KR20200130383A - 융합 단백질들을 이용한 tcr 재프로그래밍을 위한 조성물 및 방법들 - Google Patents

융합 단백질들을 이용한 tcr 재프로그래밍을 위한 조성물 및 방법들 Download PDF

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KR20200130383A
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패트릭 알렉산더 바우엘르
로버트 호프메이스터
다니엘 겟츠
필리프 키에퍼-권
줄리 도나헤이
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티씨알2 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질들 (TFPs) 및 TCR 불변 도메인을 인코드하는 재조합 핵산, 상기 인코드된 분자들을 발현시키는 변형된 T 세포들, 그리고 암을 비롯한 질환 치료에 이를 이용하는 방법들이 본원에서 제공된다.

Description

융합 단백질들을 이용한 TCR 재프로그래밍을 위한 조성물 및 방법들
교차-참고
본 출원은 2018년 3월 9일자로 제출된 미국 가특허출원 일련 번호 62/641,159를 청구하며, 이의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
발명의 배경
혈액 종양 또는 말기 고형 종양을 갖고 있는 대부분의 환자들은 표준 요법으로 치료할 수 없다. 또한, 전통적인 치료 옵션에는 종종 심각한 부작용이 있다. 암 세포를 거부하기 위하여 환자의 면역 체계를 사용하려는 수많은 시도가 있었고, 이들을 총괄적으로 암 면역요법이라고 부른다. 그러나, 몇 가지 장애물로 인해 임상 효과를 얻기는 다소 어렵다. 비록 수 백 가지의 소위 종양 항원이 확인되었지만, 이들은 대개 자가(self)에서 파생되어, 건강한 조직에 대해서도 암 면역요법을 지시할 수 있고, 또는 면역원성이 좋지 않다. 더욱이, 암세포는 암 면역요법에 의한 면역 공격의 개시 및 전파에 대해 스스로를 보이지 않게 하거나, 또는 거부하도록 만들기 위해 여러 메커니즘을 사용한다.
키메라 항원 수용체 (CAR) 변형된 자가조직의 T 세포 요법(유전공학적으로 공작된 T 세포들을 암 세포 상의 적합한 세포-표면 분자로 돌려보내는 것에 의존하는)을 이용한 최근 개발은 B 세포 악성종양을 치료하기 위한 면역계의 힘을 활용하는 유망한 결과를 보여준다 (가령, Sadelain 외., Cancer Discovery 3:388-398 (2013) 참고). CD19-특이적 CAR T 세포들 (일명 CTL019)을 이용한 임상 결과에서 만성 림프구 백혈병 (CLL)을 앓는 환자들, 뿐만 아니라 어린이의 급성 림프아구성 백혈병 (ALL)의 완벽한 완화(remissions)를 보여주었다(가령, Kalos 외., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter 외., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp 외., NEJM 368:1509-1518 (2013) 참고). 대안적인 접근법은 자가조직의 T 세포들의 유전공학적 공작을 위한 종양-연합된 펩티드 항원에 대하여 선별된 세포 수용체 (TCR) 알파 쇄와 베타 쇄의 사용이다. 이들 TCR 쇄는 완전한 TCR 복합체들을 형성하고, 제 2 정의된 특이성을 갖는 TCR을 갖는 T 세포들을 제공한다. 활막 암종 환자에서 NY-ESO-1-특이적 TCR 알파 쇄와 베타 쇄를 발현시키는 공작된 자가조직의 T 세포들로부터 고무적인 결과를 얻었다.
시험관내/생체외에서 각각의 표적 세포들을 인지하고, 파괴하기 위하여 CAR 또는 제 2 TCR을 발현시키는 유전공학적으로 변형된 T 세포들에 대한 능력이외에, 공작된 T 세포들를 이용한 환자 요법이 성공할려면 이들 T 세포들은 강력한 활성화, 확장, 시간이 경과해도 지속적이어야 하고, 그리고 재발 질환의 경우, "기억" 반응이 가능해야 한다. CAR T 세포들의 관리가능한 높은 임상 효과는 CD19-양성 B 세포 악성종양과 HLA-A2를 발현시키는 NY-ESO-1-펩티드 발현하는 활액 육종 환자들에게 현재 국한된다.
본 발명의 요약
각종 인간 악성종양에 대하여 더 광범위하게 작용하도록 유전공학적으로 공작된 T 세포들을 개선시킬 필요성이 분명히 있다.
세포 표면 항원에 대한 특이적 결합 도메인과 함께, CD3 입실론, CD3감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 TCR 소단위를 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 기존 접근법의 한계를 극복할 잠재력을 갖는 변형된 T 세포를 본원에서 제공한다. 추가적으로, 이들 변형된 T 세포는 내인성(endogenous) TCR (가령 TCR 알파, 베타 또는 이둘 모두)의 기능적 파괴를 보유할 수 있다. 이들 변형된 T 세포는 CARs과 필적할 수준의 또는 더 낮은 수준의 전-염증성 사이토킨을 방출하지만, 이보다는 더 효과적으로 표적 세포들을 사멸 시키는 능력을 보유할 수 있다. 이들 변형된 T 세포와 이를 이용하는 방법은 CARs과 비교하여 이들 세포에 더 이익을 제시할 수 있는데, 그 이유는 상승된 수준의 사이토킨은 채택성 CAR-T 요법의 투여분량-제한 독성(dose-limiting toxicities)과 연관되기 때문이다
T-세포 수용체 (TCR) 융합 단백질 (TFP)과 TCR 불변 도메인을 포함하는 변형된 T-세포, 이러한 변형된 T 세포들을 만드는 방법, 그리고 질환 치료용으로 이들을 이용하는 방법들이 본원에서 제공된다.
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii)항체 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 결합 리간드 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열; 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인, TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인, TCR 감마 불변 도메인, TCR 델타 불변 도메인, 또는 TCR 감마 불변 도메인과 TCR 델타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 항체는 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다.
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 항체 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 결합 리간드 또는 이의 단편; 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인, TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 결합 도메인 또는 이의 단편은 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함하는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 상기 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 IgG1 항체에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 IgG1 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 세포 표면 항원에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 종양 세포의 표면 상에 있는 세포 표면 항원에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 단량체(monomer), 이량체(dimer), 삼량체(trimer), 사량체(tetramer), 오량체(pentamer), 육량체(hexamer), 칠량체(heptamer), 팔량체(octomer), 구량체(nonamer), 또는 십량체(decamer)를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 항체 또는 이의 단편을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 CD16 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 CD 16-결합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 인간 또는 인간화된다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 상기 결합 리간드에 의해 결합될 수 있는 항체 또는 이의 단편을 인코드하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 세포로부터 분비될 수 있다.
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 세포 표면 상에 발현되는 수용체 또는 폴리펩티드에 결합하는 리간드 또는 이의 단편을 포함하는 항원 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 서열, 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인, TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 항원 도메인은 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함하는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 리간드를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 리간드는 세포의 수용체에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 리간드는 상기 세포 표면 상에 발현되는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 경우에서, 세포 표면 상에 발현되는 상기 수용체 또는 폴리펩티드는 스트레스 응답(stress response) 수용체 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 세포 표면 상에 발현되는 상기 수용체 또는 폴리펩티드는 MHC 클래스 I-관련된 당단백질이다. 일부 경우에서, 상기 MHC 클래스 I-관련된 당단백질은 MICA, MICB, RAET1E, RAET1G, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 상기 리간드 또는 이의 단편의 단량체 또는 이량체를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 리간드 또는 이의 단편은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체이다. 일부 경우에서, 상기 리간드 또는 이의 단편은 단량체 또는 이량체다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 항체 또는 이의 단편을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 가변 영역을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 CDR을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 리간드 또는 이의 단편은 천연 킬러 그룹(Natural Killer Group) 2D (NKG2D) 리간드 또는 이의 단편이다.
일부 구체예들에서, 상기에서 개시된 재조합 핵산의 경우, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 상기 TFP를 통합시킨 기능적 TCR 복합체와 동일한 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자 안에 내포된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자들 안에 내포된다. 일부 경우에서, 상기 TCR 소단위와 상기 항체 도메인, 상기 항원 도메인 또는 상기 결합 리간드 또는 이의 단편은 링커(linker) 서열에 의해 작동가능하도록 연계된다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 4이다. 일부 경우에서, 상기 막경유 도메인은 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 TCR 막경유 도메인이다. 일부 경우에서, 상기 세포내 도메인은 오로지 CD3 입실론, 오로지 CD3 감마, 오로지 CD3 델타, 오로지 TCR 알파 또는 오로지 TCR 베타에서만 유래된다. 일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (ii) TCR 막경유 도메인, 그리고 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 이때 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 두 개는 동일한 TCR 소단위로부터 유래된다. 일부 경우에서, 상기 TCR 세포외 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부분을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 막경유 도메인을 포함하는 막경유 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 입실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 공동자극 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 그리고 4-1BB (CD137), 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, TCR 제타 쇄, Fc 입실론 수용체 1 쇄, Fc 입실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP (DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이의 기능적 단편들, 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 일부분을 포함하는 TCR 소단위의 ITAM을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 입실론의 ITAM을 대체한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택된 상이한 ITAM을 대체한다. 일부 경우에서, 상기 TFP, 상기 TCR 알파 불변 도메인, 상기 TCR 베타 불변 도메인, 그리고 이의 임의의 조합은 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 일부 경우에서, (a) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인이고, 상기 TFP는 TCR 베타, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; (b) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 TCR 알파, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; 또는 (c) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인과 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 이에 대하여 적어도 하나, 그러나 20개를 넘지 않는 변형은 세포 신호전달을 중개하는 아미노산의 변형, 또는 상기 TFP에 결합하는 리간드에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항체 단편이다. 일부 경우에서, 상기 항체 단편은 scFv, 단일 도메인 항체 도메인, VH 도메인 또는 VL 도메인이다. 일부 경우에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항-CD19 결합 도메인, 항-B-세포 성숙 항원 (BCMA) 결합 도메인, 항-메소텔린 (MSLN) 결합 도메인, 항-IL13Rα2 결합 도메인, 항-MUC16 결합 도메인, 항-CD22 결합 도메인, 항-PD-1 결합 도메인, 항-BAFF 또는 BAFF 수용체 결합 도메인, 그리고 항-ROR-1 결합 도메인으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 mRNA이다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 핵산 유사체(analog)를 포함하고, 이때 상기 핵산 유사체는 이 재조합 핵산의 인코딩 서열에 존재하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 핵 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오르, 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 변형된, 잠김(locked) 핵산 (LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 펩티드 핵산 (PNA), 무수헥시톨 핵산 (HNA), 몰포리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 그리고 2'-플루오르 N3-P5'-포스포라미디트로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 리더(leader) 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 프로모터 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 poly(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 3'UTR 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 단리된 핵산이거나, 또는 비-자연 발생적 핵산이다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산이다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열과 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 재조합 핵산을 포함하는 벡터가 본원에서 기술된다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터 (AAV), Rous 육종 바이러스 (RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 AAV6 벡터이다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 프로모터를 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 시험관내 전사된 벡터이다.
일부 구체예들에서, 상기에서 기술된 재조합 핵산, 또는 상기에서 기술된 벡터를 포함하는 변형된 T 세포가 본원에서 기술되며; 이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기에서 기술된 핵산의 TFP를 인코딩하는 서열, 또는 상기에서 기술된 상기 TFP를 인코드하는 핵산의 서열에 의해 인코드된 TFP를 포함하는 변형된 T 세포를 본원에서 추가 개시하며, 이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함한다. 상기에서 기술된 TFP를 인코딩하는 서열, 또는 상기에서 기술된 TFP를 인코드하는 핵산의 서열에 의해 인코드된 TFP를 포함하는 변형된 동종이계(allogenic) T 세포를 본원에서 또한 기술한다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 이종기원의 서열을 더 포함하며, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이다. 일부 경우에서, 상기 기능적으로 파괴된 내인성 TCR은 내인성 TCR 알파 쇄, 내인성 TCR 베타 쇄, 또는 내인성 TCR 알파 쇄 및 내인성 TCR 베타 쇄이다. 일부 경우에서, 상기 기능적으로 파괴된 내인성 TCR은 변형안된 대조군 T 세포의 것과 비교하여, MHC-펩티드 복합체에 대한 결합이 감소된다. 일부 경우에서, 상기 기능적 파괴란 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자의 파괴를 말한다. 일부 경우에서, 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자의 파괴란 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자 서열을 이 T 세포의 게놈으로부터 제거함을 말한다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 나이브(naive) T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이중 음성(double negative) T 세포, 작동체(effector) 기억 T 세포, 작동체 T 세포, ThO 세포, TcO 세포, Th1 세포, Tc1 세포, Th2 세포, Tc2 세포, Th17 세포, Th22 세포, 감마 델타 T 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 천연 킬러 T (NKT) 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 다능성 줄기 세포이다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 동종이계 T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 변형된 T 세포들은 세포내 신호전달 도메인의 양성 신호를 포함하는 제 2 폴리펩티드와 연합된, 저해성 분자의 적어도 일부분을 포함하는 제 1 폴리펩티드를 포함하는 저해성 분자를 인코드하는 핵산을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 저해성 분자는 PD1의 적어도 일부분을 포함하는 제 1 폴리펩티드와 공동자극 도메인과 일차(primary) 신호전달 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구체예들에서, (a) 본원의 변형된 T 세포들; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 개시된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 변형된 T 세포를 만드는 방법이 본원에서 개시되는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 TCR 유전자를 파괴하고; 이로 인하여 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포가 만들어지고; 그리고 (b) 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포로 본원에서 개시된 재조합 핵산, 또는 벡터를 형질도입시킨다. 일부 경우에서, 파괴(disrupting)는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제 단백질 또는 뉴클레아제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 상기 T 세포를 형질도입시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 변형된 T 세포를 만드는 방법이 본원에서 더 개시되는데, 상기 방법은 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포로 본원에서 개시된 재조합 핵산, 또는 벡터를 형질도입시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포는 변형안된 대조군 T 세포의 것과 비교하여, MHC-펩티드 복합체에 대한 결합이 감소된다. 일부 경우에서, 상기 뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 뉴클레아제, 또는 megaTAL 뉴클레아제이다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산 또는 상기 벡터에 포함된 서열은 내인성 TCR 소단위 유전자의 절단 부위로 삽입되고, 그리고 이때 이 내인성 TCR 소단위 유전자로 이러한 서열의 삽입으로 인하여 당해 내인성 TCR 소단위는 기능적으로 파괴된다. 일부 경우에서, 상기 뉴클레아제는 메가뉴클레아제이다. 일부 경우에서, 상기 메가뉴클레아제는 제 1 소단위와 제 2 소단위를 포함하는데, 이때 상기 제 1 소단위는 인지(recognition) 서열의 제 1 인지 절반-부위(half-site)에 결합하고, 그리고 상기 제 2 소단위는 당해 인지 서열의 제 2 인지 절반-부위에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 메가뉴클레아제는 링커를 포함하는 단일-쇄 메가뉴클레아제이며, 이때 상기 링커는 상기 제 1 소단위와 제 2 소단위를 공유적으로 연결한다.
일부 구체예들에서, 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법이 본원에서 개시되며, 상기 방법은 당해 대상체에게 본원에서 개시된 약제학적 조성물의 치료요법적으로 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법을 또한 본원에서 개시하는데, 상기 방법은 당해 대상체에게 (a) 본원에서 개시된 방법에 따라 만들어진 변형된 T 세포; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 변형된 T 세포는 동종이계 T 세포다. 일부 경우에서, 변형안된 대조군 T 세포의 효과량을 투여받은 대상체와 비교하였을 때, 당해 대상체에서 사이토킨이 덜 방출된다. 일부 경우에서, 본원에서 기술된 재조합 핵산, 또는 본원에서 기술된 벡터를 포함하는 변형된 T 세포의 효과량을 투여받은 대상체와 비교하였을 때, 당해 대상체에서 사이토킨이 덜 방출된다. 일부 경우에서, 상기 방법은 상기 약제학적 조성물의 효과를 증가시키는 제제와 조합하여, 당해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 방법은 상기 약제학적 조성물와 연합된 하나 또는 그 이상의 부작용을 경감시키는 제제와 조합하여, 당해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 암은 고형 암, 림프종 또는 백혈병이다. 일부 경우에서, 상기 암은 신장 세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 콩팥 및 위암으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 재조합 핵산, 벡터, 변형된 T 세포, 또는 약제학적 조성물을 약물로써 또는 약물 제조에 사용하는 용도를 본원에서 개시한다.
참고자료의 편입
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함된 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고자료로 편입된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 TRBC1과 TRBC2 사이의 서열 배열로써, 선택된 crRNAs은 TRBC1 서열 상에 화살표로 나타낸다.
도 2A-B는 TRA-편집된 (도 2A) 세포와 TRB-편집된 (도 2B) 세포에서 CD3 (SK7) 대비 TCRαβ (IP26)의 표면 발현을 나타내는 예시적인 그래프다. TRA 또는 TRB 표면 발현을 파괴하기 위하여, 야생형 Jurkat 세포들은 TRAC 또는 TRBC 유전자에서 편집되었다. CD3 및 TCRαβ에 대하여 음성인 세포들은 자기-활성화된 세포 분류법(Magnetic-Activated Cell Sorting)을 이용하여 정제되었다. 플롯 상의 게이트(gates)는 CD3 및 TCRαβ 음성-음성 세포 집단을 묘사하기 위하여 그려진 것이며, 각 사분면에 남아있는 세포의 백분율은 코너에 나타낸다.
도 3A-E는 정제 전과 후, 야생형 세포들과 편집된 (TRA/B 파괴됨) 세포들에서 CD3 대비(vs) TCRαβ의 표면 발현을 보여주는 예시적인 그래프다. 야생형 공여자 1 T 세포들 (도 3A)은 TRA 또는 TRB 표면 발현을 파괴하기 위하여, TRAC (도 3B 또는 도 3D) 또는 TRBC (도 3C 또는 도 3E) 유전자에서 편집된다. 도 3B 및 도 3C 는 편집 후 바로 CD3 대비(vs) TCRαβ 표면 마커(markers)의 상태를 보여주며, 한편 도 3D 및 도 3E에서는 자기-활성화된 세포 분류법 (MACS)을 이용한 이들의 음성 선별 후, 이들 표면 마커들의 상태를 보여준다. 플롯 상의 게이트(gates)는 CD3 및 TCRαβ 음성-음성 세포 집단을 묘사하기 위하여 그려진 것이며, 각 사분면에 남아있는 세포의 백분율은 코너에 나타낸다.
도 4는 TCR-음성 T 세포의 증식율(proliferation rates)을 관찰함으로써, 이들 세포의 동종이계성(allogenicity)을 측정하는 예시적인 그래프를 나타낸다. TCR-음성 T 세포들은 CSFE 염료로 영구적으로 표지되었고, 이 염료는 세포 분열로 인하여 이의 농도가 절반으로 줄어든다. X-축을 따라 완전한 회색 피크는 라벨안된 세포에서의 CSFE 신호를 나타내는데, 음성 대조군 사용된다. 회색 선은 임의의 자극없이 24 시간 후 세포에서 CSFE 양을 나타내고, 한편 검은 색 선은 5 일 공동 배양 (자극과 함께) 후 CSFE 양을 나타낸다. Y-축은 세포의 백분율을 나타낸다. TRA 음성 T 세포들은 위 쪽 네 개 플롯에서 나타내고, 한편 TRB 음성 T 세포들은 아래쪽 네 개 플롯에서 나타낸다. Allo 반응은 TRA KO 공여자 2 T 세포들이 상이한 일배체형(haplotype)의 공여자 (공여자 1)로부터의 PBMCs와 혼합되었음을 나타내며, Auto 반응은 동일한 공여자의 T 세포들과 PBMCs들이 공동-배양되었음을 나타낸다. PMA 및 이오노마이신 패널에서 TCR 독립적인 자극에 대한 양성 대조군을 나타내었다.
도 5에서는 동종이계 TFP T 세포들을 만들기 위한 예시적인 전력을 도시한다. 하단 숫자는 도 5에 있는 도면 번호에 대응한다. (1)에서는 항원 제시 세포와 항원 상의 MCHI과 상호작용하는 T 세포의 내인성 TCRαβ를 보여준다. (2) TRA-/- 세포 또는 TRB-/- 세포에서 TFP 결합체(binder)에 융합된 TRAC와 TRBC의 공동 발현을 보여준다. (3) TRA-/- 세포 또는 TRB-/- 세포에서 TFP 결합체에 융합된 마우스 TRAC와 마우스 TRBC의 공동-발현을 보여준다. (4) TRA-/- 세포 또는 TRB-/- 세포에서 TFP 결합체에 융합된 뮤린화된 TRAC와 뮤린화된 TRBC의 공동-발현을 보여준다. (5) TRA-/- 세포들에서 TCRβ에 대한 강한 친화력을 갖는 강화된 TRAC 단백질에 의해 운반되는 TFP 결합체를 보여준다. (6) TRAC와 TRBC 사이의 상호작용을 강화시키기 위한 전략을 보여주는데, 상기 IgG 불변 도메인들은 상기 각 TCR 불변 도메인의 C-말단 단부에 융합되었다. 상기 TFP 결합체는 TRA-/- 세포 또는 TRB-/- 세포에서 IgG 불변 도메인의 C-말단 단부에 융합된다. (7) TRAC 및 TRBC의 N-말단 부분은 차례로 TCRγ 및 TCRδ에 있는 이들의 상동성(homolog) 부분들에 의해 대체되는 전략을 보여준다. 상기 TFP 결합체는 TRA-/- 세포 또는 TRB-/- 세포에서 TRAC 및/또는 TRBC에 의해 운반된다.
도 6은 동종이계 TFP T 세포들의 생성을 가능하게 하는 T2A 자가-절단 서열의 녹-인(knock-in) 전략을 보여주는 을 예시적인 도식을 나타낸다.
도 7에서는 실시예 6에서 기술된 바와 같이, Luc-Cyto 검정에 의해 결정되었을 때, TCRαβ 및 CD3ε (인간) 또는 마우스 TCRβ의 표면 발현을 보여주는 예시적인 그래프를 나타낸다.
도 8은 종양 표적 세포들 (위 패널은 Nalm 6 세포이며, 아래 패널은 K562 세포들임)과 3-내지-1 비율, 1-내지-1 비율, 또는 1-내지-3 비율로 배양된 T 작동체 세포의 Luc-Cyto 분석을 보여주는 예시적인 그래프를 나타낸다. 표적 (CD19 양성) 세포들은 좌측 패널에 나타낸다. x-축은 종양 세포 용해(lysis) 백분율을 나타낸다.
도 9A-C에서는 야생형 세포들 (도 9A), TRB KO 세포들(형질도입없이) (도 9B), TCRβ 전장 (FL) TFPs로 형질도입된 TRB KO 세포들 (도 9C)에서 CD3 대비(vs) TCRαβ의 표현 발현을 나타내는 예시적인 그래프를 도시한다. 플롯 상의 게이트(gates)는 CD3 및 TCRαβ 음성-음성 세포 집단을 묘사하기 위하여 그려진 것이며, 각 사분면에 남아있는 세포의 백분율은 코너에 나타낸다.
도 10A-B에서는 인간 TRBC 유전자로 형질도입되거나 (도 10A), 뮤린 TRAC-T2A-TRBC 유전자로 형질도입된 (도 10B) TRB 녹아웃(knockout) 세포들에서 CD3 대비(vs) TCRαβ의 표현 발현을 나타내는 예시적인 그래프를 도시한다. 플롯 상의 게이트(gates)는 CD3 및 TCRαβ 음성-음성 세포 집단을 묘사하기 위하여 그려진 것이며, 각 사분면에 남아있는 세포의 백분율은 코너에 나타낸다.
발명의 상세한 설명
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, 또는 TCR 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 항체 또는 인간화된 항체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질 (TFP)을 인코딩하는 서열; 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 상기 항체는 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다.
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 항체 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 결합 리간드 또는 이의 단편을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 서열; 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인, TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 결합 도메인 또는 이의 단편은 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다.
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 세포 표면 상에 발현되는 수용체 또는 폴리펩티드에 결합하는 리간드 또는 이의 단편을 포함하는 항원 도메인항원 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 서열, 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인, TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 항원 도메인은 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 재조합 핵산을 포함하는 벡터가 본원에서 기술된다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 재조합 핵산, 또는 본원에서 기술된 벡터를 포함하는 변형된 T 세포가 본원에서 기술되며; 이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 핵산의 TFP를 인코딩하는 서열, 또는 본원에서 기술된 핵산의 서열에 의해 인코드된 TFP를 포함하는 변형된 T 세포를 본원에서 추가 개시하며, 이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 TFP를 인코딩하는 서열 또는 본원에서 개시된 핵산 서열에 의해 인코드된 TFP를 포함하는 변형된 동종이계 T 세포들이 본원에서 개시된다.
일부 구체예들에서, (a) 본원의 변형된 T 세포들; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물들이 본원에서 개시된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 변형된 T 세포를 만드는 방법들이 본원에서 개시되는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 TCR 유전자를 파괴하고; 이로 인하여 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포가 만들어지고; 그리고 (b) 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포로 본원의 재조합 핵산, 또는 본원에서 개시된 벡터를 형질도입시킨다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 변형된 T 세포를 만드는 방법들이 본원에서 더 개시되는데, 상기 방법은 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포로 본원에서 개시된 재조합 핵산, 또는 본원에서 개시된 벡터를 형질도입시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법들 본원에서 개시되며, 상기 방법은 당해 대상체에게 본원에서 개시된 약제학적 조성물들의 치료요법적으로 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법들을 본원에서 개시하는데, 상기 방법은 당해 대상체에게 (a) 본원에서 개시된 방법에 따라 만들어진 변형된 T 세포; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
특정 용어
명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명에 속하는 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
용어 단수 관사("a" 및 "an")은 당해 글의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상 (가령, 적어도 하나)을 지칭한다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약(about)"이란 당업자에게 인지된 또는 인지가능한 여부 및 상황에 따라, 플러스 또는 마이너스 1 미만, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 또는 30 퍼센트 이상을 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상체(subject)" 또는 "대상체들(subjects)" 또는 "개체들(individuals)"이란 인간 또는 인간이 아닌 포유류와 같은 포유동물, 예를 들어 가축, 농업용 동물 또는 야생 동물, 뿐만 아니라, 조류 및 수생 동물을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. "환자들"는 질병, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 또는 발병 위험이 있거나 또는 그렇지 않으면, 본원에 제공된 조성물 및 방법을 필요로 하는 대상체들이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 병태의 치료 또는 개선에서 성공을 나타내는 임의의 표시를 지칭한다. 치료는 예를 들어, 질병 또는 병태의 하나 또는 그 이상의 증상의 심각성을 감소, 지연 또는 완화하는 것을 포함할 수 있거나, 또는 환자가 경험하는 질병, 결함, 장애 또는 불리한 상태 및 이와 유사한 것들의 증상이 나타나는 빈도를 줄이는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료 또는 예방"은 때때로 질병 또는 병태의 일부 수준의 치료 또는 개선을 초래하는 방법을 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 이러한 병태를 완전히 예방하는 것을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 범위의 결과들이 고려된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방"은 환자에서 질환 또는 병태, 예를 들어, 종양 형성의 예방을 의미한다. 예를 들어, 종양 또는 다른 형태의 암이 발생할 위험이 있는 개체가 본 개시 내용의 방법으로 치료되고, 이후 종양 또는 다른 형태의 암이 발생하지 않는다면, 이 질환은 적어도 당해 개체에서 일정 기간에 걸쳐 예방되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료요법적 유효량"이란 당해 조성물이 투여된 개체에서 유익한 효과를 제공하기에 충분한, 또는 그렇지 않으면 이러한 개체에서 유해한 비-유익한 효과를 감소시키기에 충분한 당해 조성물 또는 이의 활성 성분의 양을 말한다. 본원에서 "치료요법적 효과적인 투여량"이란 주어진 기간에 걸쳐 일회 또는 그 이상의 횟수로 투여될 때, 이러한 투여에 대한 한 가지 또는 그 이상의 원하는 또는 바람직한(가령, 유익한) 효과를 만들어내는 투여량(dose)을 의미한다. 정확한 투여량은 치료 목적에 따라 다르며, 공지된 기술을 사용하여 당업자가 확인할 수 있다 (가령, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); 그리고 Pickar, Dosage Calculations (1999) 참고)
본원에서 사용된 바와 같이, "T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"에는 일반적으로, i) 표적 세포들 상의 표면 항원에 결합할 수 있고, 그리고 ii) T 세포의 표면 또는 표면 상에 공동-위치될 때, 전형적으로 무손상(intact) TCR 복합체의 다른 폴리펩티드 성분들과 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 각종 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드가 내포된다.
용어 "자극(stimulation)"이란 자극 도메인 또는 자극 분자 (가령, TCR/CD3 복합체)가 이의 동계(cognate) 리간드에 결합함으로써 유도된 일차(primary) 반응을 지칭하고, 이로 인하여 신호 변환 사건, 이를 테면, 상기 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 변환을 포함하나, 이에 국한되지 않은 사건을 중재한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현 및/또는 세포골격 구조의 재구성 및 이와 유사한 것 등을 중재할 수 있다.
용어 "자극 분자" 또는 "자극 도메인"이란 T 세포에 의해 발현되는 분자 또는 이의 일부분을 지칭하는데, 이는 상기 T 세포신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대하여 자극 방식으로 TCR 복합체의 일차(primary) 활성화를 조정하는 일차(primary) 세포질 신호전달 서열(들)을 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 일차 신호는 예를 들면, TCR/CD3 복합체가 펩티드가 적재된(loaded) MCH 분자에 결합함으로써 개시되며, 그리고 이로써 증식, 활성화, 분화, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 T 세포 반응의 조정으로 이어진다. 자극 방식으로 작용하는 일차(primary) 세포질 신호전달 서열 (일명 "일차(primary) 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 또는 "ITAM"으로 공지된 신호전달 모티프를 내포할 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 일차(primary) 세포질 신호 전달 서열을 포함하는 ITAM의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (일명 "ICOS"으로도 공지됨) 및 CD66d로부터 유도된 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 세포 표면에서 주요 조직접합성 복합체들 (MHC's)과 복합된 외래(foreign) 항원을 도시하는 보조 세포(가령, B-세포, 수지상 세포 및 이와 유사한 것들)을 지칭한다. T 세포들은 이들의 T 세포 수용체들 (TCRs)을 이용하여 이들 복합체를 인지할 수 있다. APCs는 항원들을 처리하고, 이들을 T 세포들에게 제시한다.
"주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자들은 펩티드:MHC 복합체의 일부분으로써, TCRs에 전형적으로 결합된다. 상기 MHC 분자는 MHC 클래스 I 또는 II 분자일 수 있다. 상기 복합체는 항원 제시 세포, 이를 테면, 수지상 세포 또는 B 세포, 또는 암 세포들을 비롯한 임의의 다른 세포의 표면 상에 있을 수 있거나, 또는 예를 들면, 비드 또는 플레이트 상에 피복시킴으로써 고정될 수 있다.
