CN113728095A - 工程化的细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了用于诱导免疫细胞活性的系统，该系统包含嵌合抗原受体、T细胞受体、和其各种组合；表达该系统的分离的宿主细胞；包含该系统的抗原特异性免疫细胞；和免疫治疗的方法。

Description

工程化的细胞及其用途
背景技术
效应细胞活性通常涉及配体与结合在效应细胞膜上的受体的结合。配体和膜结合受体之间的此种相互作用(通常经由其细胞外结合结构域)可导致受体本身的构象和/或化学修饰，这进而可产生一系列累积以导致效应细胞激活的细胞内信号传导。利用此相互作用以开发针对癌细胞的免疫细胞疗法的尝试已显示出对血液系统恶性肿瘤的有希望的功效。然而，这些疗法存在许多缺点，包括在接受治疗的受试者中出现脱靶毒性和不希望的细胞因子释放综合征。此副作用和其他副作用可进一步加剧炎症反应、器官衰竭，以及在极端情况下导致死亡。
发明内容
鉴于前述内容，对于进行免疫治疗的替代组合物和方法存在非常大的需求。本披露的组合物和方法解决了此需要，并且还提供了额外的优点。本披露的各个方面提供了用于诱导免疫细胞活性的系统、组合物和方法。
在一个方面，本披露提供了用于诱导免疫细胞活性的系统，该系统包含：(a)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含表现出与第一表位特异性结合的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和缺乏CD3ζ(zeta)的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；和(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该复合物包含表现出与第二表位特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域与以下连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链，或(iii)CD3ζ链。
在一些实施例中，该第一抗原结合结构域与该第一表位的结合，和/或该第二抗原结合结构域与该第二表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
在一些实施例中，两个或更多个抗原结合结构域与以下任选地串联连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链，(iii)CD3ζ链，并且其中该两个或更多个抗原结合结构域与其各自表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
在一些实施例中，所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：该免疫细胞的克隆扩增；由该免疫细胞进行的细胞因子释放；该免疫细胞的细胞毒性；该免疫细胞的增殖；该免疫细胞的分化、去分化或转分化；该免疫细胞的运动和/或运输；该免疫细胞的衰竭和/或再活化；和由该免疫细胞进行的其他细胞内分子、代谢物、化学化合物、或其组合的释放。
在一些实施例中，该第一表位和该第二表位相同。在一些实施例中，该第一表位和该第二表位不同。
在一些实施例中，该第一抗原结合结构域和该第二抗原结合结构域包含相同的氨基酸序列。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域和该第二抗原结合结构域包含不同的氨基酸序列。
在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含表现出与该第二表位的结合的异源序列。
在一些实施例中，该经修饰的TCR包含第三抗原结合结构域，该第三抗原结合结构域与以下连接：(i)所述第二抗原结合结构域，(ii)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的该α链、该β链、该γ链、和该δ链，(iii)分化簇3(CD3)的该ε链、该δ链、和/或该γ链，或(iv)该CD3ζ链。
在一些实施例中，所述CAR的所述细胞内信号传导结构域缺乏基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
在一些实施例中，所述CAR进一步包含共刺激结构域。在一些实施例中，所述共刺激结构域包含MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、或Toll配体受体的信号传导结构域。
在一些实施例中，所述共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF-R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1、和VLA-6。
在一些实施例中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体、单域抗体、轻链可变结构域(VL)、或骆驼科抗体的可变结构域(VHH)。
在一些实施例中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含受体。在一些实施例中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含针对受体的配体。在一些实施例中，所述第一表位和所述第二表位存在于不同的抗原上。在一些实施例中，所述第一表位和所述第二表位存在于共同的抗原上。在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于一种或多种细胞表面抗原上。在一些实施例中，所述一种或多种细胞表面抗原是肿瘤相关抗原、酪氨酸激酶受体、丝氨酸激酶受体、和G蛋白偶联受体。在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于通用抗原上。在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于新生抗原上。在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位是新生表位。
在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于肿瘤相关抗原上。在一些实施例中，该肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素(adipophilin)、AFP、AIM-2、膜联蛋白(Annexin)II、ART-4、BAGE、BCMA、b-连环素、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CA-125、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、CLL-1、CTAG1B、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FAP、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、FR-α、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、GPC3、GPC-2、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、L1-CAM、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活蛋白、存活蛋白-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体、和κ-轻链。
在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于免疫检查点受体或免疫检查点受体配体上。在一些实施例中，所述免疫检查点受体或免疫检查点受体配体是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、TIGIT、LAG3、BLTA、CD47或CD40。
在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于细胞因子或细胞因子受体上。在一些实施例中，所述细胞因子或细胞因子受体是CCR2b、CXCR2(CXCL1受体)、CCR4(CCL17受体)、Gro-a、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、乙酰肝素酶、CD137L、LEM、Bcl-2、CCL17、CCL19或CCL2。
在一些实施例中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原上。在一些实施例中，该MHC是HLA 1类。在一些实施例中，该MHC是HLA2类。
在另一方面，本披露提供了表达本披露的以上系统的分离的宿主细胞。在一些实施例中，该宿主细胞是免疫细胞。在一些实施例中，该免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是T细胞。在一些实施例中，该T细胞是CD8+T细胞。在一些实施例中，该T细胞是CD4+T细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是γδT细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vγ9δ2T细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vδ1T细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ9δ2TCR、Vγ10/Vδ2TCR、和/或Vγ2/Vδ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ9δ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ10/Vδ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ2/Vδ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、KHYG(如KHYG-1)细胞或其衍生物。在一些实施例中，该宿主细胞表现出与同时存在于靶细胞中的两种抗原的特异性结合。
在另一方面，本披露提供了包含本披露的以上系统的抗原特异性免疫细胞。在一些实施例中，与该CAR连接的该抗原结合结构域主要介导该免疫细胞与靶细胞之间的相互作用，并且当该免疫细胞与该靶细胞之间发生相互作用时，与该TCR复合物连接的该抗原结合结构域主要介导免疫细胞活性。
在一些实施例中，所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：该免疫细胞的克隆扩增；由该免疫细胞进行的细胞因子释放；该免疫细胞的细胞毒性；该免疫细胞的增殖；该免疫细胞的分化、去分化或转分化；该免疫细胞的运动和/或运输；该免疫细胞的衰竭和/或再活化；和由该免疫细胞进行的其他细胞内分子、代谢物、化学化合物、或其组合的释放。在一些实施例中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，所述淋巴细胞是T细胞。在一些实施例中，所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是γδT细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vγ9δ2T细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vδ1T细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ9δ2TCR、Vγ10/Vδ2TCR、和/或Vγ2/Vδ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ9δ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ10/Vδ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ2/Vδ2TCR的γδT细胞。
在一些实施例中，该经修饰的TCR复合物包含含有异源序列的两个或更多个抗原结合结构域，该两个或更多个抗原结合结构域与以下任选地串联连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链，(iii)CD3ζ链。在一些实施例中，所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
在另一方面，本披露提供了免疫细胞群，单个免疫细胞表达本披露的以上系统。在一些实施例中，所述免疫细胞群包含至多约1011个细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞包含淋巴细胞。在一些实施例中，这些淋巴细胞是T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是CD4+T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是CD8+T细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是γδT细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vγ9δ2T细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vδ1T细胞。在一些实施例中，这些淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
在另一方面，本披露提供了诱导免疫细胞活性的方法，该方法包括：(a)在免疫细胞中表达本披露的以上系统；以及(b)在诱导该免疫细胞和/或靶细胞的所述活性的条件下使该靶细胞与该免疫细胞接触。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域与该第一表位的结合和/或该第二抗原结合结构域与该第二表位的结合激活该免疫细胞的细胞毒性。
在一些实施例中，两个或更多个抗原结合结构域包含异源序列，该两个或更多个抗原结合结构域与以下任选地串联连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链，(iii)CD3ζ链。
在一些实施例中，该靶细胞是癌细胞。在一些实施例中，该靶细胞是造血细胞。在一些实施例中，该靶细胞是实体瘤细胞。在一些实施例中，该靶细胞是在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、膈膜、软骨、韧带和肌腱中的一种或多种中鉴定的细胞。
在一些实施例中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是T细胞。在一些实施例中，该T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是γδT细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vγ9δ2T细胞。在一些实施例中，该γδT细胞是Vδ1T细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ9δ2TCR、Vγ10/Vδ2TCR、和/或Vγ2/Vδ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ9δ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ10/Vδ2TCR的γδT细胞。在一些实施例中，该淋巴细胞是包含Vγ2/Vδ2TCR的γδT细胞。
在一些实施例中，当所述系统在受试者的免疫细胞中表达时，同该第一抗原结合结构域仅与该第一表位的结合相比，该两个或更多个抗原结合结构域与其各自表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的细胞毒性并且增加所述细胞毒性的持久性。在一些实施例中，该淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
在另一方面，本披露提供了包含一种或多种多核苷酸的组合物，该一种或多种多核苷酸编码：(a)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和缺乏CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；和(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该复合物包含表现出与第二表位特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域与以下连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链，或(iii)CD3ζ链。
在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含表现出与该第二表位的结合的异源序列。在一些实施例中，该一种或多种多核苷酸包含与其可操作地连接的启动子。
在另一方面，本披露提供了产生经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括通过在所述免疫细胞中表达本披露的以上组合物来遗传修饰该免疫细胞，从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在另一方面，本披露提供了治疗受试者的癌症的方法，所述受试者包含表达一种或多种抗原的靶细胞，该方法包括：(a)向该受试者施用包含本披露的以上系统的抗原特异性免疫细胞，其中所表达的一种或多种抗原被该第一和/或第二抗原结合结构域识别，以及(b)在诱导该免疫细胞针对该靶细胞的免疫细胞活性的条件下，经由该第一和/或第二抗原结合结构域来使该靶细胞与该抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导该癌症的该靶细胞死亡。
在一些实施例中，该方法进一步包括遗传修饰免疫细胞以产生所述抗原特异性免疫细胞。在一些实施例中，所述癌症选自：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头颈癌、肾癌、白血病、急性髓系白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、睾丸癌、气管癌和外阴癌。
通过引用并入
将在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度就像明确且单独指出将每个单独出版物、专利或专利申请通过引用并入本文一样。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体陈述。参考陈述说明性实施例(其中利用了本发明的原理)和以下附图的以下详细说明将更好地理解本发明的特征和优点：
图1显示了包含抗原结合结构域的CAR-TCR-T系统的示意图，其中抗原结合结构域如黑白条纹椭圆和黑色椭圆所示，其能结合抗原，例如肿瘤相关抗原，其中CAR-TCR-T系统的CAR包含缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域。
图2A显示了包含与CD3的ε链融合的抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。图2B显示了包含与CD3的δ链融合的抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。图2C显示了包含与CD3的γ链融合的抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。图2D显示了包含与TCR的α链或TCR的γ链融合的抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。图2E显示了包含与TCR的β链或TCR的δ链融合的抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。图2F显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与第一ε链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的第二ε链融合。图2G显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与ε链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的γ链融合。图2H显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域反过来与CD3的ε链融合。图2I显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的α链融合并且第二抗原结合结构域与TCR的β链融合，或者第一抗原结合结构域与TCR的γ链融合并且第二抗原结合结构域与TCR的δ链融合。图2J显示了包含两个相同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的α链融合并且第二抗原结合结构域与TCR的β链融合，或者第一抗原结合结构域与TCR的γ链融合并且第二抗原结合结构域与TCR的δ链融合。图2K显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域反过来与CD3的δ链融合。图2L显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域反过来与CD3的γ链融合。图2M显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域反过来与TCR的α链或TCR的γ链融合。图2N显示了包含含有与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的TCR的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域反过来与TCR的β链或TCR的δ链融合。图2O显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与CD3的ε链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的δ链融合。图2P显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与CD3的δ链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的γ链融合。图2Q显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的α链或TCR的γ链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的ε链融合。图2R显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的β链或TCR的δ链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的ε链融合。图2S显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的α链或TCR的γ链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的γ链融合。图2T显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的β链或TCR的δ链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的γ链融合。图2U显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的α链或TCR的γ链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的δ链融合。图2V显示了包含两个抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与TCR的β链或TCR的δ链融合并且第二抗原结合结构域与CD3的δ链融合。
