CN116490518A - 用于重定向免疫抑制信号传导的嵌合MyD88受体及相关组合物和方法 - Google Patents

用于重定向免疫抑制信号传导的嵌合MyD88受体及相关组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开文本在一些方面涉及嵌合信号传导受体，所述嵌合信号传导受体包含能够结合分子如免疫抑制细胞因子的细胞外结构域和能够参与信号传导途径以激活免疫细胞的含MyD88的细胞内结构域。在一些方面，本公开文本还涉及工程化细胞如T细胞和包含所述嵌合信号传导受体或工程化细胞的组合物及其方法和用途。在一些实施方案中，所述细胞可以进一步表达针对抗原的基因工程化重组抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)，并且在一些情况下分泌重组分子，例如双特异性抗体。

Description

用于重定向免疫抑制信号传导的嵌合MyD88受体及相关组合 物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月17日提交的标题为“用于重定向免疫抑制信号传导的嵌合MYD88受体及相关组合物和方法(CHIMERIC MYD88 RECEPTORS FOR REDIRECTINGIMMUNOSUPPRESSIVESIGNALING AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS)”的美国临时申请号63/053,529的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子形式的序列表一起提交的。序列表以2021年7月10日创建的名为165282000140SeqList.txt的文件提供，其大小为228,223字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本在一些方面涉及嵌合信号传导受体，所述嵌合信号传导受体包含能够结合分子如免疫抑制细胞因子的细胞外结构域和能够参与信号传导途径以激活免疫细胞的含MyD88的细胞内结构域。在一些方面，本公开文本还涉及工程化细胞如T细胞和包含嵌合信号传导受体或工程化细胞的组合物及其方法和用途。在一些实施方案中，所述细胞可以进一步表达针对抗原的基因工程化重组抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)，或者在一些情况下分泌重组分子，例如双特异性抗体。
背景技术
用于治疗疾病或病症(如癌症或肿瘤)的细胞治疗策略包括工程化免疫细胞以表达基因工程化重组抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR))以及向受试者施用含有此类细胞的组合物。需要改进的策略来增加治疗的功效，例如，通过阻止和/或逆转肿瘤微环境中细胞因子信号传导的免疫抑制效应，以改善工程化细胞的持久性、存活和细胞毒性。提供了满足此类需求的组合物、细胞和方法。
发明内容
本文提供了嵌合信号传导受体构建体，其能够通过响应免疫抑制细胞因子诱导阳性信号和T细胞激活来重定向免疫抑制信号。在提供的方面，所述免疫抑制细胞因子是TGFβ，并且嵌合信号传导受体含有TGFβ受体(TGFβR)的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分，以及用于在TGFβ结合嵌合信号传导受体的细胞外结构域时介导细胞中的阳性信号的一个或多个MyD88信号传导结构域。因此，即使当细胞存在于免疫抑制环境如TME中时，所提供的嵌合信号传导受体也可以向T细胞提供阳性信号，从而改善T细胞活性、增殖、持久性或存活。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合受体信号传导受体含有：(a)TGFβ受体(TGFβR)的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分；(b)跨膜结构域；(c)第一截短的MyD88多肽，其缺乏全长MyD88的全长TIR结构域；和(d)第二截短的MyD88结构域，其缺乏全长MyD88的全长TIR结构域。在一些实施方案中，所述TGFβR是TGFβR2。
在一些实施方案中，所述细胞外结构域或其部分含有：(i)SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO:20中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)结合TGFβ的(i)或(ii)的一部分。在一些实施方案中，所述细胞外结构域或其部分如SEQ ID NO:20中所示。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域含有TGFβR的天然跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域含有SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述跨膜结构域如SEQ ID NO:22中所示。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域是来自除所述TGFβR以外的跨膜蛋白的异源跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域和所述第一截短的MyD88多肽直接连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域和所述第一截短的MyD88多肽通过接头间接连接。在一些实施方案中，所述接头是或包含肽接头。在一些实施方案中，所述接头是或含有TGFβR的细胞质结构域的N末端连续氨基酸的部分序列，其为非功能性部分，其中所述非功能性部分不是能够介导抑制性信号传导的功能性抑制性信号传导结构域。在一些实施方案中，用作所述跨膜结构域与所述第一截短的MyD88多肽之间的接头的细胞内(或细胞质)结构域不能募集抑制性衔接分子。在一些实施方案中，用作所述跨膜结构域与所述第一截短的MyD88多肽之间的接头的细胞内(或细胞质)结构域不能募集SMAD。在一些实施方案中，所述接头是SEQID NO:129中所示的TGFβR2细胞质结构域的氨基酸1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24或1-25。在一些实施方案中，所述接头如SEQ ID NO:24中所示。
本文提供嵌合信号传导受体，所述嵌合信号传导受体含有(i)TGFβ受体(TGFβR)的一部分，其含有TGFβR的细胞外结构域和跨膜结构域，其中所述部分小于全长TGFβR并且缺乏全长TGFβR的功能性抑制性信号传导结构域；和(ii)细胞内结构域，其含有缺乏全长MyD88的全长TIR结构域的第一截短的MyD88多肽以及缺乏全长MyD88的全长TIR结构域的第二截短的MyD88结构域。在一些实施方案中，所述TGFβR是TGFβR2。在一些实施方案中，所述TGFβR的所述部分含有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述TGFβR的所述部分如SEQ ID NO:3中所示。在一些实施方案中，所述TGFβR的所述部分与所述细胞内结构域直接连接。在一些实施方案中，所述TGFβR的所述部分与细胞内结构域通过肽接头间接连接。在一些实施方案中，所述第一截短的MyD88多肽和所述第二MyD88多肽各自含有MyD88的死亡结构域(DD)、中间结构域(ID)和全长TIR结构域的一部分。
在一些实施方案中，所述第一截短的MyD88多肽和所述第二MyD88多肽各自独立地是选自以下的氨基酸序列：所述全长MyD88的氨基酸2-155、2-156、2-157、2-158、2-159、2-160、2-161、2-162、2-163、2-164、2-165、2-166、2-167、2-168、2-169、2-170、2-171、2-172、2-173、2-174、2-175、2-176、2-177、2-178、2-179或2-180。在一些实施方案中，所述第一截短的MyD88多肽和所述第二MyD88多肽各自独立地是SEQ ID NO:128中所示的序列。在一些实施方案中，所述第一截短的MyD88多肽和所述第二截短的多肽各自独立地是全长MyD88(任选地SEQ ID NO:128)的氨基酸2-171或2-172的序列。在一些实施方案中，所述第一截短的MyD88多肽如SEQ ID NO:2中所示。在一些实施方案中，所述第二截短的MyD88多肽如SEQID NO:2中所示。在一些实施方案中，所述第一截短的MyD88多肽和所述第二截短的MyD88多肽是相同的。
在一些实施方案中，所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽通过肽接头连接。在一些实施方案中，所述肽接头是(G4S)n(SEQ ID NO:47)，其中n是1至4(含)的整数。在一些实施方案中，所述肽接头如SEQ ID NO:47((GGGGS)n)中所示，其中n是1至4(含)的整数，任选地其中肽接头选自SEQ ID NO:48(GGGGS)、SEQ ID NO:85(GGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:49(GGGGSGGGGSGGGGS)和SEQ ID NO:50(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。在一些实施方案中，所述肽接头选自SEQ ID NO:48(GGGGS)、SEQ ID NO:85(GGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:49(GGGGSGGGGSGGGGS)和SEQ ID NO:50(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。
在一些实施方案中，所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:93中所示或者是与SEQID NO:93中所示序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:93中所示。在一些实施方案中，所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:94中所示或者是与SEQ ID NO:94中所示序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:94中所示。
在一些实施方案中，当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合诱导所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽的二聚化。在一些实施方案中，当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合将IRAK4募集到所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽。在一些实施方案中，当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合导致IRAK4的磷酸化。
本文提供了含有编码本文提供的嵌合信号传导受体的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述编码嵌合信号传导受体的核苷酸序列是第一核苷酸序列，并且所述多核苷酸还包含编码重组分子的第二核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述重组分子是重组抗原受体。在一些实施方案中，所述编码嵌合信号传导受体的核苷酸序列是第一核苷酸序列，并且所述多核苷酸还包含编码重组抗原受体的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是CAR。在一些实施方案中，所述重组抗原受体结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是B7H3。
在一些实施方案中，所述重组分子是可分泌分子，如双特异性抗体(例如BiTE)或细胞因子。在一些实施方案中，所述编码嵌合信号传导受体的核苷酸序列是第一核苷酸序列，并且所述多核苷酸还包含编码重组可分泌分子的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组可分泌分子是双特异性抗体，如双特异性T细胞衔接器(BiTE)。在一些实施方案中，所述重组可分泌分子是重组细胞因子(例如IL-15或IL-12)。
在一些实施方案中，编码嵌合信号传导受体的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列被双顺反子元件隔开。在一些实施方案中，所述双顺反子元件是IRES或可切割肽。在一些实施方案中，所述可切割肽选自P2A、T2A和F2A。在一些实施方案中，所述可切割肽是T2A。在一些实施方案中，一个或多个所述核苷酸序列(例如所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列)可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列各自可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子是相同的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是EF1启动子。
本文还提供了含有本文提供的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。
本文提供了产生工程化细胞的方法，所述方法包括在用于在细胞的表面表达所述嵌合信号传导受体的条件下将本文提供的多核苷酸或本文提供的载体引入所述细胞中。
在一些实施方案中，所述方法还包括在用于在细胞的表面表达重组抗原受体的条件下将编码所述重组抗原受体的多核苷酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是CAR。在一些实施方案中，所述重组抗原受体结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是B7H3。
在一些实施方案中，所述方法还包括在用于重组分子表达和分泌的条件下将编码可分泌的重组分子(如双特异性抗体(例如BiTE)或细胞因子)的多核苷酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括在用于由所述细胞表达以及在一些情况下由所述细胞分泌双特异性抗体(例如BiTE)的条件下将编码所述双特异性抗体(如BiTE)的多核苷酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括在用于由所述细胞表达以及在一些情况下由所述细胞分泌所述细胞因子(例如IL-15或IL-12)的条件下将编码重组细胞因子的多核苷酸引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括在用于在细胞表面表达重组抗原受体的条件下将编码所述重组抗原受体的多核苷酸引入所述细胞中，以及在用于由所述细胞表达以及在一些情况下由所述细胞分泌细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE)的条件下将编码可分泌的重组分子(如所述细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE))的多核苷酸引入所述细胞中。双特异性抗体(如BiTE)的例子包括本文所述的任一种。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是结合CD3和GD2的BiTE(抗CD3和抗GD2)。
在一些实施方案中，所述细胞是来自受试者的原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞、肿瘤浸润细胞(TIL)、B细胞、自然杀伤细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞，任选地CD3+、CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD4+T细胞。
本文提供了通过本文提供的方法产生的工程化细胞。
本文提供了含有本文提供的嵌合信号传导受体的工程化细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞还包含重组抗原受体。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组抗原受体结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是B7H3。在一些实施方案中，所述工程化细胞还包含可分泌的重组分子，如细胞因子(例如IL-15或IL-12)或双特异性抗体(例如BiTE)。在一些实施方案中，所述工程化细胞还包含可分泌的重组分子(如细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE))和重组抗原受体。
本文提供了含有本文提供的多核苷酸的工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞还含有编码重组抗原受体的多核苷酸。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是CAR。在一些实施方案中，所述重组抗原受体结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是B7H3。在一些实施方案中，所述工程化细胞还包含编码可分泌的重组分子(如细胞因子(例如IL-15或IL-12)或双特异性抗体(例如BiTE))的多核苷酸。在一些实施方案中，所述工程化细胞还包含编码可分泌的重组分子(如细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE))的多核苷酸和编码重组抗原受体的多核苷酸。所述多核苷酸可以作为单个核酸分子表达，例如各自被双顺反子元件或可切割接头(例如T2A、PTA或F2A)隔开。双特异性抗体(如BiTE)的例子包括本文所述的任一种。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是结合CD3和GD2的BiTE(抗CD3和抗GD2)。
在一些实施方案中，所述工程化细胞是来自受试者的原代细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是T细胞，任选地CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是CD4+T细胞。
本文提供了含有本文提供的工程化细胞的药物组合物。例如，在一些实施方案中，所述药物组合物含有多个所述工程化细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的。
本文提供了治疗方法，所述治疗方法包括向患有癌症的受试者施用本文提供的工程化细胞或含有本文提供的工程化细胞的药物组合物。所述工程化细胞表达所提供的嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，所述工程化细胞另外含有靶向所述癌症的抗原的抗原受体。在一些实施方案中，所述工程化细胞表达含有抗原结合结构域的重组抗原受体，所述抗原结合结构域结合与所述癌症相关的肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述癌症的细胞表达所述肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述工程化细胞另外表达并且在一些情况下能够分泌可分泌的重组分子，如细胞因子(例如IL-15或IL-12)或双特异性抗体(例如BiTE)。
本文还提供了任何所提供的含有一种或多种工程化细胞的药物组合物在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途。本文还提供了用于治疗患有癌症的受试者的任何所提供的含有一种或多种工程化细胞的药物组合物。所述工程化细胞表达所提供的嵌合信号传导受体。在任何实施方案的一些中，所述药物组合物的工程化细胞还可以包含靶向所述癌症的抗原的抗原受体。在一些实施方案中，所述工程化细胞表达包含抗原结合结构域的重组抗原受体，所述抗原结合结构域结合与所述癌症相关的肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述工程化细胞另外表达并且在一些情况下能够分泌可分泌的重组分子，如细胞因子(例如IL-15或IL-12)或双特异性抗体(例如BiTE)。
在一些实施方案中，所述重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述重组抗原受体是CAR。
在一些实施方案中，所述癌症是血液癌症或实体瘤。
在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是B7H3。在一些实施方案中，所述癌症是前列腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、尿道上皮癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、肾母细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌或神经母细胞瘤。
在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19。在一些实施方案中，所述癌症是B细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是转移性淋巴瘤。
附图说明
图1A-图1C显示了描绘天然TGFβ信号传导途径(图1A)、天然Toll样受体信号传导途径(图1B)和嵌合TGFβ信号传导受体途径(图1C)的图。
图2显示了示例性嵌合TGFβ信号传导受体构建体和示例性对照嵌合信号传导受体构建体。
图3A显示了与未转导的(UT)Jurkat细胞相比，转导的Jurkat细胞中示例性嵌合TGFβ信号传导受体构建体的表达水平，如使用流式细胞术检测myc标签所测定的。图3B显示了Jurkat细胞中示例性CAR和示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C(SEQ ID NO:30)的流式细胞术分析。图3C和图3D分别显示了示例性CAR和示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C在原代人T细胞中的表达。
图4A和图4B显示了在未转导的(UT)Jurkat细胞和用示例性嵌合TGFβ信号传导受体NULL-MYD88、TGFBR2-DNR转导的Jurkat细胞中，在与不同量的TGFβ孵育2小时后，使用蛋白质印迹分析所测的磷酸-IRAK4(pIRAK4)、磷酸-SMAD2(pSMAD2)、SMAD2(总蛋白)和肌动蛋白对照的蛋白质表达。
图5A显示了如下T细胞的CFDA增殖测定：用示例性嵌合TGFβ信号传导受体(CTSR-2C；SEQ ID NO:30)和示例性CAR(CTSR-2C+CAR)或单独示例性CAR(CAR)工程化并且在暴露于靶细胞(效应物:靶标比率1:1)6天后与各种浓度(1、5、10和20ng/ml)的TGFβ一起孵育的T细胞。
图5B显示了未转导的细胞(UT)、表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体(SEQ ID NO:30)和CAR(CTSR-2C+CAR)的细胞以及表达单独CAR(CAR)的细胞的增殖活性，如通过CFDA增殖测定所测定的。
图6A和图6B显示了分别在存在10和50ng/mL TGFβ的情况下，用示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR或单独CAR转导的细胞和未转导的对照(UT)的T细胞计数随时间的倍数变化。
图7显示了在具有不同效应物与靶标比率(E:T)和TGFβ浓度的培养条件下，用示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR或单独CAR转导的T细胞的细胞杀伤动力学。
图8显示了使用活细胞成像在具有不同E:T比率和TGFβ浓度的培养条件下，用示例性嵌合TGFβ信号传导受体(SEQ ID NO:30)和CAR转导的T细胞的细胞毒性动力学。
图9A(CTSR-2C(SEQ ID NO:30)+CAR)和图9B(仅CAR)显示不同E:T比率和TGFβ浓度下的归一化细胞计数。
图10A和图10B分别显示了响应于用未转导的细胞(UT)、单独的CAR、单独的CTSR-2C或CAR与CTSR-2C的组合(CTSR-2C+CAR)的治疗，人神经母细胞瘤肿瘤模型和胰腺肿瘤模型在8周内原位生长的生物发光(左-CFPAC细胞系，右-CF10.05细胞系)。星号表示安乐死的动物(n＝3)。
图11A和图11B分别显示了接受表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体(SEQ ID NO:30)和CAR(CTSR-2C+CAR)的细胞、表达单独CAR的细胞或未转导的细胞(UT)治疗的荷瘤小鼠和非荷瘤(NT)小鼠(注射盐水)的外周血计数(计数/mm3血液)中CAR+和CD3 T细胞的存在的中值和箱形图总结数据。
图12A-图12C显示了肿瘤接种后不同时间的转移性神经母细胞瘤肿瘤生长的生物发光图像(上图)，以及在对神经母细胞瘤特异性标记物PHOX2b(棕色染色)和人CD3(红色染色)染色后在治疗注射后7天从小鼠获得的肝组织的免疫组织化学分析的代表性图像(下图)。
图13显示了包含示例性嵌合TGFβ信号传导受体和示例性CAR的示例性双顺反子多核苷酸构建体。
图14显示了用双顺反子多核苷酸转导的T细胞的流式细胞术分析的代表性点图，其中示例性嵌合TGFβ信号传导受体通过myc标签来检测，并且CAR通过蛋白L来检测。
图15显示了在与0、1、5、10和50ng TGFβ孵育2小时后，用双顺反子多核苷酸或对照多核苷酸转导的Jurkat细胞中使用蛋白质印迹分析磷酸-IRAK4(pIRAK4)、磷酸-SMAD2(pSMAD2)和β肌动蛋白(负载对照)的蛋白质表达。
图16A显示了在不同效应物与靶标比率(E:T为20、10、5和2)下，用示例性双顺反子多核苷酸、示例性嵌合TGFβ信号传导受体或单独CAR转导的T细胞对CD19+肿瘤细胞的细胞毒性效应的动力学。
图16B显示了在存在或不存在TGFβ(10ng/mL)的情况下，用示例性双顺反子多核苷酸、示例性嵌合TGFβ信号传导受体或单独CAR转导的T细胞对CD19+肿瘤细胞的细胞毒性效应的动力学。
图17显示了指定治疗组在8周内肿瘤(淋巴瘤)生长的生物发光图像。
图18显示了在存在或不存在TGFβ(10ng/mL)的情况下，暴露于靶细胞(效应物:靶标比率1:1)72小时后，与用单独CAR转导的T细胞或用CAR和TGFβR2-41bb构建体转导的T细胞相比，转导的T细胞中表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体构建体和CAR的1、2或3种耗竭标记物(PD1、TIM3和LAG3)的细胞的百分比，如通过流式细胞术测定。
图19显示了如下处理的T细胞的T细胞计数随时间的倍数变化：将用示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR、TGBFR2-DNR CAR、TGFBR2-41BB CAR、TGFBR2-DAP12CAR或单独CAR转导的T细胞暴露于靶细胞(效应物:靶标比率1:1)7天，然后在存在或不存在10ng TGFβ(每48小时添加)的情况下每天进行IL2处理(30U/ml)，持续3周。
图20A和图20B显示了如下处理的T细胞的细胞杀伤动力学：在存在或不存在10ng/ml TGFβ(每48小时添加)的情况下，将用示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR、TGBFR2-DNRCAR、TGFBR2-41BB CAR、TGFBR2-DAP12 CAR或CAR转导的T细胞与靶细胞(效应物:靶标比率1:1)培养1周。图20B显示了如下处理的T细胞的杀伤活性：将在图20A的实验结束后获得的T细胞与新鲜靶细胞(效应物:靶标比率1:1)再培养一周。
具体实施方式
本文提供了嵌合信号传导受体，其含有能够结合存在于细胞外环境中的免疫抑制分子(例如免疫抑制细胞因子)的细胞外结构域和参与免疫细胞内信号传导的含有MyD88的细胞内结构域。在一些情况下，免疫抑制分子是存在于肿瘤微环境(TME)的细胞外环境中的可溶性分子。表达所提供的嵌合信号传导受体的工程化细胞可用于过继细胞疗法的方法中，以重定向免疫抑制信号并改善细胞疗法的反应。
TME含有许多能够促进肿瘤生长和肿瘤血管生成的信号传导分子。TME中的一些信号传导分子也用以抑制免疫应答，从而促进肿瘤细胞的存活。免疫抑制或抗炎细胞因子的非限制性例子包括转化生长因子-β(TGFβ)、白介素10(IL10)、白介素4(IL4)和白介素1受体拮抗剂(IL1Ra)。免疫抑制或抗炎细胞因子可由TME的细胞或其周围的细胞分泌，其中它们可用于例如抑制对患病细胞或癌细胞的炎性应答。
例如，在TME中发现的转化生长因子β(TGFβ)由癌细胞和周围基质细胞(例如成纤维细胞)分泌，导致例如癌细胞增殖和血管生成。TGFβ与免疫细胞(例如T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞)上的其同源结合配偶体TGFβ受体(例如TGFβR2)的结合参与导致细胞抑制(例如T细胞抑制)的信号传导途径(例如SMAD途径)。肿瘤TME中的TGFβ因此具有免疫抑制性，允许癌细胞逃避细胞毒性炎性应答(图1A)。
为了避免TME中某些免疫抑制细胞因子如TGFβ、IL10、IL4、IL1Ra的免疫抑制作用，本文提供的嵌合信号传导受体被工程化以含有识别免疫抑制细胞因子的细胞外结合结构域和具有MyD88结构域的细胞内结构域。在表达嵌合信号传导受体的细胞中，免疫抑制细胞因子与嵌合信号传导受体的结合逆转了免疫抑制细胞因子的T细胞抑制活性，反而介导T细胞激活。因此，即使当细胞存在于免疫抑制环境如TME中时，所提供的嵌合信号传导受体也可以向T细胞提供阳性信号，从而改善T细胞活性、增殖、持久性或存活。
MyD88是一种衔接子信号传导分子，其提供阳性细胞信号传导以促进免疫细胞(例如，T细胞)激活，并且通常参与Toll样受体(TLR)信号传导途径(参见图1B)。MyD88在白介素-1受体(IL-1R)或Toll样受体(TLR)与其配体连接后参与介导NF-κB和丝裂原激活的蛋白激酶信号传导级联的激活。如图1B所示，通常，配体与IL-1R或TLR受体结合促进受体寡聚化，导致经由TIR结构域募集MyD88和Myd88二聚化。MyD88然后募集白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)，导致IRAK4二聚化和反式自磷酸化，以启动下游信号传导级联，导致转录因子(如NF-κB)的激活、炎性细胞因子的产生和TH1应答的产生。
MyD88(例如，UniProt登录号Q99836；SEQ ID NO:128中所示)含有N末端死亡结构域(DD，例如氨基酸19-109)、中间结构域(ID；例如氨基酸110-155)和COOH末端Toll/IL-1受体(TIR)结构域(例如氨基酸159-296)，其参与与受体TIR结构域的相互作用和与IRAK4的相互作用。研究已经表明，DD和ID中的残基参与MyD88的二聚化和IRAK4的募集(Burns等人2003,J.Exp.Med.,197:263-268)。TIR结构域中的残基的一部分(例如，在前17个氨基酸内或包括前17个氨基酸)也可参与IRAK 4募集，而不需要存在完整TIR结构域(Burns等人2003)。应当理解，对氨基酸的提及，包括对用于描述结构域组织(例如MyD88多肽或含有其的嵌合信号传导受体的结构域组织)的SEQ ID NO所示的特定序列的提及是为了说明的目的，并不意味着限制所提供的实施方案的范围。应理解，多肽和其结构域的描述是在理论上基于与相似分子的同源性分析和比对而导出的。因此，确切基因座可变，并且每一蛋白质不一定相同。因此，MyD88的特定结构域如特定DD结构域、ID结构域或TIR结构域可以更长或更短，相差若干个氨基酸(例如一个、两个、三个或四个)。
在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的细胞内结构域(本文也称为细胞质结构域)含有一个或多个(例如两个)MyD88多肽。所述一个或多个(例如两个)MyD88多肽中的每一个可以是全长MyD88或MyD88的截短部分，其能够二聚化，募集IRAK-4和/或促进IRAK4的磷酸化(例如激活)，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被免疫抑制细胞因子接合时。因此，对“截短的MyD88”或“MyD88的截短部分”或其变体的提及是指MyD88不是全长的并且可能缺乏结构域或结构域的一部分，但是保留或展现出全长MyD88二聚化、募集IRAK-4和/或促进IRAK4的磷酸化(例如激活)的一种或多种活性，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被配体例如免疫抑制细胞因子接合时。在一些实施方案中，MyD88的截短部分是二聚化、募集IRAK4和/或促进IRAK4的磷酸化所需的MyD88多肽的最小部分，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被免疫抑制细胞因子接合时。在一些实施方案中，截短部分包含DD、ID，并且在一些情况下，缺乏全长TIR结构域。在一些实施方案中，截短部分含有DD、ID并含有TIR结构域的一部分，所述部分缺少TIR结构域中多达140个连续的C末端氨基酸残基，例如TIR结构域的124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140个连续的C末端氨基酸残基。应当理解，除非另有说明，否则本文所用的术语MyD88多肽包括MyD88多肽的全长和截短部分。
在一些实施方案中，包含在细胞内信号传导结构域中的一个或多个(例如两个)MyD88多肽是全长MyD88多肽。在一些实施方案中，包含在细胞内信号传导结构域中的一个或多个(例如两个)MyD88多肽是足以二聚化、募集IRAK-4和/或介导IRAK-4磷酸化的MyD88的截短部分，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被免疫抑制细胞因子接合时。在表达嵌合信号传导受体的细胞中，免疫抑制细胞因子与嵌合信号传导受体的结合能够促进MyD88二聚化和/或IRAK-4的募集，导致IRAK-4磷酸化和下游信号传导级联(图1C)。MyD88多肽介导或促进IRAK4磷酸化的能力触发IRAK4激活以引发导致免疫细胞(例如T细胞)激活的信号传导级联。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内结构域是或包含MyD88多肽。在一些情况下，细胞内结构域含有至少一个，通常两个MyD88多肽。在一些实施方案中，细胞内结构域含有至少一个MyD88多肽。在一些实施方案中，细胞内结构域含有两个MyD88多肽。在特定的实施方案中，存在于细胞内结构域中的两个MyD88多肽是相同的。在一些实施方案中，两个MyD88多肽中的每一个都是全长MyD88。在一些实施方案中，两个MyD88多肽中的每一个是能够二聚化、募集IRAK-4和/或介导IRAK-4磷酸化的MyD88截短部分，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被免疫抑制细胞因子接合时。在一些实施方案中，例如当存在两个MyD88多肽时，MyD88多肽直接或间接连接，例如通过接头。在一些实施方案中，当存在两个MyD88多肽时，MyD88多肽通过接头连接。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO:47)，其中n是1至4(含)的整数。在一些实施方案中，接头是GGGGS(SEQ ID NO:48)。
所提供的嵌合信号传导受体的细胞外结构域与已知在TME中普遍存在并引起免疫抑制的分子如细胞因子结合，并通过跨膜结构域与含一个或多个(例如两个)MyD88的细胞内结构域连接(直接连接或通过接头间接连接)。细胞外结构域在本文中也可以被可替代地称为细胞外结构域。在一些实施方案中，细胞外结构域结合的细胞因子是免疫抑制或抗炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是免疫抑制剂。在一些实施方案中，细胞因子抑制免疫细胞。在一些实施方案中，细胞因子是转化生长因子β(TGFβ)。TGFβ由癌细胞和成纤维细胞在TME中分泌，并且可以导致免疫抑制和血管生成。在一些实施方案中，细胞因子受体结合TGFβ。所提供的嵌合信号传导受体靶向的免疫抑制细胞因子的其他例子包括但不限于IL10、IL4或IL1Ra。
本文提供的嵌合信号传导受体逆转TME中免疫抑制细胞因子(例如TGFβ、IL10、IL4、IL1Ra)对免疫细胞的免疫抑制作用，允许免疫细胞对肿瘤细胞产生有效应答。例如，如本文实施例所示，嵌合信号传导受体参与激活免疫细胞的信号传导途径，同时还减少通过天然(例如抑制性)途径的信号传导。如本文所示，表达具有包含两个MyD88多肽的细胞内结构域的嵌合信号传导受体的细胞特别显示出令人惊讶的免疫抑制信号传导的有效重定向，如在存在TGFβ的情况下所例示的，包括在体外和体内测定中促进而不是减少肿瘤细胞杀伤的能力。与缺乏本文所述的嵌合信号传导受体的细胞(包括被工程化以表达重组抗原受体(例如，CAR、TCR)的细胞)相比，被工程化以表达本文提供的嵌合信号传导受体的细胞在存在含有示例性免疫抑制细胞因子TGFβ的环境的情况下显示出改善的持久性、存活、增殖和细胞毒性。本文提供的嵌合信号传导受体可用于将免疫抑制TME转变为激活环境。在一些实施方案中，本文提供的嵌合信号传导受体可用于增强表达重组抗原受体(例如CAR)和/或产生分泌蛋白(例如BiTE或细胞因子等)的细胞的持久性、存活、增殖和细胞毒性。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合信号传导受体在能够杀死肿瘤/癌细胞的免疫细胞如T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和自然杀伤(NK)细胞中表达。
在一些实施方案中，在编码重组抗原受体(例如CAR或重组TCR)的细胞中提供嵌合信号传导受体，所述重组抗原受体将对所需抗原(例如肿瘤抗原)具有特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与提供初级激活信号的激活细胞内结构域部分(如T细胞激活结构域)组合。可替代地或另外地，在一些方面，在编码可分泌的重组分子如细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE)的细胞中提供嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，提供的嵌合信号传导受体当被基因工程化到免疫细胞中时可以调节免疫细胞(例如T细胞)刺激和/或激活，从而产生具有改善的体内寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继性细胞治疗方法。在一些方面，与杀伤不表达靶抗原的细胞相比，工程化细胞实现了对表达靶分子的靶细胞的增加的杀伤。
在一些情况下，嵌合信号传导受体和重组抗原受体可以在T细胞中表达以产生基因工程化T细胞，当施用给受试者时，与不表达嵌合信号传导受体的参考细胞组合物相比，所述基因工程化T细胞展现出一种或多种改善的特性。可替代地或另外地，在一些方面，嵌合信号传导受体可以在编码可分泌重组分子如细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE)的T细胞中表达。在一些情况下，增加的持久性、活性、结合和/或杀伤大于包含不表达嵌合信号传导受体的工程化细胞的参考组合物的影响。因此，在一些情况下，施用的基因工程化细胞与施用的参考组合物的细胞相比可改善或增加或更大的一种或多种特性包括增加的激活、和增加的存活和/或持久性。
在一些实施方案中，与未被工程化的类似细胞相比或与包含重组抗原受体但不包含嵌合信号传导受体的类似细胞相比，包含嵌合信号传导受体的工程化细胞展现出增加的持久性和/或存活。在一些实施方案中，具有增加的持久性的基因工程化细胞在施用其的受试者体内展现出更好的效力。
本文还提供了嵌合信号传导受体、含有嵌合信号传导受体的工程化细胞、以及含有嵌合信号传导受体和重组分子的工程化细胞的方法、用途和组合物，所述重组分子例如重组抗原受体，例如CAR、TCR或分泌的重组分子，如细胞因子或双特异性抗体，例如BiTE。还提供了工程化、制备和生产嵌合信号传导受体和含有嵌合信号传导受体的工程化细胞(包括用于工程化细胞的核酸)的方法。还提供了试剂盒和制品。
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I.嵌合信号传导受体
本文提供了能够参与细胞内信号传导途径的嵌合信号传导受体，所述细胞内信号传导途径在例如肿瘤微环境(TME)中结合靶分子(例如细胞因子，例如免疫抑制或抗炎细胞因子)时诱导免疫细胞激活。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体被工程化以含有与细胞内信号传导结构域连接的细胞外结构域，其中所述细胞外结构域含有抗原结合结构域(例如来自受体，如细胞因子受体)，其与免疫抑制或抗炎细胞因子(如TGFβ、IL10、IL4或IL1Ra)结合，并且所述细胞内结构域含有一个或多个(例如两个)MyD88衔接分子多肽。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域含有两个MyD88多肽。在一些实施方案中，所述一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88多肽)可以是全长MyD88。在一些实施方案中，所述一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88多肽)是能够或足以二聚化、募集IRAK-4和/或促进IRAK4的磷酸化(例如激活)的截短部分，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被配体如免疫抑制细胞因子接合时。在一些实施方案中，所述一个或多个(例如两个)MyD88多肽具有SEQ ID NO:2中所示的序列。在一些实施方案中，嵌合受体多肽具有含有两个MyD88多肽的细胞内结构域，每个MyD88多肽具有SEQ ID NO:2中所示的序列。
在一些实施方案中，细胞外结构域结合免疫抑制或抗炎细胞因子，例如TGFβ、IL10、IL4或IL1Ra。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是能够结合例如特异性结合免疫抑制细胞因子的任何分子。在一些实施方案中，细胞外结构域是或含有受体的免疫抑制细胞因子的天然受体的一部分，例如结合TME中存在的细胞因子的天然细胞因子受体的一部分。例如，所提供的嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或含有天然存在的细胞因子受体的细胞外结构域或其细胞因子结合片段，所述细胞外结构域或其细胞因子结合片段能够结合如特异性地结合免疫抑制细胞因子。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是能够结合如特异性地结合免疫抑制细胞因子的抗体或抗原结合片段。抗原结合分子的非限制性例子包括抗体、抗体片段，包括例如二价抗体片段如(Fab)2’片段和二价单链Fv(scFv)片段，和单价抗体片段如Fab片段、Fv片段和scFv片段，和前述任一种的抗原结合片段。
在一些实施方案中，细胞因子是TGFβ，并且嵌合信号传导受体的细胞外结构域结合如特异性地结合TGFβ。在一些实施方案中，细胞外结构域是或含有结合TGFβ的天然细胞因子受体的一部分，所述天然细胞因子受体可以是TGFβ受体。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或含有TGFβ受体(TGFβR)(例如TGFβR2或TGFβR1)的细胞外结构域或其结合片段。在一些实施方案中，细胞外结构域是TGFβR2的细胞外结构域。
在一些实施方案中，细胞因子是IL10，并且嵌合信号传导受体的细胞外结构域结合例如特异性地结合IL-10。在一些实施方案中，细胞外结构域是或含有结合IL10的天然细胞因子受体的一部分，所述天然细胞因子受体可以是IL10R。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或含有IL-10R的细胞外结构域或其结合片段。
在一些实施方案中，细胞因子是IL4，并且嵌合信号传导受体的细胞外结构域结合例如特异性地结合IL-4。在一些实施方案中，细胞外结构域是或含有结合IL4的天然细胞因子受体的一部分，所述天然细胞因子受体可以是IL4R。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或含有IL4R的细胞外结构域或其结合片段。
在一些实施方案中，细胞因子是IL1Ra，并且嵌合信号传导受体的细胞外结构域结合例如特异性地结合IL-1Ra。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或含有针对IL-1Ra的抗体或抗原结合片段，例如scFv。
本文提供的嵌合信号传导受体可以包含另外的结构域，例如跨膜结构域和/或接头，以维持嵌合信号传导受体及其组分的功能和/或允许嵌合信号传导受体在细胞表面(例如工程化细胞表面)上表达。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的含有一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO:2)的细胞内结构域通过跨膜结构域连接到细胞外结构域。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的跨膜结构域直接连接至细胞外结构域和含有一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO：2)的细胞内结构域中之一或二者。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的跨膜结构域经由接头间接连接至细胞外结构域和含有一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO：2)的细胞内结构域中之一或二者。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的跨膜结构域直接连接至细胞外结构域和经由接头间接连接至含有一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO：2)的细胞内结构域。在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体的跨膜结构域经由接头间接连接至细胞外结构域并且直接连接至含有一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO：2)的细胞内结构域。在一些实施方案中，接头可以是衍生细胞外结构域或跨膜结构域的细胞因子受体的天然存在序列。在一些实施方案中，接头可以是合成接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。例如，在一些实施方案中，接头是(GGGGS)n(SEQ ID:47)，其中n是1至4的整数，包含端值。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)2(SEQ ID NO:85)。
在一些实施方案中，跨膜结构域与天然细胞因子受体异源或非天然部分。异源跨膜结构域可以是所述的任一种。
在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜结构域都来自结合免疫抑制细胞因子(如TGFβ、IL10或IL4)的天然细胞因子受体。例如，跨膜结构域和细胞外结构域可以来自相同的细胞因子受体，其中跨膜结构域是细胞因子受体的天然存在的跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞外结构域是TGFβR(例如TGFβR2或TGFβR1)的细胞外结构域，并且跨膜结构域是TGFβR跨膜结构域，例如TGFβR2或TGFβR1跨膜结构域，其直接连接至相应的TGFβR细胞外结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是直接连接至TGFβR2细胞外结构域的TGFβR2。在一些实施方案中，细胞外结构域是IL10R的细胞外结构域，并且跨膜结构域是直接连接至IL10R细胞外结构域的IL10R跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞外结构域是IL4R的细胞外结构域，并且跨膜结构域是直接连接至IL4R细胞外结构域的IL4R跨膜结构域。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内结构域的一个或多个MyD88多肽通过接头连接至跨膜结构域。在一些实施方案中，接头可以是天然存在的序列，其为或包括细胞外结构域或跨膜结构域所来源的细胞因子受体的细胞内结构域的部分序列。在一些实施方案中，接头可以是合成接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。例如，在一些实施方案中，接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO:47)，其中n是1至4的整数，包含端值。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)2(SEQ ID NO:85)。
在一些实施方案中，所提供的嵌合信号传导受体中的细胞外结构域、跨膜结构域和将一个或多个(例如两个)MyD88多肽连接至跨膜结构域的细胞内结构域的部分序列是来自结合免疫抑制细胞因子(例如TGFβ、IL10或IL4)的天然细胞因子受体的氨基酸的连续序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体结合TGFβ并含有作为TGFβR(例如TGFβR2或TGFβR1)的细胞外结构域的细胞外结构域、作为相应TGFβR(例如TGFβR2或TGFβR1)的跨膜结构域的跨膜结构域、和含有与一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO:2)连接的相应TGFβR(例如TGFβR2或TGFβR1)的细胞内结构域的至少连续N末端部分的细胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体结合IL10并含有作为IL10R的细胞外结构域的细胞外结构域、作为相应IL10R的跨膜结构域的跨膜结构域、和含有与一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO:2)连接的IL10R的细胞内结构域的至少连续N末端部分的细胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体结合IL4并含有作为IL4R的细胞外结构域的细胞外结构域、作为IL4R的跨膜结构域的跨膜结构域、和含有与一个或多个(例如两个)MyD88多肽(例如SEQ ID NO:2)连接的IL4R的细胞内结构域的至少连续N末端部分的细胞内结构域。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体含有结合免疫抑制细胞因子(例如TGFβ、IL10或IL4)的天然细胞因子受体的连续氨基酸部分，其中所述连续氨基酸部分至少包括天然细胞因子受体的细胞外结构域和跨膜结构域，但其中天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的一部分被一个或多个(例如两个)MyD88多肽(SEQ ID NO:2)替换。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内信号传导结构域保留天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的至少部分序列。在一些实施方案中，所述部分序列是天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的N末端部分的1至50个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述部分序列是天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的N末端部分的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基。通常，天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的部分序列是不赋予抑制性信号传导活性的非功能性部分。例如，天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的部分序列不是功能性抑制性信号传导结构域，使得它不能响应于配体与嵌合信号传导受体的结合而被磷酸化(激活)和/或募集抑制性衔接分子如SMAD(例如SMAD2或SMAD3)。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含：与免疫抑制细胞因子结合的细胞外结构域；跨膜结构域；接头序列，例如如本文所述；和包含串联连接(例如通过本文所述的接头)的两个MyD88结构域的细胞内信号传导结构域。本文提供的嵌合信号传导受体被工程化，使得细胞因子例如TGFβ、IL10、IL4、IL1Ra与细胞外结构域的结合诱导MyD88多肽的二聚化。例如，在结合免疫抑制细胞因子(例如TGFβ、IL10、IL4、IL1Ra)后，两个嵌合受体信号传导受体可通过MyD88结构域之间的相互作用在细胞表面形成二聚体(参见例如图1C)。在一些实施方案中，MyD88多肽的二聚化产生包含MyD88多肽和已被募集至MyD88衔接子的IRAK4的寡聚复合物。因此，在一些实施方案中，免疫抑制或抗炎细胞因子与细胞外结构域的结合诱导MyD88介导的信号传导(例如细胞内信号传导)。在一些实施方案中，MyD88介导的信号传导诱导免疫细胞例如T细胞激活。