상기 인간 백혈구 항원 시스템 (HLA)은 유전자 복합체의 이름이며, 인간에서 주요 조직접합성 복합체 (MHC)를 인코드하고, HLA 클래스 I 항원들 (A, B & C) 및 HLA 클래스 II 항원들 (DP, DQ, & DR)이 내포된다. HLA 대립유전자(alleles) A, B 및 C는 세포내 단백질들로부터 주로 유래된 펩티드, 가령, 당해 세포 안에서 발현되는 단백질들을 제시한다.
생체내 T 세포 발생 동안, T 세포들은 자가 MHCs의 인식을 보장하기 위해 양성 선택 단계를 거친 후, 자가-항원을 제시하는 MHC에 너무 강하게 결합하는 T 세포를 제거하는 음성 단계를 거친다. 결과적으로, 특정 T 세포들과 이들이 발현시키는 TCRs은 특정 유형의 MHC 분자 (가령, 특정 HLA 대립유전자에 의해 인코드된 것)에 의해 제시된 펩티드 만을 인지할 것이다. 이를 HLA 제한(restriction)이라고 한다.
관심대상의 HLA 대립유전자 중 하나는 HLA-A*0201이며, 이는 Caucasian 집단의 대다수 (> 50%)에서 발현된다. 따라서, HLA-A*0201 (가령, HLA-A*0201 제한됨)에 의해 인코드된 MHC에 의해 제시되는 WT1 펩티드에 결합하는 TCRs은 이러한 TCRs을 사용하는 면역요법이 Caucasian 집단의 많은 비율을 치료하는 데 적합할 것이기 때문에, 유리하다.
다른 관심대상의 HLA- A 대립유전자는 HLA-A*0101, HLA-A*2402, 그리고 HLA-A*0301이다.
광범위하게 발현된 관심대상의 HLA-B 대립유전자는 HLA-B*3501, HLA-B*0702 및 HLA-B*3502이다.
"세포내 신호전달 도메인"이란 용어가 본원에서 이용될 때, 이는 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 상기 TFP 함유 세포, 가령, 변형된 T-T 세포의 면역 작동체 기능을 촉진시키는 신호를 만들어낸다. 가령, 변형된 T-T 세포에서 면역 작동체 기능의 예로는 사이토킨 분비를 포함한, 세포 용해 활성 및 T 헬퍼(helper) 세포 활성을 포함한다. 구체예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 일차(primary) 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 일차(primary) 세포내 신호전달 도메인은 일차(primary) 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 분자들로부터 유래된 것들을 포함한다. 구체예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호들, 또는 항원 독립적인 자극을 담당하는 분자들로부터 유래된 것들을 포함한다.
일차(primary) 세포내 신호전달 도메인은 ITAM ("면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프")을 포함할 수 있다. 일차(primary) 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 그리고 CD66d DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공동자극 분자(costimulatory molecule)"란 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하고, 이로써 T 세포의 공동자극 반응, 이를 테면, 증식을 포함하나, 이에 국한되지 않는 반응을 조정하는, T 세포 상의 동족(cognate) 결합 짝을 지칭한다. 공동자극 분자들은 항원 수용체들 또는 이들의 리간드를 제외한 세포 표면 분자로써, 효과적인 면역 반응에 요구된다. 공동자극 분자들은 MHC 클래스 1 분자, BTLA와 Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 일부분일 수 있다. 공동자극 분자는 다음의 단백질 패밀리로 대표될 수 있다: TNF 수용체 단백질들, 면역글로불린-유사 단백질들, 사이토킨 수용체들, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자들 (SLAM 단백질들), 그리고 활성화 NK 세포 수용체들. 이러한 분자들의 예로는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-연합된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 그리고 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래된 분자의 전체(entire) 세포내 일부분, 또는 전체 고유의(native) 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 용어 "4-1BB"란 GenBank 수탁 번호. AAA62478.2로 제공된 아미노산 서열을 갖는, 또는 인간이 아닌 종, 가령, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 및 이와 유사한 것들의 등가 잔기들을 갖는 TNFR 슈퍼패밀리의 구성요소를 지칭하며; 그리고 "4-1BB 공동자극 도메인"이란 GenBank 수탁 번호. AAA62478.2의 아미노산 잔기 214-255의 아미노산 서열, 또는 인간이 아닌 종, 가령, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 및 이와 유사한 것들로부터 등가 잔기들로 정의된다.
용어 "항체"는 본원에서 사용된 바와 같이, 항원에 특이적으로 결합하는, 면역글로불린 분자로부터터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다중클론성 또는 단일클론성 기원(origin)의 무손상 면역글로불린, 또는 이의 단편들이 될 수 있고, 천연 원천 또는 재조합 원천으로부터 유래될 수 있다.
용어 "항체 단편"이란 항원 결합 도메인, 가령, 표적, 이를 테면 항원 및 이의 특정된 에피토프를 항체 단편이 인지하고, 특이적으로 결합하는데 충분한, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 함유하는 항체의 적어도 하나의 일부분, 또는 이의 재조합 변이체들을 지칭한다. 항체 단편들의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편들, 단일-쇄 (sc)Fv ("scFv") 항체 단편, 선형(선형) 항체들, 단일 도메인 항체들 이를 테면 sdAb (VL 또는 VH), 카멜리드(camelid) VHH 도메인, 그리고 항체 단편들로부터 형성된 다중-특이적 항체들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편과 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 이때 상기 경쇄 및 중쇄 가변 영역들은 짧은 유연성 폴리펩티드 링커에 의해 인접하게 연계되며, 그리고 단일 폴리펩티드 쇄로써 발현될 수 있으며, 그리고 이때 상기 scFv는 이것이 유래된 무손상 항체의 특이성을 유지한다.
항체 관련하여, "중쇄 가변 영역" 또는 "VH"는 틀구조(framework) 영역들로 알려진 측방(flanking) 스트레취(stretches) 사이에 끼어져 있는 3개 CDRs를 함유하는 중쇄의 단편을 지칭하며, 이들 틀구조 영역은 일반적으로 CDRs보다 더 많이 보존되며, CDRs를 지탱하기 위한 스캐폴드(scaffold)를 형성한다. 카멜리드 "VHH" 도메인은 단일 가변성 항체 도메인을 포함하는 중쇄다.
명시하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, scFv는 가령, 폴리펩티드의 N-말단 단부와 C-말단 단부에 대하여 임의의 순서로, VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있고, 이 scFv는 VL-링커-VH 를 포함하거나, 또는 VH-링커-VL를 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 명세서의 TFP 조성물의 일부분은 다양한 형태로 존재할 수 있는데, 여기에서 상기 항원 결합 도메인은 뮤린, 인간화된 또는 인간 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 단일 쇄 항체 (scFv)를 포함하는 인접(contiguous) 폴리펩티드 쇄의 일부분으로 발현된다(Harlow 외., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow 외., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston 외., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 외., 1988, Science 242:423-426). 하나의 측면에서, 본 명세서의 TFP 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 TFP는 scFv 또는 sdAb를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "재조합 항체"란 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성된 항체, 이를 테면, 예를 들면, 박테리오파아지 또는 이스트 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 이 용어는 상기 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성과, 이 DNA 분자는 항체 단백질, 또는 당해 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현시켜 생성된 항체를 의미하는 것으로 또한 간주되어야 하며, 이때 DNA 또는 아미노산 서열은 당분야에 공지되고, 이용가능한 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술에 의해 획득되었다.
용어 "항원" 또는 "Ag"란 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 분자, 또는 그렇지 않으면 면역 반응을 일으키는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 면역학적으로-특이적인 컴피턴트(competent) 세포들, 또는 이둘 모두의 활성화와 관련될 수 있다.
당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한, 임의의 거대 분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 항원들은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA는 따라서 본원에서 이용된 용어로써 "항원"을 인코드한다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 항원은 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 전적으로 인코드될 필요가 없다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 본 명세서는 하나 이상의 유전자의 부분적 뉴클레오티드 서열의 용도, 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드들을 인코드하도록 다양하게 조합되어 배열된다는 것을 포함하나, 이에 국한되지 않음은 자명할 것이다. 더욱이, 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없음을 당업자는 이해할 것이다. 항원이 합성되어 만들어질 수 있거나 또는 생물학적 샘플에서 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 외에 거대 분자일 수 있다는 것은 자명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 다른 생물학적 성분들을 갖는 세포 또는 유체를 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CD19"란 분화(Differentiation) 19 단백질의 클러스터(Cluster)를 지칭하는데, 이것은 B 세포 백혈병 전구체 세포들, 기타 악성 B 세포들과 정상적인 B 세포 계통의 대부분 세포들에서 탐지가능한 항원성 결정인자다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "BCMA"이란 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 17 (TNFRSF17)로 또한 알려진 B-세포 성숙 항원을 지칭하며, 분화 269 단백질 (CD269)의 클러스터는 인간에서 TNFRSF17 유전자에 의해 인코드된 단백질이다. TNFRSF17은 B-세포 활성화 인자 (BAFF)를 인지하는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 세포 표면 수용체다 (가령, Laabi 외., EMBO 11 (11): 3897-904 (1992)참고. 이 수용체는 성숙한 B 림프구에서 발현되며, 그리고 B-세포 발달 및 자가면역 반응에 중요할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CD16" (FcγRIII로 또한 알려짐)은 천연 킬러 세포들, 호중구 다형핵 백혈구, 단핵구 및 대식세포의 표면 상에 발견되는 분화 분자 클러스터를 지칭한다. CD16은 Fc 수용체, FcγRIIIa (CD16a) 및 FcγRIIIb (CD16b)로 식별되었으며, 이들은 신호 변환에 참여한다. CD16은 항체의존적 세포의 세포독성 (ADCC)에 관련된 면역글로불린 수퍼패밀리 (IgSF)의 분자다.
"NKG2D"는 본원에서 사용된 바와 같이, C-타입 렉틴-유사 수용체들의 CD94/NKG2 패밀리에 속하는 막경유 단백질을 지칭한다. 인간에서, NKG2D는 NK 세포들, γδ T 세포들 및 CD8+ αβ T 세포들에 의해 발현된다. NKG2D는 스트레스를 받은 세포, 악성 형질변환된 세포, 그리고 감염된 세포의 표면 상에 나타나는 MIC 및 RAET1/ULBP 패밀리로부터 유도된-자가 단백질들을 인지한다.
메소텔린 (MSLN)이란 흉막, 복막 및 심장막의 내층 중피 세포들 상에 정상적으로 존재하는 종양 분화 항원을 지칭한다. 메소텔린은 중피종과 난소 암종 및 췌장 암종을 비롯한 몇 가지 인간 종양에서 과다 발현된다.
티로신-단백질 키나제 막경유 수용체 ROR1(일명, 신경영양성 티로신 키나제, 수용체-관련된 1 (NTRKR1)로도 알려짐)는 수용체 티로신 키나제-유사 올판(orphan) 수용체 (ROR) 패밀리의 구성원이다. 이것은 암의 전이에 역할을 한다.
용어 "MUC16"은 "세포-표면 연합된, 뮤신 16" 또는 "난소암-관련된 종양 마커 CA125"로도 또한 알려져 있는데, 이것은 이의 아미노 말단에서 세포외 도메인, 큰 텐덤(tandem) 반복 도메인, 그리고 짧은 세포질 도메인과 함께, 막경유 도메인을 내포하는 막-묶여있는 뮤신이다. 이 유전자의 산물은 다른 암에 대한 마커로 사용되었으며, 더 높은 발현 수준은 더 나쁜 예후와 관련있다.
용어 "CD22"는 시알산 결합 Ig-유사 렉틴 2, SIGLEC-2, T 세포 표면 항원 leu-14, 그리고 B 세포 수용체 CD22로도 또한 알려져 있으며, 이것은 B 세포/B 세포 상호작용을 중재하는 단백질이며, 그리고 림프 조직에서 B 세포들의 국소화에 관련되는 것으로 간주되며, 그리고 난치성 조혈 암 및 털 세포 백혈병을 비롯한 질환과 연합된다. 본원에서 기술되는 방법들에 사용하기에 적합한 완전한(fully) 인간 항-CD22 단일클론성 항체 ("M971")는 가령, Xiao 외., MAbs. 2009 May-Jun; 1(3): 297- 303에서 기술된다.
"CD79α" 및 "CD79β" 유전자는 B 림프구 항원 수용체, 항원-특이적 성분, 표면 면역글로불린 (Ig)을 포함하는 다량체 복합체를 구성하는 단백질들을 인코드한다. 표면 Ig는 B-세포 항원 수용체의 발현 및 기능에 필수적인, 두 개의 다른 단백질들, Ig-알파 및 Ig-베타 (차례로 CD79α 및 이의 파라로그(paralog) CD79β에 의해 인코드됨)와 비-공유적으로 연합된다. 이 복합체의 기능적 파괴로 인하여 가령, 인간 B-세포 만성 림프구 백혈병이 유도될 수 있다.
B 세포 활성화 인자, 또는 "BAFF"는 종양 괴사 인자 (TNF) 리간드 패밀리에 속하는 사이토킨이다. 이 사이토킨은 수용체 TNFRSF13B/TACI, TNFRSF17/BCMA, 그리고 TNFRSF13C/BAFF-R에 대한 리간드다. 이 사이토킨은 B 세포 계통 세포들에서 발현되고, 그리고 강력한 B 세포 활성제로 작용한다. 또한, B 세포의 증식과 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
용어 "항-종양 효과"란 각종 수단에 의해 현시될 수 있는 생물학적 효과를 지칭하는데, 가령, 종양 부피 감소, 종양 세포 수 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명 증가, 종양 세포 증식 감소, 종양 세포 생존 감소 또는 암 병태와 관련된 다양한 생리적 증상의 개선을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. "항-종양 효과"는 또한 먼저 종양 발생 예방에 있어서 본 명세서의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 현시될 수 있다.
용어 "자가조직의(autologous)"라는 용어는 한 개체로부터 유래된 임의의 물질이 당해 동일한 개체에게 재-도입될 수 있는 임의의 물질을 의미한다.
용어 "동종이계(allogeneic)" 또는 대체용으로 "동종이계(allogenic)"이란 당해 물질이 도입된 동일한 종에 속하는 상이한 동물, 또는 다른 환자로부터 파생된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 또는 그 이상의 개체에 있어서 하나 또는 그 이상의 유전자 좌에 있는 유전자가 동일하지 않을 때, 이들 개체는 서로 동종이계라고 한다. 일부 측면들에서, 동일한 종에 속하는 개체에서 나온 동종이계 물질은 항원적으로 상호 작용하기에는 유 전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종발생적(xenogeneic)"이란 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
용어 "암"이란 비정상적 세포의 신속하고, 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포들은 국소 적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 각종 암의 예시가 본원에서 개시되는데, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 및 이와 유사한 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "인코딩(encoding)"이란 생물학적 공정에서 특정된 서열의 뉴클레오티드 (가령, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 특정된 서열의 아미노산을 갖고, 이로부터 발생되는 생물학적 성질들을 보유하는 임의의 중합체 및 거대 분자를 합성하기 위한 주형으로 기능하는 폴리뉴클레오티드, 이를 테면, 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서 특이적 서열의 뉴클레오티드의 고유 성질을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 해당 유전자에 대응하는 mRNA의 전사 및 해독으로 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질이 생산하는 경우, 이 단백질을 인코드한다. 코딩 가닥(strand)(이의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 서열과 동일하며, 통상적으로 서열 목록에서 제시됨)과, 비-코딩 가닥(유전자 또는 cDNA의 해독을 위한 주형을 이용)은 모두 이 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 산물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
명시적인 언급이 없는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로 축퇴(degenerate) 형태이며, 동일한 아미노산 서열을 인코드하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 관용구(phrase) 뉴클레오티드 서열에는 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 형태에서 하나 또는 이상의 인트론을 포함할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료요법적 유효량"은 본원에서 호환사용되며, 특정 생물학적 결과 또는 치료요법적 결과를 얻는데 효과적인 본원에서 기술된 화합물, 제형, 물질(material), 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성(endogenous)"이란 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 내부에서 만들어진 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성(exogenous)"이란 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로 도입된, 또는 외부에서 만들어진 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"이란 프로모터에 의해 구동된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 지칭한다.
용어 "기능적 파괴(functional disruption)"란 세포 안에서 정상적인 발현 및/또는 거동을 방해하기 위하여, 특정 (가령, 표적) 핵산 (가령, 유전자, RNA 전사체, 이에 인코드된 단백질의)에 가해지는 물리적 또는 생화학적 변화를 지칭한다. 한 구체예에서, 기능적 파괴란 유전자 편집(editing) 방법을 통하여 당해 유전자의 변형을 지칭한다. 한 구체예에서, 기능적 파괴로 표적 유전자 (가령, 내인성 유전자)의 발현이 방해된다.
용어 "전이(transfer) 벡터"란 단리된 핵산을 포함하고, 이러한 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 이용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드들, 이온성 또는 양쪽성 화합물들, 플라스미드들과 연합된 폴리뉴클레오티드들, 그리고 바이러스을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다수의 벡터들이 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전이 벡터"에는 자가 복제가능한 플라스미드 또는 바이러스가 포함된다. 이 용어에는 이를 테면, 예를 들면, 폴리리신 화합물, 리포좀, 그리고 이와 유사한 것들과 같은 세포 안으로 핵산의 전이를 실행하는 비-플라스미드성 화합물과 비-바이러스성 화합물이 더 포함되는 것으로 또한 간주되어야 한다. 바이러스성 전이 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터들, 아데노-연합된 바이러스 벡터들, 레트로바이러스성 벡터들, 렌티바이러스성 벡터들, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "발현 벡터"란 뉴클레오티드 서열이 발현되도록 작동가능하게 연계된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위하여 충분한 시스(cis)-작용 요소들을 포함하고; 발현을 위한 기타 요소들은 숙주 세포 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터들에는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 통합되는 당분야에 공지된 모든 것들이 포함되는데, 가령, 코스미드, 플라스미드들 (가령, 네이키드 또는 리포좀 안에 내포된) 및 바이러스들 (가령, 렌티바이러스들, 레트로바이러스들, 아데노바이러스들, 그리고 아데노-연합된 바이러스들)이 있다.
용어 "렌티바이러스"란 레트로비리데(Retroviridae) 패밀리 속(genus)을 지칭한다. 렌티바이러스들은 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하고; 이 바이러스들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나다. HIV, SIV, 그리고 FIV는 모두 렌티바이러스의 예들이다.
용어 "렌티바이러스성 벡터"는 Milone 외., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)에서 제공된 바와 같이 특히 자가-비활성화 렌티바이러스성 벡터를 포함하는, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부분으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 이용될 수 있는 렌티바이러스 벡터들에는 가령, LENTIVECTOR™ 유전자 전달 기술(Oxford BioMedica 사의), LENTIMAX™ 벡터 시스템(Lentigen 사의), 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 비임상용 렌티바이러스성 벡터들이 또한 이용가능하며, 당업자들이 인지하고 있을 것이다.
용어 "상동성(homologous)" 또는 "동일성(identity)"이란 두 개의 중합체 분자들, 가령, 두 개의 핵산 분자들, 이를 테면, 두 개의 DNA 분자 또는 두 개의 RNA 분자, 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간에 소단위 서열 동일성을 지칭한다. 두 분자 모두의 소단위 위치에 동일한 단량체 소단위가 있을 경우; 예를 들어, 두 개의 DNA 분자 각각의 위치에 아데닌이 있다면, 해당 위치에서 동종이거나 동일하다. 두 서열 간의 상동성은 정합(matching)의 수 또는 상동성 위치의 수에 대한 직접 함수이고; 가령, 두 서열에서 위치의 절반 (가령, 길이가 10개 소단위인 중합체에서 5개 위치)가 상동성이라면, 50%의 상동성이며; 이들 위치중 90%(가령, 10개중 9개 위치)가 정합되거나 또는 상동성이면, 이 두 서열은 90%의 상동성이다.
인간이 아닌 (가령, 뮤린) 항체들의 "인간화된" 형태는 인간이 아닌 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편들 (이를 테면 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체들의 기타 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체들 및 이의 항체 단편들은 수령자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화력, 그리고 능력(capacity)을 보유한, 인간이 아닌 종 (공여자 항체) 이를 테면 마우스, 렛(rat) 또는 토끼의 CDR 잔기로 대체된, 인간 면역글로불린 (수령자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로블린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체/항체 단편은 수령자 항체 또는 수입된 CDR 또는 틀구조 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형으로 항체 또는 항체 단편 수행능이 더 세분화되고, 최적화될 수 있다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 하나의, 전형적으로 두 개의 가변성 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이며, 이때 CDR 영역들 모두 또는 실질적으로 모두는 인간이 아닌 면역글로불린의 것에 대응하며, FR 영역의 모두 또는 유의적인 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 상기 인간화된 항체 또는 항체 단편은 면역글로블린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로블린의 것을 포함할 것이다. 더욱 상세한 내용은 Jones 외., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann 외., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992를 참고한다.
"인간" 또는 "완전한(fully) 인간"이란 면역글로불린, 이를 테면 항체 또는 항체 단편을 지칭하는데, 여기에서 온전체(whole) 분자는 인간 기원이거나 또는 상기 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 구성된다.
용어 "단리된(isolated)"이란 자연 상태로부터 변경된 또는 제거된 상태를 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 자연 상태에서 이와 공존하는 물질로부터 부분적 또는 완벽하게 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있고, 또는 비-고유적 환경, 이를 테면, 예를 들면, 숙주 세포에 존재할 수 있다.
본 명세서의 내용에서, 공통적으로 발생되는 핵산 염기에 대하여 다음의 약어가 이용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, 그리고 "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "보존적(conservative) 서열 변형"란 당해 아미노산 서열이 내포된 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 유의적으로 영향을 주지 않거나 또는 변형시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 추가 및 결손을 포함한다. 변형은 부위-지향된(directed) 돌연변이유발 및 PCR-중재 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 본 명세서의 항체 또는 항체 단편으로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환이란 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당분야에 특정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판, 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 명세서의 TFP 내의 하나 또는 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 TFP는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "작동가능하도록 연계된" 또는 "전사 조절"이란 조절 서열과 이종기원의 핵산 서열 간의 기능적 연계를 지칭하고, 이로 인하여 후자가 발현된다. 예를 들면, 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능적 상관관계에 위치할 때, 상기 제 1 핵산 서열은 제 2 핵산 서열에 작동가능하도록 연계된다. 가령, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 준다면, 이 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된다. 작동가능하도록 연계된 DNA 서열은 서로 인접해 있을 수 있고, 가령, 두 단백질 코딩 영역을 연결시킬 필요가 있을 때, 이들은 동일한 판독 틀 안에 있다.
면역원성 조성물의 "비경구(parenteral)" 투여란 가령, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내(intrasternal) 주사, 종양내, 또는 주입(infusion) 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"란 단일 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어에는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고, 자연 발생적 뉴클레오티드들와 동일한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 내포하는 핵산이 포괄된다. 명시적으로 지적되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시된 서열 뿐만 아니라, 보존적으로 변형된 이의 변이체들(가령, 축중 코돈 치환), 대립유전자, 오르소로그(orthologs), SNPs, 그리고 상보적(complementary) 서열이 또한 포괄된다. 특히, 축중 코돈 치환은 하나 또는 그 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer 외., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 외., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 그리고 Rossolini 외., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 호환사용되며, 그리고 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연계된 아미노산 잔기들을 포함하는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 두 개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 서열 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 숫자에는 제약이 없다. 폴리펩티드에는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 두 개 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질이 내포된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 짧은 쇄(당분야에서 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 흔히 불리는)와 더 긴 쇄(일반적으로 다양한 유형의 단백질로 지칭됨)를 모두 지칭한다. "폴리펩티드"에는 그중에서도 예를 들면, 생물학적으로 활성 단편들, 실질적으로 상동성 폴리펩티드들, 올리고펩티드들, 동종이량체들, 이종(hetero)이량체, 폴리펩티드들의 변이체들, 변형된 폴리펩티드들, 유도체들, 유사체들, 융합 단백질들이 포함된다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 이의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터(promoter)"란 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 요구되는 세포의 전사 기전, 또는 도입된 합성 기전에 의해 인지되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"이란 프로모터/조절 서열에 작동가능하도록 연계된 유전자 산물의 발현에 요구되는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에서, 이 서열은 코어(core) 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우들에서, 이 서열은 또한 유전자 산물의 발현에 필요한 인핸서(enhancer) 서열 및 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 이 프로모터/조절 서열은 예를 들면, 조직 특이적 방식으로 당해 유전자 산물을 발현시키는 것일 수 있다.
용어 "구성적(constitutive)" 프로모터란 유전자 산물을 인코드하거나, 또는 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하도록 연계될 때, 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건하에서 세포 안에서 당해 유전자 산물이 만들어지도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성(inducible)" 프로모터란 유전자 산물을 인코드하거나, 또는 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하도록 연계될 때, 당해 프로모터에 대응하는 유도자(inducer)가 이 세포 안에 존재할 때만 실질적으로 이 세포 안에서 당해 유전자 산물이 만들어지도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적" 프로모터란 유전자에 의해 인코딩되거나 또는 특정된 폴리뉴클레오티드와 작동가능하도록 연계된 경우, 세포가 당해 프로모터에 대응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 실질적으로 이 세포 안에서 유전자 산물이 만들어지도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
scFv 내용에서 이용되는 용어 "링커" 및 "유연성 폴리펩티드 링커"란 가변성 중쇄와 가변성 경쇄 영역들을 함께 연계하기 위하여, 아미노산, 이를 테면 글리신 및/또는 세린 잔기만 단독으로 또는 조합으로 구성된 펩티드 링커를 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 유연성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이며, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하고, 여기에서 n은 1이거나 또는 이보다 큰 양의 정수다. 예를 들면, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 그리고 n=10이다. 한 구체예에서, 상기 유연성 폴리펩티드 링커에는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3가 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 또다른 구체예에서, 상기 링커에는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)의 다중 반복부가 포함된다. 또한, WO2012/138475(본원의 참고자료에 편입됨)에 기재된 링커들 또한 본 명세서 범위 안에 포함된다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 긴 링커 (LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=2 내지 4이다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 짧은 링커 (SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 3이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 5' 캡 (일명 RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡이라고도 함)은 전사 시작 직후, 진핵 메신져 RNA의 "전방(front) 또는 5' 단부에 추가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 상기 5' 캡은 상기 제 1 전사된 뉴클레오티드에 연계된 말단 기로 구성된다. 그 존재는 리보솜에 의한 인지와 RNase로부터의 보호에 중요하다. 캡 추가는 전사에 연결되어, 공동-전사적으로 발생하여 서로 영향을 미친다. 전사 시작 직후, 합성되는 mRNA의 5' 단부는 RNA 중합효소와 연합된 캡 합성 복합체에 의해 결합된다. 이 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다-단계 생화학 반응을 진행된다. 이 캡핑이 변형되어, mRNA의 기능, 이를 테면, 이의 안정성 또는 해독 효능을 조정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "시험관 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된, RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 이러한 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 만들어진다. 상기 시험관내 전사 벡터는 당해 시험관내 전사된 RNA를 만들 때 이용되는 주형을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "poly(A)"는 mRNA에 폴리아데닐화에 의해 부탁된 일련의 아데노신이다. 일과성(transient) 발현용 구조체의 바람직한 구체예에서, polyA는 50 내지 5000개, 바람직하게는 64개 이상, 더 바람직하게는 100개 이상, 가장 바람직하게는 300개 또는 400개 이상이다. poly(A) 서열은 mRNA 기능성, 이를 테면, 국소화(localization), 안정성 또는 해독 효능을 조정하기 위하여, 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "폴리아데닐화(polyadenylation)"란 메신져 RNA 분자로 폴리아데닐일 모이어티, 또는 이의 변형된 변이체의 공유 연계를 지칭한다. 진핵 유기체에서, 대부분 메신져 RNA (mRNA) 분자들은 3' 단부에서 폴리아데닐화된다. 3' poly(A) 꼬리는 폴리아데닐레이트 중합효소의 효소 작용을 통하여 프레-mRNA에 추가된 아데닌 뉴클레오티드들의 긴 서열(대개 700개)이다. 고등 진핵생물에서, 상기 poly(A) 꼬리는 특이적 서열인, 폴리아데닐화 신호를 내포하는 전사체 상에 추가된다. 상기 poly(A) 꼬리와 이에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 mRNA 분해로부터 이를 보호하는 것을 지원한다. 폴리아데닐화는 전사 종료, 핵으로부터 mRNA의 추출, 그리고 해독에 또한 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA가 RNA로 전사 직후 핵에서 일어나지만, 그러나 세포질에서 나중에 추가 발생될 수 있다. 전사가 종료된 후, mRNA 쇄는 RNA 중합효소와 연합된 엔도뉴클레아제 복합체 작용을 통하여 절단된다. 상기 절단 부위는 당해 절단 부위 인근에 항상 염기 서열 AAUAAA의 존재가 특징적이다. 상기 mRNA가 절단된 후, 이 절단 부위에서 자유 3' 단부에 아데노신 잔기들이 추가된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "일과성(transient)"이란 수 시간, 수 일 또는 수 주 동안 비-통합된 이식유전자(transgene)의 발현을 지칭하는데, 이때 발현 시간은 게놈으로 통합되거나, 또는 숙주 세포 안의 플라스미드 레플리콘 안에 안정적으로 함유된 경우의 당해 유전자의 발현 시간 보다는 짧다.
용어 "신호 전달 경로(signal transduction pathway)"란 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호를 전달하는 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 간의 생화학적 관계를 의미한다. 구절 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고, 세포막을 통해 신호를 전송할 수 있는 분자들 및 분자 복합체을 포함한다.
용어 "대상체"란 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유류, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포란 본질적으로 다른 세포 유형이 포함안 된 세포를 의미한다. 실질적으로 정제된 세포는 자연적으로 발생하는 상태에서 정상적으로 연관된 다른 세포 유형과 분리된 세포를 또한 지칭할 수 있다. 일부 경우에서, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 의미한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 이의 자연 상태에서 자연적으로 연관된 세포와 분리된 세포를 의미한다. 일부 측면들에서, 이들 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 측면들에서, 이들 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
용어 "치료요법적"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 치료를 의미한다. 치료요법적 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 완화 또는 근절을 통해 얻는다.
용어 "예방(prophylaxis)"이란 본원에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 질환 상태에 대한 예방 또는 보호 치료를 의미한다.
본 명세서의 내용에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 연합된 항원"이란 특이적 과증식성 장애에 공통적인 항원들을 지칭한다. 특정 측면들에서, 본 명세서의 과증식성 장애 항원들은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, NHL, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광 암, 신장 암 및 선암, 이를 테면 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 암으로부터 유래된다.
