JP2024500985A - 双方向シグナル伝達活性を有するキメラ膜貫通タンパク質 - Google Patents

双方向シグナル伝達活性を有するキメラ膜貫通タンパク質 Download PDF

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Abstract

本明細書では、改善された免疫治療薬をコードするポリヌクレオチド及びベクター、ポリヌクレオチド及び／又はベクターによってコードされるポリペプチド、ポリペプチドを発現する細胞、並びにポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド及び／又は細胞を含む医薬組成物が開示される。

Description

操作された細胞は、研究用途及び治療用途の両方に大きな可能性を有する。しかしながら、新しく、より進歩した操作された細胞を作製するための努力が高まっているにもかかわらず、操作された細胞の産生の効率及び治療的使用の有効性を制限する多くの課題が残っている。
一態様では、ヘテロ二量体受容体の各モノマーをコードするポリヌクレオチドが提供され、前記ポリヌクレオチドは、前記モノマーの各々をコードする核酸の間に挿入された前記モノマー以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含み、前記核酸は、同じプロモーター配列に作動可能に連結されている。
一実施形態では、プロモーター配列は、ＥＦ１α、ＭＳＣＶ、ＥＦ１α－ＨＴＬＶ－１ハイブリッドプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ又はＭＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ又はＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＭＨＣクラスＩＩ、凝固第ＩＸ因子、インスリンプロモーター、ＰＤＸ１プロモーター、ＣＤ１１、ＣＤ４、ＣＤ２、ｇｐ４７プロモーター、ＰＧＫ、β－グロビン、ＵｂＣ及びＭＮＤの群から選択される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、それらの共発現を促進する核酸の各々の間に挿入されたヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、核酸の同時発現を促進するヌクレオチド配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードするか、又はＩＲＥＳ配列である。
一実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、又はＦ２Ａペプチドから選択される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、トリシストロン性又はテトラシストロン性である。
一実施形態では、ヘテロ二量体受容体は外因性抗原認識受容体である。
一実施形態では、外因性抗原認識受容体は、Ｂ細胞受容体重鎖及び軽鎖ヘテロダイマー、Ｔｏｌｌ様受容体１及び２ヘテロダイマー、食作用性受容体Ｍａｃ－１、ＣＤ９４ ＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅ受容体、Ｔ細胞受容体、αβＴ細胞受容体、γδＴ細胞受容体、並びにその機能性断片から選択される。
一実施形態では、外因性抗原認識受容体は、αβＴ細胞受容体、γδＴ細胞受容体、又はその機能性断片である。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤを含み、ここで：
（Ａ）は（ｉ）－（ｉｉ）－（ｉｉｉ）で表される核酸であり、
（ｉ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｉｉ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖若しくはβ鎖以外のポリペプチド又はその機能性断片をコードする少なくとも１つの核酸であり；及び
（ｉｉｉ）は、αβＴ細胞受容体のβ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｉｉ）は、（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に挿入され、
（Ｂ）は（ｉｖ）－（ｖ）－（ｖｉ）で表される核酸であり、
（ｉｖ）は、αβＴ細胞受容体のβ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖若しくはβ鎖以外のポリペプチド又はその機能性断片をコードする少なくとも１つの核酸であり；及び
（ｖｉ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖ）は、（ｉｖ）と（ｖｉ）との間に挿入され、
（Ｃ）は（ｖｉｉ）－（ｖｉｉｉ）－（ｉｘ）で表される核酸であり、
（ｖｉｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖｉｉｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖若しくはδ鎖以外のポリペプチド又はその機能性断片をコードする少なくとも１つの核酸であり；及び
（ｉｘ）は、γδＴ細胞受容体のδ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖｉｉｉ）は、（ｖｉ）と（ｉｘ）との間に挿入され、
（Ｄ）は（ｘ）－（ｘｉ）－（ｘｉｉ）で表される核酸であり、
（ｘ）は、γδＴ細胞受容体のδ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｘｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖及びδ鎖以外のポリペプチド又はその機能性断片をコードする少なくとも１つの核酸であり、
（ｘｉｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｘｉ）は、（ｘ）と（ｘｉｉ）との間に挿入される。
一実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤは、
－（ｉ）及び（ｖｉ）は、配列番号１９９、２１０、２１４、２１６、２１８及び２２０から選択される、好ましくは配列番号２１０、２１６及び２２０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
－（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、配列番号１９８、２１１、２１５、２１７、２１９及び２２１から選択される、好ましくは配列番号２１１、２１７及び２２１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
－（ｖｉｉ）及び（ｘｉｉ）は、配列番号８５、８６、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、１０１、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３０及び１３２から選択される、好ましくは配列番号８５、８６、８７、９４、９５、９６、１０１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２７及び１３０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
－（ｉｘ）及び（ｘ）は、配列番号８２、８３、８４、８８、９０、９２、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３１及び１３３から選択される、好ましくは配列番号８２、８３、８４、９７、９８、９９、１００、１０２、１１４、１１６、１１８、１２６及び１３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であるようになっている。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードする受容体モノマーのそれぞれをコードする核酸の間に挿入された核酸を含み、前記タンパク質は：
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの前記細胞内ドメインを介して伝達される。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメイン並びに４１ＢＢの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むか又はそれらからなるタンパク質ではない。
一実施形態では、少なくとも２つの細胞内シグナルは誘導性である。
一実施形態では、少なくとも２つの細胞内シグナルは、１つの単一細胞で生成される。
一実施形態において、相互作用パートナーは：
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインと相互作用することができる細胞外ドメイン、
－膜貫通ドメイン、及び
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインへの相互作用パートナーの細胞外ドメインの結合後に第２のシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む。
一実施形態では、少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルは、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与する。生物学的パラメータ及び／又は機能は、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択され得る。一実施形態では、細胞は免疫細胞、好ましくはＴ又はＮＫ細胞である。
一実施形態において、前記キメラタンパク質は：
ａ．細胞外リガンドドメインはＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られるか、又は
ｂ．細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる。
一実施形態では、
－細胞外リガンドドメインは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー、サイトカイン、Ｃ型レクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、又は抗体若しくはその抗原結合性断片由来のアミノ酸配列を含み；及び
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、サイトカイン受容体又はＣ型レクチン受容体由来のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
－前記細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、又はＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０又はＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
－前記細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ又はＣＤ７０由来のアミノ酸配列を含み、
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、
（ａ）細胞外リガンドドメインは４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｂ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｃ）細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＮｐＫ８０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｄ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｅ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｆ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｇ）細胞外リガンドドメインは、ＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０Ｌに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、又は
（ｈ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られる。
一実施形態では、
（ａ）細胞外リガンドドメインは４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｂ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｃ）細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＮｐＫ８０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｄ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｅ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｆ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｇ）細胞外リガンドドメインは、ＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０Ｌに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｈ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｉ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ７０由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＣＤ７０に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、又は
（ｊ）細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列及びＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０及びＩ型膜貫通タンパク質ＩＬ２ＲＢに由来するか若しくはそれから得られる。
一実施形態では、ａ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号４５、４６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は６５と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ａ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号４５、４６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、１７８又は１７９と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｂ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号５２、５３、又は７３と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｃ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号４７又は４８と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｄ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号７８と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｅ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号７６と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｆ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号７７と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｇ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号４９、５０又は５１と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｈ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号７１又は７２と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｉ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号１８２又は１８３と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｊ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、配列番号１７９と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＴＡＭ、又はＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメインを含まない。
別の態様では、本明細書で定義されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
別の態様では、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
別の態様では、本明細書で定義されるポリヌクレオチド又はベクターによってコードされるポリペプチドが提供される。
一実施形態において、本明細書で定義されるポリヌクレオチド又は本明細書で先に定義されたベクターを含む細胞が提供され、好ましくは前記細胞は本明細書で定義されるキメラタンパク質を発現し、より好ましくは前記細胞は相互作用パートナーも発現する。
一実施形態では、本明細書で先に定義された少なくとも１つの細胞を含む細胞集団が提供される。
一実施形態では、細胞又は細胞集団は免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である。
一実施形態では、細胞集団は、外因性抗原認識受容体を発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む。
一実施形態では、外因性抗原認識受容体を発現する細胞集団はまた、本明細書で先に定義されたキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現する。
一実施形態では、外因性抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、アルファ－ベータＴ細胞受容体、又はガンマ－デルタＴ細胞受容体である。
一実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞、好ましくはガンマ－デルタＴ細胞受容体を発現するアルファ－ベータＴ細胞の集団である。
一実施形態では、本明細書で定義される細胞集団は、本明細書で定義されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現する細胞を、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に曝露すると、前記細胞集団の増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅が、キメラタンパク質を発現しない細胞の対応する集団と比較して少なくとも１０％増加するようなものである。
一態様では、本明細書で先に定義されたキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は細胞集団は、少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルが、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能の改善並びに／或いはそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／又は機能の改善に寄与し、前記生物学的パラメータが疾患又は状態の治療に寄与する、疾患又は状態を治療するための使用のためのものである。
一態様では、本明細書で先に定義されたキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は細胞集団は、使用のためのものであり：
－生物学的パラメータは増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／若しくは腫瘍細胞死滅から選択され、
－細胞は免疫細胞であり、並びに／又は
－疾患は癌である。
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本特許出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許又は特許出願の写しは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
図１は、ＭＩＤＩＳ機能の１つの例示的な例を提供する。ＭＩＤＩＳタンパク質は、操作された細胞によって発現される。細胞外リガンドがその相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「インサイドアウト」シグナル（シグナル１）と、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「アウトサイドイン」シグナル（シグナル２）とを含む多方向シグナル伝達が誘導される。第１のシグナル伝達経路及び第２のシグナル伝達経路は、標的生物学的結果を一緒に誘導することができる。 図２は、本開示のガンマ－デルタＴＣＲ及びＭＩＤＩＳタンパク質を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右側の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示し、水平線は膜／膜貫通ドメインを表す。 図３は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質又は対照タンパク質を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９細胞と共インキュベートした。ＴＥＧの連続刺激を、３回の刺激（ドナー１からのＴＥＧ、上部パネルから）又は５回の刺激（ドナー２からのＴＥＧ、下パネル）の間継続した。＊Ｐ＜０．０５ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。 図４は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質又は対照タンパク質を共発現するＴＥＧの細胞増殖を示す。ＴＥＧを、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＨＴ－２９細胞と共インキュベートした。エフェクター細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で染色し、色素の希釈を増殖のマーカーとして使用した。＊Ｐ＜０．０５ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。 図５は、ＨＴ－２９細胞による３回の共培養刺激（ドナー１）又は５回の共培養刺激（ドナー２）後の、形質導入されたガンマデルタＴＣＲを発現する細胞の数を示す。本開示のＭＩＤＩＳタンパク質又は対照タンパク質を共発現するＴＥＧを、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＨＴ－２９細胞と共インキュベートし、ＴＥＧの数をフローサイトメトリーによって決定した。＊Ｐ＜０．０５ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。 図６は、ＨＴ－２９細胞による３回の刺激（ドナー１）又は５回の刺激（ドナー２）後の疲弊マーカーＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３を共発現するＴＥＧの割合を示す。本開示のＭＩＤＩＳタンパク質又は対照タンパク質を共発現するＴＥＧを、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＨＴ－２９細胞と共インキュベートし、疲弊マーカーを共発現するＴＥＧの数をフローサイトメトリーによって決定した。＊Ｐ＜０．０５ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。 図７は、ＨＴ－２９、ＲＰＭＩ－８２２６及びＭＺ１８５１ＲＣ標的細胞と共インキュベートされた、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧ又は第３の代表的なドナー由来の対照タンパク質ＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧの連続刺激を、３回の刺激（ＨＴ－２９）、４回の刺激（ＲＰＭＩ－８２２６）又は５回の刺激（ＭＺ１８５１ＲＣ）の間継続した。左パネルは、最初の刺激からの細胞傷害性データを示し、右パネルは、ＰＡＭ処置による最後の刺激からの細胞傷害性データを示す。 図８Ａは、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９腫瘍細胞と共インキュベートした。ＴＥＧを３日後に新鮮な標的細胞を含むプレートに移し、残存する標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図８Ｂは、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧによるＩＦＮγ産生を示す。ＴＥＧを標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１：１で共インキュベートした。ＴＥＧを３日後に新鮮な標的細胞を含むプレートに移し、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。＊Ｐ＜０．０５ ＣＳＤ（４１ＢＢＬ－ＯＸ４０）。 図８Ｃは、γ４δ５ＴＣＲ又はγ４δ５ＴＣＲを単独で有する４１ＢＢＬ又は４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９腫瘍細胞と共インキュベートした。ＴＥＧを７日後に新鮮な標的細胞を含むプレートに移した。＊Ｐ＜０．０５（４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ「競合物」）。残存する標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図９Ａは、ＨＴ－２９腫瘍を有するマウスに１．０×１０＾６のＴＥＧを投与した後の経時的な平均放射輝度を示す。０．５×１０＾６個のＨＴ－２９ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞を－１４日目にＮＳＧマウスの側腹部に注射した（ｎ＝６／群）。０日目に、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を含む又は含まない、本開示のγδＴＣＲを発現するＴＥＧを全身投与した。生物発光（ＢＬＩ）及び腫瘍体積を毎週測定した。 図９Ｂは、ＨＴ－２９腫瘍を有するマウスに１．０×１０＾６のＴＥＧを投与した後の経時的な腫瘍体積を示す。０．５×１０＾６個のＨＴ－２９ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞を－１４日目にＮＳＧマウスの側腹部に注射した（ｎ＝６／群）。０日目に、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を含む又は含まない、本開示のγδＴＣＲを発現するＴＥＧを全身投与した。生物発光（ＢＬＩ）及び腫瘍体積を毎週測定した。 図１０は、ＨＴ－２９腫瘍を有するマウスに１．０×１０＾６のＴＥＧを投与した後の経時的な生存率を示す。０．５×１０＾６個のＨＴ－２９ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞を－１４日目にＮＳＧマウスの側腹部に注射した（ｎ＝６／群）。０日目に、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を含む又は含まない、本開示のγδＴＣＲを発現するＴＥＧを全身投与した。 図１１Ａは、本開示のγδ ＴＣＲ及びＭＩＤＩＳタンパク質を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。 図１１Ｂは、ＯＸ４０Ｌ－４１ＢＢ ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所的に発現するＭＺ１８５１ＲＣ標的細胞と１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共インキュベートし、新鮮な標的細胞への移入及び７日後のパミドロネート（１０μｍ）の添加（新たな刺激）、並びに２回目の刺激の７日後のルシフェラーゼアッセイによる残存標的細胞生存率の測定を行った。 図１２Ａは、本開示のγδ ＴＣＲ及びＭＩＤＩＳタンパク質を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。 図１２Ｂは、ＣＤ８６－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所的に発現するＨＴ－２９標的細胞と１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共インキュベートし、新鮮な標的細胞への移入及び７日後のパミドロネート（１０μｍ）の添加（新たな刺激）、並びに２回目の刺激の７日後のルシフェラーゼアッセイによる残存標的細胞生存率の測定を行った＊Ｐ＜０．０５（ＣＤ８６Ｐ２７６－ＯＸ４０）。 本開示のＭＩＤＩＳベクターによる形質導入の１２日後のガンマ－デルタＴＣＲ及び４１ＢＢＬの表面発現を示す。 本開示のＭＩＤＩＳベクターによる形質導入の１２日後のガンマ－デルタＴＣＲ及び４１ＢＢＬの表面発現を示す。 図１５は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質及びさらなる外因性抗原認識受容体を細胞に導入するために使用される構築物の非限定的な例の概略図を提供する。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。 図１６は、ＭＩＤＩＳ（４１ＢＢＬ－ＯＸ４０）によって駆動される生理学を示す。左の最初の２つのパネル（γ－ｅＧＦＰ－δ）は、標的刺激前後のＭＩＤＩＳなしのフローサイトメトリープロットを示す。中央のパネルは、４－１ＢＢリガンドの細胞質部分が切断された４－１ＢＢリガンドを発現する構築物（γ－４１ＢＢＬｍｉｎｃｙｔｏ－δ）を含む操作された細胞のフローサイトメトリープロットを示す。右のパネルは、ＭＩＤＩＳ（例えば、ＯＸ－４０と相互作用する無傷の細胞質部分を有する４１ＢＢＬ）を含む操作された細胞のフローサイトメトリープロットを示す。右パネルによって示されるように、ＭＩＤＩＳを含む操作された細胞は、増強されたエフェクター機能及び生物学的シグナルを示した。 図１７は、シグナル伝達を誘導するためにさらなる活性化が必要とされる場合のＭＩＤＩＳ機能の例示的な一例を提供する。ＭＩＤＩＳタンパク質は、操作された免疫細胞によって発現される。細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「インサイドアウト」シグナル（シグナル１）が誘導され、細胞外リガンドドメインの相互作用パートナーへの結合とともにＴＣＲが活性化すると、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「アウトサイドイン」シグナル（シグナル２）が誘導される。 図１８は、４１ＢＢＬ１３Ｗ－ＯＸ４０ｒｅｖ ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、１：１のＥ：Ｔ比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９腫瘍細胞と共インキュベートした。ＴＥＧを７日後に新鮮な標的細胞を含むプレートに移し、残存する標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定し、相対発光単位で示した。＊Ｐ＜０．０５ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。＊＊Ｐ＜０．０１ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。 図１９Ａは、対照タンパク質としてＣＤ８－Ｑ８タグをコードする配列を含む構築物を用いて、本開示のγδＴＣＲ及びＣＤ８６ ＭＩＤＩＳタンパク質を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。 図１９Ｂは、対照タンパク質としてｅＧＦＰをコードする配列を含む構築物を用いて、本開示のγδＴＣＲ及びＲＡＮＫ ＭＩＤＩＳタンパク質を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。 図２０Ａは、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質及びさらなる外因性抗原認識受容体の発現を細胞に導入するために使用される構築物の非限定的な例の概略図を提供する。Ｔ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。さらに、これは、フローサイトメトリーによって測定されたアルファ－ベータＴ細胞による外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳ又は対照タンパク質の発現を示す（下のパネル）。アルファ－ベータＴ細胞に示された構築物を形質導入し、１２日間の産生後に抗Ｆａｂ抗体で染色して表面発現を評価し、それと共に４１ＢＢＬ（ｙ軸）又はＣＤ１９．ＢＢ．Ｚ（ｘ軸）を含有する両方のベクターを含めた（以下のパネルに示す）。陽性発現％を象限に示す。 図２０Ｂは、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳ又は対照タンパク質を伴う又は伴わない、抗ＣＤ１９ＢＢｚ ＣＡＲ（１９ＢＢｚ）を共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害効果を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所的に発現するＣＤ１９（ＮＡＬＭ６）陽性標的細胞と１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共インキュベートし、３日ごとに新鮮な標的細胞に連続移入し、１回目（左）又は５回目（右）の刺激後にルシフェラーゼアッセイによって残存標的細胞生存率を測定し、相対発光単位（ＲＬＵ）で示した。＊Ｐ＜０．０５ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。＊＊Ｐ＜０．０１ ４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ｖｓ 示される「競合物」。 図２１Ａは、本開示のγδＴＣＲ及びＭＩＤＩＳタンパク質の発現を導入するために使用される構築物の非限定的な例の概略図を提供する。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。 図２１Ｂは、ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の表面発現を示す。ＭＩＤＩＳ又は対照タンパク質を含む又は含まないＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＣＤ７０（ｘ軸）及びγδＴＣＲ（ｙ軸）について染色した。発現をフローサイトメトリーによって決定した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に、固定ＭＯＩの本開示に含まれるベクターを形質導入した。形質導入の１週間後に、ＣＤ７０の表面発現及びγδＴＣＲの発現を実施例１に概説されるように評価し；パーセンテージは陽性ＣＤ７０発現を示す。 図２２Ａは、γδＴＣＲ及びＭＩＤＩＳの発現を細胞に導入するために使用される構築物の非限定的な例の概略図を提供し、複数のシグナル伝達ドメインを有するＭＩＤＩＳ、及びＭＩＤＩＳを含まない対照が含まれる。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。 図２２Ｂは、ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するＴＥＧの表面発現を示す。ＭＩＤＩＳ又は対照タンパク質を含む、又は含まないＴＥＧを、４１ＢＢＬ及びγδＴＣＲについて染色した。発現をフローサイトメトリーによって決定した。実施例１に概説される１２日間の産生後、アルファ－ベータＴ細胞を４１ＢＢＬ（ｘ軸）及びγδＴＣＲ（ｙ軸）について染色して表面発現を評価した。陽性発現％を、図示のパネルの象限に示す（パネルタイトルは、図２２Ａの構築物に対応する）。 図２３は、ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現するγδＴ細胞の増殖に対する効果を示す。ＭＩＤＩＳ又は対照タンパク質を含む又は含まないγδＴ細胞を、ＴｒａｎｓＡｃｔ（左）又は抗ＣＤ２８抗体を含むプレート結合抗γδＴＣＲ（右）と共に２２日間増殖させた。０日目及び回収日に細胞を計数することによって増殖を測定した。 図２４Ａは、ガンマ鎖コード核酸及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置でガンマ－デルタＴＣＲ及び本開示のさらなるタンパク質の発現を導入するために実施例１４で使用されるトリシストロン性構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。 図２４Ｂは、フローサイトメトリーによって測定された、本開示のマルチシストロン性ベクターで形質導入されたαβＴ細胞のガンマ－デルタＴＣＲ及び内因性アルファ－ベータＴＣＲの表面発現を示す。 図２５Ａは、ドナーごとに補正した全ての生存Ｔ細胞のパーセントＴＥＧによる定義されたガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）の表面発現を示す。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図２５Ｂは、本開示のマルチシストロン性ベクターによる形質導入後の産生８日目の所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）表面のドナー補正メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図２５Ｃは、全ての生存Ｔ細胞のドナー補正％γδＴＣＲ＋αβＴＣＲ－を示す。アルファベータＴ細胞に、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を形質導入し、本開示のマルチシストロン性ベクターによる形質導入後、産生８日目にγδＴＣＲ及びαβＴＣＲについて染色した。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ対「競合物」）。 図２６Ａは、ドナーごとに補正した全ての生存Ｔ細胞のパーセントＴＥＧによる定義されたガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号１１１及び１１２）の表面発現を示す。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図２６Ｂは、本開示のマルチシストロン性ベクターによる形質導入後の産生８日目の所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号１１１及び１１２）表面のドナー補正メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図２７Ａは、ガンマ鎖コード核酸及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置でガンマ－デルタＴＣＲ及び本開示のさらなるタンパク質４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳ（パネル（ｉ））又はＣＤ８－Ｑ８（パネル（ｉｉ））の発現を導入するために実施例１４で使用されるトリシストロン性構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。 図２７Ｂは、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０コード核酸を含む本開示のベクターによる形質導入後の産生８日目の所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）表面のドナー補正メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図２７Ｃは、全ての生存Ｔ細胞のドナー補正％γδＴＣＲ＋αβＴＣＲ－を示す。アルファベータＴ細胞に、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を形質導入し、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０コード核酸を含む本開示のベクターによる形質導入後、産生８日目にγδＴＣＲ及びαβＴＣＲについて染色した。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ対「競合物」）。 図２７Ｄは、Ｑ８コード核酸を含む本開示のベクターによる形質導入後の産生８日目の所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）表面のドナー補正メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図２７Ｅは、全ての生存Ｔ細胞のドナー補正％γδＴＣＲ＋αβＴＣＲ－を示す。アルファベータＴ細胞に、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を形質導入し、ＣＤ８－Ｑ８コード核酸を含む本開示のベクターによる形質導入後、産生８日目にγδＴＣＲ及びαβＴＣＲについて染色した。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ対「競合物」）。 図２８Ａは、ガンマ鎖コード核酸及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置でガンマ－デルタＴＣＲ及び本開示のさらなるタンパク質４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳ及びｅＧＦＰの発現を導入するために実施例１４で使用されるテトラシストロン性構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。 図２８Ｂは、ドナーごとに補正した全ての生存Ｔ細胞のパーセントＴＥＧによる、テトラシストロン性構築物由来の所定のガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）の表面発現を示す。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図２８Ｃは、全ての生存Ｔ細胞のドナー補正％γδＴＣＲ＋αβＴＣＲ－を示す。ＴＥＧに、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を形質導入し、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０コード核酸を含む本開示のテトラシストロン性ベクターによる形質導入後、産生８日目にγδＴＣＲ及びαβＴＣＲについて染色した。＊Ｐ＜０．０５（γ－４１ＢＢＬ－ＯＸ４０－ｅＧＦＰ－δ対「競合物」）。 図２９Ａは、所定のガンマ－デルタＴＣＲ及びさらなるタンパク質の発現を導入するために実施例１５で使用されるトリシストロン性構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。 図２９Ｂは、形質導入されていないＴ細胞（ＵＮＴＲ）と比較した、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現する標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１：１（ドナー２）で、及びパミドロネート（１０μｍ）と共に３日間共インキュベートした。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図２９Ｃは、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を発現するＴＥＧによるＩＦＮγ産生を示す。ＴＥＧを標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１：１（ドナー２）及びパミドロネート（１０μｍ）で３日間共インキュベートした。ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。 図３０Ａは、形質導入されていないＴ細胞（ＵＮＴＲ）と比較した、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現する標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１：１（ドナー３）と、パミドロネート（１０μｍ）を添加して３日間共インキュベートした。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図３０Ｂは、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を発現するＴＥＧによるＩＦＮγ産生を示す。ＴＥＧを標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１：１（ドナー３）及びパミドロネート（１０μｍ）で３日間共インキュベートした。ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。＊Ｐ＜０．０５（δ－ｅＧＦＰ－γ ｖｓ「競合物」）。 図３０Ｃは、形質導入されていないＴ細胞（ＵＮＴＲ）と比較した、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号１１１及び１１２）を発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現する標的ＲＫＯ腫瘍細胞とＥ：Ｔ比０．１１：１（ドナー１）で３日間共インキュベートした。＊Ｐ＜０．０５（γ－ｅＧＦＰ－δ ｖｓ「競合物」）。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図３１Ａは、形質導入されていないＴ細胞（ＵＮＴＲ）と比較した、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）及び４１ＢＢＬ－ＯＸ４０を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現する標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比０．３：１（ドナー１）で、及びパミドロネート（１０μｍ）と共に３日間共インキュベートした。＊Ｐ＜０．０５（γ－４１ＢＢＬＯＸ４０－δ ｖｓ「競合物」）。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図３１Ｂは、形質導入されていないＴ細胞（ＵＮＴＲ）と比較した、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）及びＣＤ８－Ｑ８を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現する標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比０．３：１（ドナー２）で、及びパミドロネート（１０μｍ）と共に３日間共インキュベートした。＊Ｐ＜０．０５（γ－４１ＢＢＬＯＸ４０－δ ｖｓ「競合物」）。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図３２Ａは、所定のガンマ－デルタＴＣＲ及びさらなるタンパク質４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳ又はｅＧＦＰの発現を導入するために実施例１６で使用されるトリシストロン性構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。 図３２Ｂは、形質導入されていないＴ細胞（ＵＮＴＲ）と比較した、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）及び４１ＢＢＬ－ＯＸ４０を共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現する標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比０．３：１（ドナー２）で、及びパミドロネート（１０μｍ）と共に３日間共インキュベートした。＊＊Ｐ＜０．０１（γ－４１ＢＢＬＯＸ４０－δ ｖｓ「δ－４１ＢＢＬＯＸ４０－γ」）＊Ｐ＜０．０５（δ－４１ＢＢＬＯＸ４０－γ ｖｓ「ＵＮＴＲ」）。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図３２Ｃは、形質導入されていないＴ細胞（ＵＮＴＲ）と比較した、構築物中のガンマ及びデルタ鎖コード核酸について様々な位置で、所定のガンマデルタＴＣＲ（配列番号１１１及び１１２）及びｅＧＦＰを共発現するＴＥＧの細胞傷害効果を示す。ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現する標的ＲＫＯ腫瘍細胞とＥ：Ｔ比３：１（ドナー３）で３日間共インキュベートした。＊Ｐ＜０．０５（γ－４１ＢＢＬＯＸ４０－δ ｖｓ「δ－４１ＢＢＬＯＸ４０－γ」）又は（δ－４１ＢＢＬＯＸ４０－γ ｖｓ「ＵＮＴＲ」）。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定した。 図３３Ａは、所定のアルファ－ベータＴＣＲ及びさらなるタンパク質ｅＧＦＰの発現を導入するために実施例１７で使用されるトリシストロン性構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。 図３３Ｂは、細胞によって発現される細胞内αβＴＣＲと比較した、細胞表面に発現される機能性αβＴＣＲの比を示す。Ｊｕｒｋａｔ ７６ Ｔ細胞に、定義されたαβＴＣＲ及びｅＧＦＰを形質導入した。形質導入の３日後、細胞を、表面発現されたαβＴＣＲについて抗ＣＤ３εによって染色し、引き続いてαβＴＣＲを固定及び染色した。＊Ｐ＜０．０５（β－ｅＧＦＰ－α ｖｓ「競合物質」）。 図３３Ｃは、ベータコード核酸及びアルファコード核酸について様々な順序で、所定のアルファ－ベータＴＣＲ及びさらなるタンパク質ｅＧＦＰの発現を導入するために実施例１７で使用されるトリシストロン性構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。 図３３Ｄは、細胞によって発現される細胞内αβＴＣＲと比較した、細胞表面に発現される機能性αβＴＣＲの比を示す。Ｊｕｒｋａｔ ７６Ｔ細胞に、定義されたαβＴＣＲ及びｅＧＦＰを形質導入した。形質導入の３日後、細胞を、表面発現されたαβＴＣＲについて抗ＣＤ３εによって染色し、引き続いてαβＴＣＲを固定及び染色した。＊＊Ｐ＜０．０１（β－ｅＧＦＰ－α ｖｓ「競合物」）。
操作された細胞は、研究用途及び治療用途の両方に大きな可能性を有する。例えば、特定の操作された免疫細胞は、有効な治療法が以前は利用できなかったいくつかの種類の癌の治療におけるランドマーク的な進歩を提供している。しかしながら、新たなより高度な操作された細胞を作製するための努力が高まっているにもかかわらず、この分野における成功を制限する多くの課題が残っている。これらの課題の例には、十分な数の所望の操作された細胞を作成することの困難さ、操作された細胞の増殖能力又は寿命の制限、操作された細胞の適合性の制限、抗原認識時のエフェクター機能の誘導の制限、及び疲弊が含まれる。
本明細書では、操作された細胞の製造及び臨床用途の複数の態様を増強することができる多方向シグナル伝達体（ＭＩＤＩＳ）タンパク質が開示される。ＭＩＤＩＳタンパク質は、相互作用パートナーに結合する細胞外リガンドドメイン、膜貫通ドメイン、及び異種性細胞内シグナル伝達ドメイン（細胞外リガンドドメインとは異なるタンパク質に由来するか、又はそれから得られる）を含む操作された融合タンパク質である。細胞外リガンドがその相互作用パートナーに結合すると、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「アウトサイドイン」シグナルと、相互作用パートナーの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「インサイドアウト」シグナルとを含む多方向シグナル伝達が誘導される。本出願を通して、「ＭＩＤＩＳタンパク質」という表現は、本明細書で後述する「キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質」という表現に置き換え得る。
ＭＩＤＩＳタンパク質の両方向のシグナル伝達経路の組合せを誘導する能力は、広範囲の標的生物学的結果及び機能、例えば、細胞増殖の増強、細胞生存の増強、並びに細胞傷害性及び炎症性メディエータの産生などの免疫エフェクター機能のより大きな規模及び持続性を誘導することが示されている。「標的生物学的結果」又は「生物学的結果」という表現は、「生物学的パラメータ」と置き換えることができる。
図１は、ＭＩＤＩＳ機能の１つの例示的な例を提供する。ＭＩＤＩＳタンパク質は、操作された細胞（細胞１）によって発現される。細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「インサイドアウト」シグナル（シグナル１）と、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「アウトサイドイン」シグナル（シグナル２）とを含む多方向シグナル伝達が誘導される。第１のシグナル伝達経路及び第２のシグナル伝達経路は、標的生物学的結果を一緒に誘導することができる。いくつかの実施形態において、多方向シグナル伝達は、双方向性シグナル伝達、例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される１つのシグナル伝達経路及び相互作用パートナーの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される１つのシグナル伝達経路であるか、又はそれらを含む。いくつかの実施形態において、多方向シグナル伝達は、多方向シグナル伝達、例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される複数のシグナル伝達経路及び／又は本明細書に開示の相互作用パートナーの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される複数のシグナル伝達経路を含む。
多方向シグナル伝達は、本明細書に開示される標的生物学的結果を達成するために、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現する細胞の、又は細胞における生物学的パラメータ及び／又は機能を調節することができる。言い換えれば、「少なくとも２つの細胞内シグナル」は、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータの改善及び／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータの改善に寄与し得る。シグナル伝達経路及び細胞種の組合せに応じて、細胞増殖、細胞生存、免疫エフェクター機能の大きさ、免疫エフェクター機能の持続期間、細胞傷害性応答（例えば、癌細胞に対する）、抗癌応答、細胞分化、細胞脱分化、及び細胞分化を含むがこれらに限定されない様々な生物学的機能及び／又はパラメータを調節することができる。細胞の１つ又は複数の生物学的機能及び／又はパラメータを調節／改善することができる。複数の生物学的機能及び／又はパラメータ、例えば、標的生物学的結果に寄与する誘導又は低減された生物学的機能及び／又はパラメータの任意の組合せを調節することができる。この文脈において、標的生物学的結果は、本明細書で後述する、疾患又は状態の治療、治癒であり得る。例えば、複数の生物学的機能を細胞において誘導することができる、及び／又はある生物学的機能を誘導することができ、他の生物学的機能を低減させることができる。
本明細書に開示される特定のＭＩＤＩＳタンパク質（又はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質）は、Ｉ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列をＩＩ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列と組み合わせる。いくつかの実施形態では、そのようなＭＩＤＩＳタンパク質は、驚くべき予想外の効果を示し、これはＩ型及びＩＩ型膜貫通タンパク質を機能性タンパク質に容易に組み合わせることはできないためである。例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列をＩＩ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列に融合しようとする多くの試みは、例えば、アミノ酸配列の１つのＮ末端又はＣ末端位置の変化、得られたタンパク質が機能的立体配座、三次構造、膜貫通配向、又はその組合せを取ることができないために、機能性タンパク質を得ることができない。
