JP2024008968A - 複数の抗原を標的とするｃｏｍｐｏｕｎｄキメラ抗原受容体（ｃＣＡＲ）の組成物およびその使用方法 - Google Patents

複数の抗原を標的とするｃｏｍｐｏｕｎｄキメラ抗原受容体（ｃＣＡＲ）の組成物およびその使用方法 Download PDF

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Yupo Ma
ケヴィン・ピンズ
Pinz Kevin
シュン・ジャン
Xun Jiang
将幸 和田
Masayuki Wada
ケヴィン・チェン
Chen Kevin
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Abstract

【課題】軟組織腫瘍のより効果的、安全、および効率的なターゲティングを可能にする、改善されたキメラ抗原受容体ベースの療法を提供すること。【解決手段】第１の抗原認識ドメイン、第１のシグナルペプチド、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、および第１のシグナリングドメインを含む第１キメラ抗原受容体ポリペプチドを、そして第2の抗原認識ドメイン、第2のシグナルペプチド、第2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2の共刺激ドメイン、および第2のシグナル伝達ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体ポリペプチド有する操作された細胞により、上記課題を解決する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願への相互参照
この出願は、2017年10月12日に出願された米国仮特許出願第62 / 571,608号および2018年2月10日出願の米国仮特許出願第62 / 628,973号の利益を主張している。これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
背景
リンパ球の一種であるT細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。細胞表面にT細胞受容体（TCR）が存在することにより、B細胞やナチュラルキラー細胞（NK細胞）などの他のリンパ球と区別される。CD4+TあるいはCD4T細胞と呼ばれるヘルパーT細胞にはCD4糖蛋白質が細胞表面上に発現している。ヘルパーT細胞は、MHC（主要組織適合遺伝子複合体）クラスII分子によって提示されるペプチド抗原にさらされると活性化される。一旦活性化されると、これらの細胞は急速に増殖し、免疫応答を調節するサイトカインを分泌する。CD8 + T細胞またはCD8 T細胞としても知られている細胞傷害性T細胞は、CD8糖蛋白質を細胞表面上に発現している。 CD8 + T細胞は、MHCクラスI分子によって提示されるペプチド抗原にさらされると活性化される。 T細胞のサブセットであるメモリーT細胞は、長期間生存し、過去における感染および/あるいは腫瘍細胞に対する“記憶”を免疫システムに提供することで、それらの同種抗原に応答する。
T細胞は、その表面上にキメラ抗原受容体（CARs）とよばれる特別な受容体を産生するように 遺伝子操作することができる。CARsは、腫瘍細胞上の特異的タンパク質（抗原）を認識することができるT細胞上のタンパク質である。これらの設計されたCAR T細胞は、実験室において数十億個に達するまで増殖させる。その後、増殖させたCAR T細胞の集団は患者に注入される。
今日までのキメラ抗原受容体（CAR）T細胞を用いた臨床試験では、 標準的な化学療法に耐性をもつ血液悪性腫瘍に対する治療方として非常に見込みがある。最も注目すべきことに、CD19-特異的CAR（CD19CAR）T細胞療法は、B細胞悪性腫瘍における長期間の寛解を含め、著しく良好な結果をしめした。（参照文献: Kochenderfer, Wilson et al. 2010, Kalos, Levine et al. 2011, Porter, Levine et al. 2011, Davila, Riviere et al. 2013, Grupp, Frey et al. 2013, Grupp, Kalos et al. 2013, Kalos, Nazimuddin et al. 2013, Kochenderfer, Dudley et al. 2013, Kochenderfer, Dudley et al. 2013, Lee, Shah et al. 2013, Park, Riviere et al. 2013, Maude, Frey et al. 2014)
B細胞白血病およびリンパ腫におけるCAR療法の成功にもかかわらず、軟部組織腫瘍に対するCAR療法の適用は、まだ十分には確立されていない。悪性軟部組織腫瘍は、B細胞の悪性腫瘍と比較して劇的に予後不良である (Abramson, Feldman et al. 2014) 、この点においてCAR療法はさらに大きな臨床におけるニーズに対応する可能性を秘めている。
CAR治療でのより広範囲なアプローチを取り入れるのを妨げるいくつかの障害が存在する。最も一般的な課題として、（1）抗原標的およびキメラ抗原受容体の選択、（2）CARのデザイン、（3）腫瘍の不均一性、特に腫瘍抗原の表面発現のばらつき。単一抗原を標的とすることは免疫エスケープの危険性を有し、これは複数の所望の抗原を標的とすることによって克服することができる。
ほとんどのCARキメラ抗原受容体はモノクローナル抗体に由来するscFvであり、これらのモノクローナル抗体のいくつかは疾患の臨床試験または治療に使用されている。しかしながら、それら有効性は限られており、CARのような代替的かつより強力な標的に対するアプローチが必要であることが示唆されている。
効果的なCAR設計を保証またはガイドする一般的なルールがないため、ターゲットの発見と選択が最初のステップである。
scFvは、CARで最も一般的に使用されるキメラ抗原受容体である。しかしながら、CARの親和性結合および抗原上の認識されたエピトープの位置は、その機能に影響し得る可能性が有る。さらに、T細胞またはNK細胞上の表面CARの発現のレベルは、適切なリーダー配列およびプロモーターの影響を受ける。さらに、過剰発現されたCARタンパク質は、細胞にとって有毒でもあり得る。
したがって、T細胞関連悪性腫瘍へのより効果的で安全で効率的に働く、改善されたキメラ抗原レセプターに基づく治療の必要性が依然として存在する。
さらに、神経芽細胞腫を標的とするCARは、異種腫瘍集団の存在および腫瘍微小環境での抑制があるため、非常に困難である。神経芽細胞腫の抗原特異的免疫療法は、患者の治療結果を改善するために長い間追求されてきたが、これらの治療法の多くが診療所で効果がなかったり、患者の転帰に不確実な影響があるため、これまでの成功は限られている。神経芽細胞腫または他の軟部組織腫瘍（肉腫など）、抗原の多様性が高い疾患における理想的な標的は確立されていない。適切なターゲットの特定は、CAのR設計にとって重要なステップであり、CARの設計は、腫瘍の不均一性、CARの持続性、および腫瘍微小環境の抑制に対処するために必要である。 CARの設計が有効で安全であるという一般的なルールはない。
したがって、軟組織腫瘍のより効果的、安全、および効率的なターゲティングを可能にする、改善されたキメラ抗原受容体ベースの療法の必要性が残っています。
米国仮特許出願第62 / 628,973号
Kochenderfer, Wilson et al. 2010 Kalos, Levine et al. 2011 Porter, Levine et al. 2011 Davila, Riviere et al. 2013 Grupp, Frey et al. 2013 Grupp, Kalos et al. 2013 Kalos, Nazimuddin et al. 2013 Kochenderfer, Dudley et al. 2013 Kochenderfer, Dudley et al. 2013 Lee, Shah et al. 2013 Park, Riviere et al. 2013 Maude, Frey et al. 2014 Abramson, Feldman et al. 2014
したがって、軟組織腫瘍のより効果的、安全、および効率的なターゲティングを可能にする、改善されたキメラ抗原受容体ベースの療法の必要性が残っています。
一実施形態では、本開示は、第１の抗原認識ドメイン、第１のシグナルペプチド、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、および第１のシグナル伝達ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体ポリペプチドを、そして、第２の抗原認識ドメイン、第２のシグナルペプチド、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、第２の共刺激ド メイン、および第２のシグナル伝達ドメインを含む第２のキメラ抗原受容体ポリペプチドを、そして、第１の抗原認識ドメインおよび第２の抗原拒絶ドメインは、インターロイキン６受容体、NY-ESO-1、アルファフェトプロテイン（AFP）、（GPC3）、BAFF-R、BAFF、APRIL、BCMA、TACI、LeY、CD5、CD4、CD3、CD2、CD52、GD2、CD13、CD14、CD15 CD19、CD20、CD22、CD33、CD30、CD41、CD45、CD61、CD64、CD68、CD117、CD123、CD138、CD267、CD269、CD38、Flt3受容体、CD4、CLL-1およびCS1（SLAMF7）からなるグループより選択される。
別の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体およびエンハンサーを含む改変ポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本開示は、以下の方法等が含まれる、（i）少なくとも1つのキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作された細胞の有効量と 標的細胞とを接触させること、操作された細胞は複数のキメラ抗原レセプターポリペプチドをもち、各キメラ抗原レセプターポリペプチドは独立していること、また（ii）場合により、前記の標的細胞の数の減少を測定することを含む、標的細胞の数を減少させる方法を提供する。標的細胞はGD2、GD3、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE-4、MAGE -5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、CD30、EGFRvIII 、CD33、CD123、CLL-1、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、NKG2D受容体、April受容体、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7 、CD2、およびCD138からなるグループより選択される少なくとも1つの細胞表面抗原を含む。標的抗原には、ヒトパピローマウイルス（HPV）またはEBV（エプスタインバーウイルス）抗原由来のE6およびE7などのウイルスまたは真菌抗原も含まれる。
別の実施形態において、本開示は、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄腫白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄増殖性腫瘍、B細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）、急性形質細胞様樹状細胞腫瘍、肺がん、肝臓がん、脳がん、骨肉腫、乳がん、前立腺がん、細胞増殖性疾患を治療する方法であって、前記された如何なる操作された細胞を必要とする患者に投与することを含む。
別の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法を提供し、この方法は、請求項１に記載の操作された細胞をそれを必要とする患者に投与することを含む。ここで、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ、シェーグレン症候群、皮膚筋症、自己免疫性溶血性貧血、視神経脊髄炎（NMOD）、NMOスペクトラム障害（NMOSD）、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、全身性自己免疫小血管血管炎症候群または顕微鏡的多発血管炎（MPA）に伴う抗好中球細胞質自己抗体（ANCA）、多発血管炎を伴う肉芽腫症（GPA、ウェゲナー肉芽腫症）、または多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症（EGPA、チャーグ-ストラウス症候群）およびTTP（血栓性血小板減少性紫斑病）を含む。
本開示は、非血液学的悪性腫瘍を標的とするキメラ抗原受容体（CARS）、その組成物および使用方法を提供する。
一実施形態において、本開示は、第１の抗原認識ドメイン、第１のシグナルペプチド、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、および第 １のシグナルドメインを含む第１のキメラ抗原受容体ポリペプチドを有し、そして第2の抗原認識ドメイン、第2のシグナルペプチド、第2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2の共刺激ドメイン、そして第2のシグナル伝達ドメインを含む第2のキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する操作された細胞を提供する。ここにおいて第1の抗原認識ドメインは第2の抗原認識ドメインとは異なる。
別の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体およびエンハンサーを含む改変ポリペプチドを提供する。さらなる態様において、エンハンサーは、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-15 / IL-15sush、IL-15/ IL-15sushiアンカー、IL-15 / IL-15RA、IL-18、IL-21、IL-21アンカー、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、IL-15受容体アルファの細胞質ドメイン、4-1BBL、IL-21、IL-21アンカーおよびTGFRベータ受容体を含むがこれらに限定されない、グループの少なくとも1つから選択することができる。
いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインを有するCARは発現カセットの一部である。好ましい実施形態では、発現遺伝子またはカセットは、アクセサリー遺伝子またはタグまたはその一部を含み得る。アクセサリー遺伝子は、カスパーゼ9遺伝子を含むがこれに限定されない誘導性自殺遺伝子またはその一部であってもよい。 「自殺遺伝子」によるアブレーションアプローチは、遺伝子治療の安全性を向上させ、特定の化合物または分子によって活性化された場合にのみ細胞を殺す。いくつかの実施形態では、エピトープタグは、c-mycタグ、CD52、ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）、トランケートされたEGFR遺伝子（EGFRt）、またはその一部または組み合わせである。
いくつかの実施形態では、抗CD52モノクローナル抗体（CAMPATH）を対象に投与することにより、CAR細胞を除去することができる。
別の実施形態において、本開示は、上記の任意の操作された細胞をそれを必要とする患者に投与することにより、軟部組織腫瘍、癌腫、肉腫、白血病、および細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。
図1：CARの構成と発現(A）2つの個別のCARユニット：抗BCMA CARはCD8由来のヒンジ（H）および膜貫通（TM）領域、およびCD3ζシグナル伝達ドメインにリンクされた4-1BB共活性化ドメインが自己切断型P2Aペプチドにより、完全な抗CS1 CARに融合したものを含む。T細胞表面上にBC1cCAR（BCMA-CS1 cCAR）分子を効率的に発現させる為に、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）およびCD8リーダー配列が使用された。 図1：CARの構成と発現（B）BC1cCARの発現は、コントロールT細胞に対し、FACSによって測定された。 BCMAはCD269とも呼ばれた。 図2：骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞のin vitroでの評価（A）2：1および5：1のE：T比で24時間、BC1cCARおよびコントロールT細胞をMM1SおよびRPMI-8226細胞とともに培養した。標的細胞をCytotracker色素（CMTMR）で染色してエフェクターT細胞と区別し、赤色で示す。集団はBCMA、CS1、およびCMTMRによってゲートされた。 図2：骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞のin vitroでの評価（B）BC1cCARおよびコントロールT細胞を同様の条件下でU266（BCMA+CS1dim）細胞とインキュベートした。 図2：骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞のin vitroでの評価（C）さまざまな骨髄腫細胞株に対するBC1cCAR T細胞でのin vitro細胞毒性のグラフによる要約。 図3：原発性患者からの細胞の表現型BCMAおよびCS1の発現について、原発性細胞をFACSでアッセイした。密度プロットは、主要な抗原の集団を表す。 図4：原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性評価（A）BCMA+CS1+原発性骨髄腫細胞（MM7-G）に対する共培養を24時間実施し、標的細胞をCMTMRで予め染色した。集団はCMTMRとともにBCMAとCS1によってゲートされ、フローサイトメトリーのプロットは標的腫瘍集団を赤で示めす（左）。インビトロでの細胞障害性を要約した棒グラフ（右）。 図4：原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性評価（B）MM10-G原発性細胞との共培養は、同様の条件下で行われた。 FACSによるBCMA+CS1+二重陽性集団（紫色）およびCS1+のみの集団（濃青色）。要約された特定の細胞毒性（以下）。 図4：原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性評価（C）BCMAdimCS1dim原発性細胞（MM11-G）は、E：T投与量の範囲でBC1cCAR抗腫瘍活性を示す。 図4：原発性骨髄腫腫瘍細胞に対するBC1cCAR T細胞の抗腫瘍活性の特性評価（D）BC1cCAR in vitroスクリーニングの結果を示す要約したパネルグラフ。 図5：BC1cCAR抗原特異性の機能検証(A) CML細胞株（K562）は、BCMAまたはCS1のいずれかを安定して発現するように形質導入された。それぞれの抗原の発現範囲におけるヒストグラムの集団シフトが発現を示す。 図5：BC1cCAR抗原特異性の機能検証（B）BCMA-K562またはCS1-K562に対するBC1cCAR T細胞の短期（4時間-8時間）培養は、E：T投与量の増加と相関し、抗原特異的細胞毒性を示す。野生型K562細胞を陰性対照として使用した。 CS1-K562細胞に対するBC1cCARとの有効性を比較するために、CS1シングルCAR（赤いバー）が作製された。 図5：BC1cCAR抗原特異性の機能検証（C）BCMA-K562細胞とCS1-K562細胞の1：1混合物で実施した長期培養（48時間）。 BC1cCAR、CS1-CAR、BCMA-CAR、およびコントロールT細胞が、各処理ウェルに5：1のE：T比で加えられた。 BCMAまたはCS1細胞の残存集団（％ゲート）を示すヒストグラムプロットは、治療条件ごとに示され、赤い線はT細胞または標的腫瘍集団の境界を示す。 図6：長期連続殺傷アッセイと腫瘍の再添加（A）外因性サイトカインなしで168時間にわたってアッセイを実施し、BCMA+CS1+ MM1S細胞と混合したCAR細胞またはコントロール細胞の1：1 E：T比を使用して初期培養を実施した。 48時間後、少量の取集したサンプルについてのフローサイトメトリー分析を行い、MM1S細胞を各処理ウェルに再び加えた。 168時間の時点まで繰り返した。 図6：長期連続殺傷アッセイと腫瘍の再添加（B）48時間後のT細胞の増殖と応答。フローサイトメトリー解析の日に画像を撮影し、細胞を抗BCMA、抗CS1、および抗CD3抗体のMM1S細胞（丸で囲んだ、青）で染色した。 図6：長期連続殺傷アッセイと腫瘍の再添加（C）同様の画像撮影とFACS分析が108時間の時点で実行された。 図7：BC1cCAR T細胞は、in vivoで抗白血病効果を示す。（A）マウスあたり1.0×106個のルシフェラーゼ+細胞の注射により作製されたMM1Sモデル腫瘍。 BC1cCAR T細胞（右）またはコントロールT細胞（左）、そしてIVIS画像撮影で処理したマウス。 図7：BC1cCAR T細胞は、in vivoで抗白血病効果を示す。（B）コントロールT細胞での処置マウス（黒）と比較し、BC1cCAR T細胞での処置マウス（赤）で測定した平均光強度。 図7：BC1cCAR T細胞は、in vivoで抗白血病効果を示す。（C）BC1cCAR（赤）およびコントロール（黒）グループの生存結果。 図8：BC1cCAR T細胞は、混合抗原異種マウスモデルで細胞傷害効果の改善を示す。（A）BCMAとCS1を発現するK562細胞を4：1、 BCMA：CS1 K562細胞の比率で注入したマウスモデル（各グループでn = 5）。マウスをBC1cCAR T細胞、コントロールT細胞、またはBCMA固有のCARで処置した。腫瘍量はIVISで視覚化され、すべてのグループの蛍光強度を関数としてプロットされた（右）。 図8：BC1cCAR T細胞は、混合抗原異種マウスモデルで細胞傷害効果の改善を示す。（B）コントロールでの処置（黒）、BCMA-CARでの処置（青）、およびBC1cCAR（赤）での処置マウスでの生存結果。 図9：BC1cCAR T細胞の持続性の改善と個別の抗原モデルにおける腫瘍抑制の維持（A）BCMA-K562またはCS1-K562腫瘍細胞のいずれかを注射したマウス（グループあたりn = 5）の全血サンプルを屠殺時に採取した。 BCMAまたはCS1陽性ピークのヒストグラム集団は、腫瘍の存在を示す。 図9：BC1cCAR T細胞の持続性の改善と個別の抗原モデルにおける腫瘍抑制の維持（B）屠殺したマウス全体の全血および肝臓サンプルの集合組織分析が要約されている。マウス腫瘍細胞数は、FACSによってサンプルごとに収集された250000個の細胞あたりの抗原陽性細胞が定められ、治療グループごとのすべてのマウスで平均化された。 図9：BC1cCAR T細胞の持続性の改善と個別の抗原モデルにおける腫瘍抑制の維持（C）屠殺時に全血および肝臓組織のT細胞持続性についても、CD3の発現により分析し、すべての屠殺マウスを用い要約した（右）。 図10A：BCMA-K562またはCS1-K562を別々に注射したマウスにおける全血の分析屠殺の時点（さまざま）で、マウスの全血を回収し、CD3、CD45、BCMA、およびCS1に対する抗体で標識した。腫瘍の存在を視覚化するためにヒストグラムが作成され、25万イベントにわたるカウントが平均化されて、グラフでの要約が作成された。一部のマウスは屠殺時前に死亡し、サンプルの回収に使用できなかった。 図10B：BCMA-K562またはCS1-K562を別々に注射したマウスにおけるマウスの肝臓での分析屠殺の時点（さまざま）で、マウスの肝臓サンプルを回収し、CD3、CD45、BCMA、およびCS1に対する抗体で標識した。腫瘍の存在を視覚化するためにヒストグラムが作成され、25万イベントにわたるカウントが平均化されて、グラフによる要約が作成された。一部のマウスは屠殺前に死亡し、サンプルの回収に使用できなかった。 図11A. IL-15 / IL-5sushiエンハンサーコンストラクトによるcCAR-Tの模式図。コンストラクトは、P2AおよびT2Aペプチドそれぞれによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットおよびIL-15 / IL-15sushiの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、BCMAおよび、またはCS1を発現する標的に結合し、そしてIL-15 / IL-15sushiエンハンサー融合体を分泌する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインは、BCMA CARセグメント上の4-1BBまたはCD28およびCS1 CARセグメント上のCD28または4-1BBを含み得るが、これらに限定されない。コンストラクトのペプチド自己切断ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sush、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、IL-21、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はまた、CAR T / NK細胞の持続性を高め、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。 図11B. CAR T細胞の発現。バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）とCD269-A7D-hu63-IL15 / IL-15sushi（右）のいずれかを形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けをした。 CAR T細胞は緑色の点（丸で囲まれた）で表される。 図11C. CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、共培養アッセイでBCMA（左）またはCS1（右）表面抗原のいずれかを合成的に発現するK562腫瘍細胞株を特異的に溶解する。2：1または5：1のエフェクター対標的比で48時間共培養実験を行い、抗ヒトCS1（CD319）およびCD3のフローサイトメトリーにより直接分析した。 図11D. CD269-A7D-CS1-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、MM.1S腫瘍細胞株（骨髄腫細胞株）に対してin vivoで強力な抗腫瘍効果を示す。 NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、4.0×106個のルシフェラーゼ発現MM.1S細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の8日後に、マウスに1コース15 x 106個のCD269-A7D-CS1-IL15 / IL15sushi CAR TまたはベクターコントロールT細胞のいずれかの静脈内注射を開始した。 8日目（T細胞注射の前）および12日目（T細胞注射の72時間後）に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。 図11E. CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi NK細胞は機能的なIL15を発現する。 NK-92細胞株は、CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CARを含むレンチウイルスベクターで形質導入された。 （A）F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選択するために、BD FACS Ariaで細胞を選別した。 （B）CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで1 mLあたり0.5 x 10e6細胞数、総量1 mLで培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの1つのウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれていたが、もう1つのウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）、細胞をカウントし（B）、容量を増加させて約0.5 x 10e6 cells / mLの細胞密度にした。このプロセスは、4、6、8日目に繰り返された。 図11F. 選別されたCD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi NK細胞と野生型コントロールNK-92細胞は、別々のウェルで72時間培養された。上清を回収し、IL-15抗体でプレコートされた96ウェルプレートでELISAを行った。製造元（Boster）の指示に従って、プレートリーダーで得られた比色分析の結果を、ヒトIL-15で作成された標準曲線（A）と比較して、上清中のIL-15濃度を決定した（B）。 図12：CD123b-CD33b cCARの遺伝子構造と機能（A）CD123-CD33cCARの表記。 図12：CD123b-CD33b cCARの遺伝子構造と機能（B）CD123b-CD33b cCAR T細胞は、患者ドナーT細胞へCD123b-CD33b cCAR遺伝子コンストラクトを持つウイルス形質導入によって作製される。翻訳されたCD123およびCD33 CARタンパク質は、CAR T細胞の表面に発現し、白血病細胞の表面のCD123およびCD33標的タンパク質を認識して結合する。 CD123b-CD33b cCAR T細胞の薬理効果とメカニズムは、CD123b-CD33b cCARの抗原認識により媒介され、コンストラクト中に、「第2世代」CARを作製するための、CD28または4-1BBの共活性化ドメインの挿入によりCD3zeta / Zap70標準細胞傷害性T細胞活性がさらに増強される。 図13：CD123b-CD33b cCARの形質導入効率フローサイトメトリーを使用して、形質導入後のT細胞表面上のCD123b-CD33b cCARの発現レベルを決定した。 図14：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、MOLM13およびU937腫瘍細胞株の標的溶解を示す。（A）2：1および5：1 E：T比のMOLM13（AML細胞株）腫瘍標的細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞へのフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は囲まれている。 図14：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、MOLM13およびU937腫瘍細胞株の標的溶解を示す。（B）2：1および5：1 E：T比のU937腫瘍標的細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞へのフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は線で囲まれている。 図14：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、MOLM13およびU937腫瘍細胞株の標的溶解を示す。（C）MOLM13腫瘍細胞（CD123 + CD33 +）およびU937細胞（CD123-CD33 +）のみをマーカー用に染色、および両方のE：T比での溶解率の要約。 図14：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、MOLM13およびU937腫瘍細胞株の標的溶解を示す。（D）HL60（CD123dimCD33 +）およびKG1a（CD123dimCD33 +）細胞で実施した用量依存的の培養は、0.25：1から10：1の範囲でのE：T比で、cCARで高い殺傷効率を示した。 図15：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、原発性患者の腫瘍細胞の標的溶解を示す。（A）2：1および5：1 E：T比でのPT1腫瘍標的細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞のフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は線で囲まれている。 図15：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、原発性患者の腫瘍細胞の標的溶解を示す。（B）2：1および5：1 E：T比でのPT2腫瘍標的細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞のフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は線で囲まれている。 図15：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、原発性患者の腫瘍細胞の標的溶解を示す。（C）2：1および5：1 E：T比でのPT3腫瘍標的細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞のフローサイトメトリー分析。標的細胞集団（CD123 + CD34 +）は線で囲まれており、CD38の発現によりさらに分類され、LSC（CD123 + CD34 + CD38-）の排除を示す。 図15：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、原発性患者の腫瘍細胞の標的溶解を示す。（D）2：1および5：1 E：T比でのPT4腫瘍標的細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞のフローサイトメトリー分析。標的細胞集団（CD33 +バルク疾患）は線で囲まれている。 図15：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、原発性患者の腫瘍細胞の標的溶解を示す。（E）2：1および5：1の両方のE：T比での4つの患者サンプルすべてに対するCD123b-CD33b cCAR T細胞の溶解率の要約。 図16：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、CD33またはCD123抗原のいずれかを発現している細胞を高い効力でアブレートする。（A）2：1のE：T比での野生型（WT）Jurkat腫瘍細胞およびCD123（Jurkatxp123）発現Jurkat細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞のフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は線で囲まれている。 図16：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、CD33またはCD123抗原のいずれかを発現している細胞を高い効力でアブレートする。（B）2：1のE：T比での野生型（WT）Jurkat腫瘍細胞およびCD33（Jurkatxp33）発現Jurkat細胞に対するコントロールT細胞およびCD123b-CD33b cCAR T細胞のフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は線で囲まれている。 図16：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、CD33またはCD123抗原のいずれかを発現している細胞を高い効力でアブレートする。（C）2：1 E：T比でのWT Jurkat細胞、Jurkat xp33、およびJurkat xp123細胞に対するCD123b-CD33b cCAR T細胞の溶解率の要約。 図17：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびU937細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（A）3、6、9、および13日目のルシフェラーゼ発現MOLM13細胞での腫瘍負荷の視覚化が可能であるIVISイメージング（各グループでn = 8）。経時的なCD123b-CD33b cCAR T細胞とコントロールT細胞で処置したマウスの腫瘍量のグラフ表示での比較。腫瘍の減少は、6日目から統計的に有意である。 Kaplan-Meier生存分析曲線は、生存回帰を表す（Mantel-Coxログランク検定p = 0.0082）。 図17：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびU937細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（B）3、6、9、および13日目のルシフェラーゼ発現U937細胞のIVISイメージングにより、腫瘍量を視覚化できる（各グループでn = 8）。経時的なCD123b-CD33b cCAR T細胞とコントロールT細胞で処置したマウスの腫瘍量のグラフ表示での比較。腫瘍の減少は、6日目から統計的に有意である。 Kaplan-Meier生存分析曲線は、生存結果を表す（Mantel-Coxログランク検定p = 0.0082）。 図17：CD123b-CD33b cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびU937細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（C）MOLM13およびU937マウス腫瘍モデルの末梢血。フローサイトメトリーにより、CD45 + CD3 + T細胞およびCD45 + CD33 +腫瘍細胞を視覚化した。 図18：CAMPATH処置による、注入されたCD123b-CD33b cCAR T細胞の枯渇。（A）NGSマウスへのCD19b-CD123 cCAR T細胞注入後のCAMPATH投与の効果を評価するための実験スキーム。 10x106 個のCD19b-CD123 cCAR T細胞を致死量以下の照射マウスに静脈内注射し（n = 6）、約24時間後、CAMPATH（0.1mg / kg）またはPBSを腹腔内注射した（それぞれn = 3、コントロールグループのn = 2である6時間目を除く）。 6および24時間後、末梢血を採取し、CAR T細胞の持続性を判定した。 図18：CAMPATH処置による、注入されたCD123b-CD33b cCAR T細胞の枯渇。 （B）CAMPATH治療の有無による、6時間後の末梢血での注入されたCD19b-CD123 cCART細胞の持続性の概要。 CD19b-CD123 cCART細胞の存在は、フローサイトメトリーにより検出された。 図18：CAMPATH処置による、注入されたCD123b-CD33b cCAR T細胞の枯渇。（C）CAMPATH処置の有無による、24時間後の末梢血における、注入されたCD19b-CD123 cCART細胞の持続性の概要。 CD19b-CD123 cCAR T細胞の存在は、フローサイトメトリーにより検出された。 図19：CD19b-CD123 cCARの組織構造cCAR-Tコンストラクト（CD19b-CD123cCAR）の模式図。コンストラクトは、P2Aペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、CD19bCARおよびCD123 CARはそれぞれCD19およびCD123抗原を発現する標的に結合する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、CD19b CARセグメント上の4-1BBおよびCD123 CAR上のCD28領域が含まれ得るが、これらに限定されない。ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）、共刺激ドメイン（CD28または4-1BB）および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ（CD3）。 図20：CD19b-CD123 cCARの形質導入効率活性化されたT細胞に、レトロネクチン被覆プレート上でCD19b-CD123 cCARを発現する解凍されたレンチウイルスを用いて形質導入した。形質導入後、細胞は洗浄され、増殖させ、 CARの発現効率を確認するために、フロー分析（F（Ab ’）2ラベリング）が行われた。 図21：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、CD19 +およびCD123 +白血病/リンパ腫細胞株の特異的かつ効果的な溶解を示す。（A）16および48時間で、5：1 E：T比での人工的に作製されたCD19 + K562細胞およびコントロールK562細胞に対するコントロールT細胞およびCD19b-CD123 cCAR T細胞とのフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は赤で描かれている。非形質導入CD19-細胞は濃い黄色で描かれている。 図21：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、CD19 +およびCD123 +白血病/リンパ腫細胞株の特異的かつ効果的な溶解を示す。（B）16時間で5：1のE：T比で、人工的に作製されたCD19 + K562細胞およびコントロールK562細胞に対するコントロールT細胞およびCD19b-CD123 cCAR T細胞とのフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は赤で描かれている。非形質導入CD123- Jurkat細胞は紫色で描かれている。 図21：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、CD19 +およびCD123 +白血病/リンパ腫細胞株の特異的かつ効果的な溶解を示す。（C）5：1 E：T比、16および48時間でのKG1a腫瘍細胞（CD123 + CD19-）およびSP53細胞（CD123-CD19 +）のフローサイトメトリー分析。 図21：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、CD19 +およびCD123 +白血病/リンパ腫細胞株の特異的かつ効果的な溶解を示す。（D）腫瘍細胞の溶解率の要約グラフ。 図22：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、原発性患者の細胞の標的溶解を示す。（A）PT1およびPT2腫瘍細胞の表現型のフローサイトメトリー分析。 図22：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、原発性患者の細胞の標的溶解を示す。（B）PT1腫瘍標的細胞に対し、24時間で5：1のE：T比でのコントロールT細胞およびCD19b-CD123 cCAR T細胞とのフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は赤色で描かれている。 図22：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、原発性患者の細胞の標的溶解を示す。（C）PT2腫瘍標的細胞に対し、24時間および48時間で、5：1 E：T比でのコントロールT細胞およびCD19b-CD123 cCAR T細胞とのフローサイトメトリー分析。標的細胞集団は赤色で描かれている。 図22：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、原発性患者の細胞の標的溶解を示す。（D）24時間および48時間で、5：1のE：T比での患者サンプルに対するCD19b-CD123 cCAR T細胞の溶解パーセントの要約。 図23：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびREH細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（A）3、6、8、および11日目のルシフェラーゼ発現MOLM13細胞での腫瘍負荷の視覚化が可能であるIVISイメージング (各グループのマウスで表示）。 図23：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびREH細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。腫瘍負荷の比較をグラフで表示。腫瘍負荷は背側と腹側の両方で測定した。腫瘍の減少は、6日目から統計的に有意である。 図23：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびREH細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（C）Kaplan-Meier生存分析曲線は、生存結果を示す（Mantel-Coxログランク検定p = 0.0031）。 図23：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびREH細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（D）16日目のルシフェラーゼ発現REH細胞での腫瘍負荷の視覚化が可能であるIVISイメージング（各グループでn = 5）。 図23：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびREH細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（E）CD19b-CD123 cCAR T細胞とコントロールT細胞で処置したマウスの経時的な腫瘍負荷の比較をグラフで表示。腫瘍の減少は統計的に有意である。腫瘍負荷は、背側および腹側で測定された。 図23：CD19b-CD123 cCAR T細胞は、2つのin vivo異種移植マウスモデルにおいて、MOLM13およびREH細胞株に対する著しい抗白血病効果を示す。（F）Kaplan-Meier生存分析曲線は生存結果を示す（Mantel-Coxログランク検定p = 0.0016）。 図24. P2Aによって結びついている図は、4-1BB、およびIL-21が単一のコンストラクト（IL-21を共発現するCAR）であるCARを示し、そしてそのTまたはNK細胞における発現。コンストラクトは、共刺激ドメイン4-1BBを有するCARの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。リンカーが開裂すると、CARとIL-21が分かれ、抗原を発現する標的に関与する。 CAR T細胞は、4-1BBまたはCD28だけでなく、4-1BBリガンド（4-1BBLまたはCD137L）またはIL-21を介した共刺激を受けた。CD3-zetaシグナル伝達ドメインは、このCAR-Tのアセンブリを完成させる。ＩＬ－２１のより良い分泌のために、ＩＬ－２１シグナルペプチドはＩＬ－２シグナルペプチドで置き換えられる。 H、CD8aヒンジ領域、TM、CD8a膜貫通ドメイン。 IL-21を使用したCARの例は、CD19-IL-21 CAR、BCMA-IL-21 CAR、CD4-IL-21 CARおよびCD45-IL-21 CARである。 図25.コンストラクト（IL-21アンカーを共発現するCAR）を説明するための概略図、およびTまたはNK細胞におけるその発現。IL-21アンカーを備えたCARは、P2A自己切断配列とリンクしている。 IL-21アンカー融合体は、IL-21に融合したIL-2シグナルペプチドで構成され、CD8ヒンジ領域とCD8膜貫通ドメインに結合している。 CARとIL-21融合体の組み合わせは、発現ベクター上でアセンブリされ、その発現はSFFVプロモーターによって駆動される。 ＩＬ－２１のより良好な分泌および細胞表面への固着のために、ＩＬ－２１シグナルペプチドはＩＬ－２シグナルペプチドに置き換わる。 IL-21アンカーを持つCARの例は、CD19-IL-21アンカーCAR、BCMA-IL-21アンカーCAR、CD4-IL-21アンカーCAR、およびCD45-IL-21アンカーCARである。 図26. P2Aによって結びついている図は、4-1BB、およびIL-18が単一のコンストラクト（IL-18を共発現するCAR）であるCARを示し、そしてそのTまたはNK細胞における発現。コンストラクトは、共刺激ドメイン4-1BBを有するCARの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。リンカーが開裂すると、CARとIL-18が分かれ、抗原を発現する標的に関与する。 CAR T細胞は、4-1BBまたはCD28だけでなく、4-1BBリガンド（4-1BBLまたはCD137L）またはIL-21を介した共刺激を受ける。 CD3-zetaシグナル伝達ドメインは、このCAR-Tのアセンブリを完成させる。 IL-18のより良い分泌のために、IL-21シグナルペプチドはIL-2シグナルペプチドで置き換えられる。 H、CD8aヒンジ領域、TM、CD8a膜貫通ドメイン。 CD3-zetaシグナル伝達ドメインは、このCAR-Tのアセンブリを完成させる。 IL-18を使用したCARの例は、CD19-IL-18 CAR、BCMA-IL-18 CAR、CD4-IL-18 CARおよびCD45-IL-18 CARである。 図27.コンストラクト（IL-18アンカーを共発現するCAR）を説明するための概略図、およびTまたはNK細胞におけるその発現。IL-18アンカーを備えたCARは、P2A自己開裂配列とリンクしている。IL-18アンカー融合体は、IL-18に融合したIL-2シグナルペプチドとCD8ヒンジ領域とCD8膜貫通ドメインにリンクされた構成である。CARとIL-18アンカー融合体の組み合わせは、CD3ゼータ鎖のない発現ベクター上でアセンブリされ、その発現はSFFVプロモーターによって駆動される。IL-18のより良い分泌のために、IL-18シグナルペプチドをIL-2シグナルペプチドに置き換えてから、細胞表面に固定する。IL-18アンカーを有するＣＡＲの例は、CD19-IL-18アンカーＣＡＲ、BCMA-IL-18アンカーＣＡＲ、CD4-IL-18アンカーＣＡＲおよびCD45-IL-18アンカーＣＡＲであり得る。 図28A. 異なるバージョンの抗BCMA CARまたはcCAR T細胞の発現。バフィーコート細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞にコントロールベクター（左上）またはさまざまなCD269 CARレンチウイルス上清を形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けした。 図28B. BCMA-CS1 cCAR T細胞の異なるバージョンの発現。バフィーコート細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞にコントロールベクター（左上）またはさまざまなCD269 cCARレンチウイルス上清を形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けをした。 