图3A显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合。图3B显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合。图3C显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合。图3D显示了包含与和第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第三抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合。图3E显示了包含与和第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第三抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合。图3F显示了包含与和第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第三抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合。图3G显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域并且还包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第四抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合。图3H显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域并且还包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第四抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合。图3I显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域并且还包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合，该第四抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合。图3J显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域并且还包含与CD3的γ链融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合。图3K显示了包含与和第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域并且包含与和第六抗原结合结构域融合的第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第三抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第六抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合。图3L显示了包含与和第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域并且包含与和第六抗原结合结构域融合的第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第三抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第六抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合。图3M显示了包含与和第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域并且包含与和第六抗原结合结构域融合的第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，该第三抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合，该第六抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合。
图4A显示了包含与CD3的ε链融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第二抗原结合结构域的CAR。图4B显示了包含与CD3的δ链融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第二抗原结合结构域的CAR。图4C显示了包含与CD3的γ链融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第二抗原结合结构域的CAR。图4D显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合。图4E显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合。图4F显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合。图4G显示了包含与CD3的ε链融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域的CAR，该第三抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4H显示了包含与CD3的δ链融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域的CAR，该第三抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4I显示了包含与CD3的γ链融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第三抗原结合结构域融合的第二抗原结合结构域的CAR，该第三抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4J显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第四抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4K显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合，该第四抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4L显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合，该第四抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4M显示了包含与CD3的ε链融合的第一抗原结合结构域、与CD3的γ链融合的第二抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR。图4N显示了包含与CD3的ε链融合的第一抗原结合结构域、与CD3的δ链融合的第二抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR。图4O显示了包含与CD3的δ链融合的第一抗原结合结构域、与CD3的γ链融合的第二抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR。图4P显示了包含与CD3的ε链融合的第一抗原结合结构域、与CD3的γ链融合的第二抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第四抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4Q显示了包含与CD3的ε链融合的第一抗原结合结构域、与CD3的δ链融合的第二抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第四抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4R显示了包含与CD3的δ链融合的第一抗原结合结构域、与CD3的γ链融合的第二抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的CAR，该第四抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4S显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域、与CD3的γ链融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第五抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4T显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域、与CD3的δ链融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第五抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4U显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域、与CD3的δ链融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合，该第五抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4V显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域、与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第六抗原结合结构域融合的第五抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合，该第四抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合，该第六抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4W显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域、与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第六抗原结合结构域融合的第五抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第四抗原结合结构域继而与CD3的γ链融合，该第六抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。图4X显示了包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域、与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物，以及包含与第六抗原结合结构域融合的第五抗原结合结构域的CAR，该第二抗原结合结构域继而与CD3的ε链融合，该第四抗原结合结构域继而与CD3的δ链融合，该第六抗原结合结构域继而与跨膜结构域和缺乏CD3-ζ信号传导链的细胞内信号传导结构域融合。
图5A显示了具有实例1中指定的不同分子设计(重点是与TCR信号传导复合物的CD3ε亚基融合的一种或多种抗CLL-1结构域的融合)的γδT细胞的抗肿瘤细胞毒性。图5B显示了具有实例1中指定的不同分子设计(重点是与TCR信号传导复合物的CD3δ亚基融合的一种或多种抗CLL-1结构域的融合)的γδT细胞的抗肿瘤细胞毒性。图5C显示了具有实例1中指定的不同分子设计(重点是与TCR信号传导复合物的CD3γ亚基融合的一种或多种抗CLL-1结构域的融合)的γδT细胞的抗肿瘤细胞毒性。图5D显示了具有实例1中指定的不同分子设计(重点是并联设计，其中两种抗CLL-1结构域与TCR信号传导复合物的CD3ε、CD3δ、和CD3γ亚基中的任两种并联融合)的γδT细胞的抗肿瘤细胞毒性。图5E显示了具有实例1中指定的不同分子设计(重点是与TCR信号传导复合物的CD3ε亚基融合的一种或多种抗CLL-1结构域的融合)的αβT细胞的抗肿瘤细胞毒性。
图6A显示了具有实例1中指定的不同分子设计的U937-共培养γδT细胞的GM-CSF产生概况。图6B显示了具有实例1中指定的不同分子设计的U937-共培养γδT细胞的TNF-α产生概况。图6C显示了具有实例1中指定的不同分子设计的U937-共培养γδT细胞的IFN-γ产生概况。图6D显示了具有实例1中指定的不同分子设计的U937-共培养αβT细胞的GM-CSF产生概况。图6E显示了具有实例1中指定的不同分子设计的U937-共培养αβT细胞的TNF-α产生概况。图6F显示了具有实例1中指定的不同分子设计的U937-共培养αβT细胞的IFN-γ产生概况。
图7A显示了用实例1中指定的不同分子设计的γδT细胞处理的CD34+细胞的集落形成单位(CFU)测定结果。图7B显示了用实例1中指定的不同分子设计的αβT细胞处理的CD34+细胞的集落形成单位(CFU)测定结果。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文披露的一些方法的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。参见，例如Sambrook和Green,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)；Current Protocols in Molecular Biology系列(F.M.Ausubel,等人编辑)；Methods In Enzymology系列(Academic Press,Inc.),PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane,编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique and Specialized Applications,第6版(R.I.Freshney,编辑(2010))。
如在说明书和权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数提及物，除非上下文清楚地另外指明。例如，术语“一种抗原结合结构域”包括多种抗原结合结构域。
术语“约”或“大约”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可以意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的多达20％、多达10％、多达5％或多达1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，该术语可以意指在一个数量级内，优选地在5倍内，并且更优选地在2倍内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应假定术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，“细胞”通常可指生物细胞。细胞可以是活生物体的基本结构、功能和/或生物单位。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如来自植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麦、种子、西红柿、大米、木薯、甘蔗、南瓜、干草、土豆、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松(clubmosses)、金鱼藻(hornworts)、苔类、苔藓的细胞)、藻类细胞(例如葡萄藻(Botryococcus braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、微绿球藻(Nannochloropsis gaditana)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻(Sargassum patens C.Agardh)等)、海藻(例如海带)、真菌细胞(例如酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物的细胞(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人等)等等。有时细胞不是源自天然生物体(例如，细胞可以是合成的，有时称为人工细胞)。
如本文所用，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是指在细胞介导的免疫中起核心作用的一类淋巴细胞。可以通过细胞表面上T细胞受体的存在来将T细胞与其他淋巴细胞(如B细胞和自然杀伤细胞)区分开。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指T细胞或T淋巴细胞表面上负责识别抗原的分子。TCR是由两条不同的蛋白链组成的异源二聚体。在人中，95％的T细胞具有由α(alpha)链和β(beta)链组成的TCR，并且称为αβTCR。αβTCR识别从与细胞表面上的主要组织相容性复合物分子(MHC)结合的蛋白质降解的抗原肽。同时，人中5％的T细胞具有由γ(gamma)和δ(delta)链组成的TCR，并且称为γδTCR。与αβTCR不同，γδTCR以不依赖于MHC的方式识别肽和非肽抗原。γδT细胞已显示在识别脂质抗原中发挥重要作用。特别地，TCR的γ链包括但不限于Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10、其功能变体及其组合，并且TCR的δ链包括但不限于δ1、δ2、δ3、其功能变体及其组合。在一些实例中，γδTCR可以是Vγ2/Vδ1 TCR、Vγ2/Vδ2 TCR、Vγ2/Vδ3 TCR、Vγ3/Vδ1 TCR、Vγ3/Vδ2 TCR、Vγ3/Vδ3 TCR、Vγ4/Vδ1 TCR、Vγ4/Vδ2 TCR、Vγ4/Vδ3 TCR、Vγ5/Vδ1 TCR、Vγ5/Vδ2 TCR、Vγ5/Vδ3 TCR、Vγ8/Vδ1 TCR、Vγ8/Vδ2 TCR、Vγ8/Vδ3 TCR、Vγ9/Vδ1 TCR、Vγ9/Vδ2 TCR、Vγ9/Vδ3TCR、Vγ10/Vδ1 TCR、Vγ10/Vδ2 TCR、和/或Vγ10/Vδ3 TCR。在一些实例中，γδTCR可以是Vγ9/Vδ2 TCR、Vγ10/Vδ2 TCR、和/或Vγ2/Vδ2 TCR。
如本文所用，术语“αβT细胞(alpha beta T cell)”、“αβT细胞”和“AB T细胞”可以互换地使用并且是指包含αβTCR或其变体或片段的T细胞(T淋巴细胞)，而术语“γδT细胞”、“γδT细胞”、和“GD T细胞”可以互换地使用并且是指包含γδTCR或其变体或片段的T细胞(T淋巴细胞)，例如，Vγ9δ2 T细胞、Vδ1 T细胞、Vδ3 T细胞或Vδ5 T细胞。在一些实例中，γδTCR可以是Vγ2/Vδ1T细胞、Vγ2/Vδ2 T细胞、Vγ2/Vδ3 T细胞、Vγ3/Vδ1 T细胞、Vγ3/Vδ2T细胞、Vγ3/Vδ3 T细胞、Vγ4/Vδ1 T细胞、Vγ4/Vδ2 T细胞、Vγ4/Vδ3 T细胞、Vγ5/Vδ1 T细胞、Vγ5/Vδ2 T细胞、Vγ5/Vδ3 T细胞、Vγ8/Vδ1 T细胞、Vγ8/Vδ2 T细胞、Vγ8/Vδ3 T细胞、Vγ9/Vδ1 T细胞、Vγ9/Vδ2 T细胞、Vγ9/Vδ3 T细胞、Vγ10/Vδ1 T细胞、Vγ10/Vδ2 T细胞、和/或Vγ10/Vδ3 T细胞。在一些实例中，γδT细胞可以是Vγ9/Vδ2 T细胞、Vγ10/Vδ2 T细胞、和/或Vγ2/Vδ2 T细胞。
如本文所用的术语“激活”及其语法等同形式可以指细胞从静止状态转变为活化状态的过程。此过程可以包含对抗原的响应、迁移和/或表型或遗传改变至功能活化状态。例如，术语“激活”可以指T细胞激活的逐步过程。在一些情况下，T细胞可需要至少两个信号来完全激活。第一信号可以在抗原-MHC复合物与TCR接合后出现，并且第二信号可以通过共刺激分子的接合出现。在一些情况下，抗CD3可以模拟第一信号并且抗CD28可以模拟第二信号(体外)。
如本文所用，术语“抗原”是指能被选择性结合剂结合的分子或其片段。作为一个实例，抗原可以是可以被选择性结合剂例如受体结合的配体。在一些情况下，受体可以起到抗原的作用并且配体可以起到选择性结合剂的作用。作为另一个实例，抗原可以是可以被选择性结合剂如免疫蛋白(例如抗体)结合的抗原性分子。在一些情况下，免疫蛋白可以用作抗原并且抗原性分子可以用作选择性结合剂。抗原还可以指能在动物中使用以产生能结合该抗原的抗体的分子或其片段。
如本文所用，术语“表位”及其语法等同形式可以指可被抗原结合结构域识别的抗原部分。抗原结合结构域可以包含，例如，存在于表面，例如细胞表面(例如，B细胞、T细胞、CAR-T细胞或工程化细胞)上的蛋白质(例如，抗体、抗体片段)。例如，表位可以是被TCR识别的癌症表位。还可以识别抗原内的多个表位。表位还可以突变。
如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆抗体和多克隆抗体)，以及其衍生物、变体和片段。抗体包括，但不限于，不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig’s)。其衍生物、变体或片段可以指保留相应抗体的结合特异性(例如，完全和/或部分)的功能衍生物或片段。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、微型抗体、双抗体和单域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼科”)。术语抗体包括已经优化、工程化或化学偶联的抗体和抗体的抗原结合片段。已经优化的抗体的实例包括亲和力成熟的抗体。已经工程化的抗体的实例包括Fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指能结合抗原或表位的蛋白质或其片段。作为一个实例，抗原结合结构域可以是细胞受体。作为一个实例，抗原结合结构域可以是工程化的细胞受体。作为一个实例，抗原结合结构域可以是可溶性受体。在一些情况下，抗原结合结构域可以是与细胞受体、工程化的细胞受体和/或可溶性受体结合的配体。
如本文所用，术语“自体的”及其语法等同形式可指源自同一人。例如，自体样本(例如，细胞)可以指被移除、处理并且然后在稍后时间返回给同一对象(例如，患者)的样本。对于过程，自体可以与同种异体过程(其中样品的供体(例如细胞)和样品的接受者不是同一对象)区分开。
如本文所用，术语“癌症新生抗原”、“新生抗原”和“新生表位”及其语法等同形式可以指不在正常、非突变宿主基因组中编码的抗原。在一些情况下，“新生抗原”可以代表致癌病毒蛋白或由体细胞突变引起的异常蛋白。例如，新生抗原可以经由通过病毒蛋白的活性的细胞机制的破坏来产生。作为另一个实例，新生抗原可由暴露于致癌化合物而产生，其在一些情况下会导致体细胞突变。此体细胞突变可以导致肿瘤/癌症的形成。
如本文所用，术语“细胞毒性”是指细胞正常状态的意外或不希望的改变。正常状态的细胞可以指在细胞暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件之前表现或存在的状态。处于正常状态的细胞可以处于稳态。正常状态的细胞的意外或不希望的改变可以表现为例如细胞死亡(例如程序性细胞死亡)、复制能力降低、细胞完整性(如膜完整性)降低、代谢活性降低、发育能力降低或本文披露的任何细胞毒性作用。
如本文所用，短语“降低的细胞毒性”和“降低细胞毒性”是指在暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件后正常状态的细胞中意外或不希望的改变的程度或频率的降低。该短语可以指降低暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件的单个细胞中的细胞毒性程度，或减少当细胞群暴露于细胞毒性组合物、药剂和/或条件时表现出细胞毒性的细胞群的数量。
术语“表达”是指从DNA模板转录多核苷酸的一种或多种过程(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)和/或随后将转录的mRNA翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。
术语“衍生物”、“变体”和“片段”(当在本文中用于提及多肽时)是指与野生型多肽相关(例如通过氨基酸序列、结构(例如，二级和/或三级)、活性(例如酶活性)和/或功能)的多肽。与野生型多肽相比，多肽的衍生物、变体和片段可以包含一个或多个氨基酸变异(例如，突变、插入和缺失)、截短、修饰或其组合。
如本文所用，术语“缺乏(devoid或devoid of)”是指基本上缺乏或不存在目的组分，或者基本上缺乏或不存在目的组分的功能。如本文所用，“缺乏(devoid或devoid of)”包括存在目的组分或其结构等效物，但本组分或其等效物的功能基本上缺乏或不存在。
如本文所用，术语“异源的”是指在宿主细胞或生物体中不天然存在的DNA序列、蛋白质序列或其他材料。例如，术语“异源序列”是指在自然界中的宿主细胞中不存在的核苷酸序列或蛋白质序列。“异源表达”是指在宿主细胞或生物体中基因或部分基因的表达并且可以通过重组DNA技术进行。在插入宿主中后，基因可整合到宿主DNA中，导致永久表达，或不整合，导致瞬时表达。
如本文所用，术语“百分比(％)同一性”是指在比对序列并且引入空位(如果需要的话)以实现最大百分比同一性后(即，可以在候选和参考序列中的一个或两个中引入缺口以最佳比对并且出于比较目的可以忽略非同源序列)，与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。出于确定百分比同一性的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，例如BLAST、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过使用BLAST来比对测试序列与比较序列，确定比对测试序列中与比较序列相同位置处的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数量，以及将相同氨基酸或核苷酸的数量除以比较序列中的氨基酸或核苷酸的数量来计算两个序列的百分比同一性。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换地使用以指脊椎动物，优选地哺乳动物如人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人、农场动物、竞技动物和宠物。还涵盖体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，术语“治疗(treatment和treating)”是指获得有益或期望结果的方法，这些结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。例如，治疗可以包括施用本文披露的系统或细胞群。治疗益处可以指治疗中对一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改善或效果。针对预防益处，可以将组合物施用于处于发展特定疾病、病症或症状的风险中的受试者，或报告疾病的一种或多种生理症状的受试者(即使该疾病、病症或症状可能还没有表现出来)。
如果所治疗的病症改变，则可出现“治疗效果”。改变可以是正向的或负向的。例如，‘正向作用’可对应于受试者中激活的T细胞数量的增加。在另一个实例中，‘负向作用’可对应于受试者中肿瘤的数量或尺寸的减小。治疗病症的“改变”可以指至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、25％、50％、75％或100％的病症改变。改变可以基于个体中治疗病症的严重性的改善或基于施用和不施用疗法的个体群体中改善病症的频率的差异。类似地，本披露的方法可以包括向受试者施用一定量的细胞(治疗有效的)。术语“治疗有效”应理解为具有对应于‘具有治疗效果’的定义。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指在施用于有需要的受试者后足以引起所需活性的组合物(例如包含免疫细胞如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物)的量。术语“治疗有效”可以指足以延迟表现、阻止进展、缓解或减轻通过本披露的方法治疗的障碍的至少一种症状的组合物的量。
