CN117480247A - 嵌合t细胞受体及其应用 - Google Patents

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CN117480247A CN202280025488.6A CN202280025488A CN117480247A CN 117480247 A CN117480247 A CN 117480247A CN 202280025488 A CN202280025488 A CN 202280025488A CN 117480247 A CN117480247 A CN 117480247A
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Abstract

提供了包含抗体/T细胞受体嵌合物的工程化细胞及其用途。

Description

嵌合T细胞受体及其应用 技术领域
本发明属于免疫治疗领域。更具体地,本发明涉及包含抗体/T细胞受体嵌合物的工程化细胞及其用途。
背景技术
表达嵌合抗原受体的T细胞(Chimeric Antibody Receptor Engineered T Cell,CAR-T)疗法在靶向CD19和BCMA的恶性肿瘤的治疗方面已显示出高效的治疗效果。但CAR-T细胞疗法在实体瘤中未能产生良好的疗效,同时在治疗过程中经常会出现严重的毒性作用,其中细胞因子释放综合征(CRS)是发生最频繁、症状最突出的急性不良反应,严重时可危及生命。因此,正确有效地对CRS进行管理和干预,降低CAR-T治疗相关不良事件发生率是亟待解决的临床问题。
目前研究表明,CRS的产生可能与CAR提供的非自然的激活信号有关,这种非自然的信号会导致T细胞不受控制的激活,因而释放了大量细胞因子,增加了产生CRS的风险,同时过度激活的T细胞在实体瘤的恶性肿瘤微环境中会迅速衰竭,降低了对实体瘤的治疗效果。相较于此,TCR-T细胞疗法由于依赖TCR的自然信号,因此发生毒副作用事件的概率更低。然而,由于TCR依赖于与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)结合,所以TCR-T细胞对肿瘤细胞的识别能力有限,另外这种结合在癌细胞中通常是不存在或下调的,癌细胞常常通过低表达MHC而逃逸免疫系统的攻击,极大降低TCR-T细胞治疗的效率。因此,降低CAR-T细胞带来的直接毒副作用和提高TCR-T细胞的靶向能力成为了目前免疫细胞治疗领域关注的重点。
发明内容
本发明第一方面提供一种工程化细胞,所述工程化细胞表达T细胞受体(TCR)嵌合物(ATC),所述ATC包含:
(a)识别抗原的抗原识别单元,和
(b)核苷酸序列同义突变的TCR亚基恒定区;
所述工程化细胞的内源性TCR亚基的表达、活性和/或信号传导被降低或抑制,而所述ATC的表达、活性和/或信号传导不被降低或抑制。
在一优选例中,相对于野生型TRAC核酸分子、TRBC核酸分子、TRGC核酸分子和/或TRDC核酸分子,所述ATC的TCR亚基恒定区的核酸分子有同义突变。
在一优选例中,所述ATC中的TCR亚基包括天然和/或修饰的TCRα链恒定区(TRAC)和β链恒定区(TRBC);或包括天然和/或修饰的TCRγ链恒定区(TRGC)和δ链恒定区(TRDC)。
在一优选例中,所述ATC的抗原识别单元包括一种或两种抗体;或所述ATC的抗原识别单元包括抗体重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
在一优选例中,所述ATC中的TRAC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRBC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRAC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRBC肽与VH直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRGC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRGC肽与VH直接连接或通过铰链区连接。
在一优选例中,所述ATC与抗原结合后能激活与所述ATC缔合的CD3分子。
在一优选例中,所述内源性TCR表达被降低或抑制是通过使用基因敲除技术和/或基因沉默技术包括:TALE核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9、Argonaute、引导编辑技术、归巢核酸内切酶技术或其组合。
在一优选例中,所述ATC不包含基因敲除技术和/或基因沉默技术所靶向的核酸序列。
在一优选例中,所述ATC的核酸分子包含碱基同义突变后不再是基因敲除技术和/或基因沉默技术所针对的靶序列的核酸分子。
在一优选例中,所述ATC不包括gRNA靶序列。
在一优选例中,所述工程化细胞包含gRNA,序列分别如SEQ ID NO:25、28、33、34、35、36、37、38、39、40、41、44或其组合所示;或包含gRNA,序列分别如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28所示;或包含gRNA,序列分别如SEQ ID NO:41和44所示。
在一优选例中,所述ATC包含SEQ ID NO:7、8、10或12所示的核苷酸序列,和SEQ ID NO:16或17所示的核苷酸序列;或所述ATC包含SEQ ID NO:5、9、11或13所示的氨基酸序列,和SEQ ID NO:14或18所示的氨基酸序列;或所述ATC包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列;或所述ATC包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在一优选例中,所述工程化细胞选自T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、NK细胞、NKT细胞、人胚胎干细胞、和可从中分化出淋巴样细胞的多能干细胞。
在一优选例中,所述工程化细胞是自体或同种异体细胞。
在一优选例中,所述抗原为肿瘤抗原和/或病原体抗原;
优选地,所述抗原为肿瘤抗原;
优选地,所述抗原为实体瘤抗原;
优选地,所述抗原为GPC3、EGFR、Claudin18.2、BCMA、间皮素、CD19。
在一优选例中,所述抗原识别单元包含识别GPC3的抗原识别单元的氨基酸序列的VL选自SEQ ID NO:3、49、51、53、55、57、59、61、63或65或与之具有70-100%的序列同一性,和/或识别GPC3的抗原识别单元的氨基酸序列的VH选自SEQ ID NO:1、48、50、52、54、56、58、60、62或64或与之具有70-100%的序列同一性,或者,
识别Claudin18.2的抗原识别单元的氨基酸序列的VL选自SEQ ID NO:67、69、71、73、75、77、79、81、83或85或与之具有70-100%的序列同一性,和/或识别Claudin18.2的抗原识别单元的氨基酸序列的VH选自SEQ ID NO:66、68、70、72、74、76、78、80、82或84或与之具有70-100%的序列同一性。
在一优选例中,所述工程化细胞具有以下特点之一或其组合:
1)能杀伤携带所述抗原的靶细胞;
2)与所述靶细胞孵育后分泌IFN;
3)与所述靶细胞孵育后CD25、CD69阳性率提高;
4)CD4+、CD8+阳性率与未转导编码ATC的多核苷酸片段的细胞接近;
5)原始T细胞比例大;和/或
6)PD-1/TIM-3/LAG-3阳性率与未转导编码ATC的多核苷酸片段的细胞接近。
在一优选例中,与表达相同抗原识别单元的嵌合抗原受体的CAR的细胞相比,所述工程化细胞具有以下之一或其组合:
1)对靶细胞的杀伤能力、和/或与靶细胞孵育后分泌IFN-γ、细胞增殖没有显著差异;与靶细胞孵育后CD25、CD69表达水平高;
2)原始T细胞比例大;
3)CD4+/CD8+比例高;
4)PD-1/TIM-3/LAG-3阳性率低。
在一优选例中,与表达相同ATC但内源性TCR亚基的表达、活性和/或信号传导没有被降低或抑制的细胞相比,所述工程化细胞ATC阳性率提高或提高约5%、10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%。
本发明第二方面提供了如本发明所述的工程化细胞中的ATC分子。
本发明第三方面提供了一种多核苷酸,其编码如本发明所述的工程化细胞中的ATC或gRNA分子。
本发明第四方面提供了一种载体,其包含如本发明所述的多核苷酸。
本发明第五方面提供了一种药物组合物,其包含有效量的如本发明所述的工程化细 胞、如本发明所述的ATC分子、如本发明所述的多核苷酸、如本发明所述的载体和药学上可接受的赋形剂。
在一优选例中,如本发明所述的药物组合物,其用于治疗肿瘤。
本发明第六方面提供了一种试剂盒,其包含如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的ATC分子、如本发明所述的多核苷酸、如本发明所述的载体或者如本发明所述的药物组合物。
在一优选例中,如本发明所述的试剂盒还包括用于治疗和/或预防肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的书面说明书。
本发明第七方面提供了一种降低受试者肿瘤负荷的方法,包括向所述受试者施用有效量的如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的药物组合物。
本发明第八方面提供了一种治疗或预防受试者肿瘤的方法,包括向所述受试者施用有效量的如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的药物组合物。
在一优选例中,所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、血液肿瘤。
在一优选例中,所述肿瘤是GPC3阳性肿瘤、或Claudin18.2阳性肿瘤。
本发明第九方面提供了一种产生抗原特异性免疫效应细胞的方法,包括将编码如本发明所述的ATC分子的多核苷酸、或将如本发明所述的多核苷酸、或将如本发明所述的载体导入免疫效应细胞。
本发明第十方面提供了一种延长患有肿瘤的受试者存活的方法,包括向所述受试者施用有效量的如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的药物组合物。
本发明第十一方面提供了如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的ATC分子、如本发明所述的多核苷酸、如本发明所述的载体、如本发明所述的药物组合物在治疗中的用途。
本发明第十二方面提供了如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的ATC分子、如本发明所述的多核苷酸、如本发明所述的载体、如本发明所述的药物组合物用于减轻受试者的肿瘤负荷的用途。
本发明第十三方面提供了如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的ATC分子、如本发明所述的多核苷酸、如本发明所述的载体、如本发明所述的药物组合物用于治疗或预防受试者肿瘤的用途。
本发明第十四方面提供了如本发明所述的工程化细胞、如本发明所述的ATC分子、如本发明所述的多核苷酸、如本发明所述的载体、如本发明所述的药物组合物用于延长患有肿瘤的受试者存活的用途。
本发明第十五方面提供了靶向GPC3的ATC,所述ATC包含识别GPC3的抗原识别单元和TRAC形成的多肽,和识别GPC3的抗原识别单元和TRBC形成的多肽;或所述ATC包含识别GPC3的抗原识别单元和TRDC形成的多肽,和识别GPC3的抗原识别单元和TRGC形成的多肽。
在一优选例中,所述识别GPC3的抗原识别单元包括抗GPC3抗体的抗体重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL):
所述TRAC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRBC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述TRAC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRBC肽与VH直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRGC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRGC肽与VH直接连接或通过铰链区连接。
本发明第十六方面提供了靶向Claudin18.2的ATC,所述ATC包含识别Claudin18.2的抗原识别单元和TRAC形成的多肽,和识别Claudin18.2的抗原识别单元和TRBC形成的多肽;或所述ATC包含识别Claudin18.2的抗原识别单元和TRDC形成的多肽,和识别Claudin18.2的抗原识别单元和TRGC形成的多肽。
在一优选例中,所述识别Claudin18.2的抗原识别单元包括抗Claudin18.2抗体的抗体重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL):
所述TRAC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRBC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述TRAC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRBC肽与VH直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRGC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRGC肽与VH直接连接或通过铰链区连接。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1 ATC病毒滴度测定结果。
图2 ATCT阳性率和敲除效率检测结果。
图3 ATCT细胞对靶细胞的体外杀伤结果。
图4 ATCT细胞与靶细胞共孵育后IFN-γ分泌结果。
图5 ATCT细胞CD25和CD69表达水平检测结果。
图6 ATCT细胞分化情况检测结果。
图7 ATCT细胞CD4/CD8分型检测结果。
图8 ATCT细胞耗竭情况检测结果。
图9 ATCT细胞增殖情况检测结果。
具体实施方式
本发明是关于一种新型细胞免疫技术平台的构建和应用。示例性以GPC3为靶点,将抗GPC3抗体与突变后的T细胞受体进行串联转入内源性TCR低表达或不表达的T细胞,构建抗体-T细胞受体嵌合T细胞(Antibody-TCR-Chimeric T cell,ATCT)。