本明細書で提供されるいくつかの例では、細胞外リガンドドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるいくつかの例では、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む（例えば、４１ＢＢＬ由来の細胞外リガンドドメイン、及びＯＸ４０由来の細胞内シグナル伝達ドメイン）。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳの細胞外リガンドドメイン及び／又は異種性細胞内シグナル伝達ドメイン（又はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質）の一部又は全ては、野生型アミノ酸配列（すなわち、レトロタンパク質として発現される）と比較して反転したアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのようなＭＩＤＩＳタンパク質（又はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質）は驚くべき予想外の効果を示すが、これは多くの場合、例えば、機能的な立体配座及び／又は三次構造を取ることができないために、レトロタンパク質が親タンパク質の機能性を保持しないためである。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質（又はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質）は、Ｉ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列をＩＩ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列と組み合わせ、野生型アミノ酸配列と比較して反転した少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。そのようなＭＩＤＩＳタンパク質の機能性は、Ｉ型及びＩＩ型膜貫通タンパク質由来の配列を機能性融合タンパク質に組み合わせる成功の見込みがないこと、及び機能性レトロタンパク質ドメインを得る成功の見込みがないことに基づいて、驚くべき且つ予想外であり得る。
Ｉ．定義
ＭＩＤＩＳタンパク質の「細胞外リガンドドメイン」は、相互作用パートナーに結合することができ、結合すると相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介されるシグナル伝達を誘導する。本出願を通して、「ＭＩＤＩＳタンパク質」という表現は、「キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質」という表現に置き換え得る。細胞外リガンドドメインは、本明細書に開示されるタンパク質、例えば野生型タンパク質、野生型タンパク質配列と比較して１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を有する野生型タンパク質に由来するバリアント、又は本明細書に開示される他のタンパク質に由来する、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。細胞外リガンドドメインは、例えば、細胞表面上に発現されるタンパク質、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー、免疫共受容体リガンド、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、サイトカイン、相互作用パートナーの天然に存在する、若しくは合成ペプチドリガンド、相互作用パートナーに結合する金属依存性加水分解酵素ファミリーメンバー、又は本明細書に開示される抗原結合タンパク質、例えば抗体の抗原結合性断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＤＡＲＰｉｎ、又は本明細書に開示される他の抗原結合性タンパク質に由来するか、又はそれから得られてもよい。細胞外リガンドドメインの非限定的な例としては、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ及びＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列が挙げられる。細胞外リガンドドメインは、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通タンパク質であり得るか、又はそれらに由来し得る。
一実施形態では、細胞外リガンドドメインは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー又はそれに由来する分子であり、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来し、したがってＩＩ型分子である。
一実施形態では、細胞外リガンドドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーであるか、又はそれに由来し、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来し、したがってＩ型分子である。
ＭＩＤＩＳタンパク質の「異種性細胞内シグナル伝達ドメイン」は、細胞外リガンドドメインとは異なるタンパク質に由来するか、又はそれから得られる、ＭＩＤＩＳタンパク質中に存在する細胞内シグナル伝達ドメインを指す。異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介されるシグナル伝達経路は、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると誘導される。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通タンパク質であるタンパク質に由来し得るか、又はそこから得ることができる。ＭＩＤＩＳタンパク質中の異種性細胞内シグナル伝達ドメインの存在は、細胞外リガンドドメインと同じタンパク質由来の細胞内シグナル伝達ドメインの存在を必ずしも排除しないが、異なるタンパク質由来の少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインがＭＩＤＩＳ中に存在することを示す。例えば、いくつかの場合、異種性細胞内シグナル伝達ドメインを全長野生型膜貫通タンパク質に付加することができ、こここで、全長野生型膜貫通タンパク質は、細胞外リガンドドメイン及び（非異種性）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。他の場合では、ＭＩＤＩＳは、細胞外リガンドドメインと同じタンパク質由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に開示されるタンパク質、例えば野生型タンパク質、野生型タンパク質配列と比較して１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を有する野生型タンパク質に由来するバリアント、又は本明細書に開示される他のタンパク質に由来するアミノ酸配列を含み得る。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、膜貫通タンパク質、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、Ｃ型レクチン受容体、シグナル伝達経路に関与する細胞質タンパク質、又は本明細書に開示される任意の他の適切なタンパク質に由来していても、それから得られてもよい。異種性細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫｐ８０、又はＩＬ１８ＲＡＰに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列が挙げられる。
ＭＩＤＩＳタンパク質の「相互作用パートナー」は、細胞の表面に存在し、ＭＩＤＩＳの細胞外リガンドドメインに結合することができる。相互作用パートナーがＭＩＤＩＳの細胞外リガンドドメインに結合すると、相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介されるシグナル伝達が誘導される。したがって、一実施形態において、相互作用パートナーは：
－キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質の細胞外リガンドドメインと相互作用することができる細胞外ドメイン、
－膜貫通ドメイン、及び
－キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質の細胞外リガンドドメインへの相互作用パートナーの細胞外ドメインの結合後に第２のシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む。
「核酸」、「核酸分子」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、調節配列、例えばプロモーターに作動可能に連結された（すなわち、機能的な関係にある）ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含み得る。そのようなポリヌクレオチドは、本明細書では代替的に「核酸構築物」又は「構築物」と呼ばれることがある。
本明細書で使用される場合、調節配列は、細胞内の核酸の発現を駆動又は他の方法で調節することが当業者に知られている任意の遺伝要素を指す。そのような配列としては、限定されないが、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、リプレッサー、サイレンサー、コザック配列、ポリＡ配列等が挙げられる。調節配列は、例えば、誘導性、非誘導性、構成的、細胞周期調節性、代謝調節性等であり得る。調節配列はプロモーターであり得る。適切なプロモーターの非限定的な例としては、ＥＦ１α、ＭＳＣＶ、ＥＦ１α－ＨＴＬＶ－１ハイブリッドプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ又はＭＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ又はＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＭＨＣクラスＩＩ、凝固第ＩＸ因子、インスリンプロモーター、ＰＤＸ１プロモーター、ＣＤ１１、ＣＤ４、ＣＤ２、ｇｐ４７プロモーター、ＰＧＫ、ベータグロビン、ＵｂＣ、ＭＮＤ及びその誘導体（すなわち、バリアント）が挙げられる。これらのプロモーターの例は、Ｐｏｌｅｔｔｉ ａｎｄ Ｍａｖｉｌｉｏ（２０２１），Ｖｉｒｕｓｅｓ １３：８；１５２６，Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １０（１１）：１１６３－１１７５，Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：８；１４５３－１４６４、及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６８３５０５にさらに記載され、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、マルチシストロン性であり得る。「マルチシストロン性」（本明細書では「ポリシストロン性」とも呼ばれる）は、少なくとも２つの異なるポリペプチドが翻訳されるｍＲＮＡをもたらすポリヌクレオチドの転写を指すことができる。これは、例えば、好ましくは同じプロモーターに作動可能に連結された別個のポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸を含むポリヌクレオチドによって達成され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、好ましくは少なくとも３つ又は少なくとも４つのポリペプチドが、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによって発現される。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、トリシストロン性であり得る（すなわち、３つの異なるポリペプチドが発現され得る）。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、テトラシストロン性であり得る（すなわち、４つの異なるポリペプチドが発現され得る）。マルチシストロン性ポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの共発現を促進するさらなるヌクレオチド配列を含んでいてもよく、これについては本明細書で後述する。ポリヌクレオチドは、本明細書において後述するようにベクターに含まれ得る。
「野生型」タンパク質アミノ酸配列は、天然に存在し、生殖細胞系ゲノムによってコードされる配列を指すことができる。種は、１つの野生型配列又は２つ以上の野生型配列（例えば、１つの古典的野生型配列及び１つ以上の非古典的野生型配列）を有することができる。野生型タンパク質アミノ酸配列は、Ｎ末端及び／又はＣ末端残基を除去するために、例えばシグナルペプチドを除去するためにプロセシングされたタンパク質の成熟形態であり得る。
本明細書に開示される野生型配列又は他のアミノ酸配列「に由来する」アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸が異なる、例えば本明細書に開示される１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含むアミノ酸配列を指すことができる。
本出願の文脈内で、タンパク質はアミノ酸配列によって表され、それに対応して核酸分子又はポリヌクレオチドは核酸配列によって表される。配列間の同一性及び類似性：本出願を通して、特定のアミノ酸配列の配列番号（例として配列番号Ｙをとる）を指すたびに、それは：アミノ酸配列、配列番号Ｙと少なくとも６０％の配列同一性又は類似性を有する配列を含むアミノ酸配列によって表されるポリペプチドによって置き換え得る。配列同一性又は類似性の他の好ましいレベルは７０％である。配列同一性又は類似性の他の好ましいレベルは８０％である。配列同一性又は類似性の他の好ましいレベルは９０％である。配列同一性又は類似性の他の好ましいレベルは９５％である。配列同一性又は類似性の他の好ましいレベルは９９％である。
本明細書に記載の各アミノ酸配列は、所与のアミノ酸配列とのその同一性又は類似性パーセンテージにより、さらなる好ましい実施形態ではそれぞれ、所与のヌクレオチド又はアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性又は類似性を有する。「相同性」、「配列同一性」等の用語は、本明細書では互換的に使用される。配列同一性は、本明細書では、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として記載される。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの所与の配列番号の全長又はその一部に基づいて計算される。その一部は、好ましくは両方の配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％を意味する。当技術分野では、「同一性」はまた、そのような配列のストリング間の一致によって決定され得るように、アミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の程度を指す。２つの配列間の配列同一性の程度は、例えば、グローバルアライメントアルゴリズム又はローカルアライメントアルゴリズムなど、この目的のために一般的に使用されるコンピュータプログラムを使用して２つの配列を比較することによって決定することができる。非限定的な例としては、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴｎ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、又は他の適切な方法若しくはアルゴリズムが挙げられる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長又はその一部（その一部は、配列の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を意味し得る）にわたってアライメントし、適合数を最大化し、ギャップの数を最小化することができる。デフォルト設定を使用することができ、好ましいプログラムはペアワイズアライメント用のＮｅｅｄｌｅ（一実施形態では、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ ６．６．０．０、ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔ ｐｅｎａｌｔｙ：０．５、ｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ：ｆａｌｓｅ、ｅｎｄ ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ：１０、ｅｎｄ ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔ ｐｅｎａｌｔｙ：０．５が使用される）及びマルチシーケンスアライメント用のＭＡＦＦＴ（一実施形態において、ＭＡＦＦＴ ｖ７Ｄｅｆａｕｌｔ値：ＢＬＯＳＵＭ６２［ｂｌ６２］，Ｇａｐ Ｏｐｅｎ：１．５３，Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：０．１２３、Ｏｒｄｅｒ：ａｌｉｇｎｅｄ、Ｔｒｅｅ ｒｅｂｕｉｌｄｉｎｇ ｎｕｍｂｅｒ：２、Ｇｕｉｄｅ ｔｒｅｅ ｏｕｔｐｕｔ：ＯＮ［ｔｒｕｅ］、Ｍａｘ ｉｔｅｒａｔｅ：２、Ｐｅｒｆｏｒｍ ＦＦＴＳ：ｎｏｎｅが使用される）である。
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。配列同一性の決定に使用されるのと同様のアルゴリズムが、配列類似性の決定に使用され得る。場合により、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者は、いわゆる保存的アミノ酸置換も考慮に入れることができる。本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。保存的置換についてのアミノ酸残基のクラスの例を以下の表に示す。
例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換バリアントは、開示される配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；Ｇｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；及び、ＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕ。
「外因性抗原認識受容体」は、抗原を認識することができる受容体であり、この受容体は操作された細胞に人工的に導入される。外因性抗原認識受容体の非限定的な例としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＣＲ（ＴＣＲが細胞に人工的に導入される場合、例えば、そうでなければＴＣＲを発現しないか、又は異なるＴＣＲを発現する細胞）が挙げられる。外因性抗原認識受容体は、例えば、トランスジェニックＴＣＲ、アルファベータＴＣＲ、又はガンマデルタＴＣＲであり得る。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、抗原、例えば癌又は感染性疾患に関連する抗原にＣＡＲが結合すると、ＣＡＲを発現する操作された細胞においてシグナル伝達を誘導することができる人工外因性抗原認識受容体を指す。ＣＡＲは一般的に、ＣＡＲを発現する操作された細胞においてシグナル伝達を誘導するが、ＣＡＲによって結合された抗原を発現又は提示する細胞では誘導しない。ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞外標的化ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの場合、ＣＡＲはヒンジドメインを含む。ＣＡＲ細胞外標的化ドメインは、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、ＶＨＨ等の単一ドメイン抗体、及びその任意の組合せを含むがこれらに限定されない、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はその機能性誘導体、バリアント若しくは断片であり得るか、それらを含むか、それらに由来し得る。ＣＡＲ細胞外標的化ドメインは、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、非抗体ドメイン（例えば、受容体又は受容体リガンド、例えば、ＡＰＲＩＬに由来するか、又はそれから得られる）であり得るか、それを含み得るか、又はそれに由来し得る。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む操作された細胞の活性を誘導又は低減させることができる。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、別の分子のシグナル伝達ドメインの切断部分であり得るか、又はそれを含み得る。いくつかの場合、ＣＡＲの細胞内ドメインは、刺激様式又は阻害様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化の調節に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲによって結合される抗原を発現する細胞に対するＴ細胞活性化及び／又は細胞傷害性応答の誘導に関与する。いくつかの場合では、ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラ免疫受容体、又はキメラＴ細胞受容体とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体受容体」という用語は、互いに異なる２つのタンパク質モノマーによって形成される高分子複合体である任意の受容体を含む。この用語は、機能性ヘテロ二量体断片又は受容体の一部を含むとさらに理解され得る。非限定的な例として、この用語は、Ｂ細胞受容体（Ｉｇ－α／Ｉｇ－βヘテロ二量体（ＣＤ７９）である）のシグナル伝達部分、Ｂ細胞受容体の重鎖及び軽鎖、Ｔｏｌｌ様受容体１及び２ヘテロ二量体、ανβ５のようなインテグリン、食作用性受容体Ｍａｃ－１、ＭＨＣ、ＣＤ９４ ＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅ受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、アルファベータ（αβ）ＴＣＲ、ガンマデルタ（γδ）ＴＣＲ、並びにヘテロ二量体として存在し得る任意の他の受容体又はその機能性断片若しくは部分を含む。
「抗原」は、抗原受容体又は抗原結合性タンパク質が認識（例えば、結合）することができる分子又は分子構造である。抗原は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、化学物質、部分、非ペプチド抗原、リン酸抗原、腫瘍関連抗原、ネオ抗原、腫瘍微小環境抗原、微生物抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、自己抗原、グリカン系抗原、ペプチド系抗原、脂質系抗原、又はその任意の組合せであり得るか、又はそれらを含み得る。いくつかの実施形態において、抗原は免疫応答を誘導することができる。いくつかの例では、抗原は、例えばＭＨＣによって提示される複合体中に存在する場合、抗原受容体又は抗原結合タンパク質に結合するか、又は免疫応答を誘導する。いくつかの場合、抗原は、抗原受容体又は抗原結合タンパク質に結合するために、及び／又は免疫応答を誘導するために特定の立体配座を取る、例えば、１つ以上の代謝産物の存在又は非存在に応答して立体配座を取る。抗原は、抗原受容体又は抗原結合タンパク質に結合する標的分子全体、複合体全体、標的分子又は複合体の断片を指すことができる。抗原を認識する抗原受容体としては、本明細書に開示される外因性抗原認識受容体及び内因性Ｔ細胞受容体等の他の抗原認識受容体が含まれる。
「ＴＥＧ」は、本明細書に開示される所定のγδＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞である。非限定的な例では、ＴＥＧは、所定のγδＴＣＲを発現するように操作されたアルファ－ベータＴ細胞であり得る。本出願の文脈内で、「操作された細胞」という表現は、組換えＤＮＡ技術を使用して改変された細胞を指す。一実施形態では、「操作された細胞」は、異種性核酸分子を含むように形質転換、改変又は形質導入されている。一実施形態では、前記細胞は、前記核酸分子によってコードされるタンパク質を発現する。
ＩＩ．ミジスタンパク質の細胞外部分
Ａ．細胞外リガンドドメイン
本開示のＭＩＤＩＳタンパク質（すなわち、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質）は、少なくとも１つの細胞外リガンドドメインを含む。ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞外リガンドドメインは、相互作用パートナーに結合し、相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達を誘導することができる。
したがって、本発明は、少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質（ＭＩＤＩＳ）を提供し、前記タンパク質は：
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介して伝達される。
一実施形態では、少なくとも２つの細胞内シグナルは誘導性である。
一実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質（すなわち、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質）は、少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができ、前記タンパク質は：
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの前記細胞内ドメインを介して伝達され、キメラタンパク質はＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメイン並びに４１ＢＢの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、又はこれからなるタンパク質ではない。
上記で放棄されるような４１ＢＢの細胞外リガンドドメイン及びＩＣＯＳＬの膜貫通ドメイン並びに異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、又はそれらからなるキメラタンパク質は、配列番号１３７によって表されても、又はその全長にわたって配列番号１３７と少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列によって表され得る。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメインを含まない。そのようなタンパク質は、配列番号１３８によって表されても、又はその全長にわたって配列番号１３８と少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列によって表されてもよい。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメインを含まない。そのようなタンパク質は、配列番号１３９によって表されても、又はその全長にわたって配列番号１３９と少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列によって表されてもよい。
ＩＣＯＳは、末梢Ｔｒｅｇ上に高度に発現され、これらの細胞の発生及び抑制機能に関与する（Ａｋｂａｒｉ Ｏ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００２ Ｓｅｐ；８（９）：１０２４－３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７４５．Ｅｐｕｂ ２００２ Ｊｕｌ ２９．ＰＭＩＤ：１２１４５６４７，Ｂｕｓｓｅ Ｍ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）１８９：１９７５－８２．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１１０３５８１及びＴｕｅｔｔｅｎｂｅｒｇ Ａ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ １５；１８２（６）：３３４９－５６．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０８０２７３３．ＰＭＩＤ：１９２６５１１１）。ＩＣＯＳ活性化は、抗炎症性ＩＬ１０シグナル伝達についてＴ細胞を感作する（Ｔｕｅｔｔｅｎｂｅｒｇ Ａ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ １５；１８２（６）：３３４９－５６．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０８０２７３３．ＰＭＩＤ：１９２６５１１１）。ＩＣＯＳ及びそのリガンドＩＣＯＳＬの生物学的特性を考慮すると、ＩＣＯＳシグナル伝達が本明細書に開示されるキメラタンパク質によって誘導されないことが好ましい。このため、本発明者らは、本開示のキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質（の一部）としての配列番号１３７、１３８又は１３９（又はその全長にわたって配列番号１３７、１３８若しくは１３９と少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％の同一性を有する配列）の存在を除外することによって、上記の３つの可能なタイプの免責事項を定義する。一実施形態において、相互作用パートナーはＩＣＯＳではない。
細胞外リガンドドメインは、所望の相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達を誘導するその能力に基づいて選択することができる。いくつかの場合、細胞外リガンドドメインは、相互作用パートナーに結合時のＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介されるシグナル伝達を誘導するその能力に基づいて選択することができる。「少なくとも２つの細胞内シグナル」は、場合により誘導性である。これは、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質が、２つの構成：シグナルが誘導されない１つの構成、及びキメラタンパク質の細胞外リガンドドメインとその相互作用パートナーの細胞外リガンドドメインとの相互作用時に「少なくとも２つの細胞内シグナル」が誘導される１つの構成を有すると見なされ得ることを意味する。これらの「少なくとも２つの細胞内シグナル」は、同時に又は連続して起こり得る。キメラタンパク質は相互作用パートナーによって制御可能であり、逆もまた同様であるため、これらの「少なくとも２つの細胞内シグナル」の誘導能は魅力的である。この誘導能は、当業者に公知の技術を使用して、キメラタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメイン及び相互作用パートナーの細胞内ドメインの同一性に応じて評価され得る。さらに、これらの「少なくとも２つの細胞内シグナル」のうちの１つは、相互作用パートナーの発現をもたらす細胞の活性化に依存し得る。さらに、これらの「少なくとも２つの細胞内シグナル」のうちの１つは、さらなる受容体、例えば限定されないがＴＣＲの活性化又はシグナル伝達に依存し得る。さらなる受容体の活性化又はシグナル伝達の非限定的な例は、ＴＣＲ活性化時のＣＤ２５（ＩＬ２Ｒａ）の発現及びＴＣＲシグナル伝達時のＩＬ２放出を伴うＩＬ２経路である。「少なくとも２つの細胞内シグナル」が誘導性である実施形態の非限定的な実例を図１７に示す。
細胞外リガンドドメインは、細胞表面上に発現されるタンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞表面上に発現されるタンパク質は、同族受容体に対してアゴニスト活性を有する。
細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
細胞外リガンドドメインは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの場合、細胞外リガンドドメインは、免疫共受容体リガンド、例えば免疫共刺激リガンドに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、又はＲＡＮＫに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ、又はＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質である４１ＢＢＬに由来するか、又はそれから得られる。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、ＯＸ４０Ｌに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、ＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
細胞外リガンドドメインは、受容体、例えばイオンチャネル、ＧＰＣＲ、又は受容体チロシンキナーゼに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、免疫共受容体に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
細胞外リガンドドメインは、サイトカインに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。細胞外リガンドドメインは、Ｃ型レクチンに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。細胞外リガンドドメインは、可溶性タンパク質、例えば分泌タンパク質又は細胞質タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。
細胞外リガンドドメインは、相互作用パートナーのペプチドリガンド、例えば、天然に存在する又は合成のペプチドリガンドを含むことができる。
細胞外リガンドドメインは、抗原結合性タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。抗原結合タンパク質の非限定的な例としては、抗体、可変領域（例えば、可変鎖重鎖領域（ＶＨ）及び／又は可変鎖軽鎖領域（ＶＬ））、短鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂコンジュゲートの二量体及び三量体、Ｆｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、アフィボディ、アンキリンタンパク質、アンキリンリピート、ＤＡＲＰｉｎ、モノボディ、ナノボディ、アビマー、アドネクチン、アンチカリン、フィノマー、クニッツドメイン、ノチン又はβ－ヘアピン模倣物が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは１つ以上の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）は、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる融合タンパク質である。ＶＨ及びＶＬドメインの配向及びリンカー長の操作を使用して、単量体、二量体（ダイアボディ）、三量体（トリアボディ）又は四量体（テトラボディ）であり得る異なる形態の分子を作製することができる。ミニボディは、二価二量体に集合するｓｃＦｖ－ＣＨ３融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは１つ以上のＤＡＲＰｉｎを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、抗体又はＴ細胞受容体由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば１つ、３つ又は６つのＣＤＲを含む。モノクローナル抗体に由来する抗原結合性断片は、例えば、キメラ、ヒト化又は完全ヒトであり得る。
細胞外リガンドドメインは、所望の相互作用パートナーに対する結合親和性に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、例えば、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、約５００ｆＭ未満、又は約１００ｆＭ未満のＫＤで相互作用パートナーに結合する。
細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。野生型タンパク質アミノ酸配列は、天然に存在し、生殖細胞系ゲノムによってコードされる配列を指すことができる。種は、１つの野生型配列又は２つ以上の野生型配列（例えば、１つの古典的野生型配列及び１つ以上の非古典的野生型配列）を有することができる。野生型タンパク質アミノ酸配列は、Ｎ末端及び／又はＣ末端残基を除去するために、例えばシグナルペプチドを除去するためにプロセシングされたタンパク質の成熟形態であり得る。
細胞外リガンドドメインは、例えば、所望のレベルの発現、表面発現、安定性、凝集に対する耐性、分解に対する耐性、相互作用パートナーに対する親和性、又は相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達のレベルを達成するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。細胞外リガンドドメインは、例えば、ＭＩＤＩＳの生物学的に活性な立体配座への折り畳みを促進するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示されるアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインの一部又は全ては、野生型アミノ酸配列（すなわち、レトロタンパク質として発現される）と比較して反転したアミノ酸配列を含む。
細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して少なくとも最小レベルの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。一実施形態では、所与のアミノ酸配列と比較して少なくとも最小レベルの配列同一性を有するそのような細胞外リガンドドメインは機能的であり、したがって、この細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーの細胞外ドメインに結合又は相互作用することができる限り、本発明に包含される。結合又は相互作用のレベルは、当業者に公知のアッセイを使用して検出可能でなければならない。適切なアッセイの例は、ウェスタンブロッティング又はＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ又はＳＰＲアッセイである。使用される細胞外リガンドドメインに応じて、当業者は、どのアッセイが最も適切であるかを知るであろう。例えば、ＯＸ４０の場合、ＮＦＫＢシグナル伝達が評価され、４１ＢＢＬの場合、４１ＢＢの結合が評価される。一実施形態において、細胞外リガンドドメインの活性は、前記細胞外リガンドドメインが、それが由来する完全長膜貫通分子内に依然として含まれる場合に評価される。例えば、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。細胞外リガンドドメインの一部又は全てが、野生型アミノ酸配列と比較して反転したアミノ酸配列を含む（すなわち、レトロタンパク質として発現される）場合、配列同一性を計算する前に野生型タンパク質アミノ酸配列を反転させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば配列番号０１～０６のいずれか１つであるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
表１は、本開示の細胞外ドメイン又は細胞外リガンドドメインが含み得るか、それからなり得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれに由来し得るアミノ酸配列の非限定的な例を提供する。ＥＣ：細胞外。
細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含み得る。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
１つ以上の挿入は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の挿入は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
１つ以上の欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の欠失は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０１～０６のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つである。
１つ以上の置換は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、保存的、非保存的、又はその組合せであり得る。
保存的アミノ酸置換は、類似の生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、及び／又は疎水性）の他のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、異なる生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、及び／又は疎水性）を有する他のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換であり得る。保存的アミノ酸変化は、例えば、ポリペプチドの二次又は三次構造に最小限の影響しか及ぼさない置換であり得る。
本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、任意の適切な数の細胞外リガンドドメインを有することができる。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、１つの細胞外リガンドドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、２つの細胞外リガンドドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の細胞外リガンドドメインを有する。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０の細胞外リガンドドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、又は多くとも１０個の細胞外リガンドドメインを有する。
Ｂ．細胞外リガンドドメインの相互作用パートナー
細胞外リガンドドメインの相互作用パートナーは細胞の表面に存在し、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介したシグナル伝達が誘導される。シグナル伝達経路の誘導は、本明細書に開示される広範囲の標的生物学的結果及び生物学的機能、例えば細胞増殖の増強、生存、並びに免疫エフェクター機能のより大きな規模及び持続期間に寄与し得る。
相互作用パートナーは、共免疫受容体であり得る。
一実施形態では、細胞は、それぞれが膜貫通タンパク質として、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及び相互作用パートナーを含むか、好ましくは共発現する。一実施形態において、相互作用パートナーを含むか又は発現し、シグナル双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を含まないか又は発現しない細胞は存在しない。相互作用パートナーは、細胞上で内因的に発現され得、前記細胞は、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質で形質導入又は形質転換され得る。或いは、相互作用パートナーとキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質の両方が、同じ細胞に形質導入され得る。
１つの単一細胞がキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質に由来する少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができるこの実施形態は、前記細胞が内因性タイプのシグナル伝達に依存し、細胞表面発現調節様式で自己活性化又は自己充足的であり、そのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／又は機能を改善するため、及び／又は生物学的パラメータ及び／又は機能を改善するための他のシグナルを必要としない可能性があるため、魅力的である。
一実施形態において、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質の相互作用パートナーは：
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインと相互作用することができる細胞外ドメイン、
－膜貫通ドメイン、及び
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインへの相互作用パートナーの細胞外ドメインの結合後に第２のシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合は、第２のシグナル伝達経路を調節し、例えば、第２のシグナル伝達経路の活性を誘導するか、又は増加若しくは低減させる。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーはシグナル伝達複合体中に存在し、ＭＩＤＩＳの細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達は調節され、例えば、シグナル伝達複合体によって媒介されるシグナル伝達は増加又は低減する。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、第１のシグナル伝達経路の活性が低下し、異なるシグナル伝達経路が誘導される。相互作用パートナーは、所望の生物学的結果又は生物学的機能に関連するシグナル伝達経路を調節する（例えば、誘導する）能力に基づいて選択することができる。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、単量体として相互作用パートナーに結合する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、相互作用パートナーに結合した場合、二量体を形成する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、相互作用パートナーに結合した場合、三量体を形成する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、四量体、五量体、六量体又は多量体として相互作用パートナーに結合する。多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体又はより高次の多量体）として結合すると、ＭＩＤＩＳタンパク質はホモ多量体（例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体、ホモ六量体、又はより高次のホモ多量体）を形成することができる。いくつかの場合、ＭＩＤＩＳタンパク質は、ヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体、ヘテロ六量体又はより高次のヘテロ多量体）として相互作用パートナーに結合する。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインに結合する相互作用パートナーは免疫細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、相互作用パートナーは、リンパ球、例えばＴ細胞等の白血球によって発現される。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、癌細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは哺乳動物細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、ヒト細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔエフェクター細胞、リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、骨髄系細胞、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ系細胞、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、肥満細胞、巨核球、形質細胞、胸腺細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、内皮細胞、間質細胞、又はその細胞の任意の混合物若しくは組合せによって発現される。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、初代細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、初代細胞ではない細胞によって発現される。
一実施形態では、本開示のキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質の相互作用パートナーは、一般的なＴ細胞の発達及び機能と比較して、Ｔｒｅｇの発達及び機能にとってそれほど重要ではない。一実施形態において、相互作用パートナーの発現は誘導性である。一実施形態では、この発現は、ＴＣＲ活性化時に誘導される。
いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現する細胞と同じ細胞種である細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質及び相互作用パートナーは両方とも同じ細胞によって発現される。
相互作用パートナーは、受容体、例えば、例えば腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーであり得る。相互作用パートナーは、例えば、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＲＡＮＫＬ、又はＩＬ１８ＲＡＰ（ＩＬ１８ＲＢ）であり得る。他の例は、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＣＤ２７である。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは４１ＢＢである。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーはＯＸ４０である。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーはＲＡＮＫＬである。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーはＩＬ１８ＲＡＰである。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーはＣＤ２７である。一実施形態において、相互作用パートナーはＩＣＯＳではない。
いくつかの実施形態では、相互作用パートナーは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー又は免疫共受容体、例えばＣＤ８６等の活性化免疫共受容体である。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーはサイトカイン受容体である。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーはＣ型レクチン受容体である。いくつかの実施形態では、相互作用パートナーは、イオンチャネル、ＧＰＣＲ、セリンペプチダーゼ、インテグリン、テトラスパニン、又は受容体チロシンキナーゼである。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、シグナル伝達を媒介することができる細胞内ドメインを含む腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーである。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーは、４１ＢＢＬ又はＯＸ４０Ｌである。
一実施形態において、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質によって伝達される少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルは、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与する。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つのシグナル伝達経路が誘導される。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのシグナル伝達経路が誘導される。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される１つのシグナル伝達経路が誘導される。
Ｃ．さらなる細胞外ドメイン
ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞外部分は、１つ以上のさらなる細胞外ドメイン並びに１つ以上の細胞外リガンドドメインを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、細胞外リガンドドメインと同じタンパク質由来の１つ以上のさらなる細胞外ドメイン、例えば、相互作用パートナーへの結合に関与しないか、又は細胞外リガンドドメインに結合する相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達を誘導しないアミノ酸のストレッチを含む。いくつかの実施形態では、さらなる細胞外ドメインは、相互作用パートナーへの結合に関与しないが、相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達のレベルを増加又は低減させる。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、膜貫通ドメインと同じタンパク質、例えば、異種性細胞内シグナル伝達ドメインと同じタンパク質又は異なるタンパク質に由来するか、又はそれから得られる、さらなる細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、そのようなさらなる細胞外ドメインは、相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達を誘導しない。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、異種性細胞内シグナル伝達ドメインと同じタンパク質に由来するか、又はそれから得られる、さらなる細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、そのようなさらなる細胞外ドメインは、相互作用パートナーによって媒介されるシグナル伝達を誘導しない。いくつかの場合、さらなる細胞外ドメインは、相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合時に、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介されるシグナル伝達を誘導する能力に基づいて選択することができる。
さらなる細胞外ドメインは、切断部位、例えばＡＤＡＭファミリー切断部位又はメタロプロテアーゼファミリー切断部位であり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞外ドメインは、多量体化ドメイン（例えば、ホモ又はヘテロ二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、又はより高次の多量体の形成を促進するドメイン、例えばテネイシン－Ｃオリゴマー化ドメイン、トロンボスポンジンオリゴマー化ドメイン、又はＧＣＮ４オリゴマー化ドメイン）であり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞外ドメインは、細胞局在化モチーフ、例えば脂質ラフト局在化モチーフ又は核局在化モチーフであり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞外ドメインは、標的ペプチド、例えばシグナルペプチドであり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞外ドメインは、リンカーを含むことができる。