如本文所用，术语“TIL”或肿瘤浸润淋巴细胞及其语法等同形式可以指分离自肿瘤的细胞。TIL可以是肿瘤内发现的任何细胞。例如，TIL可以是迁移至肿瘤的细胞。TIL可以是浸润肿瘤的细胞。TIL可以是T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞或其任何组合。TIL可以是混合的细胞群。TIL群可以包含不同表型的细胞、不同分化程度的细胞、不同谱系的细胞或其任何组合。
在一方面，本披露提供了用于诱导免疫细胞和/或靶细胞活性的系统。该系统包含(a)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含表现出与第一表位特异性结合的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和缺乏CD3ζ(zeta)的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该复合物包含表现出与第二表位特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该第二抗原结合结构域与以下中的至少一种连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域与以下中的至少一种连接：(i)T细胞受体的α链和/或β链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域与以下中的至少一种连接：(i)T细胞受体的γ链和/或δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。
主题系统的嵌合抗原受体(CAR)可以包含表现出与第一表位特异性结合的第一抗原结合结构域。第一抗原结合结构域可以包含可以与表位结合的任何蛋白质或分子。第一抗原结合结构域的非限制性实例包括，但不限于，单克隆抗体，多克隆抗体，重组抗体，人抗体，人源化抗体，鼠抗体或其功能衍生物、变体或片段，其包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体、和单域抗体(如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH))。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含单域抗体(sdAb)。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含与本文披露的表位结合的sdAb。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含选自抗CLL-1 sdAb、抗CD33sdAb、抗BCMA sdAb和抗CD19 sdAb的sdAb。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含VHH。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含与本文披露的表位结合的VHH。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含选自抗CLL-1VHH、抗CD33 VHH、抗BCMA VHH和抗CD19VHH的VHH。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含含有选自SEQ ID NO:7至49的序列的VHH。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、和scFv中的至少一种。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指可以以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子，并且其包括单链结合分子、基于细胞色素b562的结合分子、纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白质支架(例如，adnectin)、脂质运载蛋白支架、杯芳烃支架、A结构域和其他支架。在一些实施例中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物、变体或片段。例如，抗原结合结构域可以包含跨膜受体的至少一种配体结合结构域。在一些实施例中，该抗原结合结构域可以包含scFv。scFv可以源自可变区序列已知的抗体。在一些实施例中，scFv可以源自从可用小鼠杂交瘤获得的抗体序列。scFv可以从肿瘤细胞或原代细胞的全外显子组测序中获得。在一些实施例中，scFv可以被改变。例如，scFv可以以多种方式进行修饰。在一些情况下，scFv可以是突变的，使得scFv可以对其靶标具有更高的亲和力。在一些情况下，可以将scFv对其靶标的亲和力针对在正常组织上以低水平表达的靶标进行优化。可以进行此优化以最小化潜在毒性，如细胞因子释放综合征。在其他情况下，对靶标的膜结合形式具有更高亲和力的scFv的克隆可比其可溶形式的对应物更优选。如果一些靶标也可以在不同水平以可溶形式检测到并且其的靶向会导致意外毒性，如细胞因子释放综合征，则可以进行此修饰。
在一些实施例中，该抗原结合结构域可以包含相互作用对的一个成员。例如，该抗原结合结构域可以是包含受体和配体的相互作用对的一个成员或其片段。受体或配体，或其片段可以被称为抗原结合结构域。不被称为抗原结合结构域的另一个成员可以包含抗原结合结构域特异性结合的表位。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域和/或该第二抗原结合结构域包含与配体特异性结合的受体。受体可以包含G蛋白偶联受体(GPCR)；整联蛋白受体；钙粘蛋白受体；催化受体，其包括具有酶活性的受体和通过刺激非共价结合的酶(例如激酶)起作用的受体(不具有内在酶活性)；死亡受体，如肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员；细胞因子受体；免疫受体；等。在一些实施例中，该第一抗原结合结构域和/或该第二抗原结合结构域包含通过受体结合的配体。
主题系统的CAR的抗原结合结构域可以经由跨膜结构域连接至细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可以是跨膜片段。主题CAR的跨膜结构域可以将CAR锚定到细胞(例如免疫细胞)的质膜上。在一些实施例中，该跨膜片段包含多肽。连接CAR的抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜多肽可以具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，该跨膜多肽包含内源性或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施例中，与内源性或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比，该跨膜多肽包含具有至少1个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代、缺失和插入的多肽序列。在一些实施例中，该跨膜多肽包含非天然多肽序列，例如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施例中，该跨膜多肽经由抗原结合结构域将信号从细胞的细胞外区域传递到细胞内区域。CD28的天然跨膜部分可用于CAR中。在其他情况下，CD8α的天然跨膜部分也可用于CAR中。
主题系统的CAR可以包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，主题系统的CAR的细胞内信号传导结构域缺乏参与免疫细胞信号传导的信号传导结构域，或其任何衍生物、变体或片段。信号传导结构域可以诱导免疫细胞的活性。信号传导结构域可以转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。信号传导结构域可以包含其他分子的信号传导结构域。在一些实施例中，主题CAR包含缺乏CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，主题CAR包含缺乏免疫细胞信号传导结构域的细胞内结构域，其可以以刺激方式或抑制方式参与调节TCR复合物的初级活化。主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏以下的信号传导结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d、和Zap70。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的至少一部分。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的整个部分。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更多。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的至多100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的至少一个氨基酸。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的整个氨基酸序列。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的氨基酸序列的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更多。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR信号传导结构域的氨基酸序列的至多100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR细胞内结构域的至少一部分。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏整个TCR细胞内结构域。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR细胞内结构域的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更多。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR细胞内结构域的至多100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR细胞内结构域的至少一个氨基酸。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR细胞内结构域的整个氨基酸序列。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR细胞内结构域的氨基酸序列的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更多。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR细胞内结构域的氨基酸序列的至多100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少。
在一些实施例中，主题系统的CAR的细胞内信号传导结构域缺乏基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。ITAM包含由6-8个氨基酸分离的氨基酸序列YxxL/I的两个重复，其中每个x独立地为产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I的任何氨基酸。当抗原结合结构域与表位结合时，可以例如通过磷酸化来修饰ITAM。磷酸化的ITAM可以作为其他蛋白质(参与各种信号传导途径的蛋白质)的对接位点起作用。
在一些实施例中，主题CAR的细胞内信号传导结构域缺乏FcγR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcγR信号传导结构域可以选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施例中，该细胞内信号传导结构域缺乏FcεR信号传导结构域(例如，ITAM)。该FcεR信号传导结构域可以选自FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施例中，该细胞内信号传导结构域缺乏FcαR信号传导结构域(例如，ITAM)。该FcαR信号传导结构域可以选自FcαRI(CD89)和Fcα/μR。在一些实施例中，该细胞内信号传导结构域缺乏CD3ζ的ITAM。在一些实施例中，主题CAR包含缺乏CD3ζ的细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，主题CAR的细胞内信号传导结构域缺乏基于免疫受体酪氨酸的抑制基序或ITIM。ITIM可以包含在免疫系统的一些抑制性受体的胞质尾区中发现的保守氨基酸序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。ITIM可以被酶如Src激酶家族成员(例如，Lck)修饰，例如磷酸化。磷酸化后，可以将其他蛋白质(包括酶)募集到ITIM中。这些其他蛋白质包括但不限于酶，如酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2、称为SHIP的肌醇磷酸酶、以及具有一个或多个SH2结构域的蛋白质(例如ZAP70)。细胞内信号传导结构域可以包含以下的信号传导结构域(例如，ITIM)：BTLA、CD5、CD31、CD66a、CD72、CMRF35H、DCIR、EPO-R、FcγRIIB(CD32)、Fc受体样蛋白2(FCRL2)、Fc受体样蛋白3(FCRL3)、Fc受体样蛋白4(FCRL4)、Fc受体样蛋白5(FCRL5)、Fc受体样蛋白6(FCRL6)、蛋白G6b(G6B)、白介素4受体(IL4R)、免疫球蛋白超家族受体易位相关蛋白1(IRTA1)、免疫球蛋白超家族受体易位相关蛋白2(IRTA2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL5(KIR2DL5)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL1(KIR3DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LIR1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LIR2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LIR3)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5(LIR5)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员8(LIR8)、白细胞免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)、肥大细胞功能相关抗原(MAFA)、NKG2A、天然细胞毒性触发受体2(NKp44)、NTB-A、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PILR、SIGLECL1、唾液酸结合Ig样凝集素2(SIGLEC2或CD22)、唾液酸结合Ig样凝集素3(SIGLEC3或CD33)、唾液酸结合Ig样凝集素5(SIGLEC5或CD170)、唾液酸结合Ig样凝集素6(SIGLEC6)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素10(SIGLEC10)、唾液酸结合Ig样凝集素11(SIGLEC11)、唾液酸结合Ig样凝集素4(SIGLEC4)、唾液酸结合Ig样凝集素8(SIGLEC8)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、信号调节蛋白(SIRP 2)、和信号传导阈值调节跨膜接头1(SIT)。
在一些实施例中，该细胞内信号传导结构域缺乏ITAM和ITIM结构域两者。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个ITAM结构域。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR的至多10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个ITAM结构域。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以缺乏TCR的整个ITAM结构域。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以包括共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域(例如来自共刺激分子的)可以提供免疫细胞信号传导的共刺激信号。在一些实施例中，共刺激结构域是可操作的以调节免疫细胞中的增殖和/或存活信号。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含以下的信号传导结构域：MHC I类蛋白、MHCII类蛋白、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、或Toll配体受体。在一些实施例中，该共刺激结构域包含选自由以下组成的组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1、和VLA-6。在一些实施例中，该细胞内信号传导结构域包含多个共刺激结构域，例如至少两个，例如，至少3、4或5个共刺激结构域。共刺激信号传导区可以提供与初级效应激活信号协同的信号，并且可以完成激活T细胞的要求。在一些实施例中，向CAR中添加共刺激结构域可以增强本文提供的免疫细胞的功效和持久性。在一些实施例中，主题CAR的细胞内信号传导结构域仅包含一个共刺激结构域，其也被称为“仅共刺激CAR(costimulatory only CAR)”。在一些实施例中，仅共刺激CAR的共刺激结构域包含CD27的信号传导结构域。
在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个共刺激结构域。在一些情况下，主题CAR的细胞内信号传导结构域可以包括至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个共刺激结构域。
表1中提供了共刺激信号传导结构域的实例。
表1：细胞内共刺激信号传导结构域
Figure BDA0003308759980000291
Figure BDA0003308759980000301
在一些实施例中，主题CAR的细胞内结构域缺乏信号传导结构域并包含共刺激结构域。作为一个实例，CAR缺乏CD-3ζ结构域并且包含单个共刺激结构域，如CD27、CD28或4-1BB。作为另一个实例，CAR缺乏CD-3ζ结构域并且包含两个共刺激结构域，如CD28/OX40或CD28/4-1BB。作为另一个实例，CAR缺乏CD3ζ结构域并且包含超过两个刺激结构域。在一些实施例中，主题CAR的细胞内结构域缺乏ITAM且包含共刺激结构域。作为一个实例，CAR缺乏ITAM并且包含单个共刺激结构域，如CD27、CD28或4-1BB。作为另一个实例，CAR缺乏ITAM并且包含两个共刺激结构域，如CD28/OX40或CD28/4-1BB。作为另一个实例，CAR缺乏ITAM并且包含超过两个刺激结构域。
在一些实施例中，主题CAR可不与彼此配置以形成复合物。在一些实施例中，主题CAR可与彼此配置以形成复合物，如多聚体结构。在一些情况下，可以配置主题CAR以形成至少(1)单体、(2)二聚体、(3)三聚体、(4)四聚体、(5)五聚体、(6)六聚体、(7)七聚体、(8)八聚体、(9)十聚体、(10)十二聚体或(11)更高的多聚体。在一些情况下，可以配置主题CAR以形成(1)单体、(2)二聚体、(3)三聚体、(4)四聚体、(5)五聚体、(6)六聚体、(7)七聚体、(8)八聚体、(9)十聚体、(10)十二聚体、和/或(11)更高的多聚体。在一些情况下，可以配置主题CAR以形成(1a)同源二聚体和/或(1b)异源二聚体；(2a)同源三聚体和/或(2b)异源三聚体；(3a)同源四聚体和/或(3b)异源四聚体；(4a)同源五聚体和/或(4b)异源五聚体；(5a)同源六聚体和/或(5b)异源六聚体；(6a)同源八聚体和/或(6b)异源八聚体；(7a)同源十聚体和/或(7b)异源十聚体；和/或(8a)同源十二聚体和/或(8b)异源十二聚体。
在一些实施例中，主题CAR可以包含铰链或间隔子。铰链或间隔子可以指抗原结合结构域与跨膜结构域之间的片段。在一些实施例中，可以将铰链用于为抗原结合结构域(例如scFv)提供柔性。在一些实施例中，可以将铰链用于检测细胞表面上CAR的表达，例如当检测scFv的抗体不是功能化的或不可用时。在一些情况下，铰链源自免疫球蛋白分子并且可需要根据靶标上第一表位或第二表位的位置优化。在一些情况下，铰链可不属于免疫球蛋白分子，而是属于另一个分子，如CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可以含有半胱氨酸和脯氨酸残基，它们可能在CD8共受体和MHC分子的相互作用中发挥作用。在一些实施例中，半胱氨酸和脯氨酸残基可以影响CAR的性能并且因此可以被工程化以影响CAR性能。
铰链可以具有任何合适的长度。在一些实施例中，CAR铰链可以是尺寸可调的并且可以在一定程度上补偿标准化的表达CAR的细胞与靶细胞之间的正交突触距离(orthogonal synapse distance)。表达CAR的细胞与靶细胞之间的免疫突触的分子构图(topography)也可以定义一个距离，由于细胞表面靶分子上的膜远端表位，该距离不能通过CAR来功能化桥接，该细胞表面靶分子(甚至是具有短铰链CAR的)不能将突触距离引入信号传导的近似值。同样，已经描述了近膜CAR靶抗原表位，其信号传导输出仅在长铰链CAR的背景下观察到。可以根据可以使用的单链可变片段区来调整本文披露的铰链。
作为一个实例，如图1所示，CAR可以包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CAR通常可以包含源自单链抗体的抗原结合结构域、铰链结构域(H)或间隔子、提供对质膜的锚定的跨膜结构域(TM)、和缺乏CD3ζ链的信号传导结构域。CAR可缺乏CD3ζ链并且包含共刺激结构域，如CD27或4-1BB。CAR可缺乏CD3ζ链并且包含至少两个共刺激结构域，如4-1BB和OX40。可以将共刺激结构域(如4-1BB、OX40、CD28、CD27等)的各种组合用于主题CAR。
主题系统的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物可以包含表现出与第二表位结合的第二抗原结合结构域。第二抗原结合结构域可以包含可以与表位结合的任何蛋白质或分子。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含表现出与该第二表位的结合的异源序列。TCR复合物的第二抗原结合结构域的非限制性实例包括，但不限于，单克隆抗体，多克隆抗体，重组抗体，人抗体，人源化抗体，或其功能衍生物、变体或片段，其包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体、和单域抗体(如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH))。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含单域抗体(sdAb)。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含与本文披露的表位结合的sdAb。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含选自抗CLL-1sdAb、抗CD33 sdAb、抗BCMA sdAb和抗CD19 sdAb的sdAb。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含VHH。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含与本文披露的表位结合的VHH。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含选自抗CLL-1VHH、抗CD33 VHH、抗BCMAVHH和抗CD19 VHH的VHH。在一些实施例中，该第二抗原结合结构域包含含有选自SEQ ID NO:7至49的序列的VHH。在一些实施例中，TCR复合物的第二抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、和scFv中的至少一种。在一些实施例中，TCR复合物的第二抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指可以以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子，并且其包括单链结合分子、基于细胞色素b562的结合分子、纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白质支架(例如，adnectin)、脂质运载蛋白支架、杯芳烃支架、A结构域和其他支架。在一些实施例中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物、变体或片段。例如，抗原结合结构域可以包含跨膜受体的至少一种配体结合结构域。
在一些实施例中，该抗原结合结构域可以包含相互作用对的一个成员。例如，该抗原结合结构域可以是包含受体和配体的相互作用对的一个成员或其片段。受体或配体，或其片段可以被称为抗原结合结构域。不被称为抗原结合结构域的另一个成员可以包含抗原结合结构域特异性结合的表位。
第二抗原结合结构域可以与TCR复合物的任何成员连接，并且TCR可以是α/β或γ/δTCR。第二抗原结合结构域可以与TCR链、分化簇3(CD3)链或CD3ζ链中的至少一个连接。第二抗原结合结构域可以与TCR的跨膜受体，例如TCR-δ、TCR-γ、TCR-α或TCR-β连接。第二抗原结合结构域可以与CD3链，例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ连接。第二抗原结合结构域可以与CD3ζ链连接。