除非专门定义,否则本文所用的所有技术和科学术语具有在基因治疗、生物化学、遗传学和分子生物学领域内的技术人员通常理解的相同含义。类似或等效于本文中描述的那些所有方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用,其中,本文描述的是合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其全部内容通过引用并入本文。在发生冲突的情况下,以本说明书为准。此外,除非另有规定,否则本发明的材料、方法和实施例仅是说明性的,而并非旨在进行限制。根据本发明内容,本领域技术人员应了解在所公开的具体实施方案中可以作出许多变化或改变,并且仍获得相同或相似结果,而不背离本发明的精神和范围。本发明在范围上并不受限于本文描述的具体实施方案(其仅预期作为本发明的各方面的举例说明),并且功能等价的方法和组分在本发明的范围内。本发明包括对本发明的主题进行变型和修改来用于各种用途和条件。
除非另有说明,否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术,这都属于本领域的技术范围。这些技术充分解释于文献中。参见,例如,Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc.,Library of Congress,USA);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al.,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984);Mullis et al.美国专利号4,683,195;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984);Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York),尤其是Vols.154和155(Wu et al.,eds.)和Vol.185,“Gene Expression Technology”(D.Goeddel,ed.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和 Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Hand book Of Experimental Immunology,卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.,1986)和Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
1.定义:
如本文所用,“约”可表示取决于具体情况并且由本领域技术人员已知或可知的,或表示给定值的至多约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%。可替代的,特别是关于生物系统或方法,该术语可指在数值的一个数量级内,例如在一个值的约5倍之内或在约2倍之内。
范围:范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见,而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此,范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。
术语“激活免疫效应细胞”,是指信号转导通路引起的细胞内蛋白质表达的变化,导致免疫应答的启动。例如,当CD3分子响应于配体结合和基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)聚集,从而产生信号转导级联反应。在一实施例中,当内源性TCR或外源性ATC与抗原结合后形成的免疫突触,包括在结合受体(例如,CD4或CD8,CD3γ/CDδ/CDε/CDζ等)附近的许多分子的聚集。膜结合信号分子的这种聚集使CD3分子中包含的ITAM基序磷酸化。该磷酸化进而启动T细胞激活通路,最终激活转录因子,例如NF-κB和AP-1。这些转录因子诱导T细胞的整体基因表达,包括上调IL-2生成,促进T细胞增殖,进而启动T细胞介导的免疫应答。“T细胞活化”或“T细胞激活”指被刺激后诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞的状态。使用CD3/CD28磁珠,体外抗原刺激或者体内抗原刺激都会对T细胞的活化程度和持续时间造成影响。在一个实施例中,所述工程化细胞与含特定靶抗原肿瘤细胞共孵育后活化、或所述工程化细胞被病毒感染后活化。
术语“刺激免疫效应细胞”,是指信号转导通路导致免疫效应细胞发生强烈、持续的免疫应答。在一实施例中,这发生在免疫效应细胞(例如,T细胞)激活后或通过包括但不限于CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD40和ICOS的受体同时介导。
术语“抗原识别单元”是指特异性结合抗原决定簇的分子,包括免疫球蛋白分子和免疫分子的免疫活性部分,即含有与抗原特异性结合(“免疫反应”)的抗原结合位点的分子。术语“抗体”不仅包括完整的抗体分子,也包括保留抗原结合能力的抗体分子的片段。本发明中术语“抗体”与术语“免疫球蛋白”“抗原识别单元”可互换使用。抗体,包括 但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、单域抗体。在一实施例中,抗体包含通过二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区有三个结构域CH1、CH2、CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。轻链恒定区由一个结构域组成。VH和VL可进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),其间散布有更保守的区域,称为框架区(FR)。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成,从氨基端到羧基端按以下顺序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如,免疫效应细胞)与经典补体系统的第一组分(C1q)。如果抗原识别单元以与其它参考抗原(包括多肽或其他物质)结合相比更大亲和力(或称亲合力)结合抗原,则所述抗原识别单元与抗原“特异性结合”或与抗原是“免疫反应性的”。
术语“嵌合抗原受体(CAR)”,是指包括与能够激活或刺激免疫效应细胞的细胞内信号传导结构域融合的胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子。在一实施例中,CAR的胞外抗原结合结构域包含scFV。scFV包括抗体重链可变区和轻链可变区。在一实施例中,CAR包括scFV、跨膜结构域和胞内信号传导结构域顺序连接而成的多肽。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物,包括编码目的多肽或其片段的任何核酸分子。所述核酸分子只需要与内源性核酸序列保持基本同一性即可,不需要与内源性核酸序列100%同源性或同一性。与内源性序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下在互补多核苷酸序列或其部分之间形成双链分子的配对。术语“同源性”或“同一性”是指两个聚合物分子之间,例如,两个核酸分子如两个DNA分子或两个RNA分子之间,或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。术语“基本同一性”或“基本同源性”,是指与参考氨基酸序列或核酸序列表现出至少约50%同源性或同一性的多肽或核酸分子。在一实施例中,这样的序列与用于比较的氨基酸或核酸序列为至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%同源性或同一性。序列同一性可以通过使用序列分析软件(例如,BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)进行测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其它修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代:甘氨酸、丙氨酸;缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸;天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺;丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸;和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中,可以使用BLAST程序,其中e-3和e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。
术语“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症,例如肿瘤(癌症)或病原体感染。难治性癌症包括但不限于放疗不敏感、放疗后复发、化疗不敏感、化疗后复发、对CAR-T治疗不敏感或治疗后复发的癌症。
术语“治疗有效量”、“治疗有效的”、“有效量”或“以有效的量”在本文中可互换地使用,是指如本文中所述有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物、药物组合物的量,例如但不限于足以促进T细胞应答的量或剂量。有效量的免疫效应细胞,是指但不限于:能使抗肿瘤活性增加、增强或延长的免疫效应细胞的数量;抗肿瘤免疫效应细胞数目或活化免疫效应细胞数目的增加;促进IFN-γ分泌、肿瘤消退、肿瘤缩小、肿瘤坏死的免疫效应细胞的数量。
术语“内源”,是指核酸分子或多肽等来自生物体自身。
术语“外源”,是指核酸分子或多肽不是内源性存在细胞中的,或表达水平不足以实现过表达时具有的功能;涵盖在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽,例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。
术语“识别”,是指选择性结合靶抗原。识别肿瘤的工程化细胞可以表达与肿瘤抗原结合的受体(例如ATC或CAR)。
术语“特异性结合”是指识别并且结合存在于样品中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体,但是该抗体或配体基本上不会识别或结合样品中的其它分子。
术语“信号肽(SP)”,是引导新合成的蛋白或多肽向分泌通路转移的短肽链(长度约5-30个氨基酸)。本发明的多核苷酸编码区可以与编码信号肽的编码区连接,所述信号肽指导本发明多核苷酸编码的多肽分泌。例如,如果需要分泌融合蛋白,则可以将编码信号肽的多核苷酸置于编码本发明融合蛋白或多肽的多核苷酸的上游。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的蛋白或多肽通常具有与蛋白或多肽N末端融合的信号肽,所述信号肽从翻译的蛋白或多肽被切下以产生分泌的或“成熟”形式的蛋白或多肽。在某些实施方案中,使用天然信号肽,例如TCR的信号肽(TRAV信号肽序列如SEQ ID NO:93所示、TRBV信号肽如SEQ ID NO:94所示)、IL-2信号肽序列如SEQ ID NO:96(人)、SEQ ID NO:97(小鼠)所示,κ信号肽序列如SEQ ID NO:98(人)、SEQ ID NO:99(小鼠)所示;CD8信号肽序列如SEQ ID NO:95(人)所示;截短的人CD8信号肽如SEQ ID NO:100(人)所示;白蛋白信号肽序列如SEQ ID NO:101(人)所示;催乳素信号肽序列如SEQ ID NO:102(人)所示。
术语“个体”和“受试者”可互换,包括人或来自其他种属的动物,其包括但不限于人、小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠、兔子、狗、猫、绵羊、猪、山羊、牛、马、猿、猴子。
术语“T细胞(抗原)受体(T cell receptor,TCR)”,也称为“TCR亚基”,或“TCR单 元”,为所有T细胞表面的特征性标志,以非共价键与CD3结合,形成TCR-CD3复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体,由α、β两条肽链组成,或由γ、δ两条肽链组成;每条肽链包括可变区和恒定区(包括胞外恒定区、跨膜区和胞质区);其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族,其抗原特异性存在于V区;V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3,其中以CDR3变异最大,直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时,CDR1、CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁,而CDR3直接与抗原肽相结合。TCR分为两类:TCR1和TCR2;其中TCR1由γ和δ两条链组成,而TCR2由α和β两条链组成。外周血中,约90%-95%的T细胞表达TCR2;而且任一T细胞只表达TCR2或TCR1。这些天然TCR受体的识别能力常常比较弱,因此不能形成对靶细胞的有效攻击。在这种情况下,可以通过部分基因修改的方法来提高天然TCR对相应靶抗原的“亲和力”,即高亲和力TCR,例如本发明提供的抗体-T细胞受体嵌合物(Antibody-TCR-Chimeric,ATC)。
术语“分离的”意指从天然状态改变或移出的。例如,天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”,但与其天然状态下共同存在的物质部分或完全分离的相同核酸或肽则是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在,或者可存在于非天然环境如宿主细胞中。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用,是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。
术语“同义突变”,是指DNA片段中某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸,原因在于该位置的密码子在突变前后为同义密码子。核酸序列中,连续的3个核苷酸残基为一个密码子。在64个密码子中,除了3个终止密码子(TAA、TAG、TGA)以外,其余61个密码子代表20种氨基酸(表1)。除了甲硫氨酸、色氨酸各有1个密码子外,其它18种氨基酸均有2个或多个密码子。对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子。比如同义密码子CTA与CTG均编码亮氨酸,若CTA中的A突变为G则该变异为同义突变。
表1.密码子表
术语“野生型基因”,指自然界中占多数的等位基因,在生物学实验中常作为标准对照基因。与之相对应的概念为突变型基因。
