CN116964082A

CN116964082A - Fc受体CAR构建体和细胞

Info

Publication number: CN116964082A
Application number: CN202180087463.4A
Authority: CN
Inventors: 劳伦·H·布瓦塞尔; 巴瑞·J·西蒙; 胡文杰; 汉斯·G·克林格曼
Original assignee: Immunobiology Co
Current assignee: Immunobiology Co
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-10-27
Also published as: WO2022140284A1; CA3205789A1; JP2024501276A; EP4267626A1; KR20230123515A; AU2021409653A1; US20240042023A1

Abstract

呈现了具有抗体结合结构域的嵌合抗原受体，这些嵌合抗原受体优选从治疗细胞，特别是NK‑92细胞或其衍生物中的重组细胞中表达。值得注意的是，这样的经修饰的细胞具有多种细胞毒性模式、改善的中靶细胞杀伤、减少的脱靶细胞杀伤，示出了显著的重组CAR表达和/或增加的CAR介导的细胞毒作用。

Description

Fc受体CAR构建体和细胞

本申请要求序列号为63/129,340的我们共同未决的美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请于2020年12月22日提交并且通过引用以其全文并入本文。

序列表

名称为104077.0021_REV005_ST25.txt、大小为144KB的序列表的ASCII文本文件的内容于2021年12月16日创建，并经由EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，且通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本发明的领域是嵌合抗原受体(CAR)和表达这样的CAR的重组细胞，特别是涉及具有结合抗体的Fc部分的抗原结合结构域(例如CD16 Fc结合结构域、CD32 Fc结合结构域或CD64 Fc结合结构域)的CAR。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认特别地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被特别地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

在许多情况下，治疗性抗体可用于产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，这已成为利用基因修饰的NK细胞对各种癌症进行免疫治疗的有前途的途径。ADCC由CD16受体介导，该受体结合治疗性抗体并触发颗粒酶和颗粒溶素向结合抗体的靶细胞释放。然而，不幸的是，CD16受体的表达通常被迅速下调，因此限制了使用天然NK细胞的这些抗体的治疗效用。此外，天然NK细胞上的CD16对抗体的Fc部分具有相对较低的亲和力，因此甚至进一步限制了治疗用途。最近，开发了重组NK细胞(可从南克维斯特公司(NantKwest)作为haNK细胞商购获得)，其表达高亲和力版本的CD16，从而显著增加了治疗潜力，因为重组CD16变体不发生下调，并且对抗体的Fc部分具有更高的亲和力。

在另一种方法中，产生了具有CD16细胞内和跨膜部分以及CD64细胞外部分的嵌合蛋白，以维持ADCC能力，并由于CD64部分而具有增加的亲和力(参见例如，Frontiers inImmunology[免疫学前沿]，2018年12月，第9卷，文章2873)。这虽然在概念上有吸引力，但仍然存在各种缺点。除其他外，体内抗肿瘤活性尚未得到证明，诸位作者推测表达CD64/16A的NK细胞在连续杀伤方面可能效率较低。在进一步的尝试中，如WO 2015/179833中所述，产生了杂交构建体，其中CD64的多聚体与跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域偶联，从而用嵌合受体武装T细胞，该杂交构建体可以激活由抗体结合诱导的T细胞的细胞毒性细胞杀伤。

在又另一种方法中，产生了嵌合抗原受体，其包括与各种信号传导结构域偶联的CD16V结构域，如US 2018/0133252中所述。类似地，US 7618817描述了某些CAR构建体，其中CD16部分用于提供由NK-92细胞中的逆转录病毒构建体表达的CAR中的结合特异性。虽然这些方法导致了能够结合抗体的重组细胞毒性细胞，但这样的细胞系的产生通常与天然细胞毒性的丧失或降低、如与天然NK细胞相比中靶细胞杀伤减少和/或脱靶细胞杀伤增加、重组CAR的表达减弱和/或至少一些CAR构建体的CAR介导的细胞毒作用降低有关，即使在这样的构建体是第2代或第3代CAR构建体的情况下。

因此，尽管结合抗体Fc部分的CAR的各种系统和方法在本领域是已知的，但它们全部或几乎全部都存在一些缺点。因此，仍然需要用于改善CAR和表达CAR的细胞的组合物和方法，这些细胞具有多种细胞毒性方式、改善的中靶细胞杀伤、减少的脱靶细胞杀伤、显著的重组CAR表达和/或增加的CAR介导的细胞毒作用。

发明内容

本发明主题涉及重组CAR和表达这样的CAR的细胞的各种组合物和方法，其中这样的细胞表现出多种细胞毒性方式、改善的中靶细胞杀伤、减少的脱靶细胞杀伤、显著的重组CAR表达和/或增加的CAR介导的细胞毒作用。

在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种重组嵌合抗原受体(CAR)，其包含具有如下多肽的抗体结合部分的抗体结合结构域，该多肽具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：31。在这样的CAR中，抗体结合结构域进一步偶联到依次包含任选的铰链部分、跨膜部分和信号传导结构域的多肽。