在一些实施方案中，为了帮助检测或定量嵌合信号传导受体表达，嵌合信号传导受体可以包括可检测部分或标记物。在一些实施方案中，可检测标记物是myc标签(SEQ IDNO:101)。在一些实施方案中，可检测标记物是多组氨酸标签(SEQ ID NO:103)。在一些实施方案中，可检测标记物位于嵌合信号传导受体的细胞外结构域的N末端。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括信号肽，以促进定位到细胞膜用于在细胞表面上表达。在一些实施方案中，信号肽存在于前体嵌合信号传导受体蛋白中，并被切割形成成熟的嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，信号肽是CD8α信号肽。在一些实施方案中，信号肽是或包含SEQ ID NO:102中所示的氨基酸序列。
在下面的小节中，描述了所提供的嵌合信号传导受体的示例性结构域和序列。
A.细胞外结构域
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括与免疫抑制或抗炎细胞因子结合(例如特异性结合)的细胞外结构域。在一些实施方案中，免疫抑制或抗炎细胞因子是TGFβ、IL10、IL4或IL1Ra中的任一种。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包括同源受体的细胞外部分或结合相应免疫抑制或抗炎细胞因子的结合部分，如结合TGFβ、IL10、IL4或IL1Ra中的一种的同源受体的细胞外部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包括抗体或其抗原结合片段，例如单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)，其结合免疫抑制或抗炎细胞因子，例如结合TGFβ、IL10、IL4或IL1Ra中的一种。
在一些实施方案中，免疫抑制或抗炎细胞因子是TGFβ。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括与TGFβ结合(例如特异性结合)的细胞外结构域。在一些实施方案中，结合TGFβ的细胞外结构域是TGFβ受体(TGFβR)的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分。在一些实施方案中，TGFβ受体(TGFβR)或其结合TGFβ的一部分是TGFβ受体1(TGFβR1)。在一些实施方案中，TGFβR或其结合TGFβ的部分是TGFβ受体2(TGFβR2)。
在一些实施方案中，细胞外结构域含有TGFβR2的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分。TGFβR2具有如UniProt P37173中所述的结构组织和序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为SEQ ID NO:20中所示的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为氨基酸序列，所述氨基酸序列与结合TGFβ的SEQID NO:20中所示的序列具有或展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含结合TGFβ的SEQ ID NO:20的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含与SEQ ID NO:20展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性并结合TGFβ的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域由SEQ ID NO:21中所示的序列编码，或由与SEQ ID NO:21中所示的序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列编码，其中所述编码序列结合TGFβ。
在一些实施方案中，结合TGFβ的细胞外结构域是TGFβR1的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分。TGFβR1具有如UniProt P36897中所述的结构组织和序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为SEQ ID NO:4中所示的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:4中所示的序列具有或展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含结合TGFβ的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含与SEQ ID NO:4展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性并结合TGFβ的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是由SEQ ID NO:5中所示序列编码的蛋白质。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是由核酸序列编码的蛋白质，所述核酸序列与SEQ ID NO:5中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性，其中所述编码序列结合TGFβ。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是由SEQ ID NO:5的核酸序列的一部分编码的蛋白质，其中所编码的部分结合TGFβ。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是由核酸序列的一部分编码的蛋白质，所述核酸序列与SEQ ID NO:5展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性，其中所编码序列结合TGFβ。
在一些实施方案中，免疫抑制或抗炎细胞因子是IL10。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括与IL10结合(例如特异性结合)的细胞外结构域。在一些实施方案中，结合IL10的细胞外结构域是IL10受体(IL10R)的细胞外结构域或其结合IL10的一部分。IL10受体是II型细胞因子受体，并是两个IL10Ra亚基和两个IL10Rb亚基的四聚体。与IL-10的结合由高亲和力受体IL10Rα(也称为IL-10R1)介导，但该中间体复合物通常必须随后在细胞信号传导发生之前募集低亲和力IL10Rb(也称为IL-10R2)链。
在提供的实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包括与IL10结合(例如特异性结合)的细胞外结构域。在一些实施方案中，结合IL10的细胞外结构域是IL-10Ra的细胞外结构域或其结合IL10的一部分。IL10Ra具有如UniProt Q13651中所述的结构组织和序列。IL-10Ra具有包含细胞外结构域(例如SEQ ID NO:119)、跨膜结构域(例如SEQ ID NO:120)和细胞内细胞质结构域(例如SEQ ID NO:121)的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为SEQ ID NO:119中所示的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:119中所示的序列具有或展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含结合IL10的SEQ ID NO:119的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含与SEQ ID NO:119展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性并结合IL10的氨基酸序列的一部分。
在一些实施方案中，结合IL10的细胞外结构域是IL-10Rb的细胞外结构域或其结合IL10的一部分。在一些实施方案中，结合IL10的细胞外结构域是另外能够募集IL-10Rb或其结合IL10的一部分的细胞外结构域。IL10Rb具有如UniProt Q08334中所述的结构组织和序列。IL-10Rb具有包含细胞外结构域(例如SEQ ID NO:122)、跨膜结构域(例如SEQ ID NO:123)和细胞内细胞质结构域(例如SEQ ID NO:124)的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为SEQ ID NO:122中所示的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:122中所示的序列具有或展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含结合IL10的SEQ ID NO:122的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含与SEQ ID NO:122展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性并结合IL10的氨基酸序列的一部分。
在一些实施方案中，免疫抑制或抗炎细胞因子是IL4。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包含与IL4结合(例如特异性结合)的细胞外结构域。在一些实施方案中，结合IL4的细胞外结构域是IL4受体(IL4R)的细胞外结构域或其结合IL4的一部分。在一些实施方案中，细胞外结构域含有IL4R的细胞外结构域或其结合IL4的一部分。IL4R具有如UniProt P24394中所述的结构组织和序列。IL-4R具有包含细胞外结构域(例如SEQ ID NO:125)、跨膜结构域(例如SEQ ID NO:126)和细胞内细胞质结构域(例如SEQ ID NO:127)的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为SEQ ID NO:125中所示的序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域包含或为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:125中所示的序列具有或展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含结合IL4的SEQ ID NO:125的氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞外结构域是或包含与SEQ ID NO:125展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性并结合IL4的氨基酸序列的一部分。
在一些实施方案中，免疫抑制或抗炎细胞因子是IL1Ra。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包含与IL1Ra结合(例如特异性结合)的细胞外结构域。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括细胞外结构域，其为结合IL1Ra的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，细胞外结构域是针对IL1Ra的scFv。在一些实施方案中，细胞外结构域是针对IL1Ra的sdAb。
B.跨膜结构域
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包含在细胞外结构域与含有所述一个或多个(例如两个)MyD88多肽的细胞内信号传导结构域之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域在细胞上产生用于细胞表面表达的编码蛋白。在一些实施方案中，跨膜结构域直接连接至细胞外结构域(例如细胞外结构域的C末端)。在一些实施方案中，跨膜结构域经由一个或多个接头或间隔子间接连接至细胞外结构域(例如细胞外结构域的C末端)。在一些实施方案中，跨膜结构域直接连接至细胞内信号传导结构域(例如细胞内信号传导结构域的N末端)。在一些实施方案中，跨膜结构域经由一个或多个接头或间隔子间接连接至细胞内信号传导结构域(例如细胞内信号传导结构域的N末端)。在一些实施方案中，跨膜结构域主要含有疏水氨基酸残基，例如亮氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自天然来源。例如，天然跨膜结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些实施方案中，跨膜锚定结构域可用于确保嵌合信号传导受体将在工程化细胞如工程化T细胞的表面上表达。方便地，这可以来自衍生嵌合受体信号传导受体的细胞外结构域的特定的天然细胞因子受体。在一些实施方案中，当细胞外结构域是如上所述结合免疫抑制细胞因子的天然细胞因子受体的细胞外结构域时，嵌合信号传导受体的跨膜结构域是来自天然细胞因子受体的跨膜结构域或是其足以跨越细胞的脂质双层或介导嵌合信号传导受体在细胞表面上表达的一部分。应当理解，对本文提供的嵌合信号传导受体中跨膜结构域的一部分的提及是赋予跨膜结构域的活性以介导嵌合受体在细胞的脂质双层中表达的功能性部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是天然细胞因子受体的完整跨膜结构域。在其他实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域异源或不天然相关。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括跨膜结构域，其为TGFβR或衍生自TGFβR。在一些实施方案中，跨膜结构域是TGFβR2跨膜结构域。在一些实施方案中，TGFβR2跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域是或包含与SEQID NO:22中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGFβR2跨膜结构域由SEQ IDNO:23中所示的核苷酸序列编码。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自TGFβR2的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，跨膜结构域是TGFβR1跨膜结构域。在一些实施方案中，TGFβR1跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域是或包含与SEQ ID NO:6中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGFβR1跨膜结构域由SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列编码。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自TGFβR1的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，跨膜结构域是IL10Ra跨膜结构域。在一些实施方案中，IL10Ra跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:120中所示的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域是或包含与SEQ ID NO:120中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自IL10Ra的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，跨膜结构域是IL10Rb跨膜结构域。在一些实施方案中，IL10Rb跨膜是或包含SEQ ID NO:123中所示序列。在一些实施方案中，跨膜结构域是或包含与SEQID NO:123中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自IL10Rb的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，跨膜结构域是IL4R跨膜结构域。在一些实施方案中，IL4R跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:126中所示序列。在一些实施方案中，跨膜结构域是或包含与SEQ ID NO:126中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自IL4R的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，跨膜结构域是异源跨膜结构域，例如来自天然细胞表面受体的许多已知跨膜结构域中的任一种。在一些实施方案中，当细胞外结构域是如上所述结合免疫抑制细胞因子的天然细胞因子受体的细胞外结构域时，跨膜结构域是非天然跨膜结构域，其不是细胞因子受体的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自来自另一种受体多肽的跨膜结构域，所述受体多肽是膜结合的或是跨膜蛋白。在一些实施方案中，可使用来自T细胞上的另一蛋白质的跨膜锚定结构域。衍生自天然来源的跨膜结构域的非限制性例子包括衍生自以下的那些(例如，至少包含以下的跨膜结构域或其部分)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。
在一些实施方案中，跨膜衍生自合成来源。例如，合成跨膜结构域可以被工程化以主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，合成跨膜结构域可以被工程化以在合成跨膜结构域的一端或两端包括苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
C.细胞内信号传导结构域，例如MyD88细胞内信号传导结构域
所提供的嵌合信号传导受体具有细胞内信号传导结构域，其含有一个或多个(例如两个)参与免疫细胞激活途径的MyD88多肽。在一些实施方案中，与免疫抑制细胞因子结合的嵌合信号传导受体的细胞外结构域例如经由一个或多个跨膜结构域与细胞内信号传导结构域连接。因此，在一些实施方案中，通常可参与天然细胞因子受体中免疫抑制途径的细胞外结构域与一个或多个(例如两个)MyD88多肽连接，反而参与免疫细胞激活途径。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含一个或多个MyD88多肽，所述MyD88多肽能够诱导白介素-1受体相关激酶信号传导和/或IRAK例如IRAK4的结合或募集或磷酸化。在一些实施方案中，细胞内结构域包含两个MyD88多肽。在一些实施方案中，细胞内结构域包含串联的两个MyD88多肽。
如上所述，MyD88是提供阳性细胞信号传导以促进T细胞激活的衔接子信号传导分子，并且是Toll样受体(TLR)信号传导途径的一部分(参见图1B)。在TLR途径中，在TLR二聚化时发生MyD88依赖性应答，其募集MyD88衔接蛋白。MyD88转而募集蛋白激酶IRAK，包括IRAK4，导致其磷酸化。磷酸化IRAK可诱导TRAF-6信号传导，从而导致T细胞激活。
在一些情况下，细胞内结构域是或包含一个或多个MyD88多肽，例如两个MyD88多肽，其各自含有：(1)死亡结构域(DD)或其一部分(例如，氨基酸19-109，如SEQ ID NO:128的部分54-109)；(2)中间结构域(ID)或其一部分(例如，SEQ ID NO:128的氨基酸110-155)；和(3)终止立即结构域(TIR)或其一部分(例如，SEQ ID NO:128的氨基酸159-213)。在一些实施方案中，所述一个或多个MyD88多肽序列中的每一个含有N末端甲硫氨酸。例如，开始翻译可能需要N末端甲硫氨酸。因为这样的N末端甲硫氨酸通常在翻译前或翻译后被切割，所以本文公开的成熟蛋白质序列也被认为缺少N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，所述一个或多个MyD88多肽序列中的每一个缺少N末端甲硫氨酸。
在任何提供的实施方案中，细胞内结构域含有两个MyD88多肽，每个具有相同的MyD88多肽序列。在一些实施方案中，每个MyD88多肽序列是全长MyD88或是其功能性变体(例如SEQ ID NO:128中所示)。在一些实施方案中，每个MyD88多肽是MyD88的截短部分。
在一些实施方案中，MyD88多肽具有SEQ ID NO:128中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，MyD88多肽是SEQ ID NO:128中所示序列的功能性变体，其足以二聚化、募集IRAK-4和/或促进IRAK4的磷酸化(例如激活)，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被配体(例如免疫抑制细胞因子)接合时。在一些实施方案中，功能性变体具有与SEQ ID NO:128中所示氨基酸序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约98％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，MyD88多肽是MyD88的截短部分。在一些实施方案中，MyD88多肽是SEQ ID NO:128中所示序列的截短部分。在一些实施方案中，截短部分是MyD88的氨基酸的连续序列，其足以二聚化、募集IRAK-4和/或促进IRAK4的磷酸化(例如激活)，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被配体(例如免疫抑制细胞因子)接合时。在一些实施方案中，截短部分是MyD88的氨基酸的连续序列，其包含DD、ID和TIR结构域的一部分。在一些实施方案中，截短部分是MyD88的氨基酸的连续序列，其长度在100个氨基酸和194个氨基酸之间，例如长度在150与180个氨基酸之间。在一些实施方案中，截短部分是MyD88的氨基酸的连续序列，长度为150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、178、179或180个氨基酸。在一些实施方案中，MyD88的截短部分缺少完整的TIR结构域。在一些实施方案中，MyD88的截短部分缺少全长TIR结构域的120至138个连续C末端氨基酸。在一些实施方案中，MyD88的截短部分缺少全长TIR结构域的120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137或138个连续C末端氨基酸。在一些实施方案中，MyD88多肽含有TIR结构域的一部分，其是或包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的至少一部分。在一些实施方案中，MyD88多肽含有SEQ ID NO:14中所示的TIR结构域的一部分。
在一些实施方案中，MyD88多肽是MyD88的截短部分，其包括全长MyD88的氨基酸1-155所示的序列，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，MyD88多肽是全长MyD88的氨基酸1-155、1-156、1-157、1-158、1-159、1-160、1-161、1-162、1-163、1-164、1-165、1-166、1-167、1-168、1-169、1-170、1-171、1-172、1-173、1-174、1-175、1-176、1-177、1-178、1-179或1-180所示的MyD88的截短部分，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，MyD88的截短部分如全长MyD88的氨基酸1-171所示，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，MyD88的截短部分如全长MyD88的氨基酸1-172所示，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，序列可以是功能性变体，其与任何前述氨基酸序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约98％序列同一性，并且足以二聚化、募集IRAK-4和/或促进IRAK4的磷酸化(例如激活)，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被配体(例如免疫抑制细胞因子)接合时。
在一些实施方案中，MyD88的截短部分包括全长MyD88的氨基酸2-155所示的序列，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，MyD88的截短部分如全长MyD88的氨基酸2-155、2-156、2-157、2-158、2-159、2-160、2-161、2-162、2-163、2-164、2-165、2-166、2-167、2-168、2-169、2-170、2-171、2-172、2-173、2-174、2-175、2-176、2-177、2-178、2-179或2-180所示，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，MyD88的截短部分如全长MyD88的氨基酸2-171所示，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，MyD88的截短部分如全长MyD88的氨基酸2-172所示，例如SEQ ID NO:128中所示。在一些实施方案中，序列可以是功能性变体，其与任何前述氨基酸序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约98％序列同一性，并且足以二聚化、募集IRAK-4和/或促进IRAK4的磷酸化(例如激活)，例如当嵌合信号传导受体由细胞表达并被配体(例如免疫抑制细胞因子)接合时。
在一些实施方案中，MyD88多肽包括DD、ID和TIR结构域的一部分。在一些实施方案中，MyD88多肽包括DD、ID和截短的TIR结构域。在一些实施方案中，MyD88多肽包括DD、ID和全长TIR结构域。在一些实施方案中，DD是或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，DD由SEQ ID NO:11中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，ID是或包含SEQID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，ID由SEQ ID NO:13中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，TIR是或包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的至少一部分。在一些实施方案中，氨基酸序列的至少一部分由SEQ ID NO:15中所示核苷酸序列的连续部分编码。在一些实施方案中，TIR是或包含与SEQ ID NO:14展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列的至少一部分。在一些实施方案中，TIR是SEQ ID NO:14中所示的TIR结构域的一部分。在一些实施方案中，TIR结构域的T部分由SEQ ID NO:15中所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，MyD88多肽是或包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，MyD88多肽由SEQ ID NO:2的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，MyD88多肽是或包含与SEQ ID NO:2的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，MyD88多肽由与SEQ ID NO:2的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列组成或基本上由其组成。
在一些情况下，例如当细胞内结构域包含两个MyD88多肽时，MyD88多肽串联排列。例如，在一些实施方案中，细胞内结构域含有如本文所述的第一MyD88多肽和如本文所述的第二MyD88多肽，其中第一MyD88多肽和第二MyD88多肽直接或间接连接。在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽直接连接。例如，在一些实施方案中，第二MyD88多肽的N末端与第一MyD88多肽的C末端直接连接。可替代地，在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽通过接头连接。例如，在一些实施方案中，第二MyD88多肽的N末端通过接头与第一多肽的C末端连接。在一些实施方案中，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些实施方案中，接头序列是SEQID NO:47((GGGGS)n)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:47((GGGGS)n)中所示的氨基酸序列，其中n是1至4(含)的整数。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:47((GGGGS)n)中所示的氨基酸序列，其中n是1至4(含)的整数。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:48(GGGGS)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:85(GGGGSGGGGS)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列是SEQID NO:49(GGGGSGGGGSGGGGS)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列是SEQ IDNO:50(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽是相同的。第一和第二MyD88多肽的序列可以包括本文所述的MyD88多肽的任何序列。在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽中的每一个是MyD88的相同截短部分。在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽各自包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽各自由SEQID NO:2中所示的氨基酸序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽各自包含相同序列，所述序列是与SEQ ID NO:2的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽各自由相同序列组成或基本上由其组成，所述序列是与SEQ ID NO:2的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽是不同的。第一和第二MyD88多肽的序列可以独立地包括本文所述的MyD88多肽的任何序列。在一些实施方案中，第一和第二MyD88多肽中的每一个是MyD88的截短部分。在一些实施方案中，第一或第二MyD88多肽中的一个是或包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且第一或第二MyD88多肽中的另一个是或包含与SEQ ID NO:2的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88多肽)与嵌合信号传导受体的跨膜结构域连接。在一些实施方案中，所述一个或多个MyD88多肽与跨膜结构域间接连接。例如，在一些情况下，MyD88多肽的N末端与跨膜结构域的C末端直接连接。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内结构域的一个或多个MyD88多肽通过接头连接至跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，MyD88多肽通过接头与跨膜结构域间接连接。例如，一个或多个MyD88多肽中的一个(例如第一MyD88多肽)的N末端通过接头序列与跨膜结构域的C末端连接。
在一些实施方案中，将一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88多肽)连接到跨膜结构域的接头是肽接头。接头的长度可以是2-25个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:47((GGGGS)n)中所示的氨基酸序列，其中n是1至4(含)的整数。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:48(GGGGS)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:85(GGGGSGGGGS)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列是SEQID NO:49(GGGGSGGGGSGGGGS)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头序列是SEQ IDNO:50(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，将所述一个或多个MyD88(例如两个MyD88多肽)连接到跨膜结构域的接头可以是天然存在的序列，其为或包括细胞外结构域或跨膜结构域所来源的细胞因子受体的细胞内结构域的部分序列。在一些实施方案中，细胞因子受体的细胞内结构域的部分序列是细胞质结构域的一部分，例如不赋予抑制性信号传导活性的细胞质结构域的非功能性部分。例如，天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的部分序列不是能够介导抑制性信号传导的功能性抑制性信号传导结构域，使得它不能响应于配体与嵌合信号传导受体的结合而被磷酸化(激活)和/或募集抑制性衔接分子如SMAD(例如SMAD2或SMAD3)。在一些实施方案中，部分序列包括细胞因子受体的细胞质结构域的2至50个N末端氨基酸，例如2至25个。
在一些实施方案中，将所述一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88)连接到跨膜结构域的接头是TGFβR2的细胞内结构域的部分序列，其是TGFβR2的细胞质结构域的非功能性部分。在一些实施方案中，TGFβR2细胞质结构域的部分序列包括TGFβR2细胞质结构域的2至25个N末端氨基酸，例如SEQ ID NO:129中所示的TGFβR2细胞质结构域的2至25个N末端氨基酸。在一些实施方案中，TGFβR2细胞质结构域的部分序列是TGFβR2细胞质结构域的氨基酸1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24或1-25，例如SEQ ID NO:129中所示。在一些实施方案中，TGFβR2细胞质结构域的部分序列是或包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGFβR2细胞质结构域的部分序列是或包含与SEQ ID NO:24展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGFβR2细胞质结构域的部分序列如SEQ ID NO:24中所示。在一些实施方案中，TGFβR2细胞质结构域的部分序列由SEQID NO:25中所示的核苷酸序列编码。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自TGFβR2的细胞外结构域，如上所述。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的跨膜结构域是来自TGFβR2的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，将一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88)连接到跨膜结构域的接头是TGFβR1的细胞内结构域的部分序列，例如作为TGFβR1的非功能性部分的细胞质结构域的一部分。在一些实施方案中，TGFβR1细胞质结构域的部分序列包括TGFβR1细胞质结构域的2至25个N末端连续氨基酸，例如SEQ ID NO:130中所示的TGFβR1细胞质结构域。在一些实施方案中，TGFβR1细胞质结构域的部分序列是TGFβR1细胞质结构域的氨基酸1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24或1-25，例如SEQ ID NO:130中完全所示。在一些实施方案中，TGFβR1细胞质(细胞内)结构域的部分序列是或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGFβR1细胞质结构域的部分序列是或包含与SEQ ID NO:1展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGFβR1细胞质结构域的部分序列如SEQ ID NO:8中所示。在一些实施方案中，TGFβR1细胞质结构域的部分序列由SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列编码。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自TGFβR1的细胞外结构域，如上所述。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的跨膜结构域是来自TGFβR1的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内结构域包括IL10Ra的细胞内结构域的部分序列，例如作为IL10Ra的非功能性部分的细胞质结构域的一部分，其将一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88)连接到跨膜结构域。在一些实施方案中，IL10Ra细胞质结构域的部分序列是细胞质结构域的一部分，其包括完整IL10Ra细胞质结构域的2-25个N末端连续氨基酸，例如SEQ ID NO:121中所示的完整IL10Ra细胞质结构域。在一些实施方案中，IL10Rα细胞质结构域的部分序列是完整IL10Rα细胞质结构域的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个N末端连续氨基酸，例如SEQ ID NO:121中完全所示。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自IL10Ra的细胞外结构域，如上所述。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的跨膜结构域是来自IL10Ra的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内结构域包括IL10Rb的细胞内结构域的部分序列，例如作为IL10Rb的非功能性部分的细胞质结构域的一部分，其将一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88)连接到跨膜结构域。在一些实施方案中，IL10Rb细胞质结构域的部分序列是细胞质结构域的一部分，其包括完整IL10Rb细胞质结构域的2-25个N末端连续氨基酸，例如SEQ ID NO:124中所示的完整IL10Rb细胞质结构域。在一些实施方案中，IL10Rb细胞质结构域的部分序列是完整IL10Rα细胞质结构域的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个N末端连续氨基酸，例如SEQ ID NO:124中完全所示。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自IL10Rb的细胞外结构域，如上所述。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的跨膜结构域是来自IL10Rb的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内结构域包括IL4R的细胞内结构域的部分序列，例如作为IL4R的非功能性部分的细胞质结构域的一部分，其将一个或多个MyD88多肽(例如两个MyD88)连接到跨膜结构域。在一些实施方案中，IL4R细胞质结构域的部分序列是细胞质结构域的一部分，其包括完整IL4R细胞质结构域的2-25个N末端连续氨基酸，例如SEQ ID NO:127中所示的完整IL4R细胞质结构域。在一些实施方案中，IL4R细胞质结构域的部分序列是完整IL10Rα细胞质结构域的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个N末端连续氨基酸，例如SEQ ID NO:127中完全所示。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的细胞外结构域是来自IL4R的细胞外结构域，如上所述。在一些这样的实施方案中，嵌合受体信号传导结构域的跨膜结构域是来自IL4R的细胞外结构域，如上所述。
在一些实施方案中，接头序列含有本文所述的细胞质结构域和如本文所述的甘氨酸/丝氨酸接头序列。
D.示例性嵌合信号传导受体多肽
嵌合信号传导受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和含有一个或多个MyD88多肽的细胞内结构域，如本文(例如部分IA-IC)所述。在一些实施方案中，本文提供的嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含如部分I-A中所述的能够结合免疫抑制或抗炎细胞因子的细胞外结构域、，如部分I-B中所述的跨膜结构域和如部分I-C中所述的细胞内结构域。任何结构域可以通过所述的接头连接。在一些实施方案中，本文提供的嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含如部分I-A中所述的能够结合免疫抑制或抗炎细胞因子的细胞外结构域、如部分I-B中所述的跨膜结构域、如本文所述的接头序列和如部分I-C中所述的细胞内结构域。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体含有免疫抑制细胞因子(例如TGFβ、IL10或IL4)的天然细胞因子受体的连续序列，其含有细胞因子受体的用于结合免疫抑制细胞因子的细胞外结构域和跨膜结构域，但其中细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的至少功能性抑制性信号传导结构域被含有一个或多个MyD88多肽(例如串联的两个MyD88多肽)的细胞内信号传导结构域替代。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的细胞内结构域可以含有天然细胞因子受体的细胞内信号传导结构域的部分序列，例如作为跨膜结构域与一个或多个MyD88多肽之间的接头序列，只要所述部分序列不是功能性抑制性信号传导结构域并且不能够被磷酸化(激活)和/或不能够响应于配体与嵌合信号传导受体的结合而募集抑制性衔接分子如SMAD(例如SMAD2或SMAD3)即可。在一些实施方案中，细胞因子受体是TGFβR1，并且缺乏功能性抑制性信号传导结构域的细胞因子受体的连续氨基酸序列示于SEQ IDNO:1中。在一些实施方案中，细胞因子受体是TGFβR2，并且缺乏功能性抑制性信号传导结构域的细胞因子受体的连续氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域的一个或多个MyD88多肽包括具有SEQID NO:2中所示序列的至少一个MyD88结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域的一个或多个MyD88多肽是串联连接的两个MyD88结构域。在一些实施方案中，两个MyD88结构域直接连接。在一些实施方案中，两个MyD88结构域通过本文所述的接头连接。在一些实施方案中，串联连接的两个MyD88结构域各自单独地具有SEQ ID NO:2中所示的序列。每个MyD88结构域之间的接头可以是所述的任何接头。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体结合TGFβ。在一些实施方案中，本文提供的嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含如部分I-A中所述的能够结合TGFβ的细胞外结构域、如部分I-B中所述的跨膜结构域和如部分I-C中所述的细胞内结构域。在一些实施方案中，本文提供的嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含如部分I-A中所述的能够结合TGFβ的细胞外结构域、如部分I-B中所述的跨膜结构域、如本文所述的接头序列和如部分I-C中所述的细胞内结构域。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括信号肽，以促进定位到细胞膜用于在细胞表面上表达。在一些实施方案中，信号肽存在于前体嵌合信号传导受体蛋白中，并被切割形成成熟的嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，信号肽是CD8α信号肽。在一些实施方案中，信号肽是或包含SEQ ID NO:102中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含：作为TGFβR的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分的细胞外结构域；作为TGFβR跨膜结构域或其一部分的跨膜结构域；如本文所述的接头序列；和含有至少一个MyD88结构域的细胞内信号传导结构域，如所述任一种。在一些实施方案中，MyD88结构域为SEQ ID NO:2中所示的序列。在一些实施方案中，本文所述的嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含：作为TGFβR的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分的细胞外结构域；作为TGFβR跨膜结构域或其一部分的跨膜结构域；如本文所述的接头序列；和包含串联的两个MyD88结构域的细胞内信号传导结构域，其中每个独立地是所述的任一种。在一些实施方案中，两个MyD88结构域直接连接。在一些实施方案中，两个MyD88结构域通过本文所述的接头连接。在一些实施方案中，串联连接的两个MyD88结构域各自单独地具有SEQ ID NO:2中所示的序列。每个MyD88结构域之间的接头可以是所述的任何接头。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含：作为TGFβR1的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分的跨膜结构域；作为TGFβR1跨膜结构域或其一部分的跨膜结构域；如本文所述的接头序列；和含有至少一个MyD88结构域的细胞内信号传导结构域，如所述的任一种。在一些实施方案中，MyD88结构域为SEQ ID NO:2中所示的序列。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合信号传导受体含有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列连接的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2中所示的序列是直接连接的。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:90的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括信号肽(例如SEQ ID NO:102)，其在一些情况下当由细胞表达时可被切割。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQID NO:16中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ IDNO:16的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由SEQ ID NO:17中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由与SEQ ID NO:17的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:91中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:91的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括信号肽(例如SEQ ID NO:102)，其在一些情况下当由细胞表达时可被切割。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:18的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由SEQID NO:19中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由与SEQ IDNO:19的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含：作为TGFβR1的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分的跨膜结构域；作为TGFβR1跨膜结构域或其一部分的跨膜结构域；如本文所述的接头序列；和包含串联的两个MyD88结构域的细胞内信号传导结构域，其中每个独立地是所述的任一种。在一些实施方案中，两个MyD88结构域直接连接。在一些实施方案中，两个MyD88结构域通过本文所述的接头连接。在一些实施方案中，串联连接的两个MyD88结构域各自单独地具有SEQ ID NO:2中所示的序列。每个MyD88结构域之间的接头可以是所述的任何接头。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含：作为TGFβR2的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分的跨膜结构域；作为TGFβR2跨膜结构域或其一部分的跨膜结构域；如本文所述的接头序列；和含有至少一个MyD88结构域的细胞内信号传导结构域，如所述的任一种。在一些实施方案中，MyD88结构域为SEQ ID NO:2中所示的序列。
