CN117062830A

CN117062830A - 具有双向信号传导活性的嵌合跨膜蛋白

Info

Publication number: CN117062830A
Application number: CN202180094381.2A
Authority: CN
Inventors: 劳伦斯·桑德; 哈卡纳·诺雷尔
Original assignee: UMC Utrecht Holding BV
Current assignee: UMC Utrecht Holding BV
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-11-14

Abstract

本文披露了编码改善的免疫治疗剂的多核苷酸和载体，由这些多核苷酸和/或载体编码的多肽，表达这些多肽的细胞，以及包含这些多核苷酸、载体、多肽和/或细胞的药物组合物。

Description

具有双向信号传导活性的嵌合跨膜蛋白

发明背景

工程改造的细胞在研究性应用和治疗性应用方面都具有巨大的潜力。然而，尽管加大了生产新的和更先进的工程改造的细胞的努力，但仍然存在许多挑战，限制了工程改造的细胞生产的效率和治疗用途的功效。

发明内容

在一个方面，提供了编码异二聚体受体的每个单体的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含插入在编码每个所述单体的核酸之间的至少一个编码除所述单体以外的多肽的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接至相同的启动子序列。

在实施例中，启动子序列选自以下各项的组：EF1α、MSCV、EF1α-HTLV-1杂合启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、MHC II类、凝血因子IX、胰岛素启动子、PDX1启动子、CD11、CD4、CD2、gp47启动子、PGK、β-球蛋白、UbC和MND。

在实施例中，多核苷酸包含插入这些核酸中每一个之间的核苷酸序列，其促进这些核酸的共表达。

在实施例中，促进核酸共表达的核苷酸序列编码2A自切割肽或者是IRES序列。

在实施例中，2A自切割肽选自T2A、P2A、E2A或F2A肽。

在实施例中，多核苷酸是三顺反子或四顺反子。

在实施例中，异二聚体受体是外源抗原识别受体。

在实施例中，外源抗原识别受体选自B细胞受体重链和轻链异二聚体、Toll样受体1和2异二聚体、吞噬受体Mac-1、CD94NKG2C或NKG2E受体、T细胞受体、αβT细胞受体、γδT细胞受体及其功能片段

在实施例中，外源抗原识别受体是αβT细胞受体、γδT细胞受体或其功能片段。

在实施例中，多核苷酸包含A、B、C或D，其中：

(A)是由(i)-(ii)-(iii)表示的核酸，其中：

(i)是编码αβT细胞受体的α链或其功能片段的核酸，

(ii)是至少一个编码αβT细胞受体的α链或β链或其功能片段以外的多肽的核酸，以及；

(iii)是编码αβT细胞受体的β链或其功能片段的核酸，

其中(ii)插入在(i)和(iii)之间

(B)是由(iv)-(v)-(vi)表示的核酸，其中：

(iv)是编码αβT细胞受体的β链或其功能片段的核酸，

(v)是至少一个编码αβT细胞受体的α链或β链或其功能片段以外的多肽的核酸，以及；

(vi)是编码αβT细胞受体的α链或其功能片段的核酸，

其中(v)插入在(iv)和(vi)之间

(C)是由(vii)-(viii)-(ix)表示的核酸，其中：

(vii)是编码γδT细胞受体的γ链或其功能片段的核酸，

(viii)是至少一个编码γδT细胞受体的γ或δ链或其功能片段以外的多肽的核酸，以及；

(ix)是编码γδT细胞受体的δ链或其功能片段的核酸，

其中(viii)插入在(vi)和(ix)之间

(D)是由(x)-(xi)-(xii)表示的核酸，其中：

(x)是编码γδT细胞受体的δ链或其功能片段的核酸，

(xi)是至少一个编码γδT细胞受体的γ或δ链或其功能片段以外的多肽的核酸，以及；

(xii)是编码γδT细胞受体的γ链或其功能片段的核酸，

其中(xi)插入在(x)和(xii)之间

在实施例中，A、B、C和/或D使得：

-(i)和(vi)是包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，该多肽与选自SEQ ID NO：199、210、214、216、218和220，优选选自SEQ ID NO：210、216和220的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性或相似性，和/或；

-(iii)和(iv)是包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，该多肽与选自SEQ ID NO：198、211、215、217、219和221，优选选自SEQ ID NO：211、217和221的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性或相似性，和/或；

-(vii)和(xii)是包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，该多肽与选自SEQ ID NO：85、86、87、89、91、93、94、95、96、101、104、106、108、110、112、113、115、117、119、121、123、125、127、129、130和132，优选选自SEQ ID NO：85、86、87、94、95、96、101、113、115、117、119、127和130的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性或相似性，和/或；

-(ix)和(x)是包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，该多肽与选自SEQ ID NO：82、83、84、88、90、92、97、98、99、100、102、103、105、107、109、111、114、116、118、120、122、124、126、128、131和133，优选选自SEQ ID NO：82、83、84、97、98、99、100、102、114、116、118、126和131的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性或相似性。

在实施例中，多核苷酸包含插入在编码每个受体单体的核酸之间的核酸，其编码能够转导至少两个胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白，所述蛋白包含：

-胞外配体结构域，该胞外配体结构域能够与该胞外配体结构域的相互作用配偶体的胞外结构域相互作用

-跨膜结构域，和

-异源胞内信号传导结构域，该异源胞内信号传导结构域在该胞外配体结构域与该胞外配体结构域的相互作用配偶体结合后转导第一信号，

其中第二胞内信号通过相互作用配偶体的胞内结构域转导。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白不是包含以下或由以下组成的蛋白质：ICOSL的胞外配体结构域和跨膜结构域以及41BB的异源胞内信号传导结构域。

在实施例中，至少两个胞内信号是可诱导的。

在实施例中，至少两个胞内信号在一个单个细胞中产生。

在实施例中，该相互作用配偶体包含：

-能够与嵌合蛋白的胞外配体结构域相互作用的胞外结构域，-跨膜结构域，和

-胞内结构域，其在相互作用配偶体的胞外结构域与嵌合蛋白的胞外配体结构域结合后转导第二信号。

在实施例中，所述至少两种任选地可诱导的胞内信号有助于表达嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善。生物学参数和/或功能可以选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤。在实施例中，细胞是免疫细胞，优选T或NK细胞。

在实施例中，嵌合蛋白使得：

a.胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白，或

b.胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白。

在实施例中，

-胞外配体结构域包含来自肿瘤坏死因子超家族成员、细胞因子、C型凝集素、免疫球蛋白超家族成员、或抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列；和

-异源胞内信号传导结构域包含来自肿瘤坏死因子受体超家族成员、细胞因子受体或C型凝集素受体的氨基酸序列。

在实施例中，

-胞外配体结构域包含来自41BBL、OX40L、CD86或RANK的氨基酸序列，并且

-异源胞内信号传导结构域包含来自OX40、41BB、NKp80或IL18RAP的氨基酸序列。

在实施例中，

-胞外配体结构域包含来自41BBL、OX40L、CD86、RANK或CD70的氨基酸序列，并且

-异源胞内信号传导结构域包含来自OX40、41BB、NKp80、IL18RAP或IL2RB的氨基酸序列。

在实施例中，

(a)胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白41BBL，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，

(b)胞外配体结构域包含来自CD86的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白CD86，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，

(c)胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自NKp80的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白41BBL，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白NpK80，

(d)胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白RANK，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白IL18RAP，

(e)胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白RANK，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，

(f)胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自41BB的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白RANK，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白41BB，

(g)胞外配体结构域包含来自OX40L的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自41BB的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白OX40L，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白41BB，或

(h)胞外配体结构域包含来自CD86的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白CD86，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白IL18RAP。

在实施例中，

(g)胞外配体结构域包含来自OX40L的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自41BB的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白OX40L，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白41BB，

(h)胞外配体结构域包含来自CD86的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白CD86，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白IL18RAP，

(i)胞外配体结构域包含来自CD70的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白CD70，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，或

(j)胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列和来自IL2RB的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白41BBL，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40和I型跨膜蛋白IL2RB。

在实施例中，a)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：45、46、57、58、59、60、61、62、63、64或65具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，a)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：45、46、57、58、59、60、61、62、63、64、65、178或179具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，b)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：52、53或73具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，c)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：47或48具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，d)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：78具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，e)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：76具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，f)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：77具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，g)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：49、50或51具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，h)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：71或72具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，i)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：182或183具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，j)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与SEQ ID NO：179具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白不包含ITAM或来自TCR信号传导复合物的胞内结构域。

在另一方面，提供了编码本文定义的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸。

在另一方面，提供了包含本文定义的多核苷酸的载体。在实施例中，载体是病毒载体。在实施例中，病毒载体是慢病毒载体。

另一方面，提供了由本文定义的多核苷酸或载体编码的多肽。

在实施例中，提供了包含本文定义的多核苷酸或本文前面定义的载体的细胞，优选地其中所述细胞表达本文定义的嵌合蛋白，更优选地其中所述细胞还表达相互作用配偶体。

在实施例中，提供了细胞群，其中所述细胞群包含至少一个如本文前面定义的细胞。

在实施例中，细胞或细胞群是免疫细胞，优选T细胞或NK细胞。

在实施例中，细胞群进一步包含至少一个表达外源抗原识别受体的细胞。

在实施例中，表达外源抗原识别受体的细胞群还表达如本文前面定义的嵌合双向信号传导跨膜蛋白。

在实施例中，外源抗原识别受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、α-βT细胞受体或γ-δT细胞受体。

在实施例中，细胞群是T细胞群，优选表达γ-δT细胞受体的α-βT细胞。

在实施例中，如本文定义的细胞群是这样的，其中当将表达如本文定义的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞时，所述细胞群的增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤与不表达该嵌合蛋白的相应细胞群相比增加至少10％。

在一个方面，如本文前面定义的嵌合双向信号传导跨膜蛋白、多核苷酸、载体、细胞或细胞群用于治疗疾病或病症，其中至少两个任选地可诱导的胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善，所述生物学参数有助于该疾病或病症的治疗。

在一个方面，如本文前面定义的嵌合双向信号传导跨膜蛋白、多核苷酸、载体、细胞或细胞群用于使用，其中：

-生物学参数选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤，

-细胞是免疫细胞和/或

-疾病是癌症。

通过引用并入

本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请在此通过引用结合，达到如同每一个单独的公开、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用结合的相同的程度。

附图说明

提交的本专利申请含有至少一张彩色图片。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请的副本。

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本发明的原理，并且在所述附图中：

图1提供了MIDIS功能的一个说明性实例。MIDIS蛋白由工程改造的细胞表达。胞外配体结构域与相互作用配偶体的结合诱导多向信号传导，所述多向信号传导包括至少一个由相互作用配偶体的胞内信号传导结构域介导的“由内而外”信号(信号1)和至少一个由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的“由外而内”信号(信号2)。第一信号传导途径和第二信号传导途径可以共同诱导目标生物学结果。

图2显示了用于引入本披露的γ-δTCR和MIDIS蛋白的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。右图显示了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域，水平线代表膜/跨膜结构域。

图3显示了共表达本披露的MIDIS蛋白或对照蛋白的TEG的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的HT-29细胞共孵育，效应子比靶标(E∶T)的比例为1：1。TEG的连续刺激持续3次刺激(来自供体1的TEG，上分图)或5次刺激(来自供体2的TEG，下分图)。*41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P＜0.05。

图4显示了共表达本披露的MIDIS蛋白或对照蛋白的TEG的增殖。TEG与HT-29细胞共孵育，效应子比靶标(E：T)的比例为1：1。用细胞微量紫(CTV)对效应细胞进行染色，并使用染料的稀释液作为增殖标志物。*41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P<0.05。

图5显示了与HT-29细胞共培养刺激3轮(供体1)或共培养刺激五轮(供体2)后表达转导的γδTCR的细胞的数量。将共表达本披露的MIDIS蛋白或对照蛋白的TEG与HT-29细胞以1：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育，并通过流式细胞术测定TEG的数量。*41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P<0.05。

图6显示了用HT-29细胞情况下3次刺激(供体1)或5次刺激(供体2)后共表达耗竭标志物LAG-3和TIM-3的TEG的比例。将共表达本披露的MIDIS蛋白或对照蛋白的TEG与HT-29细胞以1∶1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育，并通过流式细胞术测定共表达耗竭标志物的TEG的数量。*41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P<0.05。

图7显示了共表达本披露的MIDIS蛋白的TEG或来自与HT-29、RPMI-8226和MZ1851RC靶细胞共孵育的第三代表性供体的对照蛋白TEG的细胞毒性作用。TEG的连续刺激持续3次刺激(HT-29)、4次刺激(RPMI-8226)或5次刺激(MZ1851RC)。左分图显示来自第一刺激的细胞毒性数据，而右分图显示来自PAM处理情况下的最终刺激的细胞毒性数据。

图8A显示共表达41BBL-OX40MIDIS蛋白的TEG的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1∶1共孵育。3天后将TEG转移到含有新鲜靶细胞的板上，并通过萤光素酶测定测量残留靶细胞活力。

图8B显示了共表达41BBL-OX40MIDIS蛋白的TEG产生的IFNγ。TEG与靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1：1共孵育。3天后，将TEG转移至含有新鲜靶细胞的板上，并通过ELISA测量IFNγ的产生。*P<0.05CSD(41BBL-OX40)。

图8C显示了与单独的γ4δ5TCR或γ4δ5TCR共表达41BBL或41BBL-OX40MIDIS蛋白的TEG的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1：1共孵育。7天后，TEG被转移到含有新鲜靶细胞的板上。*P<0.05(41BBL-OX40相比于“竞争物”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图9A显示了对携带HT-29肿瘤的小鼠施用1.0x10^6个TEG后随时间变化的平均辐亮度。在第-14天将0.5x10A6HT-29萤光素酶-tdTomato细胞注射到NSG小鼠的胁中(每组n＝6)。在第0天，全身施用表达本披露的γδTCR的TEG，有或没有41BBL-OX40MIDIS蛋白。每周测量生物发光(BLI)和肿瘤体积。

图9B显示了对携带HT-29肿瘤的小鼠施用1.0x10A6个TEG后随时间变化的肿瘤体积。在第-14天将0.5x10^6HT-29萤光素酶-tdTomato细胞注射到NSG小鼠的胁中(每组n＝6)。在第0天，全身施用表达本披露的γδTCR的TEG，有或没有41BBL-OX40MIDIS蛋白。每周测量生物发光(BLI)和肿瘤体积。

图10显示了对携带HT-29肿瘤的小鼠施用1.0x10^6个TEG后随时间变化的存活。在第-14天将0.5x10^6HT-29萤光素酶-tdTomato细胞注射到NSG小鼠的胁中(每组n＝6)。在第0天，全身施用表达本披露的γδTCR的TEG，有或没有41BBL-OX40MIDIS蛋白。

图11A显示了用于引入本披露的γδTCR和MIDIS蛋白的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

图11B显示共表达OX40L-41BB MIDIS蛋白的TEG的细胞毒性作用。将TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的MZ1851RC靶细胞以1：1的效应子比靶标(E∶T)比例共孵育，七天后转移至新鲜靶细胞并添加帕米膦酸二钠(10μm)(新刺激)，并在第二次刺激后七天通过萤光素酶测定法测量残余靶细胞活力。

图12A显示了用于引入本披露的γδTCR和MIDIS蛋白的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

图12B显示共表达CD86-OX40MIDIS蛋白的TEG的细胞毒性作用。将TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的HT-29靶细胞以1：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育，七天后转移至新鲜靶细胞并添加帕米膦酸二钠(10μm)(新刺激)，并在第二次刺激后七天通过萤光素酶测定法测量残余靶细胞活力*P＜0.05(CD86P276-OX40)。

图13显示了用本披露的MIDIS载体转导12天后γ-δTCR和41BBL的表面表达。

图14显示了用本披露的MIDIS载体转导12天后γ-δTCR和41BBL的表面表达。

图15提供了用于将本披露的MIDIS蛋白和另外的外源抗原识别受体引入细胞中的构建体的非限制性实例的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

图16示出了由MIDIS(41BBL-OX40)驱动的生理学。左侧前两幅分图(γ-eGFP-δ)描绘了靶标刺激前后没有MIDIS情况下的流式细胞术图。中间分图示出了包含表达4-1BB配体的构建体的工程改造的细胞的流式细胞术图，其中4-1BB配体的胞质部分被截短(γ-41BBLmincyto-δ)。右分图显示了包含MIDIS(例如，具有完整胞质部分以与OX-40相互作用的41BBL)的工程改造的细胞的流式细胞术图。如右分图所示，包含MIDIS的工程改造的细胞表现出增强的效应子功能和生物信号。

图17提供了当需要另外激活来诱导信号传导时MIDIS功能的一个说明性实例。MIDIS蛋白由工程改造的免疫细胞表达。胞外配体结构域与相互作用配偶体的结合诱导至少一个由相互作用配偶体的胞内信号传导结构域介导的“由内而外”信号(信号1)，并且TCR的激活以及胞外配体结构域与相互作用配偶体的结合诱导至少一个由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的“由外而内”信号(信号2)。

图18显示共表达41BBL13W-OX40rev MIDIS蛋白的TEG的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1∶1共孵育。7天后将TEG转移到含有新鲜靶细胞的板上，并通过萤光素酶测定测量残留靶细胞活力，并以相对发光单位表示。*41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P<0.05。**41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P<0.01。

图19A显示了以下的示意图：用于引入本披露的γδTCR和CD86MIDIS蛋白的构建体，包含编码作为对照蛋白的CD8-Q8标签的序列的构建体。P2A和T2A代表自切割肽。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

图19B显示了以下的示意图：用于引入本披露的γδTCR和RANK MIDIS蛋白的构建体，包含编码作为对照蛋白的eGFP的序列的构建体，编码作为进一步的对照的单独γδTCR的构建体。P2A和T2A代表自切割肽。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

图20A提供了用于将本披露的MIDIS蛋白和另外的外源抗原识别受体的表达引入细胞中的构建体的非限制性实例的示意图。T2A代表自切割肽。此外，它还显示了通过流式细胞术测量的α-βT细胞对外源抗原识别受体和MIDIS或对照蛋白的表达(下分图)。用指定的构建体转导α-βT细胞，并在生产12天后用抗Fab抗体染色以评估表面表达，并由此包含含有41BBL(y轴)或CD19.BB.Z(x轴)的两种载体，如下面的分图所示。阳性表达％显示在象限中。

图20B显示了在有或没有41BBL-OX40MIDIS或对照蛋白的情况下共表达抗CD19BBzCAR(19BBz)的CAR-T细胞的细胞毒性作用。将CAR-T细胞与异位表达萤光素酶-tdTomato的CD19(NALM6)阳性靶细胞以1：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育，每三天连续转移至新鲜靶细胞，并在第一次(左)或第五次(右)刺激后通过萤光素酶测定法测量残余靶细胞活力，并以相对发光单位(RLU)描绘。*41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P＜0.05。**41BBL-OX40相比于指定的“竞争物”，P＜0.01。

图21A提供了用于引入本披露的γδTCR和MIDIS蛋白表达的构建体的非限制性实例的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

图21B显示了共表达MIDIS蛋白的Jurkat T细胞的表面表达。对具有或不具有MIDIS或对照蛋白的Jurkat T细胞进行CD70(x轴)和γδTCR(y轴)染色。通过流式细胞术测定表达。用本披露中包括的载体的固定MOI转导Jurkat T细胞。转导一周后，如实例1中概述的那样评估CD70的表面表达和γδTCR表达；百分比显示CD70阳性表达。

图22A提供了用于将γδTCR和MIDIS的表达引入细胞中的构建体的非限制性实例的示意图，包括具有多个信号传导结构域的MIDIS和没有MIDIS的对照。P2A和T2A代表自切割肽。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

图22B显示了共表达MIDIS蛋白的TEG的表面表达。对具有或不具有MIDIS或对照蛋白的TEG进行41BBL和γδTCR染色。通过流式细胞术测定表达。如实例1中概述的生产12天后，对α-βT细胞进行41BBL(x轴)和γδTCR(y轴)染色以评估表面表达。％阳性表达显示在所描绘的分图的象限中(分图标题对应于图22A的构建体)。

图23显示了对共表达MIDIS蛋白的γδT细胞扩增的影响。使用TransAct(左)或板结合的抗γδTCR和抗CD28抗体(右)将具有或不具有MIDIS或对照蛋白的γδT细胞扩增22天。通过在第0天和收获日计数细胞来测量扩增。

图24A显示了实例14中使用的三顺反子构建体的示意图，该构建体用以引入本披露的γ-δTCR和另外的蛋白质(其中γ链编码核酸和δ链编码核酸具有不同的位置)的表达。P2A和T2A代表自切割肽。

图24B显示了通过流式细胞术测量的用本披露的多顺反子载体转导的αβT细胞的γ-δTCR和内源α-βTCR的表面表达。

图25A显示了根据按供体校正的所有活T细胞的TEG百分比的确定的γ-δTCR(SEQID NO：90和91)的表面表达。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图25B显示了用本披露的多顺反子载体转导后生产8天时确定的γδTCR(SEQ IDNO：90和91)表面的经供体校正的中值荧光强度(MFI)。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图25C显示了所有活T细胞的经供体校正的％γδTCR+αβTCR-。用确定的γδTCR(SEQID NO：90和91)转导αβT细胞，并在用本披露的多顺反子载体转导后生产8天时对γδTCR和αβTCR进行染色。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图26A显示了作为按供体校正的所有活T细胞的TEG百分比的确定的γ-δTCR(SEQID NO：111和112)的表面表达。*P＜0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图26B显示了用本披露的多顺反子载体转导后生产8天时确定的γδTCR(SEQ IDNO：111和112)表面的经供体校正的中值荧光强度(MFI)。*P＜0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图27A显示了实例14中使用的三顺反子构建体的示意图，该构建体用以引入本披露的γδTCR和另外的蛋白质41BBL-OX40MIDIS(分图(i))或CD8-Q8(分图(ii))(其中γ链编码核酸和δ链编码核酸具有不同的位置)的表达。P2A和T2A代表自切割肽。

图27B显示了用本披露的包含41BBL-OX40编码核酸的载体转导后生产8天时确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)表面的经供体校正的中值荧光强度(MFI)。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图27C显示了所有活T细胞的经供体校正的％γδTCR⁺αβTCR-。用确定的γδTCR(SEQID NO：90和91)转导αβT细胞，并在用本披露的包含41BBL-OX40编码核酸的载体转导后生产8天时对γδTCR和αβTCR进行染色。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图27D显示了用本披露的包含Q8编码核酸的载体转导后生产8天时确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)表面的经供体校正的中值荧光强度(MFI)。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图27E显示了所有活T细胞的经供体校正的％γδTCR⁺αβTCR-。用确定的γδTCR(SEQID NO：90和91)转导αβT细胞，并在用本披露的包含CD8-Q8编码核酸的载体转导后生产8天时对γδTCR和αβTCR进行染色。*P＜0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图28A显示了实例14中使用的四顺反子构建体的示意图，该构建体用以引入本披露的γ-δTCR和另外的蛋白质41BBL-OX40MIDIS和eGFP(其中γ链编码核酸和δ链编码核酸具有不同的位置)的表达。P2A和T2A代表自切割肽。

图28B显示了根据按供体校正的所有活T细胞的TEG百分比的来自四顺反子构建体的确定的γ-δTCR(SEQ ID NO：90和91)的表面表达。*P＜0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图28C显示了所有活T细胞的经供体校正的％γδTCR⁺αβTCR-。用确定的γδTCR(SEQID NO：90和91)转导TEG，并在用本披露的包含41BBL-OX40编码核酸的四顺反子载体转导后生产8天时对γδTCR和αβTCR进行染色。*P<0.05(γ-41BBL-OX40-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图29A显示了实例15中使用的用以引入确定的γ-δTCR和另外的蛋白质的表达的三顺反子构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。

图29B显示了与未转导的T细胞(UNTR)相比，表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1：1(供体2)和帕米膦酸二钠(10μm)共孵育3天。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图29C显示了表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)生产的IFNγ。TEG与靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1：1(供体2)和帕米膦酸二钠(10μm)共孵育3天。通过ELISA测量IFNγ的生产。*P＜0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。

图30A显示了与未转导的T细胞(UNTR)相比，表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1：1(供体3)共孵育3天，并添加帕米膦酸二钠(10μm)。*P<0.05(δ-eGFP-γ相比于“竞争物”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图30B显示了表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)生产的IFNγ。TEG与靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1：1(供体3)和帕米膦酸二钠(10μm)共孵育3天。通过ELISA测量IFNγ的生产。*P<0.05(δ-eGFP-γ相比于“竞争物”)。

图30C显示了与未转导的T细胞(UNTR)相比，表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：111和112)的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶RKO肿瘤细胞以E：T比例0.11：1(供体1)共孵育3天。*P<0.05(γ-eGFP-δ相比于“竞争物”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图31A显示了与未转导的T细胞(UNTR)相比，共表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)和41BBL-OX40MIDIS的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例0.3：1(供体1)和帕米膦酸二钠(10μm)共孵育3天。*P<0.05(γ-41BBLOX40-δ相比于“竞争物”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图31B显示了与未转导的T细胞(UNTR)相比，共表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)和CD8-Q8的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例0.3：1(供体2)和帕米膦酸二钠(10μm)共孵育3天。*P＜0.05(γ-41BBLOX40-δ相比于“竞争物”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图32A显示了实例16中使用的用以引入确定的γδTCR和另外的蛋白质41BBL-OX40MIDIS或eGFP的表达的三顺反子构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。

图32B显示了与未转导的T细胞(UNTR)相比，共表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：90和91)和41BBL-OX40的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E∶T比例0.3∶1(供体2)和帕米膦酸二钠(10μm)共孵育3天。**P<0.01(γ-41BBLOX40-δ相比于“δ-41BBLOX40-γ”)*P＜0.05(δ-41BBLOX40-γ相比于“UNTR”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图32C显示了与未转导的T细胞(UNTR)相比，共表达确定的γδTCR(SEQ ID NO：111和112)和eGFP的TEG(其中构建体中γ链和δ链编码核酸的位置不同)的细胞毒性作用。TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶RKO肿瘤细胞以E：T比例3：1(供体3)共孵育3天。*P<0.05(γ-41BBLOX40-δ相比于“δ-41BBLOX40-γ”)或(δ-41BBLOX40-γ相比于“UNTR”)。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图33A显示了实例17中使用的用以引入确定的α-βTCR和另外的蛋白质eGFP的表达的三顺反子构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。

图33B显示了在细胞表面表达的功能性αβTCR与细胞表达的胞内αβTCR的比率。用确定的αβTCR和eGFP转导Jurkat 76T细胞。转导后三天，用抗CD3ε对细胞表面表达的αβTCR进行染色，然后固定并染色αβTCR。*P＜0.05(β-eGFP-α相比于“竞争物”)

图33C显示了在实例17中使用的三顺反子构建体的示意图，该构建体用以引入确定的α-βTCR和另外的蛋白质eGFP(其对于β-和α-编码核酸具有不同的顺序)的表达。P2A和T2A代表自切割肽。

图33D显示了在细胞表面表达的功能性αβTCR与细胞表达的胞内αβTCR的比率。用确定的αβTCR和eGFP转导Jurkat 76T细胞。转导后三天，用抗CD3ε对细胞表面表达的αβTCR进行染色，然后固定并染色αβTCR。**P<0.01(β-eGFP-α相比于“竞争物”)。

具体实施方式

工程改造的细胞在研究性应用和治疗性应用方面都具有巨大的潜力。例如，某些工程改造的免疫细胞在治疗某些类型的癌症方面取得了里程碑式的进展，对于这些癌症以前没有有效的治疗方法。然而，尽管加大了生产新的和更先进的工程改造的细胞的努力，但仍然存在一些限制该领域成功的挑战。这些挑战的实例包括难以产生足够数量的所需的工程改造的细胞、工程改造的细胞的增殖能力或寿命有限、工程改造的细胞的适应性有限、抗原识别后效应子功能的诱导有限、以及耗竭。

本文披露了多向信号转导器(MIDIS)蛋白，其可以增强工程改造的细胞制造和临床应用的多个方面。MIDIS蛋白是工程改造的融合蛋白，其包含与相互作用配偶体结合的胞外配体结构域、跨膜结构域和异源胞内信号传导结构域(来自或衍生自与胞外配体结构域不同的蛋白质)。当胞外配体结合至其相互作用配偶体时，诱导多向信号传导，所述多向信号传导包括至少一个由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的“由外而内”信号，以及至少一个由相互作用配偶体的胞内信号传导结构域介导的“由内而外”信号。在整个申请中，表述“MIDIS蛋白”可以被表述“嵌合双向信号传导跨膜蛋白”替代，如本文稍后描述的。

MIDIS蛋白诱导双向信号传导途径组合的能力被证明可以诱导一系列目标生物学结果和功能，例如增强细胞增殖、增强细胞存活以及免疫效应子功能的更大程度和持久性，例如细胞毒性和炎症介质的产生。措辞“目标生物学结果”或“生物学结果”可以由“生物学参数”替代。

图1提供了MIDIS功能的一个说明性实例。MIDIS蛋白由工程改造的细胞(细胞1)表达。胞外配体结构域与相互作用配偶体的结合诱导多向信号传导，所述多向信号传导包括至少一个由相互作用配偶体的胞内信号传导结构域介导的“由内而外”信号(信号1)和至少一个由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的“由外而内”信号(信号2)。第一信号传导途径和第二信号传导途径可以共同诱导目标生物学结果。在一些实施例中，多向信号传导是或包含双向信号传导，例如由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的一个信号传导途径和由相互作用配偶体的胞内信号传导结构域介导的一个信号传导途径。在一些实施例中，多向信号传导包括多维信号传导，例如，由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的多于一个信号传导途径和/或由相互作用配偶体的胞内信号传导结构域介导的多于一个信号传导途径，如本文披露。

多向信号传导可以调节表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞中的生物学参数和/或功能，以实现本文披露的目标生物学结果。换句话说，“至少两个胞内信号”可有助于改善表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞的生物学参数和/或改善由这样的细胞诱导的生物学参数。根据信号传导途径和细胞类型的组合，可以调节各种生物学功能和/或参数，包括但不限于细胞增殖、细胞存活、免疫效应子功能的量级、免疫效应子功能的持续时间、细胞毒性应答(例如，针对癌细胞)、抗癌应答、细胞分化、细胞去分化和细胞转分化。可以调节/改善细胞的一个或多个生物学功能和/或参数。可以调节多个生物学功能和/或参数，例如有助于目标生物学结果的经诱导或减少的生物学功能和/或参数的任何组合。在本文中，目标生物学结果可以是疾病或病症的治疗、治愈，如本文稍后解释的。例如，可以在细胞中诱导多个生物学功能和/或可以诱导一个生物学功能并且可以降低另一个生物学功能。

本文披露的某些MIDIS蛋白(或嵌合双向信号传导跨膜蛋白)将来自I型跨膜蛋白的氨基酸序列与来自II型跨膜蛋白的氨基酸序列组合。在一些实施例中，此类MIDIS蛋白表现出出人意料和意想不到的效果，因为I型和II型跨膜蛋白不能容易地组合成功能蛋白。例如，将I型跨膜蛋白的氨基酸序列与II型跨膜蛋白的氨基酸序列融合的许多尝试未能产生功能性蛋白，例如，由于其中一个氨基酸序列的N末端或C末端位置的改变，所产生的蛋白质无法采用功能性构象、三级结构、跨膜取向或其组合。

在本文提供的一些实例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自I型跨膜蛋白的氨基酸序列，并且异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自II型跨膜蛋白的氨基酸序列。在本文提供的一些实例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自II型跨膜蛋白的氨基酸序列，并且异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自I型跨膜蛋白的氨基酸序列(例如，来自41BBL的胞外配体结构域和来自OX40的胞内信号传导结构域)。

在一些实施例中，MIDIS(或嵌合双向信号传导跨膜蛋白)的部分或全部胞外配体结构域和/或异源胞内信号传导结构域包括与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)。在一些实施例中，这样的MIDIS蛋白(或嵌合双向信号传导跨膜蛋白)表现出出人意料和意想不到的效果，因为在许多情况下逆向蛋白不保留亲本蛋白的功能性，例如，由于未能采用功能性构象和/或三级结构。

在一些实施例中，MIDIS蛋白(或嵌合双向信号传导跨膜蛋白)将来自I型跨膜蛋白的氨基酸序列与来自II型跨膜蛋白的氨基酸序列组合，并且含有至少一个与野生型氨基酸序列相比颠倒的氨基酸序列。这种MIDIS蛋白的功能可能是出人意料和意想不到的，因为其缺乏将来自I型和II型跨膜蛋白的序列成功组合成功能性融合蛋白的预期，并且缺乏成功获得功能性逆向蛋白结构域的预期。

I.定义

MIDIS蛋白的“胞外配体结构域”能够与相互作用配偶体结合，并在结合后诱导由相互作用配偶体的胞内结构域介导的信号传导。在整个申请中，表述“MIDIS蛋白”可以被表述“嵌合双向信号传导跨膜蛋白”替代。胞外配体结构域可以包含来自或衍生自本文披露的蛋白质的氨基酸序列，例如野生型蛋白质、衍生自野生型蛋白质的相对于野生型蛋白质序列具有一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代的变体或本文披露的另一种蛋白质。胞外配体结构域可以来自或衍生自例如在细胞表面上表达的蛋白质、肿瘤坏死因子超家族成员、免疫共受体配体、免疫球蛋白超家族成员、细胞因子、相互作用配偶体的天然存在的或合成的肽配体、与相互作用配偶体结合的金属依赖性水解酶家族成员、或本文披露的抗原结合蛋白，例如抗体的抗原结合片段、单链可变片段(scFv)、DARPin或本文披露的其他抗原结合蛋白。胞外配体结构域的非限制性实例包括来自或衍生自41BBL、OX40L、CD86、RANK和CD70的氨基酸序列。胞外配体结构域可以是或可以衍生自I型或II型跨膜蛋白。

在实施例中，胞外配体结构域是肿瘤坏死因子超家族成员或其衍生的分子，并且衍生自II型跨膜蛋白，因此是II型分子。

在实施例中，胞外配体结构域是免疫球蛋白超家族成员或是其衍生的并且衍生自I型跨膜蛋白并且因此是I型分子。

MIDIS蛋白的“异源胞内信号传导结构域”是指存在于MIDIS蛋白中的胞内信号传导结构域，其来自或衍生自与胞外配体结构域不同的蛋白质。当胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由异源胞内信号传导结构域介导的信号传导途径。异源胞内信号传导结构域可以来自或衍生自例如I型或II型跨膜蛋白。异源胞内信号传导结构域在MIDIS蛋白中的存在不一定排除来自与胞外配体结构域相同的蛋白的胞内信号传导结构域的存在，但表明至少一个来自不同蛋白的胞内信号传导结构域存在于MIDIS中。例如，在一些情况下，异源胞内信号传导结构域可以附加至全长野生型跨膜蛋白，其中全长野生型跨膜蛋白包括胞外配体结构域和(非异源)胞内信号传导结构域。在其他情况下，MIDIS不包含来自与胞外配体结构域相同的蛋白质的胞内信号传导结构域。异源胞内信号传导结构域可以包含来自本文披露的蛋白质的氨基酸序列，例如野生型蛋白质、衍生自野生型蛋白质的相对于野生型蛋白质序列具有一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代的变体或本文披露的另一种蛋白质。异源胞内信号传导结构域可以来自或衍生自例如跨膜蛋白、肿瘤坏死因子受体超家族成员、受体酪氨酸激酶、细胞因子受体、C型凝集素受体、参与信号传导途径的胞质蛋白，或本文披露的任何其他合适的蛋白质。异源胞内信号传导结构域的非限制性实例包括来自或衍生自41BB、OX40、NKp80或IL18RAP的氨基酸序列。

MIDIS蛋白的“相互作用配偶体”存在于细胞表面并且能够与MIDIS的胞外配体结构域结合。相互作用配偶体与MIDIS的胞外配体结构域的结合诱导由相互作用配偶体的胞内结构域介导的信号传导。因此，在实施例中，相互作用配偶体包含：

-能够与嵌合双向信号传导跨膜蛋白的胞外配体结构域相互作用的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-胞内结构域，其在相互作用配偶体的胞外结构域与嵌合双向信号传导跨膜蛋白的胞外配体结构域结合后转导第二信号。

术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。

本文所述的多核苷酸可包含编码与调节序列例如启动子可操作地连接(即，与其成功能关系)的多肽的一个或多个核酸。此类多核苷酸在本文中可替代地称为“核酸构建体”或“构建体”。

如本文所用，调节序列是指技术人员已知的驱动或以其他方式调节细胞中核酸表达的任何遗传元件。此类序列包括但不限于启动子、转录终止子、增强子、阻抑子、沉默子、科扎克序列、聚A序列等。调节序列可以是例如诱导型、非诱导型、组成型、细胞周期调节型、代谢调节型等。调节序列可以是启动子。合适启动子的非限制性实例包括EF1α、MSCV、EF1α-HTLV-1杂合启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、MHC II类、凝血因子IX、胰岛素启动子、PDX1启动子、CD11、CD4、CD2、gp47启动子、PGK、β-球蛋白、UbC、MND及其衍生物(即变体)。这些启动子的实例进一步描述于以下文献中：Poletti和Mavilio(2021)，Viruses[病毒学]13：8；1526，Kuroda等人(2008)，J Gene Med[基因学杂志]10(11)：1163-1175，Milone等人(2009)，Mol Ther[分子治疗]17：8；1453-1464，以及Klein等人(2008)，J BiomedBiotechnol[生物医学和生物技术杂志]683505，所有这些均通过引用以其全文并入本文。

本文描述的多核苷酸可以是多顺反子的。“多顺反子”(可替代地在本文中称为“聚顺反子”)可以指产生mRNA的多核苷酸转录，从该mRNA翻译至少两个不同的多肽。例如，这可以通过包含至少两个编码不同多肽的核酸的多核苷酸来实现，优选地，所述核酸可操作地连接至相同的启动子。在一些实施例中，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个、优选至少三个或至少四个多肽由本文所述的多核苷酸表达。本文描述的多核苷酸可以是三顺反子的(即，可以表达三个不同的多肽)。本文描述的多核苷酸可以是四顺反子的(即，可以表达四个不同的多肽)。多顺反子多核苷酸可以包含促进所编码的多肽的共表达的另外核苷酸序列，这将在本文稍后描述。多核苷酸可以包含在本文稍后描述的载体中。

“野生型”蛋白质氨基酸序列可以指天然存在并由种系基因组编码的序列。物种可以具有一个野生型序列，或两个或更多个野生型序列(例如，具有一个规范野生型序列和一个或多个非规范野生型序列)。野生型蛋白质氨基酸序列可以是蛋白质的成熟形式，其已被加工以去除N末端和/或C末端残基，例如去除信号肽。

“衍生自”野生型序列或本文披露的其他氨基酸序列的氨基酸序列可以指与参考氨基酸序列相比有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列，例如，含有如本文所披露的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。

在本申请的上下文中，蛋白质由氨基酸序列表示，并且相应地，核酸分子或多核苷酸由核酸序列表示。序列之间的同一性和相似性：在本申请中，每次提及特定的氨基酸序列SEQ ID NO(以SEQ ID NO：Y为例)时，都可以替换为：由包含与氨基酸序列SEQ ID NO：Y具有至少60％序列同一性或相似性的序列的氨基酸序列表示的多肽。另一个优选的序列同一性或相似性水平是70％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是80％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是90％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是95％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是99％。

本文描述的每个氨基酸序列凭借其与给定氨基酸序列的同一性或相似性百分比，在进一步优选的实施例中，分别与给定核苷酸或氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或相似性。术语“同源性”、“序列同一性”等在本文中可互换使用。“序列同一性”在本文中描述为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在优选的实施例中，序列同一性是基于两个给定SEQ ID NO的全长或其一部分计算的。其部分优选地表示两个SEQ ID NO的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。在本领域中，“同一性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，由此类序列的串之间的匹配确定。两个序列之间的序列同一性程度可以例如通过使用通常用于此目的的计算机程序(例如全局或局部比对算法)比较两个序列来确定。非限制性实例包括BLASTp、BLASTn、ClustalW、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline、GAP、BESTFIT、或另一合适的方法或算法。Needleman和Wunsch全局比对算法可用于比对两个序列的整个长度或其部分(其部分可以指该序列长度的至少50％、60％、70％、80％、90％)，最大化匹配数量并最小化缺口数量。可以使用默认设置并且优选程序是用于成对比对的Needle(在实施例中，EMBOSS Needle6.6.0.0，使用缺口开放罚分10，缺口延伸罚分：0.5，末端缺口罚分：假，末端缺口开放罚分：10，末端缺口延伸罚分：0.5)和用于多序列比对的MAFFT(在实施例中，使用MAFFT v7默认值为：BLOSUM62[bl62]，缺口开放：1.53，缺口延伸：0.123，次序：对齐，树重建数量：2，引导树输出：ON[真]，最大迭代次数：2，执行FFTS：无)

两个氨基酸序列之间的“相似性”通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二多肽的序列进行比较来确定。用于确定序列同一性的类似算法可以用于确定序列相似性。任选地，在确定氨基酸相似度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代。如本文使用，“保守”氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的互换性。下表给出了用于保守取代的氨基酸残基类别的实例。

可替代的保守氨基酸残基取代类别：

1	A	S	T
				2	D	E
3	N	Q
				4	R	K
5	I	L	M
				6	F	Y	W

氨基酸残基的可替代性物理和功能分类：

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例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文披露的氨基酸序列的取代变体是其中披露的序列中的至少一个残基已被移除并在其位置插入不同残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守的。每种天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：Ala至Ser；Arg至Lus；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；Ile至Leu或Val；Leu至Ile或Val；Lys至Arg；Gln或G1u；Met至Leu或Ile；Phe至Met，Leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；以及，Val至Ile或Leu。

“外源抗原识别受体”是能够识别抗原的受体，该受体被人工引入工程改造的细胞中。外源抗原识别受体的非限制性实例包括嵌合抗原受体(CAR)和TCR(其中TCR被人工引入细胞，例如不表达TCR或表达不同TCR的细胞)。外源抗原识别受体可以是例如转基因TCR、αβTCR或γδTCR。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工外源抗原识别受体，其可在CAR与抗原(例如，与癌症或感染性疾病相关的抗原)结合后在表达CAR的工程改造的细胞中诱导信号传导。CAR通常在表达CAR的工程改造的细胞中诱导信号传导，但不在表达或呈递由CAR结合的抗原的细胞中诱导信号传导。CAR包含至少一个胞外靶向结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR包含铰链结构域。CAR胞外靶向结构域可以是、包含或衍生自例如单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体或其功能衍生物、变体或片段，包括但不限于重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体、单结构域抗体例如VHH、及其任何组合。CAR胞外靶向结构域可以是、包含或衍生自例如DARPin、非抗体结构域(例如，来自或衍生自受体或受体配体，例如APRIL)。CAR的胞内信号传导结构域可以诱导或降低包含CAR的工程改造的细胞的活性。CAR的胞内信号传导结构域可以是或可以包含另一分子的信号传导结构域的截短部分。在一些情况下，CAR的胞内结构域可以以刺激方式或抑制方式参与调节TCR复合物的初级激活。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域参与诱导T细胞激活和/或针对表达由CAR结合的抗原的细胞的细胞毒性应答。在一些情况下，CAR也称为人工T细胞受体、嵌合免疫受体或嵌合T细胞受体。

如本文所用，术语“异二聚体受体”包括作为由两个彼此不同的蛋白质单体形成的大分子复合物的任何受体。该术语还可被理解为包括受体的功能性异二聚体片段或部分。作为非限制性实例，该术语包括B细胞受体(其是Ig-α/Ig-β异二聚体(CD79))的信号转导部分、B-细胞受体重链和轻链、Toll样受体1和2异二聚体、αvβ5等整合素、吞噬受体Mac-1、MHC、CD94NKG2C或NKG2E受体、T细胞受体(TCR)、alpha beta(αβ)TCR、gamma delta(γδ)TCR、以及可以作为异二聚体出现的任何其他受体或其功能片段或部分。

“抗原”是抗原受体或抗原结合蛋白可以识别(例如，结合)的分子或分子结构。抗原可以是或可以包含例如肽、多肽、碳水化合物、化学品、部分、非肽抗原、磷酸抗原、肿瘤相关抗原、新抗原、肿瘤微环境抗原、微生物抗原、病毒抗原、细菌抗原、自身抗原、基于聚糖的抗原、基于肽的抗原、基于脂质的抗原或其任何组合。在一些实施例中，抗原能够诱导免疫应答。在一些实例中，当抗原存在于例如由MHC呈递的复合物中时，抗原与抗原受体或抗原结合蛋白结合，或诱导免疫应答。在一些情况下，抗原采用某种构象以便结合抗原受体或抗原结合蛋白，和/或诱导免疫应答，例如响应于一种或多种代谢物的存在或不存在而采用构象。抗原可以指与抗原受体或抗原结合蛋白结合的完整靶分子、完整复合物、或靶分子或复合物的片段。识别抗原的抗原受体包括本文披露的外源性抗原识别受体和其他抗原识别受体，例如内源性T细胞受体。