在选定的实施例中，抗体结合结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：32。典型地，铰链部分具有SEQ ID NO：3的肽序列，跨膜部分具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：74、SEQID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：84的肽序列，并且/或者信号传导结构域具有SEQ ID NO：1的肽序列。在进一步设想的实施例中，CAR可以包括至少一个第二信号传导结构域，其可以不同于初始信号传导结构域。例如，在一些实施例中，信号传导结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9。

在进一步的示例性实施例中，这样的CAR中的抗体结合结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：32，并且信号传导结构域具有SEQ ID NO：1的肽序列。优选地，铰链部分具有SEQ ID NO：3的肽序列，并且/或者跨膜部分具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：84的肽序列。在需要的情况下，CAR还可以包括至少一个另外的信号传导结构域(例如，具有SEQ ID NO：1的序列或其他信号传导结构域)。

在进一步设想的方面中，诸位发明人设想了一种重组核酸，其编码如本文所呈现的嵌合抗原受体。优选地但不是必须地，将核酸针对人类密码子使用进行密码子优化。此外，可以设想核酸还可以包括编码细胞因子、CD16、归巢受体和/或TGF-β陷阱的序列部分。(所有这些都可以以多顺反子配置来排列)。例如，重组核酸可以是慢病毒载体的一部分，或DNA载体的一部分。

在仍进一步设想的方面中，本发明人设想了用如本文所呈现的重组核酸转染的(典型地是哺乳动物)细胞。例如，细胞是NK细胞(例如，NK-92细胞、基因修饰的NK-92细胞或自体NK细胞)或T细胞。从不同的角度看，诸位发明人还设想了用编码如本文所述的重组嵌合抗原受体的重组核酸转染的重组NK细胞(例如，NK-92细胞、基因修饰的NK-92细胞或自体NK细胞)。

因此，本发明人还设想了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，其中向该患者施用治疗有效量的本文所呈现的细胞，从而治疗该癌症。最典型地，向患者施用约1x 10⁸至约1x 10¹¹个细胞/m²患者体表面积。此外，可以向患者施用至少一种另外的治疗实体，例如病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、N-803、抗体、干细胞移植物和/或肿瘤靶向细胞因子。例如，设想治疗的癌症包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，这些实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

因此，在癌症的治疗中设想了如本文所呈现的细胞的用途。

根据优选实施例的以下详细描述以及附图(其中相同的数字代表相同的组分)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本文所呈现的各种嵌合抗原受体的示意图。

图2描绘了aNK细胞、haNK细胞和CD16-CAR 28.E细胞的示例性CD16 FACS扫描结果。

图3描绘了如与haNK细胞相比，CD16-CAR 28.E细胞对NK敏感性K562细胞的细胞毒性的示例性结果。

图4描绘了在存在和不存在中靶和脱靶抗体的情况下，CD16-CAR 28.E细胞对SUP-B15^CD20+细胞的ADCC活性的示例性结果。

具体实施方式

诸位发明人已经发现了重组CAR和表达这样的CAR的细胞的各种组合物和方法，其中这样的细胞表现出多种细胞毒性方式、改善的中靶细胞杀伤、减少的脱靶细胞杀伤、显著的重组CAR表达和/或增加的CAR介导的细胞毒作用。

基于诸位发明人先前的发现，即在第一代类型构建体中使用FcεRIγ作为信号传导结构域的各种CAR构建体在表达这样的CAR构建体的NK-92细胞中具有改善的表达并提供增加的靶标特异性杀伤，诸位发明人开始修饰各种细胞，特别是NK-92细胞和基因修饰的NK-92细胞，以用结合抗体(特别是IgG抗体)的Fc部分的高亲和力CAR构建体武装这样的细胞，因此增强了表达这样的CAR的细胞的细胞毒性作用。事实上，当这些CAR在NK细胞上表达时，比未经修饰的NK细胞，这些细胞的ADCC大幅增加。

出乎意料的是，如下面更详细地描述，当与未经修饰的NK细胞、NK-92细胞相比时，并且在某些情况下甚至当与表达CD16和共表达FcεRIγ信号传导多肽或CD3ζ链的NK细胞相比(例如，如US 9181322中所教导的)时，如此生成的重组NK细胞具有多种细胞毒性模式、改善的中靶细胞杀伤、减少的脱靶细胞杀伤、显著的重组CAR表达和/或增加的CAR介导的细胞毒作用。

在优选的实施例中，诸位发明人设想CAR构建体，其在单个多肽链中包含具有抗体结合部分的抗体结合结构域，随后依次是细胞外任选的铰链部分、跨膜部分和细胞内信号传导结构域。根据细胞内信号传导结构域的特定用途和/或排列，应该理解，如此制备的CAR构建体可以是第1代，第2代或第3代CAR。图1示例性地描绘了与本文所呈现的教导结合有用的设想的CAR。例如，第1代CA构建体可以包含单个信号传导结构域，例如CD3ζ细胞内信号传导结构域，以及更优选地FcεRIγ信号传导结构域。值得注意的是，在CAR构建体具有第1代构造的情况下，与其他CAR构建体相比，具有FcεRIγ信号传导结构域的这样的CAR在NK细胞中具有优越的特性。这样的发现尤其出乎意料，因为迄今为止已知的T细胞中的第1代CAR与具有CD3ζ、4-1BB或CD28信号传导结构域以及任选地，如在第二代和第三代CAR中常见的另外信号传导结构域的CAR相比，表现相对较差。如将容易理解的，所设想的CAR还可以包括多个FcεRIγ和/或CD3ζ细胞内信号传导结构域。