용어 "형질감염된(transfected)" 또는 "형질변형된(transformed)" 또는 "형질도입된(transduced)"이란 본외인성 핵산이 숙주 세포 안으로 전달되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질변형된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성(exogenous) 핵산이 형질감염된, 형질변형된 또는 형질도입된 것을 말한다. 세포는 일차(primary) 대상 세포 및 그의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합하는"이란 샘플에 존재하는 동족 결합 짝 (가령, CD19)을 인지하고 결합하지만, 이 샘플 안에 있는 다른 분자는 반드시 그리고 실질적으로 인지하거나 또는 결합하지 않는 항체, 항체 단편 또는 특정 리간드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "메가뉴클레아제(meganuclease)"란 인지 서열에서 12개 염기쌍 이상의 이중 가닥 DNA에 결합하는 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 바람직하게는, 본 명세서의 메가뉴클레아제에 대한 인지 서열은 22개 염기 쌍이다. 메가뉴클레아제는 I-Crel로부터 유래된 엔도뉴클레아제일 수 있으며, 그리고 예를 들면, DNA-결합 특이성, DNA 절단 활성, DNA-결합 친화력, 또는 이량체화 성질에 대하여 천연 I-Crel과 비교하여 변형된 I-Crel의 공작된 변이체를 지칭할 수 있다. 이러한 I-Crel의 변형된 변이체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (가령, WO 2007/047859). 메가뉴클레아제는 본원에서 사용된 바와 같이, 이종이량체로써 또는 "단일-쇄 메가뉴클레아제"로써 이중-가닥의 DNA에 결합하며, 이때 DNA-결합 도메인의 쌍은 펩티드 링커를 이용하여 단일 폴리펩티드에 연결된다. 용어 "귀소(homing) 엔도뉴클레아제"는 용어 "메가뉴클레아제"와 동의어다. 본 명세서의 메가뉴클레아제는 세포들, 특히 인간 T 세포들에서 발현될 때 실질적으로 비-독성이며, 본원에서 기술된 방법을 이용하여 측정하였을 때, 세포 생존력에 유해한 영향 없이 또는 메가뉴클레아제 절단 활성의 유의적인 감소 없이, 세포들이 형질감염되며, 37℃에서 유지될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일-쇄 메가뉴클레아제"란 링커에 의해 연결된 뉴클레아제 소단위 쌍을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 단일-쇄 메가뉴클레아제는 다음과 같은 체계를 갖는다: N-말단 소단위 - 링커 - C-말단 소단위. 두 개의 메가뉴클레아제 소단위는 아미노산 서열에서 일반적으로 동일하지 않을 것이며, 동일하지 않는 DNA 서열을 인지할 것이다. 따라서, 단일-쇄 메가뉴클레아제는 위(pseudo)-팔린드롬(palindromic) 또는 비(non)-팔린드롬 인지 서열을 전형적으로 절단한다. 단일-쇄 메가뉴클레아제는 실질적으로 이량체는 아닐 수 있지만, "단일-쇄 이종이량체" 또는 "단일-쇄 이종이량체성 메가뉴클레아제"라고 지칭될 수 있다. 명확하게 하기 위하여, 명시적인 언급이 없는 한, 용어 "메가뉴클레아제"는 이량체성 또는 단일-쇄 메가뉴클레아제를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "TALEN"은 Fok1 뉴클레아제 도메인의 임의의 부분에 융합된 16-22 개의 TAL 도메인 반복을 포함하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "콤팩트(Compact) TALEN"이란 I-Tev1 귀소(homing) 엔도뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인의 임의의 촉매적으로 활성부분에 임의의 방향으로 융합된 16-22 개의 TAL 도메인 반복과 함께, DNA-결합 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CRISPR"란 카스파제, 이를 테면 Cas9, 그리고 게놈 DNA에 있는 인지 부위에 혼성화됨으로써 당해 카스파제의 DNA 절단을 지시하는 가이드 RNA를 포함하는 카스파제-기반의 엔도뉴클레아제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "megaTAL"란 공작된, 서열-특이적 귀소 엔도뉴클레아제와 함께, 전사 활성화제-유사 작동체 (TALE) DNA 결합 도메인을 포함하는 단일-쇄 뉴클레아제를 지칭한다.
범위: 본 개시 전반에 걸쳐, 본 개시의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의성과 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다.
따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위 범위와 해당 범위 내의 개별 숫자 값을 구체적으로 공개한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 ~ 6과 같은 범위에 대한 설명은 1 ~ 3, 1 ~ 4, 1 ~ 5, 2 ~ 4, 2 ~ 6, 3 ~ 6 등과 같은 하위 범위 뿐만 아니라, 해당 범위 내의 개별 수치 (가령, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6)를 구체적으로 공개한 것으로 간주되어야 한다. 다른 예로서, 95-99% 동일성 범위는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가진 것을 포함하고, 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% 및 98-99% 동일성과 같은 하위범위를 포함한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
설명
T 세포 수용체들 (TCR) 융합 단백질 (TFP 및 TCR 불변 도메인을 포함하는 변형된 T 세포들을 이용하여, 질환, 이를 테면 암의 치료에 이용되는 물질의 조성물 및 방법이 본원에 제공되는데, 이때 상기 변형된 T 세포는 기능적으로 파괴된 내인성 TCR 소단위를 또한 보유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"에는 일반적으로, i) 표적 세포들 상의 표면 항원에 결합할 수 있고, 그리고 ii) T 세포의 표면 또는 표면 상에 공동-위치될 때, 전형적으로 무손상(intact) TCR 복합체의 다른 폴리펩티드 성분들과 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 각종 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드가 내포된다. 본원에서 제공된 바와 같이, TFPs는 키메라 항원 수용체들과 비교하였을 때, 실질적인 잇점을 제공한다. 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안으로 "CAR"란 scFv 형태의 세포외 항원 결합 도메인, 막경유 도메인, 그리고 하기에서 정의된 바의 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 또한 "세포내 신호전달 도메인"로 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 구조체를 지칭한다. 일반적으로, CAR의 상기 중심 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 쇄로부터 유래되며, 상기 TCR 복합체와 연합된 것으로 보통 발견된다. 상기 CD3 제타 신호전달 도메인은 적어도 하나의 공동-자극 분자,이를 테면 4-1BB (가령, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 기능성 신호전달 도메인과 융합될 수 있다.
T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질들 (TFP)
본 명세서는 TFPs를 인코딩하는 재조합 DNA 구조체들을 포괄하는데, 이때 상기 TFP는 CD19, 가령, 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 단편을 포함하며, 이때 상기 항체 단편의 서열은 TCR 소단위 또는 이의 일부분을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 판독 틀에 인접하고, 이에 있다. 본 명세서는 TFPs를 인코딩하는 재조합 DNA 구조체들을 포괄하는데, 이때 상기 TFP는 BCMA, 가령, 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 단편을 포함하며, 이때 상기 항체 단편의 서열은 TCR 소단위 또는 이의 일부분을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 판독 틀에 인접하고, 이에 있다. 본 명세서는 TFPs를 인코딩하는 재조합 DNA 구조체들을 포괄하는데, 이때 상기 TFP는 ROR1, 가령, 인간 ROR1에 특이적으로 결합하는 항체 단편을 포함하며, 이때 상기 항체 단편의 서열은 TCR 소단위 또는 이의 일부분을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 판독 틀에 인접하고, 이에 있다. 본 명세서는 TFPs를 인코딩하는 재조합 DNA 구조체들을 포괄하는데, 이때 상기 TFP는 CD22, 가령, 인간 CD22에 특이적으로 결합하는 항체 단편을 포함하며, 이때 상기 항체 단편의 서열은 TCR 소단위 또는 이의 일부분을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 판독 틀에 인접하고, 이에 있다. 본원에 제공된 TFPs는 기능적 TCR 복합체를 형성하기 위해, 하나 또는 그 이상의 내인성 (또는 대안적으로, 하나 또는 그 이상의 외인성, 또는 내인성과 외인성의 조합) TCR 소단위와 결합할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 명세서의 TFP는 항원 결합 도메인으로 지칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 특정하는 표적 항원의 유형과 수에 따라 달라진다. 예를 들면, 상기 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커(marker)로서 작용하는 표적을 인지하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 TFP에서 항원-결합 도메인에 대한 표적 항원으로 작용할 수 있는 세포 표면 마커들의 예로는 바이러스성 감염, 박테리아성 감염 및 기생충 감염; 자가면역 질환; 그리고 암 질환들 (가령, 악성 질환들)과 연합된 것들을 포함한다.
하나의 측면에서, 상기 TFP-중재된 T 세포 반응은 상기 TFP에서 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 공작하는 방식으로 관심대상 항원을 지향하도록 할 수 있다.
하나의 측면에서, 상기 항원 결합 도메인을 포함하는 TFP의 일부분은 CD19를 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 항원 결합 도메인은 인간 CD19를 표적으로 한다. 하나의 측면에서, 상기 항원 결합 도메인을 포함하는 TFP의 일부분은 BCMA를 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 항원 결합 도메인은 BCMA를 표적으로 한다.
상기 항원 결합 도메인은 상기 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있는데, 가령, 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 그리고 이를 테면 카멜리드 유래된 나노바디(nanobody)의 중쇄 가변성 도메인 (VH), 경쇄 가변성 도메인 (VL) 및 가변성 도메인 (VHH) 을 포함하나, 이에 국한되지 않는 기능적 단편, 그리고 항원 결합 도메인으로 기능하는 당분야에 공지된 대체 스캐폴드, 이를 테면 재조합 피브로넥틴 도메인, 안티칼린, DARPIN 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 유사하게 표적 항원을 특이적으로 인지하고, 이에 결합하는 천연 또는 합성 리간드를 상기 TFP의 항원 결합 도메인으로 이용할 수 있다. 일부 경우에서, TFP가 궁극적으로 사용될 동일한 종에서 항원 결합 도메인이 유래되는 것이 유익하다. 예를 들면, 인간에서 사용하기 위해, TFP의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화된 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
따라서, 하나의 측면에서, 상기 항원-결합 도메인은 인간화된 또는 인간 항체 또는 항체 단편, 또는 뮤린 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 본원에서 기술된 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인의 경쇄 상보적 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보적 결정 영역 2 (LC CDR2), 그리고 경쇄 상보적 결정 영역 3 (LC CDR3)중 하나 또는 그 이상의 (가령, 세 가지 모두), 및/또는 본원에서 기술된 인간화된 또는 인간 항-CD19 결합 도메인의 중쇄 상보적 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보적 결정 영역 2 (HC CDR2), 그리고 중쇄 상보적 결정 영역 3 (HC CDR3)의 하나 또는 그 이상의 (가령, 세 가지 모두)를 포함하는데, 가령, 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 하나 또는 그 이상의, 가령, 세 가지 모두의 LC CDRs와 하나 또는 그 이상의, 가령, 세 가지 모두의 HC CDRs를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 인간화된 또는 인간 항-CD19 결합 도메인은 본원에서 기술된 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인의 중쇄 상보적 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보적 결정 영역 2 (HC CDR2), 그리고 중쇄 상보적 결정 영역 3 (HC CDR3)중 하나 또는 그 이상의 (가령, 세 가지 모두)을 포함하며, 가령, 상기 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 두 개의 가변성 중쇄 영역을 갖는데, 각각은 본원에서 기술된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 본원에서 기술된 인간화된 또는 인간 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에서 기술된 인간화된 또는 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 본원에서 기술된 인간화된 중쇄 가변 영역을 포함하는데, 가령, 본원에서 기술된 적어도 두 개의인간화된 또는 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 본원에서 기술된 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 구체예에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인 (가령, scFv)은 다음을 포함한다: 본원에서 제공되는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서 적어도 하나, 둘 또는 세 개 변형 (가령, 치환) 그러나, 30개, 20개 또는 10개를 넘지 않는 변형 (가령, 치환)을 가지는 아미노산 서열, 또는 본원에서 제공되는 아미노산 서열에 대하여 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 본원에서 제공되는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서 적어도 하나, 둘 또는 세 개 변형 (가령, 치환), 그러나, 30개, 20개 또는 10개를 넘지 않는 변형(가령, 치환)을 가지는 아미노산 서열, 또는 본원에서 제공되는 아미노산 서열에 대하여 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 한 구체예에서, 상기 인간화된 또는 인간 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 scFv이며, 그리고 본원에서 기술된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 가령, 본원에서 기술된 링커를 통하여 본원에서 기술된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 구체예에서, 상기 인간화된 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 함유하며, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다. 상기 scFv의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역은 다음중 하나의 방향을 가질 수 있다: 가령, 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 긴 링커 (LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=2 내지 4이다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 짧은 링커 (SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 3이다.
일부 측면들에서, 인간이 아닌 항체는 인간화되며, 여기에서 항체의 특이적 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 만들어지는 항체 또는 이의 단편과의 유사성이 증가되도록 변형된다. 하나의 측면에서, 상기 항원 결합 도메인은 인간화된다.
인간화된 항체는 다음의 기술을 포함하나, 이에 국한되지 않은 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 만들어질 수 있다: CDR-그래프팅(grafting) (가령, 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호. WO 91/09967; 그리고 U.S. 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 그리고 5,585,089 참고, 각각은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입됨), 베니어링(veneering) 또는 재포장(resurfacing) (가령, 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka 외., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; 그리고 Roguska 외., 1994, PNAS, 91:969-973, 각각은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입됨), 쇄 셔플링(shuffling) (가령, U.S. 특허 번호 5,565,332 참고, 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입됨), 그리고 가령, U.S. 특허 출원 공개 번호. US2005/0042664, U.S. 특허 출원 공개 번호. US2005/0048617, U.S. 특허 번호 6,407,213, U.S. 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호. WO 9317105, Tan 외., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas 외., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea 외., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca 외., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska 외., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto 외., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto 외., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 그리고 Pedersen 외., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)에 기술된 기술(각각은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입됨). 대개, 틀구조 영역의 틀구조 잔기들은 예를 들어, 항원 결합을 개선하기 위해, CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이러한 틀구조 치환은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 항원 결합에 중요한 틀구조 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 틀구조 잔기의 상호 작용 모델링 및 특정 위치에서 비정상적인 틀구조 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (가령, Queen 외., U.S. 특허 번호. 5,585,089; 그리고 Riechmann 외., 1988, Nature, 332:323 참고, 이들의 전문은 본원의 참고자료에 편입됨)
인간화된 항체 또는 항체 단편은 인간이 아닌 원천으로부터 그 안에 남아있는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기들은 대개 "수입(import)" 잔기라고 하며, "수입(import)" 가변 도메인으로부터 전형적으로 취해진다. 본원에서 제공된 바와 같이, 인간화된 항체들 또는 항체 단편들은 비-인간 면역글로불린 분자들의 하나 또는 그 이상의 CDRs와 틀구조 영역들을 포함하며, 이때 상기 틀구조를 포함하는 아미노산 잔기들은 인간 생식계열로부터 완전하게 또는 대부분 유래된다. 항체들 또는 항체 단편들의 인간화를 위한 다중 기술들이 당분야에 공지되어 있고, Winter 및 공동-작업자들의 방법 (Jones 외., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 외., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen 외., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라, 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDRs 또는 CDR 서열로 대체함으로써, 가령, CDR-그래프팅에 의해 기본적으로 실행될 수 있다 (EP 239,400; PCT 공개 번호 WO 91/09967; 그리고 U.S. 특허 번호. 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640, 이의 내용은 이들의 전문이 본원의 참고자료에 편입됨). 이러한 인간화된 항체들과 항체 단편들에서, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 수가 비-인간 종의 상응하는 서열로 대체되었다. 인간화된 항체들은 대개 이의 일부 CDR 잔기들과 일부 틀구조 (FR) 잔기들이 설치류 항체들의 유사 부위의 잔기로 아마도 대체된, 인간 항체들이다. 항체들과 항체 단편들의 인간화는 베니어링(veneering) 또는 재포장(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka 외., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 그리고 Roguska 외., PNAS, 91:969-973 (1994)) 또는 쇄 셔플링(shuffling) (U.S. Pat. No. 5,565,332)에 의해 또한 이루어질 수 있으며, 상기 자료 내용은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다.
이러한 인간화된 항체를 만드는데 이용되는 인간의 중쇄와 경쇄 모두의 가변성 도메인의 선택은 항원성의 감소를 위함이다. 소위 "최적 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열과 가장 가까운 인간 서열은 인간화된 항체에 대한 인간 틀구조(FR)로 선택될 수 있다 (Sims 외., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia 외., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), 상기 자료 내용은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 군의 모든 인간 항체의 컨센서스(consensus) 서열로부터 유도된 특정 프레임워크을 사용한다. 몇 가지 상이한 인간화된 항체에 대하여 동일한 틀구조가 이용될 수 있다 (가령, Nicholson 외. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter 외., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta 외., J. Immunol., 151:2623 (1993) 참고, 상기 자료 내용은 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입된다). 일부 구체예들에서, 중쇄 가변 영역의 틀구조 영역, 가령, 네 개 모두 틀구조 영역은 VH4-4-59 생식계열 서열로부터 유래된다. 한 구체예에서, 상기 틀구조 영역은 가령, 대응하는 뮤린 서열의 아미노산에서 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 개 변형, 가령, 치환을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 상기 틀구조 영역, 가령, 네 개 모두 틀구조 영역은 VK3-1.25 생식계열 서열로부터 유래된다. 한 구체예에서, 상기 틀구조 영역은 가령, 대응하는 뮤린 서열의 아미노산에서 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 개 변형, 가령, 치환을 포함할 수 있다.
일부 측면들에서, 항체 단편을 포함하는 본 명세서의 TFP 조성물의 일부분은 표적 항원에 대한 높은 친화력을 유지하고, 기타 우호적인 생물학적 성질을 갖도록 인간화된다. 본 명세서의 한 측면에 따르면, 인간화된 항체들 및 항체 단편들은 부모 서열 및 인간화된 서열의 3-차원 모델을 사용하여, 부모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 공정에 의해 제조된다. 3-차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하며 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3-차원 형태적 구조를 설명하고, 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 가령, 후보 면역글로블린이 표적 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용체 및 수입 서열로부터 선택되고 결합되어, 표적 항원에 대한 증가된 친화력과 같은 원하는 항체 또는 항체 단편 특성이 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
인간화된 항체 또는 항체 단편은 기원 항체와 유사한 항원 특이성을 유지할 수 있는데, 가령, 본 명세서에서 인간 CD19에 결합하는 능력을 유지할 수 있다. 일부 구체예들에서, 인간화된 항체 또는 항체 단편은 인간CD19 또는 인간 BCMA로의 결합에 있어서 개선된 친화력 및/또는 특이성.
하나의 측면에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 특정 기능적 특징 또는 성질이다. 예를 들면, 하나의 측면에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 본 명세서의 TFP 조성물의 일부분은 인간 CD19 또는 인간 BCMA에 특이적으로 결합한다. 하나의 측면에서, 상기 항원 결합 도메인은 인간 CD19에 대하여 Nicholson 외. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)에서 기술된 FMC63 scFv와 동일한 또는 유사한 결합 특이성을 갖는다. 하나의 측면에서, 본 명세서는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인에 관계하는데, 이때 상기 항체 결합 도메인은 CD19 또는 BCMA 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하고, 이때 상기 항체 또는 항체 단편은 본원에서 제공되는 아미노산 서열을 내포하는 가변성 경쇄 및/또는 가변성 중쇄를 포함한다. 특정 측면들에서, 상기 scFv은 리더 서열과 동일한 판독 플에 인접하고, 이 안에 있다.
하나의 측면에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인은 단편, 가령, 단일 쇄 가변성 단편 (scFv)이다. 하나의 측면에서, 상기 항-CD19 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중-기능적 (가령 이중-특이적) 하이브리드 항체다 (가령, Lanzavecchia 외., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). 하나의 측면에서, 본 명세서의 상기 항체들과 이의 단편들은 야생형 또는 강화된 친화력으로 CD19 단백질에 결합한다.
표적 항원 (가령, 융합 모이어티 결합 도메인의 표적에 대하여 본 명세서의 도처에서 기술된 CD19, BCMA 또는 임의의 표적 항원)에 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 수득하는 방법들이 또한 본원에서 제공되는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: 본원에서 제시된 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 추가, 결손, 치환 또는 삽입의 방식으로 당해 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하고, 이에 따라 제공된 VH 도메인에 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 VL 도메인을 복합시키고, 그리고 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 테스트하여 관심 대상의 표적 항원(가령, CD19 또는 BCMA)에 특이적이고, 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 원하는 성질을 갖는, 특이적 결합 구성원 또는 항체 항원 결합 도메인을 식별해낸다.
일부 경우에서, VH 도메인과 scFvs는 당분야에 공지된 방법에 따라 만들어질 수 있다 (예를 들면, Bird 외., (1988) Science 242:423-426 및 Huston 외., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참고. scFv 분자들은 유연성 폴리펩티드 링커들을 이용하여 VH 영역과 VL 영역을 연계시켜 만들 수 있다. 상기 scFv 분자들은 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성물을 갖는 링커 (가령, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 상기 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 접히고, 상호 작용하는 방식에 크게 영향을 줄 수 있다. 실제, 짧은(가령, 5-10개의 아미노산) 폴리펩티드 링커가 이용된다면, 쇄 안(intra-) 폴딩이 방해된다. 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위하여 두 개의 가변 영역을 함께 가져올 때, 쇄 간(inter-) 폴딩이 필요하다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 긴 링커 (LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=2 내지 4이다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 짧은 링커 (SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 3이다. 링커의 방향 및 크기의 예시는 가령, Hollinger 외. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, U.S. 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, 그리고 PCT 공개 번호. WO2006/020258 및 WO2007/024715을 참고한다(이들은 본원의 참고자료에 편입됨).
scFv는 VL 영역과 VH 영역 사이에 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14, 15개, 또는 15개 이상의 잔기로 된 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커 서열은 임의의 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 링커 서열은 글리신 및 세린 아미노산을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 링커 서열은 글리신 및 세린 반복, 이를 테면 (Gly4Ser)n을 포함하고, 여기에서 n은 1이거나 또는 이보다 큰 양의 정수다. 한 구체예에서, 상기 링커는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3일 수 있다. 링커 길이의 변화는 활성을 유지하거나 또는 향상시킬 수 있고, 활성 연구에서 우수한 효능을 제공한다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 긴 링커 (LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=2 내지 4이다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 짧은 링커 (SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 3이다.
안정성과 돌연변이
항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인, 가령, scFv 분자들 (가령, 가용성 scFv)의 안정성은 전통적인 대조군 scFv 분자 또는 전장 항체의 생물물리적 성질 (가령, 열 안정성) 에 기준하여 평가될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 인간화된 또는 인간 scFv는 기술된 검정에서 부모 scFv보다 섭씨 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10 도, 약 11 도, 약 12 도, 약 13 도, 약 14 도, 또는 약 15 도 이상의 열 안정성을 갖는다.
상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인, 가령, scFv의 개선된 열 안정성은 전체(entire) CD19-TFP 구조체에 후속적으로 부여되어, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA TFP 구조체의 개선된 치료요법적 성질로 이어질 수 있다. 상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인, 가령, scFv의 열 안정성은 전통적인 항체와 비교하였을 때, 적어도 약 2℃ 또는 3℃ 개선될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인, 가령, scFv는 전통적인 항체와 비교하였을 때, 1℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 항-CD19 결합 도메인, 가령, scFv는 전통적인 항체와 비교하였을 때, 2℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 scFv는 전통적인 항체와 비교하였을 때, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 또는 15℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 예를 들면, 본원에서 기술된 scFv 분자들과 상기 scFv VH 및 VL이 유래된 항체의 scFv 분자들 또는 Fab 단편들 간에 비교가 이루어질 수 있다. 열 안정성은 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, TM이 측정될 수 있다. TM을 측정하는 방법들과 단백질 안정성을 결정하는 다른 방법들이 하기에서 상세하게 기술된다.
scFv에서 돌연변이 (가용성 scFv의 인간화 또는 직접 돌연변이 유발을 통하여 발생)는 상기 scFv의 안정성을 변경시키고, 상기 scFv 및 상기 항- CD19 또는 항-BCMA TFP 구조체의 전반적인 안정성을 개선시킨다. 상기 인간화된 scFv의 안정성은 이를 테면 TM, 측정, 변성 온도 및 응집 온도의 측정을 통하여, 뮤린 scFv와 비교된다. 한 구체예에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인, 가령, scFv는 인간화 과정으로 발생된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이된 scFv는 상기 항-CD19 TFP 구조체에 개선된 안정성을 부여한다. 또다른 구체예에서, 상기 항-CD19 결합 도메인, 가령, scFv는 인간화 과정으로 발생된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이된 scFv는 CD19-TFP 또는 BCMA-TFP 구조체에 개선된 안정성을 부여한다.
하나의 측면에서, 상기 TFP의 항원 결합 도메인은 본원에서 기술된 항원 결합 도메인 아미노산 서열에 대하여 상동성인 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 상기 항원 결합 도메인은 본원에서 기술된 항-CD19 또는 항-BCMA 항체 단편들의 원하는 기능적 성질을 유지한다. 하나의 특정 측면에서, 상기 본 명세서의 TFP 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 이 항체 단편은 scFv를 포함한다.
다양한 측면들에서, 하나 또는 이둘 모두의 가변 영역 (가령, VH 및/또는 VL), 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 CDR 영역 안에 및/또는 하나 또는 그 이상의 틀구조 영역 안에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 상기 TFP의 항원 결합 도메인이 공작된다. 하나의 특정 측면에서, 상기 본 명세서의 TFP 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 이 항체 단편은 scFv를 포함한다.
본 명세서의 항체 또는 항체 단편은 이들의 아미노산 서열의 변화 (가령, 야생형으로부터 변화)되기만, 그러나 원하는 활성에서는 변화가 없는, 추가 변형이 있을 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 예를 들면, "비-필수(essential)" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 추가 뉴클레오티드 치환이 당해 단백질에서 만들어질 수 있다. 예를 들면, 한 분자의 비-필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 또다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또다른 구체예에서, 아미노산들의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성에서 상이하지만 구조적으로 유사한 아미노산 스트링으로 대체될 수 있는데, 가령, 보존적 치환, 즉, 한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환이 만들어질 수 있다.
당분야에 정의된 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성한 측쇄 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
두 가지 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열들 내용에서 용어 동일성 백분율은 동일한 두 가지 또는 그 이상의 서열을 지칭한다. 서열들이 하기 서열 비교 창 또는 하기 서열 비교 알고리즘(또는 당업자들이 이용가능한 다른 알고리즘)중 하나를 이용하여 측정될 때 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응을 위하여 비교되고, 정렬될 때, 또는 수작업 배열 및 눈으로 관찰에 의해, 두 서열이 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들의 명시된 백분율에서 동일한 (가령, 명시된 영역, 또는 명시되지 않을 경우 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의선택적으로 70%, 71% , 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)하다면, 이 두 서열은 "실질적으로 동일하다". 임의선택적으로, 적어도 약 50개 뉴클레오티드들 (또는 10개 아미노산) 길이의 영역, 또는 더 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드들 (또는 20개, 50개, 200개 또는 그 이상의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 테스트 서열과 비교되는 하나의 서열은 기준 서열로 삼는다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하고, 그리고 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개 변수를 사용할 수 있거나, 대체 매개 변수를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개 변수에 기초하여, 기준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성 백분율을 산출한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 가령, Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c의 국소 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사성 방법의 조사, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.에서 이들 알고리즘 GAP, BESTFIT, FASTA, 그리고 TFASTA의 자동 실행, 또는 수작업 정렬 및 시각적 관찰(가령, Brent 외., (2003) Current Protocols in Molecular Biology 참고)에 의해, 비교를 위한 최적의 서열 정렬을 수행할 수 있다. 서열 동일성 백분율 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 두 가지 예시적인 알고리즘이 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 차례로 Altschul 외., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 그리고 Altschul 외., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410에서 기술된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information를 통해 공개적으로 제공된다.
하나의 측면에서, 본 명세서에서는 출발 항체 또는 단편 (가령, scFv)의 아미노산 서열을 변형시켜, 기능적으로 등가의 분자들을 만드는 것이 고려된다. 예를 들면, 상기 TFP에 포함된 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인, 가령, scFv의 VH 또는 VL은 상기 항-CD19 결합 도메인, 가령, scFv의 출발 VH 또는 VL 틀구조 영역에 대하여 적어도 약 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 유도하도록 변형될 수 있다. 본 명세서에서는 전체 TFP 구조체의 변형이 고려되는데, 가령, 기능적으로 등가의 분자들을 만들기 위하여, 상기 TFP 구조체의 다양한 도메인의 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열에 변형이 고려된다. 상기 TFP 구조체는 출발 TFP 구조체에 대하여 적어도 약 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 유지하도록 변형될 수 있다.
세포외 도메인
상기 세포외 도메인은 천연 원천 또는 재조합 원천으로부터 유래될 수 있다. 여기에서 원천이 자연 원천인 경우, 이 도메인은 임의의 단백질, 그러나 특히 막-결합된 단백질 또는 막경유 단백질로부터 유래된다. 하나의 측면에서 상기 세포외 도메인은 상기 막경유 도메인과 연합될 수 있다. 본 명세서에서 특정 용도의 세포외 도메인은 적어도 T 세포 수용체의 알파 쇄, 베타 쇄 또는 제타 쇄, 또는 CD3 입실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타의 세포외 영역(들)을 함유할 수 있거나, 또는 대체 구체예들에서, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 세포외 영역(들)을 함유할 수 있다.
막경유 도메인
일반적으로, TFP 서열은 단일 게놈 서열에 의해 인코드된 세포외 도메인과 막경유 도메인을 함유한다. 대체 구체예들에서, TFP는 당해 TFP의 세포외 도메인에 대하여 이종기원의 막경유 도메인을 포함하도록 기획될 수 있다. 막경유 도메인은 상기 막경유 영역에 인접한 하나 또는 그 이상의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있는데, 가령, 상기 막경유 영역이 유래된 단백질의 세포외 영역과 연합된 가령, 하나 또는 그 이상의 아미노산 (가령, 상기 세포외 영역의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 또는 그 이상의 아미노산) 및/또는 상기 막경유 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 연합된 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 (가령, 상기 세포내 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 또는 그 이상의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 막경유 도메인은 상기 세포외 영역의 적어도 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 막경유 도메인은 상기 세포내 영역의 적어도 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 막경유 도메인은 상기 TFP의 다른 도메인들중 하나와 연합되어 이용된 도메인이다. 일부 경우들에서, 가령, 상기 수용체 복합체의 다른 구성요소들과의 상호작용을 최소화시키기 위하여, 상기 막통과 도메인은 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막통과 도메인에 이러한 도메인이 결합되는 것을 회피하기 위하여 아미노산 치환으로 선택되거나 또는 변형될 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 막경유 도메인은 상기 TFP-T 세포 표면 상에서 또다른 TFP와 동종이량체될 수 있다. 상이한 측면에서, 상기 막통과 도메인의 아미노산 서열은 동일한 TFP에 존재하는 고유의 결합 짝의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화시키기 위하여 변형되거나 또는 치환될 수 있다.
상기 막경유 도메인은 천연 원천 또는 재조합 원천으로부터 유래될 수 있다. 여기에서 상기 원천이 자연 원천인 경우, 이 도메인은 임의의 막-결합된 단백질 또는 막경유 단백질로부터 유래된다. 하나의 측면에서, 상기 막경유 도메인은 상기 TFP가 표적에 결합되었을 때 마다, 상기 세포내 도메인(들)로 신호전달할 수 있다. 본 명세서에 특정 용도의 막경유 도메인은 상기 T 세포 수용체의 가령, 알파, 베타, 감마, 델타, 또는 제타 쇄, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 막경유 영역(들)을 적어도 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 막경유 도메인은 상기 TFP의 세포외 영역, 가령, 상기 TFP의 항원 결합 도메인에 힌지(hinge), 가령, 인간 단백질의 힌지를 통하여 부착될 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 상기 힌지는 인간 면역글로불린 (Ig) 힌지, 가령, IgG4 힌지, 또는 CD8a 힌지일 수 있다.
