的重量比用对照组治疗的小鼠的肿瘤组织的重量轻(图9C)。与此一起，当用YYB-103治疗时，示出肿瘤组织中的血管生成被抑制，这与用对照组治疗的肿瘤组织不同(图11A和图11B)。
为了验证YYB-103在治疗15天后的肿瘤组织中的持续，使用抗人CD3抗体(其是人T细胞标记物)进行染色。结果表明，使用对照组治疗的肿瘤组织没有被染色，因为该小鼠不含人T细胞(图10A)。
证实了用YYB-103治疗的肿瘤组织存在大量的人T细胞，并且这直接影响用YYB-103治疗的肿瘤尺寸的减小(图10B)。
作为在治疗15天后通过对肿瘤组织进行H&E染色观察肿瘤组织的结果，可以看出，在未用YYB-103治疗的组中，观察到许多血管。因此，似乎由于YYB-103，肿瘤部位的血管生成受到抑制，这获得侵袭性肿瘤的减少(图11A和图11B)。
实施例5：产生能够识别各种实体瘤和血管生成性血管的CAR的构建，以及产生稳定表达CAR的PG13细胞系。
如果允许新血管在肿瘤部位中生长的血管生成受到抑制，则可以抑制癌细胞的转变和生长。成功的抗癌CAR疗法不仅需要抗原特异性CAR-T细胞，还需要CAR-T细胞接近癌细胞和在免疫抑制性肿瘤微环境中维持CAR-T细胞功能。因此，为了达到目的而产生了抗血管生成CAR(图12A)。
产生靶向EGFRvIII(其是胶质母细胞瘤、肺癌等的主要肿瘤抗原)的CAR(图13A)。
EphA2(膜结合促红细胞生成素产生肝细胞受体酪氨酸激酶A2类)在乳癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌和脑癌等中是过表达的，因此产生靶向EphA2的CAR(图14A)。
整合素α(V)β(3)(αVβ3)(其是膜糖蛋白受体)在激活的肿瘤上皮细胞中是高度表达的。产生靶向αVβ3(作为癌干细胞特性的抗性标志物)和受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)如胰腺癌、肺癌和乳癌的厄洛替尼的CAR(图15A)。
GPC1对于癌细胞的有效生长、转变和血管生成是重要的，并且GPC1在胰腺癌、乳癌、胶质母细胞瘤中是过表达的(图16A)。
实验实施例1：转化为能够识别血管生成性血管、EGFRvIII、EphA2、整合素αVβ3或GPC1的CAR的PG13细胞表面上的CAR表达率的检查
实验方法(流式细胞分析)
对于流式细胞术(>30,000个事件)，使用BD LSRII设备(Becton Dickinson)和BDFACSDiva软件(Becton Dickinson)。具体地，在加入抗体之前，将细胞用含有2％牛血清白蛋白的PBS洗涤一次。洗涤后，在4℃下在光线被阻挡的状态下使细胞与各自的抗体反应30分钟，然后洗涤一次，并检查转化为CAR的PG13细胞表面上的CAR表达率，使用抗人纤连蛋白单克隆抗体、PE结合的抗人EphA2单克隆抗体(R&D Systems)、PE结合的抗人αvβ3单克隆抗体(BioLegend)，并且在其中不结合荧光的抗体的情况下，另外使用PE结合的抗小鼠IgG1单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)或驴抗山羊IgG藻红蛋白二抗(R&D systems)来进行荧光染色。
实验结果
作为确认转导的PG13细胞系中的各自的CAR的表达率的结果，证实了嵌合抗原受体在几乎所有活的PG13细胞系的表面上表达(图12B、图13B、图14B、图15B和图16B)。
工业适用性
本发明涉及在癌症治疗领域中迅速发展的CAR-T细胞，并且适用于在患者特异性癌症治疗领域中的医疗行业。
序列表自由文本
SEQ ID NO.1{与IL13Rα2结合的抗原结合野生型IL-13结构域的序列}
长度：112
类型：配体蛋白质
名称：人
序列：
GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN
SEQ ID NO.2{能够与血管生成活性相关的抗原结合的抗原结合结构域}
长度：92
类型：配体蛋白质
名称：人
序列：
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVLQPPSTATISGLKPGVDYTITVYAVVERNGRELNTPPISINYRTHHHHHH
SEQ ID NO.3{与EGFRvIII结合的抗原结合结构域}
长度：252
类型：scFv蛋白质
名称：人
序列：
QVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNVPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDL
SEQ ID NO.4{与EphA2结合的抗原结合结构域}
长度：141
类型：配体蛋白质
名称：人
序列：
DRHTVFWNSSNPKFRNEDYTIHVQLNDYVDIICPHYEDHSVADAAMEQYILYLVEHEEYQLCQPQSKDQVRWQCNRPSAKHGPEKLSEKFQRFTAFALAKEFKAGHSYYYISKPIHQHEDRCLRLKVTVSGEQKLISEEDL
SEQ ID NO.5{与αVβ3结合的抗原结合结构域}
长度：104
类型：配体蛋白质
名称：人
序列：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNEGSKPISINYRTEQKLISEEDL
SEQ ID NO.6{与磷脂酰肌醇蛋白聚糖1结合的抗原结合结构域}
长度：418
类型：配体蛋白质
名称：人
序列：
TSPCDNFDCQNGAQCIVRINEPICQCLPGYQGEKCEKLVSVNFINKESYLQIPSAKVRPQTNITLQIATDEDSGILLYKGDKDHIAVELYRGRVRASYDTGSHPASAIYSVETINDGNFHIVELLALDQSLSLSVDGGNPKIITNLSKQSTLNFDSPLYVGGMPGKSNVASLRQAPGQNGTSFHGCIRNLYINSELQDFQKVPMQTGILPGCEPCHKKVCAHGTCQPSSQAGFTCECQEGWMGPLCDQRTNDPCLGNKCVHGTCLPINAFSYSCKCLEGHGGVLCDEEEDLFNPCQAIKCKHGKCRLSGLGQPYCECSSGYTGDSCDREISCRGERIRDYYQKQQGYAACQTTKKVSRLECRGGCAGGQCCGPLRSKRRKYSFECTDGSSFVDEVEKVVKCGCTRCVSEQKLISEEDL
SEQ ID NO.7{野生型CD28}
长度：41
类型：蛋白质
名称：人
序列：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO.8{TNFRSF9}
长度：42
类型：蛋白质
名称：人
序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO.9{铰链区序列-1}
长度：47
类型：蛋白质
名称：人
序列：
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSEQ ID NO.10{铰链区序列-2}
长度：45
类型：蛋白质
名称：人
序列：
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFASEQ ID NO.11{跨膜结构域序列-1}
长度：21
类型：蛋白质
名称：人
序列：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
SEQ ID NO.12{跨膜结构域序列-2}
长度：23
类型：蛋白质
名称：人
序列：
LAYLLDGILFIYGVILTALFLRV
SEQ ID NO.13{包含额外谷氨酰胺的CD3ζ}
长度：113
类型：蛋白质
名称：人
序列：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.14{YYB 103}
长度：359
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT KDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.15{YYB 103A}
长度：400
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.16{YYB-103B,IL13(E11K.R107K).29.TNFRSF9.CD3ζ}
长度：400
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.17{YYB 104}
长度：339
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVLQPPSTATISGLKPGVDYTITVYAVVERNGRELNTPPISINYRTHHHHHHGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSEQ ID NO.18{YYB 104-1}
长度：308
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVLQPPSTATISGLKPGVDYTITVYAVVERNGRELNTPPISINYRTHHHHHHGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.19{YYB 105}
长度：497
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNVPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFALAYLLDGILFIYGVILTALFLRVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.20{YYB 105-1}
长度：538
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVASISTGGYNTFYSDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTSFAMDYWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCMTSTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCLQSFNVPLTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFALAYLLDGILFIYGVILTALFLRVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.21{YYB 106}