さらなる細胞外ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。さらなる細胞外ドメインは、本明細書の他の箇所に開示される任意のタンパク質又はタンパク質の種類に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。さらなる細胞外ドメインは、例えば、所望のレベルの発現、表面発現、安定性、凝集に対する耐性、シェディングに対する耐性、又は分解に対する耐性を達成するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。さらなる細胞外ドメインは、例えば、ＭＩＤＩＳの生物学的に活性な立体配座への折り畳みを促進するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示されるアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、さらなる細胞外ドメインの一部又は全ては、野生型アミノ酸配列（すなわち、レトロタンパク質として発現される）と比較して反転したアミノ酸配列を含む。
さらなる細胞外ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書の他の箇所に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。さらなる細胞外ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書の他の箇所に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して、少なくとも最小レベルの配列同一性を含むことができる。
ＩＩＩ．細胞内ドメイン
Ｄ．異種性細胞内シグナル伝達ドメイン
本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、少なくとも１つの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「異種性」とは、細胞内シグナル伝達ドメインが、細胞外リガンドドメインとは異なるタンパク質に由来するか、又はそれから得られるという事実を指す。異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介されるシグナル伝達経路は、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると誘導される。シグナル伝達経路の誘導は、本明細書に開示される広範囲の標的生物学的結果及び生物学的機能、例えば細胞増殖の増強、生存、並びに免疫エフェクター機能のより大きな規模及び持続期間に寄与し得る。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の生物学的結果又は生物学的機能に関連するシグナル伝達経路を誘導する能力に基づいて選択することができる。異種性細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質、例えば細胞表面上に発現されるタンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、サイトカイン受容体に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｃ－レクチンファミリーメンバーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫｐ８０、又はＩＬ１８ＲＡＰに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＩＬ２ＲＢに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０に由来するか、又はそれから得られ、Ｉ型膜貫通ＯＸ４０タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ２ＲＢに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、受容体、例えばイオンチャネル、ＧＰＣＲ、セリンプロテアーゼ、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、補体受容体、ＴＩＲドメイン含有受容体、又は受容体チロシンキナーゼに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含み得る。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、サイトカイン受容体に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｃ型レクチン受容体に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達経路に関与する細胞質タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達経路に関与する核タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーの細胞内ドメインに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫共受容体の細胞内ドメインに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達ドメイン、例えば免疫共刺激リガンドの細胞内シグナル伝達ドメインを含有する免疫共受容体リガンドの細胞内ドメインに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。多くの場合、鎖全体を使用する必要はなく、例えば、シグナル伝達ドメインの切断部分を異種性細胞内シグナル伝達ドメインで使用することができる。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ抗原受容体及び類似のキメラタンパク質に見られる細胞内ドメインと構造的に異なり得る。例えば、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体シグナル伝達に関連する１つ以上の成分を欠くことができる。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩＴＡＭを含有しない。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ｈｅｍＩＴＡＭを含むが、ＩＴＡＭを含まない。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、相互作用パートナーへのＭＩＤＩＳタンパク質の結合時にリン酸化されない。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３鎖由来の細胞内ドメインを含有せず、例えばＣＤ３ゼータ鎖の細胞内ドメインを含有しない。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、相互作用パートナーへのＭＩＤＩＳタンパク質の結合時にリン酸化される。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、望ましいレベルの発現、表面発現、安定性、凝集に対する耐性、分解に対する耐性、シグナル伝達強度、又は下流のシグナル伝達に関与するタンパク質、例えばアダプタータンパク質に対する親和性を達成するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＭＩＤＩＳの生物学的に活性な立体配座への折り畳みを促進するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示されるアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、異種性シグナル伝達ドメインの一部又は全ては、野生型アミノ酸配列と比較して反転した（すなわち、レトロタンパク質として発現される）アミノ酸配列を含む。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して少なくとも最小レベルの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。例えば、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。一実施形態では、所与のアミノ酸配列と比較して少なくとも最小レベルの配列同一性を有するそのような異種性細胞内シグナル伝達ドメインは機能的であり、したがって、この細胞内シグナル伝達ドメインがその相互作用パートナーの細胞外リガンドドメインに結合後に第１のシグナルを伝達することができる限り、本発明に包含される。第１のシグナルは、当業者に公知のアッセイを使用して検出可能でなければならない。適切なアッセイの例は、ウェスタンブロッティング又はＦＡＣＳ、発光アッセイである。使用される異種性細胞内シグナル伝達ドメインの同一性に応じて、当業者は、どのアッセイを使用するのが適切であるかを知るであろう。ＮＦκＢレポーターアッセイを使用して、前記異種性細胞内ドメインの活性を評価することができる。一実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインの活性は、前記細胞内シグナル伝達ドメインが、それが由来する完全長膜貫通分子内に依然として含まれる場合に評価される。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインの一部又は全てが、野生型アミノ酸配列と比較して反転したアミノ酸配列を含む（すなわち、レトロタンパク質として発現される）場合、配列同一性を計算する前に野生型タンパク質アミノ酸配列を反転させることができる。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば配列番号０７～１９のいずれか１つであるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
表２は、本開示の細胞内ドメイン及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインが含み得るか、それからなり得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれに由来し得るアミノ酸配列の非限定的な例を提供する。
異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含み得る。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
１つ以上の挿入は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の挿入は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
１つ以上の欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の欠失は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号０７～１９のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号０７～１９又は１７５のいずれか１つである。
１つ以上の置換は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、保存的、非保存的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、単量体としてシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは二量体としてシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、三量体としてシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、四量体、五量体、六量体又は多量体としてシグナル伝達する。多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体又はより高次の多量体）としてシグナル伝達すると、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはホモ多量体（例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体、ホモ六量体、又はより高次のホモ多量体）としてシグナル伝達することができる。いくつかの場合、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体、ヘテロ六量体又はより高次のヘテロ多量体）としてシグナル伝達する。いくつかの実施形態では、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが由来するか、又はそれから得られる完全長野生型タンパク質とは異なる立体配座で、又は異なる多量体としてシグナル伝達する。
本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、任意の適切な数の異種性細胞内シグナル伝達ドメインを有することができる。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、１つの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、２つの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の異種性細胞内シグナル伝達ドメインを有する。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０の異種性細胞内シグナル伝達ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、又は多くとも１０の異種性細胞内シグナル伝達ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＩＬ２ＲＢに由来するか、又はそれから得られる２つの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、ＯＸ４０に由来するか、又はそれから得られる異種性細胞内シグナル伝達ドメインと、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ、又はＩＬ２ＲＢに由来するか、又はそれから得られる異種性ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、ＯＸ４０に由来するか、又はそれから得られる異種性細胞内シグナル伝達ドメインと、ＩＬ２ＲＢに由来するか、又はそれから得られる異種性細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つのシグナル伝達経路が誘導される。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのシグナル伝達経路が誘導される。いくつかの実施形態において、細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合すると、異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される１つのシグナル伝達経路が誘導される。
Ｅ．さらなる細胞内ドメイン
ＭＩＤＩＳタンパク質は、１つ以上のさらなる細胞内ドメイン並びに１つ以上の異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、異種性細胞内シグナル伝達ドメインと同じタンパク質に由来するか、又はそれから得られる１つ以上のさらなる細胞内ドメイン、例えばシグナル伝達に関与しないアミノ酸のストレッチを含む。いくつかの実施形態では、さらなる細胞内ドメインは、シグナル伝達に直接関与しない（例えば、シグナル伝達経路成分に結合しないか、又はシグナル伝達経路の一部として化学的若しくは構造的変化を受けない）が、異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介されるシグナル伝達のレベルを増加又は減少させる。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、膜貫通ドメインと同じタンパク質、例えば、細胞外リガンドドメインと同じタンパク質又は異なるタンパク質であり得るタンパク質に由来するか、又はそれから得られる、さらなる細胞内ドメインを含む。そのような細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含んでいても、又はシグナル伝達ドメインを欠いていてもよい。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、細胞外リガンドドメインと同じタンパク質に由来するか、又はそれから得られる細胞内ドメインを含む。そのような細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを欠いていても、又はＭＩＤＩＳに存在する異種性細胞内シグナル伝達ドメインに対する異なるシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、細胞外リガンドドメインの供給源であるタンパク質との配列類似性及び／又は構造類似性を達成するために、１つ以上のアミノ酸が付加される。例えば、いくつかの実施形態において、アミノ酸ＭＬＧを、４１ＢＢＬ細胞外リガンドドメインを含有するＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内Ｎ末端に付加し得る。
さらなる細胞内ドメインは、切断部位、例えばＡＤＡＭファミリー切断部位又はメタロプロテアーゼファミリー切断部位であり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞内ドメインは、多量体化ドメイン（例えば、ホモ又はヘテロ二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、又は高次多量体の形成を促進するドメイン、例えばテネイシン－Ｃオリゴマー化ドメイン、トロンボスポンジンオリゴマー化ドメイン、又はＧＣＮ４オリゴマー化ドメイン）であり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞内ドメインは、標的ペプチド、例えばシグナルペプチドであり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞内ドメインは、細胞局在化モチーフ、例えば脂質ラフト局在化モチーフ又は核局在化モチーフであり得るか、又はそれを含み得る。さらなる細胞内ドメインは、リンカーを含むことができる。
さらなる細胞内ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。さらなる細胞内ドメインは、本明細書の他の箇所に開示される任意のタンパク質又はタンパク質の種類に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。さらなる細胞内ドメインは、例えば、望ましいレベルの発現、表面発現、安定性、凝集に対する耐性、分解に対する耐性、シグナル伝達強度、又は下流のシグナル伝達に関与するタンパク質、例えばアダプタータンパク質に対する親和性を達成するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。さらなる細胞内ドメインは、例えば、ＭＩＤＩＳの生物学的に活性な立体配座への折り畳みを促進するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示されるアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、さらなる細胞内ドメインの一部又は全ては、野生型アミノ酸配列（すなわち、レトロタンパク質として発現される）と比較して反転したアミノ酸配列を含む。
さらなる細胞内ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書の他の箇所に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。さらなる細胞内ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書の他の箇所に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して、少なくとも最小レベルの配列同一性を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内部分全体（１つ以上の異種性細胞内シグナル伝達ドメイン及び任意のさらなる細胞内ドメインを含む）は、キメラ抗原受容体及び類似のキメラタンパク質に見られる細胞内ドメインと構造的に異なり得る。例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内部分全体は、ＴＣＲ複合体シグナル伝達に関連する１つ以上の成分を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内部分全体は、ＩＴＡＭを含まない（例えば、ｈｅｍＩＴＡＭを含むがＩＴＡＭを含まないか、又はｈｅｍＩＴＡＭ若しくはＩＴＡＭを含まない）。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内部分全体は、相互作用パートナーへのＭＩＤＩＳタンパク質の結合時にリン酸化されない。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内部分は、相互作用パートナーへのＭＩＤＩＳタンパク質の結合時にリン酸化される。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内部分全体は、ＣＤ３鎖由来の細胞内ドメインを含まない、例えば、ＣＤ３ゼータ鎖の細胞内ドメインを含まないか、又はあらゆるＣＤ３鎖由来の細胞内ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞内部分全体は、ＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメインを含まない。
ＩＶ．膜貫通ドメイン
本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、細胞外リガンドドメインを異種性細胞内シグナル伝達ドメインに接続する膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの一部又は全ては、細胞外リガンドドメインと同じタンパク質に由来する。膜貫通ドメインの一部又は全てが細胞外リガンドドメインと同じタンパク質に由来する場合、膜貫通ドメイン及び細胞外リガンドドメインは、連続したアミノ酸配列（例えば、野生型配列と一致するか又は対応する）の一部であっても、又は１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換によって分離されてもよい。一実施形態では、膜貫通ドメイン又はその一部は、細胞外リガンドドメインと同じタンパク質に由来するか、又はそれから得られる。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの一部又は全ては、異種性細胞内シグナル伝達ドメインと同じタンパク質に由来する。膜貫通ドメインの一部又は全てが異種性細胞内シグナル伝達ドメインと同じタンパク質に由来する場合、膜貫通ドメイン及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、連続したアミノ酸配列（例えば、野生型配列と一致するか又は対応する）の一部であっても、又は１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換によって分離されてもよい。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの一部又は全ては、細胞外リガンドドメイン及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインとは異なるタンパク質に由来するか、又はそれから得られる。非限定的な例として、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、ＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む細胞外リガンドドメイン、４１ＢＢＬに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質、例えば細胞表面上に発現されるタンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。膜貫通ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
膜貫通ドメインは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。膜貫通ドメインは、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫｐ８０、ＲＡＮＫ又はＩＬ１８ＲＡＰに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。膜貫通ドメインは、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫｐ８０、ＲＡＮＫ、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、４１ＢＢに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＯＸ４０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＮＫｐ８０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＲＡＮＫに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー又は免疫グロブリンスーパーファミリーに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。膜貫通ドメインは、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、又はＲＡＮＫに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。膜貫通ドメインは、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ又はＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、４１ＢＢＬに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＯＸ４０Ｌに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８６に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＲＡＮＫに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ７０に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
膜貫通ドメインは、受容体、例えばイオンチャネル、ＧＰＣＲ、セレクチンファミリーメンバー、サイトカイン受容体、接着分子、又は受容体チロシンキナーゼに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。膜貫通ドメインは、サイトカイン受容体に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。膜貫通ドメインは、Ｃ型レクチン又はＣ型レクチン受容体に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、免疫共受容体に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、膜貫通ドメインは、免疫共受容体リガンド、例えば免疫共刺激リガンドに由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含む。
一態様では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ－１及び／又はＣＤ１５２に由来する。
膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を含むことができる。膜貫通ドメインは、例えば、所望のレベルの発現、表面発現、安定性、凝集に対する耐性、分解に対する耐性、シグナル伝達強度、局在化、又はＭＩＤＩＳタンパク質の多量体化を達成するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。膜貫通ドメインは、例えば、ＭＩＤＩＳの生物学的に活性な立体配座への折り畳みを促進するために、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示されるアミノ酸配列と比較して改変されたアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインの一部又は全ては、野生型アミノ酸配列（すなわち、レトロタンパク質として発現される）と比較して反転したアミノ酸配列を含む。膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、細胞局在化モチーフ、例えば脂質ラフト局在化モチーフ又は核局在化モチーフを含み得る。
非限定的な一例において、本開示のＭＩＤＩＳは、ＲＡＮＫ由来の細胞外リガンドドメイン及びＩＬ１８ＲＡＰ由来の膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ１８ＲＡＰ由来の膜貫通ドメインの包含は、三量体として機能することができる野生型ＲＡＮＫとは異なり、ＭＩＤＩＳの二量体状態への形成を誘導する。同様に、本開示の膜貫通ドメインは、細胞外リガンドドメインが由来するか若しくはそれから得られるタンパク質の全長野生型バージョンによって採用される状態とは異なる、及び／又は異種性細胞内ドメインが由来するか若しくはそれから得られるタンパク質の全長野生型バージョンとは異なる、単量体又は多量体状態へのＭＩＤＩＳの形成を誘導することができる。
膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して少なくとも最小レベルの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。例えば、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。一実施形態では、所与のアミノ酸配列と比較して少なくとも最小レベルの配列同一性を有するそのような膜貫通ドメインは機能的であり、したがって、この膜貫通ドメインがその相互作用パートナーの細胞外ドメインに結合時に、それを含むキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質の多量体化を誘導することができる限り、本発明に包含される。結合又は相互作用のレベルは、当業者に公知のアッセイを使用して検出可能でなければならない。適切なアッセイの例は、ウェスタンブロッティング又はＦＡＣＳ、単一光子顕微鏡アッセイである。
膜貫通ドメインの一部又は全てが、野生型アミノ酸配列と比較して反転したアミノ酸配列を含む（すなわち、レトロタンパク質として発現される）場合、配列同一性を計算する前に野生型タンパク質アミノ酸配列を反転させることができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば配列番号２０～２７のいずれか１つであるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。
表３は、本開示の膜貫通ドメインが含み得るか、それからなり得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれに由来し得るアミノ酸配列の非限定的な例を提供する。
膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含み得る。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、又は多くとも１０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。１つ以上の挿入は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の挿入は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、又は多くとも１０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書中に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。１つ以上の欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の欠失は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば、配列番号２０～２７のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、又は多くとも１０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のアミノ酸配列、又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば配列番号２０～２７のいずれか１つを有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号２０～２７又は１７７のいずれか１つである。１つ以上の置換は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、保存的、非保存的、又はその組合せであり得る。
Ｖ．リンカー
本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、本開示のアミノ酸配列、例えば、異なるタンパク質に由来するか、又はそれから得られるアミノ酸配列を接続する１つ以上のリンカーを含むことができる。リンカーは、例えば、細胞外リガンドドメインを膜貫通ドメインに、異種性細胞内シグナル伝達ドメインを膜貫通ドメインに、１つの細胞外リガンドドメインを第２の細胞外リガンドドメイン又はさらなる細胞外ドメインに、１つの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを他の異種性細胞内シグナル伝達ドメイン又はさらなる細胞内ドメインに、又は本明細書に開示される任意のドメインを他のアミノ酸配列に接続することができる。
リンカーは又は、それが分離するドメイン、例えば膜貫通ドメイン及び細胞外リガンドドメインの分離及び可撓性を可能にすることができる。リンカーの長さは、例えば、相互作用パートナー（細胞外リガンドドメインについて）又はシグナル伝達経路に関与する因子（例えば、異種性細胞内シグナルドメインについて）に結合するドメインの能力を変化させるように調整することができる。
リンカー配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０アミノ酸残基の長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、又は少なくとも１５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で５、最大で７、最大で９、最大で１１、最大で１５、最大で２０、最大で２５、又は最大で５０アミノ酸長である。
可撓性リンカーは、グリシン残基及びセリン残基のストレッチを含有する配列を有することができる。グリシン残基及びセリン残基は小さなサイズのために、可撓性を提供し、連結された機能性ドメインの可動性を可能にする。セリン又はトレオニンの組込みは、水分子と水素結合を形成し、それによってリンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用を減少させることによって、水溶液中のリンカーの安定性を維持することができる。可撓性リンカーはまた、可撓性を維持するためのトレオニン及びアラニン等のさらなるアミノ酸、並びに溶解性を改善するためのリジン及びグルタミン等の極性アミノ酸を含むことができる。剛性リンカーは、例えば、アルファヘリックス構造を有することができる。アルファらせん剛性リンカーは、タンパク質ドメイン間のスペーサとして作用することができる。
リンカーは、表４の配列のいずれか又はその反復（例えば、配列番号２８～４４のいずれかの２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の反復）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、配列番号２８～４４のいずれかに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を有するリンカーを含む。挿入、欠失又は置換は、Ｎ末端、Ｃ末端、配列内、又はその組合せであり得る。挿入、欠失又は置換は、連続的又は非連続的であり得る。いくつかの場合では、置換は保存的である。いくつかの場合では、置換は非保存的である。
いくつかの実施形態において、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、いずれのリンカーも含有せず、例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質は、介在するアミノ酸配列を有しない他のタンパク質からのアミノ酸配列の直接融合物である。
ＶＩ．例示的なＭＩＤＩＳタンパク質
本開示のキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質（ＭＩＤＩＳ）は少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができ、前記タンパク質は：
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介して伝達される。
一実施形態では、少なくとも２つの細胞内シグナルは誘導性である。
一実施形態では、少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は：
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの前記細胞内ドメインを介して伝達され、キメラタンパク質は、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメイン並びに４１ＢＢの前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、又はそれらからなるタンパク質ではない。
上記で放棄されるような４１ＢＢの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメイン並びに異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、又はそれらからなるキメラタンパク質は、配列番号１３７によって表されても、又はその全長にわたって配列番号１３７と少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列によって表され得る。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメインを含まない。そのようなタンパク質は、配列番号１３８によって表されても、又はその全長にわたって配列番号１３８と少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列によって表されてもよい。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメインを含まない。そのようなタンパク質は、配列番号１３９によって表されても、又はその全長にわたって配列番号１３９と少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％の同一性を有するアミノ酸配列によって表されてもよい。
一実施形態において、少なくとも２つの、場合により誘導性細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメインであって、細胞外リガンドドメインが、表１で特定される配列番号１～６のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によって表される、細胞外リガンドドメイン、
－表３で特定される配列番号２０～２７のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によって表される膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインであって、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、表２で特定される配列番号７～１９のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によって表される、異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介して伝達される。本実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。
一実施形態において、少なくとも２つの、場合により誘導性細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメインであって、細胞外リガンドドメインが、表１で特定される配列番号１～６及び１７４のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によって表される、細胞外リガンドドメイン、
－表３で特定される配列番号２０～２７及び１７７のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によって表される膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインであって、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、表２で特定される配列番号７～１９及び１７５のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列によって表される、異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介して伝達される。本実施形態では、配列同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。
一実施形態では、膜貫通ドメイン及び細胞外リガンドドメインは、同じタンパク質に由来する。非限定的な例は、ＣＤ８６－ＯＸ４０、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ－４１ＢＢである。
一実施形態において、１つの単一細胞において少なくとも２つの、場合により誘導性細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られる細胞外リガンドドメインと、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られる異種性細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。一実施形態において、１つの単一細胞において少なくとも２つの、場合により誘導性細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られる細胞外リガンドドメインと、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか、又はそれから得られる異種性細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
一実施形態において、１つの単一細胞において少なくとも２つの、場合により誘導性細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は：
ａ．Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる細胞外リガンドドメイン、及びＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる異種性細胞内シグナル伝達ドメイン、又は
ｂ．ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる細胞外リガンドドメイン、及びＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
Ｉ型膜貫通タンパク質の一部及びＩＩ型膜貫通タンパク質の一部を含むそのようなキメラタンパク質は、驚くべき予想外の効果を示すが、これは、Ｉ型膜貫通タンパク質及びＩＩ型膜貫通タンパク質を組み合わせて機能性タンパク質にすることは容易にはできないためである。例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列をＩＩ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列に融合しようとする多くの試みは、例えば、アミノ酸配列の１つのＮ末端又はＣ末端位置の変化、得られたタンパク質が機能的立体配座、三次構造、膜貫通配向、又はその組合せを取ることができないために、機能性タンパク質を得ることができない。驚くべきことに、これらのキメラタンパク質のいくつかは、実験部分において首尾よく生成され、活性であることが見出された。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は：
－腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー、サイトカイン、Ｃ型レクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、又は抗体若しくはその抗原結合性断片由来のアミノ酸配列を含む細胞外リガンドドメイン；及び
－腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、サイトカイン受容体又はＣ型レクチン受容体由来のアミノ酸配列を含む異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は：
－４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、又はＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含む細胞外リガンドドメイン、及び
－ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０又はＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含む異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は：
－４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ、又はＣＤ７０由来のアミノ酸配列を含む細胞外リガンドドメイン、及び
－ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含む異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は以下を含む：
（ａ）細胞外リガンドドメインは４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｂ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｃ）細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＮｐＫ８０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｄ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｅ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｆ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｇ）細胞外リガンドドメインは、ＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０Ｌに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、又は
（ｈ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られる。
一実施形態において、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は：
（ａ）細胞外リガンドドメインは４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｂ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｃ）細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＮｐＫ８０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｄ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｅ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｆ）細胞外リガンドドメインは、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｇ）細胞外リガンドドメインは、ＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０Ｌに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｈ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｉ）細胞外リガンドドメインは、ＣＤ７０由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＣＤ７０に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、又は
（ｊ）細胞外リガンドドメインは、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列及びＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０及びＩ型膜貫通タンパク質ＩＬ２ＲＢに由来するか若しくはそれから得られる。
これらのキメラタンパク質のそれぞれは、実験部分で生成され、それらの機能性が確認されている（例えば、実施例３～５、１０を参照されたい）。
一実施形態では、ａ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号４５、４６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、又は６５と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ａ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号４５、４６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、１７８又は１７９と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｂ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号５２、５３又は７３と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｃ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号４７、又は４８と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｄ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号７８と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｅ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号７６と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｆ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号７７と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｇ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号４９、５０又は５１と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｈ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号７１又は７２と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｉ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号１８２又は１８３と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
一実施形態では、ｊ）の下で同定されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、表５で特定される配列番号１７９と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される。
本実施形態では、配列同一性又は類似性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。
一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、ＩＴＡＭ、又はＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメインを含まない。これに関連して、一実施形態では、ＩＴＡＭモチーフは「ＹｘｘＬ／Ｉ－ｘ６－８－ＹｘｘＬ／Ｉ」であり、式中、ｘは任意のアミノ酸を表す。Ｘ６－８は、６、７又は８アミノ酸の任意のストレッチを意味し、Ｙはチロシンであり、Ｌはロイシンであり、Ｉはイソロイシンである（ＰＦＡＭ供給源ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／ＩＴＡＭ又はｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｂｓ／ｐｉｉ／Ｓ０９６２８９２４０６００１４９８ ａｒｔｉｃｌｅ）。
ＭＩＤＩＳタンパク質配列、及びＭＩＤＩＳタンパク質に含まれ得る配列の非限定的な例を表５に示す。
ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも最小レベルの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。一実施形態において、所与のアミノ酸配列と比較して少なくとも最小レベルの配列同一性を有するそのようなキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は機能性であり、したがって、このキメラタンパク質が少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルを伝達することができ、及び／又はそれを発現する細胞において生物学的パラメータ及び／又は機能の改善を誘導することができ、及び／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／又は機能の改善を誘導することができる限り、本発明に包含される。これらの少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルの伝達は、当業者に公知のアッセイを使用して検出可能でなければならない。適切なアッセイの例は、ウェスタンブロッティング、発光レポーター又はＦＡＣＳアッセイである。生物学的パラメータ及び／又は機能の改善はまた、当業者に公知のアッセイを使用して検出可能であるべきである。パラメータ及び／又は機能に応じて、当業者は、どのアッセイが使用され得るかを知るであろう。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、野生型タンパク質アミノ酸配列又は本明細書に開示される任意の他のアミノ酸配列、例えば配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つであるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を有するアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含み得る。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸挿入を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
