KR20230148435A - 키메릭 항원 수용체 및 hgf 결합 억제 물질의 조합 요법 - Google Patents

키메릭 항원 수용체 및 hgf 결합 억제 물질의 조합 요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키메릭 항원 수용체와 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF)와그 수용체의 결합을 억제하는 물질을 동시에 발현하는 효과기 세포 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, HGF와 그 수용체의 결합이 억제됨에 따라 암세포와 면역계의 상호 작용에 있어서 치료효과를 상승시켜 CAR-T 세포치료제의 항암 효과를 증가시키는 효과가 있어서, 혈액암 뿐만 아니라 고형암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

키메릭 항원 수용체 및 HGF 결합 억제 물질의 조합 요법 {Combination therapies of chimeric antigen receptors and HGF binding inhibitors}
본 발명은 3세대 면역항암제인 세포치료제의 고형암의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 구체적으로, 키메릭 항원 수용체에 추가로 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF)와 그 수용체의 결합을 억제하는 물질을 조합을 통해 암세포와 면역계의 상호 작용에 영향을 줌으로써 세포치료제의 항암 효과를 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포치료제는 면역항암제가 활용되기 어렵다고 인식되어 있는 고형암 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다.
수십 년 동안 암을 치료하는 방법들은 꾸준히 변화하고 발전해왔다. 1800년대에서부터 1900년대까지는 외과적인 수술 (Surgery), 화학요법 (Chemotherapy), 그리고 방사선 요법 (Radiation therapy)과 같은 방법들이 주로 이뤄졌지만, 이들에 대한 한계점들이 드러나기 시작하여, 최근 면역세포 요법으로 체내의 면역세포를 꺼내서, 강화시키거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 넣어주는 세포치료 방식이 개발되고 있다.
보다 구체적으로, 암을 치료하기 위한 1세대 화학항암제의 경우 세포독성물질로 암세포를 공격해 사멸시키는 방법인데, 암세포 뿐만 아니라 정상세포도 같이 손상을 주기 때문에 부작용이 심한 문제가 있다. 이러한 1세대 화학항암제의 단점을 극복하기 위한 2세대 표적항암제의 경우 암세포의 특정 물질을 목표로 공격하기 때문에 1세대 화학항암제에 비해 부작용은 적지만 내성이 생긴다는 큰 단점을 지니고 있다. 반면, 3세대 면역항암제는 우리 몸의 면역체계를 이용하기 때문에 1세대 화학항암제의 독성 문제와 2세대 표적항암제의 내성 문제가 적고 부작용도 현저히 적다. 또한, 2세대 표적항암제는 초기에 높은 생존율을 보이지만, 내성문제로 지속성이 떨어지는 반면 면역항암제는 항암효과가 유지돼 면역항암제에 대한 반응이 좋은 환자는 완치에 가까워진다. 이처럼 3세대 면역항암제는 탁월한 효능과 적은 부작용으로 인해 암환자의 장기 생존율은 물론 암환자의 삶의 질을 높이는데 기여한다.
키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)는 항체의 단편, 힌지 영역, 막통과 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인으로 구성되는데, 상기 키메릭 항원 수용체가 발현된 T 세포는 암세포만 공격하게 설계된 면역항암제 중 하나이다. CAR-T 세포치료제는 암세포를 특이적으로 공격하는 면역 T 세포의 공격성을 크게 높였기 때문에 정상세포의 손상은 줄이고 암세포만을 표적 삼아 공격한다는 점에서 매우 중요한 세포치료제이다.
현재까지 CAR-T 세포치료제와 같은 면역세포치료가 일부 혈액암에서 높은 완치율을 보였지만, 암 대부분을 차지하는 고형암에서는 제대로 치료효과를 발휘하지 못하였는데, 이는 인체가 강한 면역반응을 억제하는 경향이 있어 투여된 면역세포가 충분히 활동할 수 없기 때문으로 알려져 있다.
대한민국 등록특허 제10-0556660호 대한민국 등록특허 제10-2011789호
이에, 본 발명자들은 CAR-T 세포치료제를 난소암 등 고형암에서도 치료 효과가 발휘될 수 있도록 하는 치료 방법을 연구한 결과, 1세대 화학항암제의 독성 문제와 2세대 표적항암제의 내성 문제가 적은 3세대 면역항암제인 CAR-T 세포치료제에 HGF와 그 수용체(MET)의 결합을 억제할 수 있는 물질을 조합할 경우 CAR-T 세포치료제 단독에 비해 종양 진행의 억제 또는 감소의 개선을 초래할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명자들의 앞선 연구(특허출원 제10-2022- 0046299호)로부터 CAR-T 세포치료제와 HGF 중화항체를 병용할 경우 CAR-T 세포치료제의 항암 활성이 증가된다는 것을 확인하고, 이에 HGF와 그 수용체의 결합을 억제할 수 있는 물질이 CAR와 동시에 발현될 수 있는 카세트를 제조하여 확인한 결과 CAR-T 세포치료제와 HGF 중화항체의 단순 병용에 비해 항암 활성이 더 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 난소암 등 고형암 치료를 위한 CAR-T 세포치료제를 제공하는 것을 해결과제로 하며, HGF와 그 수용체의 결합을 억제함으로써 대상체에서 더 효율적으로 암을 치료할 수 있는 CAR-T 세포치료제를 제공하는 것을 구체적인 해결과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기와 같은 수단을 개시한다.
본 발명은 항원 결합 도메인; 힌지 영역; 막관통 도메인; 보조 자극 도메인; 및 세포질 신호 전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드; 및 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF)와 그 수용체(MET)의 결합을 억제하는 물질을 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 개시한다.
상기 HGF와 MET 결합 억제 물질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 세포질 신호 전달 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
상기 HGF와 MET 결합 억제 물질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 상기 세포질 신호 전달 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 자기 절단 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 존재할 수 있다. 자기 절단 펩타이드(self-cleaving peptide)로는 T2A (Thosea asigna virus), F2A (Foot-and-mouth disease virus), E2A (equine rhinitis A virus), P2A (porcine teschovirus-1 2A)와 같은 2A 펩타이드가 있으며, 바람직하게는 T2A일 수 있다.