図29A. CD269-A7D-CD19b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD19表面抗原（K-19）を合成的に発現しているK562腫瘍細胞株を特異的に溶解する。2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間共培養実験を実施し、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、K-19標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）、およびCD269-A7D-CD19b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 K-19細胞は丸で囲まれている。 図29B. CD269-A7D-CD19b CAR T細胞は、共培養アッセイでBCMA表面抗原（K-BCMA）を合成的に発現しているK562腫瘍細胞株を特異的に溶解する。2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間共培養実験を実施し、CD269およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、K-19標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）、およびCD269-A7D-CD19b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 K-BCMA細胞は丸で囲まれている。 図30A. BCMA-CS1 cCAR T細胞の異なるバージョンの発現。バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）または、様々なCD269 (BCMA) cCARレンチウイルス上清を形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けした。 図30B. BCMA-CS1 cCAR T細胞または強化されたBCMA CAR T細胞の異なるバージョンの発現。バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）または、様々なCD269 (BCMA) cCARレンチウイルス上清を形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けをした。 図30C. CD269-A7D-CD19b CAR T細胞は、共培養アッセイでBCMA表面抗原（K-BCMA）を合成的に発現しているK562腫瘍細胞株を特異的に溶解する。2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間共培養実験を実施し、CD269およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、K-BCMA標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）、およびCD269-A7D-CD19b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 K-BCMAセルは丸で囲まれている。 図30D. CD269-A7D-CD19b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD19表面抗原（K-19）を合成的に発現しているK562腫瘍細胞株を特異的に溶解する。2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間共培養実験を実施し、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、K-19標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）、およびCD269-A7D-CD19b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 K-19セルは丸で囲まれている。結果は左下のグラフにまとめられている。（N = 2） 図30E. CD269-A-7D-CD19b cCAR T細胞によるK562-BCMA（K-BCMA）およびK562-CD19（K-19）細胞の溶解の要約。 図30F. CD269-A7D cCAR T細胞は、共培養アッセイでMM1S腫瘍細胞株を特異的に溶解する。共培養実験は、エフェクターと標的の比率が5：1で行われた。 18時間後、CD269（BCMA）およびCMTMR（CellTracker）を用いたフローサイトメトリーで直接分析した。各アッセイは、MM1S標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（上部中央パネル）、CD269-A7D-41BBLと（中央下部）、CD269-A7D-C11Dと（右上）そして、CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T細胞と（右下）からなる。MM1S細胞は青い点で表されている。 （N = 2） 図30G. 異なるバージョンのCD269-CS1 cCARまたは強化されたCD269 CAR T細胞は、共培養アッセイでK562-BCMA腫瘍細胞株を特異的に溶解する。共培養実験は、エフェクター対標的比5：1で18時間行われ、CD269およびCD3でのフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、MM1S標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央上部パネル）、CD269-A7D-41BBLと（中央下）、CD269-A7D-C11Dと（BCMA抗原の2つの異なるエピトープを標的とするcCAR）（右上）およびCD269-A7D-CS1-hu63 CAR T細胞と（右下）からなる。 K-BCMAセルは緑色のドットで表されている。 （N = 2） 図30H. CD269-A7D-CS1-hu63 CAR T細胞は、共培養アッセイでK562-CS1腫瘍細胞株を特異的に溶解するが、CD269-A7D-C11D cCAR（CS1 CARなしでBCMA抗原の異なるエピトープを標的とするcCAR）は溶解しない。共培養実験は、エフェクター対標的比5：1で18時間行われ、CD269およびCD3でのフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、MM1Sターゲット細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）、CD269-A7D-C11Dと（右上）そしてCD269-A7D-CS1-hu63 CAR T細胞と（右下）からなる。 K-CS1細胞は濃い緑色の点で表されている。 （N = 2） 図30I. CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-C11D、およびCD269-CS1-hu63 CAR T細胞によるMM1S骨髄腫細胞の溶解の概要。 図30J. CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-C11D、およびCD269-CS1-hu63 CAR T細胞によるK-BCMA（BCMA発現K562）細胞の溶解の概要。 図30K.CD269-A7D-C11DおよびCD269-CS1-hu63 cCAR T細胞によるK-CS1（CS1発現K562）細胞の溶解の概要。 図31. CLL1-CD33b CAR T細胞の発現。バフィーコート細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター（左）またはCLL1-CD33b CAR（右）レンチウイルス上清を形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けをした。 図32A. CLL1-CD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでREH腫瘍細胞株を溶解しない。標的細胞は、T細胞と区別するためにCFSE色素で前標識されている。共培養実験は、エフェクターと標的の比率で2：1または5：1で行われた。 18時間後、CFSEおよびCD3でのフローサイトメトリーで直接分析した。各アッセイは、REH標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）、そしてCLL1-CD33b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 REH細胞は紫色のドットで表されている。注：REH細胞はCLL1（CLL-1）またはCD33を発現していない。 図32B. CLL1-CD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでCCRF-CEM腫瘍細胞株を溶解しない。標的細胞は、T細胞と区別するためにCFSE色素で前標識されている。 2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間、共培養実験を実施し、CFSEおよびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、CCRF-CEM標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）そしてCLL1-CD33b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 CCRF-CEM細胞はオレンジ色のドットで表されている。注：CCRF-CEM細胞はCLL1またはCD33抗原を発現していない。 図32C. CLL1-CD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでCLL-1表面抗原を合成的に発現しているJurkat 腫瘍細胞株を特異的に溶解する。標的細胞は、T細胞と区別するためにCFSE色素で前標識されている。 2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間共培養実験を行い、CFSEおよびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、Jurkat-CLL1（J-CLL）標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）およびCLL1-CD33b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 Jurkat-CLL細胞は青い点で表されている。 図32D. CLL1-CD33b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD33表面抗原を合成的に発現しているJurkat腫瘍細胞株を特異的に溶解する。標的細胞は、T細胞と区別するためにCFSE色素で前標識されている。 2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間共培養実験を行い、CFSEおよびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、Jurkat-CD33（J-33xp）標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）およびCLL1-CD33b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 Jurkat-CD33（J-33xp）細胞は水色のドットで表されている。 図32E. CLL1-CD33b cCAR T細胞は、共培養アッセイでHL60腫瘍細胞株を効率的に溶解する。標的細胞は、T細胞と区別するためにCFSE色素で前標識されている。 2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で18時間共培養実験を行い、CFSEおよびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、HL60標的細胞のみ（左）、コントロールT細胞と（中央パネル）およびCLL1-CD33b CAR T細胞と（右パネル）からなる。 HL60細胞は緑色のドットで表されている。 図32F. CLL1-CD33 cCAR（CLL-1-CD33 cCAR）による、異なるAML細胞株とCLL-1またはCD33を発現するJurkat細胞を使用した共培養アッセイで得られる溶解の要約。 図32G - CLL1-CD33b compound CAR T細胞はHL60標的腫瘍細胞をアブレートする。2：1および5：1のE：T比で共培養を一晩実施した。CLL-1およびCD33に対してほぼ二重陽性である標的HL60細胞は、CFSE膜色素で前標識された。翌日、CD3、CLL-1、およびCD33抗体を使用して、フローサイトメトリー解析（FACS）を実施した。 図32H - CLL1-CD33b compound CAR T細胞はU937標的腫瘍細胞をアブレートする。2：1および5：1のE：T比で共培養を一晩実施した。CLL-1およびCD33に対してほぼ二重陽性である標的U937細胞は、CFSE膜色素で前標識された。翌日、CD3、CLL-1、およびCD33抗体を使用して、フローサイトメトリー解析（FACS）を実施した。 図32I - CLL1-CD33b compound CAR T細胞は、ネガティブコントロールであるCCRF-CEM細胞を最小限のターゲートとする。2：1および5：1のE：T比で共培養を一晩実施した。 主にCLL-1およびCD33に対して陰性であるCCRF-CEM細胞は、CFSE膜色素で事前に標識された。翌日、CD3、CLL-1、およびCD33抗体を使用して、フローサイトメトリー解析（FACS）を実施した。 図32J -標的細胞株に対するCLL1-CD33b compound CAR T細胞のin vitroでの概要すべての共培養はオーバーナイトで行われ、標的細胞はCFSE膜色素で事前標識されていた。翌日、すべてのサンプルに対してCD3、CLL-1、およびCD33抗体を使用して、フローサイトメトリー解析（FACS）を実施した。 HL60標的細胞を使用した用量依存的な共培養は、同一の共培養条件下で、段階的にE：T比を増加するスキームで実施された。 図32K -混合細胞共培養での単一CAR T細胞に対し、CLL1-CD33b compound CARによる抗原の減少。CD33発現およびCLL-1発現Jurkat細胞は、野生型Jurkat細胞へのCD33またはCLL-1発現cDNAの安定したトランスフェクションにより作製された。次いで、CD33またはCLL-1のいずれかを発現する均一な安定細胞株を確立するため、発現Jurkat細胞を選別した。混合細胞共培養では、CD33を発現するJurkat細胞（Jurkat-CD33）とCLL-1を発現するJurkat細胞（Jurkat-CLL1）を約1：1の比率で混合し、合計で200,000個の細胞を培養した。次に、エフェクター細胞を1：2の比率で加え（エフェクター：標的）、一晩の培養で合計100,000個のT細胞を加えた。翌日、すべてのサンプルに対してCD3、CLL-1、およびCD33抗体を使用して、フローサイトメトリー解析（FACS）を実施した。さまざまなCARでの処理下での抗原の減少を示すヒストグラムが示され、バー（左）はT細胞集団と抗原を発現するJurkat細胞（右）を示している。 図32L -混合細胞共培養における単一CAR T細胞に対し、CLL1-CD33b compound CARによる抗原の減少の概要。前図のヒストグラムデータを要約したグラフ。全体として、CLL1-CD33b compound CAR T細胞は、CD33およびCLL-1発現Jurkat細胞の両方に対して、両方の細胞タイプに対して85％を超えるアブレーション率での強力かつ標的細胞毒性を示す。さらに、CLL1-CD33b compound CAR T細胞は、それぞれの抗原集団に対して、単一の抗CD33b CAR Tまたは単一の抗CLL-1 CAR T細胞と比較して、優れた細胞毒性を示すことができた。compound CARは、CD33 CAR TよりもCD33に対し60％、CLL-1 CAR T細胞よりもCLL-1に対し40％程優れて、これらを標的にすることができた。 図33A. P2Aによって結びついている図は、CD19 CARおよびIL-21が単一コンストラクト（IL-21を共発現するCd19 CAR）であることを示し、そしてそのTまたはNK細胞での発現。 図33B. CD19b-IL-21 CAR T細胞およびCD19-IL-21アンカーの発現。バフィーコート細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター（左）、CD19b-IL-21、またはCD19b-IL21-アンカーCAR（右）のレンチウイルス上清を形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けをした。 図34.コンストラクト（IL-21アンカーを共発現するCD19 CAR）を説明するための概略図およびTまたはNK細胞におけるその発現。IL-21アンカーを備えたCD19 CARは、P2A自己開裂配列と連結している。 IL-21アンカー融合体は、IL-21に融合したIL-2シグナルペプチドで構成され、CD8ヒンジ領域とCD8膜貫通ドメインに結合している。 CD19 CARとIL-21融合体の組み合わせは、発現ベクター上でアセンブリされ、その発現はSFFVプロモーターによって駆動される。IL-21のより良好な分泌および細胞表面への固着のために、IL-21シグナルペプチドはIL-2シグナルペプチドに置き換われる。 図35. P2Aにより結びついている図は、BCMAおよびIL-18が単一コンストラクト（IL-18を共発現するBCMA CAR）であることを示し、そしてそのTまたはNK細胞での発現。コンストラクトは、共刺激ドメイン4-1BBを持つCARの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。リンカーが開裂すると、BCMA CARとIL-18は分かれ、抗原を発現する標的に関与する。 CAR T細胞は、4-1BBまたはCD28だけでなく、4-1BBリガンド（4-1BBLまたはCD137L）またはIL-18を通じて共刺激を受ける。 CD3-zetaシグナル伝達ドメインは、このCAR-Tのアセンブリを完成させる。IL-21のより良い分泌のために、IL-21シグナルペプチドはIL-2シグナルペプチドで置き換えられる。 H、CD8aヒンジ領域、TM、CD8a膜貫通ドメイン。 図36. BCMAコンストラクト（IL-18アンカーを共発現するCAR）を説明するための概略図、およびTまたはNK細胞におけるその発現。IL-18アンカーを備えたCARは、P2A自己開裂配列と連結している。 IL-18アンカー融合体は、IL-18に融合され、ＣＤ８ヒンジ領域およびＣＤ８膜貫通ドメインに連結されたIL-2シグナルペプチドからなる。 BCMA CARとIL-18アンカー融合体の組み合わせは、発現ベクター上でアセンブリされ、その発現はSFFVプロモーターによって駆動される。 IL-18のより良好な分泌および細胞表面への固着のために、IL-18シグナルペプチドはIL-2シグナルペプチドで置き換えられる。 図37. cCARコンストラクト（BCMA-CD38 cCAR）の概略図。このコンストラクトは、P2A開裂ペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。 P2Aリンカーが開裂されると、cCARは分かれ、BCMAおよび/またはCD38を発現する標的に関与する。 CARの各ユニットは、抗原に対するscFv、ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）、共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ鎖を保有する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、BCMA CARセグメント上の4-1BBおよびCD38CAR上のCD28領域が含まれるが、これらに限定されない。 図38. cCARコンストラクト（BCM1A-BCMA2 cCAR）の概略図。このコンストラクトは、P2A開裂ペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。 P2Aリンカーが開裂されると、cCARは分かれ、BCMA1（BCMA1エピトープの1つ）および/またはBMCA2（別のBCMA抗原エピトープ）を発現する標的に関与する。 CARの各ユニットは、抗原に対するscFv、ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）、共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ鎖を保有する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインには、BCMA1 CARセグメント上の4-1BBおよびBCMA2 CAR上のCD28領域が含まれるが、これらに限定されない。各BCMA CARは、その抗原エピトープを標的とする。compound CAR、BCMA1-BCMA2は、2つの異なるBCMAエピトープを認識できる。 図39A. IL-15 / IL15sushiエンハンサーコンストラクトを持つcCAR-Tの模式図。コンストラクトは、P2AおよびT2Aペプチドそれぞれによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットおよびIL-15 / IL-15sushiの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、CLL-1および/またはCD33を発現する標的に関与し、そしてIL-15 / IL-15sushiエンハンサー融合体を分泌する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインは、CLL-1 CARセグメント上の4-1BBまたはCD28およびCD33B CARセグメント上のCD28または4-1BB領域を含み得るが、これらに限定されない。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。 図39B. CLL1-CD33b-IL15 / IL-15sushi CAR T細胞の発現。ヒト末梢血バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）、CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR（右）のレンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 4日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ヤギ抗ヒトF（Ab ’）2およびマウス抗ヒトCD3抗体でフローサイトメトリー用にラベル付けをした。 CAR T細胞は、緑色の点（丸で囲まれた）として表される。 図39C. CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、共培養アッセイでCLL-1またはCD33表面抗原を合成的に発現しているREH腫瘍細胞株を特異的に溶解する。各アッセイは、REH-CLLxp（左グラフ）またはREH-CD33xpのいずれかの標的細胞（右グラフ）とコントロールT細胞またはCLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞を2：1および5：1のエフェクター：標的細胞比で共培養された。共培養実験を24時間行い、抗ヒトCD3およびCLL-1またはCD33でのフローサイトメトリーにより直接分析した。 図40A. CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、MOLM13腫瘍細胞株に対してin vivoで強力な抗腫瘍効果を示す。NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現MOLM13細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の5日後に、CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR TまたはベクターコントロールT細胞のいずれかを15 x 106個の1コースでマウスに静脈内注射を開始した。 4日目（T細胞注射の前）、8および12日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。背面図。 図40B. CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、MOLM13腫瘍細胞株に対してin vivoで強力な抗腫瘍効果を示す。NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現MOLM13細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の5日後に、CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR TまたはベクターコントロールT細胞のいずれかを15 x 106個の1コースでマウスに静脈内注射を開始した。 4日目（T細胞注射の前）、8および12日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。腹側図。 図40C. （A）図40Aのマウスの屠殺時に、末梢血を採取し、マウス抗ヒトCD45、CD3、およびCD33で標識し、フローサイトメトリーにかけた。移植されたヒト細胞はCD45によってゲートされ、T細胞（緑の点）とMOLM13細胞（青の点）の集団について分析した。 2匹のコントロールマウスの結果が左側にあり、CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞で処置した2匹のマウスの結果が右側にある。 （B）各マウスの末梢血からの血漿を用いてELISAを行い、分泌されたヒトIL-15融合体の量を定量化した。コントロールマウス、＃1-2。ウェルはデュプリケートである。 図40D. CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi NK細胞は機能的なIL-15 / IL-15融合体を発現する。 NK-92細胞株には、CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CARを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。 （A）F（Ab ’）2表現型が陽性のNK細胞を選択するために、BD FACS Ariaで細胞を選別した。 （B）CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞、および野生型NK-92細胞は、24ウェルプレートで1 mLあたり0.5 x 10e6の細胞数、総量1 mLで培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの1つのウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれていたが、もう1つのウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）、細胞をカウントし（B）、容量を増加させて約0.5 x 10e6 cells / mLの細胞密度にした。このプロセスは、4、6、8日目に繰り返された。 図40E. 選別されたCLL1-CD33b-IL15/IL15sushi NK細胞と野生型コントロールNK-92細胞は、別々のウェルで72時間培養された。上清を回収し、IL-15抗体でプレコートされた96ウェルプレートでELISAを行った。製造元（Boster）の指示に従って、プレートリーダーで得られた比色分析の結果を、ヒトIL-15で作成された標準曲線（A）と比較して、上清中のIL-15濃度を決定した（B）。 図41A. CD20cCD19b CAR T細胞の発現。バフィーコート細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター（左）、CD20cCD19bまたはCD20hCD19b CARの（右）レンチウイルス上清を形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けをした。 図41B. CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CAR T細胞は、共培養アッセイでK562腫瘍細胞株を溶解しない。共培養実験は、エフェクターと標的の比率2：1または5：1の6時間で行われ、CD3およびCD45でのフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、K652標的細胞のみ（右）、コントロールT細胞と（左）、そしてCD20cCD19bあるいはCD20hCD19b CAR T細胞と（中央パネル）からでなる。ターゲット細胞は青い点で表されている。 （N = 2） 図41C. cCAR T細胞は、共培養アッセイでCD19を合成的に発現するK562腫瘍細胞株を溶解する。2：1または5：1のエフェクター対標的比で24時間での共培養実験を行い、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、K562-CD19xpターゲット細胞（CD19発現のK562、K-19）のみ（右側）、コントロールT細胞と（左パネル）、そしてCD20cCD19bまたはCD20hCD19b CAR T細胞と（中央パネル）からなる。ターゲット細胞は緑色のドットで表される。 図41D. cCAR T細胞は、共培養アッセイでCD20を合成的に発現するK562腫瘍細胞株を溶解する。2：1または5：1のエフェクター対標的比で24時間での共培養実験を行い、CD20およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、K562-CD20xpターゲット細胞のみ（右側）、コントロールT細胞と（左パネル）、そしてCD20cCD19bあるいはCD20hCD19b CAR T細胞と（中央パネル）からなる。ターゲット細胞は紫色のドットで表される。 図41E. cCAR T細胞は、共培養アッセイでCD19を発現するREH腫瘍細胞株を溶解する。2：1または5：1のエフェクター対標的比で24時間での共培養実験を行い、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、REHターゲット細胞のみ（右側）、コントロールT細胞と（左パネル）、そしてCD20cCD19bあるいはCD20hCD19b CAR T細胞と（中央パネル）からなる。ターゲット細胞はオレンジ色のドットで表される。 図41F. cCAR T細胞は、共培養アッセイでCD19およびCD20の両方を発現するSP53腫瘍細胞株を完全に溶解する。2：1または5：1のエフェクター対標的比で24時間での共培養実験を行い、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーにより直接分析した。各アッセイは、SP53ターゲット細胞のみ（右側）、コントロールT細胞と（左パネル）、そしてCD20cCD19bあるいはCD20hCD19b CAR T細胞と（中央パネル）からなる。ターゲット細胞は青緑色のドットで表される。 （N = 2） 図41G. 共培養の結果の要約。 図42A. CD20hCD19b CAR T細胞は、CD19抗原を発現するREH腫瘍細胞株に対してin vivoで強力な抗腫瘍効果を示す。NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現REH細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の6日後に、CD20hCD19b CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞のいずれかを10 x 106個の1コースでマウスへ静脈内注射を開始した。 5、9および12日目にに、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。背面図。 図42B. CD20hCD19b CAR T細胞は、CD19抗原を発現するREH腫瘍細胞株に対してin vivoで強力な抗腫瘍効果を示す。NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現REH細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の6日後に、CD20hCD19b CAR T細胞またはベクターコントロールT細胞のいずれかを10 x 106個の1コースでマウスへ静脈内注射を開始した。 5、9および12日目にに、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。腹側図。 図43A. IL-15 / IL15sushiエンハンサーコンストラクトを持つcCAR-Tの模式図。コンストラクトは、P2AおよびT2Aペプチドそれぞれによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットおよびIL-15 / IL-15sushiの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、CD20h-CD19b のcCARは別れ、CD20および/またはCD19を発現する標的に関与し、そしてIL-15 / IL-15sushiエンハンサー融合体を分泌する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインは、CD20h CARセグメント上の4-1BBまたはCD28およびCD19b CARセグメント上のCD28または4-1BB領域を含み得るが、これらに限定されない。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。 図43B. CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR T細胞の発現。ヒト末梢血バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）、CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR（右）のレンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 4日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ヤギ抗ヒトF（Ab ’）2およびマウス抗ヒトCD3抗体でフローサイトメトリー用にラベル付けをした。 CAR T細胞は、緑色の点（丸で囲まれた）として表される。 図43C. CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR T細胞は、共培養アッセイでCD20表面抗原を合成的に発現しているU937 腫瘍細胞株 (A) とCD19表面抗原を発現しているREH 腫瘍細胞株(A)を特異的に溶解する。2：1または5：1のエフェクター対ターゲット比で48時間共培養実験を行い、抗ヒトCD20およびCD19でのフローサイトメトリーにより直接分析した。 図44A. CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR T細胞は、REH腫瘍細胞株に対してin vivoで強力な抗腫瘍効果を示す。NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現REH細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の5日後に、CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR TまたはベクターコントロールT細胞のいずれかを15 x 106個の1コースでマウスに静脈内注射を開始した。 4日目（T細胞注射の前）、8日目(T細胞注入の後時間後)、12日目および16日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。背面図。 図44B. CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR T細胞は、REH腫瘍細胞株に対してin vivoで強力な抗腫瘍効果を示す。NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現REH細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した。腫瘍細胞の注射の5日後に、CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR TまたはベクターコントロールT細胞のいずれかを15 x 106個の1コースでマウスに静脈内注射を開始した。 4日目（T細胞注射の前）、8日目(T細胞注入の後時間後)、12日目および16日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。腹側図。 図44C. （A）図3のマウスの屠殺時に、末梢血を採取し、マウス抗ヒトCD45、CD3、およびCD19で標識し、フローサイトメトリーにかけた。移植されたヒト細胞はCD45によってゲートされ、T細胞（緑の点）とREH細胞（青の点）の集団について分析した。 2匹のコントロールマウスの結果が左側にあり、CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR T細胞で処置した2匹のマウスの結果が右側にある。 （B）各マウスの末梢血からの血漿を用いてELISAを行い、分泌されたヒトIL-15融合体の量を定量化した。コントロールマウス、＃1-2。 図44D. CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi NK細胞は機能的なIL15を発現する。 NK-92細胞株は、CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi-IL15/IL15sushi CARを含むレンチウイルスベクターで形質導入された。 （A）F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選択するために、BD FACS Ariaで細胞を選別した。 （B）CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi-IL15/IL15sushi CAR NK細胞および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで1 mLあたり0.5 x 10e6細胞数、総量1 mLで培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの1つのウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれていたが、もう1つのウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）、細胞をカウントし（B）、容量を増加させて約0.5 x 10e6 cells / mLの細胞密度にした。このプロセスは、4、6、8日目に繰り返された。 図44E. 選別されたCD20h-CD19b-IL15/IL15sushi NK細胞と野生型コントロールNK-92細胞は、別々のウェルで72時間培養された。上清を回収し、IL-15抗体でプレコートされた96ウェルプレートでELISAを行った。製造元（Boster）の指示に従って、プレートリーダーで得られた比色分析の結果を、ヒトIL-15で作成された標準曲線（A）と比較して、上清中のIL-15濃度を決定した（B）。 図45A. 発現は、コントロールT細胞と比較しFACSにより測定された。上図はCD19b-IL-15 / IL-15sushi CARの構成である。 CD19b-IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞は、CD19b-IL-15 / IL-15sushi CARを発現するレンチウイルスを患者またはドナーのT細胞へウイルスの形質導入を行うことで作製され、形質導入されたT細胞はIL-15 / IL-15sushi融合タンパク質を分泌することができる。FACS分析は、35％のCD19b-IL-15 / IL-15sushi CARがT細胞で発現できることを示して（下）、さらに分泌型IL-15 / IL-15sushi融合体は、標準的なCAR細胞と比較した場合、CAR T細胞またはNK細胞に追加の刺激、増殖、および効力の強化を提供する。 図45B：CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、CD19 + Sp53細胞を強力に溶解する。 図45C：CD19b-IL15 / IL-15sushi CAR T細胞は、CD19 + Sp53細胞を強力に溶解する（CD19b単一CAR Tと比較）。 図46A - CD19ベースのCARはin vivoでReh細胞を枯渇させ、IL-15 / IL-15sushiコンジュゲートは抗腫瘍応答を増強させる。1日目にルシフェラーゼを発現するReh腫瘍細胞（0.5x106細胞数/マウス）をマウスに注射した。3日目にIVISを実施して循環しているReh細胞を外観における検査をした。 4日目に、コントロールT細胞、CD19b CAR、およびCD19b-IL15 / IL-15sushi CAR T細胞を注射し（約7.5x106総細胞数/マウス）、6日目から22日目にかけてIVISイメージングを実施して、腫瘍量の半定量的評価と、それに続く腫瘍の減少およびT細胞による細胞増殖の制御を分析した。ここでは、両方のCAR T治療が同様の効力を示し、IL-15を分泌するCARは、標準的なCART19細胞と比較した場合、Reh腫瘍増殖に対し、同等またはそれ以上の制御を示した。 図46B - CD19b-CAR-TとCD19b-IL-15 / IL15sushi CAR-TのREH細胞に対する長期での比較。（上）前述と同じくIVISでの方法を用いた同様の実験スキーム、ただし、腫瘍の再発の兆候が見られるまでマウスを追跡した。ここでは、30日後、標準的なCART19処置でのマウスでアグレッシブなReh腫瘍の再発が起こり始めることが観察された。腫瘍のクラスター（IVISで画像化されたマウスの赤い領域で示される）はほとんどのCART19マウスで見られ、CD19b-IL-15 / IL-15sushi CARTでの処置マウスは1匹だけ22日目までに腫瘍の成長を示している。しかしながら30日後に、すべてのCART19マウスは重度の腫瘍再発の徴候を示めすが、CD19b-IL-15 / IL-15sushi CARTでの処置マウスは腫瘍の徴候を示さない。 22日目に再発したマウスでさえ、32日目までに腫瘍が消滅し、CD19b-IL-15 / IL-15sushi CART細胞が依然として有効な循環状態にあることを意味した。 図46C. 各治療コホートの経時的な腫瘍成長を推定するIVISトレンド値を要約する折れ線グラフ。30日を過ぎた後、ほとんど腫瘍がないCD19b-IL-15 / IL-15sushi CART治療グループと比較して標準のCD19b CAR（CART19）での処置マウスの腫瘍量は急激に上昇し、腫瘍量の非常に有意な増加をもたらした。両方のマウスの図（背側の画像の取得図）の値が表示される。 図46D-マウスにおける血液データをまとめた、マウスでのT細胞の持続性の要約。図3A-1のモデルからのマウス血液中のT細胞の全体的な持続性は、生存のエンドポイントで検査され、バルクT細胞集団についてCD3抗体を使用したフローサイトメトリーによりスクリーニングされた。 CD19b-IL-15 / IL-15sushiを備えたCARの持続性の結果をさらに分析するには、移植されたヒト細胞の持続性の存在を明らかにするために、マウスの血液の採取が必要である。全体として、フローサイトメトリー分析により、標準的なCART19グループと比較した場合、CARコホートを分泌するIL-15 / il-15sushiのT細胞の平均数が多いことがわかった。コントロ－ル群のT細胞は、in vivoの循環腫瘍からの刺激が最小限であるため、予想どおりベースラインのままである。 図.46E -マウスの血液データ（個々の）。図3A-1の代表的なマウスを生存のエンドポイントでフローサイトメトリーによりアッセイし、それぞれCD19 +およびCD3 +の発現により明らかになった残存腫瘍およびT細胞集団をスクリーニングした。これらのフローサイトメトリープロットは、各マウスの生存エンドポイントの状態をさらに分析し、有意な腫瘍集団と減少したT細胞数がコントロールマウスとほとんどのCART19マウスの特徴であることを明らかにしている。 T細胞の有意な数と腫瘍細胞の少ないあるいは無い事はCD19b-IL-15 / IL-15sushi CARでのコホートマウスの特徴である。 図47A. CD269-A7D-CD38 CAR T細胞の発現。バフィーコート細胞を抗CD3抗体で3日間活性化した。細胞に、コントロールベクター（左）、CD269-A7D-CD38a、CD269-A7D-CD38b、またはCD269-A7D-CD38c CAR（右）のレンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用にラベル付けした。 図47B. CD269-A7D-CD38 CAR T細胞は、共培養アッセイでCD38表面抗原を発現するREH腫瘍細胞株を特異的に溶解する。共培養実験は、エフェクターとターゲットの比率が2：1（上段）または5：1（下段）で24時間行われ、CD38およびCD3でのフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、コントロールT細胞（左パネル）、CD269-A7D-CD38a（中央左パネル）またはCD269-A7D-CD38a CAR T細胞（中央右パネル）、あるいは細胞のみ（右端）とインキュベートしたREH標的細胞からなる。 REH細胞は青い点で表される。 図47C. CD269-A7D-CD38 CAR T細胞は、共培養アッセイでCD269（BCMA）表面抗原を合成的に発現しているK562腫瘍細胞株を特異的に溶解する。共培養実験は、エフェクターとターゲットの比率が2：1（上段）または5：1（下段）で24時間行われ、CD269およびCD3でのフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、コントロールT細胞（左パネル）、CD269-A7D-CD38b（中央左パネル）またはCD269-A7D-CD38a CAR T細胞（中央右パネル）、あるいは細胞のみ（右端）とインキュベートしたK562-BCMA標的細胞からなる。 K-BCMA細胞は青い点で表される。 図48A. IL-15 / IL15sushiエンハンサーコンストラクトを持つcCAR-Tの模式図。コンストラクトは、P2AおよびT2Aペプチドそれぞれによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットおよびIL-15 / IL-15sushiの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、BCMAおよび/またはCD38を発現する標的に関与し、そしてIL-15 / IL-15sushiエンハンサー融合体を分泌する。新規cCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインは、BCMA CARセグメント上の4-1BBまたはCD28およびCD38 CARセグメント上のCD28または4-1BB領域を含み得るが、これらに限定されない。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。 図48B. CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CAR T細胞の発現。ヒト末梢血バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）、CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CAR（右）のレンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 4日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ヤギ抗ヒトF（Ab ’）2およびマウス抗ヒトCD3抗体でフローサイトメトリー用にラベル付けをした。 CAR T細胞は、緑色の点（丸で囲まれた）として表される。 図48C. CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CAR T細胞はCD38 + T細胞を溶解する。ヒト末梢血バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）、CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CAR（右）のレンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。インキュベーションの6日後（左の2つのグラフ）と12日後（右の2つのグラフ）に細胞を回収し、マウス抗ヒトCD3およびCD38抗体でフローサイトメトリー用に標識した。 CD38 + T細胞は青い点（丸）で表される。 図48D. CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、BCMA（CD269）表面抗原を合成的に発現しているK562腫瘍細胞株と、CD38抗原を元来発現している野生型REH細胞を共培養アッセイで特異的に溶解する。各アッセイは、K562-BCMAxp（左グラフ）またはREH標的細胞（右グラフ）のいずれかとコントロールT細胞またはCLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞を2：1および5：1のエフェクター：ターゲットセル比で共培養された。共培養実験を24時間および48時間実施し、抗ヒトCD3およびCD269またはCD38でのフローサイトメトリーにより直接分析した。 図48E. CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi NK細胞は機能的なIL15を発現する。 NK-92細胞株は、CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CARを持つレンチウイルスベクターで形質導入された。 （A）F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選択するために、BD FACS Ariaで細胞を選別した。 （B）CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CAR NK細胞および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで1 mLあたり0.5 x 10e6細胞数、総量1 mLで培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの1つのウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれていたが、もう1つのウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）、細胞をカウントし（B）、容量を増加させて約0.5 x 10e6 cells / mLの細胞密度にした。このプロセスは、4、6、8日目に繰り返された。 図48F. 選別されたCD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi NK細胞と野生型コントロールNK-92細胞は、別々のウェルで72時間培養された。上清を回収し、IL-15抗体でプレコートされた96ウェルプレートでELISAを行った。製造元（Boster）の指示に従って、プレートリーダーで得られた比色分析の結果を、ヒトIL-15で作成された標準曲線（A）と比較して、上清中のIL-15濃度を決定した（B）。 図49A. CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi とCD123b-CLL1-IL15/IL15sushi CAR T細胞の発現。ヒト末梢血バフィーコート細胞は、抗ヒトCD3抗体で3日間活性化された。細胞にコントロールベクター（左）、CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi (中央) または CD123b-CLL1-IL15/IL15sushi CAR（右）のレンチウイルス上清のいずれかを形質導入した。 4日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ヤギ抗ヒトF（Ab ’）2およびマウス抗ヒトCD3抗体でフローサイトメトリー用にラベル付けをした。 CAR T細胞は、緑色の点（丸で囲まれた）として表される。 図49B. CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi と CD123b-CLL1-IL15/IL15sushi NK細胞は機能的なIL15を発現する。 NK-92細胞株は、CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi または CD123b-CLL1-IL15/IL15sushi CARを含むレンチウイルスベクターで形質導入された。 （A）F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選択するために、BD FACS Ariaで細胞を選別した。 （B）CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi aと CD123b-CLL1-IL15/IL15sushi CAR NK細胞および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで1 mLあたり0.5 x 10e6細胞数、総量1 mLで培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの1つのウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれていたが、もう1つのウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）、細胞をカウントし（B）、容量を増加させて約0.5 x 10e6 cells / mLの細胞密度にした。このプロセスは、4、6、8日目に繰り返された。 図49C. 選別されたCD123b-CD33b-IL15/IL15sushi と CD123b-CLL1-IL15/IL15sushi NK細胞と野生型コントロールNK-92細胞は、別々のウェルで72時間培養された。上清を回収し、IL-15抗体でプレコートされた96ウェルプレートでELISAを行った。製造元（Boster）の指示に従って、プレートリーダーで得られた比色分析の結果を、ヒトIL-15で作成された標準曲線（A）と比較して、上清中のIL-15濃度を決定した（B）。 図50A. IL-15 / IL15sushiエンハンサーコンストラクトを持つ抗BCMA CAR-Tの模式図（BCMA-IL-15 / IL15sushi、CD269-A7D-IL-15 / IL-15sushiとも呼ばれる）。コンストラクトは、P2AおよびT2Aペプチドそれぞれによって連結された抗BCMA CARおよびIL-15 / IL-15sushiの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、cCARは別れ、BCMAを発現する標的に関与し、そしてIL-15 / IL-15sushiエンハンサー融合体を分泌する。新規のCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインは、抗BCMA CARセグメント上のCD28または4-1BBを含み得るが、これらに限定されない。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、特にNK細胞を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。 図50B. プライマリNK細胞の増殖のための、フィーダー細胞として放射線照射した遺伝子組み換えK562細胞の作製と調製の手順。 図50C.放射線照射した遺伝子改変K562細胞（フィーダー細胞）との共培養による臍帯血からのCAR形質導入ナチュラルキラー（NK）細胞の作製と増殖の手順 図51A. BCMA-IL15 / IL15sushi-CAR NK細胞は、in vivoマウスモデルで抗白血病効果を示す。 NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、翌日ルシフェラーゼ発現MM1S多発性骨髄腫細胞を静脈内注射して、測定可能な腫瘍形成を誘導した。 4日目に、マウスに10×106個のコントロールNK細胞またはBCMA-IL15 / IL15sushi-CAR発現NK細胞を静脈内注射した。 3、6、8、10日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。 図51B. コントロールとBCMA-IL15 / IL15sushi-CAR発現NK細胞で処置したマウス間での、total flux values（光子/秒）による経時的な比較。データは平均+ S.Dとして表示される。*P <0.05は指定日においてコントロールNK細胞と比較した。 図51C. MM1S多発性骨髄腫細胞を注射したマウスに、コントロールマウスとBCMA-IL15 / IL15sushi-CAR NK細胞で処置したマウスにおける、経時的な生存率の比較。80日目までの経時的なマウスの生存率を示した生存曲線を作成し、ログランク（Mantel-Cox）検定ではp = 0.0069を示す。 図52A. 異種移植マウスモデルにおける、注入されたBCMA-A7D-IL15 / IL15sushi CARを形質導入したNK細胞の、25日目（D）および60日目（E）における持続性の評価。 25日目（コントロールNKまたはCAR NK細胞をマウスに注入した21日後）および60日目（マウスにコントロールNKまたはCAR NK細胞を注入した58日後）に、末梢血を個々のマウスから採取し、注入されたコントロールおよび/またはCAR-NK細胞の存在を検出するため、ヒトCD56-とヒトCD45抗体を用いて細胞はラベルされた。採取された末梢血中の対照NK細胞またはBCMA-IL15 / IL-15sushi CAR形質導入NK細胞の持続性は、フローサイトメトリー分析により決定された。左のパネルは、NK細胞が注入されていないネガティブコントロールを示している。中央のパネルは、コントロールNK細胞を注入したマウスのグループを示している。右のパネルは、BCMA-IL15 / IL15sushi-CAR形質導入NK細胞を注入したマウスのグループを示している。 図52B. 60日目の異種移植マウスモデルにおける注入されたBCMA-A7D-IL15 / IL15sushi CARを形質導入したNK細胞の持続性の評価。 図53. 分泌IL-15 / IL-15sushi融合タンパク質を共発現するCARのコンストラクトを説明するための概略図およびTまたはNK細胞におけるその発現。A）CAR（第3世代または第2世代）とIL15アルファ受容体のIL15 / sushiドメインの組み合わせは、発現ベクター上でアセンブリされ、その発現はSFFVプロモーターによって駆動される。IL-15 / sushiを持つCARは、P2A自己切断配列と繋がっている。 IL-15/sushi部位は、ＩＬ－１５に融合したIL-2シグナルペプチドから構成され、26アミノ酸ポリプロリンリンカーを介してsushiドメインに繋がる。B）CARおよびIL-15 / sushiがTまたはNK細胞に存在する。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。 図54. IL-15/IL-15sushiアンカーを備えたCARを示す概略図。 Ａ）コンストラクトは、P2Aペプチドにより連結されたＣＡＲとIL-15/IL-15sushiアンカー（アンカーとも呼ぶ）の発現を駆動するＳＦＦＶプロモーターを含む。このP2Aペプチドが開裂すると、IL-15/IL-15sushiアンカーCARはCARとIL-15/IL-15sushiアンカーに分かれる。アンカーのIL-15/sushi部位は、IL-15に融合したIL-2シグナルペプチドで構成され、26アミノ酸ポリプロリンリンカーを介してIL15アルファ受容体のsushiドメインに繋がる。CARとアンカーの両方は、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）を含む。 CARにはscFv、共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖もあるが、アンカーはこれらのコンポーメントを負わない。 B）IL-15/IL-15sushiは、TまたはNK細胞の表面に固定される。 図55. CARエンハンサーコンストラクトを示す概略図。コンストラクトは、P2Aペプチドで連結されたCARとエンハンサー4-1BBL（CD137L）の発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。このP2Aペプチドが開裂すると、4-1BBLを持つCARコンストラクトはCARと4-1BBLタンパク質の全長に分かれる。 CARはリーダー配列とscFv、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）で構成される。 CARは共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖を持つが、4-1BBLはこれらのコンポーネントを持たない。 4-1BBLは、CD28または4-1BBと、T細胞活性化または抗腫瘍活性の相乗効果を提供する（ただし、これらに限定されない）。 図56. CARエンハンサーコンストラクトを示す概略図。コンストラクトは、P2Aペプチドで連結されたCARとエンハンサーIL-15の発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。このP2Aペプチドが開裂すると、IL-15を持つCARコンストラクトはCARとIL-15タンパク質の全長に分かれる。 CARはリーダー配列とscFv、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）で構成される。 CARは共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖を持つが、IL-15はこれらのコンポーネントを持たない。IL-15は、CD28または4-1BBとT細胞の活性化または増殖あるいは抗腫瘍活性の相乗効果を提供する。 IL-15のIL-15シグナルペプチドは、IL-15の分泌の高い効率を提供する強力なシグナルペプチドであるIL-2シグナルペプチド（リーダー配列）で置き換えられる。 図57. 複数のエンハンサー(CAR super)を持つ、CARコンストラクトを示す概略図。コンストラクトは、P2AおよびT2Aペプチドそれぞれで連結されたCARとエンハンサーである4-1BBL (CD137L) とIL-15/IL-15sushiの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。P2AおよびT2Aペプチドが開裂した後、4-1BBLとIL-15/IL-15sushiを含むCARコンストラクトは、CARと4-1BBLタンパク質と分泌IL-15/IL-15sushiの全長に分かれる。 CARはリーダー配列とscFv、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）で構成される。 CARは共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖を持つ。4-1BBLは、CD28または4-1BBと、TまたはNK細胞の活性化または抗腫瘍活性の相乗効果を提供する（ただし、これらに限定されない）。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞またはNK T細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞またはNK T細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。 図58. CD123b-Super-1-CARを発現するヒト臍帯血に由来のヒトNK細胞の作製。フローサイトメトリー分析により、臍帯血細胞にCD123b Super-1 CARのウイルスを形質導入した後、臍帯血細胞中のCD123b-Super 1CARを発現するCD56陽性細胞（ピンク色の丸で囲まれた細胞）を示した。 図59. BCMA-CD38a-IL15/IL15sushi cCAR (CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushiとも呼ばれる) を発現するヒト臍帯血に由来のヒトNK細胞の作製。フローサイトメトリー分析により、臍帯血細胞にBCMA-CD38a-IL15/IL15sushi cCARのウイルスを形質導入した後、臍帯血細胞中のBCMA-CD38a-IL15/IL15sushi cCARを発現するCD56陽性細胞（ピンク色の丸で囲まれた細胞）を示した。 図60A. super1 CARコンストラクトの模式図。super1 CARを作製するための P2AおよびT2Aによる連結されたCARを示す図解、GD2 CARは 4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushiを単一のコンストラクトに備えている。コンストラクトは、CAR、4-1BBL、IL-15 / IL-15sushiの3つのセグメントの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。リンカー（P2AおよびT2A）が開裂すると、CAR（GD2 CAR）、4-1BBL、およびIL-15 / IL-15sushiが分かれ、標的に関与する。 CARは、scFv、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖を持つ。 4-1BBLまたはIL-15 / IL-sushi、あるいはその両方は、TまたはNK細胞の活性化とCD28または4-1BBによる持続性または抗腫瘍活性の相乗効果をもたらす。 図60B. GD2-Super1-CAR-T細胞は、マウス肝臓のY79細胞を実質的に排除する。（A）フローサイトメトリー分析は、様々な形態の抗GD2 CAR T細胞で処置したマウスの肝臓におけるY79腫瘍の持続性（青い点）を示す。 Y79細胞（1x106個の細胞）が尾静脈からマウスに注射された3日後、CAR T細胞（10x106個の細胞）がI.V.によってマウスに注入された。Y79腫瘍を注入後30日目に、マウスを安楽死させ、CAR Tの効力を評価するため、肝臓をホモジナイズした。ヒトT細胞およびY79腫瘍細胞をそれぞれ検出するため、ホモジナイズした肝臓細胞をマウス抗ヒトCD3およびCD56抗体で標識した。コントロールT細胞を与えられたマウスが左側、 GD2CAR（左中央）、GD2-4-1BBL CAR（右中央）、およびGD2-Super1 CAR（右）T細胞で処置したマウスが示されている。腫瘍細胞の除去は、T細胞の高い標識と関連していた。 GD2-4-BBL CARは、4-1BBLリガンドを共発現するGD2 CARである。（B）コントロールマウスと比較し、各CARでの処置マウスによるY79細胞に対する殺傷活性の割合を示すグラフ（n = 2）。これらのデータから、特に、GD2 Super1 CAR Tのみが肝臓のY79細胞を実質排除することができた。 図60C. GD2-Super1-CAR T細胞は、マウス脾臓でより持続性を示す。（A）フローサイトメトリー分析は、様々な形態の抗GD2 CAR T細胞で処置したマウスの肝臓におけるCAR T細胞（丸で囲まれた）の持続性を示す。 Y79細胞（1x106個の細胞）が尾静脈からマウスに注射された3日後、CAR T細胞（10x106個の細胞）がI.V.によってマウスに注入された。Y79腫瘍を注入後30日目に、マウスを安楽死させ、CAR Tの効力を評価するため、脾臓をホモジナイズした。ヒトT細胞を検出するため、ホモジナイズされた脾臓細胞をマウス抗ヒトCD3およびCD45抗体で標識した。コントロールT細胞を与えられたマウスが左側、 GD2CAR（左中央）、GD2-4-1BBL CAR（右中央）、およびGD2-Super1 CAR（右）T細胞で処置したマウスが示されている。（B）コントロールTマウスと比較し、処置したマウスのCAR T細胞の増加を示すグラフ（n = 2）。これらのデータから、マウスの総脾臓細胞数でコントロールT細胞と比較して、特にGD2-Super CAR T細胞は、十分に増殖した。 図60D. マウスの血液中でのCAR T細胞の持続性。（A）フローサイトメトリー分析は、様々な形態の抗GD2 CAR T細胞で処置したマウスの全血中におけるCAR T細胞（丸で囲まれた）の持続性を示す。 Y79細胞（1x106個の細胞）が尾静脈からマウスに注射された3日後、CAR T細胞（10x106個の細胞）がI.V.によってマウスに注入された。Y79腫瘍を注入後30日目に、マウスを安楽死させ、CAR Tの効力を評価するため、全血を回収した。ヒトT細胞を検出するため、全血細胞をマウス抗ヒトCD3およびCD45抗体で標識した。コントロールT細胞を与えられたマウスが左側、 GD2CAR（左中央）、GD2-4-1BBL CAR（右中央）、およびGD2-Super1 CAR（右）T細胞で処置したマウスが示されている。 図60E.フローサイトメトリーで分析された総細胞数と比較した、全血サンプル中のヒトT細胞の残存率を表す棒グラフ（n = 2）
詳細な説明
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）組成物、方法およびその作製、ならびにＣＡＲ組成物を使用する方法を提供する。
組成物
キメラ抗原レセプターポリペプチド
一実施形態では、本開示は、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを有するキメラ抗原受容体（CAR）ポリペプチドを提供する。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は交互に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基を有する化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列とすることができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を有する任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書中で使用される場合、短鎖、一般に当該技術分野では例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも言及されており、そして長鎖、一般に当該技術分野ではタンパク質と呼ばれ、それには多くの種類が存在する、これら両者について言及する。 「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの改変体、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
「シグナルペプチド」は、輸送および局在化を指向するペプチド配列、そしてある細胞オルガネラ（小胞体など）および/または細胞表面に結合することができるいかなるペプチドを含むペプチド配列。
シグナルペプチドは、本開示において、細胞膜および細胞表面への輸送を指示し、正確な局在を提供する、如何なる分泌タンパク質または膜貫通タンパク質のペプチド、ポリペプチドである。特に、本開示のシグナルペプチドは、本開示における細胞膜へ指示する本開示のポリペプチドであり、それらポリペプチドの細胞外部分が細胞表面に提示され、膜貫通部分が原形質膜に及んでおり、活性ドメインが細胞質部分、または細胞の内部に存在する。
この実施例では、シグナルペプチドは、小胞体（ER）を通過した後に切断される、すなわち切断可能なシグナルペプチドである。この実施例では、シグナルペプチドは、I型、II型、III型またはIV型のヒトタンパク質である。この実施例では、シグナルペプチドは、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドを含む。
「抗原認識ドメイン」には、標的の抗原、受容体、ペプチドリガンド、またはタンパク質リガンドに選択的であるかまたは標的とするポリペプチドに選択的なポリペプチドが含まれる。
標的特異的抗原認識ドメインは、好ましくは、標的の抗原に対する抗体または標的の抗原に結合するペプチド、または標的の抗原に結合する抗体に結合するペプチドまたはタンパク質、または標的上の受容体に結合するペプチドまたはタンパク質リガンド（成長因子、サイトカイン、またはホルモンを含むが、これらに限定されない）、または標的上 に結合するペプチドまたはタンパク質リガンドに結合する受容体に由来するドメイン（増殖因子受容体、サイトカイン受容体またはホルモンレセプターを含むが、これらに限定されない）を標的とすることができる抗原結合ドメインを含む。ターゲットにはGD2およびGD3が含まれる。別の実施形態では、標的はGD2およびGD3の任意の部分を含む。別の実施形態では、標的はガングリオシドGD2であり、その構造はGD2 = bDGalpNAc（1-4）[aNeu5Ac（2-8）aNeu5Ac（2-3）] bDGalp（1-4）bDGlcp（1-1）Cerである。別の実施形態では、標的はガングリオシドGD3であり、その構造はGD3 = aNeu5Ac（2-8）aNeu5Ac（2-3）bDGalp（1-4）bDGlcp（1-1）Cerである。
この実施例では、抗原認識ドメインは、標的に対して（選択的な）のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む。
一実施形態では、抗原認識ドメインは抗原結合断片（Fab）を含む。別の実施形態では、抗原認識ドメインは単鎖可変断片（scFv）を含む。 scFvは、免疫グロブリンの重鎖（VH）と軽鎖（VL）の可変領域の融合タンパク質であり、短いリンカーペプチドで接続されている。
別の実施例では、抗原認識ドメインは、ラクダ科の単一ドメイン抗体またはその一部を含む。この実施例では、ラクダ科単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見出される重鎖抗体、またはVHH抗体を含む。 ラクダのVHH抗体（例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、およびアルパカ）は、ラクダ科単鎖抗体の可変断片を指し（Nguyenら、2001; Muyldermans、2001参照）、また、ラクダの単離されたVHH抗体、ラクダの組み換えVHH抗体、またはラクダのVHH合成抗体らを含む。
別の実施例では、抗原認識ドメインは、それらの同族受容体に関与するリガンドを含む。別の実施形態では、抗原認識ドメインはヒト化されている。
抗原認識ドメインは、その配列内にいくつかの可変性を含み、依然として本明細書に開示される標的に対して選択的であり得ることが理解される。 したがって、抗原認識ドメインのポリペプチドは、本明細書中に開示される抗原認識ドメインポリペプチドと少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも80％、または少なくとも70％同一であり、依然として本明細書中に記載され、本開示の範囲内にあると考えられる。
別の実施形態では、抗原認識ドメインは、ガングリオシドGD2およびガングリオシドGD3に対して選択的である。
ヒンジ領域は、例えば、キメラ抗原受容体、および少なくとも1つの共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない配列の間に位置する。ヒンジ配列は、例えば、ヒトまたはその一部を含む任意の属からの任意の適切な配列から得ることができる。そのようなヒンジ領域は当該技術分野において公知である。この実施例では、ヒンジ領域は、CD-8アルファ、CD28、4-1BB、OX40、CD3-ゼータ、T細胞レセプターαまたはβ鎖、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3ε、 CD45、CD4 、CD5、 CD8、 CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせを含むヒトタンパクのヒンジ領域を含む。
この実施例では、ヒンジ領域はCD8ヒンジ領域を含む。
いくつかの実施例では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、およびIgD）から選択されるものを含むが、これに限定されない。
膜貫通ドメインは、細胞膜に及ぶ疎水性ポリペプチドを含む。特に、膜貫通ドメインは、細胞膜の一方の側（細胞外）から細胞膜の向こう側（細胞内または細胞質）に及ぶ。
膜貫通ドメインは、アルファヘリックスまたはベータバレルの形状で、またはそれらの組み合わせであり得る。膜貫通ドメインは、多くの膜貫通セグメント、各アルファ - ヘリックス、ベータシート、またはそれらの組み合わせを有するポリトピックタンパク質を含む。
この実施例では、CARの構造のドメインの1つに もともと関連する膜貫通ドメインが使用される。別の実施例では、 同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとそのような ドメインの結合を避けるため、あるいは、レセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、膜貫通ドメインは選択またはアミノ酸置換によって修飾される。
例えば、膜貫通ドメインは、T細胞レセプターαまたはβ鎖の膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD68、CD134、CD137、ICOS、CD41、CD154、それらの機能的誘導体、およびこれらの組み合わせが含まれる。
人工的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシンやバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドである。一実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。
この実施例では、膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインである。別の実施例では、膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインである。そのような膜貫通ドメインは当該分野で公知である。
シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは、免疫細胞を活性化する、あるいは少なくも少なくともいくつかの局面の免疫細胞シグナル伝達経路を活性化するための ポリペプチドを含む。
この実施例では、シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ、共通FcRγ（FCER1G）、FcγRIIa、FcRβ（FcイプシロンRib）、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DNAX活性化タンパク質10（DAP10）、DNAX活性化タンパク質12（DAP12）、それらの活性断片、それらの機能的誘導体、およびそれらの組み合わせを含む、それら機能的シグナル伝達ドメインのポリペプチドを含む。そのようなシグナル伝達ドメインは当該分野で公知である。
この実施例では、CARポリペプチドは、1つ、あるいは1つ以上の共刺激ドメインを含む。一実施形態では、共刺激ドメインは、IL-15受容体アルファ; IL-15受容体アルファ細胞質ドメイン; B7-1 / CD80、 CD28、 4-1BB、4-1BBL、B7-2 / CD86、 CTLA-4、 B7-H1 / PD-L1、 ICOS; B7-H2、 PD-1、 B7-H3、 PD-L2、B7-H4、PDCD6、 BTLA、 4-1BB / TNFRSF9 / CD137、 CD40リガンド/ TNFSF5、4-1BBリガンド/ TNFSF9、GITR / TNFRSF18、BAFF / BLyS / TNFSF13B、GITRリガンド/ TNFSF18、BAFF R / TNFRSF13C、 HVEM / TNFRSF14、CD27 / TNFRSF7、 LIGHT / TNFSF14、 CD27リガンド/ TNFSF7、OX40 / TNFRSF4、CD30 / TNFRSF8、OX40リガンド/ TNFSF4、CD30リガンド/ TNFSF8、TACI / TNFRSF13B、CD40 / TNFRSF5、2B4 / CD244 / SLAMF4、CD84 / SLAMF5、BLAME / SLAMF8、 CD229 / SLAMF3、CD2、CD27、CRACC / SLAMF7、CD2F-10 / SLAMF9、NTB-A / SLAMF6、CD48 / SLAMF2、SLAM / CD150、CD58 / LFA-3、イカロス、 CD53、インテグリンアルファ4 / CD49d、CD82 / Kai-1、インテグリンアルファ4ベータ1、CD90 / Thy1、インテグリンアルファ4ベータ7 / LPAM-1、CD96、 LAG-3、CD160、LMIR1 / CD300A、CRTAM、TCL1A、DAP12、TIM-1 / KIM-1 / HAVCR、デクチン-1 / CLEC7A、TIM-4、DPPIV / CD26、TSLP、EphB6、TSLP RおよびHLA-DRを含むがこれに限定されない少なくとも1つのタンパク質から選択される機能的シグナル伝達ドメインである。
本開示はさらに、上記のキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。 CARをコードするポリヌクレオチドは、任意の従来の方法によって特定のCARのアミノ酸配列から容易に調製される。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、前述のNCBI RefSeq IDまたは各ドメインのアミノ酸配列をGenBenkのアクセッション番号から取得でき、そして本開示の核酸は、標準的な分子生物学的および/または化学手順を使用して調製することができる。例えば、塩基配列に基づいて、ポリヌクレオチドを合成することができ、本開示のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用してcDNAライブラリーから得られるDNA断片を組み合わせることにより調製することができる。
一実施形態において、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子、または発現またはクローニングカセットの一部である。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。ポリヌクレオチドは、DNAおよびRNAが含まれる。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される場合、核酸およびポリヌクレオチドは同様の意味でもある。当業者であれば、核酸がポリヌクレオチドであり、これを加水分解してモノマー「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有する。モノマーヌクレオチドを加水分解してヌクレオシドにすることができる。本明細書中で使用される ポリヌクレオチドは 、すなわち例えば、組換えライブラリーまたは細胞からの通常のクローニング技術およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの合成手段によるクローニング、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるがこれに限定されない。
ポリヌクレオチドベクター
上記のポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングすることができる。 「ベクター」は、単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドを細胞の内部に届けるために使用できる物質の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、ファージミド、コスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当該分野で公知である。ウイルスには、ファージ、ファージ誘導体が含まれる。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの核酸の細胞への移動を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
この実施例では、ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、組み込みベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
この実施例では、ベクターはウイルスベクターである。この実施例では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、操作された細胞は、ポリヌクレオチド配列を発現するためにウイルスで形質導入される。
哺乳動物細胞への遺伝子導入のための多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクターに挿入され、当該分野で既知の技術を用いてレトロウイルス粒子にパッケージングされる。次いで、組換えウイルスを単離し、in vivoまたはex vivoのいずれかの手段で患者の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が当該分野で公知である。いくつかの実施例では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該分野で既知である。この実施例では、レンチウイルスベクターが使用される。
ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えばSambrookら（2001、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York）および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生命体において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つ以上の選択マーカーを含む（例えば、WO 01/96584; WO 01/29058;および米国特許第6,326,193号）。
キメラ抗原レセプターポリヌクレオチドの発現は、例えば、限定されるものではないが、SFFV（脾臓フォーカス形成ウイルス）またはヒト伸長因子11α（EF）プロモーター、CAG（CMVエンハンサーを有するニワトリβ-アクチンプロモーター）プロモーター、ヒト伸長因子1α（EF）プロモーターが利用される。低強度/低発現プロモーターの例としては、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター、ユビキチンC（UBC）プロモーター、およびホスホグリセレートキナーゼ1（PGK）プロモーター、またはその一部を含め、限定されるものではないが、それらを含め利用される。キメラ抗原受容体の誘導性発現は、例えば、限定されるものではないがTRE3GV（全ての世代、好ましくは第3世代を含むTet応答エレメント ）を含めたテトラサイクリン応答性プロモーター、 誘導性プロモーター（Clontech Laboratories, Mountain View, CA）またはその一部またはそれらの組み合わせを含むこれらが 使われることで、目的を達成するかもしれない。
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに連結された操作されうる任意のポリヌクレオチド配列で高レベルの発現を誘導することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子-1a（EF-1a）である。しかしながら、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）長末端反復（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン - バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されることなく、他の構成的プロモーター配列も使用される。さらに、本開示は構成性プロモーターの使用に限定されるべきではなく、誘導性プロモーターも本開示の一部として考慮される。誘導性プロモーターの使用することで、連結されたポリヌクレオチド配列の発現を望む 場合、発現をオンにすることができる分子スイッチあるいは発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
「発現ベクター」とは、発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結された組換えポリヌクレオチド発現制御配列を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸であるかまたはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野で公知のものすべてが含まれる。
追加のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の30～100 bp上流の領域に位置しているが、最近では多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は柔軟であることが多いため、エレメントが互いに反転または移動してもプロモーター機能が維持されるため、チミジンキナーゼ（tk）プロモーターでは、活性の低下が始まる前にプロモーターエレメント間の間隔を50 bp離すことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協調的または独立して機能して転写を活性化できるようである。
CARポリペプチドまたはその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子またはその両方を含んで、細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることもできるウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとした、別の局面では、選択可能なマーカーは、別のDNAに搭載され、コトランスフェクション手順で使用されてもよい。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列が隣接していてもよい。有用な選択可能なマーカーには、例えば、neoなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在または発現されない遺伝子であり、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により明示されるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適当なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれる場合がある（例、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。適切な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製するか、商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の5 'フランキング領域を持つコンストラクトがプロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力についての代理として評価するために使用され得る。
遺伝子を細胞に導入および発現する方法は、当該分野で既知である。発現ベクターのコンテックスにおいて、ベクターは、当該技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞にトランスファーすることができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al.を参照されたい（2001、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York）。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入のための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、DNAおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、ヒト細胞などの哺乳動物に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法になった。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散システム、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。非ウイルス性送達システムが利用される場合、例示的な送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）のために考えられている。別の態様では、核酸は脂質と結合していてもよい。脂質に関与する核酸は、リポソーム、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに閉じ込められ、リポソームと複合した、脂質を含む溶液に分散した、脂質と混合した、脂質と組み合わせた、脂質中の懸濁液として含まれる、ミセルを含むまたは複合する、または脂質と関連するものの中の水性内部にカプセル化され得る。脂質、脂質/ DNA、または脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして、または「崩壊した」構造を備えた二重層構造で存在し得る。また、単純に溶液中に点在し、サイズや形状が均一ではない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然または合成の脂質である可能性のある脂肪物質である。たとえば、脂質には、細胞質に自然に発生する脂肪滴、および脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体を含む化合物の種類が含まれる。
使用に適した脂質は、商業ソースから入手できる。例えば、ジミリスチホスファチジルコリン（「DMPC」）は、ミズーリ州セントルイスのSigmaから入手でき、リン酸ジセチル（「DCP」）は、K＆K Laboratories（プレインビュー、ニューヨーク州）から入手でき、コレステロール（「チョイ」）はCalbiochem-Behringから入手でき、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids、Inc.（バーミンガム、アラバマ州）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、約-20°Cで保存できる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。
「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された、さまざまな単一および多層脂質の脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体を備えた小胞構造を有すると特徴付けることがでる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を持っています。リン脂質が過剰な水溶液に懸濁すると、自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再配列を受け、脂質二重層の間に水と溶質を閉じ込める（Ghosh et al., 19 1 Glycobiology 5; 505- 10）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる溶液構造を有する組成物も含まれる。例えば、脂質はミセル構造をとるか、または脂質分子の不均一な凝集体として存在するだけである。リポフェクタミン-核酸複合体も考えられる。
外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するため、または本開示のポリヌクレオチドに細胞を曝露するために使用される方法に関係なく、宿主細胞中の組換えDNA配列の存在を確認するために、さまざまなアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、RT-PCRおよびPCRなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイが含まれ、特定のペプチドの有無の検出などの「生化学的」アッセイには、例えば免疫学的手段（EL1SAおよびウエスタンブロット）あるいは、本開示の範囲内にある薬剤を特定するための、本明細書に記載のアッセイが含まれる。
操作された細胞
別の実施形態では、本開示は、上記のキメラ抗原受容体ポリペプチドまたはそれをコードし、上記のポリヌクレオチドを発現する操作された細胞を提供する。
「操作された細胞」は、遺伝子、DNAまたはRNA配列、またはタンパク質もしくはポリペプチドの付加または修飾によって、修飾、形質転換、または操作される任意の生体の、如何なる細胞を意味する。本開示の単離された細胞、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞は、キメラ抗原レセプターまたはキメラ抗原レセプター複合体をコードするDNAまたはRNA配列を含有し、キメラ受容体を細胞表面に発現するNK細胞およびT細胞のような、単離された免疫細胞を含む 。単離された宿主細胞および操作された細胞は、例えば、NK細胞活性またはTリンパ球活性の増強、癌の治療、および感染症の治療に使用され得る。
本明細書に開示されるキメラ抗原受容体ポリペプチドをその膜に発現および/または組み込むことができる任意の細胞を使用することができる。
この実施例では、操作された細胞は免疫調節細胞を含む。免疫調節細胞には、CD4 T細胞（ヘルパーT細胞）、CD8 T細胞（細胞傷害性T細胞、CTLs）、およびメモリーT細胞またはメモリーT幹細胞 などのT細胞が含まれる。別の実施例において、T細胞には、ナチュラルキラーT細胞（NK T細胞）が含まれる。
T細胞はCD4およびCD8細胞で構成されている。 CD4は、ヘルパーT細胞などの免疫細胞の表面に存在する糖タンパク質で、T細胞の活性化とHIVの受容体に重要である。一部の単球またはマクロファージもCD4を発現している。 CD4はOKT4とも呼ばれる。細胞傷害性T細胞は、CD8 + T細胞またはCD8糖タンパク質を表面に発現するCD8 T細胞としても知られている。これらのCD8 + T細胞は、MHCクラスIによって提示されるペプチド抗原にさらされると活性化される。
一実施形態では、操作された細胞はＮＫ Ｔ細胞を含む。 NK T細胞は当技術分野で周知である。
一実施形態では、操作された細胞はナチュラルキラー細胞を含む。ナチュラルキラー細胞は、当技術分野で周知である。一実施形態では、ナチュラルキラー細胞には、NK-92細胞などの細胞株が含まれる。 NK細胞株のさらなる例には、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS細胞、およびNKL細胞が含まれる。
NK細胞はGvHDのリスクなしに抗腫瘍効果を媒介し、T細胞に比べて短命である。したがって、NK細胞は癌細胞を破壊した後すぐに使い果たされ、操作された細胞を除去するためのCARコンストラクト上の誘導性自殺遺伝子の必要性が少なくなる。
本明細書で使用されるＣＤＸＣＡＲは、ＣＤＸ抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体を指す。本明細書で使用されるＣＤＸは、ＧＤ２およびＧＤ３のいずれかであり得る。
CARを宿すために使用されるTCR欠損T細胞
一実施形態では、改変細胞、特にドナーから得られた同種Ｔ細胞を改変して、ＭＨＣ認識に関与するＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）の成分を不活性化することができる。その結果、TCR欠損T細胞は移植片対宿主病（GVHD）を引き起こさない。
細胞のソース
改変細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄、腫瘍浸潤リンパ球、リンパ節組織、または胸腺組織から得られる場合がある。宿主細胞には、胎盤細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞が含まれ得る。細胞は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種から取得することができる。細胞は、確立された細胞株から取得され得る。
上記の細胞は、任意の既知の手段により得ることができる。細胞は、改変細胞のレシピエントに対して自家、同系、同種異系、または異種であってもよい。
「自家」という用語は、その個体に後で再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指す。