“TEG”是经工程改造以表达本文所披露的确定的γδTCR的T细胞。在非限制性实例中，TEG可以是被工程改造以表达确定的γδTCR的α-βT细胞。在本申请的上下文中，表述“工程改造的细胞”是指已经使用重组DNA技术修饰的细胞。在实施例中，“工程改造的细胞”已被转化、修饰或转导以包含异源核酸分子。在实施例中，所述细胞表达由所述核酸分子编码的蛋白质。

II.MIDIS蛋白的胞外部分

A.胞外配体结构域

本披露的MIDIS蛋白(即嵌合双向信号传导跨膜蛋白)包含至少一个胞外配体结构域。MIDIS蛋白的胞外配体结构域能够与相互作用配偶体结合，并诱导由相互作用配偶体介导的信号传导。

因此，本发明提供了能够转导至少两个胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白(MIDIS)，所述蛋白包含：

-跨膜结构域，和

-异源胞内信号传导结构域，该异源胞内信号传导结构域在胞外配体结构域与该胞外配体结构域的相互作用配偶体结合后转导第一信号，

其中第二胞内信号通过相互作用配偶体的胞内结构域转导。

在实施例中，至少两个胞内信号是可诱导的。

在实施例中，MIDIS蛋白(即嵌合双向信号传导跨膜蛋白)能够转导至少两个胞内信号，所述蛋白包含：

-跨膜结构域，和

其中第二胞内信号通过相互作用配偶体的胞内结构域转导，并且其中嵌合蛋白不是包含以下或由以下组成的蛋白：ICOSL的胞外配体结构域和跨膜结构域以及41BB的异源胞内信号传导结构域。

包含如上文所声明的ICOSL的胞外配体结构域和跨膜结构域以及41BB的异源胞内信号传导结构域或由如上文所声明的ICOSL的胞外配体结构域和跨膜结构域以及41BB的异源胞内信号传导结构域组成的嵌合蛋白可以由SEQ ID NO：137或由与SEQ ID NO：137在其全长上具有至少97％、或至少98％、或至少98.5％、或至少99％、或至少99.5％或至少100％同一性的氨基酸序列表示。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白不包含ICOSL的胞外配体结构域和跨膜结构域。此类蛋白可以由SEQ ID NO：138或由与SEQ ID NO：138在其全长上具有至少97％、或至少98％、或至少98.5％、或至少99％、或至少99.5％或至少100％同一性的氨基酸序列表示。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白不包含ICOSL的胞外配体结构域。此类蛋白可以由SEQ ID NO：139或由与SEQ ID NO：139在其全长上具有至少97％、或至少98％、或至少98.5％、或至少99％、或至少99.5％或至少100％同一性的氨基酸序列表示。

ICOS在外周Treg上高度表达，并参与这些细胞的发育和抑制功能(Akbari O，NatMed.[自然医学]2002年9月；8(9)：1024-32.doi：10.1038/nm745.电子公开于2002年7月29日.PMID：12145647，Busse M，J Immunol.[免疫学杂志](2012)189：1975-82.doi：10.4049/jimmunol.1103581andTuettenberg A，J Immunol.[免疫学杂志]2009年3月15日；182(6)：3349-56.doi：10.4049/jimmunol.0802733.PMID：19265111)。ICOS的激活使T细胞对抗炎IL10信号传导敏感(Tuettenberg A，J Immunol.[免疫学杂志]2009年3月15日；182(6)：3349-56.doi：10.4049/jimmunol.0802733.PMID：19265111)。鉴于ICOS及其配体ICOSL的生物学特性，优选ICOS信号传导不由本文披露的嵌合蛋白诱导。为此，我们通过排除SEQ IDNO：137、138或139(或与SEQ ID NO：137、138或139全长具有至少97％、或至少98％、或至少98.5％、或至少99％、或至少99.5％或至少100％同一性的序列)作为本披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的(一部分)存在，定义了上述三种可能类型的否定声明。在实施例中，相互作用配偶体不是ICOS。

可以根据其诱导由所需相互作用配偶体介导的信号传导的能力来选择胞外配体结构域。在一些情况下，可以基于其在与相互作用配偶体结合后引发由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的信号传导的能力来选择胞外配体结构域。“至少两个胞内信号”任选地是可诱导的。这意味着嵌合双向信号传导跨膜蛋白可以被认为具有两种构型：一种是不诱导信号，另一种是在嵌合蛋白的胞外配体结构域与其相互作用配偶体的胞外配体结构域相互作用后诱导“至少两个胞内信号”。这些“至少两个胞内信号”可以同时或依次发生。这些“至少两个胞内信号”的诱导能力很有吸引力，因为嵌合蛋白是由相互作用配偶体控制的，反之亦然。可以使用本领域技术人员已知的技术并根据嵌合蛋白的异源胞内信号传导结构域和相互作用配偶体的胞内结构域的身份来评估这种诱导能力。此外，这些“至少两个胞内信号”之一可以取决于导致相互作用配偶体表达的细胞的激活。另外，这些“至少两个胞内信号”之一可以取决于另外的受体(例如但不限于TCR)的激活或信号传导。另外的受体的激活或信号传导的非限制性实例是IL2途径，其在TCR激活后表达CD25(IL2Ra)并且在TCR信号传导后释放IL2。图17中示出了“至少两个胞内信号”是可诱导的实施例的非限制性示例。

胞外配体结构域可包含来自或衍生自在细胞表面上表达的蛋白质的氨基酸序列。在一些实施例中，细胞表面上表达的蛋白质对同源受体具有激动剂活性。

胞外配体结构域可包含来自或衍生自I型跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自II型跨膜蛋白的氨基酸序列。

胞外配体结构域可包含来自或衍生自肿瘤坏死因子超家族成员的氨基酸序列。在一些情况下，胞外配体结构域包含来自或衍生自免疫共受体配体，例如免疫共刺激配体的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自免疫球蛋白超家族成员的氨基酸序列。胞外配体结构域可包含来自或衍生自41BBL、OX40L、CD86或RANK的氨基酸序列。胞外配体结构域可包含来自或衍生自41BBL、OX40L、CD86、RANK或CD70的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自41BBL的氨基酸序列。在实施例中，胞外配体结构域来自或衍生自41BBL，41BBL是II型跨膜蛋白。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自OX40L的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自CD86的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自RANK的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自CD70的氨基酸序列。

胞外配体结构域可包含来自或衍生自受体(例如离子通道、GPCR或受体酪氨酸激酶)的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自肿瘤坏死因子受体超家族成员的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自或衍生自免疫共受体的氨基酸序列。

胞外配体结构域可包含来自或衍生自细胞因子的氨基酸序列。胞外配体结构域可包含来自或衍生自C型凝集素的氨基酸序列。胞外配体结构域可包含来自或衍生自可溶性蛋白质(例如分泌性蛋白质或胞质蛋白质)的氨基酸序列。

胞外配体结构域可以包含相互作用配偶体的肽配体，例如天然存在的或合成的肽配体。

胞外配体结构域可包含来自或衍生自抗原结合蛋白的氨基酸序列。抗原结合蛋白的非限制性实例包括抗体、可变区(例如，可变链重区(VH)和/或可变链轻区(VL))、短链可变片段(scFv)、单结构域抗体、Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fab缀合物的二聚体和三聚体、Fv、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、亲和体、锚蛋白、锚蛋白重复序列、DARPins、单抗体、纳米抗体、亲和多聚体(avimers)、纤维连接蛋白(adnectins)、抗运载蛋白(anticalins)、Fynomers、库尼茨(Kunitz)结构域、打结素(knottins)或β-发夹模拟物。在一些实施例中，胞外配体结构域包含一个或多个单链可变片段(scFv)。scFv(单链可变片段)是一种融合蛋白，其可包含通过肽接头连接的VH和VL结构域。操纵VH和VL结构域的取向以及接头长度可用于创建不同形式的分子，这些分子可以是单体、二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)或四聚体(四抗体)。微型抗体是组装成二价二聚体的scFv-CH3融合蛋白。在一些实施例中，胞外配体结构域包含一个或多个DARPin。在一些实施例中，胞外配体结构域包含来自抗体或T细胞受体的一个或多个互补决定区(CDR)，例如一个、三个或六个CDR。衍生自单克隆抗体的抗原结合片段可以是例如嵌合的、人源化的或完全人的。

可以根据其对所需相互作用配偶体的结合亲和力来选择胞外配体结构域。在一些实施例中，胞外配体结构域以例如小于约500nM、小于约300nM、小于约200nM、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约1nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约50pM、小于约10pM、小于约1pM、小于约500fM或小于约100fM的KD结合相互作用配偶体。

胞外配体结构域可包含来自或衍生自野生型蛋白质氨基酸序列的氨基酸序列。野生型蛋白质氨基酸序列可以指天然存在并由种系基因组编码的序列。物种可以具有一个野生型序列，或两个或更多个野生型序列(例如，具有一个规范野生型序列和一个或多个非规范野生型序列)。野生型蛋白质氨基酸序列可以是蛋白质的成熟形式，其已被加工以去除N末端和/或C末端残基，例如去除信号肽。

胞外配体结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比经过修饰的氨基酸序列，例如以实现期望的表达水平、表面表达、稳定性、抗聚集性、抗降解性、对相互作用配偶体的亲和力、或由相互作用配偶体介导的信号水平。胞外配体结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的氨基酸序列相比被修饰的氨基酸序列，例如以促进MIDIS折叠成生物活性构象。在一些实施例中，部分或全部胞外配体结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)。

胞外配体结构域可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比具有至少最低水平的序列同一性的氨基酸序列。在实施例中，与给定氨基酸序列相比具有至少最低水平的序列同一性的此类胞外配体结构域是有功能的，并且因此涵盖在本发明中，只要这种胞外配体结构域能够与其相互作用配偶体的胞外结构域结合或相互作用。结合或相互作用的水平应当可以使用技术人员已知的测定来检测。合适的测定的实例是蛋白质印迹或FACS、ELISA或SPR测定。根据所使用的胞外配体结构域，技术人员将知道哪种测定是最合适的。例如，对于OX40，将评估NFKB信号传导，对于41BBL，将评估41BB的结合。在实施例中，当胞外配体结构域仍然包含在其来源的全长跨膜分子内时，评估所述胞外配体结构域的活性。例如，胞外配体结构域可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06或174中的任一个)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。在部分或全部胞外配体结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)的情况下，野生型蛋白质氨基酸序列可以在计算序列同一性之前被反向。

在一些实施例中，胞外配体结构域可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：作为野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

表1提供了本披露的胞外结构域或胞外配体结构域可包含的、由其组成的、基本上由其组成的或从其衍生的氨基酸序列的非限制性实例。EC：胞外。

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胞外配体结构域可包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的氨基酸序列。

例如，胞外配体结构域可包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

一个或多个插入可以位于氨基酸序列内的N末端、C末端、或其组合。一个或多个插入可以是连续的、不连续的、或其组合。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

一个或多个缺失可以位于氨基酸序列内的N末端、C末端、或其组合。一个或多个缺失可以是连续的、不连续的、或其组合。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

在一些实施例中，胞外配体结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：01-06中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：01-06或174中的任一个。

一个或多个取代可以位于氨基酸序列内的N末端、C末端、或其组合。一个或多个取代可以是连续的、不连续的、或其组合。一个或多个取代可以是保守的、非保守的、或其组合。

保守氨基酸取代可以是一个氨基酸取代为具有相似生化特性(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一个氨基酸。非保守氨基酸取代可以是一个氨基酸取代为具有不同生化特性(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一个氨基酸。保守氨基酸变化可以是例如对多肽的二级或三级结构影响最小的取代。

本披露的MIDIS蛋白可以具有任何合适数量的胞外配体结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有一个胞外配体结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有两个胞外配体结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个胞外配体结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个胞外配体结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个胞外配体结构域。

B.胞外配体结构域的相互作用配偶体

胞外配体结构域的相互作用配偶体存在于细胞表面上，并且在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导经由相互作用配偶体的胞内结构域的信号传导。信号传导途径的诱导可有助于本文披露的一系列目标生物学结果和生物学功能，例如，增强的细胞增殖、存活以及更大程度和持续时间的免疫效应子功能。

相互作用配偶体可以是共免疫受体。

在实施例中，细胞包含、优选地共表达各自作为跨膜蛋白的嵌合双向信号传导跨膜蛋白和相互作用配偶体。在实施例中，不存在包含或表达相互作用配偶体并且不包含或不表达信号双向信号传导跨膜蛋白的细胞。相互作用配偶体可以在细胞上内源表达，并且所述细胞可以用嵌合双向信号传导跨膜蛋白转导或转化。可替代地，相互作用配偶体和嵌合双向信号传导跨膜蛋白可转导至同一细胞中。

其中一个单细胞能够转导源自嵌合双向信号跨膜蛋白的至少两个胞内信号的该实施例是有吸引力的，因为所述细胞依赖于内源类型的信号传导并且在细胞表面表达调节方式方面是自激活的或自给自足的并且可能不需要任何其他信号来改善生物学参数和/或功能和/或改善由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白的相互作用配偶体包含：

在一些实施例中，胞外配体结构域与相互作用配偶体的结合调节第二信号传导途径，例如，诱导、或增加或减少第二信号传导途径的活性。在一些实施例中，相互作用配偶体存在于信号传导复合物中，并且在MIDIS的胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，由相互作用配偶体介导的信号传导被调节，例如，由信号传导复合物介导的信号传导被增加或减少。在一些实施例中，在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，第一信号传导途径的活性降低并且诱导不同的信号传导途径。可以根据相互作用配偶体调节(例如，诱导)与期望的生物学结果或生物学功能相关的信号传导途径的能力来选择相互作用配偶体。

在一些实施例中，MIDIS蛋白作为单体与相互作用配偶体结合。在一些实施例中，MIDIS蛋白在与相互作用配偶体结合时形成二聚体。在一些实施例中，MIDIS蛋白在与相互作用配偶体结合时形成三聚体。在一些实施例中，MIDIS蛋白以四聚体、五聚体、六聚体或多聚体的形式与相互作用配偶体结合。当作为多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或更高阶多聚体)结合时，MIDIS蛋白可形成同多聚体(例如，同二聚体、同三聚体、同四聚体、同五聚体、同六聚体或更高阶同多聚体)。在一些情况下，MIDIS蛋白作为异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体、异四聚体、异五聚体、异六聚体、或更高阶异多聚体)与相互作用配偶体结合。

在一些实施例中，与胞外配体结构域结合的相互作用配偶体由免疫细胞表达。在一些实施例中，相互作用配偶体由白细胞，例如淋巴细胞，例如T细胞表达。在一些实施例中，相互作用配偶体由癌细胞表达。在一些实施例中，相互作用配偶体由哺乳动物细胞表达。在一些实施例中，相互作用配偶体由人细胞表达。在一些实施例中，相互作用配偶体由以下表达：α-βT细胞、γ-δT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T效应细胞、淋巴细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴细胞、先天性淋巴细胞(ILC)、肥大细胞、巨核细胞、浆细胞、胸腺细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、间充质干细胞、内皮细胞、基质细胞、或其细胞的任何混合物或组合。在一些实施例中，相互作用配偶体由原代细胞表达。在一些实施例中，相互作用配偶体由不是原代细胞的细胞表达。

在实施例中，与一般T细胞发育和功能相比，本披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的相互作用配偶体对于Treg发育和功能并不更重要。在实施例中，相互作用配偶体的表达是可诱导的。在实施例中，该表达在TCR激活后被诱导。

在一些实施例中，相互作用配偶体由与表达MIDIS蛋白的细胞属于相同细胞类型的细胞表达。在一些实施例中，MIDIS蛋白和相互作用配偶体均由同一细胞表达。

相互作用配偶体可以是受体，例如，例如肿瘤坏死因子受体超家族成员。相互作用配偶体可以是例如41BB、OX40、RANKL或IL18RAP(IL18RB)。另一个实例是41BB、OX40、RANKL、IL18RAP或CD27。在一些实施例中，相互作用配偶体是41BB。在一些实施例中，相互作用配偶体是OX40。在一些实施例中，相互作用配偶体是RANKL。在一些实施例中，相互作用配偶体是IL18RAP。在一些实施例中，相互作用配偶体是CD27。在实施例中，相互作用配偶体不是ICOS。

在一些实施例中，相互作用配偶体是免疫球蛋白超家族成员或免疫共受体，例如激活免疫共受体，例如CD86。在一些实施例中，相互作用配偶体是细胞因子受体。在一些实施例中，相互作用配偶体是C型凝集素受体。在一些实施例中，相互作用配偶体是离子通道、GPCR、丝氨酸肽酶、整合素、四跨膜蛋白、或受体酪氨酸激酶。在一些实施例中，相互作用配偶体是肿瘤坏死因子超家族成员，其包含可介导信号传导的胞内结构域。在一些实施例中，相互作用配偶体是41BBL或OX40L。

在实施例中，由嵌合双向信号传导跨膜蛋白转导的至少两个任选地可诱导的胞内信号有助于表达嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善。

在一些实施例中，在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由相互作用配偶体的胞内配体结构域介导的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个信号传导途径。在一些实施例中，在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由相互作用配偶体的胞内配体结构域介导的一个、两个、三个、四个、五个或六个信号传导途径。在一些实施例中，在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由相互作用配偶体的胞内结构域介导的一个信号传导途径。

C.另外的胞外结构域

MIDIS蛋白的胞外部分可以包含一个或多个另外的胞外结构域以及一个或多个胞外配体结构域。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自与胞外配体结构域相同的蛋白的一个或多个另外的胞外结构域，例如，不参与结合相互作用配偶体或不诱导由结合胞外配体结构域的相互作用配偶体介导的信号传导的氨基酸序列区段。在一些实施例中，另外的胞外结构域不参与与相互作用配偶体的结合，但增加或降低由相互作用配偶体介导的信号传导水平。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自与跨膜结构域相同的蛋白的另外的胞外结构域，例如与异源胞内信号传导结构域相同的蛋白或不同的蛋白。在一些实施例中，此类另外的胞外结构域不诱导由相互作用配偶体介导的信号传导。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自与异源胞内信号传导结构域相同的蛋白的另外的胞外结构域。在一些实施例中，此类另外的胞外结构域不诱导由相互作用配偶体介导的信号传导。在一些情况下，可以基于在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后引发由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的信号传导的能力来选择另外的胞外结构域。

另外的胞外结构域可以是或可以包含切割位点，例如ADAM家族切割位点或金属蛋白酶家族切割位点。另外的胞外结构域可以是或可以包含多聚化结构域(例如，促进同二聚体或异二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或更高阶多聚体形成的结构域，例如生腱蛋白-C寡聚化结构域、血小板反应蛋白寡聚化结构域或GCN4寡聚化结构域)。另外的胞外结构域可以是或可以包含细胞定位基序，例如脂筏定位基序或核定位基序。另外的胞外结构域可以是或可以包含靶肽，例如信号肽。另外的胞外结构域可以包含接头。

另外的胞外结构域可以包含来自或衍生自野生型蛋白质氨基酸序列的氨基酸序列。另外的胞外结构域可包含来自或衍生自本文别处披露的任何蛋白质或蛋白质类型的氨基酸序列。另外的胞外结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比经过修饰的氨基酸序列，例如以实现期望的表达水平、表面表达、稳定性、抗聚集性、抗脱落性或抗降解性。另外的胞外结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的氨基酸序列相比被修饰的氨基酸序列，例如以促进MIDIS折叠成生物活性构象。在一些实施例中，部分或全部另外的胞外结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)。

另外的胞外结构域可包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文别处披露的任何其他氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的氨基酸序列。与野生型蛋白质氨基酸序列或本文别处披露的任何其他氨基酸序列相比，另外的胞外结构域可包含至少最低水平的序列同一性。

III.胞内结构域

D.异源胞内信号传导结构域

本披露的MIDIS蛋白包含至少一个异源胞内信号传导结构域。“异源”是指胞内信号传导结构域来自或衍生自与胞外配体结构域不同的蛋白质的事实。当胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由异源胞内信号传导结构域介导的信号传导途径。信号传导途径的诱导可有助于本文披露的一系列目标生物学结果和生物学功能，例如，增强的细胞增殖、存活以及更大程度和持续时间的免疫效应子功能。

可以根据相互作用配偶体诱导与期望的生物学结果或生物学功能相关的信号传导途径的能力来选择异源胞内信号传导结构域。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自跨膜蛋白(例如在细胞表面上表达的蛋白)的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自I型跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自II型跨膜蛋白的氨基酸序列。

异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自肿瘤坏死因子受体超家族成员的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自免疫球蛋白超家族成员的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自细胞因子受体的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自C凝集素家族成员的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自41BB、OX40、NKp80或IL1 8RAP的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自41BB、OX40、NKp80、IL18RAP或IL2RB的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自41BB的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自OX40的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自OX40以及来自或衍生自I型跨膜OX40蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自NKp80的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自IL18RAP的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自IL2RB的氨基酸序列。

异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自受体的氨基酸序列，所述受体是例如离子通道、GPCR、丝氨酸蛋白酶、免疫球蛋白超家族成员、补体受体、含有TIR结构域的受体或受体酪氨酸激酶。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自细胞因子受体的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自C型凝集素受体的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自参与信号传导途径的胞质蛋白的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自参与信号传导途径的核蛋白的氨基酸序列。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自肿瘤坏死因子超家族成员的胞内结构域的氨基酸序列。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自免疫共受体的胞内结构域的氨基酸序列。在一些情况下，异源胞内信号传导结构域包含来自或衍生自含有信号传导结构域的免疫共受体配体的胞内结构域(例如免疫共刺激配体的胞内信号传导结构域)的氨基酸序列。在许多情况下，不必使用整个链，例如，信号传导结构域的截短部分可用于异源胞内信号传导结构域中。

异源胞内信号传导结构域可以在结构上不同于嵌合抗原受体和类似嵌合蛋白中发现的胞内结构域。例如，异源胞内信号传导结构域可以缺乏与TCR复合物信号传导相关联的一个或多个组分。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域不包含ITAM。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含hemITAM但不包含ITAM。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域在MIDIS蛋白与相互作用配偶体结合后不被磷酸化。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域不包含来自CD3链的胞内结构域，例如不包含CD3ζ链的胞内结构域。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域不包含来自TCR信号传导复合物的胞内结构域。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域在MIDIS蛋白与相互作用配偶体结合后被磷酸化。

异源胞内信号传导结构域可包含来自或衍生自野生型蛋白质氨基酸序列的氨基酸序列。异源胞内信号传导结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比经过修饰的氨基酸序列，例如以实现期望的表达水平、表面表达、稳定性、抗聚集性、抗脱落性、抗降解性、信号传导强度或对参与下游信号传导的蛋白质(例如衔接蛋白)的亲和力。异源胞内信号传导结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的氨基酸序列相比被修饰的氨基酸序列，例如以促进MIDIS折叠成生物活性构象。在一些实施例中，部分或全部异源胞内信号传导结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)。

异源胞内信号传导结构域可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比具有至少最低水平的序列同一性的氨基酸序列。例如，异源胞内信号传导结构域可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ IDNO：07-19中的任何一个)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。在实施例中，这种与给定氨基酸序列相比至少具有最低水平序列同一性的异源胞内信号传导结构域是有功能的，因此被本发明所涵盖，只要该胞内信号传导结构域能够在胞外配体结构域与其相互作用配偶体结合后转导第一信号。第一信号应当可以使用本领域技术人员已知的测定来检测。合适的测定的实例是蛋白质印迹或FACS、发光测定。根据所使用的异源胞内信号传导结构域的身份，技术人员将知道哪种测定法适合使用。NfκB报告子测定可用于评估所述异源胞内结构域的活性。在实施例中，当异源胞内信号传导结构域仍然包含在其来源的全长跨膜分子内时，评估所述异源胞内信号传导结构域的活性。

在部分或全部异源胞内信号传导结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)的情况下，野生型蛋白质氨基酸序列可以在计算序列同一性之前被反向。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：作为野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQID NO：07-19中的任一个)的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

表2提供了本披露的胞内结构域和异源胞内信号传导结构域可包含的、由其组成的、基本上由其组成的或从其衍生的氨基酸序列的非限制性实例。

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异源胞内信号传导结构域可包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的氨基酸序列。

例如，异源胞内信号传导结构域可包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO∶07-19中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：07-19中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：07-19或175中的任一个。

在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域作为单体进行信号传导。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域作为二聚体进行信号传导。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域作为三聚体进行信号传导。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域作为四聚体、五聚体、六聚体或多聚体进行信号传导。当作为多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、或更高阶多聚体)进行信号传导时，异源胞内信号传导结构域可以作为同多聚体(例如，同二聚体、同三聚体、同四聚体、同五聚体、同六聚体、或更高阶同多聚体)进行信号传导。在一些情况下，异源胞内信号传导结构域作为异多聚体(例如，异二聚体、异三聚体、异四聚体、异五聚体、异六聚体、或更高阶异多聚体)进行信号传导。在一些实施例中，异源胞内信号传导结构域以与异源胞内信号传导结构域来自或衍生自的全长野生型蛋白不同的构象或作为不同的多聚体进行信号传导。

本披露的MIDIS蛋白可以具有任何合适数量的异源胞内信号传导结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有一个异源胞内信号传导结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有两个异源胞内信号传导结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个异源胞内信号传导结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个异源胞内信号传导结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个异源胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自41BB、OX40、NKp80、IL1 8RAP或IL2RB的两个异源胞内信号传导结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自OX40的异源胞内信号传导结构域，以及来自或衍生自41BB、NKp80、IL18RAP或IL2RB的异源结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自OX40的异源胞内信号传导结构域和来自或衍生自IL2RB的异源胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由异源胞内信号传导结构域介导的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个信号传导途径。在一些实施例中，在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由异源胞内信号传导结构域介导的一个、两个、三个、四个、五个或六个信号传导途径。在一些实施例中，在胞外配体结构域与相互作用配偶体结合后，诱导由异源胞内信号传导结构域介导的一个信号传导途径。

E.另外的胞内结构域

MIDIS蛋白可包含一个或多个另外的胞内结构域以及一个或多个异源胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自与异源胞内信号传导结构域相同的蛋白质的一个或多个另外的胞内结构域，例如不参与信号传导的氨基酸区段。在一些实施例中，另外的胞内结构域不直接参与信号传导(例如，不结合信号传导途径组分或不作为信号传导途径的一部分发生化学或结构变化)，但增加或降低由异源胞内信号传导结构域介导的信号传导水平。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自与跨膜结构域相同的蛋白质的另外的胞内结构域，其可以是例如与胞外配体结构域相同的蛋白或不同的蛋白。这样的胞内结构域可包含信号传导结构域或可缺少信号传导结构域。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含来自或衍生自与胞外配体结构域相同的蛋白的胞内结构域。这样的胞内结构域可缺乏信号传导结构域或可包含与存在于MIDIS中的异源胞内信号传导结构域不同的信号传导结构域。在一些实施例中，添加一个或多个氨基酸以实现与作为胞外配体结构域来源的蛋白质的序列相似性和/或结构相似性。例如，在一些实施例中，可以将氨基酸MLG添加至含有41BBL胞外配体结构域的MIDIS蛋白的胞内N末端。

另外的胞内结构域可以是或可以包含切割位点，例如ADAM家族切割位点或金属蛋白酶家族切割位点。另外的胞内结构域可以是或可以包含多聚化结构域(例如，促进同二聚体或异二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或更高阶多聚体形成的结构域，例如生腱蛋白-C寡聚化结构域、血小板反应蛋白寡聚化结构域或GCN4寡聚化结构域)。另外的胞内结构域可以是或可以包含靶肽，例如信号肽。另外的胞内结构域可以是或可以包含细胞定位基序，例如脂筏定位基序或核定位基序。另外的胞内结构域可以包含接头。

另外的胞内结构域可以包含来自或衍生自野生型蛋白质氨基酸序列的氨基酸序列。另外的胞内结构域可包含来自或衍生自本文别处披露的任何蛋白质或蛋白质类型的氨基酸序列。另外的胞内结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比经过修饰的氨基酸序列，例如以实现期望的表达水平、表面表达、稳定性、抗聚集性、抗脱落性、抗降解性、信号传导强度或对参与下游信号传导的蛋白质(例如衔接蛋白)的亲和力。另外的胞内结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的氨基酸序列相比被修饰的氨基酸序列，例如以促进MIDIS折叠成生物活性构象。在一些实施例中，部分或全部另外的胞内结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)。

另外的胞内结构域可包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文别处披露的任何其他氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的氨基酸序列。与野生型蛋白质氨基酸序列或本文别处披露的任何其他氨基酸序列相比，另外的胞内结构域可包含至少最低水平的序列同一性。

在一些实施例中，本披露的MIDIS蛋白的整个胞内部分(含有一个或多个异源胞内信号传导结构域和任何另外的胞内结构域)可以在结构上不同于嵌合抗原受体和类似嵌合蛋白中发现的胞内结构域。例如，MIDIS蛋白的整个胞内部分可能缺乏与TCR复合物信号传导相关的一个或多个组分。在一些实施例中，MIDIS蛋白的整个胞内部分不包含ITAM(例如，包含hemITAM但不包含ITAM，或不包含hemITAM或ITAM)。在一些实施例中，MIDIS蛋白的整个胞内部分在MIDIS蛋白与相互作用配偶体结合后不被磷酸化。在一些实施例中，MIDIS蛋白的胞内部分在MIDIS蛋白与相互作用配偶体结合后被磷酸化。在一些实施例中，MIDIS蛋白的整个胞内部分不含有来自CD3链的胞内结构域，例如不含有CD3ζ链的胞内结构域，或不含有来自任何CD3链的胞内结构域。在一些实施例中，MIDIS蛋白的整个胞内部分不包含来自TCR信号传导复合物的胞内结构域。

IV.跨膜结构域

本披露的MIDIS蛋白包含将胞外配体结构域连接至异源胞内信号传导结构域的跨膜结构域。

在一些实施例中，部分或全部跨膜结构域来自与胞外配体结构域相同的蛋白质。在部分或全部跨膜结构域来自与胞外配体结构域相同的蛋白质的情况下，跨膜结构域和胞外配体结构域可以是连续氨基酸序列(例如，与野生型序列匹配或对应的连续氨基酸序列)的一部分，或者可以被一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代分隔。在实施例中，跨膜结构域或其部分来自或衍生自与胞外配体结构域相同的蛋白质。

在一些实施例中，部分或全部跨膜结构域来自与异源胞内信号传导结构域相同的蛋白质。在部分或全部跨膜结构域来自与异源胞内信号传导结构域相同的蛋白质的情况下，跨膜结构域和异源胞内信号传导结构域可以是连续氨基酸序列(例如，与野生型序列匹配或对应)的一部分)，或者可以被一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代分隔。

在一些实施例中，部分或全部跨膜结构域来自或衍生自与胞外配体结构域和异源胞内信号传导结构域不同的蛋白质。作为非限制性实例，本披露的MIDIS蛋白可包含含有来自或衍生自CD70的氨基酸序列的胞外配体结构域、含有来自或衍生自41BBL的氨基酸序列的跨膜结构域、含有来自或衍生自OX40的氨基酸序列的异源胞内信号传导结构域。

跨膜结构域可包含来自或衍生自跨膜蛋白(例如在细胞表面上表达的蛋白)的氨基酸序列。跨膜结构域可包含来自或衍生自I型跨膜蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自II型跨膜蛋白的氨基酸序列。

跨膜结构域可包含来自或衍生自肿瘤坏死因子受体超家族成员的氨基酸序列。跨膜结构域可包含来自或衍生自41BB、OX40、NKp80、RANK或IL18RAP的氨基酸序列。跨膜结构域可包含来自或衍生自41BB、OX40、NKp80、RANK、IL18RAP或CD70的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自41BB的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自OX40的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自NKp80的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自RANK的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自IL18RAP的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自CD70的氨基酸序列。

在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自肿瘤坏死因子超家族成员或免疫球蛋白超家族的氨基酸序列。跨膜结构域可包含来自或衍生自41BBL、OX40L、CD86或RANK的氨基酸序列。跨膜结构域可包含来自或衍生自41BBL、OX40L、CD86、RANK或CD70的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自41BBL的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自OX40L的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自CD86的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自RANK的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自CD70的氨基酸序列。

跨膜结构域可包含来自或衍生自受体的氨基酸序列，所述受体是例如离子通道、GPCR、选择素家族成员、细胞因子受体、粘附分子或受体酪氨酸激酶。跨膜结构域可包含来自或衍生自细胞因子受体的氨基酸序列。跨膜结构域可包含来自或衍生自C型凝集素或C型凝集素受体的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含来自或衍生自免疫共受体的氨基酸序列。在一些情况下，跨膜结构域包含来自或衍生自免疫共受体配体，例如免疫共刺激配体的氨基酸序列。

在一个方面，跨膜结构域来自T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、CD8、CD4、CD28、CD45、PD-1和/或CD152。

跨膜结构域可以包含来自或衍生自野生型蛋白质氨基酸序列的氨基酸序列。跨膜结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比经过修饰的氨基酸序列，例如以实现MIDIS蛋白的期望的表达水平、表面表达、稳定性、抗聚集性、抗降解性、信号传导强度、定位或多聚化。跨膜结构域可以包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的氨基酸序列相比被修饰的氨基酸序列，例如以促进MIDIS折叠成生物活性构象。在一些实施例中，部分或全部跨膜结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)。跨膜结构域可以包含人工疏水序列。在一些实施例中，跨膜结构域可以包含细胞定位基序，例如脂筏定位基序或核定位基序。

在一个非限制性实例中，本披露的MIDIS可以包含来自RANK的胞外配体结构域和来自IL1 8RAP的跨膜结构域。在一些实施例中，包含来自IL1 8RAP的跨膜结构域诱导MIDIS形成二聚体状态，这与可以充当三聚体的野生型RANK不同。以相同的方式，本披露的跨膜结构域可以诱导MIDIS形成单体或多聚体状态，该状态不同于胞外配体结构域来源或衍生自的蛋白质的全长野生型版本所采用的状态，和/或不同于异源胞内结构域来源或衍生自的蛋白质的全长野生型版本。

跨膜结构域可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比具有至少最低水平的序列同一性的氨基酸序列。例如，跨膜结构域可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任何一个)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。在实施例中，与给定氨基酸序列相比具有至少最低水平的序列同一性的此类跨膜结构域是有功能的，并且因此涵盖在本发明中，只要这种跨膜结构域能够在胞外结构域与其相互作用配偶体结合后诱导包括所述跨膜结构域的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多聚化。结合或相互作用的水平应当可以使用技术人员已知的测定来检测。合适的测定的实例是蛋白质印迹或FACS、单光子显微镜测定。

在部分或全部跨膜结构域包含与野生型氨基酸序列相比是颠倒的氨基酸序列(即表达为逆向蛋白)的情况下，野生型蛋白质氨基酸序列可以在计算序列同一性之前被反向。在一些实施例中，跨膜结构域可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：作为野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个

表3提供了本披露的跨膜结构域可包含的、由其组成的、基本上由其组成的或从其衍生的氨基酸序列的非限制性实例。

跨膜结构域可包含与野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的氨基酸序列。

例如，跨膜结构域可包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。在一些实施例中，跨膜结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、或至多10个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。在一些实施例中，跨膜结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。一个或多个插入可以位于氨基酸序列内的N末端、C末端、或其组合。一个或多个插入可以是连续的、不连续的、或其组合。

在一些实施例中，跨膜结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。在一些实施例中，跨膜结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、或至多10个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。在一些实施例中，跨膜结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。一个或多个缺失可以位于氨基酸序列内的N末端、C末端、或其组合。一个或多个缺失可以是连续的、不连续的、或其组合。

在一些实施例中，跨膜结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。在一些实施例中，跨膜结构域包含相对于野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、或至多10个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。在一些实施例中，跨膜结构域包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：20-27中的任一个)的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：20-27或177中的任一个。一个或多个取代可以位于氨基酸序列内的N末端、C末端、或其组合。一个或多个取代可以是连续的、不连续的、或其组合。一个或多个取代可以是保守的、非保守的、或其组合。

V.接头

本披露的MIDIS蛋白质可以包含连接本披露的氨基酸序列(例如来自或衍生自不同蛋白质的氨基酸序列)的一个或多个接头。接头可将例如胞外配体结构域连接至跨膜结构域，将异源胞内信号传导结构域连接至跨膜结构域，将一个胞外配体结构域连接至第二胞外配体结构域或另外的胞外结构域，将一个异源胞内信号传导结构域连接至另一个异源胞内信号传导结构域或另外的胞内结构域，或将本文披露的任何结构域连接至另一个氨基酸序列。

接头可允许其分离的结构域(例如跨膜结构域和胞外配体结构域)的分离和柔性。可以调整接头的长度以改变结构域结合以下的能力：例如，相互作用配偶体(对于胞外配体结构域)或参与信号传导途径的因子(例如，对于异源胞内信号传导结构域)。

接头序列的长度可以是，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基。在一些实施例中，接头的长度是至少1、至少3、至少5、至少7、至少9、至少11或至少15个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度是至多5个、至多7个、至多9个、至多11个、至多15个、至多20个、至多25个或至多50个氨基酸。

柔性接头可以具有包含甘氨酸和丝氨酸残基区段的序列。甘氨酸和丝氨酸残基的小尺寸提供了柔性，并允许连接的功能结构域移动。丝氨酸或苏氨酸的掺入可以通过与水分子形成氢键来保持接头在水溶液中的稳定性，从而减少接头和蛋白质部分之间不利的相互作用。柔性接头还可以包含另外的氨基酸(如苏氨酸和丙氨酸)以保持柔性，以及极性氨基酸(如赖氨酸和谷氨酰胺)以提高溶解度。刚性接头可具有例如α螺旋结构。α-螺旋刚性接头可以作为蛋白质结构域之间的间隔物。

接头可以包含表4中的任何序列或其重复(例如，SEQ ID NO∶28-44中的任一个的2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复)。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于SEQ ID NO：28-44中的任一个具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸插入、缺失或取代的接头。插入、缺失或取代可以在N末端、C末端、序列内或其组合。插入、缺失或取代可以是连续的或不连续的。在一些情况下，取代是保守的。在一些情况下，取代是非保守的。

在一些实施例中，本披露的MIDIS蛋白不含有任何接头，例如，MIDIS蛋白是来自其他蛋白的氨基酸序列的直接融合物，没有间插氨基酸序列。

VI.示例性MIDIS蛋白质

本披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白(MIDIS)能够转导至少两个胞内信号，所述蛋白包含：

-跨膜结构域，和

其中第二胞内信号通过相互作用配偶体的胞内结构域转导。

在实施例中，至少两个胞内信号是可诱导的。

在实施例中，能够转导至少两个胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

-跨膜结构域，和

在实施例中，能够转导至少两个、任选地可诱导的胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

-胞外配体结构域，该胞外配体结构域能够与该胞外配体结构域的相互作用配偶体的胞外结构域相互作用，其中胞外配体结构域由与表1中鉴定的SEQ ID NO：1-6之一具有至少80％同一性的序列表示，

-跨膜结构域，其由与表3中鉴定的SEQ ID NO：20-27之一具有至少80％同一性的序列表示，以及

-异源胞内信号传导结构域，该异源胞内信号传导结构域在胞外配体结构域与该胞外配体结构域的相互作用配偶体结合后转导第一信号，其中异源胞内信号传导结构域由与表2中鉴定的SEQ ID NO：7-19之一具有至少80％同一性的序列表示，

其中第二胞内信号通过相互作用配偶体的胞内结构域转导。在本实施例中，序列同一性可以是至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

-胞外配体结构域，该胞外配体结构域能够与该胞外配体结构域的相互作用配偶体的胞外结构域相互作用，其中胞外配体结构域由与表1中鉴定的SEQ ID NO：1-6或174之一具有至少80％同一性的序列表示，

-跨膜结构域，其由与表3中鉴定的SEQ ID NO：20-27或177之一具有至少80％同一性的序列表示，以及

-异源胞内信号传导结构域，该异源胞内信号传导结构域在胞外配体结构域与该胞外配体结构域的相互作用配偶体结合后转导第一信号，其中异源胞内信号传导结构域由与表2中鉴定的SEQ ID NO：7-19或175之一具有至少80％同一性的序列表示，

其中第二胞内信号通过相互作用配偶体的胞内结构域转导。在本实例中，序列同一性可以是至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一个实施例中，跨膜结构域和胞外配体结构域来自相同的蛋白质。非限制性实例是CD86-OX40、41BBL-OX40、OX40L-41BB。

在实施例中，能够在一个单细胞中转导至少两个任选地可诱导的胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含来自或衍生自I型跨膜蛋白的胞外配体结构域和来自或衍生自I型跨膜蛋白的异源胞内信号传导结构域。在实施例中，能够在一个单细胞中转导至少两个任选地可诱导的胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含来自或衍生自II型跨膜蛋白的胞外配体结构域和来自或衍生自II型跨膜蛋白的异源胞内信号传导结构域。

在实施例中，能够在一个单细胞中转导至少两个、任选地可诱导的胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

a.来自或衍生自I型跨膜蛋白的胞外配体结构域，和来自或衍生自II型跨膜蛋白的异源胞内信号传导结构域，或

b.来自或衍生自II型跨膜蛋白的胞外配体结构域，和来自或衍生自I型跨膜蛋白的异源胞内信号传导结构域。

这种包含部分I型跨膜蛋白和部分II型跨膜蛋白的嵌合蛋白表现出出人意料和意想不到的效果，因为I型和II型跨膜蛋白不能容易地组合成功能蛋白。例如，将I型跨膜蛋白的氨基酸序列与II型跨膜蛋白的氨基酸序列融合的许多尝试未能产生功能性蛋白，例如，由于其中一个氨基酸序列的N末端或C末端位置的改变，所产生的蛋白质无法采用功能性构象、三级结构、跨膜取向或其组合。出人意料的是，其中一些嵌合蛋白已在实验部分成功生成，并被发现具有活性。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

-胞外配体结构域，其包含来自肿瘤坏死因子超家族成员、细胞因子、C型凝集素、免疫球蛋白超家族成员、或抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列；和

-异源胞内信号传导结构域，其包含来自肿瘤坏死因子受体超家族成员、细胞因子受体或C型凝集素受体的氨基酸序列。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

-胞外配体结构域，其包含来自41BBL、OX40L、CD86或RANK的氨基酸序列，以及

-异源胞内信号传导结构域，其包含来自OX40、41BB、NKp80或IL18RAP的氨基酸序列。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

-胞外配体结构域，其包含来自41BBL、OX40L、CD86、RANK或CD70的氨基酸序列，以及

-异源胞内信号传导结构域，其包含来自OX40、41BB、NKp80、IL1 8RAP或IL2RB的氨基酸序列。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

(d)胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列，优选地其中胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白RANK，并且异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白IL1 8RAP，

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白包含：

这些嵌合蛋白中的每一个均已在实验部分中产生，并且它们的功能性已得到证实(参见例如实例3-5、10)。

在实施例中，a)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：45、46、57、58、59、60、61、62、63、64或65具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，a)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：45、46、57、58、59、60、61、62、63、64、65、178或179具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，b)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：52、53或73具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，c)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：47或48具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，d)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：78具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，e)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：76具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，f)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：77具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，g)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：49、50或51具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，h)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：71或72具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，i)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：182或183具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在实施例中，j)下鉴定的嵌合双向信号传导跨膜蛋白由与如表5中鉴定的SEQ IDNO：179具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在本实例中，序列同一性或相似性可以是至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白不包含ITAM或来自TCR信号传导复合物的胞内结构域。在这个上下文中，在实施例中，ITAM基序是“YxxL/I-x6-8-YxxL/I”，其中x代表任何氨基酸。X6-8表示任何具有6、7或8个氨基酸的区段，Y是酪氨酸，L是亮氨酸，I是异亮氨酸(PFAM来源https：//pfam.xfam.org/family/ITAM或https：//www,sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0962892406001498article)。

表5中提供了MIDIS蛋白序列和可包含在MIDIS蛋白中的序列的非限制性实例。

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MIDIS蛋白可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与本文披露的氨基酸序列相比具有至少最低水平的序列同一性的氨基酸序列。例如，MIDIS蛋白可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：与本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。在实施例中，与给定氨基酸序列相比具有至少最低水平的序列同一性的此类嵌合双向信号传导跨膜蛋白是有功能的，并且因此涵盖在本发明中，只要这种嵌合蛋白能够转导至少两个任选地可诱导的胞内信号和/或能够诱导表达所述嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或能够诱导由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善。这至少两个任选地可诱导的胞内信号的转导应该可以使用技术人员已知的测定来检测。合适的测定的实例是蛋白质印迹、发光报告子或FACS测定。生物学参数和/或功能的改善也应当可以使用技术人员已知的测定来检测。根据参数和/或功能，技术人员将知道可以使用哪种测定法。

在一些实施例中，MIDIS蛋白可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：作为野生型蛋白质氨基酸序列或本文披露的任何其他氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

MIDIS蛋白可包含与本文披露的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代的氨基酸序列。

例如，MIDIS蛋白可包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸插入的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸缺失的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个或至少50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个或至多50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

在一些实施例中，MIDIS蛋白包含相对于本文披露的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78中的任一个)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸取代的氨基酸序列。另一个实例是SEQ IDNO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183中的任一个。

