CN112292147A - 工程化的细胞及其用途 - Google Patents

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赵涛
曾明
张亚峰
张望
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Abstract

一种诱导免疫细胞活性的系统，所述系统包含嵌合抗原受体、T细胞受体以及它们的各种组合。

Description

工程化的细胞及其用途
交叉引用
本申请要求于2018年6月19日提交的专利合作条约申请号PCT/CN2018/091789的优先权，所述申请的全部内容出于所有目的以引用方式并入本文。
发明背景
效应细胞活性可涉及配体结合至膜结合受体，该膜结合受体包含细胞外抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域。抗原结合结构域与其对应的靶标之间形成复合物可导致受体本身发生构象和/或化学修饰，这继而可产生在细胞内转导的一系列信号。利用这种相互作用来开发免疫细胞疗法的尝试已显示出有希望的功效，但脱靶毒性也导致了所治疗的受试者的不良副作用，包括细胞因子释放综合征。这种和其他副作用可进一步加剧炎症反应、器官衰竭，并且甚至在极端情况下导致死亡。
所有T细胞的发育和功能均取决于其抗原受体。T细胞受体(TCR)是一种多蛋白复合物，其由以下两种功能不同的模块组成：配体结合模块和信号传输模块。配体结合模块由两条可变的多肽链TCRα和TCRβ组成，它们形成共价连接的异二聚体并且负责TCR的配体特异性。TCR复合体的信号传输模块由不变的多肽链组成，所述不变的多肽链包括CD3e、CD3g、CD3d和z。其中CD3e、CD3g和CD3d形成非共价连接的CD3eg和CD3ed异二聚体，而z形成共价连接的zz同二聚体。TCR复合物的表面表达需要完整组装的复合物亚基集。组装开始于在内质网中形成CD3ed和CD3eg异二聚体。然后，它们分别与TCRα和TCRβ缔合，以产生中间体复合物。zz同二聚体是最后一个接合的亚基，并在其并入后，整个TCR复合物被转运至质膜(Klausner等人，(1990)；Exley等人，(1991)；Dave等人，(1997)；Marie-Cardine和Schraven,(1999)；Kane等人，(2000)；Matthew等人，(2004))。
与TCRαβ结合的pMHC通过CD3信号传导单元传递至细胞中，涉及TCR-CD3聚集和构象变化。许多实验已经证明T细胞激活涉及一系列由TCR介导的信号，这些信号受位于CD3链(CD3 zz、CD3eg和CD3ed)的胞质尾区内的三个不同的细胞内信号传导基序调控(Sun等人，JImmunol(185),(2010))。使用嵌合分子的研究已表明，TCR的所有信号传导链的胞质尾区都可以独立地转导导致细胞毒性和/或细胞因子产生的信号，从而绕过TCR的αβ识别方式。然而，基于实验结果，先前报道过仅通过CD3ζ链的信号不足以引发静息的T淋巴细胞(Thomas等人，J.Exp.Med.,(1995))，并且小鼠中突变的CD3e信号传导结构域显示出不完整的T细胞功能(Matthew等人，J Immunol(193),(2014)。)CD3eg、CD3ed和zz链在贡献T细胞功能起互补作用，甚至协同效应(Borroto等人，J Immunol(163),(1999))。
嵌合抗原受体(CAR)是一种模块化融合蛋白，所述模块化融合蛋白包含与一个或两个共刺激分子连接的结合结构域、间隔区结构域、跨膜结构域和含有CD3z的细胞内信号传导结构域。CAR结构已从仅涉及CD3ζ信号传导结构域的初始组合物显著进化，被称为“第一代CAR”。从那时起，为了增加T细胞的持久性和增殖，添加了共刺激末端结构域，从而产生第二代(例如，CD3ζ加4-1BB或CD28信号传导结构域)和第三代(例如，CD3ζ加4-1BB和CD28信号传导结构域)CAR。
CAR T细胞的过继转移已证明了在治疗血源性肿瘤方面的显著成功；显著地，正在探索在白血病(Gill,S等人，Blood Rev,(2015))和患有淋巴瘤和骨髓瘤的患者中的适应症中使用CD19 CAR。越来越多的临床试验专注于实体瘤。不幸的是，临床结果远没有那么令人鼓舞。迄今为止，已报道的两个最积极的试验已经使用GD2 CAR靶向神经母细胞瘤(11名患者中有3名完全缓解)(Louis等人，Blood(118),(2011))，并且使用HER2 CAR用于肉瘤(17名患者中有4名表现出稳定的疾病)(Ahmed等人，J Clin Oncol(33),(2015))。
已经提出患者血清中不良的运输、有限持久性和的T细胞抑制活性导致观察到缺乏功效(Kershaw等人，Clin.Cancer Res(12),(2006))。仍然存在对用于提高具有更好的细胞杀伤效应、体内持久性和对肿瘤微环境的更好耐受性的经遗传修饰的T细胞的综合功能新设计的未满足需求。
发明内容
鉴于前述，非常需要用于进行免疫疗法的替代组合物和方法。本公开的组合物和方法解决了该需求，并且还提供了另外的优点。本公开的各个方面提供了用于诱导免疫细胞的活性的系统、组合物和方法。
在一个方面中，提供了一种诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的系统，该系统包含：(a)嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含表现出与第一表位的特异性结合的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该经修饰的TCR复合物包含表现出与第二表位的特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。
在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与第一表位的结合和/或第二抗原结合结构域与第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；(iii)CD3ζ链，并且其中所述两个或更多个抗原结合结构域与它们相应的表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
在一些实施方案中，所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，所述细胞毒性与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比得到增强。
在一些实施方案中，与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性的持久性。