링커
임의선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 길이가 2개 내지 10개 아미노산의 링커는 상기 막경유 도메인과 상기 TFP의 세포질 영역 사이의 링키지(linkage)를 형성할 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 링커의 길이는 적어도 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상일 수 있다. 글리신-세린 더블릿(doublet)이 특별히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들면, 하나의 측면에서, 상기 링커는 GGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 3)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (서열 식별 번호: 4)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된다.
세포질 도메인
상기 TFP의 세포질 도메인은 당해 TFP가 CD3 감마, 델타 또는 입실론 폴리펩티드들을 함유한다면, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있고; TCR 알파 및 TCR 베타 소단위은 일반적으로 신호전달 도메인 안에 결여되어 있다. 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 상기 TFP가 도입되는 면역 세포의 정상적인 작동체 기능중 적어도 하나의 활성을 담당한다. 용어 "작동체 기능"이란 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T 세포의 작동체 기능은 예를 들면, 사이토킨의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포-신호전달 도메인"이란 당해 작동체 기능 신호를 변환하고, 세포에게 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 많은 경우에 상기 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 상기 세포내 신호전달 도메인의 절두된(truncated) 부분이 사용되는 경우, 이러한 절두된 부분은 작동체 기능 신호를 변환시키는 한, 무손상 쇄를 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 당해 작동체 기능 신호를 변환시키는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분이 포함되는 것을 의미한다.
본 명세서의 TFP에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예로는 항원 수용체 참여(engagement) 후 신호전달을 개시하기 위하여 협력해서 작용하는 이러한 T 세포 수용체(TCR)과 이의 공동-수용체들의 의 세포질 서열 뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체, 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 재조합 서열을 포함한다.
상기 TCR 단독으로 생성된 신호는 나이브 T 세포들의 완전한(full) 활성화에 불충분하고, 부차적 및/또는 공동자극 신호가 필요하다는 것은 알려져 있다. 따라서, 나이브 T 세포 활성화는 별개의 두 클래스의 세포질 신호전달 서열에 의해 중재된다고 말할 수 있다: 상기 TCR (일차(primary) 세포내 신호전달 도메인)을 통하여 항원-의존적 일차(primary) 활성화를 개시하는 클래스, 그리고 부차적 또는 공동자극 신호를 제공하기 위하여 항원-독립적인 방식으로 작용하는 클래스 (부차적 세포질 도메인, 가령, 공동자극 도메인).
일차(primary) 신호전달 도메인은 자극 방식, 또는 저해 방식으로 TCR 복합체의 일차(primary) 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAMs)로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 명세서에 특별히 사용되는 용도의 일차(primary) 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAMs의 예로는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 그리고 CD66d를 포함한다. 한 구체예에서, 본 명세서의 TFP는 세포내 신호전달 도메인, 가령, CD3-입실론의 일차(primary) 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 일차(primary) 신호전달 도메인은 변형된 ITAM 도메인을 포함하는데, 가령, 고유의 ITAM 도메인과 비교하였을 때, 활성이 변경된(가령, 증가되거나 또는 감소된) 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 일차(primary) 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유하는 일차(primary) 세포내 신호전달 도메인, 가령, 최적화된 및/또는 절두된 ITAM-함유하는 일차(primary) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 구체예에서, 일차(primary) 신호전달 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
상기 TFP의 세포내 신호전달 도메인은 자체가 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 본 명세서의 TFP의 내용에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 복합될 수 있다. 예를 들면, 상기 TFP의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 입실론 쇄 일부분과 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 상기 세포내 도메인을 포함하는 TFP의 일부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 이의 리간드를 제외한 세포 표면 분자다. 이러한 분자들의 예로는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, 림프구 기능 -연합된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 그리고 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 그리고 이와 유사한 것들을 포함한다. 예를 들면, CD27 공동자극은 시험관내에서 인간 TFP-T 세포들의 확장, 작동체 기능 및 생존을 강화시키고, 그리고 생체내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증가시킨다고 실증되었다(Song 외. Blood. 2012; 119(3):696-706).
본 명세서의 TFP의 세포질 부분 안에 세포내 신호전달 서열은 무작위로 또는 명시된 순서로 서로 연계될 수 있다. 임의선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들면, 2개 내지 10개 길이의 아미노산 (가령, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 아미노산)이 세포내 신호전달 서열 간에 링키지를 형성할 수 있다.
한 구체예에서, 글리신-세린 더블릿이 적합한 링커로 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 단일 아미노산, 가령, 알라닌, 글리신이 적합한 링커로 이용될 수 있다.
하나의 측면에서, 본원에서 기술된 상기 TFP-발현하는 세포는 제 2 TFP, 가령, 동일한 표적 (CD19 또는 BCMA) 또는 상이한 표적 (가령, CD123)에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제 1 TFP를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 TFP-발현하는 세포가 두 개 또는 그 이상의 상이한 TFPs를 포함하는 경우, 상기 상이한 TFPs의 항원 결합 도메인은 당해 항원 결합 도메인들이 서로 상호작용하지 않을 수 있다. 예를 들면, 제 1 및 제 2 TFP를 발현시키는 세포는 제 1 TFP의 항원 결합 도메인을, 가령, 단편으로써, 가령, 제 2 TFP의 항원 결합 도메인과 연합을 형성하지 않는 scFv를 보유할 수 있고, 가령, 제 2 TFP의 상기 항원 결합 도메인은 VHH이다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 상기 TFP-발현하는 세포는 또다른 물질, 가령, 변형된 T 세포의 활성을 강화시키는 물질을 추가 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 상기 물질은 저해성 분자를 억제하는 물질일 수 있다. 저해성 분자들, 가령, PD1은 일부 구체예들에서, 변형된 T 세포의 면역 작동체 반응을 탑재하는 능력을 감소시킨다. 저해성 분자들의 예로는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 구체예에서, 저해성 분자를 억제하는 상기 물질은 제 1 폴리펩티드, 가령, 상기 세포로 양성 신호를 제공하는 제 2 폴리펩티드, 가령, 본원에서 기술된 세포내 신호전달 도메인과 연합된 저해성 분자이다. 한 구체예에서, 상기 물질은 가령, 저해성 분자, 이를 테면 PD1, LAG3, CTLA4, CD 160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4 및 TIGIT, 또는 이들중 임의의 것의 단편 (가령, 이들중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부분)의 제 1 폴리펩티드 그리고 본원에서 기술된 세포내 신호전달 도메인인 제 2 폴리펩티드(가령, 공동자극 도메인 (가령, 본원에서 기술된 4-1BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 일차(primary) 신호전달 도메인 (가령, 본원에서 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 물질은 PD1 또는 이의 단편 (가령, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부분)의 제 1 폴리펩티드, 그리고 본원에서 기술된 세포내 신호전달 도메인(가령, 본원에서 기술된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에서 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인 )의 제 2 폴리펩티드를 포함한다. PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 그리고 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리 수용체들의 저해성 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포들, T 세포들 그리고 골수 세포들 (Agata 외. 1996 Int. Immunol 8:765-75) 상에서 발현된다. PD1에 대한 두 리간드, PD- L1 및 PD-L2는 PD1에 결합할 때, T 세포 활성화를 하향조절하였다 (Freeman 외. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman 외. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter 외. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다 (Dong 외. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank 외. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi 외. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). PD1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 면역 억제는 역전될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 물질은 저해성 분자의 세포외 도메인 (ECD) 을 포함하는데, 가령, 예정된 사멸 1 (PD1)은 막경유 도메인과 임의선택적으로 세포내 신호전달 도메인, 이를 테면 41BB 및 CD3 제타 (또한 본원에서는 PD1 TFP로도 지칭됨)에 융합될 수 있다. 한 구체예에서, 본원에서 기술된 항-CD19 TFP와 조합하여 사용될 때, 상기 PD1 TFP는 상기 T 세포의 지속성을 개선시킨다. 한 구체예에서, 상기 TFP는 PD 1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 TFP이다. 대안으로, 예정된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 또는 예정된 사멸- 리간드 2 (PD-L2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 이를 테면 scFv를 함유하는 TFPs가 제공된다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 TFP-발현하는 T 세포들, 가령, TFP-T 세포들의 집단을 제공한다. 일부 구체예들에서, TFP-발현하는 T 세포들의 집단은 상이한 TFPs를 발현시키는 세포들의 혼합물을 포함한다. 예를 들면, 한 구체예에서, TFP-T 세포들 집단은 본원에서 기술된 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인을 갖는 TFP를 발현시키는 제 1 세포, 그리고 상이한 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인, 가령, 본원에서 기술된 상기 제 1 세포에 의해 발현되는 TFP에 있는 항-CD19 결합 도메인과 상이한 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인을 갖는 TFP를 발현시키는 제 2 세포를 포함할 수 있다. 또다른 예로써, TFP-발현시키는 세포들 집단은 가령, 본원에서 기술된 항-CD19 또는 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 TFP를 발현시키는 제 1 세포, 그리고 CD19 또는 BCMA이외의 표적(가령, 또다른 종양-연합된 항원)에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 TFP를 발현시키는 제 2 세포를 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 명세서은 세포들 집단을 제공하는데, 이때 이 집단에서 적어도 하나의 세포는 본원에서 기술된 항-CD19 또는 항-BCMA 도메인을 갖는 TFP를 발현시키고, 그리고 또다른 물질, 가령, 변형된 T 세포의 활성을 강화시키는 물질을 발현시키는 제 2 세포의 집단을 제공한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 상기 물질은 저해성 분자를 억제하는 물질일 수 있다. 저해성 분자들은 가령, 일부 구체예들에서, 변형된 T 세포의 면역 작동체 반응을 탑재하는 능력을 감소시킨다. 저해성 분자들의 예로는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD 160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 구체예에서, 저해성 분자를 억제하는 상기 물질은 제 1 폴리펩티드, 가령, 상기 세포로 양성 신호를 제공하는 제 2 폴리펩티드, 가령, 본원에서 기술된 세포내 신호전달 도메인과 연합된 저해성 분자이다.
시험관내에서 TFPs를 인코딩하는 전사된 RNA를 만드는 방법들이 본원에서 개시된다. 본 명세서는 세포로 직접적으로 형질감염될 수 있는 TFP 인코딩 RNA 구조체를 또한 포함한다. 형질감염에 사용을 위하여 mRNA를 만드는 방법은 특별히 기획된 프라이머에 이어서, polyA 추가, 3' 및 5' 해독안된 서열 ("UTR")을 함유하는 구조체를 만들기 위하여 polyA 추가, 5' 캡(cap) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site: IRES), 발현될 핵산, 그리고 polyA 꼬리(tail)-전형적으로 50-2000개 염기 길이-의 주형을 시험관내 전사(IVT)와 관련될 수 있다. 이렇게 만들어진 RNA는 상이한 종류의 세포들을 효과적으로 형질감염시킬 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 주형은 상기 TFP의 서열을 포함한다.
하나의 측면에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA TFP는 메신져 RNA (mRNA)에 의해 인코드된다. 하나의 측면에서, 상기 항-CD19 또는 항-BCMA TFP를 인코딩하는 mRNA는 TFP-T 세포의 생산을 위하여 T 세포 내로 도입된다. 한 구체예에서, 상기 시험관내 전사된 RNA TFP는 일과성 형질감염 형태로 세포 안으로 도입될 수 있다. 상기 RNA는 중합효소 쇄 반응 (PCR)-생성된 주형을 이용하여 시험관내 전사에 의해 만들어진다. 임의의 원천의 관심대상 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 중합효소를 이용한 시험관내 mRNA 합성을 위하여 PCR에 의해 주형으로 바로 전환될 수 있다. 상기 DNA의 원천은 예를 들면, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 적합한 DNA 원천일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 바람직한 주형은 본 명세서의 TFP이다. 한 구체예에서, PCR에 이용되는 DNA는 개방 해독 틀(open reading frame)을 함유한다. 상기 DNA는 유기체 게놈의 자연 발생적 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 5' 및/또는 3' 해독안된 영역들 (UTRs)의 전부 또는 일부분을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 엑손(exons) 및 인트론(introns)을 또한 함유할 수 있다. 한 구체예에서, PCR에 이용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또다른 구체예에서, PCR에 이용되는 DNA는 5' 및 3' UTRs을 함유하는 인간 핵산 서열이다. 대안으로, 상기 DNA는 자연 발생적 유기체에서 정상적으로 발현되지 않은 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 인코드하는 개방 해독 틀을 형성하기 위하여 함께 결찰되는 유전자의 일부분을 함유하는 서열이다. 함께 결찰되는 상기 DNA의 일부분은 단일 유기체 또는 하나 이상의 유기체로부터 유래될 수 있다.
형질감염에 이용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 만드는데 PCR이 이용된다. PCR을 실행하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. PCR에 사용을 위한 프라이머는 PCR의 주형으로 이용되는 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 기획된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 상보적"이란 일차 서열의 염기의 대부분 또는 전부가 상보적인 뉴틀레오티드 서열을 지칭하거나, 또는 하나 또는 그 이상의 염기가 비-상보적, 또는 비-합치(mismatched)된다. 실질적으로 상보적 서열은 PCR에 이용되는 어닐링 조건 하에서 의도된 DNA 표적에 어닐링되거나 또는 혼성화될 수 있다. 상기 프라이머는 DNA 주형의 임의의 일부분에 실질적으로 상보적이 되도록 기획될 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 5' 및 3' UTRs을 포함하는, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산(개방 해독 틀)의 일부분을 증폭시키도록 기획될 수 있다. 상기 프라이머는 관심대상의 특정 도메인을 인코드하는 핵산의 일부분을 증폭시키도록 기획될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 프라이머는 5' 및 3' UTRs의 전부 또는 일부분을 포함하는, 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭시키도록 기획될 수 있다. 당분야에 공지된 합성 방법들에 의해 PCR에 유용한 프라이머를 생성시킬 수 있다. "전방 프라이머(forward primers)"는 DNA 주형 상에서 증폭될DNA 서열의 상류인 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 영역이 함유된 프라이머다. "상류(upstream)"는 본원에서 코딩 가닥에 대하여 증폭되는 DNA 서열에 대하여 5에 위치하는 것을 지칭할 때 이용된다. "역 프라이머(reverse primers)"란 증폭되는 DNA 서열의 하류인 이중-가닥의 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 영역을 함유하는 프라이머다. "하류(downstream)"란 본원에서 코딩 가닥에 대하여 증폭되는 DNA 서열에 대하여 3'에 위치하는 것을 지칭할 때 이용된다.
본원에서 기술된 방법에서 PCR에 유용한 임의의 DNA 중합효소들이 이용될 수 있다. 시약 및 중합효소들은 다수의 출처로부터 상업적으로 이용가능하다.
안정성 및/또는 해독 효능을 촉진시키는 능력을 갖는 화학 구조가 또한 이용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTRs를 보유한다. 한 구체예에서, 5' UTR은 1 내지 3000개 길이의 뉴클레오티드다. 코딩 영역에 첨가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머를 디자인하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후, 최적의 해독 효율을 달성하는데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTRs는 관심대상의 핵산에 대해 자연 발생적이고 내인성인 5' 및 3 'UTRs일 수 있다. 대안으로, 관심대상 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 순방향 및 역방향 프라이머에 혼입시킴으로써, 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심대상 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 해독 효율을 변형시키는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 3'UTR 서열의 AU-가 풍부한 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 3' UTRs는 당업계에 잘 공지된 UTRs의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 디자인될 수 있다.
한 구체예에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 Kozak 서열을 함유할 수 있다. 대안으로, 관심대상 핵산에 내인성이 아닌 5 'UTR이 전술한 바와 같이 PCR에 의해 첨가될 때, 컨센수스(consensus) Kozak 서열은 5'UTR 서열을 첨가함으로써 재설계 될 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사체의 해독 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 해독을 수행하는데 필요하지는 않다. 많은 mRNAs에 대한 Kozak 서열에 대한 요건은 당업계에 공지되어 있다. 다른 구체예에서, 5' UTR은 이의 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스의 5'UTR로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 3 '또는 5'UTR에서 사용될 수 있다.
유전자 클로닝의 필요없이, DNA 주형으로부터 RNA를 합성하기 위해서, 전사 프로모터는 전사될 서열의 DNA 주형 상류에 부착되어야 한다. RNA 중합효소의 프로모터로 기능을 하는 서열을 전방 프라이머의 5' 단부에 추가할 때, 상기 RNA 중합효소 프로모터는 전사될 개방 해독 틀의 상류 PCR 산물에 통합된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 프로모터는 본원의 도체에서 기술된 T7 중합효소 프로모터다. 다른 유용한 프로모터로는 T3 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센수스 뉴클레오티드 서열은 당분야에 공지되어 있다.
일부 구체예들에서, mRNA는 리보솜 결합, 이 세포에서 mRNA의 해독 개시 및 안정성을 결정하는 5' 말단과 3' poly(A) 꼬리에 모두 캡을 가지고 있다. 가령, 원형의 DNA 주형 상에서 플라스미드 DNA, RNA 중합효소는 진핵 세포에서 발현에 적합하지 않은 긴 콘카타머(concatameric) 산물을 만든다. 3' UTR의 단부에서 선형화된 플라스미드 DNA 전사로 인하여 비록 전사 후 폴리아데닐화되더라도 진핵 형질감염에서 효과가 없는 정상 크기의 mRNA가 만들어진다.
선형 DNA 주형 상에서, 파아지 T7 RNA 중합효소는 이 전사체의 3' 단부를 당해 주형의 마지막 염기를 지나서 까지 연장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
polyA/T 스트레취가 DNA 주형으로 통합되는 전통적인 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA로 통합된 polyA/T 서열은 플라스미드를 불안정하게 할 수 있고, 그 이유는 박테리아성 세포들로부터 획득된 플라스미드 DNA 주형은 흔히 결손 및 기타 이상으로 인하여 상당히 오염되기 때문이다. 이것은 클로닝 절차를 힘들고, 시간 소모적으로 만들 뿐만 아니라, 종종 신뢰할 수 없게 한다. 그 이유는 클로닝없이, polyA/T 3' 스트레취를 갖는 DNA 주형의 구축을 허용하는 수 있는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 polyA/T 세그먼트는 polyT 꼬리, 이를 테면 100개의 T 꼬리 (크기는 50-5000개의 T가 될 수 있음)를 함유하는 역 프라이머를 이용하여 PCR 동안, 또는 임의의 다른 방법, 가령, DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후, 만들어질 수 있다. poly(A) 꼬리는 또한 RNAs에게 안정성을 제공하고, 이의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, poly(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계에 있다. 한 구체예에서, poly(A) 꼬리는 100개 내지 5000개 사이의 아데노신이다.
RNAs의 poly(A) 꼬리는 poly(A) 중합효소, 이를 테면, 대장균(E. coli) polyA 중합효소 (E-PAP)를 사용하여 시험관내 전수 후, 더 연장될 수 있다. 한 구체예에서, poly(A) 꼬리의 뉴클레오티드 길이를 100개에서 300개 내지 400개의 뉴클레오티드 길오로 증가시키면 RNA의 해독 효과가 약 2-배 증가된다. 추가적으로, 3' 단부에 상이한 화학기를 부착시키면 mRNA 안정성이 증가될 수 있다. 이러한 부착에는 변형된/인공 뉴클레오티드들, 압타머 및 기타 화합물들이 포함될 수 있다. 예를 들면, poly(A) 중합효소를 이용하여 ATP 유사체들은 이러한 poly(A) 꼬리에 통합될 수 있다. ATP 유사체들은 당해 RNA의 안정성을 더 증가시킬 수 있다.
5' 캡 또한 RNA 분자들에게 안정성을 제공할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 방법들에 의해 만들어진 RNAs에는 5' 캡이 포함된다. 상기 5' 캡은 당분야에 공지된 기술 및 본원에서 기술된 기술에 의해 제공된다(Cougot, 외., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, 외., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, 외., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본원에서 개시된 방법들에 의해 만들어진 RNAs에는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 또한 함유할 수 있다. 상기 IRES 서열은 mRNA에 캡-독립적 리보솜 결합을 개시하고, 해독 개시를 촉진시킬 수 있는 임의의 바이러스성, 염색체 또는 인공으로 기획된 서열일 수 있다. 세포 전기천공(electroporation)에 적합한 임의의 용질은 세포 침투성 및 생존력을 촉진시키는 인자, 이를 테면, 슈가, 펩티드들, 지질, 단백질들, 항산화제, 그리고 계면활성제가 포함될 수 있다.
RNA는 임의의 다수의 상이한 방법, 예를 들면, 전기천공(Amaxa Nucleofector®-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 Gene Pulser® II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator® (Eppendorf, Hamburg Germany), 리포펙션을 이용한 양이온 리포좀 중재된 형질감염, 폴리머 포집화(encapsulation), 펩티드 중재된 형질감염, 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템, 이를 테면, "유전자 총(gene guns)" (예를 들면, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001) 참고)를 포함하나, 이에 국한되지 않는 상업적으로 이용가능한 방법들을 이용하여 표적 세포로 도입시킬 수 있다.
TFP 및 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 재조합 핵산
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파, 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 항체 또는 인간화된 항체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질 (TFP)을 인코딩하는 서열; 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 상기 항체는 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 상기 TFP를 통합시킨 기능적 TCR 복합체와 동일한 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자 안에 내포된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자들안에 함유된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위와 항체 도메인, 항원 도메인 또는 결합 리간드 또는 이의 단편은 링커 서열에 의해 작동가능하도록 연계된다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 4이다.
일부 경우에서, 상기 막경유 도메인은 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 TCR 막경유 도메인이다. 일부 경우에서, 상기 세포내 도메인은 오로지 CD3 입실론, 오로지 CD3 감마, 오로지 CD3 델타, 오로지 TCR 알파 또는 오로지 TCR 베타에서만 유래된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (ii) TCR 막경유 도메인, 그리고 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 이때 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 두 개는 동일한 TCR 소단위로부터 유래된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 세포외 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부분을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 막경유 도메인을 포함하는 막경유 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 입실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열로부터 선택된 단백질 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 공동자극 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 그리고 4-1BB (CD137), 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, TCR 제타 쇄, Fc 입실론 수용체 1 쇄, Fc 입실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP (DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이의 기능적 단편들, 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 일부분을 포함하는 TCR 소단위의 ITAM을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 입실론의 ITAM을 대체한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택된 상이한 ITAM을 대체한다.
일부 경우에서, 상기 TFP, 상기 TCR 알파 불변 도메인, 상기 TCR 베타 불변 도메인, 그리고 이의 임의의 조합은 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 일부 경우에서, (a) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인이고, 상기 TFP는 TCR 베타, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; (b) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 TCR 알파, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; 또는 (c) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인과 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합된다.
일부 경우에서, 상기 이에 대하여 적어도 하나, 그러나 20개를 넘지 않는 변형은 세포 신호전달을 중개하는 아미노산의 변형, 또는 상기 TFP에 결합하는 리간드에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항체 단편이다. 일부 경우에서, 상기 항체 단편은 scFv, 단일 도메인 항체 도메인, VH 도메인 또는 VL 도메인이다. 일부 경우에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항-CD19 결합 도메인, 항-B-세포 성숙 항원 (BCMA) 결합 도메인, 항-메소텔린 (MSLN) 결합 도메인, 항-CD22 결합 도메인, 항-PD-1 결합 도메인, 항-BAFF 또는 BAFF 수용체 결합 도메인, 그리고 항-ROR-1 결합 도메인으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 경우에서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 mRNA이다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 핵산 유사체를 포함하고, 이때 상기 핵산 유사체는 이 재조합 핵산의 인코딩 서열에 존재하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 핵 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오르, 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 변형된, 잠김(locked) 핵산 (LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 펩티드 핵산 (PNA), 1',5'-무수헥시톨 핵산 (HNA), 몰포리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 그리고 2'-플루오르 N3-P5'-포스포라미디트로 구성된 군에서 선택된다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 리더 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 프로모터 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 poly(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 3'UTR 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 단리된 핵산이거나, 또는 비-자연 발생적 핵산이다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산이다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열과 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 항체 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 결합 리간드 또는 이의 단편을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 서열; 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인, TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 결합 도메인 또는 이의 단편은 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 상기 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 IgG1 항체에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 IgG1 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 세포 표면 항원에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 종양 세포의 표면 상에 있는 세포 표면 항원에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 항체 또는 이의 단편을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 CD16 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 CD16-결합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 결합 리간드는 인간 또는 인간화된다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 상기 결합 리간드에 의해 결합될 수 있는 항체 또는 이의 단편을 인코드하는 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 세포로부터 분비될 수 있다.
일부 경우에서, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 상기 TFP를 통합시킨 기능적 TCR 복합체와 동일한 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자 안에 내포된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자들 안에 내포된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위와 항체 도메인, 항원 도메인 또는 결합 리간드 또는 이의 단편은 링커 서열에 의해 작동가능하도록 연계된다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 4이다.
일부 경우에서, 상기 막경유 도메인은 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 TCR 막경유 도메인이다. 일부 경우에서, 상기 세포내 도메인은 오로지 CD3 입실론, 오로지 CD3 감마, 오로지 CD3 델타, 오로지 TCR 알파 또는 오로지 TCR 베타에서만 유래된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (ii) TCR 막경유 도메인, 그리고 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 이때 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 두 개는 동일한 TCR 소단위로부터 유래된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 세포외 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부분을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 막경유 도메인을 포함하는 막경유 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 입실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 공동자극 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 그리고 4-1BB (CD137), 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, TCR 제타 쇄, Fc 입실론 수용체 1 쇄, Fc 입실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP (DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이의 기능적 단편들, 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 일부분을 포함하는 TCR 소단위의 ITAM을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 입실론의 ITAM을 대체한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택된 상이한 ITAM을 대체한다.
일부 경우에서, 상기 TFP, 상기 TCR 알파 불변 도메인, 상기 TCR 베타 불변 도메인, 그리고 이의 임의의 조합은 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 일부 경우에서, (a) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인이고, 상기 TFP는 TCR 베타, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; (b) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 TCR 알파, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; 또는 (c) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인과 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합된다.
일부 경우에서, 상기 이에 대하여 적어도 하나, 그러나 20개를 넘지 않는 변형은 세포 신호전달을 중개하는 아미노산의 변형, 또는 상기 TFP에 결합하는 리간드에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항체 단편이다. 일부 경우에서, 상기 항체 단편은 scFv, 단일 도메인 항체 도메인, VH 도메인 또는 VL 도메인이다. 일부 경우에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항-CD19 결합 도메인, 항-B-세포 성숙 항원 (BCMA) 결합 도메인, 항-메소텔린 (MSLN) 결합 도메인, 항-CD22 결합 도메인, 항-PD-1 결합 도메인, 항-BAFF 결합 도메인, 그리고 항-ROR-1 결합 도메인으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 경우에서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 mRNA이다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 핵산 유사체를 포함하고, 이때 상기 핵산 유사체는 이 재조합 핵산의 인코딩 서열에 존재하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 핵 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오르, 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 변형된, 잠김(locked) 핵산 (LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 펩티드 핵산 (PNA), 1',5'-무수헥시톨 핵산 (HNA), 몰포리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 그리고 2'-플루오르 N3-P5'-포스포라미디트로 구성된 군에서 선택된다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 리더 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 프로모터 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 poly(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 3'UTR 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 단리된 핵산이거나, 또는 비-자연 발생적 핵산이다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산이다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열과 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 대안으로, 상기 재조합 핵산은 TCR 감마 또는 TCR 델타 도메인, 가령, 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (2) 막경유 도메인, 및 (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고 (ii) 세포 표면 상에 발현되는 수용체 또는 폴리펩티드에 결합하는 리간드 또는 이의 단편을 포함하는 항원 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 서열 그리고 (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산이 본원에서 제공되는데, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인, TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며; 이때 상기 TCR 소단위와 항원 도메인은 작동가능하도록 연계되며, 그리고 이때 상기 TFP는 T 세포 안에서 발현될 때, TCR 복합체에 기능적으로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 리간드를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 리간드는 세포의 수용체에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 리간드는 상기 세포 표면 상에 발현되는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 경우에서, 세포 표면 상에 발현되는 상기 수용체 또는 폴리펩티드는 스트레스 응답 수용체 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 세포 표면 상에 발현되는 상기 수용체 또는 폴리펩티드는 MHC 클래스 I-관련된 당단백질이다. 일부 경우에서, 상기 MHC 클래스 I-관련된 당단백질은 MICA, MICB, RAET1E, RAET1G, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 상기 리간드 또는 이의 단편의 단량체 또는 이량체를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 리간드 또는 이의 단편은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체이다. 일부 경우에서, 상기 리간드 또는 이의 단편은 단량체 또는 이량체다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 항체 또는 이의 단편을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 가변 영역을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 항원 도메인은 CDR을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 리간드 또는 이의 단편은 천연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 리간드 또는 이의 단편이다.
일부 경우에서, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 상기 TFP를 통합시킨 기능적 TCR 복합체와 동일한 기능적 TCR 복합체로 통합된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자 안에 내포된다. 일부 경우에서, 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자들안에 함유된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위와 항체 도메인, 항원 도메인 또는 결합 리간드 또는 이의 단편은 링커 서열에 의해 작동가능하도록 연계된다. 일부 경우에서, 상기 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 4이다.
일부 경우에서, 상기 막경유 도메인은 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 TCR 막경유 도메인이다. 일부 경우에서, 상기 세포내 도메인은 오로지 CD3 입실론, 오로지 CD3 감마, 오로지 CD3 델타, 오로지 TCR 알파 또는 오로지 TCR 베타에서만 유래된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (ii) TCR 막경유 도메인, 그리고 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 이때 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 두 개는 동일한 TCR 소단위로부터 유래된다.
일부 경우에서, 상기 TCR 세포외 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부분을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 막경유 도메인을 포함하는 막경유 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 입실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 공동자극 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 그리고 4-1BB (CD137), 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 TCR 소단위는 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, TCR 제타 쇄, Fc 입실론 수용체 1 쇄, Fc 입실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP (DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이의 기능적 단편들, 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 일부분을 포함하는 TCR 소단위의 ITAM을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 입실론의 ITAM을 대체한다. 일부 경우에서, 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택된 상이한 ITAM을 대체한다.
일부 경우에서, 상기 TFP, 상기 TCR 알파 불변 도메인, 상기 TCR 베타 불변 도메인, 그리고 이의 임의의 조합은 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 일부 경우에서, (a) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인이고, 상기 TFP는 TCR 베타, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; (b) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 TCR 알파, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; 또는 (c) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인과 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합된다.