VII.工程改造的细胞

本披露还提供了包含本文所述的多核苷酸和/或载体并且优选地表达由多核苷酸和/或载体编码的多肽的细胞。因此，在一些方面，本文披露了表达一个或多个MIDIS蛋白(即嵌合双向信号传导跨膜蛋白)的工程改造的细胞或其群。一个或多个MIDIS蛋白在工程改造的细胞或其群中的表达可用作克服阻碍工程改造的细胞的产生和使用的限制(例如，难以产生足够数量的所期望的工程改造的细胞、有限的细胞毒性作用、有限的免疫刺激作用、工程改造的细胞的有限的增殖能力或寿命、工程改造的细胞识别抗原后有限的效应子功能诱导以及工程改造的细胞耗竭)的策略。在本申请的上下文中，表述“工程改造的细胞”是指已经使用重组DNA技术修饰的细胞。在实施例中，“工程改造的细胞”已被转化、修饰或转导以包含异源核酸分子。在实施例中，所述细胞表达由所述核酸分子编码的蛋白质。

在一些方面，本文披露了包含并优选表达一个或多个嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞或其群。这些嵌合蛋白中的一个或多个在细胞或其群中的表达可以用作克服与先前段落中所确定的相同限制的策略。

在本申请中，措辞“工程改造的细胞”可以由“经修饰的细胞”或“转化的细胞”或“转导的细胞”代替。

在本申请中，措辞“包含异源核酸分子的工程改造的细胞”或“表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白的工程改造的细胞”可以被措辞“包含异源核酸分子的细胞”或“表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞”替代。这同样适用于包含这样的细胞的群。

在实施例中，提供了包含如本文前面定义的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞。在实施例中，该细胞包含编码所述嵌合蛋白的多核苷酸。在实施例中，该细胞包含含有所述多核苷酸的载体。在实施例中，该细胞表达所述嵌合蛋白。在实施例中，该细胞还包含、优选表达本文定义的相互作用配偶体。在实施例中，提供了包含这样的细胞的细胞群。

当胞外配体结构域结合至其相互作用配偶体时，诱导多向信号传导，所述多向信号传导包括至少一个由MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的“由外而内”信号，以及至少一个由相互作用配偶体的胞内信号传导结构域介导的“由内而外”信号。在实施例中，多向信号传导是双向信号传导。“由内而外”和“由外而内”的信号传导通路可以共同诱导目标生物学结果。在一些实施例中，“由内而外”和“由外而内”的信号传导通路可以共同降低目标生物学结果。在一些实施例中，“由内而外”和“由外而内”的信号传导通路可以共同有利于目标生物学结果。相反，引入工程改造的细胞的许多构建体仅引发单向信号传导，和/或仅单向信号传导有助于目标生物学结果。

通过该申请，措辞“目标生物学结果”可以被“生物学参数和/或生物学功能”替代。

因此，在实施例中，嵌合双向信号传导跨膜蛋白能够转导至少两个任选地可诱导的胞内信号，这些信号有助于表达嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善。

目标生物学结果(即生物学参数和/或生物学功能)可以是或可以包括例如细胞增殖、细胞存活、免疫效应子功能的程度、免疫效应子功能的持续时间、对细胞(例如，癌细胞)的细胞毒性作用、炎症介质的产生、抗癌免疫应答、细胞分化、细胞去分化。

在实施例中，生物学参数和/或功能选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤，

目标生物学结果或生物学参数和/或功能可以包括细胞毒性应答，例如针对癌细胞的细胞毒性应答。可以直接确定细胞毒性应答(例如，通过测量细胞裂解或靶细胞的存活)。可替代地或另外地，细胞毒性应答可通过测量与这种应答相关的分子的产生来确定，例如细胞因子如干扰素γ(IFNγ)的产生。合适的测量测定法，例如测定细胞毒性的发光测定法和测定IFNγ产生的ELISA是本领域技术人员已知的，并且在实验部分中提供了进一步的非限制性实例。

在一些实施例中，外源抗原识别受体可以有助于目标生物学结果。例如，在一些实施例中，细胞毒性应答不是针对表达MIDIS蛋白的相互作用配偶体的细胞诱导的，而是针对表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞诱导的。例如，相互作用配偶体可以由工程改造的免疫细胞表达，并且可以支持表达外源抗原识别受体的工程改造的免疫细胞的适应性和效应子功能。在一些实施例中，MIDIS蛋白可以增强由外源抗原识别受体诱导的免疫应答，但不改变免疫应答的特异性(例如，不诱导针对表达相互作用配偶体的细胞的免疫应答)。

因此，在一个实施例中，提供了细胞群，其中至少一个细胞表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白并且优选地表达相互作用配偶体，并且其中该细胞群进一步包含至少一个表达外源抗原识别受体的细胞。

因此，在一个实施例中，包含、优选表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白及其相互作用配偶体的细胞还包含优选表达外源抗原识别受体。

可替代地，在另一个实施例中，存在包含优选表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞，存在表达其相互作用配偶体的独特细胞。包含优选表达外源抗原识别受体的细胞可以与表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞相同或与表达相互作用配偶体的细胞相同或是不同的细胞。

可替代地，在另一个实施例中，提供具有至少一个包含、优选表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白及其相互作用配偶体的细胞和至少一个包含、优选表达外源抗原识别受体的不同细胞的细胞群。

在一些实施例中，外源抗原识别受体对目标生物学结果没有贡献。

由MIDIS蛋白诱导的多向信号传导可以调节生物学功能，例如表达MIDIS蛋白的工程改造的细胞、表达相互作用配偶体的细胞或其组合的目标生物学功能。在实施例中，由嵌合双向信号传导跨膜蛋白转导的至少两个任选地可诱导的胞内信号能够调节(增加或减少)表达所述嵌合蛋白和相互作用配偶体的细胞的生物学功能或参数。在本上下文中，生物学参数和/或功能选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤

工程改造的细胞的目标生物学功能可以是或可以包括例如存活、增殖、免疫效应子功能、细胞毒性应答(例如，针对癌细胞)、抗癌应答、细胞分化、细胞去分化、或细胞转分化。可以诱导工程改造的细胞的目标生物学功能。工程改造的细胞的目标生物学功能可以被降低。在一些实施例中，工程改造的细胞的目标生物学功能由表达或呈递由抗原识别受体识别的抗原的细胞引发或针对这些细胞。例如，在一些实施例中，当目标生物学功能包括针对癌细胞的细胞毒性应答时，工程改造的细胞可以基于抗原识别受体(例如，外源抗原识别受体)对抗原的识别来杀伤癌细胞，但不是基于相互作用配偶体的表达。

在一些实施例中，外源抗原识别受体和MIDIS蛋白各自有助于工程改造的细胞的相同生物学功能。在一些实施例中，外源抗原识别受体和MIDIS蛋白各自不有助于工程改造的细胞的相同生物学功能。在一些实施例中，外源抗原识别受体和MIDIS蛋白各自有助于工程改造的细胞的不同生物学功能。

在一些实施例中，在暴露于表达相互作用配偶体的细胞后，工程改造的细胞的靶生物学功能被调节比不表达MIDIS蛋白的相应细胞长至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在一些实施例中，在暴露于表达相互作用配偶体的细胞后，工程改造的细胞的靶生物学功能与不表达MIDIS蛋白的相应细胞相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在实施例中，在暴露于表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白及其相互作用配偶体的细胞后，所述细胞的增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤与不表达嵌合蛋白的相应细胞相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在实施例中，表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白的细胞群于表达或呈递结合外源抗原识别受体的抗原的细胞，所述细胞群的增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤与不表达嵌合蛋白的相应细胞群相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，与a相比至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

可以使用技术人员已知的测定来进行增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤的评估。这样的测定的实例在实验部分中披露。

在一些实施例中，在暴露于表达相互作用配偶体的细胞后，工程改造的细胞的靶生物学功能与不表达MIDIS蛋白的相应细胞相比减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

工程改造的细胞可以是哺乳动物细胞。工程改造的细胞可以是人细胞。工程改造的细胞可以是免疫细胞。在一些实施例中，本披露的工程改造的细胞是免疫细胞、T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、Jurkat细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应T细胞、淋巴细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞或中性粒细胞。在一些实施例中，本披露的工程改造的细胞是T细胞，优选αβT细胞或γδT细胞，更优选αβT细胞。在一些情况下，工程改造的细胞是原代细胞。在一些情况下，工程改造的细胞不是原代细胞。

在一些实施例中，本披露的工程改造的细胞是嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助T细胞、朗格汉斯细胞、淋巴细胞、先天性淋巴细胞(ILC)、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆T细胞、单核细胞、骨髓细胞、浆细胞、胸腺细胞、或其细胞的任何混合物或组合。任何前述细胞可以被工程改造，例如以表达外源抗原识别受体或以包含本文提供的多核酸。

在一些实施例中，工程改造的细胞包含基因组中一个或多个基因的缺失或破坏，例如TRAC基因、TCRB基因、免疫检查点基因或其组合的缺失或破坏。

F.表达相互作用配偶体的细胞

本文披露了包含表达能够结合MIDIS蛋白的胞外配体结构域的相互作用配偶体的细胞的组合物和方法。

表达相互作用配偶体的细胞的生物学功能可以是或可以包括例如细胞存活、增殖、免疫效应子功能、细胞毒性(也称为细胞毒性应答(例如，针对癌细胞))、抗癌应答(也称为抗肿瘤活性)、肿瘤细胞杀伤、持久性、细胞分化、细胞去分化或细胞转分化。

在实施例中，通过至少两个任选地可诱导的胞内信号改善的生物学参数和/或功能选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤。

可以诱导表达相互作用配偶体的细胞的生物学功能。可以降低表达相互作用配偶体的细胞的生物学功能。

在一些实施例中，表达相互作用配偶体的细胞的生物学功能不包括表达相互作用配偶体的细胞的死亡(例如，通过细胞凋亡、坏死性凋亡或任何其他细胞死亡途径)。在其他实施例中，表达相互作用配偶体的细胞的生物学功能包括表达相互作用配偶体的细胞的死亡(例如，通过细胞凋亡、坏死性凋亡或任何其他细胞死亡途径)。

在一些实施例中，表达相互作用配偶体的细胞还表达本文披露的抗原识别受体(例如，外源抗原识别受体)。在一些实施例中，表达相互作用配偶体的细胞的生物学功能由表达或呈递由抗原识别受体识别的抗原的细胞引发或针对这些细胞。例如，在一些实施例中，当表达相互作用配偶体的细胞的生物学功能包括针对癌细胞的细胞毒性应答时，表达相互作用配偶体的细胞可以基于抗原识别受体(例如，外源抗原识别受体)对抗原的识别来杀伤癌细胞。细胞毒性应答可以是针对不表达相互作用配偶体或仅以低水平表达相互作用配偶体的细胞(例如癌细胞)的细胞毒性应答。

在一些实施例中，外源抗原识别受体和MIDIS蛋白各自有助于表达相互作用配偶体的细胞的相同生物学功能。在一些实施例中，外源抗原识别受体和MIDIS蛋白各自不有助于表达相互作用配偶体的细胞的相同生物学功能。在一些实施例中，外源抗原识别受体和MIDIS蛋白各自有助于表达相互作用配偶体的细胞的不同生物学功能。

在一些实施例中，在暴露于表达MIDIS蛋白的工程改造的细胞后，表达相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能被调节比暴露于不表达MIDIS蛋白的相应工程改造的细胞长至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少时20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在一些实施例中，在暴露于表达MIDIS蛋白的工程改造的细胞后，表达相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应工程改造的细胞相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少时20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在一些实施例中，在暴露于表达MIDIS蛋白的工程改造的细胞后，表达相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应工程改造的细胞相比减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少时20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

表达相互作用配偶体的细胞可以是哺乳动物细胞。表达相互作用配偶体的细胞可以是人细胞。表达相互作用配偶体的细胞可以是免疫细胞。在一些实施例中，表达本披露的相互作用配偶体的细胞是免疫细胞、T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T效应细胞、淋巴细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞或中性粒细胞。在一些实施例中，表达本披露的相互作用配偶体的细胞是T细胞。在一些实施例中，表达相互作用配偶体的细胞是成纤维细胞、角质形成细胞、间充质干细胞、内皮细胞或基质细胞。在一些实施例中，表达相互作用配偶体的细胞是癌细胞。

在一些实施例中，工程改造的细胞和表达相互作用配偶体的细胞是相同的细胞类型。在一些实施例中，工程改造的细胞和表达相互作用配偶体的细胞是不同的细胞类型。在一些实施例中，工程改造的细胞和表达相互作用配偶体的细胞是相同的细胞，即共表达MIDIS蛋白和相互作用配偶体的细胞。在一些实施例中，工程改造的细胞和表达相互作用配偶体的细胞不是相同细胞。

G.外源抗原识别受体

本披露的工程改造的细胞可以表达外源抗原识别受体，例如，共表达外源抗原识别受体和本披露的MIDIS蛋白。

在实施例中，细胞包含并优选表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白、其相互作用配偶体和外源抗原识别受体。本文还涵盖包含这样的细胞的细胞群。

“外源抗原识别受体”是能够识别抗原的受体，该受体被人工引入工程改造的细胞中。外源抗原识别受体的非限制性实例包括嵌合抗原受体(CAR)和TCR(其中TCR被人工引入细胞，例如不表达TCR或表达不同TCR的细胞)。

在本披露的上下文中，“gamma”、“γ”和“g”可互换使用来指代γδTCR的γ链。“Delta”、“δ”和“d”可互换使用，指代γδTCR的δ链。“Alpha”、“α”和“a”可互换使用，指αβTCR的α链。“Beta”、“β”和“b”可互换使用，指αβTCR的β链。

外源抗原识别受体可以是转基因TCR。外源抗原识别受体可以是αβTCR(例如，引入到否则不表达α-βTCR或表达不同的α-βTCR的细胞中的αβTCR)。外源抗原识别受体可以是γ-δTCR(例如，引入到否则不表达γ-δTCR的细胞(例如α-βT细胞)或表达不同的γ-δTCR的细胞中的γ-δTCR)。

βTCR，也称为α-βTCR，可由两条蛋白链(即T细胞受体α和T细胞受体β)构成。αβTCR识别与MHC分子结合的肽抗原的复合配体。MHC分子是由主要组织相容性复合体(MHC)中的基因编码的高度多态性糖蛋白。两类MHC分子(I类和II类)在其非多态性(恒定)结构域中被CD8和CD4分子结合，这些分子区分了αβT细胞的两种不同功能类别。CD8结合MHC I类分子；CD4结合MHC II类分子。在一个方面，TCR可以是或可以包含以下中的至少一个：TCR的α链或TCR的β链。第二类型的TCR由γ链和δ链构成，在结构上与αβTCR相似，但结合不同的配体，包括非肽配体。在一个方面，TCR可以是或可以包含以下中的至少一个：TCR的γ链或TCR的δ链。

在实施例中，细胞包含并优选表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白、其相互作用配偶体和外源抗原识别受体，所述外源抗原识别受体是嵌合抗原受体、TCR、α-βTCR或γ-δTCR。在实施例中，细胞是α-βT细胞，其包含并优选表达嵌合双向信号传导跨膜蛋白、其相互作用配偶体和γ-δTCR。本文还涵盖包含这样的细胞的细胞群。

在一些实施例中，可以将外源γδTCR(也称为γ-δTCR)引入细胞，例如T细胞中。在一些实施例中，将外源γδTCR引入α-βT细胞或γ-δT细胞，优选α-βT细胞中。在一个方面，表达γδTCR的工程改造的细胞或包括将γδTCR引入免疫细胞例如αβT细胞中的方法可以克服患有晚期癌症的患者中肿瘤细胞的克隆异质性，这是对基于αβTCR的方法的改善。在一个方面，这种改善可能是由于γδTCR的独特的HLA非依赖性激活信号，例如涉及脂质代谢变化的激活。在一个方面，可以向包含具有低突变负荷的癌症的受试者施用γδTCR治疗剂(例如，也表达本披露的MIDIS蛋白)。在一些实施例中，本披露的γ-δTCR结合靶标，例如癌细胞上的CD277。γδTCR治疗剂的结合可以包括识别靶标上表达的CD277的空间和/或构象变化，例如响应于一种或多种代谢物的构象变化。在一些实施例中，γδTCR的激活包括与包含来自BTNA1、2或3家族的一个或多个蛋白质的复合物结合。在一些实施例中，γδTCR的激活包括与包含CD277的复合物结合。在一些实施例中，γδTCR的激活包括与包含CD277和BTN2A1的复合物结合。在一些实施例中，γδTCR(其识别CD277中的空间和/或构象变化，结合包含来自BTNA1、2或3家族的一个或多个蛋白质的复合物，结合包含CD277的复合物，结合包含CD277和BTNA2的复合物，或其组合)是包含γ9链或其可变区和δ2链或其可变结构域的γδTCR。

当外源抗原识别受体是γδTCR时，γδTCR可以包含(a)选自由γ2、γ3、γ4、γ5、γ8、γ9和γ11组成的组的γ链；(b)选自由δ1、δ2、δ3和δ5组成的组的δ链；或(c)(a)和(b)的任何组合。在一些实施例中，γ链是γ9链并且δ链是δ2链。在一些实施例中，γ链是γ4链并且δ链是δ5链。

在一些实施例中，γ链是γ2链并且δ链是δ1链。在一些实施例中，γ链是γ3链并且δ链是δ1链。在一些实施例中，γ链是γ4链并且δ链是δ1链。在一些实施例中，γ链是γ5链并且δ链是δ1链。在一些实施例中，γ链是γ8链并且δ链是δ1链。在一些实施例中，γ链是γ9链并且δ链是δ1链。在一些实施例中，γ链是γ11链并且δ链是δ1链。

在一些实施例中，γ链是γ2链并且δ链是δ2链。在一些实施例中，γ链是γ3链并且δ链是δ2链。在一些实施例中，γ链是γ4链并且δ链是δ2链。在一些实施例中，γ链是γ5链并且δ链是δ2链。在一些实施例中，γ链是γ8链并且δ链是δ2链。在一些实施例中，γ链是γ9链并且δ链是δ2链。在一些实施例中，γ链是γ11链并且δ链是δ2链。

在一些实施例中，γ链是γ2链并且δ链是δ3链。在一些实施例中，γ链是γ3链并且δ链是δ3链。在一些实施例中，γ链是γ4链并且δ链是δ3链。在一些实施例中，γ链是γ5链并且δ链是δ3链。在一些实施例中，γ链是γ8链并且δ链是δ3链。在一些实施例中，γ链是γ9链并且δ链是δ3链。在一些实施例中，γ链是γ11链并且δ链是δ3链。

在一些实施例中，γ链是γ2链并且δ链是δ5链。在一些实施例中，γ链是γ3链并且δ链是δ5链。在一些实施例中，γ链是γ4链并且δ链是δ5链。在一些实施例中，γ链是γ5链并且δ链是δ5链。在一些实施例中，γ链是γ8链并且δ链是δ5链。在一些实施例中，γ链是γ9链并且δ链是δ5链。在一些实施例中，γ链是γ11链并且δ链是δ5链。

在一些实施例中，外源抗原识别受体包含来自γ链的可变结构域和/或来自δ链的可变结构域。可变结构域可由γ链和δ链名称前面的V表示，例如Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ11、Vδ1、Vδ2、Vδ3和Vδ5。

在一些实施例中，当外源抗原识别受体是γδTCR时，TCR可包含(a)选自由Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9和Vγ11组成的组的γ链的可变结构域；(b)选自由Vδ1、Vδ2、Vδ3和Vδ5组成的组的δ链的可变结构域；或(c)(a)和(b)的任何组合，例如，如本文针对γ和δ链所示的。在一些实施例中，γ链可变结构域是Vγ9并且δ链可变结构域是Vδ2。在一些实施例中，γ链可变结构域是Vγ4并且δ链可变结构域是Vδ5。

在一些实施例中，外源抗原识别受体包含来自γ链的恒定结构域和/或来自δ链的恒定结构域。恒定结构域可以用γ链和δ链名称前面的C表示，例如Cγ1、Cγ2和Cδ。

在一些实施例中，当外源抗原识别受体是γδTCR时，TCR可包含(a)选自由Cγ1和Cγ2组成的组的γ链的恒定结构域；(b)δ链Cδ的恒定结构域；或(c)(a)和(b)的任何组合，例如，如本文针对γ和δ链所示的。在一些实施例中，γ链恒定结构域是Cγ1并且δ链恒定结构域是Cδ。在一些实施例中，γ链恒定结构域是Cγ2并且δ链恒定结构域是Cδ。

外源抗原识别受体可包含Vγ9Vδ2TCR或其功能片段。Vγ9Vδ2 TCR可包含能够识别细胞(例如肿瘤细胞)的细胞表面上的CD277蛋白的γ-TCR氨基酸序列或δ-TCR氨基酸序列中的至少一个。在一些实施例中，受体包含能够识别靶细胞的细胞表面上的CD277蛋白的γ-TCR氨基酸序列或δ-TCR氨基酸序列中的至少一个的变体或片段。本披露考虑了包含能够通过CD277细胞表面分子识别细胞(例如肿瘤细胞)的γδTCR的任何部分或片段或变体的外源抗原识别受体。

在一些实施例中，外源抗原识别受体包含能够识别靶细胞的细胞表面上的EPCR蛋白的γ-TCR氨基酸序列和/或δ-TCR氨基酸序列中的至少一个的变体或片段。本披露考虑了包含能够通过EPCR细胞表面分子识别细胞(例如肿瘤细胞)的γδTCR的任何部分或片段或变体的外源抗原识别受体。这样的γδTCR的可变结构域和CDR3区在表6中鉴定：SEQ ID NO：101-102。

在一些实施例中，外源抗原识别受体包含能够识别靶细胞的细胞表面上的膜联蛋白A2的γ-TCR氨基酸序列和/或δ-TCR氨基酸序列中的至少一个的变体或片段。本披露考虑了包含能够通过膜联蛋白A2细胞表面分子识别细胞(例如肿瘤细胞)的γδTCR的任何部分或片段或变体的外源抗原识别受体。这样的γδTCR的可变结构域和CDR3区在表6中鉴定：SEQID NO：130和131。

在一些实施例中，外源抗原识别受体包含能够识别靶细胞的细胞表面上的异常HLA蛋白表达的γ-TCR氨基酸序列和/或δ-TCR氨基酸序列中的至少一个的变体或片段。本披露考虑了包含能够通过细胞表面上的异常HLA蛋白表达识别细胞(例如肿瘤细胞)的γδTCR的任何部分或片段或变体的外源抗原识别受体。在一些实施例中，外源抗原识别受体包含能够以MHC非限制性方式识别癌症的γ-TCR氨基酸序列和/或δ-TCR氨基酸序列中的至少一个的变体或片段。这样的γδTCR的可变结构域和CDR3区在表6中鉴定：SEQ ID NO：82和85。

在一些实施例中，外源抗原识别受体包含γδTCR的Cγ或Cδ区的至少一部分和Vγ或V8区的至少一部分。在一些实施例中，外源抗原识别受体包含γδTCR的Cγ或Cδ区的至少一部分以及Vγ或Vδ结构域的至少CDR3结构域。在一些实施例中，外源抗原识别受体包含Vγ9Vδ2TCR的所有CDR区，并且所有CDR区可参与与细胞表面上的细胞表面分子(例如CD277分子)的结合。在一些实施例中，外源抗原识别受体包含Vγ4Vδ5TCR的所有CDR区，并且所有CDR区可参与与细胞表面上的细胞表面分子(例如EPCR分子)的结合。在一些实施例中，外源抗原识别受体包含Vγ5Vδ1TCR的所有CDR区，并且所有CDR区可参与与细胞表面上的细胞表面分子(例如HLA分子)的结合。在一些实施例中，外源抗原识别受体包含Vγ8Vδ3TCR的所有CDR区，并且所有CDR区可参与与细胞表面上的细胞表面分子(例如膜联蛋白A2)的结合。

可用于本披露的组合物和方法的γ-δTCR及其序列已披露于例如专利申请WO2013147606A1、WO 2017212074A1和WO2018211115A1中，每一篇均通过引用以其全文并入本文。这些序列已在表6中鉴定。

表6中提供了本披露的外源抗原识别受体可包含的、基本上由其组成的或由其组成的序列的非限制性实例。在一些情况下，γδTCR包含选自表6的编码γ链(G)、δ链(D)、可变结构域(TRG、TRD)、来自其的CDR(例如，CDR3)序列、恒定结构域(TRDC、TRGC1、TRGC2)或其组合的序列。合适的TRDC的实例由SEQ ID NO：134表示，合适的TRGC1的实例由SEQ ID NO：135表示，并且合适的TRGC2的实例由SEQ ID NO：136表示。序列的实例已公开(Gründer C.，等人Blood[血液]2012；120(26)：5153-5162.doi：https：//doi.org/10.1182/blood-2012-05-432427)。在一些情况下，外源抗原识别受体包含与表6中的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达约100％序列同一性的序列(例如CDR3区序列)。

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在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含δ链的γ-δ(γδ)T细胞受体，所述δ链由与SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：111具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含γ链的γ-δ(γδ)T细胞受体，所述δ链由与SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：112具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含δ链CDR3区的γ-δ(γδ)T细胞受体，该δ链CDR3区由与SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：102具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含γ链CDR3区的γ-δ(γδ)T细胞受体，所述γ链CDR3区由与SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：101具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含以下的γ-δ(γδ)T细胞受体：由与SEQID NO：90具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的δ链和由与SEQ ID NO：91具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的γ链。在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含以下的γ-δ(γδ)T细胞受体：由与SEQ ID NO：84具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的δ链CDR3区和由与SEQ ID NO：87具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的γ链CDR3区。

在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含以下的γ-δ(γδ)T细胞受体：由与SEQID NO：111具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的δ链和由与SEQ ID NO：112具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的γ链。在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含以下的γ-δ(γδ)T细胞受体：由与SEQ ID NO：102具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的δ链CDR3区和由与SEQ ID NO：101具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示的γ链CDR3区。

在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含β链的α-β(αβ)T细胞受体，所述β链由与选自SEQ ID NO：198、215和219的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含α链的α-β(αβ)T细胞受体，所述α链由与选自SEQ ID NO：199、214和218的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。

在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含β链CDR3区的α-β(αβ)T细胞受体，所述β链CDR3区由与选自SEQ ID NO：211、217和221的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。在一些实施例中，外源抗原识别受体是包含α链CDR3区的α-β(αβ)T细胞受体，所述α链CDR3区由与选自SEQ ID NO：210、216和220的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的氨基酸序列表示。

外源抗原识别受体可以是提交时已知的任何嵌合抗原受体(CAR)。CAR，也称为人工T细胞受体、嵌合免疫受体或嵌合T细胞受体，可包含胞外靶向结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。CAR通常会在表达CAR的工程改造的细胞中诱导信号传导，但不会在被CAR识别的细胞中诱导信号传导。CAR可包含至少第一靶向结构域。CAR靶向结构域的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体或其功能衍生物、变体或片段，包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体和单结构域抗体如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、DARPin、单抗体(monobody)、纳米抗体、亲和体、非抗体结构域及其任何组合。非抗体CAR靶向结构域可以来自或衍生自受体或受体配体，例如APRIL可以用于靶向BCMA。CAR通常可包含靶向结构域、铰链结构域(H)或间隔物、提供质膜锚定的跨膜结构域(TM)以及负责T细胞激活的信号传导结构域。

在一个方面，CAR进一步包括铰链。铰链可以位于CAR的任何区域。在一个方面，铰链位于靶向区域和跨膜区域之间。在另一个方面，主题CAR包含铰链或间隔物。铰链或间隔物可以指靶向部分和跨膜结构域之间的区段。在一些实施例中，铰链可用于为靶向部分例如scFv提供柔性。在一些实施例中，铰链可用于检测CAR在细胞表面上的表达，例如当检测scFv的抗体没有功能或不可用时。在一些情况下，铰链衍生自免疫球蛋白分子，并且可能需要根据靶标上第一表位或第二表位的位置进行优化。在一些情况下，铰链可能不属于免疫球蛋白分子，而是属于另一个分子，例如CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可含有半胱氨酸和脯氨酸残基，它们在CD8共受体和MHC分子的相互作用中发挥作用。

CAR的靶向部分可以通过跨膜结构域连接至胞内信号传导结构域。跨膜结构域可以是跨膜区段。主题CAR的跨膜结构域可以将CAR锚定至细胞(例如工程改造的细胞)的质膜。在一些实施例中，跨膜区段包含多肽。连接CAR的靶向部分和胞内信号传导结构域的跨膜多肽可以具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施例中，跨膜多肽包含与内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比具有至少1个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽序列。在一些实施例中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，例如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施例中，跨膜多肽将信号从胞外靶向部分传递至CAR的胞内区。在一个方面，主题CAR可以包含将靶向部分连接至胞内区的跨膜区。跨膜区可以来自或衍生自外源细胞跨膜区。各种跨膜区域是本领域已知的并且可以来自免疫细胞受体。在一个方面，跨膜结构域来自T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、CD8、CD4、CD28、CD45、ICOS、PD-1和/或CD152。CD28的天然跨膜部分可用于CAR中。在其他情况下，CD8α的天然跨膜部分也可以用于主题CAR中。在一个方面，跨膜结构域来自TCR的α链。在一个方面，跨膜结构域来自CD8并且是CD8α。

CAR的胞内信号传导结构域可以包含参与细胞信号传导的信号传导结构域或其任何衍生物、变体或片段。CAR的胞内信号传导结构域可以诱导包含CAR的工程改造的细胞的活性。虽然通常在CAR中可以使用另一个分子的信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个链。在一些情况下，信号传导结构域的截短部分用于本文提供的工程改造的细胞的CAR中。

在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含参与细胞信号传导的多个信号传导结构域或其任何衍生物、变体或片段。CAR中使用的胞内信号传导结构域可以以刺激方式或抑制方式参与调节TCR复合物的初级激活。CAR胞内信号传导结构域可以是TCR复合物的信号传导结构域。CAR胞内信号传导结构域可以包含Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fca受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD26、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD46、41BB、OX40、GITR、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d、和Zap70的信号传导结构域。在一些实施例中，CAR信号传导结构域包括基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。包含ITAM的CAR信号传导结构域可以包含由6-8个氨基酸分隔的氨基酸序列YxxL/I的两个重复，其中每个x独立地是任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。例如，当靶向部分与表位结合时，可以通过磷酸化来修饰包含ITAM的CAR信号传导结构域。磷酸化的ITAM可以充当其他蛋白质的对接位点，例如参与各种信号传导途径的蛋白质。在一些实施例中，初级CAR信号传导结构域包含经修饰的ITAM结构域，例如突变的、截短的和/或优化的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加的或减少的)活性。

在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域包含FcγR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcγR信号传导结构域可以选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含FcεR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcεR信号传导结构域可以选自FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含FcαR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcαR信号传导结构域可以选自FcαRI(CD89)和Fcα/μR。在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，初级CAR信号传导结构域包含CD3ζ的ITAM。

在一些实施例中，主题CAR的胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序或ITIM。包含ITIM的信号传导结构域可以包含在免疫系统的一些抑制性受体的胞质尾部中发现的氨基酸保守序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。包含ITIM的初级CAR信号传导结构域可以被诸如Src激酶家族成员(例如，Lck)的酶修饰，例如磷酸化。磷酸化后，其他蛋白质(包括酶)可以被募集至ITIM。这些其他蛋白质包括但不限于酶，例如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2、称为SHIP的肌醇磷酸酶以及具有一个或多个SH2结构域的蛋白质(例如ZAP70)。CAR胞内信号传导结构域可包含以下的信号传导结构域(例如，ITIM)：BTLA、CD5、CD31、CD66a、CD72、CMRF35H、DCIR、EPO-R、FcγRIIB(CD32)、Fc受体样蛋白2(FCRL2)、Fc受体样蛋白3(FCRL3)、Fc受体样蛋白4(FCRL4)、Fc受体样蛋白5(FCRL5)、Fc受体样蛋白6(FCRL6)、蛋白G6b(G6B)、白细胞介素4受体(IL4R)、免疫球蛋白超家族受体易位相关1(IRTA1)、免疫球蛋白超家族受体易位相关2(IRTA2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白-样受体2DL3(KIR2DL3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL5(KIR2DL5)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL1(KIR3DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2)、白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族成员1(LIR1)、白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族成员2(LIR2)、白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族成员3(LIR3)、白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族成员5(LIR5)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员8(LIR8)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)、肥大细胞功能相关抗原(MAFA)、NKG2A、天然细胞毒性触发受体2(NKp44)、NTB-A、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PILR、SIGLECL1、唾液酸结合Ig样凝集素2(SIGLEC2或CD22)、唾液酸结合Ig样凝集素3(SIGLEC3或CD33)、唾液酸结合Ig样凝集素5(SIGLEC5或CD170)、唾液酸结合Ig样凝集素6(SIGLEC6)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素10(SIGLEC10)、唾液酸结合Ig样凝集素11(SIGLEC11)、唾液酸结合Ig样凝集素4(SIGLEC4)、唾液酸结合Ig样凝集素8(SIGLEC8)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、信号调节蛋白(SIRP 2)和信号阈值调节跨膜衔接子1(SIT)。在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含经修饰的ITIM结构域，例如突变的、截短的和/或优化的ITIM结构域，其与天然ITIM结构域相比具有改变的(例如，增加的或减少的)活性。

在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含至少2个ITAM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITAM结构域)。在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含至少2个ITIM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITIM结构域)(例如，至少2个初级信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含ITAM和ITIM结构域两者。在一个方面，主题CAR的胞内信号传导结构域来自Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合体、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。在另一个方面，主题CAR的胞内信号传导结构域来自CD3、CD3δ、CD3γ、CD3δ和/或CD3ε。在另一个方面，主题CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。

在一些情况下，CAR胞内信号传导结构域包含共刺激结构域。在一些实施例中，CAR共刺激结构域，例如来自细胞共刺激分子，可以提供用于工程改造的细胞信号传导的共刺激信号，例如来自ITAM和/或ITIM结构域的信号传导，例如用于激活和/或失活工程改造的细胞活性。在一些实施例中，CAR共刺激结构域可操作以调节工程改造的细胞中的增殖和/或存活信号。在一些实施例中，CAR共刺激信号传导结构域包含以下的信号传导结构域：MHCI类蛋白、MHC II类蛋白、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA或Toll配体受体。在一些实施例中，CAR共刺激结构域包含选自由以下组成的组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、CD137L、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEM[A4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD46、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2R β、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD1 62)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD1 50、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1、和VLA-6。在一些实施例中，CAR共刺激结构域包含选自由以下组成的组的分子的信号传导结构域：CD3和CD28。

在一些实施例中，CAR胞内信号传导结构域包含多个共刺激结构域，例如至少两个，例如至少3、4或5个共刺激结构域。在一个方面，CAR包含至少2或3个共刺激结构域。在一个方面，CAR包含至少2个共刺激结构域，并且其中所述至少2个共刺激结构域是CD28和CD137。在一个方面，CAR包含至少3个共刺激结构域，其中所述至少3个共刺激结构域是CD28、CD137和OX40。共刺激信号传导区域可以提供与初级效应子激活信号协同的信号，并且可以完成T细胞激活的要求。在一些实施例中，向CAR添加共刺激结构域可以增强本文提供的工程改造的细胞的功效和持久性。

CAR可以是结合与癌症相关的抗原的CAR，例如在癌症中过表达的抗原，或新抗原。在一些情况下，CAR靶向CD19。在一些实施例中，CAR靶向BCMA。

在一些实施例中，CAR包含抗CD19scFv连接至CD8茎和具有41BB的跨膜结构域以及CD3z胞内信号传导结构域(CD19.BB.Z)。在一些实施例中，CAR包含抗CD19scFv连接至CD28茎和具有CD28的跨膜结构域以及CD3z胞内信号传导结构域(CD19.28.Z)。在一些实施例中，CAR包含抗EGFR scFv连接至CD8茎和具有41BB的跨膜结构域以及CD3z胞内信号传导结构域(EGFR.BB.z)。在一些实施例中，CAR包含NKG2D和CD3z胞内信号传导结构域(NKG2D.z)。这样的CAR的非限制性实例描述于WO2019/157533，Bloemberg等人(2020)，Mol Ther MethodsClin Dev[分子治疗方法和临床开发]16；238-254，以及Zhang等人(2006)，Cancer Res[癌症研究]66：11；5927-5933，所有这些均通过引用而以其全文并入本文。

在一些实施例中，CAR包含与选自SEQ ID NO：184、212、213和222的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或高达100％序列同一性或相似性的序列。

在一些实施例中，外源抗原识别受体结合选自下组的癌症相关抗原，该组由以下组成：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcralb-b3(b2a2)、ab1-bcralb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-ablp190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-ablp210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、胱天蛋白酶-8、CD171、CD277、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRVIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、LewisY、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚胎抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。

在一些实施例中，外源抗原识别受体结合新抗原或新表位。例如，新抗原可以是ERBB2IP中的E805G突变。在一些情况下，可以通过全外显子组测序来鉴定新抗原和新表位。新抗原和新表位靶标可以由癌细胞表达。在一些情况下，可包含产生新抗原或新表位的突变的基因可以是ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2M、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4，EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11IB、FGFR3、FRG1B，GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1，MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGECl、MEK、MLANA、MLL2、MMP13，MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、NY-ESO、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL、XPOT。

表7提供了癌症抗原的非限制性实例。

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可以通过一种载体或使用不同的载体将外源抗原识别受体引入工程改造的细胞中。外源抗原识别受体和MIDIS蛋白可以表达为一个转录物(例如，被一个或多个自切割肽序列分隔)或表达为不同的转录物。外源抗原识别受体和MIDIS蛋白可以可操作地连接并处于相同启动子或不同启动子的调节下。自切割肽序列和启动子将在本文稍后讨论。

在一些情况下，外源抗原识别受体需要MHC呈递抗原才能发生基于抗原的激活。在一些情况下，外源抗原识别受体不需要MHC呈递抗原来发生基于抗原的激活。

在一个方面，与内源细胞受体相比，工程改造的细胞可以包含更高比例的外源抗原识别受体。在某些情况下，可以通过优先扩增表达MIDIS蛋白的工程改造的细胞来实现更高的比率，例如导致γδTCR工程改造的细胞的(γδ)单一TCR阳性表型。

在实施例中，与未工程改造的在其他方面相当的细胞(例如，不表达MIDIS蛋白)相比，工程改造的细胞包含更高比例的γδTCR与αβTCR。在实施例中，与未经工程改造的在其他方面相当的细胞相比，工程改造的细胞包含更高比例的γ9δ2TCR与αβTCR。在实施例中，当工程改造的细胞包含MIDIS蛋白时，可以实现主要(γδ)单一TCR阳性表型与工程改造的细胞的延长寿命的组合。

与对应的非工程改造的细胞相比，本披露的任何工程改造的细胞可以包含高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍或300的外源抗原识别受体比内源细胞受体的比例。在实施例中，与对应的非工程改造的细胞相比，工程改造的细胞包含高至少约1倍、2倍、3倍、4倍至5倍的外源抗原识别受体比内源细胞受体的比例。

本披露的工程改造的细胞可以包含比例为至少1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶115∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1或300∶1的外源抗原识别受体比内源细胞受体。

在一些情况下，工程改造的细胞表达MIDIS蛋白，但不表达外源抗原识别受体。在一些情况下，工程改造的细胞是肿瘤浸润淋巴细胞，其被工程改造以表达MIDIS蛋白但不表达外源抗原识别受体。

H.表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞

本披露的组合物和方法可以包含表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的一个或多个细胞。例如，外源抗原识别受体可以结合癌抗原，并且癌细胞可以是表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞(例如，靶细胞)。

本披露的MIDIS蛋白可以调节(例如，增加或减少)工程改造的细胞对表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞的应答。

当暴露于表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞后，MIDIS蛋白可以调节表达外源抗原识别受体的工程改造的细胞的增殖。当暴露于表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞后，MIDIS蛋白可以增加表达外源抗原识别受体的工程改造的细胞的增殖。例如，当工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群相比，该工程改造的细胞群的增殖可增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

MIDIS蛋白可以调节表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞的杀伤。MIDIS蛋白可以增加表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞的杀伤。例如，当工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群相比，对表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞的杀伤可增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在一些实施例中，当工程改造细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群后相比，该工程改造的细胞杀伤至少50％表达或呈递该抗原的细胞的能力所持续的时间更长至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。

在一些实施例中，当工程改造细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群后相比，该工程改造的细胞杀伤至少25％表达或呈递该抗原的细胞的能力所持续的时间更长至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。

在一些实施例中，当工程改造细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群后相比，该工程改造的细胞杀伤至少75％表达或呈递该抗原的细胞的能力所持续的时间更长至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。

在一些实施例中，当工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞至少5天后，与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群后相比，该工程改造的细胞群的耗竭标志物的表达低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在一些实施例中，当工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞至少10天后，与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群后相比，该工程改造的细胞群的耗竭标志物的表达低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

在一些实施例中，当工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞至少15天后，与暴露于不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群后相比，该工程改造的细胞群的耗竭标志物的表达低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

MIDIS蛋白可以响应于表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞来调节免疫效应分子的产生。MIDIS蛋白可以响应于表达或呈递由外源抗原识别受体识别的抗原的细胞来增加免疫效应分子的产生。在一些实施例中，当工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与不表达MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群相比，该工程改造的细胞群对免疫效应分子的产生高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍，至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。

I.制造工程改造的细胞的方法

在实施例中，提供了编码本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸。这样的多核苷酸可进一步包含编码相互作用配偶体的核苷酸序列。这样的多核苷酸还可以进一步包含编码外源抗原识别受体的核苷酸序列。在本文中，优选的外源抗原识别受体是γ-δTCR。在实施例中，多核苷酸包含本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白和外源抗原识别受体。在实施例中，多核苷酸包含本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白和γ-δTCR。

在实施例中，一种单一慢病毒载体包含所述多核苷酸，所述多核苷酸包含本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白和γ-δTCR。这种慢病毒载体包含三顺反子序列和连接三个蛋白质序列的2A自切割肽序列，如实验部分中使用的(Xu Y.等人(2019)，CancerImmunology，Immunotherapy[癌症与免疫疗法]，68：1979-1993以及Pincha M.等人，(2011)，Gene Therapy[基因疗法]，18：750-764)。2A自切割肽序列在本文稍后进一步讨论。

在实施例中，第一多核苷酸序列编码TCR的γ链，随后是编码如本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸序列，随后是编码TCR的δ链的多核苷酸序列。

在实施例中，第一多核苷酸序列编码TCR的δ链，随后是编码如本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸序列，随后是编码TCR的γ链的多核苷酸序列。

本文披露了TCR的优选γ和δ链以及优选的嵌合双向信号传导跨膜蛋白。

在实施例中，编码本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸由与表20中鉴定的SEQ ID NO：140-171、185-186或189-190中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、或至少99.5％或100％序列同一性中任一项的核苷酸序列表示。表20还鉴定了由SEQ ID NO：140-171、185-186或189-190中的每一个编码的并且代表一些具体示例性嵌合双向信号传导跨膜蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO)。

可替代地，这样的多核苷酸可以包含编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白和相互作用配偶体的核苷酸序列，并且不包含编码外源抗原识别受体的核苷酸序列。

在实施例中，提供了包含编码本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸的载体。这样的载体可进一步包含编码相互作用配偶体的核苷酸序列。这样的载体还可以进一步包含编码外源抗原识别受体的核苷酸序列。在本文中，优选的外源抗原识别受体是γ-δTCR。可替代地，这样的载体可以包含编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白和相互作用配偶体的核苷酸序列，并且不包含编码外源抗原识别受体的核苷酸序列。

这样的载体可以是病毒载体。合适的载体在本文稍后披露。

在一些实施例中，本文披露了制备工程改造的细胞的方法。这些方法可以包括在细胞群中的至少一个细胞中表达本披露的MIDIS蛋白，以及在适合工程改造的细胞群扩增的条件下培养该细胞群。

在工程改造的细胞中表达本披露的MIDIS蛋白可以增加例如工程改造的细胞的适应性、增殖、存活和/或效应子功能。

在一些实施例中，与扩增工程改造的细胞的常规方法相比，工程改造的细胞可以在没有刺激或减少刺激的情况下培养较长时间，并且MIDIS蛋白可以支持细胞群的扩增和适应。例如，MIDIS蛋白可以提供支持工程改造的细胞存活和增殖所需的信号传导，减少或消除对外源刺激剂的需求。

在一些实施例中，制造工程改造的细胞的方法可以包括刺激，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与有时和钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，可以使用结合辅助分子的配体。在一些情况下，T细胞群可以被CD3-CD28共刺激，例如，在可以刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。

适合T细胞培养的条件可包括适当的培养基(例如，最低基本培养基或RPMI培养基1640、TexMACS(美天旎公司(Miltenyi))或X-vivo 5(龙沙公司(Lonza)))，其可能含有增殖和活力所需的因子，包括血清。在一些情况下，使用无血清培养基。在一个方面，可以将细胞维持在支持生长所必需的条件下；例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。

通常可以使用例如以下中描述的方法来激活和扩增T细胞：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005，针对这样的披露将其通过引用并入。