长度：388
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSDRHTVFWNSSNPKFRNEDYTIHVQLNDYVDIICPHYEDHSVADAAMEQYILYLVEHEEYQLCQPQSKDQVRWQCNRPSAKHGPEKLSEKFQRFTAFALAKEFKAGHSYYYISKPIHQHEDRCLRLKVTVSGEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.22{YYB 106-1}
长度：429
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSDRHTVFWNSSNPKFRNEDYTIHVQLNDYVDIICPHYEDHSVADAAMEQYILYLVEHEEYQLCQPQSKDQVRWQCNRPSAKHGPEKLSEKFQRFTAFALAKEFKAGHSYYYISKPIHQHEDRCLRLKVTVSGEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR
SEQ ID NO.23{YYB 107}
长度：351
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNEGSKPISINYRTEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.24{YYB 107-1}
长度：392
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTPRGDWNEGSKPISINYRTEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.25{YYB 108}
长度：665
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSTSPCDNFDCQNGAQCIVRINEPICQCLPGYQGEKCEKLVSVNFINKESYLQIPSAKVRPQTNITLQIATDEDSGILLYKGDKDHIAVELYRGRVRASYDTGSHPASAIYSVETINDGNFHIVELLALDQSLSLSVDGGNPKIITNLSKQSTLNFDSPLYVGGMPGKSNVASLRQAPGQNGTSFHGCIRNLYINSELQDFQKVPMQTGILPGCEPCHKKVCAHGTCQPSSQAGFTCECQEGWMGPLCDQRTNDPCLGNKCVHGTCLPINAFSYSCKCLEGHGGVLCDEEEDLFNPCQAIKCKHGKCRLSGLGQPYCECSSGYTGDSCDREISCRGERIRDYYQKQQGYAACQTTKKVSRLECRGGCAGGQCCGPLRSKRRKYSFECTDGSSFVDEVEKVVKCGCTRCVSEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.26{YYB 108-1}
长度：706
类型：蛋白质
名称：人
序列：
MGWSCIILFLVATATGVHSTSPCDNFDCQNGAQCIVRINEPICQCLPGYQGEKCEKLVSVNFINKESYLQIPSAKVRPQTNITLQIATDEDSGILLYKGDKDHIAVELYRGRVRASYDTGSHPASAIYSVETINDGNFHIVELLALDQSLSLSVDGGNPKIITNLSKQSTLNFDSPLYVGGMPGKSNVASLRQAPGQNGTSFHGCIRNLYINSELQDFQKVPMQTGILPGCEPCHKKVCAHGTCQPSSQAGFTCECQEGWMGPLCDQRTNDPCLGNKCVHGTCLPINAFSYSCKCLEGHGGVLCDEEEDLFNPCQAIKCKHGKCRLSGLGQPYCECSSGYTGDSCDREISCRGERIRDYYQKQQGYAACQTTKKVSRLECRGGCAGGQCCGPLRSKRRKYSFECTDGSSFVDEVEKVVKCGCTRCVSEQKLISEEDLGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
<110> 株式会社柳英制药（YOO YOUNG PHARM CO.,LTD.）
<120> 嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的T细胞
<130> KR15P0802PCT
<150> 10-2015-0110788
<151> 2015-08-05
<160> 26
<170> KoPatentIn 3.0
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<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
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Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu
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Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys
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<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
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1 5 10 15
Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly
20 25 30
Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Leu Gln Pro Pro Ser Thr
35 40 45
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50 55 60
Tyr Ala Val Val Glu Arg Asn Gly Arg Glu Leu Asn Thr Pro Pro Ile
65 70 75 80
Ser Ile Asn Tyr Arg Thr His His His His His His
85 90
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
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Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr
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Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly
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Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe
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Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
210 215 220
Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
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Ile Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 4
Asp Arg His Thr Val Phe Trp Asn Ser Ser Asn Pro Lys Phe Arg Asn
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Glu Asp Tyr Thr Ile His Val Gln Leu Asn Asp Tyr Val Asp Ile Ile
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Cys Pro His Tyr Glu Asp His Ser Val Ala Asp Ala Ala Met Glu Gln
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Tyr Ile Leu Tyr Leu Val Glu His Glu Glu Tyr Gln Leu Cys Gln Pro
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Val Ser Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
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<213> 未知（UNKNOWN）
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<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 5
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr
20 25 30
Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