일부 경우에서, 상기 이에 대하여 적어도 하나, 그러나 20개를 넘지 않는 변형은 세포 신호전달을 중개하는 아미노산의 변형, 또는 상기 TFP에 결합하는 리간드에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항체 단편이다. 일부 경우에서, 상기 항체 단편은 scFv, 단일 도메인 항체 도메인, VH 도메인 또는 VL 도메인이다. 일부 경우에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항-CD19 결합 도메인, 항-B-세포 성숙 항원 (BCMA) 결합 도메인, 항-메소텔린 (MSLN) 결합 도메인,, 항-CD22 결합 도메인, 항-BAFF 결합 도메인, 항-PD-1 결합 도메인, 그리고 항-ROR-1 결합 도메인으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 경우에서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 mRNA이다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 핵산 유사체를 포함하고, 이때 상기 핵산 유사체는 이 재조합 핵산의 인코딩 서열에 존재하지 않는다. 일부 경우에서, 상기 핵 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오르, 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 변형된, 잠김 핵산 (LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 펩티드 핵산 (PNA), 1',5'-무수헥시톨 핵산 (HNA), 몰포리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 그리고 2'-플루오르 N3-P5'-포스포라미디트로 구성된 군에서 선택된다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 리더 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 프로모터 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 poly(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 3'UTR 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 단리된 핵산이거나, 또는 비-자연 발생적 핵산이다. 일부 경우에서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산이다.
일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산은 TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열과 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 재조합 핵산을 포함하는 벡터가 본원에서 추가 기술된다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터 (AAV), Rous 육종 바이러스 (RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택된다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 AAV6 벡터이다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 프로모터를 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 벡터는 시험관내 전사된 벡터이다.
원하는 분자들을 코딩하는 핵산 서열은 당분야에 공지된 재조합 방법, 이를 테면, 예를 들면, 표준 기술을 이용하여 이 유전자를 발현시키는 세포로 부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 상기 동일한 것을 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 당해 유전자를 유도함으로써, 또는 상기 동일한 것을 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리함으로써 획득될 수 있다. 대안으로, 관심대상 유전자는 클론보다는 합성에 의해 만들어질 수 있다.
본 명세서는 본 명세서의 DNA가 삽입된 벡터들을 또한 제공한다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 장기(long-term) 유전자 전이를 달성하는데 적합한 도구인데, 그 이유는 이식유전자의 장기적이고, 안정적인 통합 및 이의 딸(daughter) 세포에서의 그의 전파를 허용하기 때문이다. 렌티바이러스성 벡터들은 암(onco)-레트로바이러스들, 이를 테면, 비-증식 세포들, 이를 테면 간세포를 형질도입시킬 수 있는 뮤린 백혈병 바이러스들로부터 유래된 벡터보다 추가적인 장점을 갖는다. 이들은 또한 면역원성이 낮다는 장점을 갖고 있다.
또다른 구체예에서, 본 명세서의 바람직한 TFP를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터 (A5/35)이다. 또다른 구체예에서, 상기 TFPs를 인코딩하는 핵산은 트랜스포존(transposons) 이를 테면, 슬리핑 뷰티(sleeping beauty), 크리스퍼(crisper), CAS9, 그리고 아연 핑거(zinc finger) 뉴클레아제를 이용하여 발현이 이루어질 수 있다. 하기 June 외. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716 참고(이는 본원의 참고자료에 편입됨).
본 명세서의 발현 구조체들을 표준 유전자 전달 프로토콜을 이용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 또한 이용할 수도 있다. 유전자 전달 방법들은 당분야에 공지되어 있다 (가령, U.S. 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466 참고-이들의 전문이 본원의 참고자료에 편입됨). 또다른 구체예에서, 본 명세서는 유전자 요법 벡터를 제공한다.
상기 핵산은 다수의 벡터 유형으로 클로닝될 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산은 플라스미드, 파아지미드(phagemid), 파아지 유도체, 동물 바이러스, 그리고 코스미드(cosmid)를 포함하나, 이에 국한되지 않은 벡터 안으로 클로닝될 수 있다. 특히 관심대상 벡터들에는 발현 벡터들, 복제 벡터들, 프로브 생성 벡터들, 그리고 서열화 벡터들이 포함된다.
또한, 상기 발현 벡터는 바이러스성 벡터 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스성 벡터 기술은 당분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, Sambrook 외., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), 그리고 다른 바이러스학 및 분자 생물학 메뉴얼에 기술된다. 벡터로 유용한 바이러스들에는 레트로바이러스들, 아데노바이러스들, 아데노-연합된 바이러스들, 헤르페스(herpes) 바이러스들, 그리고 렌티바이러스들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체 안에서 기증적으로 복제되는 원점, 프로모터 서열, 통상적인 제한 엔도뉴클레아제 부위, 그리고 하나 또는 그 이상의 선택성 마커들을 함유한다 (가령, WO 01/96584; WO 01/29058; 그리고 U.S. 특허 번호 6,326,193).
포유 동물 세포로의 유전자 전이를 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들면, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터에 삽입되고, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자로 포장될 수 있다. 상기 재조합 바이러스는 그 다음 단리되고, 시험관내 또는 생체 외에서 대상체의 세포들로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예들에서, 아데노바이러스 벡터들이 이용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당분야에 공지되어 있다. 한 구체예에서, 렌티바이러스 벡터들이 이용된다.
추가 프로모터 요소들, 가령, 인핸서는 전사 개시 빈도를 조절한다. 비록 다수의 프로모터는 시작 부위의 하류에 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났지만, 전형적으로, 이들은 시작 부위의 상류 30-110 bp 영역에 위치한다. 프로모터 요소들 간의 공간은 유연성이 있고, 이러한 요소들이 서로에 대하여 역전되어 있거나, 또는 이동될 때, 프로모터 기능은 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 상기 프로모터 요소들 간의 공간이 50bp로 벌어질 때까지 증가될 수 있지만, 이때부터 활성은 감소되기 시작한다. 상기 프로모터에 의존적으로, 개별 요소들은 공조적으로 또는 독립적으로 전사를 활성화시키는 기능을 할 수 있다.
포유류 T 세포에서 TFP 이식유전자를 발현시킬 수 있는 예시적인 프로모터는 EF1a 프로모터다. 고유의 EF1a 프로모터는 연장(elongation) 인자-1 복합체의 알파 소단위의 발현을 이끄는데, 이것은 아미노아실 tRNAs를 리보솜으로 효소적 운반을 담당한다. 상기 EF1a 프로모터는 포유류 발현 플라스미드에서 광범위하게 이용되었으며, 클론된 이식유전자들로부터 렌티바이러스성 벡터로 TFP 발현을 구동시키는데 효과적임을 보여주었다 (가령, Milone 외., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)). 프로모터의 또다른 예로는 즉각 초기(immediate early) 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하도록 연계된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동시킬 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 기타 구성적 프로모터 서열이 또한 이용될 수 있는데, 예를 들면, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기(early) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류(avian) 백혈병 바이러스 프로모터, Epstein-Barr 바이러스 즉각 초기(immediate early) 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터를 포함하나 이에 국한되지 않으며, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 이를 테면, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 연장 인자-1a 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 그리고 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 더욱이, 본 명세서는 구성적 프로모터의 사용에 한정되지 않아야 한다. 유도성 프로모터는 본 명세서의 일부분으로 또한 간주된다. 유도성 프로모터의 사용으로 분자 스위치를 제공하는데, 이것은 발현이 바람직한 경우에, 작동가능하도록 연계된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켤 수 있고, 이러한 발현을 원하지 않는 경우 발현을 끌 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 그리고 테트라사이클린-조절된 프로모터가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
TFP 폴리펩티드 또는 이의 일부분들의 발현을 평가하기 위하여, 세포 안으로 도입될 발현 벡터는 바이러스성 벡터들을 통하여 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선별을 용이하게 하기 위하여, 선택성 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이둘 모두를 또한 함유할 수 있다. 다른 측면들에서, 상기 선택성 마커는 별개의 DNA 조각을 통하여 운반되고, 공동형질감염 과정에 이용될 수 있다. 선별 가능한 마커 및 리포터 유전자 모두가 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열에 의해 측면에 있을 수 있다. 유용한 선택성 마커들에는 예를 들면, 항생제-저항성 유전자들, 이를 테면 neo 및 이와 유사한 것들이 포함된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나, 또는 발현되지 않는 유전자이며, 폴리펩티드의 발현으로 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성으로 현시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포로 도입된 후 적절한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다 (가령, Ui-Tei 외., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최대 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 구조체는 프로모터로써 식별된다. 이러한 프로모터 영역들은 리포터 유전자에 연계될 수 있고, 프로모터-구동된 전사를 조절하는 능력에 대하여 물질들을 평가하는데 이용될 수 있다.
세포 안으로 유전자를 도입시키고, 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 당업계의 임의의 방법으로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키는 물리적 방법은 인산 칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 마이크로인젝션, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Sambrook 외., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY) 참고. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 바람직한 방법은 인산 칼슘 형질감염이다.
관심대상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키는 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터 및 특히 레트로 바이러스 벡터는 인간 세포와 같은 포유 동물 세포에 유전자를 삽입하는 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노 바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다(가령, U.S. 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362 참고.
폴리뉴클레오티드를 숙조 세포 안으로 도입시키는 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 이를 테면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 그리고 수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드계는 리포좀 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 표적화 운반을 위한 최신 방법이 이용될 수 있는데, 이를 테면, 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 준-미크론 크기의 운반 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 운반이 이용가능하다.
비-바이러스성 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용은 핵산을 숙주 세포 내로 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 도입하기 위해 고려된다. 또다른 측면에서, 핵산은 지질과 결합할 수 있다. 지질과 결합된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화될 수 있으며, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되어 리포좀 및 올리고 뉴클레오티이드 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되어 리포좀에 포획될 수 있고, 리포좀과 복합체를 이루고, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 결합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함유되거나 또는 복합체 화되거나 그렇지 않으면 지질과 결합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터와 관련된 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들면, 그들은 이중층 구조, 미셀 또는 "붕괴된(collapsed)" 구조로 존재할 수 있다. 그것들은 단순히 용액에 흩어져 있어 크기 또는 모양이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수도 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방성 물질이다. 예를 들면, 지질은 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 부류뿐만 아니라 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 방울을 포함한다.
상업적 공급원으로부터 사용에 적합한 지질을 구할 수 있다. 예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ( "DMPC")은 Sigma, St. Louis, Mo.에서 얻을 수 있으며; 디세틸 포스페이트 ( "DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, N. Y.)에서 얻을 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring에서 얻을 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜 글리세롤 ( "DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, Ala.)에서 얻을 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올의 지질 원액(stock solution)은 약 -20℃에서 보관할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 쉽게 증발하기 때문에 유일한 용매로 사용된다. "리포좀"은 봉입된(enclosed) 지질 이중층 또는 응집체(aggregates)의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중박층(multilamellar) 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포(vesicular) 구조를 갖는 것이 특징이 될 수 있다. 다중박층 리포좀은 수성 매질로 분리된 여러 지질 층(layers)을 가지고 있다. 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때, 이들은 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조가 형성되기 전에 자가-재배열을 거쳐, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(Ghosh 외., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 용액에서 정상적인 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물도 또한 포함된다. 예를 들면, 지질은 미셀 구조로 추정될 수 있거나, 또는 단순히 지질 분자의 불균일 응집체로 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
숙주 세포 안으로 외인성 핵산을 도입하거나 또는 본 명세서의 억제제에 세포를 노출시키는 데 사용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석을 수행할 수 있다. 이러한 검정에는 예를 들면, 당분야에 잘 공지된 "분자 생물학적" 검정, 이를 테면, Southern 및 Northern 블랏팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 이를 테면 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 가령, 면역학적 방법(이를 테면 ELISAs 및 웨스턴 블랏)에 의해 탐지하는 검정, 또는 본 명세서 범위 안에 속하는 물질을 식별하기 위한 본원에 기술된 검정이 포함된다.
본 명세서는 TFP 인코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가 제공한다. 하나의 측면에서, TFP 벡터는 세포, 가령, T 세포로 직접적으로 형질도입될 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 가령, 하나 또는 그 이상의 플라스미드들 (가령, 발현 플라스미드들, 클로닝 벡터들, 미니서클(minicircles), 미니벡터들, 이중 극미 염색체(double minute chromosomes)), 레트로바이러스성 벡터 구조체들과 렌티바이러스성 벡터 구조체들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 벡터다. 하나의 측면에서, 상기 벡터는 포유류 T 세포들에서 상기 TFP 구조체를 발현시킬 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 포유류 T 세포는 인간 T 세포다.
변형된 T 세포들
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 재조합 핵산, 또는 본원에서 기술된 벡터를 포함하는 변형된 T 세포가 본원에서 기술되며; 이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 핵산의 TFP를 인코딩하는 서열, 또는 본원에서 기술된 핵산의 서열에 의해 인코드된 TFP를 포함하는 변형된 T 세포를 본원에서 또한 개시하며,이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 개시된 TFP를 인코딩하는 서열 또는 본원에서 개시된 핵산 서열에 의해 인코드된 TFP를 포함하는 변형된 동종이계 T 세포들이 본원에서 추가 시된다.
일부 경우에서, 상기 T 세포는 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 이종기원의 서열을 더 포함하며, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이다. 일부 경우에서, 상기 기능적으로 파괴된 내인성 TCR은 내인성 TCR 알파 쇄, 내인성 TCR 베타 쇄, 또는 내인성 TCR 알파 쇄 및 내인성 TCR 베타 쇄이다. 일부 경우에서, 상기 기능적으로 파괴된 내인성 TCR은 변형안된 대조군 T 세포의 것과 비교하여, MHC-펩티드 복합체에 대한 결합이 감소된다. 일부 경우에서, 상기 기능적 파괴란 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자의 파괴를 말한다. 일부 경우에서, 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자의 파괴란 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자 서열을 이 T 세포의 게놈으로부터 제거함을 말한다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 T 세포는 동종이계 T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 변형된 T 세포들은 세포내 신호전달 도메인의 양성 신호를 포함하는 제 2 폴리펩티드와 연합된, 저해성 분자의 적어도 일부분을 포함하는 제 1 폴리펩티드를 포함하는 저해성 분자를 인코드하는 핵산을 더 포함한다. 일부 경우에서, 상기 저해성 분자는 PD1의 적어도 일부분을 포함하는 제 1 폴리펩티드와 공동자극 도메인과 일차(primary) 신호전달 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함한다.
T 세포의 공급원ㅇ
확장 및 유전자 변형 전에, 대상체로부터 T 세포의 공급원이 수득된다. 용어 "대상체"란 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유류)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 인간, 개, 고양이, 생쥐, 쥐 및 이의 형질 전환 종이 있다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 본 명세서의 특정 측면들에서, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 명세서의 특정 측면들에서, 일부 구체예들에서, 이를 테면, Ficoll™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여, 대상으로부터 수집된 혈액 단위로부터 T 세포를 수득할 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술(apheresis)에 의해 수득된다. 성분 채집 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵(nucleated) 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다. 하나의 측면에서, 성분 채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획(fraction)을 제거하고, 세포를 후속 처리 단계에 적합한 완충제 또는 배지에 넣을 수 있다. 본 명세서의 하나의 측면에서, 상기 세포들은 인산염 완충된 염수(PBS)로 세척된다. 대안적 측면에서, 상기 세척액은 칼슘이 부족하고, 마그네슘이 부족할 수 있거나, 또는 이들 모두 2가 양이온이 아닐지라도 많은 것이 부족할 수 있다. 칼슘이 없는 초기 활성화 단계는 확대된 (magnified) 활성화로 이어진다. 세척 단계가 제조업자의 지시에 따라 반-자동 "흐름-통과(flow-through)" 원심 분리기 (예를 들어, Cobe® 2991 세포 처리기, Baxter OncologyCytoMate 또는 Haemonetics® Cell Saver® 5)를 이용하여 당분야에 공지된 방법에 따라 이루어질 수 있음을 당업자는 용이하게 인지할 것이다. 세척 후, 세포는 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca-없는, Mg-없는 PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액이 있거나 또는 없는 다른 식염수 용액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분 채집 샘플에서 바람직하지 않은 성분들이 제거 될 수 있고, 세포가 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
하나의 측면에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 PERCOLL® 구배(gradient)를 통한 원심 분리 또는 역류 원심 분리 용리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써, 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 이를 테면 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포는 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가 분리될 수 있다. 예를 들면, 하나의 측면에서, 원하는 T 세포의 양성 선별에 충분한 시간 동안 항-CD3/항-CD28 (가령, 3×28)-접합된 비드, 이를 테면 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 항온처리함으로써, T 세포는 단리된다. 하나의 측면에서, 기간은 약 30 분이다. 추가 측면에서, 기간은 30 분 내지 36 시간, 또는 더 긴 시간 및 그 사이의 모든 정수 값 범위이다. 추가 측면에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 여전히 또다른 바람직한 측면에서, 기간은 10 내지 24 시간이다. 하나의 측면에서, 상기 항온처리 기간은 24 시간이다. 다른 세포 유형과 비교하여, T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 T 세포를 단리하기 위해, 예를 들어 종양 침윤 림프구 (TIL)를 종양 조직으로부터 또는 면역절충된(immunocompromised) 개체로부터 단리시키는 것은 더 긴 배양 기간이 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 배양 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하는 시간을 단순히 단축 또는 연장시킴으로써, 및/또는 (본 명세서에 추가로 기술 된 바와 같이) 비드에 대한 T 세포의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 동안 또는 공정 동안 다른 시점에서 또는 이에 대해 우선적으로 선택되거나, 또는 반하여(against) 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시 또는 다른 바람직한 시점에서 우선적으로 선택되거나, 또는 반하여(against) 선택될 수 있다. 당업자는 본 명세서의 내용에서 다수의 선택 라운드가 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 측면들에서, 선택 절차를 수행하고, 활성화 및 확장 과정에서 "선택되지 않은(unselected)" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가 선택 라운드를 또한 거칠 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍도(enrichment)는 음성적으로 선택된 세포에 대하여 특유한 표면 마커를 지향하는 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일 클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성(magnetic) 면역흡착 또는 유동 세포 분석을 통한 세포 분류(sorting) 및/또는 선택법이다. 예를 들면, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 측면들에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부하게 하거나 양성적으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, 특정 측면들에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈될 수 있다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 IFNγ TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임(granzyme) B, 그리고 퍼포린(perforin), 또는 다른 적절한 분자들, 가령, 기타 사이토킨을 발현시키는 T 세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현의 스크리닝 방법은 가령, PCT 공개 번호: WO 2013/126712에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 단리하기 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도를 변화시킬 수 있다. 특정 측면들에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것 (가령, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 하나의 측면에서, 20 억개 세포/mL의 농도가 사용된다. 하나의 측면에서, 10 억개 세포/mL의 농도가 사용된다. 추가 측면에서, 1 억 개 이상의 세포/mL가 사용된다. 추가 측면에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 5 천만 세포 / mL의 세포 농도가 사용된다. 여전히 한 측면에서, 7천5백만개, 8천만개, 8천 5백만개, 9천만개, 9천5백만개 또는 1 억개 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 추가 측면들에서, 1억 2천 5백만 또는 1 억 5 천만 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같이 관심대상 표적 항원을 약하게 발현시킬 수 있거나 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (가령, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터 약하게 발현될 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있게 한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 획득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 더 효율적으로 선택할 수 있다.
관련된 측면에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석함으로써, 입자와 세포 사이의 상호 작용이 최소화된다. 이는 입자에 결합될 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들면, CD4+ T 세포는 CD28을 더 높은 수준으로 발현시키고, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 하나의 측면에서, 사용된 세포의 농도는 5x106/mL이다. 다른 측면들에서, 사용된 농도는 약 1x105/mL 내지 1x106/mL 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다. 다른 측면들에서, 세포는 2-10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 길이 동안 회전자(rotator)에서 배양될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이 문맥에서 유용할 수 있지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBD, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 예를 들면, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 적합한 세포 동결 배지를 이용하는 것과 관련되며, 그 다음 세포는 분당 1의 속도로 -80℃로 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 기상(vapor phase)에 저장된다. 다른 제어된 동결 방법이 이용될 수 있고, 뿐만 아니라 -20℃에서 즉시 또는 액체 질소에서 제어되지 않는 동결이 이용될 수 있다. 특정 측면들에서, 동결보존된 세포를 본원에 기재된 바와 같이 해동시키고, 세척하고, 그리고 본 명세서의 방법을 이용하여 활성화 전에 실온에서 1 시간 동안 휴면(rest)시켰다.
본원에 기술된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있는 시간 이전에 대상으로부터 혈액 샘플 또는 성분 채집 산물의 수집이 또한 본 명세서의 내용에서 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집 될 수 있고, T 세포와 같은 바람직한 세포는 분리 및 동결되어, 본원에 기재된 것과 같은 T 세포로부터 혜택을 받을 수 있는 임의의 수의 질병 또는 상태를 위한 T 세포 요법에서 나중에 사용될 수 있다. 하나의 측면에서, 혈액 샘플 또는 성분 채집은 일반적으로 건강한 대상에서 채취된다. 특정 측면들에서, 혈액 샘플 또는 성분 채집은 질병이 발생할 위험이 있지만, 아직 질병이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상으로부터 채취되며, 관심대상 세포는 분리되어 추후 사용을 위해 동결된다. 특정 측면들에서, T 세포는 팽창, 동결되며, 추후에 사용될 수 있다. 특정 측면들에서, 샘플은 본원에 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후, 그리나 임의의 치료에 앞서 환자로부터 수집된다. 추가 측면에서, 상기 세포는 하기 임의의 수의 관련 치료 양식에 앞서 대상으로부터 혈액 샘플 또는 성분 채집으로부터 단리된다: 나탈리주맙,에팔리주맙, 항바이러스제, 화학 요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 항체, 또는 다른 면역절제(immunoablative) 제제, 이를 테면, 알렘투주맙(alemtuzumab), 항-CD3 항체, 사이토산, 플루다라빈, 사이클로스포린, 타크로리무스(tacrolimus), 라파마이신, 미코페놀 산, 스테로이드, 로미뎁신( romidepsin)과 같은 제제를 이용한 치료 및 조사(irradiation).
본 명세서의 추가 측면에서, T 세포들은 이 대상체에게 기능적 T 세포들을 남긴 치료 직후, 환자로부터 얻는다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로 치료 후, 치료 직후 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안, 수득된 T 세포의 품질이 최적일 수 있거나, 또는 생체 외에서 확장하는 이들의 능력이 개선될 수 있다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체 외 조작 후, 이들 세포는 강화된 접목(engraftment) 및 생체내 확장에 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 이러한 회복 단계 동안, T 세포, 수지상 세포 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 명세서의 맥락 내에서 고려된다. 더욱이, 특정 측면들에서, 동원(mobilization) (예를 들어, GM-CSF에 의한 동원) 및 컨디셔닝 요법은 대상에서 특히, 치료 후 특정된 기간(window of time) 동안 특정 세포 유형의 재 증식(repopulation), 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 상태를 창출하는데 이용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포들은 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 그리고 7,572,631에서 기술된 방법들을 일반적으로 이용하여 활성화되고, 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서의 T 세포들은 CD3/TCR 복합체 연합된 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 접촉에 의해, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(가령, 브리오스태틴)과의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면에서 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들면, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예로는 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 포함하며, 당분야에 흔히 공지된 다른 방법에서와 같이 이용될 수 있다 (Berg 외., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen 외., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland 외., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 전형적인 혈액 또는 성분채집된(apheresed) 말초 혈액 단핵 세포 산물은 세포 독성 또는 억제제 T 세포 집단 (TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 생체외 확장은 약 8 일-9 일 전, 주로 TH 세포로 구성되는 T 세포 집단을 생성하는 반면, 약 8 일-9 일 후, T 세포 집단은 점점 더 많은 TC 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 TH 세포들을 포함하는 T 세포 집단을 대상에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 하위세트가 분리된 경우, 이 하위세트를 더 크게 확장시키는 것이 유리할 수 있다.
더욱이, CD4 및 CD8 마커 이외에도, 다른 표현형 마커는 세포 확장 과정 동안 상당히 유의적으로, 그러나 상당부분 재현가능하게 변한다. 따라서, 이러한 재현성(reproducibility)은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 맞춤화하는 능력을 가능하게 한다.
일단 항-CD19, 항-BCMA, 항-CD22, 항-ROR1, 항-PD-1, 또는 항-BAFF TFP가 구축되면, 각종 검정을 이용하여 적절한 시험관내에서, 그리고 동물 모델에서 이 분자의 활성, 이를 테면, 항원 자극 후 T 세포들을 확장시키는 능력, 재-자극 없이 T 세포 확장을 유지하는 능력, 그리고 항-암 활성을 포함하나, 이에 국한되지 않는 활성을 평가할 수 있다. 항-CD19 항-BCMA, 항-CD22, 항-ROR1, 항-PD-1, 또는 항-BAFF TFP의 효과를 평가하기 위한 검정은 하기에서 더 상세하게 기술된다.
일차(primary) T 세포들에서 TFP 발현의 Western 블랏 분석을 이용하여 단량체 및 이량체 존재를 탐지할 수 있다(가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453- 1464 (2009) 참고. 매우 간략하게, 상기 TFPs를 발현시키는 T 세포들 (CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)은 10일 이상 동안 시험관내에서 확장되고, 용해 후, 환원 조건에서 SDS-PAGE를 거친다. TFPs는 TCR 쇄에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의해 탐지된다. 동일한 T 세포 하위세트를 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석에 사용하여 공유적 이량체 형성을 평가할 수 있다.
항원 자극 후,TFP+ T 세포들의 시험관내 확장은 유동 세포분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 알파CD3/알파CD28 그리고 APCs에 의해 자극을 받은 후, 프로모터의 제어 하에 분석될 GFP를 발현시키는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입된다. 예시적인 프로모터에는 CMV IE 유전자, EF-1 알파, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터들이 포함된다. GFP 형광은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 하위세트에서 배양 6 일 차에 유동 세포분석에 의해 평가된다 (가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참고). 대안으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 혼합물은 0 일 차에 알파CD3/알파CD28 피복된 자성 비드로 자극을 받고, 1일 차에 2A 리보솜 스키핑(skipping) 서열을 이용하여 eGFP와 함께 TFP를 발현시키는 바이시트론성(bicistronic) 렌티바이러스성 벡터를 이용하여 TFP로 형질도입된다. 배양물은 세척 후, 항CD3 및 항-CD28 항체 (K562-BBL-3/28) 존재 하에서 hCD32 및 4-1BBL을 발현시키는 CD19+ K562 세포들 (K562-CD19), 야생형 K562 세포들 (K562 야생형) 또는 K562 세포들로 다시-자극된다. 외인성 IL-2은 100 IU/mL로 이틀마다 이 배양물에 추가된다. GFP+ T 세포들은 비드-기반의 카운팅을 이용하여 유동 세포분석에 의해 계수된다 (가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참고).
재-자극 없이, 유지된 TFP+T 세포 확장을 또한 측정할 수 있다(가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참고). 간략하게 설명하자면, 평균 T 세포 용적 (fl)은 0 일 차에 알파CD3/알파CD28 피복된 자성 비드로 자극 후, 1일 차에 지정 TFP로 형질도입 후, Coulter Multisizer III 입자 계수기를 이용하여 배양 8일 차에 측정된다.
TFP-T 활성을 측정하기 위하여 동물 모델이 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 면역결핍 마우스에서 일차(primary) 인간 프레-B ALL를 치료하기 위한 인간 CD19-특이적 TFP+ T 세포들을 이용한 이종이식편 모델이 이용될 수 있다(가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453- 1464 (2009) 참고). 매우 간단하게, ALL 확립 후, 마우스를 처리군으로 무작위화시킨다. 상이한 수의 공작된 T 세포들을 B-ALL를 품고 있는 NOD/SCID/γ-/- 마우스에 1:1 비율로 공동주사한다. 마우스 비장 DNA에서 각 벡터의 복제 수는 T 세포 주사 후 다양한 시점에서 평가된다. 매주 간격으로 백혈병에 대하여 동물을 평가한다. 말초 혈액 CD19+ B-ALL 모세포 수는 알파CD19-제타 TFP+ T 세포들 또는 모의(mock)-형질도입된 T 세포들이 주사된 마우스에서 측정된다. 그룹에 대한 생존 곡선은 로그-등급(log-rank) 테스트를 사용하여 비교된다. 또한, NOD/SCID/γ-/- 마우스에 T 세포 주사 후 4 주 시점에, 절대 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수를 또한 분석할 수도 있다. 마우스에 백혈병 세포를 주사하고, 3 주 후 eGFP에 연계된 TFP를 인코딩하는 바이시스트론성 렌티바이러스성 벡터에 의해 TFP가 발현되도록 공작된 T 세포를 주입한다. T 세포는 주사 전, 모의-형질도입된 세포와 혼합하여 45-50% 입력 GFP+ T 세포로 정상화되고, 유동 세포 분석으로 확인된다. 1-주 간격으로 백혈병에 대하여 동물을 평가한다. 상기 TFP+ T 세포 그룹에 대한 생존 곡선은 로그-등급(log-rank) 테스트를 사용하여 비교된다.
투여량 의존적 TFP 처리 반응이 평가될 수 있다(가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참고). 예를 들면, 21 일 차에 TFP T 세포, 동등한 수의 모의-형질도입된 T 세포를 주사한 마우스, 또는 T 세포를 주사하지 않은 마우스에서 백혈병이 확립 된 후, 35-70 일 차에 말초 혈액을 수득한다. 각 그룹의 마우스는 말초 혈액 CD19+ ALL 모세포를 계수하기 위해, 무작위 채혈한 다음, 35 일과 49 일 시점에 죽였다. 나머지 동물은 57 일과 70 일 차에 평가된다.
세포 증식 및 사이토킨 생산에 대한 평가는 이미 기술된 바 있는데, 가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)에서 기술되고 있다. 간단히 말해서, TFP-중재된 증식의 평가는 미량적정 플레이트 상에서 세척된 T 세포에 CD19 (K19) 또는 CD32 및 CD137 (KT32-BBL)을 발현하는 K562 세포와 혼합하는데, 이때 T 세포: K562의 최종 비율은 2:1이 되도록 혼합된다. K562 세포들은 사용하기 전, 감마-방사선으로 조사된다(irradiated). 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 9.3) 단일클론성 항체들은 T 세포 증식을 자극하기 위한 양성 대조군으로 작용하는 KT32-BBL 세포들와 배양하기 위하여 추가되는데, 그 이유는 이들 신호가 생체외에서 장기(long-term) CD8+ T 세포 확장을 뒷받침하기 때문이다. 제조업체에서 설명한대로, T 세포는 CountBright™ 형광 비드 (Invitrogen) 및 유동 세포 분석을 사용하여 배양물에서 계수된다. TFP+ T 세포들은 eGFP-2A 연계된 TFP-발현시키는 렌티바이러스성 벡터들과 함께 공작된 T 세포를 이용한 GFP 발현에 의해 식별된다. GFP를 발현시키지 않는 TFP+ T 세포들의 경우, TFP+ T 세포들은 바이오티닐화된 재조합 CD19 단백질 및 2 차 아비딘-PE 콘쥬게이트로 탐지된다. T 세포들 상에서 CD4+ 및 CD8+ 발현은 특이적 단일클론성 항체들 (BD Biosciences)을 이용하여 또한 동시에 탐지된다. 제조업체의 지침에 따라, 인간 TH1/TH2 사이토킨 혈구계산(cytometric) 어레이 키트 (BD Biosciences)를 사용하여, 재-자극 후 24 시간 동안 수집된 상청액에서 사이토킨을 측정한다. 형광은 FACScalibur™ 유동 세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 평가되고, 데이터는 제조업체의 지침에 따라 분석된다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정에 의해 평가될 수 있다 (가령, Milone 외., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참고). 표적 세포들 (K562 계통 및 일차(primary) 프로-B- ALL 세포들)은 51Cr (NaCrO4으로써, New England Nuclear)와 함께, 37℃에서 2 시간 동안 로딩되는데, 이때 빈번한 교반이 가해지며, 완전 RPMI에서 2회 세척한 후, 미량적정 플레이트 상에 도말된다. 작동체 T 세포들은 작동체 세포:표적 세포(E:T)의 비율을 다양하게 하면서, 완전 RMPI가 있는 웰에서 표적 세포들과 혼합된다. 오로지 배지만을 함유하거나 (자발적 방출, SR) 또는 Triton-X 100 세제의 1% 용액 (전체 방출, TR)을 함유하는 추가 웰들 또한 준비된다. 37℃에서 4 시간 동안 배양한 후, 각 웰로부터 상층액을 수거한다. 그 다음, 방출된 51Cr은 감마 입자 계수기 (Packard Instrument Co., Waltham, Mass.)를 이용하여 측정된다. 각 조건은 적어도 세 번 수행되며, 용해 비율은 공식을 사용하여 산출된다: 용해%=(ER-SR)/(TR-SR), 여기에서 ER은 각 실험 조건에서 평균 방출된 51Cr를 나타낸다.