在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与CD3-ε链融合的抗原结合结构域，图2A。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与CD3-δ链融合的抗原结合结构域，图2B。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与CD3-γ链融合的抗原结合结构域，图2C。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-α链或TCR-γ链融合的抗原结合结构域，图2D。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-β链或TCR-δ链融合的抗原结合结构域，图2E。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-γ链融合的抗原结合结构域。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-δ链融合的抗原结合结构域。
主题系统的经修饰的TCR复合物可以包含超过一个抗原结合结构域，例如至少2个抗原结合结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个抗原结合结构域)。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含至少两个抗原结合结构域。至少两个抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域。例如，两个抗原结合结构域可以是能结合相同配体的相同分子。至少两个抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域。例如，两个抗原结合结构域可以是能结合相同或不同配体的不同分子。在一些情况下，经修饰的TCR包含与以下连接的第三抗原结合结构域：(i)第二抗原结合结构域，(ii)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(iii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或(iv)CD3ζ链。
在一些实施例中，第一抗原结合结构域与第一CD3-ε链融合并且第二抗原结合结构域与TCR复合物的第二CD3-ε链融合，图2F。在一些实施例中，第一抗原结合结构域与CD3-ε链融合并且第二抗原结合结构域与CD3-γ链融合，图2G。在一些实施例中，第一和第二抗原结合结构域与相同链连接。例如，主题系统的经修饰的TCR复合物可以包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域反过来与CD3-ε链融合，图2H。在一些实施例中，第一抗原结合结构域与TCR-α链融合并且第二抗原结合结构域与TCR-β链融合或第一抗原结合结构域与TCR-γ链融合并且第二抗原结合结构域与TCR-δ链融合。第一和第二抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域，如黑色和黑白条纹椭圆所示(图2I)。第一和第二抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域，如类似地填充的椭圆所示(图2J)。
在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域反过来与CD3-δ链融合，图2K。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域反过来与CD3-γ链融合，图2L。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域反过来与TCR-α链或TCR-γ链融合，图2M。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域反过来与TCR-β链或TCR-δ链融合，图2N。第一和第二抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域。第一和第二抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域。
在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与CD3-ε链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-δ链融合的第二抗原结合结构域，图2O。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与CD3-δ链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-γ链融合的第二抗原结合结构域，图2P。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-α链或TCR-γ链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-ε链融合的第二抗原结合结构域，图2Q。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-β链或TCR-δ链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-ε链融合的第二抗原结合结构域，图2R。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-α链或TCR-γ链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-γ链融合的第二抗原结合结构域，图2S。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-β链或TCR-δ链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-γ链融合的第二抗原结合结构域，图2T。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-α链或TCR-γ链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-δ链融合的第二抗原结合结构域，图2U。在一些实施例中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含与TCR-β链或TCR-δ链融合的第一抗原结合结构域和与δ链融合的第二抗原结合结构域，图2V。
在本文的方面的各种实施例中，经修饰的TCR复合物包含先前鉴定的TCR。在一些情况下，可以使用全外显子测序来鉴定TCR。例如，TCR可以靶标通过靶细胞的全外显子组测序鉴定的新生抗原或新生表位。可替代地，TCR可以从自体、同种异体或异种库中鉴定。自体和同种异体鉴定可需要多步骤的过程。在自体和同种异体鉴定两者中，树突状细胞(DC)可以从选择CD14的单核细胞中产生，并且在成熟后用特定肽脉冲或转染。可以将肽脉冲DC用于刺激自体或同种异体免疫细胞，如T细胞。可以通过有限稀释来从这些肽脉冲T细胞系中分离出单细胞肽特异性T细胞克隆。可以识别并分离目的主题TCR。可以将目的TCR的α、β、γ和δ链克隆、密码子优化并编码到载体(例如慢病毒载体)中。在一些实施例中，可以替换TCR的部分。例如，可以将人TCR的恒定区替换为相应的鼠区域。可以用相应的鼠区域替换人恒定区以增加TCR稳定性。也可以离体以高或超生理的亲和力鉴定TCR。在一些情况下，鉴定TCR的方法可以包括用人肿瘤蛋白来对表达人白细胞抗原(HLA)系统的免疫转基因小鼠进行免疫以产生表达针对人抗原的TCR的T细胞(参见例如Stanislawski等人,Circumventingtolerance to a human MDM2-derived tumor antigen by TCR gene transfer,NatureImmunology 2,962-970(2001))。另一种方法可以是同种异体TCR基因转移，其中从经历肿瘤缓解的受试者中分离肿瘤特异性T细胞，并将反应性TCR序列转移到来自另一个患有该疾病但可能无反应的受试者的T细胞中(de Witte,M.A.,等人,Targeting self-antigensthrough allogeneic TCR gene transfer,Blood108,870-877(2006))。在一些情况下，可以将体外技术用于改变TCR的序列，通过增加弱反应性肿瘤特异性TCR与靶抗原的相互作用(亲和力)强度来增强它们的肿瘤杀伤活性(Schmid,D.A.,等人,Evidence for a TCRaffinity threshold delimiting maximal CD8 T cell function.J.Immunol.184,4936-4946(2010))。
主题CAR的抗原结合结构域和经修饰的TCR复合物可以与存在于不同抗原上的表位结合。在一些情况下，CAR的抗原结合结构域和经修饰的TCR复合物与存在于相同抗原上的表位结合。在一些情况下，该第一抗原结合结构域和该第二抗原结合结构域包含相同的氨基酸序列。在一些情况下，该第一抗原结合结构域和该第二抗原结合结构域包含不同的氨基酸序列。
在一些情况下，主题CAR的第一抗原结合结构域和经修饰的TCR复合物的第二抗原结合结构域可以与相同表位结合，即第一表位和第二表位相同。在一些情况下，主题CAR的第一抗原结合结构域和经修饰的TCR复合物的第二抗原结合结构域可以与不同表位结合，即第一表位和第二表位不同。
第一表位和/或第二表位可以存在于一种或多种细胞表面抗原上。一种或多种细胞表面抗原可以是酪氨酸激酶受体、丝氨酸激酶受体、组氨酸激酶受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)等。
第一表位和/或第二表位可以存在于免疫检查点受体或免疫检查点受体配体上。在一些实施例中，免疫检查点受体或免疫检查点受体配体可以是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、BLTA、TIGIT、CD47或CD40。
第一表位和/或第二表位可以存在于细胞因子或细胞因子受体上。细胞因子受体可以是，例如，CCR2b、CXCR2(CXCL1受体)、CCR4(CCL17受体)、Gro-a、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、肝素酶、CD137L、LEM、Bcl-2、CCL17、CCL19或CCL2。
第一表位和/或第二表位可以存在于肿瘤相关抗原上。表位可以是，例如，肿瘤表位。肿瘤相关抗原可以选自由以下组成的组：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、BCMA、b-连环素、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CA-125、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、CLL-1、CTAG1B、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FAP、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、FR-α、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、GPC3、GPC-2、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、L1-CAM、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活蛋白、存活蛋白-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体、和κ-轻链。在一些实施例中，第一表位和/或第二表位可以是EGFR、EGFRvIII、GPC3、GPC-2、DLL3、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、CLL-1、CD30、CD33、HER2、MSLN、PSMA、CEA、GD2、IL13Rα2、CAIX、L1-CAM、CA125、CD133、FAP、CTAG1B、MUC1、FR-α、CD70、CD171、ROR1及其任何组合。在一些情况下，第一表位和/或第二表位可以是CLL-1、CD33、BCMA、CD19及其任何组合。在优选的方面，第一表位和/或第二表位可以是CLL-1、CD33及其组合。在另一个优选的方面，第一表位和/或第二表位可以是BCMA、CD19及其组合。
第一表位和/或第二表位可以存在于新生抗原上。第一表位和/或第二表位可以是新生表位。
新生抗原和新生表位通常是指在一些情况下触发抗肿瘤T细胞响应的肿瘤特异性突变。例如，可以使用全外显子组测序方法鉴定这些内源性突变。Tran E,等人,“Cancerimmunotherapy based on mutation-specific CD4+T cells in a patient withepithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。抗原结合结构域，例如，主题CAR或经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域可以表现出与肿瘤特异性新生抗原的特异性结合。由CAR或经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的新生抗原可以在靶细胞上表达，并且例如，是通过在任何内源性基因中的突变编码的新生抗原和新生表位。在一些情况下，第一和/或第二抗原结合结构域与通过突变基因编码的新生抗原或新生表位结合。该基因可选自由以下组成的组：ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2M、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、NY-ESO、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL和XPOT。
在一些实施例中，可由第一和/或第二抗原结合结构域结合的第一表位和/或第二表位可存在于基质上。基质通常是指提供生物细胞、组织或器官的结缔和功能支持的组织。基质可以是肿瘤微环境的基质。第一表位和/或第二表位可以存在于基质抗原上。此种抗原可以位于肿瘤微环境的基质上。例如，新生抗原和新生表位可以存在于肿瘤内皮细胞、肿瘤脉管系统、肿瘤成纤维细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤间充质细胞上。实例抗原包括，但不限于，CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4、和腱生蛋白。
在一些实施例中，第一表位和/或第二表位可以存在于由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原上。MHC可以是人白细胞抗原(HLA)I类或II类。HLA可以是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DM或HLA-DO。在一些实施例中，第一表位和/或第二表位可以存在于以下上：HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*25、HLA-A*26、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、或HLA-A*24、HLA-B*27、HLA-B*35、HLA-B*48、HLA-B*55等。
在一些实施例中，第一表位和/或第二表位可以是可溶的(例如，不与细胞结合)。在一些情况下，该抗原可以是可溶的，例如，可溶抗原。第一表位和/或第二表位可以存在于通用抗原上。在一些情况下，主题CAR的抗原结合结构域和/或经修饰的TCR复合物各自可以结合多个表位，例如，多特异性。
该第一抗原结合结构域与该第一表位的结合或该第二抗原结合结构域与该第二表位的结合可以激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。在一些情况下，该第一抗原结合结构域与该第一表位的结合和该第二抗原结合结构域与该第二表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。在一些实施例中，诱导免疫细胞和/或靶细胞活性的系统可以包含超过两种抗原结合结构域。例如，系统可以包含第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十或甚至更多个抗原结合结构域。在一些实施例中，第三抗原结合结构域与第三表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。在一些实施例中，第一抗原结合结构域与第一表位的结合、第二抗原结合结构域与第二表位的结合、第三抗原结合结构域与第三表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。在本披露的系统中可以使用任何数量的抗原结合结构域，并且抗原结合结构域的数量不限于一种、两个或三个。
在一些实施例中，两个或更多个抗原结合结构域与以下任选地串联连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，(iii)CD3ζ链，并且其中该两个或更多个抗原结合结构域与其各自表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。当需要时，将两个或更多个抗原结合结构域连接至TCR复合物的单独链。可替代地，将两个或更多个抗原结合结构域连接至TCR复合物的一个链上。在一些实施例中，将两个或更多个抗原结合结构域串联地连接在分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链上。
在表达系统的免疫细胞中激活的免疫细胞活性可以是多种细胞活性中的任一种。在一些实施例中，免疫细胞活性选自由以下组成的组：免疫细胞的克隆扩增；由该免疫细胞进行的细胞因子释放；该免疫细胞的细胞毒性；该免疫细胞的增殖；该免疫细胞的分化、去分化或转分化；该免疫细胞的运动和/或运输；该免疫细胞的衰竭和/或再活化；和由该免疫细胞进行的其他细胞内分子、代谢物、化学化合物、或其组合的释放。
在一些实施例中，该免疫细胞活性包含免疫细胞的克隆扩增。克隆扩增可以包含源自免疫细胞的子细胞的产生。在克隆扩增中，免疫细胞的子代可以包含本文提供的系统。在克隆扩增中，免疫细胞的子代可以包含本文提供的CAR。在克隆扩增中，免疫细胞的子代可以包含本文提供的经修饰的TCR复合物。在克隆扩增中，免疫细胞的子代可以包含本文提供的CAR和TCR。包含本文提供的系统的免疫细胞的克隆扩增可大于缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的克隆扩增。包含本文提供的系统的免疫细胞的克隆扩增可以比缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的克隆扩增大约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约300倍、约300倍至约400倍、约400倍至约500倍、约500倍至约600倍、约600倍至约700倍。在一些实施例中，克隆扩增可以包含定量免疫细胞的数量。定量免疫细胞的数量的方法可以包含流式细胞术、台盼蓝排斥和/或血细胞计量术。
在一些实施例中，免疫细胞活性包含由免疫细胞进行的细胞因子释放。在一些实施例中，免疫细胞活性包含细胞内分子、代谢物、化学化合物或其组合的释放。由免疫细胞进行的细胞因子释放可以包含IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、IFNγ、TNFα、CSF、TGFβ、颗粒酶等的释放。在一些实施例中，可以使用ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹等来量化细胞因子释放。通过包含本文提供的系统的免疫细胞的细胞因子释放可大于缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的细胞因子释放。与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞可以产生多约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、或大于300倍的细胞因子释放。在一些实施例中，细胞因子释放可以在体外或体内定量。
在一些实施例中，免疫细胞活性包含免疫细胞的细胞毒性。在一些实例中，当在免疫细胞中表达时，本披露的系统和组合物可用于杀伤靶细胞。表达主题系统的免疫细胞或免疫细胞群可以诱导靶细胞的死亡。靶细胞的杀伤可用于多种应用，这些应用包括，但不限于治疗疾病或障碍(其中细胞群需要被消除或其增殖需要被抑制)。细胞毒性可以指靶细胞的杀伤。细胞毒性还可以指由免疫细胞进行的细胞毒性细胞因子(例如IFNγ、TNFα、TNFβ、GM-CSF或颗粒酶)的释放。在一些情况下，在免疫细胞中表达的主题系统可以改变(i)细胞毒素如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素的释放和/或(ii)经由T细胞与靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导细胞凋亡，从而触发靶细胞的破坏。在一些实施例中，细胞毒性可以通过细胞毒性测定(包括共培养测定、ELISPOT、铬释放细胞毒性测定等)来量化。包含本文提供的系统的免疫细胞的细胞毒性可大于缺乏该系统的可比免疫细胞的、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中一个仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的细胞毒性。与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞对靶细胞的细胞毒性可以高约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。包含本文提供的系统的免疫细胞可诱导靶细胞的死亡，这些靶细胞的死亡比缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。类似地，包含本文提供的系统的免疫细胞可诱导靶细胞的死亡，该靶细胞的死亡比缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、40倍、60倍、80倍或100倍。在一些实施例中，表达主题系统的免疫细胞可诱导展示靶表位的靶细胞在其表面上的细胞凋亡。
在一些实施例中，包含主题系统的主题免疫细胞的施用可在有需要的受试者中产生副作用。毒性可以包含细胞因子释放风暴、肿瘤溶解综合征、中靶肿瘤外毒性及其组合。例如，在一些情况下，αβT细胞的潜在毒性水平可以大于γδT细胞的潜在毒性水平(在两种细胞均表达相同主题系统的情况下)，图6A和图6D。在一些实施例中，方法可以包括施用包含含有主题系统的γδT细胞的细胞群，以减少受试者中的潜在副作用。在一些方面，γδT细胞中的主题系统的使用可以降低受试者中至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或高达约500倍的潜在副作用。在一些实施例中，可以将药物组合物与包含主题系统的γδT细胞一起配制。
在一方面，毒性可包含响应于与非靶细胞接触和/或非靶细胞的杀伤的细胞因子的产生。非靶细胞可以包含：非患病细胞、非癌性细胞、内源细胞或表达主题靶抗原但不癌变或患病(例如，中靶、肿瘤外毒性)的细胞。可以在体外或体内确定与施用表达主题系统的主题免疫细胞相关的毒性。评估毒性的方法可以包括进行本文提供的体外和/或体内测定，如ELISA和/或CFU测定等。
可以将ELISA测定用于鉴定和/或定量由包含主题系统的主题免疫细胞产生的细胞因子。在一方面，用于评估毒性的ELISA可以检测以下中的任一种：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素6(IL-6)和IL-10。在一些情况下，可以进行集落形成单位(CFU)测定以评估与表达主题系统的细胞相关的，针对许多非患病靶标，例如正常造血干细胞的毒性。
在主题系统的比较测定中，与第二主题系统相比，第一主题系统可以具有更高或降低的毒性水平。取决于包含主题系统的免疫细胞的应用，多或少的有效免疫响应可以是必要的，并且可以是决定在主题免疫细胞中表达什么系统的因素。在一方面，与包含含有CD3ζ链的主题系统的可比免疫细胞相比，表达不包CD3ζ链的主题系统的免疫细胞可具有降低的毒性。类似地，与包含具有共刺激结构域的主题系统的可比免疫细胞相比，不包含共刺激结构域的主题系统可具有降低的毒性。在一方面，毒性的降低可以减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或10倍。
另一个考虑可以是在其中表达主题系统的免疫细胞的选择。包含相同主题系统的不同免疫细胞可以在细胞因子产生和细胞毒性方面表现不同并且从而可以具有不依赖于主题系统的不同水平的相关毒性。例如，在一些情况下，当与靶标接触时，表达主题系统的γδT细胞可以产生更多或更少的细胞因子(与表达相同主题系统的不同免疫细胞相比)。可替代地，当与靶标接触时，表达主题系统的αβT细胞可以产生更多或更少的细胞因子(与表达相同主题系统的不同免疫细胞相比)。在一方面，表达主题系统的γδT细胞可以产生较少的GM-CSF和TNFα(与表达相同主题系统的αβT细胞相比)。在另一方面，表达主题系统的γδT细胞可以产生相当量的IFNγ(与表达相同主题系统的αβT细胞相比)。这可表明，在一些情况下，施用表达主题系统的γδT细胞可导致与降低的全身毒性相关的更有利的细胞因子特性。更有利的细胞因子特性可指产生较少的与细胞因子风暴或全身毒性相关的细胞因子。
在实施例中，还可以测试包含主题系统的免疫细胞的与重复抗原刺激相关的任何毒性和/或功能性。重复抗原刺激可以模拟包含主题系统的主题免疫细胞可遇到的肿瘤环境中的条件。主题抗原中的任一种均可用于进行重复的抗原刺激。在一方面，包含主题系统的免疫细胞可以经历至少2、3、4、5、6、7、8、9或10轮抗原刺激。刺激可以发生在体外或体内并且可以持续任何时间。在一方面，刺激持续30分钟、1小时、3小时、8小时、10小时、24小时、48小时、72小时、或多达约100小时。如前所述，表达主题系统的免疫细胞和/或主题系统的选择可有助于毒性水平(如果有的话)和/或与重复抗原刺激相关的功能性。在一方面，与表达与δ亚基融合的可比靶向结构域的可比免疫细胞相比，与TCR复合物内CD3的ε或γ亚基融合的系统的靶向结构域可具有增加的抗肿瘤细胞毒性。类似地，与表达可比系统的可比免疫细胞相比，包含含有共刺激结构域并且无CD3ζ链的主题系统的免疫细胞在重复抗原刺激下可以具有提高的活性和/或降低的毒性。在一些实施例中，此种可比系统可以是可比的仅TCR系统或可比的具有缺乏CD3ζ信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的CAR系统。此外，在一些情况下，与没有串联或并联设计的可比系统相比，具有串联或并联设计的主题系统可以具有提高的免疫细胞活性和/或降低的毒性。用实例1中所述的示例性设计贯穿本文提供了合适的串联或并联设计。