在一些实施方案中，本文所述的嵌合信号传导受体含有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列连接的SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3所示的序列和SEQ ID NO:2中所示的序列是直接连接的。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:92的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括信号肽(例如SEQ ID NO:102)，其在一些情况下当由细胞表达时可被切割。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQID NO:26中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ IDNO:26的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由与SEQ ID NO:27的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体从N末端至C末端包含：作为TGFβR2的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分的跨膜结构域；作为TGFβR2跨膜结构域或其一部分的跨膜结构域；如本文所述的接头序列；和包含串联的两个MyD88结构域的细胞内信号传导结构域，其中每个独立地是所述的任一种。在一些实施方案中，两个MyD88结构域直接连接。在一些实施方案中，两个MyD88结构域通过本文所述的接头连接。在一些实施方案中，串联连接的两个MyD88结构域各自单独地具有SEQ ID NO:2中所示的序列。每个MyD88结构域之间的接头可以是所述的任何接头。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:93中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:93的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括信号肽(例如SEQ ID NO:102)，其在一些情况下当由细胞表达时可被切割。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:28的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由SEQID NO:29中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由与SEQ IDNO:29的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:94中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:94的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体包括信号肽(例如SEQ ID NO:102)，其在一些情况下当由细胞表达时可被切割。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:30的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由SEQID NO:31中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体由与SEQ IDNO:31的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，为了帮助检测或定量嵌合信号传导受体表达，嵌合信号传导受体还包括可检测部分或标记物。在一些实施方案中，可检测标记物是myc标签(SEQ IDNO:101)。在一些实施方案中，可检测标记物是多组氨酸标签(SEQ ID NO:103)。在一些实施方案中，可检测标记物位于嵌合信号传导受体的细胞外结构域的N末端。
在一些情况下，本文提供的嵌合信号传导受体在嵌合信号传导受体多肽的N末端或C末端含有可切割肽或核糖体跳跃元件，例如IRES或T2A。在一些实施方案中，包含可切割肽或核糖体跳跃元件允许从单个多肽表达两种或更多种多肽。参见例如下面的部分II。在一些实施方案中，所述可切割肽是T2A。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:114中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:98的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:99的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:39的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:41的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
II.核酸和载体
还提供了编码嵌合信号传导受体的多核苷酸(核酸分子)和用于基因工程化细胞以表达此类多肽和受体的载体。
A.多核苷酸
在一些实施方案中，提供了编码本文提供的任何嵌合信号传导受体的多核苷酸。在一些方面，多核苷酸含有单个核酸序列，例如编码嵌合信号传导受体的核酸序列。如上(例如在部分I-D中)所述，在一些情况下，多核苷酸含有编码信号肽的信号序列。例如，信号序列可以编码衍生自CD8的信号肽，例如CD8α信号序列。在一些实施方案中，CD8α信号肽是或包含SEQ ID NO:102中所示的序列，或与该序列具有至少95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多核苷酸含有编码嵌合信号传导受体的第一核酸序列和编码另一重组分子的第二核酸序列，所述另一重组分子例如可分泌的重组分子，例如细胞因子(例如IL-15或IL-12)或双特异性抗体(例如BiTE)。在一些实施方案中，多核苷酸含有编码嵌合信号传导受体的第一核酸序列和编码重组抗原受体的第二核酸序列。在一些方面，重组抗原受体是或含有嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，重组抗原受体是或含有T细胞受体(TCR)，例如转基因TCR。示例性重组抗原受体描述于部分III中。在一些实施方案中，多核苷酸含有编码嵌合信号传导受体的第一核酸序列和编码另一种可分泌的重组分子如双特异性抗体或细胞因子的第二核酸序列。在某些方面，双特异性抗体是BiTE。包括细胞因子和BiTE的示例性重组可分泌分子描述于部分IV中。
在一些实施方案中，编码嵌合信号传导受体的多核苷酸含有至少一个可操作地连接以控制嵌合信号传导受体表达的启动子。在一些实施方案中，多核苷酸含有可操作地连接以控制嵌合信号传导受体表达的两个、三个或更多个启动子。
在一些实施方案中，例如当多核苷酸含有两个或更多个核酸编码序列，例如编码嵌合信号传导受体的序列和编码另一重组分子(例如重组抗原受体(例如CAR或重组TCR)、细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE))的序列时，可操作地连接至少一个启动子以控制两个或更多个核酸序列的表达。在一些实施方案中，多核苷酸含有两个、三个或更多个可操作地连接以控制嵌合信号传导受体和/或重组抗原受体的表达的启动子。
在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的表达是诱导型或条件型。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体和重组抗原受体的表达是诱导型或条件性。因此，在一些方面，编码嵌合信号传导受体和/或重组抗原受体的多核苷酸含有条件启动子、增强子或反式激活子。在一些这样的方面，条件性启动子、增强子或反式激活因子是诱导型启动子、增强子或反式激活因子，或者阻抑型启动子、增强子或反式激活因子。例如，在一些实施方案中，可使用诱导型或条件性启动子将嵌合信号传导受体和/或重组抗原受体的表达限制于特定微环境，例如肿瘤微环境。在一些实施方案中，诱导型或条件性启动子在肿瘤微环境中存在一种或多种条件(例如低氧、低葡萄糖、酸性pH和/或氧化应激)的情况下是有活性的。在其他实施方案中，由诱导型或条件性启动子驱动的表达通过暴露于外源性试剂如热、辐射或药物来调节。
在一些实施方案中，编码嵌合信号传导受体的多核苷酸与EF1α启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码嵌合信号传导受体和重组抗原受体的多核苷酸可操作地连接至单个EF1α启动子。在一些实施方案中，编码嵌合信号传导受体和可分泌重组分子(例如细胞因子或双特异性抗体(例如BiTE))的多核苷酸与单个EF1α启动子可操作地连接。在一些实施方案中，EF1α启动子是或包含SEQ ID NO:112中所示的核酸序列。
在多核苷酸含有多于一个编码蛋白质的核酸序列，例如编码嵌合信号传导受体的第一核酸序列和编码另一重组分子(例如重组抗原受体(例如CAR、TCR)或双特异性抗体(例如BiTE))的第二核酸序列的情况下或反之亦然，多核苷酸可进一步包含编码第一核酸序列与第二核酸序列之间的肽的核酸序列。在一些情况下，位于第一核酸序列与第二核酸序列之间的核酸编码在翻译期间或之后分离第一和第二核酸序列的翻译产物的肽。在一些实施方案中，肽含有内部核糖体进入位点(IRES)、自切割肽或引起核糖体跳跃的肽，例如T2A肽。在一些实施方案中，包含可切割肽或核糖体跳跃元件允许从单个多肽表达两种或更多种多肽。在一些实施方案中，肽是自切割肽，其为T2A肽。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ IDNO:61中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是或包含SEQ ID NO:114中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸编码嵌合信号传导受体和针对或特异于抗原(例如肿瘤抗原，例如CD19或B7H3)的CAR，其中编码嵌合信号传导受体的核酸和编码CAR的核酸被T2A自切割肽分离。
在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码SEQ ID NO:104中所示序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码与SEQ ID NO:104的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码SEQ ID NO:105中所示序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码与SEQ ID NO:105的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码SEQ ID NO:106中所示序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码与SEQ ID NO:106的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码SEQ ID NO:107中所示序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含编码与SEQ ID NO:107的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码嵌合信号传导受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码嵌合信号传导受体和重组抗原受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸(核酸分子)编码本文所述的嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸编码嵌合信号传导受体和重组抗原受体，例如CAR、TCR。此外，在一些实施方案中，本文提供了编码重组抗原受体，例如CAR或TCR的多核苷酸。
B.载体
还提供了含有多核苷酸的载体或构建体，例如本文所述的核酸分子。在一些实施方案中，载体或构建体含有与编码嵌合信号传导受体的核酸分子可操作连接以驱动其表达的一个或多个启动子。在一些实施方案中，启动子可操作地连接到一个或多于一个核酸分子，例如编码嵌合信号传导受体的核酸分子和编码重组抗原受体(例如CAR、重组TCR)的核酸分子，如下所述。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导(例如慢病毒转导)将含有编码嵌合信号传导的多核苷酸的病毒载体引入含有培养细胞的组合物中。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导(例如慢病毒转导)将编码嵌合信号传导受体和另一种重组分子(例如重组抗原受体和/或可分泌的重组分子(例如双特异性抗体或细胞因子))的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，载体或构建体包括驱动多核苷酸的一个或多个核酸分子表达的单个启动子。在一些实施方案中，这样的启动子可以是多顺反子(双顺反子或三顺反子，参见例如美国专利号6,060,273)。例如，在一些实施方案中，转录单元可以被工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的信息共表达基因产物(例如编码嵌合信号传导受体和重组抗原受体)。在一些实施方案中，本文提供的载体是双顺反子的，允许载体含有和表达两个核酸序列。在一些情况下，双顺反子载体的两个核酸序列是嵌合信号传导受体和CAR。在一些实施方案中，本文提供的载体是三顺反子的，允许载体含有和表达三个核酸序列。在一些情况下，三顺反子载体的三个核酸序列是嵌合信号传导受体和编码重组TCR的α和β链的核酸分子。
在一些实施方案中，单个启动子指导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码嵌合信号传导受体和编码重组抗原受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，所述ORF编码单个多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被加工成单个蛋白质。在一些情况下，所述肽(如T2A)可以导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，这导致2A序列末端与下游的下一个肽之间隔开(参见例如，deFelipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件在本领域是已知的。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自口蹄疫病毒的2A序列(F2A，例如SEQ ID NO:66)、来自马鼻炎A病毒的2A序列(E2A，例如SEQ ID NO:65)、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的2A序列(T2A，例如SEQ ID NO:61、62、113或114)和来自猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1的2A序列(P2A，例如SEQ ID NO:63或64)，如美国专利公开号20070116690中所述。
在一些实施方案中，选择引入嵌合信号传导受体的工程化细胞(例如T细胞)中嵌合信号传导受体的表面表达阳性的细胞。在一些实施方案中，可以通过使用对嵌合信号传导受体的细胞外结合结构域具有特异性的试剂(例如抗体或其他免疫亲和试剂)检测或选择细胞来评估表面表达。例如，可通过检测或选择对TGFβR具有特异性的细胞来评估表面表达。
在其中还将编码重组抗原受体(例如CAR或TCR)的核酸引入细胞的一些实施方案中，可以选择细胞中重组抗原受体的表面表达阳性的细胞。在一些实施方案中，可以选择嵌合信号传导受体和重组抗原受体皆阳性的细胞。在一些实施方案中，可以通过使用对重组抗原受体的细胞外结构域具有特异性的试剂(例如抗体或其他免疫亲和试剂)检测或选择细胞来评估表面表达。例如，这样的试剂包括，例如，CAR特异性靶抗原、CAR的抗原结合结构域特异性抗独特型抗体、或结合免疫球蛋白的一部分的试剂，例如蛋白L或其他抗免疫球蛋白抗体。在检测重组或工程化T细胞受体(TCR)的其他方面，可用MHC四聚体或抗TCRα或β链抗体染色。
可以使用许多熟知的用于评估表面标记物或蛋白质的表达水平的方法，如通过基于亲和力的方法，例如基于免疫亲和力的方法(例如在表面标记物的情境下，如通过流式细胞术)进行的检测。在一些实施方案中，标记是荧光团，并且用于检测或鉴定表面标记物(例如嵌合信号传导受体或重组抗原受体)的方法是通过流式细胞术。在一些实施方案中，不同的标记通过多色流式细胞术用于不同标记物中的每一种。
在一些实施方案中，产生含有工程化细胞如工程化T细胞的组合物，其中多个细胞表达嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的细胞表达嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，产生含有工程化细胞(例如工程化T细胞)的组合物，其中多个细胞表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的细胞表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在特定实施方案中，组合物中至少或约80％的细胞表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在任何实施方案的一些中，还可以产生工程化细胞，例如分泌另一种重组分子，例如细胞因子(例如IL-12或IL-15)或双特异性抗体(例如BiTE)。
III.重组抗原受体
如本文所述，在一些情况下，本文提供的嵌合信号传导受体在细胞如T细胞中与重组抗原受体共表达。在一些实施方案中，重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，重组抗原受体是T细胞受体。
A.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体和CAR在例如用本文所述的多核苷酸或载体工程化的细胞中表达，以在细胞表面上表达嵌合信号传导受体和CAR。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体和CAR包含在两个单独的多核苷酸中，例如如部分II-A中所述。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体和CAR包含在单个多核苷酸中，例如如部分II-A中所述。
本文提供的CAR是基因工程化受体，其包括细胞外抗原结合结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域，使得嵌合抗原受体通过抗原受体复合物如TCR复合物模拟激活。在一些实施方案中，CAR还含有跨膜结构域和/或细胞内结构域，在一些实施方案中，细胞外结构域通过跨膜结构域和/或细胞内结构域与细胞内信号传导结构域连接。CAR通常被工程化使得结构域(例如细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内结构域和细胞内信号传导结构域)起作用以产生类似于经由天然存在的抗原受体(包括例如共刺激受体)接收的信号的信号。
在一些实施方案中，CAR被工程化以经由包含在CAR中的细胞外抗原结合结构域与抗原结合，例如特异性结合。抗原在本文中可称为靶抗原。
示例性靶抗原包括但不限于αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、B7H3、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AI)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，靶抗原选自：CD3、NKp46、CD5、CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((TnAg)或(GalNAca-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化CD43表位、在非造血系统癌症上表达的糖基化CD43表位、癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延伸因子2突变(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区域(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)(bcr-abl)组成的癌基因融合蛋白；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标记物1；(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)；封闭蛋白6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；威尔姆氏肿瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ES0-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGEl)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；surviving；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或Galectin 8)、由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节物兄弟因子)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾脏普遍存在蛋白1(RU1)；肾脏普遍存在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLLl)、MPL、生物素、c-MYC表位标签、CD34、LAMP1 TROP2、GFRα4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea(CA19.9；唾液酰路易斯抗原)岩藻糖基-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRγ-δ、NKG2D、CD32(FCGR2A)、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、CSF2RA(GM-CSFR-α)、TGFβR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-β1链、TCR-β2链、TCR-γ链、TCR-δ链、黄体生成素激素受体(LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、HIV1包膜糖蛋白、HTLV1-Tax、CMVpp65、EBV-EBNA3c、甲型流感血凝素(HA)、GAD、PDL1、鸟苷酸环化酶C(GCC)、KSHV-K8.1蛋白、KSHV-gH蛋白、针对桥粒芯糖蛋白3的自身抗体(Dsg3)、针对桥粒芯糖蛋白1的自身抗体(Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、组织因子1(TF1)、AFP、GPRC5D、封闭蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)、P-糖蛋白、STEAP1、LIV1、NECTIN-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、以及低电导氯离子通道和整合素B7。
在一些实施方案中，靶抗原是CD33、CD123、MPL、CD19、CD22、CD20、BCMA、CS1、FLT3、CSF2RA、IL6R、LAMP1、TSLRP、CD4、CXCR4、GPC3、CD45、CD44v、CD43、CD32、CD38、CD79b、CD138、CD179b、CD70、叶酸受体β、WT1、NY-ESO1、CLL1、IL1Ra、CLEC5A、PR1、TGFβ、ROR1、TnAg、CD200R、κ轻链、TCRb1恒定链、TCRb2恒定链、TCRa恒定链、TCRg、TCRd、CD5、CD52、CD7、CD3e、IL1RAP、Lym1、Lym2和/或BST1/CD157。
靶抗原的非限制性例子可参见Jurgens等人(2019)或国际专利申请公开号WO2012/079000、WO 2015/157386、WO 2015/075468、WO 2013/176916、WO 2011/119979、WO2012/079000、WO 2014/031687、WO 2011/059836、WO 2014/153270、WO 2015142675、WO2016049459、US 20160355590，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，针对LYM1的抗原结合剂是靶向该抗原的VL和VH片段或抗体(例如US 20160355590A1中描述的抗体)的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，针对LYM1的抗原结合剂是在例如US20160355590A1中描述的抗体、抗体片段或抗体样部分。
在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤、神经母细胞瘤细胞瘤和/或卵巢癌相关的抗原。
在一些实施方案中，靶抗原在细胞表面上表达。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面配体、细胞表面受体或细胞表面标记物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽或其片段。在一些实施方案中，靶抗原是例如由MHC复合物呈递的加工肽抗原。在一些实施方案中，靶抗原是碳水化合物。在一些实施方案中，靶抗原是可被CAR中所含的细胞外抗原结合结构域靶向的细胞表达的任何分子。
在一些实施方案中，靶抗原在细胞上选择性地、排他性地表达或过表达。在一些实施方案中，例如，靶抗原在与疾病或病症相关的细胞上表达。与疾病或病症相关的细胞的非限制性例子包括肿瘤细胞、癌细胞、病毒感染细胞或可与健康细胞或组织区分的细胞。在一些实施方案中，靶抗原在肿瘤细胞上表达。在一些实施方案中，靶抗原在癌细胞上表达。
在一些实施方案中，CAR中所含的细胞外抗原结合结构域包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)、或单结构域抗体(sdAb)，例如sdFv、纳米抗体、VHH和VNAR。
在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scFv。在一些实施方案中，scFv包括一个或多个连接重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的柔性接头。接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下苏氨酸的那些接头。在一些实施方案中，接头还包括带电荷的残基(如赖氨酸和/或谷氨酸)，其可以改善溶解性。在一些实施方案中，接头还包括一个或多个脯氨酸。接头的非限制性例子包括具有序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:48)、(GGGGS)n(其中n是1至4的整数(SEQ ID NO:47))、序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:49)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:115)、SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:116)的各种数量重复的接头。
在一些实施方案中，CAR含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域通过间隔序列与细胞外抗原结合结构域连接。间隔序列可包括但不限于免疫球蛋白恒定区的全长或部分，例如铰链区。在一些实施方案中，间隔子是IgG4铰链区、CH1/CL(例如IgG1、IgG4恒定区)、Fc区。间隔子的非限制性例子可见于Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153或国际专利申请公开号WO 2014/031687，其通过引用并入本文。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域直接连接到细胞外抗原结合结构域。
跨膜结构域可以是天然存在的膜结构域、或选择的或修饰的跨膜结构域。在一些实施方案中，选择的或修饰的跨膜结构域可用于防止或最小化与天然或内源性细胞蛋白的相互作用。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以衍生自任何天然存在的膜结合蛋白或跨膜蛋白。天然存在的跨膜结构域的例子可以衍生自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
在一些实施方案中，跨膜结构域是合成跨膜结构域。在一些实施方案中，合成跨膜结构域包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并且所述接头在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
在一些实施方案中，CAR含有一个或多个细胞内信号传导结构域或组分。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域或组分是TCR复合物的细胞内组分。在一些实施方式中，TCR复合物的细胞内组分是CD3链，例如CD3-ζ链。在一些实施方案中，CAR进一步包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。
本文提供的CAR可以进一步含有一种或多种另外的分子的部分，例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。在一些实施方案中，CAR可以包括由CD3-ζ(CD3-ζ)链或Fc受体γ和CD8、CD4、CD25或CD16的部分组成的分子。
在一些实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域与靶抗原的结合导致受体的细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如工程化T细胞)的正常效应子功能或应答。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与靶抗原的结合诱导细胞溶解活性或T辅助活性。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与此类受体并行起作用以在靶抗原结合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在一些实施方案中，CAR进一步包括能够二次或共刺激信号传导的结构域。
在一些实施方案中，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级细胞质信号传导序列。因此，在一些实施方案中，CAR含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，例如包含在初级细胞质信号传导序列中的，包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，CAR含有衍生自CD3ζ或其部分的细胞质信号传导分子。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40、CD27、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR同时包括激活和共刺激组分。
在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中涵盖一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，CAR是第一、第二或第三代CAR。
在一些实施方案中，CAR包括：细胞外抗原结合结构域，例如sdAb或scFv；间隔物，例如任何含有Ig铰链的间隔物；跨膜结构域，其是CD28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有4-1BB或其功能性变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能性变体的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR包括：细胞外抗原结合结构域，例如sdAb或scFv；间隔物，例如任何含有Ig铰链的间隔物；跨膜结构域，其是CD8a或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有4-1BB或其功能性变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能性变体的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR包括：细胞外抗原结合结构域，例如sdAb或scFv；跨膜结构域，其是CD8a或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有4-1BB或其功能性变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能性变体的信号传导部分。
在一些实施方案中，CAR包含特异性结合靶抗原的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含特异性结合靶抗原的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内结构域和T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，T细胞共刺激分子是41BB。在任何这样的实施方案中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。抗原结合结构域可以是结合本文所述的任何靶抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合CD19，例如人CD19。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合B7H3，例如人B7H3。在任何这样的实施方案中，跨膜结构域包含CD8的跨膜部分。
在一些实施方案中，CAR包括能够结合B细胞恶性肿瘤中存在的B细胞表面上存在的靶抗原的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，靶抗原存在于非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金淋巴瘤的细胞表面上。在一些实施方案中，靶抗原存在于弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或伯基特淋巴瘤的细胞上。在一些实施方案中，靶抗原是CD19。在一些实施方案中，CAR包含：具有SEQ ID NO:83中所示序列的细胞外抗原结合结构域；具有SEQ ID NO:52中所示序列的跨膜结构域；含有SEQ ID NO:56中所示的4-1BB的信号传导部分的细胞内信号传导结构域；和SEQ ID NO:55中所示的CD3ζ信号传导结构域的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR是或包含SEQ ID NO:117中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:117的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR包括能够结合存在于肿瘤或癌细胞表面上的靶抗原(例如肿瘤抗原或实体瘤抗原)的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，靶抗原存在于神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌和/或结肠直肠癌的细胞表面上。在一些实施方案中，靶抗原存在于神经母细胞瘤癌细胞的表面上。在一些实施方案中，靶抗原存在于卵巢肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，靶抗原是B7H3。在一些实施方案中，CAR包括：具有SEQ ID NO:84中所示序列的细胞外抗原结合结构域；具有SEQ ID NO:52中所示序列的跨膜结构域；含有SEQ ID NO:56中所示的4-1BB的信号传导部分的细胞内信号传导结构域；和SEQ ID NO:55中所示的CD3ζ信号传导结构域的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR是或包含SEQ ID NO:118中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:118的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的CAR包含信号肽，以促进定位到细胞膜用于在细胞表面上表达。在一些实施方案中，信号肽存在于前体CAR蛋白中，并被切割形成成熟CAR。在一些实施方案中，信号肽位于用作CAR的细胞外抗原结合结构域的scFv重链的N末端。在一些实施方案中，信号肽是CD8α信号肽。在一些实施方案中，信号肽是或包含SEQ ID NO:102中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR是或包含SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:38的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR是或包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体是或包含与SEQ ID NO:45的序列展现出至少或约85％、90％、92％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列。
本文提供的CAR可以进一步包括标记物或标签，例如myc标签，用于检测，例如表达、成功转导和/或定量。
B.重组T细胞受体
如本文所述，在一些情况下，嵌合信号传导受体(如部分I中所述)与重组抗原受体(例如重组T细胞受体(TCR))共表达。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体和重组TCR在例如用本文所述的多核苷酸或载体工程化的细胞中表达，以在细胞表面上表达嵌合信号传导受体和TCR。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体和重组TCR包含在两个单独的多核苷酸中。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体和重组TCR包含在单个多核苷酸中，例如部分II-A中所述。
在一些实施方案中，重组TCR对抗原(也称为靶抗原)具有特异性。在一些实施方案中，靶抗原在细胞表面上表达。在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面配体、细胞表面受体或细胞表面标记物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽或其片段。在一些实施方案中，靶抗原是例如由MHC复合物呈递的加工肽抗原。在一些实施方案中，靶抗原是可被重组T细胞受体结合结构域靶向的细胞表达的任何分子。
在一些实施方案中，靶抗原在细胞上选择性地、排他性地表达或过表达。在一些实施方案中，例如，靶抗原在与疾病或病症相关的细胞上表达。与疾病或病症相关的细胞的非限制性例子包括肿瘤细胞、癌细胞、病毒感染细胞或可与健康细胞或组织区分的细胞。在一些实施方案中，靶抗原在肿瘤细胞上表达。在一些实施方案中，靶抗原在癌细胞上表达。
在一些实施方案中，TCR克隆自天然存在的T细胞。在一些实施方案中，从患者中鉴定和分离T细胞克隆。在一些实施方案中，TCR是从用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠产生和分离的。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169–180和Cohen等人(2005)JImmunol.175:5799–5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390–1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349–354。
在一些实施方案中，在获得T细胞克隆后，将TCRα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，α和β链可从克隆的TCR中分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，α和β基因通过小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，例如在部分II-A中所述，因此允许两条链共表达。本文提供的重组TCR可以进一步包括标记物或标签，用于检测，例如表达、成功转导和/或定量。
IV.重组可分泌分子
在一些实施方案中，本文提供的嵌合信号传导受体与可分泌分子在细胞如T细胞中共表达。在一些实施方案中，可分泌分子是双特异性抗体，例如双特异性T细胞衔接器(BiTE)。在一些实施方案中，可分泌分子是细胞因子。
在一些实施方案中，本文提供的嵌合信号传导受体与双特异性靶向分子(例如双特异性T细胞衔接器(BiTE))在细胞如T细胞中共表达。在一些实施方案中，细胞还被工程化以表达重组抗原受体，例如上文部分III中所述的任一种。在一些实施方案中，重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，重组抗原受体是T细胞受体。
在一些实施方案中，双特异性靶向分子是双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两种不同的结合特异性，并因此结合两种不同的抗原。在一个实施方案中，双特异性抗体包含结合第一抗原的第一抗原结合结构域和结合第二抗原的第二抗原结合结构域。在另一个实施方案中，双特异性抗体包含含有第一和第二单链可变片段(scFv)分子的抗原结合结构域。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域结合靶细胞上的抗原和激活T细胞上的抗原。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含对激活T细胞上的至少一种抗原的特异性。激活T细胞抗原包括可激活另一细胞的T细胞表面上发现的抗原。激活T细胞抗原可结合共刺激分子。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或其配体。激活T细胞抗原的例子可包括但不限于CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、或其任何片段。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD3。在这些实施例中，双特异性抗体识别T细胞抗原并被称为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
双特异性抗体或BiTE分子也可以表达为对至少一种靶细胞相关抗原具有特异性的可溶性蛋白。在提供的实施方案中，靶细胞抗原可以是与T细胞受体结合的相同抗原或可以是不同的抗原。靶细胞抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)或病毒、细菌和寄生虫抗原、或其任何片段。靶细胞抗原可包括限定靶细胞的任何类型的配体。例如，可以选择靶细胞抗原以识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞标记物的配体。因此，细胞标记物可作为双特异性抗体中抗原结合结构域的配体，包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫病和癌细胞相关的那些。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自：CD2、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD47、CD52、CD56、CD70、CD79和CD137。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自：4-1BB、5T4、AGS-5、AGS-16、血管生成素2、B7.1、B7.2、B7DC、B7H1、B7H2、B7H3、BT-062、BTLA、CAIX、癌胚抗原、CTLA4、Cripto、ED-B、ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFL7、EpCAM、EphA2、EphA3、EphB2、FAP、纤连蛋白、叶酸受体、神经节苷脂GM3、GD2、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、gp100、gpA33、GPNMB、ICOS、IGF1R、整合素αν、整合素ανβ、KIR、LAG-3、Lewis Y、间皮素、c-MET、MN碳酸酐酶IX、MUC1、MUC16、结合素-4、NKGD2、NOTCH、OX40、OX40L、PD-1、PDL1、PSCA、PSMA、RANKL、ROR1、ROR2、SLC44A4、粘结蛋白聚糖-1、TACI、TAG-72、肌腱蛋白、TIM3、TRAILR1、TRAILR2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及其变体。
在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接器(BiTE)是靶向CD19/CD3、CD20/CD3、CD22/CD3、CD38/CD3、BCMA/CD3、FAP/CD3、PD-L1/CD3、PD-L2/CD3或GD2/CD3的双特异性抗体。例如，双特异性抗体可以是抗CD3×抗GD2双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体的每个抗体是scFv。在一些实施方案中，BiTE包含结合CD19和CD3、CD20和CD3、CD22和CD3、CD38和CD3、BCMA和CD3、FAP和CD3、PD-L1和CD3、PD-L2和CD3或GD2和CD3的scFv。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含多于一个抗原结合结构域。在该实施方案中，至少一个抗原结合结构域包括合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段及其任何组合。用于制备人和人源化抗体的技术在本文别处描述。
在一些实施方案中，所提供的细胞用编码双特异性抗体的核酸工程化，所述双特异性抗体包含对靶细胞上的抗原和激活T细胞上的抗原的双特异性，其中T细胞瞬时分泌双特异性抗体。用于工程化和表达双特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))以及“杵臼结构(knob-in-hole)”工程化(参见例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过工程化静电转向效应来制备抗体Fc异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如，Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)所述制备三特异性抗体来制备。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如，US 2006/0025576A1)。双特异性抗体可以通过连接两种不同的抗体或其部分来构建。例如，双特异性抗体可包含来自两种不同抗体的Fab、F(ab′)2、Fab′、scFv和sdAb。
在一些实施方案中，重组分子是细胞因子，例如白介素。白介素是一组细胞因子，它们通常是介导广泛免疫应答的分泌蛋白和信号分子。在一些实施方案中，将白介素或其功能性部分，或编码其的多核苷酸引入也用嵌合信号传导受体工程化的细胞中。在一些实施方案中，白介素或其功能性部分是IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-18或IL-21中一种或多种的部分或全部肽。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、Flt3-L、SCF或IL-7。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2或其功能性部分。在一些实施方案中，细胞因子是IL-12或其功能性部分。在一些实施方案中，细胞因子是IL-15或其功能性部分。在一些实施方案中，细胞因子是IL-21或其功能性部分。在一些实施方案中，细胞因子可以与细胞因子的相应受体一起引入。细胞因子(例如，IL-2、IL-12、IL-15或IL-21)氨基酸序列可包含成熟细胞因子的任何功能性部分，例如成熟IL-2、成熟IL-12、成熟IL-15或成熟IL-21的任何功能性部分。功能性部分可以是包含作为其一部分的白介素的连续氨基酸的任何部分，条件是功能性部分特异性结合相应的白介素受体。术语“功能性部分”当用于指白介素时是指白介素的任何部分或片段，该部分或片段保留了作为其一部分的白介素(亲本白介素)的生物活性。功能性部分包括，例如，白介素的那些部分，其保持特异性结合相应的白介素受体、激活白介素的下游靶标、和/或诱导免疫细胞如T细胞的分化、增殖(或死亡)和活性中的一种或多种的能力，达到与亲本白介素相似的程度、相同的程度或更高的程度。白介素的功能性部分的生物活性可以使用本领域已知的测定法测量。关于亲本白介素，功能性部分可包含例如亲本成熟白介素的氨基酸序列的约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
V.细胞疗法
在一些方面，本文提供的嵌合信号传导受体用于细胞疗法以治疗疾病或病症，例如癌症。在一些实施方案中，如部分I-A中所述的嵌合信号传导受体与重组抗原受体(例如，如部分III中所述的CAR或重组TCR)在用于细胞疗法的工程化细胞中共表达。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体的存在防止肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞抑制。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体激活TME中的免疫细胞。例如，在TME含有TGFβ的情况下，在工程化细胞的表面上表达的嵌合信号传导受体可以结合TGFβ，导致诱导可以激活免疫细胞的MyD88依赖性信号传导途径。在一些实施方案中，嵌合信号传导受体还减少或最小化通过其天然的免疫细胞抑制途径的TGFβ信号传导。因此，在一些实施方案中，嵌合信号传导受体可以增加细胞疗法的活性、功效和/或持久性，甚至在存在免疫抑制TME的情况下。通过逆转和/或防止TME中免疫细胞的抑制，免疫细胞可产生针对肿瘤细胞的有效应答。
还提供了工程化以表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体的细胞群，含有此类细胞和/或富集此类细胞的组合物。组合物包括用于施用(例如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。还提供了用于向受试者(例如，患者)施用所述细胞和组合物的治疗方法。
在一些实施方案中，细胞疗法的细胞是经由基因工程化将编码嵌合信号传导受体和重组抗原受体的一种或多种核酸引入(例如通过转导或电穿孔)细胞而被工程化的，从而使细胞共表达两种受体。在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将所述细胞与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记物的表达测量的)的刺激物组合，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