细胞可以从用于产生工程改造的细胞的任何合适来源获得。细胞可以是原代细胞。细胞可以是重组细胞。细胞可以从许多非限制性来源获得，这些来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、和肿瘤。细胞可以来自健康供体、被诊断患有癌症的患者或被诊断患有感染的患者。细胞也可以从细胞疗法库获得。细胞也可以从受试者的全食物、单采或肿瘤样品中获得。细胞可以是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些情况下，单采可以是白细胞单采。

还可以在修饰之前选择所期望的细胞群。选择可以包括以下中至少一项：磁分离、流式细胞术选择、抗生素选择。一个或多个细胞可以是任何血细胞，例如外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。一个或多个细胞可以是任何免疫细胞，例如淋巴细胞、T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、Jurkat细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T效应细胞、淋巴细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞，优选α-βT细胞或γ-δT细胞，更优选αβT细胞。

制备工程改造的细胞的方法可包括使用载体引入本文所述的多核苷酸，例如编码本披露的MIDIS蛋白和/或外源抗原识别受体的核酸序列。载体可以是任何遗传元件，例如，质粒、染色体、病毒、转座子，其表现为细胞内多核苷酸复制的自主单位(即能够在其自身控制下进行复制)或通过插入细胞染色体而使其能够复制，已附接有另一个多核苷酸片段，以便引起所附接的片段的复制和/或表达。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、噬菌体和粘粒。载体可含有实现载体连接或插入所期望宿主细胞以及影响所附区段的表达所必需的多核苷酸序列。这些序列根据宿主生物体的不同而不同；它们包括实现转录的启动子序列、增加转录的增强子序列、核糖体结合位点序列以及转录和翻译终止序列。可替代地，表达载体能够直接表达其中编码的核酸序列产物，而不将载体连接或整合到宿主细胞DNA序列中。载体可以包含选择性标志基因。在一些实施例中，载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在存在适当的选择压力的情况下作为DNA的染色体外区段持续存在于宿主细胞内。

可用于本文所述的方法和组合物的多核苷酸载体可以是良好生产规范(GMP)兼容的载体。例如，GMP载体可以比非GMP载体更纯。在一些情况下，纯度可以通过生物负载来测量。例如，生物负载可以是载体组合物中需氧菌、厌氧菌、孢子形成体、真菌或其组合的存在或不存在。在一些情况下，纯载体可以是低内毒素或无内毒素的。纯度也可以通过双链引物步移测序来测量。质粒身份可以作为确定载体纯度的来源。本发明的GMP载体可以比非GMP载体纯度高10％至99％。如通过生物负载、内毒素、测序或其组合的存在来测量，GMP载体可以比非GMP载体纯度高10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

多种酶可以催化外源DNA插入宿主基因组。基因编辑工具和技术的非限制性实例包括CRISPR、TALEN、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、Mega-TAL和基于转座子的系统。

CRISPR系统可用于促进编码膜蛋白或其组分的多核苷酸序列插入细胞基因组中。例如，CRISPR系统可以在基因组中的靶位点处引入双链断裂。至少有五种类型的CRISPR系统都包含RNA和CRISPR相关蛋白(Cas)。I、III和IV型组装能够切割与crRNA互补的核酸的多Cas蛋白复合物。I型和III型都需要在将加工后的crRNA组装成多Cas蛋白复合物之前进行预crRNA加工。II型和V型CRISPR系统包含与至少一个指导RNA复合的单一Cas蛋白。

基于转座子的系统可用于将编码本披露的蛋白质或其组分的多核酸插入基因组中。

在一些情况下，细胞经遗传工程改造以在体内包含本披露的蛋白质。在一些情况下，细胞经遗传工程改造以在体外或离体包含本披露的蛋白质。

将基因编辑组分引入细胞的方法包括但不限于电穿孔、声穿孔、使用基因枪、脂转染、磷酸钙转染、使用树枝状聚合物、显微注射和使用病毒载体。病毒载体递送系统可以包括DNA和RNA病毒，它们在递送到细胞后具有附加型或整合型基因组。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体、辅助依赖性腺病毒载体、杂交腺病毒载体、Epstein-Bar病毒载体、单纯疱疹病毒载体、日本血凝病毒(HVJ)载体和莫洛尼鼠白血病病毒载体。

VIII.用于治疗方法的药物组合物

本披露提供了药物组合物、用于治疗方法的组合物以及利用本文披露的MIDIS蛋白的治疗方法。在一些实施例中，本文披露了用于在受试者中施用的组合物，该组合物包含本文披露的MIDIS蛋白、编码其的多核苷酸、或表达其的工程改造的细胞。

在一些实施例中，表达本披露的MIDIS蛋白的工程改造的细胞被配制成可施用于有需要的受试者的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包括用于将本披露的MIDIS蛋白体外、离体或体内引入细胞中的载体。在一些实施例中，将含有MIDIS基因的病毒载体施用于患有癌症的受试者。

在实施例中，本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白、编码所述嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含(优选地表达)所述嵌合蛋白的细胞或包含所述细胞的细胞群用于治疗疾病或病症，其中至少两个任选地可诱导的胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善，所述生物学参数有助于该疾病或病症的治疗。

在实施例中，提供了治疗疾病或病症的方法，该方法包括施用本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白、编码所述嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含(优选地表达)所述嵌合蛋白的细胞或包含所述细胞的细胞群，其中至少两个任选地可诱导的胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善，并且所述生物学参数有助于该疾病或病症的治疗。

在实施例中，提供了本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白、编码所述嵌合双向信号传导跨膜蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含(优选地表达)所述嵌合蛋白的细胞或包含所述细胞的细胞群用于制造用于治疗疾病或病症的药物的用途，其中至少两个任选地可诱导的胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善，并且所述生物学参数有助于该疾病或病症的治疗。

在实施例中，本文披露的嵌合双向信号传导跨膜蛋白、编码其的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含、优选表达所述嵌合蛋白的细胞或包含所述细胞的细胞群，用于使用，其中

-生物学参数选自增殖、存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤，

-细胞是免疫细胞和/或

-疾病是癌症。

-细胞是表达所述嵌合蛋白及其相互作用配偶体的α-βT细胞和/或-疾病是癌症。

-细胞是表达γ-δTCR，表达所述嵌合蛋白及其相互作用配偶体的α-βT细胞，以及

-疾病是癌症。

每个特征已在本文中先前定义。

有需要的受试者可能患有障碍，例如癌症。在一些情况下，癌症是转移性癌症。在一些情况下，癌症是复发性或难治性癌症。在一些情况下，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些情况下，癌症是实体瘤。在其他情况下，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施例中，障碍是感染性疾病。

施用给有需要的受试者的细胞可以是受试者自体的。施用给有需要的受试者的细胞可以是与受试者同种异体的，例如完全HLA匹配的，1、2、3、4、5、6、7或8个HLA等位基因或至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个HLA等位基因HLA匹配的。施用给有需要的受试者的细胞可以对于受试者是单倍体的。施用给有需要的受试者的细胞可以来自与该受试者相关的供体。施用给有需要的受试者的细胞可以来自与该受试者不相关的供体。

在某些实施例中，将冷冻保存的细胞(例如，工程改造的细胞)如本文所述进行解冻和洗涤，并允许在使用本披露的方法活化之前在室温静置1小时。在一个方面，包含工程改造的细胞的组合物可以包括细胞剂型，例如单位剂型。

在一些情况下，使用一种或多种生理上可接受的载剂，包括赋形剂和助剂，以常规方式配制药物组合物，所述载剂有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。合适的配制品取决于所选择的施用途径。本文所述的药物组合物的概述在以下文献中找到，例如：Remington：The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第十九版(宾夕法尼亚州伊斯顿：Mack Publishing Company[马克出版公司]，1995)；Hoover，JohnE.，Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，Mack Publishing Co.[马克出版公司]，宾夕法尼亚州伊斯顿1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.编辑，Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型]，Marcel Decker[马塞尔德克尔公司]，纽约州纽约，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems[药物剂型和药物递送系统]，第七版(Lippincott Williams&Wilkins[利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版社]1999)。

在某些实施例中，组合物还可包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，例如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，例如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，例如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。此类酸、碱和缓冲液的含量为将组合物的pH维持在可接受的范围内所需的量。

在一些实施例中，组合物还可以包含一种或多种盐，其量需要使组合物的渗透摩尔量达到可接受的范围。此类盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。

本文所述的药物组合物可以通过任何合适的施用途径施用，包括但不限于肠胃外(例如静脉内、瘤内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、颊内、舌下、口服或直肠施用途径。在一些情况下，药物组合物被配制用于肠胃外(例如，静脉内、瘤内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。

本文所述的药物组合物被配制成任何合适的剂型，包括但不限于水分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等，用于向待治疗的受试者施用。在一些实施例中，将药物组合物配制成溶液(例如，用于IV施用)。在一些情况下，药物组合物被配制成输注剂。在一些情况下，药物组合物被配制成注射剂。

肠胃外施用可以是例如通过推注或通过随时间逐渐灌注。也可以通过外科手术沉积细胞团或沉淀，或放置医疗装置来施用。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物被配制成固体口服剂型、气雾剂、控释配制品、速溶配制品、泡腾配制品、冻干配制品、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放配制品、延长释放配制品、脉冲释放配制品、多颗粒配制品以及混合的立即释放和控释配制品。在一些实施例中，药物组合物被配制成胶囊。

本文所述的药物固体剂型任选地包含本文所述的化合物和一种或多种药学上可接受的添加剂，例如相容性载剂、粘合剂、填充剂、助悬剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、防沫剂、抗氧化剂、防腐剂、或其一种或多种组合。

可以将治疗有效量的本披露的组合物施用给受试者。“治疗有效量”可以指在必要的剂量下和时间段内有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及本发明核酸序列在个体中引发所期望应答的能力等因素而变化。

IX.另外的多核苷酸

多核苷酸可以编码如本文前面描述的异二聚体受体。这样的多核苷酸可以是多顺反子的。发明人出人意料地发现，当细胞包含多核苷酸(所述多核苷酸包含至少一个编码除受体单体之外的多肽的插入在编码受体单体的核酸之间的核酸)时，并且当核酸可操作地连接至相同的启动子序列时，本文前面所述的细胞对异二聚体受体的表达可能明显增强。

异二聚体受体表达的改善可以通过本文前面讨论的技术人员可用的任何标准技术来评估，例如流式细胞术、FACS等。进一步的非限制性实例在实验部分中提供。

异二聚体受体表达的改善可以导致表达该受体的细胞的生物学参数和/或功能的改善，生物学参数和/或功能可以是或可以包括例如细胞增殖、细胞存活、免疫效应子功能的程度、免疫效应子功能的持续时间、对靶细胞(例如癌细胞)的细胞毒性作用、炎性介质的产生、抗癌免疫应答、细胞分化、细胞去分化等，如本文前面所讨论的。该改善与以下细胞相比可以是至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍，该细胞表达该受体，但在编码所述受体的多核苷酸中编码受体单体的核酸之间没有插入至少一个编码除受体单体以外的多肽的核酸。本文前面描述了测量这些生物学参数和/或功能的测定，并且在实验部分中提供了进一步的非限制性实例。

因此，本发明还提供了编码异二聚体受体的每个单体的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含插入在编码每个所述单体的核酸之间的至少一个编码除所述单体以外的多肽的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接至相同的启动子序列。应当理解，在编码每个受体单体的核酸之间插入多于一个核酸的情况下，插入的核酸可以编码相同或不同的多肽。

在一些实施例中，编码除异二聚体受体的单体以外的多肽的至少两个核酸、至少三个核酸或至少四个核酸插入编码每个单体的核酸之间。

在一些实施例中，编码异二聚体受体的多核苷酸是三顺反子的。这是指将编码除异二聚体受体单体以外的多肽的单个核酸插入到编码每个单体的核酸之间。

在一些实施例中，编码异二聚体受体的多核苷酸是四顺反子。这是指将编码除异二聚体受体单体以外的多肽的两个核酸插入到编码每个单体的核酸之间。多肽可以相同或不同。

可以与核酸可操作地连接的合适的启动子序列在本文前面进行了讨论。在一些实施例中，启动子序列选自以下各项的组：EF1α、MSCV、EF1α-HTLV-1杂合启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、MHC II类、凝血因子IX、胰岛素启动子、PDX1启动子、CD11、CD4、CD2、gp47启动子、PGK、β-球蛋白、UbC和MND，优选来自MSCV、MMLV、EF1α和MND。在一些实施例中，启动子序列是本文描述的启动子序列的衍生序列(即变体序列)。在一些实施例中，启动子序列包含与SEQ ID NO：202-205中任一个具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％至少98％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，编码本文所述异二聚体受体的多核苷酸包含插入这些核酸中每一个之间的核苷酸序列，该核苷酸序列促进这些核酸的共表达。如本文所用，“促进它们的共表达”应理解为这些序列的功能是确保不同的多肽(即异二聚体受体单体和至少一个本文所述的另外多肽)从多核苷酸转录的单一mRNA翻译而来。这样的核苷酸序列可以例如选自但不限于内部核糖体进入位点(IRES)序列或编码2A自切割肽的序列。在一些实施例中，插入这些核酸中每一个之间的核苷酸序列是编码2A自切割肽的序列或者是IRES序列。IRES序列通过在第一多肽合成后核糖体从mRNA解离后允许组装新的翻译起始复合物来发挥作用。合适的IRES序列对于本领域技术人员来说是已知的，并且实例还可在公共数据库中获得，例如IRESite：The database of experimentally verified IRES structures[IRESite：实验验证的IRES结构数据库]，描述于等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]2006；34(数据库间题)：D125-D130，其通过引用以其全文并入本文。在优选的实施例中，插入这些核酸中每一个之间的核苷酸序列是编码2A自切割肽的序列。2A自切割肽(本文缩写为“2A肽”)可能有利于表达本文所述的多顺反子多核苷酸，因为它们尺寸小且具有自切割能力，这允许促进多肽共表达。2A肽通常由16-22个氨基酸组成并且源自病毒RNA。2A肽介导的多肽切割通常由2A肽C末端脯氨酸(P)和甘氨酸(G)之间的肽键的核糖体跳跃触发，导致位于2A肽上游的多肽在其C末端具有额外的氨基酸，而位于2A肽下游的肽在其N末端有额外的脯氨酸。编码2A肽的核酸序列的实例可以在Xu Y.等人(2019)和Pincha M.等人(2011)(同上)中找到。合适的2A肽的非限制性实例是F2A(衍生自口蹄疫病毒的2A肽)、E2A(衍生自马鼻炎病毒的2A肽)、P2A(衍生自猪睾丸病毒-1的2A肽)、或T2A(衍生自明脉扁刺蛾病毒(Thatsa asigna)病毒的2A肽)。在一些实施例中，2A自切割肽是F2A肽。在一些实施例中，2A自切割肽是E2A肽。在一些实施例中，2A自切割肽是P2A肽。在一些实施例中，2A自切割肽是T2A肽。技术人员理解，本文描述的多核苷酸还可以包含编码不同2A自切割肽的核苷酸序列。作为非限制性实例，在三顺反子构建体中，可以将P2A肽编码序列插入到编码第一和第二多肽的核酸之间，并且可以将编码T2A肽的序列插入到编码第二和第三多肽的核酸之间。因此，还提供了包含编码多种不同2A自切割肽的核苷酸序列的多核苷酸。优选的多核苷酸包含P2A肽编码序列和T2A肽编码序列。进一步优选的多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：207或209具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的2A自切割肽的核苷酸序列，或包含编码由与SEQ ID NO：206或208具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或相似性的氨基酸序列表示的2A自切割肽的核苷酸序列。

在一些实施例中，由本文所述的多核苷酸编码的异二聚体受体是外源抗原识别受体。在一些实施例中，外源抗原识别受体选自B细胞受体重链和轻链异二聚体、Toll样受体1和2异二聚体、吞噬受体Mac-1、CD94NKG2C或NKG2E受体、T细胞受体(TCR)、alpha beta(αβ)T细胞受体、gamma delta(γδ)T细胞受体及其功能片段。在一些实施例中，异二聚体受体是B细胞受体重链和轻链异二聚体或其功能片段。在一些实施例中，异二聚体受体是Toll样受体1和2异二聚体或其功能片段。在一些实施例中，异二聚体受体是吞噬受体Mac-1或其功能片段。在一些实施例中，异二聚体受体是CD94NKG2C或NKG2E受体或其功能片段。

在优选的实施例中，外源抗原识别受体是T细胞受体或其功能片段。在T细胞受体中，优选αβT细胞受体、γδT细胞受体或其功能片段，最优选γδT细胞受体或其功能片段。合适的T细胞受体、αβT细胞受体和γδT细胞受体在本文前面描述。

编码异二聚体受体的每个单体的核酸可以优选地按照它们在多核苷酸中的位置的特定顺序。本文使用的术语“特定顺序”是指核糖体从多顺反子mRNA翻译所编码的多肽的顺序。换句话说，它是指多顺反子多核苷酸中编码多肽的核酸的位置。因此，位于“第一位置”的核酸被理解为要表达的第一个核酸，并且位于“最后位置”的核酸被理解为最后要表达的核酸。作为非限制性实例，在编码本文所述的αβT细胞受体的多核苷酸中，核酸的顺序可以是：α链编码核酸(第一位置)，随后是至少一个编码除αβT细胞受体的α或β链以外的多肽的核酸，随后是β链编码核酸(最后位置)。可替代地，核酸的优选顺序可以是：β链编码核酸(第一位置)，随后是至少一个编码除αβT细胞受体的α或β链以外的多肽的核酸，随后是α链编码核酸(最后位置)。作为另一个非限制性实例，在编码本文所述的γδT细胞受体的多核苷酸中，核酸的优选顺序可以是：γ链编码核酸(第一位置)，随后是至少一个编码除γδT细胞受体的γ或δ链以外的多肽的核酸，随后是δ链编码核酸(最后位置)。可替代地，核酸的顺序可以是：δ链编码核酸(第一位置)，随后是至少一个编码除γδT细胞受体的γ或δ链以外的多肽的核酸，随后是γ链编码核酸(最后位置)。优选地，上述多核苷酸是三顺反子或四顺反子。

在一些实施例中，编码γδT细胞受体的多核苷酸是三顺反子的，并且在第一位置处包含编码γ链的核酸并且在第三位置处包含编码δ链的核酸。

在一些实施例中，编码γδT细胞受体的多核苷酸是三顺反子的，并且在第一位置处包含编码δ链的核酸并且在第三位置处包含编码γ链的核酸。

在一些实施例中，编码γδT细胞受体的多核苷酸是四顺反子的，并且在第一位置处包含编码γ链的核酸并且在第四位置处包含编码δ链的核酸。

在一些实施例中，编码γδT细胞受体的多核苷酸是四顺反子的，并且在第一位置处包含编码δ链的核酸并且在第四位置处包含编码γ链的核酸。

因此，在一些实施例中，本文所述的多核苷酸包含A、B、C或D，其中：

(A)是由(i)-(ii)-(iii)表示的核酸，其中：

(i)是编码αβT细胞受体的α链或其功能片段的核酸，

(iii)是编码αβT细胞受体的β链或其功能片段的核酸，

其中(ii)插入在(i)和(iii)之间

(B)是由(iv)-(v)-(vi)表示的核酸，其中：

(iv)是编码αβT细胞受体的β链或其功能片段的核酸，

(vi)是编码αβT细胞受体的α链或其功能片段的核酸，

其中(v)插入在(iv)和(vi)之间

(C)是由(vii)-(viii)-(ix)表示的核酸，其中：

(vii)是编码γδT细胞受体的γ链或其功能片段的核酸，

(ix)是编码γδT细胞受体的δ链或其功能片段的核酸，

其中(viii)插入在(vi)和(ix)之间

(D)是由(x)-(xi)-(xii)表示的核酸，其中：

(x)是编码γδT细胞受体的δ链或其功能片段的核酸，

(xii)是编码γδT细胞受体的γ链或其功能片段的核酸，

其中(xi)插入在(x)和(xii)之间

(i)、(iv)、(vii)和(x)代表位于各个多核苷酸的包含它们的第一位置处的核酸。(iii)、(vi)、(ix)和(xii)代表位于各个多核苷酸的包含它们的最后位置处的核酸。

在A、B、C或D中，优选以B、C和D为特征的多核苷酸，更优选C和D，最优选C。优选地，多核苷酸还包含插入这些核酸中每一个之间的2A肽编码核苷酸序列。

本文已构建并实验验证了此类多核苷酸的非限制性实例(例如实例14-17)。

优选地，A、B、C和/或D是这样的：

编码除异二聚体受体单体以外的多肽的优选核酸(其可以插入在编码所述受体的多核苷酸中编码每个所述单体的核酸之间)是本文前面描述的嵌合双向信号传导跨膜蛋白(MIDIS)。

因此，在一些实施例中，编码本文所述异二聚体受体的优选多核苷酸包含插入在编码每个受体单体的核酸之间的核酸，其编码能够转导至少两个胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白，所述蛋白包含：

-跨膜结构域，和

其中第二胞内信号通过相互作用配偶体的胞内结构域转导。

可以包含在多核苷酸中的优选的MIDIS蛋白在本文前面描述。

在一些实施例中，MIDIS蛋白是这样的，

-胞外配体结构域包含来自41BBL、OX40L、CD86、或RANK、或CD70的氨基酸序列，如本文前面描述，以及

-异源胞内信号传导结构域包含来自OX40、41BB、NKp80、或IL1 8RAP、或IL2RB的氨基酸序列，如本文前面描述。

在一些实施例中，多核苷酸是编码γδTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的三顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的γ链，随后是编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白的核酸，随后是编码TCR的δ链的核酸。

在一些实施例中，多核苷酸是编码γδTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的三顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的δ链，随后是编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白的核酸，随后是编码TCR的γ链的核酸。

TCR的优选γ和δ链以及优选的嵌合双向信号传导跨膜蛋白在本文前面描述。

在一些实施例中，多核苷酸是编码γδTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的四顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的γ链，随后是两个核酸，其中至少一个核酸编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白，随后是编码TCR的δ链的核酸。

在一些实施例中，多核苷酸是编码γδTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的四顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的δ链，随后是两个核酸，其中至少一个核酸编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白，随后是编码TCR的γ链的核酸。

在一些实施例中，多核苷酸是编码αβTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的三顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的α链，随后是编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白的核酸，随后是编码TCR的β链的核酸。

在一些实施例中，多核苷酸是编码αβTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的三顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的β链，随后是编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白的核酸，随后是编码TCR的α链的核酸。

TCR的优选α和β链以及优选的嵌合双向信号传导跨膜蛋白在本文前面描述。

在一些实施例中，多核苷酸是编码αβTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的四顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的α链，随后是两个核酸，其中至少一个核酸编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白，随后是编码TCR的β链的核酸。

在一些实施例中，多核苷酸是编码αβTCR和嵌合双向信号传导跨膜蛋白的四顺反子多核苷酸。第一个核酸编码TCR的β链，随后是两个核酸，其中至少一个核酸编码嵌合双向信号传导跨膜蛋白，随后是编码TCR的α链的核酸。

在一些实施例中，多核苷酸进一步包含编码如本文前面描述的嵌合双向信号传导蛋白的相互作用配偶体的核酸。

在一些实施例中，多核苷酸包含在本文前面描述的载体中。优选的载体是病毒载体，最优选慢病毒载体。

本文前面描述的包含多核苷酸和/或载体的细胞优选地表达所述多核苷酸和/或载体。优选的细胞是T细胞。在T细胞中，优选αβT细胞。

编码本文所述异二聚体受体的多核苷酸可用于本文前面描述的药物组合物、方法、治疗和治疗用途。

特别地，本披露提供了多核苷酸，载体，由多核苷酸和/或载体编码的多肽，包含多核苷酸和/或载体、优选另外表达多肽的细胞(或细胞群)，以及包含本文前面描述的所述多核苷酸、载体、多肽和/或细胞的药物组合物，用作药物，或治疗方法，包括将所述多核苷酸、载体、多肽、细胞和/或组合物施用给有需要的受试者。有需要的受试者在本文前面已定义。这样的受试者可能患有障碍，例如癌症。在一些情况下，癌症是转移性癌症。在一些情况下，癌症是复发性或难治性癌症。在一些情况下，癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。在一些情况下，癌症是实体瘤。在其他情况下，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施例中，障碍是感染性疾病。

药物组合物的合适的另外组分和施用模式在本文前面进行了讨论。

在实施例中，本文前面描述的多核苷酸、载体和/或由多核苷酸和/或载体编码的异二聚体受体用于治疗和/或预防疾病，其中

-表达异二聚体受体的细胞的选自增殖、存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤的生物学参数和/或功能得到改善，

-细胞是免疫细胞和/或

-疾病是癌症。

-细胞是αβT细胞和/或

-疾病是癌症。

-细胞是αβT细胞

-异二聚体受体是γδT细胞受体，和/或

-疾病是癌症。

本文前面讨论了工程改造的细胞以通过引入本文所述的多核苷酸和/或载体来实现异二聚体受体表达的方法。

在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其变体以其非限制性意义使用以表示包括该词之后的项，但不排除未特别提及的项。此外，动词“组成”可以替换为“基本上由……组成”，意思是本文所述的产物(嵌合蛋白、多核苷酸、载体、细胞、群)可包含除具体鉴定的组分之外的另外一个或多个组分，所述另外一个或多个组分不改变本发明的独特特征。此外，动词“由……组成”可以替换为“基本上由……组成”，意思是如本文所描述的产物可以包含除具体指明的组分之外的一个或多个另外的组分，所述一个或多个另外的组分不改变本发明的独特特征。

通过不定冠词“一”(“a”或“an”)提及要素并不排除存在多于一个/一种要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个/一种并且仅一个/一种要素。因此，不定冠词“一”(“a”或“an”)通常意指“至少一个/一种”。

如本文使用，“至少”特定值表示该特定值或更多。例如，“至少2”被理解为与“2或更多”一样，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15……等等。

当与数值(例如约10)结合使用时，词语“约”或“大约”优选地表示该值可以是给定值(10)加或减该值的0.1％。

如本文使用，术语“和/或”表示所陈述情况中的一个或多个可能单独发生或与所陈述情况中的至少一个组合地发生，直至与所有所陈述情况组合地发生。

本文描述各种实施例。除非另有说明，否则如本文所述的每个实施例可以组合在一起。

本领域技术人员将认识到与在此所述的那些相似或等同的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实践。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。

X.实例

包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

在使用市售试剂和设备的情况下，所使用的方案是根据制造商的说明，除非另有说明。

实例1：设计并在工程改造用于表达确定的γ-δTCR的α-βT细胞(TEG)中表达MIDIS 蛋自

本披露的MIDIS蛋白被设计为掺入胞外配体结构域和异源胞内信号传导结构域，如表8-14、15-17中所示。生成慢病毒载体以允许编码本披露的MIDIS蛋白的DNA序列的基因组整合。慢病毒载体含有编码本披露的γTCR链和δTCR链的三顺反子序列(γ链和δ链之间具有MIDIS蛋白编码序列)以及连接三个蛋白序列的2A自切割肽序列(Xu Y.等人(2019)，Cancer Immunology，Immunotherapy[癌症与免疫疗法]，68：1979-1993以及Pincha M.等人，(2011)，Gene Therapy[基因疗法]，18：750-764)。

将冷冻保存的αβTCR T细胞解冻，以每孔1.6x10^6个细胞的密度接种在48孔板中的含有青霉素/链霉素(0.5％)、人血清(2.4％)、IL-7(1700IU/ml)和IL-15(150IU/ml)的TexMACS(美天旎公司，DE)培养基(TEG培养基)中。用CD3/CD28TransAct激活T细胞24小时，然后通过在TexMACS培养基中稀释慢病毒，以预先设定的感染复数(MOI；0.3-25)转导选定的慢病毒载体。与Pirona等人2020，Biology Methods and Protocols[生物学方法和方案]5：1类似，通过基于FACS的滴定在J76 Jurkat细胞上测定慢病毒MOI。简而言之，J76 Jurkat细胞以0.5E6/m1个活细胞接种在96孔板中。将慢病毒上清液浓缩并在含有10％FBS的冷培养基中连续稀释，从100x稀释开始。连续稀释后，将含有慢病毒的上清液用J76 Jurkat细胞1：1稀释，并将混合物在37摄氏度孵育3天。通过分析CD3⁺γδTCR⁺活细胞的百分比来确定滴度。第二天更新培养基并将T细胞转移至12孔板。第5天再次更新培养基，并将T细胞转移至T25细胞培养瓶中，终体积为10ml。第7天，将T细胞转移至T75细胞培养瓶中，终体积为25ml。48小时后，再次更新培养基，至终体积25ml。T细胞在解冻后12天收获。

通过流式细胞术对12天方案后出现的细胞进行表征。用FACS缓冲液(含2％胎牛血清的PBS)洗涤细胞，并用FACS缓冲液中选定的荧光缀合抗体在4摄氏度染色30分钟。染色后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并用4％多聚甲醛在4摄氏度固定10分钟。固定后，用FACS缓冲液再次洗涤细胞，然后重悬浮于100-200μl FACS缓冲液中，随后进行流式细胞术分析(BD LSR Fortessa)。

表8-14、15-17提供了12天方案后γ-δTCR+细胞的倍数扩增和比例的详细信息。每个表都来自单独的生产运行和/或使用来自不同供体的细胞。EC：胞外。异源IC：异源胞内。这些结果表明本披露的某些MIDIS蛋白可以增强工程改造的细胞的扩增。

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实例2：表达MIIDIS蛋白和确定的γ-δTCR的靶细胞和效应T细胞的共培养测定

将靶肿瘤细胞(包括HT-29、MZ1851RC、RPMI-8226、MM1-S、OPM-2细胞)以规定浓度接种在96孔板中。在添加效应细胞前一天接种贴壁靶细胞，并在添加效应细胞的同一天接种悬浮靶细胞。

所表达的确定的γ-δTCR的可变结构域是由SEQ ID NO：90和91(克隆5)或111和112(E57)表示的可变结构域。

使用新鲜(生产第12天)或冷冻保存的TEG作为效应细胞。添加到所有共培养物中的效应细胞数量经过校正，以匹配实验中转导效率最低的TEG。添加经过相同生产过程但未添加慢病毒载体的未转导细胞，以便一个实验中的所有共培养物含有相同数量的TEG和相同数量的总T细胞。

共培养物的效应细胞与靶标比率(E：T)为1：1或0.3：1，并在效应细胞添加当天进行或不进行帕米膦酸二钠盐处理(10μm)。包括未转导的、仅效应子、仅靶标或完全裂解对照。

3或7天后，从共培养物中收集上清液，轻轻地重悬浮未贴壁的细胞，并将细胞悬浮液转移至圆底96孔板。当通过发光测定细胞毒性时，将100ul测定培养基与D-萤光素一起添加到含有任何剩余靶细胞的残留共培养板中，并孵育12分钟，然后通过Glomax(普洛麦格公司(Promega))测量发光。对于基于Xcelligence的细胞毒性，在共培养孵育过程中实时捕获数据，并在转移后丢弃细胞悬浮液板。

将细胞悬浮液培养基更换为每孔60ul，将其中的50ul转移到预先接种的靶标的新板中，用于下一轮细胞毒性评估，并按照各个图所示重复该过程。

通过FACS对残留的细胞悬浮液混合物进行表征，以测量增殖、细胞适应性和其他参数。在连续细胞毒性测定开始时对TEG进行染色时，通过确定TEG和总T细胞的数量，或通过细胞微量紫稀释来测量增殖。TEG的适应性是根据各种标志物(例如4-1BB、OX40、PD-1、TIM-3、LAG-3)的染色来确定的。用FACS缓冲液(含有2％胎牛血清的PBS)洗涤细胞，并用FACS缓冲液中选定的荧光缀合抗体在4摄氏度染色30分钟(例如，对CD4、CD8a、CD3、αβTCR、γδTCR、4-1BB、OX40、PD-1、TIM-3、LAG-3、4-1BBL、OX40L、CD86、Fab2、CD107a和CD69，参见表14)。染色后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并用4％多聚甲醛在4摄氏度固定10分钟。固定后，用FACS缓冲液再次洗涤细胞，然后重悬浮于100-200μl FACS缓冲液中，随后进行流式细胞术分析。

在某些实验中，最初使用更多的共培养板，并且在一轮细胞毒性评估结束时，使用单独的板进行细胞毒性评估、效应T细胞表征以及将效应细胞传代至下一轮实验。

实例3：MIDIS蛋白增强工程改造的免疫细胞对靶细胞的应答

本实例评估了本披露的MIDIS蛋白对工程改造的免疫细胞应答靶细胞的能力的影响。

如实例1中概述用确定的γ-δTCR(SEQ ID NO：90和91)转导α-βT细胞以产生TEG，有或没有另外的MIDIS蛋白或其他对照蛋白。本实例中使用的确定的γ-δTCR是本披露的Vγ9Vδ2TCR。MIDIS蛋白和对照蛋白是：

(i)41BBL-野生型41BBL，在本实例中使用SEQ ID NO：54；

(ii)41BBLmincyto-含有胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域并且缺乏胞内信号传导结构域的蛋白质，在本实例中使用SEQ ID NO：55；

(iii)41BBLmincyto_NKp80-含有胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域和NKp80异源胞内信号传导结构域并且缺乏41BBL胞内序列的MIDIS，在本实例中使用SEQID NO：48；

(iv)41BBL_NKp80-含有胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域和NKp80异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：47；

(v)41BBL_OX40-包含胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：45；

(vi)41BBL13W_OX40rev-包含胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域、来自41BBL的部分胞内结构域(缺失了含有推定酪蛋白激酶I基序的前12个氨基酸)和颠倒的OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS(即表达为逆向蛋白)，在本实例中使用SEQ ID NO：46；

以及(vii)eGFP对照，在本实例中为SEQ ID NO：81。

图2显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。41BBL或eGFP的N末端的黑条代表接头序列。右图显示了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域，水平条代表跨膜结构域。

如实例2中所述将TEG与由确定的γ-δTCR识别的靶肿瘤细胞共孵育，每三天转移至新鲜靶细胞并通过萤光素酶测定测量残余靶细胞活力。实验包括有或没有帕米膦酸二钠盐处理(10μm)的条件，并持续直至观察到低于90％的细胞毒性。

图3示出了与异位表达萤光素酶-tdTomato的HT-29以1：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育的来自两个供体的TEG的细胞毒性。对TEG的连续刺激持续了3次刺激(供体1)或5次刺激(供体2)。结果显示本披露的MIDIS蛋白可以增强工程改造的免疫细胞的效应子功能。例如，含有胞外41BBL配体结构域和胞内OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白在持续暴露于靶细胞后保留了很强的细胞毒能力，显著优于对照细胞或表达胞外41BBL配体结构域但缺乏OX40胞内结构域的细胞。

为了测量增殖，将来自供体1和供体2的效应细胞用细胞微量紫(CTV)染色，并使用染料的稀释液作为增殖标志物。每次转移到新的靶HT-29细胞时，通过FACS评估重新激发前总效应细胞的1/6。如图4所示，本披露的MIDIS蛋白可以在激活后增强工程改造的免疫细胞的增殖，包括应答于靶细胞识别的工程改造的T细胞增殖。

图5显示用HT-29细胞情况下3次刺激(共培养刺激轮)(供体1)或5次刺激(供体2)后表达转导的γδTCR的细胞的数量。这些数据证明本披露的MIDIS蛋白可以在激活后增强工程改造的免疫细胞的增殖，包括应答于靶细胞识别的工程改造的T细胞增殖。例如，对于表达含有胞外41BBL配体结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白的细胞，观察到特别大量的TEG。

在用HT-29细胞情况下3次刺激(供体1)或5次刺激(供体2)后测量共表达耗竭标志物LAG-3和TIM-3的TEG的比例。LAG-3和TIM-3可以是T细胞耗竭的标志物，并且已经观察到许多或大多数LAG-3或TIM-3阳性的细胞也是PD-1阳性的，尤其是LAG-3⁺TIM-3⁺细胞。如图6所示，与不表达MIDIS蛋白的细胞相比，本披露的MIDIS蛋白可以减少持续暴露于靶细胞后工程改造的T细胞的耗竭。例如，在表达含有胞外41BBL配体结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白的TEG中观察到特别低水平的LAG-3⁺TIM-3⁺细胞。

在与HT-29、RPMI-8226和MZ1851RC靶细胞共培养后，还评估了来自第三代表性供体的TEG的细胞毒性。TEG的连续刺激持续3次刺激(HT-29)、4次刺激(RPMI-8226)或5次刺激(MZ1851RC)。使用的MIDIS构建体是SEQ NO：81、45、54、55。图7的左分图显示来自第一共培养刺激的细胞毒性数据，而右分图显示来自PAM处理(10μm)情况下的最终共培养刺激的细胞毒性数据。结果进一步显示本披露的MIDIS蛋白可以增强工程改造的免疫细胞的效应子功能。例如，表达含有胞外41BBL配体结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白的工程改造的细胞在持续暴露于靶细胞后保留了很强的细胞毒能力，显著长于对照细胞或表达胞外41BBL配体结构域但缺乏OX40胞内结构域的细胞。

与HT-29共培养后，还评估了来自第四代表性供体的TEG的细胞毒性。TEG的连续刺激持续2次(HT-29)。使用的MIDIS构建体是SEQ NO：46和54。图18显示了用帕米膦酸二钠盐处理(10μm)情况下的第二刺激的细胞毒性(显示了残留的活HT-29细胞的发光)。结果进一步显示本披露的MIDIS蛋白可以增强工程改造的免疫细胞的效应子功能。例如，表达含有胞外41BBL配体结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白的工程改造的细胞在持续暴露于靶细胞后保留了很强的细胞毒能力，显著长于对照细胞或表达胞外41BBL配体结构域但缺乏OX40胞内结构域的细胞。

实例4：41BBL-OX40 MIDIS蛋白对用确定的γ-δTCR转导的工程改造的α-βT细胞的体外和体内益处

与之前的实例相比，在表达不同的确定的γδTCR的αβT细胞的背景下评估了包含胞外41BBL配体结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS的能力。

在本实例中，如实例1中用本披露的确定的Vγ4Vδ5 TCR SEQ NO：111-112(γδTCR)转导α-βT细胞以产生TEG，有或没有另外的41BBL-OX40MIDIS蛋白(在本实例中使用SEQ IDNO：45)或41BBL-野生型41BBL(在本实例中使用SEQ ID NO：54)。

TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的靶HT-29肿瘤细胞以E：T比例1：1共孵育(HT-29细胞由确定的γ-δTCR识别)。3(图8A，B)或7(图8C)天后，TEG被转移到含有新鲜靶细胞的板上。通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力，并通过ELISA测定IFNγ产生。如图8A所示，41BBL-OX40MIDIS蛋白在一次刺激后增强了工程改造的细胞对肿瘤细胞的杀伤，并且如图8B所示，共表达41BBL-OX40MIDIS蛋白的TEG细胞产生显著更多的IFNγ。如图8C所示，与41BBL或没有另外蛋白质相比，41BBL-OX40MIDIS蛋白质在一次刺激后显著增强了工程改造的细胞对肿瘤细胞的杀伤。

这些数据进一步证明本披露的MIDIS蛋白可以改善工程改造的免疫细胞的功能。

为了测试41BBL-OX40MIDIS蛋白是否可以增强体内抗癌应答，使用了异种移植模型。在第-14天将0.5x10^6HT-29萤光素酶-tdTomato细胞注射到NSG小鼠的胁中(每组n＝6)。在第0天，以指示的剂量全身性施用表达本披露的Vγ4Vδ5TCR(γδTCR)SEQ NO：111-112的TEG，有或没有41BBL-OX40MIDIS蛋白SEQ NO：45(例如，1M＝100万个细胞)。每周测量生物发光(BLI)和肿瘤体积。与缺乏MIDIS蛋白的TEG相比，表达MIDIS蛋白的TEG在显著更大程度上限制肿瘤生长并且显著改善存活，如图9A-B和图10所示，其显示随时间变化的平均辐亮度(图9A)和肿瘤体积(图9B)，以及总体存活图10。

这些数据证明本披露的MIDIS蛋白的表达可以改善工程改造的免疫效应细胞的抗肿瘤功效。

实例5：OX40L-41BB和CD86-OX40MIDIS蛋白增强工程改造的免疫细胞对靶细胞的杀伤

本实例评估了本披露的MIDIS蛋白对工程改造的免疫细胞杀伤靶细胞的能力的影响。

如实例1中用确定的γ-δTCR(SEQ ID NO：90和91)转导α-βT细胞以产生TEG，有或没有另外的MIDIS蛋白或其他对照蛋白。在本实例中，确定的γ-δTCR是本披露的Vγ9Vδ2TCR。

在第一实验中，MIDIS蛋白和对照蛋白是：

(i)OX40L-野生型OX40L，在本实例中使用SEQ ID NO：66；

(ii)OX40Lmincyto-41BB-含有胞外OX40L配体结构域、OX40L跨膜结构域、缺乏OX40L胞内信号传导结构域并且含有41BB胞内结构域的蛋白质，在本实例中使用SEQ IDNO：67；

(iii)OX40Lmincyto-41BBrev-含有胞外OX40L配体结构域、OX40L跨膜结构域、缺乏OX40L胞内信号传导结构域、并且含有颠倒的41BB胞内结构域(即表达为逆向蛋白)的蛋白质，在本实例中使用SEQ ID NO：65；

(iv)OX40L-41BBrev-含有胞外OX40L配体结构域、OX40L跨膜结构域和颠倒的41BB异源胞内信号传导结构域(即表达为逆向蛋白)的蛋白质，在本实例中使用SEQ ID NO：51；

(v)OX40L-41BB-含有胞外OX40L配体结构域、OX40L跨膜结构域和41BB异源胞内信号传导结构域的蛋白质，在本实例中使用SEQ ID NO：50；和

(vi)Q8-含有CD8-Q8标签的对照蛋白；SEQ ID NO：80。

图11A显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的选定构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。

如实例2中所述，将TEG与由确定的γ-δTCR识别的靶MZ1851RC肿瘤细胞共孵育，偏差是在第一刺激后停止实验，并在第一刺激后通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图11B中显示了与异位表达萤光素酶-tdTomato的MZ1851RC靶细胞以效应子比靶标(E：T)的比例1：1共孵育的TEG的细胞毒性。结果显示本披露的MIDIS蛋白可以增强工程改造的免疫细胞的效应子功能。例如，表达包含胞外OX40L配体结构域和41BB异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白的TEG比表达野生型OX40L的TEG表现出更高的细胞毒性。

在也利用本披露的Vγ9Vδ2 TCR的第二个实验中，MIDIS蛋白和对照蛋白是：

(i)γδTCR-本披露的Vγ9Vδ2TCR，没有任何共表达的蛋白质；

(ii)CD86-野生型CD86，在本实例中使用SEQ ID NO：68；

(iii)CD86-OX40-包含胞外CD86配体结构域、来自CD86的跨膜结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的蛋白质，在本实例中使用SEQ ID NO：52；

(iv)CD86delP276-CD86，其胞质部分缺失至显示参与CD86的正确细胞定位的点(缺失CD86的氨基酸277-329)，在本实例中使用SEQ ID NO：69；

(v)CD86delP276-OX40-含有胞外CD86配体结构域、来自CD86的跨膜结构域、缺失CD86的氨基酸277-329并且含有OX40异源胞内信号传导结构域的蛋白质，在本实例中使用SEQ ID NO：53；和

(vi)慢病毒γδTCR，-来自替代性慢病毒制剂的本披露的Vγ9Vδ2TCR。

图12A显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的选定构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。右图说明了胞外(顶部)和胞内(底部)存在的结构域。水平条代表膜/跨膜结构域。

如实例2中所述将TEG与由确定的γ-δTCR识别的靶HT-29肿瘤细胞共孵育，每七天转移至新鲜靶细胞并添加帕米膦酸二钠(10μm)，并在第二次刺激后通过萤光素酶测定测量残余靶细胞的活力。

图12B中显示了与异位表达萤光素酶-tdTomato的HT-29靶细胞以效应子比靶标(E：T)的比例1∶1共孵育的TEG的细胞毒性作用。结果显示本披露的MIDIS蛋白可以增强工程改造的免疫细胞的效应子功能。例如，表达含有胞外CD86配体结构域、来自CD86的跨膜和截短的胞内信号传导结构域(delP276)以及OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白的TEG表现出比表达野生型CD86或截短的CD86的TEG更高的细胞毒性。(delP276)。

实例6：MIDIS蛋白的表面表达取决于融合配偶体的组合

本实例评估了本披露的几种MIDIS蛋白的细胞表面表达。

用确定的γ-δTCR(SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91)转导α-βT细胞以产生TEG，有或没有另外的MIDIS蛋白或其他对照蛋白，如实例1中。MIDIS蛋白和对照蛋白是：

(i)eGFP对照SEQ ID NO：81；

(v)41BBL_OX40-包含胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：45；和

(vi)41BBL13W_OX40rev-包含胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域、来自41BBL的部分胞内结构域(缺失了含有推定酪蛋白激酶I基序的前12个氨基酸)和颠倒的OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS(即表达为逆向蛋白)，在本实例中使用SEQ ID NO：60。