이미징 기술은 종양이 있는 동물 모델에서 TFPs의 특정 트래피킹(trafficking) 및 증식의 평가에 사용할 수 있다. 이러한 검증은 가령, Barrett 외., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)에서 기술된다. NOD/SQD/γc-/- (NSG) 마우스에게 IV로 Nalm-6 세포들 (ATCC® CRL-3273™)을 주사하고 7 일 후, 상기 TFP 구조체들로 전기천공 후 4시간 시점에, T 세포들을 주사한다. 상기 T 세포들은 반딧불이 루시페라제를 발현하기 위해 렌티바이러스 구조체로 안정적으로 형질감염되고, 생물발광에 대하여 생쥐의 영상을 찍는다. 대안으로, Nalm-6 이종이식 모델에서 TFP+ T 세포의 단일 주사에 대한 치료 효능 및 특이성은 다음과 같이 측정할 수 있다: NSG 마우스에게서 반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현시키기 위해 형질도입된 Nalm-6을 주사하고, 7 일 후 CD19 TFP로 전기천공된 T 세포를 일회 꼬리 정맥 주사한다. 주사 후 다양한 시점에서 동물을 촬영한다. 예를 들면, 5 일 (치료 전 2 일) 및 8 일 (TPP+ PBL 후 24 시간)에 대표적인 마우스에서 반딧불이 루시퍼라제 양성 백혈병의 광자-밀도 열 지도(heat maps)를 만들 수 있다.
본원의 실시예 섹션에서 기술된 것들, 뿐만 아니라 당분야에 공지된 것들을 비롯한 기타 검정을 또한 이용하여 본원에서 기술한 항-CD19, 항-BCMA,, 항-CD22, 항-ROR1, 항-PD-1, 또는 항-BAFF TFP 구조체들을 평가할 수 있다.
약제학적 조성물
일부 구체예들에서, (a) 본원의 변형된 T 세포들; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물들이 본원에서 개시된다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 및 이와 유사한 것들과 같은 완충액; 포도당, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신과 같은 폴리펩티드 또는 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 어쥬번트 (가령, 수산화 알루미늄); 그리고 보존제를 포함할 수 있다. 본 명세서의 조성물은 하나의 측면에서, 정맥내 투여용으로 제형화된다.
본 명세서의 약제학적 조성물은 치료 (또는 예방)할 질병에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량과 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 따라 결정되지만, 적절한 용량(dosages)은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 약제학적 조성물에는 오염물질, 가령, 엔도톡신, 미코플라스마, 복제 컴피턴트(competent) 렌티바이러스 (RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 항-CD3/항-CD28 피복된 잔류 비드, 마우스 항체들, 푸울된(pooled) 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분들, 벡터 패치지 세포 또는 플라스미드 성분들, 박테리아 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 오염물질이 실질적으로 없거나, 또는 가령, 탐지불가능한 수준으로 존재한다. 한 구체예에서, 상기 박테리아는 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 대장균(Escherichia coli), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닝지티드스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 그리고 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 그룹 A로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 박테리아다.
"면역학적으로 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료요법적 양"이 표시될 경우, 투여될 본 명세서의 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도 그리고 상태에 따른 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 기술된 T 세포들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중 kg당 104 내지 109 세포, 일부 경우에서 체중 kg 당 105 내지 106 세포의 용량으로 투여될 수 있다고 일반적으로 말할 수 있고, 이때 이들 범위 안의 모든 정수 범위도 포함된다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 사용하여 이들 세포를 투여할 수 있다(가령, Rosenberg 외., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참고).
특정 측면들에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 다음, 후속적으로 혈액을 다시 채취하고 (또는 성분채집술을 수행하고), 본 개시 내용에 따라 이로부터 T 세포를 활성화시키고, 이러한 활성화된, 그리고 확장된 T 세포를 환자에게 재-주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 프로세스는 몇 주마다 여러 번 수행될 수 있다. 특정 측면들에서, T 세포는 10cc에서 400cc의 채혈로 활성화될 수 있다. 특정 측면들에서, T 세포들은 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 또는 100cc의 채혈로 활성화된다.
당해 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 복용(ingestion), 투입(transfusion), 착상(implantation) 또는 이식(transplantation)을 비롯한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에서 기술된 조성물은 환자에게 동맥을 경유하여(transarterially), 피하(subcutaneously), 피내(intradermal), 종양내, 마디내(intranodally), 골수내, 근육내, 정맥내 (i.v.) 또는 복강내로 투여될 수 있다. 하나의 측면에서, 본 명세서의 T 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 하나의 측면에서, 본 명세서의 T 세포 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. 상기 T 세포 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위에 바로 주사될 수 있다.
특정 예시적인 측면에서, 대상체들은 백혈구성분채집술(leukapheresis)을 겪을 수 있고, 이때 관심 대상의 세포들, 가령, T 세포들을 선별 및/또는 단리시키기 위하여, 백혈구를 수집하고, 농축시키고, 또는 생체외 감손된다(depleted). 이들 T 세포 단리물(isolates)은 당업계에 공지된 방법에 의해 확장될 수 있고, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 TFP 구조체가 도입될 수 있도록 처리되어, 이로 인하여 본 명세서의 변형된 T-T 세포가 탄생할 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 후속적으로 고용량 화학 요법에 이어, 말초 혈액 줄기 세포 이식에 의한 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 측면들에서, 이식 후 또는 이식과 동시에, 대상체는 본 명세서의 확장 변형된 T 세포를 주입받게 된다. 추가 측면에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
환자에게 투여되는 상기 치료의 용량은 치료될 병태의 정확한 성질 및 치료를 받는 대상자에 따라 달라질 수 있다. 인간 투여를 위한 용량 조정(scaling)은 당업계에서 인정하는 관행에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 알렘투주맙의 투여량은 일반적으로 성인 환자의 경우 일반적으로 1 일 내지 30 일 동안 매일 1 내지 약 100mg 범위로 투여된다. 일부 경우, 하루 최대 40mg까지 더 많은 용량을 사용할 수 있지만, 바람직한 일일 투여량은 하루에 1 ~ 10mg이다 (U.S. 특허 번호 6,120,766에서 기술됨).
한 구체예에서, 상기 TFP는 가령, 시험관내 전사를 이용하여 T 세포 내로 도입되며, 그리고 대상체 (가령, 인간)는 본 명세서의 TFP T 세포들을 최초 투여받고, 그리고 후속적으로 본 명세서의 TFP T 세포의 한번 또는 그 이상의 투여를 제공받으며, 이때 이러한 한번 하나 또는 그 이상의 후속 투여는 앞서 받은 투여 후 15 일 이내, 가령, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 또는 2 일 이내에 투여된다. 한 구체예에서, 본 명세서의 TFP T 세포들의 한 번 이상의 투여는 주당 당해 대상체에게 (가령, 인간)투여되는데, 가령, 본 명세서의 TFP T 세포들은 주당 2회, 3회, 또는 4회 투여된다. 한 구체예에서, 상기 대상체 (가령, 인간 대상체)는 주당 한 번 이상의 TFP T 세포들을 투여받고(가령, 주당 2회, 3회, 또는 4회 투여) (이를 또한 본원에서는 주기(cycle)로 칭함 이어서 TFP T 세포 투여가 없이 한 주를 보내고, 그리고 상기 TFP T 세포들의 한번 또는 그 이상의 추가 투여 (가령, 상기 TFP T 세포들을 주당 한 번 이상)를 당해 대상체에게 제공한다. 또다른 구체예에서, 상기 대상체 (가령, 인간 대상체)는 일회 이상의 주기로 TFP T 세포들을 제공받고, 이때 각 주기 사이의 기간은 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 또는 3 일 미만이다. 한 구체예에서, 상기 TFP T 세포들은 주당 3회 투여를 위하여 격일로 투여된다. 한 구체예에서, 본 명세서의 TFP T 세포들은 적어도 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주 또는 그 이상 주 동안 투여된다.
하나의 측면에서, CD19 TFP T 세포들은 렌티바이러스성 바이러스성 벡터들, 이를 테면 렌티바이러스를 이용하여 생성된다. 생성된 TFP-T 세포들은 안정적인 TFP 발현을 가질 것이다.
하나의 측면에서, TFP T 세포들은 형질도입 후, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15 일 동안 일과적으로 TFP 벡터를 발현시킨다. TFPs의 일과성 발현은 RNA TFP 벡터 운반에 영향을 받을 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 TFP RNA는 상기 T 세포로 전기천공에 의해 형질도입된다.
TFP를 일과적으로 발현시키는 T 세포 (특히 TFP T 세포를 품고 있는 뮤린 scFv을 이용)를 사용하여 치료중인 환자에서 발생할 수 있는 잠재적인 문제는 다중 치료 후 과민증이다.
이 이론에 얽매이지 않고, 그러한 과민 반응은 체액성 항-TFP 반응, 즉 항-IgE 아이소타입을 갖는 항-TFP 항체를 발달시키는 환자에 의해 야기될 수 있다고 본다. 환자의 항체 생산 세포는 항원 노출이 10 일에서 14 일 사이에있을 때 IgG 아이소타입 (과민증를 유발하지 않음)에서 IgE 아이소타입으로 클래스 전환을 겪는 것으로 보인다.
환자가 일과적인 TFP 요법 (가령, RNA 형질 도입에 의해 생성된 것) 동안, 항-TFP 항체 반응을 생성할 위험이 높은 경우, TFP T 세포 주입 휴지기는 10 ~ 14 일 이상 지속되지 않아야 한다.
변형된 T 세포들을 만드는 방법
일부 구체예들에서, 본 명세서의 변형된 T 세포를 만드는 방법들이 본원에서 개시되는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄 또는 이의 임의의 조합을 인코드하는 내인성 TCR 유전자를 파괴하고; 이로 인하여 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포가 만들어지고; 그리고 (b) 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포로 본원의 재조합 핵산, 또는 본원에서 개시된 벡터를 형질도입시킨다. 일부 경우에서, 파괴는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제 단백질 또는 뉴클레아제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 상기 T 세포를 형질도입시키는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 변형된 T 세포를 만드는 방법들이 본원에서 더 개시되는데, 상기 방법은 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포로 본원에서 개시된 재조합 핵산, 또는 본원에서 개시된 벡터를 형질도입시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포이다.
일부 경우에서, 상기 T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 경우에서, 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포는 변형안된 대조군 T 세포의 것과 비교하여, MHC-펩티드 복합체에 대한 결합이 감소된다.
일부 경우에서, 상기 뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 뉴클레아제, CRISPR/Cas 니카제, 또는 megaTAL 뉴클레아제이다. 일부 경우에서, 상기 재조합 핵산 또는 상기 벡터에 포함된 서열은 내인성 TCR 소단위 유전자의 절단 부위로 삽입되고, 그리고 이때 이 내인성 TCR 소단위 유전자로 이러한 서열의 삽입으로 인하여 당해 내인성 TCR 소단위는 기능적으로 파괴된다. 일부 경우에서, 상기 뉴클레아제는 메가뉴클레아제이다. 일부 경우에서, 상기 메가뉴클레아제는 제 1 소단위와 제 2 소단위를 포함하는데, 이때 상기 제 1 소단위는 인지 서열의 제 1 인지 절반-부위에 결합하고, 그리고 상기 제 2 소단위는 당해 인지 서열의 제 2 인지 절반-부위에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 메가뉴클레아제는 링커를 포함하는 단일-쇄 메가뉴클레아제이며, 이때 상기 링커는 상기 제 1 소단위와 제 2 소단위를 공유적으로 연결한다.
유전자 편집 기술
일부 구체예들에서, 본원에서 개시되는 변형된 T 세포들은 유전자 편집 기술, 이를 테면, 클러스트화된 규칙적으로 공간을 둔(clustered regularly interspaced) 짧은 팔린드롬 반복부(CRISPR®, 가령, US 특허 번호 8,697,359 참고), 전사 활성화제-유사 작동체 (TALE) 뉴클레아제 (TALENs, 가령, U.S. 특허 번호 No. 9,393,257 참고), 메가뉴클레아제 (12 내지 40개 염기쌍의 이중-가닥으로된 DNA 서열을 포함하는 큰 인지부위를 갖는 엔도데옥시리보뉴클레아제), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN, 가령, Urnov 외., Nat. Rev. Genetics (2010) v11, 636-646 참고), 또는 megaTAL 뉴클레아제 (메가뉴클레아제 TAL 반복부에 메가 뉴클레아제가 융합된 단백질) 방법을 이용하여 공작된다. 이러한 방식으로, 키메라 구조체는 배좌(conformation) 또는 신호 전달 능력과 같은 각 소단위의 바람직한 특성이 복합되도록 설계될 수 있다. Sander & Joung, Nat. Biotech. (2014) v32, 347-55; 그리고 June 외., 2009 Nature Reviews Immunol. 9.10: 704-716를 또한 참고, 이들 각각은 본원의 참고자료에 편입됨. 일부 구체예들에서, TFP 소단위의 하나 또는 그 이상의 세포외 도메인, 막경유 도메인, 또는 세포질 도메인은 천연 TCR 소단위 도메인의 하나 이상의 측면을 갖도록 공작된다 (가령, 키메라로).
인간 게놈을 영구적으로 변경시키고, 질병 관련 유전자에 부위-특이적 게놈 변형을 도입시키는 기술의 최근 발달은 치료 응용의 토대가 된다. 이러한 기술은 이제 흔히 "게놈 편집"으로 알려져 있다.
일부 구체예들에서, 내인성 TCR 유전자를 파괴하는데 유전자 편집 기술이 사용된다. 일부 구체예들에서, 언급된 내인성 TCR 유전자는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 유전자 편집 기술은 내인성 TCR 유전자에서 여러 게놈 유전자좌를 동시에 파괴할 수 있는 다중 게놈 편집을 위한 길을 열어준다. 일부 구체예들에서, 다중 게놈 편집 기술은 내인성 TCR 및/또는 인간 백혈구 항원 (HLA) 및/또는 예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD1) 및/또는 기타 유전자의 발현이 부족한 유전자-파괴된 T 세포를 생성하는데 적용된다.
현행 유전자 편집 기술은 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL 작동체 뉴클레아제 (TALEN), 그리고 클러스트화된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 팔린드롬 반복부 (CRISPR)/CRISPR-연합된 (Cas) 시스템을 포함한다. 이들 네 가지 주요 유전자 편집 기술은 사용자-정의 DNA 서열 결합, 이중-가닥 DNA 파손(break) (DSB)을 중재함에 있어서 공통 작용 모드를 공유한다. 그 다음, DSB는 비-상동성 단부 연결 (NHEJ) 또는 (공여자 DNA가 존재할 때) 상동성 재조합 (HR)-공여자 DNA 단편으로부터 상동성 서열을 도입시키는 사건-에 의해 복구될 수 있다. 추가적으로, 니카제 뉴클레아제는 단일-가닥 DNA 파손 (SSB)을 만든다. DSBs는 단일 가닥 DNA 편입 (ssDI) 또는 단일 가닥 주형 복구 (ssTR), 공여자 DNA로부터 상동성 서열을 도입시키는 사건-에 의해 복구될 수 있다.
게놈 DNA의 유전적 변형은 관심대상의 좌(locus)의 DNA 서열을 인지하도록 공작된 부위-특이적, 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다. 공작된, 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 만드는 방법들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFNs)는 게놈에 있는 사전-결정된 부위들을 인지하고, 이를 절단하도록 공작될 수 있다. ZFNs는 Fok1 제한효소에 융합된 아연 핑거 DNA-결합도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 상기 아연 핑거 도메인은 합리적 또는 실험적 수단을 통해 재-설계되어, 사전-결정된 DNA 서열-18개 염기쌍에 결합하는 단백질을 생산할 수 있다. Fok1 뉴클레아제에 이렇게 공작된 단백질 도메인이 융합됨으로써, 게놈-수준 특이성을 갖는 DNA 파손(breaks)을 표적으로 하는 것이 가능하다. ZFNs는 광범위한 진핵 유기체에서 유전자의 추가, 제거 및 치환을 표적으로 하는데 상당히 이용되어 왔었다(Durai 외. (2005), Nucleic Acids Res 33, 5978에서 검토됨). 유사하게, 게놈 DNA에서 특정 부위를 절단하기 위해, TAL-작동체 뉴클레아제 (TALENs)가 만들어질 수 있다. ZFN과 같이, TALEN은 Fok1 뉴클레아제 도메인에 융합된 공작된, 부위특이적 DNA-결합 도메인을 포함한다 (Mak 외. (2013), Curr Opin Struct Biol. 23:93-9에서 검토됨). 이 경우, 그러나, 상기 DNA 결합 도메인은 TAL-작동체 도메인의 텐덤(tandem) 어레이를 포함하는데, 이들 각각은 단일 DNA 염기쌍을 특이적으로 인지한다. 콤팩트 TALENs는 이량체화 요구를 회피하기 위한 대체 엔도뉴클레아제 구조를 갖는다 (Beurdeley 외. (2013), Nat Commun. 4: 1762). 콤팩트 TALEN은 I-TevI 귀소 엔도뉴클레아제로부터 기인된 뉴클레아제 도메인에 융합된 공작된, 부위-특이적 TAL-작동체 DNA-결합 도메인을 포함한다. Fok1과는 달리, I-TevI는 이중-가닥 DNA 파손을 만들기 위하여 이량체화를 요구하지 않고, 따라서 콤팩트 TALEN는 단량체로 기능한다.
CRISPR/Cas9 시스템 기반의 공작된 엔도뉴클레아제는 당분야에 또한 공지되어 있다 (Ran 외. (2013), Nat Protoc. 8:2281-2308; Mali 외. (2013), Nat Methods 10:957-63). CRISPR 유전자-편집 기술은 엔도뉴클레아제 단백질로 구성되는데, 이의 DNA-표적화 특이성 및 절단 활성은 짧은 가이드 RNA 또는 듀플렉스(duplex) crRNA/TracrRNA에 의해 프로그래밍될 수 있다. CRISPR 엔도뉴클레아제는 두 성분을 포함한다: (1) 카스파제 작동체 뉴클레아제, 전형적으로 미생물 Cas9; 그리고 (2) 상기 뉴클레아제를 게놈의 관심 부위로 지향시키는 18 내지 20개의 뉴클레오티드 표적화 서열을 포함하는 짧은 "가이드 RNA" 또는 RNA 듀플렉스. 동일한 세포에서 다중 가이드 RNAs를 발현시키는데, 이들 각각은 상이한 표적화 서열을 갖고 있음으로써, 게놈에서 다중 부위로 DNA 파손을 동시에 표적화시키는 것이 가능하다(복합(multiplex) 게놈 편집).
당분야에는 두 가지 클래스의 CRISPR 가 공지되어 있는데(Adli (2018) Nat. Commun.multiplex 9:1911), 이들 각각은 다중 CRISPR 타입을 함유한다. 클래스 1은 타입 I과 타입 III CRISPR 시스템을 함유하는데, 이들은 고세균류(Archaea)에서 흔히 찾을 수 있다. 그리고, 클래스 II는 타입 II, IV, V, 그리고 VI CRISPR 시스템을 함유한다. 비록 가장 광범위하게 이용되는 CRISPR/Cas 시스템은 타입 II CRISPR-Cas9 시스템이지만, CRISPR/Cas 시스템은 게놈 편집을 위하여 연구자들에 의해 용도변경되었다. 10가지 이상의 상이한 CRISPR/Cas 단백질들이 최근 수년 동안 리모델링되었다 (Adli (2018) Nat. Commun. 9:1911). 그중에서, 이를 테면, 악시도 아미노코커스( Acid- aminococcus) 종 (AsCpf1) 및 란치노스피라세 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) (LbCpf1)으로부터 유래된 Cas12a (Cpf1) 단백질들이 특히 주목된다.
귀소 엔도뉴클레아제는 자연-발생적 뉴클레아제 군으로써 식물 및 곰팡이의 게놈에서 흔히 발견되는 15-40개 염기-쌍 절단 부위를 인지한다. 이들은 기생충 DNA 요소들, 이를 테면 그룹 1 자가-스플라이싱(self-splicing) 인트론 및 인테인(inteins)과 빈번하게 연합된다. 그들은 세포 DNA 복구 기전을 동원하는 염색체에서 이중-가닥 파손을 생성함으로써, 숙주 게놈의 특정 위치에서 상동성 재조합 또는 유전자 삽입을 자연스럽게 촉진시킨된다 (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38: 49- 95). 특이적 아미노산 치환은 귀소 뉴클레아제의 DNA 절단 특이성을 재-프로그램할 수 있다(Niyonzima (2017), Protein Eng Des Sei. 30(7): 503-522). 메가뉴클레아제 (MN)는 박테리아성 귀소 엔도뉴클레아제로부터 유래되고, 독특한 표적 부위를 위하여 공작된, 선천적 뉴클레아제활서을 갖는 단량체 단백질이다(Gersbach (2016), Molecular Therapy. 24: 430-446). 일부 구체예들에서, 메가뉴클레아제는 공작된 I-CreI 귀소 엔도뉴클레아제다. 다른 구체예들에서, 메가뉴클레아제는 공작된 I-SceI 귀소 엔도뉴클레아제다.
언급된 4가지 주요 유전자 편집 기술에 추가하여, 메가뉴클레아제, ZFNs, 그리고 TALENs의 융합을 포함하는 키메라 단백질들은 ZFNs 및 TALENs의 결합 친화력과 메가뉴클레아제의 절단 특이성의 장점을 취하는 새로운 단량체 효소를 만들기 위하여 공작되었다(Gersbach (2016), Molecular Therapy. 24: 430-446). 예를 들면, megaTAL는 단일 키메라 단백질로써, 메가뉴클레아제의 높은 절단 효능을 갖추고, TALENs으로부터 다루기 용이한(easy-to-tailor) DNA 결합 도메인의 조합이다.
유전자 편집 기술을 실행하기 위하여, 상기 뉴클레아제, 그리고 CRISPR/ Cas9 시스템의 경우, gRNA는 관심대상 세포로 효과적으로 전달되어야 한다. 전달 방법, 이를 테면 물리적 방법, 화학적 방법, 그리고 바이러스성 방법들이 당분야에 또한 공지되어 있다 (Mali (2013). Indian J. Hum. Genet. 19: 3-8.). 일부 경우에서, 물리적 전달 방법은 전기천공, 현미주사, 또는 탄도(ballistic) 입자의 사용을 포함하나, 이에 국한되지 않은 방법에서 선택될 수 있다. 다른 한편, 화학적 전달 방법은 복합체 분자들, 이를 테면 인산칼슘, 지질, 또는 단백질의 사용을 필요로 한다. 일부 구체예들에서, 바이러스성 전달 방법은 바이러스들, 이를 테면 아데노바이러스, 렌티바이러스, 그리고 레트로바이러스를 포함하나, 이에 국한되지 않는 바이러스를 사용한 유전자 편집 기술에 적용된다.
치료 방법
일부 구체예들에서, 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법들 본원에서 개시되며, 상기 방법은 당해 대상체에게 본원에서 개시된 약제학적 조성물들의 치료요법적으로 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법들을 본원에서 더 개시하는데, 상기 방법은 당해 대상체에게 (a) 본원에서 개시된 방법에 따라 만들어진 변형된 T 세포; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 변형된 T 세포는 동종이계 T 세포다. 일부 경우에서, 변형안된 대조군 T 세포의 효과량을 투여받은 대상체와 비교하였을 때, 당해 대상체에서 사이토킨이 덜 방출된다. 일부 경우에서, 본원에서 기술된 재조합 핵산, 또는 본원에서 기술된 벡터를 포함하는 변형된 T 세포의 효과량을 투여받은 대상체와 비교하였을 때, 당해 대상체에서 사이토킨이 덜 방출된다.
일부 경우에서, 상기 방법은 상기 약제학적 조성물의 효과를 증가시키는 제제와 조합하여, 당해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 방법은 상기 약제학적 조성물와 연합된 하나 또는 그 이상의 부작용을 경감시키는 제제와 조합하여, 당해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 암은 고형 암, 림프종 또는 백혈병이다. 일부 경우에서, 상기 암은 신장 세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 콩팥 및 위암으로 구성된 군에서 선택된다.
본 명세서는 세포 요법 유형을 포함하는데, 여기에서 T 세포들은 TFP 및 TCR 알파 및/또는 베타 불변 도메인을 발현시키도록 유전적으로 변형되며, 이런 변형된 T 세포는 이를 필요로 하는 수령자에게 주입된다. 이렇게 주입된 세포는 수령자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, 변형된 T 세포들은 생체내에서 복제가능하여 장기적으로 지속되며, 이로써 지속적인 종양 관리가 유도될 수 있다. 다양한 측면들에서, 당해 환자에게 투여된 상기 T 세포들 또는 이들의 자손들은 당해 환자에게 이 세포를 투여한 후, 이 환자에서 적어도 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월, 14 개월, 15 개월, 16 개월, 17 개월, 18 개월, 19 개월, 20 개월, 21 개월, 22 개월, 23 개월, 2 년, 3 년, 4 년, 또는 5 년 동안 지속된다.
본 명세서는 세포 요법 유형을 또한 포함하는데, 여기에서 T 세포들은 TFP 및 TCR 알파 및/또는 베타 불변 도메인을 일과적으로 발현시키도록, 가령, 시험관내 전사된 RNA에 의해 변형되며, 이런 변형된 T 세포는 이를 필요로 하는 수령자에게 주입된다. 이렇게 주입된 세포는 수령자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면들에서, 상기 환자에게 투여된 T 세포들은 이 환자에게 상기 T 세포를 투여한 후, 1 개월 미만, 가령, 3 주, 2 주, 또는 1 주 동안 존재한다.
임의의 특정 이론에 결부되지 않고, 상기 변형된 T 세포들에 의해 유도된 항-종양 면역 반응은 활성 또는 수동적(passive) 면역 반응일 수 있으며, 또는 대안으로 직접 대(vs) 간접 면역 반응일 수 있다.
하나의 측면에서, 본 명세서의 인간 변형된 T 세포들은 포유류에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신 타입일 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 포유류는 인간이다.
생체외 면역화에 있어서, 포유류에게 상기 세포를 투여하기 전, 다음중 적어도 하나가 발생된다: i) 상기 세포들의 확장, ii) TFP 및 TCR 알파 및/또는 베타 불변 도메인을 인코딩하는 핵산을 상기 세포들에게 도입, 또는 iii) 상기 세포들의 저온보존.
생체외 과정은 당분야에 잘 공지되어 있고, 하기에서 더 상술된다. 간략하게 설명하자면, 세포들을 포유류 (가령, 인간)로부터 단리시키고, 본원에서 기술한 벡터로 유전적으로 변형된다 (가령, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염됨). 상기 변형된 T 세포를 포유류 수령자에게 투여하여 치료요법적 이익을 제공할 수 있다. 상기 포유류 수령자는 인간일 수 있고, 상기 변형된 세포는 당해 수령자의 자가조직일 수 있다. 대안으로, 상기 세포들은 당해 수령자에 대하여 동종이계, 유전적동계(syngeneic) 또는 이종발생적일 수 있다.
조혈 줄기 및 선조 세포들의 생체외 확장 과정은 U.S. 특허 번호 5,199,942에서 기술되며(본원의 참고자료에 편입됨), 본 명세서의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법들이 당분야에 공지되어 있고, 따라서, 본 명세서는 상기 세포외 생체외 확장을 위한 임의의 특정 방법에 국한되지 않는다. 간략하게 설명하자면, T 세포의 생체외 배양 및 확장은 다음을 포함한다: (1) 포유류의 말초 혈액 수거물 또는 골수 절편(explants)으로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 이의 선조 세포들을 수거하고; 그리고 (2) 이러한 세포들을 생체외에서 확장시킨다. U.S. 특허 번호 5,199,942에서 기술된 세포 성장 인자에 추가로, 다른 인자들, 이를 테면 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드를 이들 세포의 배양 및 확장에 이용할 수 있다.
생체외 면역화에 있어서 세포-기반 백신을 이용하는 것에 추가로, 본 명세서는 환자에서 항원에 대항하여 지향된 면역 반응을 유도하기 위한 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 또한 제공한다.
일반적으로, 본원에서 기술된 바와 같이 활성화되고, 확장된 상기 세포들을 면역절출된 개체에서 발생되는 질환의 치료 및 예방에 이용할 수 있다.
본 명세서의 변형된 T 세포들은 단독으로 투여되거나, 또는 희석제와 조합하여, 및/또는 기타 성분들, 이를 테면 IL-2 또는 기타 사이토킨 또는 다른 세포 집단과 조합된 약제학적 조성물로 투여될 수 있다.
조합 요법(Combination Therapies)
본원에서 기술된 변형된 T 세포는 공지의 다른 제제 및 요법과 조합하여 이용될 수 있다. "조합"하여 투여된다라는 것은 본원에서 사용된 바와 같이, 두 가지(또는 그 이상의) 상이한 치료가 장애로 인한 고통을 받는 대상의 과정 동안 당해 대상체에게 전달되는데, 가령, 이 대상체가 장애로 진단받은 후, 그리고 이 장애게 완치되거나, 또는 제거되기 전, 또는 다른 이유로 인하여 치료가 중단되기 전, 두 가지 또는 그 이상의 치료는 당해 대상체에게 전달된다라는 의미다. 일부 구체예들에서, 하나의 치료 전달이 두 번째의 전달이 시작될 때 여전히 진행중이므로, 투여 측면에서 볼 때, 중첩된다. 이것은 때때로 본원에서 "동시(simultaneous)" 또는 "공존(concurrent) 전달"으로 지칭된다. 다른 구체예들에서, 한 가지 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 어느 경우이건 일부 구체예들에서, 이 치료는 조합 투여로 인하여 더 효과적이다. 예를 들면, 두 번째 치료가 더 효과적인데, 가령, 두 번째 치료를 덜 받으면 등가의 효과를 보이며, 또는 두 번째 치료는 첫 번째 치료가 없는 상태에서 두 번째 치료가 투여되거나, 또는 첫 번째 치료에서 유사한 상황이 보이는 경우보다 증상을 더 많이 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 전달은 증상의 감소 또는 장애와 관련된 기타 매개 변수가 다른 치료가 없는 상태에서 전달되는 한 치료로 관찰되는 것보다 더 크다. 두 치료의 효과는 부분적으로 가산적일 수 있거나, 완전히 가산적이거나, 또는 가산적인 경우 보다 클 수 있다. 전달은 전달된 첫 번째 치료의 효과가 두 번째가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 "적어도 하나의 추가 치료요법제"는 변형된 T 세포를 포함한다. 동일한 또는 상이한 표적 항원들, 또는 이러한 동일한 표적 항원 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하는 다중 TFPs를 발현시키는 T 세포를 또한 제공한다. T 세포들의 제 1 하위세트는 제 1 TFP 및 TCR 알파 및/또는 베타 불변 도메인을 발현시키고, T 세포들의 제 2 하위세트는 제 2 TFP 및 TCR 알파 및/또는 베타 불변 도메인을 발현시키는, T 세포 집단이 또한 제공된다.