A.用于基因工程化的细胞
根据本文所述的方法(参见，例如，第II部分和下文)用于基因工程化的合适细胞包括免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞获自健康受试者。在一些实施方案中，免疫细胞获自患有疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，免疫细胞是原代细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自体的。在一些实施方案中，免疫细胞是同种异体的。
在一些实施方案中，用于基因工程化的细胞是能够靶向和/或浸润癌细胞或肿瘤的免疫细胞。例如，在一些情况下，免疫细胞是靶向和/或浸润癌细胞和/或肿瘤以进行细胞杀伤的细胞。在一些实施方案中，用于工程化的免疫细胞是淋巴细胞，例如T细胞、自然杀伤(NK)细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在某些方面，用于基因工程化的免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，用于细胞疗法的工程化细胞是T细胞。T细胞可基于细胞表面标记物表达如CD3、CD4和/或CD8表达进行分类。因此，在一些实施方案中，T细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，该T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，该T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞。例如，细胞毒性T细胞能够杀伤细胞，例如癌细胞、受损细胞和/或感染细胞，例如病毒感染细胞。在一些实施方案中，细胞毒性T细胞是CD8+细胞毒性T细胞。
在某些情况下，用于工程化的T细胞是CD4+或CD8+T细胞的亚型。例如，在一些实施方案中，用于工程化的CD4+或CD8+T细胞是CD4+或CD8+幼稚T细胞、CD4+或CD8+中央记忆T细胞、CD4+或CD8+效应T细胞、或CD4+或CD8+效应记忆T细胞。在一些实施方案中，T细胞亚型是幼稚T细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)、中央记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、TEMRA细胞或终末分化的效应记忆T细胞。在一些实施方案中，T细胞亚型的任一种、全部或子集(例如本文所述)可用于基因工程化。
在一些方面，用于基因工程化的免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，用于细胞疗法的工程化细胞是NK细胞。NK细胞是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，用于工程化的NK细胞是CD3-、CD56+、CD94+、CD122/IL-2Rβ+、CD127/IL-7α-、FcγRIII/CD16+、FcγRIII/CD16-、KIR家族受体+、NKG2A+、NKG2D+、NKp30+、NKp44+、NKp46+和/或NKp80+。在一些实施方案中，NK细胞是CD56+/CD3-。在一些实施方案中，NK细胞是CD56+。在一些实施方案中，CD56+/CD3-NK细胞是CD7+/CD127-/NKp46+/T-bet+/Eomes+。在一些实施方案中，NK细胞是CD16+/CD56+。在一些实施方案中，NK细胞是CD16-/CD56+。在一些实施方案中，NK细胞是CD3-/CD16+/CD56+。在一些实施方案中，NK细胞是CD3-/CD16-/CD56+。在一些实施方案中，NK细胞亚型的任一种、全部或子集(例如本文所述)可用于基因工程化。
在一些方面，用于基因工程化的免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，用于细胞疗法的工程化细胞是TIL。TIL包括从血流迁移到肿瘤部位的白细胞如T细胞和B细胞。在一些实施方案中，TIL在肿瘤基质中发现。在一些实施方案中，TIL在肿瘤本身中发现。在一些实施方案中，TIL进行肿瘤细胞杀伤。在一些实施方案中，TIL是CD3+。在一些实施方案中，TIL亚型的任一种、全部或子集(例如本文所述)可用于基因工程化。
B.细胞基因工程化方法
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入嵌合信号传导受体的细胞可以从样品(如生物样品，例如获自或源自受试者的样品)中分离。在一些实施方案中，细胞分离自患有疾病或病症或需要细胞疗法或将向其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。在一些实施方案中，细胞被进一步工程化以表达重组抗原受体，例如CAR或TCR。
用于工程化的细胞可以衍生、分离、或以任何方式获自样品，所述样品例如但不限于直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个处理步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。在一些实施方案中，生物样品是直接从生物来源获得的样品。在一些实施方案中，生物样品是被加工的样品。生物样品的非限制性例子包括体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些实施方案中，细胞衍生自或分离自血液或血液衍生的样品，例如单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在一些实施方案中，样品获自自体来源。在一些实施方案中，样品获自同种异体来源。在一些实施方案中，用于工程化的细胞获自或衍生自细胞系。
在一些实施方案中，将获自样品的细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以除去不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或除去对特定试剂敏感的细胞。在一些实施方案中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，细胞类型可以基于一种或多种特定分子(例如表面标记物(例如表面蛋白)、细胞内标记物或核酸)在细胞中的表达或存在来彼此分离。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记物的用于分离的方法。在一些实施方案中，分开是基于亲和力或基于免疫亲和力的分开。
本文考虑的分离技术可以基于阳性选择(其中保留已结合试剂的细胞以供进一步使用)、阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)或阳性和阴性选择。在一些情况下，阴性选择是有用的，其中没有抗体可用于分离特定标记物，例如表面分子。
在一些实施方案中，细胞的分离导致特定类型的细胞的富集。在一些实施方案中，富集是特定细胞类型的65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％或更多，或其间的任何百分比。
在一些实施方案中，富集特定的细胞亚群。在一些实施方案中，富集的细胞是在部分III-A中描述的那些。在一些实施方案中，富集T细胞及其亚型，例如部分III-A中所述。在一些实施方案中，富集NK细胞。在一些实施方案中，富集TIL。
分离和/或其他步骤可根据分离待工程化细胞的合适方法进行。在一些实施方案中，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotic)进行分离，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上的细胞的自动化分离。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的所有部件并引导系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并且与夹管阀一起确保缓冲液在系统中的受控流动和细胞的持续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌、无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞之后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预装配的无菌管路(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序之后，系统自动地将细胞样品施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群在去除磁场之后从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许自动化洗涤和通过离心来分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，所述图像识别软件通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，可以将外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成的细胞培育室，所述细胞培育室完成细胞培养方案，如例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见，例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72–82,和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记物染色的细胞携载于流体流中。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分选来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376。在两种情况下，可以用多种标记物来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记物来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记物具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞是在流体流中进行，如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞术检测系统组合。此类方法允许同时基于多种标记物进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，所述制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。
在一些实施方案中，所提供的方法包括培育、孵育、培养和/或基因工程化步骤。例如，在一些实施方案中，提供了用于孵育耗尽的细胞群和培养起始组合物和/或将它们工程化的方法。
因此，在一些实施方案中，在培养起始组合物中孵育细胞群。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或与基因工程化结合孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：在群体中诱导细胞的增殖、扩增、激活和/或存活以模拟抗原暴露和/或引发细胞用于遗传工程化(例如用于引入嵌合信号传导受体和/或重组抗原受体，例如本文所述)。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和旨在激活细胞的任何其他试剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
用于引入基因工程化组分例如嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码嵌合信号传导受体的核酸的那些方法，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子(例如睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统)。基因转移的方法可以包括转导、电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法。本文所述的方法还适用于将编码重组抗原受体(例如CAR、TCR)的核酸引入免疫细胞中，包括当此类核酸是包含嵌合信号传导受体的双、三或多顺反子多核苷酸的一部分时。
在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将所述细胞与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记物的表达测量的)的刺激物组合，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。在一些实施方案中，在转导、转染或本文所述或本领域可用的其他方式之前，例如使用CD28/CD3(例如或/>)激活待工程化的细胞。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒粒子(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将核酸或多核苷酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到免疫细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol TherNucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550–557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，经由电穿孔将重组核酸转移到免疫细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到免疫细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther NuclAcids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码嵌合信号传导受体的核酸的其他方法和载体是例如在国际专利申请公开号WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、TIL可以在扩增期间或之后用例如嵌合信号传导受体转染或转导。在一些实施方案中，免疫细胞例如T细胞在扩增期间或之后用例如嵌合信号传导受体转染或转导。这种转染或转导可以用例如任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。第二种类型的刺激物可包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物。在重组抗原受体也在细胞中表达的情况下，遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigenreceptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些实施方案中，扩增转染或转导的细胞。在一些实施方案中，将工程化细胞扩增直至达到期望的阈值。
C.工程化细胞的示例性特性
在一些方面，本文所述的嵌合信号传导受体在工程化细胞中的表达增加工程化细胞的持久性、暴露、增殖和/或细胞毒性活性。例如，嵌合抗原受体的表达可以阻止工程化细胞例如免疫细胞的抑制，从而允许所述工程化细胞持续存在、增殖和/或杀死靶细胞。
在一些实施方案中，例如与未被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞相比，被工程化以表达本文所述的嵌合信号传导受体的细胞在存在免疫抑制环境(例如TME)的情况下具有增加的持久性、暴露、增殖和/或细胞毒性活性。在一些实施方案中，例如与未被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞相比，被工程化以表达本文所述的嵌合信号传导受体的细胞在存在TME的情况下具有增加的持久性、暴露、增殖和/或细胞毒性活性。在一些实施方案中，与未被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞相比，被工程化以表达本文所述的嵌合信号传导受体的细胞在存在能够抑制免疫活性的分子(例如细胞因子)的情况下具有增加的持久性、暴露、增殖和/或细胞毒性活性。在一些实施方案中，与未被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞相比，被工程化以表达本文所述的嵌合信号传导受体的细胞在存在TGFβ的情况下具有增加的持久性、暴露、增殖和/或细胞毒性活性。因此，在一些实施方案中，与未被工程化以表达嵌合信号传导受体或被工程化以仅表达重组抗原受体的细胞相比，被工程化以表达本文所述的嵌合信号传导受体本身或与重组抗原受体例如本文所述的CAR、TCR组合的细胞具有增加的持久性、暴露、增殖和/或细胞毒性活性。
1.工程化细胞持久性、暴露和增殖
在一些实施方案中，被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞的暴露、持久性和增殖可通过在体外、离体或体内评估工程化细胞的特征来测量。在一些实施方案中，被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞被进一步工程化以表达重组抗原受体，例如CAR、TCR。被工程化以共表达本文所述的嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR、TCR)的细胞的持久性和增殖也可如本文所述在体外、离体或体内测定中评估。
在一些实施方案中，评估在施用工程化细胞后受试者中表达嵌合信号传导受体的细胞(例如，施用用于细胞疗法的表达嵌合信号传导受体的细胞，任选地还含有重组抗原受体)的存在和/或量。在一些方面，使用定量PCR(qPCR)评估表达嵌合信号传导受体的细胞在受试者的血液或血清或器官或组织样品(例如，疾病部位，例如肿瘤样品)中的量。在一些方面，持久性被定量为每微克的DNA中编码嵌合信号传导受体的DNA或质粒的拷贝，或者定量为每微升的样品(例如，血液或血清)中表达嵌合信号传导受体的细胞的数量，或者每微升的样品中外周血单个核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数量。在细胞已被工程化以共表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如，CAR、TCR)的情况下，本文所述的方法也可用于评估或定量重组抗原受体。
指示扩增和/或持久性的表达嵌合信号传导受体的细胞(例如施用用于细胞疗法)的暴露(例如，数量)可以根据以下方面来陈述：暴露至受试者的表达嵌合信号传导受体的细胞的最大数量、可检测的表达嵌合信号传导受体的细胞或高于某一数量或百分比的表达嵌合信号传导受体的细胞的持续时间、表达嵌合信号传导受体的细胞数量相对于时间的曲线下面积和/或其组合和其指示物。暴露可以使用已知方法来评估，例如使用qPCR来检测与特定样品(例如血液、血清、血浆或组织，如肿瘤样品)中核酸或DNA的总量相比，编码嵌合信号传导受体的核酸的拷贝数；和/或使用流式细胞术测定，通常使用对嵌合信号传导受体具有特异性的抗体来检测表达嵌合信号传导受体的细胞。在细胞已被工程化以共表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如，CAR、TCR)的情况下，本文所述的方法也可用于评估或定量重组抗原受体。
还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，所述功能细胞如能够结合和/或中和和/或诱导针对疾病或病症的细胞和/或如果细胞被工程化以共表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体，则表达被重组抗原受体识别的抗原的细胞的应答，例如细胞毒性应答。
在一些方面，表达嵌合信号传导受体的细胞显示出高体内增殖，例如，通过流式细胞术所测量的。在一些方面，检测细胞的高峰比例。例如，在一些实施方案中，在施用表达嵌合信号传导受体的细胞之后，在受试者的血液或疾病部位或其白细胞级分(例如，PBMC级分)中的水平峰值或最大值下，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞表达嵌合信号传导受体。
在一些实施方案中，在施用表达嵌合信号传导受体的工程化细胞后至少20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天或更长时间，表达嵌合信号传导受体的细胞在受试者的血清、血浆、血液或组织(例如肿瘤样品)中是可检测的，例如通过指定方法(例如基于qPCR或流式细胞术的检测方法)检测。细胞数量可以如通过基于流式细胞术或基于定量PCR的方法来检测，并使用已知方法外推至总细胞数量。参见例如，Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)；Park等人,Molecular Therapy 15(4):825–833(2007)；Savoldo等人,JCI 121(5):1822-1826(2011)；Davila等人,(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Davila等人,Oncoimmunology1(9):1577-1583(2012)；Lamers,Blood 2011 117:72-82；Jensen等人,Biol Blood Marrow Transplant 2010年9月；16(9):1245–1256；Brentjens等人,Blood 2011 118(18):4817-4828。
在一些实施方案中，与通过施用缺乏嵌合信号传导受体的细胞获得的相比，在施用工程化细胞后，受试者的体液、血浆、血清、血液、组织、器官和/或疾病部位(例如肿瘤部位)中表达嵌合信号传导受体的浓度细胞随时间的曲线下面积(AUC)更大。
在一些方面，受试者中工程化细胞的增加或延长的扩增和/或持久性与受试者中肿瘤相关结果的益处相关。在一些实施方案中，肿瘤相关结果包括受试者体内肿瘤负荷的减少。在一些实施方案中，在所述方法的施用后，肿瘤负荷的减少量是为或是至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，与已经被施用缺乏嵌合信号传导受体的细胞的受试者相比，在施用含有嵌合信号传导受体的工程化细胞后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负担或体积降低至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多。
2.工程化细胞功能活性
在一些实施方案中，被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞的功能活性可通过在体外、离体或体内评估工程化细胞的特征来测量。在一些实施方案中，被工程化以表达嵌合信号传导受体的细胞被进一步工程化以表达重组抗原受体，例如CAR、TCR。被工程化以共表达本文所述的嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR、TCR)的细胞的功能活性也可在体外、离体或体内评估。
在一些实施方案中，可以使用本领域中用于评估含有嵌合信号传导受体的细胞的活性(例如细胞毒性或细胞溶解活性)的任何已知测定。在一些实施方案中，表达嵌合信号传导受体的细胞与靶抗原的特异性结合可在体内(例如通过成像)或离体(例如通过ELISA或流式细胞术)评估。在某些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的方法(如描述于例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中的细胞毒性测定)测量表达嵌合信号传导受体的细胞破坏靶细胞的能力。在某些实施方案中，通过评估一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2、GM-CSF和TNFα)的表达和/或分泌和/或通过评估细胞溶解或细胞毒性活性来测量表达嵌合信号传导受体的细胞的生物活性。
在一些实施方案中，用于工程化表达嵌合信号传导受体的细胞的的活性、增殖和/或功能的测定包括但不限于ELISPOT、ELISA、细胞增殖、细胞毒性淋巴细胞(CTL)测定、与抗原表位、或细胞内细胞因子染色、增殖测定、淋巴因子分泌测定、直接细胞毒性测定和有限稀释测定。在一些实施方案中，可以测量工程化细胞的增殖应答，例如通过将3H-胸苷、BrdU(5-溴-2'-脱氧尿苷)或2'-脱氧-5-乙炔基尿苷(EdU)掺入它们的DNA中或使用诸如羧基荧光素二乙酸酯琥珀γ分泌酶抑制酯(CFSE)、CellTrace Violet或膜染料PKH26的染料稀释测定。
在一些实施方案中，评估工程化表达嵌合信号传导受体的细胞的活性、增殖和/或功能包括测量工程化细胞的细胞因子产生，和/或测量来自受试者的生物样品(例如血浆、血清、血液和/或组织样品，例如肿瘤样品)中的细胞因子产生。在一些情况下，此类所测量的细胞因子可以包括但不限于白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、TNF-α(TNFα)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD107a和/或TGF-β(TGFβ)。测量细胞因子的测定是本领域所熟知的，并且包括但不限于ELISA、细胞内细胞因子染色、流式微珠阵列、RT-PCR、ELISPOT、流式细胞术和在存在测试样品的情况下测试对相关细胞因子有反应的细胞的反应性(例如，增殖)的生物测定。
在一些实施方案中，评估工程化表达嵌合信号传导受体的细胞的活性、增殖和/或功能包括评估细胞表面标记物表达，例如表型。在一些实施方案中，评估工程化细胞的细胞激活标记物、细胞耗竭标记物和/或分化标记物的表达。在一些实施方案中，在施用前评估细胞表型。在一些实施方案中，在向受试者施用后评估细胞表型。用于评估的示例性免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、TIL细胞激活标记物、耗竭标记物和/或分化标记物包括本领域已知用于特定免疫细胞子集的任何标记物，例如CD25、CD38、人白细胞抗原-DR(HLA-DR)、CD69、CD44、CD137、KLRG1、CD62Llow低、CCR7low低、CD71、CD2、CD54、CD58、CD244、CD160、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)和/或基于T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)(参见例如，Liu等人,Cell Death and Disease(2015)6,e1792)。
在一些方面，检测表达水平包括进行体外测定。在一些实施方案中，体外测定是免疫测定、基于适配体的测定、组织学或细胞学测定或mRNA表达水平测定。在一些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧流免疫测定、抑制测定或亲合力测定来检测一种或多种因子、效应子、酶和/或表面标记物各自的一种或多种的一个或多个参数。在一些实施方案中，细胞因子和/或表面标记物的检测是使用特异性结合至少一种标记物的结合试剂来确定的。在一些情况下，结合试剂是抗体或其抗原结合片段、适体或核酸探针。
VI.组合物、配制品和施用方法
还提供了含有如本文所述的嵌合信号传导受体的组合物。在一些实施方案中，本文提供的组合物含有被工程化以表达嵌合信号传导受体和任选地重组抗原受体(例如CAR、TCR)的细胞。在一些实施方案中，本文提供的组合物含有被工程化以表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR、TCR)的细胞。还提供了含有工程化细胞的组合物，包括药物组合物和配制品。还提供了组合物的使用方法和用途，例如用于治疗疾病、病症和障碍，例如癌症。
在一些实施方案中，组合物包含用嵌合信号传导受体工程化的多个细胞。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％细胞(例如T细胞)包含嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体工程化或表达嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约60％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体工程化或表达嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约70％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体工程化或表达嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约80％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体工程化或表达嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约90％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体工程化或表达嵌合信号传导受体。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在一些实施方案中，组合物包含用嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化的多个细胞。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％细胞(例如T细胞)包含嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化或表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约60％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化或表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约70％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化或表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约80％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化或表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约90％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化或表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。
在一些实施方案中，组合物包含用嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸工程化的多个细胞。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％细胞(例如T＝细胞)包含嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约50％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸工程化或表达嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约60％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸工程化或表达嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约70％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸工程化或表达嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约80％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸工程化或表达嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物中至少或至少约90％细胞(例如T细胞)用嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸工程化或表达嵌合信号传导受体和编码重组可分泌分子(例如双特异性抗体，例如BiTE，或细胞因子)的多核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。
A.组合物/配制品
本文提供了含有表达本文所述的嵌合信号传导受体的任何工程化细胞的组合物。药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。例如，药物组合物可含有一种或多种赋形剂，以用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在一些方面，技术人员理解，含有细胞的药物组合物可以与含有蛋白质的药物组合物不同。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
配制品或组合物还可以含有可用于用表达嵌合信号传导受体的细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物进一步包含其他药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，表达嵌合信号传导受体的细胞以盐(例如药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无机酸的那些，该无机酸是如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，以及衍生自有机酸的那些，该有机酸是如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸(例如，对甲苯磺酸)。
在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的表达本文所述的嵌合信号传导受体的工程化细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的表达本文所述的嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如，CAR、TCR)的工程化细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用所述组合物、通过多次推注施用所述组合物或通过连续输注施用所述组合物来递送。
在一些实施方案中，使用标准施用技术、配制品和/或设备施用表达本文所述的嵌合信号传导受体的工程化细胞。在一些实施方案中，使用标准施用技术、配制品和/或设备施用表达本文所述的嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR、TCR)的工程化细胞。提供了用于储存和施用组合物的配制品和设备(如注射器和小瓶)。工程化细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且施用至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射(包括导管施用)、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用来施用。在施用治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于静脉内、腹膜内或皮下施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用细胞群。如本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送将细胞群施用给受试者。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液或分散体，其在一些方面可以缓冲至所选pH)提供。液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。液体组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以是冻干的。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等)来确保。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
B.施用方法
提供了所提供的表达嵌合信号传导受体的工程化细胞和此类工程化细胞的组合物在各种治疗应用中的方法和用途，例如治疗或预防疾病、病症和障碍，包括癌症。在特定实施方案中，疾病、病症或障碍是癌症，并且靶细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，工程化细胞展现出针对疾病、病症或障碍的靶细胞的治疗活性，从而治疗疾病、病症或障碍。在一些实施方案中，工程化细胞表达所提供的嵌合信号传导受体并且还表达重组抗原受体，例如CAR或TCR，其中所述重组抗原受体针对与疾病、病症或障碍的靶细胞相关或在其上表达的靶抗原。在一些实施方案中，工程化细胞展现出针对疾病、障碍或病症的靶细胞的细胞毒性，诸如展现出针对肿瘤细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，疾病、病症或障碍是实体瘤。
这样的方法和用途包括治疗性方法和用途，例如，其涉及将工程化细胞或含有所述工程化细胞的组合物施用于患有疾病、病症或障碍的受试者。在一些情形中，如所述，疾病或障碍是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，以实现疾病或障碍的治疗的有效量施用工程化细胞。用途包括工程化细胞在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，方法通过向患有或怀疑患有该疾病或病症的受试者施用工程化细胞或包含其的组合物来进行。在一些实施方案中，方法由此治疗受试者的疾病或病症或障碍。
在一些实施方案中，将例如表达嵌合信号传导受体或嵌合信号传导受体和重组抗原受体的工程化细胞及其组合物例如通过过继细胞疗法施用至患有待治疗的特定疾病或病症的受试者或患者。在一些实施方案中，过继细胞疗法是T细胞疗法。在一些实施方案中，过继细胞疗法是NK细胞疗法。在一些实施方案中，过继细胞疗法是TIL细胞疗法。在一些实施方案中，将例如表达嵌合信号传导受体或嵌合信号传导受体和重组抗原受体的所提供的工程化细胞及其组合物施用至受试者，例如患有疾病或病症或处于疾病或病症风险中的受试者。在一些方面中，方法由此治疗(例如，减轻)疾病或病症的一种或多种症状。
用于过继细胞疗法的工程化细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，向其施用细胞、细胞群或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结果或表型的完全或部分改善或减轻。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓和、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、减轻或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的影响。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用的，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数之外在其他方面相同的条件相比时，或者可替代地，与另一种情况相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在施用的情况下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效动力学作用的量。所述治疗有效量可以根据诸如疾病状态、受试者的年龄、性别和体重以及施用的细胞群等因素而变化。在一些实施方案中，所提供的方法包括以有效量(例如治疗有效量)施用细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病状况或障碍的病因学相关和/或参与其中，例如导致、加剧这种疾病、病症或障碍或以其他方式参与其中。在一些实施方案中，与疾病状况或障碍的病因学相关和/或参与其中，例如导致、加剧这种疾病、病症或障碍或以其他方式参与其中的抗原是靶抗原。与疾病状况或障碍的病因学相关和/或参与其中，例如导致、加剧这种疾病、病症或障碍或以其他方式参与其中的抗原在本文中可替代地称为靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。上文，例如在部分II-B-1中描述了示例性抗原，例如靶抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在一些实施方案中，表达嵌合信号传导受体的细胞是TIL，其天然结合靶抗原。在一些实施方案中，表达嵌合信号传导受体的细胞是NK细胞，其天然具有细胞毒性活性。在一些实施方案中，被工程化以表达本文提供的嵌合信号传导受体的细胞也被工程化以表达本文所述的重组抗原受体，例如CAR或TCR。在一些实施方案中，表达嵌合信号传导受体和重组抗原受体的工程化细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，CAR或重组TCR特异性结合与疾病或病症相关的抗原，嵌合信号传导受体结合存在于例如肿瘤微环境中的免疫抑制或抗炎细胞因子，例如TGFβ、IL10、IL4、IL1Ra。
在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症包括例如在细胞表面上表达B7H3的细胞。在一些实施方案中，CAR、重组TCR或TIL结合的靶抗原是B7H3。在一些实施方案中，待治疗的含有表达B7H3的细胞的疾病或病症是神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌和/或结肠直肠癌。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是神经母细胞瘤。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是卵巢癌。
在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症包括例如在细胞表面上表达CD19的细胞。在一些实施方案中，CAR、重组TCR或TIL结合的靶抗原是CD19。在一些实施方案中，待治疗的含有表达CD19的细胞的疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或伯基特淋巴瘤。
因此，所提供的方法和用途包括用于过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将所述工程化细胞或含有所述工程化细胞的组合物施用至受试者、组织或细胞，如患有、有风险患上或怀疑患有所述疾病、病症或障碍的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，将所述细胞、群体和组合物施用至患有有待例如经由过继细胞疗法如过继T细胞疗法治疗的特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，将所述细胞或组合物施用至所述受试者，如患有或有风险患上所述疾病或病症的受试者，改善所述疾病或病症的一个或多个症状。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受细胞疗法的受试者或从源自这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和加工后将所述细胞施用给同一受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞施用至相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者与第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。细胞可以通过任何合适的方式施用。给药和施用可以部分取决于施用是短暂的还是长期的。各种给药时间表包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或其他药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任何顺序依次施用。在一些实施方案中，细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗性干预联合施用(同时或以任何顺序依次施用)。在一些情境下，将细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施方案中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之后施用。在一些实施方案中，方法包括施用化学治疗剂。
在施用工程化细胞后，在一些实施方案中，工程化细胞群的生物活性例如通过多种已知方法中的任一种来测量，例如部分III-C中所述。要评估的参数包括在体内(例如通过成像)或离体(例如通过ELISA或流式细胞术)工程化或天然细胞与抗原的特异性结合。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在一些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(例如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量工程化细胞的生物活性。在一些方面中，通过评估临床结果(如肿瘤负担或负荷的减少)来测量生物活性。
VII.试剂盒和制品
还提供了制品或试剂盒，其包含所提供的嵌合信号传导受体、重组抗原受体(例如CAR、TCR)、基因工程化细胞(包括被工程化以表达本文所述的嵌合信号传导受体的细胞或被工程化以共表达本文所述的嵌合信号传导受体和重组抗原受体的细胞，例如本文所述)、和/或包含所述工程化细胞的组合物。制品可以包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、试管、IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。在一些实施方案中，容器具有无菌入口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可被注射用针刺穿的塞子的那些。所述制品或试剂盒可还包括包装说明书，其指示所述组合物可以用于治疗特定病症，例如本文所述的病症。可替代地或另外地，所述制品或试剂盒可以进一步包含另一个或相同的含有药学上可接受的缓冲液的容器。它可进一步包括其他材料，如其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和/或注射器。
标签或包装插页可以指示将组合物用于治疗个体中的特定疾病、障碍或病症，例如文中所述的疾病。在容器上的或与所述容器相关联的标签或包装插页可指示关于重建和/或使用配制品的指导说明。标签或包装插页还可以指示，所述配制品用于或意图用于皮下、静脉内或其他施用方式，用于治疗或预防个体中的疾病、障碍或病症。在一些方面，标签或包装插页可包括使用说明，例如用于施用工程化细胞、工程化细胞以表达本文所述的嵌合信号传导受体、工程化细胞以共表达本文所述的嵌合信号传导受体和重组抗原受体的说明，在一些方面，根据本文所述的任何方法或用途。
在一些实施方案中，容器容纳有效治疗和/或预防疾病或病症例如癌症的组合物。制品或试剂盒可以包括其中含有组合物的容器，其中组合物包括表达本文提供的嵌合信号传导受体的工程化细胞，并且该制品或试剂盒还包括标签或包装插页上的说明，用于用治疗有效量的工程化细胞治疗受试者。制品或试剂盒可包括其中含有组合物的容器，其中组合物包括表达本文提供的嵌合信号传导受体和重组抗原受体(例如CAR或TCR)的工程化细胞，并且该制品或试剂盒还包括标签或包装插页上的说明，用于用治疗有效量的工程化细胞治疗受试者。
VIII.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解，在所述范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，结构域(通常为三个或更多个，通常为5或7个或更多个氨基酸的序列，如10至200个氨基酸残基)是指分子(如蛋白质或编码核酸)的一部分，所述部分在结构上和/或功能上与分子的其他部分不同并且是可鉴定的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，该多肽链的那些部分可以在由一个或多个结构基序构成的蛋白质内形成独立折叠的结构和/或通过功能活性(如结合活性)识别。蛋白质可具有一个或多于一个独特结构域。例如，结构域可依据一级序列或结构与相关家族成员的同源性(例如与基序的同源性)来鉴别、定义或区分。在另一个例子中，结构域可以通过其功能来区分，例如与生物分子(例如MyD88衔接子的结构域与IRAK4信号传导激酶之间的相互作用)相互作用的能力。结构域可独立地展现生物学功能或活性，使得结构域可独立地或与另一份子融合后发挥活性，例如结合。结构域可以是线性氨基酸序列或非线性氨基酸序列。多种多肽含有多个结构域。所述结构域是已知的，并且可由本领域技术人员来鉴别。对于本文中的示例，提供定义，但应理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可采用适当软件来鉴别结构域。
如本文所用，可互换使用的术语“细胞外结构域”或“胞外域”是指位于囊泡膜外的膜蛋白(如跨膜蛋白)的区域。胞外域通常包含特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域，如特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域。
如本文所用，可互换使用的术语“胞内域”或“细胞内结构域”或“细胞质结构域”是指在一些膜蛋白(例如跨膜蛋白)中发现的区域，其延伸至由细胞表面膜界定的内部空间中。在哺乳动物细胞中，胞内结构域是膜蛋白的细胞质区域。在细胞中，胞内结构域与细胞内成分相互作用，并且可在信号转导中发挥作用，并且因此在一些情况下可以是细胞内信号传导结构域。细胞跨膜蛋白的胞内结构域可替代地称为细胞质结构域，其在一些情况下可以是细胞质信号传导结构域。
如本文所用的术语“跨膜结构域”意指在基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白中发现的结构域，所述脂质双层例如在生物膜(例如哺乳动物细胞)中或在人工构建体(例如脂质体)中发现的那些脂质双层。跨膜结构域通常可通过任何数目的市售生物信息学软件应用，基于其相对于与水性环境(例如胞质溶胶、细胞外液)相互作用的蛋白质区域提高的疏水性，从其氨基酸序列来预测。跨膜结构域通常为跨越膜的疏水性α螺旋。跨膜蛋白可一次或多次穿过脂质双层的两层。