상기 결합 억제 물질이 간세포성장인자 이소폼 (truncated HGF isoforms)일 수 있다. 또한, 상기 결합 억제 물질이 수용성 MET(soluble MET)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 억제 물질이 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19, MUC16, MUCl, CAlX, CEA, CDS, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포 항원, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 폴레이트 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, K-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, 암태아 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD276 또는 IL13Ra2로부터 선택되는 항원과 결합되는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
상기 CAR의 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터 선택되는 막관통 도메인을 포함할 수 있다.
상기 CAR의 보조 자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Tolllike ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로부터 선택되는 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다.
상기 CAR의 세포질 신호 전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3ζ의 기능적 신호 전달 도메인, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다.
구체적인 양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 도메인; 힌지 영역; 막관통 도메인; 보조 자극 도메인; 및 세포질 신호 전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드; 및 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
이때, 상기 키메릭 항원 수용체는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 HGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 본 발명의 발현 카세트는 서열번호 26의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터가 형질도입된 효과기 세포를 개시한다.
상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 또는 이들의 전구세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 효과기 세포를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 개시한다.
상기 암은 난소암, 유방암, 위암, 폐암, 간암, 담도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 신장암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암일 수 있다.
본 발명에 따른 “발현 카세트”는 항원을 인식하는 항원 결합 도메인; 항원 결합 도메인과 막통과 도메인을 연결하는 힌지 영역(또는 스페이서); 막통과 도메인; 보조 자극 도메인; 및 세포질 신호 도메인으로 구성된 2세대 CAR 구조에 추가로 HGF와 그 수용체(MET)의 결합을 억제하는 물질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 효과기 세포는 암세포를 항원으로 인식하는 수용체와 HGF와 그 수용체의 결합을 억제하는 물질을 동시에 발현하는 세포이다.
본 발명의 CAR 구조에서 항원 결합 도메인은 주신호가 전달되는 부위로 세포막 외부에 있으며 특정 항원을 발현하는 암세포를 인식하는 부분이다. 따라서, CAR 구조를 이용한 암 치료에 있어서, 구체적인 치료대상은 항원 결합 도메인에 의하여 결정되는데, 본 발명에서, 이와 같은 항원 결합 도메인에 결합하는 항원은 CD19, MUC16, MUCl, CAlX, CEA, CDS, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포 항원, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 폴레이트 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, K-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, 암태아 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD276 또는 IL13Ra2가 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않고, 바람직하게는 IL13Rα2에 특이적으로 결합할 수 있는 키메릭 항원 수용체를 개시한다.
본 발명에 따른 CAR 구조에서 IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 도메인의 서열은 서열번호 2와 같은데, IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 wild type IL-13 서열의 11번, 64번, 67번 및 107번 위치가 각각 E11K.R64D.S67D.R107K로 치환된 돌연변이다. 해당 위치에서 치환되는 아미노산은 상기 특정된 아미노산과 유사한 성질의 아미노산으로 대체될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 CAR 구조는 CAR 단백질의 용해도를 높여 키메릭 항원 수용체의 발현을 증가시키기 위해서 항원 결합 도메인과 힌지 영역 사이에 3개의 글리신을 추가적으로 도입한 것이다. 위 3개의 글리신(G)은 이와 유사한 성질의 아미노산인 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 CAR 구조의 보조 자극 도메인은 보조 자극 신호가 전달되는 부위로서 항원 결합 도메인과 결합한 특정 항원을 인식한 CAR를 발현하는 효과기 세포, 예를 들면 T 세포가 면역반응을 일으키며 자가 증식을 돕고, 체내에 잔존하는 시간을 늘리도록 신호를 전달하는 역할을 한다. 본 발명에서는 서열번호 6의 보조 자극 도메인을 사용한다.
본 발명에 따른 CAR 구조의 세포질 신호 전달 도메인은 Jurkat T세포의 CD3ζ 신호전달 도메인이 아닌, 추가의 글루타민이 포함된 정상 인간(normal person)의 CD3ζ 신호전달 도메인을 사용하였고, 상기 추가의 글루타민은 서열번호 7에 있어서 50번 위치의 글루타민(Q)를 의미한다. 또한, CD3ζ는 총 3개의 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM- YxxL/Ix6-8YxxL/I) 서열을 지니고 있는데, 3개의 YxxL/Ix6-8YxxL/I 중 2번째와 3번째의 tyrosine(Y)를 phenylalanine (F)으로 돌연변이(Mutation) 하여 사용될 수 있다 (서열번호 8). 이와 같은 돌연변이는 WO 2019/133969에 개시된 내용으로 제작되었고, 이 전문은 참고로 통합된다.
본 명세서에서 개시하는 도메인을 구성하는 폴리펩타이드의 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 재조합 방법을 이용하여 수득될 수 있으며, 예를 들어 표준 기법을 이용하여 상기 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 상기 동일한 유전자를 포함하도록 공지된 벡터로부터 유전자를 유도하거나, 상기 동일한 유전자를 포함하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로는, 상기 관심이 있는 유전자는 클로닝이 아닌 합성에 의해 생성될 수 있다.
세포 내로 유전자를 도입하고 발현하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포 내로 신속하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서는 최종적으로 제작된 CAR 유전자 단편을 BamH/NotI로 절단된 MFG 레트로바이러스 발현 벡터에 접합시켜 CAR-T 세포를 제조할 수 있다. 본 발명은 구조체의 성분 각각에 대한 다수의 임의의 변이체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명에 따른 CAR 구조의 IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 도메인; 힌지 영역; 막관통 도메인; 보조 자극 도메인; 및 세포질 신호 전달 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 국제공개특허 WO2017/023138에 개시된 내용을 반영하여 제작되었으며, 이 전문은 참조로 통합된다.
본 발명의 발현 카세트에서 CAR 구조를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 추가된 HGF와 그 수용체의 결합을 억제하는 물질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 간세포성장인자 이소폼 (truncated HGF isoforms), 수용성 MET(soluble MET) 또는 HGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하며, 바람직하게는 HGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화한다.
상기 HGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 HGF의 중화가능 에피토프에 결합하여 HGF를 중화시킬 수 있는 활성을 나타내는 것으로, HGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한, 상기 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 VH 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 VL 영역을 갖는 것으로, 4개의 프레임워크 영역(framework region; FR)과 3개의 항원결합부위(complementarity determining region; CDR)가 존재(서열번호 15 내지 20)한다.
구체적으로, 본 발명의 HGF에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄는 서열번호 13, 경쇄는 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 대한민국 등록특허 제556660호에 개시된 내용으로 제작되었으며, 이 전문은 참조로 통합된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 HGF에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편은 서열번호 23의 단일-사슬 가변 절편(single-chain variable domain fragment, ScFv)이다.