「同種異系」という用語は、物質が導入された個体と同じ種の異なる動物に由来する材料を指す。 1つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、2人以上の個人が互いに同種異系であると言われる。いくつかの局面において、同じ種の個体由来の同種異系の材料は、遺伝的に抗原的に相互作用するのに十分に異なり得る。
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
「同系」という用語は、特に抗原または免疫学的反応に関して極めて類似した遺伝的類似性または同一性を指す。同系には、例えば、臓器と細胞（例えば、癌細胞とその非癌性の対応物）が同じ個体に由来するモデル、および/または器官と細胞が同じ近交系の異なる個々の動物に由来するモデルが含まれる。
特定の実施形態では、TおよびNK細胞は、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）、白血球除去製品（PBSC）、ヒト胚性幹細胞（hESC）、人工多能性幹細胞（iPSC）、骨髄、または臍帯血に由来する。
CAR療法でNK細胞を使用する場合の潜在的な欠点には、長期的な有効性を低下させる可能性がある持続性の欠如が含まれる。
一致しないT細胞がレシピエントの組織に付着し、移植片対宿主病（GVHD）を引き起こす可能性があるため、CAR T細胞を作製するための一致するドナーT細胞を見つけることは困難である。
最近の研究では、ユニバーサルCAR T細胞の作製のためのCRISPR-Cas9を介した遺伝子編集が、意図しない変異を作成し、p53修復タンパク質の機能を破壊することにより、がんリスクを高めることが示されている。このリスクを考えると、患者のCAR治療の計画を作成する際にゲノム編集を回避する方法を探すことが重要である。ナチュラルキラー（NK）細胞は、ゲノム編集に関連するリスクを回避するuniversal CARを作製するための理想的なプラットフォームである。ただし、in vivoでのNK CAR細胞の平均寿命は非常に短く、寿命は約1週間である。
一実施形態において、本開示は、疾患を治療するためのインビボでの長寿命または長期持続性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ＮＫ細胞を作製する方法を含む。驚くべきことに、IL-15 / IL-15sushiまたはIL-15/IL-15 sushiアンカーを共発現するCAR NK細胞は長期の生存を伸ばすことがわかった。
さらなる実施形態において、CAR NK細胞の生存の延長は、IL-15 / IL-15アンカーを共発現させることにより達成することができる。
いくつかの実施形態では、IL-15/IL-15sushi またはIL-15/IL-15sushiアンカーを共発現するCAR NK細胞をスケールアップし、既製品として使用することができる。
一実施形態では、IL-15/IL-15sushi またはIL-15/IL-15sushiアンカーを共発現するCAR NK細胞は、支持性のサイトカインシグナル伝達を継続することができ、これは患者における注入後の生存に重要である。
いくつかの実施形態では、IL-15/IL-15sushi またはIL-15/IL-15sushiアンカーを共発現するCAR NK T細胞をスケールアップし、既製品として使用することができる。
一実施形態では、IL-15/IL-15sushi またはIL-15/IL-15sushiアンカーを共発現するCAR NK T細胞は、支持性のサイトカインシグナル伝達を継続することができ、これは患者における注入後の生存に重要である。
さらなる実施形態において、CAR NK細胞生存の延長は、IL-7、IL-15、IL-15 / IL-15アンカー、IL-15 / IL-15RA IL-12、IL-18、およびIL-21のグループから選択されるサイトカインを共発現することにより達成され得る。
一実施形態では、IL-15/IL-15sushi またはIL-15/IL-15sushiアンカーを共発現するCAR NK T細胞は、支持性のサイトカインシグナル伝達を継続することができ、これは患者における注入後の生存に重要である。
さらなる実施形態において、CAR NK細胞生存の延長は、IL-7、IL-15、IL-15 / IL-15アンカー、IL-15 / IL-15RA、 IL-12、IL-18、およびIL-21のグループから選択されるサイトカインを共発現することにより達成され得る。
ナチュラルキラーT（NK T）細胞は、T細胞とナチュラルキラー細胞の両方の特性を共有するT細胞のグループである。
一実施形態では、IL-15産物は、IL-15 / sushiドメイン複合体をIgG1などのFc領域と連結するジスルフィド結合を生成するように修正される。この実施形態では、IL-15/sushi複合体をＦｃ領域に連結することができ、それは２つの分子を連結するジスルフィド架橋を有する二量体を形成する。一実施形態では、IL-15の52番目のロイシンはシステインに置換され、Sushiドメインの40番目のセリンはシステインに置換される。
一実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔ細胞受容体経路などの細胞経路の活性化時に発現を引き起こす。この実施形態では、関心のある遺伝子の発現は、T細胞受容体またはCARにより活性化されるものを含む類似の経路の活性化により誘導される。当業者は、これが、その配列はよく説明されているIL-2プロモーターの一部またはNFAT結合モチーフからなる合成プロモーターIL-2プロモーターの部分を含む、またはNFAT結合モチーフからなる合成プロモーターを含む、活性化T細胞の核因子（NFAT）プロモーターの制御下にあるもの等のプロモーターを含むと理解するであろう。これらは活性化誘導プロモーターの例にすぎず、限定するものではない。
uCAR NK細胞
同種異系のCAR T細胞はレシピエントにGVHD（移植片対宿主病）を引き起こすことができるため、現在の臨床試験または治療の大部分は自家CAR T細胞を注入している。この自家アプローチは、臨床的に顕著な成功を収めたが、患者固有のT細胞製品の製造プロセスには時間がかかり、費用もかかる。さらに、十分な用量のCAR T細胞を首尾よく作製するために、強い治療をした患者から十分なT細胞を採取することは常に可能ではない。自家同種CAR製品の開発に対する大きな需要がある。NK細胞は、細胞毒性の高い免疫エフェクターであるという点でT細胞に似ている。 T細胞とは対照的に、NK細胞は特定の方法で標的を殺す性質を持っている。 NK細胞は、通常GVHDを引き起こす可能性がないため、自家同種産物として使用できる。 NK細胞を使用する主な欠点は、in vivoでの持続性の欠如であり、半減期はわずか約1週間である。
いくつかの実施形態において、本発明は、保存され、次いで要求に応じて個体に注入され得る健康なドナー由来のuniversalＣＡＲ発現ＮＫ細胞またはＮＫ Ｔ細胞の形態を開示する。さらなる実施形態では、本発明は、ＧＶＨＤを引き起こさずに任意の患者に注入することができる同種異系の健康なドナーからのuniversal CAR NK製品を作製する方法を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞またはＮＫ Ｔは、臍帯血バンクおよび末梢血バンクから得られる。さらなる実施形態では、NKは人工多能性幹細胞または胚性幹細胞またはNK-92細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＫ細胞においてIL-15/IL-15sushiを共発現するＣＡＲまたはcompound CAR (cCAR)を有する方法を含む。これらの操作されたNK細胞は、uCAR NK細胞と呼ばれる。
一部の実施形態では、uCAR NK細胞は、IL-15 / IL-15sushiを共発現するCARまたはcCARを有する。さらなる実施形態において、uCAR NK細胞は、インビボで１週間以上持続することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、IL-15 / IL-15sushiを備えたCARまたはcCARを発現するベクターを有するuCAR NK細胞のための方法を含む。
いくつかの実施形態では、CARまたはcCARとのIL-15 / IL-15sushiの共発現は、対象におけるNK細胞の長期持続性を提供する。
いくつかの実施形態において、CARまたはcCARと IL-15 / IL-15sushiとの共発現は、標的癌細胞のCAR認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期にわたる寛解をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示は、IL-15 / IL-15sushiを共発現する1つのCARまたはcCARをもつNK細胞を作製する方法を含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲ内の抗原認識ドメインによって標的化される特定の腫瘍抗原は、GD2、GD3、インターロイキン6受容体、FSHR、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE-4、 MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MMG49エピトープ、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受容体、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD56、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、 TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2、およびCD138のグループから選択され得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示は、IL-15 / IL-15sushiおよび/または特定の腫瘍抗原の抗原認識ドメインを持つCARを発現するように遺伝子操作されたNK細胞を治療に有効量での注入による障害または疾患の治療方法を含む。さらなる実施形態において、抗原認識ドメインにより標的化される特定の腫瘍抗原は、GD2、GD3、インターロイキン6受容体、FSHR、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE-4、 MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MMG49エピトープ、CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受容体、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD47、CD200、CD70、CD56、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、 TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2、およびCD138のグループから選択され得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、高用量のuCAR NK細胞の投与は、サイトカイン放出症候群（CRS）を引き起こし得る。本開示では、対象に低用量または分割用量のuCAR NK細胞を提供することによるCRSの低減または回避の方法を含む。
自殺および安全スイッチシステム
本開示の改変細胞はまた、自殺システムを含み得る。自殺システムは、上記のように操作された細胞が不活性化または破壊されるメカニズムを提供する。そのような特徴により、操作された細胞が使用されるあらゆる治療の正確な治療制御が可能になる。本明細書で使用する場合、自殺システムは、自殺システムを有する細胞を不活性化または破壊することができるメカニズムを提供する。自殺システムは、当技術分野で周知である。
一実施形態において、自殺システムは、必要に応じて含有細胞を除去するために薬理学的に活性化され得る遺伝子を含む。特定の局面において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を宿している宿主に対して免疫原性ではない。一例では、自殺システムは、遺伝子操作された細胞の細胞表面でCD20を発現させる遺伝子を含む。従って、リツキシマブの投与は、遺伝子を含む操作された細胞を破壊するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、自殺システムはエピトープタグを含む。エピトープタグの例には、c-mycタグ、CD52ストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）、および短縮型EGFR遺伝子（EGFRt）が含まれる。この実施形態では、エピトープタグは操作された細胞で発現される。したがって、エピトープタグに対する抗体の投与は、遺伝子を含む操作された細胞を破壊するために使用され得る。
別の実施形態では、自殺システムは、トランケートされた上皮成長因子受容体を操作された細胞の表面で発現させる遺伝子を含む。したがって、セツキシマブの投与は、遺伝子を含む操作された細胞を破壊するために使用され得る。
別の実施形態では、自殺システムは、操作された細胞の表面に発現されるCD52を含む。したがって、抗52モノクローナル抗体（CAMPATH、アレムツズマブ）の投与により、遺伝子を含む人工細胞を破壊することができる。
別の実施形態では、自殺システムは、CAMPATH（アレムツズマブ）を含む。したがって、抗52モノクローナル抗体（CAMPATH）の投与により、CAR T細胞またはT細胞がCD52を高度に発現するため、タグまたは遺伝子を発現せずに操作細胞を破壊することができる。
別の実施形態において、自殺遺伝子は、カスパーゼ8遺伝子、カスパーゼ9遺伝子、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ（CD）、またはシトクロムP450を含み得る。
さらなる自殺システムの例には、Jones ら（Jones BS, Lamb LS, Goldman F and Di Stasi A (2014) Improving the safety of cell therapy products by suicide gene transfer. Front. Pharmacol. 5:254. doi: 10.3389/fphar.2014.00254）の記載されているものが含まれる。
Compound CAR (cCAR)
本明細書で使用されるcompound CAR（cCAR）またはmultiple CARは、少なくとも2つの完全かつ別個のキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する操作された細胞を指す。本明細書で用いられる「異なるキメラ抗原レセプターポリペプチド」は、ユニークな抗原認識ドメイン、シグナルペプチド、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを有する。したがって、2つのユニークなキメラ抗原レセプターポリペプチドは、異なる抗原認識ドメインを有するであろう。シグナルペプチド、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、少なくとも1つの共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインは、2つの異なるキメラ抗原レセプターポリペプチド間で同じであっても異なっていてもよい。本明細書で使用される、キメラ抗原レセプター（CAR）ユニットは、異なるキメラ抗原レセプターポリペプチド、またはそれを同様にコードするポリヌクレオチドを指す。
本明細書中で使用される場合、ユニークな抗原認識ドメインは、標的に特異的である、または単一の標的または標的の単一のエピトープを標的にするかの一つである。
本明細書で使用される場合、文脈でのcompound CAR。単一のキメラ抗原受容体ポリペプチドは、唯一のユニークな抗原認識ドメインを持っている。さらなる説明として、この単一の抗原認識ドメインは、単一の抗原または単一の抗原エピトープのみを認識して結合する。
いくつかの実施形態では、compound CARは同じ抗原を標的とする。たとえば、cCARは異なるエピトープまたは単一の抗原の一部を標的とする。いくつかの実施形態では、compoundＣＡＲに存在するＣＡＲユニットの各々は、同じまたは異なる疾患状態または疾患状態によって引き起こされる副作用に特異的な異なる抗原を標的とする。
いくつかの実施形態では、compound CARは2つの異なる抗原を標的とする。
異なるCARユニットを有するcompound CARsの考案は大変挑戦的である、（1）CAR-CAR相互作用が有害な影響を及ぼすかもしれず、適切なCAR設計がこの悪影響を相殺する鍵である、（2）単一コンストラクトのcompound CARは発現カセットの長さを増加させる可能性がある、その結果、ウイルス力価およびタンパク質発現レベルの低下を引き起こすかもしれない、（3）単一のベクター内にmultiple CARsを発現させる為の戦略を選択するため、様々なCARボディ要素を含む適切な設計が必要である、（4）CARの追加ユニットを有するcompound CARに対して強力なプロモーターは特に重要である、 （5）CARのヒンジ領域は、各CARユニット間のヒンジ領域の相互作用ができるだけ回避されるように設計する必要がある、（6）細胞で発現する２つまたはそれ以上CARユニットが毒性作用を引き起こすかもしれない(CARとCAR の相互作用)。出願人は、 新規且つ驚くべきCARの組成物並びに、これらのハードルを克服する 方法を提供する。
cCARの形質導入効率（CAR T細胞の割合）は、単一ユニットCARの場合よりも低いことがよくある。トランスフェクションと形質導入の両方のステップで、効率を改善する方法がいくつかある。cCARを作製するためのウイルス力価を改善するには、一般的に使用されるHEK-293FTの代わりに、高力価のレンチウイルス産生用に選り出されたLentiX（商標）293 T（Clontech / Takara）パッケージング細胞株を使用することが好ましい。また、トランスフェクション効率を高めるために、パッケージング細胞をトランスフェクトする際に、プラスミドDNA（cCARコンストラクトを含む）の量を1.5～2.0倍に増やすことが好ましい。ウイルスパッケージングプラスミドとトランスフェクション試薬の量は、複合体の形成中は同じままである。形質導入効率は、形質導入段階でウイルスベクターに対するT細胞の比率を1 mLあたり0.3 x 106個の細胞数に下げ、レンチウイルス上清またはレンチウイルスの量を増やすことでさらに高めることができる。
この実施例では、本開示は、multiple CARユニットを有する操作された細胞を提供する。これにより、単一の操作された細胞が複数の抗原を標的とすることが可能になる。複数の表面マーカーまたは抗原を同時にmultiple CARユニットで標的とすることにより、耐性クローンの選別が妨げられ、腫瘍の再発が減少する。 様々なドメインおよび活性化部位を含む個々のcomponent CARを用いたMultiple CAR T細胞免疫療法はいずれの悪性腫瘍に対してもまだ展開されていない 。
本発明のひとつの側面では、cCARは、multiple CARユニットを含む。いくつかの実施例では、cCARは、少なくとも2つのCARユニットを含む。別の実施例において、cCARは、少なくとも3つのCARユニットを含む。別の実施例において、cCARは、少なくとも4つのユニットを含む。
一実施形態では、本開示は、それぞれが異なる抗原認識ドメインを有する少なくとも２つの別個のキメラ抗原受容体ポリペプチドを有する操作された細胞を提供する。
この実施例では、少なくとも2つの異なるキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作細胞は、T細胞またはNK T細胞である。 T細胞は、細胞表面抗原を発現しないように操作することができる。例えば、T細胞は、CD45細胞表面抗原を発現しないように操作することができる。
好ましい実施例では、少なくとも2つの異なるキメラ抗原レセプターポリペプチドを有する操作細胞は、末梢血または臍帯血から単離された初代NK細胞またはNK T細胞であり、またNK-92細胞であり、疾患または癌を有する任意の哺乳類に「既製品」として投与される。
この実施例では、操作された細胞は、（i）第1の抗原認識ドメイン、第1のシグナルペプチド、第1のヒンジ領域、第1の膜貫通ドメイン、第1の共刺激ドメイン、および第1のシグナル伝達ドメインを含む第1のキメラ抗原レセプターポリペプチド、（ii）第2の抗原認識ドメイン、第2のシグナルペプチド、第2のヒンジ領域、第2の膜貫通ドメイン、第2の共刺激ドメイン、および第2のシグナル伝達ドメインを含む第2のキメラ抗原レセプターポリペプチド。第1の抗原認識ドメインは、第2の抗原認識ドメインとは異なる。
好ましい実施例おいて、 各操作されたCARユニットポリヌクレオチドは、相同組換えを回避するために異なるヌクレオチド配列を有する。
一実施形態では、第１の抗原認識ドメインの標的は、これらに限定されないが、GD2、GD3、インターロイキン6受容体、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE- 4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、 CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受容体、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5 、CD7、CD2およびCD138から、また、2番目の認識ドメインのターゲットはGD2、GD3、インターロイキン6受容体、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE- 4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、 CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、NKG2D、NKG2D受容体、免疫グロブリンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF、BAFF受容体、エイプリル受容体、TACI、CD3、 CD4、CD8、CD5、CD7、CD2、およびCD138からなるグループから選択される。
一実施形態では、第１の抗原認識ドメインの標的は、GD2、GD3、CD19、CD20、CD22、CD38、CD138、BCMA、CS1、BAFF、BAFF受容体、TACI、April、April受容体、CD3、CD4、CD5、CD7、CD2、CLL-1、CD33、CD123、NKG2D受容体およびCD30らのグループから選択されるが、これらに限定されない、2番目の認識ドメインのターゲットは、GD2、GD3、CD19、CD20、CD22、CD38、CD138、BCMA、CS1、BAFF、4月、4月受容体、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD5、CD7、CD2、CLL-1、CD33、CD123、NKG2D受容体およびCD30らのグループから選択される。
一実施形態では、各ＣＡＲユニットは、同じまたは異なるヒンジ領域を含む。別の実施形態では、各ＣＡＲユニットは同じまたは異なる膜貫通領域を含む。別の実施形態では、各ＣＡＲユニットは、同じまたは異なる細胞内ドメインを含む。
この実施例では、各CARユニットは、CD3ゼータ鎖シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、各別個のＣＡＲユニットは、異なる共刺激ドメインを含む。例えば、第1のキメラ抗原レセプターポリペプチドは、4-1BB共刺激ドメインを含み、そして第2のキメラ抗原レセプターポリペプチドは、CD28共刺激ドメインを含む。
一実施形態では、各別個のＣＡＲユニットは、同じ共刺激ドメインを含む。例えば、第1キメラ抗原受容体ポリペプチドは4-1BB共刺激ドメインを含み、そして、第２のキメラ抗原受容体ポリペプチドは、4-1BB共刺激ドメインを含む。
別の実施例では、ヒンジ領域は、望ましくない分子内または分子間相互作用を引き起こし得るアミノ酸を排除するように設計される。例えば、ヒンジ領域は、ジスルフィド結合の形成を防止するためにシステイン残基を排除または最小化するように設計される。別の実施例において、ヒンジ領域は、疎水性残基を排除または最小化して、望ましくない疎水性相互作用を防止するように設計される。
Compound CARは、単独で、またはコンビネーションにより標的を殺傷させることができる。Multipleまたはcompound CARは、同一の、または異なるヒンジ領域、同じまたは異なる膜貫通、同じまたは異なる共刺激性および同一または異なる細胞内ドメインを含む。好ましくは、ヒンジ領域は、相互作用部位を避けるように選択される。
本発明のcompound CARは、T細胞またはNK細胞において、同一または異なる腫瘍集団を標的とすることができる。例えば、第1のCARは、巨大な腫瘍集団を標的とし、次の、または第2のCARは、癌再発を避けるために、例えば、癌または白血病幹細胞を根絶するかもしれない。
本開示によれば、驚くべきことに、異なるまたは同じ腫瘍集団を標的とするTまたはNK細胞中のcompound CARが、CAR殺傷活性に耐性の癌細胞を引き起こし、それにより癌細胞表面からの標的抗原のダウンレギュレーションを引き起こす、腫瘍因子と戦うことを見出した 。驚くべきことに、これにより、「抗原逃避」および、異なる腫瘍細胞が異なる表面抗原発現プロファイルを示すことでの腫瘍の不均一性により癌細胞が CAR療法から「隠す」ことが可能になることも見出された。以下の本開示のように、驚くべきことに、compound CARは、そのマルチターゲティング能力により、単一CAR療法よりも有意な利点を有することがわかった。抗原特異的な選択のプレッシャー状況下において単一の抗原が失われる可能性はあるが、2つの主要な抗原が同時に失われる可能性ははるかに低くなる。
一実施形態では、抗原認識ドメインは、標的に対する（選択的）ヒト化モノクローナルまたはヒト化ポリクローナル抗体の結合部分または可変領域を含む。
本発明の一態様では、抗原認識ドメインは、２つの標的化ドメインを含む二重特異性タンデムキメラ抗原受容体であり得る。さらなる実施形態では、３つ以上の標的化ドメインを含む多重特異性タンデムキメラ抗原受容体が存在する。
本発明の特定の局面において、抗原認識ドメインは、2つの標的化ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体（二重特異性抗体に由来する）であり得る。
一実施形態では、二重特異性タンデムキメラ抗原受容体または二重特異性キメラ抗原受容体は、腫瘍エスケープまたは抗原の喪失を効果的に相殺し、抗原認識の感度を高める。
別の実施例では、抗原認識ドメインは、ラクダ科の単一ドメイン抗体またはその一部を含む。この実施例では、ラクダ科単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見出される重鎖抗体、またはVHH抗体を含む。 ラクダ科のVHH抗体（例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、およびアルパカ）は、ラクダ科単鎖抗体の可変断片を指し（Nguyenら、2001; Muyldermans、2001参照）、また、ラクダ科の単離されたVHH抗体、ラクダ科の組み換えVHH抗体、またはラクダ科のVHH合成抗体を含む。
CARの機能のエンハンサーとT細胞および自然細胞の増加または増殖の促進
IL-15/IL15sushi エンハンサー
一実施形態では、IL-15 / IL15sushiエンハンサーを有するCARコンストラクトを図53に示す。CARは分泌IL-15 / IL-15sushi複合体を備えている。 IL-15 / IL-15sushiを伴うCARは、P2A自己開裂シーケンスとリンクしている。 IL-15 / IL-15sushi部分は、IL-15に融合し、２６アミノ酸ポリプロリンリンカーを介してIL-15アルファ受容体のsushiに結合したIL-2シグナルペプチドから構成される。CARにはscFv、共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖がある。 IL-15中のIL-15シグナルペプチドは、高効率でのIL-15 / IL-15sushi分泌を提供する強力なシグナルペプチドであるIL-2シグナルペプチド（リーダー配列）で置き換えられる。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
IL-15は、他の書面、US8507222 B2に記載されているIL-15N72Dの変異体であり得る。
IL-15 / IL15sushiアンカーエンハンサー
一実施形態において、IL-15 / IL-15sushiアンカーを有するCARコンストラクトを図54に示す。CARIL-15 / IL15sushiアンカーコンストラクトは、P2Aペプチドによって連結されたCARおよびIL-15 / IL-15sushiアンカー（アンカーとも呼ばれる）の発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。このP2Aペプチドが開裂すると、IL-15 / IL-15アンカーCARはCARとIL-15 / IL15sushiアンカーに分かれる。アンカーのIL-15 / IL-15sushi部分は、IL-15に融合し、26アミノ酸のポリプロリンリンカーを介してIL-15アルファ受容体のsushiドメインに結合したIL-2シグナルペプチドで構成されています。CARとアンカーの両方は、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）を含む。 CARにはscFv、共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖もあるが、アンカーにはこれらのコンポーネントを含まない。IL-15/IL-15sushiアンカーは、CD28または4-1BBとのT細胞の活性化または抗腫瘍活性の相乗効果を提供する。 IL-15/IL-15sushiアンカーを備えると、CARはより強力になる。（図54）
IL-15は、他の書面、US8507222 B2に記載されているIL-15N72Dの変異体であり得る。
4-1BBL エンハンサー
別の実施形態において、4-1BBLエンハンサーを有するＣＡＲコンストラクトが図55に示されている。 CAR 4-1BBLコンストラクトは、P2Aペプチドで連結されたCARとエンハンサー、4-1BBL（CD137L）の発現を促進するSFFVプロモーターで構成される。このP2Aペプチドが開裂すると、4-1BBLを持つCARコンストラクトはCARポリペプチドと全長の4-1BBLタンパク質に分かれる。 CARには、リーダー配列とscFv、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）が含まれる。 CARには共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖もあるが、4-1BBLはこれらのコンポーネントを持たない。 4-1BBLは、CD28または4-1BBとT細胞活性化または抗腫瘍活性の相乗効果を提供する。 4-1BBLを備えると、CARはより強力になる。
IL-15エンハンサー
CARの機能は、図56に示す分泌エンハンサーIL-15を組み込むことで強化できる。 CAR 4-IL-15コンストラクトは、P2Aペプチドで連結されたCARとエンハンサーIL-15の発現を駆動するSFFVプロモーターで構成されている。このP2Aペプチドが開裂すると、IL-15を含むCARコンストラクトはCARポリペプチドと全長のIL-15タンパク質に分かれる。 CARには、リーダー配列とscFv、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）が含まれる。 CARには共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖もあるが、IL-15はこれらのコンポーネントを持たない。 IL-15の分泌は、CD28または4-1BBとのT細胞活性化または抗腫瘍活性の相乗効果をもたらす。 IL-15を分泌する場合、CARはより強力である。 IL-15中のIL-15シグナルペプチドは、高効率でのIL-15分泌を提供する強力なシグナルペプチドであるIL-2シグナルペプチド（リーダー配列）で置き換えられた。
複数のエンハンサーを備えたCAR
複数のエンハンサー（CAR super）を用いたCARの作製の例。図57、CARエンハンサーコンストラクトを示す概略図。コンストラクトは、P2AおよびT2Aペプチドそれぞれで連結されたCARとエンハンサーである4-1BBL (CD137L) とIL-15/IL-15sushiの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。P2AおよびT2Aペプチドが開裂した後、4-1BBLとIL-15/IL-15sushiを含むCARコンストラクトは、CARと4-1BBLタンパク質と分泌IL-15/IL-15sushiの全長に分かれる。 CARはリーダー配列とscFv、ヒンジ（H）領域、膜貫通ドメイン（TM）で構成される。 CARは共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖を持つ。4-1BBLは、CD28または4-1BBと、TまたはNK細胞の活性化または抗腫瘍活性の相乗効果を提供する（ただし、これらに限定されない）。コンストラクトの自己開裂ペプチドには、P2A、T2A、F2A、およびE2Aが含まれるが、これらに限定されない。コンストラクトの分泌エンハンサーはまた、IL-15 / IL-15sushi、IL-15、IL-21、IL-18、IL-7、およびIL-12を含み得るが、これらに限定されない。 IL-15 / IL-15sushiなどの分泌エンハンサーは、CAR TまたはNK細胞の増殖と持続性を強化する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
BCMA-CS1 compound CAR (BCMA-CS1 cCAR)
多発性骨髄腫（MM）は、形質細胞の異常に急速な増殖によって引き起こされる血液がんであり、米国のすべての血液がんの18％を占めている。MM治療の選択肢には、化学療法、コルチコステロイド療法、標的療法、幹細胞移植を伴う大量化学療法、生物学的療法、放射線療法、モノクローナル抗体、プロテアソーム阻害剤、および手術が含まれる。これらの利用可能な治療法を使用しても、MMの5年生存率は49.6％のままである。しかし、MMの治療法はなく、ほとんどすべての患者が治療後に再発する。
多発性骨髄腫における現在のCARテクノロジーでの取り組みには、James Kochenderfer（NIH）が率いる、バルク疾患に対してBCMA（CD269）を標的としたCART細胞の使用が含まれる。BCMA CAR治療後に寛解状態にある患者は最終的に再発するが、これは骨髄腫細胞の一部がBCMAに対してdim（弱い）または陰性の発現であるという事実による可能性がある。したがって、CARベースの治療での単一の標的では、骨髄腫の再発を防ぐのに十分ではない場合がある。CS1（SLAMF7）は、骨髄腫細胞での発現が一般的に高く均一であり、骨髄腫細胞の接着と腫瘍形成に関係しているため、骨髄腫のもう1つの優れた標的である。
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターで2つの別個のCARユニットを発現する単一のCAR T細胞が、複数の抗原を標的とし、腫瘍の再発を潜在的に回避するための新しいアプローチとして利用できることを含む。compound CAR（cCAR）は、CS1 CARに自己開裂型P2Aペプチドを介してリンクされたBCMA CARで、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現したを含む。
本開示において、驚くべきことに、このBCMA-CS1 cCAR (BC1cCAR)Ｔ細胞は、インビトロで強力かつ特異的な抗腫瘍活性を示し、インビボで有意な腫瘍成長を制御することを見出した。我々は、初めて、2ユニットの個別のCARがin vitroで両方の抗原を効果的に標的にでき、より包括的な臨床転帰に潜在的な影響を与えることを実証する。 BCMAとCS1の両方を組み合わせて標的とするcompound CARで、多発性骨髄腫を標的にすることが非常に強力な戦略であることは予想外である。この新しいアプローチは、compound設計での組み合わせによるプレッシャーにより、単一CAR治療での選択圧に起因する抗原エスケープ（単一抗原の喪失）を回避する。
BCMA（B細胞成熟抗原）およびCS1（SLAMF7）は、骨髄腫症例の大部分で。いずれかまたは両方を表面抗原のとして発現し、これらの抗原には造血幹細胞が含まれていないため、compound CARのターゲットとして選択されることが好ましい。形質細胞に広く発現している2つの異なるターゲットBCMAとCS1を使用すると、カバレッジが向上し、抗原の逃避を防ぐこで癌細胞を効果的に根絶することができる。
本開示では、驚くべきことに、BCMA CARに対し、CS1の追加により、生き残ったBCMA-CS1+骨髄腫細胞を排除して再発のリスクを低減することにより、抗腫瘍応答が増強された。BCMAとCS1（CD319）は両方ともMM細胞で広く発現されており、この高発現により、BCMA-CS1 cCARは潜在的にすべての癌細胞を包括的にカバーできる。これにより、耐性が発現する前に複数の標的を同時に強く叩くことにより、癌細胞をより完全に排除して抗原の逃避を減らすことができる。
一実施形態では、BCMA-CS1向けのBCMA-CS1cCAR (BC1cCAR)療法は、骨髄移植（BMT）または大量化学療法とBMTとの組み合わせの「ブリッジ」である。 BCMA-CS1 cCARは、以前は残存疾患を抱えていた多くの患者に、治癒の可能性のあるBMTオプションへの道を提供できる。現在の文献では、微小残存病変量（MRD）を検出できないレベルに減らすことは、患者の転帰の改善に関連する可能性があるという考えが支持されている。これは、治療が困難で非常に攻撃的な悪性腫瘍の再発防止という点で非常に有益である。
別の実施形態では、BCMA-CS1 cCAR療法は、移植前に疾患の負担を可能な限り低いレベルに下げるか、MRDを完全に排除することができ、再発率が低下し、長期無病生存率が増加することが期待でき、そして患者の転帰は劇的に改善される。
一実施形態では、BCMA-CS1 cCAR療法は、骨髄移植への架け橋を越えたBCMA+および／またはCS1+多発性骨髄腫の患者にさらなる用途を有することができる。単独療法としての、または患者個別の免疫化学療法レジメンの一部としてのBCMA-CS1cCAR療法。高齢患者、または非常に強力な化学療法やBMTに耐えられない併存疾患のある患者にとって、これは患者の生存期間を延長し、より良い生活の質を確保するための有望な戦略かもしれない。
いくつかの実施形態では、BCMA-CS1cCAR T細胞療法は、化学療法の補足として、「移植への架け橋」、または多発性骨髄腫患者の単独療法として開発することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、BCMAまたはCS1抗原またはその両方を発現する細胞を標的とするcompound CARポリペプチド改変細胞を提供する。標的細胞 は、リンパ腫、白血病、形質細胞新生物など、ただしこれらに限定されない、癌細胞であってもよい。さらなる実施形態において、形質細胞新生物は、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、重鎖疾患、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、孤発性骨性形質細胞腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（MGUS）およびくすぶり多発性骨髄腫から選択される。
IL-15 / IL-15sushiとcCARの共発現が、標的がん細胞のCARでの認識の感度を高めるか、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすことができることを見つけ驚いた。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushiアンカーまたは4-1BBLとBCMA-CS1 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとBCMA-CS1 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
一実施形態では、操作された細胞は、BCMA-CS1 cCARポリペプチドおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号42）、および対応するヌクレオチド（配列番号43）を含む。
BCMA1-BCMA2 compound CAR (BCMA1-BCMA2 cCAR) (図 38)
ほとんどのB-ALLの初期寛解は、CD19 CAR T治療で見られるが、エピトープ消失を伴う再発は、レスポンダーの10％～20％で発生する。
多発性骨髄腫における現在のCARテクノロジーでの取り組みには、James Kochenderfer（NIH）が率いる、多発性骨髄腫に対してBCMA（CD269）を標的としたCART細胞の使用が含まれる。BCMA CAR治療後に寛解状態にある患者は最終的に再発するが、これは骨髄腫細胞の一部がBCMAに対してdim（弱い）または陰性の発現であるという事実による可能性がある。さらに、患者の多発性骨髄腫細胞を排除するための、単一のCARでの効力の問題でもある。したがって、単一の標的でのCARベースの治療では、骨髄腫の再発を防ぐのに十分ではない場合がある。
一実施形態では、抗体認識ドメインは、モノクローナル抗体の結合可変領域、単鎖断片可変（scFv）を含む。scFvには、1つの軽鎖抗体と重鎖抗体が含まれている。特定の実施形態では、抗原認識ドメインは2つの異なる重鎖ドメイン（VHH）から構成される。各重鎖ドメインは、同じ抗原または異なる抗原の異なるエピトープに結合する。 VHH抗体は、抗体全体よりも安定で堅牢である。
いくつかの実施形態では、compound CARは同じ抗原を標的とする。たとえば、cCARは異なるエピトープまたは単一の抗原の一部を標的とする。いくつかの実施形態では、compound CARに存在するCARユニットのそれぞれは、同じ抗原であるが異なる位置に特異的な異なるエピトープを標的とする。
いくつかの実施形態では、compound CARは、1つの抗原上の異なるエピトープを標的とする。
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを持つベクターで、2つの個別のCARユニットを発現する単一のCAR T細胞が、1つの抗原上の異なるエピトープを標的とし、腫瘍エピトープのスキッピングまたはエピトープの喪失またはエピトープの逃避を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できることを含む。compound cCAR（BCMA1-BCMA2 cCAR）は、自己開裂P2Aペプチドを介して別のBCMA CAR（BCMA2 CAR）にリンクされた1つのBCMA CAR（BCMA1 CAR）で構成され、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。 cCARの両方のCARユニットは、同じ抗原BCMAを標的とする。
一実施形態では、操作された細胞は、ＢＣＭＡ抗原認識エピトープを有する第１キメラ抗原受容体ポリペプチドと、異なるＢＣＭＡ認識エピトープを有する第２キメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。この実施例では、この操作された細胞は、配列番号3のポリペプチドと配列番号4に対応するポリヌクレオチドを含む。
本開示において、驚くべきことに、このBCMA1-BCMA2 cCAR T細胞は、in vitroで強力かつ特異的な抗腫瘍活性を示し、in vivoで有意な腫瘍成長を制御することが見出された。我々は、初めて、2ユニットの個別のCARがin vitroで1つの抗原、BCMAの両方の異なるエピトープを効果的に標的にすることができ、より包括的な臨床転帰に潜在的な影響があることを示す。異なるエピトープを組み合わせて標的とするcompound CARで、多発性骨髄腫を標的とすることが非常に強力な戦略であることは予想外である。この新しいアプローチは、compound設計での組み合わせによるプレッシャーにより、単一CAR治療での選択圧に起因する抗原エスケープ（単一抗原の喪失または抗原のスキッピング）を回避する。
この開示において、驚くべきことに、BCMA CARに対し、エピトープの追加は、抗腫瘍応答を増強し、BCMAエピトープの喪失による多発性骨髄腫の再発のリスクを低減することが見出された。
一実施形態では、BCMA1-BCMA2向けの療法は、骨髄移植（BMT）または大量化学療法とBMTとの組み合わせの「ブリッジ」である。 BCMA1-BCMA2 cCARは、BCMA抗原への認識感度を高めることができ、以前は残存疾患を抱えていた多くの患者に、治癒の可能性のあるBMTオプションへの道を提供できる。現在の文献では、微小残存病変量（MRD）を検出できないレベルに減らすことは、患者の転帰の改善に関連する可能性があるという考えが支持されている。これは、治療が困難で非常に攻撃的な悪性腫瘍の再発防止という点で非常に有益である。
別の実施形態では、BCMA1-BCMA2 cCAR療法は、移植前に疾患の負担を可能な限り低いレベルに下げるか、MRDを完全に排除することができ、再発率が低下し、長期無病生存率が増加することが期待でき、そして患者の転帰は劇的に改善される。
いくつかの実施形態では、本開示は、BCMA抗原の2つの異なるエピトープを標的とするcompound CARポリペプチド改変細胞を提供する。標的細胞 は、リンパ腫、白血病、形質細胞新生物など、ただしこれらに限定されない、癌細胞であってもよい。さらなる実施形態において、形質細胞新生物は、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、重鎖疾患、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、孤発性骨性形質細胞腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（MGUS）およびくすぶり多発性骨髄腫から選択される。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushi またはIL-15 / IL-15sushiアンカーあるいは4-1BBLとBCMA1-BCMA2 cCARとの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとBCMA1-BCMA2 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
CD123-CD33 compound CAR (CD123-CD33 cCAR)
CARでの成功をAMLへ転換するには、疾患に固有の特性を慎重に理解する必要がある。AMLの特徴は芽球細胞の存在であり、これは非常に攻撃的で急速に分裂する細胞であり、疾患の大部分を形成する。B細胞悪性腫瘍とは異なり、AMLは白血病幹細胞（LSCs）の役割により、治療が非常に困難である。LSCsは、造血器悪性腫瘍を開始および維持できる造血幹細胞のマーカー（CD34 + CD38-）を発現する細胞集団であり、健康な骨髄を追い越すクローン細胞集団を生成する。LSCsはほとんど細胞周期の静止期にあるため、急速に分裂する腫瘍集団に対する化学療法はLSCsに影響を与えない。ほとんどの場合、最小限の残存病変（MRD）を含む、このとらえどころのない集団であり、AML治療後の避けられない再発の原因となっている。疾患を完全に排除し、再発しないようにするための、CAR療法をAMLへ移植することは、バルク白血病疾患だけでなく白血病幹細胞も根絶することができる慎重な抗原選択が必要である。
CARとCARの相互作用を引き起こすことなく、CD33 +とCD123 +の両方の細胞を除去するCD123-CD33 cCARが期待されている。この場合の便利な例えとして、AMLを葉と根を持つ癌の木と考えることである。葉は病気の大部分/過半数を占めているが（これらはCD33 + AML芽細胞である）、これらの葉をトリミングしても、根（これらはCD123 + CD34 + CD38- LSC）から木を抜かない限り、気のさらに成長を妨げられない。319人のAML患者の研究では、症例の87.8％がCD33を発現していたため、そのため、CD33をターゲットにすると、ほとんどの白血病細胞が標的になる可能性がある。しかし、カリケアマイシン結合した抗CD33抗体療法であるゲムツズマブオゾガマイシンで治療された患者は、おそらくカリケアマイシンに対する後天性の化学療法抵抗性のためにCD33 + AMLで再発した。したがって、CD33を標的とすることで疾患の大部分が排除される一方で、化学療法抵抗性LSCsも標的にする必要がある、そうしないと、再発が起きる。これは、健康な造血幹細胞と比較してCD34 + CD38- LSCsで過剰発現しているCD123を標的とすることで達成できる。AML症例の97.2％が2つのターゲットの少なくとも1つを発現していることを考慮すると、CD123とCD33の両方をターゲットにすると、大多数の患者のすべてのがん細胞が排除され、治療効果が高まり、癌の木が引き抜かれる。
AMLは急速に進行する血液がんで、急性小児白血病の約15～20％、急性成人白血病の80％を占めている。患者は、現在でも潜在的に高用量の多剤併用化学療法によって治療され、そして造血幹細胞移植が続く。このような集中的な治療にもかかわらず、多くの場合、かなりの毒性や死に至ることもあるにもかかわらず、AML患者の約60～70％は、後天性の治療抵抗性またはLSCの再出現により依然として再発する。さらに、AMLからの5年間の生存率は27％にとどまっている。ただし、AMの治療にCARを使用しようとする臨床試験は限られている。
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターにおいて2つの別個のCARユニットを発現する単一のCAR T細胞が、複数の抗原を標的とし、腫瘍再発を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できることを含む。compound CAR（cCAR）はCD33 CARに自己開裂型P2Aペプチドを介してリンクされたCD123 CARで、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現したものを含む。
本開示において、驚くべきことに、このCD123-CD33 cCAR Ｔ細胞は、インビトロで強力かつ特異的な抗腫瘍活性を示し、インビボで有意な腫瘍成長を制御することを見出した。我々は、初めて、2ユニットの個別のCARがin vitroで両方の抗原を効果的に標的にでき、より包括的な臨床転帰に潜在的な影響を与えることを実証する。CD123とCd33の両方を組み合わせてターゲティングするcompound CARでAMLをターゲティングすることは、非常に強力な戦略であることは予想外である。この新しいアプローチは、LSCsに関連する疾患の再発を回避し、compound設計での組み合わせによるプレッシャーにより、単一CAR治療での選択圧に起因する抗原エスケープ（単一抗原の喪失）を回避する。