１つ以上の挿入は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の挿入は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸欠失を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
１つ以上の欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の欠失は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して、多くとも１、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くとも２０、多くとも２５、多くとも３０、多くとも３５、多くとも４０、多くとも４５、又は多くとも５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列、例えば、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８のいずれか１つに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。他の例は、配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３のいずれか１つである。
１つ以上の置換は、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸配列内、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、連続的、非連続的、又はその組合せであり得る。１つ以上の置換は、保存的、非保存的、又はその組合せであり得る。
ＶＩＩ．操作された細胞
本開示はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／又はベクターを含み、好ましくはポリヌクレオチド及び／又はベクターによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する。したがって、いくつかの態様において、１つ以上のＭＩＤＩＳタンパク質（すなわち、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質）を発現する操作された細胞又はその集団が本明細書中に開示される。操作された細胞又はその集団における１つ以上のＭＩＤＩＳタンパク質の発現は、操作された細胞の産生及び使用を妨げる制限、例えば、十分な数の所望の操作された細胞を作製することの困難性、制限された細胞傷害効果、制限された免疫刺激効果、操作された細胞の制限された増殖能力又は寿命、抗原の操作された細胞認識時のエフェクター機能の制限された誘導、及び操作された細胞の疲弊を克服するための戦略として使用することができる。本出願の文脈内で、「操作された細胞」という表現は、組換えＤＮＡ技術を使用して改変された細胞を指す。一実施形態では、「操作された細胞」は、異種性核酸分子を含むように形質転換、改変又は形質導入されている。一実施形態では、前記細胞は、前記核酸分子によってコードされるタンパク質を発現する。
いくつかの態様において、１つ以上のキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を含み、好ましくは発現する細胞又はその集団が本明細書中に開示される。細胞又はその集団におけるこれらのキメラタンパク質の１つ以上の発現は、前の段落で特定されたのと同じ制限を克服するための戦略として使用することができる。
本出願において、「操作された細胞」という表現は、「改変された細胞」又は「形質転換された細胞」又は「形質導入された細胞」に置き換え得る。
本出願において、「異種核酸分子を含む操作された細胞」又は「キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現する操作された細胞」という表現は、「異種核酸分子を含む細胞」又は「キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現する細胞」という表現に置き換えられ得る。同じことは、そのような細胞を含む集団にも当てはまる。
一実施形態では、本明細書で先に定義されたキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を含む細胞が提供される。一実施形態において、この細胞は、前記キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、この細胞は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。一実施形態において、この細胞は、前記キメラタンパク質を発現する。一実施形態では、この細胞はまた、本明細書で定義される相互作用パートナーを含み、好ましくは発現する。一実施形態では、そのような細胞を含む細胞の集団が提供される。
細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合すると、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「アウトサイドイン」シグナルと、相互作用パートナーの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも１つの「インサイドアウト」シグナルとを含む多方向シグナル伝達が誘導される。一実施形態では、多方向シグナル伝達は双方向シグナル伝達である。「インサイドアウト」及び「アウトサイドイン」シグナル伝達経路は、一緒になって標的生物学的結果を誘導することができる。いくつかの実施形態では、「インサイドアウト」及び「アウトサイドイン」のシグナル伝達経路は、標的生物学的結果を共に軽減し得る。いくつかの実施形態では、「インサイドアウト」及び「アウトサイドイン」のシグナル伝達経路は、共に標的生物学的結果に有利に働き得る。対照的に、操作された細胞に導入された多くの構築物は、一方向シグナル伝達のみを誘導し、及び／又は一方向シグナル伝達のみが標的生物学的結果に寄与する。
本出願を通じて、「標的生物学的結果」という表現は、「生物学的パラメータ及び／又は生物学的機能」に置き換え得る。
したがって、一実施形態において、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与する少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルを伝達することができる。
標的生物学的結果（すなわち、生物学的パラメータ及び／又は生物学的機能）は、例えば、細胞増殖、細胞生存、免疫エフェクター機能の大きさ、免疫エフェクター機能の持続時間、細胞（例えば、癌細胞）に対する細胞傷害効果、炎症性メディエータの産生、抗癌免疫応答、細胞分化、細胞脱分化であり得るか、又はそれらを含み得る。
一実施形態では、生物学的パラメータ及び／又は機能は、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択される。
標的生物学的結果又は生物学的パラメータ及び／又は機能は、例えば癌細胞に対する細胞傷害性応答を含み得る。細胞傷害性応答は（例えば、標的細胞の細胞溶解又は生存を測定することによって）直接決定することができる。代替において、又は、加えて、細胞傷害性応答は、そのような応答に伴う分子の産生、例えば、サイトカイン、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生を測定することによって決定し得る。好適な測定アッセイ、例えば、細胞傷害性を決定するための発光アッセイ及びＩＦＮγ産生を決定するためのＥＬＩＳＡは当業者に公知であり、さらなる非限定的な例が実験セクションに示される。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、標的生物学的結果に寄与し得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞傷害性応答は、ＭＩＤＩＳタンパク質の相互作用パートナーを発現する細胞に対して誘導されず、むしろ外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞に対して誘導される。例えば、相互作用パートナーは、操作された免疫細胞によって発現され得、外因性抗原認識受容体を発現する操作された免疫細胞の適応性及びエフェクター機能を支持し得る。いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体によって誘導される免疫応答を増強することができるが、免疫応答の特異性を変化させない（例えば、相互作用パートナーを発現する細胞に対する免疫応答を誘導しない）。
したがって、一実施形態では、少なくとも１つの細胞がキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、好ましくは相互作用パートナーを発現し、細胞集団が、外因性抗原認識受容体を発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、細胞集団が提供される。
したがって、一実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及びその相互作用パートナーを含む、好ましくは発現する細胞は、好ましくは外因性抗原認識受容体の発現を含む。
或いは、他の実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を含む、好ましくは発現する細胞が存在し、その相互作用パートナーを発現する別個の細胞が存在する。好ましくは外因性抗原認識受容体を発現することを含む細胞は、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現するものと同じであっても、又は相互作用パートナーを発現するものと同じであっても、又は別個のものであってもよい。
或いは、他の実施形態では、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及びその相互作用パートナーを含み、好ましくは発現する少なくとも１つの細胞と、好ましくは外因性抗原認識受容体を発現することを含む少なくとも１つの異なる細胞とを含む細胞集団が提供される。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は標的生物学的結果に寄与しない。
ＭＩＤＩＳタンパク質によって誘導される多方向シグナル伝達は、生物学的機能、例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞、相互作用パートナーを発現する細胞、又はその組合せの標的生物学的機能を調節することができる。一実施形態において、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質によって伝達される少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルは、前記キメラタンパク質及び相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能又はパラメータを調節する（増加又は低減させる）ことができる。本文脈では、生物学的パラメータ及び／又は機能は、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択される。
操作された細胞の標的生物学的機能は、例えば、生存、増殖、免疫エフェクター機能、（例えば、癌細胞に対する）細胞傷害性応答、抗癌応答、細胞分化、細胞脱分化、又は細胞分化転換であり得るか、又はそれらを含み得る。操作された細胞の標的生物学的機能を誘導することができる。操作された細胞の標的生物学的機能を低減することができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞の標的生物学的機能は、抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞によって誘導されるか、又は指向される。例えば、標的生物学的機能が癌細胞に対する細胞傷害性応答を含むいくつかの実施形態では、操作された細胞は、抗原認識受容体（例えば、外因性抗原認識受容体）による抗原の認識に基づくが、相互作用パートナーの発現には基づかずに癌細胞を死滅させることができる。
いくつかの実施形態において、外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質はそれぞれ、操作された細胞の同じ生物学的機能に寄与する。いくつかの実施形態において、外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質は操作された細胞の同じ生物学的機能に寄与しない。いくつかの実施形態において、外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質はそれぞれ、操作された細胞の異なる生物学的機能に寄与する。
いくつかの実施形態では、相互作用パートナーを発現する細胞への曝露時に、操作された細胞の標的生物学的機能は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する細胞よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍長く調節される。
いくつかの実施形態では、相互作用パートナーを発現する細胞への曝露時に、操作された細胞の標的生物学的機能は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍増加する。
一実施形態において、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及びその相互作用パートナーを発現する細胞に曝露されると、前記細胞の増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅は、前記キメラタンパク質を発現しない対応する細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍又は少なくとも１０００倍増加する。
一実施形態では、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に対するキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を発現する細胞集団は、前記細胞の増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅がキメラタンパク質を発現しない対応する細胞集団と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍増加する。
増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅の評価は、当業者に公知のアッセイを使用して行うことができる。そのようなアッセイの例は、実験セクションに開示されている。
いくつかの実施形態では、相互作用パートナーを発現する細胞への曝露時に、操作された細胞の標的生物学的機能は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍低減する。
操作された細胞は哺乳動物細胞であり得る。操作された細胞はヒト細胞であり得る。操作された細胞は免疫細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、免疫細胞、Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔエフェクター細胞、リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、又は好中球である。いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、Ｔ細胞、好ましくはαβＴ細胞又はγδＴ細胞、より好ましくはαβＴ細胞である。いくつかの場合、操作された細胞は初代細胞である。いくつかの場合、操作された細胞は初代細胞ではない。
いくつかの実施形態では、本開示の操作された細胞は、好塩基球、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ系細胞、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、形質細胞、胸腺細胞、又はそれらの細胞の任意の混合物若しくは組合せである。前述の細胞のいずれも、例えば、外因性抗原認識受容体を発現するように、又は本明細書で提供されるポリ核酸を含むように操作することができる。
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ゲノム中の１つ以上の遺伝子の欠失又は破壊、例えばＴＲＡＣ遺伝子、ＴＣＲＢ遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、又はその組合せの欠失又は破壊を含む。
Ｆ．相互作用パートナーを発現する細胞
ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞外リガンドドメインに結合することができる相互作用パートナーを発現する細胞を含む組成物及び方法が本明細書に開示される。
相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能は、例えば、細胞生存、増殖、免疫エフェクター機能、細胞傷害性（（例えば、癌細胞に対する）細胞傷害性応答とも呼ばれる）、抗癌応答（抗腫瘍活性とも呼ばれる）、腫瘍細胞死滅、持続性、細胞分化、細胞脱分化又は細胞分化転換であっても、又はそれらを含んでいてもよい。
一実施形態では、少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルによって改善される生物学的パラメータ及び／又は機能は、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択される。
相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能を誘導することができる。相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能を低減することができる。
いくつかの実施形態において、相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能は、相互作用パートナーを発現する細胞の死（例えば、アポトーシス、ネクロトーシス、又は任意の他の細胞死経路を介する）を含まない。他の実施形態において、相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能は、相互作用パートナーを発現する細胞の死（例えば、アポトーシス、ネクロトーシス、又は任意の他の細胞死経路を介する）を含む。
いくつかの実施形態では、相互作用パートナーを発現する細胞はまた、本明細書に開示される抗原認識受容体（例えば、外因性抗原認識受容体）も発現する。いくつかの実施形態では、相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能は、抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞によって誘導されるか、又は指向される。例えば、いくつかの実施形態では、相互作用パートナーを発現する細胞の生物学的機能が癌細胞に対する細胞傷害性応答を含む場合、相互作用パートナーを発現する細胞は、抗原認識受容体（例えば、外因性抗原認識受容体）による抗原の認識に基づいて癌細胞を死滅させることができる。細胞傷害性応答は、相互作用パートナーを発現しないか、又は低レベルでのみ発現する細胞（例えば、癌細胞）に対する細胞傷害性応答であり得る。
いくつかの実施形態において、外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質はそれぞれ、相互作用パートナーを発現する細胞の同じ生物学的機能に寄与する。いくつかの実施形態において、外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質は、相互作用パートナーを発現する細胞の同じ生物学的機能に寄与しない。いくつかの実施形態において、外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質はそれぞれ、相互作用パートナーを発現する細胞の異なる生物学的機能に寄与する。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞への曝露時に、相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞への暴露時よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍長く調節される。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞への曝露時に、相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞への暴露時と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍増加する。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞への曝露時に、相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞への暴露時と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍低減する。
相互作用パートナーを発現する細胞は、哺乳動物細胞であり得る。相互作用パートナーを発現する細胞は、ヒト細胞であり得る。相互作用パートナーを発現する細胞は、免疫細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の相互作用パートナーを発現する細胞は、免疫細胞、Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔエフェクター細胞、リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、又は好中球である。いくつかの実施形態において、本開示の相互作用パートナーを発現する細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーを発現する細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、内皮細胞又は間質細胞である。いくつかの実施形態において、相互作用パートナーを発現する細胞は、癌細胞である。
いくつかの実施形態では、操作された細胞及び相互作用パートナーを発現する細胞は同じ細胞種である。いくつかの実施形態では、操作された細胞及び相互作用パートナーを発現する細胞は異なる細胞種である。いくつかの実施形態において、操作された細胞及び相互作用パートナーを発現する細胞は、同じ細胞、すなわち、ＭＩＤＩＳタンパク質及び相互作用パートナーを共発現する細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞及び相互作用パートナーを発現する細胞は同じ細胞種ではない。
Ｇ．外因性抗原認識受容体
本開示の操作された細胞は、外因性抗原認識受容体を発現することができ、例えば、外因性抗原認識受容体と本開示のＭＩＤＩＳタンパク質とを共発現することができる。
一実施形態では、細胞は、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、その相互作用パートナー及び外因性抗原認識受容体を含み、好ましくはそれを発現する。そのような細胞を含む細胞集団も本明細書に包含される。
外因性抗原認識受容体は、抗原を認識することができる受容体であり、この受容体は操作された細胞に人工的に導入される。外因性抗原認識受容体の非限定的な例としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＣＲ（ＴＣＲが細胞に人工的に導入される場合、例えば、そうでなければＴＣＲを発現しないか、又は異なるＴＣＲを発現する細胞）が挙げられる。
本開示の文脈では、「ガンマ」、「γ」、及び「ｇ」は、γδＴＣＲのγ鎖を指すために互換可能に使用される。「デルタ」、「δ」、及び「ｄ」は、γδＴＣＲのδ鎖を指すために互換可能に使用される。「アルファ」、「α」、及び「ａ」は、αβＴＣＲのα鎖を指すために互換可能に使用される。「ベータ」、「β」、及び「ｂ」は、αβＴＣＲのβ鎖を指すために互換可能に使用される。
外因性抗原認識受容体はトランスジェニックＴＣＲであり得る。外因性抗原認識受容体は、アルファベータＴＣＲ（例えば、そうでなければアルファ－ベータＴＣＲを発現しない、又は異なるアルファ－ベータＴＣＲを発現する細胞に導入されたアルファベータＴＣＲ）であり得る。外因性抗原認識受容体は、ガンマ－デルタＴＣＲ（例えば、アルファ－ベータＴ細胞等の、そうでなければガンマ－デルタＴＣＲを発現しない細胞、又は異なるガンマ－デルタＴＣＲを発現する細胞に導入されたガンマ－デルタＴＣＲ）であり得る。
αβＴＣＲは、アルファ－ベータＴＣＲとも呼ばれ、２つのタンパク質鎖、Ｔ細胞受容体α及びＴ細胞受容体βから構成され得る。αβＴＣＲは、ＭＨＣ分子に結合したペプチド抗原の複合リガンドを認識する。ＭＨＣ分子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）中の遺伝子によってコードされる高度に多型性の糖タンパク質である。２つのクラスのＭＨＣ分子（クラスＩ及びクラスＩＩ）は、αβＴ細胞の２つの異なる機能クラスを区別するＣＤ８及びＣＤ４分子によって、その非多型（定常）ドメインに結合される。ＣＤ８はＭＨＣクラスＩ分子に結合し；ＣＤ４はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。一態様では、ＴＣＲは、ＴＣＲのアルファ鎖又はＴＣＲのベータ鎖の少なくとも１つであっても、又はそれを含んでいてもよい。γ鎖及びδ鎖から構成される第２の型のＴＣＲは、αβＴＣＲと構造的に類似しているが、非ペプチドリガンドを含む異なるリガンドに結合する。一態様では、ＴＣＲは、ＴＣＲのガンマ鎖又はＴＣＲのデルタ鎖の少なくとも１つであっても、又はそれを含んでいてもよい。
一実施形態では、細胞は、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、その相互作用パートナー、及びキメラ抗原受容体、ＴＣＲ、アルファ－ベータＴＣＲ又はガンマ－デルタＴＣＲである外因性抗原認識受容体を含み、好ましくは発現する。一実施形態では、細胞は、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、その相互作用パートナー及びガンマ－デルタＴＣＲを含み、好ましくは発現するアルファ－ベータＴ細胞である。そのような細胞を含む細胞集団も本明細書に包含される。
いくつかの実施形態では、外因性γδＴＣＲ（ガンマ－デルタＴＣＲとも呼ばれる）をＴ細胞等の細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、外因性γδＴＣＲは、アルファ－ベータＴ細胞又はガンマ－デルタＴ細胞、好ましくはアルファ－ベータＴ細胞に導入される。一態様では、γδＴＣＲを発現する操作された細胞、又はαβＴ細胞等の免疫細胞にγδＴＣＲを導入することを含む方法は、進行癌を有する患者における腫瘍細胞のクローン不均一性を克服することができ、これはαβＴＣＲベースのアプローチを上回る改善である。一態様では、この改善は、γδＴＣＲの異なるＨＬＡ非依存性活性化キュー、例えば脂質代謝の変化を伴う活性化に起因し得る。一態様では、γδＴＣＲ治療薬（例えば、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質も発現する）は、低い突然変異負荷を有する癌を含む対象に投与し得る。いくつかの実施形態では、本開示のガンマ－デルタＴＣＲは、癌細胞上のＣＤ２７７等の標的に結合する。γδＴＣＲ治療薬の結合は、標的上に発現されるＣＤ２７７の空間的及び／又は立体配座変化、例えば１つ以上の代謝産物に応答した立体配座変化の認識を含み得る。いくつかの実施形態では、γδＴＣＲの活性化は、ＢＴＮＡ１、２、又は３ファミリーからの１つ以上のタンパク質を含む複合体への結合を含む。いくつかの実施形態では、γδＴＣＲの活性化は、ＣＤ２７７を含む複合体への結合を含む。いくつかの実施形態では、γδＴＣＲの活性化は、ＣＤ２７７及びＢＴＮ２Ａ１を含む複合体への結合を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２７７の空間的及び／又は立体配座変化を認識し、ＢＴＮＡ１、２、又は３ファミリーからの１つ以上のタンパク質を含む複合体に結合し、ＣＤ２７７を含む複合体に結合し、ＣＤ２７７及びＢＴＮＡ２を含む複合体又はその組合せに結合するγδＴＣＲは、γ９鎖又はその可変領域、及びδ２鎖又はその可変ドメインを含むγδＴＣＲである。
外因性抗原認識受容体がγδＴＣＲである場合、γδＴＣＲは、（ａ）γ２、γ３、γ４、γ５、γ８、γ９及びγ１１からなる群から選択されるγ鎖；（ｂ）δ１、δ２、δ３及びδ５からなる群から選択されるδ鎖；又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）との任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ９鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ４鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。
いくつかの実施形態では、γ鎖はγ２鎖であり、δ鎖はδ１鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ３鎖であり、δ鎖はδ１鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ４鎖であり、δ鎖はδ１鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ５鎖であり、δ鎖はδ１鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ８鎖であり、δ鎖はδ１鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ９鎖であり、δ鎖はδ１鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ１１鎖であり、δ鎖はδ１鎖である。
いくつかの実施形態では、γ鎖はγ２鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ３鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ４鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ５鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ８鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ９鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ１１鎖であり、δ鎖はδ２鎖である。
いくつかの実施形態では、γ鎖はγ２鎖であり、δ鎖はδ３鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ３鎖であり、δ鎖はδ３鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ４鎖であり、δ鎖はδ３鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ５鎖であり、δ鎖はδ３鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ８鎖であり、δ鎖はδ３鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ９鎖であり、δ鎖はδ３鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ１１鎖であり、δ鎖はδ３鎖である。
いくつかの実施形態では、γ鎖はγ２鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ３鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ４鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ５鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ８鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ９鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。いくつかの実施形態では、γ鎖はγ１１鎖であり、δ鎖はδ５鎖である。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、γ鎖由来の可変ドメイン及び／又はδ鎖由来の可変ドメインを含む。可変ドメインは、γ鎖及びδ鎖の名称に先行するＶ、例えばＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１１、Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３、及びＶδ５によって示すことができる。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体がγδＴＣＲである場合、ＴＣＲは、（ａ）Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、及びＶγ１１からなる群から選択されるγ鎖の可変ドメイン；（ｂ）Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３及びＶδ５からなる群から選択されるδ鎖の可変ドメイン；又は（ｃ）例えば、γ鎖及びδ鎖について本明細書に示されるような、（ａ）及び（ｂ）の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、γ鎖可変ドメインはＶγ９であり、δ鎖可変ドメインはＶδ２である。いくつかの実施形態では、γ鎖可変ドメインはＶγ４であり、δ鎖可変ドメインはＶδ５である。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、γ鎖由来の定常ドメイン及び／又はδ鎖由来の定常ドメインを含む。定常ドメインは、γ鎖及びδ鎖の名称に先行するＣ、例えばＣγ１、Ｃγ２及びＣδによって示すことができる。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体がγδＴＣＲである場合、ＴＣＲは、（ａ）Ｃγ１及びＣγ２からなる群から選択されるγ鎖の定常ドメイン；（ｂ）δ鎖Ｃδの定常ドメイン；又は（ｃ）例えば、γ鎖及びδ鎖について本明細書に示されるような（ａ）及び（ｂ）の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、γ鎖定常ドメインはＣγ１であり、δ鎖定常ドメインはＣδである。いくつかの実施形態では、γ鎖定常ドメインはＣγ２であり、δ鎖定常ドメインはＣδである。
外因性抗原認識受容体は、Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ又はその機能性断片を含むことができる。Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲは、細胞（例えば腫瘍細胞）の細胞表面上のＣＤ２７７タンパク質を認識することができるγ－ＴＣＲアミノ酸配列又はδ－ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つを含むことができる。いくつかの実施形態では、受容体は、標的細胞の細胞表面上のＣＤ２７７タンパク質を認識することができるγ－ＴＣＲアミノ酸配列又はδ－ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つのバリアント又は断片を含む。本開示は、ＣＤ２７７細胞表面分子を介して細胞（例えば腫瘍細胞）を認識することができるγδＴＣＲの任意の部分又は断片又は変形例を含む外因性抗原認識受容体を企図する。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、標的細胞の細胞表面上のＥＰＣＲタンパク質を認識することができるγ－ＴＣＲアミノ酸配列及び／又はδ－ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つのバリアント又は断片を含む。本開示は、ＥＰＣＲ細胞表面分子を介して細胞（例えば腫瘍細胞）を認識することができるγδＴＣＲの任意の部分又は断片又は変形例を含む外因性抗原認識受容体を企図する。そのようなγδＴＣＲの可変ドメイン及びＣＤＲ３領域を表６：配列番号１０１～１０２に示す。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、標的細胞の細胞表面上のアネキシンＡ２を認識することができるγ－ＴＣＲアミノ酸配列及び／又はδ－ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つのバリアント又は断片を含む。本開示は、アネキシンＡ２表面分子を介して細胞（例えば腫瘍細胞）を認識することができるγδＴＣＲの任意の部分又は断片又は変形例を含む外因性抗原認識受容体を企図する。そのようなγδＴＣＲの可変ドメイン及びＣＤＲ３領域を表６：配列番号１３０及び１３１に示す。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、標的細胞の細胞表面上の異常なＨＬＡタンパク質発現を認識することができるγ－ＴＣＲアミノ酸配列及び／又はδ－ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つのバリアント又は断片を含む。本開示は、細胞表面上の異常なＨＬＡタンパク質発現を介して細胞（例えば腫瘍細胞）を認識することができるγδＴＣＲの任意の部分又は断片又は変形例を含む外因性抗原認識受容体を企図する。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、ＭＨＣ非拘束的に癌を認識することができるγ－ＴＣＲアミノ酸配列及び／又はδ－ＴＣＲアミノ酸配列の少なくとも１つのバリアント又は断片を含む。そのようなγδＴＣＲの可変ドメイン及びＣＤＲ３領域を表６：配列番号８２及び８５に示す。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、γδＴＣＲのＣγ又はＣδ領域の少なくとも一部及びＶγ又はＶδ領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、γδＴＣＲのＣγ又はＣδ領域の少なくとも一部と、Ｖγ又はＶδドメインの少なくともＣＤＲ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体はＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲの全てのＣＤＲ領域を含み、全てのＣＤＲ領域は細胞の表面上の細胞表面分子（例えば、ＣＤ２７７分子）への結合に関与し得る。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体はＶγ４Ｖδ５ ＴＣＲの全てのＣＤＲ領域を含み、全てのＣＤＲ領域は細胞の表面上の細胞表面分子（例えば、ＥＰＣＲ分子）への結合に関与し得る。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体はＶγ５Ｖδ１ ＴＣＲの全てのＣＤＲ領域を含み、全てのＣＤＲ領域は細胞の表面上の細胞表面分子（例えばＨＬＡ分子）への結合に関与し得る。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体はＶγ８Ｖδ３ ＴＣＲの全てのＣＤＲ領域を含み、全てのＣＤＲ領域は細胞の表面上の細胞表面分子（例えばアネキシンＡ２）への結合に関与し得る。
本開示の組成物及び方法、並びにそれらの配列に有用なガンマ－デルタＴＣＲは、例えば、特許出願国際公開第２０１３１４７６０６ Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１７２１２０７４ Ａ１号パンフレット、及び国際公開第２０１８２１１１１５ Ａ１号パンフレットに開示されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの配列は表６で特定されている。
本開示の外因性抗原認識受容体が含み得るか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる配列の非限定的な例を表６に示す。いくつかの場合、γδＴＣＲは、表６から選択されるγ鎖（Ｇ）、δ鎖（Ｄ）、可変ドメイン（ＴＲＧ、ＴＲＤ）、それ由来のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）配列、定常ドメイン（ＴＲＤＣ、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２）、又はその組合せをコードする配列を含む。適切なＴＲＤＣの一例は配列番号１３４によって表され、適切なＴＲＧＣ１の一例は配列番号１３５によって表され、適切なＴＲＧＣ２の一例は配列番号１３６によって表される。配列の例は公開されている（Ｇｒｕｅｎｄｅｒ Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２０１２；１２０（２６）：５１５３－５１６２．ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１２－０５－４３２４２７）。いくつかの場合、外因性抗原認識受容体は、表６の配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大約１００％の配列同一性を有する配列（例えば、ＣＤＲ３領域配列）を含む。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号９０又は配列番号１１１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるデルタ鎖を含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号９１又は配列番号１１２と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるガンマ鎖を含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号８４又は配列番号１０２と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるデルタ鎖ＣＤＲ３領域を含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号８７又は配列番号１０１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるガンマ鎖ＣＤＲ３領域を含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号９０と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるデルタ鎖と、配列番号９１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるガンマ鎖とを含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号８４と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるデルタ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号８７と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるガンマ鎖ＣＤＲ３領域とを含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号１１１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるデルタ鎖と、配列番号１１２と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるガンマ鎖とを含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号１０２と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるデルタ鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号１０１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるガンマ鎖ＣＤＲ３領域とを含むガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞受容体である。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号１９８、２１５、及び２１９から選択される配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるベータ鎖を含むアルファ－ベータ（αβ）Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号１９９、２１４、及び２１８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるアルファ鎖を含むアルファ－ベータ（αβ）Ｔ細胞受容体である。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号２１１、２１７、及び２２１から選択される配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるベータ鎖ＣＤＲ３領域を含むアルファ－ベータ（αβ）Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、配列番号２１０、２１６、及び２２０から選択される配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表されるアルファ鎖ＣＤＲ３領域を含むアルファ－ベータ（αβ）Ｔ細胞受容体である。
外因性抗原認識受容体は、出願時に公知の任意のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラ免疫受容体、又はキメラＴ細胞受容体としても公知であり、細胞外標的化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲは一般的に、ＣＡＲを発現する操作された細胞においてシグナル伝達を誘導するが、ＣＡＲによって認識される細胞では誘導しない。ＣＡＲは、少なくとも第１の標的化ドメインを含み得る。ＣＡＲ標的化ドメインの非限定的な例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はその機能的誘導体、バリアント若しくは断片が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、及び単鎖抗体、例えば重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ＤＡＲＰｉｎ、モノボディ、ナノボディ、アフィボディ、非抗体ドメイン、及びその任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。非抗体ＣＡＲ標的化ドメインは、受容体又は受容体リガンドに由来するか、又はそれから得られてもよく、例えば、ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡを標的化するために使用され得る。ＣＡＲは、一般的に、標的化ドメイン、ヒンジドメイン（Ｈ）又はスペーサ、細胞膜への固定を提供する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及びＴ細胞活性化を担うシグナル伝達ドメインを含み得る。
一態様では、ＣＡＲはヒンジをさらに含む。ヒンジは、ＣＡＲの任意の領域に位置することができる。一態様では、ヒンジは、標的化領域と膜貫通領域との間に位置する。別の態様では、対象ＣＡＲはヒンジ又はスペーサを含む。ヒンジ又はスペーサは、標的化部分と膜貫通ドメインとの間のセグメントを指すことができる。いくつかの実施形態では、ヒンジを使用して、標的化部分、例えばｓｃＦｖに柔軟性を提供することができる。いくつかの実施形態では、例えばｓｃＦｖを検出するための抗体が機能的でないか又は利用可能でない場合、ヒンジを使用して細胞の表面上のＣＡＲの発現を検出することができる。いくつかの場合、ヒンジは免疫グロブリン分子に由来し、標的上の第１のエピトープ又は第２のエピトープの位置に応じて最適化を必要とし得る。いくつかの場合、ヒンジは免疫グロブリン分子に属さず、代わりにＣＤ８アルファ分子の天然ヒンジなどの別の分子に属し得る。ＣＤ８アルファヒンジは、多くの場合、ＣＤ８共受容体とＭＨＣ分子との相互作用において役割を果たすシステイン及びプロリン残基を含むことができる。
ＣＡＲの標的化部分は、膜貫通ドメインを介して細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。膜貫通ドメインは、膜貫通セグメントであり得る。対象ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞、例えば操作された細胞の細胞膜にＣＡＲを固定することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通セグメントはポリペプチドを含む。標的化部分とＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ポリペプチドは、任意の適切なポリペプチド配列を有することができる。いくつかの場合、膜貫通ポリペプチドは、内因性又は野生型膜貫通タンパク質の膜貫通部分のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、内因性又は野生型膜貫通タンパク質の膜貫通部分と比較して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、ポリペプチドリンカーの配列などの非天然ポリペプチド配列を含む。ポリペプチドリンカーは、可撓性又は剛性であり得る。ポリペプチドリンカーは、構造化されていても構造化されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、細胞外標的化部分からのシグナルをＣＡＲの細胞内領域に伝達する。一態様では、対象ＣＡＲは、標的化部分を細胞内領域に接続する膜貫通領域を含み得る。膜貫通領域は、外因性細胞膜貫通領域に由来し得るか、又はそこから得ることができる。様々な膜貫通領域が当技術分野で公知であり、免疫細胞受容体に由来し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１及び／又はＣＤ１５２に由来する。ＣＤ２８の天然の膜貫通部分をＣＡＲにおいて使用することができる。他の場合において、ＣＤ８アルファの天然の膜貫通部分もまた、対象ＣＡＲにおいて使用し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、ＴＣＲのアルファ鎖に由来する。一態様では、膜貫通ドメインはＣＤ８に由来し、ＣＤ８αである。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞シグナル伝達に関与するシグナル伝達ドメイン又はその任意の誘導体、バリアント若しくは断片を含み得る。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む操作された細胞の活性を誘導することができる。通常、他の分子のシグナル伝達ドメインをＣＡＲに使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。いくつかの場合、シグナル伝達ドメインの切断部分は、本明細書中に提供される操作された細胞のＣＡＲにおいて使用される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞シグナル伝達に関与する複数のシグナル伝達ドメイン、又はその任意の誘導体、バリアント若しくは断片を含む。ＣＡＲにおいて使用される細胞内シグナル伝達ドメインは、刺激又は阻害方法のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化の調節に関与し得る。ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体のものであり得る。ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４５、ＣＤ４６、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）、ＣＤ２４７ζ、ＣＤ２４７η、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦＹＮ、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＭＡＰＫ、ＭＨＣ複合体、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＰＬＣ－γ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄ、及びＺａｐ７０のシグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲシグナル伝達ドメインは免疫受容体チロシン活性化モチーフ又はＩＴＡＭを含む。ＩＴＡＭを含むＣＡＲシグナル伝達ドメインは、６～８個のアミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの反復を含むことができ、ここで、各ｘは独立して任意のアミノ酸であり、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉを生成する。ＩＴＡＭを含むＣＡＲシグナル伝達ドメインは、例えば、標的化部分がエピトープに結合している場合、リン酸化によって改変され得る。リン酸化ＩＴＡＭは、他のタンパク質、例えば様々なシグナル伝達経路に関与するタンパク質のドッキング部位として機能することができる。いくつかの実施形態において、初代ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、天然のＩＴＡＭドメインと比較して、活性が変化した（例えば、増加又は低減した）、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば変異、切断及び／又は最適化されたＩＴＡＭドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインはＦｃγＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃγＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）から選択することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインはＦｃεＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃεＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲＩ及びＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）から選択し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインはＦｃαＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃαＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）及びＦｃα／μＲから選択し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、初代ＣＡＲシグナル伝達ドメインはＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む。