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Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro
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Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Pro Arg Gly Asp
65 70 75 80
Trp Asn Glu Gly Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Gln
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Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
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<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 6
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Val Arg Ile Asn Glu Pro Ile Cys Gln Cys Leu Pro Gly Tyr Gln Gly
20 25 30
Glu Lys Cys Glu Lys Leu Val Ser Val Asn Phe Ile Asn Lys Glu Ser
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Asp Lys Asp His Ile Ala Val Glu Leu Tyr Arg Gly Arg Val Arg Ala
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Thr Ile Asn Asp Gly Asn Phe His Ile Val Glu Leu Leu Ala Leu Asp
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Gln Ser Leu Ser Leu Ser Val Asp Gly Gly Asn Pro Lys Ile Ile Thr
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Asn Leu Ser Lys Gln Ser Thr Leu Asn Phe Asp Ser Pro Leu Tyr Val
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Gly Gly Met Pro Gly Lys Ser Asn Val Ala Ser Leu Arg Gln Ala Pro
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Gly Gln Asn Gly Thr Ser Phe His Gly Cys Ile Arg Asn Leu Tyr Ile
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Asn Ser Glu Leu Gln Asp Phe Gln Lys Val Pro Met Gln Thr Gly Ile
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Leu Pro Gly Cys Glu Pro Cys His Lys Lys Val Cys Ala His Gly Thr
210 215 220
Cys Gln Pro Ser Ser Gln Ala Gly Phe Thr Cys Glu Cys Gln Glu Gly
225 230 235 240
Trp Met Gly Pro Leu Cys Asp Gln Arg Thr Asn Asp Pro Cys Leu Gly
245 250 255
Asn Lys Cys Val His Gly Thr Cys Leu Pro Ile Asn Ala Phe Ser Tyr
260 265 270
Ser Cys Lys Cys Leu Glu Gly His Gly Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu
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290 295 300
Cys Arg Leu Ser Gly Leu Gly Gln Pro Tyr Cys Glu Cys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Tyr Thr Gly Asp Ser Cys Asp Arg Glu Ile Ser Cys Arg Gly Glu Arg
325 330 335
Ile Arg Asp Tyr Tyr Gln Lys Gln Gln Gly Tyr Ala Ala Cys Gln Thr
340 345 350
Thr Lys Lys Val Ser Arg Leu Glu Cys Arg Gly Gly Cys Ala Gly Gly
355 360 365
Gln Cys Cys Gly Pro Leu Arg Ser Lys Arg Arg Lys Tyr Ser Phe Glu
370 375 380
Cys Thr Asp Gly Ser Ser Phe Val Asp Glu Val Glu Lys Val Val Lys
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Cys Gly Cys Thr Arg Cys Val Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
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Asp Leu
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 7
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 8
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
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<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 9
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 10
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ala Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40 45
<210> 11
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 11
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 12
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 12
Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val
20
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<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 14
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Lys Leu Ile
20 25 30
Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn
35 40 45
Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala
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Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys
65 70 75 80
Thr Gln Asp Met Leu Asp Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly
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Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln
100 105 110
Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Lys Glu Gly
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Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
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Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
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Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg
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Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
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Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