本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质的如下的能力：在特定结合条件下与靶蛋白结合，使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质对足够统计学大小的随机肽或多肽的集合的平均亲和力或亲合力的至少5倍，但任选地至少10、20、30、40、50、100、250或500倍，或甚至至少1000倍。特异性结合蛋白不需要专一地与单个靶分子结合，但由于靶标与非靶标(例如，旁系同源物或直系同源物)之间的结构构象的相似性，可以特异性结合非靶分子。本领域技术人员将认识到，与在不同动物物种中具有相同功能的分子(即直系同源物)特异性结合或与具有与靶分子基本相似的表位的非靶分子(例如，旁系同源物)的特异性结合是可能的，并且不会降低相对于统计学上有效的一系列独特非靶标(例如随机多肽)确定的结合特异性。由于交叉反应性，因此多肽可以与多于一种的不同种类的靶分子特异性结合。可使用固相ELISA免疫测定或Biacore测量来确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用具有小于1×10-5M的解离常数(Kd)，并且通常低至1×10-12M。在本公开的某些实施方案中，两种结合蛋白之间的相互作用具有1x10-6 M、1x10-7 M、1x10-8 M、1x10-9 M、1x10-10 M或1x10-11 M的解离常数。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集”是指例如与组合物中的总细胞数或组合物的体积相比或者相对于其他细胞类型，如通过基于群体或细胞表达的标记物的阳性选择，或通过基于在待耗尽的细胞群或细胞上不存在的标记物的阴性选择来增加细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物中完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在富集的组合物中以等于或甚至接近100％存在。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记物呈“阳性”的陈述是指特定标记物(通常为表面标记物)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记物呈“阴性”的陈述是指特定标记物(通常为表面标记物)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用的，术语“表达”是指借此基于核酸分子(如基因)的编码序列产生多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。
如本文所用，受试者包括任何活的生物体，如人和其他哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人和非人动物，包括农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。
如本文所用的，对照是指除了没有用测试参数处理外与测试样品基本上相同的样品，或者如果是血浆样品，它可以来自不受目标条件影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用，“可操作地连接(operably linked或operatively linked)”是指当合适的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时，组分(例如DNA序列，例如异源核酸)和调节序列以允许基因表达的方式缔合。因此，这意味着所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。
如本文所用，当关于核苷酸序列(参考核苷酸序列)或氨基酸序列(参考氨基酸序列)使用时，“百分比(％)序列同一性”和“百分比同一性”分别定义为在比对序列且必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考序列中的残基相同的核苷酸残基或氨基酸残基的百分比。用于确定序列同一性百分比的目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。所述载体尤其是病毒载体，如慢病毒载体。
IX.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种嵌合信号传导受体，所述嵌合信号传导受体包含：
(a)TGFβ受体(TGFβR)的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分；
(b)跨膜结构域；
(c)第一截短的MyD88多肽，其缺乏全长MyD88的全长TIR结构域；以及
(d)第二截短的MyD88结构域，其缺乏全长MyD88的全长TIR结构域。
2.根据实施方案1所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR是TGFβR2。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的嵌合信号传导受体，其中所述细胞外结构域或其部分包含：
(i)SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:20中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列；或
(iii)结合TGFβ的(i)或(ii)的一部分。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述细胞外结构域或其部分如SEQ ID NO:20中所示。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域包含所述TGFβR的天然跨膜结构域。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域如SEQ ID NO:22中所示。
8.根据实施方案1-4中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域是来自除所述TGFβR以外的跨膜蛋白的异源跨膜结构域。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域和所述第一截短的MyD88多肽直接连接。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域和所述第一截短的MyD88多肽通过接头间接连接。
11.根据实施方案10所述的嵌合信号传导受体，其中所述接头是或包含肽接头。
12.根据实施方案10所述的嵌合信号传导受体，其中所述接头是或包含所述TGFβR的细胞质结构域的N末端连续氨基酸的部分序列，其为非功能性部分，其中所述非功能性部分不是能够介导抑制性信号传导的功能性抑制性信号传导结构域。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述细胞内结构域不能募集抑制性衔接分子，任选地SMAD。
14.根据实施方案10、12或13所述的嵌合信号传导受体，其中所述接头是SEQ IDNO:129中所示的TGFβR2细胞质结构域的氨基酸1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24或1-25，任选地其中所述接头如SEQ ID NO:24中所示。
15.一种嵌合信号传导受体，所述嵌合信号传导受体包含(i)TGFβ受体(TGFβR)的一部分，其含有所述细胞外结构域和所述跨膜结构域，其中所述部分小于所述全长TGFβR并且缺乏所述全长TGFβR的功能性抑制性信号传导结构域；和(ii)细胞内结构域，其含有缺乏全长MyD88的全长TIR结构域的第一截短的MyD88多肽和缺乏全长MyD88的全长TIR结构域的第二截短的MyD88结构域。
16.根据实施方案15所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR是TGFβR2。
17.根据实施方案15或实施方案16所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。
18.根据实施方案15-17中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分如SEQ ID NO:3中所示。
19.根据实施方案15-18中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分与所述细胞内结构域直接连接。
20.根据实施方案15-18中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分和所述细胞内结构域通过肽接头间接连接。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二MyD88多肽各自包含MyD88的死亡结构域(DD)、中间结构域(ID)和全长TIR结构域的一部分。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二MyD88多肽各自独立地是选自以下的氨基酸序列：所述全长MyD88、任选地SEQ ID NO:128的氨基酸2-155、2-156、2-157、2-158、2-159、2-160、2-161、2-162、2-163、2-164、2-165、2-166、2-167、2-168、2-169、2-170、2-171、2-172、2-173、2-174、2-175、2-176、2-177、2-178、2-179或2-180。
23.根据实施方案1-21中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二截短的多肽各自独立地是所述全长MyD88、任选地SEQ ID NO:128的氨基酸2-171或2-172的序列。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽如SEQ ID NO:2中所示。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第二截短的MyD88多肽如SEQ ID NO:2中所示。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二截短的MyD88多肽是相同的。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽通过肽接头连接。
28.根据实施方案11、20和27所述的嵌合信号传导受体，其中所述肽接头是(G4S)n(SEQ ID NO:47)，其中n是1至4的整数，包含端值。
29.根据实施方案11、20、27和28所述的嵌合信号传导受体，其中所述肽接头如SEQID NO:47((GGGGS)n)中所示，其中n是1至4的整数，包含端值，任选地其中所述肽接头选自SEQ ID NO:48(GGGGS)、SEQ ID NO:85(GGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:49(GGGGSGGGGSGGGGS)和SEQ ID NO:50(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:93中所示或与SEQ ID NO:93中所示序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约97％序列同一性的氨基酸序列。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:93中所示。
32.根据实施方案1-29中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:94中所示或与SEQ ID NO:94中所示序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约97％序列同一性的氨基酸序列。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:94中所示。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合诱导所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽的二聚化。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合将IRAK4募集到所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合导致IRAK4的磷酸化。
37.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码根据实施方案1-36中任一项所述的嵌合信号传导受体的核苷酸序列。
38.根据实施方案37所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列是第一核苷酸序列，并且所述多核苷酸还包含编码重组抗原受体的第二核苷酸序列。
39根据实施方案38所述的多核苷酸，其中所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
40.根据实施方案38或39所述的多核苷酸，其中所述重组抗原受体是CAR。
41.根据实施方案38-40中任一项所述的多核苷酸，其中所述重组抗原受体结合肿瘤抗原。
42.根据实施方案41所述的多核苷酸，其中所述肿瘤抗原是CD19。
43.根据实施方案41所述的多核苷酸，其中所述肿瘤抗原是B7H3。
44.根据实施方案38-43中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列被双顺反子元件隔开。
45.根据实施方案44所述的多核苷酸，其中所述双顺反子元件是IRES或可切割肽。
46.根据实施方案45所述的多核苷酸，其中所述可切割肽选自P2A、T2A和F2A。
47.根据实施方案45或实施方案46所述的多核苷酸，其中所述可切割肽是T2A。
48.根据实施方案37-47中任一项所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地连接至启动子。
49.根据实施方案38-47中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列各自可操作地连接至启动子。
50.根据实施方案49所述的多核苷酸，其中所述启动子是相同的启动子。
51.根据实施方案48-50中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子是EF1启动子。
52.一种载体，所述载体包含根据实施方案37、48或51所述的多核苷酸。
53.一种载体，所述载体包含根据实施方案37-51中任一项所述的多核苷酸。
54.根据实施方案52或实施方案53所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
55.根据实施方案54所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
56.根据实施方案54或实施方案55所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
57.一种产生工程化细胞的方法，所述方法包括在用于在细胞的表面表达所述嵌合信号传导受体和所述重组抗原受体的条件下，将根据实施方案38-51中任一项所述的多核苷酸或根据实施方案53-56中任一项所述的载体引入所述细胞中。
58.一种产生工程化细胞的方法，所述方法包括在用于在细胞的表面表达所述嵌合信号传导受体的条件下，将根据实施方案37-51所述的多核苷酸或根据实施方案52-56中任一项所述的载体引入所述细胞中。
59.根据实施方案58所述的方法，所述方法还包括在用于在所述细胞的表面表达重组抗原受体的条件下将编码所述重组抗原受体的多核苷酸引入所述细胞中。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
61.根据实施方案59或实施方案60所述的方法，其中所述重组抗原受体是CAR。
62.根据实施方案60或实施方案61所述的方法，其中所述重组抗原受体结合肿瘤抗原。
63.根据实施方案62所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD19。
64.根据实施方案62所述的方法，其中所述肿瘤抗原是B7H3。
65.根据实施方案57-64中任一项所述的方法，其中所述细胞是来自受试者的原代细胞。
66.根据实施方案57-65中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞、肿瘤浸润细胞(TIL)、B细胞、自然杀伤细胞或巨噬细胞。
67.根据实施方案57-66中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞，任选地CD3+、CD4+或CD8+T细胞。
68.根据实施方案57-67中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD8+T细胞。
69.根据实施方案57-67中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD4+T细胞。
70.一种通过根据实施方案57-69中任一项所述的方法产生的工程化细胞。
71.一种包含根据实施方案1-36中任一项所述的嵌合信号传导受体的工程化细胞。
72.根据实施方案71所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞还包含重组抗原受体。
73.根据实施方案72所述的工程化细胞，其中所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
74.一种包含根据实施方案37所述的多核苷酸的工程化细胞。
75.根据实施方案74所述的工程化细胞，所述工程化细胞进一步包含编码重组抗原受体的多核苷酸。
76.根据实施方案75所述的工程化细胞，其中所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
77.根据实施方案72-73和75-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述重组抗原受体是CAR。
78.根据实施方案72-72和75-77中任一项所述的工程化细胞，其中所述重组抗原受体结合肿瘤抗原。
79.根据实施方案78所述的工程化细胞，其中所述肿瘤抗原是CD19。
80.根据实施方案78所述的工程化细胞，其中所述肿瘤抗原是B7H3。
81.一种包含根据实施方案38-51中任一项所述的多核苷酸的工程化细胞。
82.根据实施方案70-81中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是来自受试者的原代细胞。
83.根据实施方案70-82中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞。
84.根据实施方案70-83中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞，任选地CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞。
85.根据实施方案70-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是CD8+T细胞。
86.根据实施方案70-85中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是CD4+T细胞。
87.一种包含根据实施方案70-86中任一项所述的工程化细胞的药物组合物。
88.根据实施方案87所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
89.根据实施方案87或实施方案88所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
90.一种治疗方法，所述治疗方法包括将根据实施方案70-86中任一项所述的工程化细胞或根据实施方案87-89中任一项所述的药物组合物施用给患有癌症的受试者。
91.根据实施方案90所述的方法，其中所述工程化细胞包含靶向所述癌症的抗原的抗原受体。
92.根据实施方案90所述的方法，其中所述工程化细胞表达包含结合与所述癌症相关的肿瘤抗原的抗原结合结构域的重组抗原受体，任选地其中所述癌症的细胞表达所述肿瘤抗原。
93.根据实施方案92所述的方法，其中所述重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
94.根据实施方案92或实施方案93所述的方法，其中所述重组抗原受体是CAR。
95.根据实施方案90-94中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤。
96.根据实施方案92-95中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是B7H3。
97.根据实施方案92-96中任一项所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、尿道上皮癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、肾母细胞瘤，任选地其中所述癌症是卵巢癌或神经母细胞瘤。
98.根据实施方案92-95中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD19。
99.根据实施方案90-95和98中任一项所述的方法，其中所述癌症是B细胞癌。
100.根据实施方案90-95、98和99中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤，任选地转移性淋巴瘤。
X.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1嵌合TGFβ信号传导受体的产生
产生编码嵌合TGFβ信号传导受体的多核苷酸，所述嵌合TGFβ信号传导受体包含与骨髓分化初级应答88(MyD88)多肽连接的人TGFβR细胞外结构域。MyD88是提供阳性细胞信号传导以促进T细胞激活的衔接子信号传导分子，并且通常是Toll样受体(TLR)的一部分(参见图1)。产生的构建体含有SEQ ID NO:2中所示的示例性MyD88序列，其包含三个结构域：(1)死亡结构域(DD；SEQ ID NO:10)；(2)中间结构域(ID；SEQ ID NO:12)；以及(3)终止立即结构域(TIR；SEQ ID NO:14)。产生构建体以评估MyD88通过不依赖于TLR而激活MyD88来逆转TGFβ抑制信号传导的能力。
A.多核苷酸构建体
编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体的多核苷酸构建体被设计以从N末端至C末端编码：来自TGFβR2(例如，SEQ ID NO:20)或TGFβR1(SEQ ID NO:4)的人TGFβR细胞外结构域、来自TGFβR2(例如，SEQ ID NO:22)或TGFβR1(SEQ ID NO:6)的TGFβR跨膜结构域、以及包含至少一个MyD88多肽(SEQ ID NO:2)的细胞内结构域。在一些情况下，细胞内结构域包含两个串联的MyD88多肽，各自如SEQ ID NO:2中所示的第一MyD88多肽和第二MyD88多肽。在构建体中，含有相应TGFβR的细胞内结构域的连续非信号传导部分或异源柔性肽接头序列的接头序列(L1)位于跨膜结构域与MyD88多肽之间。此外，在一些情况下，柔性肽接头序列(L2)将含有串联MyD88的构建体中的第一MyD88多肽与第二MyD88多肽隔开。示例性柔性肽接头序列包含单个或重复的GGGGS基序，如SEQ ID NO:48、50或85中所示。还产生不包含具有MyD88衔接多肽序列的细胞内结构域或不包含TGFβR细胞外结构域的对照构建体。所有构建体还包含多组氨酸标签(HHHHHH，SEQ ID NO:103)或myc标签(EQKLISEEDL，SEQ ID NO:101)以帮助纯化和检测。编码多核苷酸还包含编码CD8α信号肽的信号序列(MALPVTALLLPLALLLHAARP，SEQ ID NO:102)。
由多核苷酸构建体编码的示例性嵌合TGFβ信号传导受体多肽示于表E1中。由多核苷酸构建体编码的示例性对照信号传导受体多肽示于表E2中。图2也描述了产生的构建体。
ECD：细胞外结构域；TM：跨膜结构域
ECD：细胞外结构域；TM：跨膜结构域
B.细胞表达测定
为了评估嵌合TGFβ信号传导受体的表达，将编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体和对照的多核苷酸构建体克隆到第三代慢病毒载体中。将编码嵌合TGFβ信号传导受体的序列置于人延伸因子1α(EF1α)启动子(SEQ ID NO:112中所示的序列)的可操作控制下。
用编码示例性TGFβ信号传导受体CTSR-1A、CTSR-2A或CTSR-2C的载体或编码对照TGFβ信号传导受体CTSR-2IN的载体转导Jurkat细胞或原代人T细胞。在一些情况下，用编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸共转染原代人T细胞，所述嵌合抗原受体包含含有单链可变片段(scFv)的细胞外抗原结合结构域(在这种情况下，靶向B7H3或CD19)。
图3A显示通过流式细胞术测定的未转导(UT)和转导的Jurkat细胞中myc标签的表达水平。这些数据显示，包含myc标签的示例性嵌合TGFβ信号传导受体和对照在Jurkat细胞中表达。
如图3B所示，流式细胞术分析显示CAR和示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C在Jurkat细胞中的高效表达。
图3C和图3D分别显示了CAR和示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C在原代人T细胞中的表达效率。
这些结果证明了示例性嵌合TGFβ信号传导受体在T细胞中表达的能力，包括当与CAR共转导时。
实施例2对嵌合TGFβ信号传导受体关于TGFβ信号传导途径进行评估
评估示例性嵌合TGFβ信号传导受体经由其天然抑制途径阻断TGFβR信号传导以及参与MyD88途径以用于T细胞激活的能力。
用编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2A或CTSR-2C的载体转导Jurkat细胞。在蛋白质提取之前，将转导的细胞与0、1、5或10ng/mL的TGFβ孵育6小时。使用蛋白质印迹分析测定磷酸化SMAD 2(pSMAD2)、磷酸化IRAK4(pIRAK4)和SMAD 2蛋白水平的量。
如图4所示，与用TGFβR2-DNR、NULL-MYD88转导的那些或未转导的(UT)Jurkat细胞相比，用示例性嵌合TGFβ信号传导受体转导的细胞显示pSMAD2水平降低。这些结果表明，示例性嵌合TGFβ信号传导受体减少通过天然TGFβR信号传导途径的信号传导。图4还显示与未转导的对照细胞相比，在用示例性嵌合TGFβ信号传导受体转导的细胞中、特别是在含有两个串联MyD88结构域的嵌合构建体CTSR-2C中pIRAK4水平的增加。这些结果表明，示例性嵌合TGFβ信号传导受体参与激活MyD88途径。
实施例3对嵌合TGFβ信号传导受体信号传导关于T细胞增殖进行评估
为了评估示例性嵌合TGFβ信号传导受体诱导T细胞增殖的能力，进行CFDA-SE(5[6]-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯)增殖测定。
将人T细胞用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)标记，并用编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C的载体、编码示例性CAR(抗B7H3 CAR；SEQ ID NO:45)的载体或两个载体(一个编码示例性TGFβ信号传导受体，且另一个编码示例性CAR)转导。
将转导细胞与1、5、10或20ng/mL TGFβ和人神经母细胞瘤细胞系CHLA255靶细胞以1:1的效应物与靶标比率孵育。每48小时补充靶细胞。暴露6天后，测量CFDA强度。
图5A显示了在存在TGFβ的情况下暴露于靶细胞6天后的CFDA强度。这些数据表明，示例性嵌合TGFβ信号传导受体的存在诱导T细胞增殖。
还在第2天和第5天在存在20ng/mL TGFβ和靶细胞(E:T为1:1，每48小时补充)的情况下评估CFDA强度。如图5B所示，与单独的CAR或未转导的(UT)对照细胞相比，表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR的细胞显示增加的增殖。
还通过测定与TGFβ孵育期间T细胞计数的变化直接评估T细胞增殖。用编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2A或CTSR-2C的载体和编码示例性CAR(抗B7H3CAR；SEQ IDNO:45)的载体或单独的示例性CAR转导人T细胞。将转导细胞与0、10或50ng/mL TGFβ和人神经母细胞瘤细胞系CHLA255靶癌细胞(E:T为1:1，每48小时补充)培养3周。在培养期间测定T细胞计数。
图6A和图6B分别显示在存在10和50ng/mL TGFβ的情况下转导细胞和未转导对照的T细胞计数随时间的倍数变化。这些数据表明，含有两个串联MyD88结构域的示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C的存在改善了在存在TGFβ的情况下表达CAR的T细胞的T细胞增殖。相反，在不共表达嵌合TGFβ信号传导受体的表达CAR的T细胞中，在存在TGFβ的情况下T细胞增殖显著减少。
实施例4对嵌合TGFβ信号传导受体对于神经母细胞瘤的细胞毒性作用进行体外评 估
体外评估表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR的人T细胞对神经母细胞瘤肿瘤细胞的细胞毒性作用。
用编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2A或CTSR-2C的载体和编码示例性CAR(SEQ ID NO:45)的载体或单独的示例性CAR转导人T细胞。
在存在或不存在TGFβ(50ng/mL)的情况下，将转导细胞与表达绿色荧光蛋白(GFP)的神经母细胞瘤癌细胞以不同的效应物与靶标比率(E:T)培养。使用活细胞成像来评估培养条件下54小时内的GFP强度以监测细胞死亡。图7显示了在不同培养条件下细胞杀伤的动力学。如所示，在不存在TGFβ的情况下，细胞毒性杀伤在表达CAR的T细胞中是强烈的(实线)，并且通常在5:1的较高E:T比率下观察到更大的细胞毒性活性。在仅表达CAR的细胞中，T细胞的细胞毒性杀伤在存在TGFβ的情况下显著降低(CAR条件，虚线)。相比之下，在共表达CAR和含有两个串联MyD88结构域的示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C的T细胞中，在存在TGFβ的情况下的细胞毒性活性(CTSR-2C+CAR，虚线)基本上类似于在不存在TGFβ的情况下观察到的细胞毒性活性(CTSR-2C+CAR，实线)。在共表达仅含有单个MyD88结构域的CTSR-2A嵌合TGFβ信号传导受体的CAR-T细胞中没有观察到嵌合TGFβ信号传导受体的改善的活性。
还在288小时培养期间在较低的E:T比率和较低浓度的TGFβ(10ng/mL)下评估了用示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C和CAR转导的细胞的细胞毒性作用。如图8所示，与不存在TGFβ相比，在存在TGFβ的情况下观察到改善的杀伤，并且在较低的E:T比率下观察到最大的改善。这些结果与TGFβ通过含有两个串联MyD88结构域的嵌合TGFβ信号传导受体在工程化T细胞中诱导阳性刺激信号的发现一致。
实施例5对嵌合TGFβ信号传导受体对于卵巢癌的细胞毒性作用进行体外评估
体外评估表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR的人T细胞对卵巢肿瘤细胞的细胞毒性作用。
用编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C的载体和编码示例性靶向B7H3的CAR(SEQ ID NO:45)的载体或单独的示例性CAR转导人T细胞。将转导细胞与卵巢癌622细胞系以20:1至1:10的不同效应物与靶标比率(E:T)在存在或不存在TGFβ(10ng/mL)的情况下培养8天。测定肿瘤细胞计数并针对最大细胞计数归一化。
图9A(CTSR-2C+CAR)和图9B(仅CAR)显示在不同E:T比率和TGFβ浓度下的归一化卵巢肿瘤(SW 626)细胞计数。在用B7H3 CAR和包含两个串联MyD88结构域的嵌合TGFβ信号传导受体共转导的T细胞中，在所有条件下随时间观察到卵巢肿瘤细胞杀伤增加，在用TGFβ刺激的细胞中观察到细胞计数减少更大，这支持嵌合TGFβ信号传导受体在调节T细胞活性中的正刺激作用(图9A)。相比之下，在仅表达B7H3 CAR的T细胞中，在存在TGFβ的情况下观察到更大的肿瘤细胞计数，特别是在较低的E:T比率下，这与TGFβ抑制CAR介导的细胞毒性杀伤的观察结果一致(图9B)。这些数据表明，包含其中含有两个MyD88结构域的示例性嵌合TGFβ信号传导受体改善CAR介导的细胞杀伤活性，特别是在存在TGFβ的情况下。
实施例6对嵌合TGFβ信号传导受体在神经母细胞瘤的体内小鼠模型中的细胞毒性 作用进行评估
为了评估嵌合TGFβ信号传导受体在体内的作用，使用原位神经母细胞瘤小鼠肿瘤模型。
免疫缺陷NSG小鼠接受1×106个人神经母细胞瘤细胞(细胞系CHLA255)的肾内注射。在肿瘤接种后第14天，动物接受1×107个未转导T细胞(UT)、靶向B7H3的CAR-T细胞(SEQID NO:45)、用编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C的载体转导的T细胞或用编码CTSR-2C和抗B7H3 CAR(SEQ ID NO:45)的单独载体转导的T细胞的静脉内(i.v.)注射。使用生物发光成像来监测每个治疗组中的肿瘤生长。
图10A显示每个治疗组在8周内神经母细胞瘤肿瘤生长的生物发光图像。这些结果表明，在用表达CAR和嵌合TGFβ信号传导受体的T细胞治疗的动物中肿瘤生长显著减少且存活率提高。共转导T细胞组中的三只动物因推测的移植物抗宿主病(GVHD)被安乐死，GVHD是用能够识别小鼠HLA的异种人T细胞移植的NSG小鼠中的已知现象。在施用仅表达嵌合TGFβ信号传导受体的工程化细胞(没有工程化CAR)的小鼠中也观察到改善的活性。
图10B显示了每个治疗组在8周内的两个胰腺肿瘤模型(使用CFPAC和CF10.05细胞系)生长的生物发光图像。这些结果表明，在用表达CAR和嵌合TGFβ信号传导受体的T细胞治疗的动物中肿瘤生长显著减少且存活率提高。
图11A和图11B显示了接受上述治疗的荷瘤小鼠和非荷瘤(NT)小鼠(注射盐水)的外周血计数(计数/mm3血液)中CAR+和CD3 T细胞的存在的中值和箱形图汇总数据。如图11A和图11B所示，在肿瘤接种后第21天(d21)、d35或d49天，与仅施用T细胞(未转导(UT))、单独表达CAR的T细胞的小鼠和治疗的非肿瘤对照(NT)组相比，用表达CAR和嵌合TGFβ信号传导受体的T细胞治疗的动物具有增加的CAR+和CD3+T细胞数量。
为了评估在高肿瘤负荷下的细胞毒性活性，使用相同的神经母细胞瘤肿瘤模型并在接种后第28天如上治疗小鼠。图12A-图12C的上图显示了肿瘤接种后不同时间的转移性神经母细胞瘤肿瘤生长的生物发光图像，而下图提供了来自在对神经母细胞瘤特异性标记物PHOX2b(棕色染色)和人CD3(红色染色)染色后在治疗注射后7天从小鼠获得的肝组织的免疫组织化学分析的代表性图像。与用仅表达CAR的T细胞治疗的小鼠(图12B)相比，在用表达CAR和嵌合TGFβ信号传导受体的T细胞治疗的小鼠中观察到高肿瘤负荷的一些降低(图12C)。此外，组织学分析显示，与用仅表达CAR的T细胞治疗的小鼠相比，在用表达CAR和嵌合TGFβ信号传导受体的T细胞治疗的小鼠中，T细胞更大程度地浸润到具有转移性神经母细胞瘤肿瘤细胞的肝组织中(比较图12B和图12C)。
实施例7编码嵌合TGFβ信号传导受体和嵌合抗原受体的双顺反子多核苷酸构建体 的产生
产生多核苷酸构建体以编码如实施例1中所述的示例性嵌合TGFβ信号传导受体和示例性嵌合抗原受体(CAR)。编码T2A(SEQ ID NO:61)可切割肽的多核苷酸序列将编码受体的核酸隔开。
示例性构建体示于表E3和图13中。示例性对照构建体示于表E4中。
/>
为了评估编码TGFβ信号传导受体和CAR的双顺反子多核苷酸构建体的细胞表达，将编码示例性TGFβ信号传导受体和示例性CAR的多核苷酸克隆到第三代慢病毒载体中。将编码双顺反子多肽嵌合TGFβ信号传导受体/CAR构建体的序列置于人延伸因子1α(EF1α)启动子(SEQ ID NO:112中所示的序列)的可操作控制下。
用编码双顺反子构建体CTSR-2A-T2A-CAR-B或CTSR-2C-T2A-CAR-B，或用于比较仅嵌合TGFβ信号传导受体(CTSR-2A或CTSR-2C)，或仅CAR-B(抗CD19 CAR；SEQ ID NO:38)的载体转导人T细胞。通过流式细胞术测定细胞表达。蛋白L和myc标签分别用作CAR和TGFβ信号传导受体表达的替代标记物。
图14显示了来自流式细胞术分析的代表性点图。这些数据表明，双顺反子构建体能够在人T细胞中表达。
实施例8对嵌合TGFβ信号传导受体和CAR共表达关于TGFβ信号传导途径进行评估
用实施例7中描述的双顺反子构建体或仅编码CAR(抗CD19 CAR；SEQ ID NO:38)或仅编码嵌合TGFβ信号传导受体的对照构建体转导Jurkat细胞。在蛋白质提取之前，将转导的细胞与0、1、5或10 ng/mL的TGFβ孵育2小时。使用蛋白质印迹分析测定磷酸化SMAD 2(pSMAD2)和磷酸化IRAK4(pIRAK4)的量。
如图15所示，与用单独CAR转导的细胞或未转导细胞(UT)相比，用包含串联MyD88的示例性TGFβR信号传导受体(作为单一编码构建体(CTSR-2C)或作为也编码CAR的双顺反子构建体(CTSR-2C-T2A-CAR-B))转导的细胞显示pSMAD2水平降低和pIRAK4水平增加。这些结果表明，包含两个串联MyD88结构域的示例性嵌合TGFβ信号传导受体能够减少通过天然TGFβR信号传导途径的信号传导，即使当与CAR由单个双顺反子构建体共表达时。
实施例9对与CAR共表达的嵌合TGFβ信号传导受体对于CD19+肿瘤细胞的细胞毒性 作用进行体外评估
将实施例7中描述的双顺反子构建体转导到人T细胞中，并评估对CD19+肿瘤细胞的细胞毒性作用。
用编码双顺反子构建体CTSR-2A-T2A-CAR-B或CTSR-2C-T2A-CAR-B的载体、编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C的载体或仅编码CAR的载体转导人T细胞。将转导细胞与表达GFP的CD19+肿瘤细胞以不同效应物与靶细胞比率(E:T)培养21小时。通过GFP强度随时间监测肿瘤细胞死亡。
图16A显示了在不同培养条件下细胞杀伤的动力学。这些结果表明，表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR的细胞与单独表达CAR的细胞具有相似的杀伤活性。
还在存在10 ng/mL TGFβ的情况下评估转导细胞的细胞毒性作用。如图16B所示，在不表达CAR(CTSR-2C)的细胞中或在表达仅含有单个MyD88结构域的嵌合TGFβ信号传导受体的细胞中，在存在TGFβ的情况下观察到降低的细胞毒性活性，与上述结果一致(比较实线和虚线)。其中含有两个串联MyD88结构域的嵌合TGFβ信号传导受体作为具有抗CD19 CAR的双顺反子构建体表达的T细胞即使在存在TGFβ的情况下也展现出强烈的杀伤，其大于在仅表达CAR的T细胞中观察到的杀伤，并且与不存在TGFβ的情况下的杀伤相比可以是改善的。
实施例10对与CAR共表达的嵌合TGFβ信号传导受体对于转移性淋巴瘤的细胞毒性 作用进行体内评估
为了评估以具有抗CD19 CAR的双顺反子构建体的形式表达嵌合TGFβ信号传导受体的T细胞的体内抗肿瘤活性，使用转移性淋巴瘤的小鼠模型。
免疫缺陷NSG小鼠接受1×106个Raji细胞的尾静脉注射。在肿瘤接种后第3天，动物接受1×107个未转导T细胞(UT)、抗CD19 CAR-T细胞、用编码CTSR-2A-T2A-CAR-B或CTSR-2C-T2A-CAR-B的载体转导的T细胞、或用编码示例性TGFβ信号传导受体CTSR-2C的载体转导的T细胞的静脉内(i.v.)注射。使用生物发光成像来监测每个治疗组中的肿瘤生长。
图17显示了每个治疗组在8周内肿瘤生长的生物发光图像。这些结果表明，在用T细胞治疗的动物中肿瘤生长减少和存活率提高，所述T细胞是用由具有示例性抗CD19CAR的双顺反子构建体表达的含有两个MyD88结构域的示例性嵌合TGFβ信号传导受体转导的。
实施例11对与CAR共表达的示例性嵌合TGFβ信号传导受体与其他嵌合TGFβ信号传 导构建体相比的耗竭标记物、扩增和细胞毒性作用进行评估
体外评估表达示例性嵌合TGFβ信号传导受体和CAR的人T细胞以及用CAR和其他嵌合TGFβ信号传导构建体(TGFβR2-DNR、NULL-MYD88、TGFβR2-41bb、TGFβR2-DAP12)转导的T细胞的耗竭特征、扩增能力和细胞毒性作用。
用编码示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2A、CTSR-2C、TGFβR2-DNR、NULL-MYD88、TGFβR2-41bb或TGFβR2-DAP12的载体和编码示例性CAR(抗B7H3 CAR；SEQ ID NO:45)的载体或编码单独示例性CAR的载体转导人T细胞。
在存在或不存在TGFβ(10ng/mL)下，将转导细胞与表达绿色荧光蛋白(GFP)的神经母细胞瘤癌细胞以1:1靶标比率(E:T)培养。使用流式细胞术来评估与肿瘤细胞培养72小时后表达PD1、Tim3和LAG3耗竭标记物的细胞的频率。图18显示了在存在或不存在TGFβ的情况下表达1、2或全部3种耗竭标记物的细胞的百分比。如图所示，具有1、2或3种耗竭标记物的细胞的百分比仅在共表达CAR和包含两个串联MyD88结构域的示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C的T细胞中降低。在共表达仅含有单个MyD88结构域的CTSR-2A嵌合TGFβ信号传导受体的CAR-T细胞中也观察到具有1、2或3种耗竭标记物的细胞数量减少，但程度较低。相比之下，表达单独CAR或CAR和TGFβR2-41bb载体的细胞在存在TGFβ的情况下具有较高百分比的具有3种耗竭标记物的T细胞。
与其他嵌合TGFβR信号传导构建体相比，在4周内评价示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C和CTSR-2A的增殖能力，其中第一周在存在肿瘤细胞的情况下接着是每天IL2处理并且使用或不使用TGFβ(10ng/mL)。图19显示与共表达CAR和嵌合TGFβ信号受体TGFβR2-DNR、TGFβR2-41bb、TGFβR2-DAP12的T细胞或表达单独CAR的细胞相比，共表达CAR和示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C和CTSR-2A的T细胞的T细胞计数随时间的倍数变化显著更高。
通过首先在存在或不存在TGFβ(10ng/mL)的情况下，将T细胞与肿瘤细胞以1:1靶比率(E:T)共培养一周，然后从培养物中回收T细胞，并在存在或不存在TGFβ(10ng/mL)的情况下，将它们与新鲜肿瘤细胞以1:1靶比率(E:T)再培养一周来比较用CAR和嵌合TGFβ信号传导受体转导的细胞的细胞毒性作用。如图20A所示，所有具有指定嵌合TGFβ信号传导的CAR T细胞都展现出一定水平的针对肿瘤细胞的细胞毒性。然而，如图20B所示，只有用CAR和示例性嵌合TGFβ信号传导受体CTSR-2C和CTSR-2A转导的T细胞保留了它们的细胞毒性作用，并且用CTSR-2C转导的T细胞在存在TGFβ的情况下显示出改善的杀伤。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这样的变化，并且所述变化意图落入本公开文本的范围内。
序列
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/>
序列表
<110> 西穆尔克斯股份有限公司
洛杉矶儿童医院
<120> 用于重定向免疫抑制信号传导的嵌合MYD88受体及相关组合物和方法
<130> 16528-20001.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 63/053,529
<151> 2020-07-17
<160> 130
<170> 用于Windows的FastSEQ版本4.0
<210> 1
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1，氨基酸34-183 (胞外域，氨基酸34-126；跨膜结构域，氨基酸127-147)；细胞质结构域的部分，氨基酸148-183)
<400> 1
Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val
1 5 10 15
Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val
20 25 30
Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp
35 40 45
Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala Val
85 90 95
Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met Val
100 105 110
Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn Glu
115 120 125
Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr Leu
130 135 140
Lys Asp Leu Ile Tyr Asp
145 150
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MYD88，氨基酸2-171
<400> 2
Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr
1 5 10 15
Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu
20 25 30
Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala
35 40 45
Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
50 55 60
Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg
65 70 75 80
Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
85 90 95
Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys
100 105 110
Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu
115 120 125
Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala
130 135 140
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe
145 150 155 160
Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
165 170
<210> 3
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2
<400> 3
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val
145 150 155 160
Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser
165 170 175
<210> 4
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1细胞外
<400> 4
Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val
1 5 10 15
Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val
20 25 30
Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp
35 40 45
Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu
85 90
<210> 5
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1细胞外
<400> 5
ctgcaatgtt tttgtcacct ctgtacgaaa gataatttta cgtgtgtcac tgatggcctt 60
tgttttgtct cagtcactga aactacggat aaagtaatac ataatagcat gtgtattgca 120
gagattgatc tcatcccgag agaccggcct ttcgtctgtg cgcctagctc caaaacagga 180
tcagttacca ccacgtattg ctgtaaccaa gaccactgca acaaaatcga gcttccaaca 240
actgtaaagt cttcccctgg ccttggccct gtagaactg 279
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1跨膜
<400> 6
Ala Ala Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met
1 5 10 15
Leu Met Val Tyr Ile
20
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1跨膜
<400> 7
gctgcggtaa ttgctgggcc cgtatgcttt gtttgtatct ccctcatgct catggtctac 60
atc 63
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1细胞内
<400> 8
Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn Glu Glu Asp
1 5 10 15
Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr Leu Lys Asp
20 25 30
Leu Ile Tyr Asp
35
<210> 9
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1细胞内
<400> 9
tgtcataacc gcacggtcat acaccatcgc gtgcctaatg aagaggatcc atcactcgat 60
cggcctttta tttctgaggg cactactctt aaagacttga tctatgac 108
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MYD88 DD
<400> 10
Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr
1 5 10 15
Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu
20 25 30
Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala
35 40 45
Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
50 55 60
Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg
65 70 75 80
Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
85 90 95
Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile
100 105
<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYD88 DD
<400> 11
gcggctggcg gaccaggggc aggttcagct gctccagtaa gtagcacctc ctcattgcct 60
ttggctgcat tgaatatgcg ggtacggaga agacttagtc tcttcttgaa cgtaagaact 120
caagtcgccg cagattggac ggctcttgcc gaagaaatgg actttgaata tctcgagatt 180
cgacaactcg aaacccaagc ggatccaact ggtcggttgc ttgacgcttg gcagggtcgc 240
cctggagcgt ctgtcggccg attgcttgaa ttgttgacaa aacttggcag agatgacgtg 300
ctcctggaac tcggcccctc catc 324
<210> 12