术语“工程化”是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法,通过某种工程学手段,在细胞整体水平、细胞器水平、分子水平上,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
2.抗体-T细胞受体嵌合物ATC(Antibody-TCR-Chimeric)
本发明提供了对TCR进行改造后的ATC受体。所述ATC包含用抗原识别单元修饰的TCR亚基部分。
2.1 TCR亚基部分
ATC的TCR亚基部分包括天然或修饰的TCRα链、β链、γ链和/或δ链。在一实施例中,ATC包括天然或修饰的TCRα链和β链的恒定区;或包括天然或修饰的TCRγ链和δ链的恒定区。
在一实施例中,TCR亚基恒定区,任选地,还包括铰链/间隔区。
TCR亚基恒定区包含TCRα恒定区(TRAC)、TCRβ恒定区(TRBC,例如TRBC1或TRBC2)、TCRγ恒定区(TRGC,例如TRGC1或TRGC2)、TCRδ恒定区(TRDC)或其任何变体或功能片段。
野生型TRAC核酸分子,指编码TRAC多肽,具有NCBI GenBank Gene ID:28755, NG_001332.3,925603至930229(TRAC,SEQ ID NO:6)所示核苷酸序列。
野生型TRBC核酸分子,指编码TRBC多肽,具有NCBI GenBank Gene ID:28639,NC_000007.14,142791694至142793141(TRBC1,SEQ ID NO:15),或NCBI GenBank Gene ID:28638,NG_001333.2,655095至656583(TRBC2)所示核苷酸序列。
野生型TRGC核酸分子,指编码TRGC多肽,具有NCBI GenBank Gene ID:6966,NG_001336.2,108270至113860(TRGC1,SEQ ID NO:19),或NCBI GenBank Gene ID:6967,NG_001336.2,124376至133924(TRGC2)所示核苷酸序列。
野生型TRDC核酸分子,指编码TRDC多肽,具有与NCBI GenBank Gene ID:28526,NG_001332.3,841011至844674(TRDC,SEQ ID NO:22)所示核苷酸序列。
本发明提供的ATC核酸分子包含碱基突变后不再是基因敲除技术和/或基因沉默技术所针对的靶序列的核酸分子。在一实施例中,对ATC包含的TCR亚基的恒定区的核酸片段进行突变。在一实施例中,对ATC包含的TRAC和/或TRBC的核酸片段进行突变。在一实施例中,对ATC包含的TRGC和/或TRDC的核酸片段进行突变。优选地,对ATC包含的野生型TRAC和/或TRBC的核酸片段进行突变。优选地,对ATC包含的野生型TRGC和/或TRDC的核酸片段进行突变。
本发明提供的ATC核酸分子包含碱基同义突变后不再是基因敲除技术和/或基因沉默技术所针对的靶序列的核酸分子。在一实施例中,对ATC包含的TCR亚基的胞外恒定区的核酸片段进行同义突变。在一实施例中,对ATC包含的TRAC和/或TRBC的胞外恒定区的核酸片段进行同义突变。在一实施例中,对ATC包含的TRGC和/或TRDC的胞外恒定区的核酸片段进行同义突变。优选地,对ATC包含的野生型TRAC和/或TRBC的胞外恒定区的核酸片段进行同义突变。优选地,对ATC包含的野生型TRGC和/或TRDC的胞外恒定区的核酸片段进行同义突变。
在一实施例中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRAC多肽包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在一个实施例中,ATC中的TRAC多肽第47位氨基酸突变为半胱氨酸、第115位氨基酸突变为亮氨酸、第118位氨基酸突变为缬氨酸、第119位氨基酸突变为亮氨酸或其组合。
在某些实施方式中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRAC多肽具有与由NCBI GenBank Gene ID:28755,NG_001332.3,925603至930229的基因表达的转录物编码的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片 段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在一个实施例中,ATC中的TRAC多肽第47位氨基酸突变为半胱氨酸、第115位氨基酸突变为亮氨酸、第118位氨基酸突变为缬氨酸、第119位氨基酸突变为亮氨酸或其组合。
在一实施例中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRBC多肽包含与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在一个实施例中,ATC中的TRBC多肽第57位氨基酸突变为半胱氨酸。
在一实施例中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRBC多肽具有与由NCBI GenBank Gene ID:28639,NC_000007.14,142791694至142793141(TRBC1,SEQ ID NO:15),NCBI GenBank Gene ID:28638,NG_001333.2,655095至656583(TRBC2)的基因表达的转录物编码的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在一个实施例中,ATC中的TRBC多肽第57位氨基酸突变为半胱氨酸。
在一实施例中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRGC多肽包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在一个实施例中,ATC中的TRBC多肽第57位氨基酸突变为半胱氨酸。
在一实施例中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRGC多肽具有与由NCBI GenBank Gene ID:6966,NG_001336.2,108270至113860(TRGC1),NCBI GenBank Gene ID:6967,NG_001336.2,124376至133924的基因表达的转录物编码的氨基酸序列具有至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在一实施例中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRDC多肽包含与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在一个实施例中,ATC中的TRBC多肽第57位氨基酸突变为半胱氨酸。
在一实施例中,本发明提供的ATC多肽所包含的TRDC多肽具有与由NCBI GenBank Gene ID:28526,NG_001332.3,841011至844674的基因表达的转录物编码的氨基酸序 列具有至少约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在一实施例中,本发明ATC包含与TCR亚基恒定区直接连接的抗原识别单元(也称为胞外抗原结合结构域)。在一实施例中,本发明ATC包含将抗原识别单元(也称为胞外抗原结合结构域)连接至TCR亚基恒定区的铰链/间隔区。铰链/间隔区可以是来自IgG1的铰链区,或者是免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分,CD28多肽的部分,CD8多肽的部分,与前述任一项具有至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%的同源性或同一性的变体,或合成的间隔序列。
在一实施例中,ATC包含TCRα恒定区(SEQ ID NO:5或9、11、13所示氨基酸序列)、TCRβ链恒定区(SEQ ID NO:14或18所示氨基酸序列)、TCRγ链恒定区(SEQ ID NO:20所示氨基酸序列)、和/或与TCRδ链恒定区(SEQ ID NO:23所示氨基酸序列)。在一实施例中,ATC不包含如SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:28所示核苷酸序列。在一实施例中,ATC不包含如SEQ ID NO:41和/或SEQ ID NO:44所示序列。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:7、8、10或12所示核苷酸序列)、TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16或17所示核苷酸序列)、TCRγ突变恒定区(SEQ ID NO:21所示核苷酸序列)、和/或TCRδ突变恒定区(SEQ ID NO:24所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:7、8、10或12所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16或17所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:7所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:7所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:17所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:8所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:8所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:17所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:10所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:10所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:17所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:12所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:12所示核苷酸序列)和TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:17所示核苷酸序列)。在一实施例中,ATC包括TCRγ突变恒定区(SEQ ID NO:21 所示核苷酸序列)和TCRδ突变恒定区(SEQ ID NO:24所示核苷酸序列)。
本发明的ATC的胞外结构域可衍生自天然来源或重组来源。在天然来源的情况下,该结构域可衍生自任何蛋白质,但特别是膜结合蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面,胞外结构域能够与跨膜结构域缔合。在本发明中特别有用的胞外结构域可包括至少以下胞外区域:例如T细胞受体的α、β或γ、δ链,或者CD3ε、CD3γ或CD3δ,或者在替代实施方案中,包括CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。
本发明的ATC的跨膜结构域可衍生自天然来源或重组来源。在天然来源的情况下,该结构域可衍生自任何膜结合蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面,每当ATC与靶抗原结合时,跨膜结构域能够向细胞内结构域发信号。在本发明中特别有用的跨膜结构域可包括至少以下跨膜区域:例如T细胞受体的α、β或γ、δ链,或者CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些情况下,跨膜结构域可经由铰链(例如来自人类蛋白质的铰链)与ATC的胞外区域(例如ATC的抗原结合结构域)连接。例如,在一个实施方案中,该铰链可以是T细胞受体的α、β链的铰链。
2.2胞外抗原结合结构域
本发明提供的ATC包含胞外的抗原结合结构域(也称为抗原识别单元)和TCR亚基恒定区。抗原结合结构域特异性结合抗原,例如肿瘤抗原或病原体抗原。在一实施例中,抗原结合结构域包含抗体或其片段。在某些实施例中,抗原结合结构域包含抗体重链可变区和/轻链可变区;或者包含交联的Fab;或者包含F(ab) 2。在一实施例中,抗原结合结构域包含抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),形成可变片段(Fv)。
在一个实施例中,ATC中的抗体重链可变区与TCR的α链恒定区(TRAC)直接连接,和/或抗体轻链可变区与TCR的β链恒定区(TRBC)直接连接;或抗体轻链可变区与TCR的α链恒定区直接连接,和/或抗体重链可变区与TCR的β链恒定区直接连接。在一实施例中,ATC中的抗体重链可变区与TCR的α链恒定区直接连接形成片段1,抗体轻链可变区与TCR的β链恒定区直接连接形成片段2,所述片段1和片段2由连接子连接,所述片段1和片段2可以交换相对于连接子的前后顺序。在一实施例中,ATC中的抗体轻链可变区与TCR的α链恒定区直接连接形成片段3,抗体重链可变区与TCR的β链恒定区直接连接形成片段4,所述片段3和片段4由连接子连接,所述片段3和片段4可以交换相对于连接子的前后顺序。在一实施例中,ATC中的抗体重链可变区与TCR的γ链恒定区直接连接形成片段5,抗体轻链可变区与TCR的δ链恒定区直接连接形成片段6,所述片段5和片段6由连接子连接,所述片段5和片段6可以交换相对于连接子的前后顺序。在一实施例 中,ATC中的抗体重链可变区与TCR的δ链恒定区直接连接形成片段7,抗体轻链可变区与TCR的γ链恒定区直接连接形成片段8,所述片段7和片段8由连接子连接,所述片段7和片段8可以交换相对于连接子的前后顺序。所述“连接子”包括编码自切割肽(例如,2A序列)或蛋白酶识别位点(例如,弗林蛋白酶)的序列。如本文所使用,“自切割肽”是指允许将多个蛋白编码为多蛋白的寡肽,其在翻译后解离为组分蛋白。本领域技术人员已知各种自切割肽,包括但不限于在小核糖核酸病毒科的成员中发现的那些病毒,如口蹄疫病毒(FMDV),马鼻炎A病毒(ERAV0)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)及猪铁士古病毒-1(PTV-1)、及心脏病毒诸如泰勒病毒(Theilovirus)及脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽在本文中分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。本领域技术人员将能够选择适合用于本发明的自切割肽。示例性,F2A包含SEQ ID NO:88或89所示序列,P2A包含SEQ ID NO:90或91所示序列,连接肽1包含SEQ ID NO:92所示序列。