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Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
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Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
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Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
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Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
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Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
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Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 15
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Lys Leu Ile
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Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala
50 55 60
Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys
65 70 75 80
Thr Gln Asp Met Leu Asp Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly
85 90 95
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100 105 110
Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Lys Glu Gly
115 120 125
Gln Phe Asn Gly Gly Gly Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
130 135 140
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
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Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
165 170 175
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
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Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Arg Ser Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
210 215 220
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
225 230 235 240
Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
245 250 255
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Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
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290 295 300
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305 310 315 320
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
370 375 380
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 16
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Lys Leu Ile
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Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn
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Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala
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Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly
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Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Lys Glu Gly
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Gln Phe Asn Gly Gly Gly Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
130 135 140
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
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Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
165 170 175
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180 185 190
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Arg Ser Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
210 215 220
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
225 230 235 240
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245 250 255
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Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
275 280 285
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
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Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
305 310 315 320
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
325 330 335
Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
340 345 350
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
355 360 365
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
370 375 380
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
385 390 395 400
<210> 17
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<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 17
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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100 105 110
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115 120 125
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
145 150 155 160
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
165 170 175
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
180 185 190
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
195 200 205
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Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
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325 330 335
Pro Pro Arg
<210> 18
<211> 380
<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 18
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1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser
20 25 30
Trp Arg His Pro His Phe Pro Thr Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly
35 40 45
Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Leu Gln Pro
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Pro Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Ile Thr Val Tyr Ala Val Val Glu Arg Asn Gly Arg Glu Leu Asn Thr
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Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr His His His His His His Gly
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Gly Gly Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
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Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
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<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 19
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1 5 10 15
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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
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195 200 205
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Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
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275 280 285
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<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 20
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<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 21
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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385
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 22
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1 5 10 15
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275 280 285
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355 360 365
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
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<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 23
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1 5 10 15
Val His Ser Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala
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Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
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<211> 392
<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 24
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Val His Ser Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala
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<210> 25
<211> 665
<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 25
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Ala Leu Asp Gln Ser Leu Ser Leu Ser Val Asp Gly Gly Asn Pro Lys
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245 250 255
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Cys Leu Gly Asn Lys Cys Val His Gly Thr Cys Leu Pro Ile Asn Ala
275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
Cys Gln Thr Thr Lys Lys Val Ser Arg Leu Glu Cys Arg Gly Gly Cys
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Ala Gly Gly Gln Cys Cys Gly Pro Leu Arg Ser Lys Arg Arg Lys Tyr
385 390 395 400
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405 410 415
Val Val Lys Cys Gly Cys Thr Arg Cys Val Ser Glu Gln Lys Leu Ile
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
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485 490 495
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660 665
<210> 26
<211> 706
<212> PRT
<213> 未知（UNKNOWN）
<220>
<221> CHAIN
<223> 人（HUMAN）
<400> 26
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Tyr Gln Gly Glu Lys Cys Glu Lys Leu Val Ser Val Asn Phe Ile Asn
50 55 60
Lys Glu Ser Tyr Leu Gln Ile Pro Ser Ala Lys Val Arg Pro Gln Thr
65 70 75 80
Asn Ile Thr Leu Gln Ile Ala Thr Asp Glu Asp Ser Gly Ile Leu Leu
85 90 95
Tyr Lys Gly Asp Lys Asp His Ile Ala Val Glu Leu Tyr Arg Gly Arg
100 105 110
Val Arg Ala Ser Tyr Asp Thr Gly Ser His Pro Ala Ser Ala Ile Tyr
115 120 125
Ser Val Glu Thr Ile Asn Asp Gly Asn Phe His Ile Val Glu Leu Leu
130 135 140
Ala Leu Asp Gln Ser Leu Ser Leu Ser Val Asp Gly Gly Asn Pro Lys
145 150 155 160
Ile Ile Thr Asn Leu Ser Lys Gln Ser Thr Leu Asn Phe Asp Ser Pro
165 170 175
Leu Tyr Val Gly Gly Met Pro Gly Lys Ser Asn Val Ala Ser Leu Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Gly Gln Asn Gly Thr Ser Phe His Gly Cys Ile Arg Asn
195 200 205