在一些实施方案中，当所述系统在受试者的免疫细胞中表达时，与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合相比，所述两个或更多个抗原结合结构域与它们相应的表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性持久性。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR包含第三抗原结合结构域，所述第三抗原结合结构域连接至：(i)所述第二抗原结合结构域；(ii)所述至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(iii)分化簇3(CD3)的所述ε链、所述δ链和/或所述γ链；或(iv)所述CD3ζ链。
在一些实施方案中，所述CAR包含一个或多个另外的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的抗原结合结构域表现出与一个或多个另外的表位的特异性结合。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的表位与所述第一表位或所述第二表位相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的表位与所述第一表位和所述第二表位不同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的抗原结合结构域和所述第一抗原结合结构域串联连接。
在一些实施方案中，所述CAR的所述细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述CAR的所述细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
在一些实施方案中，所述CAR的所述细胞内信号传导结构域包括Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR还包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包含选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF-R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体、单结构域抗体、骆驼科动物抗体的轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域中的至少一者包含受体。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域中的至少一者包含受体的配体。
在一些实施方案中，所述第一表位和所述第二表位存在于不同的抗原上。在一些实施方案中，所述第一表位和所述第二表位存在于共同抗原上。
在一些实施方案中，至少一种表位存在于一种或多种细胞表面抗原上。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞表面抗原是肿瘤相关抗原、酪氨酸激酶受体、丝氨酸激酶受体和G蛋白偶联受体。
在一些实施方案中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于通用抗原上。
在一些实施方案中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于新抗原上。在一些实施方案中，所述第一表位和/或所述第二表位是新表位。
在一些实施方案中，所述第一表位和/或所述第二表位存在于肿瘤相关抗原上。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、BCMA、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CA-125、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD4、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、CLL-1、CTAG1B、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FAP、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、FR-α、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、GPC3、GPC-2、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、L1-CAM、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、生存素、生存素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFαRII、TGFβRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ轻链。
在一些实施方案中，至少一个表位存在于免疫检查点受体或免疫检查点受体配体上。在一些实施方案中，所述免疫检查点受体或免疫检查点受体配体是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、BLTA、CD47或CD40。
在一些实施方案中，至少一个表位存在于细胞因子或细胞因子受体上。在一些实施方案中，该细胞因子或细胞因子受体是CCR2b、CXCR2(CXCL1受体)、CCR4(CCL17受体)、Gro-a、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、乙酰肝素酶、CD137L、LEM、Bcl-2、CCL17、CCL19或CCL2。
在一些实施方案中，至少一个表位存在于由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原上。在一些实施方案中，MHC是HLA 1类。在一些实施方案中，MHC是HLA 2类。
在另一方面中，提供了一种表达本公开的系统的分离的宿主细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+ T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞表现出与同时存在于靶细胞中的两种抗原的特异性结合。
在另一方面中，提供了一种抗原特异性免疫细胞，所述抗原特异性免疫细胞包含至少两个外源引入的抗原结合结构域，所述至少两个外源引入的抗原结合结构域中的一个连接至T细胞受体(TCR)复合物，另一个连接至嵌合抗原受体(CAR)，其中所述免疫细胞与表达由所述至少两个外源引入的抗原结合结构域识别的一种或多种抗原的靶细胞特异性结合。
在一些实施方案中，连接至所述CAR的所述抗原结合结构域主要介导所述免疫细胞与所述靶细胞之间的相互作用，并且当所述免疫细胞与所述靶细胞之间的所述相互作用发生时，连接至所述TCR复合物的所述抗原结合结构域主要介导免疫细胞活性。
在一些实施方案中，所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；(iii)CD3ζ链。