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MYD88 ID
<400> 12
Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr
20 25 30
Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met
35 40 45
Pro
<210> 13
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYD88 ID
<400> 13
gaagaggact gtcagaaata cattctgaaa cagcaacaag aggaagcgga aaagcccctg 60
caggtcgctg cagttgattc tagcgttcct cggaccgcgg aacttgcagg cataaccact 120
ctcgacgatc ccttggggca catgcct 147
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MYD88 TIR
<400> 14
Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MYD88 TIR
<400> 15
gaacgctttg acgccttcat ttgttattgc ccaagcgac 39
<210> 16
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-1A
<400> 16
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His His His His His His Leu Gln Cys Phe Cys
20 25 30
His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val Thr Asp Gly Leu Cys
35 40 45
Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val Ile His Asn Ser Met
50 55 60
Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp Arg Pro Phe Val Cys
65 70 75 80
Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Thr Tyr Cys Cys Asn
85 90 95
Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr Thr Val Lys Ser Ser
100 105 110
Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala Val Ile Ala Gly Pro Val
115 120 125
Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met Val Tyr Ile Cys His Asn
130 135 140
Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn Glu Glu Asp Pro Ser Leu
145 150 155 160
Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr Leu Lys Asp Leu Ile Tyr
165 170 175
Asp Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
180 185 190
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
195 200 205
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
210 215 220
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
225 230 235 240
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
245 250 255
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
260 265 270
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
275 280 285
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
290 295 300
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
305 310 315 320
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
325 330 335
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
340 345
<210> 17
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-1A
<400> 17
atggcacttc ccgttacagc actgctcctg cccctggcgc tgctcctgca cgcggcccgc 60
ccccatcatc accatcacca cctgcaatgt ttttgtcacc tctgtacgaa agataatttt 120
acgtgtgtca ctgatggcct ttgttttgtc tcagtcactg aaactacgga taaagtaata 180
cataatagca tgtgtattgc agagattgat ctcatcccga gagaccggcc tttcgtctgt 240
gcgcctagct ccaaaacagg atcagttacc accacgtatt gctgtaacca agaccactgc 300
aacaaaatcg agcttccaac aactgtaaag tcttcccctg gccttggccc tgtagaactg 360
gctgcggtaa ttgctgggcc cgtatgcttt gtttgtatct ccctcatgct catggtctac 420
atctgtcata accgcacggt catacaccat cgcgtgccta atgaagagga tccatcactc 480
gatcggcctt ttatttctga gggcactact cttaaagact tgatctatga cgcggctggc 540
ggaccagggg caggttcagc tgctccagta agtagcacct cctcattgcc tttggctgca 600
ttgaatatgc gggtacggag aagacttagt ctcttcttga acgtaagaac tcaagtcgcc 660
gcagattgga cggctcttgc cgaagaaatg gactttgaat atctcgagat tcgacaactc 720
gaaacccaag cggatccaac tggtcggttg cttgacgctt ggcagggtcg ccctggagcg 780
tctgtcggcc gattgcttga attgttgaca aaacttggca gagatgacgt gctcctggaa 840
ctcggcccct ccatcgaaga ggactgtcag aaatacattc tgaaacagca acaagaggaa 900
gcggaaaagc ccctgcaggt cgctgcagtt gattctagcg ttcctcggac cgcggaactt 960
gcaggcataa ccactctcga cgatcccttg gggcacatgc ctgaacgctt tgacgccttc 1020
atttgttatt gcccaagcga ctag 1044
<210> 18
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-1B
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro His His His His His His Leu Gln Cys Phe Cys
20 25 30
His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val Thr Asp Gly Leu Cys
35 40 45
Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val Ile His Asn Ser Met
50 55 60
Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp Arg Pro Phe Val Cys
65 70 75 80
Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Thr Tyr Cys Cys Asn
85 90 95
Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr Thr Val Lys Ser Ser
100 105 110
Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala Val Ile Ala Gly Pro Val
115 120 125
Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met Val Tyr Ile Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser
145 150 155 160
Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn
165 170 175
Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln
180 185 190
Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr
195 200 205
Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu
210 215 220
Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu
225 230 235 240
Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly
245 250 255
Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln
260 265 270
Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val
275 280 285
Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu
290 295 300
Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser
305 310 315 320
Asp
<210> 19
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-1B
<400> 19
atggcacttc ccgttacagc actgctcctg cccctggcgc tgctcctgca cgcggcccgc 60
ccccatcatc accatcacca cctgcaatgt ttttgtcacc tctgtacgaa agataatttt 120
acgtgtgtca ctgatggcct ttgttttgtc tcagtcactg aaactacgga taaagtaata 180
cataatagca tgtgtattgc agagattgat ctcatcccga gagaccggcc tttcgtctgt 240
gcgcctagct ccaaaacagg atcagttacc accacgtatt gctgtaacca agaccactgc 300
aacaaaatcg agcttccaac aactgtaaag tcttcccctg gccttggccc tgtagaactg 360
gctgcggtaa ttgctgggcc cgtatgcttt gtttgtatct ccctcatgct catggtctac 420
atcggcggcg gtggtagcgg tggcggtggc agcgcggctg gcggaccagg ggcaggttca 480
gctgctccag taagtagcac ctcctcattg cctttggctg cattgaatat gcgggtacgg 540
agaagactta gtctcttctt gaacgtaaga actcaagtcg ccgcagattg gacggctctt 600
gccgaagaaa tggactttga atatctcgag attcgacaac tcgaaaccca agcggatcca 660
actggtcggt tgcttgacgc ttggcagggt cgccctggag cgtctgtcgg ccgattgctt 720
gaattgttga caaaacttgg cagagatgac gtgctcctgg aactcggccc ctccatcgaa 780
gaggactgtc agaaatacat tctgaaacag caacaagagg aagcggaaaa gcccctgcag 840
gtcgctgcag ttgattctag cgttcctcgg accgcggaac ttgcaggcat aaccactctc 900
gacgatccct tggggcacat gcctgaacgc tttgacgcct tcatttgtta ttgcccaagc 960
gactag 966
<210> 20
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2细胞外结构域
<400> 20
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
<210> 21
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2细胞外结构域
<400> 21
actattcccc ctcatgttca gaaatccgta aacaatgata tgattgtcac ggacaacaac 60
ggtgcggtca aattcccgca gctttgcaaa ttttgtgatg ttagattctc aacgtgtgat 120
aatcaaaagt cctgcatgag taattgttca attacttcca tctgcgaaaa gcctcaggaa 180
gtttgcgtcg cagtctggag gaagaacgac gaaaacatta cacttgagac tgtgtgtcat 240
gatcctaaac tcccctatca tgacttcatc cttgaggatg cggcgtcccc caaatgtatc 300
atgaaagaga aaaaaaagcc cggtgagacg ttcttcatgt gcagctgctc cagcgacgag 360
tgcaatgata acatcatttt ctctgaagaa tacaatacct caaatcccga cctcctcttg 420
gtaatatttc ag 432
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2跨膜
<400> 22
Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val
1 5 10 15
Ile Ile Ile Phe Tyr
20
<210> 23
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2跨膜
<400> 23
gtgacgggta taagtttgct tccgcctctc ggtgtggcga tctccgttat cattatcttt 60
tat 63
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2细胞质结构域
<400> 24
Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2细胞质结构域
<400> 25
tgctatcgcg tgaacagaca acaaaaattg tcc 33
<210> 26
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2A
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr
20 25 30
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
35 40 45
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
50 55 60
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
65 70 75 80
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
85 90 95
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
100 105 110
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
115 120 125
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
130 135 140
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
165 170 175
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
180 185 190
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ala
195 200 205
Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser
210 215 220
Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser
225 230 235 240
Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu
245 250 255
Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr
260 265 270
Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro
275 280 285
Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg
290 295 300
Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln
305 310 315 320
Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln
325 330 335
Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly
340 345 350
Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp
355 360 365
Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
370 375
<210> 27
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2A
<400> 27
atggcacttc ccgttacagc actgctcctg cccctggcgc tgctcctgca cgcggcccgc 60
cccgagcaaa aacttatctc tgaagaggac ctcactattc cccctcatgt tcagaaatcc 120
gtaaacaatg atatgattgt cacggacaac aacggtgcgg tcaaattccc gcagctttgc 180
aaattttgtg atgttagatt ctcaacgtgt gataatcaaa agtcctgcat gagtaattgt 240
tcaattactt ccatctgcga aaagcctcag gaagtttgcg tcgcagtctg gaggaagaac 300
gacgaaaaca ttacacttga gactgtgtgt catgatccta aactccccta tcatgacttc 360
atccttgagg atgcggcgtc ccccaaatgt atcatgaaag agaaaaaaaa gcccggtgag 420
acgttcttca tgtgcagctg ctccagcgac gagtgcaatg ataacatcat tttctctgaa 480
gaatacaata cctcaaatcc cgacctcctc ttggtaatat ttcaggtgac gggtataagt 540
ttgcttccgc ctctcggtgt ggcgatctcc gttatcatta tcttttattg ctatcgcgtg 600
aacagacaac aaaaattgtc cgcggctggc ggaccagggg caggttcagc tgctccagta 660
agtagcacct cctcattgcc tttggctgca ttgaatatgc gggtacggag aagacttagt 720
ctcttcttga acgtaagaac tcaagtcgcc gcagattgga cggctcttgc cgaagaaatg 780
gactttgaat atctcgagat tcgacaactc gaaacccaag cggatccaac tggtcggttg 840
cttgacgctt ggcagggtcg ccctggagcg tctgtcggcc gattgcttga attgttgaca 900
aaacttggca gagatgacgt gctcctggaa ctcggcccct ccatcgaaga ggactgtcag 960
aaatacattc tgaaacagca acaagaggaa gcggaaaagc ccctgcaggt cgctgcagtt 1020
gattctagcg ttcctcggac cgcggaactt gcaggcataa ccactctcga cgatcccttg 1080
gggcacatgc ctgaacgctt tgacgccttc atttgttatt gcccaagcga ctag 1134
<210> 28
<211> 547
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2B
<400> 28
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr
20 25 30
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
35 40 45
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
50 55 60
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
65 70 75 80
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
85 90 95
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
100 105 110
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
115 120 125
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
130 135 140
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
165 170 175
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
180 185 190
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ala
195 200 205
Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser
210 215 220
Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser
225 230 235 240
Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu
245 250 255
Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr
260 265 270
Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro
275 280 285
Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg
290 295 300
Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln
305 310 315 320
Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln
325 330 335
Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly
340 345 350
Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp
355 360 365
Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala
370 375 380
Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala
385 390 395 400
Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg
405 410 415
Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe
420 425 430
Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly
435 440 445
Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg
450 455 460
Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu
465 470 475 480
Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln
485 490 495
Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser
500 505 510
Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp
515 520 525
Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys
530 535 540
Pro Ser Asp
545
<210> 29
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2B
<400> 29
atggcacttc ccgttacagc actgctcctg cccctggcgc tgctcctgca cgcggcccgc 60
cccgagcaaa aacttatctc tgaagaggac ctcactattc cccctcatgt tcagaaatcc 120
gtaaacaatg atatgattgt cacggacaac aacggtgcgg tcaaattccc gcagctttgc 180
aaattttgtg atgttagatt ctcaacgtgt gataatcaaa agtcctgcat gagtaattgt 240
tcaattactt ccatctgcga aaagcctcag gaagtttgcg tcgcagtctg gaggaagaac 300
gacgaaaaca ttacacttga gactgtgtgt catgatccta aactccccta tcatgacttc 360
atccttgagg atgcggcgtc ccccaaatgt atcatgaaag agaaaaaaaa gcccggtgag 420
acgttcttca tgtgcagctg ctccagcgac gagtgcaatg ataacatcat tttctctgaa 480
gaatacaata cctcaaatcc cgacctcctc ttggtaatat ttcaggtgac gggtataagt 540
ttgcttccgc ctctcggtgt ggcgatctcc gttatcatta tcttttattg ctatcgcgtg 600
aacagacaac aaaaattgtc cgcggctggc ggaccagggg caggttcagc tgctccagta 660
agtagcacct cctcattgcc tttggctgca ttgaatatgc gggtacggag aagacttagt 720
ctcttcttga acgtaagaac tcaagtcgcc gcagattgga cggctcttgc cgaagaaatg 780
gactttgaat atctcgagat tcgacaactc gaaacccaag cggatccaac tggtcggttg 840
cttgacgctt ggcagggtcg ccctggagcg tctgtcggcc gattgcttga attgttgaca 900
aaacttggca gagatgacgt gctcctggaa ctcggcccct ccatcgaaga ggactgtcag 960
aaatacattc tgaaacagca acaagaggaa gcggaaaagc ccctgcaggt cgctgcagtt 1020
gattctagcg ttcctcggac cgcggaactt gcaggcataa ccactctcga cgatcccttg 1080
gggcacatgc ctgaacgctt tgacgccttc atttgttatt gcccaagcga cgcggctggc 1140
ggaccagggg caggttcagc tgctccagta agtagcacct cctcattgcc tttggctgca 1200
ttgaatatgc gggtacggag aagacttagt ctcttcttga acgtaagaac tcaagtcgcc 1260
gcagattgga cggctcttgc cgaagaaatg gactttgaat atctcgagat tcgacaactc 1320
gaaacccaag cggatccaac tggtcggttg cttgacgctt ggcagggtcg ccctggagcg 1380
tctgtcggcc gattgcttga attgttgaca aaacttggca gagatgacgt gctcctggaa 1440
ctcggcccct ccatcgaaga ggactgtcag aaatacattc tgaaacagca acaagaggaa 1500
gcggaaaagc ccctgcaggt cgctgcagtt gattctagcg ttcctcggac cgcggaactt 1560
gcaggcataa ccactctcga cgatcccttg gggcacatgc ctgaacgctt tgacgccttc 1620
atttgttatt gcccaagcga ctag 1644
<210> 30
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2C
<400> 30
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr
20 25 30
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
35 40 45
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
50 55 60
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
65 70 75 80
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
85 90 95
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
100 105 110
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
115 120 125
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
130 135 140
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
165 170 175
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
180 185 190
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ala
195 200 205
Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser
210 215 220
Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser
225 230 235 240
Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu
245 250 255
Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr
260 265 270
Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro
275 280 285
Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg
290 295 300
Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln
305 310 315 320
Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln
325 330 335
Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly
340 345 350
Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp
355 360 365
Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala
370 375 380
Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser
385 390 395 400
Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala
420 425 430
Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln
435 440 445
Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly
450 455 460
Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp
465 470 475 480
Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys
485 490 495
Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val
500 505 510
Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile
515 520 525
Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala
530 535 540
Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
545 550
<210> 31
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2C
<400> 31
atggcacttc ccgttacagc actgctcctg cccctggcgc tgctcctgca cgcggcccgc 60
cccgagcaaa aacttatctc tgaagaggac ctcactattc cccctcatgt tcagaaatcc 120
gtaaacaatg atatgattgt cacggacaac aacggtgcgg tcaaattccc gcagctttgc 180
aaattttgtg atgttagatt ctcaacgtgt gataatcaaa agtcctgcat gagtaattgt 240
tcaattactt ccatctgcga aaagcctcag gaagtttgcg tcgcagtctg gaggaagaac 300
gacgaaaaca ttacacttga gactgtgtgt catgatccta aactccccta tcatgacttc 360
atccttgagg atgcggcgtc ccccaaatgt atcatgaaag agaaaaaaaa gcccggtgag 420
acgttcttca tgtgcagctg ctccagcgac gagtgcaatg ataacatcat tttctctgaa 480
gaatacaata cctcaaatcc cgacctcctc ttggtaatat ttcaggtgac gggtataagt 540
ttgcttccgc ctctcggtgt ggcgatctcc gttatcatta tcttttattg ctatcgcgtg 600
aacagacaac aaaaattgtc cgcggctggc ggaccagggg caggttcagc tgctccagta 660
agtagcacct cctcattgcc tttggctgca ttgaatatgc gggtacggag aagacttagt 720
ctcttcttga acgtaagaac tcaagtcgcc gcagattgga cggctcttgc cgaagaaatg 780
gactttgaat atctcgagat tcgacaactc gaaacccaag cggatccaac tggtcggttg 840
cttgacgctt ggcagggtcg ccctggagcg tctgtcggcc gattgcttga attgttgaca 900
aaacttggca gagatgacgt gctcctggaa ctcggcccct ccatcgaaga ggactgtcag 960
aaatacattc tgaaacagca acaagaggaa gcggaaaagc ccctgcaggt cgctgcagtt 1020
gattctagcg ttcctcggac cgcggaactt gcaggcataa ccactctcga cgatcccttg 1080
gggcacatgc ctgaacgctt tgacgccttc atttgttatt gcccaagcga cggtggcggt 1140
ggctcggcgg ctggcggacc aggggcaggt tcagctgctc cagtaagtag cacctcctca 1200
ttgcctttgg ctgcattgaa tatgcgggta cggagaagac ttagtctctt cttgaacgta 1260
agaactcaag tcgccgcaga ttggacggct cttgccgaag aaatggactt tgaatatctc 1320
gagattcgac aactcgaaac ccaagcggat ccaactggtc ggttgcttga cgcttggcag 1380
ggtcgccctg gagcgtctgt cggccgattg cttgaattgt tgacaaaact tggcagagat 1440
gacgtgctcc tggaactcgg cccctccatc gaagaggact gtcagaaata cattctgaaa 1500
cagcaacaag aggaagcgga aaagcccctg caggtcgctg cagttgattc tagcgttcct 1560
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tag 603
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gacgaaaaca ttacacttga gactgtgtgt catgatccta aactccccta tcatgacttc 360
atccttgagg atgcggcgtc ccccaaatgt atcatgaaag agaaaaaaaa gcccggtgag 420
acgttcttca tgtgcagctg ctccagcgac gagtgcaatg ataacatcat tttctctgaa 480
gaatacaata cctcaaatcc cgacctcctc ttggtaatat ttcaggtgac gggtataagt 540
ttgcttccgc ctctcggtgt ggcgatctcc gttatcatta tcttttattg ctatcgcgtg 600
aacagacaac aaaaattgtc cgcggctggc ggaccagggg caggttcagc tgctccagta 660
agtagcacct cctcattgcc tttggctgca ttgaatatgc gggtacggag aagacttagt 720
ctcttcttga acgtaagaac tcaagtcgcc gcagattgga cggctcttgc cgaagaaatg 780
gactttgaat atctcgagat tcgacaactc gaaacccaag cggatccaac tggtcggttg 840
cttgacgctt ggcagggtcg ccctggagcg tctgtcggcc gattgcttga attgttgaca 900
aaacttggca gagatgacgt gctcctggaa ctcggcccct ccatcgaaga ggactgtcag 960
aaatacattc tgaaacagca acaagaggaa gcggaaaagc ccctgcaggt cgctgcagtt 1020
gattctagcg ttcctcggac cgcggaactt gcaggcataa ccactctcga cgatcccttg 1080
gggcacatgc ctgaacgctt tgacgccttc atttgttatt gcccaagcga cggatctggt 1140
gaggggcggg ggtccctgct gacctgcggc gacgtcgaag aaaatcccgg tccc 1194
<210> 43
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2EN-T2A
<400> 43
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr
20 25 30
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Val Thr Gly Ile
35 40 45
Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe
50 55 60
Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ala Ala Gly Gly
65 70 75 80
Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro
85 90 95
Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu
100 105 110
Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu
115 120 125
Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp
130 135 140
Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val
165 170 175
Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile
180 185 190
Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala
195 200 205
Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr
210 215 220
Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile
225 230 235 240
Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gly Gly Pro
245 250 255
Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro Leu
260 265 270
Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Asn
275 280 285
Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu Met
290 295 300
Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp Pro
305 310 315 320
Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val
325 330 335
Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu
340 345 350
Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu
355 360 365
Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val
370 375 380
Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu
385 390 395 400
Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys
405 410 415
Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
420 425 430
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
435 440
<210> 44
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2EN-T2A
<400> 44
atggcacttc ccgttacagc actgctcctg cccctggcgc tgctcctgca cgcggcccgc 60
cccgagcaaa aacttatctc tgaagaggac ctcactattc cccctcatgt tcagaaatcc 120
gtaaacaatg atgtgacggg tataagtttg cttccgcctc tcggtgtggc gatctccgtt 180
atcattatct tttattgcta tcgcgtgaac agacaacaaa aattgtccgc ggctggcgga 240
ccaggggcag gttcagctgc tccagtaagt agcacctcct cattgccttt ggctgcattg 300
aatatgcggg tacggagaag acttagtctc ttcttgaacg taagaactca agtcgccgca 360
gattggacgg ctcttgccga agaaatggac tttgaatatc tcgagattcg acaactcgaa 420
acccaagcgg atccaactgg tcggttgctt gacgcttggc agggtcgccc tggagcgtct 480
gtcggccgat tgcttgaatt gttgacaaaa cttggcagag atgacgtgct cctggaactc 540
ggcccctcca tcgaagagga ctgtcagaaa tacattctga aacagcaaca agaggaagcg 600
gaaaagcccc tgcaggtcgc tgcagttgat tctagcgttc ctcggaccgc ggaacttgca 660
ggcataacca ctctcgacga tcccttgggg cacatgcctg aacgctttga cgccttcatt 720
tgttattgcc caagcgacgg tggcggtggc tcggcggctg gcggaccagg ggcaggttca 780
gctgctccag taagtagcac ctcctcattg cctttggctg cattgaatat gcgggtacgg 840
agaagactta gtctcttctt gaacgtaaga actcaagtcg ccgcagattg gacggctctt 900
gccgaagaaa tggactttga atatctcgag attcgacaac tcgaaaccca agcggatcca 960
actggtcggt tgcttgacgc ttggcagggt cgccctggag cgtctgtcgg ccgattgctt 1020
gaattgttga caaaacttgg cagagatgac gtgctcctgg aactcggccc ctccatcgaa 1080
gaggactgtc agaaatacat tctgaaacag caacaagagg aagcggaaaa gcccctgcag 1140
gtcgctgcag ttgattctag cgttcctcgg accgcggaac ttgcaggcat aaccactctc 1200
gacgatccct tggggcacat gcctgaacgc tttgacgcct tcatttgtta ttgcccaagc 1260
gacggatctg gtgaggggcg ggggtccctg ctgacctgcg gcgacgtcga agaaaatccc 1320
ggtccc 1326
<210> 45
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A
<400> 45