いくつかの実施形態において、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは免疫受容体チロシン系の阻害モチーフ又はＩＴＩＭを含む。ＩＴＩＭを含むシグナル伝達ドメインは、免疫系のいくつかの阻害性受容体の細胞質尾部に見られるアミノ酸の保存された配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）を含み得る。ＩＴＩＭを含む一次ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、Ｓｒｃキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｌｃｋ）などの酵素によって修飾、例えばリン酸化され得る。リン酸化に続いて、酵素を含む他のタンパク質をＩＴＩＭにリクルートすることができる。これらの他のタンパク質としては、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２等の酵素、ＳＨＩＰと呼ばれるイノシトールホスファターゼ、並びに１つ異常のＳＨ２ドメインを有するタンパク質（例えば、ＺＡＰ７０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＢＴＬＡ、ＣＤ５、ＣＤ３１、ＣＤ６６ａ、ＣＤ７２、ＣＭＲＦ３５Ｈ、ＤＣＩＲ、ＥＰＯ－Ｒ、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、Ｆｃ受容体様タンパク質２（ＦＣＲＬ２）、Ｆｃ受容体様タンパク質３（ＦＣＲＬ３）、Ｆｃ受容体様タンパク質４（ＦＣＲＬ４）、Ｆｃ受容体様タンパク質５（ＦＣＲＬ５）、Ｆｃ受容体様タンパク質６（ＦＣＲＬ６）、タンパク質Ｇ６ｂ（Ｇ６Ｂ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、ＩＲＴＡ１（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ １）、ＩＲＴＡ２（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ１（ＫＩＲ２ＤＬ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ２（ＫＩＲ２ＤＬ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ３（ＫＩＲ２ＤＬ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ４（ＫＩＲ２ＤＬ４）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ５（ＫＩＲ２ＤＬ５）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＲ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＲ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー３（ＬＩＲ３）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー５（ＬＩＲ５）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー８（ＬＩＲ８）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ－１）、肥満細胞機能関連抗原（ＭＡＦＡ）、ＮＫＧ２Ａ、天然細胞傷害性トリガー受容体２（ＮＫｐ４４）、ＮＴＢ－Ａ、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＰＩＬＲ、ＳＩＧＬＥＣＬ１、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン２（ＳＩＧＬＥＣ２又はＣＤ２２）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３（ＳＩＧＬＥＣ３又はＣＤ３３）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（ＳＩＧＬＥＣ５又はＣＤ１７０）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン６（ＳＩＧＬＥＣ６）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ７）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１０（ＳＩＧＬＥＣ１０）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１１（ＳＩＧＬＥＣ１１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン４（ＳＩＧＬＥＣ４）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン８（ＳＩＧＬＥＣ８）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（ＳＩＧＬＥＣ９）、血小板・内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ－１）、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ２）、シグナル閾値調節膜貫通アダプター１（ＳＩＴ）のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＩＭ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、天然のＩＴＩＭドメインと比較して、活性が変化した（例えば、増加又は低減した）、改変されたＩＴＩＭドメイン、例えば変異、切断及び／又は最適化されたＩＴＩＭドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは少なくとも２つのＩＴＡＭドメイン（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０のＩＴＡＭドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは少なくとも２つのＩＴＩＭドメイン（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０のＩＴＩＭドメイン）（例えば、少なくとも２つの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインはＩＴＡＭドメインとＩＴＩＭドメインの両方を含む。一態様では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）、ＣＤ２４７ζ、ＣＤ２４７η、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦＹＮ、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＭＡＰＫ、ＭＨＣ複合体、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＰＬＣ－γ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄ及びＺａｐ７０に由来する。別の態様では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及び／又はＣＤ３εに由来する。別の態様では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。
いくつかの場合、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、例えば細胞共刺激分子からのＣＡＲ共刺激ドメインは、例えば操作された細胞活性の活性化及び／又は不活性化のための、ＩＴＡＭ及び／又はＩＴＩＭドメインからのシグナル伝達などの操作された細胞シグナル伝達のための共刺激シグナルを提供することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ共刺激ドメインは、操作された細胞における増殖及び／又は生存シグナルを調節するように操作可能である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ共刺激シグナル伝達ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、又はＴｏｌｌリガンド受容体のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ共刺激ドメインは：２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１５０、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２００、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＣＤ４、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４６、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５、ＣＤ５３、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ－４、ＤＡＰ１２、Ｄｅｃｔｉｎ－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＥｐｈＢ６、ＧＡＤＳ、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、Ｉｋａｒｏｓ、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＩＰＯ－３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＴ、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＬＴＢＲ、Ｌｙ１０８、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ－１、ＰＤＣＤ６、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＳＧＬ１、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１）、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、ＶＬＡ１、及びＶＬＡ－６からなる群から選択される分子のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ共刺激ドメインは、ＣＤ３及びＣＤ２８からなる群より選択される分子のシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、複数の共刺激ドメイン、例えば少なくとも２つ、例えば少なくとも３、４、又は５つの共刺激ドメインを含む。一態様では、ＣＡＲは、少なくとも２つ又は３つの共刺激ドメインを含む。一態様では、ＣＡＲは少なくとも２つの共刺激ドメインを含み、少なくとも２つの共刺激ドメインはＣＤ２８及びＣＤ１３７である。一態様では、ＣＡＲは少なくとも３つの共刺激ドメインを含み、少なくとも３つの共刺激ドメインはＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＯＸ４０である。共刺激シグナル伝達領域は、一次エフェクター活性化シグナルと相乗的なシグナルを提供し得、Ｔ細胞の活性化のための要件を完了し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲへの共刺激ドメインの付加は、本明細書に提供される操作された細胞の有効性及び持続性を増強することができる。
ＣＡＲは、癌に関連する抗原、例えば癌において過剰発現される抗原、又はネオ抗原に結合するＣＡＲであり得る。いくつかの場合、ＣＡＲはＣＤ１９を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＢＣＭＡを標的とする。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４１ＢＢ及びＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ１９．ＢＢ．Ｚ）を有するＣＤ８ストーク及び膜貫通ドメインに連結された抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ１９．２８．Ｚ）を有するＣＤ２８ストーク及び膜貫通ドメインに連結された抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４１ＢＢ及びＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＥＧＦＲ．ＢＢ．ｚ）を有するＣＤ８ストーク及び膜貫通ドメインに連結された抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ．ｚ）を含む。そのようなＣＡＲの非限定的な例は、国際公開第２０１９／１５７５３３号パンフレット、Ｂｌｏｅｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １６；２３８－２５４及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１１；；５９２７－５９３３に記載されており、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１８４、２１２、２１３及び２２２から選択される配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％の配列同一性又は類似性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体は：７０７－ＡＰ、ビオチン化分子、ａ－アクチニン－４、ａｂｌ－ｂｃｒ ａｌｂ－ｂ３（ｂ２ａ２）、ａｂｌ－ｂｃｒ ａｌｂ－ｂ４（ｂ３ａ２）、アディポフィリン、ＡＦＰ、ＡＩＭ－２、アネキシンＩＩ、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ｂ－カテニン、ｂｃｒ－ａｂｌ、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ１９０（ｅ１ａ２）、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ２１０（ｂ２ａ２）、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ２１０（ｂ３ａ２）、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＧ－３、ＣＡＩＸ、ＣＡＭＥＬ、カスパーゼ－８、ＣＤ１７１、ＣＤ２７７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ－４、ＣＥＡ、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ－１０、ＤＡＭ－６、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥＬＦ２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－Ｂ３、ｅｒｂ－Ｂ４、ＥＳ－ＥＳＯ－１ａ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＦＧＦ－５、ＦＮ、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇｐ１００、ｇｐ７５、Ｈｅｒ－２、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２（ＦＧＦ６）、ＨＳＴ－２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ＫＤＲ、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ＲＡＳ、Ｌ１細胞接着分子、ＬＡＧＥ－１、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－１０、ＭＡＧＥ－１２、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン－Ａ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＲＴ－２、ＭＣ１Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン、ＮＡ８８－Ａ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＰＭ／ＡＬＫ、Ｎ－ＲＡＳ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＡ１、ＯＧＴ、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＯＳ－９、Ｐポリペプチド、Ｐ１５、Ｐ５３、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＧＥ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、ＳＯＸ１０、ＳＳＸ－２、サバイビン、サバイビン－２Ｂ、ＳＹＴ／ＳＳＸ、ＴＡＧ－７２、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦａＲＩＩ、ＴＧＦｂＲＩＩ、ＴＰ１、ＴＲＡＧ－３、ＴＲＧ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＲＰ－２－６ｂ、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ１、α－葉酸受容体及びκ軽鎖からなる群から選択される癌関連抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体はネオ抗原又はネオエピトープに結合する。例えば、ネオ抗原は、ＥＲＢＢ２ＩＰにおけるＥ８０５Ｇ変異であり得る。ネオ抗原及びネオエピトープは、場合によっては全エクソームシーケンシングによって同定することができる。ネオ抗原及びネオエピトープ標的は、癌細胞によって発現され得る。いくつかの場合において、ネオ抗原又はネオエピトープを生じさせる変異を含み得る遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＣＯＩ １９９７、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＬＰＰＬ２、ＡＮＡＰＣ１、ＡＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲ、ＡＲ－ｖ７、ＡＳＣＬ２、β２Ｍ、ＢＲＡＦ、ＢＴＫ、Ｃ１５ＯＲＦ４０、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ６、ＣＮＯＴ１、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＤＣＴ、ＤＫＫ４、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１ＤＰ３、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ２Ｂ３、ｅｎｖ、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＳＲＰ１、ＦＡＭ１１ ＩＢ、ＦＧＦＲ３、ＦＲＧ１Ｂ、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ１０、ＧＡＴＡ３、ＧＢＰ３、ＨＥＲ２、ＩＤＨ１、ＪＡＫ１、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＭＡＮ１、ＭＡＢＥＢ １６、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＢ１７，ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＣ１、ＭＥＫ、ＭＬＡＮＡ、ＭＬＬ２、ＭＭＰ１３、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＲＡＳ、ＮＹ－ＥＳＯ、ＰＡＧＥ２、ＰＡＧＥ５、ＰＤＧＦＲａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＭＥＬ、ｐｏｌタンパク質、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＢＭ２７、ＲＮＦ４３、ＲＰＬ２２、ＲＵＮＸ１、ＳＥＣ３１Ａ、ＳＥＣ６３，ＳＦ３Ｂ１，ＳＬＣ３５Ｆ５、ＳＬＣ４５Ａ２、ＳＭＡＰ１、ＳＰＯＰ、ＴＦＡＭ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＡＰ５、ＴＰ５３、ＴＴＫ、ＴＹＲ、ＵＢＲ５、ＶＨＬ、ＸＰＯＴであり得る。
癌抗原の非限定的な例を表７に示す。
外因性抗原認識受容体は、１つのベクターを介して、又は異なるベクターを使用して、操作された細胞に導入することができる。外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質は、１つの転写物（例えば、１つ以上の自己切断性ペプチド配列によって分離される）又は異なる転写物として発現され得る。外因性抗原認識受容体及びＭＩＤＩＳタンパク質は、同じプロモーター又は異なるプロモーターの制御下で作動可能に連結され得る。自己切断性ペプチド配列及びプロモーターは、本明細書において後述される。
いくつかの場合において、外因性抗原認識受容体は、抗原ベースの活性化が起こるためにＭＨＣによって提示される抗原を必要とする。いくつかの場合において、外因性抗原認識受容体は、抗原ベースの活性化が起こるためにＭＨＣによって提示される抗原を必要としない。
一態様では、操作された細胞は、内因性細胞受容体と比較してより高い割合の外因性抗原認識受容体を含み得る。特定の場合には、より高い比率は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞の優先的増殖によって達成することができ、例えば、γδＴＣＲ－操作された細胞の（γδ）単一ＴＣＲ陽性表現型をもたらす。
一実施形態では、操作された細胞は、操作されていない他の点では同等の細胞（例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない）と比較して、αβＴＣＲに対するγδＴＣＲのより高い比を含む。一実施形態では、操作された細胞は、操作されていない、他の点では同等の細胞と比較して、αβＴＣＲに対するγ９δ２ＴＣＲのより高い比を含む。一実施形態において、操作された細胞がＭＩＤＩＳタンパク質を含む場合、主に（γδ）単一ＴＣＲ陽性表現型が、操作された細胞の長寿命と組み合わせて達成され得る。
本開示の操作された細胞のいずれも、対応する操作されていない細胞よりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍又は３００倍高い内因性細胞受容体に対する外因性抗原認識受容体の比を含み得る。一実施形態では、操作された細胞は、対応する操作されていない細胞よりも少なくとも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍高い内因性細胞受容体に対する外因性抗原認識受容体の比を含む。
本開示の操作された細胞は、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１ １５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１又は３００：１である内因性細胞受容体に対する外因性抗原認識受容体の比を含み得る。
いくつかの場合、操作された細胞は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現し、外因性抗原認識受容体を発現しない。いくつかの場合、操作された細胞は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現するが外因性抗原認識受容体を発現しないように操作された腫瘍浸潤リンパ球である。
Ｈ．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞
本開示の組成物及び方法は、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する１つ以上の細胞を含むことができる。例えば、外因性抗原認識受容体は癌抗原に結合することができ、癌細胞は、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞（例えば、標的細胞）であり得る。
本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に対する操作された細胞の応答を調節（例えば、増加又は低減）することができる。
ＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞への曝露時に、外因性抗原認識受容体を発現する操作された細胞の増殖を調節することができる。ＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞への曝露時に、外因性抗原認識受容体を発現する操作された細胞の増殖を増加させることができる。例えば、操作された細胞の集団を、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に曝露すると、操作された細胞の集団の増殖は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない操作された細胞の対応する集団と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍増加し得る。
ＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞の死滅を調節することができる。ＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞の死滅を増加させることができる。例えば、操作された細胞の集団を、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に曝露すると、外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞の死滅は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない操作された細胞の対応する集団への曝露と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍増加し得る。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞への操作された細胞の集団の曝露時に、抗原を発現又は提示する細胞の少なくとも５０％を死滅させる操作された細胞の能力は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない操作された対応する細胞の集団への曝露時よりも少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１４日、少なくとも２１日、又は少なくとも２８日長く持続する。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞への操作された細胞の集団の曝露時に、抗原を発現又は提示する細胞の少なくとも２５％を死滅させる操作された細胞の能力は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない操作された対応する細胞の集団への曝露時よりも少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１４日、少なくとも２１日、又は少なくとも２８日長く持続する。
いくつかの実施形態では、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞への操作された細胞の集団の曝露時に、抗原を発現又は提示する細胞の少なくとも７５％を死滅させる操作された細胞の能力は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない操作された対応する細胞の集団への曝露時よりも少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１４日、少なくとも２１日、又は少なくとも２８日長く持続する。
いくつかの実施形態では、操作された細胞の集団を、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に少なくとも５日間曝露すると、操作された細胞の集団による疲弊マーカーの発現は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない、対応する操作された細胞の集団への曝露と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍低い。
いくつかの実施形態では、操作された細胞の集団を、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に少なくとも１０日間曝露すると、操作された細胞の集団による疲弊マーカーの発現は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない、対応する操作された細胞の集団への曝露と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍低い。
いくつかの実施形態では、操作された細胞の集団を、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に少なくとも１５日間曝露すると、操作された細胞の集団による疲弊マーカーの発現は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない、対応する操作された細胞の集団への曝露と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍低い。
ＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞に応答して免疫エフェクター分子の産生を調節することができる。ＭＩＤＩＳタンパク質は、外因性抗原認識受容体によって認識される抗原を発現又は提示する細胞に応答して免疫エフェクター分子の産生を増加させることができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞の集団を、外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に曝露すると、操作された細胞の集団による免疫エフェクター分子の産生は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞の集団よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍高い。
Ｉ．操作された細胞を作製する方法
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。そのようなポリヌクレオチドは、相互作用パートナーをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのようなポリヌクレオチドはまた、外因性抗原認識受容体をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。本文脈において、好ましい外因性抗原認識受容体はガンマ－デルタＴＣＲである。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及び外因性抗原認識受容体を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及びガンマ－デルタＴＣＲを含む。
一実施形態では、１つの単一レンチウイルスベクターは、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及びガンマ－デルタＴＣＲを含む前記ポリヌクレオチドを含む。このレンチウイルスベクターは、トリシストロン性配列と、実験部分で使用される３つのタンパク質配列を連結する２Ａ自己切断性ペプチド配列とを含む（Ｘｕ Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２０１９），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，６８：１９７９－１９９３及びＰｉｎｃｈａ Ｍ．ｅｔ ａｌ，（２０１１），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：７５０－７６４）。２Ａ自己切断性ペプチド配列は、本明細書においてさらに後述される。
一実施形態において、第１のポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲのガンマ鎖をコードし、続いて、本明細書中に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、次いで、ＴＣＲのデルタ鎖をコードするポリヌクレオチド配列が続く。
一実施形態において、第１のポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲのデルタ鎖をコードし、続いて、本明細書中に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、次いで、ＴＣＲのガンマ鎖をコードするポリヌクレオチド配列が続く。
ＴＣＲの好ましいガンマ鎖及びデルタ鎖並びに好ましいキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、本明細書において開示されている。
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表２０で特定される配列番号１４０～１７１、１８５～１８６、又は１８９～１９０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％若しくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって表される。表２０はまた、配列番号１４０～１７１、１８５～１８６、又は１８９～１９０のそれぞれによってコードされ、いくつかの特定の例示的なキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質を表すアミノ酸配列（配列番号）を特定する。
或いは、そのようなポリヌクレオチドは、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及び相互作用パートナーをコードするヌクレオチド配列を含んでいてよく、外因性抗原認識受容体をコードするヌクレオチド配列を含まない。
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。そのようなベクターは、相互作用パートナーをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのようなベクターはまた、外因性抗原認識受容体をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。本文脈において、好ましい外因性抗原認識受容体はガンマ－デルタＴＣＲである。或いは、そのようなベクターは、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質及び相互作用パートナーをコードするヌクレオチド配列を含んでいてよく、外因性抗原認識受容体をコードするヌクレオチド配列を含まない。
そのようなベクターはウイルスベクターであり得る。適切なベクターは、本明細書において後に開示される。
いくつかの実施形態では、操作された細胞を作製する方法が本明細書に開示される。本方法は、細胞の集団中の少なくとも１つの細胞において本開示のＭＩＤＩＳタンパク質を発現させること、及び操作された細胞の集団の増殖に適した条件で細胞の集団を培養することを含み得る。
操作された細胞において本開示のＭＩＤＩＳタンパク質を発現させることは、例えば、操作された細胞の適応性、増殖、生存及び／又はエフェクター機能を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、操作された細胞を増殖させる従来の方法と比較して、刺激なしで、又は減少した刺激で長期間培養することができ、ＭＩＤＩＳタンパク質は細胞集団の増殖及び適合性を支持することができる。例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質は、操作された細胞の生存及び増殖を支持するために必要なシグナル伝達を提供し、外因性刺激剤の必要性を低減又は排除することができる。
いくつかの実施形態では、操作された細胞を作製する方法は、例えば表面に固定化された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合性断片、又は抗ＣＤ２抗体との接触による、又は場合によってカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣアクチベータ（例えば、ブリオスタチン）との接触による刺激を含み得る。Ｔ細胞の表面上の補助分子の共刺激のために、補助分子に結合するリガンドを使用することができる。いくつかの場合、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激することができる条件下で、ＣＤ３－ＣＤ２８共刺激することができる、例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。
Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清を含む、増殖及び生存率に必要な因子を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０、ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）又はＸ－ｖｉｖｏ ５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。いくつかの場合では、無血清培地が使用される。一態様では、細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ ＣＯ２）で維持することができる。
Ｔ細胞は、一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載されるような方法を使用して活性化及び増殖させることができ、これらは、そのような開示のために参照により組み込まれる。
細胞は、操作された細胞を作製するための任意の適切な供給源から得ることができる。細胞は初代細胞であり得る。細胞は組換え細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多くの非限定的な供給源から得ることができる。細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、又は感染症と診断された患者に由来し得る。細胞は、細胞療法バンクから得ることもできる。細胞はまた、対象の全食物、アフェレーシス又は腫瘍試料から得ることができる。細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり得る。いくつかの場合には、アフェレーシスは白血球アフェレーシスであり得る。
望ましい細胞集団はまた、改変前に選択され得る。選択は、磁気分離、フローサイトメトリー選択、抗生物質選択の少なくとも１つを含むことができる。１つ以上の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、単球又はマクロファージ等の任意の血液細胞であり得る。１つ以上の細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔエフェクター細胞、リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、又は好中球などの任意の免疫細胞、好ましくはアルファ－ベータＴ細胞又はガンマ－デルタＴ細胞、より好ましくはアルファ－ベータＴ細胞であり得る。
操作された細胞を作製する方法は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、例えば、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質、及び／又は外因性抗原認識受容体をコードする核酸配列導入するためのベクターの使用を含み得る。ベクターは、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律単位（すなわち、それ自体の制御下で複製することができる）として又は他のポリヌクレオチドセグメントが結合した細胞染色体への挿入によって複製可能にされ、結合したセグメントの複製及び／又は発現をもたらす、挙動する任意の遺伝要素、例えばプラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであり得る。適切なベクターには、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ及びコスミドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞へのベクターのライゲーション又は挿入を行い、結合したセグメントの発現に影響を及ぼすために必要なポリヌクレオチド配列を含むことができる。そのような配列は、宿主生物に応じて異なり；それらは、転写を行うためのプロモーター配列、転写を増加させるためのエンハンサー配列、リボソーム結合部位配列並びに転写及び翻訳終結配列を含む。或いは、発現ベクターは、宿主細胞ＤＮＡ配列へのベクターのライゲーション又は組込みなしに、その中にコードされる核酸配列産物を直接発現することができる。ベクターは、選択マーカー遺伝子を含むことができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することができ、適切な選択圧の存在下で宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する「エピソーム発現ベクター」又は「エピソーム」である。
本明細書に記載の方法及び組成物に有用なポリヌクレオチドベクターは、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）適合ベクターであり得る。例えば、ＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターよりも純粋であり得る。いくつかの場合には、バイオバーデンによって純度を測定することができる。例えば、バイオバーデンは、ベクター組成物中の好気性、嫌気性、胞子形成菌、真菌、又はその組合せの存在又は非存在であり得る。いくつかの場合、純粋なベクターは、低エンドトキシン又はエンドトキシン非含有であり得る。純度はまた、二本鎖プライマー歩行シーケンシングによって測定することができる。プラスミド同一性は、ベクターの純度を決定するための供給源であり得る。本発明のＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターよりも１０％～９９％純粋であり得る。ＧＭＰベクターは、バイオバーデンの存在、エンドトキシン、シーケンシング、又はその組合せによって測定した場合、非ＧＭＰベクターよりも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％純粋であり得る。
様々な酵素が、外来ＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入を触媒することができる。遺伝子編集ツール及び技術の非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬ、及びトランスポゾンベースのシステムが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲシステムを利用して、膜タンパク質又はその成分をコードするポリヌクレオチド配列の細胞ゲノムへの挿入を促進することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ゲノム内の標的部位に二本鎖切断を導入することができる。全てがＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）を組み込む少なくとも５種類のＣＲＩＳＰＲシステムが存在する。Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶ型は、ｃｒＲＮＡに相補的な核酸を切断することができるマルチＣａｓタンパク質複合体を構築する。Ｉ型及びＩＩＩ型は両方とも、プロセシングされたｃｒＲＮＡをマルチＣａｓタンパク質複合体に構築する前にｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシングを必要とする。ＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体を形成した単一のＣａｓタンパク質を含む。
トランスポゾンベースのシステムは、本開示のタンパク質又はその成分をコードするポリ核酸をゲノムに挿入するために利用することができる。
いくつかの場合、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで本開示のタンパク質を含むように遺伝子操作される。いくつかの場合、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで本開示のタンパク質を含むように遺伝子操作される。
遺伝子編集成分を細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃の使用、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、及びウイルスベクターの使用が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター送達システムは、細胞への送達後にエピソーム又は組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含み得る。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、日本赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）ベクター、及びモロニーマウス白血病ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
ＶＩＩＩ．治療方法に使用するための医薬組成物
本開示は、本明細書に開示されるＭＩＤＩＳタンパク質を利用する医薬組成物、治療方法で使用するための組成物、及び治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象への投与のための、本明細書に開示されるＭＩＤＩＳタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを発現する操作された細胞を含む組成物が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞は、それを必要とする対象に投与することができる医薬組成物に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入するためのベクターを含む。いくつかの実施形態において、ＭＩＤＩＳ遺伝子を含有するウイルスベクターは、癌を有する対象に投与される。
一実施形態において、本明細書中に開示されるようなキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラタンパク質を含む、好ましくは発現する細胞又は前記細胞を含む細胞集団は、少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルが、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能の改善、並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／又は機能の改善に寄与し、前記生物学的パラメータが疾患又は状態の処置に寄与する疾患又は状態を治療するための使用のためのものである。
一実施形態において、疾患又は状態の治療方法であって、本明細書中に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラタンパク質を含む、好ましくは発現する細胞、又は前記細胞を含む細胞の集団を投与することを含み、少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルが、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能の改善、並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／又は機能の改善に寄与し、前記生物学的パラメータが、前記疾患又は状態の治療に寄与する、方法が提供される。
一実施形態において、本明細書中に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラタンパク質を含み、好ましくは発現する細胞を含む細胞又は前記細胞を含む細胞集団の使用が、疾患又は状態を処置するための医薬の製造のために提供され、ここで、少なくとも２つの、場合により誘導性の細胞内シグナルは、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能の改善、並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／又は機能の改善に寄与し、前記生物学的パラメータは、疾患又は状態の処置に寄与する。
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラタンパク質を含む、好ましくは発現する細胞、又は前記細胞を含む細胞の集団は、使用のためのものであり、ここで、
－生物学的パラメータは、増殖、生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択され、
－細胞は免疫細胞であり、及び／又は
－疾患は癌である。
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラタンパク質を含む、好ましくは発現する細胞、又は前記細胞を含む細胞の集団は、使用のためのものであり、ここで、
－生物学的パラメータは、増殖、生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択され、
－細胞は前記キメラタンパク質及びその相互作用パートナーを発現するアルファ－ベータＴ細胞であり、及び／又は
－疾患は癌である。
一実施形態では、本明細書に開示されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記キメラタンパク質を含む、好ましくは発現する細胞、又は前記細胞を含む細胞の集団は、使用のためのものであり、ここで、
－生物学的パラメータは、増殖、生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択され、
－細胞は前記キメラタンパク質及びその相互作用パートナーを発現するガンマ－デルタＴＣＲを発現するアルファ－ベータＴ細胞であり、及び／又は
－疾患は癌である。
各特徴は、本明細書において既に先に定義されている。
それを必要とする対象は、障害、例えば癌を有し得る。いくつかの場合では、癌は転移性癌である。他の場合では、癌は再発性又は難治性の癌である。いくつかの場合には、癌は固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、障害は、感染性疾患である。
それを必要とする対象に投与される細胞は、対象にとって自己由来であり得る。それを必要とする対象に投与される細胞は、対象に対して同種異系であってもよく、例えば、完全なＨＬＡ一致、１、２、３、４、５、６、７若しくは８つのＨＬＡ対立遺伝子、又は少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、若しくは少なくとも８つのＨＬＡ対立遺伝子でＨＬＡ一致し得る。それを必要とする対象に投与される細胞は、対象とハプロタイプ一致であり得る。それを必要とする被験体に投与される細胞は、対象に関連するドナーに由来し得る。それを必要とする対象に投与される細胞は、対象に関連しないドナーに由来し得る。
特定の実施形態において、凍結保存された細胞（例えば、操作された細胞）は、本明細書中に記載されるように解凍及び洗浄され、本開示の方法を使用して活性化する前に室温で１時間静置される。一態様では、操作された細胞を含む組成物は、細胞の剤形、例えば単位剤形を含むことができる。
いくつかの例では、医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の方法で製剤化される。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書中に記載される医薬組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）に見出される。
特定の実施形態では、組成物はまた、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸及び塩酸などの酸、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、トリス－ヒドロキシメチルアミノメタン等の塩基；及びクエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム及び塩化アンモニウム等の緩衝剤を含む１つ以上のｐＨ調整剤又は緩衝剤を含むことができる。そのような酸、塩基及び緩衝剤は、組成物のｐＨを許容範囲に維持するのに必要な量で含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物はまた、組成物のオスモル濃度を許容範囲にするのに必要な量の１つ以上の塩を含むことができる。そのような塩としては、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムカチオン及び塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩又は重亜硫酸塩アニオンを有するものが挙げられ、好適な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムが挙げられる。
本明細書に記載の医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、又は頭蓋内）、鼻腔内、頬側、舌下、経口、又は直腸投与経路を含むが、これらに限定されない任意の適切な投与経路によって投与することができる。いくつかの例では、医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、又は頭蓋内）投与用に製剤化される。
本明細書に記載の医薬組成物は、治療される対象への投与のために、水性分散剤、液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁剤などを含むが、これらに限定されない任意の適切な剤形に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液剤（例えば、ＩＶ投与用）に製剤化される。いくつかの場合には、医薬組成物は輸液として製剤化される。いくつかの場合には、医薬組成物は注射剤として製剤化される。
非経口投与は、例えば、ボーラス注射又は経時的な漸進的灌流によるものであり得る。投与はまた、細胞のボーラス若しくはペレットの外科的堆積、又は医療機器の位置決定によるものであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、固体経口剤形、エアロゾル、制御放出製剤、速溶製剤、発泡性製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、散剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、拍動放出製剤、多粒子製剤、並びに混合即時放出及び制御放出製剤に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はカプセル剤に製剤化される。
本明細書に記載の医薬固体剤形は、本明細書に記載の化合物及び１つ以上の薬学的に許容される添加剤、例えば適合性担体、結合剤、充填剤、懸濁化剤、香味剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、潤滑剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、湿潤剤、可塑剤、安定剤、浸透促進剤、湿潤剤、消泡剤、酸化防止剤、保存剤、又はその１つ以上の組合せを任意に含む。
治療有効量の本開示の組成物を対象に投与することができる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投与量及び期間で有効な量を指すことができる。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに本発明の核酸配列が個体において所望の応答を誘発する能力などの因子に従って変動し得る。
ＩＸ．付加的なポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、本明細書中で先に記載されるようにヘテロ二量体受容体をコードし得る。そのようなポリヌクレオチドは、マルチシストロン性であり得る。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書において先に記載された細胞によるヘテロ二量体受容体の発現が、細胞が、受容体モノマーをコードする核酸の間に挿入された受容体のモノマー以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含むポリヌクレオチドを含む場合、及び核酸が同じプロモーター配列に作動可能に連結されている場合、有意に増強され得ることを見出した。
ヘテロ二量体受容体の発現の改善は、本明細書で前述した当業者が利用可能な任意の標準的な技術、例えばフローサイトメトリー、ＦＡＣＳなどによって評価され得る。さらなる非限定的な例を実験セクションに提供する。
ヘテロ二量体受容体の発現の改善は、受容体を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能の改善をもたらし得、これは、本明細書で先に論じたように、例えば、細胞増殖、細胞生存、免疫エフェクター機能の大きさ、免疫エフェクター機能の持続期間、標的細胞（例えば、癌細胞）に対する細胞傷害性効果、炎症性メディエータの産生、抗癌免疫応答、細胞分化、細胞脱分化などであっても、又はそれらを含んでいてもよい。改善は、受容体モノマーをコードする核酸の間に受容体のモノマー以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸が前記受容体をコードするポリヌクレオチドに挿入されていない受容体を発現する細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍又は少なくとも１０００倍であり得る。これらの生物学的パラメータ及び／又は機能を測定するためのアッセイは、本明細書中で先に記載され、さらなる非限定的な例が実験セクションで示される。