본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 당업계에 공지된 다양한 암을 포함하며, 예를 들어 난소암, 유방암, 위암, 폐암, 간암, 담도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 신장암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 IL13Ra2를 발현하면서 HGF를 분비하는 암이고, 보다 구체적으로 IL13Ra2 발현하면서 HGF를 분비하는 난소암이다.
본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 암 환자에게 주입하기까지는 여러 단계를 거친다. 예를 들어, 환자의 혈액에서 백혈구성분 분리채집 과정을 거쳐 T 세포를 추출한 뒤, 발현 벡터를 이용하여 CAR로 디자인된 유전자를 T 세포에 주입하고 이 CAR-T 세포를 증식시킨 후, 이를 환자에게 주입하게 된다.
본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 1회 투여량은 1 x 107~108 cells/ kg이다.
본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 난소암 등 다양한 고형암의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다. 보다 특별하게는, HGF와 그 수용체의 결합을 억제함으로써 암세포와 면역계의 상호 작용에 있어서의 치료 효과 상승을 통해 세포 치료제의 항암 효과를 증가시켜 난소암 등 다양한 고형암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다. 특히, 1세대 화학항암제의 독성 문제와 2세대 표적항암제의 내성 문제가 적은 3세대 면역항암제인 CAR-T 세포치료제를 고형암에 활용할 수 있다는 특별한 효과가 있다.
도 1은 난소암 세포주 (A2780)에서 IL13Ra2 (human interleukin 13 receptor alpha 2) 발현률을 나타내는 유세포 분석 결과이다.
도 2는 난소암 세포주 (A2780)에서 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF) ELISA 분석 결과이다.
도 3은 YYB-103 및 YYB-103-1XX의 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 YYB-103 CAR-T 및 YYB-103-1XX CAR-T 세포의 IL13 발현률을 확인한 유세포 분석 결과이다.
도 5a는 YYB-103-1XX 구조에 YYB-101의 Single Chain Variable Fragment (scFv)이 결합된 구조이고, 도 5b는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 카세트를 갖는 재조합 벡터를 나타낸다.
도 6. YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 바이러스 생산을 위한 stable cell line 제작 결과이다.
도 7은 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 T세포의 세포수 배가 정도 (population doubling level) 결과이다.
도 8은 제1 공여자(YY83)에서 IL13 발현률을 확인한 유세포 분석 결과이다.
도 9는 제2 공여자(YY89)에서 IL13 발현률을 확인한 유세포 분석 결과이다.
도 10은 제3 공여자(YY94)에서 IL13 발현률을 확인한 유세포 분석 결과이다.
도 11은 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 T세포의 YYB-101 scFv 분비를 확인한 결과이다.
도 12는 제1 공여자(YY83)에서 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 T 세포의 세포사멸 능력 (LDH) 측정 결과이다.
도 13은 제3 공여자(YY94)에서 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 T 세포의 세포사멸 능력 (LDH) 측정 결과이다.
도 14는 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 T 세포의 사이토카인 (IFN-gamma) 양을 확인한 결과이다.
도 15는 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 T 세포의 표적세포 사멸현상 (Crystal violet) 확인한 결과이다.
도 16은 본 발명의 CAR-T 세포치료제의 난소암 세포주 (A2780)에 대한 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 17은 본 발명의 CAR-T 세포치료제의 난소암 세포주 (A2780)에 대한 survival 확인 결과이다.
도 18은 본 출원의 YYB-101, YYB-103, YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX + YYB-101 scFv의 서열에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 난소암 세포주 (A2780)에서 IL13Ra2 (human interleukin 13 receptor alpha 2) 발현 확인
실험 방법
유세포 분석을 위해, FITC-conjugated anti-human IL13Ra2 단일클론 항체 (R&D, Cat. No., FAB614F)를 첨가하기 전 세포를 2% bovine serum albumin을 함유한 PBS에 1회 세척하였다. 세척 후 빛이 차단된 상태에서 4℃, 30 분간 각각의 항체와 반응한 후, 세포를 1회 세정하고, 난소암 세포주 (A2780)에서 IL13Ra2 발현률을 체크하였다. 대조군으로 isotype control 시료 (R&D, Cat. No., IC108F)를 포함시켰다.
실험 결과
실험방법에 따라 난소암 세포주 (A2780)을 이용하여 IL13Ra2 발현률을 확인한 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다. 난소암 세포주 (A2780)의 IL13Ra2의 발현률은 69.1% 이고, 대조군으로 사용한 isotype control의 경우 0.9%로 확인되었다.
난소암 세포주(A2780) IL13Ra2 발현률
Unstained 0.7%
Isotype control 0.9%
Anti-IL13Ra2 69.1%
실시예 2. 난소암 세포주 (A2780)에서 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF) 분석
실험 방법
난소암 세포주 (A2780)에서 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF)가 분비되는 양을 확인하기 위해서 2% Fetal bovine serum (FBS, Gibco, 10082-147)가 포함된 RPMI 배지를 이용하여 난소암 세포주 (A2780)을 32℃, 6% CO2 조건에서 2일간 배양하였다. 2일후 배양 배지를 1,500 rpm 조건으로 5분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 1.5 mL tube에 옮겼다. 난소암 세포주 (A2780)에서 분비되는 HGF의 양을 확인하기 위해서 human HGF Quantikine ELISA kit (R&D system, DHG00B)을 이용하였다. ELISA 분석 결과에 대한 대조군으로 난소암 세포주 (A2780)의 배양액인 RPMI을 포함시켰다.
실험 결과
ELISA 분석 결과를 도 2에 나타내었다. 대조군으로 사용한 난소암 세포주 (A2780)의 배양액인 RPMI의 경우 4 ng/mL의 농도로 HGF 양이 확인되었으며, 난소암 세포주 (A2780)의 경우 164 ng/mL 농도로 약 41배 높은 HGF 양이 확인되었다.
실시예 1 및 실시예 2의 결과를 종합하여, IL13Ra2 발현 및 HGF를 분비하는 난소암 세포주 (A2780)가 본 발명의 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 단편이 추가된 CAR-T 세포 치료제 시험을 위해 선정되었다.