在进一步的实例中，CAR构建体可以包括至少两个不同的细胞内信号传导结构域，并且这样的CAR构建体的典型实例包括其中CD3ζ细胞内信号传导结构域偶联到CD28信号传导结构域或4-1BB信号传导结构域的那些，如图1的第2代CAR构建体中所示例性描绘的。此外，应注意，所设想的CAR构建体可以包括两个以上的信号传导结构域(典型地是不同的)，并且示例性第3代CAR构建体包括其中CD3ζ细胞内信号传导结构域偶联到CD28信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域的那些。当然，应认识到，细胞内信号传导结构域的特定序列顺序可以变化，并且所有排列都被认为适用于本文。

关于抗体结合结构域，通常设想到，本文所呈现的CAR具有至少一个抗体结合部分，该部分将结合抗体的Fc部分，以及最优选地IgG的Fc部分。然而，在替代性的方面中，Fc部分也可属于IgG以外的抗体类别，包括IgA、IgM和IgE。因此，合适的抗体结合结构域将优选地包括CD16A、CD16B、CD32A、CD32B、CD64A、CD64B和CD64C的全长多肽或抗体结合部分，并且在次优选的方面还包括蛋白质A和蛋白质G。因此，合适的全长多肽或抗体结合部分将具有或包含根据SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：31的氨基酸序列(或这些序列中每一个的一部分)。当抗体结合部分是CD16、CD32或CD64的细胞外结构域时，特别是设想的细胞外结构域将具有或包含根据SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29和SEQ IDNO：32的氨基酸序列(或这些序列中每一个的一部分)。

无论抗体结合结构域的类型如何，应当理解，在大多数情况下，抗体结合结构域将经由铰链部分偶联到跨膜部分，以提供抗体结合结构域相对于跨膜部分的柔性。然而，应当认识到，在某些实施例中，铰链部分被省略，如下面的一些示例序列中所示。当存在时，铰链部分最典型地但不必须地是具有约5至100个(主要是亲水性)氨基酸残基的短且柔性的多肽。因此，合适的高部分特别包括具有或包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或其部分)的CD8铰链部分(尤其是人CD8铰链部分)。

在进一步设想的方面中，抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域也被认为适合于本文所述的嵌合受体。在一些实施例中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在其他实施例中，铰链结构域是抗体的铰链结构域，并且包含抗体的铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在进一步的实施例中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在仍进一步的实施例中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域以及抗体的CH2和CH3恒定区。

在另外的优选的方面中，抗体结合结构域和铰链部分(在存在的情况下)经由跨膜部分锚定在细胞膜中。例如，在一些实施例中，本文所述的嵌合受体的跨膜结构域可以衍生自I型单通膜蛋白。单通膜蛋白包括CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、Fc∈RIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3∈、CD3γ、CD36、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD45、CDS、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD4OL/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B。在优选的实例中，跨膜结构域衍生自CD8α或CD28或CD34。因此，特别优选的跨膜部分将具有或包含根据SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82或SEQ IDNO：84的氨基酸序列(或针对任何紧接在前的氨基酸序列，其部分)。

在仍进一步的方面中，来自多通膜蛋白的跨膜结构域对于在本文所述的嵌合受体中使用也可以是相容的。多通膜蛋白可包含复合(至少2、3、4、5、6、7或更多个)α螺旋或β折叠结构。优选地，多通膜蛋白的N末端和C末端存在于脂质双层的相对侧，例如，蛋白质的N末端可以存在于脂质双层的细胞质侧，而蛋白质的C末端可以存在于细胞外侧。来自多通膜蛋白的一个或多个螺旋通道可用于构建本文所述的嵌合受体。

用于本文所述的嵌合受体中的跨膜结构域还可以包含至少一部分合成的、非天然存在的蛋白质区段。在一些实施例中，跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施例中，蛋白质区段为至少大约20个氨基酸，例如，至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸。合成跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在US7052906和WO 2000/032776中，两者均通过引用并入本文。

关于合适的信号传导结构域，通常设想所有信号传导部分(典型地为细胞内)被认为适用于本文，其可包括表面受体(例如CD3ζ和FcεRIγ)的信号传导部分以及共刺激蛋白的信号传导部分，这些共刺激蛋白例如B7/CD28家族成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)、TNF超家族成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACl/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)、SLAM家族成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMFS、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)、和任何其他共刺激分子，例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thyl、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。

然而，特别优选的信号传导结构域包括来自CD3ζ的具有或包含根据SEQ ID NO：9的氨基酸序列(或其部分)、来自FcεRIγ的具有或包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列(或其部分)、来自CD28的具有或包含根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列(或其部分)、和来自4-1BB的具有或包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列(或其部分)的那些。