在另一方面中，提供了一种免疫细胞群，其中单个免疫细胞表达本公开的系统，并且所述免疫细胞群的特征在于：在将所述免疫细胞群暴露于受试者中的靶细胞群后，所述免疫细胞群在约2天内诱导所述靶细胞的至少5％的死亡。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群包括至多约1011个细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞包括淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在另一方面中，提供了一种诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的方法，所述方法包括：(a)在免疫细胞中表达系统；以及(b)在诱导所述免疫细胞和/或所述靶细胞的所述活性的条件下使所述靶细胞与所述免疫细胞接触，其中在所述免疫细胞中表达的所述系统包含：嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合和/或所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活所述免疫细胞的细胞毒性。
在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；(iii)CD3ζ链。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活所述免疫细胞的细胞毒性，所述细胞毒性与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比得到增强。
在一些实施方案中，与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合或所述第二抗原结合结构域的结合激活所述免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性的持久性。
在一些实施方案中，免疫细胞的细胞毒性诱导靶细胞的死亡。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是造血细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是实体肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜、软骨、韧带和肌腱中的一者或多者中鉴定出的细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，当所述系统在受试者的免疫细胞中表达时，与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合相比，所述两个或更多个抗原结合结构域与它们相应的表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性持久性。
在另一方面中，提供了一种组合物，所述组合物包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码：(a)嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含表现出与第二表位的特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，所述一种或多种多核苷酸包含与其可操作连接的启动子。
在另一方面中，提供了一种产生经修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括通过在所述免疫细胞中表达本公开的组合物来对所述免疫细胞进行遗传修饰，从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在另一方面中，提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，所述抗原特异性免疫细胞包含含有第一抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)和含有第二抗原结合结构域的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，其中所述受试者的癌症的靶细胞表达一种或多种由所述第一和/或第二抗原结合结构域识别的抗原，并且其中所述免疫细胞与所述靶细胞特异性结合，以及(b)在诱导所述免疫细胞针对所述靶细胞的免疫细胞活性的条件下，通过所述第一和/或第二抗原结合结构域使所述靶细胞与所述抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导所述癌症的所述靶细胞的死亡。
在另一方面中，提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，其中所述抗原特异性免疫细胞是表达本公开的系统的经遗传修饰的免疫细胞；以及(b)在诱导所述免疫细胞针对所述受试者的癌症的靶细胞的免疫细胞活性的条件下使所述靶细胞与所述抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导所述癌症的所述靶细胞的死亡。
在一些实施方案中，所述方法还包括对免疫细胞进行遗传修饰以产生所述抗原特异性免疫细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
在一些实施方案中，所述免疫细胞活性是所述免疫细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，所述免疫细胞针对所述靶细胞的所述细胞毒性导致所述受试者的所述癌症的至少10％减少。在一些实施方案中，所述免疫细胞活性是由所述免疫细胞的细胞因子释放。在一些实施方案中，当所述第一和第二抗原结合结构域均与它们相应的表位结合时，所述免疫细胞活性的持久性与仅单独的所述第一抗原结合结构域的结合或仅所述第二抗原结合结构域的结合相比得以增加。