したがって、本発明はさらに、ヘテロ二量体受容体の各モノマーをコードするポリヌクレオチドを提供し、ここで、前記ポリヌクレオチドは、前記モノマーの各々をコードする核酸の間に挿入された前記モノマー以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含み、前記核酸は、同じプロモーター配列に作動可能に連結されている。複数の核酸が各受容体モノマーをコードする核酸の間に挿入される場合、挿入された核酸は同じ又は異なるポリペプチドをコードし得ることは理解される。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体受容体のモノマー以外のポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸、少なくとも３つの核酸、又は少なくとも４つの核酸が、各モノマーをコードする核酸の間に挿入される。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体受容体をコードするポリヌクレオチドはトリシストロン性である。これは、各モノマーをコードする核酸の間に挿入されているヘテロ二量体受容体のモノマー以外のポリペプチドをコードする単一の核酸を指す。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体受容体をコードするポリヌクレオチドはテトラシストロン性である。これは、各モノマーをコードする核酸の間に挿入されているヘテロ二量体受容体のモノマー以外のポリペプチドをコードする２つの核酸を指す。ポリペプチドは同じであっても異なっていてもよい。
核酸に作動可能に連結され得る適切なプロモーター配列は、本明細書で前述されている。一実施形態では、プロモーター配列は、ＥＦ１α、ＭＳＣＶ、ＥＦ１α－ＨＴＬＶ－１ハイブリッドプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ又はＭＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ又はＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＭＨＣクラスＩＩ、凝固第ＩＸ因子、インスリンプロモーター、ＰＤＸ１プロモーター、ＣＤ１１、ＣＤ４、ＣＤ２、ｇｐ４７プロモーター、ＰＧＫ、β－グロビン、ＵｂＣ及びＭＮＤの群、好ましくはＭＳＣＶ、ＭＭＬＶ、ＥＦ１α及びＭＮＤから選択される。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、本明細書に記載のプロモーター配列の誘導体配列（すなわち、バリアント配列）である。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号２０２～２０５のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヘテロ二量体受容体をコードするポリヌクレオチドは、それらの共発現を促進する核酸の各々の間に挿入されたヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される場合、「それらの共発現を促進する」は、これらの配列が、異なるポリペプチド（すなわち、本明細書中に記載のヘテロ二量体受容体モノマー及び少なくとも１つのさらなるポリペプチド）がポリヌクレオチドから転写された単一のｍＲＮＡから翻訳されることを確実にするように機能することを理解されたい。そのようなヌクレオチド配列は、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又は２Ａ自己切断性ペプチドをコードする配列から選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、各核酸間に挿入されたヌクレオチド配列は、２Ａ自己切断性ペプチドをコードする配列であるか、又はＩＲＥＳ配列である。ＩＲＥＳ配列は、第１のポリペプチドの合成後にリボソームがｍＲＮＡから解離した後、新しい翻訳開始複合体の構築を可能にすることによって機能する。適切なＩＲＥＳ配列は当技術分野の当業者に公知であり、実施例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＩＲＥＳｉｔｅ：Ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ＩＲＥＳ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｍｏｋｒｅｊｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６；３４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１２５－Ｄ１３０等の公共のデータベースでさらに入手可能である。好ましい実施形態では、各核酸間に挿入されたヌクレオチド配列は、２Ａ自己切断性ペプチドをコードする配列である。２Ａ自己切断性ペプチド（本明細書では「２Ａペプチド」と略記される）は、ポリペプチド共発現の促進を可能にする、その小さいサイズ及び自己切断能力のために、本明細書に記載のマルチシストロン性ポリヌクレオチドの発現に有利であり得る。２Ａペプチドは、典型的には１６～２２個のアミノ酸から構成され、ウイルスＲＮＡに由来する。２Ａペプチド媒介ポリペプチド切断は、典型的には、２ＡペプチドのＣ末端におけるプロリン（Ｐ）とグリシン（Ｇ）との間のペプチド結合のリボソームスキップによって引き起こされ、その結果、２Ａペプチドの上流に位置するポリペプチドはそのＣ末端に余分なアミノ酸を有し、一方、２Ａペプチドの下流に位置するペプチドはそのＮ末端に余分なプロリンを有する。２Ａペプチドをコードする核酸配列の例は、Ｘｕ Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２０１９）及びＰｉｎｃｈａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，（２０１１）（上掲）に見出すことができる。適切な２Ａペプチドの非限定的な例は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド）、Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎ウイルス由来の２Ａペプチド）、Ｐ２Ａ（ブタテスコウイルス－１由来の２Ａペプチド）、又はＴ２Ａ（トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来の２Ａペプチド）である。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドはＦ２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドは、Ｅ２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドはＰ２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドはＴ２Ａペプチドである。当業者は、本明細書に記載のポリヌクレオチドが、異なる２Ａ自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列も含み得ることを理解する。非限定的な例として、トリシストロン性構築物において、第１及び第２のポリペプチドをコードする核酸の間にＰ２Ａペプチドをコードする配列を挿入することができ、第２及び第３のポリペプチドをコードする核酸の間にＴ２Ａペプチドをコードする配列を挿入することができる。したがって、複数の異なる２Ａ自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供される。好ましいポリヌクレオチドは、Ｐ２Ａペプチドコード配列及びＴ２Ａペプチドコード配列を含む。さらなる好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２０７又は２０９と少なくとも少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する２Ａ自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号２０６若しくは２０８と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列によって表される２Ａ自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるヘテロ二量体受容体は外因性抗原認識受容体である。いくつの実施形態では、外因性抗原認識受容体は、Ｂ細胞受容体重鎖及び軽鎖ヘテロ二量体、Ｔｏｌｌ様受容体１及び２ヘテロ二量体、食作用性受容体Ｍａｃ－１、ＣＤ９４ ＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅ受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、アルファベータ（αβ）Ｔ細胞受容体、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞受容体、並びにその機能性断片から選択される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体受容体は、Ｂ細胞受容体重鎖及び軽鎖ヘテロ二量体又はその機能性断片である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体受容体は、Ｔｏｌｌ様受容体１及び２ヘテロ二量体、又はその機能性断片である。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体受容体は食作用性受容体Ｍａｃ－１又はその機能性断片である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体受容体は、ＣＤ９４ ＮＫＧ２Ｃ若しくはＮＫＧ２Ｅ受容体、又はその機能性断片である。
好ましい実施形態では、外因性抗原認識受容体はＴ細胞受容体又はその機能性断片である。Ｔ細胞受容体の中でも、αβＴ細胞受容体、γδＴ細胞受容体又はその機能性断片が好ましく、γδＴ細胞受容体又はその機能性断片が最も好ましい。適切なＴ細胞受容体、αβＴ細胞受容体、及びγδＴ細胞受容体は、本明細書で先に記載されている。
ヘテロ二量体受容体の各単量体をコードする核酸は、好ましくは、ポリヌクレオチド中の位置に関して特定の順序であり得る。本明細書で使用される「特定の順序」という用語は、コードされたポリペプチドがリボソームによってマルチシストロン性ｍＲＮＡから翻訳される順序を指す。換言すれば、マルチシストロン性ポリヌクレオチド中のポリペプチドをコードする核酸の位置を指す。したがって、「第１の位置」に位置する核酸は、発現される最初の核酸であると理解され、「最後の位置」に位置する核酸は、発現される最後の核酸であると理解される。非限定的な例として、本明細書に記載のαβＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドでは、核酸の順序は、α鎖コード核酸（最初の位置）、続いてαβＴ細胞受容体のα鎖又はβ鎖以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、続いてβ鎖コード核酸（最後の位置）であり得る。或いは、核酸の好ましい順序は：β鎖コード核酸（最初の位置）、続いてαβＴ細胞受容体のα鎖又はβ鎖以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、続いてα鎖コード核酸（最後の位置）であり得る。別の非限定的な例として、本明細書に記載のγδＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドでは、核酸の好ましい順序は、γ鎖コード核酸（最初の位置）、続いてγδＴ細胞受容体のγ鎖又はδ鎖以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、続いてδ鎖コード核酸（最後の位置）であり得る。或いは、核酸の順序は、δ鎖コード核酸（最初の位置）、続いてγδＴ細胞受容体のγ鎖又はδ鎖以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、続いてγ鎖コード核酸（最後の位置）であり得る。好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、トリシストロン性又はテトラシストロン性である。
いくつかの実施形態では、γδＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドは、トリシストロン性であり、第１の位置にγ鎖コード核酸及び第３の位置にδ鎖コード核酸を含む。
いくつかの実施形態では、γδＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドは、トリシストロン性であり、第１の位置にδ鎖コード核酸及び第３の位置にγ鎖コード核酸を含む。
いくつかの実施形態では、γδＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドは、テトラシストロン性であり、第１の位置にγ鎖をコードする核酸及び第４の位置にδ鎖コード核酸を含む。
いくつかの実施形態では、γδＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドは、テトラシストロン性であり、第１の位置にδ鎖コード核酸及び第４の位置にγ鎖コード核酸を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤを含み、ここで、
（Ａ）は（ｉ）－（ｉｉ）－（ｉｉｉ）で表される核酸であり、
（ｉ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｉｉ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖若しくはβ鎖以外のポリペプチド又はその機能性断片をコードする少なくとも１つの核酸であり；及び
（ｉｉｉ）は、αβＴ細胞受容体のβ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｉｉ）は、（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に挿入され、
（Ｂ）は（ｉｖ）－（ｖ）－（ｖｉ）で表される核酸であり、
（ｉｖ）は、αβＴ細胞受容体のβ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖若しくはβ鎖以外のポリペプチド又はその機能性断片をコードする少なくとも１つの核酸であり；及び
（ｖｉ）は、αβＴ細胞受容体のα鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖ）は、（ｉｖ）と（ｖｉ）との間に挿入され、
（Ｃ）は（ｖｉｉ）－（ｖｉｉｉ）－（ｉｘ）で表される核酸であり、
（ｖｉｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖｉｉｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖若しくはδ鎖以外のポリペプチド又はその機能性断片をコードする少なくとも１つの核酸であり；及び
（ｉｘ）は、γδＴ細胞受容体のδ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｖｉｉｉ）は、（ｖｉ）と（ｉｘ）との間に挿入され、
（Ｄ）は（ｘ）－（ｘｉ）－（ｘｉｉ）で表される核酸であり：
（ｘ）は、γδＴ細胞受容体のδ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｘｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖及びδ鎖又はその機能性断片以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸であり；
（ｘｉｉ）は、γδＴ細胞受容体のγ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
（ｘｉ）は、（ｘ）と（ｘｉｉ）との間に挿入され、
（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）及び（ｘ）は、それらを含むそれぞれのポリヌクレオチドの最初の位置に位置する核酸を表す。（ｉｉｉ）、（ｖｉ）、（ｉｘ）及び（ｘｉｉ）は、それらを含むそれぞれのポリヌクレオチドの最後の位置に位置する核酸を表す。
Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤの中でも、Ｂ、Ｃ及びＤを特徴とするポリヌクレオチドが好ましく、Ｃ及びＤがより好ましく、Ｃが最も好ましい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、各核酸の間に挿入された２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
そのようなポリヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書において構築され、実験的に検証されている（例えば、実施例１４～１７）。
好ましくは、Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤは、
－（ｉ）及び（ｖｉ）は、配列番号１９９、２１０、２１４、２１６、２１８及び２２０から選択される、好ましくは配列番号２１０、２１６及び２２０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
－（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、配列番号１９８、２１１、２１５、２１７、２１９及び２２１から選択される、好ましくは配列番号２１１、２１７及び２２１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
－（ｖｉｉ）及び（ｘｉｉ）は、配列番号８５、８６、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、１０１、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３０及び１３２から選択される、好ましくは配列番号８５、８６、８７、９４、９５、９６、１０１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２７及び１３０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
－（ｉｘ）及び（ｘ）は、配列番号８２、８３、８４、８８、９０、９２、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３１及び１３３から選択される、好ましくは配列番号８２、８３、８４、９７、９８、９９、１００、１０２、１１４、１１６、１１８、１２６及び１３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であるようになっている。
ヘテロ二量体受容体をコードするポリヌクレオチド中の単量体の各々をコードする核酸の間に挿入され得る、前記受容体の単量体以外のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、本明細書で前述したキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質（ＭＩＤＩＳ）である。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードする受容体モノマーのそれぞれをコードする核酸の間に挿入された核酸を含み、前記タンパク質は：
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介して伝達される。
ポリヌクレオチドに含まれ得る好ましいＭＩＤＩＳタンパク質は、本明細書において先に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＭＩＤＩＳタンパク質は
－細胞外リガンドドメインが、本明細書に前述するように４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ又はＣＤ７０由来のアミノ酸配列を含み、
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、本明細書に前述するようにＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含むようになっている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、γδＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするトリシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸はＴＣＲのガンマ鎖をコードし、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードする核酸、次いでＴＣＲのデルタ鎖をコードする核酸が続く。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、γδＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするトリシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸は、ＴＣＲのデルタ鎖をコードし、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードする核酸、次いでＴＣＲのガンマ鎖をコードする核酸が続く。
ＴＣＲの好ましいガンマ鎖及びデルタ鎖並びに好ましいキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、本明細書において以前に記載されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、γδＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするテトラシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸は、ＴＣＲのガンマ鎖をコードし、２つの核酸が続き、少なくとも１つの核酸はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードし、次いでＴＣＲのデルタ鎖をコードする核酸が続く。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、γδＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするテトラシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸は、ＴＣＲのデルタ鎖をコードし、２つの核酸が続き、少なくとも１つの核酸はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードし、次いでＴＣＲのガンマ鎖をコードする核酸が続く。
ＴＣＲの好ましいガンマ鎖及びデルタ鎖並びに好ましいキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、本明細書において以前に記載されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、αβＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするトリシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸は、ＴＣＲのアルファ鎖をコードし、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードする核酸、次いでＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸が続く。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、αβＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするトリシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸は、ＴＣＲのベータ鎖をコードし、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードする核酸、次いでＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸が続く。
ＴＣＲの好ましいアルファ鎖及びベータ鎖並びに好ましいキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、本明細書において以前に記載されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、αβＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするテトラシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸は、ＴＣＲのアルファ鎖をコードし、２つの核酸が続き、少なくとも１つの核酸はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードし、次いでＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸が続く。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、αβＴＣＲ及びキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするテトラシストロン性ポリヌクレオチドである。第１の核酸は、ＴＣＲのベータ鎖をコードし、２つの核酸が続き、少なくとも１つの核酸はキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードし、次いでＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸が続く。
ＴＣＲの好ましいアルファ鎖及びベータ鎖並びに好ましいキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質は、本明細書において以前に記載されている。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書中で先に記載されるようなキメラ双方向シグナル伝達タンパク質の相互作用パートナーをコードする核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で前述したベクターに含まれる。好ましいベクターはウイルスベクターであり、レンチウイルスベクターが最も好ましい。
ポリヌクレオチド及び／又はベクターを含む本明細書で前述の細胞は、好ましくは前記ポリヌクレオチド及び／又はベクターを発現する。好ましい細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞の中でも、αβＴ細胞が好ましい。
本明細書中に記載されるようなヘテロ二量体受容体をコードするポリヌクレオチドは、本明細書中で先に記載される医薬組成物、方法、治療及び治療的使用において使用され得る。
特に、本開示は、ポリヌクレオチド、ベクター、ポリヌクレオチド及び／又はベクターによってコードされるポリペプチド、ポリヌクレオチド及び／又はベクターを含み、好ましくはポリペプチドをさらに発現する細胞（又は細胞集団）、並びに医薬として使用するための、本明細書で前述した前記ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド及び／又は細胞を含む医薬組成物、又は前記ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞及び／又は組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。それを必要とする対象は、本明細書中で先に定義される。そのような対象は、障害、例えば癌を有し得る。いくつかの場合では、癌は転移性癌である。他の場合では、癌は再発性又は難治性の癌である。いくつかの場合には、癌は固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、癌は固形腫瘍である。他の例では、癌は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、障害は、感染性疾患である。
医薬組成物の好適なさらなる成分、及び投与様式は、本明細書中で先に論じられる。
一実施形態では、本明細書で先に記載されたポリヌクレオチド、ベクター、及び／又はポリヌクレオチド及び／若しくはベクターによってコードされるヘテロ二量体受容体は、疾患の治療及び／又は予防に使用するためのものであり、ここで、
－増殖、生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択されるヘテロ二量体受容体を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能が改善され、
－細胞は免疫細胞であり、及び／又は
－疾患は癌である。
一実施形態では、本明細書で先に記載されたポリヌクレオチド、ベクター、及び／又はポリヌクレオチド及び／若しくはベクターによってコードされるヘテロ二量体受容体は、疾患の治療及び／又は予防に使用するためのものであり、ここで、
－増殖、生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択されるヘテロ二量体受容体を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能が改善され、
－細胞はαβＴ細胞であり、及び／又は
－疾患は癌である。
一実施形態では、本明細書で先に記載されたポリヌクレオチド、ベクター、及び／又はポリヌクレオチド及び／若しくはベクターによってコードされるヘテロ二量体受容体は、疾患の治療及び／又は予防に使用するためのものであり、ここで、
－増殖、生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択されるヘテロ二量体受容体を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／又は機能が改善され、
－細胞はαβＴ細胞であり、
－ヘテロ二量体受容体はγδＴ細胞受容体であり、及び／又は
－疾患は癌である。
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド及び／又はベクターの導入によってヘテロ二量体受容体の発現を達成するように細胞を操作する方法は、本明細書中で先に論じられる。
本明細書及びその特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその活用形は、その語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。加えて、「からなる」という動詞は、本明細書に記載の生成物（キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、集団）が具体的に識別されたもの以外の追加の構成要素を含み得ることを意味する「から本質的になる」に置き換えられてもよく、前記追加の構成要素は本発明の固有の特性を変更するものではない。加えて、「からなる」という動詞は、本明細書に記載の生成物が具体的に識別されたもの以外の構成要素を含み得ることを意味する「から本質的になる」に置き換えられてもよく、前記追加の構成要素は本発明の固有の特性を変更するものではない。
不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が要素の１つのみが存在することを明確に要求しない限り、要素の複数が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
本明細書で使用される場合、特定の値についての「少なくとも」とは、その特定の値以上を意味する。例えば、「少なくとも２つ」は、「２以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５…等と同じであると理解される。
「約」又は「およそ」という用語は、数値（例えば約１０）に関連して使用される場合、好ましくは、その値が値の０．１％以上又は以下の（１０の）所与の値であり得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、記載された事例の１つ以上が、単独で、又は記載された事例の少なくとも１つ、最大では記載された事例の全てと組み合わせて発生し得ることを示す。
様々な実施形態が本明細書に記載される。本明細書で特定される各実施形態は、特に明記しない限り、共に組み合わせることができる。
当技術分野の当業者は、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されたものと類似又は同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載された方法及び材料に決して限定されない。
以下の実施例は、例示のみを目的として含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
市販の試薬及び機器を利用した場合、特に指示がない限り、使用したプロトコルは製造者の指示に従った。
実施例１：所定のガンマ－デルタＴＣＲを発現するように操作されたアルファ－ベータＴ細胞（ＴＥＧ）におけるＭＩＤＩＳタンパク質の設計及び発現
表８～１４、１５～１７に示すように、細胞外リガンドドメイン及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインを組み込んで、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質を設計した。本開示のＭＩＤＩＳタンパク質をコードするＤＮＡ配列のゲノム組込みを可能にするために、レンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスベクターは、本開示のガンマＴＣＲ鎖及びデルタＴＣＲ鎖をコードするトリシストロン性配列を含み、ＭＩＤＩＳタンパク質コード配列はガンマ鎖とデルタ鎖の間にあり、２Ａ自己切断性ペプチド配列は３つのタンパク質配列を接続していた（Ｘｕ Ｙ．ｅｔ ａｌ（２０１９），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，６８：１９７９－１９９３及びＰｉｎｃｈａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ（２０１１），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：７５０－７６４）。
凍結保存したαβＴＣＲ Ｔ細胞を解凍し、ペニシリン／ストレプトマイシン（０．５％）、ヒト血清（２．４％）、ＩＬ－７（１７００ＩＵ／ｍｌ）及びＩＬ－１５（１５０ＩＵ／ｍｌ）を含むＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，ＤＥ）培地（ＴＥＧ培地）中１．６×１０＾６細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ ＴｒａｎｓＡｃｔで２４時間活性化し、次いで、ＴｅｘＭＡＣＳ培地でレンチウイルスを希釈することによって、選択したレンチウイルスベクターを事前に設定した感染多重度（ＭＯＩ；０．３～２５）で形質導入した。レンチウイルスＭＯＩは、Ｐｉｒｏｎａ ｅｔ ａｌ，２０２０，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５：１と同様にＪ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＦＡＣＳに基づく滴定によって決定した。簡単に記載すると、Ｊ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞を、９６ウェルプレートに０．５Ｅ６／ｍｌの生細胞で播種した。レンチウイルス上清を濃縮し、１００倍希釈から始めて、１０％ ＦＢＳを含む冷培地で連続希釈した。連続希釈後、レンチウイルス含有上清をＪ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞で１：１に希釈し、混合物を３７℃で３日間インキュベートした。ＣＤ３＋γδＴＣＲ＋生存細胞のパーセンテージを分析することによって力価を決定した。２日目に、培地を交換し、Ｔ細胞を１２ウェルプレートに移した。５日目に、培地をもう一度交換し、Ｔ細胞を最終体積１０ｍｌでＴ２５細胞培養フラスコに移した。７日目に、Ｔ細胞を最終体積２５ｍｌでＴ７５細胞培養フラスコに移した。４８時間後、培地をもう１回交換し、最終体積を２５ｍｌにした。Ｔ細胞を解凍した１２日後に回収した。
１２日間のプロトコル後に存在する細胞をフローサイトメトリーによって特徴付けた。細胞をＦＡＣＳ緩衝剤（２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝剤中の選択された蛍光コンジュゲート抗体を用いて４℃で３０分間染色した。染色後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより１０分間、４℃で固定した。固定後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤でもう一度洗浄した後、１００～２００μｌのＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、続いてフローサイトメトリー分析（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を行った。
表８～１４、１５～１７は、１２日間のプロトコル後のガンマ－デルタＴＣＲ＋細胞の増殖倍率及び割合の詳細を提供する。各表は、別個の産生ラン由来のものであり、及び／又は異なるドナー由来の細胞を使用する。ＥＣ：細胞外。ヘテロＩＣ：異種性細胞内。これらの結果は、本開示の特定のＭＩＤＩＳタンパク質が操作された細胞の増殖を増強することができることを示唆している。
実施例２：ＭＩＤＩＳタンパク質及び所定のガンマ－デルタＴＣＲを発現する標的細胞及びエフェクターＴ細胞の共培養アッセイ
ＨＴ－２９、ＭＺ１８５１ＲＣ、ＲＰＭＩ－８２２６、ＭＭ１－Ｓ、ＯＰＭ－２細胞を含む標的腫瘍細胞を、９６ウェルプレートに所定の濃度で播種した。エフェクター細胞を添加する前日に接着性標的細胞を播種し、エフェクター細胞を添加した同日に浮遊性標的細胞を播種した。
発現された所定のガンマ－デルタＴＣＲの可変ドメインは、配列番号９０及び９１（クローン５）又は１１１及び１１２（Ｅ５７）のいずれかによって表されるものであった。
新鮮な（産生の１２日目の）又は凍結保存したＴＥＧをエフェクター細胞として使用した。全ての共培養物に添加したエフェクター細胞の数を、実験において最も低い形質導入効率を有するＴＥＧと一致するように補正した。同じ産生プロセスを経たがレンチウイルスベクターを添加しなかった非形質導入細胞を、１つの実験内の全ての共培養物が同じ数のＴＥＧ及び同じ数の総Ｔ細胞を含むように添加した。
共培養物を、エフェクター細胞添加日に１：１又は０．３：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）及びパミドロネート処理あり又はなし（１０μｍ）で設定した。非形質導入、エフェクターのみ、標的のみ、又は完全溶解対照を含めた。
３又は７日後、共培養物から上清を回収し、非接着性細胞を穏やかに再懸濁し、細胞懸濁液を丸底９６ウェルプレートに移した。細胞傷害性を発光によって測定した場合、Ｄ－ルシフェリンを含むアッセイ培地１００ｕｌを、残りの標的細胞を含む残留共培養プレートに添加し、１２分間インキュベートした後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって発光を測定した。Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅベースの細胞傷害性については、共培養インキュベートに沿ってリアルタイムでデータを捕捉し、細胞懸濁プレートを移した後に廃棄した。
細胞懸濁液を６０ｕｌ／ウェルに培地交換し、これの５０ｕｌを、その後の細胞傷害性評価のために予め播種した標的の新しいプレートに移し、プロセスを個々の図について示すように繰り返した。
残存細胞懸濁混合物をＦＡＣＳによって特徴付けて、増殖、細胞適合性、及び他のパラメータを測定した。増殖は、ＴＥＧ及び総Ｔ細胞の数を決定することによって、又は連続細胞傷害性アッセイの開始時にＴＥＧを染色した場合にはセルトレースバイオレット希釈を介して測定した。ＴＥＧの適合性を、種々のマーカー（例えば、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３）に対する染色に基づいて決定した。細胞をＦＡＣＳ緩衝剤（２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝剤中の選択された蛍光コンジュゲート抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ３、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、Ｆａｂ２、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ６９に特異的な抗体の適切な組合せ、表１４を参照）で、４℃で３０分間染色した。染色後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより１０分間、４℃で固定した。固定後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤でもう一度洗浄した後、１００～２００μｌのＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。
特定の実験では、より多くの共培養プレートを最初に使用し、１回の細胞傷害性評価の終了時に、細胞傷害性評価、エフェクターＴ細胞の特性評価、及びエフェクター細胞の次の回の実験への継代のために別個のプレートを使用した。
実施例３：ＭＩＤＩＳタンパク質は標的細胞に対する操作された免疫細胞応答を増強する
本実施例は、操作された免疫細胞が標的細胞に応答する能力に対する本開示のＭＩＤＩＳタンパク質の効果を評価する。
アルファ－ベータＴ細胞に、さらなるＭＩＤＩＳタンパク質又は他の対照タンパク質を用いて、又は用いずに、実施例１に概説されるようなＴＥＧを作製するために、所定されたガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を形質導入した。本実施例で使用した所定のガンマ－デルタＴＣＲは、本開示のＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲであった。ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）４１ＢＢＬ－野生型４１ＢＢＬ、本実施例では配列番号５４を使用した；
（ｉｉ）４１ＢＢＬｍｉｎｃｙｔｏ－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くタンパク質、この実施例では配列番号５５を使用した；
（ｉｉｉ）４１ＢＢＬｍｉｎｃｙｔｏ＿ＮＫｐ８０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＮＫｐ８０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、４１ＢＢＬの細胞内配列を欠くＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４８を使用した；
（ｉｖ）４１ＢＢＬ＿ＮＫｐ８０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＮＫｐ８０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４７を使用した；
（ｖ）４１ＢＢＬ＿ＯＸ４０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４５を使用した；
（ｖｉ）４１ＢＢＬ１３Ｗ＿ＯＸ４０ｒｅｖ－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、推定カゼインキナーゼＩモチーフを含有する最初の１２アミノ酸が欠失している４１ＢＢＬ由来の部分的細胞内ドメイン、及び反転しているＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメイン（すなわち、レトロタンパク質として発現される）を含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では、配列番号４６を使用した；
及び（ｖｉｉ）ｅＧＦＰ対照、本実施例では配列番号８１。
図２は、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。４１ＢＢＬ又はｅＧＦＰのＮ末端の黒色バーは、リンカー配列を表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示し、水平のバーは膜貫通ドメインを表す。
ＴＥＧを、実施例２に記載されるように所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される標的腫瘍細胞と共インキュベートし、３日ごとに新鮮な標的細胞に移し、ルシフェラーゼアッセイによって残存標的細胞生存率を測定した。実験は、パミドロネート処理（１０μｍ）の有り又は無しの条件を含み、９０％未満の細胞傷害性が観察されるまで続けた。
エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９と共インキュベートした２人のドナーからのＴＥＧの細胞傷害性を図３に示す。ＴＥＧの連続刺激を３回の刺激（ドナー１）又は５回の刺激（ドナー２）の間継続した。結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が、操作された免疫細胞のエフェクター機能を増強し得ることを示す。例えば、細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン及び細胞内ＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳタンパク質は、標的細胞への持続的曝露後に強い細胞傷害性を保持し、対照細胞又は細胞外４１ＢＢＬリガンドドメインを発現するがＯＸ４０細胞内ドメインを欠く細胞よりも有意に良好であった。
増殖を測定するために、ドナー１及びドナー２由来のエフェクター細胞をセルトレースバイオレット（ＣＴＶ）で染色し、色素の希釈を増殖のマーカーとして使用した。再チャレンジ前の総エフェクター細胞の１／６を、新しい標的ＨＴ－２９細胞への各移入時にＦＡＣＳによって評価した。図４に示すように、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、標的細胞の認識に応答した操作されたＴ細胞増殖を含む、活性化時の操作された免疫細胞の増殖を増強することができる。
図５は、ＨＴ－２９細胞による３回（共培養刺激の回数）の刺激（ドナー１）又は５回の刺激（ドナー２）後の、形質導入されたガンマデルタＴＣＲを発現する細胞の数を示す。これらのデータは、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が、標的細胞の認識に応答した操作されたＴ細胞増殖を含む、活性化時の操作された免疫細胞の増殖を増強することができることを実証している。例えば、細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳタンパク質を発現する細胞について、特に多数のＴＥＧが観察される。
疲弊マーカーＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３を共発現するＴＥＧの割合を、ＨＴ－２９細胞による３回の刺激（ドナー１）又は５回の刺激（ドナー２）の後に測定した。ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３は、Ｔ細胞疲弊のマーカーであり得、ＬＡＧ－３又はＴＩＭ－３に対して陽性である多くの又はほとんどの細胞、特にＬＡＧ－３＋ＴＩＭ－３＋細胞はＰＤ－１陽性でもあることが観察されている。図６に示されるように、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質は、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない細胞と比較して、標的細胞への持続的曝露後の操作されたＴ細胞の疲弊を低減することができる。例えば、細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むＭＩＤＩＳタンパク質を発現するＴＥＧでは、特に低レベルのＬＡＧ－３＋ＴＩＭ－３＋細胞が観察された。
第３の代表的なドナー由来のＴＥＧの細胞傷害性も、ＨＴ－２９、ＲＰＭＩ－８２２６及びＭＺ１８５１ＲＣ標的細胞との共培養後に評価した。ＴＥＧの連続刺激を、３回の刺激（ＨＴ－２９）、４回の刺激（ＲＰＭＩ－８２２６）又は５回の刺激（ＭＺ１８５１ＲＣ）の間継続した。使用されるＭＩＤＩＳ構築物は、配列番号８１、４５、５４、５５である。図７の左パネルは、最初の共培養刺激からの細胞傷害性データを示し、右パネルは、ＰＡＭ処置（１０μｍ）を伴う最後の共培養刺激からの細胞傷害性データを示す。結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が、操作された免疫細胞のエフェクター機能を増強し得ることをさらに示す。例えば、細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳタンパク質を発現する、操作された細胞は、標的細胞への持続的曝露後に、対照細胞又は細胞外４１ＢＢＬリガンドドメインを発現するがＯＸ４０細胞内ドメインを欠く細胞よりも実施的に長く、強い細胞傷害性を保持した。
第４の代表的なドナー由来のＴＥＧの細胞傷害性も、ＨＴ－２９との共培養後に評価した。ＴＥＧの連続刺激を２回の刺激（ＨＴ－２９）の間継続した。使用されるＭＩＤＩＳ構築物は、配列番号４６、及び５４である。図１８は、パミドロネート処理（１０μｍ）を伴う２回目の刺激の細胞傷害性を示す（残存生存ＨＴ－２９細胞の発光を示す）。結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が、操作された免疫細胞のエフェクター機能を増強し得ることをさらに示す。例えば、細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳタンパク質を発現する、操作された細胞は、標的細胞への持続的曝露後に、対照細胞又は細胞外４１ＢＢＬリガンドドメインを発現するがＯＸ４０細胞内ドメインを欠く細胞よりも実施的に長く、強い細胞傷害性を保持した。
実施例４：所定のガンマ－デルタＴＣＲで形質導入された操作されたアルファ－ベータＴ細胞に対する４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの利点
細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むＭＩＤＩＳの能力を、先の実施例と比較して異なる所定のガンマデルタＴＣＲを発現するアルファベータＴ細胞の状況で評価した。
本実施例では、アルファ－ベータＴ細胞に、本開示の所定のＶγ４Ｖδ５ ＴＣＲ配列番号１１１～１１２（γδＴＣＲ）を形質導入して、さらなる４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質（本実施例では、配列番号４５を使用した）又は４１ＢＢＬ－野生型４１ＢＢＬ、本実施例では配列番号５４、を使用して、又は使用せずに、実施例１のようにＴＥＧを生成した。
ＴＥＧを、ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所的に発現する標的ＨＴ－２９腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１：１で共インキュベートした（ＨＴ－２９細胞は、所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される）。３日（図８Ａ、Ｂ）又は７日（図８Ｃ）後に、ＴＥＧを新鮮な標的細胞を含むプレートに移した。残存標的細胞生存率をルシフェラーゼアッセイによって測定し、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡによって測定した。図８Ａに示すように、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質は、１回の刺激後の操作された細胞による腫瘍細胞の死滅を増強し、図８Ｂに示すように、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質を共発現したＴＥＧ細胞によって有意により多くのＩＦＮγが産生された。図８Ｃに示すように、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質は、１回の刺激の後、４１ＢＢＬと比較して、又は余分なタンパク質なしで、操作された細胞による腫瘍細胞の死滅を有意に増強した。
これらのデータは、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が操作された免疫細胞の機能を改善し得ることをさらに実証する。
４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで抗癌応答を増強することができるかどうかを試験するために、異種移植片モデルを使用した。０．５×１０＾６個のＨＴ－２９ルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞を－１４日目にＮＳＧマウスの側腹部に注射した（ｎ＝６／群）。０日目に、本開示のＶγ４Ｖδ５ ＴＣＲ（γδＴＣＲ）配列番号１１１～１１２を発現し、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質配列番号４５を含む又は含まないＴＥＧを、示された用量（例えば、１Ｍ＝１００万細胞）で全身投与した。生物発光（ＢＬＩ）及び腫瘍体積を毎週測定した。ＭＩＤＩＳタンパク質を発現したＴＥＧは、経時的な平均放射輝度（図９Ａ）及び腫瘍体積（図９Ｂ）、並びに全生存率図１０を示す図９Ａ～Ｂ及び図１０に示すように、ＭＩＤＩＳタンパク質を欠くＴＥＧよりも有意に大きな程度まで腫瘍増殖を制限し、有意に生存率を改善した。
これらのデータは、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質の発現が、操作された免疫エフェクター細胞の抗腫瘍効果を改善し得ることを実証している。
実施例５：ＯＸ４０Ｌ－４１ＢＢ及びＣＤ８６－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳタンパク質は、標的細胞の操作された免疫細胞死滅を増強する
本実施例は、操作された免疫細胞が標的細胞を死滅させる能力に対する本開示のＭＩＤＩＳタンパク質の効果を評価する。
アルファ－ベータＴ細胞に、さらなるＭＩＤＩＳタンパク質又は他の対照タンパク質を用いて、又は用いずに、実施例１のようにＴＥＧを作製するために、所定されたガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を形質導入した。本実施例において、所定のガンマ－デルタＴＣＲは、本開示のＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲであった。
第１の実験では、ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）ＯＸ４０Ｌ－野生型ＯＸ４０Ｌ、本実施例では、配列番号６６を使用した；
（ｉｉ）ＯＸ４０Ｌｍｉｎｃｙｔｏ－４１ＢＢ－細胞外ＯＸ４０Ｌリガンドドメイン、ＯＸ４０Ｌ膜貫通ドメインを含み、ＯＸ４０Ｌの細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、４１ＢＢ細胞内ドメインを含むタンパク質、本実施例では配列番号６７を使用した；
（ｉｉｉ）ＯＸ４０Ｌｍｉｎｃｙｔｏ－４１ＢＢｒｅｖ－細胞外ＯＸ４０Ｌリガンドドメイン、ＯＸ４０Ｌ膜貫通ドメインを含み、ＯＸ４０Ｌの細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、反転している４１ＢＢ細胞内ドメイン（すなわち、レトロタンパク質として発現される）を含むタンパク質、本実施例では、配列番号６５を使用した；
（ｉｖ）ＯＸ４０Ｌ－４１ＢＢｒｅｖ－細胞外ＯＸ４０Ｌリガンドドメイン、ＯＸ４０Ｌ膜貫通ドメイン、及び反転している４１ＢＢ異種性細胞内シグナル伝達ドメイン（すなわち、レトロタンパク質として発現される）を含有するタンパク質、本実施例では、配列番号５１を使用した；
（ｖ）ＯＸ４０Ｌ－４１ＢＢ－細胞外ＯＸ４０Ｌリガンドドメイン、ＯＸ４０Ｌ膜貫通ドメイン、及び４１ＢＢ異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するタンパク質、本実施例では配列番号５０を使用した；及び
（ｖｉ）Ｑ８－ＣＤ８－Ｑ８タグを含む対照タンパク質；配列番号８０。
図１１Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質を導入するために使用される選択構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。
ＴＥＧを、最初の刺激後に実験を停止したこと、及び最初の刺激後のルシフェラーゼアッセイによる残存標的細胞生存率を測定したことを除き、実施例２に記載されるように、所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される標的ＭＺ１８５１ＲＣ腫瘍細胞と共インキュベートした。
エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＭＺ１８５１ＲＣ標的細胞と共インキュベートしたＴＥＧの細胞傷害性を図１１Ｂに示す。結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が、操作された免疫細胞のエフェクター機能を増強し得ることを示す。例えば、細胞外ＯＸ４０Ｌリガンドドメイン及び４１ＢＢ異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むＭＩＤＩＳタンパク質を発現するＴＥＧは、野生型ＯＸ４０Ｌを発現するＴＥＧよりも高い細胞傷害性を示した。