因此，从又另一个角度来看，诸位发明人设想了根据表1的各种CAR构建体，其中任一个结构域都可以使用本文所呈现的氨基酸序列的一个或多个的来构建。此外，虽然下表列出了示例性序列，但应当理解，所鉴定的每个序列可以包括一个或多个氨基酸变化，使得这些改变的氨基酸序列将与表中所示的序列具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少91％同一性。此外，还应认识到，表中所示的序列可以被截短(在任一端或两端)为较短的序列，只要截短的序列仍将保留指示的功能。当然，应认识到，这些序列代表成熟多肽序列，没有任何进一步的用于输出或运输的序列部分(例如，前导肽)。

表1

在本发明主题的进一步方面中，应当认识到，不仅设想了本文所呈现的多肽序列，还设想了编码本文所设想的序列的核酸序列和构建体。当然，如将容易理解的，所设想的核酸序列可以利用所有密码子使用模式，特别是人类密码子使用。此外，重组核酸还将包括所有必需的调控元件，以在用重组核酸转染的细胞中实现CAR构建体的表达。多种已知的启动子可用于表达本文所述的CAR构建体，包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒LTR，例如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、单纯疱疹tk病毒启动子等。用于表达嵌合受体的另外的启动子包括免疫细胞中的任何组成型活性启动子。替代性地，可以使用任何可调控的启动子，使得其表达在免疫细胞内可以被调节。

此外，在需要的情况下，重组核酸可以包含一个或多个另外的序列部分，这些序列部分可以编码具有所需功能的一种或多种另外的蛋白质。例如，合适的另外的序列部分将包括细胞因子，特别是NK细胞的自分泌生长刺激所需的细胞因子如IL-2和/或IL15，其可以经由内质滞留序列留在细胞内，免疫刺激细胞因子如N-801、干扰素γ等，以及有助于细胞迁移(例如，趋化因子受体)或改变肿瘤微环境(例如，IL-8或TGF-β陷阱)的一种或多种功能蛋白。

此外，重组核酸可含有进一步的功能元件，例如选择性标记基因(例如，用于在宿主细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因)、用于增加转录水平的来自人类CMV的立即早期基因的一个或多个增强子/启动子序列、用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号、用于在细菌中复制的SV40多瘤复制起点和ColEl、一个或多个内部核糖体结合位点(IRES)、多个克隆位点、用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6RNA启动子、“自杀开关”或“自杀基因”，其在被触发时导致携带载体的细胞死亡(例如，HSV胸苷激酶、诱导型半胱天冬酶如iCasp9)和/或用于评估CAR构建体表达的一个或多个报告基因。示例性多顺反子构建体描述于WO 2019/226708中，其通过引用并入本文。为此，所设想的核酸构建体可以包含编码2A肽(例如T2A、P2A、E2A或F2A肽)的序列，以产生等摩尔水平的由相同mRNA编码的多肽。

在其他多种核酸序列中，示例性核酸序列将具有根据SEQ ID NO：2(编码FcεRIγ细胞内信号传导结构域)、SEQ ID NO：4(编码人CD8铰链)、SEQ ID NO：6(编码人CD28跨膜部分)、SEQ ID NO：10(编码CD3ζ细胞内信号传导结构域)、SEQ ID NO：11(编码低亲和力CD16A)、SEQ ID NO：13(编码高亲和力CD16A)、SEQ ID NO：15(编码CD64A)、SEQ ID NO：18(编码CD64B)、SEQ ID NO：21(编码CD64C)、SEQ ID NO：24(编码CD32A)、SEQ ID NO：27(编码CD32B)和SEQ ID NO：30(编码CD16B)的序列。另外的所设想的核酸序列将具有根据SEQ IDNO：73(编码CD16A跨膜结构域)、SEQ ID NO：75(编码CD32A跨膜结构域)、SEQ ID NO：77(编码CD32B跨膜结构域)、SEQ ID NO：79(编码CD64A跨膜结构域)、SEQ ID NO：81(编码CD64B跨膜结构域)或SEQ ID NO：83(编码CD16C跨膜结构域)的核酸序列。如上所述，应当认识到，如上文所列的核酸序列可以在一定程度上变化，例如由于密码子偏好和一个或多个氨基酸交换(优选同时保持其各自的功能)。因此，本文所设想的核酸序列还包括与本文所披露的那些核酸序列具有至少99％、或至少98％、或至少97％、或至少96％、或至少95％、或至少94％、或至少93％、或至少92％、或至少91％、或至少90％序列同一性的核酸序列。因此，本文所设想的氨基酸序列还包括与本文所披露的那些氨基酸序列具有至少99％、或至少98％、或至少97％、或至少96％、或至少95％、或至少94％、或至少93％、或至少92％、或至少91％、或至少90％序列同一性的氨基酸序列。

因此，所设想的核酸序列还将包括适用于转染、繁殖和/或表达CAR构建体的各种重组构建体。例如，这样的重组核酸将包括线性或环状DNA和RNA，例如线性化的DNA和RNA、克隆载体、表达载体、甚至重组病毒。在其他优选的选择中，这样的构建体将典型地被配置为呈线性化形式、病毒形式(例如腺病毒或慢病毒)或病毒表达载体的多顺反子构建体。