실시예 3. YYB-103 그리고 YYB-103-1XX 유전자 발현 T세포의 제작
YYB-103 발현 T 세포의 제작
IL13Ra2에 특이적으로 결합하는 2세대 (IL13.E11K.R64D.S67D.R107K.TNFRSF9.CD3ζ) 키메릭 항원 수용체인 YYB-103은 항원 결합 도메인과 힌지 영역 사이에 추가로 3개의 글리신(G)이 도입되어 있으며, 항원 결합 도메인은 IL13Rα2와 결합하되, 서열번호 2와 같이 IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 wild type IL-13 서열의 11번, 64번, 67번 및 107번 위치가 각각 리신(K), 아스파르트산(D), 아스파르트산(D) 및 리신(K)으로 치환되었다(서열번호 9). YYB-103 발현 T 세포는 국제공개특허 WO2017/023138에 개시된 내용으로 제작되었으며(도 3), 이 전문은 참조로 통합된다.
YYB-103-1XX 발현 T 세포의 제작
T 세포의 구성요소인 CD3ζ는 총 3개의 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM- YxxL/Ix6-8YxxL/I) 서열을 지니고 있는데, YYB-103-1XX는 YYB-103의 3개의 YxxL/Ix6-8YxxL/I 중 2번째와 3번째를 tyrosine(Y)을 phenylalanine (F)로 돌연변이(Mutation) 하였다(서열번호 10). YYB-103-1XX는 국제공개특허 WO 2019/133969에 개시된 내용으로 제작되었고(도 3), YYB-103-1XX 발현 T 세포는 국제공개특허 WO2017/023138에 개시된 내용으로 제작되었으며, 이 전문들은 참고로 통합된다.
실험방법
T 세포 배양 배지에 배양 중인 YYB-103 CAR-T 및 YYB-103-1XX CAR-T (공여자 번호, YY93) 1 x 106 세포를 원심분리 하였다. 그 후 상층액을 제거하고, 2% bovine serum albumin을 함유한 PBS을 이용하여 YYB-103 CAR-T 및 YYB-103-1XX CAR-T 세포를 2회 세척하였다. 세척이 완료된 후 형질 도입된 T 세포의 발현은 IL13을 통해서 YYB-103 CAR-T 및 YYB-103-1XX CAR-T의 surface IL13 발현을 유세포 분석을 통해 체크하였으며, 그 결과는 표 2 및 도 4에 나타내었다. 유세포 분석 결과에 대한 대조군으로 YYB-103 CAR 또는 YYB-103-1XX CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 (Untransduced T 세포) 시료를 포함시켰다.
공여자 번호 (YY93) CAR-T 발현 (%, IL13)
Untransduced T 세포 0.3
YYB-103 CAR-T 60.6
YYB-103-1XX CAR-T 54.9
실험 결과
YYB-103 CAR-T 또는 YYB-103-1XX CAR-T 세포 (공여자 번호, YY93)의 발현을 확인하기 위해서 유세포 분석을 진행한 결과, YYB-103 CAR 또는 YYB-103-1XX CAR가 형질도입 되지 않은 untransduced T 세포의 IL13 발현은 DAY 11에서 0.3% 이하로 IL13이 발현하지 않았는데 반해, YYB-103 CAR-T 또는 YYB-103-1XX CAR-T 세포의 IL13의 발현률은 DAY 11에서 YYB-103 CAR-T는 60.6%, YYB-103-1XX CAR-T는 54.9%을 보였다.
실시예 4. HGF(hepatocyte growth factor; 간세포성장인자) 중화가능 에피토프에 결합하는 중화 항체(YYB-101)의 제작
HGF와 그 수용체간의 결합을 방해하는 HGF 중화 항체인 YYB-101(서열번호 13 및 서열번호 14)은 대한민국 등록특허 제556660호에 개시된 내용으로 제작되었으며, 이 전문은 참조로 통합된다.
실시예 5. 2세대 키메릭 항원 수용체 및 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원 결합 단편 발현 카세트를 갖는 재조합 벡터의 구축
실시예 3에서 제작된 YYB-103-1XX 구조에 서열번호 23의 YYB-101의 Single Chain Variable Fragment (scFv)을 삽입하여 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 키메릭 항원 수용체(서열번호 26)를 제작하였다(도 5).
Retroviral vector PG13-IL13-BBZ의 유전체는 Moloney murine leukemia virus 5' long terminal repeat (MMLV 5' LTR), splice donor와 splice acceptor 부위를 포함하는 포장 시그날 (packaging signal), YYB-103-1XX+YYB-101 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 Moloney murine leukemia virus 3' long terminal repeat (MMLV 3' LTR) 부위로 구성되어 있으며 CAR로 디자인된 유전자 도입을 통해 자가 유래 T 세포에 전달되어 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv가 단백질로 발현하게 된다.
실시예 6. 2세대 키메릭 항원 수용체 및 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원 결합 단편 유전자 발현 카세트를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질 변형된 T 세포 제조
Phoenix-Ampho와 Phoenix-Eco로의 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 도입
Phoenix-Ampho (Cat No. CRL-3213, ATCC)와 Phoenix-Eco (Cat No. CRL-3214, ATCC) 세포(각각 5 x 105 세포)를 10% FBS가 포함된 DMEM (Gibco, 10569-101) 배지 2mL (최종 세포수, 1 x 106/2mL DMEM 배지)에 넣고 6 웰 플레이트 (SPL, Cat, No. 30006)에서 32℃, 6% CO2 조건으로 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 배양 후 DMEM 배양배지를 제거하고, PBS (Gibco, 10010-023)을 이용하여 Phoenix-Ampho와 Phoenix-Eco 세포가 배양 중인 6 웰 플레이트를 2회 세척하였다. Opti-MEM™ Reduced Serum Medium (Gibco, 31985-070)에 lipofectamine® 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)을 넣고 5 분간 실온에서 반응시켰다. 5분 경과 후 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv DNA를 포함한 Opti-MEM을 lipofectamine이 포함된 Opti-MEM과 Mix 후 20 분 동안 실온에서 반응시켰다. 20분 경과 후 Phoenix-Ampho와 Phoenix-Eco 세포에 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv DNA 처리 후 반응시켰다. 반응 6시간 후 새로운 DMEM 배지로 교체하고, 32℃, 6% CO2 조건에서 2일간 배양하였다. 2일 후 배양 배지를 수집하여 syringe filter (PALL, 4614)을 이용하여 배양배지를 여과하였다. 여과 된 바이러스를 이용하여 PG-13 세포에 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자를 도입할 준비를 하였다.