본원에서 기술된 변형된 T 세포 및 적어도 하나의 추가 치료요법제는 동일한 조성물에서 동시 투여되거나, 또는 별도의 조성물로 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 본원에서 기술된 변형된 T 세포를 우선 투여하고, 추가 제제는 두 번째로 투여하거나, 또는 투여 순서는 뒤바뀔 수 있다.
추가 측면들에서, 본원에서 기술된 변형된 T 세포는 외과술, 화학요법, 방사능, 면역억제제(이를 테면 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506), 항체들, 또는 다른 면역절제제(immunoablative)(이를 테면 알렘투주맙), 항-CD3 항체들 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, 로미셉신, 사이토킨, 그리고 조사(irradiation), 펩티드 백신(이를 테면, Izumoto 외. 2008 JNeurosurg 108:963-971에서 기술된 것들)과 조합된 치료 섭생에 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 대상체에게 변형된 T 세포의 투여와 연합된 부작용을 감소 또는 개선시키는 물질이 투여될 수 있다. 변형된 T 세포의 투여와 연합된 부작용에는 사이토킨 방출 증후군 (CRS), 그리고 혈구식작용성 림프조직구증식(hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH)-일명 대식세포 활성화 증후군 (MAS)-이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. CRS 증상에는 고열, 메쓰꺼움, 일과성 저혈압, 저산소증, 그리고 이와 유사한 것들이 포함된다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 방법들은 본원에서 기술된 변형된 T 세포를 대상체에게 투여하고, 변형된 T 세포 치료로 인간 가용성 인자의 상승된 수준을 관리하는 물질을 추가 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 대상체에서 상승된 가용성 인자는 IFNγ, TNFα, IL-2 및 IL-6중 하나 또는 그 이상이다. 따라서, 이러한 부작용을 치료하기 위하여 투여되는 제제는 이들 가용성 인자 하나 또는 그 이상을 중화시키는 제제일 수 있다. 이러한 제제에는 스테로이드, TNFα의 억제제, 그리고 IL-6의 억제제를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. TNFα 억제제의 예는 에타너셉트(entanercept)이다. IL-6 억제제의 예는 토실리주밥(tocilizumab) (toe)이다.
한 구체예에서, 상기 대상체에게 변형된 T 세포의 활성을 강화시키는 물질이 투여될 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 상기 물질은 저해성 분자를 억제하는 물질일 수 있다. 일부 구체예들에서, 저해성 분자들, 가령, 예정된 사멸 1 (PD1)은 변형된 T 세포의 면역 작동체 반응을 탑재하는 능력을 감소시킬 수 있다. 저해성 분자들의 예로는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 가령, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 억제함으로써 저해성 분자의 억제로 변형된 T 세포 수행능을 최적화시킬 수 있다. 구체예들에서, 저해성 핵산, 가령, 저해성 핵산, 가령, dsRNA, 가령, siRNA 또는 shRNA를 이용하여, 상기 TFP-발현시키는 세포에서 저해성 분자 발현을 억제시킬 수 있다. 구체예에서, 상기억제제는 shRNA이다. 구체예에서, 상기 저해성 분자는 변형된 T 세포 안에서 억제된다. 이들 구체예에서, 상기 저해성 분자의 발현을 억제시키는 dsRNA 분자는 성분, 가령, 상기 TFP의 모든 성분을 인코드하는 핵산에 연계된다. 한 구체예에서, 저해성 신호의 억제제는 가령, 저해성 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4 (가령, 이필리무맙 (일명 MDX-010 및 MDX-101, 그리고 Yervoy®로 시판됨; Bristol-Myers Squibb; 프레멜리무맙 (Pfizer 사의 IgG2 단일클론성 항체, 기존 티실리무맙, CP-675,206으로 알려짐))에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 구체예에서, 상기 제제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 구체예에서, 상기 제제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
일부 구체예들에서, 변형된 T 세포의 활성을 강화시키는 물질은 가령, 제 1 도메인과 제 2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 이때 상기 제 1 도메인은 저해성 분자, 또는 이의 단편이며, 그리고 제 2 도메인은 양성 신호와 연합된 폴리펩티드, 가령, 본원에서 기술된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, 상기 양성 신호와 연합된 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS의 공동자극 도메인, 가령, CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 가령, 본원에서 기술된, 가령, CD3 제타의 일차(primary) 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 상기 TFP를 발현시켰던 동일한 세포에 의해 발현된다. 또다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 세포, 가령, 항-CD19 TFP를 발현시키지 못하는 T 세포에 의해 발현된다.
실시예
본 발명은 다음의 실험 실시예들을 참고하여 더 설명된다. 이들 실시예는 오로지 설명을 위한 것이며, 다른 언급이 없는 한, 본 발명의 범위를 제한시키는 것으로 간주되어서는 안된다. 따라서, 본 발명은 어떠한 경우에도 다음의 실시예들로 국한되는 것으로 간주되지 않아야 하며, 오히려 본 명세서에서 제공되는 교시의 결과로써 자명하게 되는 임의의 그리고 모든 변이를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다. 추가 설명없이도, 당업자는 전술한 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 이용하여 본 발명의 화합물들을 만들고 이용하며, 청구된 방법을 실시할 수 있을 것이다. 다음의 작업 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 특이적으로 지적하며, 어떠한 방식으로도 명세서의 나머지 내용을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1-5의 배경
T 세포 수용체들 (TCRs)은 작은 펩티드로 프로세싱되고, 항원 제시 세포들 (APCs)의 표면에서 주요 조직접합성 복합체 (MHC) 분자들에 결합되는 외래 항원을 인지한다. 상기 T 세포 수용체 (TCR) 복합체는 다음의 T 세포 수용체 알파 및 베타 소단위 (TCRα/β) 또는 감마 및 델타 소단위 (TCRγδ); 그리고 CD3 이량체 CD3γ/ε, CD3δ/ε, 그리고 CD3ζ/ζ을 포함하는 이량체 집단에 의해 형성된다. 상기 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 및 T 세포 수용체 베타 불변 (TRBC) 유전자는 차례로 TCRα 및 TCRβ의 불변 C-말단 영역을 인코드한다.
상기 TCR 불변 영역(들)의 파괴는 상기 세포 표면으로 TCRα 또는 TCRβ의 전좌(translocation)를 차단시키고, 따라서 상기 TCR 수용체 복합체의 어셈블리는 억제된다. TCRα 또는 TCRβ의 전좌 손상만으로도 충분히 전체 TCR 수용체의 어셈블리가 억제된다. 따라서, 상기 TCR 복합체의 비활성화는 클러스트화된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 팔린드롬 반복부 (CRISPR) 방법, 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제 (TALENs), 아연 핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 이용하는 유전자 편집 방법으로 TRAC 또는 TRBC 유전자를 표적화함으로써 실행될 수 있다. 그러나, CD3ε 또는 CD3γ 또는 CD3δ 융합 단백질들에 기반된 TFP T 세포들은 기능적 TCR 복합체로의 통합을 위하여 TCRα/β의 표면 발현을 필요로 한다.
수신 항원들 (가령, 항원 제시 세포들 상에 있는 주요 조직접합성 복합체 (MHC)에 의해 제시되는 항원들의 인지)에 의해 공여자 T 세포의 표면 상에 상기 TCR 복합체의 활성화로 원치않은 효과, 이를 테면, 이식편-대-숙주 질환 (GvHD)과 사이토킨 방출 증후군 (CRS)을 촉발시킬 수 있다. 따라서, 다음 실시예들은 TCRα 또는 TCRβ의 절두현 형태를 인코딩하는 TCR 녹-아웃(knock-out) 세포에게 이식 유전자, 그리고 자가-절단 신호에 의해 자체 분리된 융합 단백질 (가령, T2A)을 도입시키는 방법들을 기술한다. 한 구체예에서, TCRα 또는 TCRβ의 상기 절두된 형태에는 TCRα 또는 TCRβ의 막경유 도메인과 연결 펩티드 도메인(CP)가 내포된다. 또다른 구체예에서, 상기 TFP의 항원 결합 도메인은 절두된 또는 전장 TCRα 및/또는 TCRβ의 N-말단에 융합된다.
실시예 1. crRNA (CRISPR RNA) 디자인
TRA를 비활성화시키기 위한 crRNAs는 DeskGen™ CRISPR 라이브러이 웹사이트 (www.deskgen.com)에서 접근가능한 "Dunne 2017" 알고리즘으로 기획되었다. TRA 좌에 결합하는 임의의 crRNAs는 이 TRA 유전자에서 이중 가닥 파손을 효과적으로 만들 수 있다. CRISPR 엔도뉴클레아제의 표적-외(off-target) 활성을 최소화시키기 위하여, 이용된 crRNAs는 >90%의 표적-외 득점을 갖고, Genome Reference Consortium의 인간 게놈 빌트(build) 38 (GRCh38/hg38) 게놈에서 가장 근접한 상동성 서열과 적어도 3개의 불합치를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 하나의 불합치는 프로토스페이스(protospacer) 인접 모티프 (PAM)에 대해 8bp 상류에 위치한다. 표 1-2에서는 TRA 유전자를 비활성화시키기 위하여 선택된 예시적인 crRNA 서열 (표 1)과 예상되는 표적 활성 (표 2)을 보여준다.
Figure pct00001
Figure pct00002
TRB를 비활성화시키기 위한 crRNAs는 상기에서 기술된 바와 같이 Dunne 2017 알고리즘으로 기획되었다. TCRβ의 불변 영역은 두 개 유전자 TRBC1 및 TRBC2에 의해 인코드되기 때문에, crRNAs는 TRBC1 및 TRBC2 모두에서 동일한 서열을 지향한다. 결과적으로, DeskGen™ 에 의해 생성된 표적-외 득점은 94%보다 낮다. 그러나, TRBC1 및 TRBC2를 표적으로 하는 것 이외에, crRNAs와 GRCh38/hg38 게놈 간의 다른 상동성 서열은 적어도 3개의 불합치를 담고 있다. 바람직한 구체예에서, 이들 불합치중 하나는 프로토스페이스(protospacer) 인접 모티프 (PAM)에 대해 8bp 상류에 위치한다. 표 3-4에서는 TRB 유전자를 비활성화시키기 위하여 선택된 예시적인 crRNA 서열 (표 3)과 예상되는 표적 활성 (표 4)을 보여준다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 2: Jurkat 세포들에서 내인성 TCRα 또는 β의 편집
Jurkat 세포들에서 TRA 유전자 또는 TRB 유전자의 비활성화는 TRA 유전자 또는 TRB 유전자를 지향하는 SpCas9 리보뉴클레오단백질들 (RNPs)의 전기천공에 의해 실행되었다. 전기천공 전까지 세포들은 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 300mg/L L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지 mL 당 0.2x106 세포 수준으로 유지되었다. TRA 유전자 또는 TRB 유전자를 표적으로 하는 SpCas9 리보뉴클레오단백질들은 TRAC (TRAC2-4598) 또는 TRBC (TRBC-44345)을 표적으로 하는 crRNA를 tracrRNA에 1:1의 분자 비율로 어닐링함으로써 준비되었다. 어닐링된 듀플렉스는 1.5:1의 분자 비율로 SpCas9 단백질과 혼합되었다. 0.61 μM의 RNPs는 2.5x106 T 세포들과 혼합된 후, Neon Transfection System (ThermoFisher)의 제조업자 프로토콜에 따라 전기천공되었다. 전기천공은 1600V, 10ms, 3 펄스로 설정되었다. 펄스 후, 상기 세포들을 바로 따뜻한 배지로 이동시키고, 3일 동안 37℃에서 항온처리하였다.
편집 효능은 유동 세포분석에 의해 TCRαβ 및 CD3ε의 표면 발현 상실을 관찰함으로써 평가되었다. 도 2에서는 TRA 편집된 세포들 (좌측 패널) 및 TRB 편집된 세포들 (우측 패널)의 결과를 나타낸다. 편집된 Jurkat 세포들은 자기-활성화된 세포 분류법 (MACS, Miltenyi Biotec) 세포 분리 시스템을 통하여 정제되었다. 편집된 Jurkat 세포들은 항-TCRαβ IP27 (eBioscience #17-9986-42) 항체 및 항-CD3ε SK7 항체 (eBioscience #25-0036-42)에 대하여 음성적으로 선별되었다. TCRαβ 또는 CD3ε를 세포 표면에서 발현시키는 세포들은 MACS MS (Cat. #130-041-301) 또는 LS (Cat. #130-041-306) 컬럼에 고정시키고, 한편 TCRαβ 및 CD3ε 모두에 대하여 음석인 편집된 Jurkat 세포들은 컬럼을 통하여 흘려보냄으로써 수거되었고, 상기 명시된 배지에서 0.4x106 세포들/mL 수준으로 배양물에서 유지되었다.
실시예 3. 인간 T 세포들의 편집
그 다음, TRA 유전자 또는 TRB 유전자는 인간 공여자의 일차(primary) T 세포들에서 비활성화된다. 전기천공 전 2-4일 시점에, 10%의 인간 혈청(hAB, Valley Biomedical HP 1022) 및 300 U.ml-1 IL2 (Petrotech #200-02)가 보충된 CTS 최적화 배지 (Gibco # A1022101)에서 T 세포들은 CD3/CD28 (Gibco #11132D)에 특이적인 Dynabeads® 인간 T 세포 활성자 비드로 1:1 비율에서 활성화되었다. TRA 유전자 또는 TRB 유전자를 표적으로 하는 SpCas9 리보뉴클레오단백질들(RNPs)은 TRAC (TRAC2-4598) 또는 TRBC (TRBC-44345)을 표적으로 하는 crRNA를 tracrRNA에 1:1의 분자 비율로 어닐링함으로써 준비되었다. 어닐링된 듀플렉스는 1.5:1의 분자 비율로 SpCas9 단백질과 혼합되었다. 0.61 μM의 RNPs는 2.5x106 T 세포들과 혼합된 후, Neon Transfection System의 제조업자 프로토콜에 따라 전기천공되었고, 이때 전기천공은 1600V, 10ms, 3 펄스로 설정되었다. 세포들은 10% hAB (Valley Biomedical #HP1022), 300 u.ml-1 IL2(Petrotech #200-02), 25 ng.mL-1 IL7 (R & D System # 207-IL-010)이 보충된 따뜻한 배지(CTS Optimizer (Gibco #A1048501)로 즉시 이동되고, 편집된 T 세포들의 확장을 허용하기 위하여 37℃에서 항온처리되었으며, 적절한 배가(doubling time)은 3 내지 5 일이다. 편집 효능은 유동 세포분석에 의해 TCRαβ 및 CD3ε의 표면 발현 상실을 측정함으로써 평가되었다. 편집된 T 세포들은 제조업자에 따라 자기-활성화된 세포 분류법 (MACS®, Miltenyi Biotec) 세포 분리 시스템을 이용하여 정제되었으며, 항-CRαβ IP27 항체 (eBioscience #14-9986-82) 및 항-CD3ε SK7 항체들 (eBioscience #16- 0036-81)에 대하여 음성적으로 선별되었다. TCRαβ 또는 CD3ε를 세포 표면에서 발현시키는 세포들은 MACS MS (Cat. #130-041-301) 또는 LS (Cat#130-041-306) 컬럼에 고정시키고, 한편 TCRαβ 및 CD3ε 모두에 대하여 음석인 편집된 T 세포들은 컬럼을 통하여 흘려보냄으로써 수거되었고, 상기 명시된 배지에서 106 세포들/mL 수준으로 배양물에서 유지되었다. 결과는 도 3에 나타낸다.
실시예 4: TCR 음성 T 세포들의 동종이계성
혼합된 림프구 반응 (MLR) 검정을 이용하여 TCRαβ 녹-아웃 (KO) 세포들의 동종이계성을 평가하였다. 카르복시플루로에신 숙시니미딜 에스테르 (CSFE) 라벨링 염료는 TCRα 및 TCRβ KO T 세포에 통합되었고, 후속적으로 이들 세포는 합치된 (자가 반응) 또는 불합치된(allo 반응 HLA 공여자 (차례로 공여자 1 및 공여자 2)로부터 증식-억제된(arrested) PBMCs (Streck, Inc.)와 1:1 비율로 공동배양되었다. 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 5 ng/mL 및 이오노마이신 500 ng/mL는 독립적인 TCR 자극에 대한 양성 대조군으로 이용되었다. 플레이트 결합된 항-CD3ε는 상기 TCRα 및 TCRβ 녹-아웃(knock out) T 세포들에서 TCR 수용체의 결핍을 확인하기 위한 간접 대조군으로 또한 이용되었다. CSFE 고갈에 의해 공여자 T 세포의 증식을 모니터링하였고; 증식의 기저 수준은 자극없이 24-시간 배양한 후 측정된 수준이며, 5-일 항온처리 기간 후에 다시 상기 수준이 되었다. CFSE 염료는 세포 분열시 절반으로 희석하여, 세포에서 발생되었던 증식의 양을 평가하였고, 합치 및 불합치 HLA 공여자 대조군과 비교했다. 이들 결과는 도 4에 나타낸다.
TCRαβ 및 CD3ε의 표면 발현은 실시예 2에서 기술된 바와 같이, Jurkat T 세포들 (도 9A-C) 및 공여자 T 세포들(도 10A-B)에 대하여 분석되었다. 도 9A-C에서는 야생형 세포들 (도 9A), TRB KO 세포들(형질도입 없이) (도 9B), TCRβ 전장 (FL) TFPs로 형질도입된 TRB KO 세포들 (도 9C)에서 CD3 대비(vs) TCRαβ의 표현 발현을 나타낸다. 플롯 상의 게이트(gates)는 CD3 및 TCRαβ 음성-음성 세포 집단을 묘사하기 위하여 그려진 것이며, 각 사분면에 남아있는 세포의 백분율은 코너에 나타낸다.
도 10A-B에서는 절두된 인간 TRBC 유전자로 형질도입되거나 (도 10A), 뮤린 TRAC-T2A-TRBC 유전자로 형질도입된 (도 10B) TRB 녹아웃(knockout) 세포들에서 CD3 대비(vs) TCRαβ의 표현 발현을 나타낸다. 플롯 상의 게이트(gates)는 CD3 및 TCRαβ 음성-음성 세포 집단을 묘사하기 위하여 그려진 것이며, 각 사분면에 남아있는 세포의 백분율은 코너에 나타낸다.
실시예 5: TCR 음성 세포들에서 T 세포 수용체 융합 단백질 발현
TRA 또는 TRB의 비활성화는 모든 TCR 소단위의 세포 표면으로의 전좌를 차단시킨다. 결과적으로, 외인성 TRA 또는 TRB 이식유전자는 기능적 TFP T 세포를 얻기 위하여, TRA-/- 또는 TRB-/- 세포들에서 차례로 발현된다.
Jurkat 세포들의 형질도입
가령, 공동계류중인 U.S. 특허 공개 번호 2017-0166622에서 기술된 바와 같이, 렌티바이러스들을 이용하여, TFP 이식유전자들이 Jurkat 세포 안으로 도입되었다. Jurkat 세포들은 감염비(multiplicity of infection: MOI) 5에서 바이러스와 함께 항온처리되었다. 배양 24-시간-후, 배지를 교체하였다. 형질 도입 효능 및 TFP 발현은 관심있는 TFP 결합제에 특이적인 리간드 및/또는 TCRαβ 및 CD3ε의 표면 발현을 사용하여 유동 세포 분석으로 평가되었다.
T 세포들의 형질도입
가령, 공동계류중인 U.S. 특허 공개 번호 2017-0166622에서 기술된 바와 같이, 렌티바이러스들을 이용하여, TFP 이식유전자들이 T 세포 안으로 도입되었다. T 세포들은 5 μg/mL의 폴리브렌과 함께, 감염비(MOI) 5에서 바이러스와 함께, 600 g에서 100분 동안 원심분리되었다. 원심분리 24-시간-후, 배지를 교체하였다. 형질 도입 효능 및 TFP 발현은 관심있는 TFP 결합제에 특이적인 리간드 및/또는 TCRαβ 및 CD3ε의 표면 발현을 사용하여 유동 세포 분석으로 평가되었다.
인간 TCRα/β TFP의 발현
TCRα 음성 세포들은 여전히 TCRβ를 발현시키고, 상반되게, TCRα는 TCRβ 음성 세포들에서 발현되므로; 따라서, TCRα TFPs는 TRA-/- 세포들에서 발현되었으며, TCRβ TFPs는 TRB-/- 세포들에서 발현되었다. 전체 TCR 복합체의 전좌를 복원시키기 위한 최적의 구조체를 결정하기 위하여 TCR 음성 세포들에서 TCRα/β 및 TCRα/β TFPs의 다중 형태들이 테스트되었다 (도 5). TCRα/β 전장 (FL) TFPs는 임의의 가변성 엑손 (V)과 임의의 졍션 엑손(J)에 이어서, TCR 좌의 모든 불변 엑손을 어셈블리함으로써 생성되었다. 한 구체예에서, 다양성 엑손 D는 V와 J 사이에 위치할 수 있다. 아마도, 돌연변이 또는 인델(indel)은 재조합 활성화 유전자 (RAG) 효소의 활성을 모방하기 위해, 각 엑손의 접합부에 추가될 수 있다. TRAV 잔기들은 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템(IMGT, imgt.org)에 따라 계수된다.
TRA -/- 세포들에서 발현된 TCRα (FL) FMC63 TFP
Nt-FMC63-TRA(V13-1(1-256); J13; C)-Ct
Nt- FMC63-TRA(V8-1; J20; C)-Ct
Nt- FMC63-TRA(V29DV5 ; J44; C)-Ct
TRA -/- 세포들에서 발현된 절두된 TCRα TFP,
Nt-FMC63-TRA(V13-1(33-256); J13; C)-Ct
Nt-FMC63-TRA(V13-1(105-256); J13; C)-Ct
절두된 TCRα는 TRA-/- 세포들에서 발현되었고, TRAC 잔기들은 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템 (IMGT, www.imgt.org)에 따라 계수된다.
Nt-TRAC7-174-Ct
Nt-TRAC128-174-Ct
TRB -/- 세포들에서 발현된 TCRβ (FL) FMC63 TFP
Nt-FMC63-TRB(V9; J1-1; C1)-Ct
Nt- FMC63-TRB(V7-9; J1-5; C1)-Ct
Nt-FMC63-TRB(V5-1 ; J2-2; C1)-Ct
절두된 TCRβ 는 TRB-/- 세포들에서 발현되었고, TRBC 잔기들은 상기에서 명시된 바와 같이, 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템에 따라 계수된다.
Nt-FMC63-TRBC1(-8-)-173-Ct
Nt-FMC63-TRBC122-174-Ct
Nt-FMC63-TRBC127-174-Ct
절두된 인간 TCRα/β TFP의 발현
TCRα 및 TCRβ 모두의 불변 도메인의 과다발현은 전체 TCR 복합체의 상기 세포 표면으로의 전좌를 구동시키는데 충분할 수 있다. 이를 테스트하기 위하여, TRP 이식유전자는 2A 자가-절단 펩티드에 의해 분리된 TCRα와 TCRβ 불변 도메인을 인코드하도록 기획되었다. 한 구체예에서, 상기 TFP 결합체는 TRAC 및/또는 TRBC의 N 말단 단부에서 융합된다. 또다른 구체예에서, 상기 TFP는 CD3 분자에 융합되고, 독립적으로 TR[A/B]C 이식유전자를 발현시킨다.
절두된 뮤린 TCRα/β TFP의 발현
인간 TCR 불변 영역들은 이들의 뮤린 동족체(homologs)와 호환될 수 있다. 추가적으로, 마우스 TCR 불변 영역들은 인간 세포들에서 발현될 때, CD3ζTCR 복합체의 안정성을 증가시킨다. 결과적으로, TFP 이식유전자는 2A 자가-절단 펩티드에 의해 분리된 TCRα와 TCRβ 불변 도메인을 인코드하도록 기획되었다. 한 구체예에서, 상기 TFP 결합체는 mTRAC 및/또는 mTRBC의 N 말단 단부에서 융합된다. 또다른 구체예에서, 상기 TFP 결합체는 CD3 분자들에 의해 운반되고, 독립적으로 mTR[A/B]C 이식유전자를 발현시킨다.
mTR[A/B]C 이식유전자는 TRA-/- 또는 TRB-/-세포들에서 발현된다 Nt-FMC65-mTRAC114-169-T2A-mTRBC123-173-Ct
Nt-mTRAC114-169-T2A-mTRBC123-173-Ct
뮤린화된 인간 TCRα/β TFP의 발현
인간 TCRα 및 TCRβ의 불변 영역들 간의 친화력을 증가시키기 위하여, 인간 TCR 잔기들이 마우스 TCR로 대체된 일련의 서열이 공작되었다. TCRα의 불변 영역으로 잔기 P90S, E91D, S92V, S93P를 포함하는 치환들이 도입되었다. TCRβ의 불변 영역에 도입된 치환은 E11K, S15A, F129I, E132A, Q135H들이었다. 이들 치환으로 상기 세포 표면으로 전체 TCR 복합체의 전좌에 충분한 TRAC 및 TRBC를 만들었다. 따라서, 상기 TFP는 TRA-/- 또는 TRB-/- 세포들에서 이식유전자 Nt-FMC63-TRAC(-7-)174 P90S, E91D, S92V, S93P-T2A-TRBC1(-8-)-173 E11K, S15A, F129I, E132A, Q135H-Ct를 통하여 발현된다.
강화된 TCRα TFP의 발현
단백질 데이터 뱅크 (PDB)에는 이용가능한 몇 가지 구조의 인간 TCRαβ 복합체들이 있다. 이들 구조는 TCRα/TCRβ 상호작용에 관여하는 잔기 및 TCRα/TCRβ 상호작용에는 관여하지 않지만, TRBC에 가까이 있는 TRAC의 잔기를 강조한다. 그런 이유로, TRAC에서 다음 치환중 하나 또는 그 이상에 의해 TCRβ에 대한 TCRα의 친화력을 강화시킬 수 있다: V22W, F85.5E, T84D, S85.1D, V84.1W,
TRA-/- 세포들에서 TRAC-TFP의 강화된 발현으로 전체 TCR이 세포 표면으로 전좌되는 것이 복원된다. WT 세포들에서 강화된 TRAC-TFP는 TCR 복합체에서 내인성 TCRα 분자를 효율적으로 대신한다. TFP 결합체 없이 TRAC 발현을 강화시켜 상기 세포 표면으로의 TCR 복합체 전좌를 효과적으로 복원시키고, 이 경우 TFP 결합체는 CD3 분자들에 융합되어, 강화된 TRAC 이식유전자를 독립적으로 발현시키거나, 또는 두 코딩 서열 (CDS) 사이에 2A 자가-절단 펩티드를 배치함으로써 동일한 이식유전자에서 발현된다.
유사하게, TRBC에서 치환은 TCRα/TCRβ 사이의 상호작용을 강화시킨다. TRBC에서 개별적으로 또는 조합에 의해 도입된 치환 V22W는 TRB-/- 세포들에서 상기 세포 표면으로 전체 TCR의 전좌를 복원시키는데 충분하다. TRB-/- 세포들에서 TRBC-TFP의 강화된 발현으로 전체 TCR이 세포 표면으로 전좌되는 것이 복원된다. 야생형 세포들에서 TRBC-TFP의 강화된 발현은 TCR 복합체에서 내인성 TCRβ 분자를 효율적으로 대신한다. TFP 결합체 없이 TRBC 발현이 강화된 경우, 상기 TFP 결합체는 CD3 분자들에 융합되고, 강화된 TRBC 이식유전자를 독립적으로 발견시키거나, 또는 두 개 CDS 사이에 2A 자가-절단 펩티드를 배치함으로써 동일한 이식유전자에서 발현된다.
하이브리드 IgG/TCRα/β TFP의 발현
TCRα와 TCRβ 간의 상호작용은 TCRα 및 TCRβ의 가변 도메인을 IgG 불변 도메인으로 대체함으로써 강화된다. 따라서, IgG 중쇄 불변 도메인들 CH1은 TRBC의 N 말단 단부에 융합되며, 한편 IgG 경쇄 불변 도메인들 CL은 TRAC의 N 말단 단부에 융합되었다. 끝으로, 상기 TFP는 CL의 N 말단 단부에 추가되었다. 한 구체예에서, 이 두 구조체들은 표시된 바와 같이 이들 사이에 2A 자가-절단 펩티드를 배치함으로써 동일한 이식유전자에 의해 인코딩된다: Nt-FMC63-IgGCL(-7)-125-TRAC(-6-)174-T2A-IgGCH1(-7)-122-TRBC(-8)-173. 또다른 구체예에서, IgGCL와 IgGCH1의 위치는 바뀌었다. 또다른 구체예에서, 상기 TFP 결합체는 IgGCL 및/또는 IgGCH1의 N-말단 단부에 융합되거나, 또는 CD3 분자들에 융합되어, 독립적으로 발현된다. 또다른 구체예에서, CH1/CL 상호작용을 강화시키기 위하여 잔기 치환이 도입된다: IgGCLF7A, IgGCH1A20L.