在仍进一步设想的方面中，本文所呈现的CAR构建体将典型地在哺乳动物细胞中表达，并且最优选地在治疗细胞或免疫感受态细胞中表达，这些细胞相对于接受细胞的个体可以是自体或异源的。例如，用于表达本文所呈现的CAR构建体的合适的细胞特别包括T细胞、NK细胞和NKT细胞。

关于合适的NK细胞，应当注意，所有NK细胞均被认为适用于本文，因此包括原代NK细胞(保存、扩增和/或新鲜的细胞)、已永生化的继代NK细胞、自体或异源NK细胞(储存的(banked)、保存的、新鲜的等)和经修饰的NK细胞，如以下更详细所述。在一些实施例中，优选地，NK细胞是NK-92细胞。NK-92细胞系是独特的细胞系，发现其在白介素2(IL-2)的存在下增殖(参见，例如，Gong等人，Leukemia[白血病]8：652-658(1994))。NK-92细胞是癌性NK细胞，在合适的培养基中扩增后具有广泛的抗肿瘤细胞毒性和可预测的产量。有利地，NK-92细胞对多种癌症具有高细胞溶解活性。

原始NK-92细胞系表达CD56bright、CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45和CD54表面标志物，但未展示CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23和CD34标志物。这样的NK-92细胞在培养物中的生长取决于白介素2(例如，rIL-2)的存在，低至1IU/mL的剂量足以维持增殖。IL-7和IL-12不支持长期生长，测试的其他多种细胞因子(包括IL-1α、IL-6、肿瘤坏死因子α、干扰素α和干扰素γ)也不支持。与原代NK细胞相比，NK-92即使在相对较低的效应细胞∶靶标(E∶T)比率(例如，1∶1)下也典型地具有较高的细胞毒性。代表性NK-92细胞于美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，命名为CRL-2407。仍进一步设想的NK-92细胞包括那些经过基因工程化以表达用于自分泌生长刺激的细胞因子的细胞，和/或经过基因工程化以表达高亲和力版本的CD16的细胞。

在仍进一步的实施例中，诸位发明人设想了表达本文所呈现的一种或多种CAR构建体的重组细胞治疗疾病(例如，癌症、病毒感染、细菌感染等)，特别是治疗性抗体可用的疾病的用途。在这样的治疗用途和方法中，治疗有效量的重组细胞将单独施用，或与治疗性抗体结合施用。

所设想的疾病特别包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，这些实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

可以按绝对数量的细胞向个体施用所设想的转染细胞(例如，转染的NK-92细胞)。例如，可以向个体施用约1000个细胞/注射至高达约100亿个细胞/注射，例如每次注射约、至少约、或至多约1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³个细胞，或这些数字中任何两个之间的任何范围(含端点)。在其他实施例中，可以按相对数量的细胞向个体施用细胞，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞/千克个体至高达约100亿个细胞/千克个体，例如约、至少约或至多约1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³个细胞/千克个体，或这些数字中任何两个之间的任何范围(含端点)。在其他实施例中，总剂量可以按m²的身体表面积进行计算，包括每m²约1×10¹¹、1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷个，或这些数字中任何两个之间的任何范围(含端点)。人平均为约1.6至约1.8m²。在一个优选的实施例中，向患者施用约10亿至约30亿个的NK-92细胞。

转染的细胞(例如，转染的NK-92细胞)，和任选地，其他抗癌或抗病毒剂可以在疗法期间向患有癌症或感染病毒的患者施用一次，或者可以施用多次，例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，或这些数字中任何两个之间的任何范围(含端点)。

实例

与本文所呈现的教导结合使用的示例性核酸和氨基酸序列包括SEQ ID NO：33-72。更特别地，SEQ ID NO：33示出了编码具有ECD-CD16a TM-FceRIg结构域的示例性CD16aVCAR的核酸，SEQ ID NO：34示出了具有ECD-CD16a TM-FceRIg结构域的示例性CD16aV CAR的氨基酸，SEQ ID NO：35示出了编码具有ECD-CD28TM-FceRIg结构域的示例性CD16aV CAR的核酸，SEQ ID NO：36示出了具有ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CD16aV CAR的氨基酸，SEQ ID NO：37示出了编码具有ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CD16aV CAR的核酸，SEQ ID NO：38示出了包含CD16aV ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：39示出了编码包含CD16b ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：40示出了包含CD16b ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：41示出了编码包含CD16b ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：42示出了包含CD16b ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：43示出了编码包含CD64a ECD-CD64 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQID NO：44示出了包含CD64a ECD-CD64 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ IDNO：45示出了编码包含CD64a ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：46示出了包含CD64a ECD-CD28TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：47示出了编码包含CD64a ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：48示出了包含CD64a ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：49示出了编码包含CD64b ECD-CD64TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：50示出了包含CD64b ECD-CD64 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：51示出了编码包含CD64b ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：52示出了包含CD64b ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：53示出了编码包含CD64b ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：54示出了包含CD64b ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：55示出了编码包含CD64c ECD-CD64 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：56示出了包含CD64c ECD-CD64 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：57示出了编码包含CD64c ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：58示出了包含CD64cECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：59示出了编码包含CD64cECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：60示出了包含CD64cECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：61示出了编码包含CD32a ECD-CD32a TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：62示出了包含CD32aECD-CD32a TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：63示出了编码包含CD32aECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：64示出了包含CD32a ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：65示出了编码包含CD32a ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：66示出了包含CD32a ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：67示出了编码包含CD32bECD-CD32b TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：68示出了包含CD32b ECD-CD32b TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：69示出了编码包含CD32b ECD-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，SEQ ID NO：70示出了包含CD32b ECD-CD28TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸，SEQ ID NO：71示出了编码包含CD32b ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的核酸，并且SEQ ID NO：72示出了包含CD32b ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR的氨基酸。