本发明包括编码ATC的重组DNA分子(或称为构建体),示例性,ATC包含与GPC3或Claudin18.2特异性结合的抗体片段,其中该抗体片段序列与编码TCR亚基或其部分的核酸序列连接并在同一开放阅读框(Open Reading Frame)中。
在一实施例中,提供了识别GPC3的抗体,所述抗体包含重链可变区,所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、48、50、52、54、56、58、60、62或64所示氨基酸序列;和/或所述抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3、49、51、53、55、57、59、61、63或65所示氨基酸序列。在一实施例中,提供了识别CLDN18A2的抗体,所述抗体包含重链可变区,所述重链可变区包含SEQ ID NO:66、68、70、72、74、76、78、80、82或84所示氨基酸序列;和/或所述抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:67、69、71、73、75、77、79、81、83或85所示氨基酸序列。
在一个方面,本发明考虑到产生功能上等同的分子的起始抗体或片段(例如,VH或VL)氨基酸序列的修饰。例如,可修饰ATC中包含的抗GPC3或Claudin18.2结合结构域例如VH或VL,以保留抗GPC3或Claudin18.2结合结构域例如VH或VL至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。
本发明考虑到整个ATC构建体的修饰,例如,ATC构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列的修饰,以便产生功能上等同的分子。可修饰ATC构建体以保留起始ATC构建体的至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93 %、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
本领域普通技术人员将会理解,可进一步修饰本发明的抗体或抗体片段,使得它们在氨基酸序列上(例如,相对于野生型)有所变化,但在所需活性上没有变化。例如,可对蛋白质进行另外的核苷酸置换,导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换。例如,分子中的非必需氨基酸残基可被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一个实施方案中,氨基酸片段可被结构相似但在顺序和/或组成上与侧链家族成员不同的氨基酸片段取代,例如,可进行保守置换,其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。
2.3.抗原
在一实施例中,ATC与肿瘤抗原结合。任何肿瘤抗原均可用于本发明所述的肿瘤相关的实施例中。抗原表达为多肽或完整蛋白或其部分。本发明的肿瘤抗原包括但不限于:促甲状腺激素受体(TSHR);CD171;CS-1;C型凝集素样分子-1;神经节苷脂GD3;Tn抗原;CD19;CD20;CD 22;CD 30;CD 70;CD 123;CD 138;CD33;CD44;CD44v7/8;CD38;CD44v6;B7H3(CD276),B7H6;KIT(CD117);白介素13受体亚单位α(IL-13Rα);白介素11受体α(IL-11Rα);前列腺干细胞抗原(PSCA);前列腺特异性膜抗原(PSMA);癌胚抗原(CEA);NY-ESO-1;HIV-1Gag;MART-1;gp100;酪氨酸酶;间皮素;EpCAM;蛋白酶丝氨酸21(PRSS21);血管内皮生长因子受体,血管内皮生长因子受体2(VEGFR2);路易斯(Y)抗原;CD24;血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β);阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4);细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1),MUC6;表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR,EGFR2,ERBB3,ERBB4,EGFRvIII);神经细胞粘附分子(NCAM);碳酸酐酶IX(CAIX);LMP2;肝配蛋白A型受体2(EphA2);岩藻糖基GM1;唾液酸基路易斯粘附分子(sLe);神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer;TGS5;高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA);邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2);叶酸受体;肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248);肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R);Claudin 6,Claudin18.2、Claudin18.1;ASGPR1;CDH16;5T4;8H9;αvβ6整合素;B细胞成熟抗原(BCMA);CA9;κ轻链(kappa light chain);CSPG4;EGP2,EGP40;FAP;FAR;FBP;胚胎型AchR;HLA-A1,HLA-A2;MAGEA1,MAGE3;KDR;MCSP;NKG2D配体;PSC1;ROR1;Sp17;SURVIVIN;TAG72;TEM1;纤连蛋白;腱生蛋白;肿瘤坏死区的癌胚变体;G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D);X染色体开放阅读框61(CXORF61);CD97;CD179a;间变性淋巴瘤激酶(ALK);聚唾液酸;胎盘特异性1(PLAC1);globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH);乳腺分化抗原(NY-BR-1);uroplakin 2(UPK2);甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1);肾上腺素受体β3(ADRB3);pannexin 3(PANX3);G蛋白偶联受体20(GPR20);淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K);嗅觉受体51E2 (OR51E2);TCRγ交替阅读框蛋白(TARP);肾母细胞瘤蛋白(WT1);ETS易位变异基因6(ETV6-AML);精子蛋白17(SPA17);X抗原家族成员1A(XAGE1);血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2);黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1);黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2);Fos相关抗原1;p53突变体;人端粒酶逆转录酶(hTERT);肉瘤易位断点;细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP);ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因);N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17);配对盒蛋白Pax-3(PAX3);雄激素受体;细胞周期蛋白B1;V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN);Ras同源物家族成员C(RhoC);细胞色素P450 1B1(CYP1B1);CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS);由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3);配对盒蛋白Pax-5(PAX5);proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1);淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK);A激酶锚定蛋白4(AKAP-4);滑膜肉瘤X断点2(SSX2);CD79a;CD79b;CD72;白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1);IgA受体的Fc片段(FCAR);白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2);CD300分子样家族成员f(CD300LF);C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A);骨髓基质细胞抗原2(BST2);含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2);淋巴细胞抗原75(LY75);磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3);Fc受体样5(FCRL5);免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一实施例中,ATC识别GPC3。在一实施例中,ATC识别Claudin18.2。在一实施例中,人GPC3多肽包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。在一实施例中,ATC结合至GPC3多肽的胞外结构域。在一实施例中,人Claudin18.2多肽包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列。在一实施例中,ATC结合至Claudin18.2多肽的胞外结构域。
在一实施例中,ATC识别病原体抗原,例如用于治疗和/或预防病原体感染或其他感染性疾病,例如在免疫受损的受试者中。病原体抗原包括但不限于:病毒、细菌、真菌、原生动物,或寄生虫的抗原;病毒抗原包括但不限于:巨细胞病毒(CMV)抗原、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)抗原、人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原或流感病毒抗原。
2.4 CD3复合物
本发明提供的ATC受体能够与CD3ζ多肽缔合。在一实施例中,ATC包含TCR亚基的恒定区与CD3ζ多肽缔合。CD3ζ多肽可以是内源性,也可以是外源性的。在一实施例中,ATC的胞外抗原结合结构域与抗原的结合能够激活与TCA亚基恒定区缔合的CD3ζ多肽。
激活的CD3ζ多肽可激活和/或刺激免疫效应细胞(例如,淋巴谱系的细胞,例如T细胞)。CD3ζ包含三个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM1、ITAM2和ITAM3)、三个富碱性拉伸区(BRS)(BRS1、BRS2和BRS3),并在抗原与ATC的胞外抗原结合结构域结合后将激活信号传递至细胞(例如,淋巴谱系的细胞,例如T细胞)。CD3ζ链的细胞内信号传导结构域是TCR信号主要的传递者。
本发明提供的ATC受体能与CD3复合物(也称为“T细胞共受体”)缔合。在一实施例中,ATC和CD3复合物形成类似于天然TCR/CD3复合物的抗原识别受体复合物。在一实施例中,ATC与抗原结合后能激活与所述ATC缔合的CD3分子。本发明所述CD3分子包括CD3ζ、CD3γ、CD3δ和CD3ε。
CD3复合物可以是内源性的,也是外源性的。ATC受体替代了CD3/TCR复合物中的天然和/或内源性TCR。CD3复合物包含两条CD3ζ、CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。
本发明提供的ATC受体比靶向相同抗原的CAR表现出更高的抗原敏感性。在某些实施例中,ATC在与肿瘤细胞表面上具有低密度的抗原结合时能够诱导免疫应答。在某些实施例中,包含本发明ATC的免疫效应细胞可以用于治疗具有表面抗原低表达水平的肿瘤细胞的受试者,例如由于疾病的复发,其中该受试者接受过导致残留的肿瘤细胞的治疗。
3.工程化细胞
本发明提供的工程化细胞是包含表达ATC的免疫效应细胞。ATC能激活所述免疫效应细胞。本发明的工程化细胞在结合抗原后,对携带抗原的细胞表现出细胞溶解作用。
本发明提供了构建表达ATC的工程化细胞的技术平台,示例性,所述工程化细胞为T细胞,也称为ATCT细胞,将抗体/抗原识别单元的识别抗原的高亲和力和高度特异性,与T细胞的天然TCR信号传导能力相结合,在不减弱本发明所述工程化细胞杀伤作用的情况下可减少细胞因子分泌,提高临床安全性,同时ATCT细胞具有较低的分化程度和耗竭程度,提示本发明的细胞存活能力更强,在治疗实体瘤方面具有一定优势。
在一实施例中,与包含靶向相同抗原CAR的细胞相比,本发明工程化细胞表现出相当或更好的治疗效力。在一实施例中,与包含靶向相同抗原CAR的细胞相比,本发明工程化细胞表现出相当或更好的细胞溶解作用。在一实施例中,本发明工程化细胞分泌抗肿瘤细胞因子。工程化细胞分泌的细胞因子包括但不限于TNFα、IFNγ和IL2。在一实施例中,与包含靶向相同抗原CAR的细胞相比,本发明工程化细胞表现出相当或更好的抗原结合后工程化细胞激活水平。在一实施例中,与包含靶向相同抗原CAR的细胞相比,本发明工程化细胞表现出相当或更低的分化程度,例如ATCT细胞的CCR7和CD45RA表达比例高。在一实施例中,与包含靶向相同抗原CAR的细胞相比,本发明工程化细胞表现出相当或接近天然状态的CD4/CD8表型。在一实施例中,与包含靶向相同抗原CAR的细胞相比,本发明工程化细胞表现出相当或更低的耗竭程度。在一实施例中,与包含靶向相同抗原CAR的细胞相比,本发明工程化细胞表现出相当或更接近天然状态的增殖能力。在一实施例中,与表达相同抗原识别单元的CAR的细胞相比,所述工程化细胞具有以下之一特点或其组合:1)对靶细胞的杀伤能力、和/或与靶细胞孵育后分泌IFN-γ、细胞增殖没有显著差异; 与靶细胞孵育后CD25、CD69表达水平高;2)原始T细胞比例大;3)CD4+/CD8+比例高;4)PD-1/TIM-3/LAG-3阳性率低。
在一个实施例中,与过表达ATC靶向抗原的肿瘤细胞共孵育,所述ATCT细胞能分泌大量IFN-γ、颗粒酶-B、IL2、TNF-α及GM-CSF;与同样抗原识别单元构建的CAR T细胞(嵌合抗原受体T细胞)相比,ATCT保持了同样显著的细胞毒性,但是细胞因子分泌量明显降低,这有效降低了细胞因子风暴的可能。本发明的平台将抗体识别的高亲和力和高度特异性与T细胞的天然TCR信号传导能力相结合,在不减弱杀伤作用的情况下可减少细胞因子分泌,提高临床安全性,同时ATCT细胞具有较低的分化程度和耗竭程度,提示本发明的细胞存活能力更强,在治疗实体瘤方面具有显著优势。