在一些实施例中，可以在体外或体内确定细胞毒性。在一些实施例中，确定细胞毒性可以包含确定与施用前的疾病水平相比，施用包含本文提供的系统的细胞后的疾病水平。在一些实施例中，确定细胞毒性可以包含确定施用包含本文提供的系统的细胞后的疾病水平和施用缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞后的疾病水平。在一些实施例中，靶病灶上的疾病水平可以作为完全应答(CR)：靶病灶消失，部分应答(PR)：以基线总和LD作为参考，靶病灶的最长直径(LD)总和至少减少30％，进展(PD)：；以自治疗开始以来记录的最小LD总和或一个或多个新病灶的出现作为参考，靶病灶的LD总和至少增加20％，稳定疾病(SD)：或者，以最小的总和LD作为参考，既没有足够的符合PR的缩小也没有足够的符合PD的增加来衡量。在一些实施例中，可以衡量非靶病灶。非靶病灶的疾病水平可以是完全应答(CR)：所有非靶病灶消失并且肿瘤标志物水平正常化，非完全反应；一个或多个非靶病灶的存留，进展(PD)：或一个或多个新病灶的出现。
在一些实施例中，免疫细胞活性是免疫细胞的增殖。免疫细胞的增殖可以指免疫细胞的扩增。免疫细胞的增殖可以指免疫细胞的表型变化。包含本文提供的系统的免疫细胞的增殖可大于缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的增殖。包含本文提供的系统的免疫细胞的增殖可以比缺乏本文提供的系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的增殖大约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、从约200倍至约300倍、从约300倍至约400倍、从约400倍至约500倍、从约500倍至约600倍、从约600倍至约700倍。在一些实施例中，增殖可以包含定量免疫细胞的数量。定量免疫细胞的数量的方法可以包含流式细胞术、台盼蓝排斥和/或血细胞计量术。增殖也可以通过免疫细胞的表型分析来确定。例如，与缺乏该系统的可比免疫细胞相比，培养物中免疫细胞的结块可以表示免疫细胞的增殖。
在一些实施例中，免疫细胞活性可以是分化、去分化、或转分化。可以通过评估细胞表面上的分化、去分化或转分化标志物的表型表达(通过流式细胞术)来确定免疫细胞的分化、去分化或转分化。免疫细胞的分化、去分化或转分化也可以经由CFU测定来确定。在一些实施例中，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞具有增加的分化能力。在一些实施例中，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞具有增加的去分化能力。在一些实施例中，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞具有更好的转分化能力。
在一些实施例中，免疫细胞活性可以是包含该系统的免疫细胞的运动和/或运输。在一些实施例中，可以通过定量免疫细胞对靶位点的定位来确定运动。例如，包含主题系统的免疫细胞可以在施用后在靶位点处(例如在不是该靶位点的位点处)量化。可以通过分离病灶并定量包含该系统的大量免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞来进行定量。包含本文提供的系统的免疫细胞的运动和/或运输可以大于缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的运动和/或运输。在一些实施例中，在靶位点(例如肿瘤病灶)处的包含该系统的免疫细胞的数量可以是缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的数量的约5X、10X、15X、20X、25X、30X、35X、或40X。还可以利用transwell迁移测定体外确定运输。在一些实施例中，在靶位点处的包含该系统的免疫细胞的数量(例如，在transwell迁移测定中)可以是缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的数量的约5X、10X、15X、20X、25X、30X、35X、或40X。
在一些实施例中，免疫细胞活性可以是免疫细胞的衰竭和/或激活。免疫细胞的衰竭和/或激活可以通过流式细胞术或显微分析通过表型分析来确定。例如，可以定量地和/或定性地确定衰竭标志物，例如程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG3)、2B4、CD160、Tim3和具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)的表达水平。在一些情况下，免疫细胞(如T细胞)会以分层的方式失去效应子功能并变得衰竭。由于衰竭，可能会丧失功能，如IL-2产生和细胞因子表达，以及高增殖能力。衰竭后还可出现IFNγ、TNF和趋化因子的产生以及脱粒方面的缺陷。包含本文提供的系统的免疫细胞的衰竭或激活可大于缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞的衰竭或激活。在一些实施例中，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞可经历增加至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、或大于300倍的衰竭或激活。在一些实施例中，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞可经历减少至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、或大于300倍的衰竭或激活。
在一些实施例中，第一抗原结合结构域与第一表位的结合和第二抗原结构域与第二表位的结合激活表达该系统的主题免疫细胞的细胞毒性。与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合，或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，可以增强细胞毒性。如通过细胞毒性测定中的杀伤百分比所测量的，与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合，或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，可以增强细胞毒性。与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合，或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，杀伤百分比可以是接触后靶细胞的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或高达约100％。
在一些实施例中，与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合，或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，第一抗原结合结构域与第一表位的结合和第二抗原结合结构域与第二表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的细胞毒性并减少与细胞毒性相关的副作用。在一些实施例中，与细胞毒性相关的副作用是细胞因子释放综合征。与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合，或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，副作用的减少(如细胞因子释放综合征的减少)可以是约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多约100％的减少。
在一些实施例中，与仅第一抗原结合结构域与第一表位结合或仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，第一抗原结合结构域与第一表位的结合和第二抗原结合结构域与第二表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的细胞毒性并增加细胞毒性的持久性。与仅第一抗原结合结构域与第一表位结合或仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，当所述系统在受试者的免疫细胞中表达时，第一抗原结合结构域与第一表位的结合和第二抗原结合结构域与第二表位的结合可以激活表达该系统的免疫细胞的细胞毒性并增加所述细胞毒性的持久性。可以通过定量施用后包含该系统的免疫细胞的水平来确定持久性的增加。与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，持久性的增加可以是指施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、35天、40天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年或更多存在包含本文提供的系统的免疫细胞。
在一方面，本披露提供了表达本文各种实施例的任何系统(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的分离的宿主细胞。分离的宿主细胞可以包含宿主细胞群。宿主细胞可以是用于表达主题系统的任何合适的细胞。在一些情况下，宿主细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是淋巴细胞，如T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、和/或辅助T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
在一方面，本披露提供了包含至少两个抗原结合结构域的抗原特异性免疫细胞，其中一个与T细胞受体(TCR)复合物连接并且另一个与嵌合抗原受体(CAR)连接。抗原特异性免疫细胞可以与表达被至少两个抗原结合结构域识别的一个或多个抗原的靶细胞特异性结合。免疫细胞可以是淋巴细胞，如T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、和/或辅助T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
在一方面，本披露提供了免疫细胞群，单个免疫细胞表达本文各种实施例的任何系统，并且其中免疫细胞群的特征在于：在将免疫细胞群暴露于受试者中的靶细胞群时，免疫细胞群诱导靶细胞死亡。免疫细胞群可以诱导至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或高达约100％的靶细胞死亡并且是在暴露后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、35天、40天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年或更多内。
免疫细胞群可以包含多种免疫细胞中的任一种。在一些情况下，免疫细胞群包含淋巴细胞。淋巴细胞可以是T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、和/或辅助T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
免疫细胞群可以包含任何合适数量的细胞。免疫细胞的数量可以确定为体外测定中使用的细胞数量。免疫细胞的数量可以确定为施用于受试者的细胞数量。免疫细胞的数量可以确定为激活任何免疫细胞活性(如增殖和/或扩增)之前的细胞数量。免疫细胞群可以包含至少约1×106个细胞、至少约2×106个细胞、至少约3×106个细胞、至少约4×106个细胞、至少约5×106个细胞、至少约6×106个细胞、至少约7×106个细胞、至少约8×106个细胞、至少约9×106个细胞、1×107个细胞、至少约2×107个细胞、至少约3×107个细胞、至少约4×107个细胞、至少约5×107个细胞、至少约6×107个细胞、至少约7×107个细胞、至少约8×107个细胞、至少约9×107个细胞、至少约1×108个细胞、至少约2×108个细胞、至少约3×108个细胞、至少约4×108个细胞、至少约5×108个细胞、至少约6×108个细胞、至少约7×108个细胞、至少约8×108个细胞、至少约9×108个细胞、至少约1×109个细胞、至少约2×109个细胞、至少约3×109个细胞、至少约4×109个细胞、至少约5×109个细胞、至少约6×109个细胞、至少约7×109个细胞、至少约8×109个细胞、至少约9×109个细胞、至少约1×1010个细胞、至少约2×1010个细胞、至少约3×1010个细胞、至少约4×1010个细胞、至少约5×1010个细胞、至少约6×1010个细胞、至少约7×1010个细胞、至少约8×1010个细胞、至少约9×1010个细胞、至少约1×1011个细胞、至少约2×1011个细胞、至少约3×1011个细胞、至少约4×1011个细胞、至少约5×1011个细胞、至少约6×1011个细胞、至少约7×1011个细胞、至少约8×1011个细胞、至少约9×1011个细胞或至少约1×1012个细胞，将其施用于受试者。在一些实施例中，免疫细胞群可以包含至多约5×1010个细胞、至多约4×1010个细胞、至多约3×1010个细胞、至多约2×1010个细胞、至多约1×1010个细胞、至多约9×109个细胞、至多约8×109个细胞、至多约7×109个细胞、至多约6×109个细胞、至多约5×109个细胞、至多约4×109个细胞、至多约3×109个细胞、至多约2×109个细胞、至多约1×109个细胞、至多约9×108个细胞、至多约8×108个细胞、至多约7×108个细胞、至多约6×108个细胞、至多约5×108个细胞、至多约4×108个细胞、至多约3×108个细胞、至多约2×108个细胞、至多约1×108个细胞、至多约9×107个细胞、至多约8×107个细胞、至多约7×107个细胞、至多约6×107个细胞、至多约5×107个细胞、至多约4×107个细胞、至多约3×107个细胞、至多约2×107个细胞、至多约1×107个细胞、至多约9×106个细胞、至多约8×106个细胞、至多约7×106个细胞、至多约6×106个细胞、至多约5×106个细胞、至多约4×106个细胞、至多约3×106个细胞、至多约2×106个细胞、至多约1×106个细胞、至多约9×105个细胞、至多约8×105个细胞、至多约7×105个细胞、至多约6×105个细胞、至多约5×105个细胞、至多约4×105个细胞、至多约3×105个细胞、至多约2×105个细胞、或至多约1×105个细胞。可以将免疫细胞群施用于有需要的受试者。例如，可以将约5×1010个细胞施用于受试者。在一些情况下，可以将细胞群扩大到用于疗法的足够数量。例如，5×107个细胞可以经历快速扩增，以产生用于治疗用途的足够数量。可以将任何数量的细胞施用于受试者(例如通过输注)以用于治疗用途。例如，可以向患者输注例如约1×106至5×1012之间的数量的细胞(包括端值在内)。可以为患者输注尽可能多的细胞(可以针对它们产生的)。
在本文各个方面的任何细胞中，细胞可表现出与同时存在于靶细胞中的两种抗原的特异性结合。抗原可以存在于靶细胞表面，或者在一些情况下，可以是由另一个细胞展示的靶细胞的细胞内蛋白(如在MHC的情况下)。
在本文的方面的各种实施例中，与该CAR连接的该抗原结合结构域可能主要介导该免疫细胞与该靶细胞之间的相互作用，并且当该免疫细胞与该靶细胞之间发生相互作用时，与该经修饰的TCR复合物连接的该抗原结合结构域可能主要介导免疫细胞活性。如本文先前描述的，免疫细胞活性可以包括免疫细胞的克隆扩增；由该免疫细胞进行的细胞因子释放；该免疫细胞的细胞毒性；该免疫细胞的增殖；该免疫细胞的分化、去分化或转分化；该免疫细胞的运动和/或运输；该免疫细胞的衰竭和/或再活化；和由该免疫细胞进行的其他细胞内分子、代谢物、化学化合物、或其组合的释放。
在一方面，本文提供了诱导免疫细胞和/或靶细胞活性的方法，该方法包括(a)在免疫细胞中表达系统；以及(b)在诱导该免疫细胞和/或靶细胞的活性的条件下使该靶细胞与该免疫细胞接触，其中在免疫细胞中表达的该系统包含嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和缺乏CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；和经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该复合物包含与以下中的至少一种连接的第二抗原结合结构域：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。
当靶细胞与表达系统的免疫细胞接触时，第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域可以结合其各自表位。这些表位，例如，存在于靶细胞上。第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域与其各自表位的结合可以激活免疫细胞的细胞毒性。在一些情况下，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或表达该系统并且其中仅第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，当第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者分别各自结合它们的表位时在免疫细胞中激活的细胞毒性增强。第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域与其各自表位的结合可以激活免疫细胞的细胞毒性并且减少与细胞毒性相关的副作用。在一些情况下，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或表达该系统并且其中仅第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，与细胞毒性有关的副作用的减少更多。在一些情况下，减少的副作用是细胞因子释放综合征。第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域与其各自表位的结合可以激活免疫细胞的细胞毒性并且增加细胞毒性的持久性。在一些情况下，与缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞和/或表达该系统并且其中仅第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞相比，细胞毒性的持久性增加。在一些情况下，免疫细胞的细胞毒性减少了靶细胞的死亡。
在诱导免疫细胞和/或靶细胞活性的方法的各种实施例中，免疫细胞可以是多种免疫细胞中的任一种。在一些情况下，免疫细胞包含淋巴细胞。淋巴细胞可以是T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、和/或辅助T细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
在诱导免疫细胞和/或靶细胞活性的方法的各种实施例中，靶细胞可以是多种细胞类型中的任一种。靶细胞可以是，例如，癌细胞、造血细胞、或实体瘤细胞。在一些情况下，靶细胞可以是在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、膈膜、软骨、韧带和肌腱中的一种或多种中鉴定的细胞。靶细胞可以是患病细胞。
在一方面，本披露提供了治疗受试者的癌症的方法。该方法包括(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，该抗原特异性免疫细胞包含含有第一抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)和含有第二抗原结合结构域的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，其中受试者的癌症靶细胞表达被第一和/或第二抗原结合结构域识别的一种或多种抗原，并且其中免疫细胞特异性结合靶细胞，以及(b)在诱导免疫细胞针对靶细胞的免疫细胞活性的条件下经由第一和/或第二抗原结合结构域来使靶细胞与抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导癌症的靶细胞死亡。
在一方面，本披露提供了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，其中该抗原特异性免疫细胞是经遗传修饰的免疫细胞，该免疫细胞表达本文提供的实施例的任何系统；以及(b)在诱导免疫细胞针对受试者的癌症靶细胞的免疫细胞活性的条件下使靶细胞与抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导癌症的靶细胞死亡。
在一些实施例中，治疗受试者的癌症的方法包括基因修饰免疫细胞以产生抗原特异性免疫细胞。
靶细胞与抗原特异性免疫细胞接触后，针对受试者的癌症靶细胞的免疫细胞活性可以诱导靶细胞死亡。免疫细胞活性可以选自由以下组成的组：该免疫细胞的克隆扩增；由该免疫细胞进行的细胞因子释放；该免疫细胞的细胞毒性；该免疫细胞的增殖；该免疫细胞的分化、去分化或转分化；该免疫细胞的运动和/或运输；该免疫细胞的衰竭和/或再活化；和由该免疫细胞进行的其他细胞内分子、代谢物、化学化合物、或其组合的释放。在一些情况下，免疫细胞活性是免疫细胞的细胞毒性。免疫细胞对靶细胞的细胞毒性可以产生至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或高达约100％的受试者的癌症减少。在一些实施例中，免疫细胞活性可以是通过免疫细胞的细胞因子释放。在一些情况下，由免疫细胞释放细胞因子。由免疫细胞释放的细胞因子的量可以比缺乏该系统的可比免疫细胞、缺乏该系统的一种或多种组分(例如，CAR、经修饰的TCR)的可比免疫细胞和/或其中仅第一和第二抗原结合结构域中的一个与其各自表位结合的可比免疫细胞小至少3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或高达100％。在一些情况下，与仅单独结合第一抗原结合结构域或单独结合第二抗原结合结构域相比，当第一和第二抗原结合结构域两者均结合其各自表位时，免疫细胞活性的持久性更大。
在治疗受试者的癌症的方法的各种实施例中，免疫细胞可以是多种免疫细胞中的任一种。在一些情况下，免疫细胞包含淋巴细胞。淋巴细胞可以是T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。在一些情况下，该淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些情况下，表达主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞(如KHYG-1细胞)或其衍生物。
在治疗受试者的癌症的方法的各种实施例中，癌症可以是多种癌症中的任一种。癌症是，例如膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头颈癌、肾癌、白血病、急性髓系白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、睾丸癌、气管癌或外阴癌。
在一方面，本披露提供了包含一种或多种多核苷酸的组合物，该一种或多种多核苷酸编码(a)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该复合物包含表现出与第二表位特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域与以下连接：选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链；分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链；或CD3ζ链。该组合物可包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码(a)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和(b)与以下连接的第二抗原结合结构域：T细胞受体的α链、β链、γ链、和/或δ链；分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链；或CD3ζ链。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸包含与其可操作地连接的启动子。一种或多种多核苷酸可以包含脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。在一些实施例中，将由一种或多种多核苷酸编码的系统的一种或多种组分通过分隔两个或多个核酸编码区的接头连接。接头可以是2A序列、弗林蛋白酶-V5-SGSGF2A等。
在一方面，本披露提供了产生经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括通过在免疫细胞中表达本文提供的组合物来遗传修饰该免疫细胞，从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在本文的方面的各种实施例中，可以将包含本文提供的系统的免疫细胞用于诱导靶细胞死亡。使用本披露的系统和方法可以杀死多种靶细胞。可以应用此方法的靶细胞包括多种细胞类型。靶细胞可以是体外的。靶细胞可以是体内的。靶细胞可以是离体的。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养物中的细胞。靶细胞可以是细胞集合中的一个。靶细胞可以是哺乳动物细胞或源自哺乳动物细胞。靶细胞可以是啮齿动物细胞或源自啮齿动物细胞。靶细胞可以是人类细胞或源自人类细胞。靶细胞可以是原核细胞或源自原核细胞。靶细胞可以是细菌细胞或可以源自细菌细胞。靶细胞可以是古细菌细胞或源自古细菌细胞。靶细胞可以是真核细胞或源自真核细胞。靶细胞可以是多能干细胞。靶细胞可以是植物细胞或源自植物细胞。靶细胞可以是动物细胞或源自动物细胞。靶细胞可以是无脊椎动物细胞或源自无脊椎动物细胞。靶细胞可以是脊椎动物细胞或源自脊椎动物细胞。靶细胞可以是微生物细胞或源自微生物细胞。靶细胞可以是真菌细胞或源自真菌细胞。靶细胞可以来自特定器官或组织。