本開示において、驚くべきことに、CD33 CARに対しCD123の追加は、白血病芽球およびその根であるLSCsの両方を排除して再発のリスクを低減することにより、抗腫瘍応答を増強した。これにより、ゆっくりと成長するLSCsと増殖性白血病細胞の両方を削除することにより、癌細胞をより完全に排除して疾患の再発を減らすことができる。
本開示において、驚くべきことに、CD123-CD33 cCAR T細胞は、通常の白血病細胞および白血病前駆細胞を排除して再発のリスクを低減し、抗腫瘍活性を高めることができることが見出された。
この開示において、驚くべきことに、CD123-CD33 cCAR T細胞は、 抵抗性が発生する前に複数の標的を同時に強く叩くことにより、抗原逃避を減らし、癌細胞のより完全な除去を示す。
一実施形態では、CD123-CD33cCAR T細胞療法は、「移植への架け橋」、化学療法の補足、またはチェックポイント遮断（PD-L1、CTLA-4阻害剤を含むが、これらに限定されない）あるいは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病および慢性骨髄増殖性障害を含むがこれらに限定されない病気の患者に対する単独療法として展開することができる。
別の実施形態では、CD123-CD33cCAR T細胞療法は、移植前に疾患の負担を可能な限り低いレベルに下げるか、MRDを完全に排除することができ、再発率が低下し、長期無病生存率が増加することが期待でき、そして患者の転帰は劇的に改善される。
一実施形態では、CD123-CD33cCAR T細胞療法は、骨髄移植への架け橋を越えCd123+および／またはCD33+多発性骨髄腫の患者にさらなる用途を有することができる。単独療法としての、または患者個別の免疫化学療法レジメンの一部としてのCD123-CD33cCAR T細胞療法。高齢患者、または非常に強力な化学療法やBMTに耐えられない併存疾患のある患者にとって、これは患者の生存期間を延長し、より良い生活の質を確保するための有望な戦略かもしれない。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushi またはIL-15 / IL-15sushiアンカーあるいは4-1BBLとCD123-CD33 cCARとの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとCD123-CD33 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
一実施形態では、操作された細胞は、CD123-CD33 cCARポリペプチドおよびIL-15/IL-15sushi（配列番号34）、および対応するヌクレオチド（配列番号35）を含む。
CLL-1-CD33 compound CAR (CLL-1-CD33 cCAR)
cCARには、CLL-1とCD33をそれぞれ発現する腫瘍細胞を標的とするCLL-1CARとCD33 CARの2つのユニットのCARが含まれている。図９２に示されるcCARのバージョンの構築にCD33b CARおよびCLL-1 CARを使用した。コンストラクトは、Ｐ２Ａペプチドにより連結されたＣＡＲの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するＳＦＦＶプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、cCARは分かれ、CD33とCLL-1を発現する標的に関与する。コンストラクトの活性化ドメインには、CD33b（CD33）CARユニット上の4-1BBおよびCLL-1 CARユニット上のCD28が含まれている。このCD33b-CLL-1 cCARは、白血病幹細胞を含む骨髄性白血病細胞を削除するために設計された。
現在、MDS、MPN（慢性骨髄増殖性新生物）およびAMLの治療法は白血病芽細胞に焦点を当てている、なぜなら、これらは非常に豊富であり、患者にとって最も差し迫った問題を明確に表しているからである。重要なことに、白血病幹細胞（LSCs）は、他の白血病細胞（「芽球」細胞）の大部分とはかなり異なり、それらはまれな亜集団を構成する。芽球細胞を死滅させることで短期間の救済となるが 、LSCsを破壊しなければ 、常に再成長し、患者の病気は再発する。 MDS疾患の恒久的な治癒を達成するためには、LSCsを破壊することが不可欠である。残念なことに、標準的な薬物レジメンは、MDSまたはMPNまたはAML のLSCsに対して効果的はない。したがって、白血病幹細胞集団および巨大な白血病集団の両方を特異的に標的とすることができる新しい治療法を開発することが重要である。本発明で開示されるcompound CARは、これらの集団の両方を標的とし、本明細書に具体的に記載している。
本開示の一態様では、CLL-1抗原は、cCAR療法での標的の１つである。 C型レクチン様1（CLL-1）は、MICL、CLEC12A、CLEC-1およびDCAL2としても知られている。 CLL-1は糖タンパク質受容体であり、造血細胞で発現している。 CLL-1は、コミットされていないCD34 + / CD38-またはCD34 + / CD33-幹細胞には存在しないが、CD34 + / CD38 +またはCD34 + / CD33 +前駆細胞のサブセットに存在する（Bakker et al、2004）。さらに、CLL-1は他の組織では発現していない。
CLL-1発現は、急性骨髄性白血病（AML）の芽球および白血病幹細胞で見られる。 CLL-1は、骨髄単球性白血病（M4）、急性単球性白血病（M5）、急性前骨髄球性白血病（M3）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄増殖性腫瘍および骨髄異形成症候群（MDS）を含むさまざまな白血病で発現している。
CLL-1は、白血病幹細胞（LSCs）に関連する白血病細胞のサブセットに発現し、その除去は疾患の不応性と再発の予防に不可欠である。
CD33（Siglec-3）は、初期の骨髄前駆細胞、ほとんどの単球細胞、およびAML芽球の約90％に発現しているが、正常なHSCには存在しない骨髄系統特異的抗原である。
本開示の一態様では、CD33抗原はcCAR療法の標的の1つである。 CD33は、急性骨髄性白血病の悪性細胞の90％に発現する膜貫通受容体である。したがって、本開示によれば、CLL-1およびCD33標的抗原は、安全性の観点から特に魅力的である。
本開示によれば、compound CLL-1-CD33は、慢性骨髄性白血病（CML）集団の治療に非常に効果的であり得る。慢性骨髄性白血病（CML）には、CD34 + CD38-である細胞のレアなサブセットがある。この集団はLSCsで構成されていると見なされる。 LSCsの数の増加は、疾患の進行に関連している。低分子Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）は、CP-CML患者の全生存期間を大幅に改善することが示されている。ただし、LSCsはTKI療法に耐性があると考えられている。 CMLの治療には、CML耐性LSCsを標的とする新規療法が緊急に必要であり、新規療法は、本開示で開示されるcompound CD33CLL-1 CARで具体化される。CLL-1の発現は、CD34 + CD38-集団で高くなっている。本開示によれば、compoundCD33CLL-1 CARは、この集団の治療的処置に非常に効果的である。
本開示の一実施形態では、cCARにおいてCD33およびCLL-1の両方を発現する白血病細胞が治療的処置として使用される。 CD33は、骨髄系、骨髄性白血病芽球、および成熟単球の細胞に発現しているが、正常な多能性造血幹細胞には発現していない。 CD33は、CML、骨髄増殖性腫瘍、およびMDSの白血病細胞で広く発現している。
急性骨髄性白血病（AML）のかなりの数の患者が標準的な化学療法レジメンに抵抗性であるか、治療後に疾患の再発を経験するため（Burnett 2012）、AMLに対するCAR T細胞免疫療法の開発は、巨大な臨床的ニーズに対応する可能性を秘めている。これらの患者の大部分では、白血病細胞はCLL-1とCD33の両方を発現し、本明細書に開示されているcompound CLL-1-CD33 cCARに幅広い臨床適用性を与えている。したがって、本開示は、複数の白血病関連抗原を標的とする複数のCARを含む新規の複数のcCAR T / NK細胞コンストラクトを開示し、それにより、共刺激ドメイン活性化の相乗効果により、白血病幹細胞を含む白血病細胞を標的とする抗原エスケープのメカニズムを相殺し、それにより、より強力で安全かつ効果的な治療を提供する。
さらなる実施形態では、本開示は、CLL-1もしくはCD33、またはその両方を発現する白血病幹細胞（LSCs）またはバルク白血病細胞の根絶または殺傷方法を提供する。この実施形態では、CD33ユニットおよびCLL-1ユニットを有するＴまたはＮＫ操作細胞が、それを必要とする患者に投与される。
さらなる実施形態では、ＴまたはＮＫ細胞中のcompound CARを使用して、CLL-1またはCD33または両方を発現するCD34+ CD38-白血病幹細胞またはバルク白血病細胞を根絶または殺傷することができる。
本開示はさらに、標的抗原を共発現する細胞に対する抗腫瘍活性が増強された効力を有するcompound CARコンストラクトを開示するが、1つの抗原のみを発現する腫瘍細胞に対する感受性も保持する。さらに、compound CARの各CARは1つまたは2つの共刺激ドメインを含み、特定の標的の存在下で強力な殺傷能力を示す。
本開示において、驚くべきことに、CLL-1-CD33 cCAR T細胞は、通常の白血病細胞および白血病前駆細胞を排除して再発のリスクを低減し、抗腫瘍活性を高めることができることが見出された。
この開示において、驚くべきことに、CLL-1-CD33 cCAR T細胞は、 抵抗性が発生する前に複数の標的を同時に強く叩くことにより、抗原逃避を減らし、癌細胞のより完全な除去を示す。
一実施形態では、CLL-1-CD33 cCAR T細胞療法は、「移植への架け橋」、化学療法の補足、またはチェックポイント遮断（PD-L1、CTLA-4阻害剤を含むが、これらに限定されない）あるいは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病および慢性骨髄増殖性障害を含むがこれらに限定されない病気の患者に対する単独療法として展開することができる。
別の実施形態では、CLL-1-CD33cCAR T細胞療法は、移植前に疾患の負担を可能な限り低いレベルに下げるか、MRDを完全に排除することができ、再発率が低下し、長期無病生存率が増加することが期待でき、そして患者の転帰は劇的に改善される。
一実施形態では、CLL-1-CD33 cCAR T細胞療法は、骨髄移植への架け橋を越え、CLL-1+および／またはCD33+多発性骨髄腫の患者にさらなる用途を有することができる。単独療法としての、または患者個別の免疫化学療法レジメンの一部としてのCLL-1-CD33cCAR T細胞療法。高齢患者、または非常に強力な化学療法やBMTに耐えられない併存疾患のある患者にとって、これは患者の生存期間を延長し、より良い生活の質を確保するための有望な戦略かもしれない。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushi またはIL-15 / IL-15sushiアンカーあるいは4-1BBLとCLL-1-CD33 cCARとの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとCLL-1-CD33 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
一実施形態では、操作された細胞は、CLL1-CD33 cCARポリペプチドおよびIL-15/IL-15sushi（配列番号６０）、および対応するヌクレオチド（配列番号６１）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CLL-1 CARポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15/IL-15sushi（配列番号４４）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号４５）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD33 CARポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号20）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号21）を含む。
CD123-NKG2D cCAR または CLL-1-NKG2D cCAR または CD33-NKG2D cCAR またはBCMA-NKG2D cCAR
NKG2D（NKG2D受容体）は、C型レクチン様受容体のCD94 / NKG2ファミリーに属する膜貫通タンパク質と考えられている。 NKG2Dは、AML、多発性骨髄腫、またはその他の白血病で自然に発現する少なくとも8つの異なるリガンドに結合できる。NKG2Dリガンドは誘導された自己タンパク質で、正常細胞の表面にはほとんど存在しないか非常に低いレベルでしか存在しないが、AMLや多発性骨髄腫などの癌細胞で過剰発現している。したがって、これらはCARターゲティングでの優れた候補である。
cCARには、それぞれCD123およびNKG2Dリガンドを発現している腫瘍細胞を標的とする2つのユニットのCAR、CD123 CARおよびNKG2D CARが含まれている。
cCARには、CLL-1およびNKG2Dリガンドをそれぞれ発現する腫瘍細胞を標的とするCLL-1 CARおよびNKG2D CARの2つのユニットのCARが含まれている。
CD123-NKG2D cCARまたはCLL-1-NKG2D cCARまたはCD33-NKG2D cCARは、AML、MDS、CML、MPNなどの白血病を排除できる。
本開示において、BCMA-NKG2D cCARは多発性骨髄腫を排除することができる。
本開示では、NKG2DはAML、MDS、 CMLおよびMPNで広く発現しているため、CD123 CARまたはCLL-1 CARまたはCD33 CARに対しNKG2Dの追加は、抗腫瘍反応を強化し、疾患再発に関連する抗原逃避のリスクを低減する。
BCMAおよびNKG2Dリガンドは両方とも多発性骨髄腫細胞で広く発現しており、この高発現により、BCMA-NKG2D cCARは潜在的にすべての癌細胞を包括的にカバーできる。これにより、耐性が発現する前に複数の標的を同時に強く叩くことにより、癌細胞をより完全に排除して抗原の逃避を減らすことができる。
BCMA-CD38 compound CAR (BCMA-CD38 cCAR)
多発性骨髄腫における現在のCARテクノロジーでの取り組みには、James Kochenderfer（NIH）が率いる、バルク疾患に対してBCMA（CD269）を標的としたCART細胞の使用が含まれる。BCMA CAR治療後に寛解状態にある患者は最終的に再発するが、これは骨髄腫細胞の一部がBCMAに対してdim（弱い）または陰性の発現であるという事実による可能性がある。したがって、単一の標的でのCARベースの治療では、骨髄腫の再発を防ぐのに十分ではない場合がある。
サイクリックADPリボースヒドロラーゼとしても知られるCD38は、CD4 +、CD8 +、Bリンパ球、形質細胞、ナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞の表面に存在する糖タンパク質である。
CD38は、骨髄腫細胞およびリンパ腫細胞で発現が一般的に高く均一であるため、骨髄腫のもう1つの優れた標的である。
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターで2つの別個のCARユニットを発現する単一のCAR T細胞が、複数の抗原を標的とし、腫瘍の再発を潜在的に回避するための新しいアプローチとして利用できることを含む。compound CAR（cCAR）は、CD38 CARに自己開裂型P2Aペプチドを介してリンクされたBCMA CARで、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現したを含む。このcompound cCARの発現は、強力なプロモーターSFFVによって制御され、適切なCARの発現を確保する。
本開示において、BCMA-CD38 cCAR T細胞は、骨髄腫の制御において強力かつ特異的な抗腫瘍活性を提供できる（図37）。BCMAとCD38の両方を組み合わせてターゲティングするcompound CARで多発性骨髄腫を標的にすることは、非常に強力な戦略である。この新しいアプローチは、compound設計での組み合わせによるプレッシャーにより、単一CAR治療での選択圧に起因する抗原エスケープ（単一抗原の喪失）を回避する。
この開示において、BCMA CARに対しCD38の追加は、生存するBCMA-CD38 +骨髄腫細胞を排除して再発のリスクを低減することにより抗腫瘍応答を増強した。
BCMAおよびCD38は両方とも多発性骨髄腫細胞で広く発現しており、この高発現により、BCMA-CD38 cCARは潜在的にすべての癌細胞を包括的にカバーできる。これにより、耐性が発現する前に複数の標的を同時に強く叩くことにより、癌細胞をより完全に排除して抗原の逃避を減らすことができる。
一実施形態では、BCMA-CD38向けのBCMA-CD38 cCAR療法は、骨髄移植（BMT）または大量化学療法とBMTとの組み合わせの「ブリッジ」である。 BCMA-CD38 cCARは、以前は残存疾患を抱えていた多くの患者に、治癒の可能性のあるBMTオプションへの道を提供できる。現在の文献では、微小残存病変量（MRD）を検出できないレベルに減らすことは、患者の転帰の改善に関連する可能性があるという考えが支持されている。これは、治療が困難で非常に攻撃的な悪性腫瘍の再発防止という点で非常に有益である。
別の実施形態では、BCMA-CD38 cCAR療法は、移植前に疾患の負担を可能な限り低いレベルに下げるか、MRDを完全に排除することができ、再発率が低下し、長期無病生存率が増加することが期待でき、そして患者の転帰は劇的に改善される。
一実施形態では、BCMA-CD38 cCAR療法は、骨髄移植への架け橋を越えたBCMA+および／またはCD38+多発性骨髄腫の患者にさらなる用途を有することができる。単独療法としての、または患者個別の免疫化学療法レジメンの一部としてのBCMA-CD38 cCAR療法。高齢患者、または非常に強力な化学療法やBMTに耐えられない併存疾患のある患者にとって、これは患者の生存期間を延長し、より良い生活の質を確保するための有望な戦略かもしれない。
いくつかの実施形態では、本開示は、BCMAまたはCD38抗原またはその両方を発現する細胞を標的とするcompound CARポリペプチド改変細胞を提供する。標的細胞 は、リンパ腫、白血病、形質細胞新生物など、ただしこれらに限定されない、癌細胞であってもよい。さらなる実施形態において、形質細胞新生物は、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、重鎖疾患、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、孤発性骨性形質細胞腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（MGUS）およびくすぶり多発性骨髄腫から選択される。
IL-15 / IL-15sushiまたはIL-15 / IL-15sushiアンカーまたは4-1BBLとBCMA-CD38 cCARの共発現により、標的がん細胞のCARでの認識の感度を高めるか、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすことができることを見つけ驚いた。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとBCMA-CD38 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
一実施形態では、操作された細胞は、BCMA-CD38 cCARポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号40）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号41）を含む。
理論に拘泥するものではないが、BCMA-CD38 compound CAR操作細胞は、自己免疫障害または自己免疫障害に関連するB細胞と形質細胞の枯渇による臓器拒絶に苦しむ患者に、より良い治療結果をもたらすと考えられている。
いくつかの実施形態では、compound CAR (BCMA-CD38 cCAR) はBCMAまたはCD38抗原またはその両方を発現する細胞を標的とする。標的細胞 は、リンパ腫、白血病、形質細胞新生物など、ただしこれらに限定されない、癌細胞であってもよい。さらなる実施形態において、形質細胞新生物は、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、重鎖疾患、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、孤発性骨性形質細胞腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（MGUS）およびくすぶり多発性骨髄腫から選択される。
BCMA-CD38 cCARの標的細胞は、B細胞、未熟B細胞、記憶B細胞、形質芽細胞、長命の形質細胞、または自己免疫疾患患者の形質細胞である。自己免疫疾患には、全身性強皮症、多発性硬化症、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患（クローン病や潰瘍性大腸炎など）、全身性エリテマトーデス、血管炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性筋炎、肺胞タンパク症、肉芽腫症および血管炎、アジソン病、抗原抗体複合体媒介疾患、および抗糸球体基底膜疾患が挙げられる。
別の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。自己免疫疾患は全身性狼瘡を含むエリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ、シェ ーグレン症候群、皮膚筋症、自己免疫性溶血性貧血、視神経脊髄炎（NMO）、NMOスペクトラ ム障害（NMOSD）、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、全身性自己免疫性の小血管血管炎症候群または顕微鏡的多発血管炎（MPA）に関連する抗好中球細胞質自己抗体（ANCAs）、多発血管炎を伴う肉芽腫症（GPA、ウェゲナー肉芽腫症）、 尋常性天疱瘡（PV）および落葉状天疱瘡（PF）を含む自己免疫疾患を含む疾患のグループから選択される。尋常性天疱瘡（PV）および落葉状天疱瘡（PF）は、自己抗体によって引き起こされる慢性で生命を脅かす水疱性疾患である。
Compound CD123-CLL-1
B細胞および形質細胞の悪性腫瘍とは異なり、AMLは白血病幹細胞（LSCs）の役割により、治療が非常に困難である。LSCsは、造血器悪性腫瘍を開始および維持できる造血幹細胞のマーカー（CD34 + CD38-）を発現する細胞集団であり、健康な骨髄を追い越すクローン細胞集団を生成する。LSCsはほとんど細胞周期の静止期にあるため、急速に分裂する腫瘍集団に対する化学療法はLSCsに影響を与えない。ほとんどの場合、最小限の残存病変（MRD）を含む、このとらえどころのない集団であり、AML治療後の避けられない再発の原因となっている。疾患を完全に排除し、再発しないようにするための、CAR療法をAMLへ移植することは、バルク白血病疾患だけでなく白血病幹細胞も根絶することができる慎重な抗原選択が必要である。
単一CAR療法は最近、以前は難治性で再発したB細胞悪性腫瘍の治療において高い寛解率を達成することでブレークスルーをもたらした。逆に、AMLの新しい治療アプローチは不足しており、CAR療法は希望の光を提供する。特に、AMLへのcompound CAR療法の適用は、その治療法を完全に変える可能性がある。
CD123およびC型レクチン様分子-1（CLL-1）は、AML患者の大部分のAML CD34 + CD38-細胞に存在する。理論に拘泥するものではないが、compound CARは、2つの別々のCARユニットをコードする単一のT細胞がLSCsを同時に、より広範囲に標的および根絶し、疾患の再発を防ぐことができると考えられている。
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターにおいて2つの別個のCARユニットを発現する単一のCAR T細胞が、複数の抗原を標的とし、腫瘍再発を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できることを含む。compound CAR（cCAR）はCLL-1 CARに自己開裂型P2Aペプチドを介してリンクされたCD123 CARで、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現したものを含む。
一実施形態では、CD123-CLL-1 cCAR T細胞療法は、「移植への架け橋」、化学療法の補足、またはチェックポイント遮断（PD-L1、CTLA-4阻害剤を含むが、これらに限定されない）あるいは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病および慢性骨髄増殖性障害を含むがこれらに限定されない病気の患者に対する単独療法として展開することができる。
別の実施形態では、CD123-CLL-1 cCAR T細胞療法を使用して、MRDを完全に排除することができる。再発率が低下し、長期の無病生存率が増加し、患者の転帰が劇的に改善されることが期待できる。
一実施形態では、CD123-CLL1 cCAR T細胞療法は、骨髄移植への架け橋を越えたCD123+および／またはCLL-1+多発性骨髄腫の患者にさらなる用途を有することができる。単独療法としての、または患者個別の免疫化学療法レジメンの一部としてのCD123-CLL1 cCAR T細胞療法。高齢患者、または非常に強力な化学療法やBMTに耐えられない併存疾患のある患者にとって、これは患者の生存期間を延長し、より良い生活の質を確保するための有望な戦略かもしれない。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushi またはIL-15 / IL-15sushiアンカーあるいは4-1BBLとCD123-CDLL-1 cCARとの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとCD123-CLL-1 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
Compound CD38 CARs for T cell malignancies
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターにおいて2つの別個のCARユニットを発現する単一のCAR T細胞が、複数の抗原を標的とし、腫瘍再発を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できることを含む。CD38ベースのcompound CAR（cCAR）は、自己開裂P2Aペプチドを介してCD38 CARにリンクされたCD4 CARまたはCD5 CARまたはCD3 CARまたはCD7 CARを含み、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターにおいて2つの別個のCARユニットを発現する単一のNK細胞が、複数の抗原を標的とし、腫瘍再発を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できることを含む。CD38ベースのcompound CAR（cCAR）は、自己開裂P2Aペプチドを介してCD38 CARにリンクされたCD4 CARまたはCD5 CARまたはCD3 CARまたはCD7 CARを含み、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。
理論に拘泥するものではないが、CD38ベースのcompound cCAR TまたはNK細胞は、T細胞リンパ腫/白血病細胞を除去して、抗原エスケープによる再発のリスクを減らし、抗腫瘍活性を高めると考えられている。
CD4 CAR を含むCD4-CD38 compound CAR (cCAR)は、自己開裂P2Aペプチドを介してCD38 CARに連結され、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。
CD5 CAR を含むCD5-CD38 compound CAR (cCAR)は、自己開裂P2Aペプチドを介してCD38 CARに連結され、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。
一実施形態では、操作された細胞は、CD5-CD38キメラ抗原受容体ポリペプチド（配列番号１８）、および対応するヌクレオチド（配列番号１９）を含む。
CD4 CAR を含むCD7-CD38 compound CAR (cCAR)は、自己開裂P2Aペプチドを介してCD38 CARに連結され、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。
リンパ腫/白血病に対するCD56-CD38 CAR
CD56は糖タンパク質であり、神経細胞接着分子として機能する。抗原はNK細胞に発現している。CD56またはCD38は、1）攻撃性NK細胞白血病/リンパ腫、2）節外NK / Tリンパ腫（鼻型）、肝脾T細胞リンパ腫、および4）慢性NK細胞リンパ球増加症のほとんどの場合に通常存在する。
CD38と同様に、CD56は脳細胞などの非血液細胞でも発現している。オフターゲット効果は、CD56またはCD38 CAR T細胞のみを投与した患者にとっては深刻である。
理論に拘泥するものではないが、2つのCARを持ち、異なる抗原を標的とするcompound cCAR T細胞は、単一のcCARが標的とする抗原をもつ細胞よりも、cCARが標的とする2つの抗原を持つ細胞への結合親和性が高いと考えられている。結果として、compound cCAR T細胞は、単一のCAR T細胞よりも腫瘍へのトラフィッキング能力が高いと考えられている。したがって、驚くべきことに、出願人は、compound cCAR細胞ベースの治療が使用された場合、オフターゲット効果の懸念が大幅に減少することを発見した。
CD56は糖タンパク質であり、神経細胞接着分子として機能する。抗原はNK細胞に発現している。CD38と同様に、CD56は脳細胞などの非血液細胞でも発現している。オフターゲット効果は、CD56またはCD38 CAR T細胞のみを投与した患者にとっては深刻である。したがって、本発明の開示は、CD56 CARまたはCD38 CARを単独で使用することに伴うオフターゲット効果の懸念を軽減するためにCD56-CD38 cCARを作製する方法を提供する。
本発明は、CD56およびCD38を同時に標的とし、腫瘍再発を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できる独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターにおいて２つの別個のＣＡＲユニットを発現する単一Ｔ細胞からなる。CD56-CD38 compound CAR (cCAR)は、自己開裂P2Aペプチドを介してCD38 CARにリンクされたCD56 CARを保持し、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。
本発明は、CD56およびCD38を同時に標的とし、腫瘍再発を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できる独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターにおいて２つの別個のＣＡＲユニットを発現する単一Ｔ細胞からなる。CD56-CD38 compound CAR (cCAR)は、自己開裂P2Aペプチドを介してCD38 CARにリンクされたCD56 CARを保持し、NK細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現する。
CD19-CD38 compound CAR (CD19-CD38 cCAR)
CD19CARを用いたB-ALLでの治療は、初期寛解率は約90％であるが、これらのほとんどは1年以内に再発する。再発は、少なくとも部分的には抗原エスケープによるものである。したがって、再発を防止するためのより効果的なCAR T細胞療法が緊急に必要とされている。
CD38は、リンパ腫細胞で発現が一般的に高く均一であるため、リンパ腫のもう1つの優れた標的である。CD38は、慢性リンパ球性リンパ腫/小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫を含むさまざまなリンパ腫で発現している。
本開示は、独立したシグナル伝達ドメインを有するベクターにおいて2つの別個のCARユニットを発現する単一のCAR T細胞が、複数の抗原を標的とし、腫瘍再発を潜在的に回避するための新規アプローチとして利用できることを含む。compound CAR（cCAR）はCD38 CARに自己開裂型P2Aペプチドを介してリンクされたCD19 CARで、T細胞の表面に両方の機能性CAR分子を発現したものを含む。このcompound cCARの発現は、強力なプロモーターSFFVによって制御され、適切なCARの発現を確保する。
本開示において、CD19-CD38 cCAR T細胞は、リンパ腫の制御において強力かつ特異的な抗腫瘍活性を提供し得る。 BCMAとCD19の両方を組み合わせて標的とするcompound CARで多発性骨髄腫を標的にすることは、非常に強力な戦略である。この新しいアプローチは、compound設計での組み合わせによるプレッシャーにより、単一CAR治療での選択圧に起因する抗原エスケープ（単一抗原の喪失）を回避する。
本開示では、BCMA CARに対しCD38の追加は、生存するBCMA-CD38 +リンパ腫を排除して再発のリスクを低減することにより、抗腫瘍応答を強化した。
CD19およびCD38は両方とも多発性骨髄腫細胞で広く発現しており、この高発現により、CD19-CD38 cCARは潜在的にすべてのリンパ腫細胞を包括的にカバーできる。これにより、耐性が発現する前に複数の標的を同時に強く叩くことにより、癌細胞をより完全に排除して抗原の逃避を減らすことができる。
一実施形態では、CD19-CD38向けのBCMA-CD38 cCAR療法は、骨髄移植（BMT）または大量化学療法とBMTとの組み合わせの「ブリッジ」である。 CD19-CD38 cCARは、以前は残存疾患を抱えていた多くの患者に、治癒の可能性のあるBMTオプションへの道を提供できる。現在の文献では、微小残存病変量（MRD）を検出できないレベルに減らすことは、患者の転帰の改善に関連する可能性があるという考えが支持されている。これは、治療が困難で非常に攻撃的な悪性腫瘍の再発防止という点で非常に有益である。
別の実施形態では、CD19-CD38 cCAR療法は、移植前に疾患の負担を可能な限り低いレベルに下げるか、MRDを完全に排除することができ、再発率が低下し、長期無病生存率が増加することが期待でき、そして患者の転帰は劇的に改善される。
一実施形態では、CD19-CD38 cCAR療法は、骨髄移植への架け橋を越えたCD19+および／またはCD38+多発性骨髄腫の患者にさらなる用途を有することができる。単独療法としての、または患者個別の免疫化学療法レジメンの一部としてのCD19-CD38 cCAR療法。高齢患者、または非常に強力な化学療法やBMTに耐えられない併存疾患のある患者にとって、これは患者の生存期間を延長し、より良い生活の質を確保するための有望な戦略かもしれない。
いくつかの実施形態では、本開示は、CD19またはCD38抗原またはその両方を発現する細胞を標的とするcompound CARポリペプチド改変細胞を提供する。標的細胞はリンパ腫などのがん細胞である可能性があるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、リンパ腫は、B-ALL、高悪性度B細胞リンパ腫、低悪性度B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、CLL、辺縁帯B細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫から制限なく選択される。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushi またはIL-15 / IL-15sushiアンカーあるいは4-1BBLとCD19-CD38 cCARとの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとCD19-CD38 cCARの共発現は、標的癌細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または癌細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、CD19-CD38compound CAR操作細胞は、自己免疫障害または自己免疫障害に関連するB細胞と形質細胞の枯渇による臓器拒絶に苦しむ患者に、より良い治療結果をもたらすと考えられている。
いくつかの実施形態では、compound CAR (BCMA-CD38 cCAR) はBCMAまたはCD38抗原またはその両方を発現する細胞を標的とする。標的細胞 は、リンパ腫、白血病、形質細胞新生物など、ただしこれらに限定されない、癌細胞であってもよい。さらなる実施形態において、形質細胞新生物は、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、重鎖疾患、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、孤発性骨性形質細胞腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（MGUS）およびくすぶり多発性骨髄腫から選択される。
BCMA-CD38 cCARの標的細胞は、B細胞、未熟B細胞、記憶B細胞、形質芽細胞、長命の形質細胞、または自己免疫疾患患者の形質細胞である。自己免疫疾患には、全身性強皮症、多発性硬化症、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患（クローン病や潰瘍性大腸炎など）、全身性エリテマトーデス、血管炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性筋炎、肺胞タンパク症、肉芽腫症および血管炎、アジソン病、抗原抗体複合体媒介疾患、および抗糸球体基底膜疾患が挙げられる。
別の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。自己免疫疾患は全身性狼瘡を含むエリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ、シェ ーグレン症候群、皮膚筋症、自己免疫性溶血性貧血、視神経脊髄炎（NMO）、NMOスペクトラ ム障害（NMOSD）、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、全身性自己免疫性の小血管血管炎症候群または顕微鏡的多発血管炎（MPA）に関連する抗好中球細胞質自己抗体（ANCAs）、多発血管炎を伴う肉芽腫症（GPA、ウェゲナー肉芽腫症）、 尋常性天疱瘡（PV）および落葉状天疱瘡（PF）を含む自己免疫疾患を含む疾患のグループから選択される。尋常性天疱瘡（PV）および落葉状天疱瘡（PF）は、自己抗体によって引き起こされる慢性で生命を脅かす水疱性疾患である。
BCMA-CD19 compound CAR (BCMA-CD19 cCAR )
多発性骨髄腫細胞を死滅させると短期的な軽減が得られるが、LSCs（骨髄腫白血病幹細胞）は、破壊されない場合は常に再成長し、再発を患者へ引き起こす。多発性骨髄腫の永続的な治療を達成するには、LSCsを破壊することが不可欠である。理論に縛られることを望まないが、多発性骨髄腫細胞の小さなサブセットはCD19陽性であり、疾患の進行と再発に関連する幹細胞であり、巨大な骨髄腫細胞集団はBCMA陽性であると考えられている。したがって、骨髄腫幹細胞集団と巨大骨髄腫集団の両方を特異的に標的とすることができる新しい治療法を開発することが重要である。本開示におけるcompoundCARは、多発性骨髄腫細胞のBCMA+および/またはCD19+９陽性集団の両方を標的とし、本明細書で具体化される。
いくつかの実施形態において、本開示は、CD19および/またはBCMAを発現する骨髄腫幹細胞（LSCs）またはバルク骨髄腫細胞を根絶または殺傷方法を提供する。この実施形態では、BCMAユニットおよびCD19ユニットを有するＴまたはＮＫ操作細胞が、それを必要とする患者に投与される。
いくつかの実施形態では、開示される開示は、BCMA-CD19 cCARを使用して多発性骨髄腫の再発を防ぐために、BCMAおよびCD19集団の両方を消去する方法および組成物を含む。CARは、ベクターまたは細胞内でBCMAとCD19の2つのユニット（BCMA-CD19）を組み合わせた場合、骨髄腫細胞を除去するのにより強力である。
さらなる実施形態では、ＴまたはＮＫ細胞中のcompound CARであるBCMA-CD19 cCARを使用して、BCMA+CD19+またはBCMA+CD19-またはBCMA-CD19+集団を根絶または殺傷することができる。
いくつかの実施形態では、開示される開示は、BCMA-CD19 cCARを使用して多発性骨髄腫の再発を防ぐためにBCMAおよびCD19集団の両方を消去する方法および組成物を含む。CARは、ベクターまたは細胞内でBCMAとCD19 の2つのユニット（BCMA-CD19）を組み合わせた場合、骨髄腫細胞を除去するのにより強力である。
いくつかの実施形態では、CD19 +集団は多発性骨髄腫細胞の初期前駆体であり得、そしてCD19-BCMA +細胞はより分化した悪性多発性骨髄腫細胞であり得る。いくつかの実施形態において、開示される発明は、BCMA-CD19b cCAR（BCMA-CD19 cCARのバージョン）ＴまたはＮＫ細胞を使用して、多発性骨髄腫細胞の初期前駆体および、より分化した悪性多発性骨髄腫細胞の両方を消去する方法および組成物を含む。さらなる実施形態において、開示される開示は、初期前駆細胞およびより分化した悪性細胞の両方を標的とし、BCMA-CD19b cCARＴまたはＮＫ細胞を使用して多発性骨髄腫の悪性クローンを完全に排除する方法および組成物を含む。
本開示はさらに、標的抗原を共発現する細胞に対する抗骨髄腫細胞活性の増強された効力を有するcompound CARコンストラクトを開示するが、1つの抗原のみを発現する腫瘍細胞に対する感受性をも保持する。さらに、compound CARの各CARは1つまたは2つの共刺激ドメインを含み、特定の標的の存在下で強力な殺傷能力を示す。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushi またはIL-15 / IL-15sushiアンカーあるいは4-1BBLとBCMA-CD19 cCARとの共発現は、標的の骨髄腫細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または骨髄腫細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
いくつかの実施形態では、compound CAR (BCMA-CD19 cCAR) はBCMAまたはCD19抗原またはその両方を発現する細胞を標的とする。標的細胞 は、リンパ腫、白血病、形質細胞新生物など、ただしこれらに限定されない、癌細胞であってもよい。さらなる実施形態において、形質細胞新生物は、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞腫、重鎖疾患、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、孤発性骨性形質細胞腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（MGUS）およびくすぶり多発性骨髄腫から選択される。
理論に拘泥するものではないが、IL-21 またはIL-21アンカーとBCMA-CD19 cCARの共発現は、標的の骨髄腫細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または骨髄腫細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、IL-18またはIL-18アンカーとBCMA-CD19 cCARの共発現は、標的の骨髄腫細胞へのCARでの認識の感度を高めることにより、または骨髄腫細胞に対する自然免疫細胞をリクルーティングすることによって、患者において長期耐性寛解をもたらすと考えられている。
いくつかの実施形態では、本開示は、患者にCARまたはcompound CAR（BCMA-CD19 cCAR）T細胞またはNK細胞を投与することにより、自己免疫疾患を有する患者のB細胞、未熟B細胞、記憶B細胞、形質芽細胞、長命形質細胞、または形質細胞を枯渇させる方法を提供する。
BCMA- CD19 cCARの標的細胞は、B細胞、未熟B細胞、記憶B細胞、形質芽細胞、長命の形質細胞、または自己免疫疾患患者の形質細胞である。自己免疫疾患には、全身性強皮症、多発性硬化症、乾癬、皮膚炎、炎症性腸疾患（クローン病や潰瘍性大腸炎など）、全身性エリテマトーデス、血管炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性筋炎、肺胞タンパク症、肉芽腫症および血管炎、アジソン病、抗原抗体複合体媒介疾患、および抗糸球体基底膜疾患が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、患者にBCMAおよびCD19二重特異性CAR T細胞または二重特異性抗体を投与することにより、自己免疫疾患を有する患者のB細胞、未熟B細胞、記憶B細胞、形質芽細胞、長命形質細胞、または形質細胞を枯渇させる方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法を提供する。自己免疫疾患は全身性狼瘡を含むエリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ、シェ ーグレン症候群、皮膚筋症、自己免疫性溶血性貧血、視神経脊髄炎（NMO）、NMOスペクトラ ム障害（NMOSD）、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、全身性自己免疫性の小血管血管炎症候群または顕微鏡的多発血管炎（MPA）に関連する抗好中球細胞質自己抗体（ANCAs）、多発血管炎を伴う肉芽腫症（GPA、ウェゲナー肉芽腫症）、 尋常性天疱瘡（PV）および落葉状天疱瘡（PF）を含む自己免疫疾患を含む疾患のグループから選択される。臓器移植は人にとって新しい命を象徴し、移植可能な臓器には腎臓、心臓、肺、膵臓、腸が含まれる。しかし、多くの患者は、ヒト白血球抗原（HLA）のようなドナー抗原に対する既存または発生中のドナー特異的抗体のために、生命を救う可能性の臓器を受け取ることができない。したがって、患者は提供された臓器を失うことがある。現在、抗体介在拒絶に利用可能な治療選択肢はほとんどなく、抗体媒介拒絶反応の有効な治療のための分野において満たされていない大きなニーズがある。CAR T / NK細胞を用いたB細胞または形質細胞またはその両方の削除は、抗体媒介拒絶の治療法を提供する。
BCMA-CD19 cCARまたはCD19-CD38 cCARまたはBCMA-CD38 cCARの標的細胞は、B細胞、未熟B細胞、記憶B細胞、形質芽細胞、長命の形質細胞、または臓器拒絶に関連する抗体媒介拒絶反応のある患者の形質細胞。
CARポリペプチドとエンハンサーを有する操作された細胞
別の実施例において、本開示は、少なくとも1つのキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびエンハンサーを有する操作された細胞を提供する。
別の実施例において、本開示は、少なくとも1つのキメラ抗原受容体ポリペプチドおよび、少なくとも1つのエンハンサーを有する操作された細胞を提供する。
この実施例では、本開示は、少なくとも2つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびエンハンサーを有する操作細胞を提供する。
この実施例では、本開示は、少なくとも2つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドおよび、少なくとも１つのエンハンサーを有する操作細胞を提供する。
本明細書中で使用される場合、エンハンサーは、キメラ抗原受容体ポリペプチドを有する操作された細胞の活性を促進または強化する生体分子を含む。エンハンサーにはサイトカインも含まれる。別の実施例において、エンハンサーは、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-21アンカー、PD-1、PD-L1、CSF1R、CTAL-4、TIM-3 そしてTGFR-beta、同受容体、およびその機能的な断片を含む。
エンハンサーは、本明細書に記載される操作された細胞によって発現され、操作された細胞の表面上に提示され得るか、またはエンハンサーは、操作された細胞によって周囲の細胞外空間に分泌され得る。サーフェスディスプレイおよび分泌の方法は、当技術分野において周知である。例えば、エンハンサーは、細胞外空間へのサーフェスディスプレイまたは分泌を提供するペプチドとの融合タンパク質であるかもしれない。
エンハンサーの効果は、エンハンサー受容体およびその機能的フラグメントなどの追加の因子によって補完されるかもしれない。追加の因子は、融合タンパク質としてエンハンサーと共発現されてもよく、または別個のペプチドとして発現されて細胞外空間に分泌されてもよい。
エンハンサーは、操作されたCAR細胞から分泌されたサイトカインであり、CARポリペプチドと共発現するように設計されている。同族の抗原とCARの関与時に大量放出が起こる。腫瘍細胞を取り囲む炎症細胞は、癌細胞の進行および転移と有意な相関関係を有する。炎症細胞には、T細胞およびNK細胞、マクロファージ、樹状細胞などの自然免疫応答細胞が含まれ、それらの増殖および抗腫瘍活性はサイトカインによって調節される。 CAR T細胞またはNK細胞などのCAR細胞は、標的癌細胞に結合し、CAR T / NK細胞の増殖からのエンハンサーの大量分泌を誘発する。分泌されたエンハンサーは、癌細胞に対する免疫応答細胞の生存、分化および活性化を効率的に促進する。エンハンサーとCARとの共発現は、CAR TまたはNK細胞が非標的癌細胞を排除できないという欠点を補うことができる。
CAR細胞はサイトカインのキャリアであり、高用量の外因性サイトカインによる全身毒性を低下させるために、CAR細胞によって標的癌部位にサイトカインを送達することができる。
CAR細胞の持続的な生存または長期持続性を改善するために、CAR持続性を改善するために、膜結合エンハンサーをCARと共発現させることができる。