在另一个方面,本文所述的ATCT细胞可进一步表达另一种因子,例如细胞因子、转录因子、趋化因子、和/或其组合,来增加T细胞的增殖、细胞存活、抗凋亡作用、肿瘤浸润等作用来提高抗肿瘤活性。
在一实施例中,本发明提供的工程化细胞中内源性TCR分子低表达或不表达,所包含的ATC能与内源性CD3形成复合体。所述ATC核酸分子在包含碱基突变后不再是基因敲除技术和/或基因沉默技术所针对的靶序列的核酸分子。在一实施例中,所述ATC核酸分子在包含碱基同义突变后不再是基因敲除技术和/或基因沉默技术所针对的靶序列的核酸分子,且ATC多肽可以与内源性CD3形成复合体。在一实施例中,所述ATC核酸分子在包含碱基同义突变后不再是基因敲除技术和/或基因沉默技术所针对的靶序列的核酸分子,且ATC氨基酸序列与野生型TCR亚基恒定区具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约100%同源性或同一性的氨基酸序列或其片段,且ATC多肽可以与内源性CD3形成复合体。
在一实施例中,本发明提供的工程化细胞中内源性αβTCR分子低表达或不表达,所表达的ATC核酸分子包含相对野生型TRAC核酸分子、TRBC核酸分子存在同义突变。在一实施例中,本发明提供的工程化细胞中内源性γδTCR分子低表达或不表达,所表达的ATC核酸分子包含相对野生型TRGC核酸分子、TRDC核酸分子存在同义突变。在一实施例中,与未基因工程化的细胞中内源性TCR的表达、活性和/或信号传导相比,所述工程化细胞中内源性TCR的表达、活性和/或信号传导减少大于约50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。在一实施例中,对工程化细胞的TCRα、β链恒定区相应编码基因的外显子用CRISPR/Cas技术敲除。在一实施例中,所述CRISPR/Cas技术所靶向的靶序列位于TCRα链和β链恒定区。在一实施例中,同时敲除工程化细胞中的内源性TRAC和内源性TRBC。在一个实施例中,工程化细胞包 含gRNA,序列如SEQ ID NO:25、28、33、34、35、36、37、38、39、40或其组合所示。在一实施例中,工程化细胞包含gRNA,序列如SEQ ID NO:41和/或44所示。在一实施例中,工程化细胞包含序列如SEQ ID NO:25和/或28所示gRNA。
在一实施例中,与表达相同ATC但内源性TCR亚基的表达、活性和/或信号传导没有被降低或抑制的细胞相比,所述工程化细胞ATC阳性率和/或ATC和内源性CD3形成复合体比率提高,或提高约5%、10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
本发明还提供了ATCT细胞,其被转导有编码所述ATC和靶向编码内源性TCR基因的抑制性核酸分子或gRNA的核酸、或被转导有包含所述核酸的重组质粒、或被转导包含所述质粒的病毒。在一个实施例中,ATCT细胞是指利用两组核苷酸片段修饰而得,第一组核苷酸片段包括抑制性核酸分子和/或gRNA,所述抑制性核酸分子的互补序列或gRNA靶序列位于野生型TCR亚基恒定区;第二组核苷酸片段包括编码识别抗原的抗原识别单元和包含核苷酸序列同义突变的TCR亚基恒定区的核苷酸片段,所述第二组核苷酸片段不包括所述第一组核苷酸片段中抑制性核酸分子的互补序列和/或gRNA靶序列。
本发明所述的免疫效应细胞可以是淋巴谱系的细胞。包括B、T和自然杀伤(NK)细胞的淋巴谱系提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外源试剂的检测、宿主外源细胞的检测等。淋巴谱系的免疫效应细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞及其前体,包括胚胎干细胞和多能干细胞(例如,分化成淋巴样细胞的干细胞或多能干细胞)。T细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞,主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与适应性免疫系统。T细胞可以是任何类型的T细胞,包括但不限于辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和两种效应记忆T细胞:例如TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关性不变T细胞、γδT细胞或αβT细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤性T细胞)是能够诱导被感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞。受试者自身的T细胞可以被工程化改造以表达ATC靶向特定的抗原。在一实施例中,免疫效应细胞是T细胞。在一实施例中,T细胞可以是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一实施例中,免疫效应细胞是CD3+T细胞。在一实施例中,所述工程化细胞包括由PBMC细胞经CD3磁珠刺激后收集的细胞群。
免疫效应细胞(例如,T细胞)可以是自体的、非自体的(例如,同种异体的)、或者是体外从工程化的祖细胞或干细胞衍生而来。可从许多来源获得,包括外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
在本发明的某些方面,可使用本领域技术人员已知的任意数量的技术如Ficoll TM分离技术从收集自受试者的血液样品中获得T细胞。在一个优选的方面,通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞,包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面,可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在本发明的背景下还可使用多轮选择。在某些方面,可能需要进行选择程序并在激活和扩充过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受其他轮选择。
本发明的工程化细胞能够调节肿瘤微环境。
未纯化的CTL来源可以是本领域已知的任何来源,例如骨髓、胎儿、新生儿或成年或其它造血细胞来源,例如胎儿肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如,阴性选择法可以最初去除非CTL。mAb对于鉴定与特定细胞谱系和/或阳性和阴性选择的分化阶段相关的标志物特别有用。
最初可以通过相对粗略的分离除去大部分末端分化的细胞。例如,最初可以使用磁珠分离来去除大量不相关的细胞。在某些实施方式中,在分离细胞之前将去除总造血细胞的至少约80%,通常至少约70%。
分离的程序包括但不限于密度梯度离心;重沉(resetting);偶联至改变细胞密度的颗粒;用抗体包被的磁珠进行磁分离;亲和色谱;与mAb结合或结合使用的细胞毒性剂,包括但不限于补体和细胞毒素;并用附着在固体基质(例如板、芯片、淘析)上的抗体淘选或任何其它方便的技术。
分离和分析的技术包括但不限于流式细胞术,其可以具有不同的复杂程度,例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。
通过使用与死细胞相关的染料,例如碘化丙啶(PI),可以针对死细胞选择细胞。在某些实施方式中,将细胞收集在包含2%胎牛血清(FCS)或0.2%牛血清白蛋白(BSA)的培养基或任何其它合适的例如无菌等渗培养基中。
4.载体
工程化细胞(例如,T细胞或NKT细胞)的遗传修饰可以通过用重组DNA分子转导基本上均质的细胞群来完成。在某些实施方式中,逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)用于将DNA分子引入细胞。例如,可以将编码ATC的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体。也可以使用非病毒载体。转导可以使用任何合适的病毒载体或非病毒递送系统。可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中用辅助分子(例如细胞因子)构建ATC。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES,例如,FGF-1IRES、FGF-2IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES、NF-κB IRES、RUNX1 IRES、p53IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、无杆状病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可切割的接头(例如2A肽,例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。
可以使用的其它病毒载体包括,例如,腺病毒、慢病毒和与腺相关的病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒,例如爱泼斯坦-巴尔病毒。
非病毒方法也可以用于工程化细胞的遗传修饰。例如,可以通过在脂质转染,脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸偶联,或手术条件下的微注射的情况下施用核酸来将核酸分子引入免疫效应细胞中。其它非病毒的基因转移方法包括使用脂质体、磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。也可以通过将核酸分子转移到可离体培养的细胞类型(例如,自体或同种异体原代细胞或其后代)中来完成将所述核酸分子移植到受试者体内,之后,将经所述核酸分子修饰后的细胞(或其后代)注射到受试者目标组织中或全身注射。
采用基因敲除技术和/或基因沉默技术来制备内源性TCR分子低表达或不表达的工程化细胞。基因敲除技术包括Argonaute、CRISPR/Cas9技术、ZFN技术、TALE技术、TALE-CRISPR/Cas9技术、Base Editor技术、引导编辑技术和/或归巢核酸内切酶技术。基因沉默技术包括但不限于:反义RNA、RNA干扰、微小RNA介导的翻译抑制等。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统用于基因组编辑。该系统包括Cas9(一种能够使用crRNA作为其向导来修饰DNA的蛋白质),CRISPR RNA(crRNA,包含Cas9用来引导其到达宿主DNA正确片段的RNA,以及与tracrRNA结合的区域(通常以发夹环形式),与Cas9形成活性复合物),反式激活crRNA(tracrRNA,与crRNA结合,与Cas9形成活性复合物),以及DNA修复模板的可选片段(可指导细胞修复过程允许插入特定的DNA序列的DNA)。CRISPR/Cas9通常采用质粒、或电转方式传递核酸片段到靶细胞。crRNA需要针对每种应用进行设计,因为这是Cas9用来识别并直接结合细胞中靶DNA的序列。多个crRNA和tracrRNA可以包装在一起以形成指导RNA(gRNA)。该gRNA可以与Cas9基因连接在一起并制成质粒,以便被转染到细胞中。本发明凡涉及gRNA的序列时,其可以为靶向的DNA序列,亦可以为所述DNA对应的核糖核苷酸与crRNA、TracrRNA形成的完整Cas9引导序列。在进行基因编辑时,施用的gRNA、tracr配对序列及tracr序列可以单独施用,也可以一条完整的RNA序列施用。CRISPR/Cas9转基因可以通过载体(例如AAV、腺病毒、慢病毒)、和/或粒子和/或纳米粒子、和/或电转来递送。
锌指核酸酶(ZFN)是一种人工限制性酶,通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域结合而产生。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的DNA序列,其允许锌指核酸酶靶向 基因组内的靶序列。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是限制性酶,可以工程化为切割DNA的特定序列。TALEN系统的工作原理几乎与ZFN相同。它们是通过将转录激活因子样效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域结合而产生的。
本发明还提供了编码本文所述的一种或多种ATC、靶向内源性TCR的核酸抑制分子或gRNA构建体的核酸分子。
5.工程化细胞制备方法
在一实施例中,首先采用包含编码ATC的多核苷酸的病毒感染免疫效应细胞(例如T细胞或NKT细胞),再利用CRISPR/Cas9技术敲除内源性TCR亚基,得到本发明的工程化细胞。在一实施例中,首先利用CRISPR/Cas9技术敲除免疫效应细胞内源性TCR亚基,再采用包含编码ATC的多核苷酸的病毒感染。在一实施例中,采用包含编码ATC的多核苷酸的病毒感染免疫效应细胞和利用CRISPR/Cas9技术敲除免疫效应细胞内源性TCR亚基同时进行。在一实施例中,编码ATC的多核苷酸片段不包括CRISPR/Cas9的靶序列。
在T细胞激活第1,2,3,4,5,6,7,8,9或10天加入包含编码ATC的多核苷酸的病毒感染所述T细胞,感染后第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20天采用CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除所述T细胞内源性TCR亚基,制备得到本发明的ATCT细胞。在T细胞激活第1,2,3,4,5,6,7,8,9或10天利用CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除所述T细胞内源性TCR亚基,敲除后1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20天内加入包含编码ATC的多核苷酸的病毒感染所述T细胞,制备得到本发明的ATCT细胞。
在一实施例中,在T细胞激活1-5天内加入包含编码ATC的多核苷酸的病毒,感染后1-7天内采用CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除所述T细胞内源性TCR亚基。在一实施例中,在T细胞激活1-5天内利用CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除所述T细胞内源性TCR亚基,敲除后1-7天内加入包含编码ATC的多核苷酸的病毒感染所述T细胞。在一实施例中,在T细胞激活第2天加入包含编码ATC的多核苷酸的病毒,感染后第2天采用CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除所述T细胞内源性TCR亚基。在一实施例中,在T细胞激活第2天加入包含编码ATC的多核苷酸的病毒,感染后第2天采用CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除所述T细胞内源性TCR亚基。在一实施例中,在T细胞激活第2天利用CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除所述T细胞内源性TCR亚基,敲除后第2天加入包含编码ATC的多核苷酸的病毒感染所述T细胞。