在一些实施方案中，所述癌症选自：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头颈癌、肾癌、白血病、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、睾丸癌、气管癌和外阴癌。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在另一个方面中，提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，其中A包含与选自由SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:56组成的组的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；B包含与选自由SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:66组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；C包含与选自由SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:76组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；D包含与选自由SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:86组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；X包含与选自由SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:96组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；Y包含与选自由SEQ ID NO:97至SEQID NO:106组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；并且Z包含与选自由SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:116组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子表现出如在37℃下通过表面等离振子共振测定的为100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm或1nm或更小的对人BCMA的结合亲和力(KD)。
在一些实施方案中，抗原结合分子包含与选自由SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:23组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。在一些实施方案中，抗原结合分子包含选自由SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:23组成的组的序列。
在另一方面中，提供了一种经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含一个或多个抗原结合结构域，其中所述一个或多个抗原结合结构域连接至：(iv)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(v)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(vi)CD3ζ链；并且其中所述一个或多个抗原结合结构域中的至少一个包含本公开的抗原结合分子。
在一些实施方案中，所述一个或多个抗原结合结构域中的至少一个或两个包含与选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:46组成的组的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的分开的链。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的一条链。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域串联连接至所述TCR复合物的一条链。在一些实施方案中，所述经修饰的TCR复合物还包含一个或多个连接至所述TCR复合物的另一条链的抗原结合结构域。
在另一个方面中，提供了一种经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个表现出与两个或更多个表位的特异性结合的抗原结合结构域，其中所述两个或更多个抗原结合结构域连接至：(i)至少一条TCR链，该至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的分开的链。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的一条链。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域串联连接至所述TCR复合物的一条链。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR复合物还包含一个或多个连接至所述TCR复合物的另一条链的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域与BCMA结合。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结构域与BCMA的相同表位结合。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域是抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域选自与SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23中的任一者具有至少80％的序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域串联连接在分化簇3(CD3)的所述ε链、所述δ链和/或所述γ链上。
在另一方面中，提供了一种包含本公开的经修饰的TCR复合物的抗原特异性免疫细胞。
在一些实施方案中，所述抗原特异性免疫细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR还包含一个或多个表现出与它们的相应表位的特异性结合的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR的所述一个或多个抗原结合结构域串联排列。
在一些实施方案中，所述抗原特异性免疫细胞还包含两个或更多个嵌合抗原受体(CAR)，每个CAR包含一个或多个表现出与它们的相应表位的特异性结合的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
本文所公开的方法可用于治疗多种癌症，所述多种癌症包括但不限于：选自以下的癌症：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头颈癌、肾癌、白血病、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、睾丸癌、气管癌和外阴癌。
引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文中，并入程度如同明确且单独地指示每个单独出版物、专利或专利申请通过引用并入一般。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考下面的详细说明，可以更好地理解本发明的特征和优点，以下详细说明阐述了说明性实施方案，在所述说明性实施方案中利用了本发明的原理，并且在附图中：