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met
20 25 30
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Asn Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Met Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg
245 250 255
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 46
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A
<400> 46
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcg ccatgacaca atctcaaaag ttcatgtcca cgtcagtcgg agaccgagtc 120
tccgtcactt gcaaggccag tcagaatgtg gataccaatg tagcatggta ccagcaaaaa 180
cccggacagt cacctaaggc tcttatatac tccgcttctt ataggtattc tggtgtacct 240
gacaggttta ctgggtccgg gtccggcaca gacttcactc tgacaataaa caatgtgcaa 300
tcagaggacc tcgcggagta tttctgtcag caatataaca actacccatt tactttcggt 360
tcaggcacta aactggagat aaagggcgga ggagggtcag gcgggggcgg ttcaggggga 420
ggtgggtcag gcgggggggg ttccgatgtt cagttggtag agtccggggg gggtctggta 480
cagcctggtg gatcaagaaa actgtcttgc gcggcgagtg ggttcacctt ctctagtttt 540
ggaatgcact gggtacgcca agcaccggag aaaggtttgg aatgggtcgc atacatttct 600
tcagatagtt cagcaattta ttacgcggac acagtgaaag gacggtttac gatctccaga 660
gacaacccta agaatacgct ctttctccaa atgaccagcc tccgatctga agatacggca 720
atgtattatt gtggtcgggg cagagagaac atttattatg gctcccgcct cgattactgg 780
ggccaaggta ccactctgac ggtctcttca accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 960
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 1020
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1080
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1140
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1482
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (1)...(5)
<223> 重复1-4次
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 50
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 51
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a TM
<400> 51
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 52
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a TM
<400> 52
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 53
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 54
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 55
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 56
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> 4-1BB (氨基酸 214-255)
<400> 56
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 57
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (氨基酸153-179)
<400> 57
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 58
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (氨基酸 114-179)
<400> 58
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 59
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (氨基酸180-220)
<400> 59
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 60
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
<400> 60
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 61
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 61
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 62
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 62
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 63
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 63
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 64
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 65
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 66
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 66
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 67
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B轻链
<400> 67
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
<210> 68
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B重链
<400> 68
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
115 120 125
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
130 135 140
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
145 150 155 160
Asp Phe Ala Cys Asp
165
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B重链CDR1
<400> 69
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B重链CDR2
<400> 70
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B重链CDR3
<400> 71
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B轻链CDR1
<400> 72
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B轻链CDR2
<400> 73
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B轻链CDR3
<400> 74
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 75
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A轻链
<400> 75
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met
20 25 30
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Asn Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 76
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A重链
<400> 76
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
115 120 125
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
130 135 140
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
145 150 155 160
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
165
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A重链CDR1
<400> 77
Ser Phe Gly Met His
1 5
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A重链CDR2
<400> 78
Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A重链CDR3
<400> 79
Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A轻链CDR1
<400> 80
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A轻链CDR2
<400> 81
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A轻链CDR3
<400> 82
Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 83
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B scFv
<400> 83
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp
305
<210> 84
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A scFv
<400> 84
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met
20 25 30
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Asn Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Met Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg
245 250 255
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
305 310 315
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2细胞质结构域4 aa
<400> 86
Cys Tyr Arg Val
1
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2细胞外结构域的一部分
<400> 87
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp
1 5 10
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 88
Ala Ala Gly Ser Gly
1 5
<210> 89
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 89
Gly Ser Gly
1
<210> 90
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-1A
<400> 90
Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val
1 5 10 15
Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val
20 25 30
Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp
35 40 45
Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala Val
85 90 95
Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met Val
100 105 110
Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn Glu
115 120 125
Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr Leu
130 135 140
Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala
145 150 155 160
Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met
165 170 175
Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val
180 185 190
Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu
195 200 205
Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu
210 215 220
Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu
225 230 235 240
Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro
245 250 255
Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu
260 265 270
Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro
275 280 285
Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly
290 295 300
His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
305 310 315 320
<210> 91
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-1B
<400> 91
Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val
1 5 10 15
Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val
20 25 30
Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp
35 40 45
Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala Val
85 90 95
Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met Val
100 105 110
Tyr Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gly Gly
115 120 125
Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro
130 135 140
Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu
145 150 155 160
Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu
165 170 175
Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp
180 185 190
Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser
195 200 205
Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val
210 215 220
Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile
225 230 235 240
Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala
245 250 255
Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr
260 265 270
Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile
275 280 285
Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
290
<210> 92
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2A
<400> 92
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val
145 150 155 160
Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser
165 170 175
Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr
180 185 190
Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu
195 200 205
Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala
210 215 220
Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
225 230 235 240
Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg
245 250 255
Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
260 265 270
Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys
275 280 285
Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu
290 295 300
Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala
305 310 315 320
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe
325 330 335
Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
340 345
<210> 93
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2B
<400> 93
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val
145 150 155 160
Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser
165 170 175
Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr
180 185 190
Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu
195 200 205
Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala
210 215 220
Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
225 230 235 240
Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg
245 250 255
Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
260 265 270
Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys
275 280 285
Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu
290 295 300
Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala
305 310 315 320
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe
325 330 335
Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ala Ala Gly Gly Pro Gly
340 345 350
Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala
355 360 365
Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val
370 375 380
Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp
385 390 395 400
Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr
405 410 415
Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly
420 425 430
Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu
435 440 445
Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys
450 455 460
Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val Asp
465 470 475 480
Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp
485 490 495
Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr
500 505 510
Cys Pro Ser Asp
515
<210> 94
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2C
<400> 94
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val
145 150 155 160
Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser
165 170 175
Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr
180 185 190
Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu
195 200 205
Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala
210 215 220
Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
225 230 235 240
Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg
245 250 255
Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
260 265 270
Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys
275 280 285
Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu
290 295 300
Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala
305 310 315 320
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe
325 330 335
Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser
355 360 365
Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser
370 375 380
Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu
385 390 395 400
Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr
405 410 415
Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro
420 425 430
Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg
435 440 445
Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln
450 455 460
Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln
465 470 475 480
Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly
485 490 495
Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp
500 505 510
Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp
515 520
<210> 95
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2IN
<400> 95
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
65 70 75 80
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
100 105 110
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
115 120 125
Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val
145 150 155 160
Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val
165
<210> 96
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2IN-T2A
<400> 96
Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
20 25 30
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
35 40 45
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
50 55 60
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
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Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu
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Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly
115 120 125
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165 170 175
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165 170 175
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<211> 1059
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2C-T2A-CAR-B
<400> 105
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
130 135 140
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
145 150 155 160
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
165 170 175
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
180 185 190
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ala
195 200 205
Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser
210 215 220
Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser
225 230 235 240
Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu
245 250 255
Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr
260 265 270
Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro
275 280 285
Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg
290 295 300
Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln
305 310 315 320
Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln
325 330 335
Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly
340 345 350
Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp
355 360 365
Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala
370 375 380
Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser
385 390 395 400
Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala
420 425 430
Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln
435 440 445
Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly
450 455 460
Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp
465 470 475 480
Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala
530 535 540
Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser
545 550 555 560
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu
565 570 575
Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala
580 585 590
Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser
595 600 605
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser
610 615 620
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu
625 630 635 640
Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu
660 665 670
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690 695 700
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
705 710 715 720
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
725 730 735
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
740 745 750
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
755 760 765
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Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val
325 330 335
Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu
340 345 350
Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu
355 360 365
Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val
370 375 380
Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu
385 390 395 400
Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys
405 410 415
Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
420 425 430
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr
435 440 445
Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp
450 455 460
Ile Ala Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp
465 470 475 480
Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val
485 490 495
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr
500 505 510
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
515 520 525
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu
530 535 540
Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr
545 550 555 560
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val
580 585 590
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg
595 600 605
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
610 615 620
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr
625 630 635 640
Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly
645 650 655
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln
660 665 670
Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg
675 680 685
Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
690 695 700
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
705 710 715 720
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
725 730 735
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
740 745 750
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
755 760 765
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
770 775 780
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
785 790 795 800
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
805 810 815
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
820 825 830
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
835 840 845
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
850 855 860
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
865 870 875 880
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
885 890 895
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
900 905 910
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
915 920 925
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
930 935
<210> 111
<211> 928
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSR-2EN-T2A-CAR-B
<400> 111
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr
20 25 30
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Val Thr Gly Ile
35 40 45
Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe
50 55 60
Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ala Ala Gly Gly
65 70 75 80
Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro
85 90 95
Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu
100 105 110
Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu
115 120 125
Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp
130 135 140
Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val
165 170 175
Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile
180 185 190
Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala
195 200 205
Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr
210 215 220
Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile
225 230 235 240
Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gly Gly Pro
245 250 255
Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser Thr Ser Ser Leu Pro Leu
260 265 270
Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Asn
275 280 285
Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr Ala Leu Ala Glu Glu Met
290 295 300
Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu Glu Thr Gln Ala Asp Pro
305 310 315 320
Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly Arg Pro Gly Ala Ser Val
325 330 335
Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu Gly Arg Asp Asp Val Leu
340 345 350
Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp Cys Gln Lys Tyr Ile Leu
355 360 365
Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro Leu Gln Val Ala Ala Val
370 375 380
Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu Ala Gly Ile Thr Thr Leu
385 390 395 400
Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys
405 410 415
Tyr Cys Pro Ser Asp Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
420 425 430
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr
435 440 445
Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp
450 455 460
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
465 470 475 480
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
485 490 495
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
500 505 510
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
515 520 525
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
530 535 540
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
545 550 555 560
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
580 585 590
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
595 600 605
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
610 615 620
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
625 630 635 640
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
645 650 655
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
660 665 670
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
675 680 685
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
690 695 700
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
705 710 715 720
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
725 730 735
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
740 745 750
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
755 760 765
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
770 775 780
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
785 790 795 800
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
805 810 815
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
820 825 830
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
835 840 845
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
850 855 860
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
865 870 875 880
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
885 890 895
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
900 905 910
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
915 920 925
<210> 112
<211> 544
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有HTLV1增强子的Ef1α启动子
<400> 112
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540
ctac 544
<210> 113
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 113
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 114