この実施例では、エンハンサーはIL-15である。この場合、上記の追加因子は、IL-15受容体およびその機能的断片である。機能的断片には、IL-15受容体、IL-15RA、およびIL-15RA（IL-15sushi）のsushiドメインが含まれる。可溶性IL-15RAまたはIL15sushiは、IL-15の分解を防止することで、IL-15機能活性を著しく増強する。可溶性IL-15 / IL-15RAまたはIL-15 / IL-15sushi複合体は、インビボでIL-15単独よりも安定ではるかに刺激性である。
この実施例では、IL-15は、IL-15受容体、IL-15RA、およびIL-15RA（IL-15sushi）のsushiドメインの少なくとも1つと融合タンパク質として共発現される。この実施例では、IL-15受容体、IL-15RA、またはIL-15RAのsushiドメイン（IL-15sushi）は、IL-15のN末端にある。別の実施例では、IL-15受容体、IL-15RA、またはIL-15RAのsushiドメイン（IL-15sushi）は、IL-15のC末端にある。本明細書中で使用される場合、IL-15 / IL-15sushiは、融合タンパク質においてIL-15sushiがIL-15のC末端にあることを示し、 IL-15sushi / il-15は、IL-15sushiが融合タンパク質中のIL-15のN末端にあることを示す。
いくつかの実施例では、IL-15およびIL-15受容体またはその機能的断片ポリペプチドは、単一のポリペプチド分子上にあり、ペプチドリンカーによって離され、ペプチドリンカーは、長さが1～25アミノ酸残基、長さが25～100アミノ酸残基、または長さが50～200アミノ酸残基である。このリンカーは、本明細書に記載の高効率切断部位を含み得る。
インターロイキン（IL）-15およびその特異的受容体鎖であるIL-15Rα（IL-15-RA）は、NKおよびCD8 T細胞を含む様々なエフェクター細胞において重要な機能的役割を果たす。CD8 + T細胞は、IL-2、IL-7、IL21またはIL-15を含むが、これらに限定されない自己分泌成長因子を発現するように改変され、インビボへの移転後の生存を維持する。理論に縛られることを望むものではないが、IL-15は、CD4欠損を克服して、一次記憶を誘導し、そして記憶CD8T細胞を想起し得ると考えられている。CD8 T細胞上のIL-15-RAまたはIL-15 IL-RA融合体の過剰発現は、インビトロおよびインビボでその生存および増殖を有意に増強する。いくつかの実施形態では、CD4 CARまたはCD3 CARまたはCD5 CARまたはCD20 CAR、CD33 CAR、CLL-1またはCD123 CAR、CD19 CARまたはＣCD45 CARまたはGD2 CAR、BCMA CARまたは任意のCARが、IL-15、IL15RAおよびIL-15 / IL-15RAまたはIL15-RA / IL-15またはIL-15/IL-15 sushiの少なくとも一つ、あるいは一部、またはそれらの組み合わせの共発現を行うことで、CAR TまたはNKの生存または増殖を増強し、記憶CAR CD8 + T細胞の増殖を改善する。
CD4 CARもしくはCD7 CAR、CD3 CARもしくはCD5 CARもしくはCD20 CAR、CD33 CAR、CLL-1もしくはCD123 CAR、CD19 CARもしくはGD2 CARもしくはCD45 CARもしくはBCMA CAR、または任意のCARが、IL-15/IL-15 sushiの少なくとも一つ、あるいは一部、またはそれらの組み合わせの共発現を行うことで、CAR NKの生存または増殖を増強し、記憶CAR CD8 + T細胞の増殖を改善する。
驚くべきことに、IL-15/IL-15sushiとCARの共発現が腫瘍細胞を標的としたT細胞やNK細胞のより長い持続性と活性の増強に重要であることが明らかとなった。驚くべきことに、IL-15/IL-15sushiとCARの共発現は、T細胞やNK T細胞、NK細胞が腫瘍細胞を標的とし、がんの再発を防ぐために重要であることがわかってきた。
驚くべきことに、CARのNK細胞やNK細胞をIL-15/IL-15sushiと共発現させると生存期間が延長できることがわかった。
本開示は、本明細書に記載のCARポリペプチドおよび患者の癌を治療するためのCAR TまたはNKの生存または持続性または増殖を増強するために、IL-15、IL-15RA、IL-15sushi、IL-15 / IL-15RA、IL15-RA / IL-15、IL-15/ IL-15sushi、IL15sushi / IL-15、それらの断片、それらの組み合わせの少なくとも1つを有する操作された細胞を提供する。
一実施形態では、操作された細胞は、CD5キメラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号48）、および対応するヌクレオチド（配列番号49）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD4メラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号22）、および対応するヌクレオチド（配列番号23）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、C4キメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号20）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号21）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD3キメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号18）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号19）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD19キメラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号24）、および対応するヌクレオチド（配列番号25）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD19キメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号26）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号27）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD33キメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号30）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号31）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD123キメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号32）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号33）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、BCMAキメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号38）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号39）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、GD2キメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号46）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号47）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、GD2キメラ抗原受容体ポリペプチド（配列番号56）、および対応するヌクレオチド（配列番号57）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、GD2キメラ抗原受容体ポリペプチドおよび4-1BBL（配列番号56）、および対応するヌクレオチド（配列番号57）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD45キメラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-15 / IL-15sushi（配列番号54）、および対応するヌクレオチド（配列番号55）を含む。
別の実施例では、本開示は、組換えIL-15、IL-15RA、IL-15sushi、IL-15 / IL-15RA、IL15-RA / IL-15、IL-15 / IL -15sushi、IL15sushi / IL-15、その機能的フラグメント、およびそれらの組み合わせ、および少なくとも1つの別個のCARポリペプチドを含み、ここで抗原認識ドメインはGD2、GD3、インターロイキン6受容体、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE- 4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、 CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、イムノグロビンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2およびCD138から少なくとも一つが含まれる操作された細胞を提供する。
理論に拘泥するものではないが、IL-15 / IL-15sushiおよび他のタイプのIL-15またはIL-15RAタンパク質またはそのタンパク質フラグメントは、チェックポイントインヒビターまたはモジュレーター (例えば、抗PD-1)と組み合わせた場合にCARポリペプチドの相乗効果をもたらすと考えられる。
一実施形態では、本開示は、IL-21またはIL-12アンカーを共発現するCAR操作細胞をそれを必要とする患者に投与することにより、癌を患っている患者に長期の持続的寛解を提供する方法を提供する（図24および25）。理論に拘泥するものではないが、IL-21またはIL-21アンカーとCARの共発現は、CARで操作された細胞の持続性を高めることにより、患者に長期にわたる寛解をもたらすと考えられている。
分泌型IL-21とCARポリペプチドの共発現は、腫瘍の微小環境に影響を及ぼし、免疫抑制の減少と自然細胞の増殖または機能の促進をもたらすことにより、患者に長期にわたる寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、分泌IL-21またはIL-21アンカーとCARの共発現は、腫瘍細胞を標的とするT細胞、NK T細胞、およびNK細胞の長期の持続性と活性の向上に重要であると考えられている。 CAR NK細胞またはNK細胞またはNK T細胞は、IL-21またはIL-21アンカーと共発現することで生存期間を延長できる。
一実施形態では、本開示は、腫瘍細胞を標的とするＣＡＲ ＴまたはＮＫ細胞が、腫瘍微小環境にエンハンサー、IL-21を送達するためのキャリアであり得ることに関連する方法を提供する。 CAR TまたはNK細胞は、分泌IL-21を共発現するように設計されている。腫瘍の微小環境で操作されたCAR TまたはNK T細胞またはNK細胞は腫瘍細胞を標的とし、CARターゲティング抗原に結合し、腫瘍細胞の溶解およびCAR TまたはNK T細胞またはNK細胞の増殖による可溶性IL-21の大量分泌の誘発を引き起こす。
特定の実施形態では、腫瘍の除去は、以下のステップの少なくとも1つまたは複数の組み合わせにより達成することができる：
(1) CAR抗原を標的とすることにより、本明細書に開示されるCAR操作T細胞またはNK細胞またはNK T細胞の腫瘍細胞の一部への結合。
(2) この分子を共発現するCAR T / NK細胞の増殖によるIL-21の大量分泌のトリガー。
(3) 腫瘍に対する様々な自然免疫細胞および適応免疫細胞のリクルーティングと刺激。
(4) PD-L1およびCTLA-4阻害剤などのチェックポイント遮断の投与により、腫瘍に存在する腫瘍抑制の軽減。
理論に拘泥するものではないが、上記のステップの組み合わせは、協調した自然免疫と適応免疫応答を介して強力な抗腫瘍効果を提供すると考えられている。
別の実施例では、本開示は、IL-21、またはIL-21アンカー、その機能的フラグメント、およびそれらの組み合わせ、および少なくとも1つの別個のCARポリペプチドを含み、ここで抗原認識ドメインはGD2、GD3、インターロイキン6受容体、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE- 4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、 CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、イムノグロビンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2およびCD138から少なくとも一つが含まれる操作された細胞を提供する。
一実施形態では、本開示は、IL-18またはIL-18アンカーを共発現するCAR操作細胞をそれを必要とする患者に投与することにより、癌を患っている患者に長期の持続的寛解を提供する方法を提供する（図26および27）。理論に拘泥するものではないが、IL-18またはIL-18アンカーとCARの共発現は、CARで操作された細胞の持続性を高めることにより、患者に長期にわたる寛解をもたらすと考えられている。
分泌型IL-18とCARポリペプチドの共発現は、腫瘍の微小環境に影響を及ぼし、免疫抑制の減少と自然細胞の増殖または機能の促進をもたらすことにより、患者に長期にわたる寛解をもたらすと考えられている。
理論に拘泥するものではないが、分泌IL-18またはIL-18アンカーとCARの共発現は、腫瘍細胞を標的とするT細胞、およびNK細胞の長期の持続性と活性の向上に重要であると考えられている。 CAR NK細胞またはNK細胞は、IL-18またはIL-18アンカーと共発現することで生存期間を延長できる。
一実施形態では、本開示は、腫瘍細胞を標的とするＣＡＲ ＴまたはＮＫ細胞が、腫瘍微小環境にエンハンサー、IL-18を送達するためのキャリアであり得ることに関連する方法を提供する。 CAR TまたはNK細胞は、分泌型IL-18を共発現するように設計されている。腫瘍の微小環境で操作されたCAR TまたはNK細胞は腫瘍細胞を標的とし、CARターゲティング抗原に結合し、腫瘍細胞の溶解およびCAR TまたはNK細胞の増殖による可溶性IL-18の大量分泌の誘発を引き起こす。
特定の実施形態では、腫瘍の除去は、以下のステップの少なくとも1つまたは複数の組み合わせにより達成することができる：
(1) CAR抗原を標的とすることにより、本明細書に開示されるCAR操作T細胞またはNK細胞の腫瘍細胞の一部への結合。
(2) この分子を共発現するCAR T / NK細胞の増殖によるIL-18の大量分泌のトリガー。
(3) 腫瘍に対する様々な自然免疫細胞および適応免疫細胞のリクルーティングと刺激。
(4) PD-L1およびCTLA-4阻害剤などのチェックポイント遮断の投与により、腫瘍に存在する腫瘍抑制の軽減。
理論に拘泥するものではないが、上記のステップの組み合わせは、協調した自然免疫と適応免疫応答を介して強力な抗腫瘍効果を提供すると考えられている。
別の実施例では、本開示は、IL-18、またはIL-18アンカー、その機能的フラグメント、およびそれらの組み合わせ、および少なくとも1つの別個のCARポリペプチドを含み、ここで抗原認識ドメインはGD2、GD3、インターロイキン6受容体、ROR1、PSMA、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、MAGE A3、糖脂質、グリピカン3、F77、GD-2、WT1、CEA、HER-2 / neu、MAGE-3、MAGE- 4、MAGE-5、MAGE-6、アルファフェトプロテイン、CA 19-9、CA 72-4、NY-ESO、FAP、ErbB、c-Met、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、 CD30、EGFRvIII、CD33、CD123、CLL-1、イムノグロビンカッパおよびラムダ、CD38、CD52、CD19、CD20、CD22、CD38、BCMA、CS1、BAFF受容体、TACI、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD2およびCD138から少なくとも一つが含まれる操作された細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの別個のＣＡＲＴまたはＮＫ細胞によって産生されるプールされたＣＡＲ操作細胞によって、２つ以上の異なる抗原を標的化することができる。
本明細書中で使用されるpooled CAR操作細胞には、1つ以上の異なるCARポリペプチドユニットを有する操作細胞の集団が含まれる。一例として、プールされた操作された細胞は、異なるCARポリペプチドを有する操作された細胞の集団および異なるおよび別個のCARポリペプチドを有する操作された細胞の集団を含む。さらに、pooled CAR操作細胞には、cCARポリペプチドを有する操作細胞が含まれる。
操作された細胞を作製する方法
本明細書に開示されるいかなるポリヌクレオチドのいずれかは、当技術分野で既知の任意の方法によって操作された細胞に導入され得る。
この実施例では、CARポリヌクレオチドは、本明細書に開示される任意のウイルスベクターによって操作された細胞に送達される。
この実施例では、安全性プロファイルまたは治療指数の向上を達成するために、本明細書中に開示される任意の操作細胞は、一過性RNA修飾「生分解性」バージョンまたは誘導体、またはそれらの組み合わせとして構築される。本発明のRNA修飾CARは、T細胞またはNK細胞に電気穿孔されるかもしれない。compound CARの発現は、数日にわたって徐々に減少し得るかもしれない。
本発明のいくつかの実施例では、本明細書中に開示される任意の操作された細胞は、ウイルスベクターなしで宿主ゲノムにCAR DNAを組み込むトランスポゾンシステム（「Sleeping Beauty」とも呼ばれる）で構築され得る。
本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に開示される任意の操作された細胞は、２つのベクターによって導入され得、各ベクターは、ＣＡＲまたはエンハンサーのユニットを保有する。 複数のCARユニットを有する人工細胞を作製する方法
別の実施例では、本開示は、少なくとも2つのCARユニットを有する操作された細胞を作製する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、CARの複数のユニットが、バイシストロンまたはマルチシストロン発現ベクターを用いてT細胞またはNK細胞で発現される。バイシストロン性またはマルチシストロン性のベクターを構築するために用いることができるいくつかの戦略があり、限定されるものではないが、（1）CARのオープンリーディングフレームに融合した複数のプロモーター、（ 2）CARのユニット間のスプライシングシグナルの挿入、発現が単一のプロモーターによって誘導されるCARの融合、（3）CARのユニット間にタンパク質分解切断部位の挿入（自己切断ペプチド）、そして（iv）内部リボソーム侵入部位（IRESs）の挿入、（5）CARの異なるユニットを発現させるために2つのベクターに分ける、などがあげられる。
好ましい実施例では、複数のCARユニットが単一のオープンリーディングフレーム（ORF）で発現され、それによって複数のCARユニットを有する単一のポリペプチドが作製される。この実施例では、高効率切断部位を含むアミノ酸配列またはリンカーがそれぞれのCARユニットの間に配置される。
本明細書中で使用される場合、高い切断効率とは、翻訳されたタンパク質の50％以上、70％以上、80％以上または90％以上が切断されると定義される。切断効率は、Kim 2011によって記載されているように、ウエスタンブロット解析によって評価されるかもしれない。
さらに、好ましい実施例では、ウェスタンブロット分析で示されるように、等量の切断産物が存在する。
高効率切断部位の例として、ブタ・テスコウイルス-1 2A（P2A）、FMDV 2A（本明細書ではF2Aと略記する）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）2A（E2A）、 Thoseaasignaウイルス（T2A）、細胞質多角体病ウイルス2A（BmCPV2A）および軟化病ウイルス2A（BmIFV2A）、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。好ましい実施例では、高効率切断部位はP2Aである。高効率切断部位は、Kim JH, Lee S-R, Li L-H, Park H-J, Park J-H, Lee KY, et al. (2011) High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice. PLoS ONE 6(4): e18556の記載を参照により、本明細書に使用されている。
ここでの実施例において、複数のCARユニットが単一のオープンリーディングフレーム（ORF）下で発現され、発現は強力なプロモーターの制御下にある。強力なプロモーターの例として、SFFVプロモーターおよびその誘導体が含まれる。
より長い遺伝子コンストラクトを設計する場合、タンパク質発現のレベルは、1kbの長さの追加ごとに大幅に低下する。したがって、いくつかの抗原認識配列の初期スクリーニングは、最高の形質導入効率と最高の標的細胞溶解の両方をもたらす組み合わせを見つけることが好ましい。さらに、細胞表面での単鎖の凝集により引き起こされるトニック効果および溶解不良につながる非常に高いCAR発現を避けることが好ましい。
複数のCARユニットが細胞内で発現される実施形態では、各個々のCARのヒンジ領域間のCAR-CAR相互作用は回避されることが好ましい。ヒンジの相互作用部位を除外するか、CARの各ユニットが異なるヒンジ領域を使用して相互作用を回避することが好ましい。
複数のCARユニットが細胞で発現されるいくつかの実施形態では、リーダー配列、ヒンジおよび膜貫通領域、およびCD3ゼータ領域などの各ドメインに共通の異なるヌクレオチド配列は、同じアミノ酸配列を維持しながら、相同組換えを回避することが好ましい。
複数のCARユニットが作成されるいくつかの実施形態では、医学的知識および背景に基づいて、最良の治療効果が得られることに基づいて、標的抗原の選択が好ましい。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの別個のＣＡＲＴまたはＮＫ細胞によって産生されるプールされたＣＡＲ操作細胞によって、２つ以上の異なる抗原を標的化することができる。
特異性をテストするために、CAR TまたはNK細胞を使用して、オンターゲット細胞株とオフターゲット細胞株の両方で共培養溶解実験を行うことが好ましい。さらに、各コンポーネントのCARが溶解する能力を示すために、それぞれ1つの標的化抗原のみを発現する細胞株を使用することが好ましい。これを行うには、オフターゲット細胞株を作製して、所望の抗原を合成的に発現させることが好ましい。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの別個のＣＡＲＴまたはＮＫ細胞によって産生されるプールされたＣＡＲ操作細胞によって、２つ以上の異なる抗原を標的化することができる。
本明細書中で使用されるpooled CAR操作細胞には、1つ以上の異なるCARポリペプチドユニットを有する操作細胞の集団が含まれる。一例として、プールされた操作された細胞は、異なるCARポリペプチドを有する操作された細胞の集団および異なるおよび別個のCARポリペプチドを有する操作された細胞の集団を含む。
CARポリペプチドとエンハンサーをもつ操作された細胞 。
別の実施例では、本開示は、少なくとも1つのCARユニットおよびエンハンサーを発現する操作された細胞を作製する方法を提供する。
いくつかの実施例では、少なくとも1つのCARユニットおよびエンハンサーが、バイシストロンまたはマルチシストロン発現ベクターを用いてT細胞またはNK細胞で発現される。バイシストロンまたはマルチシストロンのベクターを構築するために用いることができるいくつかのストラテジーがあり、限定されるものではないが、（1）CARのオープンリーディングフレームに融合された複数のプロモーター、（2）CARのユニット間にスプライシングシグナルの挿入、および発現が単一のプロモーターによって駆動されるCARの融合、（3）CARのユニット間へのタンパク質分解切断部位（自己切断ペプチド）の挿入、そして（4）内部リボソーム侵入部位（IRES）の挿入がある。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞で発現する少なくとも１つのCARおよびエンハンサーは、２つの別個のベクターまたはウイルスによって達成することができる。
好ましい実施例では、少なくとも1つのCARユニットとエンハンサーが単一のオープンリーディングフレーム（ORF）で発現され、それによって少なくとも1つのCARユニットおよびエンハンサーを有する単一のポリペプチドが作製される。この実施例では、高効率切断部位を含むアミノ酸配列またはリンカーが、各CARユニット間およびCARユニットとエンハンサーとの間に配置される。この実施例では、ORFは強力なプロモーターの制御下にある。強力なプロモーターの例には、SFFVプロモーターおよびその誘導体が含まれる。
さらに、好ましい実施形態では、ウエスタンブロット分析で示されるように、等量の切断産物が存在する。
併用療法
本開示の組成物および方法を使用して、癌の治療における免疫療法で使用するための一次および共刺激シグナルの両方を送達するCAR Tリンパ球またはNK細胞の集団を作製することができる。さらなる実施形態では、臨床的側面に関する本発明は、抗癌剤などの過剰増殖性疾患の治療に有効な他の薬剤と組み合わされる。抗癌剤は、対象における腫瘍の負担を軽減することができる。抗がん剤には、化学療法、放射線療法および免疫療法が含まれる。
がん患者の50％以上が何らかの手術を受ける。治癒的手術には、癌性組織の全部または一部が物理的に除去、切除、および/または破壊される切除が含まれる。
本開示に記載される組成物および方法は、化学療法、外科手術、放射線療法、遺伝子療法などのような癌の他のタイプの療法と併せて利用されてもよい。
本開示によれば、ナチュラルキラー（NK）細胞は、CAR主導の殺傷のための代替の細胞毒性エフェクターを示す。 T細胞とは異なり、NK細胞は事前活性化を必要とせず、構成的に細胞溶解機能を発揮する。NK細胞におけるcCARのさらなる発現により、NK細胞は癌、特にNK細胞治療に耐性のある癌細胞を効果的に殺傷することができる。
さらに、NK細胞は移植片対宿主病（GvHD）を誘発するリスクなしに抗癌効果を媒介することが知られている。
本開示は、以下に記載される実施例を参照してよりよく理解され得る。以下の実施例は、本明細書に請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法がどのように作成および評価されるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、純粋に例示を意図しており、開示を限定することを意図していない。
本明細書に記載の操作された細胞のいずれかの投与では、CAR増強剤の共投与を追加することができるかもしれない。CAR増強剤の例には、治療効果を高めるために、CAR活性を増強する免疫調節薬、例えば、免疫チェックポイント経路を標的とするような薬剤、コロニー刺激因子-1受容体（CSF1R）の阻害剤などが挙げられる、しかしながらこれに限定されない。免疫チェックポイント経路を標的とする薬剤には、抑制性免疫受容体CTLA-4、PD-1、およびPD-L1に結合し、CTLA-4およびPD-1 / PD-L1遮断をもたらす小分子、タンパク質または抗体が含まれる。本明細書で使用されるように、増強剤は、上記で述べられたエンハンサーをも含む。
本明細書で使用する「患者」には、哺乳動物が含まれる。本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、マウスおよびハムスターのようなげっ歯類の哺乳動物、およびウサギのようなウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を意味する。哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む、食肉目からのものでもあり得る。哺乳動物は、ウシ属（ウシ）およびブタ属（ブタ）を含む偶蹄目またはウマ属（ウマ）を含む奇蹄目のものでもあり得る。哺乳動物は、霊長目、セボイド目、またはシモイド目（サル）、または真猿亜目ヒトおよび類人猿）であり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。患者には被験者が含まれる。
特定の実施例では、患者は、0～6ヶ月齢、6～12ヶ月齢、1～5歳齢、5～10歳齢、5～12歳齢、10～15歳、15～20歳、13～19歳、20～25歳、25～30歳、20～65歳、30～35歳、35～40歳、40～45歳、45～50歳、50～55歳、55～60歳、60～65歳、65～70歳、70～75歳、75～80歳、80～85歳、85～90歳、90～95歳、または95歳～100歳のヒトである。
本明細書で述べられるように、操作された細胞の「有効量」および「治療有効量」という用語は、所望の治療または生理学的または効果または治療効果を提供するのに十分な量の操作細胞を意味する。そのような効果または治療効果には、細胞性疾患の症状の軽減または改善が含まれる。望ましくない効果、例えば、副作用は、時に所望の治療効果と共に現れる。それゆえ、従事者は潜在的な効果と潜在的なリスクとのバランスを取って、適宜な「有効量」が何であるかを判断する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢および患者の一般的な状態、投与様式、その他などに依存して、患者によって異なるであろう。したがって、正確な「有効量」を指定することは不可能かもしれない。しかしながら、任意の個人の場合でも、適切な「有効量」は、日常の実験のみを使用して当業者により決定され得る。一般的に、特定の操作された細胞または操作された細胞群は、標的細胞の増殖を減少させるのに十分な量および条件下で与えられる。
癌の治療、阻害または予防のためのデリバリーシステムでの投与後、 熟練した専門家に周知の様々な技術を用いることで治療用の操作細胞の有効性を評価することができる。例えば、化学療法アジュバントと共に送達される治療用に操作された細胞が、癌細胞の負荷を軽減するか、またはさらなる増殖を予防することを観察することによって、対象の癌の治療または阻害するのに有効であることを当業者は理解するであろう。癌細胞の負荷は、例えば、特定の癌細胞の核酸の存在を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイを用いて、または血液中の特定の癌細胞マーカーの同定、たとえば抗体を用いての被験体または患者からのサンプル（例えば、血液に限定されないが）の測定、または、患者の循環する癌細胞抗体レベルの量を測定することによる、当該分野で既知の方法によって測定することができる。
本明細書を通して、量は範囲および範囲の下限および上限によって定義される。各下限を各上限と組み合わせ範囲を定義することができる。下限と上限はそれぞれ別の要素として考慮すべきである。
この明細書全体を通して参照される、「実施形態（one embodiment、an embodiment）」、「例（one example、又は an example）」は、実施形態又は例に関連して記述される特定の特徴（feature）、構造（structure）、または特質（characteristic）が、本願実施形態の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本願明細書の全体の様々な箇所で使用される、用語「一実施形態では（in one embodiment、in an embodiment）」、又は、例（one example又はan example）は、同一の実施形態又は例を全て参照する必要はない。さらに、特定の特徴、構造又は特質は、任意の適した組み合わせ及び／又は部分的組合せで、１つまたは複数の実施形態又は例において、組み合わせられ得る。さらに、本願明細書において提供された図は当業者へ説明することを意図したものであり、図は、必ずしも縮尺通りには描かれていない。
本明細書において使用される、「含む（comprises、comprising、includes、including）「有する（has、having）」又はその他の任意の変形体（varietion）は、非独占的な包含を意味することを意図している。例えば、列挙された要素を含む方法（process）、物（article）、又は、装置（apparatus）は、それらの要素のみに限定される必要はなく、明示的に列挙されていない、又はこのような方法、物、若しくは装置に固有の他の要素も含むことができる。
さらに、反対に明確に述べられていない限り、「又は（もしくは）（or）」は包括的な「又は（もしくは）（or）」を意味し、排他的な「又は（もしくは）（or）」は意味しない。例えば、条件AまたはBは、以下のいずれかを満たす：Aが真（または存在する）及びBが偽（又は存在しない）、Aが偽（又は存在しない）及びBが真（又は存在する）、並びに、AとBの両方が真（又は存在する）。
さらに、本願明細書において開示される任意の例または図は、利用される任意の用語の定義に制限される、利用される任意の用語の定義に限定される、又は利用される任意の用語の定義を表現する、とみなされることはない。代わりに、これらの例または図は、１つの特定の実施形態に関して説明されており、例示のみであるとみなされる。当業者は、これらの例又は図で使用される任意の用語は、それと共に、又は本願明細書の他の場所で与えられても与えられなくてもよい他の実施形態を包含し、そのような全ての実施形態は、その用語の範囲内に含まれることが意図されていることを、理解する。そのような非限定的な例及び図のような言語指定には「例えば（for example、for instance、e.g.,」及び「一実施形態では（in one embodiment）」が含まれるが、これに限定されない。
本願明細書において、複数の要素を含む様々なパラメーターの群が記載される。一群のパラメーターの中に、各要素は、追加的に亜群を作るために、任意の１つまたは複数の他の要素と組み合わせることができる。例えば、ある群の要素がa、b、c、d、及びeである場合、具体的に考えらえる追加的な亜群は任意の１、２、３又は４つの要素を含む（例えば、aとc；a、d、及びe；並びに、b、c、 d、 及び e、等。）
本明細書中で使用される場合、XXXX抗原認識ドメインは、XXXXに対して選択的なポリペプチドである。「XXXX」は、本明細書および上記で説明したターゲットを示す。例えば、CD38抗原認識ドメインは、CD38に特異的なポリペプチドである。
本明細書中で使用される場合、CDXCARは、CDX抗原認識ドメインを有するキメラ抗原受容体を指す。
使用例
多発性骨髄腫などの形質細胞疾患を標的とするBCMA-CS1 cCAR
BCMA-CS1 cCAR（BC1cCAR）T細胞の作製
BC1cCARコンストラクトは、自己切断型P2Aペプチドによって完全なCS1-CARに融合した完全なBCMA-CARで構成される2ユニットのCARであり、T細胞表面で両方のCAR受容体を個別に発現させることができる（図1A）。FACSによってアッセイされた発現は、異なる形質導入細胞を明らかにした（図1B）。リーダー、scFv、ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）、共刺激ドメイン（CD28または4-1BB）、および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ（CD3）が各CARユニットに含まれている。T細胞表面でのBCMA-CS1 cCAR分子の効率的な発現には、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）とCD8リーダー配列を使用した。
BC1cCAR T細胞は、BCMA +およびCS1 +骨髄腫細胞株を特異的に溶解する
BC1cCAR T-cells による細胞障害活性を評価するため、MM1S（BMCA + CS1 +）、RPMI-8226（BCMA+ CS1dim）およびU266（BCMA+ CS1dim）らの骨髄腫細胞株と共培養アッセイを行った。24時間の共培養におけるBC1cCAR細胞毒性のFACS分析は、すべてのE：T比でMM1S細胞の実質的に完全な溶解（> 90％）を示す（図2A）。培養中のRPMI-8226およびU266細胞に対しても同様の傾向が観察され（図2A、2B）、さまざまなレベルの抗原発現を伴う標的集団に対する効果的なバルクな細胞毒性が示された（図2C）。
BC1cCAR T細胞は、一次患者の骨髄腫サンプルにおけるBCMA +およびCS1 +集団を特異的に標的とする
BC1cCARの多様な原発性骨髄腫細胞タイプを殺傷させる能力をさらに評価するために、原発性サンプルを選択して、標的抗原の発現のスペクトルを示した（図3）。MM10-Gサンプルのフローサイトメトリー分析により、BCMA + CS1 +二重陽性とCS1 +のみの母集団のサブセットの混合腫瘍が明らかになった。 MM7-Gサンプルは完全なBCMA+ CS1+表現型を示し、骨髄穿刺液MM11-Gはノイズの多いBCMAdim CS1dim表現型を示した。BC1cCAR T細胞は、MM7-G原発性の患者サンプルに強い（> 80％）用量依存的なアブレーションを示した（図4A）。
BC1cCARは、MM10-Gとの共培養でBCMA+ CS1+とBCMA- CS1+の両方の母集団サブセットを大幅にアブレートすることにより、対象を絞った特定の溶解能力も示した。2：1のE：T比で、BC1cCAR T細胞はBCMA+ CS1+集団の60％および70％のCS1+のみの集団をアブレートする（図4B）。BC1cCAR T細胞はまた、MM11-G細胞に対して用量依存的な細胞傷害活性を実証することができた（図4C）。細胞毒性スクリーニングを通して、BC1cCAR T細胞は骨髄腫細胞株と、BCMAとCS1の異なる組み合わせを発現する原発性腫瘍細胞の両方に対して強力な抗腫瘍活性を示した（図4D）。
BC1cCAR抗原特異的活性の機能的評価
我々はBC1cCAR scFv機能を個別にテストできるモデルを確立した。骨髄腫マーカーが陰性のCML細胞株K562を、CS1（CS1-K562）またはBCMA（BCMA-K562）のいずれかで過剰発現させた。各細胞株における独立した抗原発現を確認した後（図5A）、共培養実験を通じてBC1cCAR T細胞のターゲティング機能を決定した。
短期培養（一晩）では、BC1cCAR T細胞がBCMA-K562細胞に対して細胞傷害活性を示した。どちらの抗原にも陰性の野生型K562細胞に対するオフターゲット効果はなかった（図5B）。 CS1-K562細胞に対する短期培養でも、CS1発現標的細胞に対して同様の反応が見られた。さらに、BC1cCAR T細胞は、CS1-K562細胞に対して、CS1特異的CARよりも強い細胞毒性効果を持っているように見られた（図5B）。
非標的抗原を保有する残存腫瘍集団は、単一抗原CARを使用した治療を受けた患者の再発につながる可能性がある。したがって、より臨床的に関連する混合抗原発現細胞集団をモデル化するために、我々は組み合わせでの共培養実験を行った。BCMA-K562細胞とCS1-K562細胞を持続培養（48時間）で1：1の比率で混合し、残りの抗原陽性集団をアッセイした。次に、T細胞と標的腫瘍細胞の集団を表すヒストグラムを作成し、残りのゲートされた標的腫瘍集団をマークした（図5C）。コントロールのT細胞と比較して、BCMA固有のCARとCS1固有のCARは、それぞれのターゲット母集団に対して目覚ましい細胞毒性効果を示した。ただし、BCMA-CARは有意な細胞毒性を成し遂げたが、CS1+の小さな集団を残したのに対し、CS1-CARは有意な残存BCMA+の集団を残した。対照的に、BC1cCAR T細胞は両方の標的集団を効果的に枯渇させた（図5C）。
腫瘍の再負荷は、BC1cCAR T細胞の継時的殺傷能力を実証する
次に、BC1cCAR T細胞が、細胞溶解、破片、および腫瘍の再攻撃によって引き起こされる好ましくない微小環境下で腫瘍細胞を連続的に殺す能力を調査した。図6Aのスキームを使用して、MM1S細胞を骨髄腫モデル腫瘍として長期間共培養し、BC1cCAR T細胞と単一のBCMA-CARおよびCS1-CAR T細胞に新鮮なMM1S細胞を定期的に再添加することで腫瘍の増殖または再発をシミュレートする。外因性サイトカインがなくても、すべてのCAR処理で48時間後に標的抗原が枯渇し、有意なクラスタリングとT細胞増殖が見られた（図6B）。対照的に、コントロールT細胞は応答または増殖を示さず、腫瘍細胞集団をその初期サイズの2倍にしました。すべての処理ウェルに新鮮なMM1S細胞を再負荷したところ、すべてのCARが依然として高い細胞障害性を保持していることがわかった。108時間までに、新しいMM1S細胞はBCMA-CARとBC1cCARの両方によって実質的に枯渇したが、CS1-CARは新しいMM1S細胞の不完全な殺傷を示した（図6C）。すべてのCARを介した腫瘍溶解と細胞毒性は168時間後に停止したが、BCMA-CARとBC1cCARは依然として検出可能な少数のT細胞集団を示したが、コントロールT細胞とCS1-CAR T細胞は事実上検出できなかったた（データは示さず）。
BC1cCAR T細胞は、インビボで腫瘍の有意な 制御および 減少を示す
BC1cCAR T細胞のin vivoでの活性を評価するために、ルシフェラーゼ発現MM1S細胞を用いて蛍光可視の腫瘍形成を誘導する骨髄腫マウスモデルを開発した。BC1cCAR T細胞は、腫瘍負荷を大幅に軽減し、コントロールT細胞と比較してMM1S注入マウスの生存を延長した。マウスにBC1cCARまたはコントロールT細胞を単回投与し、腫瘍負荷をIVISイメージングで測定した（図7A）。 6日目以降、コントロールグループとBC1cCAR治療グループの間の腫瘍負荷のIVISでの測定に非常に有意な差（P <0.0003）があった（図7B）。CARを注射したマウスはまた、有意で、より良好な生存転帰を示した（図7C）。
混合抗原集団マウスモデルは、cCARを発現する細胞と単一のCARを発現する細胞による優れた腫瘍負荷制御を示す
異種細胞集団と潜在的な抗原逃避をモデル化するために、BCMA:CS1を発現するK562細胞の4:1混合物をマウスに注射し、3日目に7.5 x 106のコントロール、BCMA-CAR、またはBC1cCAR T細胞のいずれかで処置した。3日目に、注射処置の結果として2匹のコントロールマウスが死亡し、分析から除外された。腫瘍負荷は蛍光によって視覚化された（図8A）。 10日目には、両方のCARでGFPコントロールと比較して50％以上の腫瘍減少を示し、12日目までに減少が60％以上に増加しました（図8A -右）。10日目までに、BC1cCARは腫瘍抑制においてBCMA-CARを6％追い越し、この広がりは12日目までに17％に増加し、BCMA-CARが残存するCS1-K562細胞を溶解できないことをモデル化した可能性がある（腫瘍の20％が注入された）。すべてのCAR T細胞治療マウスの生存転帰は、コントロールグループよりも有意に改善された。 BC1cCARグループとBCMA-CARグループの生存率も有意に改善した（p <0.05）（図8B）。両方のCARは腫瘍の成長を制御するのに効果的であるが、BC1cCARは、単一のターゲットオプションと比較してより強力な制御を示している。
独立した抗原マウスモデルにおけるcompound CAR T細胞によるT細胞の持続性の強化と腫瘍枯渇の維持
特定のBCMAおよびCS1抗原を発現する細胞の枯渇をアッセイし、compoundのscFvの有効性を検証するために、それぞれ5つのマウスからなる4つのグループに、BCMA-K562またはCS1-K562細胞のいずれかを投与した腫瘍グループに、コントロールあるいはBC1cCAR T細胞とともに注入する3番目のマウスモデルを構築した（マウスの早期での自然死の結果としてn = 19）。屠殺時（様々：30日～80日以上）に、マウスの全血および肝臓組織においてT細胞および腫瘍集団についてスクリーニングした。両方の血液組織タイプは、cCARグループと比較すると、コントロールグループで一貫した腫瘍の存在を示している（図9A、9B、10A、10B）。両方の組織の平均化された腫瘍細胞集団の集合組織分析は、cCAR処置マウス群において、腫瘍負荷の枯渇といった一貫した傾向を示している（図9B）。血液と肝臓の両方で、コントロールT細胞は30日を超えて存続することができず、両方の組織タイプで有意な腫瘍量を示した（図9B、9C）。対照的に、cCAR処置マウスは、30日目以降でもすべてのマウスでコントロールT細胞と比較して有意なT細胞の増殖と持続性を示し（図9C）、抗腫瘍活性の増加がみられたことと相関し、全体的な生存の改善をサポートした。
BCMA-CS1-IL-15 / IL-15sushi（CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi）の構造組織
BCMA-CS1-IL-15 / IL-15sushi（図11A）には、2つの独立したCARユニット、CD269-A7D（BCMA CARまたは抗CD269 CARとも呼ぶ）、およびCS1 CAR（CS1-hu63 CARまたは抗CS1 CARとも呼ぶ）。 BCMA-CS1-IL-15 / IL-15sushi CARはIL-15 / IL-15sushiを分泌できる。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
CARの発現
活性化されたヒト末梢血T細胞は、CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CARのレンチウイルスベクターで形質導入された。図11Bは、ヤギ抗マウスF(Ab’)2抗体での標識により決定された、コントロールベクターまたはCD269-A7D-hu63-IL15 / IL15sushi CARベクターのいずれかで形質導入された活性化T細胞間での形質導入効率を示す。CARベクターで形質導入された活性化T細胞は、CD269-A7D-hu63-IL15/IL15sushiに対して23.7％のF(Ab’)2陽性細胞をもたらした（図11B）。これらのCAR T細胞は、以下のin vitroでの殺傷アッセイで使用された。
CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、in vitroアッセイでCD269またはCS1抗原を発現する腫瘍細胞株を溶解できる
図11BのCD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞が、CD269（BCMA）またはCS1（CD319）抗原のいずれかを合成的に発現する両方のK562細胞を特異的に溶解する能力について測定した。野生型K562細胞は、CD269抗原またはCS1抗原発現用のレンチウイルスベクターで形質導入され、FACS（FACS-Aria、BD）により陽性が選別された。K562-BCMAxpまたはK562-CS1xp合成発現細胞との共培養を、2：1および5：1のエフェクター細胞：標的細胞の比率で48時間でセットアップした。このインキュベーションの後、マウス抗ヒトCD3抗体（すべての場合）、およびマウス抗ヒトCD269またはCS1のいずれかを使用して細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。2：1 E：T比では、K562-BCMAxp腫瘍細胞の58％が溶解したが、5：1比では、91％の腫瘍細胞が溶解した（図11C）。 K562-CS1-xp腫瘍細胞との共培養では、溶解率はそれぞれ33％と72％であった（図11C）。これらの結果は、CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の各CARコンポーネントが、目的の標的細胞を溶解できることを示している。
CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は異種マウスモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示す
CD269-A7D-CS1-hu63-IL15/IL15sushi CAR T細胞のインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、我々は、測定可能な腫瘍形成を誘発するために、 4 x 106 個のルシフェラーゼ発現MM.1S野生型の多発性骨髄腫細胞を致死量以下で照射したNSGマウスに静脈注射し、異種マウスモデルを開発した。腫瘍細胞の注射の8日後に、すべてのマウスに、コントロールT細胞またはCD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞を15 x 106個のコースで静脈内注射した。 8日目（T細胞治療の前日）、および12日目（治療後72時間）に、マウスのIVISイメージングを行って腫瘍量を測定した。
CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞を注入されたMM.1Sマウスで測定された平均光度を、コントロールT細胞を注入されたマウスのそれと比較して、標的細胞の溶解率を決定した。結果は、T細胞による処置の3日後（12日目）に、CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞で処置されたマウスは、コントロールT細胞を与えられたマウスよりも腫瘍負荷が90％低いことを示した（図11D）。これらの結果は、in vivoでの多発性骨髄腫細胞株に対するCD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の有効性を示している。さらに、屠殺時に採取した血液は、CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR T細胞を注入されたMM.1Sマウスにおいて、検出不能であったコントロールマウスよりも有意に高レベルのヒトIL-15 / IL-15sushiを検出したことを示した。
CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞におけるIL15の機能。
IL-15 / IL15sushiが分泌されているかどうかをさらに判断するために、NK-92細胞株にCD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CARを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選別するため、細胞をBD FACS Ariaでソートした（図11E）。選別した細胞を増やし、72時間後、上清を回収し、IL-15抗体でプレコートした96ウェルプレートでELISAを行った。製造元（Boster）の指示に従って、プレートリーダーで得られた比色分析の結果を、ヒトIL-15で作成された標準曲線と比較して、上清中のIL-15濃度を決定した。IL-15が上清で285.9 pg / mL検出されたことが確認された（図11F）。比較すると、同じ細胞数の野生型コントロールNK-92細胞を含む上清での濃度はわずか0.33 pg / mLであった。
CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞から分泌されるIL15 / IL15sushiは、T細胞の増殖のために、in vitroでIL-2の機能を代替することができる
NK-92細胞の培養にはIL-2の存在が必要である。 IL-15は、インビトロでのNK-92細胞の増殖または増幅のために、IL-2の不在を置き換えることができる。このシステムは、CD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CARで形質導入されたNK細胞から分泌される融合IL-15 / IL-15sushiの機能をテストするために使用される。選別されたCD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞、および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで、1 mLあたり0.5 x 10e6個の細胞、1 mLの総容量で培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの一方のウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれ、もう一方のウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）に細胞をカウントし、容量を増やして約0.5 x 10e6個の細胞/ mLの濃度にした。このプロセスを4、6、および8日目に繰り返した。図11Eのグラフに示すように、IL-2なしで、8日間培養したCD269-A7D-CS1-hu63-IL15 / IL15sushi NK CAR細胞は、IL-2を添加して培養した野生型NK-92細胞と同じ率で増殖し、一方、IL-2を添加せずに培養した野生型NK-92はすべて6日目までに死滅した。これは、NK CAR細胞から分泌されたIL-15がIL-2の増殖活性に代用できることを示している。
一実施形態では、操作された細胞は、BCMA-CS1 cCARポリペプチドおよびIL-15/IL-15sushi（配列番号４２）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号４３）を含む。
CD123b-CD33b cCAR（CD123-CD33 cCARのバージョン）T細胞によるCD123 +および/またはCD33 +白血病/リンパ腫のターゲティングの例
CD123b-CD33b cCAR T細胞の作製
レンチウイルスをトランスフェクトした細胞傷害性エフェクターT細胞は、自己切断P2Aペプチドによって連結された2つの完全なユニットのCARを発現するように設計された（図12A）。 得られたcompound CAR（CD123b-CD33b cCAR）は、CD123 +および/またはCD33 +白血病細胞を標的とすることができる（図12B）。リーダー、scFv、ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）、共刺激ドメイン（CD28または4-1BB）、および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ（CD3）が各CARユニットに含まれている。T細胞表面でのCD123b-CD33b cCAR分子の効率的な発現には、強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）とCD8リーダー配列を使用した。
CD123b-CD33b cCAR T細胞の形質導入効率
形質導入後のT細胞表面でのCD123b-CD33b cCAR発現レベルを評価するために、フローサイトメトリー分析を使用した（図13）。形質導入効率は25％であると決定された。
CD123b-CD33b cCAR T細胞は急性骨髄性白血病細胞株を効果的に溶解する
CD123b-CD33b cCAR（CD123b-CD33b cCAR）T細胞の抗腫瘍活性を評価するために、AML細胞株MOLM13（CD33 + CD123 +）と前単球U937細胞株（CD33 + CD123-）を使用して共培養を行った。フローサイトメトリー中でのターゲット白血病の（MOLM13とU927;どちらもCD3-）とエフェクターT細胞（CD3 +）を区別するために、細胞をCD3で染色した。エフェクターとターゲット（E：T）の比率が2：1と5：1の共培養アッセイを24時間実施し、フローサイトメトリー分析を使用して、CD123b-CD33b cCAR T細胞またはコントロールT細胞による細胞溶解率を決定した（図14A、14B）。2：1のE：T比で、CD123b-CD33b cCAR T細胞は、コントロールT細胞と比較した場合、約98％のCD123 + CD33 + MOLM13細胞と99.9％のCD33 + U937細胞を溶解することができた。さらに、5：1の比率では、両方の細胞株の100％の溶解が観察された（図14C）。また、MOLM13およびU937細胞株の両方で発現した表面マーカーを検証した（図14C）。全体として、これらの結果は、CD123b-CD33b cCAR T細胞がいずれかまたは両方の抗原を発現している腫瘍細胞を特異的かつ確実に排除することを示唆する。さらに、CD123b-CD33b cCAR T細胞が、CD123ではなくCD33のみを発現するU937細胞を効果的にアブレートしたという発見は、compound CARの各個別のユニットが独立してその抗原を標的とし、1つの抗原のみまたは両方の抗原を発現する標的を排除できるという事実を支持する。
我々はさらに、他の2つの細胞株、KG1a（CD123dimCD33 +）およびHL60（CD123dimCD33 +）に対するE：T比を変化および減少させることにより、CD123b-CD33b cCAR T細胞の用量依存性の腫瘍溶解能を評価した。CD123b-CD33b cCAR T細胞をKG1aおよびHL60細胞株に対して0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、5：1、および10：1のE：T比で培養し、0.25：1の比率でも75％以上の腫瘍溶解能力を示した。全体として、5：1の比率で飽和するまで、用量と腫瘍溶解の間には強い相関があった（図14D）。
CD123b-CD33b cCAR T-細胞は原発性骨髄性白血病腫瘍細胞を効果的に溶解する
次に、原発性腫瘍細胞に対するCD123b-CD33b cCAR T細胞の抗腫瘍特性を確立した。 CAR T細胞とCD3-白血病サンプルを区別するために、細胞をCD3で染色した。2つのCD123 + CD33 + AMLおよび2つのCD123 + B-ALLサンプル（PT1：AML、PT2：B-ALL、PT3：AML、およびPT4：B-ALL）を含むさまざまな患者の原発性白血病サンプルをこのパネルでアッセイし、枯渇した標的集団を取り囲んで腫瘍溶解を検証するためにフローサイトメトリー分析が実施された（図15）。AML細胞株に関する以前の抗腫瘍細胞毒性の結果（図14）と比較して、CD123b-CD33b cCAR T細胞は、すべての患者サンプルに対して2：1の比率で80％以上の腫瘍溶解率、5：1の比率で98％以上の腫瘍溶解率を伴うポジティブな結果を示した（図15）。さらに、私たちの細胞株と同様に、CD123b-CD33b cCAR T細胞がCD33ではなくCD123のみを発現するPT2細胞を効果的にアブレートしたという発見は、compound CARの各個別のユニットが独立してその抗原を標的とし、その標的抗原の1つだけ（CD33 + U937およびCD123 + PT2細胞に対して見られる）または両方の標的抗原（CD123 + CD33 + MOLM13およびPT1細胞に対して見られる）発現細胞を排除できるという事実を裏付けている。全体として、これらの結果は、CD123b-CD33b cCAR T細胞が、一方または両方の抗原を発現している患者の腫瘍細胞に対して高い殺傷効果を示すことを示唆している。
我々は、また、PT3サンプルの白血病幹細胞（CD123 + CD34 + CD38-）およびPT4サンプルの骨髄性白血病バルク疾患（CD34variableCD33 +）を含む特定の細胞集団を排除するCD123b-CD33b cCARの能力も具体的に調査した（図15C、15D ）。 我々は、CD123b-CD33b cCAR T細胞が、LSCsとバルク疾患細胞の両方を正常にアブレートしたことを発見した。
CD123b-CD33b cCART細胞の別個の受容体ユニットは、抗原特異的な方法で独立して標的細胞を溶解する
cCARの独立した抗原標的能力をさらに確認するために、CD123またはCD33のいずれかを発現するJurkat人工細胞株を作製し、どちらの抗原も発現しない野生型Jurkat細胞に加えて、これらの細胞に対してCD123b-CD33b cCAR T細胞をテストした（図16）。我々は、CD123b-CD33b cCAR T細胞は、どちらの抗原も発現していない野生型Jurkat細胞と比較して、CD123またはCD33抗原のいずれかを発現している細胞を特異的かつ強力に除去したことを発見した（図16A、16B、16C）。全体的に見て、我々のCD123b-CD33b cCAR T細胞はいずれかのCAR受容体の刺激を介して作用し、1つの標的抗原のみまたは両方を等しく発現している細胞を標的とすることができ、高い効率で標的を排除できると結論付ける。
CD123b-CD33b cCAR T細胞は、MOLM13細胞とU937細胞を使用したAMLの2つの異種移植マウスモデルで、強力な抗腫瘍活性を示す
CD123b-CD33b cCAR T細胞のin vivoでの抗腫瘍活性を患者の治療効果の予測因子として評価するために、2つの異種移植マウスモデルを開発した（図17）。致死量以下で照射した（2.0 Gy）NSGマウスに、1.0 x 106個のホタルルシフェラーゼ発現MOLM13細胞または1.0 x 106個のホタルルシフェラーゼ発現U937細胞のいずれかを静脈内注射した。MOLM13またはU937生着後の4日目に、マウスにCD123b-CD33b cCARまたはコントロールT細胞のいずれかの10×106個の細胞を静脈内注射した。マウスの腫瘍負荷を評価するために、RediJect D-ルシフェリン（Perkin-Elmer）を6、9、13日目に腹腔内注射し、マウスをIVISイメージングにかけてルシフェラーゼ活性（Caliper LifeSciences）を定量化した（図17A、17B） 。IVISイメージングで観察されたように、総フラックスレベルは、大幅な腫瘍量の増加を伴うコントロールマウスで継続的に増加した。対照的に、CD123b-CD33b cCARで処置したマウスは、腫瘍負荷を3日目までに有意に抑制した。6日目までに、cCARで処置したマウスでは、両方のモデルで腫瘍負荷が80％以上減少した（図17A、17B）。CD123b-CD33b cCARでの処置マウスの総フラックスはバックグラウンドのnull値近くに留まり、コントロールT細胞での処置マウスと統計的に有意な差があり、この腫瘍抑制は維持され、13日目まで効力が増加した。
我々は屠殺時の腫瘍細胞とCAR T細胞の持続性も評価した。
末梢血を屠殺時にコントロールマウスと共に各実験マウスから採取し、フローサイトメトリーを介して移植腫瘍（MOLM13またはU937細胞）およびT細胞（cCARまたはコントロール）の有無を分析した。MOLM13およびU937細胞はCD3-細胞であり、CD3 + CARまたはコントロールT細胞と区別できる。マウス末梢血細胞は、側方散乱光とヒトCD45抗体によってゲートされ、CD3とCD33に分けられた。コントロ－ルでの治療マウスは末梢血に有意な残存腫瘍集団（約75-87％）を示したが、CD123b-CD33b cCARでの治療マウスは、コントロールマウスにおけるすべての腫瘍の実質的な枯渇を示した（図17C）。さらに、CD123b-CD33b cCARでの処置マウスは、末梢血中の実質的にはCAR T細胞であるヒト細胞での有意なT細胞の増殖を示した。これにより、cCAR T細胞が長期的な応答を維持する能力と持続性が確認される。さらに、CD123b-CD33b cCARでの処置マウスは、コントロール処置マウスと比較して有意に生存転帰の増加を示しました（図17A、17B）。
CAMPATHによる治療後の注入されたcCAR T細胞のin vivoでの枯渇
急性骨髄性白血病に対してCAR T細胞を用いた臨床治療では、CAR療法による予期しない副作用のため、腫瘍の枯渇後あるいは緊急の場合、患者からCAR T細胞を排除する安全な方法の確立が必要になる場合がある。 T細胞とB細胞は細胞表面にCD52を発現し、CD52特異的抗体であるCAMPATH（アレムツズマブ）はCD52 +細胞を循環系から排除することができる。 CAMPATHでの処置によるCAR除去の効果を評価するために、説明のように、我々はin vivoでの手順を実施した（図18A）。照射したマウスに10 x 106個のcCAR T細胞を静脈注射した。翌日、各グループの3匹のマウスにIP注射を介して、0.1 mg / kgのCAMPATHまたはPBSを投与した。CAMPATH処置の6時間後と24時間後に末梢血を採取し、FACS分析によりcCAR T細胞の存在を確認した。 cCAR T細胞は、側方散乱光（SSC）およびCD3の発現とCD3およびCD45の発現によってゲートされ、マウス細胞と区別された。CAMPATH注射により、6時間と24時間の両方で血中のcCAR T細胞が枯渇した（図18B、18C）。これらの発見は、循環系からCAR-T細胞を急速に枯渇させる安全スイッチとしてのCAMPATHの使用をサポートしている。
一実施形態では、操作された細胞は、CD123-CD33 cCARポリペプチド、およびIL-15/IL-15sushi（配列番号３４）、および対応するヌクレオチド（配列番号３５）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD123-CLL1 cCARポリペプチド、およびIL-15/IL-15sushi（配列番号３６）、および対応するヌクレオチド（配列番号３７）を含む。
CD19b-CD123 cCAR（CD19-CD123 cCARのバージョン）によるB-ALLおよびその他の白血病のターゲットの例
CD19b-CD123 cCAR T細胞の作製
レンチウイルスをトランスフェクトした細胞傷害性エフェクター細胞、すなわちT細胞は、自己切断P2Aペプチドによって抗CD123フラグメント（scFv2、CD123）に融合した抗CD19単鎖可変フラグメント（scFv1、CD19b）領域を発現するように設計されている。これらの抗体ドメインは、CD8由来のヒンジ（H）および膜貫通（TM）領域によって4-1BBおよびCD28共活性化ドメインとCD3ζシグナル伝達ドメインにリンクされている（図19）。強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）とCD8リーダー配列は、T細胞表面でのCD19b-CD123 cCAR分子の効率的な発現に使用された。
CD19b-CD123 cCAR T細胞の形質導入効率
臍帯血（UCB）バフィーコートから分離されたT細胞は、活性化の2日後にCD19b-CD123 cCARレンチウイルスで形質導入された。CD19b-CD123 cCARの形質導入効率は、フローサイトメトリーにより26％と測定された（図20）。
CD19b-CD123 cCAR-2G T細胞は、CD19陽性およびCD123陽性の白血病細胞株を効果的に溶解する
CD19b-CD123 cCAR T細胞の細胞傷害性を評価するために、人工的にCD19およびCD123を発現させた白血病/リンパ腫細胞株に対して、5：1のエフェクター：ターゲット（E：T）比で共培養アッセイを行った。K562細胞（骨髄性白血病細胞株）を使用して、レンチウイルスの感染（K19と命名）によってCD19抗原を発現させ、野生型K562細胞株をコントロールとして使用した。Jurkat細胞を同様に用いて、CD123抗原（J123と命名）を発現させ、野生型Jurkat細胞をコントロールとして使用した。
CD19b-CD123 cCAR T細胞による標的細胞の溶解は、フローサイトメトリーによって定量化された。16時間の共培養では、CD19b-CD123 cCAR T細胞は、16時間でK19細胞の66％以上、48時間では99％以上溶解した（図21A）。 J123細胞の88％以上が16時間で溶解し、飽和に達した（図21Bおよび21D）。コントロールK562およびコントロールJurkat細胞は有意に溶解せず、溶解は20％未満であった。 CD19b-CD123 cCAR T細胞が人工的に誘導された単一陽性のCD19細胞とCD123細胞の両方を効果的にアブレーションするという発見は、compound CARの各個別のユニットが独立してその抗原を標的とし、1つの抗原のみまたは両方の抗原を発現する標的を排除できるという考えを支持する。
さらに、コントロールK562およびJurkat細胞の細胞溶解の欠如は、CD19b-CD123 cCAR T細胞が抗原特異的な細胞傷害性を示すことを示している。
我々は、次に、CD19b-CD123 cCAR T細胞が、自然に発生するCD19 / CD123抗原の発現を伴うヒトマントル細胞リンパ腫SP53（CD19 + CD123-）およびヒト急性骨髄性白血病KG1a（CD19- CD123 +）らの白血病/リンパ腫細胞株を標的とする能力を評価した。16時間の共培養で、CD19b-CD123 cCARはSP53細胞の実質的に完全な溶解を示し、標的細胞が86％消失し、飽和に達した（図21C）。KG1aでは、CD19b-CD123 cCARは、16時間で69％以上のCD123 +標的細胞を溶解し、48時間で94％以上を溶解した（図21Cおよび21D）。全体として、CD19b-CD123 cCAR T細胞は、特異的かつ効果的にいずれかの抗原標的を発現する標的集団を溶解し、有効なバルクな細胞毒性を示す。
CD19b-CD123 cCAR-2G T細胞は、原発性B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）および急性骨髄性白血病（AML）腫瘍細胞を効果的に溶解する
我々は、多様な種類の原発性白血病細胞を殺傷する能力を評価するために、原発性腫瘍細胞に対してCD19b-CD123 cCAR T細胞を使用して共培養を行った。患者のサンプルをCMTMR Cytotracker Dyeで染色することで、原発性腫瘍細胞とCAR T細胞を区別した。PT1：B-ALLとPT2：AMLの2つのサンプルで共培養を行い、腫瘍溶解を確認するためにフローサイトメトリーを行った。PT1サンプルのフローサイトメトリー分析では、明確なCD19 + CD123 +集団を含む、ほぼ完全なCD19 +表現型が見られた。 PT2サンプルは、部分的なCD123 + CD19-表現型を含む混合腫瘍の表現型を示した（図22A）。CD19b-CD123 cCAR T細胞は、PT1原発性のB-ALLサンプルに強力なアブレーションを示し、24時間でのE：T比5：1でほぼ完全に溶解した（図22Bおよび22D。CD19b-CD123cCAR T細胞もまたPT2原発性のAMLサンプルをアブレートし、24時間で31％溶解し、48時間で67％溶解した（図22Cおよび22D）。要約すると、CD19b-CD123 cCAR T細胞は、白血病細胞株と、CD19とCD123の異なる組み合わせを発現する原発性腫瘍細胞の両方に対して強力な抗腫瘍活性を示した（図22D）
CD19b-CD123 cCAR-3G T細胞は、MOLM-13およびREH細胞を用いたAMLおよびB-ALLの2つの異種移植マウスモデルにおいて、強力な抗腫瘍活性を示す。
CD19b-CD123 cCAR T細胞のin vivo抗腫瘍活性を評価するために、我々は、1つはルシフェラーゼを発現するMOLM13細胞（CD123 + CD19-）で、もう1つはルシフェラーゼを発現するREH細胞（CD19 + CD123- ）で測定可能な腫瘍形成を誘発する、2つのモデルを開発した。マウスにCD19b-CD123 cCAR T細胞またはコントロールGFP細胞を単回投与し、腫瘍負荷を3、6、8および11日目に測定した（図23A）。MOLM13モデルでは、6日目までにcCAR治療群とコントロール群の間に有意差（P <0.01）があり、コントロール群と比較して、光強度が弱く、したがってCD19b-CD123 cCAR T細胞注入したグループでの腫瘍負荷が少なかった（図23B）。CD19b-CD123 CAR T細胞を注射したマウスは、11日目までにコントロールマウスよりも腫瘍負荷が99％減少した。次に、2つのグループ間でマウスの生存率を比較した。前述のIVISイメージング実験に続いて、マウスに重症の症状がないか毎日観察し、動きが大きく損なわれた時点で屠殺した。すべてのコントロールマウスは18日目までに死亡したが、CD19b-CD123 CAR Tでの処置マウスは、コントロールマウスよりも最大15日長く生存した（p = 0.0031）（図23C）。
0A1同様の結果がREHマウスモデルで見られた（図23D）。 CD19b-CD123 cCAR T細胞を注射したREH白血病マウスは、16日目にコントロールマウスより99％少ない腫瘍負荷を示した（図23E）。cCARとコントロールで処置したグループ間でマウスの生存率を比較すると、CD19b-CD123 cCAR Tを注入したマウスは、コントロールマウスよりもはるかに長く生存した（図23F）（p = 0.0031）。要約すると、これらのin vivoのデータは、コントロールT細胞と比較すると、CD19b-CD123 cCAR T細胞が腫瘍量を大幅に軽減し、MOLM13注入およびREH注入NSGマウスの生存を延長することを示している。
BCMA +および/またはCS1 +白血病細胞、特に共培養殺傷アッセイを使用した多発性骨髄腫細胞を標的とするcCARのいくつかのバージョンのスクリーニングと評価。
BCMA（CD269）-CS1 cCARの異なるバージョンの世代。
上記のように、異なるCARユニットを持つcompound CARの作成は非常に困難な場合がある。強力なプロモーターとP2A自己切断部位を使用して、単一のベクターでCARの複数のユニットを発現するために、さまざまなCARボディエレメントを選択した。CARのヒンジ領域は、各CARユニット間のヒンジ領域の相互作用を回避できるように選択された。レンチウイルスをトランスフェクトした細胞傷害性エフェクター細胞、すなわちT細胞は、自己開裂P2Aペプチドによって抗CS1フラグメント（scFv2）に融合した抗BCMA（CD269）単鎖可変フラグメント（scFv1）領域を発現するように設計された。これらのscFvドメインは、CD8由来のヒンジ（H）および膜貫通（TM）領域によって4-1BBおよびCD28共活性化ドメインとCD3ζ（CD3）シグナル伝達ドメインにリンクされている（図30）。強力な脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）とCD8リーダー配列は、T細胞表面上のcompound CAR分子の効率的な発現に使用された。最後に作製されたコンストラクトをスクリーニングし、その発現と機能を評価した。 scFv1は、BCMA抗原に対する異なるscFvバージョン（A7DまたはC11D）を表す。 scFv 2は、CS1抗原に対する異なるscFvバージョン（hu63またはmu34またはmu90）を表す。
BCMA-CS1 cCARレンチウイルスのさまざまなバージョンで形質導入されたT細胞におけるCAR発現のさまざまなレベル。
末梢血単核バフィーコート細胞は3日間活性化され、CD269（A7DまたはC11D）とCS1（hu63、mu34またはmu90）CARを含む6種類の異なる配列のバリエーションのcCAR、またはコントロールベクターのレンチウイルスベクターで形質導入された。T細胞表面でのCARの発現は、形質導入T細胞をヤギ抗マウスFab抗体およびマウス抗ヒトCD3で染色することにより、形質導入の3日後に実証された。図30Aは、CD269-CS1 CARsのそれぞれについての表面発現を示す：A7D-mu34は11.2％、A7D-mu90は23.1％、A7D-hu63は28.5％、 C11D-mu34は28.0％、C11Dmu90 は13.6％そしてC11Dhu63は42％。 これは、最高レベルのCAR発現をもたらすCARユニットのペアを見つける必要性を示している。高効率のレンチウイルスパッケージング細胞株は、これらのコンストラクトの高力価の作製に重要です（図30B）。compound CARコンストラクトに対して高いウイルス力価をするため、我々はlenti-X 293 T細胞株をパッケージングシステムとして使用した。 Lenti-X 293Tパッケージング細胞株は他の細胞株よりも明らかに優れており、293 FT細胞の2～6倍の数のウイルスを産生した。
cCARの形質導入効率（CAR T細胞の割合）は、多くの場合、単一ユニットのCARよりも低くなる。トランスフェクションとトランスダクションの両方のステップで、効率を改善するいくつかの方法がある。cCARを作製するためのウイルス力価を改善するには、一般的に使用されるHEK-293FTの代わりに、高力価のレンチウイルス産生用に選択されたLentiX(商標)293 T（Clontech / Takara）パッケージング細胞株を使用することが好ましい。トランスフェクション効率を高めるために、パッケージング細胞にトランスフェクションする場合は、プラスミドDNA（cCARコンストラクトを含む）の量を1.5～2.0倍に増やすことも推奨される。ウイルスパッケージングプラスミドとトランスフェクション試薬の量は、複合体の形成には同じままである。形質導入効率をさらに高めるには、形質導入ステップでT細胞とウイルスベクターの比率を0.3 x 106個の細胞/ mLに下げ、レンチウイルス上清またはレンチウイルスの量を増やす。
さまざまな抗BCMAレンチウイルスベクターで形質導入されたT細胞でのCAR発現のテスト。
上記の研究に基づいて、CD269-A7D（別名A7D）およびCS1-hu63（別名hu63）が、enhanced CARまたはcompound CAR（cCAR）の作製に適した候補として選択された。我々はまた、同じ抗原BCMA上の2つのエピトープをターゲットとするcCAR（CD269-A7D-C11D-2G）を作製した。このcCARでは、CARの各ユニットは、BCMAの異なるエピトープをターゲットとする異なるscFvを持っている。Enhanced CARsは、BCMA抗原をターゲットとするCD269-A7D-IL15 / IL15sushiおよびCD269-A7D-41BBL-2Gである。Compound CARsは、BCMAおよびCD19抗原をターゲットとするCD269-A7D-CD19b-2G、およびBCMAおよびCS1抗原をターゲットとするCD269-A7D-CS1-hu63またはCD269-C11D-CS1-hu63-BBである。
末梢血単核バフィーコート細胞を3日間活性化し、単一のCAR（CD269-A7D-2G、CD269-A7D-IL15 / IL15sushi、CD269-A7D-41BBL-2G）およびcCAR（CD269-A-A7D-C11D-2G、CD269-A7D-CD19b-2G、CD269-A7D-CS1-hu63、CD269-C11D-CS1-hu63-BB））の抗BCMAレンチウイルスベクターまたはコントロールベクターで形質導入した（図30B）。T細胞表面でのCARの発現は、形質導入T細胞をヤギ抗マウスFab抗体およびマウス抗ヒトCD3で染色することにより、形質導入の3日後に実証された。図30Bは、レンチウイルスCARsのそれぞれについての表面発現を示す：CD269-A7D-2Gは48.4％、 CD269-A7D-IL15 / IL15sushi、は32.2％、CD269-A7D-41BBL-2Gは36％、CD269-A7D-C11D-2Gは27.4％、CD269-A7D-CD19b-2Gは30.6％、CD269-A7D-CS1-hu63は28.5％;およびCD269-C11D-CS1-hu63-BBは42.0％。
CD269-A7D-CD19b cCAR T細胞は、BCMAおよび/またはCD19発現腫瘍細胞株の両方を効率的に溶解する
CD269-A7D-CD19b cCAR T細胞を、in vitro共培養アッセイで個々の標的細胞株を溶解する能力についてテストした（図30Cおよび30D）。 K562細胞は、細胞表面にBCMA（CD269）（K-BCMAと呼ばれる）またはCD19（K-19と呼ばれる）のいずれかを合成的に発現するように修飾された。 18時間の共培養後、細胞を抗ヒトCD3および抗ヒトCD269またはCD19で標識し、フローサイトメトリーで分析した（図30CおよびCD30E）。CD269-A7D-CD19b cCAR T細胞は、標的K-BCMA細胞の31％を2：1 E：T比で、65％を5：1比で溶解することができた。CD269-A7D-CD19bcCAR T細胞もターゲットK-CD19細胞の60％を2：1 E：T比で溶解でき、ほぼすべてを5：1比で溶解できる（図30DおよびCD30E）。これらの結果は、各CARユニット（CD269およびCD19b CAR）がその特定の標的細胞を効果的に溶解することを確認する。
CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-CS1-hu63、およびCD269-A7D-C11D cCAR T細胞は、MM1S腫瘍細胞株を効率的に溶解する
上記で作製されたさまざまなバージョンのBCMA-CS1 cCAR T細胞を、in vitro共培養アッセイで特定の標的細胞株を溶解する能力についてテストした。ヒト多発性骨髄腫細胞株MM1Sは、CD269-A7D-41BBL CAR、CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR、CD269-A7D-C11D cCAR T細胞、またはコントロールT細胞と2：1および5：1 E：T比で共培養された（図30F）。18時間の共培養後、細胞をCMTMR（Cell Tracker）と抗ヒトCD269で標識し、フローサイトメトリーで分析した。 CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T細胞が溶解している間、CD269-A7D-41BBL CAR T細胞は、標的MM1S細胞の74％を2：1 E：T比率で、90％を5：1比率で溶解することができた、一方、CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T細胞は2：1および5：1の比率でMM1S細胞の59％および90％溶解し、CD269-A7D-C11D CAR T細胞はMM1S細胞の62％および86％をそれぞれ2：1および5：1の比率で溶解した（図30F）。これらのcompound CARは、CARとCARの相互作用の証拠を示すようには見えなかった。PCT/US2016/01995およびPCT/US2016/039306で記載されている方法を使用して、生体内での抗腫瘍活性、異種マウスモデルでの細胞殺傷を行い、BCMAまたはCS1または両方を発現する標的細胞をcCAR TまたはNK細胞で排除または抑制された。
CD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-CS1-hu63、およびCD269-A7D-C11D CAR T細胞は、BCMAまたはCS1を合成的に発現する細胞株K562を効率的に溶解する
上記で作製されたさまざまなバージョンのBCMA-CS1 cCAR T細胞を、in vitro共培養アッセイで特定の標的細胞株を溶解する能力についてテストした。K562細胞は、細胞表面でBCMA（CD269）またはCS1のいずれかを合成的に発現するように改変され、その後2：1および5：1のE：T比でCD269-A7D-41BBL、CD269-A7D-CS1-hu63、CD269-A7D-C11D cCAR T細胞またはコントロールT細胞と共培養された。18時間の共培養後、細胞を抗ヒトCD3および抗ヒトCD269（またはCS1）で標識し、フローサイトメトリーで分析した。 CD269-A7D-41BBL CAR T細胞は、標的K-BCMA細胞の56％を2：1 E：T比で溶解し、すべての標的細胞を5：1比で完全に除去しましたが、一方、CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T細胞はK-BCMA細胞を2：1および5：1の比率でそれぞれ、38％および79％溶解し、CD269-A7D-C11D CAR T細胞はK-BCMA細胞をそれぞれ2：1および5：1の比率で16％および74％を溶解した（図30G）。CD269-A7D-CS1-hu63、CD269-A7D-C11D cCAR T細胞のみが、K-CS1細胞に対する共培養でテストされた（図30H。CD269-A7D-CS1-hu63 cCAR T細胞は、K-562細胞をそれぞれ2：1および5：1の比率で18％および54％溶解した、一方、BCMA抗原上の2つの異なるエピトープをターゲットとするcompound CAR、 CD269-A7D-C11D cCAR T細胞は、CS1 CARユニットがないため、いずれの比率でも予想されたように、K-CS1細胞を溶解する能力を示さなかった（図30H）。これらの結果は、各CARユニットがそのターゲット母集団を特異的に溶解する能力を示している。
CLL1-CD33b cCAR（CLL1-CD33のバージョン）によるCLL1 +および/またはCD33 +白血病細胞のターゲティングの例
形質導入されたT細胞はCLL1-CD33b cCAR（CLL1-CD33b CAR）を効率的に発現する
末梢血単核バフィーコート細胞を2日間または3日間活性化し、CLL1-CD33b cCARまたはコントロールベクターのいずれかで形質導入した。T細胞表面でのCLL1-CD33b cCARの発現は、形質導入後3日目に、形質導入されたT細胞をヤギ抗マウスFab抗体およびマウス抗ヒトCD3で染色することにより示された。図31は、CLL1-CD33b cCARウイルスで形質導入された細胞の29.7％が、フローサイトメトリーでF（ab ’）2とCD3の両方に陽性であることを測定されたと示している。
CLL1-CD33b cCAR T細胞は、CLL1（CLL-1）とCD33を発現する腫瘍細胞株の両方を特異的に標的とする
T細胞共培養殺傷アッセイを実施して、CLL1-CD33b cCAR T細胞がCLL1（CLL-1）およびCD33発現細胞株を効果的かつ特異的に溶解する能力を決定した：自然に細胞表面に両方の抗原を発現する急性骨髄性白血病細胞株HL60; CLL1（Jurkat-CLL-1xpと呼ばれる）またはCD33（Jurkate-CD33xpと呼ばれる）のいずれかを合成的に発現するように改変されたJurkat細胞。さらに、CLL1-CD33b cCAR T細胞は、CLL1およびCD33に対して陰性であるREHおよびCCRF-CEM細胞株に対して共培養さた（図32Aおよび32B）。すべての標的細胞はCFSE膜色素であらかじめ標識されており、T細胞と区別されている。18時間の共培養後、細胞を抗ヒトCD3で標識し、フローサイトメトリーで分析した。2：1のエフェクター：ターゲット比率が低い場合、CLL1-CD33b cCAR T細胞はHL60細胞（89％）、Jurkat-CLL-1xp細胞（84％）およびJurkat -CD33xp細胞（96％）を効果的に溶解でき（図32C、32D、32E）、5：1のE：T比では、ほぼすべての標的細胞が枯渇した（図2a-d）。ただし、REH（8％）とCCRF-CEM細胞（14％）はどちらもオフターゲットであり、細胞溶解はほとんどなかった（図32Aおよび32B）。これは、CLL1-CD33b cCAR T溶解の顕著な効力と特異性を示している。結果を棒グラフにまとめる（図32F）。
CLL1-CD33b compound CAR T細胞は、in vitroで強力かつ指向性のある細胞障害性を示すことができる。
CAML-1とCD33の両方を大量に発現する標的AML細胞株HL60およびU937を使用して共培養アッセイを実施した。 CLL-1 CAR T細胞は、これらの細胞タイプの両方を90％以上の高効率で強力に除去できることがわかった（図32Gおよび32H）。さらに、compound CARは、基礎レベルの活性を有する陰性コントロール細胞株CCRF-CEMの最小限のターゲティングを示した（図32I）。
さらに、CLL1-CD33b cCARは、漸増する投薬計画において強力な用量依存性細胞毒性を示し、0.25：1（エフェクター：標的）細胞比の最低用量閾値でも約50％の活性を示した（図32J）。
単一のCAR Tオプションと比較して、CLL1-CD33b cCAR T細胞は優れた抗腫瘍活性を示す
CLL-1またはCD33のいずれかを発現するJurkat細胞を1：1の比率で組み合わせ、100,000個のエフェクター細胞とインキュベートして、最終的な有効なE：T比率を1：2にした。結果は、compound CARがCLL-1またはCD33を発現するJurkat細胞のセット（> 85％）に対して非常に特異的で強力な細胞障害性を示した一方で、それぞれの抗原に対する単一のCARオプションよりも高い細胞毒性を示した（図32Kおよび32L）。
CD19b-IL-21 CAR（CD19-IL-21 CARのバージョン）
使用例
操作されたCD19b-IL-21 (CD19b-IL21) CAR細胞は、本開示に従って調製された（図３３Ａ）。 分泌型IL-2を備えているCD19b CARは、CD19抗原を発現する白血病/リンパ腫を溶解する。
末梢血単核バフィーコート細胞を2日間または3日間活性化し、CD19b-IL-21またはコントロールベクターのいずれかで形質導入した。T細胞表面でのCD19b-IL-21の発現は、形質導入後3日目に、形質導入されたT細胞をヤギ抗マウスFab抗体およびマウス抗ヒトCD3で染色することにより示された。図33Bは、CD19b-IL-21 CARウイルスで形質導入された細胞の63.9％が、フローサイトメトリーでF（ab ’）2とCD3の両方に陽性であることを測定された事を示している。
IL-19-IL-21 CARで細胞殺傷アッセイを行い、CD19を発現する標的細胞を溶解する。
PCT/US2016/01995およびPCT/US2016/039306で記載されている方法を使用して、生体内での抗腫瘍活性、異種マウスモデルでの細胞殺傷を行い、CD19を発現する標的細胞は、CD19b-IL-21 CAR TまたはNK細胞によって排除または抑制される。
同様のアッセイをBCMA-IL-18 CARで使用できる（図35）
一実施形態では、操作された細胞は、CD19キメラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-21（配列番号16）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号17）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、CD19キメラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-21アンカー（配列番号1）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号2）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、BCMAキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-18（配列番号11）、ならびに対応するヌクレオチド（配列番号12）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、BCMAキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびIL-18アンカー（配列番号13）、および対応するヌクレオチド（配列番号14）を含む。
CD19b-IL-21アンカーCAR（CD19-IL-21アンカーのバージョン）
使用例
操作されたCD19b-IL-21アンカー（CD19b-IL21）CAR細胞は、本開示に従って調製された（図34）。 CD19b- IL-21アンカーCARは、CD19抗原を発現する白血病/リンパ腫を溶解する。
IL-19-IL-21アンカーCARで細胞殺傷アッセイを行い、CD19を発現する標的細胞を溶解する。
PCT/US2016/01995およびPCT/US2016/039306で記載されている方法を使用して、生体内での抗腫瘍活性、異種マウスモデルでの細胞殺傷を行い、CD19を発現する標的細胞は、CD19b-IL-21アンカー CAR TまたはNK細胞によって排除または抑制される。
同様のアッセイをBCMA-IL-18 CARアンカーで使用できる（図36）
BCMA-CD38 cCARによる多発性骨髄腫の標的化の例
使用例
操作されたBCMA-CD38 cCAR細胞は、本開示に従って調製された（図３７）。レンチウイルスをトランスフェクトした細胞傷害性エフェクターTまたはNK細胞は、自己切断P2Aペプチドによって連結された2つの完全なユニットのCARを発現するように設計された。得られたcompound CARは、BCMA +および/またはCD38 +多発性骨髄腫細胞または異常な形質細胞を標的とすることができる（図37）。リーダー、scFv、ヒンジドメイン（H）、膜貫通ドメイン（TM）、共刺激ドメイン（CD28または4-1BB）、および細胞内シグナル伝達ドメインCD3ゼータ（CD3）が各CARユニットに含まれている。強い脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター（SFFV）とCD8リーダー配列は、TまたはNK細胞表面でのBCMA-CD38 cCAR分子の効率的な発現に使用された。
BCMA-CD38 cCARは、BCMAおよび/またはCD38抗原を発現する多発性骨髄腫細胞または異常な形質細胞を溶解する。
BCMA-CD38 cCARで細胞殺傷アッセイを行い、BCMAおよび/またはCD38抗原を発現する標的細胞を溶解する。
PCT/US2016/01995およびPCT/US2016/039306で記載されている方法を使用して、生体内での抗腫瘍活性、異種マウスモデルでの細胞殺傷を行い、BCMAおよび/またはCD38抗原を発現する標的細胞は、BCMA-CD38 cCAR TまたはNK細胞によって排除または抑制される。
この実施例では、配列番号15を含むCD38抗原認識ドメイン 。
一実施形態では、操作された細胞は、ＢＣＭＡ抗原認識ドメインを有する第１のキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびＣＤ３８認識ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体ポリペプチドを含む。一実施形態では、この操作された細胞は、配列番号5、7、9のポリペプチドおよび、配列番号6、8、10に対応するポリヌクレオチドを含む。
CLL1-CD33b-IL-15 / IL-15sushi（CLL1-CD33-IL-15 / IL-15sushi）の構造組織
CLL1-CD33b-IL-15 / IL-15sushi（図39A）には、CARの2つの独立したユニット、CLL-1 CAR（抗CD371 CARまたは抗CLL1 CARとも呼ばれる）、およびCD33b CAR（抗CD33 CARとも呼ばれる）が含まれている。CLL1-CD33b-IL-15 / IL-15sushiはIL-15 / IL-15sushiを分泌することができる。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞またはNK T細胞およびそれらに隣接する腫瘍の免疫応答細胞の予期せぬ強力な免疫調節として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はCAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
CAR の発現
活性化されたヒト末梢血T細胞は、CLL1-CD33b-IL15/IL15sushi CARのレンチウイルスベクターで形質導入された。図39Bは、ヤギ抗マウスF(Ab’)2抗体での標識により決定された、コントロールベクターまたはCLL1-CD33b-IL15/IL-15sushi CARベクターのいずれかで形質導入された活性化T細胞間での形質導入効率を示す。CARベクターで形質導入された活性化T細胞は、CLL1-CD33b-IL15/IL15sushiに対して22％のF(Ab’)2陽性細胞をもたらした（図39B）。これらのCAR T細胞は、以下のin vitroでの殺傷アッセイで使用された。
CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、in vitroアッセイでCLL-1またはCD33抗原を発現する腫瘍細胞株を溶解することができる
図39BのCLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞が、CLL-1抗原またはCD33抗原のいずれかを合成的に発現するREH細胞を特異的に溶解する能力についてアッセイした。野生型REH細胞に、CLL-1またはCD33抗原発現用のレンチウイルスベクターを形質導入し、FACS（FACS-Aria、BD）で陽性を選別し、REH-CLL1xpおよびREH-CD33xp細胞株を作製した。コントロールT細胞またはCLL1-CD33b-IL15 / IL-15sushi CAR T細胞、およびREH-CLL1xp（CLL-1抗原を発現するREH細胞）またはREH-CD33xp（CD33抗原を発現するREH細胞）細胞のいずれかと2：1および5：1のエフェクター細胞：標的細胞の比率で、24時間の共培養をセットアップした。このインキュベーション後、マウス抗ヒトCD3抗体（すべての場合）、およびマウス抗ヒトCLL1またはCD33のいずれかを使用して細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。 2：1 E：T比では、76％のREH-CLL1xp腫瘍細胞が溶解し、5：1比では、94％の腫瘍細胞が溶解した（図39C）。REH-CD33xp細胞との共培養では、溶解も2：1で66.7％、5：1で96％であった（図39C）。これらの結果は、CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の各CARコンポーネントが、目的の標的細胞を溶解できることを示している。
CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は異種マウスモデルで有意な抗腫瘍活性を示す
CLL1-CD33b-IL15/IL-15sushi CAR T細胞のインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、我々は、測定可能な腫瘍形成を誘発するために、 1 x 106 個の細胞表面にCD33を発現する ルシフェラーゼ発現MOLM13野生型の急性骨髄性白血病腫瘍細胞を致死量以下で照射したNSGマウスに静脈注射し、異種マウスモデルを開発した。腫瘍細胞の注射の4日後に、すべてのマウスに、コントロールT細胞またはCLL1-CD33b-IL15/IL-15sushi CAR T細胞を15 x 106個のコースで静脈内注射した。 4日目（T細胞治療の前日）、および8日目（治療後72時間）に、12匹のマウスのIVISイメージングを行って腫瘍量を測定した。CLL1-CD33b-IL15/IL15sushi CAR T細胞を注入されたMOLM13マウスで測定された平均光度を、コントロールT細胞を注入されたマウスのそれと比較して、標的細胞の溶解率を決定した。結果は、T細胞による処置の3日後（8日目）に、CLL1-CD33b-IL15/IL15sushi CAR T細胞で処置されたマウスは、コントロールT細胞を与えられたマウスよりも63％（背側図）および59％（腹側図）腫瘍負荷が低かった（図40A、40B）。12日目までに、溶解率はそれぞれ77％と86％に増加した。これらの結果は、in vivoでのAML細胞株に対するCLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の有効性を示している。
IL-15 / IL15sushiの分泌により、マウスの末梢血中にCLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞が持続する
MOLM13腫瘍細胞がさまざまな臓器に広がることによる麻痺の兆候が見られたので、各コントロールマウスを18日目に安楽死させ、屠殺時に4匹のマウスのそれぞれから採血した。 2匹のCAR T細胞での処置マウスを21日目と23日目に安楽死させた。末梢血を採取し、マウス抗ヒトCD45、CD3およびCD33で標識し、フローサイトメトリーを行った。移植されたヒト細胞はCD45によってゲートされ、T細胞およびMOLM13細胞集団について分析された。図４０Ｃに示されるように、コントロールマウスは腫瘍細胞（青い点）の大きな集団を有していたが、ＣＡＲ Ｔでの処置マウスの血液にはほとんど腫瘍がないように見えた。血液中の腫瘍細胞の消失にもかかわらず、これらのマウスは、CAR T細胞の持続の兆候としてのCAR T細胞（緑色の点）の大集団、および他の臓器に隔離されたMOLM13腫瘍細胞の生着からのマウスの保護を維持した。この持続性がIL15 / IL-15sushiの分泌によるものであるかどうかを判断するために、各マウスの血漿をELISAにかけ、分泌されたヒトIL-15融合体の量を定量した。図40Cに示すように、IL-15は2匹のコントロールマウスでは検出されなかったが、CAR T細胞での処置マウスでは30および40 pg / mLの低濃度のIL-15が検出された。
CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞におけるIL15の機能。
IL-15が分泌されているかどうかを確認するために、NK-92細胞株にCLL1-CD33b-IL15 / IL-15sushi CARを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選ぶため、細胞をBD FACS Ariaでソートした（図40D）。選別した細胞を増殖させ、72時間後、上清を回収し、IL-15抗体でプレコートした96ウェルプレートでELISAに供した。製造元（Boster）の指示に従い、プレートリーダーで得られた比色分析の結果をヒトIL-15で作成された標準曲線と比較して、上清中のIL-15の濃度を決定した（図40E）。488 pg / mLのIL -15が上清で検出されたことが判明した。比較すると、ほぼ同じ細胞数の野生型コントロールNK-92細胞を含む上清のバックグラウンド濃度はわずか0.33 pg / mLであった。
CLL1-CD33b-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞から分泌されたIL15 / IL-15sushiは、in vitroでIL-2の機能を代替することができる
選別されたCLL1-CD33b-IL15/IL15sushi CAR NK細胞、および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで、1 mLあたり0.5 x 10e6個の細胞、1 mLの総容量で培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの一方のウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれ、もう一方のウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）に細胞をカウントし、容量を増やして約0.5 x 10e6個の細胞/ mLの濃度にした。このプロセスを4、6、および8日目に繰り返した。図40Dのグラフに示すように、IL-2なしで、8日間培養したCLL1-CD33b-IL15/IL15sushi NK CAR細胞は、IL-2を添加して培養した野生型NK-92細胞と同じ率で増殖し、一方、IL-2を添加せずに培養した野生型NK-92はすべて6日目までに死滅した。これは、NK CAR細胞から分泌されたIL-15がIL-2の増殖活性に代用できることを示している。
CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CARの作製と特性評価
コンストラクトは、P2Aペプチドによって連結されたCARの複数のモジュラーユニットの発現を駆動するSFFVプロモーターを含む。リンカーが開裂すると、cCAR、CD20h-CD19b cCARまたはCD20h-CD19b cCARが分かれ、CD20および/またはCD19を発現するターゲットに関与する。新規のcCARコンストラクトとして、コンストラクトの活性化ドメインは、CD20h CARまたはCD20c CARセグメント上の4-1BB、およびCD19b CARセグメント上のCD28領域を含み得るが、これらに限定されない。cCARのCD20h CARセクションには、CD20発現細胞を標的とするヒト化抗CD20 scFvが含まれている。
CD20および/またはCD19発現細胞を標的とするCD20-CD19のcompound CARの2つのバージョンは、CD20c-CD19b（CD20cCD19b）およびCD20h-CD19b CAR（CD20hCD19b）で、上記と同様の方法を使用する。形質導入されたT細胞における2つのcompound CAR、CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CARの発現率は、それぞれ22％および28％であった（図41A）。バフィーコート細胞は、抗CD3抗体で3日後に活性化された。細胞は、コントロールベクター（左）、CD20cCD19bまたはCD20hCD19b CAR（右）レンチウイルス上清のいずれかで形質導入された。 3日間のインキュベーション後、細胞を回収し、フローサイトメトリー用に標識した。
非標的野生型K562細胞に対するCD20cCD19bおよびCD20hCD19b CAR T細胞の特異性を評価するために、エフェクターと標的の比率が2：1または5：1で6時間共培養実験を行い、CD3およびCD45を用いフローサイトメトリーによって直接分析した（図41B）。各アッセイは、K652ターゲット細胞のみ（右）、コントロールT細胞（左）、およびCD20cCD19bまたはCD20hCD19b CAR T細胞（中央パネル）で構成された。標的細胞は青い点で表される（N = 2）。 CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CAR T細胞は、共培養アッセイでCD20またはCD19を発現しなかったK562腫瘍細胞株を溶解しなかった。
CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CAR T細胞がCD19を発現する標的細胞を溶解する能力を評価するために、24時間、2：1または5：1のエフェクターと標的の比率でCD19抗原（K-19）を合成的に発現する標的K562細胞株を用いて共培養実験を行い、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーで直接分析した（図41C）。各アッセイは、K562-CD19xpターゲット細胞のみ（右側）、コントロールT細胞（左側のパネル）、およびCD20cCD19bまたはCD20hCD19b CAR T細胞（中央のパネル）で構成された。標的細胞は緑色の点で表される。両方のタイプのcompound CAR T細胞は、共培養アッセイでCD19を合成的に発現するK562腫瘍細胞株を溶解した。
CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CAR T細胞がCD20を発現する標的細胞を溶解する能力を評価するために、24時間、2：1または5：1のエフェクターと標的の比率でCD20抗原（K-20xp）を合成的に発現する標的K562細胞株を用いて共培養実験を行い、CD20およびCD3でのフローサイトメトリーで直接分析した（図41D）。各アッセイは、K562-CD20xpターゲット細胞のみ（右側）、コントロールT細胞（左側のパネル）、およびCD20cCD19bまたはCD20hCD19b CAR T細胞（中央のパネル）で構成された。標的細胞は緑色の点で表される。両方のタイプのcompound CAR T細胞は、共培養アッセイでCD19 またはCD20を合成的に発現するK562腫瘍細胞株を溶解した（図41Cおよび41D）。
CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CAR T細胞がCD19を発現する標的REH細胞への特異性を評価するために、24時間、2：1または5：1のエフェクターと標的の比率でCD19発現REH細胞株を用いて共培養実験を行い、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーで直接分析した（図41D）。各アッセイは、REHターゲット細胞のみ（右側）、コントロールT細胞（左側のパネル）、およびCD20cCD19bまたはCD20hCD19b CAR T細胞（中央のパネル）で構成された。標的細胞は緑色の点で表される。両方のタイプのcompound CAR T細胞は、共培養アッセイでCD19発現REH腫瘍細胞株を完全に溶解した（図41E）。
CD20cCD19bおよびCD20hCD19b CAR T細胞がCD19とCD20の両方の抗原を発現する標的細胞を溶解する能力を評価するために、24時間、2：1または5：1のエフェクターと標的の比率でCD19およびCD20を発現するSP53 B細胞リンパ腫細胞株を用いて共培養実験を行い、CD19およびCD3でのフローサイトメトリーで直接分析した（図41F）。各アッセイは、SP53標的細胞のみ（右側）、コントロールT細胞（左側のパネル）、およびCD20cCD19bまたはCD20hCD19b CAR T細胞（中央のパネル）で構成された。標的細胞は、青緑色のドットとして表される（N = 2）。両方のタイプのcompound CAR T細胞は、共培養アッセイで、CD19抗原とCD20抗原の両方を発現するSP53腫瘍細胞株を完全に溶解した。
K562wt（野生型）は6時間の共培養で、その他は24時間で行われた共培養の結果の概要を図41Gに示す（N = 2）。CD20hCD19b-2G CAR T細胞は、CD20cCD19b-2G CAR T細胞と比較して、CD20抗原を合成的に発現しているターゲットK562細胞のより強力な殺傷を示し、両方のcompared CARタイプがコントロールT細胞と比較して優れたオンターゲットの溶解を示した。
In vivoでのCD20h-CD19 CAR T細胞の抗腫瘍活性を特徴づけるため、NSGマウスに致死量未満の放射線を照射し、1.0 x 106個のルシフェラーゼ発現REH細胞を静脈内注射して（0日目）、測定可能な腫瘍形成を誘導した（図42A、B）。腫瘍細胞の注射の6日後に、CD20hCD19b CAR TまたはベクターコントロールT細胞のいずれかを10 x 106個の1コースでマウスに静脈内注射を開始した。5、9、12日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。 12日目までに、CD20h-CD19 CAR T細胞は、背側と腹側の両方で腫瘍細胞の98％の溶解を達成した。これらの結果は、CD20h-CD19 CAR T細胞がCD19抗原を発現するREH細胞の強力な溶解を示すことを示している。
CD20h-CD19b-IL-15 / IL-15sushi（CD20hCD19b-IL-15 / IL-15sushi）の構造組織
Compound CAR（cCAR）、CD20h-CD19b-IL-15 / IL-15sushi（図43A）には、CARの2つの独立したユニット、CD20h CAR（抗CD20 CARとも呼ばれる）、およびCD19b CAR（抗CD19 CARとも呼ばれる）が含まれている。CD20h-CD19b-IL-15 / IL-15sushiはIL-15 / IL-15sushiを分泌することができる。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対して予期せぬ強力な免疫調節として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はCAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
CAR の発現
活性化されたヒト末梢血T細胞は、CD20h-CD19b-IL15 / IL15sushiからのレンチウイルスベクターで形質導入された。図43Bは、ヤギ抗マウスF(Ab’)2抗体での標識により決定された、コントロールベクターまたはCD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CARベクターのいずれかで形質導入された活性化T細胞間での形質導入効率を示す。CARベクターで形質導入された活性化T細胞は、CD20h-CD19b-IL15/IL15sushiに対して25％のF(Ab’)2陽性細胞をもたらした（図43B）。これらのCAR T細胞は、以下のin vitroでの殺傷アッセイに使用された。
CD20h-CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、in vitroアッセイでCD20抗原またはCD19抗原のいずれかまたは両方を発現する腫瘍細胞株を溶解することができる
図43BのCD20h-CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞が、CD20を合成的に発現するU937細胞（U937-CD20xpまたはU-CD20xpとも呼ばれる）とCD19抗原を自然に発現するREH細胞の両方を特異的に溶解する能力について評価した。野生型U937細胞は、CD20抗原発現のためにレンチウイルスベクターで形質導入され、FACS（U-CD20xp; FACS-Aria、BD）によって陽性が選別された。コントロールT細胞またはCD20h-CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞とU-CD20xp細胞、またはREH野生型細胞のいずれかと2：1および5：1のエフェクター細胞：標的細胞の比率で、24時間の共培養をセットアップした。このインキュベーション後、マウス抗ヒトCD3抗体（すべての場合）、およびマウス抗ヒトCD20またはCD19のいずれかを使用して細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。2：1のE：T比では、77％のU-CD20xp腫瘍細胞が溶解し、5：1の比では、74％の腫瘍細胞が溶解した（図43C）。REH腫瘍細胞との共培養では、ほぼ完全に溶解し、2：1比で96％、5：1比で99％であった（図43C）。これらの結果は、CD20h-CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の各CARコンポーネントが、目的の標的細胞を溶解できることを示している。
CD20h-CD19b-IL15 / IL-15sushi CAR T細胞は異種マウスモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示す
CD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR T細胞のインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、我々は、測定可能な腫瘍形成を誘発するために、1 x 106 個のルシフェラーゼ発現REH野生型のB-ALL腫細胞を致死量以下で照射したNSGマウスに静脈注射し、異種マウスモデルを開発した。腫瘍細胞の注射の4日後に、すべてのマウスに、コントロールT細胞またはCD20h-CD19b-IL15/IL-15sushi CAR T細胞を15 x 106個のコースで静脈内注射した。 4日目（T細胞治療の前日）、および8日目（治療後72時間）12、16日目に、マウスのIVISイメージングを行って腫瘍量を測定した。CD20h-CD19b-IL15 / IL-15sushi CAR T細胞を注入されたREHマウスで測定された平均光度を、コントロールT細胞を注入されたマウスのそれと比較して、標的細胞の溶解率を決定した。結果は、T細胞による処置のわずか3日後に（8日目）、コントロールT細胞を与えられたマウスより、CD20h-CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞で処置されたマウスの腫瘍負荷が> 90％（背側）および> 86％（腹側）低いことを示した。（図44A、B）。16日目までに、腫瘍は検出されなかった。これらの結果は、in vivoでの急性リンパ芽球性リンパ腫細胞株に対するCD20h-CD19b-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の有効性を示している。
IL15 / IL-15sushiの分泌は、マウスの末梢血におけるCD20h-CD19b-IL15 / IL-15sushi CAR T細胞の持続をもたらす
REH腫瘍細胞がさまざまな臓器に広がることによる麻痺の兆候が見られたので、各コントロールマウスを28および30日目に安楽死させ、屠殺時に4匹のマウス、それぞれから採血した。 2匹のCAR T細胞での処置マウスを33日目と36日目に安楽死させた、ただし、36日目に安楽死させたマウスは、まだ比較的動いていた。末梢血を採取し、マウス抗ヒトCD45、CD3およびCD19で標識し、フローサイトメトリーを行った。移植されたヒト細胞はCD45によってゲートされ、T細胞およびREH細胞集団について分析された。図４4Ｃに示されるように、コントロールマウスは腫瘍細胞（青い点）の大きな集団を有していたが、ＣＡＲ Ｔでの処置マウスの血液にはほとんど腫瘍がないように見えた。血液中の腫瘍細胞の消失にもかかわらず、これらのマウスは、CAR T細胞の持続の兆候としてのCAR T細胞（緑色の点）の大集団、および他の臓器に隔離されたREH腫瘍細胞の生着からのマウスの保護を維持した。この持続性がIL15 / IL-15sushiの分泌によるものであるかどうかを判断するために、各マウスの血漿をELISAにかけ、分泌されたヒトIL-15の量を定量した。図44Cに示すように、ヒトIL-15は2匹のコントロールマウスでは検出されなかったが、CAR T細胞で処置したマウスで159 pg / mLの濃度が検出され、安楽死させた36日目にはまだ比較的健康であるように見えた。
CD20h-CD19b-IL15 / IL-15sushi CAR NK細胞におけるIL15の機能。
IL-15が分泌されているかどうかを確認するために、NK-92細胞株にCD20h-CD19b-IL15/IL-15sushi CARを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選ぶため、細胞をBD FACS Ariaでソートした（図44D）。選別した細胞を増殖させ、72時間後、上清を回収し、IL-15抗体でプレコートした96ウェルプレートでELISAに供した。製造元（Boster）の指示に従い、プレートリーダーで得られた比色分析の結果をヒトIL-15で作成された標準曲線と比較して、上清中のIL-15の濃度を決定した（図44E）。328 pg / mLのIL -15が上清で検出されたことが判明した。比較すると、ほぼ同じ細胞数の野生型コントロールNK-92細胞を含む上清のバックグラウンド濃度はわずか0.33 pg / mLであった。
CD20h-CD19b-IL15 / IL15sushi CAR NK細胞から分泌されるIL15 / IL15sushiは、試験管内での増殖と成長に関連するIL-2の機能の代わりになる。
選別されたCD20h-CD19b-IL15/IL15sushi CAR NK細胞、および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで、1 mLあたり0.5 x 10e6個の細胞、1 mLの総容量で培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの一方のウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれ、もう一方のウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）に細胞をカウントし、容量を増やして約0.5 x 10e6個の細胞/ mLの濃度にした。このプロセスを4、6、および8日目に繰り返した。図44Dのグラフに示すように、IL-2なしで、8日間培養したCD20h-CD19b-IL15/IL-15sushi NK CAR細胞は、IL-2を添加して培養した野生型NK-92細胞と同じ率で増殖し、一方、IL-2を添加せずに培養した野生型NK-92はすべて6日目までに死滅した。これは、NK CAR細胞から分泌されたIL-15がIL-2の増殖活性に代用できることを示している。
一実施形態では、操作された細胞は、CD20-CD19 cCARポリペプチド、およびIL-15/IL-15sushi（配列番号28）、および対応するヌクレオチド（配列番号29）を含む。
１つの実施形態において、操作された細胞は、CD20-CD19 cCARポリペプチド（配列番号52）、および対応するヌクレオチド（配列番号53）を含む。
CD19b-IL-15/IL-15sushi CARの作製
CD19b-IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞は、以前に記載されているように（Pinz、2015）レンチウイルスコンストラクトを用いて一次末梢血T細胞に形質導入することによって作製された。CD19b-IL-15 / IL-15sushi CARコンストラクトには、CARの1つのユニットである抗CD19 CAR（CD19b CARとも呼ばれる）が含まれている。 CD19b-IL-15 / IL-15sushi CARはIL-15 / IL-15sushiを分泌できる（図45A）。可溶性IL-15/IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はCAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
フローサイトメトリー分析により、T細胞の約35％が、形質導入後にCD19b-IL-15 / IL-15sushi CAR F(Ab’)2フラグメントを発現したことを示した（図45A）。このCD19b-IL-15 / IL15suhsi CARは、1）標的腫瘍細胞を消去する、2）抗腫瘍細胞毒性を強化する、3）IL-15 / IL15-sushi融合体を分泌することにより、CARの効力と持続性を確実に増加させるように設計されている。
共培養実験は、エフェクターとターゲット（E：T）の比率が1：1から5：1の範囲で24時間で行われ、マウス抗ヒトCD3pPerCpおよびマウス抗ヒトCD19- PEを用いたフローサイトメトリーによって直接分析された。各アッセイは、P2AコントロールまたはCAR T細胞のいずれかとインキュベートした標的細胞（Sp53は、すべてCD19 +）からなる。この実験により、CD19b-IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞の用量依存的な性質が明らかにり、1：1のような低いE：T比でも、60％を超える腫瘍細胞の強力な溶解が見られた。2：1比で、すべての腫瘍細胞が溶解し、殺傷能力の飽和が観察された（図45B）。
CD19b-IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞は、CD19 + Sp53細胞を強力に溶解する（CD19bシングルCART細胞との比較）
この実験スキームでは上記と同様の共培養条件を使用し（図45B）、抗CD19 CAR共発現IL-15 / IL-15sushi（CD19b-IL-15 / IL-15sushi）CAR T細胞を、コントロールP2Aと単一の抗CD19b CAR T細胞の両方と比較するため、CD19陽性Reh細胞に対して培養した。抗CD19b CART細胞は同じ方法で作製され、T細胞表面での発現は～50％（すべてのT細胞の、データは示されていない）であることが確認された。ここでの結果は、1：1のような低いE：T比でさえ、両方のCART治療が等しく効果的であり、すべての抗原陽性Reh細胞の強力かつ実際の消去があることを示している。 「分泌型IL-15 / IL-15sushi融合体」は、CAR T細胞の細胞障害性に有害な影響を与えない。
CD19b-IL-15 / IL-15sushi CARTコンストラクトは、標準のCD19 CARに比べて持続性と生物学的活性が強化される
CARの分泌IL-15 / IL-15sushiが現在のCAR T / NK細胞のパラダイムの実行可能なオプションとして特徴付けるために、1）標的細胞を殺傷する能力（有効性）、2）バイオアベイラビリティとサーベイランスの増加のための持続性の強化、および3）より強力なCAR T表現型の増殖の3つの広範な要因について分析した。我々は、CD19b-IL-15 / IL-15sushi CARコンストラクトは、標準のCART-19（CD19b CAR）に匹敵するわずかに優れた有効性で、Rehモデルの腫瘍成長をin vivoで制御できることがわかった（図46A）。2番目のRehモデルでは、標準的なCAR T（CD19b CAR）治療で時間の経過とともにReh腫瘍が再発したが、IL-15 / IL-15sushi分泌CARは持続し、再発した腫瘍を消去して、マウスを無病に保った（図46Bおよび46C）。さらに、生存エンドポイントによって、CD19b-IL-15 / IL-15sushi CAR T細胞をマウスに投与すると、IL-15 / IL-15sushiを分泌しないCD19b CARと比較して、細胞障害性T細胞の明確な集団が血中により高いレベルで残っていることが明らかになった（図46D）。さらに、両方の治療グループの残りのT細胞の集団では、CAR T細胞（CD19b-IL-15 / IL-15sushi）がIL-15 / IL-15sushiを分泌することにより、CD8 +細胞のより高い集団を含む、細胞障害性のT細胞集団が生じる（図46DおよびE）。
BCMA-CD38 compound CARsの作製
3つのバージョンの複合CAR、CD269-A7D-CD38b、CD269-A7D-CD38a、およびCD269-A7D-CD38cが作成され、それら CAR T細胞は、以前に記載されているように（Pinz、2015）レンチウイルスコンストラクトを用いて一次末梢血T細胞に形質導入することによって作製された。フローサイトメトリー分析は、形質導入後のF（Ab ’）2フラグメントを用い、さまざまなレベルのCAR T細胞の発現を示した（図45A）。
図45AのCD269-A7D-CD38aまたはCD269-A7D-CD38b CAR T細胞が、CD38を自然に発現するREHを特異的に溶解する能力についてアッセイした。コントロールT細胞またはCD269-A7D-CD38aまたはCD269-A7D-CD38b CAR T細胞とREH野生型細胞と2：1および5：1のエフェクター細胞：標的細胞の比率で、24時間の共培養をセットアップした（図47B）。
CD269-A7D-CD38aまたはCD269-A7D-CD38b CAR T細胞も、BCMAを合成的に発現するK562細胞を標的とする能力についてテストされた。コントロールT細胞またはCD269-A7D-CD38aまたはCD269-A7D-CD38bと、野生型またはK562発現BCMA（k-BCMA）細胞と2：1および5：1のエフェクター細胞：標的細胞の比率で、24時間の共培養をセットアップした。このインキュベーション後、マウス抗ヒトCD3抗体（すべての場合）、およびマウス抗ヒトBCMA (CD269)のいずれかを使用して細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。両方のCAR T細胞ともに、標的細胞の著しい溶解を示した（図47C）。
CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi CAR（別名BCMA-CD38-IL-15 / IL-15sushi CAR）の構造組織
CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi（図48A）には、2つのCAR、CD269-A7D（抗BCMA CARまたは抗CD269 CARとも呼ばれる）、およびCD38a CAR（抗CD38とも呼ばれる）の2つの独立したユニットが含まれている。CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushiはIL-15 / IL-15sushiを分泌することができる。可溶性IL-15/IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はCAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
CARの発現
活性化されたヒト末梢血T細胞は、CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CARのレンチウイルスベクターで形質導入された。図1は、ヤギ抗マウスF(Ab’)2抗体での標識により決定された、コントロールベクターまたはCD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CARベクターのいずれかで形質導入された活性化T細胞間での形質導入効率を示す。CARベクターで形質導入された活性化T細胞は、CD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushiに対して33％のF(Ab’)2陽性細胞をもたらした（図48B）。これらのCAR T細胞は、以下のin vitroでの殺傷アッセイに使用された。
CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi CARで形質導入されたT細胞は、CD38 + T細胞の自己殺傷を示す
CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi CARで形質導入されたT細胞がCD38a CARドメインによって溶解されるかどうかを判断するために、細胞を6日目（上記の抗F(Ab’)2標識と同じ日）および12日目に回収した。細胞をマウス抗ヒトCD3およびCD38で標識し、フローサイトメトリーで分析した。図2に示すように、6日目のCD38を発現するCAR T細胞の数は、コントロールT細胞と比較してほぼ半分（97％～51％）に減少したが、12日目までに、ほとんどすべてのCAR細胞はCD38-であった。これは、CD38a CARによるCD38 + T細胞の殺傷または自己殺傷の裏付けである。
CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi CAR T細胞は、BCMA（CD269）またはCD38抗原のいずれかを発現する腫瘍細胞株をin vitroアッセイで溶解できる
図48BのCD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi CAR T細胞が、BCMA（CD269）抗原を合成的に発現するK562細胞またはCD38抗原を自然に発現する野生型REH細胞を特異的に溶解する能力についてアッセイした。野生型K562細胞にBCMA抗原発現用のレンチウイルスベクターを形質導入し、FACS（FACS-Aria、BD）で陽性細胞を選別してK-BCMAxp細胞株を作製した。コントロールT細胞またはCD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CAR T細胞と、K-BCMAxpまたはREH細胞のいずれかと、2：1および5：1のエフェクター細胞：標的細胞の比率で、24時間または48時間での共培養をセットアップした。このインキュベーション後、マウス抗ヒトCD3抗体（すべての場合）、およびマウス抗ヒトCD269またはCD38のいずれかを使用して細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。結果は、CD269-A7D-CD38a-IL15 / IL15sushi CAR T細胞の各CARコンポーネントが、目的の標的細胞を溶解できることを示している（図48D）。
CD269-A7D-CD38a -IL15 / IL15sushi CAR NK細胞におけるIL-15の機能。
IL-15が分泌されているかどうかを確認するために、NK-92細胞株にCD269-A7D-CD38a-IL15/IL15sushi CARを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選ぶため、細胞をBD FACS Ariaでソートした（図48E）。選別した細胞を増殖させ、72時間後、上清を回収し、IL-15抗体でプレコートした96ウェルプレートでELISAに供した。製造元（Boster）の指示に従い、プレートリーダーで得られた比色分析の結果をヒトIL-15で作成された標準曲線と比較して、上清中のIL-15の濃度を決定した（図48F）。512 pg / mLのIL -15が上清で検出されたことが判明した。比較すると、ほぼ同じ細胞数の野生型コントロールNK-92細胞を含む上清のバックグラウンド濃度は0であった。
CD269-A7D-CD38a -IL15 / IL15sushi CAR NK細胞から分泌されたIL15 / IL15sushiは、試験管内での増殖と成長に関連するIL-2の機能の代わりになる。
選別されたCD269-A7D-CD38a -IL15/IL15sushi CAR NK細胞、および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで、1 mLあたり0.5 x 10e6個の細胞、1 mLの総容量で培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの一方のウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれ、もう一方のウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）に細胞をカウントし、容量を増やして約0.5 x 10e6個の細胞/ mLの濃度にした。このプロセスを4、6、および8日目に繰り返した。図48Eのグラフに示すように、IL-2なしで、8日間培養したCD269-A7D-CD38a -IL15/IL15sushi NK CAR細胞は、IL-2を添加して培養した野生型NK-92細胞と同じ率で増殖し、一方、IL-2を添加せずに培養した野生型NK-92はすべて6日目までに死滅した。これは、NK CAR細胞から分泌されたIL-15がIL-2の増殖活性に代用できることを示している。
CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi cCAR
CD123b-CD33b-IL15 / IL15sushi（別名CD123-CD33-IL-15 / IL-15sushi）およびCD123b-CLL1-IL15 / IL15sushi（別名CD123-CLL1-IL15 / IL-15sushi）cCARの構造的構成
CD123b-CD33b-IL15 / IL15sushiには、2つのCARの2つの独立したユニット、CD123b CAR（抗CD123 CARとも呼ばれる）、およびCD33b CAR（抗CD33 CARとも呼ばれる）が含まれている。
CD123b-CLL1-IL15 / IL15sushiには、2つのCARの2つの独立したユニット、CD123b CAR（抗CD123 CARとも呼ばれる）、およびCLL-1 CAR（抗CLL1 CARとも呼ばれる）も含まれている。両方のCARコンストラクトは、説明されている同様の方法を使用して作製された。
両方のCARはIL-15/IL-15sushiを分泌することができた。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞またはNK T細胞、およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はCAR T / NK細胞またはNK T細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
CD123b-CD33b-IL15 / IL15sushiおよびCD123b-CLL1-IL15 / IL15sushi CARにおけるIL-15の機能
IL-15が分泌されているかどうかを確認するために、NK-92細胞株にCD123b-CD33b-IL15/IL15sushi または CD123b-CLL1-IL15/IL15sushを含むレンチウイルスベクターを形質導入した。F(Ab’)2表現型が陽性のNK細胞を選ぶため、細胞をBD FACS Ariaでソートした（図49B）。選別した細胞を増殖させ、72時間後、上清を回収し、IL-15抗体でプレコートした96ウェルプレートでELISAに供した。製造元（Boster）の指示に従い、プレートリーダーで得られた比色分析の結果をヒトIL-15で作成された標準曲線と比較して、上清中のIL-15の濃度を決定した（図49C）。CD123b-CD33b-IL-15 / IL-15sushiおよびCD123b-CLL1-IL-15 / IL-15sushi NK細胞から、IL-15sushiがそれぞれ上清で> 1500 pg / mLおよび> 1000 pg / mLで検出されたことが判明した。比較すると、ほぼ同じ細胞数の野生型コントロールNK-92細胞を含む上清のバックグラウンド濃度は0に近かった。
CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi および CD123b-CLL1-IL15/IL15sushi CAR NK細胞から分泌されたIL15 / IL15sushiは、試験管内での増殖と成長に関連するIL-2の機能の代わりになる。
CD123b-CD33b-IL15/IL15sushi および CD123b-CLL1-IL15/IL15sush
選別されたCD123b-CD33b-IL15/IL15sushiまたはCD123b-CLL1-IL15/IL15sushi CAR NK細胞、および野生型NK-92細胞を、24ウェルプレートで、1 mLあたり0.5 x 10e6個の細胞、1 mLの総容量で培養した。細胞をデュプリケートでウェルに追加し、各ペアの一方のウェルには300 IU / mLのIL-2が含まれ、もう一方のウェルには含まれていない。 48時間後（2日目）に細胞をカウントし、容量を増やして約0.5 x 10e6個の細胞/ mLの濃度にした。このプロセスを4、6、および8日目に繰り返した。図49Bのグラフに示すように、IL-2なしで、8日間培養したCD123b-CD33b-IL15/IL15sushi または CD123b-CLL1-IL15/IL15sushi NK CAR細胞は、IL-2を添加して培養した野生型NK-92細胞と同じ率で増殖し、一方、IL-2を添加せずに培養した野生型NK-92はすべて8日目までに死滅した。これは、NK CAR細胞から分泌されたIL-15がIL-2の増殖活性に代用できることを示している。
UCAR (universal CAR)作製の例
ヒト臍帯血から調製したBCMA15 / IL-15sushi-CAR発現ヒトNK細胞の作製
BCMA15 / IL-15sushi-CARコンストラクト（CD269-A7D-IL-15 / IL-15sushiまたはBCMA CARVacとも呼ばれる）には、CAR、CD269-A7D（抗BCMA CARまたは抗CD269 CARとも呼ばれる）の1つのユニットが含まれている（図50A）。BCMA15 / IL-15sushi-CARは、IL-15 / IL-15sushiを分泌できる。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NK細胞、およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はCAR T / NK細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
臍帯血NK細胞の増殖のためのフィーダー細胞の作製：
フィーダー細胞を作製するための工程を、フローチャートとともに図50Bに示す。 K562細胞に、表面にアンカータンパク質またはscFvタグ付きIL-21（IL-21アンカー）（図55を参照）またはscFvタグ付き4-1BBLおよびIL-15 / IL-15sushiアンカー（super 2とも呼ばれる）を発現するレンチウイルスが形質導入される（図54および図55）。
一実施形態では、操作されたK562細胞は、IL-21アンカーポリペプチド（配列番号1）、および対応するヌクレオチド（配列番号2）を含む。
一実施形態では、操作されたK562細胞は、super2ポリペプチド（配列番号50）、および対応するヌクレオチド（配列番号51）を含む。
K562は、IL-21アンカーまたはsuper 2レンチウイルスで48時間形質導入される。形質導入後、細胞を増殖させ、FACSによる遺伝子改変K562細胞の選別のために抗体によって標識する。選別された遺伝子組み換えK562細胞を増やし、照射し（10-100Gy）、使用するまで凍結する。照射された遺伝子組み換えK562細胞は、臍帯血細胞に刺激を与え、フィーダー細胞としてNK細胞を増殖させる。
ヒト臍帯血からのヒトNK細胞の増殖（図50C）。
フローチャート（図50C）は、照射された遺伝子組み換えK562細胞との共培養による、臍帯血からのCAR形質導入ナチュラルキラー（NK）細胞の作製と増殖の手順を示している。臍帯血細胞を300U / ml IL-2を含むT細胞培養培地で48時間培養する。照射された遺伝子組み換えK562細胞が臍帯血細胞に追加され、NK細胞を刺激し、48時間増殖させる。
刺激された臍帯血細胞はCARレンチウイルスで形質導入され、最大48時間インキュベートされる。 CARで形質導入された臍帯血細胞は、照射された遺伝子組み換えK562フィーダー細胞と再び共培養される。
2～3日ごとに、CARで形質導入した臍帯血細胞を数え、細胞の状態を維持するために新鮮な培地を供給する。外因性IL-2は、すべての細胞培養培地に添加される。
2週間後、NK細胞の増殖倍率は、初日と比較して220～680倍になる。 3週間後、NK細胞の増殖倍率は初日と比較して450～1500倍になる。
NK細胞とT細胞の割合、およびNK細胞でのCARの発現は、再度マウスのFabフラグメントの抗体を使用したフローサイトメトリー分析によって決定される。
フローサイトメトリー分析は、臍帯血細胞におけるBCMA-IL15 / IL15sushi-CAR-ウイルスの形質導入後の臍帯血細胞におけるCD56陽性細胞（ピンク色で囲まれた青い点）上でのBCMA-IL15 / IL15sushi-CARの発現レベルを示す。
これらのデータは、BCMA-IL15 / IL15sushi-CARウイルスの臍帯血NK細胞への形質導入により、BCMA-IL15 / IL15sushi-CARを発現したNK細胞の作製が成功したことを示している。
BCMA-IL-15 / IL15sushi-CAR NK細胞は、in vivoマウスモデルで驚くほど予期しない抗白血病効果を示す。
ヒト臍帯血由来のBCMA-IL-15/IL-15sushi-CAR 発現 NK細胞のインビボでの特異的な抗腫瘍活性を評価するために、我々は、測定可能な腫瘍形成を誘発するために、ルシフェラーゼ発現MM.1S多発性骨髄腫細胞を致死量以下で照射したNSGマウスに静脈注射し、異種マウスモデルを開発した。4日目に、マウスに、10 x 106個のコントロールNK細胞またはBCMA-IL15/IL15sushi-CAR発現NK細胞を静脈内注射した。 3、6、8日目および10日目に、マウスにRediJect D-ルシフェリンを皮下注射し、IVISイメージングを行った。IVISイメージングで観察されたように、腫瘍量の増加に伴い、総フラックスのレベルは、コントロールマウスで継続的に増加した。対照的に、BCMA-IL15 / IL15sushi-CAR-NK細胞を注入したマウスは、腫瘍負荷を6日目までに有意に抑制し、腫瘍負荷を59.5％減少させた、CAR NK細胞で処置した10日後（6日目）、BCMA-IL-15 / IL-15sushi CAR NK細胞で処置したマウスは、コントロールNK細胞を与えたマウスよりも腫瘍負荷が84％以上低い結果を示した（図51Aおよび51B） 。さらに、CAR NK細胞で処置されたマウスは、非常に有意で、さらに好ましい生存転帰を示した。45日までしか生存しなかったコントロールと比較し、CAR NK細胞で処置したマウスが80日以上の生存し、ログランク（Mantel-Cox）検定p = 0.0069を示す生存曲線が作成された（図51C）。
注入されたBCMA-A7D-IL15 / IL15sushi CARを形質導入したNK細胞のインビボでの持続性の評価。
BCMA-A-7D-IL-15 / IL-15sushi（CD269-IL-15 / IL-15sushiとも呼ばれる）NK細胞の持続性を評価するために、我々は致死量以下で照射したNSGマウスを使用し、測定可能な腫瘍形成を誘導するために、1 x 106個のルシフェラーゼ発現MM1S多発性骨髄腫細胞を静脈内注射して異種マウスモデルを開発した。4日目に、白血病マウスに、ヒト臍帯血由来の10 x 106個のBCMA-A-7D-IL-15 / IL-15sushi NK細胞を静脈内注射した。 異種移植マウスモデルにおける注入されたBCMA-A7D-IL15 / IL15sushi CAR形質導入NK細胞の持続性の評価は、25日目（図52A）および60日目（図52B）に行われた。 25日目（マウスにコントロールNKまたはCAR NK細胞を注入して21日後）および60日目（マウスにコントロールNKまたはCAR NK細胞を注入して58日後）に、末梢血を個々のマウスから採集し、注入されたコントロールおよび/またはCAR-NK細胞の存在を検出するため、細胞をヒトCD56-およびヒトCD45抗体を使用して標識した。MM1S骨髄腫細胞株は、CD56およびCD45に対して陰性であり（図52A左パネル）、マウスのヒトNK細胞のモニタリングに使用できる。採取された末梢血中のコントロールNK細胞またはBCMA-IL15 / IL15sushi CAR形質導入NK細胞の持続性は、フローサイトメトリー分析によって決定された。左側のパネルは、MM1SがCD56およびCD45に対して陰性であることを示している。BCMA-IL15 / IL15sushi-CAR形質導入NK細胞は、注入後の25日（図52A）および60日（図52B）以降に持続したが、非形質導入NK細胞（対照）はマウス内で検出されなかった。さらに、さらなる査定により、BCMA-IL15 / IL15sushi-CARで形質導入されたNK細胞が3か月以上持続することが示された。一般に、ヒトの非形質導入NK細胞は通常、マウス内で1～2週間未満しか持続しない。
ナチュラルキラー細胞は、ゲノム編集に関連するリスクを回避するuniversal CARを作製するための理想的なプラットフォームである。しかし、NK CAR細胞のin vivoでの寿命は非常に短く、寿命は1週間または2週間である。理想的には、NK細胞の持続性は、治療に適切と見なされるように1か月または2か月である必要がある。私たちは、IL-15 / IL-15sushi融合体を使用して持続性と殺傷性を改善したuniversal CAR治療用のNK細胞のプラットフォームを開発した。ここで発明された研究は、分泌型IL-15 / IL-15sushiを同時発現しているCAR NK細胞が、さまざまな疾患の治療のための非遺伝子編集のuniversal CARプラットフォームとして使用できることを示している。
CD123 CAR super1
CD123 CAR super 1の構造組織
CD123 CAR super 1（図57）には、CD123 CAR（抗CD123 CARまたはCD123b CARとも呼ばれる）であるCARが含まれている。 CD123b CAR super 1はまた、4-1BBLリガンドを共発現させて、CARの機能を強化し、IL-15/IL-15sushiの融合体を分泌する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は安定しており、CAR T / NKまたは NK T細胞、およびその隣接する腫瘍免疫応答細胞に対する予期せぬ強力な免疫調節因子として機能する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体はCAR T / NKまたは NK T細胞の持続性を向上させ、腫瘍浸潤リンパ球の増殖、および抗腫瘍活性を刺激する。可溶性IL-15 / IL-15sushi融合体は、癌と戦うために、体の免疫系を再プログラミングして、抗腫瘍ワクチンのような効果を提供する。
CAR の発現
臍帯血からのNK細胞は、CD123b CAR super 1を発現するレンチウイルスベクターで形質導入された。図58は、ヤギ抗マウスF（Ab ’）2抗体で標識して決定した、コントロールベクターまたはCD123b super 1のいずれかで形質導入されたNK細胞間の形質導入効率を示している。CARベクターで形質導入された活性化T細胞は、CD123b super 1に対して8％のF(Ab’)2陽性細胞をもたらした（図58）。これらのCAR T細胞は、以下のin vitro殺傷アッセイで使用された。機能試験は、インビトロおよびインビボで上記のように行われる。
一実施形態では、操作された細胞は、CD123bキメラ抗原受容体ポリペプチドおよび4-1BBLリガンド、ならびにIL-15/IL-15sushi（配列番号３２）、および対応するヌクレオチド（配列番号３３）を含む。
ヒト臍帯血由来のNK細胞におけるBCMA-CD38a-IL15 / IL15sushi cCAR
臍帯血からのNK細胞は、BCMA-CD38a-IL15/IL15sushi cCARを発現するレンチウイルスベクターで形質導入された。図59は、ヤギ抗マウスF（Ab ’）2抗体で標識して決定した、コントロールベクターまたはBCMA-CD38a-IL15/IL15sushi cCARのいずれかで形質導入されたNK細胞間の形質導入効率を示している。CARベクターで形質導入された活性化T細胞は、BCMA-CD38a-IL15/IL15sushi cCARに対して40％のF(Ab’)2陽性細胞をもたらした（図59）。これらのCAR T細胞は、以下のin vitro殺傷アッセイで使用された。機能試験は、インビトロおよびインビボで上記のように行われる。
一実施形態では、操作された細胞は、BCMA-CD38aキメラ抗原受容体ポリペプチドおよび4-1BBLリガンド、ならびにIL-15/IL-15sushi（配列番号40）、および対応するヌクレオチド（配列番号41）を含む。
GD2-Super1-CAR
使用例
図60Aに示すGD2 super1 CARの構造組織。P1AとT2Aでリンクされた、単一のコンストラクトで4-1BBLとIL-15 / IL-15sushiを備えたGD2 CARである CAR、super1 CARを作製する概略図を示す。コンストラクトは、CAR、4-1BBL、IL-15 / IL-15sushiの3つのセグメントの発現を駆動するSFFVプロモーターからなる。リンカー（P2AおよびT2A）が開裂すると、CAR、4-1BBL、およびIL-15 / IL-15sushiが分かれ、標的に関与する。 CARは、scFv、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン（CD28または4-1BBを含むがこれらに限定されない）および細胞内シグナル伝達、CD3ゼータ鎖を持つ。 4-1BBLまたはIL-15 / IL-sushi、あるいはその両方は、TまたはNK細胞の活性化とCD28または4-1BBによる持続性または抗腫瘍活性の相乗効果をもたらす。
GD2を標的とするさまざまなCAR構造のin vivoでの抗腫瘍活性を評価するために、我々は致死量以下で照射したNSGマウスを使用し、測定可能な腫瘍形成を誘導するために、ルシフェラーゼ発現Y79網膜芽細胞腫細胞を静脈内注射して異種マウスモデルを開発した。腫瘍細胞注射の3日後、GD2-CAR、GD2-4-1BBL CAR、またはGD2-super1 CAR、またはベクターコントロールT細胞のいずれかを10 x 10e6個のコースで静脈内注射した。CAR T細胞の持続性を決定するために、マウスを30日目に安楽死させた。肝臓、脾臓および全血を各マウスから回収した。
フローサイトメトリー分析は、さまざまなタイプの抗GD2 CAR T細胞で処置されたマウスの肝臓におけるY79腫瘍（青い点）の存続を示している（図60B）。ホモジナイズされた肝細胞をマウス抗ヒトCD3およびCD56抗体で標識し、それぞれヒトT細胞およびY79腫瘍細胞を検出した。左側にコントロールT細胞を与えられたマウス、GD2CAR（左中央）、GD2-4-1BBL CAR（右中央）、およびGD2-super1 CAR（右）T細胞で処置したマウスの結果が示されている。図60Bは、GD2CAR T細胞は、コントロールT細胞を与えられたマウスと比較して、肝臓からY79細胞を排除できなかったが、GD2-4-1-BBL CAR T細胞で処置されたマウスは、腫瘍細胞が32％少ないことを示している。対照的に、GD2-super1 CARでの処置マウスでは、肝臓の腫瘍細胞が85％減少した。次に、グラフが作成され、コントロールマウス（n = 2）と比較して、各CAR処置マウスによるY79細胞に対する殺傷活性の割合が示された（図60B）。これらのデータから、特にGD2-Super CARは肝臓のY79細胞を排除する。マウスの脾臓の分析では、コントロールマウスと比較してGD2-super1処置マウスでヒトT細胞が1.87倍増加し（図60C）、GD2CAR（1.15x）およびGD2-4-1BBL（1.35）よりも高いことが示された。このGD2-super1 T細胞の増加は、マウス全血の分析ではさらに顕著であり、コントロールマウスのほぼ3倍の増加があり、GD2CARのパーセンテージより2倍以上である（図60D）。次に、フローサイトメトリーによって分析された全細胞の数と比較して、全血サンプル中のヒトT細胞の持続性を示すグラフが作成された（各n = 2）（図60E）。これらのデータは、分泌されたIL-15 / IL-15sushiおよび4-1BBLドメインの両方を持つGD2-super1 CARがGD2発現腫瘍細胞を溶解し、GD2CARまたはGD2-41BBL CAR T細胞よりも持続性が高いことを強く示唆している。
一実施形態では、操作された細胞は、ＧＤ２キメラ抗原受容体ポリペプチドおよび４－１ＢＢＬリガンド（配列番号５８）、および対応するヌクレオチド（配列番号５９）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、ＧＤ２キメラ抗原受容体ポリペプチド（配列番号56）、および対応するヌクレオチド（配列番号57）を含む。
一実施形態では、操作された細胞は、GD2キメラ抗原受容体ポリペプチド、4-1BBLリガンドおよびIL-15/IL-15sushi（配列番号58）、および対応するヌクレオチド（配列番号59）を含む。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載の発明。
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