在一实施例中,为了减少T细胞中内源性TCR亚基与ATC亚基形成错配导致ATC低 表达,本发明敲除T细胞内源性TCR或对T细胞进行基因修饰使得内源性TCR分子低表达或不表达,并且对ATC中的TCR亚基的胞外恒定区进行基因修饰,使得在敲除T细胞内源性TCR或进行导致内源性TCR分子低表达或不表达的基因修饰时不影响T细胞中ATC表达和/或不影响T细胞中ATC与内源性CD3形成复合体。
在一个方面,将编码靶向靶抗原(示例性,GPC3或Claudin18.2肿瘤抗原)的ATC、靶向内源性TCR的核酸抑制分子或gRNA的核酸分子引入T细胞中以产生ATCT细胞。在一个实施方案中,体外转录的ATC核酸分子、靶向内源性TCR的核酸抑制分子或gRNA可作为瞬时转染的形式引入细胞中。示例性人工DNA序列是包含连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可来自单个生物体或来自多于一个生物体。
6.给药
可以将包含本发明的工程化细胞的组合物系统地或直接提供给受试者,以诱导和/或增强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防肿瘤、病原体感染或感染性疾病。在一实施例中,将本发明的工程化细胞或包含其的组合物直接注射到目的器官(例如,受肿瘤影响的器官)中。或者,例如通过向循环系统(例如,静脉、肿瘤脉管系统)给药,将本发明的工程化细胞或包含其的组合物间接地提供给目的器官。可以在施用细胞或组合物之前、同时或之后提供扩增和分化剂,以增加体外或体内T细胞、NKT细胞或CTL细胞的产生。
本发明的工程化细胞可以包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法,例如荧光激活细胞分选(FACS),容易地确定群体中本发明的工程化细胞的百分比。在包含本发明的工程化细胞的群体中,纯度的合适范围是约50%至约55%、约5%至约60%、以及约65%至约70%。在某些实施方式中,纯度为约70%至约75%、约75%至约80%或约80%至约85%。在某些实施方式中,纯度为约85%至约90%,约90%至约95%以及约95%至约100%。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如,纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等引入细胞。
本发明的组合物可以是包含本发明的免疫效应细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。给药可以是自体的或异体的。例如,可以从一个受试者获得免疫效应细胞或祖细胞,并将其施用于相同受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫效应细胞或其后代(例如,体内、离体或体外来源)可通过局部注射施用,包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当施用本发明的主题的治疗组合物(例如,包含本发明的免疫效应细胞的药物组合物)时,可以将其配制成单位剂量可注射形式(溶液剂、悬浮剂、乳剂等)。
7.剂型
包含本发明的工程化细胞的组合物可以方便地以无菌液体制剂的形式提供,例如等渗水溶液剂、悬浮液、乳剂、分散剂或粘性组合物,其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外,液体组合物在某种程度上更方便施用,尤其是通过注射。另一方面,可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体,所述载体可以是溶剂或分散介质,其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
可以通过将遗传修饰的工程化细胞掺入所需量的适当溶剂中,并根据需要掺入不同量的其它成分来制备无菌注射溶液。这样的组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以冻干。所述组合物可包含辅助物质,例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如,甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、颜料等,这取决于给药途径和所需制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂,包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。然而,所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂将必须与遗传修饰的免疫效应细胞或其祖细胞相容。
该组合物可以是等渗的,即它们可以具有与血液和/或泪液相同的渗透压。组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。氯化钠可以特别适用于含有钠离子的缓冲剂。
如果需要,可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定水平。例如,甲基纤维素容易且经济地获得并且易于使用。其它合适的增稠剂包括,例如,黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于选择的试剂。重要的是要使用能够达到所选粘度的用量。显然,合适载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质,例如液体剂型(例如,是否将组合物配制成溶液剂、悬浮液、凝胶剂或其它液体形式,例如定时释放形式或液体填充形式)。
对于所治疗的受试者,要施用的细胞数量将有所不同。在一个实施方式中,向人受试者施用的本发明的免疫效应细胞为约10 4至约10 10之间、约10 5至约10 9之间、或约10 6至约10 9之间。可以更少的数量施用更有效的细胞。可以根据每个受试者的个体因素,包括其大小、年龄、性别、体重和受试者的状况,来确定有效剂量的精确确定。本领域技术人员从本发明和本领域知识中可以容易地确定剂量。
本领域技术人员可以容易地确定组合物中和在方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒 介物和/或载体的量。通常,任何添加剂(除一种或多种活性细胞和/或一种或多种试剂外)在磷酸盐缓冲盐水中的存在量为0.001%至50%(重量)溶液,并且活性成分按微克至毫克的顺序存在,例如约0.0001wt%至约5wt%、约0.0001wt%至约1wt%、约0.0001wt%至约0.05wt%或约0.001wt%至约20wt%、约0.01wt%至约10wt%或约0.05wt%至约5wt%。对于要施用于动物或人的任何组合物,可以确定以下结果:毒性,例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物如小鼠中确定致死剂量(LD)和LD50;组合物的剂量,其中的组分浓度和施用组合物的时间,引起合适的反应。
8.治疗方法
本发明提供用于在需要所述工程化细胞的受试者中诱导和/或增加免疫应答的方法。本发明的工程化细胞和包含其的组合物可以用于治疗和/或预防受试者的肿瘤。本发明的工程化细胞和包含其的组合物可以用于延长患有肿瘤的受试者的存活。本发明的工程化细胞和包含其的组合物也可以用于治疗和/或预防诸如免疫功能低下的人受试者的病原体感染或其它感染性疾病。这种方法包括施用有效量的本发明的工程化细胞或包含其的组合物(例如药物组合物)以达到期望的效果,无论是减轻现有病症还是预防复发。为了治疗,施用的量是有效产生所需效果的量。可以一次或多次给药来提供有效量。可以大剂量或通过连续灌注来提供有效量。
在一实施例中,包含本发明的ATC的免疫效应细胞可以用于治疗具有表面抗原表达水平低的肿瘤细胞的受试者,例如由于疾病的复发,其中受试者接受过导致残留肿瘤细胞的治疗。在某些实施方式中,肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上具有低密度的靶分子。
在一实施例中,包含本发明的ATC的免疫效应细胞可以用于治疗患有疾病复发的受试者,其中该受试者接受过包含CAR的免疫效应细胞(例如,T细胞),该CAR包含细胞内信号传导结构域,其包含含有共刺激性信号传导结构域(例如4-1BBz CAR)。在某些实施方式中,肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上具有低密度的肿瘤特异性抗原。在某些实施方式中,该疾病是GPC3阳性肿瘤、Claudin18.2阳性肿瘤。在一实施例中,肿瘤细胞在肿瘤细胞上具有低密度的GPC3。在一实施例中,肿瘤细胞在肿瘤细胞上具有低密度的Claudin18.2。这种方法包括施用有效量的本发明的免疫效应细胞或包含其的组合物(例如药物组合物)以达到期望的效果,缓解现有病症或预防复发。
“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。可以以一剂或多剂剂量将有效量施用于受试者。就治疗而言,有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展或以其它方式减少疾病病理后果的量。有效量通常由医师根据具体情况确定,并且在本领域技术人员的能力范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时,通常要考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的 严重程度以及所施用的免疫效应细胞的形式和有效浓度。
对于使用抗原特异性T细胞的过继免疫疗法,通常输注约10 6-10 10范围内的细胞剂量。在将本发明的工程化细胞施用于宿主并随后分化后,诱导特异性针对特定抗原的T细胞。工程化细胞可以通过本领域已知的任何方法施用,包括但不限于静脉内、皮下、结内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接向胸腺施用。
本发明提供用于治疗和/或预防受试者中的肿瘤的方法。该方法可以包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本发明的工程化或包含其的组合物。
肿瘤的非限制性实例包括血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤、喉癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。肿瘤的非限制性实例包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、成骨肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及其肝转移灶、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆小管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilms’肿瘤、睾丸肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、Waldenstrom’s巨球蛋白血症和重链疾病、诸如导管和小叶腺癌的乳腺肿瘤、子宫颈的鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移行鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节性和弥漫性)浆细胞瘤、急慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。在某些实施方式中,肿瘤选自血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤和喉癌。在一实施例中,本发明工程化细胞和包含其的组合物可以用于治疗和/或预防常规治疗措施不适合或复发难治性实体瘤,例如肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌。在一实施例中,肿瘤是血液肿瘤。
本发明工程化细胞治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用、或治疗目标包括降低或延迟复发风险。
本发明提供用于在例如免疫受损的受试者中治疗和/或预防病原体感染(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或原生动物感染)的方法。该方法可以包括向患有病原体感染的受试者施用有效量的本发明工程化细胞或包含其的组合物。易于治疗的示例 性病毒感染包括但不限于巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人免疫缺陷病毒和流感病毒感染。
术语“增强”指允许受试者或肿瘤细胞改善其响应本文公开的治疗的能力。例如,增强的应答可以包含应答性中5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%或更多的增加。如本文使用的,“增强”还可以指增加响应治疗例如免疫效应细胞疗法的受试者数目。例如,增强的应答可以指响应治疗的受试者总百分比,其中百分比是5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%更多。
在本发明实例中,免疫效应细胞靶向GPC3表达阳性的肿瘤。在本发明实例中,免疫效应细胞靶向Claudin18.2表达阳性的肿瘤。在具体的实施方式中,所述肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌。本领域技术人员知晓,有些肿瘤细胞,例如肝癌细胞对很多药物不敏感,因此,即便在体外有效的药物,有时候在体内的效果也不佳,甚至没有效果。因此,在优选的实施方式中,本文所述的GPC3表达阳性的肿瘤或GPC阳性肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、食道癌。因此,在优选的实施方式中,本文所述的Claudin18.2表达阳性的肿瘤或Claudin18.2阳性肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、胰腺癌、胆囊瘤、胆管癌。
9.试剂盒
本发明提供用于在受试者中诱导和/或增强免疫应答和/或治疗和/或预防肿瘤或病原体感染的试剂盒。在一实施例中,试剂盒包含有效量的本发明工程化细胞或包含其的药物组合物。在一实施例中,试剂盒包括无菌容器;这样的容器可以是盒子、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其它适合于容纳药物的材料制成。在一实施例中,试剂盒包括编码本发明的ATC的核酸分子,其以可表达的形式靶向目的抗原,可以任选地包含在一种或多种载体中。