如实例1所示，通过流式细胞术对12天方案后存在的细胞进行表征，并通过染色来鉴定表达γ-δTCR(Y轴)和GFP或41BBL(X轴，如每个分图所示)的细胞。如图13所示，针对每个构建体鉴定了表达γδTCR的群，确认了转导效率。41BBL表面表达的检测出人意料地因构建体而异。例如，尽管41BBL_NKp80与41BBL_OX40均包含完整的41BBL序列，但在41BBL检测中在两者之间观察到较大差异。另外，41BBL13W_OX40rev表现出表面表达，并且在其他实验中显示出有功能(图18)。这是出人意料的，因为许多逆向蛋白不能正确折叠，和/或不保留天然取向亲本蛋白的功能。

进行了另一项实验，其中用具有41BBL胞外配体结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的确定的γ-δTCR和MIDIS构建体转导α-βT细胞。在不同的载体中，41BBL定位在包括41BBL的跨膜结构域的蛋白质(在本实例中使用SEQ ID NO：45)的C末端，或者定位在包括OX40跨膜结构域的蛋白质(在本实例中使用SEQ ID NO：58)的N末端。

如图14所示，当41BBL位于包括含OX40跨膜结构域的蛋白质的N末端时，在细胞表面上无法检测到。

这些结果表明，MIDIS蛋白的细胞表面表达依赖于构建体中融合配偶体的组合，并且在一些情况下，可以实现意想不到的高表达。在不希望受到理论约束的情况下，MIDIS蛋白在细胞表面表达的能力可能受到亲本蛋白的I型/II型取向、跨膜结构域的选择、特定融合配偶体的组合、任一结构域的原生与逆向取向或其组合的影响。

实例7：评估MIDIS蛋白对另外类型的工程改造的细胞的影响

载体被设计成将本披露的MIDIS蛋白单独或与其他蛋白组合引入其他类型的细胞中。例如，将MIDIS蛋白引入免疫细胞，例如表达外源抗原识别受体(例如α-βTCR或嵌合抗原受体(CAR))的免疫细胞。载体设计用于单独引入MIDIS蛋白或与外源抗原识别受体组合引入MIDIS蛋白。图15中提供了构建体的非限制性实例。

例如，如实例1中所述，将MIDIS蛋白引入细胞群中。MIDIS蛋白的作用在各种类型的免疫细胞中进行评估，例如TIL、NK细胞、γδT细胞、αβT细胞、B细胞或其他类型的免疫细胞。

评估表达MIDIS蛋白的工程改造的细胞以确定MIDIS蛋白对细胞功能和生物学结果的影响，例如，使用实例3-6中描述的测定法和/或其他已知测定法。

实例8：使用MIDIS蛋白制造用于过继细胞疗法的工程改造的细胞

本披露的一种或多种MIDIS蛋白在用于过继细胞疗法的细胞群中表达。将编码MIDIS蛋白的核酸引入细胞群中，例如，如实例1中所述离体/体外引入。工程改造的细胞群在培养物中扩增。在一些情况下，MIDIS蛋白会增加工程改造的细胞的增殖，从而可以制备更多数量的工程改造的细胞。在一些情况下，MIDIS蛋白选择性地增加所期望的细胞亚群的增殖，例如识别目的抗原并对其做出应答的细胞。工程改造的细胞群可以任选地储存在细胞库中。工程改造的细胞群可以作为过继细胞疗法(例如治疗癌症的细胞免疫疗法)的一部分施用于有需要的受试者。工程改造的细胞群对于受试者可以是自体的或同种异体的。在一些情况下，过继细胞疗法的功效基于本文披露的MIDIS蛋白的有益作用而增强。

本实例评估通过生产和共培养后TEG的富集。

(i)eGFP对照SEQ ID NO：81；

(iii)41BBL_OX40-包含胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：45。

如实例2中所述将TEG与由确定的γ-δTCR识别的靶肿瘤细胞以RPMI-8226E：T比例1：1共孵育1次，因为在7天后通过FACS染色评估刺激和富集以鉴定表达γ-δTCR(Y轴)和αβTCR(X轴)的细胞。

在如实例1中所述的标准培养之后，观察到γδ+TEG和γδ+αβ-TEG的富集(图16)并且两个群在刺激它们之后进一步富集。这些结果表明，MIDIS蛋白增强了高度表达目的外源受体的选择性群的生长。

实例9：41BBL-OX40MIDIS增强CAR工程改造的免疫细胞对靶细胞的应答

本实例评估了本披露的MIDIS蛋白对CAR工程改造的免疫细胞杀伤靶细胞的能力的影响。

如实例1中所示，用确定的CD19.BB.Z CAR(SEQ ID NO：184)和eGFP转导α-βT细胞以产生CAR-T，不同的是在该情况下使用2个载体。MIDIS或对照蛋白由单独的载体表达，并且当引入MIDIS或对照蛋白时，用CD19.BB.Z和含有MIDIS的载体以相等的MOI转导αβT细胞。

在实验中，MIDIS蛋白和对照蛋白是：

(i)41BBL-野生型41BBL，在本实例中使用SEQ ID NO：54；

(ii)41BBL-OX40-包含胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：45。

图20A的靠上部分显示了用于引入CAR和其他蛋白质的选定构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。通过流式细胞术评估转导的CAR T细胞中两个载体的存在。CD19.BB.Z和41BBL的表达显示在图20A中的靠下部分。

如实例2中所述，将转导的α-β细胞与由CD19BBZ CAR识别的靶NALM6肿瘤细胞共孵育，在每次刺激后通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。与41BBL共转导的α-β细胞相比，在刺激1次时，41BBL-OX40在没有另外载体的情况下具有改善的细胞毒性。

图20B示出了在第一次刺激和第五次刺激后，与异位表达萤光素酶-tdTomato的NALM6靶细胞以1：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育的CAR T细胞的细胞毒性(残余HT-29的发光以相对发光单位(RLU)表示)。结果显示本披露的MIDIS蛋白可以增强工程改造的免疫细胞的效应子功能。例如，表达包含胞外41BBL配体结构域和OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS蛋白的CAR T细胞比表达野生型41BBL的CAR T细胞表现出更高的细胞毒性。

实例10.另外的MIDIS的表达

本实例评估了本披露的MIDIS蛋白在工程改造的免疫细胞中在细胞表面的表达。

将Jurkat 76用确定的γ-δTCR(SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91)转导，有或没有另外的MIDIS蛋白或其他对照蛋白。

在实验中，MIDIS蛋白和对照蛋白是：

(i)CD70-野生型CD70，在本实例中使用SEQ ID NO：180；

(ii)CD70mincyto-没有其胞质信号传导结构域的野生型CD70，在本实例中使用SEQ ID NO：181；

(iii)CD70mincyto-OX40-包含来自CD70的胞外和跨膜结构域以及OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：182。

(iv)CD70-41BBL-OX40-包含胞外CD70结构域、来自41BBL的跨膜结构域和胞质结构域、以及OX40异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：183。

图21A显示了用于引入确定的γ-δTCR和其他蛋白质的选定构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。CD70的表达如图21B中在从上到下不同构建体中(包括不含CD70编码核酸的对照)所示。

在另外的实验中，如实例1中使用本披露的确定的γ-δTCR(SEQ ID NO：90和91)来产生TEG，有或没有另外的MIDIS蛋白或其他对照蛋白。MIDIS蛋白是：

(i)41BBL-OX40-IL2RB-包含胞外41BBL配体结构域、来自41BBL的跨膜结构域、以及OX40和IL2RB异源胞内信号传导结构域的MIDIS，在本实例中使用SEQ ID NO：179；

图22A显示了有或没有MIDIS蛋白时的确定的γδ的选定构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。通过流式细胞术测量的MIDIS的表达显示在图22B中。

结果显示本披露的MIDIS蛋白可以含有多个异源胞内信号传导结构域并且将在工程改造的免疫细胞的细胞表面表达。

实例11：MIDIS蛋白增强工程改造的免疫细胞的扩增

本实例评估了本披露的MIDIS蛋白对工程改造的非α-βT细胞扩增能力的影响。

使用Ficoll通过密度梯度分离从新鲜血沉棕黄层中分离出PBMC。使用autoMACS(美天旎公司)使用抗TCR γ/δMicroBead试剂盒(美天旎公司)直接从PBMC中分离γδT细胞。分离(第0天)后，将γδT细胞用CD3/CD28 TransAct(美天旎公司(Miltenyi))或用1μg/mL包被抗体抗γδTCR克隆B1(博奇公司(Biolegend))和抗CD28(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))激活，并在含青霉素/链霉素(0.5％)、人血清(2.4％)、IL-2(50IU/ml)和IL-15(250IU/ml)的TexMACS(美天旎公司)培养基(T细胞培养基)中培养。激活5天后，对细胞进行计数并以每孔0.35-0.4E6个细胞接种，用与第0天相同的程序激活，并通过在T细胞培养基中稀释慢病毒，以预先设定的感染复数(MOI；10)进行转导。如实例1所述测定慢病毒滴度。用MIDIS蛋白或其他对照蛋白转导γδT细胞。

在本实验中，MIDIS蛋白和对照蛋白是：

(i)41BBL-野生型41BBL，在本实例中使用SEQ ID NO：54，

(iii)eGFP-荧光对照蛋白，在本实例中使用SEQ ID NO：81；

在第8、13、16和20天，用T细胞培养基更新培养基，并在第22天收获γδT细胞。使用NucleoCounter NC-200自动细胞计数器(Chemometec公司)对收获日存在的细胞进行计数，并在图23中所示的扩增是基于最终产量除以第0天的接种数计算的。

结果显示本披露的MIDIS蛋白可以在非α-βT细胞中表达并增强它们的扩增。

实例12：设计并在工程改造用于表达确定的γ-δ或α-βTCR的T细胞中表达多顺反子构建体。

本披露的多顺反子构建体被设计为测试在编码异二聚体受体的受体单体的核酸之间插入至少一个核酸对受体表达的影响。生成慢病毒载体以允许编码本披露所包括的不同顺序的多个蛋白质的DNA序列的基因组整合。慢病毒载体含有三顺反子或四顺反子序列，其编码本披露的γTCR链和δTCR链或α和βTCR链(位于与ORF不同的位置)、编码eGFP、本披露的MIDIS蛋白和/或CD8-Q8的一个或两个另外核苷酸序列，以及连接三个或四个蛋白质编码序列的2A自切割肽序列(描述于Xu Y.等人(2019)和Pincha M.等人，(2011)，上文引用)。

将冷冻保存的T细胞(αβT细胞或J76 Jurkat细胞)解冻，并在含青霉素/链霉素(0.5％)、人血清(2.4％)、IL-7(1700IU/ml)和IL-15(150IU/ml)的TexMACS(美天旎公司)培养基(TEG培养基)中以每孔1.6x10^6个细胞的密度接种在48孔板中。用CD3/CD28TransAct激活T细胞24小时，然后通过在TexMACS培养基中稀释慢病毒，以预先设定的感染复数(MOI；0.3-25)转导选定的慢病毒载体。与Pirona等人.2020(如上所述)类似，通过基于FACS的滴定在J76 Jurkat细胞上测定慢病毒MOI。简而言之，J76 Jurkat细胞以0.5E6/ml个活细胞接种在96孔板中。将慢病毒上清液浓缩并在含有10％FBS的冷培养基中连续稀释，从100x稀释开始。连续稀释后，将含有慢病毒的上清液用J76 Jurkat细胞1：1稀释，并将混合物在37摄氏度孵育3天。通过分析CD3+活细胞的百分比来确定滴度。

第二天，更新培养基，并将用含有γδTCR或αβTCR编码序列的载体转导的T细胞(αβT细胞或J76 Jurkat细胞)转移至T25烧瓶中，终体积为5ml。在αβTCR的情况下，可替代地，可以将T细胞用含有αβTCR的载体转导，并根据Synthego的一般准则，使用nucleofector 2b、程序T-023和Nucleofector试剂盒T(龙沙公司(Lonza))，用SpCAS9和单指导RNA的蛋白-RNA复合物(CAS9：sgRNA)进行核转染；可以使用的sgRNA是针对TRAC的ACAAAACUGUGCUAGACAUG(SEQ ID NO：191)、GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU(SEQ ID NO：192)、CUCUCAGCUGGUACACGGCA(SEQID NO：193)和针对TRBC1和TRBC2的ACCCGAGGUCGCUGUGUUUG(SEQ ID NO：194)、AGGUCGCUGUGUUUGAGCCA(SEQID NO：195)、CGACCACGUGGAGCUGAGCU(SEQ ID NO：196)、GAUACUGCCUGAGCAGCCGC(SEQ ID NO：197)。核转染后，可将细胞转移至如上所述的T25烧瓶中。

第6天再次更新培养基，并将T细胞转移至T75细胞培养瓶中，终体积为10ml。T细胞在解冻后8天收获。

通过流式细胞术对8天方案后出现的细胞进行表征。用FACS缓冲液(含2％胎牛血清的PBS)洗涤细胞，并用FACS缓冲液中选定的荧光缀合抗体在4摄氏度染色30分钟。染色后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并用4％多聚甲醛在4摄氏度固定10分钟。固定后，用FACS缓冲液再次洗涤细胞，然后重悬浮于100-200μl FACS缓冲液中，随后进行流式细胞术分析。

实例13：靶细胞和在多顺反子构建体中表达确定的α-βTCR的γ-δTCR的效应T细胞的共培养测定

将靶肿瘤细胞(包括HT-29、RKO、U266细胞)以规定浓度接种在96孔板中。在添加效应细胞前一天接种贴壁靶细胞，并在添加效应细胞的同一天接种悬浮靶细胞。

在多顺反子构建体中表达的确定的γ-δTCR的可变结构域是由SEQ ID NO：90和91(c15)或111和112(E57)表示的可变结构域。

冷冻保存的TEG用作效应细胞。添加到所有共培养物中的效应细胞数量经过校正，以匹配实验中转导效率最低的TEG。添加经历相同生产过程但未添加包含多顺反子构建体的慢病毒载体的未转导细胞，以便一个实验中的所有共培养物含有相同数量的TEG和相同数量的总T细胞。

共培养物的效应细胞与靶标比率(E：T)为9∶1、3∶1、1∶1、0.3∶1或0.11∶1，并在效应细胞添加当天进行或不进行帕米膦酸二钠盐处理(10μm)。包括未转导的、仅效应子、仅靶标或完全裂解对照。

3或4天后，从共培养物中收集上清液用于IFNγELISA(R&D系统公司(R&Dsystems))。轻轻重悬浮未贴壁的细胞，并将细胞悬浮液转移至圆底96孔板。当通过发光测定细胞毒性时，将100μl测定培养基与D-萤光素一起添加到含有任何剩余靶细胞的残留共培养板中，并孵育12分钟，然后通过Glomax(普洛麦格公司(Promega))测量发光。

实例14：其中γ链编码核酸位于第一位置并且6链编码核酸位于最后位置的多顺反子构建体增强了确定的γ-δTCR的表达

本实例评估了本文所述的多顺反子构建体中γ链编码核酸和δ链编码核酸的位置对工程改造的免疫细胞表达确定的γ-δTCR的能力的影响。

如实例12中概述用编码以下γ-δTCR链组合的核酸转导α-βT细胞：确定的γ(SEQ IDNO：90)和δ(SEQ ID NO：91)链或γ(SEQ ID NO：111)和δ(SEQ ID NO：112)链，以产生TEG，其中编码eGFP的核酸(SEQ ID NO：81)插入在三顺反子构建体中编码γ链和δ链的核酸之间。还设计了对照三顺反子构建体，其中编码eGFP的核酸被放置在构建体的第一位置或最后位置。

图24A显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的表达的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。

如实例12所述对三个供体进行TEG染色，并获得TEG(γδTCR+T细胞)的％、γδTCR+细胞的γδTCR MFI或活单细胞的γδTCR+αβTCR-％作为γδTCR表达的量度。图24B中示出了流程图的实例(确定的γδTCR c15，SEQ ID NO：90和91)。图25A-25C(表达SEQ ID NO：90-91的TEG)和图26A-26B(SEQ ID NO：111-112)显示了合并的经供体校正的测量值。对于供体校正，将对于γ-eGFP-δ/供体获得的值设置为1，并相应地计算其他构建体的相对变化(构建体/供体的之间的相对比较)。与其他组合相比，在第一位置具有γ且在最后位置具有δ的三顺反子构建体显示出确定的γ-δTCR的最高表达。

在另一个实验中，如实例12中概述用编码确定的γ链(SEQ ID NO：90)和δ链(SEQID NO：91)的核酸转导α-βT细胞以产生TEG，其中编码41BBL-OX40(SEQ ID NO：45)或CD8-Q8(SEQ ID NO：80)的核酸插入三顺反子构建体中编码γ链和δ链的核酸之间。还设计了对照三顺反子构建体，其中编码41BBL-OX40或Q8的核酸置于构建体的最后位置。

图27A显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的表达的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。41BBL的N-末端的黑条代表接头序列(SEQID NO：28)。

如实例12所述对三个供体进行TEG染色，并获得γδTCR+的γδTCR MFI或活单个T细胞的γδTCR+αβTCR-％作为表达的量度。图27B-C(41BBL-OX40)和图27D-E(CD8-Q8)显示了合并的经供体校正的测量值。与上述类似地进行供体校正。与其他组合相比，在第一位置具有γ链编码核酸且在最后位置具有δ链编码核酸的三顺反子构建体显示出确定的γ-δTCR的最高表达。

在另一个实验中，如实例12中概述用编码确定的γ链(SEQ ID NO：90)和δ链(SEQID NO：91)的核酸转导α-βT细胞以产生TEG，其中编码41BBL-OX40(SEQ ID NO：45)和eGFP(SEQ ID NO：81)的核酸插入四顺反子构建体中编码γ链和δ链的核酸之间。还设计了对照四顺反子构建体，其中编码41BBL-OX40和eGFP的核酸置于构建体的前两个或最后两个位置。

图28A显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的表达的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。如实例12所述对三个供体进行TEG染色，并获得TEG的％或活单个T细胞的γδTCR+αβTCR-％作为表达的量度。与上述类似地进行供体校正。图28B-C示出了组合的经供体校正的测量结果。与其他组合相比，在第一位置具有γ链编码核酸且在最后位置具有δ链编码核酸的四顺反子构建体显示出确定的γ-δTCR的最高表达。这些数据进一步证明，在多顺反子构建体中插入一个或多个编码除受体单体之外的多肽的核酸(其中一个核酸在第一位置编码异二聚体的一部分，另一个在最后位置)可以改善异二聚体在工程改造的免疫细胞中的表达。

实例15：其中γ链或δ链编码核酸位于第一位置并且δ链或γ链编码核酸位于最后位置的多顺反子构建体导致对靶细胞的最高细胞应答

本实例评估多顺反子构建体中编码本披露的受体的异二聚体单体的核酸的位置对工程改造的免疫细胞应答靶细胞的能力的影响。用编码以下γ-δTCR链组合的核酸转导α-βT细胞：确定的γ(SEQ ID NO：90)和δ(SEQ ID NO：91)链或γ(SEQ ID NO：111)和δ(SEQ IDNO：112)链，其中编码eGFP的核酸(SEQ ID NO：81)插入在三顺反子构建体中编码γ链和δ链的核酸之间，如实例12中概述。还设计了对照三顺反子构建体，其中编码eGFP的核酸被放置在构建体的第一位置或最后位置。

图24A和图29A显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的表达的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。

如实例13中所述，将TEG与由确定的γ-δTCR识别的靶肿瘤细胞共孵育，包括收集上清液并通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。实验包括有或没有10μM帕米膦酸二钠盐处理的条件。

图29B-C(γ-eGFP-δ顺序)和图30A-B(δ-eGFP-γ顺序)中分别示出了TEG的细胞毒性(通过活靶标的相对发光单位)和IFNy释放，该TEG表达以下：在三顺反子构建体的第一位置编码确定的γ链(SEQ ID NO：90)并在最后位置编码δ链(SEQ ID NO：91)的核酸，或在与异位表达萤光素酶-tdTomato的HT-29以1：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育的代表性供体的第一位置编码δ链并在最后位置编码γ链的核酸。与从构建体的第一位置或最后位置表达γ链或δ链的TEG共培养具有显著更少的存活靶细胞和显著更高水平的IFNy释放。

图30C示出了与异位表达萤光素酶-tdTomato的RKO以0.11：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育的代表性供体的TEG的细胞毒性，所述TEG从三顺反子构建体的第一位置表达确定的γ链(SEQ ID NO：111)并从最后位置表达δ链(SEQ ID NO：112)，结果与针对SEQ IDNO：90和SEQ ID NO：91获得的结果一致。

在另一个实验中，如实例12中概述用编码确定的γ(SEQ ID NO：90)链和δ(SEQ IDNO：91)链的核酸转导α-βT细胞以产生TEG，其中编码蛋白质的另外核酸插入在三顺反子构建体中编码γ链和δ链的核酸之间。对照也按照实例14中的概述进行设计。本实例中的另外的蛋白质是41BBL-OX40(SEQ ID NO：45)和CD8-Q8(SEQ ID NO：80)。如实例13中所述，将TEG与由确定的γ-δTCR识别的靶肿瘤细胞共孵育，包括收集上清液并通过萤光素酶测定来测量残余靶细胞活力。

图31-B示出了TEG的毒性(通过可存活靶标的相对发光单位)，所述TEG表达与异位表达萤光素酶-tdTomato的HT-29以0.3：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育的代表性供体的确定的γδ。表达γ链编码性核酸定位在构建体中的第一个位置并且δ编码性核酸定位在最后一个位置的构建体(其中41BBL-OX40-或CD8-Q8-编码性核酸定位在γ链编码性核酸与δ链编码性核酸之间)的TEG显示出显著高的细胞毒性。

实例16：其中γ链编码核酸位于第一位置且δ链编码核酸位于最后位置的多顺反子构建体与δ链编码核酸位于第一位置且γ链编码核酸位于最后位置相比导致对靶细胞的更高的细胞应答。

本实例评估了本披露的多顺反子构建体中γ链和δ链编码核酸的位置(顺序)对表达它们的细胞应答靶细胞的能力的影响。用编码以下γ-δTCR链组合的核酸转导α-βT细胞：确定的γ(SEQ ID NO：90)和δ(SEQ ID NO：91)链或γ(SEQ ID NO：111)和δ(SEQ ID NO：112)链，其中编码eGFP的核酸(SEQ ID NO：81)或41BBL-OX40(SEQ ID NO：45)插入在三顺反子构建体中编码γ链和δ链的核酸之间，如实例12中概述。

图32A显示了用于引入γ-δTCR和其他蛋白质的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。

如实例13中所述将TEG与由确定的γ-δTCR识别的靶肿瘤细胞共孵育，通过萤光素酶测定测量残余靶细胞活力。实验包括有或没有帕米膦酸二钠盐处理(10μm)的条件。

图32B显示了表达代表性供体的确定的γδ(SEQ ID NO：90-91)的TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的HT-29以3：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育的细胞毒性(通过活靶的相对发光单位)。图32C显示了具有代表性供体的确定的γδ(SEQ ID NO：111-112)的TEG与异位表达萤光素酶-tdTomato的RKO以3：1的效应子比靶标(E：T)比例共孵育的细胞毒性。尽管与未转导的T细胞(UNTR)相比，无论γ链编码核酸和δ链编码核酸何时被定位为三顺反子构建体中的第一核酸或最后核酸，TEG都会显著杀伤靶细胞，但与表达δ链编码核酸定位在第一位置并且γ链编码核酸定位在最后位置的构建体的TEG相比，表达γ链编码核酸定位在第一位置并且δ链编码核酸定位在最后位置的构建体的TEG显示出显著高的细胞毒性。

实例17：其中β链编码核酸位于第位置且α链编码核酸位于最后位置的多顺反子构建体导致α-βTCR的更高表达。

本实例评估了本披露的多顺反子构建体中α链编码核酸和β链编码核酸的位置(顺序)对工程改造的免疫细胞应答靶细胞的能力的影响。

用三顺反子构建体(其包含编码确定的α(SEQ ID NO：199)和β(SEQ ID NO：198)链的核酸，和插入编码α和β链的核酸之间的编码eGFP的核酸(SEQ ID NO：81))转导Jurkat76T细胞，以产生表达外源αβTCR的工程改造的T细胞。还设计了对照三顺反子构建体，其中编码eGFP的核酸被放置在构建体的第一位置或最后位置。如实例12中所述以固定MOI进行转导，不同之处在于Jurkat T细胞未进行CRISPR编辑。转导后3天，通过流式细胞术评估αβTCR的表达和转导效率，如实例12中所述。用抗CD3ε评估αβTCR的表面表达，并通过用抗αβTCR抗体固定后对细胞染色来评估αβTCR的总表达(表18)。细胞表面表达和胞内表达之间的比例证明了αβTCR运输和表面表达的效率。

图33A显示了用于引入确定的αβTCR和其他蛋白质的表达的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽(SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：208)。

αβTCR表面表达除以胞内αβTCR表达的比例如图33B所示，与对照相比，该比例在表达三顺反子构建体的Jurkat T细胞中更高，该三顺反子构建体在第一位置具有β链编码核酸且在最后位置具有α链编码核酸。

在另一个实验中，将三顺反子构建体中第一位置处的β链编码核酸和最后位置处的α链编码核酸的顺序与第一位置处的α链编码核酸和最后位置处的β链编码核酸的顺序进行比较。该构建体进一步包含插入在编码α链和β链的核酸之间的编码eGFP的核酸(SEQ IDNO：81)。用包含编码确定的α(SEQ ID NO：199)和β(SEQ ID NO：198)链的核酸的构建体转导Jurkat 76T细胞，以产生表达外源αβTCR的工程改造的T细胞。图33C显示了该实验中使用的构建体的示意图。P2A和T2A代表自切割肽。如本例的第一个实验中所述进行转导细胞的染色。αβTCR表面表达除以胞内αβTCR表达的比例显示在图33D中。

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XI.实施例

实施例1.一种多向信号转导器(MIDIS)蛋白，其包含胞外配体结构域、跨膜结构域和异源胞内信号传导结构域，其中该胞外配体结构域与相互作用配偶体的结合诱导多向信号传导，该多向信号传导包括由该MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的第一信号传导途径和由该相互作用配偶体的胞内结构域介导的第二信号传导途径，其中该第一信号传导途径和该第二信号传导途径共同诱导目标生物学结果。该第一和第二信号传导途径可以发生在同一细胞中。

实施例2.如实施例1所述的MIDIS蛋白，其中该目标生物学结果是细胞增殖、细胞存活、细胞分化、细胞去分化、或细胞转分化、或其组合。

实施例3.如实施例1所述的MIDIS蛋白，其中该目标生物学结果是免疫效应子功能、抗癌免疫应答或其组合。

实施例4.如实施例1-3中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该多向信号传导包括由内向外信号传导和由外向内信号传导。

实施例5.如实施例1-4中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含来自免疫共受体配体的氨基酸序列。

实施例6.如实施例1-5中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含来自I型或II型跨膜蛋白的氨基酸序列。

实施例7.如实施例1-6中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含来自免疫共刺激配体的氨基酸序列。

实施例8.如实施例1-4中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含衍生自抗体的抗原结合片段。

实施例9.如实施例1-4中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含短链可变片段(scFv)、单结构域抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、亲和体、锚蛋白重复序列、darpin、纳米抗体、亲和多聚体、纤维连接蛋、抗运载蛋白、Fynomer、库尼茨结构域、打结素或β-发夹模拟物。

实施例10.如实施例1-4中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含来自肿瘤坏死因子超家族成员、细胞因子、C型凝集素、免疫球蛋白超家族成员、或抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。

实施例11.如实施例1-7中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含来自41BBL、OX40L、CD86、RANK或CD70的氨基酸序列。

实施例12.如实施例1-7中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列。

实施例13.如实施例1-7和10-12中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该胞外配体结构域包含与SEQ ID NO：01-06或174中任一个具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施例14.如实施例1-13中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该异源胞内信号传导结构域包含来自肿瘤坏死因子受体超家族成员、细胞因子受体或C型凝集素受体的氨基酸序列。

实施例15.如实施例1-14中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该异源胞内信号传导结构域包含来自I型或II型跨膜蛋白的氨基酸序列。

实施例16.如实施例1-15中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该异源胞内信号传导结构域包含来自共刺激免疫受体的氨基酸序列。

实施例17.如实施例1-16中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该异源胞内信号传导结构域包含来自41BB、NKp80、IL18RAP、CD70或IL2RB的氨基酸序列。

实施例18.如实施例1-17中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列。

实施例19.如实施例1-18中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该异源胞内信号传导结构域包含与SEQ ID NO：07-19、175或176中的任一个具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施例20.如实施例1-19中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该相互作用配偶体是41BB、OX40、CD28或RANKL。

实施例21.如实施例1-20中任一项所述的MIDIS蛋白，其进一步包含一个或多个另外的胞外配体结构域。

实施例22.如实施例1-21中任一项所述的MIDIS蛋白，其进一步包含一个或多个另外的胞内信号传导结构域。

实施例23.如实施例1-22中任一项所述的MIDIS蛋白，其中与野生型氨基酸序列相比，该胞外配体结构域的N末端至C末端取向是反向的。

实施例24.如实施例1-23中任一项所述的MIDIS蛋白，其中与野生型氨基酸序列相比，该异源胞内信号传导结构域的N末端至C末端取向是反向的。

实施例25.如实施例1-24中任一项所述的MIDIS蛋白，其中当该胞外配体结构域与该相互作用配偶体结合后，该MIDIS蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或多聚体进行信号传导。

实施例26.如实施例1-25中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该相互作用配偶体由免疫细胞表达。

实施例27.如实施例1-25中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该相互作用配偶体由T细胞表达。

实施例28.如实施例1-27中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该相互作用配偶体是免疫共受体。

实施例29.如实施例1-28中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该跨膜结构域和该胞外配体结构域来自相同蛋白。

实施例30.如实施例1-29中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该MIDIS蛋白包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：45-53、57-65、67、71-73、76-78、178-179或182-183具有至少90％、95％、97％、98％、99％或99.5％或100％序列同一性的氨基酸序列。

实施例31.如实施例1-30中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该MIDIS蛋白不包含ITAM、来自TCR信号传导复合物的胞内结构域、或来自CD3链的胞内结构域。

实施例32.如实施例1-30中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该MIDIS蛋白包含hemITAM但不包含ITAM。

实施例33.如实施例1-31中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该MIDIS蛋白在与该相互作用配偶体结合后不被磷酸化。

实施例34.如实施例1-32中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该MIDIS蛋白在与该相互作用配偶体结合后被磷酸化。

实施例35.如实施例1-34中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该多向信号传导包含由该MIDIS蛋白的该异源胞内信号传导结构域介导的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个信号传导途径。

实施例36.如实施例1-35中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该多向信号传导包含由该相互作用配偶体的该胞内结构域介导的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个信号传导途径。

实施例37.如实施例1-34中任一项所述的MIDIS蛋白，其中该多向信号传导是双向信号传导，该双向信号传导涉及由该MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的一个信号传导途径和由该相互作用配偶体的胞内结构域介导的一个信号传导途径。

实施例38.如实施例1-37中任一项所述的MIDIS蛋白，用于经工程改造以表达该MIDIS蛋白的细胞群，其中该多向信号传导诱导目标生物学结果。

实施例39.一种制备工程改造的细胞群的方法，该方法包括：(a)在该工程改造的细胞群中的至少一个细胞中表达如实施例1-37中任一项所述的MIDIS蛋白，以及(b)在适合该工程改造的细胞群扩增的条件下培养该工程改造的细胞群。

实施例40.一种富集细胞群中应答抗原的细胞的方法，该方法包括：(a)在该细胞群中的至少一个细胞中表达如实施例1-37中任一项所述的MIDIS蛋白；以及(b)培养具有抗原的细胞群或呈递抗原的细胞群。

实施例41.一种表达如实施例1-37中任一项所述的MIDIS蛋白的工程改造的细胞。

实施例42.如实施例41所述的工程改造的细胞，用于治疗有需要的受试者。

实施例43.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例41所述的工程改造的细胞。

实施例44.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如实施例1-37中任一项所述的MIDIS蛋白。

实施例45.如实施例4244所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码外源抗原识别受体。

实施例46.如实施例45的多核苷酸，其中该外源抗原识别受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、α-βT细胞受体或γ-δT细胞受体。

实施例47.如实施例45-46中任一项所述的多核苷酸，其中该MIDIS蛋白和该外源抗原识别受体在一个转录物中表达。

实施例48.如实施例45-46中任一项所述的多核苷酸，其中该MIDIS蛋白和该外源抗原识别受体在编码自切割肽的一个转录物中表达。

实施例49.一种载体，其包含如实施例44-48中任一项所述的多核苷酸。

实施例50.如实施例49所述的载体，用于治疗有需要的受试者。

实施例51.一种治疗方法，其包括向有需要的受试者施用如实施例50所述的载体。

实施例52.一种工程改造的细胞，该工程改造的细胞表达多向信号转导器(MIDIS)蛋白，该多向信号转导器蛋白包含胞外配体结构域、跨膜结构域和异源胞内信号传导结构域，其中该胞外配体结构域与由细胞表达的相互作用配偶体的结合诱导多向信号传导，该多向信号传导包括由该MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的第一信号传导途径和由该相互作用配偶体的胞内结构域介导的第二信号传导途径，其中该第一信号传导途径调节该工程改造的细胞的目标生物学功能，并且该第二信号途径调节表达该相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能。

实施例53.如实施例52所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞的目标生物学功能被诱导。

实施例54.如实施例52所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞的目标生物学功能被降低。

实施例55.如实施例52-54中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞的目标生物学功能包括存活、增殖、免疫效应子功能、细胞毒性应答、抗癌应答、细胞分化、细胞去分化或细胞转分化。

实施例56.如实施例52-55中任一项所述的工程改造的细胞，其中在该胞外配体结构域与该相互作用配偶体结合后，该工程改造的细胞的靶生物学功能被调节比不表达该MIDIS蛋白的相应细胞长至少10％。

实施例57.如实施例52-56中任一项所述的工程改造的细胞，其中在该胞外配体结构域与该相互作用配偶体结合后，该工程改造的细胞的目标生物学功能与不表达该MIDIS蛋白的相应细胞相比增加至少10％或减少至少10％。

实施例58.一种工程改造的细胞，该工程改造的细胞表达多向信号转导器(MIDIS)蛋白，该多向信号转导器蛋白包含胞外配体结构域、跨膜结构域和异源胞内信号传导结构域，其中该胞外配体结构域与由细胞表达的相互作用配偶体的结合诱导多向信号传导，该多向信号传导包括由该MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的第一信号传导途径和由该相互作用配偶体的胞内结构域介导的第二信号传导途径，其中该多向信号传导调节表达该相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能，并且不诱导针对表达该相互作用配偶体的细胞的细胞毒性应答。

实施例59.如实施例52-58中任一项所述的工程改造的细胞，其中表达该相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能被诱导。

实施例60.如实施例52-58中任一项所述的工程改造的细胞，其中表达该相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能被降低。

实施例61.如实施例52-60中任一项所述的工程改造的细胞，其中表达该相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能包括存活、增殖、免疫效应子功能、抗癌应答、细胞分化、细胞去分化或细胞转分化。

实施例62.如实施例52-61中任一项所述的工程改造的细胞，其中表达该相互作用配偶体的细胞的目标生物学功能包括针对癌细胞的细胞毒性应答。

实施例63.如实施例52-62中任一项所述的工程改造的细胞，其中表达该相互作用配偶体的细胞是免疫细胞、T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应T细胞、淋巴细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、间充质干细胞、内皮细胞，或基质细胞。

实施例64.如实施例52-63中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞是免疫细胞、T细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、Jurkat细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应T细胞、淋巴细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞或中性粒细胞。

实施例65.如实施例52-64中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞和表达该相互作用配偶体的细胞是相同的细胞类型。

实施例66.如实施例52-64中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞和表达该相互作用配偶体的细胞是不同的细胞类型。

实施例67.如实施例52-66中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞或表达该相互作用配偶体的细胞是哺乳动物细胞。

实施例68.如实施例52-67中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞或表达该相互作用配偶体的细胞是人细胞。

实施例69.如实施例52-68中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞表达外源抗原识别受体。

实施例70.如实施例69所述的工程改造的细胞，其中该外源抗原识别受体是转基因TCR、α-βTCR、γ-δTCR或嵌合抗原受体。

实施例71.如实施例69所述的工程改造的细胞，其中该外源抗原识别受体是γ-δTCR。

实施例72.如实施例71所述的工程改造的细胞，其中该γ-δTCR包含：(a)选自由γ2、γ3、γ4、γ5、γ8、γ9和γ11组成的组的γ链；(b)选自由δ1、δ2、δ3和δ5组成的组的δ链；或(c)(a)和(b)的任何组合。

实施例73.如实施例72所述的工程改造的细胞，其中该γ链是γ9并且该δ链是δ2。

实施例74.如实施例71-73中任一项所述的工程改造的细胞，其中该γ-δTCR包含γ链，该γ链包含与SEQ ID NO：85、86、87、94、95、96、101、113、115、117、119、127、130中的任一个具有至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的CDR序列，并且其中该γ-δTCR包含δ链，该δ链包含与SEQ ID NO：82、83、84、97、98、99、100、102、114、116、118、126、131中的任一个具有至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的CDR序列。

实施例75.如实施例82-74中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞进一步包含一个或多个基因的缺失或破坏。

实施例76.如实施例52-75中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞进一步包含TRAC、TCRB或免疫检查点基因的缺失或破坏。

实施例77.如实施例52-76中任一项所述的工程改造的细胞，其中该工程改造的细胞表达相互作用配偶体。

实施例78.如实施例52-77中任一项所述的工程改造的细胞，其中该多向信号传导包含由该MIDIS蛋白的该异源胞内信号传导结构域介导的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个信号传导途径。

实施例79.如实施例52-78中任一项所述的工程改造的细胞，其中该多向信号传导包含由该相互作用配偶体的该胞内结构域介导的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个信号传导途径。

实施例80.如实施例52-77中任一项所述的工程改造的细胞，其中该多向信号传导是双向信号传导。

实施例81.如实施例52-80中任一项所述的工程改造的细胞，用于治疗有需要的受试者。

实施例82.一种治疗方法，该方法包括向有需要的受试者施用如实施例82-80中任一项所述的工程改造的细胞。

实施例83.一种制备工程改造的细胞群的方法，该方法包括在合适的条件下培养包含多个如实施例52-77中任一项所述的工程改造的细胞的工程改造的细胞群。

实施例84.一种工程改造的细胞群，该工程改造的细胞群包含至少一个表达多向信号转导器(MIDIS)蛋白的细胞和至少一个表达相互作用配偶体的细胞，其中该MIDIS蛋白包含：胞外配体结构域，其中该胞外配体结构域能够与该相互作用配偶体结合；跨膜结构域；和异源胞内信号传导结构域；其中该胞外配体结构域与该相互作用配偶体的结合诱导多向信号传导，该多向信号传导包括由该MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的第一信号传导途径和由该相互作用配偶体的胞内结构域介导的第二信号传导途径。

实施例85.如实施例84所述的工程改造的细胞群，其中该工程改造的细胞群中的至少一个细胞表达外源抗原识别受体。

实施例86.如实施例85所述的工程改造的细胞群，其中该外源抗原识别受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、α-βT细胞受体或γ-δT细胞受体。

实施例87.如实施例85-86中任一项所述的工程改造的细胞群，其中当该工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与不表达该MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群相比，该工程改造的细胞群的增殖增加至少10％。

实施例88.如实施例85-87中任一项所述的工程改造的细胞群，其中当该工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，表达或呈递该抗原的细胞的杀伤与将表达或呈递该抗原的细胞暴露于不表达该MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群时的杀伤相比增加了至少10％。

实施例89.如实施例85-88中任一项所述的工程改造的细胞群，其中当该工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，与不表达该MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群相比，该工程改造的细胞杀伤至少50％表达或呈递该抗原的细胞的能力所持续的时间长至少3天。

实施例90.如实施例85-89中任一项所述的工程改造的细胞群，其中当该工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞至少5天后，该工程改造的细胞群对耗竭标志物的表达比不表达该MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群低至少10％。

实施例91.如实施例85-90中任一项所述的工程改造的细胞群，其中当该工程改造的细胞群暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞后，该工程改造的细胞群产生的免疫效应分子比不表达该MIDIS蛋白的相应的工程改造的细胞群高至少10％。

实施例92.如实施例84-91中任一项所述的工程改造的细胞群，其中该工程改造的细胞群中的至少一个细胞表达该MIDIS蛋白和该相互作用配偶体。

实施例93.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例84-92中任一项所述的工程改造的细胞群。

实施例94.如实施例84-93中任一项所述的工程改造的细胞群，其中该多向信号传导包含由该MIDIS蛋白的该异源胞内信号传导结构域介导的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个信号传导途径。

实施例95.如实施例84-94中任一项所述的工程改造的细胞群，其中该多向信号传导包含由该相互作用配偶体的该胞内结构域介导的至少两个、至少三个、至少四个或至少五个信号传导途径。

实施例96.如实施例84-93中任一项所述的工程改造的细胞群，其中该多向信号传导是双向信号传导。

实施例97.一种制备工程改造的细胞群的方法，该方法包括在该工程改造的细胞群中的至少一个细胞中表达多向信号转导器(MIDIS)蛋白，以及在适于该工程改造的细胞群扩增的条件下培养该工程改造的细胞群；其中该MIDIS蛋白包含：胞外配体结构域，其中该胞外配体结构域能够结合由该工程改造的细胞群中的至少一个细胞表达的相互作用配偶体；跨膜结构域；和异源胞内信号传导结构域；其中该胞外配体结构域与该相互作用配偶体的结合诱导多向信号传导，该多向信号传导包括由该MIDIS蛋白的异源胞内信号传导结构域介导的第一信号传导途径和由该相互作用配偶体的胞内结构域介导的第二信号传导途径。

实施例98.如实施例43、51、76和87中任一项所述的方法，其中该受试者患有癌症。

实施例99.如实施例43、82、93和98中任一项所述的方法，其中该工程改造的细胞或该工程改造的细胞群对于该受试者是自体的。

实施例100.如实施例43、82、93和98中任一项所述的方法，该工程改造的细胞或该工程改造的细胞群对于该受试者是同种异体的、HLA匹配的、HLA错配的或单倍体的。

实施例101.一种能够转导至少两个胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白，所述蛋白包含：

-跨膜结构域，和

其中该第二胞内信号通过该相互作用配偶体的该胞内结构域转导，并且

其中该嵌合蛋白不是包含以下或由以下组成的蛋白：ICOSL的胞外配体结构域和跨膜结构域以及41BB的异源胞内信号传导结构域。

实施例102.如实施例101所述的嵌合蛋白，其中该至少两个胞内信号在一个单细胞中产生。

实施例103.如实施例101或102所述的嵌合蛋白，其中该相互作用配偶体包含：

-能够与该嵌合蛋白的该胞外配体结构域相互作用的胞外结构域，

-跨膜结构域，和

-胞内结构域，其在该相互作用配偶体的该胞外结构域与该嵌合蛋白的该胞外配体结构域结合后转导第二信号。

实施例104.如实施例101-103中任一项所述的嵌合蛋白，其中该至少两个胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善。

实施例105.如实施例101-104中任一项所述的嵌合蛋白，其中

a.该胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白，或

b.该胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白。

实施例106.如实施例102-105中任一项所述的嵌合蛋白，其中该细胞是免疫细胞，优选T细胞或NK细胞。

实施例107.如实施例104-106中任一项所述的嵌合蛋白，其中该生物学参数和/或功能选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤，

实施例108.如实施例101-107中任一项所述的嵌合蛋白，其中：

-该胞外配体结构域包含来自肿瘤坏死因子超家族成员、细胞因子、C型凝集素、免疫球蛋白超家族成员、或抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列；和

-该异源胞内信号传导结构域包含来自肿瘤坏死因子受体超家族成员、细胞因子受体或C型凝集素受体的氨基酸序列。

实施例109.如实施例108所述的嵌合蛋白，其中：

-该胞外配体结构域包含来自41BBL、OX40L、CD86或RANK的氨基酸序列，并且

-该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40、41BB、NKp80或IL18RAP的氨基酸序列。

实施例110.如实施例109所述的嵌合蛋白，其中：

(a)该胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白41BBL，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，

(b)该胞外配体结构域包含来自CD86的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，

(c)该胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自NKp80的氨基酸序列，

(d)该胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列，

(e)该胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，

(f)该胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自41BB的氨基酸序列，

(g)该胞外配体结构域包含来自OX40L的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自41BB的氨基酸序列，或

(h)该胞外配体结构域包含来自CD86的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列。

实施例111.如实施例101-110中任一项所述的嵌合蛋白，其中该嵌合蛋白不包含ITAM或来自TCR信号传导复合物的胞内结构域。

实施例112.一种多核苷酸，其编码如实施例101-111中任一项所定义的嵌合蛋白。

实施例113.一种载体，其包含如实施例112中所定义的多核苷酸，其中优选该载体是病毒载体。

实施例114.一种细胞，其包含如实施例112中所定义的多核苷酸或如实施例113中所定义的载体，优选地其中所述细胞表达所述嵌合蛋白，更优选地其中所述细胞还表达该相互作用配偶体。