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 114
Ala Ala Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 115
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 115
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 116
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 116
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 117
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-B (无信号肽)
<400> 117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 118
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR-A (无信号肽)
<400> 118
Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu
195 200 205
Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly
210 215 220
Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
275 280 285
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
290 295 300
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
305 310 315 320
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
325 330 335
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
340 345 350
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
355 360 365
Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
370 375 380
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
385 390 395 400
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
405 410 415
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
420 425 430
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
435 440 445
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
450 455 460
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 119
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10Ra细胞外结构域
<400> 119
His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val Trp Phe Glu Ala Glu
1 5 10 15
Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile Pro Asn Gln Ser Glu
20 25 30
Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Ile Glu Ser Trp
35 40 45
Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser Tyr Asp Leu Thr Ala
50 55 60
Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr Arg Ala Arg Val Arg
65 70 75 80
Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr Val Thr Asn Thr Arg
85 90 95
Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly Ser Val Asn Leu Glu
100 105 110
Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln Leu Pro Arg Pro Lys
115 120 125
Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile Phe Ser His Phe Arg
130 135 140
Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly Asn Phe Thr Phe Thr
145 150 155 160
His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu Leu Thr Ser Gly Glu
165 170 175
Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser Val Ala Ser Arg Ser
180 185 190
Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile Ser Leu Thr Arg Gln
195 200 205
Tyr Phe Thr Val Thr Asn
210
<210> 120
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10Ra跨膜结构域
<400> 120
Val Ile Ile Phe Phe Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Cys Leu Ala Leu
20
<210> 121
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10Ra细胞质结构域
<400> 121
Gln Leu Tyr Val Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Ser Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Lys Lys Pro Ser Pro Phe Ile Phe Ile Ser Gln Arg Pro Ser Pro Glu
20 25 30
Thr Gln Asp Thr Ile His Pro Leu Asp Glu Glu Ala Phe Leu Lys Val
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Lys Asn Leu Asp Leu His Gly Ser Thr Asp Ser Gly
50 55 60
Phe Gly Ser Thr Lys Pro Ser Leu Gln Thr Glu Glu Pro Gln Phe Leu
65 70 75 80
Leu Pro Asp Pro His Pro Gln Ala Asp Arg Thr Leu Gly Asn Arg Glu
85 90 95
Pro Pro Val Leu Gly Asp Ser Cys Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ser Thr
100 105 110
Asp Ser Gly Ile Cys Leu Gln Glu Pro Ser Leu Ser Pro Ser Thr Gly
115 120 125
Pro Thr Trp Glu Gln Gln Val Gly Ser Asn Ser Arg Gly Gln Asp Asp
130 135 140
Ser Gly Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Glu Gly Arg Ala Gly Asp Thr
145 150 155 160
Gln Gly Gly Ser Ala Leu Gly His His Ser Pro Pro Glu Pro Glu Val
165 170 175
Pro Gly Glu Glu Asp Pro Ala Ala Val Ala Phe Gln Gly Tyr Leu Arg
180 185 190
Gln Thr Arg Cys Ala Glu Glu Lys Ala Thr Lys Thr Gly Cys Leu Glu
195 200 205
Glu Glu Ser Pro Leu Thr Asp Gly Leu Gly Pro Lys Phe Gly Arg Cys
210 215 220
Leu Val Asp Glu Ala Gly Leu His Pro Pro Ala Leu Ala Lys Gly Tyr
225 230 235 240
Leu Lys Gln Asp Pro Leu Glu Met Thr Leu Ala Ser Ser Gly Ala Pro
245 250 255
Thr Gly Gln Trp Asn Gln Pro Thr Glu Glu Trp Ser Leu Leu Ala Leu
260 265 270
Ser Ser Cys Ser Asp Leu Gly Ile Ser Asp Trp Ser Phe Ala His Asp
275 280 285
Leu Ala Pro Leu Gly Cys Val Ala Ala Pro Gly Gly Leu Leu Gly Ser
290 295 300
Phe Asn Ser Asp Leu Val Thr Leu Pro Leu Ile Ser Ser Leu Gln Ser
305 310 315 320
Ser Glu
<210> 122
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10Rb细胞外结构域
<400> 122
Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly Asn Leu Thr
20 25 30
Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp Lys Cys Met
35 40 45
Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Gly
50 55 60
Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu His Ser Asp
65 70 75 80
Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile Ile Gly Pro
85 90 95
Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His Met Arg Phe
100 105 110
Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr Met Lys Asn
115 120 125
Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys Asn Gly Thr
130 135 140
Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu Val Leu Arg
145 150 155 160
Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg Gly Phe Leu
165 170 175
Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val Cys Glu Gln
180 185 190
Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser
195 200
<210> 123
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10Rb跨膜结构域
<400> 123
Trp Met Val Ala Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Cys Phe
20
<210> 124
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL10Rb细胞质结构域
<400> 124
Ala Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe Ser Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His Pro His
20 25 30
His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu Asn Asp
35 40 45
Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser Gly Lys
50 55 60
Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly Gln Gly
65 70 75 80
Pro Gln Ser
<210> 125
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL4R细胞外结构域
<400> 125
Met Lys Val Leu Gln Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile
1 5 10 15
Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu
20 25 30
Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu
50 55 60
Met Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala
65 70 75 80
Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val
85 90 95
Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp
100 105 110
Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu
115 120 125
Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro
130 135 140
Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg
145 150 155 160
Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val
165 170 175
Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro
180 185 190
Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His
195 200 205
<210> 126
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL4R跨膜结构域
<400> 126
Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys
1 5 10 15
Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr
20
<210> 127
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL4R细胞质结构域
<400> 127
Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser
1 5 10 15
Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu
20 25 30
Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn
35 40 45
Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg
50 55 60
Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp
85 90 95
Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro
100 105 110
Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe
115 120 125
Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu
130 135 140
Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly
145 150 155 160
Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu
165 170 175
Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe
180 185 190
Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro
195 200 205
Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp
210 215 220
Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala
225 230 235 240
Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu
245 250 255
Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro
260 265 270
Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln
275 280 285
Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln
290 295 300
His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln
305 310 315 320
Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val
325 330 335
Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser
340 345 350
Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala
355 360 365
Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly
370 375 380
Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly
385 390 395 400
Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser
405 410 415
Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp
420 425 430
Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val
435 440 445
Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu
450 455 460
Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr
465 470 475 480
Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser
485 490 495
Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly
500 505 510
Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly
515 520 525
Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly
530 535 540
Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser
545 550 555 560
Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser
565
<210> 128
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MyD88
<400> 128
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln
165 170 175
Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys
180 185 190
Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala
195 200 205
Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val Val Val Ser
210 215 220
Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ile Lys
245 250 255
Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr
260 265 270
Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg
275 280 285
Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
290 295
<210> 129
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR2细胞质结构域
<400> 129
Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr
1 5 10 15
Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile
20 25 30
Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile
35 40 45
Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr
65 70 75 80
Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu
85 90 95
Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu
100 105 110
Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr
115 120 125
Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly
130 135 140
Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu
145 150 155 160
Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser
165 170 175
Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu
195 200 205
Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp
210 215 220
Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro
225 230 235 240
Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys
245 250 255
Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser
260 265 270
Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly
275 280 285
Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val
290 295 300
Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His
305 310 315 320
Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His
325 330 335
Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser
340 345 350
Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu
355 360 365
Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
370 375 380
<210> 130
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFBR1细胞质结构域
<400> 130
Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn Glu Glu Asp
1 5 10 15
Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr Leu Lys Asp
20 25 30
Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu
35 40 45
Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln Glu Ser Ile
50 55 60
Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp Arg Gly Glu
65 70 75 80
Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg Ser Trp Phe
85 90 95
Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His Glu Asn Ile
100 105 110
Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr Trp Thr Gln
115 120 125
Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu Phe Asp Tyr
130 135 140
Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys Leu Ala Leu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile Val Gly Thr
165 170 175
Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile
180 185 190
Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala
195 200 205
Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala Pro Asn His
210 215 220
Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Asp Ser
225 230 235 240
Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp Ile Tyr Ala
245 250 255
Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser Ile Gly Gly
260 265 270
Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val Pro Ser Asp
275 280 285
Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln Lys Leu Arg
290 295 300
Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu Arg Val Met
305 310 315 320
Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala Ala Arg Leu
325 330 335
Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser Gln Gln Glu
340 345 350
Gly Ile Lys Met
355

Claims (114)

1.一种嵌合信号传导受体，所述嵌合信号传导受体包含：
(a)TGFβ受体(TGFβR)的细胞外结构域或其结合TGFβ的一部分；
(b)跨膜结构域；
(c)第一截短的MyD88多肽，其缺乏全长MyD88的全长TIR结构域；以及
(d)第二截短的MyD88结构域，其缺乏全长MyD88的全长TIR结构域。
2.根据权利要求1所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR是TGFβR2。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的嵌合信号传导受体，其中所述细胞外结构域或其部分包含：
(i)SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:20中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列；或
(iii)结合TGFβ的(i)或(ii)的一部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述细胞外结构域或其部分如SEQ ID NO:20中所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域包含所述TGFβR的天然跨膜结构域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域包含SEQID NO:22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域如SEQID NO:22中所示。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域是来自除所述TGFβR以外的跨膜蛋白的异源跨膜结构域。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域和所述第一截短的MyD88多肽直接连接。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述跨膜结构域和所述第一截短的MyD88多肽通过接头间接连接。
11.根据权利要求10所述的嵌合信号传导受体，其中所述接头是或包含肽接头。
12.根据权利要求10所述的嵌合信号传导受体，其中所述接头是或包含所述TGFβR的细胞质结构域的N末端连续氨基酸的部分序列，其为非功能性部分，其中所述非功能性部分不是能够介导抑制性信号传导的功能性抑制性信号传导结构域。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述细胞内结构域不能募集抑制性衔接分子，任选地SMAD。
14.根据权利要求10、12或13所述的嵌合信号传导受体，其中所述接头是SEQ ID NO:129中所示的TGFβR2细胞质结构域的氨基酸1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24或1-25，任选地其中所述接头如SEQ ID NO:24中所示。
15.一种嵌合信号传导受体，所述嵌合信号传导受体包含(i)TGFβ受体(TGFβR)的一部分，其含有所述细胞外结构域和所述跨膜结构域，其中所述部分小于所述全长TGFβR并且缺乏所述全长TGFβR的功能性抑制性信号传导结构域；和(ii)细胞内结构域，其含有缺乏全长MyD88的全长TIR结构域的第一截短的MyD88多肽和缺乏全长MyD88的全长TIR结构域的第二截短的MyD88结构域。
16.根据权利要求15所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR是TGFβR2。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3中所示序列展现出至少或约85％、至少或约90％、至少或约92％、至少或约95％、至少或约97％序列同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分如SEQ ID NO:3中所示。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分与所述细胞内结构域直接连接。
20.根据权利要求15-18中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述TGFβR的一部分和所述细胞内结构域通过肽接头间接连接。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二MyD88多肽各自包含MyD88的死亡结构域(DD)、中间结构域(ID)和全长TIR结构域的一部分。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二MyD88多肽各自独立地是选自以下的氨基酸序列：所述全长MyD88、任选地SEQ ID NO:128的氨基酸2-155、2-156、2-157、2-158、2-159、2-160、2-161、2-162、2-163、2-164、2-165、2-166、2-167、2-168、2-169、2-170、2-171、2-172、2-173、2-174、2-175、2-176、2-177、2-178、2-179或2-180。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二截短的多肽各自独立地是所述全长MyD88、任选地SEQ ID NO:128的氨基酸2-171或2-172的序列。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽如SEQ ID NO:2中所示。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第二截短的MyD88多肽如SEQ ID NO:2中所示。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一截短的MyD88多肽和所述第二截短的MyD88多肽是相同的。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽通过肽接头连接。
28.根据权利要求11、20和27所述的嵌合信号传导受体，其中所述肽接头是(G4S)n(SEQID NO:47)，其中n是1至4的整数，包含端值。
29.根据权利要求11、20、27和28所述的嵌合信号传导受体，其中所述肽接头如SEQIDNO:47((GGGGS)n)中所示，其中n是1至4的整数，包含端值，任选地其中所述肽接头选自SEQ ID NO:48(GGGGS)、SEQ ID NO:85(GGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:49(GGGGSGGGGSGGGGS)和SEQ ID NO:50(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:93中所示或与SEQ ID NO:93中所示序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约97％序列同一性的氨基酸序列。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:93中所示。
32.根据权利要求1-29中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:94中所示或与SEQ ID NO:94中所示序列展现出至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约95％、或至少或至少约97％序列同一性的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中所述嵌合信号传导受体如SEQ ID NO:94中所示。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合诱导所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽的二聚化。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合将IRAK4募集到所述第一MyD88多肽和所述第二MyD88多肽。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的嵌合信号传导受体，其中当所述嵌合信号传导受体由细胞表达时，TGFβ与所述细胞外结构域的结合导致IRAK4的磷酸化。
37.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码根据权利要求1-36中任一项所述的嵌合信号传导受体的核苷酸序列。
38.根据权利要求37所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列是第一核苷酸序列，并且所述多核苷酸还包含编码另一重组分子的第二核苷酸序列。
39.根据权利要求38所述的多核苷酸，其中所述重组分子是重组抗原受体，任选地其中所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
40.根据权利要求38或39所述的多核苷酸，其中所述重组抗原受体是CAR。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的多核苷酸，其中所述重组抗原受体结合肿瘤抗原，任选地其中所述肿瘤抗原是CD19或B7H3。
42.根据权利要求41所述的多核苷酸，其中所述重组分子是细胞因子，任选地白介素或其功能性部分，任选地其中所述白介素是IL-2、IL-12、或IL-15或其功能性部分。
43.根据权利要求38所述的多核苷酸，其中所述重组分子是双特异性抗体，任选地其中所述双特异性抗体是双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
44.根据权利要求38-43中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列被双顺反子元件隔开。
45.根据权利要求44所述的多核苷酸，其中所述双顺反子元件是IRES或可切割肽。
46.根据权利要求45所述的多核苷酸，其中所述可切割肽选自P2A、T2A和F2A。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的多核苷酸，其中所述可切割肽是T2A。
48.根据权利要求37-47中任一项所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地连接至启动子。
49.根据权利要求38-47中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列各自可操作地连接至启动子。
50.根据权利要求49所述的多核苷酸，其中所述启动子是相同的启动子。
51.根据权利要求48-50中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子是EF1启动子。
52.一种载体，所述载体包含根据权利要求37、48或51所述的多核苷酸。
53.一种载体，所述载体包含根据权利要求37-51中任一项所述的多核苷酸。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
55.根据权利要求54所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
57.一种产生工程化细胞的方法，所述方法包括在用于表达所述嵌合信号传导受体和所述重组分子的条件下，将根据权利要求38-51中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求53-56中任一项所述的载体引入细胞中。
58.一种产生工程化细胞的方法，所述方法包括在用于在细胞的表面表达所述嵌合信号传导受体的条件下，将根据权利要求37-51所述的多核苷酸或根据权利要求52-56中任一项所述的载体引入所述细胞中。
59.根据权利要求58所述的方法，所述方法还包括在用于在所述细胞的表面表达所述重组抗原受体的条件下将编码重组抗原受体的多核苷酸引入所述细胞中。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
61.根据权利要求59或权利要求60所述的方法，其中所述重组抗原受体是CAR。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述重组抗原受体结合肿瘤抗原，任选地其中所述肿瘤抗原是CD19或B7H3。
63.根据权利要求62所述的方法，所述方法还包括在用于细胞因子的表达和任选分泌的条件下，将编码所述细胞因子的多核苷酸引入所述细胞，任选地其中所述细胞因子是白介素或其功能性部分，任选地其中所述白介素是IL-2、IL-12或IL-15或其功能性部分。
64.根据权利要求58所述的方法，所述方法还包括在用于双特异性抗体的表达和任选分泌的条件下，将编码所述双特异性抗体的多核苷酸引入所述细胞中，任选地其中所述双特异性抗体是BiTE。
65.根据权利要求57-64中任一项所述的方法，其中所述细胞是来自受试者的原代细胞。
66.根据权利要求57-65中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞、肿瘤浸润细胞(TIL)、B细胞、自然杀伤细胞或巨噬细胞。
67.根据权利要求57-66中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞，任选地CD3+、CD4+或CD8+T细胞。
68.根据权利要求57-67中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD8+T细胞。
69.根据权利要求57-67中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD4+T细胞。
70.一种通过根据权利要求57-69中任一项所述的方法产生的工程化细胞。
71.一种包含根据权利要求1-36中任一项所述的嵌合信号传导受体的工程化细胞。
72.根据权利要求71所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞还包含重组分子。
73.一种包含根据权利要求37所述的多核苷酸的工程化细胞。
74.根据权利要求73所述的工程化细胞，所述工程化细胞还包含编码重组分子的多核苷酸。
75.根据权利要求72或权利要求74所述的工程化细胞，其中所述重组分子是重组抗原受体，任选地其中所述重组抗原受体是重组T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
76.根据权利要求75所述的工程化细胞，其中所述重组抗原受体是CAR。
77.根据权利要求75-76中任一项所述的工程化细胞，其中所述重组抗原受体结合肿瘤抗原，任选地其中所述肿瘤抗原是CD19或B7H3。
78.根据权利要求72或权利要求74所述的工程化细胞，其中所述重组分子是可从所述细胞分泌的分子。
79.根据权利要求72、权利要求74或权利要求78所述的工程化细胞，其中所述重组分子是细胞因子，任选地白介素或其功能性部分，任选地其中所述白介素是IL-2、IL-12、或IL-15或其功能性部分。
80.根据权利要求72、权利要求74或权利要求78所述的工程化细胞，其中所述重组分子是双特异性抗体，任选地其中所述双特异性抗体是BiTE。
81.一种包含根据权利要求38-51中任一项所述的多核苷酸的工程化细胞。
82.根据权利要求70-81中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是来自受试者的原代细胞。
83.根据权利要求70-82中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞。
84.根据权利要求70-83中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞，任选地CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞。
85.根据权利要求70-84中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是CD8+T细胞。
86.根据权利要求70-85中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是CD4+T细胞。
87.一种包含根据权利要求70-86中任一项所述的工程化细胞的药物组合物。
88.根据权利要求87所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
89.根据权利要求87或权利要求88所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
90.一种治疗方法，所述治疗方法包括将根据权利要求70-86中任一项所述的工程化细胞或根据权利要求87-89中任一项所述的药物组合物施用给患有癌症的受试者。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述工程化细胞包含靶向所述癌症的抗原的抗原受体。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述工程化细胞表达包含结合与所述癌症相关的肿瘤抗原的抗原结合结构域的重组抗原受体，任选地其中所述癌症的细胞表达所述肿瘤抗原。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中所述重组抗原受体是CAR。
95.根据权利要求90-94中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤。
96.根据权利要求92-95中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是B7H3。
97.根据权利要求92-96中任一项所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、尿道上皮癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、肾母细胞瘤，任选地其中所述癌症是卵巢癌或神经母细胞瘤。
98.根据权利要求92-95中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD19。
99.根据权利要求90-95和98中任一项所述的方法，其中所述癌症是B细胞癌。
100.根据权利要求90-95、98和99中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤，任选地转移性淋巴瘤。
101.根据权利要求90-100中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞表达从所述细胞分泌的重组分子，任选地其中所述重组分子是双特异性抗体或细胞因子。
102.根据权利要求87-89中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途。
103.根据权利要求87-89中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有癌症的受试者。
104.根据权利要求102所述的用途或根据权利要求103所述的用于所述用途的药物组合物，其中所述药物组合物的工程化细胞包含靶向所述癌症的抗原的抗原受体。
105.根据权利要求104所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述工程化细胞表达包含结合与所述癌症相关的肿瘤抗原的抗原结合结构域的重组抗原受体，任选地其中所述癌症的细胞表达所述肿瘤抗原。
106.根据权利要求105所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
107.根据权利要求105或权利要求106所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述重组抗原受体是CAR。
108.根据权利要求103-107中任一项所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤。
109.根据权利要求103-108中任一项所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是B7H3。
110.根据权利要求103-109中任一项所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述癌症是前列腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、尿道上皮癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、肾母细胞瘤，任选地其中所述癌症是卵巢癌或神经母细胞瘤。
111.根据权利要求103-108中任一项所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是CD19。
112.根据权利要求103-108和111中任一项所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述癌症是B细胞癌。
113.根据权利要求103-108、111和112中任一项所述的用途或用于所述用途的药物组合物，其中所述癌症是白血病或淋巴瘤，任选地转移性淋巴瘤。
114.根据权利要求103-113中任一项所述的用途或药物组合物，其中所述工程化细胞表达从所述细胞分泌的重组分子，任选地其中所述重组分子是双特异性抗体或细胞因子。
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