도메인-맞교체된(swapped) TCR-TFP의 발현
TCRα/β/γ/δ 분자들은 유사한 구조적 조직을 선택한다. N-말단 단부에서, 이들 V(D)J 영역들은 면역글로불린 (IgV) 유사 입체구조를 채택하고, 반면 이들의 C 영역들은 면역글로불린 (IgC) 유사 도메인에 이어서 연결 펩티드 (CP) 막경유 도메인 (TM)과 이의 C-말단 단부에 짧은 세포내 꼬리 (IC)로 구성된다. 이들 분자 사이의 높은 구조적 상동성에도 불구하고, TCRα는 오로지 TCRβ와만 쌍을 이루고, TCRγ는 오로지 TCRδ와만 쌍을 이룬다. 결과적으로, TCRα의 도메인(들)을 TCRγ 도메인(들)과 맞교체하고, TCRβ의 도메인(들)을 TCRγ 도메인(들)과 맞교체함으로써 생성된 TFPs는 내인성 TCR 분자들과는 쌍을 이루지 않는다. 예를 들면, Nt-FMC63-IgCα-CPγ-TMγ-ICγ-2A-IgCβ-CPδ-ICδ-Ct는 IgCαCPγTMγICγ가 IgCbCPdICd와 특이적으로 상호작용하고, TRA-/- 세포들에서 내인성 TCRβ 또는 TRB-/- 세포들에서 내인성 TCRα와는 상호작용하지 않는 동종이계 수용체를 만든다. 또다른 구체예에서, 상기 TFP 결합체는 IgCβ 및/또는 IgCα의 N-말단 단부에 융합되거나, 또는 CD3 분자들에 융합되어, 독립적으로 발현된다. 맞교체된 도메인의 상이한 조합들은 본원에서 개시되는 방법들에 이용될 수 있다. TCR 좌에서 2A 자가-절단 펩티드의 녹-인(KI)
TRAC 또는 TRBC 유전자와 동일 틀 안에서 CP 도메인의 상류에 자가-절단 신호를 도입시키면 내인성 절두된 형태의 TCRα 또는 TCRβ가 생성된다. 따라서, CP 및 TM 도메인을 포함하는 절단 신호의 하류 서열은 세포 표면으로 전좌되고; 대조적으로, 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함하는 절단 신호의 상류 부분은 세포 표면으로 전좌되지 않는다. 한 구체예에서, 상기 자가-절단 신호는 상동성-지향된 복구 (HDR) 또는 단일 가닥의 주형 복구 (ssTR)를 통하여 TRAC 유전자 또는 TRBC 유전자와 동일한 틀로 삽입된다. HDR은 DNA 단일-가닥 파손 (SSB) 또는 DNA 이중-가닥 파손 (DSB)에 의해 유도되는 반면, ssTR은 오로지 SSB에 의해서만 유도된다. 한 구체예에서, 맞춤(custom) 엔도뉴클레아제를 이용하여 CP 영역의 상류에 DSB를 만들거나, 또는 TRAC 또는 TRBC의 동일한 영역에 SSB를 만들기 위하여 니카제를 사용한다. 자가-절단 신호를 포함하는 상동성 공여자 DNA는 내인성 표적과 상동성인 염기쌍을 적어도 40개 bp를 보유해야 하고, 그리고 단일-가닥 또는 이중-가닥, 선형 또는 원형일 수 있다. 추가적으로, 상동성 공여자 DNA는 상기 맞춤 엔도뉴클레아제 또는 니카제에 의해 절달되지 않는 다수의 염기 치환을 포함한다. 한 구체예에서, CD3-TFP 이식유전자는 유전자 편집 전 또는 후, 상기 세포로 삽입된다. 또다른 구체예에서, 상기 상동성 공여자 DNA는 TRAC 또는 TRBC와 동일 틀에서 자가-절단 펩티드의 하류에서 TFP 서열을 인코드한다. 결과적으로, 상기 TFP-TCR 융합 분자는 게놈을 통한 외인성 프로모터의 다중 무작위 삽입 위험없이, 내인성 TCR 수용체의 제어 하에 있게 된다. 계략도는 도 6에 제시된다.
실시예 6: TFPs를 발현시키는 인간 TCR-음성 T 세포들의 세포독성
루시퍼라제-기반의 세포독성 검정 ("Luc-Cyto" 검정) 은 공동-배양 후, 잔류 생존 표적 세포에서 루시퍼라제 효소 활성을 간접적으로 측정함으로써, TFP T 세포의 세포독성을 평가한다.
반딧불이 루시퍼라제 (Luc)를 발현하는 종양 세포의 생성
Luc-Cyto 검정에 이용된 표적 세포들은 반딧불이 루시퍼라제를 발현시키기 위하여 Nalm6-Luc (CD19 양성) 및 K562-Luc (CD19 음성은 Nalm6 (DSMZ Cat. # ACC 128) 및 K562 ((ATCC® Cat. #CCL-243™)을 안정적으로 형질도입시켜 만들어짐) 세포들을 이용하였다. 반딧불이 루시퍼라제를 인코딩하는 DNA는 Gene Art® (ThermoFisher)에서 합성되었으며, 단일-프로모터 렌티바이러스성 벡터 pCDH527A-1 (System Biosciences)의 다중 클로닝 부위로 삽입되었다. 이 렌티바이러스는 제작자의 지침에 따라 패키지되었다. 그 다음, 종양 세포들은 렌티바이러스로 24 시간동안 형질도입되었으며, 퓨로마이신 (5μg/mL)을 이용하여 선별되었다. Nalm6-Luc 세포 및 K562-Luc 세포의 성공적인 생산은 Bright-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega)에서 상기 세포들의 루시퍼라제 효소 활성을 측정함으로써 확인되었다.
Allo-TFP T 세포들의 표현형 특징
동종이계-TFP T 세포들은 이들에 의한 다음 발현에 대하여 검사되었다: 인간 TCRαβ (항-인간 TCR에 의해, Miltenyi Bio, 클론 BW242/412), 마우스 TCRαβ (항-마우스 TCRβ에 의해, BioLegend, 클론 H57-597), 인간 CD3ε (항-인간 CD3ε에 의해, BioLegend, 클론 UCHT1), 인간 CD4 (항-인간 CD4에 의해, BioLegend, 클론 RPA-T4), 인간 CD8 (항-인간 CD8에 의해, BioLegend, 클론 SK-1) 그리고 TFPs (바이오티닐화된 CD19 (Cat.# CD9-H8259, AcroBio)에 의한 CD19 결합체 FMC63 탐지에 의해). 비교용으로, 동일한 공여자로부터 야생형 T 세포들 (편집안됨)은 동일 패널로 검사되었다.
이들 결과는 도 7에 나타낸다. 야생형 T 세포들은 인간 TCRαβ 및 CD3ε의 표면 발현을 나타내지만, 마우스 TCRβ의 표면 발현을 나타내지 않는다. 대조적으로 동종이계 TFP T 세포들은 인간 TCRαβ의 표면 발현을 보이지 않는데, 이것은 편집이 성공적이었음을 나타낸다. 동종이계 TFP T 세포들에서 마우스 TCRβ의 표면 발현은 이 표면에서 인간 CD3ε의 탐지와 일치되고, 이는 온전체(full) TCR 복합체가 성공적으로 재-어셈블리되었음을 암시한다. 인간 CD4 및 CD8의 발현은 야생형 세포와 TFP T 세포간에 유의적으로 상이하지 않다. 표면 CD19 결합체 (FMC63, 서열 식별 번호:X)의 탐지는 동종이계 TFP T 세포들에서만 관찰되었다.
T 세포들의 세포독성을 평가하기 위한 Luc-Cyto 검정
상기 Luc-Cyto 검정은 표적 (종양 세포)에 대한 작동체 (T 세포) (E-대-T)의 상이한 비율에서 종양 세포와 T 세포를 혼합하여 설정되었다. 상기 표적 세포들 (Nalm6-Luc 또는 K562-Luc)은 10% 열-불활성화된 (HI) FBS가 보충된 RPMI-1640 배지가 있는 96-웰 플레이트에서 웰당 10,000개 세포로 도말되었다. 동종이계 TFP T 세포들은 E-대-T의 비율이 3-대-1, 1-대-1, 또는 1-대-3에 도달되도록, 웰당 30000개, 10000개, 또는 3333개의 세포로 수준으로 종양 세포에 추가되었다. 세포 혼합물은 24 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리되었다. 루시퍼라제 효소 활성은 Bright-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega)을 이용하여 측정되었고, 이것은 상기 T 세포와 종양 세포의 공동-배양물에 남아있는 생존 표적 세포로부터의 활성을 측정한다.
결과는 도 8에 나타낸다. 동종이계 TFP T 세포들, Allo CD3ε-TFP 및 Allo mTCRαβ-TFP T 세포들은 CD19 양성 종양 세포 Nalm6-Luc에 대항하여 강력하고 특이적인 용해를 보이지만, 그러나 CD19 음성 종양 세포 K562-Luc에 대항해서는 그렇지 않았다.
TFPs를 발현시키는 인간 TCR-음성 T 세포들의 MLR
혼합형 림프구 반응 (MLR) 검정을 이용하여 TFPs를 발현시키는 인간 TCR-음성 T 세포들의 동종이계성을 평가하였다. 불합치된 PBMC 공여자 세포들은 CD19 음성 세포들의 자기-활성화된 세포 분류에 의해 우선 B 세포를 고갈시켰다. PBMCs는 친지성 세포 라벨링 염료 PKH로 라벨링시키고, .4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 동시에, 상이한 색의 PKH 염료를 표적 T 세포들에 통합시켰다. TFPs를 발현시키는 인간 TCR- 음성 T 세포들과 동일한 공여자의 야생형 T 세포들은 1:1 비율 (PBMCs 대 T 세포)에서 후속적으로 공동-배양하거나, 또는 T 세포들만 단독으로 배양한다. 공여자 T 세포의 증식은 6일 내지 12-일 시점에 걸쳐 PKH 염료를 추적하여 모니터링한다. PKH 염료는 세포 분열시 절반으로 희석되며, 따라서, 상기 T 세포에서 발생되는 증식의 양이 평가되고, 야생형 대조군과 비교된다.
SEQUENCE LISTING <110> TCR2 THERAPEUTICS INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TCR REPROGRAMMING USING FUSION PROTEINS <130> 48538-714.601 <140> PCT/US2019/021315 <141> 2019-03-08 <150> 62/641,159 <151> 2018-03-09 <160> 93 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 1-4 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 1-6 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 13 <211> 2000 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2000) <223> This sequence may encompass 50-2000 nucleotides <400> 13 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> This sequence may encompass 50-5000 nucleotides <400> 15 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340 tttttttttt tttttttttt tttttttttt 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tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980 tttttttttt tttttttttt 5000 <210> 16 <211> 5000 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> This sequence may encompass 100-5000 nucleotides <400> 16 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 17 <211> 400 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(400) <223> This sequence may encompass 100-400 nucleotides <400> 17 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 400 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 agggcgggct gctccttgag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ctgcctgagc agccgcctga 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 gcgggggttc tgccagaagg 20 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 actctgggct gcctggccac ggg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 actctgttgt gcctggacac cgg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 tcacaggtga gcctggccac agg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 gcacgggtgg gcctggccac tgg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gcaggggtgt gcctggccac tgg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 atcctgctgt gcctggccac agg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 tctctggtgt 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<223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (303)..(304) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (307)..(309) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (312)..(312) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (315)..(315) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (319)..(320) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (340)..(341) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (345)..(348) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (350)..(350) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (363)..(364) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (366)..(366) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (368)..(368) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (371)..(374) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (376)..(376) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (379)..(379) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (381)..(382) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (384)..(384) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (387)..(387) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (390)..(391) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (394)..(394) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (396)..(399) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (402)..(403) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (405)..(405) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (417)..(417) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (420)..(420) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (433)..(433) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (515)..(515) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (519)..(519) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (579)..(579) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (753)..(753) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (804)..(804) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (810)..(810) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (812)..(812) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (816)..(816) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (859)..(859) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (877)..(877) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (885)..(885) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (897)..(897) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (903)..(903) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (907)..(907) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (935)..(935) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (944)..(945) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 93 atgnnnatca ggctcctctg nnnngtggnc ttttntttnc tggnngnagg cctcntngan 60 gnnnanntnn nccagancnc nagatanctn gtnanangga cngganagaa nntnnntctg 120 gaatgtnnnc annnnatggn ccatganaan atgtnctggt atcnacaaga nccaggnntg 180 gnnctacnnc tnatcnantn ntcntatgnn gttaannnna naganaangg agatnttncn 240 nnngngtnna nngtctcnag annnangang gagcnnttnn ccctgannct ggagtcngcc 300 agnnccnnnc anacntctnn gtacctctgt gccagcagtn natgnnnngn gggccgtgac 360 cannanancc nnnncntcng nncnggnacn nggntnnnng tnntngagga cctgaanaan 420 gtgttcccac ccnaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480 aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctncccng accacgtgga gctgagctgg 540 tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacng acccgcagcc cctcaaggag 600 cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660 ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720 aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa ccngtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780 tggggtagag cagactgtgg cttnacctcn gngtcntacc agcaaggggt cctgtctgcc 840 accatcctct atgagatcnt gctagggaag gccaccntgt atgcngtgct ggtcagngcc 900 ctngtgntga tggccatggt caagagaaag gattncagag gctnn 945

Claims (107)

  1. 다음을 포함하는 재조합 핵산:
    (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분,
    (2) 막경유 도메인, 그리고
    (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위
    (ii) 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 항체 또는 인간화된 항체를 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질 (TFP)을 인코딩하는 서열; 그리고
    (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며;
    이때 상기 TCR 소단위와 상기 항체는 작동가능하도록 연계되며, 그리고
    이때 상기 TFP는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 발현시키는 변형된 T 세포에서 발현될 때, TCR 복합체로 기능적으로 통합되는, 재조합 핵산.
  2. 다음을 포함하는 재조합 핵산:
    (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분,
    (2) 막경유 도메인, 그리고
    (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고
    (ii) 항체 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 결합 리간드 또는 이의 단편을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질 (TFP)을 인코딩하는 서열; 그리고
    (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며;
    이때 상기 TCR 소단위와 상기 결합 리간드 또는 이의 단편은 작동가능하도록 연계되며, 그리고
    이때 상기 TFP는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 발현시키는 변형된 T 세포에서 발현될 때, TCR 복합체로 기능적으로 통합되는, 재조합 핵산.
  3. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 상기 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는, 재조합 핵산.
  4. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 IgG1 항체에 선택적으로 결합할 수 있는, 재조합 핵산.
  5. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 IgG4 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 재조합 핵산.
  6. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 단편은 세포 표면 항원에 결합하는, 재조합 핵산.
  7. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 단편은 종양 세포의 표면 상에서 세포 표면 항원에 결합하는, 재조합 핵산.
  8. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체를 포함하는, 재조합 핵산.
  9. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 항체 또는 이의 단편을 포함하지 않는, 재조합 핵산.
  10. 청구항 9에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 CD16 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는, 재조합 핵산.
  11. 청구항 10에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 CD16-결합 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 핵산.
  12. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 결합 리간드는 인간 또는 인간화된, 재조합 핵산.
  13. 청구항 2에 있어서, 상기 결합 리간드에 의해 결합될 수 있는 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  14. 청구항 13에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 단편은 세포로부터 분비될 수 있는, 재조합 핵산.
  15. 다음을 포함하는 재조합 핵산:
    (a) (i) (1) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분,
    (2) 막경유 도메인, 그리고
    (3) CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TCR 소단위, 그리고
    (ii) 세포 표면 상에 발현되는 수용체 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 리간드 또는 이의 단편을 포함하는 항원 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) 융합 단백질 (TFP)을 인코딩하는 서열; 그리고
    (b) TCR 불변 도메인을 인코드하는 서열을 포함하는 재조합 핵산, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인이며;
    이때 상기 TCR 소단위와 상기 항원 도메인은 작동가능하도록 연계되며, 그리고
    이때 상기 TFP는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 발현시키는 변형된 T 세포에서 발현될 때, TCR 복합체로 기능적으로 통합되는, 재조합 핵산.
  16. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 항원 도메인은 리간드를 포함하는, 재조합 핵산.
  17. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 리간드는 상기 세포의 수용체에 결합하는, 재조합 핵산.
  18. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 리간드는 상기 세포 표면 상에 발현되는 폴리펩티드에 결합하는, 재조합 핵산.
  19. 청구항 15에 있어서, 이때 세포 표면 상에 발현되는 상기 수용체 또는 폴리펩티드는 스트레스 응답 수용체 또는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 핵산.
  20. 청구항 15에 있어서, 이때 세포 표면 상에 발현되는 상기 수용체 또는 폴리펩티드는 MHC 클래스 I-관련된 당단백질인, 재조합 핵산.
  21. 청구항 20에 있어서, 이때 상기 MHC 클래스 I-관련된 당단백질은 MICA, MICB, RAET1E, RAET1G, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산.
  22. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 항원 도메인은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체를 포함하는, 재조합 핵산.
  23. 청구항 22에 있어서, 이때 상기 항원 도메인은 상기 리간드 또는 이의 단편의 단량체 또는 이량체를 포함하는, 재조합 핵산.
  24. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 리간드 또는 이의 단편은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체인, 재조합 핵산.
  25. 청구항 24에 있어서, 이때 상기 리간드 또는 이의 단편은 단량체 또는 이량체인, 재조합 핵산.
  26. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 항원 도메인은 항체 또는 이의 단편을 포함하지 않는, 재조합 핵산.
  27. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 항원 도메인은 가변 영역을 포함하지 않는, 재조합 핵산.
  28. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 항원 도메인은 CDR을 포함하지 않는, 재조합 핵산.
  29. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 리간드 또는 이의 단편은 천연 킬러 그룹 2D (NKG2D) 리간드 또는 이의 단편인, 재조합 핵산.
  30. 청구항 1-29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 기능적 TCR 복합체로 통합되는, 재조합 핵산.
  31. 청구항 1-30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 T 세포 안에서 발현될 때, 상기 TFP를 통합시킨 기능적 TCR 복합체와 동일한 기능적 TCR 복합체로 통합되는, 재조합 핵산.
  32. 청구항 1-31중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자 안에 내포되는, 재조합 핵산.
  33. 청구항 1-31중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TFP를 인코딩하는 서열과 상기 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자 안에 내포되는, 재조합 핵산.
  34. 청구항 1-33중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 소단위와 상기 항체 도메인, 상기 항원 도메인 또는 상기 결합 리간드 또는 이의 단편은 링커(linker) 서열에 의해 작동가능하도록 연계되는, 재조합 핵산.
  35. 청구항 34에 있어서, 이때 상기 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 이때 n=1 내지 4인, 재조합 핵산.
  36. 청구항 1-35중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 막경유 도메인은 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 TCR 막경유 도메인인, 재조합 핵산.
  37. 청구항 1-36중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 막경유 도메인은 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, TCR 알파 또는 TCR 베타의 TCR 막경유 도메인인, 재조합 핵산.
  38. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 소단위는 (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, (ii) TCR 막경유 도메인, 그리고 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 이때 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 두 개는 동일한 TCR 소단위로부터 유래되는, 재조합 핵산.
  39. 청구항 1-38중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 세포외 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부분을 포함하는, 재조합 핵산.
  40. 청구항 1-39중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 소단위는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이의 기능적 단편들, 그리고 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 막경유 도메인을 포함하는 막경유 도메인을 포함하는, 재조합 핵산.
  41. 청구항 1-40중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 소단위는 CD3 입실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산.
  42. 청구항 1-41중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 소단위는 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이에 대하여 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열에서 선택된 단백질의 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산.
  43. 청구항 1-42중 임의의 한 항에 있어서, 공동자극 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  44. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 그리고 4-1BB (CD137), 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는, 재조합 핵산.
  45. 청구항 1-44중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TCR 소단위는 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, CD3 델타 TCR 소단위, TCR 제타 쇄, Fc 입실론 수용체 1 쇄, Fc 입실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP (DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이의 기능적 단편들, 그리고 이에 대하여 적어도 하나의, 그러나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 단백질의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 일부분을 포함하는 TCR 소단위의 ITAM을 포함하는, 재조합 핵산.
  46. 청구항 45에 있어서, 이때 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 입실론의 ITAM을 대체하는, 재조합 핵산.
  47. 청구항 45에 있어서, 이때 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 CD3 제타 TCR 소단위, CD3 입실론 TCR 소단위, CD3 감마 TCR 소단위, 그리고 CD3 델타 TCR 소단위로 구성된 군에서 선택된 상이한 ITAM을 대체하는, 재조합 핵산.
  48. 청구항 1-47중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 TFP, 상기 TCR 알파 불변 도메인, 상기 TCR 베타 불변 도메인, 그리고 이의 임의의 조합은 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 재조합 핵산.
  49. 청구항 1-48중 임의의 한 항에 있어서, 이때
    (a) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인이며, 상기 TFP는 TCR 베타, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며;
    (b) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 TCR 알파, CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되며; 또는
    (c) 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인과 TCR 베타 불변 도메인이며, 상기 TFP는 CD3 입실론, CD3 감마, CD3 델타, 또는 이의 조합의 내인성 소단위를 포함하는 TCR 복합체로 기능적으로 통합되는, 재조합 핵산.
  50. 청구항 1-49중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 이에 대하여 적어도 하나, 그러나 20개를 넘지 않는 변형은 세포 신호전달을 중개하는 아미노산의 변형, 또는 상기 TFP에 결합하는 리간드에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함하는, 재조합 핵산.
  51. 청구항 1 및 34-50중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 인간 항체 또는 인간화된 항체는 항체 단편인, 재조합 핵산.
  52. 청구항 51에 있어서, 이때 상기 항체 단편은 scFv, 단일 도메인 항체 도메인, VH 도메인 또는 VL 도메인인, 재조합 핵산.
  53. 청구항 1 및 34-52중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항원 결합 도메인은 항-CD19 결합 도메인, 항-B-세포 성숙 항원 (BCMA) 결합 도메인, 항-메소텔린 (MSLN) 결합 도메인, 항-IL13Rα2 결합 도메인, 항-MUC16 결합 도메인, 항-CD22 결합 도메인, 항-PD-1 결합 도메인,항 BAFF 또는 BAFF 수용체 결합 도메인, 그리고 항-ROR-1 결합 도메인으로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산.
  54. 청구항 1-53중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산.
  55. 청구항 1-54중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 핵산은 mRNA인, 재조합 핵산.
  56. 청구항 1-55중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 재조합 핵산은 핵산 유사체를 포함하고, 이때 상기 핵산 유사체는 이 재조합 핵산의 인코딩 서열에 존재하지 않는, 재조합 핵산.
  57. 청구항 56에 있어서, 이때 상기 핵 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O- 아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오르, 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), T- O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O- NMA) 변형된, 잠김 핵산 (LNA), 에틸렌 핵산 (ENA), 펩티드 핵산 (PNA), 1',5'-무수헥시톨 핵산 (HNA), 몰포리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 그리고 2'-플루오르 N3-P5'-포스포라미디트로 구성된 군에서 선택되는, 재조합 핵산.
  58. 청구항 1-57중 임의의 한 항에 있어서, 리더 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  59. 청구항 1-58중 임의의 한 항에 있어서, 프로모터 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  60. 청구항 1-59중 임의의 한 항에 있어서, poly(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  61. 청구항 1-60중 임의의 한 항에 있어서, 3'UTR 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  62. 청구항 1-61중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 핵산은 단리된 핵산 또는 비-자연 발생적 핵산인, 재조합 핵산.
  63. 청구항 1-62중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산인, 재조합 핵산.
  64. 청구항 1-63중 임의의 한 항에 있어서, TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  65. 청구항 1-63중 임의의 한 항에 있어서, TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  66. 청구항 1-63중 임의의 한 항에 있어서, TCR 알파 막경유 도메인을 인코딩하는 서열 및 TCR 베타 막경유 도메인을 인코딩하는 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산.
  67. 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  68. 청구항 67에 있어서, 이때 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스성 벡터 (AAV), Rous 육종 바이러스 (RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택된, 벡터.
  69. 청구항 67 또는 68에 있어서, 이때 상기 벡터는 AAV6 벡터인, 벡터.
  70. 청구항 67-69중 임의의 한 항에 있어서, 프로모터를 더 포함하는, 벡터.
  71. 청구항 67-70중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 벡터는 시험관내 전사된 벡터인, 벡터.
  72. 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 재조합 핵산, 또는 청구항 67-71중 임의의 한 항체 따른 벡터를 포함하는 변형된 T 세포에 있어서, 이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함하는, 변형된 T 세포.
  73. 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 TFP 핵산을 인코딩하는 서열, 또는 상기 TFP를 인코딩하는 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 핵산 서열에 의애 인코딩되는 TFP를 포함하는 변형된 T 세포에 있어서, 이때 상기 변형된 T 세포는 내인성 TCR의 기능적 파괴를 포함하는, 변형된 T 세포.
  74. 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 TFP를 인코딩하는 서열, 또는 TFP를 인코딩하는 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 핵산의 서열에 의해 인코드된 TFP를 포함하는 변형된 동종이계(allogenic) T 세포.
  75. 청구항 72-74중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 T 세포는 TCR 불변 도메인을 인코딩하는 이종기원의 서열을 더 포함하며, 이때 상기 TCR 불변 도메인은 TCR 알파 불변 도메인, TCR 베타 불변 도메인 또는 TCR 알파 불변 도메인 및 TCR 베타 불변 도메인인, 변형된 T 세포.
  76. 청구항 72-75중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 기능적으로 파괴된 내인성 TCR은 내인성 TCR 알파 쇄, 내인성 TCR 베타 쇄, 또는 내인성 TCR 알파 쇄 그리고 내인성 TCR 베타 쇄인, 변형된 T 세포.
  77. 청구항 72-76중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 기능적으로 파괴된 내인성 TCR은 변형안된 대조군 T 세포의 것과 비교하여, MHC-펩티드 복합체에 대한 결합이 감소된, 변형된 T 세포.
  78. 청구항 72-77중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 기능적 파괴란 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자의 파괴인, 변형된 T 세포.
  79. 청구항 78에 있어서, 이때 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자의 파괴는 상기 내인성 TCR을 인코드하는 유전자 서열을 이 T 세포의 게놈으로부터 제거인, 변형된 T 세포.
  80. 청구항 72-79중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 T 세포는 CD4 세포들, CD8 세포들, 나이브 T-세포들, 기억 줄기 T-세포들, 중추 기억 T- 세포들, 이중 음성 T-세포들, 작동체 기억 T-세포들, 작동체 T-세포들, ThO 세포들, TcO 세포들, Th1 세포들, Tc1 세포들, Th2 세포들, Tc2 세포들, Th 17 세포들, Th22 세포들, 감마/델타 T-세포들, 천연 킬러 (NK) 세포들, 천연 킬러 T (NKT) 세포들, 조혈 줄기 세포들 및 다능성 줄기 세포들로부터 선택된 인간 T 세포인, 변형된 T 세포.
  81. 청구항 72-80중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 T 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포인, 변형된 T 세포.
  82. 청구항 72-81중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 T 세포는 동종이계 T 세포인, 변형된 T 세포.
  83. 청구항 72-82중 임의의 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인의 양성 신호를 포함하는 제 2 폴리펩티드와 연합된, 저해성 분자의 적어도 일부분을 포함하는 제 1 폴리펩티드를 포함하는 저해성 분자를 인코드하는 핵산을 더 포함하는, 변형된 T 세포.
  84. 청구항 83에 있어서, 이때 상기 저해성 분자는 PD1의 적어도 일부분을 포함하는 제 1 폴리펩티드와 공동자극 도메인과 일차(primary) 신호전달 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 포함하는, 변형된 T 세포.
  85. 다음을 포함하는 약제학적 조성물:
    (a) 청구항 72-84중 임의의 한 항에 따른 변형된 T 세포; 그리고
    (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체.
  86. 청구항 72-84중 임의의 한 항에 따른 변형된 T 세포를 만드는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    (a) TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코딩하는 내인성 TCR 유전자를 파괴하고, 이로 인하여 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포가 만들어지며; 그리고
    (b) 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포에 청구항 1-63중 임의의 한 항에 따른 재조합 핵산, 또는 청구항 67-71중 임의의 한 항에 따른 벡터를 형질도입시킨다.
  87. 청구항 86에 있어서, 이때 파괴는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 유전자를 표적으로 하는 뉴클레아제 단백질 또는 뉴클레아제 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 상기 T 세포를 형질도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  88. 청구항 72-84중 임의의 한 항에 따른 변형된 T 세포를 만드는 방법에 있어서, 상기 방법은 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포에 청구항 1-63중 임의의 한 항에 따른 재조합 핵산, 또는 청구항 67-71중 임의의 한 항에 따른 벡터를 형질도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  89. 청구항 88에 있어서, 이때 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코드하는 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포인, 방법.
  90. 청구항 86-89중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 T 세포는 인간 T 세포인, 방법.
  91. 청구항 86-90중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 내인성 TCR 유전자의 기능적 파괴를 내포하는 T 세포는 변형안된 대조군 T 세포의 것과 비교하여, MHC-펩티드 복합체에 대한 결합이 감소되는, 방법.
  92. 청구항 86-91중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 뉴클레아제, 또는 megaTAL 뉴클레아제인, 방법.
  93. 청구항 86-92중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 재조합 핵산 또는 상기 벡터에 포함된 서열은 내인성 TCR 소단위 유전자의 절단 부위로 삽입되고, 그리고 이때 이 내인성 TCR 소단위 유전자로 이러한 서열의 삽입으로 인하여 당해 내인성 TCR 소단위는 기능적으로 파괴되는, 방법.
  94. 청구항 86-93중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 뉴클레아제는 메가뉴클레아제인, 방법.
  95. 청구항 94에 있어서, 이때 상기 메가뉴클레아제는 제 1 소단위와 제 2 소단위를 포함하는데, 이때 상기 제 1 소단위는 인지 서열의 제 1 인지 절반-부위에 결합하고, 그리고 상기 제 2 소단위는 당해 인지 서열의 제 2 인지 절반-부위에 결합하는, 방법.
  96. 청구항 95에 있어서, 이때 상기 메가뉴클레아제는 링커를 포함하는 단일-쇄 메가뉴클레아제이며, 이때 상기 링커는 상기 제 1 소단위와 제 2 소단위를 공유적으로 연결하는, 방법.
  97. 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 당해 대상체에게 청구항 85에 따른 약제학적 조성물의 치료요법적으로 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  98. 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 당해 대상체에게 (a) 청구항 86-96중 임의의 한 항에 따른 방법에 의해 만들어진 변형된 T 세포; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  99. 치료를 요하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 당해 대상체에게 (a) 청구항 88-96중 임의의 한 항에 따른 방법에 의해 만들어진 변형된 T 세포; 그리고 (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  100. 청구항 97-99중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 T 세포는 동종이계 T 세포인, 방법.
  101. 청구항 97-100중 임의의 한 항에 있어서, 이때 형안된 대조군 T 세포의 효과량을 투여받은 대상체와 비교하였을 때, 당해 대상체에서 사이토킨이 덜 방출되는, 방법.
  102. 청구항 97-101중 임의의 한 항에 있어서, 이때 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 재조합 핵산, 또는 청구항 67-71중 임의의 한 항에 따른 벡터를 포함하는 변형된 T 세포의 효과량이 투여된 대상체와 비교하였을 때, 이 대상체에서 사이토킨 방출이 더 적은, 방법.
  103. 청구항 97-102중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 상기 약제학적 조성물의 효과를 증가시키는 제제와 조합하여, 당해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  104. 청구항 97-103중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 상기 약제학적 조성물와 연합된 하나 또는 그 이상의 부작용을 경감시키는 제제와 조합하여, 당해 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  105. 청구항 97-104중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 암은 고형 암, 림프종 또는 백혈병인, 방법.
  106. 청구항 97-105중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 암은 신장 세포 암종, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 콩팥 및 위암으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  107. 약물로써 이용되거나, 또는 약물 제조에 이용되는, 청구항 1-66중 임의의 한 항에 따른 재조합 핵산, 청구항 67-71중 임의의 한 항에 따른 벡터, 청구항 72-84중 임의의 한 항에 따른 변형된 T 세포, 또는 청구항 85의 약제학적 조성물.
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