在一实施例中,将本发明的工程化细胞和/或核酸分子,与将所述细胞或核酸分子施用于患有肿瘤或病原体或免疫疾病或有发展成肿瘤或病原体或免疫疾病的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括有关组合物用于治疗和/或预防肿瘤或病原体感染的信息。在一实施例中,说明书包括以下至少一项:治疗剂的描述;用于治疗或预防肿瘤、病原体感染或免疫疾病或其症状的剂量表和给药;注意事项;警告;适应症;不适应症;用药信息;不良反应;动物药理学;临床研究;和/或参考。这些说明书可以直接打印在容器上, 或者作为粘贴在容器上的标签,或者作为单独的纸页、小册子、卡片或文件夹提供在容器内或与容器一起。
本发明的优点:
本发明所述ATCT细胞在不降低体外杀伤能力的同时可减少细胞因子的分泌,同时具有更持久的存活能力、且具有更高的抗原敏感性。本发明涉及ATCT细胞的设计和构建方法(包括但不限于GPC3、Claudin18.2靶点)。本发明还涉及ATCT细胞体外功能性实验的研究和应用(包括但不限于GPC3、Claudin18.2靶点)。
本发明包括,例如中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、CN104140974A、CN108884459A、CN107893052A、CN108866003A、CN108853144A、CN109385403A、CN109385400A、CN109468279A、CN109503715A、CN109908176A、CN109880803A、CN110055275A、CN110123837A、CN110438082A、CN110468105A以及例如国际专利申请公开号WO2017186121A1、WO2018006882A1、WO2015172339A8、WO2018/018958A1、WO2014180306A1、WO2015197016A1、WO2016008405A1、WO2016086813A1、WO2016150400A1、WO2017032293A1、WO2017080377A1、WO2017186121A1、WO2018045811A1、WO2018108106A1、WO 2018/219299、WO2018/210279、WO2019/024933、WO2019/114751、WO2019/114762、WO2019/141270、WO2019/149279、WO2019/170147A1、WO 2019/210863、WO2019/219029中公开的那些CAR-T细胞及其制备方法、抗体。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文,其程度如同特别地且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入本文。
实施例1.T细胞内源性TCR敲除
在实施过程中,由于内源性TCR会竞争外源性抗体-T细胞受体嵌合物(ATC)的表达或引起错配,进而影响ATC在细胞表面的表达,因此本实施例利用CRISPR技术将内源性TCR进行敲除。示例性,针对TCRα链恒定区(TRAC)和β链恒定区(TRBC)的靶序列及其对应的引物序列如表2所示,针对TCRγ链恒定区(TRGC)和δ链恒定区(TRDC)的 靶序列及其对应的引物序列如表3所示;gRNA的合成使用GeneArt TMPrecision gRNA Synthesis Kit(Invitrogen),具体步骤参考其说明书。采用本领域常规分子生物学技术,通过电转将Cas 9酶、靶向TRAC的gRNA和靶向TRBC的gRNA共同电转至T细胞,最终成功获得了TCRα链和TCRβ链敲除的T细胞;通过电转将Cas 9酶、靶向TRGC的gRNA和靶向TRDC的gRNA共同电转至T细胞,最终成功获得了TCRγ链和TCRδ链敲除的T细胞。
表2内源性TCRα链和β链的gRNA及其引物序列
表3内源性TCRγ链和δ链的gRNA及其引物序列
实施例2.ATCT慢病毒载体构建
为了防止实施例1中对内源性TCR的敲除会影响到外源性ATC,因此本实施例对提供的ATC中TCR的恒定区进行了突变设计,保持对应的氨基酸不变但是碱基序列进行突变。示例性的,针对实施例1中的表2中所例举的gRNA所靶向的TCRα链恒定区和β链恒定区的序列进行突变设计,突变后序列如表4所示。示例性的,针对实施例1中的 表3中所例举的gRNA所靶向的TCRγ链恒定区和δ链恒定区的序列进行突变设计,突变后序列如表5所示。
表4外源性TCRα链和β链的恒定区突变位点(下划线标出)
位置 原序列 突变后序列
α链恒定区 TGTACCAGCTGAGAGACTCT TGTA TCAGCTGAG GGA TTC C
β链恒定区 AGATCGTCAGCGCCGAGGCC AGAT TGTC TCCGCCGA AGCC
表5外源性TCRγ链和δ链的恒定区突变位点(下划线标出)
位置 原序列 突变后序列
γ链恒定区 GCCTTCTGGAGCTTTGTTTC GCCTTCTG CAGCTT GGT CTC
δ链恒定区 CTGGGAGAGATGACAATAGC CTGGG TGAGAT CAC GAT GGC
本实施例以构建包括表4中TCRα链和β链恒定区突变序列的ATC、或构建包括表5中TCRγ链和δ链恒定区突变序列的ATC为例。示例性的,ATC含有两条链,链1包括识别靶抗原的抗体可变区VH或VL,与TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:7、8、10、12);链2包括识别靶抗原的抗体可变区VL或VH,与TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16、17);两条链基因序列通过连接肽(示例性的,F2A(SEQ ID NO:88)、P2A(SEQ ID NO:90)或连接肽1(SEQ ID NO:92)连接,构建于载体中。
示例性的,ATC含有两条链,链1包括识别靶抗原的抗体可变区VH或VL,与TCRγ突变恒定区(SEQ ID NO:21)串联;链2包括识别靶抗原的抗体可变区VL或VH,与TCRδ突变恒定区(SEQ ID NO:24)串联;两条链基因序列通过连接肽(示例性的,F2A(SEQ ID NO:88)、P2A(SEQ ID NO:90)或连接肽1(SEQ ID NO:92)连接,构建于载体中。
示例性的,ATC的可变区靶向结合肿瘤抗原GPC3,具体而言,可变区包括靶向人GPC3抗体的轻链可变区及重链可变区。ATC含有两条链,链1包括抗GPC3抗体可变区VH(SEQ ID NO:1、2),与TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:7)串联;链2包括抗GPC3抗体可变区VL(SEQ ID NO:3、4),与TCRβ突变恒定区(SEQ ID NO:16)串联;两条链基因序列通过连接肽F2A(SEQ ID NO:88)连接构建于pWPT慢病毒载体中,称为PWPT-ATC。
示例性的,ATC的可变区靶向结合肿瘤抗原Claudin18.2,具体而言,可变区包括靶向人Claudin18.2抗体的轻链可变区及重链可变区。ATC含有两条链,链1包括抗Claudin18.2抗体可变区VH(SEQ ID NO:84),与TCRα突变恒定区(SEQ ID NO:7)串联;链2包括抗Claudin18.2抗体可变区VL(SEQ ID NO:85),与TCRβ突变恒定 区(SEQ ID NO:16)串联;两条链基因序列通过连接肽F2A(SEQ ID NO:88)连接构建于pWPT慢病毒载体中。
慢病毒采用磷酸钙法进行包装,病毒上清用PEG8000/NaCl进行纯化,纯化后对病毒用流式细胞法进行滴度检测,即用稀释不同浓度(1:100、1:300、1:900、1:2700、1:8100)的病毒感染J.RT3-T3.5细胞(ATCC),65小时后取细胞用5ug/ml抗原(生物素化的人GPC3蛋白)4度孵育45分钟,二抗采用SA-PE荧光抗体(eBioscience)1:300稀释使用,4度孵育45分钟后用流式细胞仪检测。
结果如图1所示,ATC病毒滴度为1.9E+09。
实施例3.ATCT细胞构建及鉴定
对于GPC3,采用常规生物学手段从健康人供主的血液中分离制备T细胞。T细胞复苏激活24-48小时加入病毒(示例性的,PWPT-ATC)体积(mL)=细胞数x MOI值(MOI=20)/滴度,感染后24-96小时采用参照实施例1所述的CRISPR/Cas9技术用电转方法敲除TCRα链和β链,gRNA在TRAC上的靶序列如SEQ ID NO:25所示,gRNA在TRBC上的靶序列如SEQ ID NO:28所示。随后在T细胞激活后第5-8天检测ATC阳性率和TCR敲除效率。ATC阳性率检测试剂为5ug/ml生物素化的人GPC3蛋白,然后加入SA-PE荧光抗体(eBioscience)1:300稀释进行标记;敲除效率通过细胞表面CD3的表达反映,用Anti-CD3-APC(Invitrogen)进行标记;最后通过流式细胞仪检测。UT组为未感染病毒T细胞。UT ko为未转导ATC载体,但敲除了内源性TCRα链和β链的T细胞。
结果如图2所示,UT ko组TCR敲除效率达到94.6%;ATCT组ATC阳性率达到68.5%;ATCT未敲除内源性TCR(ATCT w/o ko)组,由于存在内源性TCR的错配,ATCT阳性率为15.0%。作为对照的CAR-T组为anti-GPC3-CAR T细胞(按照常规CAR-T细胞制备方法制备,CAR的序列参见SEQ ID NO:47),未敲除内源性TCR,其CAR阳性率为91.8%。
为了进一步证明在ATCT细胞中,ATC结构是否能与内源性CD3亚基整合表达于T细胞表面,形成完整的ATC/CD3复合体,我们采用免疫共沉淀方法进行了验证。收集慢病毒感染后的ATCT细胞,使用蛋白裂解液将细胞裂解后,采用生物素标记的GPC3抗原,链霉亲和素标记的磁珠将ATC及其结合蛋白免疫共沉淀后,进行蛋白质印迹实验,采用相应的抗体检测不同CD3亚基的表达。结果显示,ATC能与CD3ζ、CD3γ、CD3δ和CD3ε形成复合物。
另外,采用人Claudin18.2蛋白及相应对照进行了上述实验,获得了类似的结果。
实施例4.ATCT细胞对靶细胞的杀伤效果
对于GPC3,对实施例3构建的ATCT、CAR-T细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。
靶细胞:表达GPC3的肝癌细胞Huh7(中国科学院细胞库)、不表达GPC3的肝癌细胞SK-hep-1(ATCC)
效应细胞:参照实施例3制备的ATCT细胞、CAR-T细胞、UT细胞
首先将靶细胞分别用AIM-V培养基(AIM-V+2%ABS)调整密度至0.2x10 6/mL,96孔细胞培养板每孔加入10000个靶细胞,然后根据效靶比(E/T)3:1、1:1和1:3分别加入效应细胞,37度共孵育16小时后,取上清采用LDH试剂盒进行显色,最后用酶标仪进行OD490读数和数据分析。
结果如图3所示,ATCT组杀伤效果与CAR-T组较为一致:特异性杀伤表达GPC3的Huh7细胞,杀伤效率最高达到86.7%,且具有浓度依赖特性,而对无GPC3表达的SK-hep-1细胞则没有杀伤作用。
另外,采用表达或不表达Claudin18.2的靶细胞进行了上述实验,获得了类似的结果。
实施例5.ATCT细胞与靶细胞共孵育后IFN-γ分泌情况检测
对于GPC3,将实施例4中效应细胞与靶细胞共孵育16小时后的上清进行细胞因子IFN-γ检测。实验采用Biolegend的检测试剂盒,按照试剂盒说明书的步骤进行。
结果如图4显示,ATCT与CAR-T细胞与表达GPC3的肝癌细胞Huh7共孵育后,IFN-γ分泌明显上调,显著高于UT组。当E/T=1:1和1:3时,ATCT组分泌的IFN-γ低于CAR-T组;E/T=3:1时,ATCT组分泌的IFN-γ略高于CAR-T组。
此外,采用表达或不表达Claudin18.2的靶细胞进行了上述实验,获得了类似的结果。
实施例6.ATCT细胞与靶细胞共孵育后CD25和CD69表达情况
对于GPC3,效应细胞(参照实施例3制备的ATCT、CAR-T细胞、UT细胞)与靶细胞(Huh7、SK-hep-1)按照效靶比为3:1进行共孵育,共孵育16小时后取细胞进行流式检测。实验将细胞分两组分别加入CD69-PE/CD3-APC(Invitrogen)和CD25-APC/CD3-FITC(Invitrogen)进行孵育,4度孵育45分钟后用流式细胞仪检测。
结果如图5所示,相较于肿瘤抗原GPC3表达阴性的SK-hep-1细胞,ATCT细胞与肿瘤抗原GPC3表达阳性的Huh7细胞共孵育后,细胞表面CD25和CD69的表达水平有明显提高,且相较于CAR-T细胞偏移更加明显,表明ATCT细胞受肿瘤抗原刺激后细胞 激活水平更高。
另外,采用表达或不表达Claudin18.2的靶细胞进行了上述实验,获得了类似的结果。
实施例7.ATCT细胞分化情况检测
对于GPC3,实施例3制备的ATCT细胞、CAR-T细胞进行分化指标检测,细胞分成4组分别与GranB-488、CCR7-FITC、CD45RA-FITC、CD45RO-APC抗体(BD Biosciences)共孵育,4度孵育45分钟后用流式细胞仪检测。
结果如图6所示,CAR-T细胞低表达CCR7和CD45RA以及高表达CD45RO,表明CAR-T组较ATCT和UT组分化程度更高,而ATCT细胞分化程度相对较低,原始T细胞更多。
对于Clauding18.2,同样进行了上述实验,获得了类似的结果。
实施例8.ATCT细胞CD4/CD8分型检测
对于GPC3,实施例3制备的ATCT细胞、CAR-T细胞进行CD4/CD8分型检测,抗体CD4-PE/CD8-APC(BD Biosciences)与细胞4度共孵育45分钟后用流式细胞仪检测。
结果如图7所示,CAR-T组在病毒转导后一直保持较高比例的CD8+T细胞(大于85%);而ATCT组CD8+T细胞、CD4+T细胞变化趋势与UT组一致。这说明ATCT细胞表型与未转染T细胞更相似,更接近天然状态。
对于Clauding18.2,同样进行了上述实验,获得了类似的结果。
实施例9.ATCT细胞耗竭情况检测
对于GPC3,实施例3制备的细胞进行耗竭情况检测。细胞共分为三组,均先与抗原为5ug/ml生物素化的人GPC3蛋白共孵育,然后二抗均加入SA-APC-Cy7(BD Biosciences)进行阳性细胞检测,与二抗孵育的同时均加入CD4-BV510/CD8-APC(BD Biosciences)抗体进行共孵育,且与此同时三组细胞分别加入PD-1-BV421(BD Biosciences)、TIM-3-PE(BD Biosciences)和LAG-3-BV421(BD Biosciences)抗体在4度共孵育,45分钟后用流式细胞仪检测。
结果如图8所示,CAR-T细胞表面PD-1/TIM-3/LAG-3表达有明显提高,ATCT组与UT组相似且表达水平较低。结果表明ATCT细胞的耗竭程度要低于CAR-T组,与未转染T细胞更相似。
对于Clauding18.2,同样进行了上述实验,获得了类似的结果。
实施例10.ATCT细胞增殖情况检测