实施例115.一种细胞群，其中该细胞群包含至少一个如实施例114中所定义的细胞。

实施例116.如实施例114所述的细胞或如实施例115所述的细胞群，其中这些细胞是免疫细胞，优选T细胞或NK细胞。

实施例117.如实施例115或116所述的细胞群，其中该细胞群进一步包含至少一个表达外源抗原识别受体的细胞。

实施例118.如实施例117所述的细胞群，其中至少一个表达如实施例101-111中任一项所定义的嵌合蛋白的细胞还表达外源抗原识别受体。

实施例119.如实施例117或118所述的细胞群，其中该外源抗原识别受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、α-βT细胞受体或γ-δT细胞受体。

实施例120.如实施例115-119中任一项所述的细胞群，其中这些T细胞是表达γ-δT细胞受体的α-βT细胞。

实施例121.如实施例115-120中任一项所述的细胞群，其中当将表达如实施例101-111中任一项所定义的嵌合蛋白的细胞暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞时，所述细胞群的增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤与不表达该嵌合蛋白的相应细胞群相比增加至少10％。

实施例122.如实施例101-111中任一项所述的嵌合蛋白、如实施例112所述的多核苷酸、如实施例113所述的载体、如实施例114所述的细胞或如实施例115-121中任一项所述的细胞群，其中该嵌合蛋白、该多核苷酸、该载体、该细胞或该细胞群用于治疗疾病或病症，其中该至少两个胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善，所述生物学参数有助于该疾病或病症的治疗。

实施例123.如实施例122所述的嵌合蛋白、如实施例122所述的多核苷酸、如实施例122所述的载体、如实施例122所述的细胞或如实施例122所述的细胞群，其中：

-该生物学参数选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤，

-该细胞是免疫细胞和/或

-该疾病是癌症。

实施例124.一种能够转导至少两个可诱导的胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白，所述蛋白包含：

-跨膜结构域，和

其中该第二胞内信号通过该相互作用配偶体的胞内结构域转导。

实施例125.如实施例124所述的嵌合蛋白，其中该相互作用配偶体包含：

-能够与该嵌合蛋白的该胞外配体结构域相互作用的胞外结构域，-跨膜结构域，和

实施例126.如实施例124或125所述的嵌合蛋白，其中该至少两个可诱导的胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善。

实施例127.如实施例124-126中任一项所述的嵌合蛋白，其中

实施例128.如实施例126-127中任一项所述的嵌合蛋白，其中该细胞是免疫细胞，优选T细胞或NK细胞。

实施例129.如实施例126-128中任一项所述的嵌合蛋白，其中该生物学参数和/或功能选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤，

实施例130.如实施例124-129中任一项所述的嵌合蛋白，其中：

实施例131.如实施例130所述的嵌合蛋白，其中：

-该胞外配体结构域包含来自41BBL、OX40L、CD86或RANK的氨基酸序列，以及

实施例132.如实施例131所述的嵌合蛋白，其中：

(d)该胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自IL1 8RAP的氨基酸序列，

实施例133.如实施例124-132中任一项所述的嵌合蛋白，其中该嵌合蛋白不包含ITAM或来自TCR信号传导复合物的胞内结构域。

实施例134.一种多核苷酸，其编码如实施例124-133中任一项所定义的嵌合蛋白。

实施例135.一种载体，其包含如实施例134中所定义的多核苷酸，其中优选该载体是病毒载体。

实施例136.一种细胞，其包含如实施例134中所定义的多核苷酸或如实施例135中所定义的载体，优选地其中所述细胞表达所述嵌合蛋白，更优选地其中所述细胞还表达该相互作用配偶体。

实施例137.一种细胞群，其中该细胞群包含至少一个如实施例136中所定义的细胞。

实施例138.如实施例136所述的细胞或如实施例137所述的细胞群，其中这些细胞是免疫细胞，优选T细胞或NK细胞。

实施例139.如实施例137或138所述的细胞群，其中该细胞群进一步包含至少一个表达外源抗原识别受体的细胞。

实施例140.如实施例139所述的细胞群，其中至少一个表达如实施例124-133中任一项所定义的嵌合蛋白的细胞还表达外源抗原识别受体。

实施例141.如实施例139或140所述的细胞群，其中该外源抗原识别受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、α-βT细胞受体或γ-δT细胞受体。

实施例142.如实施例137-141中任一项所述的细胞群，其中这些T细胞是表达γ-δT细胞受体的α-βT细胞。

实施例143.如实施例137-142中任一项所述的细胞群，其中当将表达如实施例124-133中任一项所定义的嵌合蛋白的细胞暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞时，所述细胞群的增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤与不表达该嵌合蛋白的相应细胞群相比增加至少10％。

实施例144.如实施例124-133中任一项所述的嵌合蛋白、如实施例134所述的多核苷酸、如实施例135所述的载体、如实施例136所述的细胞或如实施例137-143中任一项所述的细胞群，其中该嵌合蛋白、该多核苷酸、该载体、该细胞或该细胞群用于治疗疾病或病症，其中该至少两个可诱导的胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善，所述生物学参数有助于该疾病或病症的治疗。

实施例145.如实施例144所述的嵌合蛋白、如实施例144所述的多核苷酸、如实施例144所述的载体、如实施例144所述的细胞或如实施例144所述的细胞群，其中：

-该细胞是免疫细胞和/或

-该疾病是癌症。

虽然已经在本文示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不背离本发明的情况下众多变化、改变和替代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，本文所述的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实践本发明。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。

序列表

<110> 歌德塔有限公司（Gadeta B.V.）

<120> 改善的免疫疗法及其用途

<130> P6099087PCT

<150> EP20217167.4

<151> 2020-12-23

<150> EP20217164.1

<151> 2020-12-23

<160> 222

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-EC

<400> 1

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp

20 25 30

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln

35 40 45

Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp

50 55 60

Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu

65 70 75

Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly

80 85 90

Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala

95 100 105

Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

110 115 120

Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

125 130 135

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe

140 145 150

Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

155 160 165

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr

170 175 180

Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile

185 190 195

Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

200 205

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40L

<400> 2

Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln

1 5 10 15

Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

20 25 30

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile

35 40 45

Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser

50 55 60

Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro

65 70 75

Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val

80 85 90

Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr

95 100 105

Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu

110 115 120

Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

125 130

<210> 3

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86

<400> 3

Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val

1 5 10 15

Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala

20 25 30

Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser

35 40 45

Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln

50 55 60

Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe

65 70 75

Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser

80 85 90

Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys

95 100 105

Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met

110 115 120

Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

125 130 135

Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn

140 145 150

Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu

155 160 165

Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile

170 175 180

Glu Tyr Asp Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu

185 190 195

Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val

200 205 210

Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr

215 220 225

Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln

230 235 240

Pro Pro Pro Asp His Ile Pro

245

<210> 4

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RANK

<400> 4

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ala Arg Leu Gln Val Ala Leu Gln Ile

20 25 30

Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg

35 40 45

Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys

50 55 60

Thr Thr Thr Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu

65 70 75

Tyr Leu Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys

80 85 90

Val Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val Ala Val Val Ala Gly Asn

95 100 105

Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp

110 115 120

Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro

125 130 135

Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln Leu Asn Lys Asp Thr Val

140 145 150

Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser

155 160 165

Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys

170 175 180

Arg Val Glu His His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala Val Cys Ser

185 190 195

Ser Ser Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His Val Tyr

200 205 210

Leu Pro

<210> 5

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向41BBL

<400> 5

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His

1 5 10 15

Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu

20 25 30

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr

35 40 45

Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser

50 55 60

Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val

65 70 75

Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly

80 85 90

Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu

95 100 105

Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu

110 115 120

Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

125 130 135

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His

140 145 150

Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

155 160 165

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro

170 175 180

Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Arg Leu Asp Leu Leu Gly

185 190 195

Ala Pro Asp Asp Pro Ser Leu Glu Pro Gly Glu Arg Leu Arg Pro

200 205 210

Ser Ala Ala Ser Gly Pro Ser Ala Arg Ala

215 220

<210> 6

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL CD86 IgV结构域

<400> 6

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp

20 25 30

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln

35 40 45

Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp

50 55 60

Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu

65 70 75

Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly

80 85 90

Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala

95 100 105

Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

110 115 120

Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

125 130 135

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe

140 145 150

Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

155 160 165

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr

170 175 180

Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile

185 190 195

Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Ser Leu Asn Gly Gly

200 205 210

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

215 220 225

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Ala Pro Leu Lys Ile

230 235 240

Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala

245 250 255

Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln

260 265 270

Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu

275 280 285

Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe

290 295 300

Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys

305 310 315

Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr

320 325 330

Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu

335 340 345

Ala Asn

<210> 7

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40-ICD

<400> 7

Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His

20 25 30

Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35

<210> 8

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40-ICD-REV

<400> 8

Ile Lys Ala Leu Thr Ser His Ala Asp Ala Gln Glu Glu Gln Ile

1 5 10 15

Pro Thr Arg Phe Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys His Ala Asp Pro

20 25 30

Pro Leu Arg Gln Asp Arg

35

<210> 9

<211> 63

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40-ICD-TM

<400> 9

Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln

20 25 30

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe

35 40 45

Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu

50 55 60

Ala Lys Ile

<210> 10

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB-ICD

<400> 10

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

1 5 10 15

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

20 25 30

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 11

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB-ICD-REV

<400> 11

Met Leu Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

1 5 10 15

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40 45

<210> 12

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp80-ICD

<400> 12

Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser Lys

1 5 10 15

Lys Arg Ser Ser Ala Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Ser Val Thr Leu His Trp

35

<210> 13

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL18RAP-ICD

<400> 13

Ala Ala Ser Ala Leu Leu Tyr Arg His Trp Ile Glu Ile Val Leu

1 5 10 15

Leu Tyr Arg Thr Tyr Gln Ser Lys Asp Gln Thr Leu Gly Asp Lys

20 25 30

Lys Asp Phe Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ala Lys Trp Ser Ser Phe

35 40 45

Pro Ser Glu Ala Thr Ser Ser Leu Ser Glu Glu His Leu Ala Leu

50 55 60

Ser Leu Phe Pro Asp Val Leu Glu Asn Lys Tyr Gly Tyr Ser Leu

65 70 75

Cys Leu Leu Glu Arg Asp Val Ala Pro Gly Gly Val Tyr Ala Glu

80 85 90

Asp Ile Val Ser Ile Ile Lys Arg Ser Arg Arg Gly Ile Phe Ile

95 100 105

Leu Ser Pro Asn Tyr Val Asn Gly Pro Ser Ile Phe Glu Leu Gln

110 115 120

Ala Ala Val Asn Leu Ala Leu Asp Asp Gln Thr Leu Lys Leu Ile

125 130 135

Leu Ile Lys Phe Cys Tyr Phe Gln Glu Pro Glu Ser Leu Pro His

140 145 150

Leu Val Lys Lys Ala Leu Arg Val Leu Pro Thr Val Thr Trp Arg

155 160 165

Gly Leu Lys Ser Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Trp Ala Lys Met

170 175 180

Arg Tyr His Met Pro Val Lys Asn Ser Gln Gly Phe Thr Trp Asn

185 190 195

Gln Leu Arg Ile Thr Ser Arg Ile Phe Gln Trp Lys Gly Leu Ser

200 205 210

Arg Thr Glu Thr Thr Gly Arg Ser Ser Gln Pro Lys Glu Trp

215 220

<210> 14

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB-ICD-TM

<400> 14

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly

20 25 30

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

35 40 45

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

50 55 60

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

65

<210> 15

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40-ICD-ALYLLR

<400> 15

Ile Lys Ala Leu Thr Ser His Ala Asp Ala Gln Glu Glu Gln Ile

1 5 10 15

Pro Thr Arg Phe Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys His Ala Asp Pro

20 25 30

Pro Leu Arg Gln Asp Arg Arg Leu Leu Tyr Leu Ala

35 40

<210> 16

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40-ICD-ALYLLR-REV

<400> 16

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala

1 5 10 15

His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu

20 25 30

Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TRAF结构域 OX40

<400> 17

Pro Ile Gln Glu Glu Gln

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YMTLN基序

<400> 18

Tyr Met Thr Leu Asn

1 5

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TRAF结构域 41BB

<400> 19

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

1 5 10 15

Glu Glu Glu

<210> 20

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40-TM

<400> 20

Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ile Leu Leu

20

<210> 21

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40L-TM

<400> 21

Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu Gly Leu Leu Leu

1 5 10 15

Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu

20 25

<210> 22

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BB-TM

<400> 22

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

20 25

<210> 23

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-TM

<400> 23

Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Cys Ala Val Phe Leu

20

<210> 24

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKp80-TM

<400> 24

Ile Leu Leu Gly Ile Ser Gly Thr Val Asn Gly Ile Leu Thr Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ile Ser Leu Ile

20

<210> 25

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86-TM

<400> 25

Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val

1 5 10 15

Phe Cys Leu Ile Leu Trp

20

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL18RAP-TM

<400> 26

Gly Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Leu Gly Thr Ile Gly Thr Leu

1 5 10 15

Val Ala Val Leu

<210> 27

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RANK-TM

<400> 27

Gly Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Val Ala Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Ile Ile Phe Gly Val

20

<210> 28

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 28

Thr Ser Gly Ser

1

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 30

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 30

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 31

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 31

gg 2

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 32

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg

1 5 10 15

Ser Leu Asp

<210> 33

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 33

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

1 5 10

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 34

Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe

1 5 10

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头

<400> 35

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头

<400> 36

Glu Ala Ala Ala Arg

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头

<400> 37

Pro Ala Pro Ala Pro

1 5

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头

<400> 38

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 39

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头

<400> 39

Ile Leu Thr His Asp Ser Ser Ile Arg Tyr Leu Gln Glu Ile Tyr

1 5 10 15

Asn Ser Asn Asn Gln Lys Ile Val Asn Leu Lys Glu Lys Val Ala

20 25 30

Gln Leu Glu Ala Gln Cys Gln Glu Pro Cys Lys Asp Thr Val Gln

35 40 45

Ile His Asp Ile Thr Gly

50

<210> 40

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 40

Gly Gly Ser

1

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 41

Ser Leu Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser

20 25 30

<210> 42

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 42

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Gln

20

<210> 43

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 43

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln

20 25

<210> 44

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 44

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 45

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-OX40

<400> 45

Met Leu Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

1 5 10 15

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala

20 25 30

Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Ser Gly Ser Tyr Ala

35 40 45

Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro

50 55 60

Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly

65 70 75

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu

80 85 90

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

95 100 105

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp

110 115 120

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln

125 130 135

Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp

140 145 150

Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu

155 160 165

Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly

170 175 180

Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala

185 190 195

Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

200 205 210

Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

215 220 225

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe

230 235 240

Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

245 250 255

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr

260 265 270

Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile

275 280 285

Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

290 295

<210> 46

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL13W-OX40rev

<400> 46

Met Leu Gly Ile Lys Ala Leu Thr Ser His Ala Asp Ala Gln Glu

1 5 10 15

Glu Gln Ile Pro Thr Arg Phe Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys His

20 25 30

Ala Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Arg Thr Ser Gly Ser Trp Ala

35 40 45

Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys

50 55 60

Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala

65 70 75

Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu

80 85 90

Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly

95 100 105

Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

110 115 120

Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

125 130 135

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val

140 145 150

Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

155 160 165

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu

170 175 180

His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala

185 190 195

Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser

200 205 210

Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln

215 220 225

Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

230 235 240

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

245 250 255

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

260 265

<210> 47

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-NKp80

<400> 47

Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser Lys

1 5 10 15

Lys Arg Ser Ser Ala Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Ser Val Thr Leu His Trp Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro

35 40 45

Glu Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val

50 55 60

Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

65 70 75

Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser

80 85 90

Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg

95 100 105

Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

110 115 120

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu

125 130 135

Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala

140 145 150

Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys

155 160 165

Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln

170 175 180

Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val

185 190 195

Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

200 205 210

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

215 220 225

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu

230 235 240

Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg

245 250 255

Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly

260 265 270

Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro

275 280 285

Arg Ser Glu

<210> 48

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBLmincyto-NKp80

<400> 48

Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser Lys

1 5 10 15

Lys Arg Ser Ser Ala Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Ser Val Thr Leu His Trp Tyr Lys Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu

35 40 45

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala

50 55 60

Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala

65 70 75

Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

80 85 90

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu

95 100 105

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr

110 115 120

Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser

125 130 135

Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val

140 145 150

Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly

155 160 165

Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu

170 175 180

Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu

185 190 195

Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

200 205 210

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His

215 220 225

Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

230 235 240

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro

245 250 255

Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

260

<210> 49

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40L-41BB

<400> 49

Met Leu Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

1 5 10 15

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40 45

Thr Ser Gly Ser Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly

50 55 60

Asn Ala Ala Arg Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val

65 70 75

Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr

80 85 90

Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro

95 100 105

Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu

110 115 120

Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys

125 130 135

Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu

140 145 150

Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu

155 160 165

His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val

170 175 180

Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp

185 190 195

Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp

200 205 210

Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro

215 220 225

Gly Glu Phe Cys Val Leu

230

<210> 50

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40L-41BB

<400> 50

Met Leu Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

1 5 10 15

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40 45

Gly Gly Ser Ala Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly

50 55 60

Asn Ala Ala Arg Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val

65 70 75

Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr

80 85 90

Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro

95 100 105

Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu

110 115 120

Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys

125 130 135

Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu

140 145 150

Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu

155 160 165

His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val

170 175 180

Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp

185 190 195

Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp

200 205 210

Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro

215 220 225

Gly Glu Phe Cys Val Leu

230

<210> 51

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40L-41BBrev

<400> 51

Met Leu Gly Leu Glu Cys Gly Gly Glu Glu Glu Glu Pro Phe Arg

1 5 10 15

Cys Ser Cys Gly Asp Glu Glu Gln Thr Thr Gln Val Pro Arg Met

20 25 30

Phe Pro Gln Lys Phe Ile Tyr Leu Leu Lys Lys Arg Gly Arg Lys

35 40 45

Leu Gly Gly Ser Ala Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val

50 55 60

Gly Asn Ala Ala Arg Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu

65 70 75

Val Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr

80 85 90

Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr

95 100 105

Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys

110 115 120

Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met

125 130 135

Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr

140 145 150

Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser

155 160 165

Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys

170 175 180

Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys

185 190 195

Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp

200 205 210

Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

215 220 225

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

230

<210> 52

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86-OX40

<400> 52

Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val

1 5 10 15

Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala

20 25 30

Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser

35 40 45

Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln

50 55 60

Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe

65 70 75

Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser

80 85 90

Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys

95 100 105

Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met

110 115 120

Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

125 130 135

Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn

140 145 150

Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu

155 160 165

Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile

170 175 180

Glu Tyr Asp Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu

185 190 195

Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val

200 205 210

Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr

215 220 225

Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln

230 235 240

Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr

245 250 255

Val Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp

260 265 270

Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn

275 280 285

Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys

290 295 300

Ile His Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys

305 310 315

Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe Gly

320 325 330

Ser Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro

335 340 345

Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp

350 355 360

Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

365

<210> 53

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD86delP276-OX40

<400> 53

Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val

1 5 10 15

Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala

20 25 30

Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser

35 40 45

Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln

50 55 60

Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe

65 70 75

Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser

80 85 90

Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys

95 100 105

Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met

110 115 120

Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

125 130 135

Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn

140 145 150

Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu

155 160 165

Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile

170 175 180

Glu Tyr Asp Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu

185 190 195

Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val

200 205 210

Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr

215 220 225

Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln

230 235 240

Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr

245 250 255

Val Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp

260 265 270

Lys Lys Lys Lys Arg Pro Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp

275 280 285

Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln

290 295 300

Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

305 310

<210> 54

<211> 254

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 41BBL

<400> 54

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp

1 5 10 15

Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala

20 25 30

Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys

35 40 45

Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala

50 55 60

Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu

65 70 75

Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly

80 85 90

Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

95 100 105

Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

110 115 120

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val

125 130 135

Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

140 145 150

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu

155 160 165

His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala

170 175 180

Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser

185 190 195

Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln

200 205 210

Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

215 220 225

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 55

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-mincyto

<400> 55

Met Ser Lys Ser Thr Gly Ser Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys

20 25 30

Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro

50 55 60

Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

65 70 75

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

80 85 90

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr

95 100 105

Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr

110 115 120

Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu

125 130 135

Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg

140 145 150

Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro

155 160 165

Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly

170 175 180

Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

185 190 195

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly

200 205 210

Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

215 220 225

Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

230

<210> 56

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL13W

<400> 56

Met Glu Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser

20 25 30

Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg

35 40 45

Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

50 55 60

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu

65 70 75

Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala

80 85 90

Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys

95 100 105

Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln

110 115 120

Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val

125 130 135

Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

140 145 150

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

155 160 165

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu

170 175 180

Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg

185 190 195

Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly

200 205 210

Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro

215 220 225

Arg Ser Glu

<210> 57

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-OX40rev

<400> 57

Met Leu Gly Ile Lys Ala Leu Thr Ser His Ala Asp Ala Gln Glu

1 5 10 15

Glu Gln Ile Pro Thr Arg Phe Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys His

20 25 30

Ala Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Arg Thr Ser Gly Ser Tyr Ala

35 40 45

Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro

50 55 60

Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly

65 70 75

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu

80 85 90

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

95 100 105

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp

110 115 120

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln

125 130 135

Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp

140 145 150

Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu

155 160 165

Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly

170 175 180

Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala

185 190 195

Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

200 205 210

Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

215 220 225

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe

230 235 240

Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

245 250 255

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260 265 270

Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile

275 280 285

Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

290 295

<210> 58

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-rev 胞外-OX40tm-cyto

<400> 58

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His

1 5 10 15

Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu

20 25 30

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr

35 40 45

Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser

50 55 60

Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val

65 70 75

Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly

80 85 90

Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu

95 100 105

Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu

110 115 120

Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

125 130 135

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His

140 145 150

Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

155 160 165

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro

170 175 180

Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Arg Leu Asp Leu Leu Gly

185 190 195

Ala Pro Asp Asp Pro Ser Leu Glu Pro Gly Glu Arg Leu Arg Pro

200 205 210

Ser Ala Ala Ser Gly Pro Ser Ala Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu

215 220 225

Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu

230 235 240

Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp

245 250 255

Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln

260 265 270

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275 280

<210> 59

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBLmincyto-OX40

<400> 59

Met Leu Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

1 5 10 15

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala

20 25 30

Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Ser Gly Ser Trp Ala

35 40 45

Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys

50 55 60

Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala

65 70 75

Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu

80 85 90

Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly

95 100 105

Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

110 115 120

Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

125 130 135

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val

140 145 150

Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

155 160 165

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu

170 175 180

His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala

185 190 195

Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser

200 205 210

Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln

215 220 225

Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

230 235 240

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

245 250 255

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

260 265

<210> 60

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL13W-OX40rev

<400> 60

Met Glu Ile Lys Ala Leu Thr Ser His Ala Asp Ala Gln Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ile Pro Thr Arg Phe Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys His Ala

20 25 30

Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Arg Arg Leu Leu Trp Pro Pro Ala

35 40 45

Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala

50 55 60

Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

65 70 75

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly

80 85 90

Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro

95 100 105

Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala

110 115 120

Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser

125 130 135

Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly

140 145 150

Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala

155 160 165

Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val

170 175 180

Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

185 190 195

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val

200 205 210

Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

215 220 225

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly

230 235 240

Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu

245 250 255

Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu

260 265 270

Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

275 280

<210> 61

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-mincyto-OX40rev

<400> 61

Met Leu Gly Ile Lys Ala Leu Thr Ser His Ala Asp Ala Gln Glu

1 5 10 15

Glu Gln Ile Pro Thr Arg Phe Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys His

20 25 30

Ala Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Arg Thr Ser Gly Ser Trp Ala

35 40 45

Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys

50 55 60

Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala

65 70 75

Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu

80 85 90

Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly

95 100 105

Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

110 115 120

Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

125 130 135

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val

140 145 150

Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

155 160 165

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu

170 175 180

His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala

185 190 195

Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser

200 205 210

Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln

215 220 225

Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

230 235 240

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

245 250 255

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

260 265

<210> 62

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-OX40ENrev

<400> 62

Met Leu Gly Ile Lys Ala Leu Thr Ser His Ala Asp Ala Gln Glu

1 5 10 15

Glu Gln Ile Pro Thr Arg Phe Ser Gly Gly Gly Pro Pro Lys His

20 25 30

Ala Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Arg Arg Leu Leu Tyr Leu Ala

35 40 45

Thr Ser Gly Ser Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala

50 55 60

Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro

65 70 75

Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala

80 85 90

Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala

95 100 105

Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly

110 115 120

Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg

125 130 135

Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile

140 145 150

Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

155 160 165

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu

170 175 180

Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu

185 190 195

Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu

200 205 210

Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala

215 220 225

Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg

230 235 240

Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

245 250 255

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

260 265 270

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe

275 280 285

Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser

290 295 300

Glu

<210> 63

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-OX40EN

<400> 63

Met Leu Gly Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro

1 5 10 15

Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro

20 25 30

Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40 45

Thr Ser Gly Ser Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala

50 55 60

Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro

65 70 75

Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala

80 85 90

Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala

95 100 105

Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly

110 115 120

Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg

125 130 135

Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile

140 145 150

Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

155 160 165

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu

170 175 180

Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu

185 190 195

Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu

200 205 210

Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala

215 220 225

Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg

230 235 240

Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

245 250 255

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

260 265 270

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe

275 280 285

Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser

290 295 300

Glu

<210> 64

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBLmincyto-13alink-OX40

<400> 64

Met Leu Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

1 5 10 15

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala

20 25 30

Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Ser Leu Asn Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

50 55 60

Gly Ser Gly Gly Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu

65 70 75

Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp

80 85 90

Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro

95 100 105

Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly

110 115 120

Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln

125 130 135

Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro

140 145 150

Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

155 160 165

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

170 175 180

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser

185 190 195

Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala

200 205 210

Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala

215 220 225

Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu

230 235 240

Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr

245 250 255

Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr

260 265 270

Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu

275 280 285

Pro Ser Pro Arg Ser Glu

290

<210> 65

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40Lmincyto-41BBrev

<400> 65

Met Leu Gly Leu Glu Cys Gly Gly Glu Glu Glu Glu Pro Phe Arg

1 5 10 15

Cys Ser Cys Gly Asp Glu Glu Gln Thr Thr Gln Val Pro Arg Met

20 25 30

Phe Pro Gln Lys Phe Ile Tyr Leu Leu Lys Lys Arg Gly Arg Lys

35 40 45

Leu Gly Gly Ser Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu

50 55 60

Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser Ala

65 70 75

Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

80 85 90

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser

95 100 105

Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile

110 115 120

Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe

125 130 135

Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu

140 145 150

Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met

155 160 165

Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr

170 175 180

Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu

185 190 195

Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

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<211> 183

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> OX40L WT

<400> 66

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala

1 5 10 15

Arg Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val

20 25 30

Ile Gln Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu

35 40 45

His Phe Ser Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln

50 55 60

Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe

65 70 75

Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn

80 85 90

Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu

95 100 105

Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln

110 115 120

Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val

125 130 135

Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr

140 145 150

Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val

155 160 165

Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe

170 175 180

Cys Val Leu

<210> 67

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40Lmincyto-41BB

<400> 67

Met Leu Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

1 5 10 15

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40 45

Gly Gly Ser Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu Gly

50 55 60

Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu

65 70 75

Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln

80 85 90

Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

95 100 105

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile

110 115 120

Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser

125 130 135

Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro

140 145 150

Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val

155 160 165

Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr

170 175 180

Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu

185 190 195

Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

200 205

<210> 68

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> CD86 WT

<400> 68

Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val

1 5 10 15

Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala

20 25 30

Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser

35 40 45

Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln

50 55 60

Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe

65 70 75

Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser

80 85 90

Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys

95 100 105

Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met

110 115 120

Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

125 130 135

Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn

140 145 150

Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu

155 160 165

Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile

170 175 180

Glu Tyr Asp Gly Val Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu

185 190 195

Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val

200 205 210

Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr

215 220 225

Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln

230 235 240

Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr

245 250 255

Val Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp

260 265 270

Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn

275 280 285

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Gly Asp Lys Lys Asp Phe Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ala Lys Trp

260 265 270

Ser Ser Phe Pro Ser Glu Ala Thr Ser Ser Leu Ser Glu Glu His

275 280 285

Leu Ala Leu Ser Leu Phe Pro Asp Val Leu Glu Asn Lys Tyr Gly

290 295 300

Tyr Ser Leu Cys Leu Leu Glu Arg Asp Val Ala Pro Gly Gly Val

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Tyr Ala Glu Asp Ile Val Ser Ile Ile Lys Arg Ser Arg Arg Gly

320 325 330

Ile Phe Ile Leu Ser Pro Asn Tyr Val Asn Gly Pro Ser Ile Phe

335 340 345

Glu Leu Gln Ala Ala Val Asn Leu Ala Leu Asp Asp Gln Thr Leu

350 355 360

Lys Leu Ile Leu Ile Lys Phe Cys Tyr Phe Gln Glu Pro Glu Ser

365 370 375

Leu Pro His Leu Val Lys Lys Ala Leu Arg Val Leu Pro Thr Val

380 385 390

Thr Trp Arg Gly Leu Lys Ser Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Trp

395 400 405

Ala Lys Met Arg Tyr His Met Pro Val Lys Asn Ser Gln Gly Phe

410 415 420

Thr Trp Asn Gln Leu Arg Ile Thr Ser Arg Ile Phe Gln Trp Lys

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Gly Leu Ser Arg Thr Glu Thr Thr Gly Arg Ser Ser Gln Pro Lys

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Glu Trp

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 79

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Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

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35 40 45

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<213> 人工序列

<220>

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1 5 10 15

Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly

20 25 30

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35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

50 55 60

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65 70 75

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80 85 90

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

95 100 105

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110 115 120

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125 130 135

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<213> 人工序列

<220>

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Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu

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Phe Gly

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VG9 cl5

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1 5 10 15

Phe

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<211> 135

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD cl3

<400> 88

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

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<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

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<212> PRT

<213> 智人

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125 130 135

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

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Thr

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<211> 14

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

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<400> 99

Cys Ala Leu Gly Glu Leu Arg Tyr Trp Gly Ile Val Asp Lys Leu

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Ile Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VD1 Zi11

<400> 100

Cys Ala Leu Gly Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ser Phe Leu Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Gly Asp Thr Thr Asp Lys Leu Ile Phe

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 101

Cys Ala Thr Trp Asp Gly Phe Tyr Tyr Lys Lys Leu Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VD5 E57

<400> 102

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1 5 10 15

Leu Ile Phe

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD E113

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

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<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG F4

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Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile

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<211> 146

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD Zi11

<400> 107

Met Val Phe Ser Ser Leu Leu Cys Val Phe Val Ala Phe Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Gly Ser Ser Val Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser

20 25 30

Val Ser Met Pro Val Arg Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr

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<210> 108

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG Zi11

<400> 108

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<212> PRT

<213> 智人

<220>

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Pro Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val

20 25 30

Lys Gln Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75

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80 85 90

Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro

95 100 105

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110 115 120

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Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg

140

<210> 110

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG D37

<400> 110

Met Val Leu Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ala Phe Leu Pro Pro Ala

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Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr

20 25 30

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110 115 120

Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr

125 130

<210> 111

<211> 144

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD E57

<400> 111

Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln

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Pro Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val

20 25 30

Lys Gln Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser

35 40 45

Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu

50 55 60

Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser

65 70 75

Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val

80 85 90

Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro

95 100 105

Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Ser

110 115 120

Pro Ile Arg Gly Tyr Thr Gly Ser Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys

125 130 135

Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg

140

<210> 112

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG E57

<400> 112

Met Glu Trp Ala Leu Ala Val Leu Leu Ala Phe Leu Ser Pro Ala

1 5 10 15

Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile

20 25 30

Arg Gln Thr Gly Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Ser Thr Gly Tyr Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Gln Arg Leu Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val

65 70 75

Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly

80 85 90

Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu

95 100 105

Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Gly Phe Tyr

110 115 120

Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr

125 130

<210> 113

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VG8 D37

<400> 113

Cys Ala Thr Trp Asp Asn Tyr Met Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 114

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VD3 F2

<400> 114

Cys Ala Ser Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Asp Thr Pro Gly Arg

1 5 10 15

Val Arg Asp Trp Lys Leu Ile Phe

20

<210> 115

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VG4 F2

<400> 115

Cys Ala Thr Trp Asp Gly Pro Pro Tyr Tyr Lys Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 116

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VD1 Ze11

<400> 116

Cys Ala Leu Gly Asp Tyr Leu Gly Asp Lys Tyr Pro Ser Tyr Asp

1 5 10 15

Leu Leu Gly Asp Thr Thr Asp Lys Leu Ile Phe

20 25

<210> 117

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VG8 Ze11

<400> 117

Cys Ala Thr Trp Asp Asn Tyr Lys Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 118

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VD5 B23

<400> 118

Cys Ala Ala Ser Ser Pro Ile Arg Gly Tyr Thr Gly Ser Asp Lys

1 5 10 15

Leu Ile Phe

<210> 119

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VG8 B23

<400> 119

Cys Ala Thr Trp Asp Asn Tyr Lys Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 120

<211> 144

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD F2

<400> 120

Met Ile Leu Thr Val Gly Phe Ser Phe Leu Phe Phe Tyr Arg Gly

1 5 10 15

Thr Leu Cys Asp Lys Val Thr Gln Ser Ser Pro Asp Gln Thr Val

20 25 30

Ala Ser Gly Ser Glu Val Val Leu Leu Cys Thr Tyr Asp Thr Val

35 40 45

Tyr Ser Asn Pro Asp Leu Phe Trp Tyr Arg Ile Arg Pro Asp Tyr

50 55 60

Ser Phe Gln Phe Val Phe Tyr Gly Asp Asn Ser Arg Ser Glu Gly

65 70 75

Ala Asp Phe Thr Gln Gly Arg Phe Ser Val Lys His Ile Leu Thr

80 85 90

Gln Lys Ala Phe His Leu Val Ile Ser Pro Val Arg Thr Glu Asp

95 100 105

Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly

110 115 120

Asp Thr Pro Gly Arg Val Arg Asp Trp Lys Leu Ile Phe Gly Lys

125 130 135

Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg

140

<210> 121

<211> 135

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG F2

<400> 121

Met Glu Trp Ala Leu Ala Val Leu Leu Ala Phe Leu Ser Pro Ala

1 5 10 15

Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile

20 25 30

Arg Gln Thr Gly Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Ser Thr Gly Tyr Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Gln Arg Leu Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val

65 70 75

Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly

80 85 90

Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu

95 100 105

Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Gly Pro Pro

110 115 120

Tyr Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr

125 130 135

<210> 122

<211> 147

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD Ze11

<400> 122

Met Val Phe Ser Ser Leu Leu Cys Val Phe Val Ala Phe Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Gly Ser Ser Val Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser

20 25 30

Val Ser Met Pro Val Arg Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr

35 40 45

Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu

50 55 60

Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu

65 70 75

Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala

80 85 90

Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp

95 100 105

Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Asp Tyr Leu Gly Asp Lys

110 115 120

Tyr Pro Ser Tyr Asp Leu Leu Gly Asp Thr Thr Asp Lys Leu Ile

125 130 135

Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg

140 145

<210> 123

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG Ze11

<400> 123

Met Val Leu Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ala Phe Leu Pro Pro Ala

1 5 10 15

Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr

20 25 30

Arg Pro Thr Gly Ser Ser Ala Val Ile Thr Cys Asp Leu Pro Val

35 40 45

Glu Asn Ala Val Tyr Thr His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Gln Arg Leu Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Asn Ser Arg Val

65 70 75

Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser Arg Glu Lys Tyr His Thr Tyr Ala

80 85 90

Ser Thr Gly Lys Ser Leu Lys Phe Ile Leu Glu Asn Leu Ile Glu

95 100 105

Arg Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asn Tyr Lys

110 115 120

Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr

125 130

<210> 124

<211> 144

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD B23

<400> 124

Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val

20 25 30

Lys Gln Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser

35 40 45

Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu

50 55 60

Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser

65 70 75

Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val

80 85 90

Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro

95 100 105

Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Ser

110 115 120

Pro Ile Arg Gly Tyr Thr Gly Ser Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys

125 130 135

Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg

140

<210> 125

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG B23

<400> 125

Met Val Leu Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ala Phe Leu Pro Pro Ala

1 5 10 15

Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr

20 25 30

Arg Pro Thr Gly Ser Ser Ala Val Ile Thr Cys Asp Leu Pro Val

35 40 45

Glu Asn Ala Val Tyr Thr His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Gln Arg Leu Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Asn Ser Arg Val

65 70 75

Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser Arg Glu Lys Tyr His Thr Tyr Ala

80 85 90

Ser Thr Gly Lys Ser Leu Lys Phe Ile Leu Glu Asn Leu Ile Glu

95 100 105

Arg Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asn Tyr Lys

110 115 120

Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr

125 130

<210> 126

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VD1 B9

<400> 126

Cys Ala Leu Gly Asn Gly Asn His Ile Gly Tyr Trp Arg Tyr Thr

1 5 10 15

Asp Lys Leu Ile Phe

20

<210> 127

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VG5 B9

<400> 127

Cys Ala Thr Trp Asp Arg Leu Tyr Tyr Lys Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 128

<211> 141

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD B9

<400> 128

Met Val Phe Ser Ser Leu Leu Cys Val Phe Val Ala Phe Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Gly Ser Ser Val Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser

20 25 30

Val Ser Met Pro Val Arg Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr

35 40 45

Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu

50 55 60

Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu

65 70 75

Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala

80 85 90

Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp

95 100 105

Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Asn Gly Asn His Ile Gly

110 115 120

Tyr Trp Arg Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg

125 130 135

Val Thr Val Glu Pro Arg

140

<210> 129

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG B9

<400> 129

Met Val Trp Ala Leu Leu Val Leu Leu Ala Phe Leu Ser Pro Ala

1 5 10 15

Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Gly Thr Lys Ser Val Thr

20 25 30

Arg Pro Thr Arg Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Thr Val

35 40 45

Ile Asn Ala Phe Tyr Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Gln Arg Leu Leu Tyr Tyr Asp Val Ser Asn Ser Lys Asp

65 70 75

Val Leu Glu Ser Gly Leu Ser Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr His Thr

80 85 90

Pro Arg Arg Trp Ser Trp Ile Leu Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu

95 100 105

Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Arg Leu Tyr

110 115 120

Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr

125 130

<210> 130

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VG8 An2

<400> 130

Cys Ala Thr Trp Asp Ser Ser Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 131

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VD3 An2

<400> 131

Cys Ala Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Ser His Ala Asp Lys Leu

1 5 10 15

Ile Phe

<210> 132

<211> 131

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRG An2

<400> 132

Met Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ala Phe Leu Pro Pro Ala

1 5 10 15

Ser Gln Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr

20 25 30

Arg Pro Thr Gly Ser Ser Ala Val Ile Thr Cys Asp Leu Pro Val

35 40 45

Glu Asn Ala Val Tyr Thr His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Gln Arg Leu Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Asn Ser Arg Val

65 70 75

Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser Arg Glu Lys Tyr His Thr Tyr Ala

80 85 90

Ser Thr Gly Lys Ser Leu Lys Phe Ile Leu Glu Asn Leu Ile Glu

95 100 105

Arg Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ser Ser Lys

110 115 120

Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr

125 130

<210> 133

<211> 138

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRD An2

<400> 133

Met Ile Leu Thr Val Gly Phe Ser Phe Leu Phe Phe Tyr Arg Gly

1 5 10 15

Thr Leu Cys Asp Lys Val Thr Gln Ser Ser Pro Asp Gln Thr Val

20 25 30

Ala Ser Gly Ser Glu Val Val Leu Leu Cys Thr Tyr Asp Thr Val

35 40 45

Tyr Ser Asn Pro Asp Leu Phe Trp Tyr Arg Ile Arg Pro Asp Tyr

50 55 60

Ser Phe Gln Phe Val Phe Tyr Gly Asp Asn Ser Arg Ser Glu Gly

65 70 75

Ala Asp Phe Thr Gln Gly Arg Phe Ser Val Lys His Ile Leu Thr

80 85 90

Gln Lys Ala Phe His Leu Val Ile Ser Pro Val Arg Thr Glu Asp

95 100 105

Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Ser

110 115 120

His Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val

125 130 135

Glu Pro Arg

<210> 134

<211> 153

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRDC

<400> 134

Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly

1 5 10 15

Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

20 25 30

Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro

35 40 45

Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu

50 55 60

Gly Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His

65 70 75

Asp Asn Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp

80 85 90

Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln

95 100 105

Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu

110 115 120

Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu

125 130 135

Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu

140 145 150

Phe Phe Leu

<210> 135

<211> 173

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRGC1

<400> 135

Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe

1 5 10 15

Leu Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His

35 40 45

Trp Gln Glu Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly

50 55 60

Asn Thr Met Lys Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu

65 70 75

Thr Val Pro Glu Lys Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val

80 85 90

Arg His Glu Asn Asn Lys Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe

95 100 105

Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn

110 115 120

Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn

125 130 135

Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val

140 145 150

Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala

155 160 165

Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

170

<210> 136

<211> 189

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> TRGC2

<400> 136

Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe

1 5 10 15

Leu Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Ile Ile Lys Ile His

35 40 45

Trp Gln Glu Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly

50 55 60

Asn Thr Met Lys Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu

65 70 75

Thr Val Pro Glu Glu Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val

80 85 90

Arg His Glu Asn Asn Lys Asn Gly Ile Asp Gln Glu Ile Ile Phe

95 100 105

Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Thr Thr Val Asp Pro Lys Tyr Asn