在此，ECD是指Fc受体的细胞外结构域(例如，对于CD32B Fc受体的细胞外结构域，其可以定性为“CD32b ECD”，或者对于CD16a Fc受体的细胞外结构域，其可以定性为ECD-CD16a)，TM是指跨膜结构域(例如，CD28跨膜结构域CD28TM)，FceRIg是指信号传导结构域形式FceRIg，CD8是指CD8铰链结构域。

与本文所呈现的教导结合使用的进一步的示例性核酸和氨基酸序列包括SEQ IDNO：73-84。更特别地，SEQ ID NO：73示出了编码示例性CD16A跨膜结构域的核酸，SEQ IDNO：74示出了示例性CD16A跨膜结构域的氨基酸，SEQ ID NO：75示出了编码示例性CD32A跨膜结构域的核酸，SEQ ID NO：76示出了示例性CD32A跨膜结构域的氨基酸，SEQ ID NO：77示出了编码示例性CD32B跨膜结构域的核酸，SEQ ID NO：78示出了示例性CD32B跨膜结构域的氨基酸，SEQ ID NO：79示出了编码示例性CD64A跨膜结构域的核酸，SEQ ID NO：80示出了示例性CD64A跨膜结构域的氨基酸，SEQ ID NO：81示出了编码示例性CD64B跨膜结构域的核酸，SEQ ID NO：82示出了示例性CD64B跨膜结构域的氨基酸，SEQ ID NO：83示出了编码示例性CD64C跨膜结构域的核酸，并且SEQ ID NO：84示出了示例性CD64C跨膜结构域的氨基酸。在此上下文中，应当理解，所有跨膜结构域序列都可以互换地用于如本文所述的CAR构建体中。因此，例如，包含CD32b ECD-CD8-CD28 TM-FceRIg结构域的示例性CAR也可以制备为包含如上文SEQ ID NO：73-84所示的CD16A、CD32A、CD32B、CD64A、CD64B或CD64C TM结构域中任一个(而非CD28 TM结构域)的CAR。

实例1.aNK细胞的转染：Fc-CAR aNK细胞是通过用含有Fc-CAR和IL-2序列的基于双顺反子质粒的载体电穿孔aNK细胞生成的。IL-2序列用内质网滞留信号KDEL标记，以防止IL-2蛋白从内质网(ER)分泌，并被称为ERIL-2。

编码各种Fc-CAR构建体的核酸在序列表中提供，并且可以包括或可以不包括铰链区。这些构建体将由金唯智公司(GeneWiz，Inc.)生成的合成寡核苷酸和PCR产物组装而成。这些构建体将被克隆到双顺反子pNEUKv1 IRES_ERIL2载体骨架中，该载体骨架含有氨苄西林抗性盒、EF-1α启动子和SV40聚腺苷酸化序列。所得质粒DNA将从经转化细菌中纯化，其浓度将通过UV光谱法来测定。aNK细胞将使用Neon电穿孔装置用各种纯化的Fc-CAR质粒来电穿孔。电穿孔的细胞将被放回到补充有5％热灭活人AB血清的X-VIVO 10培养基(不添加IL-2)中，并在37℃下在5％CO₂培养箱中孵育。

预期结果：成功掺入质粒构建体的多克隆aNK细胞群将能够在培养基中在没有IL-2的情况下生长。扩增的Fc-CAR aNK细胞群应在电穿孔的3至5周内可检测到，并在另外2至3周内可进行测试。

实例2.表型分析：将进行流式细胞术分析，以测量电穿孔的aNK细胞上Fc-CAR的表面表达。根据制造商的说明，细胞将用识别人CD16、CD32或CD64的荧光染料缀合的抗体进行染色，并在流式细胞仪装置上进行分析。

预期结果：电穿孔后培养3至5周后，应在至少30％的细胞中观察到Fc-CAR分子的表面表达。更特别地，在选定的实验结果中，图2描绘了在aNK细胞(CD16-CAR.28E细胞)中表达的CD16-CAR.28E构建体的数据，其中CAR由FCGRIIIA的CD16A-158V变体的细胞外结构域、CD28的跨膜结构域和FCERIG的信号传导结构域构建。将编码这样的构建体的核酸亚克隆到pNEUKv1-IRES-ERIL2质粒中。使用NeonTM电穿孔仪装置用该质粒电穿孔aNK细胞。电穿孔后三周，将细胞用抗CD16抗体进行染色并通过流式细胞术进行分析。将电穿孔的细胞与非电穿孔的aNK细胞和haNK细胞进行比较。如从扫描中可以容易地看出的，aNK细胞在其细胞表面上不表达CD16，而haNK细胞在细胞表面上示出显著的CD16表达。同样，CD16-CAR 28.E细胞具有强烈的CD16表面呈递信号。