靶细胞可以是干细胞或祖细胞。靶细胞可以包括干细胞(例如，成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干(iPS)细胞)和祖细胞(例如，心脏祖细胞、神经祖细胞等)。靶细胞可以包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人干细胞、人祖细胞等。克隆细胞可以包含细胞的后代。靶细胞可以在活生物体中。靶细胞可以是经遗传修饰的细胞。
靶细胞可以是原代细胞。例如，可以将原代细胞的培养物传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多。细胞可以是单细胞生物体。细胞可以在培养物中生长。
靶细胞可以是患病细胞。患病细胞可具有改变的代谢、基因表达和/或形态特征。患病细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞和/或凋亡细胞。患病细胞可以是来自患病受试者的细胞。示例性疾病可以包括血液障碍、癌症、代谢障碍、眼睛障碍、器官障碍、肌肉骨骼障碍、心脏病等。
如果靶细胞是原代细胞，则它们可通过任何方法从个体收获，例如在体外实验中。例如，可以通过单采、白细胞分离术、密度梯度分离等来收获白细胞。可以通过活检来收获来自组织如皮肤、肌肉、骨髓、脾脏、肝、胰腺、肺、肠、胃等的细胞。可以使用合适的溶液来分散或悬浮收获的细胞。此种溶液通常可以是便利地补充有胎牛血清或其他天然存在的因子，结合低浓度的可接受的缓冲液的平衡盐溶液(例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)等)。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸缓冲液等。可以立即使用细胞，或者也可以储存(例如，通过冷冻)他们。可以将冷冻细胞解冻并且其能重复使用。可以将细胞在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基)和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其他此种常用溶液中冷冻。
可以在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、膈膜、软骨、韧带和肌腱中的一种或多种中鉴定靶细胞。
可以作为靶细胞的细胞的非限制性实例包括，但不限于，造血细胞、淋巴细胞(如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、辅助T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞)；髓细胞(如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多节核中性白细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突状细胞)；来自内分泌系统的细胞(包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体((松果体细胞)细胞)；神经系统的细胞(包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞和垂体(促性腺细胞(Gonadotrope)、促皮质激素细胞(Corticotrope)、促甲状腺细胞(Thyrotrope)、生长激素细胞(Somatotrope)、催乳激素细胞(Lactotroph))；呼吸系统的细胞(包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、尘细胞)；循环系统的细胞(包括心肌细胞、周细胞)；消化系统的细胞(包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞)；肠内分泌细胞(包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝(肝细胞、库普弗细胞)、软骨/骨/肌肉)；骨细胞(包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿(成牙骨质细胞、成釉细胞))；软骨细胞(cartilage cell)(包括成软骨细胞、软骨细胞(Chondrocyte))；皮肤细胞(包括毛细胞、角质细胞、黑色素细胞(痣细胞))；肌肉细胞(包括肌细胞)；泌尿系统细胞(包括足细胞、肾小球旁细胞、球内系膜细胞/球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞(Kidney proximal tubule brush border cell)、致密斑细胞)；生殖系统细胞(包括精子、支持细胞、间质细胞、卵子)；以及其他细胞(包括脂肪细胞，成纤维细胞，肌腱细胞，表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)，表皮基底细胞(干细胞)，手指甲和脚趾甲的角质细胞，甲床基底细胞(干细胞)，髓质毛干细胞，皮质毛干细胞，表皮毛干细胞，表皮毛根鞘细胞，赫胥黎氏层毛根鞘细胞，汉勒氏层毛根鞘细胞，外毛根鞘细胞，毛发基质细胞(干细胞)，湿分层屏障上皮细胞(Wet stratified barrier epithelial cell)，角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞，角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)，泌尿上皮细胞(衬里膀胱(lining urinary bladder)和尿管)，外分泌腺分泌的上皮细胞，唾液腺粘液细胞(富含多糖的分泌)，唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌)，舌上的冯·埃布纳腺细胞(洗味蕾)，乳腺细胞(乳汁分泌)，泪腺细胞(泪液分泌)，耳内耵聍腺细胞(蜡分泌)，外分泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)，外分泌汗腺透明细胞(小分子分泌物)。顶浆分泌汗腺细胞(气味分泌、性激素敏感)、眼睑中的莫耳腺细胞(特化汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)、鼻子中的鲍曼氏腺细胞(洗涤嗅上皮)、十二指肠中的Brunner腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液成分、包括用于游泳精子的果糖)、前列腺细胞(分泌精液成分)、尿道球腺细胞(粘液分泌)、前庭大腺细胞(阴道润滑剂分泌)、Littre细胞腺(粘液分泌)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、呼吸道和消化道的分离的杯状细胞(粘液分泌)、胃内粘液细胞(Stomach lining mucous cell)(粘液分泌)、胃腺酶原细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠潘氏细胞(溶菌酶分泌)、肺的II型肺细胞(表面活性剂分泌)、肺的克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、生长激素细胞(Somatotrope)、催乳素细胞(Lactotrope)、促甲状腺细胞、促性腺素细胞、促皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜氧细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸的间质细胞、卵泡的内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、颗粒黄体细胞、膜黄体细胞、肾小球旁细胞(肾素分泌)、肾的致密斑细胞、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(Barrier function cell)(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾細胞(Kidney)、I型肺细胞(肺的衬里空气空间(lining air space of lung))、胰管细胞(泡心细胞)、(汗腺、唾液腺、乳腺等的)无横纹的导管细胞(Nonstriated ductcell)、(精囊、前列腺等)的导管细胞、内衬封闭内体腔的上皮细胞(Epithelial cellslining closed internal body cavities)、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红血球(红细胞)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨中的)、树突状细胞(淋巴组织中的)、小胶质细胞(中枢神经系统中的)、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、血液和免疫系统的干细胞和定向祖细胞(各种类型)、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、感官传感器细胞(Sensorytransducer cell)、自主神经细胞、感觉器官和外周神经支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵母细胞(Oogonium/Oocyte)、精子细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、看护细胞、卵巢卵泡细胞、支持细胞(睾丸中的)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。
特别感兴趣的是癌细胞。在一些实施例中，该靶细胞是癌细胞。癌症可以是实体瘤或血液肿瘤。癌症可以是转移性的。癌症可以是复发癌症。癌细胞的非限制性实例包括癌症的细胞，这些癌症包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端雀斑样痣型黑色素瘤(Acrallentiginous melanoma)、肢端汗腺瘤(Acrospiroma)、急性嗜酸细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性粒细胞白血病伴成熟、急性髓系树突状细胞白血病、急性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、造釉细胞瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关的癌症、AIDS相关的淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、间变性甲状腺癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂肪瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、贝里尼导管癌(Bellini duct carcinoma)、胆道癌、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、Brenner瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发位点不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌(Carcinoma of thepenis)、原发位点不明的癌、癌肉瘤、卡斯尔曼氏病、中枢神经系统胚胎性肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、慢性中性粒细胞白血病、透明细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆突性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、促结缔组织增生小圆细胞肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关的T细胞性淋巴瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜细胞瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、嗅神经母细胞瘤、Ewing氏家族肿瘤(Ewing Family of Tumor)、Ewing氏家族肉瘤(Ewing Family Sarcoma)、Ewing氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤(颅外)、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、乳房外佩吉特氏病、输卵管癌、胎中胎(Fetus in fetu)、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质细胞瘤(Ganglioglioma)、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠类癌、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤(Germ cell tumor，Germinoma)、妊娠性绒癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺母细胞瘤、卵巢颗粒细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、成血管细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤(Hypothalamic Glioma)、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤(IntraocularMelanoma)、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、青少年骨髓单核细胞性白血病、卡波西肉瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、Klatskin瘤(Klatskin tumor)、库肯勃瘤、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮癌、淋巴性白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、骨的恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性周围神经鞘瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵膈生殖细胞瘤、纵膈肿瘤(Mediastinal tumor)、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发不明的颈部转移性鳞癌、转移性尿路上皮癌、混合副中肾管瘤、单核细胞性白血病、口腔癌、黏液性肿瘤、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常病、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、髓细胞肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer，Nasopharyngeal carcinoma)、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼部肿瘤、少突星形细胞瘤(Oligoastrocytoma)、少突神经胶质瘤、嗜酸性细胞腺瘤(Oncocytoma)、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮性癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、乳腺的佩吉特氏病、pancoast肿瘤、胰腺肿瘤、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌(Paranasal Sinus Cancer)、甲状旁腺癌、阴茎癌(Penile Cancer)、血管周围上皮样细胞瘤、鼻咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化的松果体实质瘤(Pineal Parenchymal Tumor ofIntermediate Differentiation)、松果体母细胞瘤(Pineoblastoma)、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及15号染色体上的NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(Rhabdomyoma，Rhabdomyosarcoma)、Richter转化(Richter's transformation)、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液瘤、支持-间质细胞瘤、性索间质肿瘤(Sex cord-stromaltumor)、塞扎里(Sezary)综合征、印戒细胞癌(Signet ring cell carcinoma)、皮肤癌、小蓝圆细胞肿瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓肿瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、表面上皮间质肿瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌(Terminal lymphatic cancer)、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌(Urachal cancer)、尿道癌、泌尿生殖道肿瘤(Urogenital neoplasm)、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、弗纳-莫里森综合征、疣状癌、视路胶质瘤(Visual Pathway Glioma)、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、Warthin瘤、Wilms瘤、及其组合。在一些实施例中，靶向的癌细胞代表癌细胞群内的亚群，如癌症干细胞。在一些实施例中，癌症属于造血谱系，如淋巴瘤。第一和/或第二抗原结合结构域可以与存在于癌细胞的抗原上的表位结合。
在一些实施例中，靶细胞可以形成肿瘤。用本文的方法治疗的肿瘤可导致稳定的肿瘤生长(例如，一个或多个肿瘤的尺寸增加不超过1％、5％、10％、15％或20％和/或一个或多个肿瘤不转移)。在一些实施例中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或更多周。在一些实施例中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或更多个月。在一些实施例中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多年。在一些实施例中，如根据本文提供的方法的治疗结果，肿瘤的尺寸或肿瘤细胞的数量减少至少约5％、10％、15％、20％、25、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施例中，肿瘤被完全消除或降低到检测水平以下。在一些实施例中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或更多周内保持无肿瘤(例如缓解)。在一些实施例中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或更多个月内保持无肿瘤。在一些实施例中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多年内保持无肿瘤。
靶细胞的死亡可以通过任何合适的方法来确定，该方法包括但不限于在治疗前后对细胞计数，或测量与活细胞或死细胞(例如活的或死的靶细胞)相关的标记物水平。
可以通过任何适合的方法来确定细胞死亡的水平。在一些实施例中，相对于起始条件来确定细胞死亡的程度。例如，个体可以具有已知起始量的靶细胞，如已知尺寸的起始细胞团块或已知浓度的循环靶细胞。在此类情况下，细胞死亡的程度可以表示为治疗后存活细胞与起始细胞群的比率。在一些实施例中，可以通过合适的细胞死亡测定来确定细胞死亡的程度。可以使用多种细胞死亡测定并且其可以利用多种检测方法。检测方法的实例包括，但不限于使用细胞染色、显微镜检查、流式细胞术、细胞分选和这些的组合。
当肿瘤在完成治疗期后进行手术切除时，可以通过测量坏死(即死亡)切除组织的百分比来确定在减小肿瘤尺寸方面的治疗功效。在一些实施例中，如果切除组织的坏死百分比大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)，则治疗是治疗有效的。在一些实施例中，切除组织的坏死百分比为100％，即不存在或检测不到活的肿瘤组织。
在本文提供的方面的各种实施例中，可以在体外或体内将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群或将靶细胞与免疫细胞或免疫细胞群接触。将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群通常是指使靶细胞与免疫细胞接触和/或足够接近，使得靶细胞的抗原(例如，包含表位)(例如，膜结合或非膜结合)可以结合第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的抗原结合结构域。在体外将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群可以通过共培养靶细胞和免疫细胞来实现。可以将靶细胞和免疫细胞共培养，例如作为贴壁细胞或可替代地在悬浮液中。可以将靶细胞和免疫细胞在各种合适类型的细胞培养基(例如具有补充剂、生长因子、离子等的)中共培养。在一些情况下，可以通过将免疫细胞施用于受试者，例如人受试者，并允许免疫细胞经由循环系统定位于靶细胞来在体内将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群。在一些情况下，可以将免疫细胞递送至靶细胞所在的附近区域(immediate area)，例如，通过直接注射。
可以进行任何合适时间长度的暴露或接触，例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长。
在本文的方面的各种实施例中，在宿主细胞(例如，免疫细胞，例如，抗原特异性免疫细胞)中表达本文提供的系统。宿主细胞可以是人细胞。宿主细胞可以是非人细胞。宿主细胞对有需要的受试者可以是自体的或同种异体的。在一些情况下，宿主细胞可以是异种的。宿主细胞可以是免疫细胞，如淋巴细胞或髓细胞。宿主细胞可以是T细胞、B细胞、NK细胞等。在一些实施例中，宿主细胞可以是CD3+细胞、CD3-细胞、CD5+细胞、CD5-细胞、CD7+细胞、CD7-细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD8+细胞、CD8-细胞、CD103+细胞、CD103-细胞、CD11b+细胞、CD11b-细胞、BDCA1+细胞、BDCA1-细胞、L-选择素+细胞、L-选择素-细胞、CD25+、CD25-细胞、CD27+、CD27-细胞、CD28+细胞、CD28-细胞、CD44+细胞、CD44-细胞、CD56+细胞、CD56-细胞、CD57+细胞、CD57-细胞、CD62L+细胞、CD62L-细胞、CD69+细胞、CD69-细胞、CD45RO+细胞、CD45RO-细胞、CD127+细胞、CD127-细胞、CD132+细胞、CD132-细胞、IL-7+细胞、IL-7-细胞、IL-15+细胞、IL-15-细胞、凝集素样受体G1阳性细胞、凝集素样受体G1阴性细胞、或其分化或去分化的细胞。在一些实施例中，宿主细胞可以对两种或更多种因子呈阳性。例如，宿主细胞可以是CD4+和CD8+。在一些实施例中，宿主细胞可以对两种或更多种因子呈阴性。例如，宿主细胞可以是CD25-、CD44-、和CD69-。在一些实施例中，宿主细胞可以对一种或更多种因子呈阳性并且对一种或更多种因子呈阴性。例如，细胞可以是CD4+和CD8-。在一些实施例中，可以选择具有或不具有一种或多种给定因子的宿主细胞(例如，可基于本文所述的一种或多种标志物的存在或不存在来分离细胞)。
在一些实施例中，也可以体外扩增选择的宿主细胞，可以将选择和/或扩增的宿主细胞施用于有需要的受试者。应当理解，在本文披露的任何方法中使用的细胞可以是本文披露的任何细胞的混合物(例如，两种或更多种不同的细胞)。例如，组合物可以包含不同细胞(例如T细胞和B细胞)的混合物。混合物可以包括，例如，包含CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+的干记忆TSCM细胞，干记忆细胞也可以表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3、和LFA-1，并且显示出干记忆细胞特有的许多功能属性。混合物可以包括，例如，包含L-选择素和CCR7的中枢记忆TCM细胞，其中中枢记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。混合物可以包括，例如，包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞并且产生，例如，效应细胞因子如IFNγ和IL-4。
宿主细胞可以获得自受试者。在一些情况下，宿主细胞可以是获得自受试者的T细胞群、NK细胞群、B细胞群等。T细胞可以获得自许多来源，包括PBMC、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、和来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用任何数量的技术(如，FicollTM分离)来从受试者收集的血液中获得T细胞。在一个实施例中，来自个体循环血的细胞是通过单采(apheresis)获得的。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。可以洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。