本開示のＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲも利用する第２の実験では、ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）γδＴＣＲ－共発現タンパク質を含まない、本開示のＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ；
（ｉｉ）ＣＤ８６－野生型ＣＤ８６、本実施例では、配列番号６８を使用した；
（ｉｉｉ）ＣＤ８６－ＯＸ４０－細胞外ＣＤ８６リガンドドメイン、ＣＤ８６由来の膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むタンパク質、本実施例では配列番号５２を使用した；
（ｉｖ）ＣＤ８６ｄｅｌＰ２７６－ＣＤ８６の正しい細胞局在化に関与することが示されている点まで細胞質部分の欠失（ＣＤ８６のアミノ酸２７７～３２９の欠失）を有するＣＤ８６。本実施例では配列番号６９を使用した；
（ｖ）ＣＤ８６ｄｅｌＰ２７６－ＯＸ４０－細胞外ＣＤ８６リガンドドメイン、ＣＤ８６由来の膜貫通ドメインを含み、ＣＤ８６のアミノ酸２７７～３２９が欠失しており、ＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むタンパク質、本実施例では配列番号５３を使用した；及び
（ｖｉ）レンチゲンγδＴＣＲ－代替レンチウイルス調製物由来の本開示のＶγ９Ｖδ２ ＴＣＲ。
図１２Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質を導入するために使用される選択構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。右の図は、細胞外（上）及び細胞内（下）に存在するドメインを示す。水平のバーは、膜／膜貫通ドメインを表す。
ＴＥＧを、実施例２に記載されるような所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される標的ＨＴ－２９腫瘍細胞と共インキュベートし、７日毎に新鮮な標的細胞へ移し、パミドロネート（１０μｍ）を添加し、並びに２回目の刺激後にルシフェラーゼアッセイによる残存標的細胞生存率の測定を行った。
エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９標的細胞と共インキュベートしたＴＥＧの細胞傷害効果を図１２Ｂに示す。結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が、操作された免疫細胞のエフェクター機能を増強し得ることを示す。例えば、細胞外ＣＤ８６リガンドドメイン、ＣＤ８６由来の膜貫通及び切断型細胞内シグナル伝達ドメイン（ｄｅｌＰ２７６）、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むＭＩＤＩＳタンパク質を発現するＴＥＧは、野生型ＣＤ８６又は切断型ＣＤ８６（ｄｅｌＰ２７６）を発現するＴＥＧよりも高い細胞傷害性を示した。
実施例６：ＭＩＤＩＳタンパク質の表面発現は融合パートナーの組合せに依存する
本実施例は、本開示のいくつかのＭＩＤＩＳタンパク質の細胞表面発現を評価する。
アルファ－ベータＴ細胞に、さらなるＭＩＤＩＳタンパク質又は他の対照タンパク質を用いて、又は用いずに、実施例１のようにＴＥＧを作製するために、所定のガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０およ配列番号び９１）を形質導入した。ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）ｅＧＦＰ対照 配列番号８１；
（ｉｉ）４１ＢＢＬｍｉｎｃｙｔｏ－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くタンパク質、この実施例では配列番号５５を使用した；
（ｉｉｉ）４１ＢＢＬｍｉｎｃｙｔｏ＿ＮＫｐ８０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＮＫｐ８０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、４１ＢＢＬの細胞内配列を欠くＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４８を使用した；
（ｉｖ）４１ＢＢＬ＿ＮＫｐ８０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＮＫｐ８０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４７を使用した；
（ｖ）４１ＢＢＬ＿ＯＸ４０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４５を使用した；及び
（ｖｉ）４１ＢＢＬ１３Ｗ＿ＯＸ４０ｒｅｖ－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、推定カゼインキナーゼＩモチーフを含有する最初の１２アミノ酸が欠失している４１ＢＢＬ由来の部分的細胞内ドメイン、及び反転しているＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメイン（すなわち、レトロタンパク質として発現される）を含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では、配列番号６０を使用した。
１２日間のプロトコルの後に存在する細胞を、ガンマ－デルタＴＣＲ（Ｙ軸）及びＧＦＰ又は４１ＢＢＬ（各パネルについて示されるＸ軸）を発現する細胞を同定するための染色を用いて、実施例１のようにフローサイトメトリーによって特徴付けた。図１３に示すように、ガンマデルタＴＣＲを発現する集団を各構築物について同定し、形質導入効率を確認した。４１ＢＢＬの表面発現の検出は、構築物によって驚く程変化した。例えば、両方とも完全な４１ＢＢＬ配列を含むにもかかわらず、４１ＢＢＬ＿ＮＫｐ８０対４１ＢＢＬ＿ＯＸ４０の間で４１ＢＢＬ検出に大きな差が観察された。さらに、４１ＢＢＬ１３Ｗ＿ＯＸ４０ｒｅｖは表面発現を示し、他の実験において機能性であることが示された（図１８）。多くのレトロタンパク質が適切に折り畳むことができず、及び／又は天然の配向親タンパク質の機能性を保持しないので、これは驚くべきことである。
アルファ－ベータＴ細胞に、４１ＢＢＬ細胞外リガンドドメイン及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを有する所定のガンマ－デルタＴＣＲ及びＭＩＤＩＳ構築物を形質導入するさらなる実験を行った。異なるベクターにおいて、４１ＢＢＬは、タンパク質のＣ末端に配向され、４１ＢＢＬの膜貫通ドメインが含まれたか（本実施例では、配列番号４５を使用した）、又はタンパク質のＮ末端に配向され、ＯＸ４０膜貫通ドメインが含まれた（本実施例では、配列番号５８を使用した）。
図１４に示されるように、ＯＸ４０膜貫通ドメインを含めてタンパク質のＮ末端に配置した場合、４１ＢＢＬを細胞表面上に検出することができなかった。
これらの結果は、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞表面発現が構築物中の融合パートナーの組合せに依存し、場合によっては予想外に高い発現が達成され得ることを示す。理論に拘束されることを望むものではないが、ＭＩＤＩＳタンパク質の細胞表面上に発現される能力は、親タンパク質のＩ型／ＩＩ型配向、膜貫通ドメインの選択、特異的融合パートナーの組合せ、いずれかのドメインの天然の配向対レトロ配向、又はその組合せによって影響され得る。
実施例７：さらなる種類の操作された細胞に対するＭＩＤＩＳタンパク質の効果の評価
ベクターは、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質を、単独で又は他のタンパク質と組み合わせて、さらなる首位の細胞に導入するように設計されている。例えば、ＭＩＤＩＳタンパク質は、免疫細胞、例えば、アルファ－ベータＴＣＲ又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の外因性抗原認識受容体を発現する免疫細胞に導入される。ベクターは、ＭＩＤＩＳタンパク質を単独で又は外因性抗原認識受容体と組み合わせて導入するように設計される。構築物の非限定的な例を表１５に示す。
ＭＩＤＩＳタンパク質は、例えば、実施例１に記載されるように、細胞集団に導入される。ＭＩＤＩＳタンパク質の効果は、ＴＩＬ、ＮＫ細胞、ガンマデルタＴ細胞、アルファベータＴ細胞、Ｂ細胞、又は他の種類の免疫細胞等の様々な種類の免疫細胞で評価される。
ＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞は、例えば、実施例３～６に記載されるアッセイ、及び／又は他の公知のアッセイを使用して、細胞機能及び生物学的結果に対するＭＩＤＩＳタンパク質の影響を決定するために評価される。
実施例８：養子細胞療法のための操作された細胞の作製におけるＭＩＤＩＳタンパク質の使用
本開示の１つ以上のＭＩＤＩＳタンパク質は、養子細胞療法に使用される細胞集団で発現される。ＭＩＤＩＳタンパク質をコードする核酸は、細胞集団に導入され、例えば、実施例１に記載されるようにｅｘ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏで導入される。操作された細胞集団を培養で増殖させる。いくつかの場合、ＭＩＤＩＳタンパク質は、操作された細胞の増殖を増加させ、より多くの操作された細胞の調製が可能になる。いくつかの場合、ＭＩＤＩＳタンパク質は、目的の抗原を認識してそれに応答する細胞等の細胞の所望のサブセットの増殖を選択的に増加させる。操作された細胞の集団は、場合により細胞バンクに保存され得る。操作された細胞の集団は、癌を治療するための細胞免疫療法等の養子細胞療法の一部として、それを必要とする対象に投与することができる。操作された細胞の集団は、対象に対して自家性又は同種異系間であり得る。いくつかの場合では、養子細胞療法の有効性は、本明細書に開示されるようなＭＩＤＩＳタンパク質の有益な効果に基づいて増強される。
本実施例は、共培養後の産生によるＴＥＧの濃縮を評価する。
アルファ－ベータＴ細胞に、さらなるＭＩＤＩＳタンパク質又は他の対照タンパク質を用いて、又は用いずに、実施例１のようにＴＥＧを作製するために、所定のガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０およ配列番号び９１）を形質導入した。ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）ｅＧＦＰ対照；配列番号８１；
（ｉｉ）４１ＢＢＬｍｉｎｃｙｔｏ－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くタンパク質、この実施例では配列番号５５を使用した；
（ｉｉｉ）４１ＢＢＬ＿ＯＸ４０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４５を使用した。
ＴＥＧを、刺激としてのＲＰＭＩ－８２２６ Ｅ：Ｔ比１：１で、実施例２に記載のように所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される標的腫瘍細胞と１回共インキュベートし、７日後にＦＡＣＳ染色によって濃縮を評価して、ガンマ－デルタＴＣＲ（Ｙ軸）及びアルファベータＴＣＲ（Ｘ軸）を発現する細胞を同定した。
実施例１に記載されているように標準培養後に既に、γδ＋ＴＥＧ及びγδ＋αβ－ＴＥＧの濃縮が観察され（図１６）、両集団はそれらを刺激した後にさらに濃縮された。これらの結果は、ＭＩＤＩＳタンパク質が、目的の外因性受容体を高度に発現する選択的集団の増殖を増強することを示す。
実施例９：４１ＢＢＬ－ＯＸ４０ ＭＩＤＩＳは、標的細胞に対するＣＡＲ操作免疫細胞応答を増強する
本実施例は、ＣＡＲ操作免疫細胞が標的細胞を死滅させる能力に対する本開示のＭＩＤＩＳタンパク質の効果を評価する。
この場合は２つのベクターが使用されたことを除き、アルファ－ベータＴ細胞に、所定のＣＤ１９．ＢＢ．Ｚ ＣＡＲ（配列番号１８４）及びｅＧＦＰを形質導入して、実施例１に示されるようにＣＡＲ－Ｔを作製した。ＭＩＤＩＳ又は対照タンパク質を別個のベクターによって発現させ、アルファベータＴ細胞に、ＭＩＤＩＳ又は対照タンパク質を導入したときに等しいＭＯＩでＣＤ１９．ＢＢ．Ｚ及びＭＩＤＩＳ含有ベクターの両方を形質導入した。
実験では、ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）４１ＢＢＬ－野生型４１ＢＢＬ、本実施例では配列番号５４を使用した；
（ｉｉ）４１ＢＢＬ－ＯＸ４０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４５を使用した。
図２０Ａ上部は、ＣＡＲ及び他のタンパク質を導入するために使用される選択構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞における両方のベクターの存在をフローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ１９．ＢＢ．Ｚ及び４１ＢＢＬの発現を図２０Ａ下部に示す。
形質導入されたアルファ－ベータ細胞を、実施例２に記載されるように、ＣＤ１９ ＢＢＺ ＣＡＲによって認識される標的ＮＡＬＭ ６腫瘍細胞と共インキュベートし、各刺激後のルシフェラーゼアッセイによる残存標的細胞生存率を測定した。１回目の刺激時に、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０及びさらなるベクターなしで、４１ＢＢＬ共形質導入アルファ－ベータ細胞と比較して細胞傷害性が改善された。
第１の刺激及び第５の刺激後のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＮＡＬＭ ６標的細胞と共インキュベートしたＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を図２０Ｂに示す（残存ＨＴ－２９の発光は相対発光単位（ＲＬＵ）で示される）。結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が、操作された免疫細胞のエフェクター機能を増強し得ることを示す。例えば、細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むＭＩＤＩＳタンパク質を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、野生型４１ＢＢＬを発現するＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い細胞傷害性を示した。
実施例１０．さらなるＭＩＤＩＳの発現
本実施例は、細胞表面における操作された免疫細胞における本開示のＭＩＤＩＳタンパク質の発現を評価する。
Ｊｕｒｋａｔ ７６に、さらなるＭＩＤＩＳタンパク質又は他の対照タンパク質を含む又は含まない、所定のガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０及び配列番号９１）を形質導入した。
実験では、ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）ＣＤ７０－野生型ＣＤ７０、本実施例では、配列番号１８０を使用した；
（ｉｉ）ＣＤ７０ｍｉｎｃｙｔｏ－細胞質シグナル伝達ドメインを含まない野生型ＣＤ７０、本実施例では、配列番号１８１を使用した；
（ｉｉｉ）ＣＤ７０ｍｉｎｃｙｔｏ－ＯＸ４０－ＣＤ７０由来の細胞外及び膜貫通ドメインと、ＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインとを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号１８２を使用した。
（ｉｖ）ＣＤ７０－４１ＢＢＬ－ＯＸ４０－細胞外ＣＤ７０ドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号１８３を使用した。
図２１Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質を導入するために使用される選択構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。ＣＤ７０の発現を、ＣＤ７０コード核酸を含まない対照を含めて、上から下までの異なる構築物において図２１Ｂに示す。
さらなる実験では、本開示の所定のガンマ－デルタＴＣＲ（配列番号９０及び９１）を使用して、さらなるＭＩＤＩＳタンパク質又は他の対照タンパク質を用いて、又は用いずに、実施例１のようにＴＥＧを作製した。ＭＩＤＩＳタンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）４１ＢＢＬ－ＯＸ４０－ＩＬ２ＲＢ－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、並びにＯＸ４０及びＩＬ２ＲＢの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号１７９を使用した；
（ｉｉ）４１ＢＢＬ－ＯＸ４０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４５を使用した。
図２２Ａは、ＭＩＤＩＳタンパク質を含む又は含まない、所定のガンマデルタの選択構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。フローサイトメトリーにより測定したＭＩＤＩＳの発現を図２２Ｂに示す。
結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が複数の異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができ、操作された免疫細胞の細胞表面で発現されることを示す。
実施例１１：ＭＩＤＩＳタンパク質は操作された免疫細胞の増殖を増強する
本実施例は、操作された非アルファ－ベータＴ細胞の増殖能力に対する本開示のＭＩＤＩＳタンパク質の効果を評価する。
Ｆｉｃｏｌｌを用いた密度勾配分離によって、ＰＢＭＣを新鮮なバフィーコートから単離した。γδＴ細胞を、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して抗ＴＣＲγ／δ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから直接単離した。単離後（０日目）、γδＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、又は１μｇ／ｍＬコート抗体抗γδＴＣＲクローンＢ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び抗ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化し、ペニシリン／ストレプトマイシン（０．５％）、ヒト血清（２．４％）、ＩＬ－２（５０ＩＵ／ｍｌ）及びＩＬ－１５（２５０ＩＵ／ｍｌ）を含むＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）培地（Ｔ細胞培地）で培養した。活性化の５日後、細胞を計数し、０．３５～０．４Ｅ６細胞／ウェルで播種し、０日目と同じ手順で活性化し、レンチウイルスをＴ細胞培地で希釈することによって、選択されたレンチウイルスベクターを事前に設定された感染多重度（ＭＯＩ；１０）で形質導入した。レンチウイルス力価を実施例１に記載のように決定した。ガンマデルタＴ細胞に、ＭＩＤＩＳタンパク質又は他の対照タンパク質を形質導入した。
本実験では、ＭＩＤＩＳタンパク質及び対照タンパク質は以下の通りであった：
（ｉ）４１ＢＢＬ－野生型４１ＢＢＬ、本実施例では配列番号５４を使用した；
（ｉｉ）４１ＢＢＬ－ＯＸ４０－細胞外４１ＢＢＬリガンドドメイン、４１ＢＢＬ由来の膜貫通ドメイン、及びＯＸ４０異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＭＩＤＩＳ、本実施例では配列番号４５を使用した。
（ｉｉｉ）ｅＧＦＰ－蛍光対照タンパク質、本実施例では配列番号８１を使用した；
８、１３、１６及び２０日目に、培地をＴ細胞培地で交換し、２２日目にγδＴ細胞を回収した。回収日に存在する細胞を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００自動細胞計数器（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数し、図２３に示される増殖を、０日目の播種数で割った最終収量に基づいて計算した。
結果は、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質が非アルファ－ベータＴ細胞において発現され得、その増殖を増強し得ることを示す。
実施例１２：所定のガンマ－デルタ又はアルファ－ベータＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞におけるマルチシストロン性構築物の設計及び発現
本開示のマルチシストロン性構築物は、受容体の発現に対するヘテロ二量体受容体の受容体単量体をコードする核酸間に少なくとも１つの核酸を挿入する効果を試験するために設計された。レンチウイルスベクターは、本開示に含まれる異なる順序で複数のタンパク質をコードするＤＮＡ配列のゲノムインテグレーションを可能にするように生成された。レンチウイルスベクターは、ＯＲＦと共に様々な位置に配置された本開示のガンマＴＣＲ鎖及びデルタＴＣＲ鎖又はアルファＴＣＲ鎖及びベータＴＣＲ鎖をコードするトリシストロン性又はテトラシストロン性配列、ｅＧＦＰ、本開示のＭＩＤＩＳタンパク質、及び／又はＣＤ８－Ｑ８をコードする１つ又は２つのさらなるヌクレオチド配列、並びに３つ又は４つのタンパク質コード配列を接続する２Ａ自己切断性ペプチド配列を含んでいた（Ｘｕ Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２０１９）及びＰｉｎｃｈａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ（２０１１）に記載、上記参照）。
凍結保存したＴ細胞（αβＴ細胞又はＪ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞）を解凍し、ペニシリン／ストレプトマイシン（０．５％）、ヒト血清（２．４％）、ＩＬ－７（１７００ＩＵ／ｍｌ）及びＩＬ－１５（１５０ＩＵ／ｍｌ）（ＴＥＧ培地）を含むＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）培地中、１．６×１０＾６細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに播種した。Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ ＴｒａｎｓＡｃｔで２４時間活性化し、次いで、ＴｅｘＭＡＣＳ培地でレンチウイルスを希釈することによって、選択したレンチウイルスベクターを事前に設定した感染多重度（ＭＯＩ；０．３～２５）で形質導入した。レンチウイルスＭＯＩを、Ｐｉｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．２０２０（上記参照）と同様にＪ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＦＡＣＳに基づく滴定によって決定した。簡単に記載すると、Ｊ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞を、９６ウェルプレートに０．５Ｅ６／ｍｌの生細胞で播種した。レンチウイルス上清を濃縮し、１００倍希釈から始めて、１０％ ＦＢＳを含む冷培地で連続希釈した。連続希釈後、レンチウイルス含有上清をＪ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞で１：１に希釈し、混合物を３７℃で３日間インキュベートした。ＣＤ３＋生存細胞のパーセンテージを分析することによって力価を決定した。
２日目に培地を交換し、γδＴＣＲ又はαβＴＣＲコード配列を含むベクターで形質導入されたＴ細胞（αβＴ細胞又はＪ７６ Ｊｕｒｋａｔ細胞）を、最終体積５ｍｌでＴ２５フラスコに移した。αβＴＣＲの場合、Ｓｙｎｔｈｅｇｏの一般的ガイドラインに従って、ヌクレオフェクター２ｂ、プログラムＴ－０２３及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ Ｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、Ｔ細胞にαβＴＣＲを含むベクターを形質導入し、ＳｐＣＡＳ９及びシングルガイドＲＮＡ（ＣＡＳ ９：ｓｇＲＮＡ）のタンパク質－ＲＮＡ複合体でヌクレオフェクトしてもよく；使用され得るｓｇＲＮＡは、ＴＲＡＣについてはＡＣＡＡＡＡＣＵＧＵＧＣＵＡＧＡＣＡＵＧ（配列番号１９１）、ＧＡＧＡＡＵＣＡＡＡＡＵＣＧＧＵＧＡＡＵ（配列番号１９２）、ＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣＡ（配列番号１９３）及びＴＲＢＣ１及びＴＲＢＣ２についてはＡＣＣＣＧＡＧＧＵＣＧＣＵＧＵＵＵＧ（配列番号１９４）、ＡＧＧＵＣＧＣＵＧＵＧＵＵＵＧＡＧＣＣＡ（配列番号１９５）、ＣＧＡＣＣＡＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＣＵ（配列番号１９６）、ＧＡＵＡＣＵＧＣＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣ（配列番号１９７）である。ヌクレオフェクション後、細胞を上記のようにＴ２５フラスコに移してもよい。
６日目に、培地をもう一度交換し、Ｔ細胞を最終体積１０ｍｌでＴ７５細胞培養フラスコに移した。Ｔ細胞を解凍し８日後に回収した。
８日間のプロトコル後に存在する細胞をフローサイトメトリーによって特徴付けた。細胞をＦＡＣＳ緩衝剤（２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝剤中の選択された蛍光コンジュゲート抗体を用いて４℃で３０分間染色した。染色後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより１０分間、４℃で固定した。固定後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤でもう一度洗浄した後、１００～２００μｌのＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。
実施例１３：マルチシストロン性構築物におけるアルファ－ベータＴＣＲの所定のガンマ－デルタＴＣＲを発現する標的細胞及びエフェクターＴ細胞の共培養アッセイ
ＨＴ－２９、ＲＫＯ、Ｕ２６６細胞を含む標的腫瘍細胞を、所定の濃度で９６ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞を添加する前日に接着性標的細胞を播種し、エフェクター細胞を添加した同日に浮遊性標的細胞を播種した。
マルチシストロン性構築物において発現された所定のガンマ－デルタＴＣＲの可変ドメインは、配列番号９０及び９１によって表されるもの（ｃｌ５）又は１１１及び１１２によって表されるもの（Ｅ５７）のいずれかであった。
凍結保存したＴＥＧをエフェクター細胞として使用した。全ての共培養物に添加したエフェクター細胞の数を、実験において最も低い形質導入効率を有するＴＥＧと一致するように補正した。マルチシストロン性構築物を含むレンチウイルスベクターを添加せずに、同じ製造プロセスを経た非形質導入細胞を、１つの実験内の全ての共培養物が同じ数のＴＥＧ及び同じ数の総Ｔ細胞を含むように添加した。
共培養物を、エフェクター細胞添加日に９：１、３：１、１：１、０．３：１又は０．１１：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で、パミドロネート処理あり又はなし（１０μｍ）で設定した。非形質導入、エフェクターのみ、標的のみ、又は完全溶解対照を含めた。
３日後又は４日後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）のために共培養物から上清を回収した。非接着細胞を穏やかに再懸濁し、細胞懸濁液を丸底９６ウェルプレートに移した。発光によって細胞傷害性を測定する場合、アッセイ培地１００μｌを、Ｄ－ルシフェリンと共に、任意の残存標的細胞を含有する残存共培養プレートに添加し、１２分間インキュベートした後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって発光を測定した。
実施例１４：ガンマ鎖コード核酸が最初の位置に配置され、デルタ鎖コード核酸が最後の位置に配置されるマルチシストロン性構築物は、所定のガンマ－デルタＴＣＲの発現を増強する
本実施例では、本明細書に記載のマルチシストロン性構築物中のガンマ鎖コード核酸及びデルタ鎖コード核酸の位置が、操作された免疫細胞が所定のガンマ－デルタＴＣＲを発現する能力に及ぼす影響を評価する。
アルファ－ベータＴ細胞に、以下のガンマ－デルタＴＣＲ鎖の組合せ：所定のガンマ（配列番号９０）鎖及びデルタ（配列番号９１）鎖又はガンマ（配列番号１１１）鎖及びデルタ（配列番号１１２）鎖をコードする核酸を形質導入して、実施例１２に概説されるようにＴＥＧを生成し、ｅＧＦＰをコードする核酸（配列番号８１）をトリシストロン性構築物中のガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする核酸の間に挿入した。ｅＧＦＰをコードする核酸が構築物の最初又は最後の位置に配置された対照トリシストロン性構築物も設計した。
図２４Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質の発現を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。
ＴＥＧを、３人のドナーについて実施例１２に記載されるように染色し、ＴＥＧの％（γδＴＣＲ＋Ｔ細胞）、γδＴＣＲ＋細胞のγδＴＣＲ ＭＦＩ又は生存単一細胞のγδＴＣＲ＋αβＴＣＲ－％を、γδＴＣＲ発現の尺度として得た。フロープロットの一例（所定のガンマデルタＴＣＲ ｃｌ５、配列番号９０及び９１）を図２４Ｂに示す。組み合わせたドナー補正測定値を図２５Ａ～２５Ｃ（配列番号９０～９１を発現するＴＥＧ）及び図２６Ａ～２６Ｂ（配列番号１１１～１１２）に示す。ドナー補正のために、ドナー当たりのγ－ｅＧＦＰ－δについて得られた値を１に設定し、それに応じて他の構築物の相対変化を計算した（ドナー当たりの構築物間の相対比較）。最初の位置にガンマ及び最後の位置にデルタを有するトリシストロン性構築物は、他の組合せと比較して、明確なガンマ－デルタＴＣＲの最も高い発現を示した。
他の実験において、アルファ－ベータＴ細胞に、所定のガンマ鎖（配列番号９０）及びデルタ鎖（配列番号９１）をコードする核酸を形質導入して、実施例１２に概説されるように、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０（配列番号４５）又はＣＤ８－Ｑ８（配列番号８０）をコードする核酸を、トリシストロン性構築物においてガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする核酸の間に挿入してＴＥＧを作製した。４１ＢＢＬ－ＯＸ４０又はＱ８をコードする核酸を構築物の最後の位置に配置した対照トリシストロン性構築物も設計した。
図２７Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質の発現を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。４１ＢＢＬのＮ末端の黒色バーは、リンカー配列（配列番号２８）を表す。
ＴＥＧを、３人のドナーについて実施例１２に記載されるように染色し、γδＴＣＲ＋のγδＴＣＲ ＭＦＩ又は生存単一Ｔ細胞のγδＴＣＲ＋αβＴＣＲ－％を発現の尺度として得た。組み合わせたドナー補正測定値を図２７Ｂ～Ｃ（４１ＢＢＬ－ＯＸ４０）及び図２７Ｄ～Ｅ（ＣＤ８～Ｑ８）に示す。上記と同様にドナー補正を行った。最初の位置にガンマ鎖コード核酸を有し、最後の位置にデルタ鎖コード核酸を有するトリシストロン性構築物は、他の組合せと比較して、所定のガンマ－デルタＴＣＲの最も高い発現を示した。
他の実験において、アルファ－ベータＴ細胞に、所定のガンマ鎖（配列番号９０）及びデルタ鎖（配列番号９１）をコードする核酸を形質導入して、実施例１２に概説されるように、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０（配列番号４５）及びｅＧＦＰ（配列番号８１）をコードする核酸を、テトラシストロン性構築物においてガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする核酸の間に挿入してＴＥＧを作製した。４１ＢＢＬ－ＯＸ４０及びｅＧＦＰをコードする核酸を構築物の最初の２つ又は最後の２つの位置に配置した対照テトラシストロン性構築物も設計した。
図２８Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質の発現を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。ＴＥＧを、３人のドナーについて実施例１２に記載されるように染色し、ＴＥＧの％又は生存単一Ｔ細胞のγδＴＣＲ＋αβＴＣＲ－％を発現の尺度として得た。上記と同様にドナー補正を行った。組み合わせたドナー補正測定値を図２８Ｂ～Ｃに示す。最初の位置にガンマ鎖コード核酸を有し、最後の位置にデルタ鎖コード核酸を有するテトラシストロン性構築物は、他の組合せと比較して、所定のガンマ－デルタＴＣＲの最も高い発現を示した。これらのデータは、受容体モノマー以外のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を、マルチシストロン性構築物中の最初の位置及び最後の位置のヘテロ二量体の一部をコードする核酸と共に挿入することにより、操作された免疫細胞におけるヘテロ二量体の発現を改善することができることをさらに実証している。
実施例１５：ガンマ鎖又はデルタ鎖をコードする核酸が最初の位置に位置し、デルタ鎖又はガンマ鎖をコードする核酸が最後の位置に位置するマルチシストロン性構築物は、標的細胞に対する最高の細胞応答をもたらす
本実施例は、操作された免疫細胞が標的細胞に応答する能力に対する、マルチシストロン性構築物中の本開示の受容体のヘテロ二量体単量体をコードする核酸の位置の影響を評価する。アルファ－ベータＴ細胞に、実施例１２に概説されるように以下のガンマ－デルタＴＣＲ鎖の組合せ：所定のガンマ（配列番号９０）鎖及びデルタ（配列番号９１）鎖又はガンマ（配列番号１１１）鎖及びデルタ（配列番号１１２）鎖をコードする核酸を形質導入して、ｅＧＦＰをコードする核酸（配列番号８１）をトリシストロン性構築物中のガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする核酸の間に挿入した。ｅＧＦＰをコードする核酸が構築物の最初又は最後の位置に配置された対照トリシストロン性構築物も設計した。
図２４Ａ及び図２９Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質の発現を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。
実施例１３に記載の所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される標的腫瘍細胞と、ＴＥＧを共インキュベートし、上清の収集及びルシフェラーゼアッセイによる残存標的細胞生存率の測定が含まれた。実験には、１０μＭパミドロネート処理有り又は無しの条件を含めた。
エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏ異所性発現ＨＴ－２９と共インキュベートした代表的なドナーのトリシストロン性構築物の最初の位置の所定のガンマ鎖（配列番号９０）及び最後の位置のデルタ鎖（配列番号９１）をコードする核酸又は最初の位置のデルタ鎖及び最後の位置のガンマ鎖をコードする核酸を発現するＴＥＧの細胞傷害性（生存標的の相対発光単位による）及びＩＦＮγ放出をそれぞれ図２９Ｂ～Ｃ（ガンマ－ｅＧＦＰ－デルタの順）及び図３０Ａ～Ｂ（デルタ－ｅＧＦＰ－ガンマの順）に示す。構築物の最初又は最後の位置からガンマ鎖又はデルタ鎖を発現するＴＥＧとの共培養は、有意に生存可能な標的細胞が少なく、有意に高いレベルのＩＦＮｙ放出を有した。
０．１１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所的に発現するＲＫＯと共インキュベートした代表的なドナーの、トリシストロン性構築物の最初の位置からの所定のガンマ鎖（配列番号１１１）及び最後の位置からのデルタ鎖（配列番号１１２）を発現するＴＥＧの細胞傷害性を図３０Ｃに示し、結果は配列番号９０及び配列番号９１について得られた結果と一致している。
他の実験では、実施例１２に概説されるように、所定のガンマ（配列番号９０）鎖及びデルタ（配列番号９１）鎖をコードする核酸でアルファ－ベータＴ細胞を形質導入してＴＥＧを生成し、トリシストロン性構築物中のガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする核酸の間にタンパク質をコードするさらなる核酸を挿入した。対照も実施例１４に概説されるように設計した。本実施例におけるさらなるタンパク質は、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０（配列番号４５）及びＣＤ８－Ｑ８（配列番号８０）であった。実施例１３に記載の所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される標的腫瘍細胞と、ＴＥＧを共インキュベートし、上清の収集及びルシフェラーゼアッセイによる残存標的細胞生存率の測定が含まれた。
０．３：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９と共インキュベートした代表的なドナーの所定のガンマデルタを発現するＴＥＧの細胞傷害性（生存標的の相対発光単位による）を図３１－Ｂに示す。構築物中でガンマ鎖コード核酸が最初に位置し、デルタ鎖コード核酸が最後に位置し、４１ＢＢＬ－ＯＸ４０又はＣＤ８－Ｑ８をコードする核酸がガンマ鎖コード核酸とデルタ鎖コード核酸との間に位置する構築物を発現するＴＥＧは、有意により高い細胞傷害性を示した。
実施例１６：ガンマ鎖コード核酸が最初の位置に位置し、デルタ鎖コード核酸が最後の位置に位置するマルチシストロン性構築物は、最初の位置のデルタ鎖コード核酸及び最後の位置のガンマ鎖コード核酸と比較して、標的細胞に対するより高い細胞応答をもたらす
本実施例は、本開示のマルチシストロン性構築物中のガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする核酸の位置（順序）が、それらを発現する細胞が標的細胞に応答する能力に及ぼす影響を評価する。アルファ－ベータＴ細胞に、実施例１２に概説されるように以下のガンマ－デルタＴＣＲ鎖の組合せ：所定のガンマ（配列番号９０）鎖及びデルタ（配列番号９１）鎖又はガンマ（配列番号１１１）鎖及びデルタ（配列番号１１２）鎖をコードする核酸を形質導入して、ｅＧＦＰをコードする核酸（配列番号８１）又は４１ＢＢＬ－ＯＸ４０（配列番号４５）をトリシストロン性構築物中のガンマ鎖及びデルタ鎖をコードする核酸の間に挿入した。
図３２Ａは、ガンマ－デルタＴＣＲ及び他のタンパク質を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。
実施例１３に記載の所定のガンマ－デルタＴＣＲによって認識される標的腫瘍細胞と、ＴＥＧを共インキュベートし、ルシフェラーゼアッセイによって残存標的細胞生存率を測定した。実験には、パミドロネート処理（１０μｍ）有り又は無しの条件を含めた。
３：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＨＴ－２９と共インキュベートした代表的なドナーの所定のガンマデルタ（配列番号９０～９１）を発現するＴＥＧの細胞傷害性（生存標的の相対発光単位による）を図３２Ｂに示す。３：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でルシフェラーゼ－ｔｄＴｏｍａｔｏを異所性発現するＲＫＯと共インキュベートした代表的なドナーの所定のガンマデルタ（配列番号１１１～１１２）を有するＴＥＧの細胞傷害性を図３２Ｃに示す。ＴＥＧは、ガンマ鎖コード核酸及びデルタ鎖コード核酸がトリシストロン性構築物中の最初又は最後の核酸としていつ位置付けられるかに関係なく、非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴＲ）と比較して標的細胞を有意に死滅させるが、ガンマ鎖コード核酸を最初の位置、デルタ鎖コード核酸を最後の位置に有するＴＥＧ発現構築物は、デルタ鎖コード核酸が最初に位置付けられ、ガンマ鎖コード核酸が最後に位置付けられたＴＥＧ発現構築物と比較して有意に高い細胞傷害性を示した。
実施例１７：ベータ鎖コード核酸が最初の位置に配置され、アルファ鎖コード核酸が最後の位置に配置されているマルチシストロン性構築物は、アルファ－ベータＴＣＲのより高い発現をもたらす。
本実施例は、操作された免疫細胞が標的細胞に応答する能力に対する、本開示のマルチシストロン性構築物中のアルファ鎖コード核酸及びベータ鎖コード核酸の位置（順序）の影響を評価する。
Ｊｕｒｋａｔ ７６ Ｔ細胞に、所定のアルファ（配列番号１９９）鎖及びベータ（配列番号１９８）鎖をコードする核酸と、アルファ鎖及びベータ鎖をコードする核酸の間に挿入されたｅＧＦＰをコードする核酸（配列番号８１）とを含むトリシストロン性構築物を形質導入して、外因性アルファベータＴＣＲ発現操作Ｔ細胞を作製した。ｅＧＦＰをコードする核酸が構築物の最初又は最後の位置に配置された対照トリシストロン性構築物も設計した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＣＲＩＳＰＲ編集に供しなかった点は異なるが、形質導入を、固定されたＭＯＩを用いて実施例１２に概説されるように行った。形質導入の３日後、アルファベータＴＣＲの発現及び形質導入効率を、実施例１２に記載されるようにフローサイトメトリーによって評価した。アルファベータＴＣＲの表面発現を抗ＣＤ３εで評価し、アルファベータＴＣＲの全発現を抗アルファベータＴＣＲ抗体で、固定した後に細胞を染色することによって評価した（表１８）。細胞表面発現と細胞内発現との比は、アルファベータＴＣＲ輸送及び表面発現の効率を実証する。
図３３Ａは、アルファベータＴＣＲ及び他のタンパク質の発現を導入するために使用される構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは、自己切断性ペプチド（配列番号２０６、配列番号２０８）を表す。
細胞内アルファベータＴＣＲ発現で割ったアルファベータＴＣＲ表面発現の比は、図３３Ｂに示されており、対照と比較して、最初の位置にベータ鎖コード核酸、及び最後の位置にアルファ鎖コード核酸を有するトリシストロン性構築物を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてより高かった。
他の実験では、トリシストロン性構築物中の最初の位置のベータ鎖コード核酸及び最後の位置のアルファ鎖コード核酸の順序を、最初の位置のアルファ鎖コード核酸及び最後の位置のベータ鎖コード核酸の順序と比較した。構築物はさらに、アルファ鎖及びベータ鎖をコードする核酸の間に挿入されたｅＧＦＰ（配列番号８１）をコードする核酸を含んでいた。Ｊｕｒｋａｔ ７６ Ｔ細胞に、所定のアルファ（配列番号１９９）及びベータ（配列番号１９８）鎖をコードする核酸を含む構築物を形質導入して、外因性アルファベータＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞を生成した。図３３Ｃは、本実験で使用した構築物の概略図を示す。Ｐ２Ａ及びＴ２Ａは自己切断性ペプチドを表す。形質導入された細胞の染色を、本実施例の第１の実験に記載されるように行った。アルファベータＴＣＲ表面発現を細胞内アルファベータＴＣＲ発現で割った比を図３３Ｄに示す。
ＸＩ．実施形態
実施形態１．細胞外リガンドドメイン、膜貫通ドメイン、及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む多方向シグナル伝達体（ＭＩＤＩＳ）タンパク質であって、相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される第１のシグナル伝達経路及び相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される第２のシグナル伝達経路を含む多方向シグナル伝達を誘導し、第１のシグナル伝達経路及び第２のシグナル伝達経路が、標的生物学的結果を共に誘導する、多方向シグナル伝達体タンパク質。この第１及び第２のシグナル伝達経路は、同じ細胞内で起こり得る。
実施形態２．標的生物学的結果が、細胞増殖、細胞生存、細胞分化、細胞脱分化、若しくは細胞分化転換、又はその組合せである、実施形態１に記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３．標的生物学的結果が、免疫エフェクター機能、抗癌免疫応答、又はその組合せである、実施形態１に記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態４．多方向シグナル伝達が、インサイドアウトシグナル伝達及びアウトサイドインシグナル伝達を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態５．細胞外リガンドドメインが、免疫共受容体リガンドに由来するアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態６．細胞外リガンドドメインが、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態７．細胞外リガンドドメインが、免疫共刺激リガンド由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態８．細胞外リガンドドメインが、抗体に由来する抗原結合性断片を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態９．細胞外リガンドドメインが、短鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、アフィボディ、アンキリンリピート、ｄａｒｐｉｎ、ナノボディ、アビマー、アドネクチン、アンチカリン、フィノマー、クニッツドメイン、ノチン、又はβ－ヘアピン模倣物を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１０．細胞外リガンドドメインが、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー、サイトカイン、Ｃ型レクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、又は抗体若しくはその抗原結合性断片由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１１．細胞外リガンドドメインが、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ又はＣＤ７０に由来するアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１２．細胞外リガンドドメインが４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１３．細胞外リガンドドメインが、配列番号０１～０６又は１７４のいずれか１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～７及び１０～１２のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１４．異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、サイトカイン受容体又はＣ型レクチン受容体由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１５．異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型又はＩＩ型膜貫通タンパク質由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１６．異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激免疫受容体由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つのＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１７．異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＣＤ７０又はＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１８．異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態１９．異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号０７～１９、１７５又は１７６のいずれか１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２０．相互作用パートナーが、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２８又はＲＡＮＫＬである、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２１．１つ以上のさらなる細胞外リガンドドメインをさらに含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２２．１つ以上のさらなる細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２３．細胞外リガンドドメインのＮ末端からＣ末端への配向が、野生型アミノ酸配列と比較して反転している、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２４．異種性細胞内シグナル伝達ドメインのＮ末端からＣ末端への配向が、野生型アミノ酸配列と比較して反転している、実施形態１～２３のいずれか１つのＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２５．相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合時に、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体又は多量体としてシグナル伝達する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２６．相互作用パートナーが免疫細胞によって発現される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２７．相互作用パートナーがＴ細胞によって発現される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２８．相互作用パートナーが免疫共受容体である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態２９．膜貫通ドメイン及び細胞外リガンドドメインが同じタンパク質に由来する、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３０．配列番号４５～５３、５７～６５、６７、７１～７３、７６～７８、１７８～１７９又は１８２～１８３と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３１．ＩＴＡＭ、ＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメイン、又はＣＤ３鎖由来の細胞内ドメインを含まない、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３２．ＭＩＤＩＳタンパク質がｈｅｍＩＴＡＭを含有するが、ＩＴＡＭを含まない、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３３．相互作用パートナーへの結合時にリン酸化されない、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３４．相互作用パートナーへの結合時にリン酸化される、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３５．多方向シグナル伝達が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのシグナル伝達経路を含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３６．多方向シグナル伝達が、相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのシグナル伝達経路を含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３７．多方向シグナル伝達が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される１つのシグナル伝達経路及び相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される１つのシグナル伝達経路を含む双方向性シグナル伝達である、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３８．多方向シグナル伝達が標的生物学的結果を誘導する、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現するように操作された細胞集団における使用のための実施形態１～３７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質。
実施形態３９．操作された細胞の集団を作製する方法であって：（ａ）操作された細胞の集団中の少なくとも１つの細胞において実施形態１～３７のいずれか１つのＭＩＤＩＳタンパク質を発現させること、及び（ｂ）操作された細胞の集団を、操作された細胞の集団の増殖に適した条件で培養することを含む方法。
実施形態４０．抗原に応答する細胞について細胞の集団を濃縮する方法であって：（ａ）細胞集団中の少なくとも１つの細胞において、実施形態１～３７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質を発現させること；及び（ｂ）細胞集団を、抗原又は抗原を提示する細胞と共に培養することを含む、方法。
実施形態４１．実施形態１～３７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質を発現する操作された細胞。
実施形態４２．それを必要とする対象の治療に使用するための実施形態４１に記載の操作された細胞。
実施形態４３．それを必要とする対象を治療する方法であって、実施形態４１に記載の操作された細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態４４．実施形態１～３７のいずれか１つに記載のＭＩＤＩＳタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態４５．外因性抗原認識受容体をコードする、実施形態４２４４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４６．外因性抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、アルファ－ベータＴ細胞受容体、又はガンマ－デルタＴ細胞受容体である、実施形態４５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４７．ＭＩＤＩＳタンパク質及び外因性抗原認識受容体が１つの転写物中で発現される、実施形態４５～４６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態４８．ＭＩＤＩＳタンパク質及び外因性抗原認識受容体が、自己切断性ペプチドをコードする１つの転写物中で発現される、実施形態４５～４６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態４９．実施形態４４～４８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態５０．それを必要とする対象の治療に使用するための実施形態４９に記載のベクター。
実施形態５１．治療方法であって、それを必要とする対象に実施形態５０に記載のベクターを投与することを含む、方法。
実施形態５２．細胞外リガンドドメイン、膜貫通ドメイン、及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む多方向シグナル伝達体（ＭＩＤＩＳ）タンパク質を発現する操作された細胞であって、細胞によって発現される相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される第１のシグナル伝達経路及び相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される第２のシグナル伝達経路を含む多方向シグナル伝達を誘導し、第１のシグナル伝達経路が、操作された細胞の標的生物学的機能を調節し、第２のシグナル伝達経路が、相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能を調節する、操作された細胞。
実施形態５３．操作された細胞の標的生物学的機能が誘導される、実施形態５２に記載の操作された細胞。
実施形態５４．操作された細胞の標的生物学的機能が低下している、実施形態５２に記載の操作された細胞。