110 115 120

Tyr Ser Lys Asp Ala Asn Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp

125 130 135

Asn Trp Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr

140 145 150

Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser

155 160 165

Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr

170 175 180

Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

185

<210> 137

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL -41BB

<400> 137

Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser

1 5 10 15

Leu Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly

20 25 30

Ser Asp Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe

35 40 45

Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys

50 55 60

Thr Val Val Thr Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn

65 70 75

Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly

80 85 90

Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro

95 100 105

Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu

110 115 120

Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His Val Ala

125 130 135

Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro His Ser Pro Ser

140 145 150

Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn Gly Tyr Pro

155 160 165

Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu Leu

170 175 180

Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg Gly

185 190 195

Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser

200 205 210

Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn

215 220 225

Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp

230 235 240

Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala

245 250 255

Thr Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala

260 265 270

Val Ala Ile Gly Trp Val Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

275 280 285

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

290 295 300

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

305 310 315

Gly Cys Glu Leu

<210> 138

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL 胞外 + tm

<400> 138

Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser

1 5 10 15

Leu Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly

20 25 30

Ser Asp Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe

35 40 45

Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys

50 55 60

Thr Val Val Thr Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn

65 70 75

Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly

80 85 90

Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro

95 100 105

Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu

110 115 120

Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His Val Ala

125 130 135

Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro His Ser Pro Ser

140 145 150

Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn Gly Tyr Pro

155 160 165

Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu Leu

170 175 180

Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg Gly

185 190 195

Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser

200 205 210

Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn

215 220 225

Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp

230 235 240

Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala

245 250 255

Thr Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala

260 265 270

Val Ala Ile Gly Trp Val Cys

275

<210> 139

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOSL 胞外

<400> 139

Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser

1 5 10 15

Leu Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly

20 25 30

Ser Asp Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe

35 40 45

Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys

50 55 60

Thr Val Val Thr Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn

65 70 75

Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly

80 85 90

Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro

95 100 105

Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu

110 115 120

Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His Val Ala

125 130 135

Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro His Ser Pro Ser

140 145 150

Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser Ile Asn Gly Tyr Pro

155 160 165

Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu Leu

170 175 180

Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg Gly

185 190 195

Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser

200 205 210

Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn

215 220 225

Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp

230 235 240

Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala

245 250 255

Thr

<210> 140

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 45（41BBL-OX40）的序列

<400> 140

atgctggggc gcgaccagag gctgccacct gacgcacaca agccacctgg 50

tgggggctca tttcgaactc ccatccagga agagcaggcc gacgcacaca 100

gtacccttgc caaaatcact agtggaagtt atgccagtga cgcatctctc 150

gatcccgaag ccccttggcc accggcgcca agagctagag cttgcagagt 200

gttgccttgg gctttggtgg ccggactgct gctcctgctg ctgctggctg 250

ctgcctgtgc cgtgtttctc gcatgtcctt gggctgtgtc cggtgcaaga 300

gcctctcctg gatctgccgc gagtccgcgc ctgcgagagg gaccagaatt 350

gtcaccggat gaccctgcag gccttctcga tctcaggcaa ggaatgtttg 400

cgcagctggt ggcacaaaac gtgttgctta tagacggacc acttagctgg 450

tattctgatc ccggcctggc cggggtttca ttgaccggcg gcctttccta 500

caaggaagat accaaggaac tggtggtcgc caaggccgga gtatactatg 550

ttttcttcca attggagttg cggcgcgtcg tggcagggga agggagcggt 600

tctgtctctt tggctctcca cctgcaaccc ttgagatccg cggctggagc 650

tgcagctttg gcgctcactg ttgacctgcc acctgcaagt tccgaggctc 700

ggaactcagc gttcgggttt caaggcagac tgctgcacct gagcgccggg 750

caaagacttg gtgtacactt gcacactgag gctagagccc gccacgcttg 800

gcaactcaca caaggggcta cagtgcttgg cctgttccga gtaacgcccg 850

aaattccagc gggcctgcca agtcctagat ctgaa 885

<210> 141

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 46（41BBL13W-OX40rev）的序列

<400> 141

atggaaatca aggctctaac cagccacgcg gacgctcagg aagaacaaat 50

tcccacccgc tttagtggtg gggggccacc taaacatgct gatcctccat 100

tgcgacagga taggaggctg ctgtggccac cggcgccaag agctagagct 150

tgcagagtgt tgccttgggc tttggtggcc ggactgctgc tcctgctgct 200

gctggctgct gcctgtgccg tgtttctcgc atgtccttgg gctgtgtccg 250

gtgcaagagc ctctcctgga tctgccgcga gtccgcgcct gcgagaggga 300

ccagaattgt caccggatga ccctgcaggc cttctcgatc tcaggcaagg 350

aatgtttgcg cagctggtgg cacaaaacgt gttgcttata gacggaccac 400

ttagctggta ttctgatccc ggcctggccg gggtttcatt gaccggcggc 450

ctttcctaca aggaagatac caaggaactg gtggtcgcca aggccggagt 500

atactatgtt ttcttccaat tggagttgcg gcgcgtcgtg gcaggggaag 550

ggagcggttc tgtctctttg gctctccacc tgcaaccctt gagatccgcg 600

gctggagctg cagctttggc gctcactgtt gacctgccac ctgcaagttc 650

cgaggctcgg aactcagcgt tcgggtttca aggcagactg ctgcacctga 700

gcgccgggca aagacttggt gtacacttgc acactgaggc tagagcccgc 750

cacgcttggc aactcacaca aggggctaca gtgcttggcc tgttccgagt 800

aacgcccgaa attccagcgg gcctgccaag tcctagatct gaa 843

<210> 142

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 47（41BBL-NKp80）的序列

<400> 142

atgcaggacg aggacgggta tatgactctc aacgttcaga gcaagaagag 50

gtcttccgct cagacgagtc agctgacctt taaagactat agcgttacac 100

tccattggta tgccagtgac gcatctctcg atcccgaagc cccttggcca 150

ccggcgccaa gagctagagc ttgcagagtg ttgccttggg ctttggtggc 200

cggactgctg ctcctgctgc tgctggctgc tgcctgtgcc gtgtttctcg 250

catgtccttg ggctgtgtcc ggtgcaagag cctctcctgg atctgccgcg 300

agtccgcgcc tgcgagaggg accagaattg tcaccggatg accctgcagg 350

ccttctcgat ctcaggcaag gaatgtttgc gcagctggtg gcacaaaacg 400

tgttgcttat agacggacca cttagctggt attctgatcc cggcctggcc 450

ggggtttcat tgaccggcgg cctttcctac aaggaagata ccaaggaact 500

ggtggtcgcc aaggccggag tatactatgt tttcttccaa ttggagttgc 550

ggcgcgtcgt ggcaggggaa gggagcggtt ctgtctcttt ggctctccac 600

ctgcaaccct tgagatccgc ggctggagct gcagctttgg cgctcactgt 650

tgacctgcca cctgcaagtt ccgaggctcg gaactcagcg ttcgggtttc 700

aaggcagact gctgcacctg agcgccgggc aaagacttgg tgtacacttg 750

cacactgagg ctagagcccg ccacgcttgg caactcacac aaggggctac 800

agtgcttggc ctgttccgag taacgcccga aattccagcg ggcctgccaa 850

gtcctagatc tgaa 864

<210> 143

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 48（41BBLmincyto-NKp80）的序列

<400> 143

atgcaggacg aggacgggta tatgactctc aacgttcaga gcaagaagag 50

gtcttccgct cagacgagtc agctgacctt taaagactat agcgttacac 100

tccattggta caaatgggct ttggtggccg gactgctgct cctgctgctg 150

ctggctgctg cctgtgccgt gtttctcgca tgtccttggg ctgtgtccgg 200

tgcaagagcc tctcctggat ctgccgcgag tccgcgcctg cgagagggac 250

cagaattgtc accggatgac cctgcaggcc ttctcgatct caggcaagga 300

atgtttgcgc agctggtggc acaaaacgtg ttgcttatag acggaccact 350

tagctggtat tctgatcccg gcctggccgg ggtttcattg accggcggcc 400

tttcctacaa ggaagatacc aaggaactgg tggtcgccaa ggccggagta 450

tactatgttt tcttccaatt ggagttgcgg cgcgtcgtgg caggggaagg 500

gagcggttct gtctctttgg ctctccacct gcaacccttg agatccgcgg 550

ctggagctgc agctttggcg ctcactgttg acctgccacc tgcaagttcc 600

gaggctcgga actcagcgtt cgggtttcaa ggcagactgc tgcacctgag 650

cgccgggcaa agacttggtg tacacttgca cactgaggct agagcccgcc 700

acgcttggca actcacacaa ggggctacag tgcttggcct gttccgagta 750

acgcccgaaa ttccagcggg cctgccaagt cctagatctg aa 792

<210> 144

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 50（OX40L-41BB）的序列

<400> 144

atgctgggga agcggggcag aaagaaactg ctgtacatct ttaagcagcc 50

cttcatgcgg cccgtgcaga ccacccagga agaggacggc tgctcctgca 100

gattccccga ggaagaagaa ggcggctgcg agctgggagg cagcgctgag 150

cgtgttcagc cactggagga aaatgtcggc aacgccgcca ggcctcgatt 200

cgagcgtaac aaactgctcc ttgttgctag tgtgattcag gggctgggac 250

tgttgttgtg cttcacatac atttgtctcc acttttctgc attgcaggtc 300

agccataggt atccccgcat tcagtctatc aaagtgcaat tcactgagta 350

caagaaggag aaaggcttta ttttaactag tcaaaaggaa gacgagataa 400

tgaaggtgca gaacaacagc gttattatca attgcgacgg gttctattta 450

atctctctga aagggtactt ctcacaggag gttaacatta gtttacatta 500

tcaaaaggac gaggaaccct tgttccagct gaaaaaagtg cggtctgtta 550

attcccttat ggtggcgagt cttacataca aggacaaggt gtatctcaac 600

gtgacaacgg acaatacctc tctggacgat tttcacgtta acggcgggga 650

gcttatactt atccatcaaa acccaggaga attttgcgtc ctt 693

<210> 145

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 51（OX40L-41BBrev）的序列

<400> 145

atgctggggc tggagtgcgg cggcgaggag gaggagccct tcaggtgcag 50

ctgcggcgac gaggagcaga ccacccaggt gcccaggatg ttcccccaga 100

agttcatcta cctgctgaag aagaggggca ggaagctggg aggcagcgct 150

gagcgtgttc agccactgga ggaaaatgtc ggcaacgccg ccaggcctcg 200

attcgagcgt aacaaactgc tccttgttgc tagtgtgatt caggggctgg 250

gactgttgtt gtgcttcaca tacatttgtc tccacttttc tgcattgcag 300

gtcagccata ggtatccccg cattcagtct atcaaagtgc aattcactga 350

gtacaagaag gagaaaggct ttattttaac tagtcaaaag gaagacgaga 400

taatgaaggt gcagaacaac agcgttatta tcaattgcga cgggttctat 450

ttaatctctc tgaaagggta cttctcacag gaggttaaca ttagtttaca 500

ttatcaaaag gacgaggaac ccttgttcca gctgaaaaaa gtgcggtctg 550

ttaattccct tatggtggcg agtcttacat acaaggacaa ggtgtatctc 600

aacgtgacaa cggacaatac ctctctggac gattttcacg ttaacggcgg 650

ggagcttata cttatccatc aaaacccagg agaattttgc gtcctt 696

<210> 146

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 52（CD86-OX40）的序列

<400> 146

atggaccctc agtgtaccat gggcctgagc aacatcctgt tcgtgatggc 50

ctttctgctg agcggagccg ctcctctgaa gatccaggcc tacttcaacg 100

agacagccga cctgccttgc cagttcgcca acagccagaa tcagagcctg 150

agcgagctgg tggtgttctg gcaggaccaa gagaacctgg tgctgaacga 200

ggtgtacctg ggcaaagaaa agttcgacag cgtgcacagc aagtacatgg 250

gcagaaccag cttcgactcc gacagctgga cactgagact gcacaacctg 300

cagatcaagg acaagggcct gtaccagtgc atcatccacc acaagaaacc 350

caccggcatg atcagaatcc accagatgaa cagcgagctg agcgtgctgg 400

ccaacttcag ccagcctgag atcgtgccca tcagcaacat caccgagaac 450

gtgtacatca acctgacctg cagcagcatc cacggctacc ccgagcctaa 500

gaaaatgtcc gtgctgctgc ggaccaagaa cagcaccatc gagtacgacg 550

gcgtgatgca gaaaagccag gacaacgtga ccgagctgta cgacgtgtcc 600

atcagcctgt ccgtgtcatt ccccgacgtg accagcaata tgaccatctt 650

ctgcatcctg gaaaccgaca agacccggct gctgtctagc cccttcagca 700

tagagctgga agatccccag cctcctcctg atcacatccc ttggattacc 750

gccgtgctgc ccaccgtgat catctgcgtg atggtgtttt gcctgatcct 800

gtggaagtgg aagaagaaga aacggcctcg gaacagctac aagtgcggca 850

ccaacaccat ggaacgggaa gagagcgagc agaccaagaa gagagagaag 900

attcacatcc ccgagcggag cgacgaagcc cagagagtgt ttaagagcag 950

caagaccagc agctgcgaca agagcgatac ctgcttcgga tcagggcggg 1000

atcagcgcct gcctccagat gcacataaac cccccggcgg cgggtctttt 1050

agaacaccaa tacaagagga acaagctgac gcccacagta ccctcgcaaa 1100

aatt 1104

<210> 147

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 53（CD86delP276-OX40）的序列

<400> 147

atggaccctc agtgtaccat gggcctgagc aacatcctgt tcgtgatggc 50

ctttctgctg agcggagccg ctcctctgaa gatccaggcc tacttcaacg 100

agacagccga cctgccttgc cagttcgcca acagccagaa tcagagcctg 150

agcgagctgg tggtgttctg gcaggaccaa gagaacctgg tgctgaacga 200

ggtgtacctg ggcaaagaaa agttcgacag cgtgcacagc aagtacatgg 250

gcagaaccag cttcgactcc gacagctgga cactgagact gcacaacctg 300

cagatcaagg acaagggcct gtaccagtgc atcatccacc acaagaaacc 350

caccggcatg atcagaatcc accagatgaa cagcgagctg agcgtgctgg 400

ccaacttcag ccagcctgag atcgtgccca tcagcaacat caccgagaac 450

gtgtacatca acctgacctg cagcagcatc cacggctacc ccgagcctaa 500

gaaaatgtcc gtgctgctgc ggaccaagaa cagcaccatc gagtacgacg 550

gcgtgatgca gaaaagccag gacaacgtga ccgagctgta cgacgtgtcc 600

atcagcctgt ccgtgtcatt ccccgacgtg accagcaata tgaccatctt 650

ctgcatcctg gaaaccgaca agacccggct gctgtctagc cccttcagca 700

tagagctgga agatccccag cctcctcctg atcacatccc ttggattacc 750

gccgtgctgc ccaccgtgat catctgcgtg atggtgtttt gcctgatcct 800

gtggaagtgg aagaagaaga aacggcctgg gcgggatcag cgcctgcctc 850

cagatgcaca taaacccccc ggcggcgggt cttttagaac accaatacaa 900

gaggaacaag ctgacgccca cagtaccctc gcaaaaatt 939

<210> 148

<211> 762

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 54（41BBL）的序列

<400> 148

atggaatatg ccagtgacgc atctctcgat cccgaagccc cttggccacc 50

ggcgccaaga gctagagctt gcagagtgtt gccttgggct ttggtggccg 100

gactgctgct cctgctgctg ctggctgctg cctgtgccgt gtttctcgca 150

tgtccttggg ctgtgtccgg tgcaagagcc tctcctggat ctgccgcgag 200

tccgcgcctg cgagagggac cagaattgtc accggatgac cctgcaggcc 250

ttctcgatct caggcaagga atgtttgcgc agctggtggc acaaaacgtg 300

ttgcttatag acggaccact tagctggtat tctgatcccg gcctggccgg 350

ggtttcattg accggcggcc tttcctacaa ggaagatacc aaggaactgg 400

tggtcgccaa ggccggagta tactatgttt tcttccaatt ggagttgcgg 450

cgcgtcgtgg caggggaagg gagcggttct gtctctttgg ctctccacct 500

gcaacccttg agatccgcgg ctggagctgc agctttggcg ctcactgttg 550

acctgccacc tgcaagttcc gaggctcgga actcagcgtt cgggtttcaa 600

ggcagactgc tgcacctgag cgccgggcaa agacttggtg tacacttgca 650

cactgaggct agagcccgcc acgcttggca actcacacaa ggggctacag 700

tgcttggcct gttccgagta acgcccgaaa ttccagcggg cctgccaagt 750

cctagatctg aa 762

<210> 149

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 55（41BBLmincyto）的序列

<400> 149

atgtcaaaga gcacgggcag ctgggctttg gtggccggac tgctgctcct 50

gctgctgctg gctgctgcct gtgccgtgtt tctcgcatgt ccttgggctg 100

tgtccggtgc aagagcctct cctggatctg ccgcgagtcc gcgcctgcga 150

gagggaccag aattgtcacc ggatgaccct gcaggccttc tcgatctcag 200

gcaaggaatg tttgcgcagc tggtggcaca aaacgtgttg cttatagacg 250

gaccacttag ctggtattct gatcccggcc tggccggggt ttcattgacc 300

ggcggccttt cctacaagga agataccaag gaactggtgg tcgccaaggc 350

cggagtatac tatgttttct tccaattgga gttgcggcgc gtcgtggcag 400

gggaagggag cggttctgtc tctttggctc tccacctgca acccttgaga 450

tccgcggctg gagctgcagc tttggcgctc actgttgacc tgccacctgc 500

aagttccgag gctcggaact cagcgttcgg gtttcaaggc agactgctgc 550

acctgagcgc cgggcaaaga cttggtgtac acttgcacac tgaggctaga 600

gcccgccacg cttggcaact cacacaaggg gctacagtgc ttggcctgtt 650

ccgagtaacg cccgaaattc cagcgggcct gccaagtcct agatctgaa 699

<210> 150

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 57（41BBL-OX40rev）的序列

<400> 150

atgctgggga tcaaggctct aaccagccac gcggacgctc aggaagaaca 50

aattcccacc cgctttagtg gtggggggcc acctaaacat gctgatcctc 100

cattgcgaca ggataggact agtggaagtt atgccagtga cgcatctctc 150

gatcccgaag ccccttggcc accggcgcca agagctagag cttgcagagt 200

gttgccttgg gctttggtgg ccggactgct gctcctgctg ctgctggctg 250

ctgcctgtgc cgtgtttctc gcatgtcctt gggctgtgtc cggtgcaaga 300

gcctctcctg gatctgccgc gagtccgcgc ctgcgagagg gaccagaatt 350

gtcaccggat gaccctgcag gccttctcga tctcaggcaa ggaatgtttg 400

cgcagctggt ggcacaaaac gtgttgctta tagacggacc acttagctgg 450

tattctgatc ccggcctggc cggggtttca ttgaccggcg gcctttccta 500

caaggaagat accaaggaac tggtggtcgc caaggccgga gtatactatg 550

ttttcttcca attggagttg cggcgcgtcg tggcagggga agggagcggt 600

tctgtctctt tggctctcca cctgcaaccc ttgagatccg cggctggagc 650

tgcagctttg gcgctcactg ttgacctgcc acctgcaagt tccgaggctc 700

ggaactcagc gttcgggttt caaggcagac tgctgcacct gagcgccggg 750

caaagacttg gtgtacactt gcacactgag gctagagccc gccacgcttg 800

gcaactcaca caaggggcta cagtgcttgg cctgttccga gtaacgcccg 850

aaattccagc gggcctgcca agtcctagat ctgaa 885

<210> 151

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 58（41BBL-rev 胞外-OX40tm-cyto）的序列

<400> 151

atgctgctgt tggtcacctc cttgttactc tgcgagcttc cacatcccgc 50

tttcctctta attcccgacc agggcatgtt tgcgcagctc gtcgcccaga 100

atgtcctcct aatagatggc ccactatcct ggtacagtga tccaggcctg 150

gccggggtgt ctcttacggg aggcctgagc tataaggaag acaccaaaga 200

gttggtggtc gcgaaggccg gagtgtatta tgtttttttt caacttgagc 250

tgcgacgtgt ggtcgccgga gaaggctcgg gatctgtttc actcgctctt 300

cacctgcaac cactgcggtc cgccgcgggg gctgccgctc tcgccctaac 350

cgtggatctg cctcccgcct cttccgaagc acgcaattct gcttttggat 400

ttcagggtag gctactgcat ctgtccgcag gccaacggtt aggtgtgcat 450

ctgcatacag aagcccgggc tcggcacgcc tggcaactaa cacagggagc 500

taccgtgctg ggtctgttta gagtgacacc tgaaatccct gccgggttac 550

caagccctag gtccgagcgc ttggacctgc tgggagcacc agatgatcct 600

agcttggagc ccggggagag acttcgccca agtgccgcta gcggcccctc 650

tgctagggct gttgctgcca tcctaggact gggtcttgtt ctcggcctgc 700

tgggcccgtt ggccattctg cttgccctgt acctgctaag aagagatcaa 750

agactgcctc ccgatgccca caagcctcca ggaggagggt cattcagaac 800

ccccatccag gaagaacagg cagacgctca ctctacgctc gcgaagatc 849

<210> 152

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 59（41BBLmincyto-OX40）的序列

<400> 152

atgctggggc gcgaccagag gctgccacct gacgcacaca agccacctgg 50

tgggggctca tttcgaactc ccatccagga agagcaggcc gacgcacaca 100

gtacccttgc caaaatcact agtggaagtt gggctttggt ggccggactg 150

ctgctcctgc tgctgctggc tgctgcctgt gccgtgtttc tcgcatgtcc 200

ttgggctgtg tccggtgcaa gagcctctcc tggatctgcc gcgagtccgc 250

gcctgcgaga gggaccagaa ttgtcaccgg atgaccctgc aggccttctc 300

gatctcaggc aaggaatgtt tgcgcagctg gtggcacaaa acgtgttgct 350

tatagacgga ccacttagct ggtattctga tcccggcctg gccggggttt 400

cattgaccgg cggcctttcc tacaaggaag ataccaagga actggtggtc 450

gccaaggccg gagtatacta tgttttcttc caattggagt tgcggcgcgt 500

cgtggcaggg gaagggagcg gttctgtctc tttggctctc cacctgcaac 550

ccttgagatc cgcggctgga gctgcagctt tggcgctcac tgttgacctg 600

ccacctgcaa gttccgaggc tcggaactca gcgttcgggt ttcaaggcag 650

actgctgcac ctgagcgccg ggcaaagact tggtgtacac ttgcacactg 700

aggctagagc ccgccacgct tggcaactca cacaaggggc tacagtgctt 750

ggcctgttcc gagtaacgcc cgaaattcca gcgggcctgc caagtcctag 800

atctgaa 807

<210> 153

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 60（41BBL13W-OX40rev）的序列

<400> 153

atggaaatca aggctctaac cagccacgcg gacgctcagg aagaacaaat 50

tcccacccgc tttagtggtg gggggccacc taaacatgct gatcctccat 100

tgcgacagga taggaggctg ctgtggccac cggcgccaag agctagagct 150

tgcagagtgt tgccttgggc tttggtggcc ggactgctgc tcctgctgct 200

gctggctgct gcctgtgccg tgtttctcgc atgtccttgg gctgtgtccg 250

gtgcaagagc ctctcctgga tctgccgcga gtccgcgcct gcgagaggga 300

ccagaattgt caccggatga ccctgcaggc cttctcgatc tcaggcaagg 350

aatgtttgcg cagctggtgg cacaaaacgt gttgcttata gacggaccac 400

ttagctggta ttctgatccc ggcctggccg gggtttcatt gaccggcggc 450

ctttcctaca aggaagatac caaggaactg gtggtcgcca aggccggagt 500

atactatgtt ttcttccaat tggagttgcg gcgcgtcgtg gcaggggaag 550

ggagcggttc tgtctctttg gctctccacc tgcaaccctt gagatccgcg 600

gctggagctg cagctttggc gctcactgtt gacctgccac ctgcaagttc 650

cgaggctcgg aactcagcgt tcgggtttca aggcagactg ctgcacctga 700

gcgccgggca aagacttggt gtacacttgc acactgaggc tagagcccgc 750

cacgcttggc aactcacaca aggggctaca gtgcttggcc tgttccgagt 800

aacgcccgaa attccagcgg gcctgccaag tcctagatct gaa 843

<210> 154

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 61（41BBL-mincyto-OX40rev）的序列

<400> 154

atgctgggga tcaaggctct aaccagccac gcggacgctc aggaagaaca 50

aattcccacc cgctttagtg gtggggggcc acctaaacat gctgatcctc 100

cattgcgaca ggataggact agtggaagtt gggctttggt ggccggactg 150

ctgctcctgc tgctgctggc tgctgcctgt gccgtgtttc tcgcatgtcc 200

ttgggctgtg tccggtgcaa gagcctctcc tggatctgcc gcgagtccgc 250

gcctgcgaga gggaccagaa ttgtcaccgg atgaccctgc aggccttctc 300

gatctcaggc aaggaatgtt tgcgcagctg gtggcacaaa acgtgttgct 350

tatagacgga ccacttagct ggtattctga tcccggcctg gccggggttt 400

cattgaccgg cggcctttcc tacaaggaag ataccaagga actggtggtc 450

gccaaggccg gagtatacta tgttttcttc caattggagt tgcggcgcgt 500

cgtggcaggg gaagggagcg gttctgtctc tttggctctc cacctgcaac 550

ccttgagatc cgcggctgga gctgcagctt tggcgctcac tgttgacctg 600

ccacctgcaa gttccgaggc tcggaactca gcgttcgggt ttcaaggcag 650

actgctgcac ctgagcgccg ggcaaagact tggtgtacac ttgcacactg 700

aggctagagc ccgccacgct tggcaactca cacaaggggc tacagtgctt 750

ggcctgttcc gagtaacgcc cgaaattcca gcgggcctgc caagtcctag 800

atctgaa 807

<210> 155

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 62（41BBL-OX40ENrev）的序列

<400> 155

atgctgggga tcaaggctct aaccagccac gcggacgctc aggaagaaca 50

aattcccacc cgctttagtg gtggggggcc acctaaacat gctgatcctc 100

cattgcgaca ggataggagg ctgctctacc tggctactag tggaagttat 150

gccagtgacg catctctcga tcccgaagcc ccttggccac cggcgccaag 200

agctagagct tgcagagtgt tgccttgggc tttggtggcc ggactgctgc 250

tcctgctgct gctggctgct gcctgtgccg tgtttctcgc atgtccttgg 300

gctgtgtccg gtgcaagagc ctctcctgga tctgccgcga gtccgcgcct 350

gcgagaggga ccagaattgt caccggatga ccctgcaggc cttctcgatc 400

tcaggcaagg aatgtttgcg cagctggtgg cacaaaacgt gttgcttata 450

gacggaccac ttagctggta ttctgatccc ggcctggccg gggtttcatt 500

gaccggcggc ctttcctaca aggaagatac caaggaactg gtggtcgcca 550

aggccggagt atactatgtt ttcttccaat tggagttgcg gcgcgtcgtg 600

gcaggggaag ggagcggttc tgtctctttg gctctccacc tgcaaccctt 650

gagatccgcg gctggagctg cagctttggc gctcactgtt gacctgccac 700

ctgcaagttc cgaggctcgg aactcagcgt tcgggtttca aggcagactg 750

ctgcacctga gcgccgggca aagacttggt gtacacttgc acactgaggc 800

tagagcccgc cacgcttggc aactcacaca aggggctaca gtgcttggcc 850

tgttccgagt aacgcccgaa attccagcgg gcctgccaag tcctagatct 900

gaa 903

<210> 156

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 63（41BBL-OX40EN）的序列

<400> 156

atgctggggg ccctgtacct gctcaggcgc gaccagaggc tgccacctga 50

cgcacacaag ccacctggtg ggggctcatt tcgaactccc atccaggaag 100

agcaggccga cgcacacagt acccttgcca aaatcactag tggaagttat 150

gccagtgacg catctctcga tcccgaagcc ccttggccac cggcgccaag 200

agctagagct tgcagagtgt tgccttgggc tttggtggcc ggactgctgc 250

tcctgctgct gctggctgct gcctgtgccg tgtttctcgc atgtccttgg 300

gctgtgtccg gtgcaagagc ctctcctgga tctgccgcga gtccgcgcct 350

gcgagaggga ccagaattgt caccggatga ccctgcaggc cttctcgatc 400

tcaggcaagg aatgtttgcg cagctggtgg cacaaaacgt gttgcttata 450

gacggaccac ttagctggta ttctgatccc ggcctggccg gggtttcatt 500

gaccggcggc ctttcctaca aggaagatac caaggaactg gtggtcgcca 550

aggccggagt atactatgtt ttcttccaat tggagttgcg gcgcgtcgtg 600

gcaggggaag ggagcggttc tgtctctttg gctctccacc tgcaaccctt 650

gagatccgcg gctggagctg cagctttggc gctcactgtt gacctgccac 700

ctgcaagttc cgaggctcgg aactcagcgt tcgggtttca aggcagactg 750

ctgcacctga gcgccgggca aagacttggt gtacacttgc acactgaggc 800

tagagcccgc cacgcttggc aactcacaca aggggctaca gtgcttggcc 850

tgttccgagt aacgcccgaa attccagcgg gcctgccaag tcctagatct 900

gaa 903

<210> 157

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 64（41BBLmincyto-13alink-OX40）的序列

<400> 157

atgctggggc gcgaccagag gctgccacct gacgcacaca agccacctgg 50

tgggggctca tttcgaactc ccatccagga agagcaggcc gacgcacaca 100

gtacccttgc caaaatcagt ttaaacggcg gaggtgggag cggaggtggc 150

ggctccgggg gaggtggcag cggtggggga ggcagcggcg ggccttgggc 200

tttggtggcc ggactgctgc tcctgctgct gctggctgct gcctgtgccg 250

tgtttctcgc atgtccttgg gctgtgtccg gtgcaagagc ctctcctgga 300

tctgccgcga gtccgcgcct gcgagaggga ccagaattgt caccggatga 350

ccctgcaggc cttctcgatc tcaggcaagg aatgtttgcg cagctggtgg 400

cacaaaacgt gttgcttata gacggaccac ttagctggta ttctgatccc 450

ggcctggccg gggtttcatt gaccggcggc ctttcctaca aggaagatac 500

caaggaactg gtggtcgcca aggccggagt atactatgtt ttcttccaat 550

tggagttgcg gcgcgtcgtg gcaggggaag ggagcggttc tgtctctttg 600

gctctccacc tgcaaccctt gagatccgcg gctggagctg cagctttggc 650

gctcactgtt gacctgccac ctgcaagttc cgaggctcgg aactcagcgt 700

tcgggtttca aggcagactg ctgcacctga gcgccgggca aagacttggt 750

gtacacttgc acactgaggc tagagcccgc cacgcttggc aactcacaca 800

aggggctaca gtgcttggcc tgttccgagt aacgcccgaa attccagcgg 850

gcctgccaag tcctagatct gaa 873

<210> 158

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 65（OX40Lmincyto-41BBrev）的序列