图1示出了CAR-TCR-T系统的示意图，该CAR-TCR-T系统包含如黑白条纹椭圆和黑色椭圆所示的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够结合抗原，例如肿瘤相关抗原。
图2A示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与ε链融合的抗原结合结构域。图2B示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与δ链融合的抗原结合结构域。图2C示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与γ链融合的抗原结合结构域。图2D示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与α链融合的抗原结合结构域。图2E示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与β链融合的抗原结合结构域。图2F示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与第一ε链融合，并且第二抗原结合结构域与第二ε链融合。图2G示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与ε链融合，并且第二抗原结合结构域与γ链融合。图2H示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与ε链融合。图2I示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与α链融合，并且第二抗原结合结构域与β链融合。图2J示出了包含两个相同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与α链融合，并且第二抗原结合结构域与β链融合。图2K示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与δ链融合。图2L示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与γ链融合。图2M示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与α链融合。图2N示出了包含TCR的经修饰的TCR复合物，所述TCR包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与β链融合。图2O示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与ε链融合，并且第二抗原结合结构域与δ链融合。图2P示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与δ链融合，并且第二抗原结合结构域与γ链融合。图2Q示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与α链融合，并且第二抗原结合结构域与ε链融合。图2R示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与β链融合，并且第二抗原结合结构域与ε链融合。图2S示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与α链融合，并且第二抗原结合结构域与γ链融合。图2T示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与β链融合，并且第二抗原结合结构域与γ链融合。图2U示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与α链融合，并且第二抗原结合结构域与δ链融合。图2V示出了包含两个不同抗原结合结构域的经修饰的TCR复合物。第一抗原结合结构域与β链融合，并且第二抗原结合结构域与δ链融合。
图3示出了CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的抗原结合结构域。
图4A示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与ε链融合。图4B示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与δ链融合。图4C示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与γ链融合。图4D示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域与第三抗原结合结构域融合，所述第三抗原结合结构域继而与ε链融合。图4E示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域与第三抗原结合结构域融合，所述第三抗原结合结构域继而与δ链融合。图4F示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域与第三抗原结合结构域融合，所述第三抗原结合结构域继而与γ链融合。图4G示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域继而与ε链融合，并且所述经修饰的TCR复合物还包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域，所述第四抗原结合结构域继而与δ链融合。图4H示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域继而与ε链融合，并且所述经修饰的TCR复合物还包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域，所述第四抗原结合结构域继而与γ链融合。图4I示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与δ链融合，并且所述经修饰的TCR复合物还包含与第四抗原结合结构域融合的第三抗原结合结构域，所述第四抗原结合结构域继而与γ链融合。图4J示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与ε链融合，并且所述经修饰的TCR复合物还包括与γ链融合的第三抗原结合结构域。图4K示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域与第三抗原结合结构域融合，所述第三抗原结合结构域继而与ε链融合，并且所述经修饰的TCR复合物还包含与第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域，所述第五抗原结合结构域与第六抗原结合结构域融合，所述第六抗原结合结构域继而与δ链融合。图4L示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域与第三抗原结合结构域融合，所述第三抗原结合结构域继而与ε链融合，并且所述经修饰的TCR复合物还包含与第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域，所述第五抗原结合结构域与第六抗原结合结构域融合，所述第六抗原结合结构域继而与γ链融合。图4M示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域与第三抗原结合结构域融合，所述第三抗原结合结构域继而与δ链融合，并且所述经修饰的TCR复合物还包含与第五抗原结合结构域融合的第四抗原结合结构域，所述第五抗原结合结构域与第六抗原结合结构域融合，所述第六抗原结合结构域继而与γ链融合。