実施形態５５．操作された細胞の標的生物学的機能が、生存、増殖、免疫エフェクター機能、細胞傷害性応答、抗癌応答、細胞分化、細胞脱分化、又は細胞分化転換を含む、実施形態５２～５４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態５６．細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合する際に、操作された細胞の標的生物学的機能が、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する細胞よりも少なくとも１０％長く調節される、実施形態５２～５５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態５７．細胞外リガンドドメインが相互作用パートナーに結合する際に、操作された細胞の標的生物学的機能が、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する細胞と比較して、少なくとも１０％増加又は少なくとも１０％低減する、実施形態５２～５６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態５８．細胞外リガンドドメイン、膜貫通ドメイン、及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含む多方向シグナル伝達体（ＭＩＤＩＳ）タンパク質を発現する操作された細胞であって、細胞によって発現される相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される第１のシグナル伝達経路及び相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される第２のシグナル伝達経路を含む多方向シグナル伝達を誘導し、多方向シグナル伝達が、相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能を調節し、相互作用パートナーを発現する細胞に対する細胞傷害性応答を誘導しない、操作された細胞。
実施形態５９．相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能が誘導される、実施形態５２～５８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６０．相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能が低減される、実施形態５２～５８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６１．相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能が、生存、増殖、免疫エフェクター機能、抗癌応答、細胞分化、細胞脱分化、又は細胞分化転換を含む、実施形態５２～６０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６２．相互作用パートナーを発現する細胞の標的生物学的機能が、癌細胞に対する細胞傷害性応答を含む、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６３．相互作用パートナーを発現する細胞が、免疫細胞、Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔエフェクター細胞、リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、骨髄系細胞、単球、マクロファージ、好中球、線維芽細胞、ケラチノサイト、間葉系幹細胞、内皮細胞又は間質細胞である、実施形態５２～６２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６４．免疫細胞、Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔエフェクター細胞、リンパ球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ又は好中球である、実施形態５２～６３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６５．操作された細胞及び相互作用パートナーを発現する細胞が同じ細胞種である、実施形態５２～６４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６６．操作された細胞と相互作用パートナーを発現する細胞とが異なる細胞種である、実施形態５２～６４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６７．操作された細胞又は相互作用パートナーを発現する細胞が哺乳動物細胞である、実施形態５２～６６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６８．操作された細胞又は相互作用パートナーを発現する細胞がヒト細胞である、実施形態５２～６７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態６９．外因性抗原認識受容体を発現する、実施形態５２～６８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７０．外因性抗原認識受容体がトランスジェニックＴＣＲ、アルファ－ベータＴＣＲ、ガンマ－デルタＴＣＲ、又はキメラ抗原受容体である、実施形態６９に記載の操作された細胞。
実施形態７１．外因性抗原認識受容体がガンマ－デルタＴＣＲである、実施形態６９に記載の操作された細胞。
実施形態７２．ガンマ－デルタＴＣＲが、（ａ）γ２、γ３、γ４、γ５、γ８、γ９、及びγ１１からなる群から選択されるγ鎖；（ｂ）δ１、δ２、δ３及びδ５からなる群から選択されるδ鎖；又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）の任意の組合せを含む、実施形態７１に記載の操作された細胞。
実施形態７３．γ鎖がγ９であり、δ鎖がδ２である、実施形態７２に記載の操作された細胞。
実施形態７４．ガンマ－デルタＴＣＲが、配列番号８５、８６、８７、９４、９５、９６、１０１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２７、１３０のいずれか１つと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性を有するＣＤＲ配列を含むγ鎖を含み、ガンマ－デルタＴＣＲが、配列番号８２、８３、８４、９７、９８、９９、１００、１０２、１１４、１１６、１１８、１２６、１３１のいずれか１つと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性を有するＣＤＲ配列を含むδ鎖を含む、実施形態７１～７３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７５．操作された細胞が、１つ以上の遺伝子の欠失又は破壊をさらに含む、実施形態８２～７４のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７６．ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、又は免疫チェックポイント遺伝子の欠失又は破壊をさらに含む、実施形態５２～７５のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７７．相互作用パートナーを発現する、実施形態５２～７６のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７８．多方向シグナル伝達が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのシグナル伝達経路を含む、実施形態５２～７７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態７９．多方向シグナル伝達が、相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのシグナル伝達経路を含む、実施形態５２～７８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８０．多方向シグナル伝達が双方向性シグナル伝達である、実施形態５２～７７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８１．それを必要とする対象の治療に使用するための実施形態５２～８０のいずれか１つに記載の操作された細胞。
実施形態８２．それを必要とする対象を治療する方法であって、実施形態８２～８０のいずれか１つに記載の操作された細胞を対象に投与することを含む方法。
実施形態８３．操作された細胞の集団を作製する方法であって、実施形態５２～７７のいずれか１つに記載の複数の操作された細胞を含む操作された細胞の集団を適切な条件で培養することを含む、方法。
実施形態８４．多方向シグナル伝達体（ＭＩＤＩＳ）タンパク質を発現する少なくとも１つの細胞及び相互作用パートナーを発現する少なくとも１つの細胞を含む操作された細胞の集団であって、ＭＩＤＩＳタンパク質が：細胞外リガンドドメインであって、相互作用パートナーに結合することができる細胞外リガンドドメイン；膜貫通ドメイン；及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み；相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される第１のシグナル伝達経路及び相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される第２のシグナル伝達経路を含む多方向シグナル伝達を誘導する、細胞の集団。
実施形態８５．操作された細胞の集団中の少なくとも１つの細胞が外因性抗原認識受容体を発現する、実施形態８４に記載の操作された細胞の集団。
実施形態８６．外因性抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、アルファ－ベータＴ細胞受容体、又はガンマ－デルタＴ細胞受容体である、実施形態８５に記載の操作された細胞の集団。
実施形態８７．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現する又は提示する細胞に曝露されると、操作された細胞の集団の増殖が、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞の集団と比較して少なくとも１０％増加する、実施形態８５～８６のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態８８．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現する又は提示する細胞に曝露されると、抗原を発現する又は提示する細胞の死滅が、抗原を発現する又は提示する細胞が、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞の集団に曝露された場合の死滅と比較して、少なくとも１０％増加する、実施形態８５～８７のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態８９．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現又は提示する細胞に曝露された際に、抗原を発現又は提示する細胞の少なくとも５０％を死滅させる操作された細胞の能力が、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞の集団よりも少なくとも３日間長く持続する、実施形態８５～８８のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態９０．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現する又は提示する細胞に少なくとも５日間曝露されると、操作された細胞の集団による疲弊マーカーの発現が、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない、対応する操作された細胞の集団よりも少なくとも１０％低い、実施形態８５～８９のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態９１．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現する又は提示する細胞に曝露されると、操作された細胞の集団による免疫エフェクター分子の産生が、ＭＩＤＩＳタンパク質を発現しない対応する操作された細胞の集団よりも少なくとも１０％高い、実施形態８５～９０のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態９２．操作された細胞の集団における少なくとも１つの細胞が、ＭＩＤＩＳタンパク質及び相互作用パートナーを発現する、実施形態８４～９１のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態９３．それを必要とする対象を治療する方法であって、実施形態８４～９２のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団を対象に投与することを含む、方法。
実施形態９４．多方向シグナル伝達が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのシグナル伝達経路を含む、実施形態８４～９３のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態９５．多方向シグナル伝達が、相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのシグナル伝達経路を含む、実施形態８４～９４のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態９６．多方向シグナル伝達が双方向性シグナル伝達である、実施形態８４～９３のいずれか１つに記載の操作された細胞の集団。
実施形態９７．操作された細胞の集団を作製する方法であって、操作された細胞の集団中の少なくとも１つの細胞において多方向シグナル伝達体（ＭＩＤＩＳ）タンパク質を発現させること、及び操作された細胞の集団の増殖に適した条件で操作された細胞の集団を培養することを含み、ＭＩＤＩＳタンパク質が；細胞外リガンドドメインであって、操作された細胞の集団中の少なくとも１つの細胞によって発現される相互作用パートナーに結合することができる細胞外リガンドドメイン；膜貫通ドメイン；及び異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み；相互作用パートナーへの細胞外リガンドドメインの結合が、ＭＩＤＩＳタンパク質の異種性細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介される第１のシグナル伝達経路及び相互作用パートナーの細胞内ドメインによって媒介される第２のシグナル伝達経路を含む多方向シグナル伝達を誘導する、方法。
実施形態９８．対象が癌を有する、実施形態４３、５１、７６、及び８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９．操作された細胞又は操作された細胞の集団が対象に対して自家性である、実施形態４３、８２、９３及び９８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１００．操作された細胞又は操作された細胞の集団が、対象と同種異系、ＨＬＡ一致、ＨＬＡ不一致、又はハプロタイプ一致である、実施形態４３、８２、９３、及び９８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１．少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質であって：
－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルは、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介して伝達され、キメラタンパク質が、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメイン並びに４１ＢＢの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むか、又はそれらからなるタンパク質ではない、キメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質。
実施形態１０２．少なくとも２つの細胞内シグナルが単一細胞で生成される、実施形態１０１に記載のキメラタンパク質。
実施形態１０３．相互作用パートナーが：
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインと相互作用することができる細胞外ドメイン、
－膜貫通ドメイン、及び
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインへの相互作用パートナーの細胞外ドメインの結合後に第２のシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む、実施形態１０１又は１０２に記載のキメラタンパク質。
実施形態１０４．少なくとも２つの細胞内シグナルが、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与する、実施形態１０１～１０３のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１０５．ａ．細胞外リガンドドメインはＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られるか、又は
ｂ．細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１０６．細胞が、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である、実施形態１０２～１０５のいずれか１つのキメラタンパク質。
実施形態１０７．生物学的パラメータ及び／又は機能が、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択される、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１０８．－細胞外リガンドドメインが、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー、サイトカイン、Ｃ型レクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、又は抗体若しくはその抗原結合性断片由来のアミノ酸配列を含み；及び
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、サイトカイン受容体又はＣ型レクチン受容体由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１０１～１０７のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１０９．－細胞外リガンドドメインが、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、又はＲＡＮＫからのアミノ酸配列を含み、
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０又はＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１０８に記載のキメラタンパク質。
実施形態１１０．実施形態１０９に記載のキメラタンパク質であって、
（ａ）細胞外リガンドドメインは４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
（ｂ）細胞外リガンドドメインがＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）細胞外リガンドドメインが４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＮＫｐ８０由来のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）細胞外リガンドドメインがＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）細胞外リガンドドメインがＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）細胞外リガンドドメインがＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、
（ｇ）細胞外リガンドドメインがＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、又は
（ｈ）細胞外リガンドドメインがＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質。
実施形態１１１．ＩＴＡＭ、又はＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメインを含有しない、実施形態１０１～１１０のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１１２．実施形態１０１～１１１のいずれか１つに記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態１１３．実施形態１１２で定義されるポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくはウイルスベクターである、ベクター。
実施形態１１４．実施形態１１２で定義されるポリヌクレオチド又は実施形態１１３で定義されるベクターを含む細胞であって、好ましくは前記細胞が前記キメラタンパク質を発現し、より好ましくは前記細胞が相互作用パートナーも発現する細胞。
実施形態１１５．実施形態１１４で定義される少なくとも１つの細胞を含む、細胞の集団。
実施形態１１６．細胞が、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である、実施形態１１４に記載の細胞又は実施形態１１５に記載の細胞の集団。
実施形態１１７．外因性抗原認識受容体を発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、実施形態１１５又は１１６に記載の細胞の集団。
実施形態１１８．実施形態１０１～１１１のいずれか１つで定義されるキメラタンパク質を発現する少なくとも１つの細胞が、外因性抗原認識受容体も発現する、実施形態１１７に記載の細胞集団。
実施形態１１９．外因性抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、アルファ－ベータＴ細胞受容体、又はガンマ－デルタＴ細胞受容体である、実施形態１１７又は１１８に記載の細胞の集団。
実施形態１２０．Ｔ細胞が、ガンマ－デルタＴ細胞受容体を発現するアルファ－ベータＴ細胞である、実施形態１１５～１１９のいずれか１つに記載の細胞の集団。
実施形態１２１．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現するか又は提示する細胞に実施形態１０１～１１１のいずれか１つで定義されるキメラタンパク質を発現する細胞を曝露すると、前記細胞の集団の増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅が、キメラタンパク質を発現しない細胞の対応する集団と比較して少なくとも１０％増加する、実施形態１１５～１２０のいずれか１つに記載の細胞の集団。
実施形態１２２．キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は細胞の集団が、疾患又は状態を治療するための使用のためのものであり、少なくとも２つの細胞内シグナルが、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与し、前記生物学的パラメータが疾患若しくは状態の治療に寄与する、実施形態１０１～１１１のいずれか１つに記載のキメラタンパク質、実施形態１１２に記載のポリヌクレオチド、実施形態１１３に記載のベクター、実施形態１１４に記載の細胞又は実施形態１１５～１２１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１２３．－生物学的パラメータが増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／若しくは腫瘍細胞死滅から選択され、
－細胞が免疫細胞であり、並びに／又は
－疾患が癌である、実施形態１２２に記載のキメラタンパク質、実施形態１２２に記載のポリヌクレオチド、実施形態１２２に記載のベクター、実施形態１２２に記載の細胞又は実施形態１２２に記載の細胞の集団。
実施形態１２４．－その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
－膜貫通ドメイン、及び
－細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
第２の細胞内シグナルが、相互作用パートナーの細胞内ドメインを介して伝達される、
少なくとも２つの誘導性細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質。
実施形態１２５．相互作用パートナーが：
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインと相互作用することができる細胞外ドメイン、
－膜貫通ドメイン、及び
－キメラタンパク質の細胞外リガンドドメインへの相互作用パートナーの細胞外ドメインの結合後に第２のシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む、実施形態１２４に記載のキメラタンパク質。
実施形態１２６．少なくとも２つの、誘導性の細胞内シグナルが、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与する、実施形態１２４又は１２５に記載のキメラタンパク質。
実施形態１２７．ａ．細胞外リガンドドメインはＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインはＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られるか、又は
ｂ．細胞外リガンドドメインは、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる、異種性細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる、実施形態１２４～１２６のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１２８．細胞が、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である、実施形態１２６～１２７のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１２９．生物学的パラメータ及び／又は機能が、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択される、実施形態１２６～１２８のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１３０．－細胞外リガンドドメインが、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー、サイトカイン、Ｃ型レクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、又は抗体若しくはその抗原結合性断片由来のアミノ酸配列を含み；及び
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、サイトカイン受容体又はＣ型レクチン受容体由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１２４～１２９のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１３１．－細胞外リガンドドメインが、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、又はＲＡＮＫからのアミノ酸配列を含み、
－異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０又はＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含む、実施形態１３０に記載のキメラタンパク質。
実施形態１３２．実施形態１３１に記載のキメラタンパク質であって、
（ａ）細胞外リガンドドメインが４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、細胞外リガンドドメインがＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られ、
（ｂ）細胞外リガンドドメインがＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）細胞外リガンドドメインが４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＮＫｐ８０由来のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）細胞外リガンドドメインが、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）細胞外リガンドドメインが、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、
（ｆ）細胞外リガンドドメインが、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、
（ｇ）細胞外リガンドドメインがＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインが４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｈ）細胞外リガンドドメインがＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質。
実施形態１３３．ＩＴＡＭ、又はＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメインを含有しない、実施形態１２４～１３２のいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
実施形態１３４．実施形態１２４～１３３のいずれか１つに記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態１３５．実施形態１３４で定義されるポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくはウイルスベクターである、ベクター。
実施形態１３６．実施形態１３４で定義されるポリヌクレオチド又は実施形態１３５で定義されるベクターを含む細胞であって、好ましくは前記細胞が前記キメラタンパク質を発現し、より好ましくは前記細胞が相互作用パートナーも発現する細胞。
実施形態１３７．実施形態１３６で定義される少なくとも１つの細胞を含む、細胞の集団。
実施形態１３８．細胞が、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である、実施形態１３６に記載の細胞又は実施形態１３７に記載の細胞の集団。
実施形態１３９．外因性抗原認識受容体を発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、実施形態１３７又は１３８に記載の細胞の集団。
実施形態１４０．実施形態１２４～１３３のいずれか１つで定義されるキメラタンパク質を発現する少なくとも１つの細胞が、外因性抗原認識受容体も発現する、実施形態１３９に記載の細胞の集団。
実施形態１４１．外因性抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、アルファ－ベータＴ細胞受容体、又はガンマ－デルタＴ細胞受容体である、実施形態１３９又は１４０に記載の細胞の集団。
実施形態１４２．Ｔ細胞が、ガンマ－デルタＴ細胞受容体を発現するアルファ－ベータＴ細胞である、実施形態１３７～１４１のいずれか１つに記載の細胞の集団。
実施形態１４３．外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現するか又は提示する細胞に実施形態１２４～１３３のいずれか１つで定義されるキメラタンパク質を発現する細胞を曝露すると、前記細胞の集団の増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅が、キメラタンパク質を発現しない細胞の対応する集団と比較して少なくとも１０％増加する、実施形態１３７～１４２のいずれか１つに記載の細胞の集団。
実施形態１４４．キメラタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は細胞の集団が、疾患又は状態を治療するための使用のためのものであり、少なくとも２つの誘導性細胞内シグナルが、キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与し、前記生物学的パラメータが疾患若しくは状態の治療に寄与する、実施形態１２４～１３３のいずれか１つに記載のキメラタンパク質、実施形態１３４に記載のポリヌクレオチド、実施形態１３５に記載のベクター、実施形態１３６に記載の細胞又は実施形態１３７～１４３のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態１４５．－生物学的パラメータが、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／若しくは腫瘍細胞死滅から選択され、
－細胞が免疫細胞であり、並びに／又は
－疾患が癌である、実施形態１４４に記載のキメラタンパク質、実施形態１４４に記載のポリヌクレオチド、実施形態１４４に記載のベクター、実施形態１４４に記載の細胞又は実施形態１４４に記載の細胞の集団。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、及び置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

Claims (39)

  1. ヘテロ二量体受容体の各モノマーをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、前記モノマーの各々をコードする核酸の間に挿入された前記モノマー以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含み、前記核酸が、同じプロモーター配列に作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
  2. 前記プロモーター配列が、ＥＦ１α、ＭＳＣＶ、ＥＦ１α－ＨＴＬＶ－１ハイブリッドプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マウス乳がんウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ＭＨＣクラスＩＩ、凝固第ＩＸ因子、インスリンプロモーター、ＰＤＸ１プロモーター、ＣＤ１１、ＣＤ４、ＣＤ２、ｇｐ４７プロモーター、ＰＧＫ、β－グロビン、ＵｂＣ及びＭＮＤの群、好ましくはＭＳＣＶ、ＭＭＬＶ、ＥＦ１α及びＭＮＤから選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記ポリヌクレオチドが、それらの共発現を促進する前記核酸の各々の間に挿入されたヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ヌクレオチド配列が、２Ａ自己切断性ペプチドをコードする配列であるか、又はＩＲＥＳ配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記２Ａ自己切断性ペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａペプチドから選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記ポリヌクレオチドが、トリシストロン性又はテトラシストロン性である、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ヘテロ二量体受容体が外因性抗原認識受容体である、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記外因性抗原認識受容体が、Ｂ細胞受容体重鎖及び軽鎖ヘテロダイマー、Ｔｏｌｌ様受容体１及び２ヘテロダイマー、食作用性受容体Ｍａｃ－１、ＣＤ９４ ＮＫＧ２Ｃ又はＮＫＧ２Ｅ受容体、Ｔ細胞受容体、αβＴ細胞受容体、γδＴ細胞受容体、並びにその機能性断片から選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記外因性抗原認識受容体が、αβＴ細胞受容体、γδＴ細胞受容体、又はその機能性断片である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチドであって、
    （Ａ）が（ｉ）－（ｉｉ）－（ｉｉｉ）で表される核酸であり、
    （ｉ）が、αβＴ細胞受容体のα鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｉｉ）が、αβＴ細胞受容体のα鎖若しくはβ鎖又はその機能性断片以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸であり；
    （ｉｉｉ）が、αβＴ細胞受容体のβ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｉｉ）が、（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に挿入され、
    （Ｂ）が（ｉｖ）－（ｖ）－（ｖｉ）で表される核酸であり、
    （ｉｖ）が、αβＴ細胞受容体のβ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｖ）が、αβＴ細胞受容体のα鎖若しくはβ鎖又はその機能性断片以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸であり；
    （ｖｉ）が、αβＴ細胞受容体のα鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｖ）が、（ｉｖ）と（ｖｉ）との間に挿入され、
    （Ｃ）が、（ｖｉｉ）－（ｖｉｉｉ）－（ｉｘ）で表される核酸であり、
    （ｖｉｉ）が、γδＴ細胞受容体のγ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｖｉｉｉ）が、γδＴ細胞受容体のγ鎖若しくはδ鎖又はその機能性断片以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸であり；
    （ｉｘ）が、γδＴ細胞受容体のδ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｖｉｉｉ）が、（ｖｉ）と（ｉｘ）との間に挿入され、
    （Ｄ）が（ｘ）－（ｘｉ）－（ｘｉｉ）で表される核酸であり：
    （ｘ）が、γδＴ細胞受容体のδ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｘｉ）が、γδＴ細胞受容体のγ鎖及びδ鎖又はその機能性断片以外のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸であり；
    （ｘｉｉ）が、γδＴ細胞受容体のγ鎖又はその機能性断片をコードする核酸であり、
    （ｘｉ）が、（ｘ）と（ｘｉｉ）との間に挿入される、ポリヌクレオチド。
  11. －（ｉ）及び（ｖｉ）が、配列番号１９９、２１０、２１４、２１６、２１８及び２２０から選択される、好ましくは配列番号２１０、２１６及び２２０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
    －（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）が、配列番号１９８、２１１、２１５、２１７、２１９及び２２１から選択される、好ましくは配列番号２１１、２１７及び２２１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
    －（ｖｉｉ）及び（ｘｉｉ）が、配列番号８５、８６、８７、８９、９１、９３、９４、９５、９６、１０１、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３０及び１３２から選択される、好ましくは配列番号８５、８６、８７、９４、９５、９６、１０１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２７及び１３０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であり、並びに／又は；
    －（ｉｘ）及び（ｘ）が、配列番号８２、８３、８４、８８、９０、９２、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３１及び１３３から選択される、好ましくは配列番号８２、８３、８４、９７、９８、９９、１００、１０２、１１４、１１６、１１８、１２６及び１３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸である、
    請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも２つの細胞内シグナルを伝達することができるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードする受容体モノマーのそれぞれをコードする核酸の間に挿入された核酸を含み、前記タンパク質が：
    －その相互作用パートナーの細胞外ドメインと相互作用することができる細胞外リガンドドメイン
    －膜貫通ドメイン、及び
    －前記細胞外リガンドドメインがその相互作用パートナーに結合した後に第１のシグナルを伝達する異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
    前記第２の細胞内シグナルが、前記相互作用パートナーの前記細胞内ドメインを介して伝達される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記キメラタンパク質が、ＩＣＯＳＬの細胞外リガンドドメイン及び膜貫通ドメイン並びに４１ＢＢの異種性細胞内シグナル伝達ドメインを含むか又はそれらからなるタンパク質ではない、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記少なくとも２つの細胞内シグナルが誘導性である、請求項１２又は１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記少なくとも２つの細胞内シグナルが単一細胞で生成される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記相互作用パートナーが：
    －前記キメラタンパク質の前記細胞外リガンドドメインと相互作用することができる細胞外ドメイン、
    －膜貫通ドメイン、及び
    －前記キメラタンパク質の前記細胞外リガンドドメインへの前記相互作用パートナーの前記細胞外ドメインの結合後に第２のシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記少なくとも２つの細胞内シグナルが、前記キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与する、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  18. ａ．前記細胞外リガンドドメインがＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られるか、又は
    ｂ．前記細胞外リガンドドメインが、ＩＩ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質に由来するか若しくはそれから得られる、
    請求項１２～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記細胞が、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記生物学的パラメータ及び／又は機能が、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅から選択される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  21. －前記細胞外リガンドドメインが、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー、サイトカイン、Ｃ型レクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、又は抗体若しくはその抗原結合性断片由来のアミノ酸配列を含み；及び
    －前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、サイトカイン受容体又はＣ型レクチン受容体由来のアミノ酸配列を含む、
    請求項１２～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  22. －前記細胞外リガンドドメインが、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＲＡＮＫ又はＣＤ７０由来のアミノ酸配列を含み、
    －前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＩＬ１８ＲＡＰ又はＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含む、
    請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
  23. （ａ）前記細胞外リガンドドメインが４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインがＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｂ）前記細胞外リガンドドメインがＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインがＩ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインがＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｃ）前記細胞外リガンドドメインが、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＮＫｐ８０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインが、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＮｐＫ８０に由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｄ）前記細胞外リガンドドメインが、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｅ）前記細胞外リガンドドメインが、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｆ）前記細胞外リガンドドメインが、ＲＡＮＫ由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、４１ＢＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫに由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｇ）前記細胞外リガンドドメインが、ＯＸ４０Ｌに由来するアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、４１ＢＢに由来するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインが、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０Ｌに由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質４１ＢＢに由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｈ）前記細胞外リガンドドメインは、ＣＤ８６由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＩＬ１８ＲＡＰ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ８６に由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＩＬ１８ＲＡＰに由来するか若しくはそれから得られるか、
    （ｉ）前記細胞外リガンドドメインが、ＣＤ７０由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインが、ＩＩ型膜貫通タンパク質ＣＤ７０に由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０に由来するか若しくはそれから得られるか、又は
    （ｊ）前記細胞外リガンドドメインが、４１ＢＢＬ由来のアミノ酸配列を含み、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０由来のアミノ酸配列及びＩＬ２ＲＢ由来のアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記細胞外リガンドドメインが、ＩＩ型膜貫通タンパク質４１ＢＢＬに由来するか若しくはそれから得られ、前記異種性細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質ＯＸ４０及びＩ型膜貫通タンパク質ＩＬ２ＲＢに由来するか若しくはそれから得られる、
    請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. ｋ）ａ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号４５、４６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、１７８若しくは１７９と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｌ）ｂ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号５２、５３、若しくは７３と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｍ）ｃ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号４７若しくは４８と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｎ）ｄ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号７８と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｏ）ｅ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号７６と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｐ）ｆ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号７７と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｑ）ｇ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号４９、５０、若しくは５１と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｒ）ｈ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号７１若しくは７２と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、
    ｓ）ｉ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号１８２若しくは１８３と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるか、又は
    ｔ）ｊ）の下で同定される前記キメラタンパク質が、配列番号１７９と少なくとも８０％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表される、
    請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記キメラタンパク質が、ＩＴＡＭ、又はＴＣＲシグナル伝達複合体由来の細胞内ドメインを含有しない、請求項１２～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  26. 請求項１２～２５のいずれか一項で定義されるキメラ双方向シグナル伝達膜貫通タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  27. 請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくはウイルスベクターである、ベクター。
  28. レンチウイルスベクターである、請求項２７に記載のベクター。
  29. 請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによって、又は請求項２７若しくは２８に記載のベクターによってコードされるポリペプチド。
  30. 請求項１２～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項２７若しくは２８に記載のベクターを含む細胞であって、好ましくは前記細胞が前記キメラタンパク質を発現し、より好ましくは前記細胞が相互作用パートナーも発現する、細胞。
  31. 請求項３０に記載の少なくとも１つの細胞を含む、細胞の集団。
  32. 前記細胞が、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項３０に記載の細胞又は請求項３１に記載の細胞の集団。
  33. 外因性抗原認識受容体を発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、請求項３１又は３２に記載の細胞の集団。
  34. 請求項１２～２５のいずれか一項で定義されるキメラタンパク質を発現する少なくとも１つの細胞が、外因性抗原認識受容体も発現する、請求項３３に記載の細胞の集団。
  35. 前記外因性抗原認識受容体が、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、αβＴ細胞受容体、又はγδＴ細胞受容体である、請求項３３又は３４に記載の細胞の集団。
  36. 前記Ｔ細胞が、γδＴ細胞受容体を発現するαβＴ細胞である、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  37. 前記外因性抗原認識受容体に結合する抗原を発現するか又は提示する細胞に請求項１２～２５のいずれか一項で定義されるキメラタンパク質を発現する前記細胞を曝露すると、前記細胞の集団の増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／又は腫瘍細胞死滅が、前記キメラタンパク質を発現しない細胞の対応する集団と比較して少なくとも１０％増加する、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  38. 請求項１２～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１２～２５のいずれか一項で定義されるキメラタンパク質、請求項２７若しくは２８に記載のベクター、請求項３０に記載の細胞又は請求項３１～３７のいずれか一項に記載の細胞の集団であって、前記ポリヌクレオチド、前記キメラタンパク質、前記ベクター、前記細胞又は前記細胞の集団が、疾患又は状態を治療するための使用のためのものであり、前記少なくとも２つの細胞内シグナルが、前記キメラタンパク質を発現する細胞の生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善並びに／又はそのような細胞によって誘導される生物学的パラメータ及び／若しくは機能の改善に寄与し、前記生物学的パラメータが前記疾患又は状態の治療に寄与する、ポリヌクレオチド、キメラタンパク質、ベクター、細胞又は細胞の集団。
  39. －前記生物学的パラメータが、増殖、細胞生存、細胞傷害性、抗腫瘍活性、持続性及び／若しくは腫瘍細胞死滅から選択され、
    －前記細胞が免疫細胞であり、並びに／又は
    －前記疾患が癌である、
    請求項３８に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のキメラタンパク質、請求項３８に記載のベクター、請求項３８に記載の細胞又は請求項３８に記載の細胞の集団。
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