实例3.直接或天然细胞毒性：K562细胞将在补充有10％热灭活FBS(吉布科/赛默飞世尔公司(Gibco/Thermofisher))的RPMI-1640培养基(吉布科/赛默飞世尔公司)中生长，并在37℃下在5％CO₂培养箱中孵育。K562细胞将用绿色荧光染料(PKH67-GL)进行染色，Fc-CAR aNK效应细胞将在96孔板中以不同的效应细胞与靶标(E∶T)比率组合，短暂离心，并在37℃下在5％CO₂培养箱中孵育4h。孵育后，细胞将用1％BSA/PBS缓冲液中1μg/ml的碘化丙啶(PI)进行染色，并立即通过流式细胞术进行分析。靶细胞和效应细胞也将分别用PI进行染色以评估自发的细胞裂解。

死亡靶细胞将被鉴定为PKH67-GL和PI双阳性。死细胞的百分比将通过PKH67⁺靶细胞群中PI⁺的百分比来确定。％杀伤将计算如下＝[样品中死亡靶细胞％-自发的死亡靶细胞％]/[100-％自发的死亡靶细胞]。

预期结果：在最高E∶T比率下，K562靶细胞的杀伤百分比应超过50％。更特别地，在选定的实验结果中，图3描绘了CD16-CAR.28E细胞的细胞毒性活性数据，如通过基于流式的体外细胞毒性测定(针对NK敏感性人细胞系K562，并与haNK细胞进行比较)所确定的。将效应细胞和靶细胞以范围为10∶1至0.06∶1的E∶T比率混合，并在37℃下孵育4小时。如从图3中的图可以容易地得出的，细胞毒性是相当的，并且在较高的E∶T比率下甚至优于haNK细胞的细胞毒性。

实例4.ADCC：NK抗性SUP-B15靶细胞的表达CD20的变体将用于测定。CD20+SUP-B15靶细胞将在补充有20％热灭活FBS(吉布科/赛默飞世尔公司)和0.2％β-巯基乙醇的RPMI-1640培养基(吉布科/赛默飞世尔公司)中生长，并在37℃下在5％CO2培养箱中孵育。CD20+SUP-B15细胞将用绿色荧光染料(PKH67-GL)进行染色。然后，经染色的靶细胞将与浓度为2ug/ml的单克隆抗体利妥昔单抗(抗CD20抗体)或曲妥珠单抗(抗HER2/neu对照抗体，SUP-B15细胞为HER2/neu阴性)预孵育或无抗体预孵育20分钟。预孵育的经染色的靶细胞将与Fc-CAR aNK效应细胞在96孔板中以不同的效应细胞与靶标(E∶T)比率组合，短暂离心，并在37℃下在5％CO2培养箱中孵育4h。孵育后，细胞将用1％BSA/PBS缓冲液中1μg/ml的碘化丙啶(PI)进行染色，并立即通过流式细胞术进行分析。靶细胞和效应细胞将分别用PI进行染色以评估自发的细胞裂解。死亡靶细胞被鉴定为PKH67-GL和PI双阳性。抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(％ADCC)将计算如下＝[(样品E+T加mAb中的死亡靶细胞％)-(样品E+T减去mAb中的死亡靶细胞％)]/[100-(样品E+T减去mAb中的死亡靶细胞％)]，(E＝效应细胞，T＝靶标，mAb＝单克隆抗体)。

预期结果：在利妥昔单抗存在下，对CD20+SUP-B15靶细胞的ADCC杀伤百分比应显著高于在曲妥珠单抗存在下的杀伤百分比。在最高E∶T比率下，％ADCC应为至少20％。更特别地，在选定的实验结果中，图4描绘了CD16-CAR.28E细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的数据，如通过基于流式的体外细胞毒性测定(针对CD20阳性、HER2阴性、NK抗性人细胞系SUP-B15^CD20+)所确定的。将靶细胞在室温下与2μg/mL的利妥昔单抗(中靶抗CD20)或曲妥珠单抗(脱靶抗HER2)抗体预孵育或无抗体预孵育20分钟。然后将效应细胞和预孵育的靶细胞以范围为10∶1至0.06∶1的E∶T比率混合，并在37℃下孵育4小时。将haNK细胞包括在测定中进行比较。如从图4中的图可以清楚地看出的，haNK细胞和CD16-CAR.28E细胞在脱靶抗体的存在下均无ADCC活性。相反，haNK细胞和CD16-CAR.28E细胞在中靶抗体的存在下均具有显著的ADCC活性，其中CD16-CAR.28E细胞显著优于haNK细胞。从不同角度来看，CD16-CAR.28E构建体出乎意料地提供了比在细胞表面上表达CD16158V高亲和力变体的可比的NK细胞更强的ADCC活性。

适合与本文所呈现的教导结合使用的进一步方面、考虑因素和方法在US 2018/0133252和US 2016/0067356中描述，这两者都通过引用并入本文。

在一些实施例中，用于描述和要求保护本发明某些实施例的表达成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施例中，书面说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例寻求获得的希望的特性而变化。本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，否则将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。