图5A示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与ε链融合的第一抗原结合结构域和CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的第二抗原结合结构域。图5B示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与δ链融合的第一抗原结合结构域和CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的第二抗原结合结构域。图5C示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与γ链融合的第一抗原结合结构域和CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的第二抗原结合结构域。图5D示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与ε链融合的第一抗原结合结构域、与δ链融合的第二抗原结合结构域，以及CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的第三抗原结合结构域。图5E示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与ε链融合的第一抗原结合结构域、与γ链融合的第二抗原结合结构域，以及CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的第三抗原结合结构域。图5F示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与δ链融合的第一抗原结合结构域、与γ链融合的第二抗原结合结构域，以及CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的第三抗原结合结构域。图5G示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与ε链融合；以及CAR，所述CAR包含与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合的第三抗原结合结构域。图5H示出了经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含与ε链融合的第一抗原结合结构域，以及CAR，所述CAR包含与第三抗原结合结构域的第二抗原结合结构域，所述第三抗原结合结构域与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导链)融合。
图6A示出了抗BCMAεTCR的载体构建体。图6B示出了抗BCMA-4-1BB-CD3ζCAR的载体构建体。图6C示出了抗BCMA或CD19-εTCR和抗CD19或BCMA-4-1BB-CD3ζCAR的载体构建体。图6D示出了抗BCMA或CD19γ或δTCR和抗CD19或BCMA-4-1BB-CD3ζCAR的载体构建体。图6E示出了串联的抗BCMAεTCR的载体构建体。图6F示出了串联的抗BCMAεTCR和串联的抗CD19或BCMA-4-1BB-CD3ζCAR的载体构建体。
图7示出了不同肿瘤细胞和经工程化的细胞系上的CD19和BCMA表达水平。
图8A、图8B和图8C示出了转导后第3天或第6天的细胞毒性测定结果，其中抗BCMA抗体(BCMA1-12)以为0.5:1、1.5:1和3:1的效应子与靶细胞比率(E:T)融合至ε-TCR。图8D、图8E和8F示出了通过使用HTRF从图8A、图8B和图8C的细胞毒性测定中收集的上清液中的IFNγ的量。
图9示出了转染后第6天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA系统:抗BCMA3-ε-TCR(BCMA3 eTCR)、抗BCMA2-ε-TCR(BCMA2 eTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3-εTCR(串联BCMA2&3eTCR)和抗BCMA1-抗BCMA2-抗BCMA3-γTCR(串联BCMA1&2&3gTCR)，以及对照未转导的细胞与RPMI-8226细胞(BCMA+)以0.33:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。
图10示出了转染后第6天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA系统、抗BCMA2-抗BCMA3ε-TCR(串联BCMA 2-3eTCR)、抗BCMA4-抗BCMA5ε-TCR(串联BCMA 4-5eTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3-抗BCMA4ε-TCR(串联BCMA 2-3-4eTCR)以及对照未转导的细胞与CHO/BCMA/CD19细胞(BCMA+CD19+)以1.5:1和0.5:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。
图11A示出了转染后第11天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA和/或抗CD19系统：抗BCMA1ε-TCR(BCMA1 eTCR)、抗BCMA1 4-1BB-CD3ζ-CAR(BCMA1 BBzCAR)、抗CD19ε-TCR(CD19 eTCR)和抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19 eTCR)以及对照未转导的细胞与NCI-H929细胞(BCMA+)以10:1和5:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。图11B示出了通过使用HTRF从图11A的细胞毒性测定中收集的上清液中的IFNγ的量。