PG-13을 이용한 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 바이러스 도입
코팅되지 않은 6웰 플레이트 (Thermo, Cat No. 150239)에 20 μg/mL 농도로 준비된 레트로넥틴 (Retronectin, TaKaRa, Japan)이 포함된 PBS을 웰당 2 mL 첨가한 후 상온에서 암흑조건으로 2시간 반응하여 6웰 플레이트를 레트로넥틴으로 코팅하였다. 2시간 경과 후 PBS 2mL를 이용하여 웰을 2회 세척 후 Phoenix-Ampho와 Phoenix-Eco로부터 생산한 레트로바이러스 (YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자) 4 mL을 레트로넥틴이 코팅된 6웰 플레이트에 넣어주었다. PG-13 (empty) 세포를 0.5 X 105 cells/mL로 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 바이러스가 포함된 6웰 플레이트에 추가한 후 2,500rpm, 32℃ 조건으로 2시간 동안 원심 분리를 진행하였다. 원심 분리 후 6웰 플레이트를 세포 배양기에서 32℃, 6% CO2 조건에서 48 시간 배양하였다.
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자가 도입된 PG-13 (PG-13/YYB-103-1XX+YYB-101 scFv) 세포 중 유세포분석기에 의하여 높은 역가의 클론을 분리하였다. 높은 역가의 PG-13/YYB-103-1XX+YYB-101 scFv은 높은 IL13발현 (99% 이상)을 안정적으로 보여주었으며, 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)에 효율적인 형질 도입 능력을 위하여 선택되었다. PG-13/YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 세포의 상층액은 T 세포의 유전적 변형을 위해 syringe filter (PALL, 4614)을 이용하여 필터한 후 말초혈액에 도입할 준비를 하였다.
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 CAR-T 세포 제조
말초 혈액 단핵 세포는 건강한 공여자로부터 얻은 전혈 (whole blood)을 Ficoll-Paque premium (GE healthcare, 17-5442-03)를 이용하여 단핵구층 (buffy coat)의 단핵 세포만을 획득하였다. 분리된 PBMC를 1 x 106 세포에 Human IL2 (NOVARTIS) 500 IU/mL 조건으로 있는 상태에서 항-CD3 단일클론 항체 (OKT3, eBioscience, Cat No. 16-0037-81) 100 ng/mL와 항-CD28 단일클론 항체 (eBioscience, Cat No. 16-0289-85) 100 ng/mL을 첨가하여, OpTmizerTM CTSTM T-Cell Expansion Supplement (Gibco, A10484-02), CTSTM Immune Cell SR (Gibco, A25961-01) 및 GlutaMAXTM-I CTSTM (100X) (Gibco, A12860-01)가 함유된 CTSTM T-Cell Expansion Basal Medium (Gibco, A10221-01) (이하, T 세포 배양 배지)에 배양함으로써 T 세포 분획을 활성화시켰다. 활성화 단계 3일 후, T 세포에 여과된 PG-13/YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 상층액을 사용하여 1회 형질도입 진행하였다.
코팅 되지 않은 6웰 플레이트에 20 μg/mL 농도로 준비된 레트로넥틴이 포함된 PBS을 웰당 2 mL 첨가한 후 상온에서 암흑조건으로 2시간 반응하여 6웰 플레이트에 레트로넥틴을 코팅하였다. 반응 후 잔여 레트로넥틴을 PBS을 이용하여 제거한 후 PG-13/YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 레트로바이러스를 4 mL 넣고 2500 rpm, 32℃ 조건으로 2시간 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 PBS을 이용하여 잔여 레트로바이러스를 제거하였다. 활성화된 T 세포를 웰당 2 Х 106 세포로 T 세포 배양 배지에 첨가 후 1,000 xg로 10분간 원심분리하여 T 세포에 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 레트로바이러스를 전달하였다. 활성화된 T 세포에 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 레트로바이러스 전달은 1회 진행하였다. YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 세포는 75 T 플라스크에서 12일 동안 세포를 IL-2를 500IU/mL이 포함된 T 세포 배양배지를 이용하여 증식하였다. 이러한 방식으로 증식된 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv을 발현하는 T 세포는 다양한 분석 실험에 사용하였다.
실시예 7. YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 CAR-T 세포의 세포수 배가 정도 (population doubling level) 확인
실험 방법
YYB-103-1XX 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 CAR-T 세포의 세포수 배가 정도 (population doubling level, PDL)을 확인하기 위해서 2일 마다 세포수를 측정 하였으며, 5 x 105/mL 세포수 기준으로 YYB-103-1XX 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 CAR-T 세포 배양을 진행하였다.
실험 결과
그 결과는 표 3 및 도 7에 나타내었다. 구체적으로, YYB-103-1XX 발현 CAR-T 세포의 세포수 배가 정도는 DAY 6일부터 DAY 12일까지 DAY 6 2.1. DAY 8 3.6, DAY 10 4.79 그리고 Day 12 5.54 이었다. YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 CAR-T 세포의 세포수 배가 정도는 DAY 6일부터 DAY 12일까지 DAY 6 1.6. DAY 8 3.8, DAY 10 5.25 그리고 Day 12 5.72 이었다. 이는 YYB-101 scFv 구조를 추가함에 의해서 CAR-T 세포의 성장에는 영향이 없음을 의미한다.
PDL
공여자 번호(YY94)		 DAY 0 DAY 6 DAY 8 DAY 10 Day 12
YYB-103-1XX CAR-T 0 2.1 3.6 4.79 5.54
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 0 1.6 3.8 5.25 5.72
실시예 8. YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 CAR-T 세포의 IL13 발현률 체크
실험 방법
T 세포 배양 배지에 배양 중 (배양일, 10일 그리고 12일)인 YYB-103-1XX 발현 T 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 T 세포(1 x 106)를 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 2% bovine serum albumin을 함유한 PBS을 이용하여 YYB-103-1XX 발현 T 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 T 세포를 2회 세척하였다. 세척이 완료된 후 형질 도입된 T 세포의 발현은 YYB-103-1XX 발현 T 그리고 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 T의 surface IL13 발현을 유세포 분석을 통해 체크하였다. 유세포 분석 결과에 대한 대조군으로 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 (Untransduced T 세포) 시료를 포함시켰다.
실험 결과
YYB-103-1XX 발현 T 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 발현 T 세포에서 발현을 확인하기 위해서 실험방법에 따라 유세포 분석을 진행하였다.