对于GPC3,分别取实施例3制备的1×10 6的CAR-T、ATCT、UT细胞在相同条件下培养(AIM-V+2%ABS+300U/ml IL-2),之后每两天进行一次计数,检测细胞扩增情况。
结果如图9所示,ATCT、CAR-T和UT组在T细胞活化10天后的细胞增殖情况相似,无明显区别。这说明ATCT细胞的体外增殖与未转染T细胞没有明显差异,接近天然状态。
对于Clauding18.2,同样进行了上述实验,获得了类似的结果。
本发明所述实施例包括将该实施例作为任何单一实施例或与任何其他实施例或其部分相结合。此外应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明进行各种改动或修改,这些经过改动或修改的等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列信息

Claims (40)

  1. 一种工程化细胞,其特征在于,所述工程化细胞表达T细胞受体(TCR)嵌合物(ATC),所述ATC包含:
    (a)识别抗原的抗原识别单元,和
    (b)核苷酸序列同义突变的TCR亚基恒定区;
    所述工程化细胞的内源性TCR亚基的表达、活性和/或信号传导被降低或抑制,而所述ATC的表达、活性和/或信号传导不被降低或抑制。
  2. 如权利要求1所述的工程化细胞,其特征在于,相对于野生型TRAC核酸分子、TRBC核酸分子、TRGC核酸分子和/或TRDC核酸分子,所述ATC的TCR亚基恒定区的核酸分子有同义突变。
  3. 如权利要求1或2所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC中的TCR亚基包括天然和/或修饰的TCRα链恒定区(TRAC)和β链恒定区(TRBC);或包括天然和/或修饰的TCRγ链恒定区(TRGC)和δ链恒定区(TRDC)。
  4. 如权利要求1-3任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC的抗原识别单元包括一种或两种抗体;或所述ATC的抗原识别单元包括抗体重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
  5. 如权利要求4所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC中的TRAC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRBC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRAC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRBC肽与VH直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRGC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRGC肽与VH直接连接或通过铰链区连接。
  6. 如权利要求1-5任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC与抗原结合后能激活与所述ATC缔合的CD3分子。
  7. 如权利要求1-6任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述内源性TCR表达被降低或抑制是通过使用基因敲除技术和/或基因沉默技术包括:TALE核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9、Argonaute、引导编辑技术、归巢核酸内切酶技术或其组合。
  8. 如权利要求1-7任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC不包含基因敲除技术和/或基因沉默技术所靶向的核酸序列。
  9. 如权利要求1-8任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC的核酸分子包含碱基同义突变后不再是基因敲除技术和/或基因沉默技术所针对的靶序列的核酸分子。
  10. 如权利要求1-9任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC不包括gRNA靶序列。
  11. 如权利要求10所述的工程化细胞,其特征在于,所述工程化细胞包含gRNA,序列分别如SEQ ID NO:25、28、33、34、35、36、37、38、39、40、41、44或其组合所示;或包含gRNA,序列分别如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:28所示;或包含gRNA,序列分别如SEQ ID NO:41和44所示。
  12. 如权利要求1-11任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述ATC包含SEQ ID NO:7、8、10或12所示的核苷酸序列,和SEQ ID NO:16或17所示的核苷酸序列;或所述ATC包含SEQ ID NO:5、9、11或13所示的氨基酸序列,和SEQ ID NO:14或18所示的氨基酸序列;或所述ATC包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列;或所述ATC包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
  13. 如权利要求1-12任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述工程化细胞选自T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、NK细胞、NKT细胞、人胚胎干细胞、和可从中分化出淋巴样细胞的多能干细胞。
  14. 如权利要求1-13任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述工程化细胞是自体或同种异体细胞。
  15. 如权利要求1-14任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述抗原为肿瘤抗原和/或病原体抗原;
    优选地,所述抗原为肿瘤抗原;
    优选地,所述抗原为实体瘤抗原;
    优选地,所述抗原为GPC3、EGFR、Claudin18.2、BCMA、间皮素、CD19。
  16. 如权利要求1-15任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述抗原识别单元包含识别GPC3的抗原识别单元的氨基酸序列的VL选自SEQ ID NO:3、49、51、53、55、57、59、61、63或65或与之具有70-100%的序列同一性,和/或识别GPC3的抗原识别单元的氨基酸序列的VH选自SEQ ID NO:1、48、50、52、54、56、58、60、62或64或与之具有70-100%的序列同一性,或者,
    识别Claudin18.2的抗原识别单元的氨基酸序列的VL选自SEQ ID NO:67、69、71、73、75、77、79、81、83或85或与之具有70-100%的序列同一性,和/或识别Claudin18.2的抗原识别单元的氨基酸序列的VH选自SEQ ID NO:66、68、70、72、74、76、78、80、82或84或与之具有70-100%的序列同一性。
  17. 如权利要求1-16任一所述的工程化细胞,其特征在于,所述工程化细胞具有以下特点之一或其组合:
    1)能杀伤携带所述抗原的靶细胞;
    2)与所述靶细胞孵育后分泌IFN;
    3)与所述靶细胞孵育后CD25、CD69阳性率提高;
    4)CD4+、CD8+阳性率与未转导编码ATC的多核苷酸片段的细胞接近;
    5)原始T细胞比例大;和/或
    6)PD-1/TIM-3/LAG-3阳性率与未转导编码ATC的多核苷酸片段的细胞接近。
  18. 如权利要求1-17任一所述的工程化细胞,其特征在于,与表达相同抗原识别单元的嵌合抗原受体的CAR的细胞相比,所述工程化细胞具有以下之一或其组合:
    1)对靶细胞的杀伤能力、和/或与靶细胞孵育后分泌IFN-γ、细胞增殖没有显著差异;与靶细胞孵育后CD25、CD69表达水平高;
    2)原始T细胞比例大;
    3)CD4+/CD8+比例高;
    4)PD-1/TIM-3/LAG-3阳性率低。
  19. 如权利要求1-18任一所述的工程化细胞,其特征在于,与表达相同ATC但内源性TCR亚基的表达、活性和/或信号传导没有被降低或抑制的细胞相比,所述工程化细胞ATC阳性率提高或提高约5%、10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%。
  20. 如权利要求1-19任一所述工程化细胞中的ATC分子。
  21. 一种多核苷酸,其编码权利要求1-19任一所述的工程化细胞中的ATC或gRNA分子。
  22. 一种载体,其包含权利要求21所述的多核苷酸。
  23. 一种药物组合物,其包含有效量的权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求20所述的ATC分子、权利要求21所述的多核苷酸或者权利要求22所述的载体和药学上可接受的赋形剂。
  24. 如权利要求23所述的药物组合物,其用于治疗肿瘤。
  25. 一种试剂盒,其包含权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求20所述的ATC分子、权利要求21所述的多核苷酸、权利要求22所述的载体或者权利要求23或24所述的药物组合物。
  26. 如权利要求25所述的试剂盒,其还包括用于治疗和/或预防肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的书面说明书。
  27. 一种降低受试者肿瘤负荷的方法,其特征在于,包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求23或24所述的药物组合物。
  28. 一种治疗或预防受试者肿瘤的方法,其特征在于,包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求23或24所述的药物组合物。
  29. 如权利要求27或28所述的方法,其特征在于,所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、血液肿瘤。
  30. 如权利要求27、28或29所述的方法,其特征在于,所述肿瘤是GPC3阳性肿瘤、或Claudin18.2阳性肿瘤。
  31. 一种产生抗原特异性免疫效应细胞的方法,其特征在于,包括将编码权利要求20所述的ATC分子的多核苷酸、或将权利要求21所述的多核苷酸、或将权利要求22所述的载体导入免疫效应细胞。
  32. 一种延长患有肿瘤的受试者存活的方法,其特征在,包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求23或24所述的药物组合物。
  33. 权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求20所述的ATC分子、权利要求21所述的多核苷酸、权利要求22所述的载体、权利要求23或24所述的药物组合物在治疗中的用途。
  34. 权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求20所述的ATC分子、权利要求21所述的多核苷酸、权利要求22所述的载体、权利要求23或24所述的药物组合物用于减轻受试者的肿瘤负荷的用途。
  35. 权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求20所述的ATC分子、权利要求21所述的多核苷酸、权利要求22所述的载体、权利要求23或24所述的药物组合物用于治疗或预防受试者肿瘤的用途。
  36. 权利要求1-19任一所述的工程化细胞、权利要求20所述的ATC分子、权利要求21所述的多核苷酸、权利要求22所述的载体、权利要求23或24所述的药物组合物用于延长患有肿瘤的受试者存活的用途。
  37. 靶向GPC3的ATC,其特征在于,所述ATC包含识别GPC3的抗原识别单元和TRAC形成的多肽,和识别GPC3的抗原识别单元和TRBC形成的多肽;或所述ATC包含识别GPC3的抗原识别单元和TRDC形成的多肽,和识别GPC3的抗原识别单元和TRGC形成的多肽。
  38. 如权利要求37所述的ATC,其特征在于,所述识别GPC3的抗原识别单元包括抗GPC3抗体的抗体重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL):
    所述TRAC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRBC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述TRAC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRBC肽与VH直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRGC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRGC肽与VH直接连接或通过铰链区连接。
  39. 靶向Claudin18.2的ATC,其特征在于,所述ATC包含识别Claudin18.2的抗原识别 单元和TRAC形成的多肽,和识别Claudin18.2的抗原识别单元和TRBC形成的多肽;或所述ATC包含识别Claudin18.2的抗原识别单元和TRDC形成的多肽,和识别Claudin18.2的抗原识别单元和TRGC形成的多肽。
  40. 如权利要求39所述的ATC,其特征在于,所述识别Claudin18.2的抗原识别单元包括抗Claudin18.2抗体的抗体重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL):
    所述TRAC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRBC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述TRAC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRBC肽与VH直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VH直接连接或通过铰链区连接、TRGC肽与VL直接连接或通过铰链区连接;或所述ATC中的TRDC肽与VL直接连接或通过铰链区连接、所述TRGC肽与VH直接连接或通过铰链区连接。
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