图12A示出了转染后第6天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA和/或抗CD19系统：抗BCMA1-ε-TCR(BCMA eTCR)、抗BCMA1-4-1BB-CD3ζ-CAR(BCMA BBzCAR)、抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 BBzCAR)、抗CD19-εTCR(CD19 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA BBzCAR)和抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA eTCR/CD19BBzCAR)以及对照未转导的细胞与CHO/BCMA/CD19细胞(BCMA+和CD19+)以20:1、10:1和5:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。图12B示出了通过使用HTRF从图12A的细胞毒性测定中收集的上清液中IFNγ的量。
图13A示出了转染后第5天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA和/或抗CD19系统：抗CD19ε-TCR(CD19 eTCR)、抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19eTCR/BCMA1 dTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19eTCR/BCMA1 BBzCAR)和抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)以及对照未转导的细胞与CHO-BCMA-CD19细胞(BCMA+和CD19+)以10:1和5:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。图13B示出了转染后第5天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA和/或抗CD19系统：抗BCMA1-εTCR(BCMA1 eTCR)、抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 BBzCAR)、抗BCMA1/抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19eTCR/BCMA1 BBzCAR)和抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)以及对照未转导的细胞与NCI-H929细胞(BCMA+)以2.5:1和5:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。
图14A示出了转染后第6天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA和/或抗CD19系统：抗BCMA1ε-TCR(BCMA1 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-γTCR(CD19 eTCR/BCMA1 gTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1 dTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)以及对照未转导的细胞与CHO-BCMA1-CD19细胞(BCMA+和CD19+)以1.3:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。图14B和图14C示出了通过使用HTRF从图14A的细胞毒性测定收集的上清液中的IFNγ和TNFα的量。
图15A示出了转染后第6天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA和/或抗CD19系统：抗BCMAε-TCR(BCMA eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMABBzCAR)、抗BCMA和抗CD19-ε-TCR(串联BCMA/CD19 dTCR)以及对照未转导的细胞与CHO-BCMA-CD19细胞(BCMA+和CD19+)以1.3:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。图15B和图15C示出了通过使用HTRF从图15A的细胞毒性测定收集的上清液中的IFNγ和TNFα的量。
图16A示出了转染后第4天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA系统:抗BCMA2ε-TCR(BCMA2 eTCR)、抗BCMA2-εTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 eTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-γTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 gTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-δTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 dTCR/BCMA3BBzCAR)以及对照未转导的细胞与RPMI-8226细胞(BCMA+)以0.5:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。图16B示出了通过使用HTRF从图16A的细胞毒性测定收集的上清液中的IFNγ的量。
图17A示出了转染后第6天的细胞毒性测定结果，其中将抗BCMA系统:抗BCMA2-抗BCMA3ε-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR(串联BCMA2&3eTCR/gTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3 4-1BB-CD3ζCAR(串联BCMA2&3gTCR/BBzCAR)以及对照未转导的细胞与RPMI-8226细胞(BCMA+)以0.33:1的效应子比靶细胞比率(E:T)共培养。图17B示出了通过使用HTRF从图17A的细胞毒性测定收集的上清液中的IFNγ的量。
图18示出了在具有多发性骨髓瘤肿瘤异种移植物的NCG小鼠模型(NOD_Prkdcem26Cd52/NjuCrl)中评估的三重特异性BCMA CAR-T细胞、三重特异性BCMA TCR-T细胞和三重特异性BCMA CAR-TCR-T细胞的体内抗肿瘤功效。