如本文所用，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物典型地通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)的步骤。还应注意，术语“预后”或“预测”病症、疾病发展的易感性或对预期治疗的应答旨在涵盖进行预测或预测病症、易感性和/或应答(包括受试者中病症的进展速度、改善和/或持续时间)的行为(但不包括治疗行为或诊断行为)。

除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例而提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。

如本文的说明书和随后的整个权利要求书中所用，“一个/一种(a、an)”以及“该/这些(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。此外，如本文的说明书中所用，“在......中(in)”的含义包括“在......中(in)”和“在......上(on)”，除非上下文清楚地另外指明。还如本文中所使用，并且除非上下文另有指示，否则术语“偶联至”旨在包括直接偶联(其中两个彼此偶联的元件彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的元件位于两个元件之间)。因此，术语“偶联到”和“与......偶联”同义使用。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本发明主题除在所附权利要求书的范围内外，不应受到限制。此外，在解释本说明书和权利要求书时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括(comprises和comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书和/或权利要求书涉及选自由A、B、C......和N组成的组中的至少一种时，该文字应解释为只需要该组中的一个要素，而不是A加N、或B加N等。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种在NK细胞上表达的重组嵌合抗原受体(CAR)，该重组嵌合抗原受体包含：

具有如下多肽的抗体结合部分的抗体结合结构域，该多肽具有选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：31；并且

其中该抗体结合结构域偶联到依次包含任选的铰链部分、跨膜部分和具有SEQ ID NO：1的FcεRIγ信号传导结构域的多肽。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中该抗体结合结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：32。

3.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该任选的铰链部分具有SEQID NO：3的肽序列。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜部分具有SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：84的肽序列。

5.删除。

6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体进一步包含至少一个第二信号传导结构域。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其中该第二信号传导结构域不同于该信号传导结构域。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中该信号传导结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。

9.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中该抗体结合结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：32，并且其中该信号传导结构域具有SEQ ID NO：1的肽序列。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中该任选的铰链部分具有SEQ ID NO：3的肽序列。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜部分具有SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82或SEQ IDNO：84的肽序列。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体进一步包含至少一个另外的信号传导结构域，并且任选地其中该另外的信号传导结构域具有SEQ ID NO：1的肽序列。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该另外的信号传导结构域具有SEQ ID NO：1的肽序列。

14.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中该嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：34、SEQID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54xx、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列。

15.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中该嵌合抗原受体由具有SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列的核酸编码。

16.一种重组核酸，该重组核酸编码根据权利要求1-13中任一项所述的嵌合抗原受体。

17.根据权利要求16所述的重组核酸，其中将该核酸针对人类密码子使用进行密码子优化。

18.根据权利要求16-17中任一项所述的重组核酸，该重组核酸进一步包含编码细胞因子、CD16、归巢受体和/或TGF-β陷阱的序列部分。

19.根据权利要求18所述的重组核酸，其中该核酸编码该嵌合抗原受体，并且编码该细胞因子、该CD16、该归巢受体和/或该TGF-β陷阱的该序列部分被配置为多顺反子核酸。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的重组核酸，其中该重组核酸是慢病毒载体的一部分。

21.根据权利要求16-19中任一项所述的重组核酸，其中该重组核酸是DNA载体的一部分。

22.一种NK细胞，该细胞用根据权利要求16-21中任一项所述的重组核酸转染。

23.删除。

24.根据权利要求22所述的细胞，其中该细胞是NK-92细胞、基因修饰的NK-92细胞或自体NK细胞。

25.一种重组NK细胞，该细胞用编码根据权利要求1-13或权利要求15中任一项所述的重组嵌合抗原受体的重组核酸转染。

26.根据权利要求25所述的重组NK细胞，其中该NK细胞是NK-92细胞、基因修饰的NK-92细胞或自体NK细胞。

27.根据权利要求25所述的重组NK细胞，该细胞用根据权利要求14-19中任一项所述的重组核酸转染。

28.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的根据权利要求22-27中任一项所述的细胞，从而治疗该癌症。

29.根据权利要求28所述的方法，该方法进一步包括施用至少一种另外的治疗实体的步骤，该另外的治疗实体选自由以下组成的组：病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、N-803、抗体、干细胞移植物和肿瘤靶向细胞因子。

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中该癌症选自白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，这些实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中向该患者施用约1x 10⁸至约1x 10¹¹个细胞/m²患者体表面积。

32.根据权利要求22-27中任一项所述的细胞在治疗癌症或病毒感染中的用途。

Claims

1.一种重组嵌合抗原受体(CAR)，该重组嵌合抗原受体包含：

其中该抗体结合结构域偶联到依次包含任选的铰链部分、跨膜部分和信号传导结构域的多肽。

4.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜部分具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82或SEQ IDNO：84的肽序列。

5.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该信号传导结构域具有SEQID NO：1的肽序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体进一步包含至少一个第二信号传导结构域。

8.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该信号传导结构域具有选自由以下组成的组的肽序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。

22.一种细胞，该细胞用根据权利要求16-21中任一项所述的重组核酸转染。

23.根据权利要求22所述的细胞，其中该细胞是NK细胞或T细胞。