Leu Tyr Ile Asn Ser Glu Leu Gln Asp Phe Gln Lys Val Pro Met Gln
210 215 220
Thr Gly Ile Leu Pro Gly Cys Glu Pro Cys His Lys Lys Val Cys Ala
225 230 235 240
His Gly Thr Cys Gln Pro Ser Ser Gln Ala Gly Phe Thr Cys Glu Cys
245 250 255
Gln Glu Gly Trp Met Gly Pro Leu Cys Asp Gln Arg Thr Asn Asp Pro
260 265 270
Cys Leu Gly Asn Lys Cys Val His Gly Thr Cys Leu Pro Ile Asn Ala
275 280 285
Phe Ser Tyr Ser Cys Lys Cys Leu Glu Gly His Gly Gly Val Leu Cys
290 295 300
Asp Glu Glu Glu Asp Leu Phe Asn Pro Cys Gln Ala Ile Lys Cys Lys
305 310 315 320
His Gly Lys Cys Arg Leu Ser Gly Leu Gly Gln Pro Tyr Cys Glu Cys
325 330 335
Ser Ser Gly Tyr Thr Gly Asp Ser Cys Asp Arg Glu Ile Ser Cys Arg
340 345 350
Gly Glu Arg Ile Arg Asp Tyr Tyr Gln Lys Gln Gln Gly Tyr Ala Ala
355 360 365
Cys Gln Thr Thr Lys Lys Val Ser Arg Leu Glu Cys Arg Gly Gly Cys
370 375 380
Ala Gly Gly Gln Cys Cys Gly Pro Leu Arg Ser Lys Arg Arg Lys Tyr
385 390 395 400
Ser Phe Glu Cys Thr Asp Gly Ser Ser Phe Val Asp Glu Val Glu Lys
405 410 415
Val Val Lys Cys Gly Cys Thr Arg Cys Val Ser Glu Gln Lys Leu Ile
420 425 430
Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Pro Arg Lys Pro Thr Thr Thr Pro
435 440 445
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
450 455 460
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
465 470 475 480
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
485 490 495
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Arg Ser
500 505 510
Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
515 520 525
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
530 535 540
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
565 570 575
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
580 585 590
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
595 600 605
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
610 615 620
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
625 630 635 640
Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
645 650 655
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
660 665 670
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
675 680 685
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
690 695 700
Pro Arg
705

Claims (22)

1.一种嵌合抗原受体，包含抗原结合结构域；铰链区；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域；其特征在于，所述共刺激结构域是突变的CD28或TNFRSF9。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，在所述突变的CD28中，在用序列编号7表示的氨基酸序列的第6位至第9位的氨基酸被从RLLH替换为RGGH或具有与RGGH相似性质的氨基酸。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，在具有与RGGH相似性质的氨基酸中，用丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)替换甘氨酸(G)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激结构域由突变的CD28和TNFRSF9组成。
5.一种嵌合抗原受体，包含抗原结合结构域；铰链区；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域，其特征在于，在所述抗原结合结构域和所述铰链区之间另外引入三个甘氨酸(G)或具有与甘氨酸相似性质的氨基酸。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，具有与甘氨酸相似性质的氨基酸是丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
7.一种嵌合抗原受体，包含抗原结合结构域；铰链区；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域与选自由以下各项组成的组的抗原结合：IL13Rα2、与血管生成活性相关的抗原、EGFRvIII、EphA2、αVβ3和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1。
8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域与IL13Rα2结合。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域具有其中用序列编号1表示的氨基酸序列的第11位被赖氨酸替换且第107位是替换的赖氨酸的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，在所述抗原结合结构域中，用序列编号1表示的氨基酸序列的第11位、第64位、第67位和第107位被赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、天冬氨酸(D)和赖氨酸(K)或与它们相似的氨基酸替换。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，在用与它们相似的氨基酸替换的情况下，在第11位中，氨基酸被精氨酸(R)或组氨酸(H)而不是赖氨酸(K)替换；在第64位和第67位中，氨基酸被谷氨酸(E)而不是天冬氨酸(D)替换；并且在第107位中，氨基酸被组氨酸(H)而不是赖氨酸(K)替换。
12.一种嵌合抗原受体，包含抗原结合结构域；铰链区；跨膜结构域；共刺激结构域和胞质信号转导结构域，其特征在于，所述胞质信号转导结构域使用其中包含额外的谷氨酰胺的正常人的CD3ζ信号转导结构域。
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述额外的谷氨酰胺是存在于正常人的CD3ζ信号转导结构域的第50位的谷氨酰胺。
14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3ζ信号转导结构域是用序列编号13表示的序列。
15.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，用序列编号14表示。
16.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，用序列编号15表示。
17.一种CAR-T细胞，其中表达根据权利要求1、5、7、10、12或16中任一项所述的嵌合抗原受体。
18.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，与用序列编号17或序列编号18表示的和血管生成活性相关的抗原结合。
19.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，与用序列编号19或序列编号20表示的EGFRvIII结合。
20.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，与用序列编号21或序列编号22表示的EphA2结合。
21.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，与用序列编号23或序列编号24表示的αVβ3结合。
22.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，与用序列编号25或序列编号26表示的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1结合。
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