<400> 158

atgctggggc tggagtgcgg cggcgaggag gaggagccct tcaggtgcag 50

ctgcggcgac gaggagcaga ccacccaggt gcccaggatg ttcccccaga 100

agttcatcta cctgctgaag aagaggggca ggaagctggg aggcagcctg 150

ctccttgttg ctagtgtgat tcaggggctg ggactgttgt tgtgcttcac 200

atacatttgt ctccactttt ctgcattgca ggtcagccat aggtatcccc 250

gcattcagtc tatcaaagtg caattcactg agtacaagaa ggagaaaggc 300

tttattttaa ctagtcaaaa ggaagacgag ataatgaagg tgcagaacaa 350

cagcgttatt atcaattgcg acgggttcta tttaatctct ctgaaagggt 400

acttctcaca ggaggttaac attagtttac attatcaaaa ggacgaggaa 450

cccttgttcc agctgaaaaa agtgcggtct gttaattccc ttatggtggc 500

gagtcttaca tacaaggaca aggtgtatct caacgtgaca acggacaata 550

cctctctgga cgattttcac gttaacggcg gggagcttat acttatccat 600

caaaacccag gagaattttg cgtcctt 627

<210> 159

<211> 549

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 66（OX40L WT）的序列

<400> 159

atggaacgtg ttcagccact ggaggaaaat gtcggcaacg ccgccaggcc 50

tcgattcgag cgtaacaaac tgctccttgt tgctagtgtg attcaggggc 100

tgggactgtt gttgtgcttc acatacattt gtctccactt ttctgcattg 150

caggtcagcc ataggtatcc ccgcattcag tctatcaaag tgcaattcac 200

tgagtacaag aaggagaaag gctttatttt aactagtcaa aaggaagacg 250

agataatgaa ggtgcagaac aacagcgtta ttatcaattg cgacgggttc 300

tatttaatct ctctgaaagg gtacttctca caggaggtta acattagttt 350

acattatcaa aaggacgagg aacccttgtt ccagctgaaa aaagtgcggt 400

ctgttaattc ccttatggtg gcgagtctta catacaagga caaggtgtat 450

ctcaacgtga caacggacaa tacctctctg gacgattttc acgttaacgg 500

cggggagctt atacttatcc atcaaaaccc aggagaattt tgcgtcctt 549

<210> 160

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 67（OX40Lmincyto-41BB）的序列

<400> 160

atgctgggga agcggggcag aaagaaactg ctgtacatct ttaagcagcc 50

cttcatgcgg cccgtgcaga ccacccagga agaggacggc tgctcctgca 100

gattccccga ggaagaagaa ggcggctgcg agctgggagg cagcctgctc 150

cttgttgcta gtgtgattca ggggctggga ctgttgttgt gcttcacata 200

catttgtctc cacttttctg cattgcaggt cagccatagg tatccccgca 250

ttcagtctat caaagtgcaa ttcactgagt acaagaagga gaaaggcttt 300

attttaacta gtcaaaagga agacgagata atgaaggtgc agaacaacag 350

cgttattatc aattgcgacg ggttctattt aatctctctg aaagggtact 400

tctcacagga ggttaacatt agtttacatt atcaaaagga cgaggaaccc 450

ttgttccagc tgaaaaaagt gcggtctgtt aattccctta tggtggcgag 500

tcttacatac aaggacaagg tgtatctcaa cgtgacaacg gacaatacct 550

ctctggacga ttttcacgtt aacggcgggg agcttatact tatccatcaa 600

aacccaggag aattttgcgt cctt 624

<210> 161

<211> 987

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 68（CD86 WT）的序列

<400> 161

atggaccctc agtgtaccat gggcctgagc aacatcctgt tcgtgatggc 50

ctttctgctg agcggagccg ctcctctgaa gatccaggcc tacttcaacg 100

agacagccga cctgccttgc cagttcgcca acagccagaa tcagagcctg 150

agcgagctgg tggtgttctg gcaggaccaa gagaacctgg tgctgaacga 200

ggtgtacctg ggcaaagaaa agttcgacag cgtgcacagc aagtacatgg 250

gcagaaccag cttcgactcc gacagctgga cactgagact gcacaacctg 300

cagatcaagg acaagggcct gtaccagtgc atcatccacc acaagaaacc 350

caccggcatg atcagaatcc accagatgaa cagcgagctg agcgtgctgg 400

ccaacttcag ccagcctgag atcgtgccca tcagcaacat caccgagaac 450

gtgtacatca acctgacctg cagcagcatc cacggctacc ccgagcctaa 500

gaaaatgtcc gtgctgctgc ggaccaagaa cagcaccatc gagtacgacg 550

gcgtgatgca gaaaagccag gacaacgtga ccgagctgta cgacgtgtcc 600

atcagcctgt ccgtgtcatt ccccgacgtg accagcaata tgaccatctt 650

ctgcatcctg gaaaccgaca agacccggct gctgtctagc cccttcagca 700

tagagctgga agatccccag cctcctcctg atcacatccc ttggattacc 750

gccgtgctgc ccaccgtgat catctgcgtg atggtgtttt gcctgatcct 800

gtggaagtgg aagaagaaga aacggcctcg gaacagctac aagtgcggca 850

ccaacaccat ggaacgggaa gagagcgagc agaccaagaa gagagagaag 900

attcacatcc ccgagcggag cgacgaagcc cagagagtgt ttaagagcag 950

caagaccagc agctgcgaca agagcgatac ctgcttc 987

<210> 162

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 69（CD86delP276）的序列

<400> 162

atggaccctc agtgtaccat gggcctgagc aacatcctgt tcgtgatggc 50

ctttctgctg agcggagccg ctcctctgaa gatccaggcc tacttcaacg 100

agacagccga cctgccttgc cagttcgcca acagccagaa tcagagcctg 150

agcgagctgg tggtgttctg gcaggaccaa gagaacctgg tgctgaacga 200

ggtgtacctg ggcaaagaaa agttcgacag cgtgcacagc aagtacatgg 250

gcagaaccag cttcgactcc gacagctgga cactgagact gcacaacctg 300

cagatcaagg acaagggcct gtaccagtgc atcatccacc acaagaaacc 350

caccggcatg atcagaatcc accagatgaa cagcgagctg agcgtgctgg 400

ccaacttcag ccagcctgag atcgtgccca tcagcaacat caccgagaac 450

gtgtacatca acctgacctg cagcagcatc cacggctacc ccgagcctaa 500

gaaaatgtcc gtgctgctgc ggaccaagaa cagcaccatc gagtacgacg 550

gcgtgatgca gaaaagccag gacaacgtga ccgagctgta cgacgtgtcc 600

atcagcctgt ccgtgtcatt ccccgacgtg accagcaata tgaccatctt 650

ctgcatcctg gaaaccgaca agacccggct gctgtctagc cccttcagca 700

tcgagctgga agatccccag cctcctcctg atcacatccc ttggattacc 750

gccgtgctgc ccaccgtgat catctgcgtg atggtgtttt gcctgatcct 800

gtggaagtgg aagaagaaga aacggcct 828

<210> 163

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 70（CD86mincyto）的序列

<400> 163

atggaccctc agtgtaccat gggcctgagc aacatcctgt tcgtgatggc 50

ctttctgctg agcggagccg ctcctctgaa gatccaggcc tacttcaacg 100

agacagccga cctgccttgc cagttcgcca acagccagaa tcagagcctg 150

agcgagctgg tggtgttctg gcaggaccaa gagaacctgg tgctgaacga 200

ggtgtacctg ggcaaagaaa agttcgacag cgtgcacagc aagtacatgg 250

gcagaaccag cttcgactcc gacagctgga cactgagact gcacaacctg 300

cagatcaagg acaagggcct gtaccagtgc atcatccacc acaagaaacc 350

caccggcatg atcagaatcc accagatgaa cagcgagctg agcgtgctgg 400

ccaacttcag ccagcctgag atcgtgccca tcagcaacat caccgagaac 450

gtgtacatca acctgacctg cagcagcatc cacggctacc ccgagcctaa 500

gaaaatgtcc gtgctgctgc ggaccaagaa cagcaccatc gagtacgacg 550

gcgtgatgca gaaaagccag gacaacgtga ccgagctgta cgacgtgtcc 600

atcagcctgt ccgtgtcatt ccccgacgtg accagcaata tgaccatctt 650

ctgcatcctg gaaaccgaca agacccggct gctgtctagc cccttcagca 700

tagagctgga agatccccag cctcctcctg atcacatccc ttggattacc 750

gccgtgctgc ccaccgtgat catctgcgtg atggtgtttt gcctgatcct 800

gtgg 804

<210> 164

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 71（CD86mincyto-IL18RAP）的序列

<400> 164

atggaccctc agtgtaccat gggcctgagc aacatcctgt tcgtgatggc 50

ctttctgctg agcggagccg ctcctctgaa gatccaggcc tacttcaacg 100

agacagccga cctgccttgc cagttcgcca acagccagaa tcagagcctg 150

agcgagctgg tggtgttctg gcaggaccaa gagaacctgg tgctgaacga 200

ggtgtacctg ggcaaagaaa agttcgacag cgtgcacagc aagtacatgg 250

gcagaaccag cttcgactcc gacagctgga cactgagact gcacaacctg 300

cagatcaagg acaagggcct gtaccagtgc atcatccacc acaagaaacc 350

caccggcatg atcagaatcc accagatgaa cagcgagctg agcgtgctgg 400

ccaacttcag ccagcctgag atcgtgccca tcagcaacat caccgagaac 450

gtgtacatca acctgacctg cagcagcatc cacggctacc ccgagcctaa 500

gaaaatgtcc gtgctgctgc ggaccaagaa cagcaccatc gagtacgacg 550

gcgtgatgca gaaaagccag gacaacgtga ccgagctgta cgacgtgtcc 600

atcagcctgt ccgtgtcatt ccccgacgtg accagcaata tgaccatctt 650

ctgcatcctg gaaaccgaca agacccggct gctgtctagc cccttcagca 700

tcgagctgga agatccccag cctcctcctg atcacatccc ttggattacc 750

gccgtgctgc ccaccgtgat catctgcgtg atggtgtttt gcctgatcct 800

gtggagcgcc ctgctgtacc ggcactggat cgagatcgtg ctgctgtaca 850

gaacctacca gagcaaggac cagacactgg gcgacaagaa ggacttcgac 900

gccttcgtgt cctacgccaa gtggtccagc tttcctagcg aggccacaag 950

cagcctgagc gaggaacatc tggccctgag cctgtttcct gacgtgctgg 1000

aaaacaaata cggctacagc ctgtgcctgc tcgagagaga tgttgctcct 1050

ggcggagtgt acgccgagga catcgtgtcc atcatcaagc ggagcagacg 1100

gggcatcttc attctgagcc ccaactacgt gaacggcccc agcatctttg 1150

aactgcaagc cgccgtgaac ctggctctgg atgatcagac cctgaagctg 1200

atcctgatca agttctgcta cttccaagag cctgagagcc tgcctcacct 1250

ggtcaagaaa gccctgagag tgctgcctac cgtgacttgg agaggcctga 1300

agtccgtgcc tcctaacagc agattctggg ccaagatgag ataccacatg 1350

cctgtgaaga acagccaggg cttcacctgg aaccagctgc ggatcaccag 1400

ccggatcttt cagtggaagg gcctgagcag aaccgagaca accggcagaa 1450

gcagccagcc taaagagtgg 1470

<210> 165

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 72（CD86-IL18RAP）的序列

<400> 165

atggaccctc agtgtaccat gggcctgagc aacatcctgt tcgtgatggc 50

ctttctgctg agcggagccg ctcctctgaa gatccaggcc tacttcaacg 100

agacagccga cctgccttgc cagttcgcca acagccagaa tcagagcctg 150

agcgagctgg tggtgttctg gcaggaccaa gagaacctgg tgctgaacga 200

ggtgtacctg ggcaaagaaa agttcgacag cgtgcacagc aagtacatgg 250

gcagaaccag cttcgactcc gacagctgga cactgagact gcacaacctg 300

cagatcaagg acaagggcct gtaccagtgc atcatccacc acaagaaacc 350

caccggcatg atcagaatcc accagatgaa cagcgagctg agcgtgctgg 400

ccaacttcag ccagcctgag atcgtgccca tcagcaacat caccgagaac 450

gtgtacatca acctgacctg cagcagcatc cacggctacc ccgagcctaa 500

gaaaatgtcc gtgctgctgc ggaccaagaa cagcaccatc gagtacgacg 550

gcgtgatgca gaaaagccag gacaacgtga ccgagctgta cgacgtgtcc 600

atcagcctgt ccgtgtcatt ccccgacgtg accagcaata tgaccatctt 650

ctgcatcctg gaaaccgaca agacccggct gctgtctagc cccttcagca 700

tcgagctgga agatccccag cctcctcctg atcacatccc ttggattacc 750

gccgtgctgc ccaccgtgat catctgcgtg atggtgtttt gcctgatcct 800

gtggaagtgg aagaagaaga aacggcctcg gaacagctac aagtgcggca 850

ccaacaccat ggaacgggaa gagagcgagc agaccaagaa gagagagaag 900

attcacatcc ccgagcggag cgacgaagcc cagagagtgt ttaagagcag 950

caagaccagc agctgcgaca agagcgatac ctgcttcagc gccctgctgt 1000

accggcactg gatcgagatc gtgctgctgt acagaaccta ccagagcaag 1050

gaccagacac tgggcgacaa gaaggacttc gacgccttcg tgtcctacgc 1100

caagtggtcc agctttccta gcgaggccac aagcagcctg agcgaggaac 1150

atctggccct gagcctgttt cctgacgtgc tggaaaacaa atacggctac 1200

agcctgtgcc tgctcgagag agatgttgct cctggcggag tgtacgccga 1250

ggacatcgtg tccatcatca agcggagcag acggggcatc ttcattctga 1300

gccccaacta cgtgaacggc cccagcatct ttgaactgca agccgccgtg 1350

aacctggctc tggatgatca gaccctgaag ctgatcctga tcaagttctg 1400

ctacttccaa gagcctgaga gcctgcctca cctggtcaag aaagccctga 1450

gagtgctgcc taccgtgact tggagaggcc tgaagtccgt gcctcctaac 1500

agcagattct gggccaagat gagataccac atgcctgtga agaacagcca 1550

gggcttcacc tggaaccagc tgcggatcac cagccggatc tttcagtgga 1600

agggcctgag cagaaccgag acaaccggca gaagcagcca gcctaaagag 1650

tgg 1653

<210> 166

<211> 1311

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 73（CD86IgV-41BBL-OX40）的序列

<400> 166

atgctggggc gcgaccagag gctgccacct gacgcacaca agccacctgg 50

tgggggctca tttcgaactc ccatccagga agagcaggcc gacgcacaca 100

gtacccttgc caaaatcact agtggaagtt atgccagtga cgcatctctc 150

gatcccgaag ccccttggcc accggcgcca agagctagag cttgcagagt 200

gttgccttgg gctttggtgg ccggactgct gctcctgctg ctgctggctg 250

ctgcctgtgc cgtgtttctc gcatgtcctt gggctgtgtc cggtgcaaga 300

gcctctcctg gatctgccgc gagtccgcgc ctgcgagagg gaccagaatt 350

gtcaccggat gaccctgcag gccttctcga tctcaggcaa ggaatgtttg 400

cgcagctggt ggcacaaaac gtgttgctta tagacggacc acttagctgg 450

tattctgatc ccggcctggc cggggtttca ttgaccggcg gcctttccta 500

caaggaagat accaaggaac tggtggtcgc caaggccgga gtatactatg 550

ttttcttcca attggagttg cggcgcgtcg tggcagggga agggagcggt 600

tctgtctctt tggctctcca cctgcaaccc ttgagatccg cggctggagc 650

tgcagctttg gcgctcactg ttgacctgcc acctgcaagt tccgaggctc 700

ggaactcagc gttcgggttt caaggcagac tgctgcacct gagcgccggg 750

caaagacttg gtgtacactt gcacactgag gctagagccc gccacgcttg 800

gcaactcaca caaggggcta cagtgcttgg cctgttccga gtaacgcccg 850

aaattccagc gggcctgcca agtcctagat ctgaaagttt aaacggcgga 900

ggtgggagcg gaggtggcgg ctccggggga ggtggcagcg gtgggggagg 950

cagcggcggg ggaggtagca ctagtgcccc tctgaagatc caggcttact 1000

tcaacgaaac cgcagatttg ccctgccagt ttgccaattc tcagaatcag 1050

tctttatctg aactggtggt cttctggcag gaccaggaga atcttgtact 1100

gaatgaagtt tatctcggca aggaaaagtt tgatagtgta catagtaagt 1150

acatgggtag aacctccttc gattctgact cgtggacttt aaggctgcac 1200

aacctgcaga tcaaggataa agggctttac cagtgcatta tccaccataa 1250

gaagccaacc ggcatgattc ggattcatca gatgaactct gagctgtctg 1300

tactcgccaa t 1311

<210> 167

<211> 1839

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 74（RANK WT）的序列

<400> 167

atggccccta gagccagaag aagaaggcct ctgtttgccc tgctgctgct 50

gtgcgctctg ctggctagac tgcaagtggc cctgcagatt gcccctccat 100

gtaccagcga gaagcactac gagcacctgg gcagatgctg caacaagtgc 150

gagcccggca agtacatgag cagcaagtgt accaccacca gcgacagcgt 200

gtgtctgcct tgtggccctg acgagtacct ggacagctgg aacgaagagg 250

acaagtgcct gctgcacaaa gtgtgcgata ccggcaaagc cctggtggca 300

gtggtggccg gcaatagcac aacccctaga agatgtgcct gcaccgccgg 350

ctatcactgg tcccaggatt gcgagtgctg cagacggaat accgagtgtg 400

ctcctggact gggagcacag catcctctgc agctgaacaa ggacaccgtg 450

tgcaagcctt gtctggccgg ctacttcagc gacgccttta gcagcaccga 500

caagtgcaga ccctggacca actgcacctt cctgggcaag agagtggaac 550

accacggcac cgagaagtcc gatgccgtgt gtagcggcag cagaaagcct 600

cctaatgagc cccacgtgta cctgcctggc ctgatcatcc tgctgctttt 650

tgctagcgtg gccctggtcg ccgccatcat ctttggcgtg tgctaccgga 700

agaaaggcaa ggccctgacc gccaatctgt ggcactggat caatgaggcc 750

tgcggcagac tgagcggcga caaagaaagc agcggcgact cctgtgtgtc 800

tacccacacc gccaatttcg gacagcaggg cgcttgtgaa ggcgtgctgc 850

ttctgaccct ggaagagaaa acattccccg aggacatgtg ctaccccgac 900

caaggcggag tgtgtcaggg cacatgtgtt ggcggaggcc cttatgctca 950

gggcgaagat gccagaatgc tgagcctggt gtccaagacc gagatcgagg 1000

aagatagctt ccggcagatg cccaccgagg atgagtacat ggatagaccc 1050

agccagccta ccgaccagct gctgtttctg acagagcctg gcagcaagag 1100

cacccctcca ttttccgagc ctctggaagt gggcgagaac gacagcctga 1150

gccagtgctt tacaggcacc cagagcacag tgggcagcga gagctgtaat 1200

tgcaccgagc cactgtgccg gaccgactgg acacctatga gcagcgagaa 1250

ctacctgcag aaagaggtgg actccggcca ctgtcctcat tgggctgcta 1300

gcccctctcc taactgggcc gatgtgtgta ccggctgccg aaatccacct 1350

ggcgaagatt gcgaacctct cgtgggcagc cctaaacgag gacctctgcc 1400

tcagtgtgcc tacggcatgg gactgcctcc agaggaagag gccagcagaa 1450

ccgaagccag agatcagcct gaagatggcg ccgatggcag actgcctagc 1500

tctgctagag ctggcgctgg ctctggatct tctcctggcg gacaatctcc 1550

tgccagcggc aatgtgaccg gcaacagcaa cagcaccttc atcagcagcg 1600

gccaagtgat gaacttcaag ggcgacatca tcgtggtgta cgtgtcccag 1650

acaagccaag aaggcgctgc cgcagctgct gaacctatgg gtagacccgt 1700

gcaagaggaa accctggcca gaagagattc cttcgccggc aacggcccta 1750

gattccctga tccttgtggc ggccctgaag gcctgagaga gcctgaaaaa 1800

gccagccggc ctgtgcaaga acaaggcggc gctaaagct 1839

<210> 168

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 75（RANKmincyto）的序列

<400> 168

atggccccta gagccagaag aagaaggcct ctgtttgccc tgctgctgct 50

gtgcgctctg ctggctagac tgcaagtggc cctgcagatt gcccctccat 100

gtaccagcga gaagcactac gagcacctgg gcagatgctg caacaagtgc 150

gagcccggca agtacatgag cagcaagtgt accaccacca gcgacagcgt 200

gtgtctgcct tgtggccctg acgagtacct ggacagctgg aacgaagagg 250

acaagtgcct gctgcacaaa gtgtgcgata ccggcaaagc cctggtggca 300

gtggtggccg gcaatagcac aacccctaga agatgtgcct gcaccgccgg 350

ctatcactgg tcccaggatt gcgagtgctg cagacggaat accgagtgtg 400

ctcctggact gggagcacag catcctctgc agctgaacaa ggacaccgtg 450

tgcaagcctt gtctggccgg ctacttcagc gacgccttta gcagcaccga 500

caagtgcaga ccctggacca actgcacctt cctgggcaag agagtggaac 550

accacggcac cgagaagtcc gatgccgtgt gtagcggcag cagaaagcct 600

cctaatgagc cccacgtgta cctgcctggc ctgatcatcc tgctgctttt 650

tgctagcgtg gccctggtcg ccgccatcat ctttggcgtg 690

<210> 169

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 76（RANK-OX40）的序列

<400> 169

atggcccctc gtgctcgacg taggcgtcca ttattcgctc tcctgctctt 50

gtgcgcgctt ctcgctcggc tgcaggtggc cctccagatt gcgcccccat 100

gcacttccga gaagcactat gaacatcttg gccgctgttg caataaatgt 150

gaacctggca aatacatgtc ctccaaatgt actactacgt cagacagcgt 200

gtgcttgccc tgtggacccg acgagtatct ggattcatgg aatgaggagg 250

ataaatgcct cttgcataag gtctgtgata ctgggaaggc gctggtggct 300

gtggtggctg gaaacagtac cacaccgcga cgatgcgctt gtactgccgg 350

atatcactgg tctcaggatt gcgagtgctg tagacgtaat acagaatgtg 400

cccccggcct tggcgctcag caccctctgc agttgaataa agacacagtc 450

tgtaaaccct gtctggcagg gtatttctct gatgcattta gttctacaga 500

caagtgtcgc ccttggacca actgtacttt ccttggtaag agggtggaac 550

accacggcac agaaaagtcc gacgccgtct gttcaggctc ccggaaaccg 600

cccaacgaac cacatgtgta tctgcccgtg gctgccattc tgggactggg 650

gcttgtcttg gggctgctcg ggccattggc gatcctgctg gccctgtacc 700

tgttgcggcg ggatcagcgc ctgcctccag atgcacataa accccccggc 750

ggcgggtctt ttagaacacc aatacaagag gaacaagctg acgcccacag 800

taccctcgca aaaatt 816

<210> 170

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 77（RANK-41BB）的序列

<400> 170

atggcccctc gtgctcgacg taggcgtcca ttattcgctc tcctgctctt 50

gtgcgcgctt ctcgctcggc tgcaggtggc cctccagatt gcgcccccat 100

gcacttccga gaagcactat gaacatcttg gccgctgttg caataaatgt 150

gaacctggca aatacatgtc ctccaaatgt actactacgt cagacagcgt 200

gtgcttgccc tgtggacccg acgagtatct ggattcatgg aatgaggagg 250

ataaatgcct cttgcataag gtctgtgata ctgggaaggc gctggtggct 300

gtggtggctg gaaacagtac cacaccgcga cgatgcgctt gtactgccgg 350

atatcactgg tctcaggatt gcgagtgctg tagacgtaat acagaatgtg 400

cccccggcct tggcgctcag caccctctgc agttgaataa agacacagtc 450

tgtaaaccct gtctggcagg gtatttctct gatgcattta gttctacaga 500

caagtgtcgc ccttggacca actgtacttt ccttggtaag agggtggaac 550

accacggcac agaaaagtcc gacgccgtct gttcaggctc ccggaaaccg 600

cccaacgaac cacatgtgta tctgcccatt atttcttttt tcctggcact 650

gacaagcaca gcgctgttat ttctcttatt ctttttgacc ctccgcttca 700

gtgtcgtgaa gcgcgggcgc aaaaagttgc tgtacatttt taagcagcct 750

tttatgagac ccgtgcagac cacccaggag gaagatggct gcagctgcag 800

gttccccgag gaggaagagg gcggatgcga actc 834

<210> 171

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 78（RANK-IL18RAP）的序列

<400> 171

atggccccta gagccagaag aagaaggcct ctgtttgccc tgctgctgct 50

gtgcgctctg ctggctagac tgcaagtggc cctgcagatt gcccctccat 100

gtaccagcga gaagcactac gagcacctgg gcagatgctg caacaagtgc 150

gagcccggca agtacatgag cagcaagtgt accaccacca gcgacagcgt 200

gtgtctgcct tgtggccctg acgagtacct ggacagctgg aacgaagagg 250

acaagtgcct gctgcacaaa gtgtgcgata ccggcaaagc cctggtggca 300

gtggtggccg gcaatagcac aacccctaga agatgtgcct gcaccgccgg 350

ctatcactgg tcccaggatt gcgagtgctg cagacggaat accgagtgtg 400

ctcctggact gggagcacag catcctctgc agctgaacaa ggacaccgtg 450

tgcaagcctt gtctggccgg ctacttcagc gacgccttta gcagcaccga 500

caagtgcaga ccctggacca actgcacctt cctgggcaag agagtggaac 550

accacggcac cgagaagtcc gatgccgtgt gtagcggcag cagaaagcct 600

cctaatgagc cccacgtgta cctgcctggt gtagtcctgc tctacatcct 650

gctgggcaca atcgggactc tggtggctgt gctggctgcc agcgccctgc 700

tgtaccggca ctggatcgag atcgtgctgc tgtacagaac ctaccagagc 750

aaggaccaga cactgggcga caagaaggac ttcgacgcct tcgtgtccta 800

cgccaagtgg tccagctttc ctagcgaggc cacaagcagc ctgagcgagg 850

aacatctggc cctgagcctg tttcctgacg tgctggaaaa caaatacggc 900

tacagcctgt gcctgctcga gagagatgtt gctcctggcg gagtgtacgc 950

cgaggacatc gtgtccatca tcaagcggag cagacggggc atcttcattc 1000

tgagccccaa ctacgtgaac ggccccagca tctttgaact gcaagccgcc 1050

gtgaacctgg ctctggatga tcagaccctg aagctgatcc tgatcaagtt 1100

ctgctacttc caagagcctg agagcctgcc tcacctggtc aagaaagccc 1150

tgagagtgct gcctaccgtg acttggagag gcctgaagtc cgtgcctcct 1200

aacagcagat tctgggccaa gatgagatac cacatgcctg tgaagaacag 1250

ccagggcttc acctggaacc agctgcggat caccagccgg atctttcagt 1300

ggaagggcct gagcagaacc gagacaaccg gcagaagcag ccagcctaaa 1350

gagtgg 1356

<210> 172

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 80（CD8-Q8）的序列

<400> 172

atgggactcg ttagaagagg cgccagagcc ggacctagaa tccctagagg 50

atggacagcc ctgtgcctgc tgtctctgct gccttctggc tttatggccg 100

agctgcctac acagggcacc ttcagcaatg tgtccaccaa cgtgtcccca 150

gccaagccta caacaacccc tgctcctaga cctcctacac cagctcctac 200

aatcgccagc cagccactgt ctctgaggcc agaagcttgt agacctgctg 250

ctggcggagc cgtgcataca agaggactgg atttcgcctg cgacatctac 300

atctgggccc ctctggctgg aacatgtggc gttctgctgc tgagcctggt 350

catcaccctg tactgcaacc accggaacag gcggagagtg tgcaagtgcc 400

ctagacctgt ggtt 414

<210> 173

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 81（eGFP）的序列

<400> 173

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt 50

cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 100

gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 150

accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 200

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact 250

tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg 350

cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 400

acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 450

gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 500

gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc 550

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga 650

tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 700

tggacgagct gtacaag 717

<210> 174

<211> 155

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD70

<400> 174

Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu Glu Ser Leu

1 5 10 15

Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln

20 25 30

Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg

35 40 45

Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile

50 55 60

His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala

65 70 75

Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu

80 85 90

Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu

95 100 105

Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu

110 115 120

Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly

125 130 135

Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val

140 145 150

Gln Trp Val Arg Pro

155

<210> 175

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL2RB ICD

<400> 175

Val Leu His Thr Pro Asp Gln Gly Gln Leu Glu Gln Leu Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Ala Asp Thr Asn Leu Pro Leu Leu Gln Thr Val Lys Asp Arg

20 25 30

Glu Leu Val Glu Leu Pro Ser Ile Glu Pro Ala Leu Gly Gly Pro

35 40 45

Ser Phe Ser Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Leu Trp Lys Gln Val

50 55 60

Asp Gly Gly His Glu Ser Ser Leu Gln Ser Phe Phe Lys Ser Pro

65 70 75

Asp Pro Thr Asn Cys Lys Leu Val Lys Lys Leu Trp Pro Gly Thr

80 85 90

Asn Arg Cys Asn

<210> 176

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD70 ICD

<400> 176

Met Leu Gly Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg

1 5 10 15

Pro Tyr Gly

<210> 177

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD70 -TM

<400> 177

Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile

1 5 10 15

Cys Leu Val Val Cys Ile

20

<210> 178

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-13W-OX40

<400> 178

Met Leu Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

1 5 10 15

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala

20 25 30

Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Ser Gly Ser Trp Pro

35 40 45

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu

50 55 60

Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala

65 70 75

Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser

80 85 90

Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu

95 100 105

Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met

110 115 120

Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro

125 130 135

Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr

140 145 150

Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

155 160 165

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg

170 175 180

Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

185 190 195

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu

200 205 210

Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala

215 220 225

Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg

230 235 240

Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp

245 250 255

Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

260 265 270

Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

275 280

<210> 179

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 41BBL-OX40-IL2RB

<400> 179

Met Leu Gly Val Leu His Thr Pro Asp Gln Gly Gln Leu Glu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Leu Tyr Ala Asp Thr Asn Leu Pro Leu Leu Gln Thr Val

20 25 30

Lys Asp Arg Glu Leu Val Glu Leu Pro Ser Ile Glu Pro Ala Leu

35 40 45

Gly Gly Pro Ser Phe Ser Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Leu Trp

50 55 60

Lys Gln Val Asp Gly Gly His Glu Ser Ser Leu Gln Ser Phe Phe

65 70 75

Lys Ser Pro Asp Pro Thr Asn Cys Lys Leu Val Lys Lys Leu Trp

80 85 90

Pro Gly Thr Asn Arg Cys Asn Gly Ser Gly Arg Asp Gln Arg Leu

95 100 105

Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr

110 115 120

Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

125 130 135

Ile Thr Ser Gly Ser Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu

140 145 150

Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu

155 160 165

Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala

170 175 180

Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly

185 190 195

Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu

200 205 210

Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu

215 220 225

Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

230 235 240

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly

245 250 255

Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu

260 265 270

Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu

275 280 285

Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser

290 295 300

Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala

305 310 315

Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

320 325 330

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

335 340 345

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala

350 355 360

Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu

365 370 375

Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg

380 385 390

Ser Glu

<210> 180

<211> 195

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> CD70

<400> 180

Met Leu Gly Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg

1 5 10 15

Pro Tyr Gly Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala

20 25 30

Gly Leu Val Ile Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln

35 40 45

Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala

50 55 60

Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu

65 70 75

Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly

80 85 90

Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile

95 100 105

Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr

110 115 120

Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys

125 130 135

Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His

140 145 150

Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg

155 160 165

Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser

170 175 180

Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro

185 190 195

<210> 181

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD70mincyto

<400> 181

Met Leu Gly Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Ile Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln

20 25 30

Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala

35 40 45

Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu

50 55 60

Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly

65 70 75

Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile

80 85 90

Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr

95 100 105

Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys

110 115 120

Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His

125 130 135

Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg

140 145 150

Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser

155 160 165

Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro

170 175 180

<210> 182

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD70mincyto-OX40

<400> 182

Met Leu Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

1 5 10 15

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala

20 25 30

Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Ser Gly Ser Gly Cys

35 40 45

Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile

50 55 60

Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln

65 70 75

Leu Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu

80 85 90

Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly

95 100 105

Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp

110 115 120

Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His

125 130 135

Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg

140 145 150

His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser

155 160 165

Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr

170 175 180

Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu

185 190 195

Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp

200 205 210

Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro

215 220

<210> 183

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD70-41BBL-OX40

<400> 183

Met Leu Gly Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

1 5 10 15

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala

20 25 30

Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Thr Ser Gly Ser Tyr Ala

35 40 45

Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro

50 55 60

Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly

65 70 75

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu

80 85 90

Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Pro Leu Glu Ser Leu

95 100 105

Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln

110 115 120

Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg

125 130 135

Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile

140 145 150

His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala

155 160 165

Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu

170 175 180

Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu

185 190 195

Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu

200 205 210

Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly

215 220 225

Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val

230 235 240

Gln Trp Val Arg Pro

245

<210> 184

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19.BB.Z

<400> 184

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

20 25 30

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg

35 40 45

Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu

65 70 75

His Ser Cys Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

80 85 90

Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala

95 100 105

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly

110 115 120

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

125 130 135

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser

140 145 150

Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

155 160 165

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile

170 175 180

Arg Gln Pro Pro Arg Lys Cys Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp

185 190 195

Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

200 205 210

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met

215 220 225

Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

305 310 315

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

320 325 330

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

335 340 345

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

350 355 360

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

365 370 375

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

380 385 390

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

395 400 405

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

410 415 420

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

425 430 435

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

440 445 450

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

455 460 465

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 185

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 178（41BBL-13W-OX40）的序列

<400> 185

atgctggggc gcgaccagag gctgccacct gacgcacaca agccacctgg 50

tgggggctca tttcgaactc ccatccagga agagcaggcc gacgcacaca 100

gtacccttgc caaaatcact agtggaagtt ggccaccggc gccaagagct 150

agagcttgca gagtgttgcc ttgggctttg gtggccggac tgctgctcct 200

gctgctgctg gctgctgcct gtgccgtgtt tctcgcatgt ccttgggctg 250

tgtccggtgc aagagcctct cctggatctg ccgcgagtcc gcgcctgcga 300

gagggaccag aattgtcacc ggatgaccct gcaggccttc tcgatctcag 350

gcaaggaatg tttgcgcagc tggtggcaca aaacgtgttg cttatagacg 400

gaccacttag ctggtattct gatcccggcc tggccggggt ttcattgacc 450

ggcggccttt cctacaagga agataccaag gaactggtgg tcgccaaggc 500

cggagtatac tatgttttct tccaattgga gttgcggcgc gtcgtggcag 550

gggaagggag cggttctgtc tctttggctc tccacctgca acccttgaga 600

tccgcggctg gagctgcagc tttggcgctc actgttgacc tgccacctgc 650

aagttccgag gctcggaact cagcgttcgg gtttcaaggc agactgctgc 700

acctgagcgc cgggcaaaga cttggtgtac acttgcacac tgaggctaga 750

gcccgccacg cttggcaact cacacaaggg gctacagtgc ttggcctgtt 800

ccgagtaacg cccgaaattc cagcgggcct gccaagtcct agatctgaa 849

<210> 186

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 179（41BBL-OX40-IL2RB）的序列

<400> 186

atgctggggg tgctgcacac accagatcag ggacagctgg aacagctgag 50

cctgtacgcc gacaccaatc tgcctctgct gcagaccgtg aaggaccgcg 100

aactggtgga actgcctagc atcgaacctg ctctcggcgg acctagcttt 150

agcagcagcc catttcctag cagcctgtgg aaacaggtgg acggcggcca 200

cgaatctagc ctgcagagct tcttcaagag ccccgatcct accaactgca 250

agctggtcaa gaagctgtgg cccggcacca acagatgcaa cggcagcggc 300

cgcgaccaga ggctgccacc tgacgcacac aagccacctg gtgggggctc 350

atttcgaact cccatccagg aagagcaggc cgacgcacac agtacccttg 400

ccaaaatcac tagtggaagt tatgccagtg acgcatctct cgatcccgaa 450

gccccttggc caccggcgcc aagagctaga gcttgcagag tgttgccttg 500

ggctttggtg gccggactgc tgctcctgct gctgctggct gctgcctgtg 550

ccgtgtttct cgcatgtcct tgggctgtgt ccggtgcaag agcctctcct 600

ggatctgccg cgagtccgcg cctgcgagag ggaccagaat tgtcaccgga 650

tgaccctgca ggccttctcg atctcaggca aggaatgttt gcgcagctgg 700

tggcacaaaa cgtgttgctt atagacggac cacttagctg gtattctgat 750

cccggcctgg ccggggtttc attgaccggc ggcctttcct acaaggaaga 800

taccaaggaa ctggtggtcg ccaaggccgg agtatactat gttttcttcc 850

aattggagtt gcggcgcgtc gtggcagggg aagggagcgg ttctgtctct 900

ttggctctcc acctgcaacc cttgagatcc gcggctggag ctgcagcttt 950

ggcgctcact gttgacctgc cacctgcaag ttccgaggct cggaactcag 1000

cgttcgggtt tcaaggcaga ctgctgcacc tgagcgccgg gcaaagactt 1050

ggtgtacact tgcacactga ggctagagcc cgccacgctt ggcaactcac 1100

acaaggggct acagtgcttg gcctgttccg agtaacgccc gaaattccag 1150

cgggcctgcc aagtcctaga tctgaa 1176

<210> 187

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 180（CD70）的序列

<400> 187

atgctgggac ctgaggaggg cagcggctgc agcgtgagga ggaggcccta 50

cggctgcgtg ctgagggccg ccctggtgcc cctggtggcc ggcctggtga 100

tctgcctggt ggtgtgcatc cagaggttcg cccaggccca gcagcagctg 150

cccctggaga gcctgggctg ggacgtggcc gagctgcagc tgaaccacac 200

cggcccccag caggacccta gactgtactg gcaaggcgga cctgctctgg 250

gcagatcttt tctgcacggc cccgagctgg ataagggcca gctgagaatc 300

caccgcgacg gcatctacat ggtgcacatc caagtgaccc tggccatctg 350

cagcagcacc acagcctcta gacatcaccc taccacactg gccgtgggca 400

tctgttctcc agccagcaga tctatcagcc tgctgcggct gagcttccac 450

cagggatgta caatcgccag ccagagactg acccctctgg ctagaggcga 500

taccctgtgc accaatctga ccggcacact gctgcccagc cggaacaccg 550

atgagacatt ctttggcgtg cagtgggtcc gacct 585

<210> 188

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 181（CD70-mincyto）的序列

<400> 188

atgctggggt gcgtgctgag ggccgccctg gtgcccctgg tggccggcct 50

ggtgatctgc ctggtggtgt gcatccagag gttcgcccag gcccagcagc 100

agctgcccct ggagagcctg ggctgggacg tggccgagct gcagctgaac 150

cacaccggcc cccagcagga ccctagactg tactggcaag gcggacctgc 200

tctgggcaga tcttttctgc acggccccga gctggataag ggccagctga 250

gaatccaccg cgacggcatc tacatggtgc acatccaagt gaccctggcc 300

atctgcagca gcaccacagc ctctagacat caccctacca cactggccgt 350

gggcatctgt tctccagcca gcagatctat cagcctgctg cggctgagct 400

tccaccaggg atgtacaatc gccagccaga gactgacccc tctggctaga 450

ggcgataccc tgtgcaccaa tctgaccggc acactgctgc ccagccggaa 500

caccgatgag acattctttg gcgtgcagtg ggtccgacct 540

<210> 189

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 182（CD70-mincyto-OX40）的序列

<400> 189

atgctggggc gcgaccagag gctgccacct gacgcacaca agccacctgg 50

tgggggctca tttcgaactc ccatccagga agagcaggcc gacgcacaca 100

gtacccttgc caaaatcact agtggaagtg gatgcgtgct gagggccgcc 150

ctggtgcccc tggtggccgg cctggtgatc tgcctggtgg tgtgcatcca 200

gaggttcgcc caggcccagc agcagctgcc cctggagagc ctgggctggg 250

acgtggccga gctgcagctg aaccacaccg gcccccagca ggaccctaga 300

ctgtactggc aaggcggacc tgctctgggc agatcttttc tgcacggccc 350

cgagctggat aagggccagc tgagaatcca ccgcgacggc atctacatgg 400

tgcacatcca agtgaccctg gccatctgca gcagcaccac agcctctaga 450

catcacccta ccacactggc cgtgggcatc tgttctccag ccagcagatc 500

tatcagcctg ctgcggctga gcttccacca gggatgtaca atcgccagcc 550

agagactgac ccctctggct agaggcgata ccctgtgcac caatctgacc 600

ggcacactgc tgcccagccg gaacaccgat gagacattct ttggcgtgca 650

gtgggtccga cct 663

<210> 190

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 183（CD70EC-41BBL-OX40）的序列

<400> 190

atgctggggc gcgaccagag gctgccacct gacgcacaca agccacctgg 50

tgggggctca tttcgaactc ccatccagga agagcaggcc gacgcacaca 100

gtacccttgc caaaatcact agtggaagtt atgccagtga cgcatctctc 150

gatcccgaag ccccttggcc accggcgcca agagctagag cttgcagagt 200

gttgccttgg gctttggtgg ccggactgct gctcctgctg ctgctggctg 250

ctgcctgtgc cgtgtttctc cagaggttcg cccaggccca gcagcagctg 300

cccctggaga gcctgggctg ggacgtggcc gagctgcagc tgaaccacac 350

cggcccccag caggacccta gactgtactg gcaaggcgga cctgctctgg 400

gcagatcttt tctgcacggc cccgagctgg ataagggcca gctgagaatc 450

caccgcgacg gcatctacat ggtgcacatc caagtgaccc tggccatctg 500

cagcagcacc acagcctcta gacatcaccc taccacactg gccgtgggca 550

tctgttctcc agccagcaga tctatcagcc tgctgcggct gagcttccac 600

cagggatgta caatcgccag ccagagactg acccctctgg ctagaggcga 650

taccctgtgc accaatctga ccggcacact gctgcccagc cggaacaccg 700

atgagacatt ctttggcgtg cagtgggtcc gacct 735

<210> 191

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 191

acaaaacugu gcuagacaug 20

<210> 192

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 192

gagaaucaaa aucggugaau 20

<210> 193

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 193

cucucagcug guacacggca 20

<210> 194

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 194

acccgagguc gcuguguuug 20

<210> 195

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 195

aggucgcugu guuugagcca 20

<210> 196

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 196

cgaccacgug gagcugagcu 20

<210> 197

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sgRNA

<400> 197

gauacugccu gagcagccgc 20

<210> 198

<211> 316

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 带有弗林蛋白酶位点的NY-ESO-1 TRB

<400> 198

Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp

1 5 10 15

Ala Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln

20 25 30

Val Leu Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp

35 40 45

Met Asn His Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met

50 55 60

Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp

65 70 75

Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr

80 85 90

Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr

95 100 105

Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu

110 115 120

Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu

125 130 135

Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu

140 145 150

Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

155 160 165

Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

170 175 180

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu

185 190 195

Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

200 205 210

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

215 220 225

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

230 235 240

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr

260 265 270

Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu

275 280 285

Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu

290 295 300

Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Arg Ala Lys Arg

305 310 315

Ser

<210> 199

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> NY-ESO-1 TRA

<400> 199

Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln

1 5 10 15

Trp Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Val Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr

35 40 45

Asp Ser Ala Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu

65 70 75

Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly

80 85 90

Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala

95 100 105

Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile

110 115 120

Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile

125 130 135

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

140 145 150

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

155 160 165

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys

170 175 180

Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala

185 190 195

Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe

200 205 210

Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu

215 220 225

Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

230 235 240

Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile

245 250 255

Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

260 265 270

Leu Trp Ser Ser

<210> 200

<211> 948

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> NY-ESO-1 TRB DNA

<400> 200

atgtctatcg gcctgctgtg ttgtgccgct ctgtctctgc tttgggccgg 50

acctgttaat gccggcgtga cccagacacc taagttccag gtgctgaaaa 100

ccggccagag catgaccctg cagtgcgccc aggatatgaa ccacgagtac 150

atgagctggt acagacagga ccctggcatg ggcctgagac tgatccacta 200

ttctgtcgga gccggcatca ccgaccaggg cgaagttcct aatggctaca 250

acgtgtccag aagcaccacc gaggacttcc cactgagact gctgtctgcc 300

gctcctagcc agaccagcgt gtacttttgt gccagcagct acgtgggcaa 350

caccggcgag ctgttttttg gcgagggcag cagactgacc gtgctggaag 400

atctgaagaa cgtgttccca ccagaggtgg ccgtgttcga gccttctgag 450

gccgagatca gccacacaca gaaagccaca ctcgtgtgtc tggccaccgg 500

cttctatccc gatcacgtgg aactgtcttg gtgggtcaac ggcaaagagg 550

tgcacagcgg cgtcagcaca gatccccagc ctctgaaaga acagcccgct 600

ctgaacgaca gccggtactg tctgtcctcc agactgagag tgtccgccac 650

cttctggcag aaccccagaa accacttcag atgccaggtg cagttctacg 700

gcctgagcga gaacgatgag tggacccagg atagagccaa gcctgtgaca 750

cagatcgtgt ctgccgaagc ctggggcaga gccgattgtg gctttaccag 800

cgagagctac cagcagggcg ttctgtctgc caccatcctg tacgagatcc 850

tgctgggcaa agccactctg tacgccgtgc tggtgtctgc cctggtgctg 900

atggccatgg tcaagcggaa ggacagtaga ggcagagcca agagaagc 948

<210> 201

<211> 822

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> NY-ESO-1 TRA DNA

<400> 201

atggaaacac tgctgggcct gctgatcctg tggctgcaac tgcaatgggt 50

gtcctccaag caagaagtga ctcagatccc agccgctctg agtgtgccag 100

agggcgaaaa cctggtcctg aactgcagct tcaccgacag cgccatctac 150

aacctgcagt ggttcagaca agatcccggc aagggactga ccagcctgct 200

gctgattcag agcagccaga gagagcagac ctccggcaga ctgaatgcca 250

gcctggataa gagcagcggc cggtctacac tgtatatcgc cgcatctcag 300

cctggcgata gcgccacata tctgtgtgcc gtgcgacctc tgtacggcgg 350

cagctacatc cctacatttg gcagaggcac cagcctgatc gtgcacccct 400

acattcagaa ccccgatcct gccgtgtatc agctgagaga cagcaagtcc 450

agcgacaaga gcgtgtgcct gttcaccgac ttcgactccc agaccaatgt 500

gtcccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgataag acagtgctgg 550

acatgcggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggtccaac 600

aagagcgatt tcgcctgcgc caacgccttc aacaacagca ttatccccga 650

ggacacattc ttcccaagtc ctgagagcag ctgcgacgtg aagctggtgg 700

aaaagagctt cgagacagac accaacctga acttccagaa cctgagcgtg 750

atcggcttcc ggattctgct gctcaaggtg gccggcttca acctgctgat 800

gaccctgaga ctctggtcca gc 822

<210> 202

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MSCV启动子

<400> 202

tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt 50

tgcaaggcat ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg 100

ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 150

agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg 200

gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc 250

ccaaggacct gaaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt 300

cgcttctcgc ttctgttcgc gcgtttctgc tccccgagct caataaaaga 350

gcccacaacc cctcact 367

<210> 203

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMLV启动子

<400> 203

aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat 50

tttgcaaggc atggaaaaat acataactga gaatagaaaa gttcagatca 100

aggtcaggaa cagatggaac agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt 150

ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat ggaacagctg 200

aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 250

gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct 350

gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc 400

gcttatgctc cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg 450

cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg ggtacccgtg tatccaataa 500

accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc cttgggaggg 550

tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catt 594

<210> 204

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EF1a启动子

<400> 204

gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag 50

aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg 100

cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg 150

agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 200

tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc 250

ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300

cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt 350

tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc 400

ctcgtgcttg agttgaggcc tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga 450

atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 500

catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata 550

gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 600

gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag 650

gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag 700

ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg 750

ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 800

atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc 850

gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 900

ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc 950

caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt 1000

ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag 1050

actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1100

cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc 1150

aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1182

<210> 205

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MND启动子

<400> 205

tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt 50

ttggcaagct aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc 100

caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga 150

acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag 200

ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 250

gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300

gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc 350

tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399

<210> 206

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A

<400> 206

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

<210> 207

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A DNA

<400> 207

gccaccaatt tcagcctgct gaaacaggct ggcgacgtgg aagagaaccc 50

tgggccc 57

<210> 208

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A

<400> 208

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 209

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A DNA

<400> 209

gaaggccgcg gcagcctgct gacctgcgga gacgtggaag aaaaccctgg 50

cccg 54

<210> 210

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NY-ESO-1 CDR3 TCRα

<400> 210

Cys Ala Val Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe

1 5 10 15

<210> 211

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NY-ESO-1 CDR3 TCRβ

<400> 211

Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe

1 5 10

<210> 212

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR.BB.Z

<400> 212

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr

20 25 30

Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn

50 55 60

Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys

65 70 75

Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr

80 85 90

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu

95 100 105

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly

110 115 120

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

125 130 135

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu

140 145 150

Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser

155 160 165

Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn

170 175 180

Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

185 190 195

Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

200 205 210

Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr

215 220 225

Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly

230 235 240

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

245 250 255

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

260 265 270

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

275 280 285

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

290 295 300

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

305 310 315

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

320 325 330

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

335 340 345

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

350 355 360

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

365 370 375

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

380 385 390

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

395 400 405

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

410 415 420

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

425 430 435

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

440 445 450

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

455 460 465

Leu Pro Pro Arg

<210> 213

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19.28.z

<400> 213

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser

20 25 30

Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

80 85 90

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

95 100 105

Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

110 115 120

Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

125 130 135

Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser

140 145 150

Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro

155 160 165

Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu

170 175 180

Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

185 190 195

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu

200 205 210

Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr

215 220 225

Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Thr Thr Thr Thr Pro Ala

245 250 255

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

260 265 270

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

275 280 285

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Arg Arg Pro Pro Ser

290 295 300

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

305 310 315

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

320 325 330

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

335 340 345

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

350 355 360

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Leu Arg Val

365 370 375

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

380 385 390

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

395 400 405

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

410 415 420

Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

425 430 435

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

440 445 450

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

455 460 465

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 214

<211> 271

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> MUC1 TRA

<400> 214

Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln

1 5 10 15

Trp Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Val Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr

35 40 45

Asp Ser Ala Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu

65 70 75

Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly

80 85 90

Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala

95 100 105

Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Ser Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe

110 115 120

Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val His Pro Asn Ile Gln Asn Pro

125 130 135

Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys

140 145 150

Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Ser Val Ser

155 160 165

Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu

170 175 180

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

185 190 195

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

200 205 210

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys

215 220 225

Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu

230 235 240

Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu

245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser

260 265 270

Ser

<210> 215

<211> 309

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> MUC1 TRB

<400> 215

Met Ala Thr Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Leu Leu Gly

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ile Asp Ala Arg Val Thr Gln Thr Pro Arg His Lys

20 25 30

Val Thr Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Met Arg Cys Gln Pro Ile

35 40 45

Leu Gly His Asn Thr Val Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Leu Leu Ala Tyr Phe Arg Asn Arg Ala Pro Leu Asp

65 70 75

Asp Ser Gly Met Pro Lys Asp Arg Phe Ser Ala Glu Met Pro Asp

80 85 90

Ala Thr Leu Ala Thr Leu Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp

95 100 105

Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Gly Leu Gly Glu Gly Arg Gly

110 115 120

Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu

125 130 135

Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu

140 145 150

Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

155 160 165

Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

170 175 180

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu

185 190 195

Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

200 205 210

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His

215 220 225

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

230 235 240

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr

260 265 270

Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu

275 280 285

Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu

290 295 300

Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

305

<210> 216

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MUC1 TRA CDR3

<400> 216

Cys Ala Val Thr Ser Ser Tyr Gly Lys Leu Thr Phe

1 5 10

<210> 217

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MUC1 TRB CDR3

<400> 217

Cys Ala Ser Gly Leu Gly Glu Gly Arg Gly Tyr Thr Phe

1 5 10

<210> 218

<211> 271

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> MAGE-A4 TRA

<400> 218

Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln

1 5 10 15

Trp Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Val Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr

35 40 45

Asp Ser Ala Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu

65 70 75

Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly

80 85 90

Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala

95 100 105

Thr Tyr Leu Cys Ala Val Gly Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly

110 115 120

Lys Gly Thr Val Leu Leu Val Ser Pro Asp Asn Ile Gln Asn Pro

125 130 135

Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys

140 145 150

Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser

155 160 165

Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu

170 175 180

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

185 190 195

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

200 205 210

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys

215 220 225

Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu

230 235 240

Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu

245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser

260 265 270

Ser

<210> 219

<211> 308

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> MAGE-A4 TRB

<400> 219

Met Ser Ile Ser Leu Leu Cys Cys Ala Ala Phe Pro Leu Leu Trp

1 5 10 15

Ala Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Arg

20 25 30

Ile Leu Lys Ile Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp

35 40 45

Met Asn His Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met

50 55 60

Gly Leu Lys Leu Ile Tyr Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp

65 70 75

Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr

80 85 90

Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Glu Leu Ala Ala Pro Ser Gln Thr

95 100 105

Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Ser Arg Trp Ser Pro Leu

110 115 120

His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn

125 130 135

Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala

140 145 150

Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr

155 160 165

Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

170 175 180

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

185 190 195

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg

200 205 210

Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

215 220 225

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp

230 235 240

Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

245 250 255

Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln

260 265 270

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly

275 280 285

Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met

290 295 300

Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

305

<210> 220

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MAGE-A4 TRA CDR3

<400> 220

Cys Ala Val Gly Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe

1 5 10

<210> 221

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MAGE-A4 TRB CDR3

<400> 221

Cys Ala Ser Ser Tyr Ser Arg Trp Ser Pro Leu His Phe

1 5 10

<210> 222

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NKG2D.z

<400> 222

Met Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

1 5 10 15

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

20 25 30

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

35 40 45

Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

50 55 60

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

65 70 75

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

80 85 90

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

95 100 105

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Trp Ile Arg

110 115 120

Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser Glu Phe His Asn

125 130 135

Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr Arg Trp Gln

140 145 150

Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu Asn Ala

155 160 165

Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile

170 175 180

Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn

185 190 195

Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr

200 205 210

Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys

215 220 225

Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala

230 235 240

Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys

245 250 255

Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met

260 265 270

Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp

275 280 285

Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln

290 295 300

Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

305 310 315

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr

320 325 330

Val

Claims

1.一种编码异二聚体受体的每个单体的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含插入在编码每个所述单体的核酸之间的至少一个编码除所述单体以外的多肽的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接至相同的启动子序列。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述启动子序列选自以下各项的组：EF1α、MSCV、EF1α-HTLV-1杂合启动子、莫洛尼鼠白血病病毒、长臂猿白血病病毒、鼠乳腺肿瘤病毒、劳斯肉瘤病毒、MHCII类、凝血因子IX、胰岛素启动子、PDX1启动子、CD11、CD4、CD2、gp47启动子、PGK、β-球蛋白、UbC和MND，优选来自MSCV、MMLV、EF1α和MND。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含插入这些核酸中每一个之间的核苷酸序列，该核苷酸序列促进这些核酸的共表达。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列是编码2A自切割肽的序列或者是IRES序列。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述2A自切割肽选自T2A、P2A、E2A或F2A肽。

6.如权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是三顺反子或四顺反子。

7.如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸，其中所述异二聚体受体是外源抗原识别受体。

8.如权利要求7所述的多核苷酸，其中所述外源抗原识别受体选自B细胞受体重链和轻链异二聚体、Toll样受体1和2异二聚体、吞噬受体Mac-1、CD94 NKG2C或NKG2E受体、T细胞受体、αβT细胞受体、γδT细胞受体及其功能片段。

9.如权利要求8所述的多核苷酸，其中该外源抗原识别受体是αβT细胞受体、γδT细胞受体或其功能片段。

10.如权利要求9所述的多核苷酸，其包含A、B、C或D，其中：

(A)是由(i)-(ii)-(iii)表示的核酸，其中：

(i)是编码αβT细胞受体的α链或其功能片段的核酸，

(iii)是编码αβT细胞受体的β链或其功能片段的核酸，

其中(ii)插入在(i)和(iii)之间

(B)是由(iv)-(v)-(vi)表示的核酸，其中：

(iv)是编码αβT细胞受体的β链或其功能片段的核酸，

(vi)是编码αβT细胞受体的α链或其功能片段的核酸，

其中(v)插入在(iv)和(vi)之间

(C)是由(vii)-(viii)-(ix)表示的核酸，其中：

(vii)是编码γδT细胞受体的γ链或其功能片段的核酸，

(ix)是编码γδT细胞受体的δ链或其功能片段的核酸，

其中(viii)插入在(vi)和(ix)之间

(D)是由(x)-(xi)-(xii)表示的核酸，其中：

(x)是编码γδT细胞受体的δ链或其功能片段的核酸，

(xi)是至少一个编码γST细胞受体的γ或δ链或其功能片段以外的多肽的核酸，以及；

(xii)是编码γδT细胞受体的γ链或其功能片段的核酸，

其中(xi)插入在(x)和(xii)之间。

11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中：

12.如权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含插入在编码每个受体单体的核酸之间的核酸，该插入在编码每个受体单体的核酸之间的核酸编码能够转导至少两个胞内信号的嵌合双向信号传导跨膜蛋白，所述蛋白包含：

-跨膜结构域，和

其中第二胞内信号通过该相互作用配偶体的胞内结构域转导。

13.如权利要求12所述的多核苷酸，其中所述嵌合蛋白不是包含以下或由以下组成的蛋白：ICOSL的胞外配体结构域和跨膜结构域以及41BB的异源胞内信号传导结构域。

14.如权利要求12或13所述的多核苷酸，其中该至少两个胞内信号是可诱导的。

15.如权利要求12至14中任一项所述的多核苷酸，其中该至少两个胞内信号在一个单个细胞中产生。

16.如权利要求12-15中任一项所述的多核苷酸，其中该相互作用配偶体包含：

-跨膜结构域，和

17.如权利要求12-16中任一项所述的多核苷酸，其中该至少两个胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善。

18.如权利要求12至17中任一项所述的多核苷酸，其中

19.如权利要求15至18中任一项所述的多核苷酸，其中该细胞是免疫细胞，优选T或NK细胞。

20.如权利要求17至19中任一项所述的多核苷酸，其中该生物学参数和/或功能选自增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤。

21.如权利要求12至20中任一项所述的多核苷酸，其中：

-该胞外配体结构域包含来自肿瘤坏死因子超家族成员、细胞因子、C型凝集素、免疫球蛋白超家族成员、或抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列；并且

22.如权利要求21所述的多核苷酸，其中：

-该胞外配体结构域包含来自41BBL、OX40L、CD86、RANK或CD70的氨基酸序列，并且

-该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40、41BB、NKp80、IL18RAP或IL2RB的氨基酸序列。

23.如权利要求22所述的多核苷酸，其中：

(b)该胞外配体结构域包含来自CD86的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白CD86，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，

(c)该胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自NKp80的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白41BBL，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白NpK80，

(d)该胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白RANK，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白IL1 8RAP，

(e)该胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白RANK，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，

(f)该胞外配体结构域包含来自RANK的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自41BB的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白RANK，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白41BB，

(g)该胞外配体结构域包含来自OX40L的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自41BB的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白OX40L，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白41BB，

(h)该胞外配体结构域包含来自CD86的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自IL18RAP的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白CD86，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白IL18RAP，

(i)该胞外配体结构域包含来自CD70的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白CD70，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40，或

(j)该胞外配体结构域包含来自41BBL的氨基酸序列并且该异源胞内信号传导结构域包含来自OX40的氨基酸序列和来自IL2RB的氨基酸序列，优选地其中该胞外配体结构域来自或衍生自II型跨膜蛋白41BBL，并且该异源胞内信号传导结构域来自或衍生自I型跨膜蛋白OX40和I型跨膜蛋白IL2RB。

24.如权利要求23所述的多核苷酸，其中：

k)a)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：45、46、57、58、59、60、61、62、63、64、65、178或179具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

l)b)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：52、53或73具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

m)c)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：47或48具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

n)d)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：78具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

o)e)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：76具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

p)f)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：77具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

q)g)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：49、50或51具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

r)h)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：71或72具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，

s)i)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：182或183具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示，或

t)j)中鉴定的嵌合蛋白由与SEQ ID NO：179具有至少80％同一性或相似性的氨基酸序列表示。

25.如权利要求12-24中任一项所述的多核苷酸，其中该嵌合蛋白不包含ITAM或来自TCR信号传导复合物的胞内结构域。

26.一种多核苷酸，其编码如权利要求12-25中任一项所定义的嵌合双向信号传导跨膜蛋白。

27.一种载体，其包含如权利要求25中所定义的多核苷酸，其中优选地，所述载体是病毒载体。

28.如权利要求27所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。

29.一种多肽，其由如权利要求1-26中任一项所定义的多核苷酸或由如权利要求27或28中所定义的载体编码。

30.一种细胞，其包含如权利要求12-26中任一项所定义的多核苷酸、或如权利要求27或28中所定义的载体，优选地其中所述细胞表达所述嵌合蛋白，更优选地其中所述细胞还表达该相互作用配偶体。

31.一种细胞群，其中该细胞群包含至少一个如权利要求30所定义的细胞。

32.如权利要求30所述的细胞或如权利要求31所述的细胞群，其中这些细胞是免疫细胞，优选T细胞或NK细胞。

33.如权利要求31或32所述的细胞群，其中该细胞群进-步包含至少一个表达外源抗原识别受体的细胞。

34.如权利要求33所述的细胞群，其中至少一个表达如权利要求12-25中任一项所定义的嵌合蛋白的细胞还表达外源抗原识别受体。

35.如权利要求33或权利要求34所述的细胞群，其中该外源抗原识别受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、αβT细胞受体或γδT细胞受体。

36.如权利要求32至35中任一项所述的细胞群，其中这些T细胞是表达γδT细胞受体的αβT细胞。

37.如权利要求33-36中任一项所述的细胞群，其中当将表达如权利要求12至25中任一项所定义的嵌合蛋白的细胞暴露于表达或呈递与该外源抗原识别受体结合的抗原的细胞时，所述细胞群的增殖、细胞存活、细胞毒性、抗肿瘤活性、持久性和/或肿瘤细胞杀伤与不表达该嵌合蛋白的相应细胞群相比增加至少10％。

38.如权利要求12-26中任一项所述的多核苷酸、如权利要求12-25中任一项所定义的嵌合蛋白、如权利要求27或28所述的载体、如权利要求30所述的细胞或如权利要求31至37中任一项所述的细胞群，其中该多核苷酸、该嵌合蛋白、该载体、该细胞或该细胞群用于治疗疾病或病症，其中该至少两个胞内信号有助于表达该嵌合蛋白的细胞的生物学参数和/或功能的改善和/或由这样的细胞诱导的生物学参数和/或功能的改善，所述生物学参数有助于该疾病或病症的治疗。

39.如权利要求38所述的多核苷酸、如权利要求38所述的嵌合蛋白、如权利要求38所述的载体、如权利要求38所述的细胞或如权利要求38所述的细胞群，其中：

-该细胞是免疫细胞和/或

-该疾病是癌症。