제1 공여자(YY83)에서 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 untransduced T 세포의 IL13 발현은 DAY 10 및 12일에 0.2% 이하인데 반해, YYB-103-1XX CAR 유전자가 전달된 T 세포의 경우 DAY 10에서 62.3% 및 DAY 12에서 58.6%의 발현률을 나타내었으며, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자가 전달된 T 세포의 경우 DAY 10에서 52.5% 및 DAY 12에서 54.7%의 발현률을 나타내었다 (표 4 및 도 8).
CAR-T 발현(%, IL13) DAY 10 DAY 12
untransduced T 세포 0.2% 0.2%
YYB-103-1XX CAR-T 62.3% 58.6%
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 52.5% 54.7%
또한, 제2 공여자(YY89)에서 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 untransduced T 세포의 IL13 발현은 DAY 10 및 12일에 0.2% 이하인데 반해, YYB-103-1XX CAR 유전자가 전달된 T 세포의 경우 DAY 10에서 30.5% 및 DAY 12에서 26.4%의 발현률을 나타내었으며, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR 유전자가 전달된 T 세포의 경우 DAY 10에서 46.4% 및 DAY 12에서 46.7%의 발현률을 나타내었다 (표 5 및 도 9).
CAR-T 발현(%, IL13) DAY 10 DAY 12
untransduced T 세포 0.1% 0.2%
YYB-103-1XX CAR-T 30.5% 26.4%
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 46.4% 46.7%
또한, 제3 공여자(YY94)에서 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 untransduced T 세포의 IL13 발현은 DAY 10 및 12일에 0.2% 이하인데 반해, YYB-103-1XX CAR 유전자가 전달된 T 세포의 경우 DAY 10에서 63.9% 및 DAY 12에서 54.4%의 발현률을 나타내었으며, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR 유전자가 전달된 T 세포의 경우 DAY 10에서 66.6% 및 DAY 12에서 66.8%의 발현률을 나타내었다 (표 6 및 도 10).
CAR-T 발현(%, IL13) DAY 10 DAY 12
untransduced T 세포 0.2% 0.2%
YYB-103-1XX CAR-T 63.9% 54.4%
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 66.6% 66.8%
실시예 9. YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv 유전자 발현 T 세포의 YYB-101 scFv 분비 확인
실험 방법
2 x 106 세포의 YYB-103-1XX CAR-T 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지를 이용하여 32℃, 6% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 경과 후 T 세포 배양배지를 1,500 rpm 조건으로 5분간 원심분리 하였다. 그 후 상층액을 4℃에 보관하였다.
HGF 단백질을 코팅 되지 않은 96웰 플레이트에 넣고 4℃ 조건으로 24시간 코팅 하였다. 24시간 경과 후 PBS을 이용하여 96웰 플레이트를 세척하였다. 세척 완료 후 4℃에 보관하였던, 상층액을 96웰 플레이트에 코팅된 HGF 단백질과 반응시켰다. 반응이 완료된 후 DuoSet ELISA Ancillary Reagent Kit2 (R&D systems, DY008)을 시험방법에 따라 진행하였다. 마지막으로 microtiter plate reader를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 시험을 위한 positive control로 YYB-101 (1ug/mL) 시료를 포함시켰으며, 대조군으로 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 (Untransduced T 세포) 시료를 포함시켰다.
실험 결과
그 결과는 표 7 및 도 11에 나타내었다. 구체적으로, 배양 배지인 RPMI 및 untransduced T 세포의 경우 흡광도가 확인되지 않았으며, YYB-101 scFv을 분비하지 않는 YYB-103-1XX CAR-T의 경우도 흡광도 (0.07)가 확인되지 않았다. HGF에 특이적으로 결합하는 YYB-101 scFv을 포함하는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T의 경우 HGF 단백질과 결합을 확인할 수 있는 흡광도 2.63이 확인되었다. ELISA 시험을 위해 positive control인 YYB-101의 경우도 HGF 단백질과 결합을 확인할 수 있는 흡광도 3.02 나타내었다. 이는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T의 경우 HGF을 인식하는 YYB-101 scFv을 분비하는 것을 의미한다.
HGF 결합 (OD, 450nm)
Diluent Buffer 0.07
RPMI (배양배지) 0.07
Untransduced T 세포 0.06
YYB-103-1XX CAR-T 0.07
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 2.63
YYB-101(1㎍/mL) 3.02
실험예 1. IL13Rα2 발현 및 HGF 분비하는 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR 유전자 발현 T 세포의 세포사멸 능력 (LDH) 측정
실험방법
IL13Rα2 발현 및 HGF을 분비하는 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX CAR-T 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포의 세포 용해 활성을 측정하기 위해 CytoTox96 Non-radio cytotoxicity assay LDH (Promega Cat. No., G1781) 키트를 사용하여 세포사멸 분석 (Cytotoxicity assay)을 진행하였다. 구체적으로는 YYB-103-1XX CAR-T 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포 (Effector 세포, 공여자 번호 YY83 및 YY94)는 12일 배양 후에 사용하였으며 96 웰 플레이트에 (effector:target, E:T ratio)의 비율 (2.5:1, 1.25:1 그리고 0.625:1)로 세포를 넣고 37℃에서 18시간 동안 반응시켰다.
실험결과
제1 공여자(YY83)의 경우, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포는 E:T ratio (0.625:1, 1.25:1 및 2.5:1)에 따라 난소암 세포주 A2780에 대해 27.7 %, 42 % 및 51.5 %의 세포사멸 능력을 보였는데 반해, YYB-101 scFv을 포함하지 않은 YYB-103-1XX CAR-T 세포는 E:T ratio (0.625:1, 1.25:1 및 2.5:1)에 따라 23.5 %, 30.1 % 그리고 41.8 %의 세포사멸 능력을 보였다. 대조군으로 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 Untransduced T 세포는 E:T ratio (0.625:1, 1.25:1 및 2.5:1)에 따라 9.8 %, 9.5 % 및 12.4 %의 LDH 값을 나타내었다 (표 8 및 도 12). 이 결과로부터 YYB-101 scFv을 분비하는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T가 YYB-101 scFv을 분비하지 않는 YYB-103-1XX CAR-T 보다 난소암 세포주 A2780에 대한 세포사멸능력이 높음을 확인할 수 있었다.