在一些实施例中，本文提供的免疫细胞群可以是异质的。在一些实施例中，使用的细胞可以由CD4和CD8 T细胞的异质混合物组成。所述CD4和CD8细胞可以具有循环效应T细胞的表型特征。所述CD4和CD8细胞也可以具有效应记忆细胞的表型特征。在一些实施例中，细胞可以是中枢记忆细胞。
在一些实施例中，宿主细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群，如，但不限于T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。在一些情况下，细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞，如肿瘤浸润细胞(TIL)，如CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或任何其他类型的T细胞。T细胞还可以包括记忆T细胞、记忆干T细胞或效应T细胞。T细胞还可以选自大量细胞群，例如，从全血中选择的T细胞。还可以从大量细胞群中扩增T细胞。T细胞也可以偏向于特定细胞群和表型。例如，T细胞可以偏向于表型包含CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。可以选择合适的细胞，其包含选自包含以下的列表的多种标记中的一种：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。宿主细胞还包括干细胞，如，例如，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。宿主细胞可以包含任何数量的原代细胞，如人细胞、非人细胞和/或小鼠细胞。宿主细胞可以是祖细胞。宿主细胞可以源自待治疗的受试者(例如，患者)。宿主细胞可以源自人供体。宿主细胞可以是，由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+组成的干记忆TSCM细胞，所述干记忆细胞也可以表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3、和LFA-1，并且显示出所述干记忆细胞特有的许多功能属性。宿主细胞可以是包含L-选择素和CCR7的中枢记忆TCM细胞，所述中枢记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。宿主细胞还可以是包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞并且产生，例如，效应细胞因子如IFNγ和IL-4。
已经开发了用于将基因转移到哺乳动物细胞中的许多基于病毒的系统。例如，逆转录病毒、慢病毒、和腺病毒为基因递送系统提供了便利的平台。使用本领域已知的技术可以将主题系统插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。来源于逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体比来源于癌逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有更多的优势，因为它们可以转导非增殖细胞。它们还具有低免疫原性的另外的优势。
在一方面，编码包含经修饰的TCR复合物和/或CAR的系统的核酸可以病毒或非病毒地递送。在一些实施例中，编码包含经修饰的TCR复合物和/或CAR的系统的核酸可以通过病毒递送系统递送。可以通过直接注射，立体定向注射，通过微型泵输注系统，通过对流，导管的脑室内地静脉内、肠胃外、腹膜内和/或皮下注射来将病毒递送系统(例如，包含本披露的药物组合物的病毒)施用于有需要的受试者的细胞、组织或器官。在一些情况下，可以用病毒递送系统体外或离体转导细胞。可以将转导的细胞施用于患有疾病的受试者。例如，可以用包含药物组合物的病毒递送系统转导干细胞并且可以将干细胞植入患者中以治疗疾病。在一些情况下，给予受试者的转导细胞剂量可以是一个单剂量中约1×105细胞/kg、约5×105细胞/kg、约1×106细胞/kg、约2×106细胞/kg、约3×106细胞/kg、约4×106细胞/kg、约5×106细胞/kg、约6×106细胞/kg、约7×106细胞/kg、约8×106细胞/kg、约9×106细胞/kg、约1×107细胞/kg、约5×107细胞/kg、约1×108细胞/kg、或更多。
在一些实施例中，编码包含经修饰的TCR复合物和/或CAR的系统的核酸可以通过非病毒递送系统递送。可用于本文的非病毒递送系统包括但不限于DNA质粒、RNA、裸核酸和与递送载体(如脂质体或泊洛沙姆)复合的核酸。在一些实施例中，非病毒递送系统是基于转座子的递送系统。在一些实施例中，非病毒递送系统是选自睡美人(SB)转座子系统、PiggyBac转座子系统和Tol2转座子系统的基于转座子的递送系统。
可以将包装细胞系用于产生包含本文提供的系统的病毒颗粒。还可以将包装细胞系用于进行本文提供的方法。可以使用的包装细胞包括，但不限于，HEK 293细胞、HeLa细胞、和Vero细胞等。在一些情况下，通过PEG沉淀来处理包装细胞系的上清液以浓缩病毒颗粒。在其他情况下，可以将离心步骤用于浓缩病毒颗粒。例如，可以使用柱子来在离心过程中浓缩病毒。在一些情况下，在不超过约4℃(例如约3℃、约2℃、约1℃或约1℃)下发生至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时、或至少约24小时的沉淀。在一些情况下，可以通过低速离心，随后的CsCl梯度来从PEG沉淀的上清液中分离病毒颗粒。低速离心可以是约4000rpm、约4500rpm、约5000rpm、或约6000rpm持续约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、或约60分钟。在一些情况下，通过以约5000rpm离心约30分钟，随后是CsCl梯度来从PEG沉淀的上清液分离病毒颗粒。
可以将病毒(例如，慢病毒)在刺激或激活步骤(例如抗CD3、抗CD28或其组合)后约、从约、至少约或至多约1-3小时、3-6小时、6-9小时、9-12小时、12-15小时、15-18小时、18-21小时、21-23小时、23-26小时、26-29小时、29-31小时、31-33小时、33-35小时、35-37小时、37-39小时、39-41小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、16天、20天、或超过20天引入主题细胞或主题细胞群。在一些情况下，病毒载体编码系统，例如CAR-T、经修饰的TCR复合物或其组合。在一些情况下，病毒载体编码CAR-T。在一些情况下，病毒载体编码经修饰的TCR复合物。可以用编码CAR和经修饰的TCR复合物的病毒颗粒转导免疫细胞。可以用编码CAR的病毒颗粒转导免疫细胞。可以用编码经修饰的TCR复合物的病毒颗粒转导免疫细胞。可以将编码主题系统的核酸随机插入细胞的基因组中。编码系统的核酸可以编码其自身的启动子或可插入到受细胞内源性启动子控制的位置。可替代地，可以将编码系统的核酸插入基因，例如基因的内含子、基因的外显子、启动子或非编码区。可以通过表达测定(例如qPCR)或通过测量转导细胞中的RNA水平来验证系统的表达。表达水平还可以指示拷贝数。例如，如果表达水平较高，则可以表明超过一个拷贝的编码系统的核酸被整合到细胞的基因组中。可替代地，高表达可以表明编码系统的核酸被整合进高度转录区，例如，靠近高度表达的启动子。也可以通过测量蛋白质水平，如通过蛋白质印迹来验证表达。
可以通过荧光激活细胞分选(FACS)来测量主题细胞或主题细胞群的细胞活力。在一些情况下，在将包含编码主题系统的核酸的病毒或非病毒载体引入细胞或细胞群后测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒载体引入细胞或细胞群后，细胞群中至少约、或至多约、或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％的细胞是活的。在一些情况下，在将病毒载体引入细胞和/或细胞群后约、至少约、或至多约4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时、或超过240小时测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒载体引入细胞或细胞群后约、至少约、或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天、或超过90天测量细胞活力。在一些情况下，在将病毒载体引入细胞或细胞群后约、至少约、或至多约4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时、96小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时、或超过240小时测量细胞毒性。
在一些实施例中，可以通过病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米粒子介导的核酸递送等来递送编码包含经修饰的TCR复合物和/或CAR的系统的一种或多种核酸。
在一些实施例中，施用表达本文提供的系统的免疫细胞。可以在疾病或病症发生之前、期间或之后施用免疫细胞，并且施用免疫细胞的时间可以变化。例如，表达主题系统的免疫细胞可以用作预防剂并且可以连续施用于具有病症或疾病倾向的受试者以防止疾病或病症的发生。可以在症状出现期间或在症状出现后尽快将免疫细胞施用于受试者。可以在症状发作的前48小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前6小时内或症状发作的3小时内开始施用。初始施用可以经由任何合适的途径，如通过使用本文所述的任何配制品的本文所述的任何途径。在检测到或怀疑疾病或病症发作后，可以在可行的情况下尽快施用免疫细胞，并持续治疗疾病所必需的时间长度，如，例如，约1个月至约3个月。针对每个受试者，治疗时长可以不同。
可以使用已知的模式和技术来将本文提供的包含表达主题系统的免疫细胞的组合物施用于受试者。示例性的模式包括，但不限于，静脉注射。其他模式包括，但不限于，瘤内、皮内、皮下(S.C.、s.q.、sub-Q、Hypo)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。可以使用任何已知的可用于配制品输注的肠胃外注射的装置来影响此种施用。可以将包含主题组合物的配制品以有效治疗和/或预防特定适应征或疾病的量施用于受试者。医师可以确定将使用的适当剂量。包含表达主题系统的免疫细胞的组合物可以每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周一次、每八天、每九天、每十天、两周、每月和两月施用4次、3次、2次或1次。
可以将本文提供的组合物和方法与包括细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂的二级疗法组合。可以将细胞毒性/抗肿瘤剂定义为攻击和杀死癌细胞的药剂。还可以使用抗血管生成剂。也可以使用小分子(包括拓扑异构酶，如雷佐生，具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂)。
包含本文提供的任何系统的免疫细胞可以与任何数量的相关治疗方式(包括但不限于用药剂治疗，如抗病毒疗法、西多福韦和白介素-2、或阿糖胞苷(也称为ARA-C)))联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者。在一些情况下，可以将主题免疫细胞与以下组合使用：化疗、放疗、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体、或其他免疫吸附剂(如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子以及照射。工程化的细胞组合物也可以与以下联合(例如，之前、同时或之后)施用至患者：骨髓移植，使用化学治疗剂(如氟达拉滨)、外部光束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺、或抗体(如OKT3或CAMPATH)进行的T细胞消融疗法。在一些情况下，可以将主题免疫细胞组合物在B细胞消融疗法(如，与CD20反应的药剂，例如利妥昔单抗)后施用。例如，受试者可以经受用高剂量化学疗法、然后进行外周血干细胞移植的标准疗法。在某些实施例中，在移植后，受试者可以接受免疫细胞(例如，包含主题系统的扩增的免疫细胞)的输注。此外，可以在手术前或手术后施用扩增的免疫细胞。
本文提供的免疫细胞、组合物和方法可以与T细胞刺激剂组合(例如，之前、同时或之后)使用。T细胞刺激剂是可以激活、扩增、刺激或调节T细胞的分子。在一些情况下，T细胞刺激剂是γδT细胞刺激剂。特别地，所述T细胞刺激剂是包括，但不限于焦磷酸异戊烯酯(IPP)、4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)、磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)、焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)、乙基腺苷三磷酸酯(EPPPA)、焦磷酸香叶酯(GPP)、焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)、异戊烯基-腺苷三磷酸酯(IPPPA)、磷酸单乙酯(MEP)、焦磷酸单乙酯(MEPP)、3-甲酰基-1-丁基-焦磷酸酯(TUBAg 1)、X-焦磷酸盐(TUBAg 2)、3-甲酰基-1-丁基-尿苷三磷酸酯(TUBAg 3)、3-甲酰基-1-丁基-脱氧胸苷三磷酸酯(TUBAg 4)、单乙基烷基胺、焦磷酸烯丙酯、焦磷酸巴豆酯(crotoylpyrophosphate)、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、巴豆基-γ-尿苷三磷酸酯、烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺、含氮双膦酸盐、双膦酸(如帕米膦酸盐、阿仑膦酸盐、唑来膦酸盐、利塞膦酸盐、奈立膦酸盐、伊班膦酸盐、伊卡膦酸盐、奥帕膦酸盐、olvadronate、米诺膦酸盐、EB1053、依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐和亚甲基二磷酸)、溴醇焦磷酸酯(BrHPP)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或其任何类似物。
在一些情况下，例如，在治疗癌症的组合物、配制品和方法中，施用的组合物或配制品的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。在一些情况下，施用的组合物或配制品的总量可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100g。
本文还可以提供包含主题细胞和主题系统的药物组合物。在一方面，药物组合物包含含有单位剂型的主题系统的细胞群。在一方面，药物组合物包含含有γδT细胞(包含主题系统)的细胞群。在一方面，药物组合物包含含有αβT细胞(包含主题系统)的细胞群。
可以施用包含本文所述的系统或含有系统的免疫细胞的药物组合物，以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，可以将组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或病症的症状，或治愈、愈合、改善或减轻病症的量施用于已经患有疾病或病症的受试者。有效用于此用途的量可以基于疾病或病症的严重程度和病程、先前疗法、受试者的健康状况、体重和对药物的反应以及治疗医师的判断来变化。
可以以任何顺序或同时施用多种治疗剂。如果同时，则多种治疗剂可以以单一、统一形式，或以多种形式(例如，以多个单独的药丸)提供。可以将分子一起或分开包装在单一包装中或多个包装中。可以以多个剂量给予一种或所有治疗剂。如果不是同时，则多个剂量之间的时间可以变化至长达约一个月。
可以在疾病或病症发生之前、期间或之后施用本文所述的系统，并且施用组合物的时间可以变化。例如，药物组合物可以用作预防剂并且可以连续施用于具有病症或疾病倾向的受试者以防止疾病或病症的发生。可以在症状出现期间或在症状出现后尽快将药物组合物施用于受试者。可以在症状发作的前48小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前6小时内或症状发作的3小时内开始施用分子。初始施用可以经由任何实际的途径，如通过使用本文所述的任何配制品的本文所述的任何途径。在检测到或怀疑疾病或病症发作后，可以在可行的情况下尽快施用系统，并持续治疗疾病所必需的时间长度，例如，约1个月至约3个月。针对每个受试者，治疗时长可以不同。
实例
通过以下非限制性实例进一步说明本披露的不同方面。
实例1：TCR+仅包含共刺激域的CAR构建体的设计
此实例描述了示例性TCR+仅包含共刺激域的CAR构建体的设计。设计了12种构建体，每种包含如下的一种多核苷酸：
构建体1(抗CLL-1 TCRε+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3ε前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3ε-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体2(抗CLL-1 TCRδ+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3δ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3δ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体3(抗CLL-1 TCRγ+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3γ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3γ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体4(抗CLL-1串联TCRεε+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3ε前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3ε-T2A-CD8前导肽-抗CD33sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体5(抗CLL-1串联TCRδδ+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3δ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3δ-T2A-CD8前导肽-抗CD33sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体6(抗CLL-1串联TCRγγ+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3γ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-抗CLL-1sdAb-(G4S)3-CD3γ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体7(抗CLL-1 TCRε+抗CD33共刺激串联CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3ε前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3ε-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-(G4S)3-抗CD33sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体8(抗CLL-1 TCRδ+抗CD33共刺激串联CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3δ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3δ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-(G4S)3-抗CD33sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体9(抗CLL-1 TCRγ+抗CD33共刺激串联CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3γ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3γ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-(G4S)3-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体10(抗CLL-1并联TCRεδ+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3ε前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3ε-T2A-CD3δ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3δ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体11(抗CLL-1并联TCRεγ+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3ε前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3ε-T2A-CD3γ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3γ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
构建体12(抗CLL-1并联TCRδγ+抗CD33共刺激CAR)：多核苷酸从N-末端到C-末端包含CD3γ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3γ-T2A-CD3δ前导肽-抗CLL-1 sdAb-(G4S)3-CD3δ-T2A-CD8前导肽-抗CD33 sdAb-CD8铰链-CD8跨膜-CD27共刺激结构域；
用于以上系统的抗CLL-1 sdAb序列对应于表5中列出的SEQ ID NO.41。用于以上系统的抗CD33 sdAb序列对应于表2中列出的SEQ ID NO.23。
多核苷酸是基因合成的并且被插入慢病毒载体(用于修饰的TCR和/或CAR转导)。以下前导肽、铰链和跨膜结构域的非限制性示例性序列可以与以下序列具有约60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性：
SEQ ID NO:1(CD8前导子)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:2(CD3ε前导子)
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQ
SEQ ID NO:3(CD3γ前导子)
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLA
SEQ ID NO:4(CD3δ前导子)
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSP
SEQ ID NO:5(CD8铰链)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:6(CD8跨膜)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
实例2：病毒转染和病毒粒子生产
为了产生包含编码本文披露的任何系统的多核酸的病毒颗粒，将包括pMDLg/pRRE(Addgene#12251)、pRSV-Rev(Addgene#12253)和pMD2.G(Addgene#12259的慢病毒包装质粒混合物与PLVX-EF1A(包括靶系统)载体以预先优化的比率与聚醚酰亚胺(PEI)预混合，充分混合并在室温下孵育5分钟。将转染混合物逐滴添加滴至293-T细胞中并轻轻混合。将转染的293-T细胞在37℃和5％CO2下孵育过夜。转染后24小时，收集上清液，并在4℃，500g离心10min以去除任何细胞碎片。将离心后的上清液通过0.45μm PES过滤器过滤，超速离心后浓缩病毒上清液。离心后，小心丢弃上清液，并用预冷的DPBS冲洗病毒沉淀。测定病毒的浓度。将病毒等分并储存在-80℃。通过T细胞系上的功能转导测定病毒滴度。
简而言之，使用pLVX-Puro(Clontech#632164)，通过将原始启动子替换为人类延伸因子1α启动子(hEF1α)并通过GenScript用EcoRI和BamHI去除嘌呤霉素抗性基因来修饰慢病毒载体。PLVX-EF1A进一步进行如上所述的慢病毒包装程序。
实例3：免疫细胞制备
在R10培养基中收集α/β白细胞，然后将其与0.9％NaCl溶液以1:1(v/v)的比率混合。将3mL lymphoprep培养基添加至15mL离心管中。Lymphoprep缓慢分层，形成6mL的稀释淋巴细胞混合物。将淋巴细胞混合液在20℃以800g不停地离心30分钟。然后用200μL移液器收集淋巴细胞血沉棕黄层。将收获的部分以至少6倍的0.9％NaCl或R10稀释以降低溶液的密度。然后将收获的部分在20℃以250g离心10分钟。将上清液完全吸出，并将10mL的R10添加到细胞沉淀物中。将混合物在20℃以250g进一步离心10分钟。然后将上清液吸出。将2mL37℃预热的R10与100IU/mL IL-2添加到细胞沉淀物中，并将细胞沉淀物轻轻重悬。将细胞定量并且PBMC样品准备好用于实验。使用Miltenyi泛T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)来从PBMC中纯化人T细胞。
随后用人T细胞激活/扩增试剂盒(Milteny#130-091-441)通过每两个细胞使用一个加载的抗生物素MACSiBead颗粒(珠与细胞的比率为1:2)来预激活制备的α/βT细胞48小时。
通过向PBMC中添加5μM唑来膦酸盐和1000IU/mL IL-2来制备γ/δT细胞，并培养14天，定期更换补充有1000IU/mL IL-2的培养基。可替代地，从PBMC或脐带血(UCB)中分离γ/δT细胞，然后用抗γ/δTCR抗体和抗CD3(OKT3)刺激，随后以1:2的比率与基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)共孵育至少10天。