Specific lysis(%),E:T ratio 0.625:1 1.25:1 2.5:1
Untransduced T 세포 9.8% 9.5% 12.4%
YYB-103-1XX CAR-T 23.5% 30.1% 41.8%
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 27.7% 42% 51.5%
제3 공여자(YY94)의 경우, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포는 E:T ratio (0.625:1, 1.25:1 및 2.5:1)에 따라서 난소암 세포주 A2780에 대해 18.4 %, 28.9 % 및 51.4 %의 세포사멸 능력을 보였는데 반해, YYB-101 scFv을 포함하지 않은 YYB-103-1XX CAR-T의 경우 E:T ratio (0.625:1, 1.25:1 및 2.5:1)에 따라 17.2 %, 28.4 % 및 43.3 %의 세포사멸 능력을 보였다. 대조군으로 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 Untransduced T 세포는 E:T ratio (0.625:1, 1.25:1 및 2.5:1)에 따라 2.8 %, 5.2 % 및 8 %의 LDH 값을 나타냈다 (표 9 및 도 13). 이 결과로부터 YYB-101 scFv을 분비하는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T가 YYB-101 scFv을 분비하지 않는 YYB-103-1XX CAR-T 보다 난소암 세포주 A2780에 대한 세포사멸 능력이 높음을 확인할 수 있었다.
Specific lysis(%),E:T ratio 0.625:1 1.25:1 2.5:1
Untransduced T 세포 2.8% 5.2% 8%
YYB-103-1XX CAR-T 17.2% 28.4% 43.3%
YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 18.4% 28.9% 51.4%
실험예 2. IL13Rα2 발현 및 HGF 분비하는 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR 유전자 발현 T 세포의 사이토카인 (IFN-gamma) 생성 체크
실험 방법
96웰 플레이트에 난소암 세포주 (A2780)를 4 x 105 넣고, YYB-103-1XX 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포를 1 x 105 넣고 37℃CO2 incubator에서 18 시간 배양하였다. 대조군으로 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 Untransduced T 세포 시료를 포함시켰다.
난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포의 IFN-gamma의 양을 분석하기 위해서 human IFN-gamma immunoassay kit (R&D)을 이용하여 진행하였다.
실험 결과
그 결과는 도 14에 나타내었다. 구체적으로, 난소암 세포주 (A2780)과의 공배양에 따른 IFN-gamma의 양은 YYB-103-1XX CAR-T의 경우 CAR 바이러스에 형질 도입되지 않은 시료에 비해서 높은 IFN-gamma을 분비하였으며, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T의 경우 YYB-103-1XX CAR-T 세포와 비슷하거나 또는 약 1.2 배 높은 IFN-gamma을 분비하였다.
실험예 3. IL13Rα2 발현 및 HGF 분비하는 난소암 세포주 (A2780)에 대한 YYB-103-1XX 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR 유전자 발현 T 세포의 표적세포 사멸현상 (Crystal violet) 확인
실험방법
표적 세포에 대한 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포의 항암 활성능을 다른 방법을 통해 확인하기 위해서 표적세포와 공배양 후 살아 있는 표적세포에만 염색되는 crystal violet 용액 (Sigma, Cat No. V5265)을 처리하여 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포의 표적세포 사멸현상을 확인하였다.
난소암 세포주 (A2780, 1 x 105 세포)와 YYB-103-1XX CAR-T 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포 2 x 105를 12웰 플레이트에 48시간 공배양을 진행하였다. 48시간 공배양 후 PBS을 이용하여 죽은 세포를 완벽하게 제거하고 0.1 % crystal violet 용액을 이용하여 살아 있는 난소암 세포주 (A2780)를 염색하였다. 살아 있는 난소암 세포주 (A2780)의 crystal violet 염색이 완료된 후, PBS을 이용하여 1회 세척한 후 YYB-103-1XX CAR-T 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포의 난소암 세포주 (A2780)에 대한 사멸현상을 확인하였다. 대조군으로 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 (Untransduced T 세포) 시료를 포함시켰다.
실험결과
제3 공여자(YY94)의 T 세포를 이용한 실험에서, YYB-103-1XX CAR-T 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T와 공배양의 경우 untransduced T 세포에 비해 crystal violet 용액에 대한 염색이 적게 되었다. 대조군으로 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 untransduced T 세포 시료의 경우 난소암 세포주 (A2780) 세포의 crystal violet 용액에 대한 염색은 난소암 세포주 (A2780) 세포에 대한 염색이 유지되는 것을 확인할 수 있었다(도 15).
제4 공여자(YY91)의 T 세포를 이용한 실험에서도, YYB-103-1XX CAR-T 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T와 공배양의 경우 untransduced T 세포에 비해 crystal violet 용액에 대한 염색이 적게 되었다(도 15).
이러한 결과는 YYB-103-1XX CAR-T 또는 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포의 표적세포주의 사멸현상을 의미한다.
실험예 4. 표적세포 항암 활성 확인
난소암 세포주 (A2780) 준비
IL13Rα2 발현 및 HGF 분비하는 난소암 세포주 (A2780)를 10% FBS와 1% antibiotics가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 CO2 incubator (Thermo, 371) 내에서 32℃6% CO2 조건에서 배양하였다.
난소암 세포주 (A2780) 종양이식 및 군구성
NSGA 마우스에 1x105 A2780 세포 8 ul와 matrigel 2 ul를 이용하여 NSGA 마우스의 난소에 직접 이식하여 생착을 유도하였다. 생착 3일 후, 시험동물의 체중 측정 및 in vivo luciferase 이미징을 이용하여 종양의 크기가 고르게 분배되었음을 확인하였다. 시험군은 1개의 대조군 (Vehicle)과 4개의 시험물질의 투여군 (Untransduced T 세포, YYB-103-1XX CAR-T, YYB-103-1XX CAR-T와 YYB-101 병용 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T)으로 구성하였으며, 각 군당 5마리씩 분배하였다.
시험물질 조제
CAR-T 세포치료제에 대하여 PBS을 이용하여 2회 세척 후 각각의 untransduced T 세포 및 CAR-T을 PBS로 희석한 후 준비하였다.
실험 방법
종양이식 후 3일에 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 T 세포 (Untransduced T 세포), YYB-103-1XX CAR-T 및 YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 세포를 1.5 x 107 세포 농도로 정맥으로 단회 투여하였다. 또한, YYB-103-1XX CAR-T와 YYB-101 병용군의 경우 YYB-101은 YYB-103-1XX CAR-T와 동시에 투여(1차)를 시작하여 추가(2차)로 1회 더 투여하여 총 주 2회 (20 mpk) 정맥으로 반복 투여하였다.
실험 결과
그 결과는 도 16 및 17에 나타내었다. 구체적으로, 난소암 세포주 (A2780)에 대하여 Vehicle 군과 untransduced T 세포를 처리한 군의 경우 24일에 모든 개체가 사망한 반면, YYB-103-1XX CAR-T을 투여한 군에서는 투여 24일까지 5개체 모두 생존하였으며, 일주일 단위로 1개체 또는 2개체가 사망하여 투여 45일까지 5개체 중 1개체가 생존하였다.
YYB-103-1XX CAR-T와 YYB-101 병용 투여군의 경우 투여 17일까지 5개체가 모두 생존하였고, 투여 24일까지 1개체 사망, 31일까지 1개체가 더 사망하여 31일까지 2개체가 사망하였지만, 45일까지 추가 사망 개체가 발생하지 않아 5개체 중에서 3개체가 생존하였다. 또한, YYB-103-1XX CAR-T 세포와 YYB-101 병용군에서 YYB-103-1XX CAR-T 투여군의 종양 크기에 비해서 감소된 결과를 보여주었다. 이러한 결과로부터 난소암 세포주 (A2780)에 대해서 YYB-103-1XX CAR-T 단독 투여군보다 YYB-101을 병용한 투여군에서 종양 크기가 감소되었고 생존률이 개선되었다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 투여군의 경우 투여 24일까지 모든 개체가 생존하였으며, 31일 까지 1개체가 사망하였지만, 45일까지 추가 사망 개체가 발생하지 않아 5개체 중에서 4개체가 생존하였다. 특히, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T 투여군의 경우 YYB-103-1XX CAR-T와 YYB-101 병용 투여군에 비해 종양 크기가 더 감소하였으며, 생존률이 더 우수하였음을 확인할 수 있었다. 이는 YYB-103-1XX CAR-T와 YYB-101 병용 투여의 경우 YYB-101가 전신에 고르게 퍼지기 때문에 종양 조직에서의 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도가 낮게 유지될 수 밖에 없으나, YYB-103-1XX+YYB-101 scFv CAR-T의 경우 항원을 인식하는 키메릭 항원 수용체에 조합됨으로써 종양 조직에서 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 농도가 높게 유지될 수 있기 때문으로 추정된다.
본 발명에 따른 효과기 세포는 난소암 등 고형암에 대한 항암 효과를 나타내므로, 항암제와 같은 의약품으로 이용 가능하다.
<110> CellabMED Inc. <120> Combination therapies of chimeric antigen receptors and HGF binding inhibitors <130> OKR21P0131-CMED <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hVHCAMP signal peptide <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IL13 ligand <400> 2 Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Lys Leu Ile Glu Glu Leu 1 5 10 15 Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30 Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Asp 50 55 60 Met Leu Asp Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser 65 70 75 80 Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys 85 90 95 Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Lys Glu Gly Gln Phe Asn 100 105 110 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 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Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg 195 200 205 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 210 215 220 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 245 250 255 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 260 265 270 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 275 280 285 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 290 295 300 Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu 305 310 315 320 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 325 330 335 Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His 340 345 350 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 355 360 365 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ala Met Gly Trp Ser Cys Ile 370 375 380 Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln 385 390 395 400 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 405 410 415 Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 420 425 430 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu 435 440 445 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 450 455 460 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 465 470 475 480 Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Arg Gly Ala Thr Phe Gly Gln Gly 485 490 495 Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 500 505 510 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 515 520 525 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 530 535 540 Thr Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 545 550 555 560 Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Gly Thr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr 565 570 575 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser 580 585 590 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 595 600 605 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ile Asn Leu Trp Gly 610 615 620 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 625 630 635 640 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val 645 650 655 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 660 665 670 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 675 680 685 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 690 695 700 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 705 710 715 720 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 725 730 735 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 740 745 750 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 755 760 765 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 770 775 780 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 785 790 795 800 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 805 810 815 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 820 825 830 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 835 840 845 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 850 855 860

Claims (21)

  1. 항원 결합 도메인; 힌지 영역; 막관통 도메인; 보조 자극 도메인; 및 세포질 신호 전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드; 및
    간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF)와 그 수용체(MET)의 결합을 억제하는 물질을 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 HGF와 MET 결합 억제 물질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 세포질 신호 전달 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 연결되는 것인 발현 카세트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 HGF와 MET 결합 억제 물질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 상기 세포질 신호 전달 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 자기 절단 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 존재하는 것인 발현 카세트.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 결합 억제 물질이 간세포성장인자 이소폼 (truncated HGF isoforms)인 발현 카세트.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 결합 억제 물질이 간세포성장인자 이소폼 (truncated HGF isoforms)인 발현 카세트.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 결합 억제 물질이 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor, HGF)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 발현 카세트.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 CAR의 항원 결합 도메인이 CD19, MUC16, MUCl, CAlX, CEA, CDS, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포 항원, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 폴레이트 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, K-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, 암태아 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD276 또는 IL13Ra2로부터 선택되는 항원과 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 발현 카세트.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 CAR의 막관통 도메인이 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터 선택되는 막관통 도메인을 포함하는 발현 카세트.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 CAR의 보조 자극 도메인이 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Tolllike ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로부터 선택되는 보조 자극 도메인을 포함하는 발현 카세트.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 CAR의 세포질 신호 전달 도메인이 4-1BB, CD28, OX40, CD3ζ의 기능적 신호 전달 도메인, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 세포질 신호 전달 도메인을 포함하는 발현 카세트.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 CAR의 항원 결합 도메인이 IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 발현 카세트.
  12. 제 1항에 있어서, IL13Rα2와 결합하는 항원 결합 도메인; 힌지 영역; 막관통 도메인; 보조 자극 도메인; 및 세포질 신호 전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드; 및
    HGF에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체가 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 발현 카세트.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 HGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 발현 카세트.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 발현 카세트가 서열번호 26의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  16. 제 15항의 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  17. 제 16항의 재조합 발현 벡터가 형질 도입된 효과기 세포.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 효과기 세포가 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 또는 이들의 전구세포, 또는 이들의 조합인 효과기 세포.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 T 림프구가 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구 또는 이들의 조합인 효과기 세포.
  20. 제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 효과기 세포를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 암이 난소암, 유방암, 위암, 폐암, 간암, 담도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 신장암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암인 약제학적 조성물.
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