实例4：T细胞修饰
(1)α/βT细胞的转导
收集预激活的α/βT细胞并重悬于含有300IU/mL IL-2的1640培养基中。将编码实例1的系统的慢病毒载体用相同的培养基稀释至MOI＝5并用1E+06活化的T细胞感染。在8μg/ml聚凝胺存在下，用慢病毒原液转导预激活的T细胞，在32℃下以1000g离心1h。然后将转导的细胞转移到细胞培养箱中，在适当的条件下进行转基因表达。第二天，将转导的细胞离心并替换为新鲜的培养基，每2天测量一次细胞浓度，并且添加新鲜的培养基以继续扩增。
(2)γ/δT细胞的转导
通过密度离心(lymphoprep)从白细胞去除术材料分离PBMC并冷冻保存。复苏PBMC并在补充有IL-2(1000IU/ml)和5％人AB血清的细胞培养基AIM-V中用唑来膦酸(5μM)激活，并且保存在加湿室(37℃，5％CO2)中。激活后48小时，在MOI为5且存在5pg/ml聚凝胺下，用编码实例1的系统的慢病毒载体转导细胞。第二天重复这一转导过程，随后在第二次转导后的当天补充含有IL-2(1000IU/ml)的新鲜培养基。在加湿室中在补充有IL-2(1000IU/ml)的AIM-V中培养细胞，培养基的定期更换取决于培养基的pH，以进一步扩增。转导后10天收获细胞，并测定细胞的总数、纯度和转导效率。在将来应用或冷冻保存之前，用阴性TCRγ/δ+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)进一步富集细胞。
实例5：受体表达的定量
在转导后第3天及之后(通常是第3、7和14天)，通过流式细胞术评估细胞中实例1的系统的表达。从培养物中收集细胞的等分试样，洗涤，沉淀并重悬于每个样品50-100μl以1/100于PBS+0.5％FBS中稀释的Ab(eBioscience抗小鼠TCRβPE和抗CAR Ab)中。重悬的细胞在约50至100μl的Ab中。将细胞在4℃下孵育30分钟。根据制造商的说明还添加了活性染料eFluor780或SYTOX蓝活力染色剂。孵育后，将细胞在PBS中洗涤两次并重悬于100至200μlPBS中进行分析。通过流式细胞术定量系统的平均荧光。
对于抗CLL-1染色，将细胞用PE标记的小鼠抗人CLL-1抗体(BioLegend，克隆号50C1)染色。对于抗CD33染色，将细胞用APC标记的小鼠抗人CD33抗体(BioLegend，克隆号WM53)染色。使用FlowJo(Tree Star,Inc.)进行流式细胞术所有实验的分析。
实例6：细胞毒性测定
在20h共培养测定中确定了12种设计的TCR+共刺激CAR以及其对照T细胞的细胞毒性。在实验中，离心收集效应细胞，然后将其用1640无酚红培养基(Invitrogen)和2％热灭活的FBS(Invitrogen)稀释到所希望的浓度。靶细胞，U937，表现出两种靶抗原CLL-1和CD33的强表达。将效应细胞在24孔板中以1:5(E:T＝5:1)的效应子与靶标比率在37℃下共培养48h。其他孔仅含有测定缓冲液(1640无酚红培养基加2％hiFBS)，仅含有靶细胞(T)，仅含有效应细胞(E)和最大释放量的靶细胞(1％triton-X 100溶液)。每种条件进行三次测试，并且通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。完成20h共培养后，将测定板离心，并将上清液收集在新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃-25℃下孵育约30min。使用Flexstation读数器(MolecularDevices)在492nm和650nm处测量并如前所述计算板的吸光度。这些效应细胞经历了两轮靶细胞刺激，以确定其在重复抗原刺激的背景下的抗肿瘤毒性水平。
结果显示，与仅TCR、仅CAR(具有CD3ζ信号)和测试的串联设计相比，TCR+仅包含共刺激域的CAR(无CD3ζ信号)设计表现出大致相同水平的抗肿瘤细胞毒性，图5。然而，在第二轮抗原刺激时，不同设计的抗肿瘤毒性开始出现差异。首先，与CD3的δ对应物相比，其中抗CLL-1结构域与TCR复合物内CD3的ε或γ亚基融合的设计显示出更好的抗肿瘤细胞毒性。然而，在第二轮抗原刺激期间，与仅TCR和仅包含共刺激域的CAR(无CD3ζ信号)对照物(无论TCR复合物的哪些CD3亚基用于抗CLL-1结构域融合)相比，TCR+仅包含共刺激CAR(无CD3ζ信号)展现出更好的体外功效(图5A、图5B和图5C)。其次，当两个抗CLL-1结构域与TCR复合物内的CD3亚基融合时，观察到用于串联设计的仅TCR设计的抗肿瘤细胞毒性显著改善。此外，当抗CLL-1结构域与具有TCR复合物的CD3亚基并联融合时，观察到更强的抗肿瘤细胞毒性(图5D)。有趣的是，CD3δ亚基与抗CLL-1结构域融合发现的缺陷可以用串联或并联设计来挽救。基于γδT细胞中的以上发现，使用αβT细胞进行类似的分析，重点是关于CD3ε亚基的设计。结果显示，与仅TCR和仅包含共刺激域的CAR(无CD3ζ信号)相比，包含主题TCR+仅共刺激域的CAR(无CD3ζ信号)的αβT细胞在第二轮抗原刺激期间展示出更好的体外功效。此外，与γδT细胞的类似，发现串联和并联设计改善了抗肿瘤细胞毒性(图5E)。
实例7：细胞因子释放测定
将具有实例1中指定的不同设计的γ/δ或α/βT细胞与U937细胞以1:5的比率孵育48小时。收集共培养物的上清液以用于使用以下商业试剂盒的细胞因子释放分析：人IFNγ试剂盒(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)、人TNFα试剂盒(Cisbio，目录号62HTNFAPEH)和人GM-CSF试剂盒(Cisbio，目录号62HGMCSFPEH)。将细胞上清液和ELISA标准品直接分配到测定板中，以使用
Figure BDA0003308759980000761
试剂进行细胞因子检测。将用HTRF供体和受体标记的抗体预先混合，并添加在单个分配步骤中。使用四参数逻辑(4PL)曲线产生ELISA标准曲线。与线性分析相比，使用标准曲线的回归能在更大的浓度范围内准确测量未知样品浓度，其适合于分析生物系统，如细胞因子释放。
αβT细胞产生的细胞因子比具有相同分子设计的γδT细胞更多，图6。这表明可以将包含实例1中概述的设计的γδT细胞安全地施用于受试者。γδT细胞中TCR+仅包含共刺激域的CAR(无CD3ζ信号)产生的GM-TNF-α比TCR+CAR(具有CD3ζ信号)的显著更少，进一步证明了γδT细胞中TCR+仅包含共刺激域的CAR设计的安全特性(图6B)。此外，两种设计均展现出相似水平的IFN-γ，确保了其抗肿瘤细胞毒性和功能。
实例8：集落形成单位(CFU)测定
为了评估实例1中概述的主题分子设计的潜在毒性(如果有的话)，包含抗CD33结构域的选择构建体的细胞毒性用于在针对源自富含CD34的正常脐带血(CB)样品的正常造血细胞的CFU测定中。将CD34+脐带血(CB)细胞(HemaCare，目录：CB34C-2)阳性富集并与CD33 CAR-T细胞或仅培养基(未处理)以10:1的E:T(CAR-T:CB细胞)共培养6小时。然后将混合的细胞接种在METHOCULTTMH4034 Optimum培养基中(总细胞数为5000)(n＝3)，培养5-7天并针对总集落形成单位(CFU)的存在评分。CD123特异性CAR-T细胞用作阳性对照。抗BCMACAR-T和未转导的T细胞用作阴性对照。数据代表培养皿中集落的平均值±SEM，每个样品测三次。
结果表明，无论是γδT细胞还是αβT细胞，TCR+仅包含共刺激域的抗CD33 CAR(无CD3ζ信号)显示最高数目的集落计数，这与仅抗CD33CAR(无CD3ζ信号)和未经修饰T细胞的相似，图7。另一方面，用TCR+抗CD33 CAR(具有CD3ζ信号)和抗CD33 CAR(具有CD3ζ信号)发现的集落数明显更少。这些发现表明，TCR+仅包含共刺激域的CAR(无CD3ζ信号)细胞可以安全地用作针对癌症(如AML)的疗法，而无与HSC靶向相关的潜在毒性。
多种抗原结合结构域序列适用于构建本文披露的载体构建体和系统，参见例如，WO 2017/025038，将其以全文并入本文。非限制性示例性序列可以与如下表2至表5中所示的序列具有约60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或100％同一性：
表2抗BCMA VHH的序列
Figure BDA0003308759980000781
表3抗CD19 VHH的序列
Figure BDA0003308759980000782
Figure BDA0003308759980000791
表4抗CD33 VHH的序列
Figure BDA0003308759980000792
Figure BDA0003308759980000801
表5抗CLL-1VHH的序列
Figure BDA0003308759980000802
尽管本文示出并描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，多种变型、改变和替换将是本领域技术人员容易想到的。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围和由此涵盖在这些权利要求及其等效物范围内的方法和结构。

Claims (86)

1.一种用于诱导免疫细胞活性的系统，该系统包含：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含表现出与第一表位特异性结合的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和缺乏CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；和
(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该复合物包含表现出与第二表位特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域与以下连接：
(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，
(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或
(iii)CD3ζ链。
2.如权利要求1所述的系统，其中该第一抗原结合结构域与该第一表位的结合，和/或该第二抗原结合结构域与该第二表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
3.如权利要求1所述的系统，其中两个或更多个抗原结合结构域与以下任选地串联连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链，(iii)CD3ζ链，并且其中该两个或更多个抗原结合结构域与其各自表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
4.如权利要求2或3所述的系统，其中所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：该免疫细胞的克隆扩增；由该免疫细胞进行的细胞因子释放；该免疫细胞的细胞毒性；该免疫细胞的增殖；该免疫细胞的分化、去分化或转分化；该免疫细胞的运动和/或运输；该免疫细胞的衰竭和/或再活化；和由该免疫细胞进行的其他细胞内分子、代谢物、化学化合物、或其组合的释放。
5.如权利要求1所述的系统，其中该第一表位和该第二表位相同。
6.如权利要求1所述的系统，其中该第一表位和该第二表位不同。
7.如权利要求1所述的系统，其中该第一抗原结合结构域和该第二抗原结合结构域包含相同的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的系统，其中该第一抗原结合结构域和该第二抗原结合结构域包含不同的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的系统，其中该第二抗原结合结构域包含表现出与该第二表位的结合的异源序列。
10.如权利要求1所述的系统，其中所述经修饰的TCR包含第三抗原结合结构域，该第三抗原结合结构域与以下连接：
(i)所述第二抗原结合结构域，
(ii)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的该α链、该β链、该γ链、和该δ链，
(iii)分化簇3(CD3)的该ε链、该δ链、和/或该γ链，或
(iv)该CD3ζ链。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述CAR的所述细胞内信号传导结构域缺乏基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
12.如权利要求1所述的系统，其中所述CAR进一步包含共刺激结构域。
13.如权利要求12所述的系统，其中所述共刺激结构域包含MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体或Toll配体受体的信号传导结构域。
14.如权利要求12所述的系统，其中所述共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF-R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
15.如权利要求1所述的系统，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体、单域抗体、轻链可变结构域(VL)或骆驼科抗体的可变结构域(VHH)。
16.如权利要求1所述的系统，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含受体。
17.如权利要求1所述的系统，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含针对受体的配体。
18.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和所述第二表位存在于不同的抗原上。
19.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和所述第二表位存在于共同的抗原上。
20.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于一种或多种细胞表面抗原上。
21.如权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种细胞表面抗原是肿瘤相关抗原、酪氨酸激酶受体、丝氨酸激酶受体和G蛋白偶联受体。
22.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于通用抗原上。
23.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于新生抗原上。
24.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位是新生表位。
25.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于肿瘤相关抗原上。
26.如权利要求25所述的系统，其中该肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、亲脂素、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、BCMA、b-连环素、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CA-125、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、CLL-1、CTAG1B、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FAP、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、FR-α、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、GPC3、GPC-2、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、L1-CAM、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活蛋白、存活蛋白-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。
27.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于免疫检查点受体或免疫检查点受体配体上。
28.如权利要求27所述的系统，其中所述免疫检查点受体或免疫检查点受体配体是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、BLTA、CD47或CD40。
29.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于细胞因子或细胞因子受体上。
30.如权利要求29所述的系统，其中所述细胞因子或细胞因子受体是CCR2b、CXCR2(CXCL1受体)、CCR4(CCL17受体)、Gro-a、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、乙酰肝素酶、CD137L、LEM、Bcl-2、CCL17、CCL19或CCL2。
31.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原上。
32.如权利要求31所述的系统，其中该MHC是HLA 1类。
33.如权利要求31所述的系统，其中该MHC是HLA 2类。
34.一种分离的宿主细胞，该宿主细胞表达如权利要求1至33中任一项所述的系统。
35.如权利要求34所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是免疫细胞。
36.如权利要求34所述的宿主细胞，其中该免疫细胞是淋巴细胞。
37.如权利要求36所述的宿主细胞，其中该淋巴细胞是T细胞。
38.如权利要求37所述的宿主细胞，其中该T细胞是CD8+T细胞。
39.如权利要求37所述的宿主细胞，其中该T细胞是CD4+T细胞。
40.如权利要求36所述的宿主细胞，其中该淋巴细胞是γδT细胞。
41.如权利要求40所述的宿主细胞，其中该γδT细胞是Vγ9δ2T细胞。
42.如权利要求40所述的宿主细胞，其中该γδT细胞是Vδ1T细胞。
43.如权利要求36所述的宿主细胞，其中该淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
44.如权利要求34至43中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞表现出与同时存在于靶细胞中的两种抗原的特异性结合。
45.一种抗原特异性免疫细胞，该免疫细胞包含如权利要求1所述的系统。
46.如权利要求45所述的免疫细胞，其中与该CAR连接的所述抗原结合结构域主要介导该免疫细胞与靶细胞之间的相互作用，并且当该免疫细胞与该靶细胞之间发生相互作用时，与该TCR复合物连接的该抗原结合结构域主要介导免疫细胞活性。
47.如权利要求46所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：该免疫细胞的克隆扩增；由该免疫细胞进行的细胞因子释放；该免疫细胞的细胞毒性；该免疫细胞的增殖；该免疫细胞的分化、去分化或转分化；该免疫细胞的运动和/或运输；该免疫细胞的衰竭和/或再活化；和由该免疫细胞进行的其他细胞内分子、代谢物、化学化合物、或其组合的释放。
48.如权利要求45至47中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
49.如权利要求48所述的免疫细胞，其中所述淋巴细胞是T细胞。
50.如权利要求49所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
51.如权利要求48所述的宿主细胞，其中该淋巴细胞是γδT细胞。
52.如权利要求51所述的宿主细胞，其中该γδT细胞是Vγ9δ2T细胞。
53.如权利要求51所述的宿主细胞，其中该γδT细胞是Vδ1T细胞。
54.如权利要求46所述的免疫细胞，其中该经修饰的TCR复合物包含含有异源序列的两个或更多个抗原结合结构域，该两个或更多个抗原结合结构域与以下任选地串联连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链、和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链、和/或γ链，(iii)CD3ζ链。
55.如权利要求48所述的免疫细胞，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
56.一种免疫细胞群，单个免疫细胞表达如权利要求1至33中任一项所述的系统。
57.如权利要求56所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞群包含至多约1011个细胞。
58.如权利要求56所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞包含淋巴细胞。
59.如权利要求58所述的免疫细胞群，其中所述淋巴细胞是T细胞。
60.如权利要求59所述的免疫细胞群，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
61.如权利要求59所述的免疫细胞群，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
62.如权利要求58所述的免疫细胞群，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
63.如权利要求58所述的免疫细胞群，其中所述淋巴细胞是γδT细胞。
64.如权利要求63所述的免疫细胞群，其中所述γδT细胞是Vγ9δ2T细胞。
65.如权利要求63所述的免疫细胞群，其中所述γδT细胞是Vδ1T细胞。
66.一种诱导免疫细胞活性的方法，该方法包括：
(a)在免疫细胞中表达如权利要求1所述的系统；以及
(b)在诱导该免疫细胞和/或靶细胞的所述活性的条件下使该靶细胞与该免疫细胞接触。
67.如权利要求66所述的方法，其中该第一抗原结合结构域与该第一表位的结合和/或该第二抗原结合结构域与该第二表位的结合激活该免疫细胞的细胞毒性。
68.如权利要求66所述的方法，其中两个或更多个抗原结合结构域包含异源序列，该两个或更多个抗原结合结构域与以下任选地串联连接：(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，(iii)CD3ζ链。
69.如权利要求66所述的方法，其中该靶细胞是癌细胞。
70.如权利要求66所述的方法，其中该靶细胞是造血细胞。
71.如权利要求66所述的方法，其中该靶细胞是实体瘤细胞。
72.如权利要求66所述的方法，其中该靶细胞是在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、膈膜、软骨、韧带和肌腱中的一种或多种中鉴定的细胞。
73.如权利要求66至72中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
74.如权利要求73所述的方法，其中该淋巴细胞是T细胞。
75.如权利要求74所述的方法，其中该T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
76.如权利要求73所述的宿主细胞，其中该淋巴细胞是γδT细胞。
77.如权利要求76所述的宿主细胞，其中该γδT细胞是Vγ9δ2T细胞或Vδ1T细胞。
78.如权利要求68所述的方法，其中当所述系统在受试者的免疫细胞中表达时，同该第一抗原结合结构域仅与该第一表位的结合相比，该两个或更多个抗原结合结构域与其各自表位的结合激活表达该系统的免疫细胞的细胞毒性并且增加所述细胞毒性的持久性。
79.如权利要求73所述的方法，其中该淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
80.一种组合物，该组合物包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域、和缺乏CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域；和
(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该复合物包含表现出与第二表位特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域与以下连接：
(i)选自以下的至少一种TCR链：T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，
(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或
(iii)CD3ζ链。
81.如权利要求80所述的组合物，其中该第二抗原结合结构域包含表现出与该第二表位的结合的异源序列。
82.如权利要求80所述的组合物，其中该一种或多种多核苷酸包含与其可操作地连接的启动子。
83.一种产生经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括：
通过在所述免疫细胞中表达如权利要求80至82中任一项所述的组合物来遗传修饰该免疫细胞，从而产生所述经修饰的免疫细胞。
84.一种治疗受试者的癌症的方法，所述受试者包含表达一种或多种抗原的靶细胞，该方法包括：
(a)向该受试者施用抗原特异性免疫细胞，该免疫细胞包含如权利要求1-33中任一项所述的系统，其中所表达的一种或多种抗原被该第一和/或第二抗原结合结构域识别，以及
(b)在诱导该免疫细胞针对该靶细胞的免疫细胞活性的条件下，经由该第一和/或第二抗原结合结构域来使该靶细胞与该抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导该癌症的该靶细胞死亡。
85.如权利要求84所述的方法，该方法进一步包括遗传修饰免疫细胞以产生所述抗原特异性免疫细胞。
86.如权利要求84或85所述的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头颈癌、肾癌、白血病、急性髓系白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、睾丸癌、气管癌和外阴癌。
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