图19示出了在OVCAR-8异种移植模型中评定的抗MSLN/FSHR双重CAR-T(MSLN CAR+FSHR CAR)、抗MSLN/FSHR双重eTCR-T(MSLN eTCR+FSHR eTCR)和抗MSLN CAR/FSHR eTCR-T(MSLN CAR+FSHR eTCR)的体内抗肿瘤功效。在第0天将10×106个OVCAR-8细胞皮下植入NODscidγ(NSG)小鼠中。一旦肿瘤为150-200mm3，就将小鼠随机分入治疗组。静脉内施用200μl剂量的0.33×106个CAR阳性T细胞。在肿瘤细胞植入后监测小鼠和小鼠肿瘤约60天。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文公开的一些方法的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些常规技术在本领域技术范围内。参见例如Sambrook和Green，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版(2012)；the series Current Protocols in Molecular Biology(FM Ausubel等人编辑)；the series Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.),PCR 2:A PracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))，Harlow和Lane编辑，(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique and Specialized Applications，第6版(R.I.Freshney编辑(2010))。
如说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。例如，术语“抗原结合结构域”包括多个抗原结合结构域。
术语“约”或“大致”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于该值是如何测量或测定的，即测量系统的极限值。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准偏差之内。替代地，“约”可以表示给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在值的一个数量级内，优选地在5倍以内，并且更优选地在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假设术语“约”表示在该特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，“细胞”通常可以指生物细胞。细胞可以是活生物体的基本结构、功能和/或生物学单位。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如来自植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麦、种子、西红柿、稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、土豆、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松类、角苔类、苔类、藓类的细胞)、藻类细胞(例如，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、迦得拟微球藻(Nannochloropsisgaditana)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻裂叶变种(Sargassumpatens C.Agardh)等)、海藻(例如巨藻(kelp))、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如，果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫类等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人等)的细胞等。有时，细胞不是源自天然生物体(例如，细胞可以是合成制备的，有时也称为人造细胞)。
如本文所用，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是指在细胞介导的免疫中起关键作用的一种类型的淋巴细胞。通过在细胞表面存在T细胞受体，可以将T细胞与其他淋巴细胞(诸如B细胞和自然杀伤细胞)区分开。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指T细胞或T淋巴细胞表面上负责识别抗原的分子。TCR是由两个不同的蛋白质链构成的异源二聚体。在一些实施方案中，本公开的TCR由阿尔法(α)链和贝塔(β)链组成，并且被称为αβTCR。αβTCR识别从与细胞表面处的主要组织相容性复合物分子(MHC)结合的蛋白质降解的抗原肽。在一些实施方案中，本公开的TCR由伽马(γ)链和德尔塔(δ)链组成，并且被称为γδTCR。γδTCR以非MHC依赖性方式识别肽和非肽抗原。γδT细胞已显示出在识别脂质抗原中的重要作用。具体地，TCR的γ链包括但不限于Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ10、它们的功能变体以及它们的组合；并且TCR的δ链包括但不限于δ1、δ2、δ3、它们的功能变体以及它们的组合。在一些实施例中，γδTCR可以是Vγ2/Vδ1TCR、Vγ2/Vδ2TCR、Vγ2/Vδ3TCR、Vγ3/Vδ1TCR、Vγ3/Vδ2TCR、Vγ3/Vδ3TCR、Vγ4/Vδ1TCR、Vγ4/Vδ2TCR、Vγ4/Vδ3TCR、Vγ5/Vδ1TCR、Vγ5/Vδ2TCR、Vγ5/Vδ3TCR、Vγ8/Vδ1TCR、Vγ8/Vδ2TCR、Vγ8/Vδ3TCR、Vγ9/Vδ1TCR、Vγ9/Vδ2TCR、Vγ9/Vδ3TCR、Vγ10/Vδ1TCR、Vγ10/Vδ2TCR，和/或Vγ10/Vδ3TCR。在一些实例中，γδTCR可以是Vγ9/Vδ2TCR、Vγ10/Vδ2TCR，和/或Vγ2/Vδ2TCR。
如本文所用，术语“阿尔法贝塔T细胞”、“αβT细胞”和“AB T细胞”可以互换使用，并且是指包含αβTCR或其变体或片段的T细胞(T淋巴细胞)，而术语“伽马德尔塔T细胞”、“γδT细胞”和“GD T细胞”可以互换使用，并且是指包含γδTCR或其变体或片段的T细胞(T淋巴细胞)，例如，Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞或Vδ5T细胞。在一些实施方案中，γδT细胞可以是Vγ2/Vδ1T细胞、Vγ2/Vδ2T细胞、Vγ2/Vδ3T细胞、Vγ3/Vδ1T细胞、Vγ3/Vδ2T细胞、Vγ3/Vδ3T细胞、Vγ4/Vδ1T细胞、Vγ4/Vδ2T细胞、Vγ4/Vδ3T细胞、Vγ5/Vδ1T细胞、Vγ5/Vδ2T细胞、Vγ5/Vδ3T细胞、Vγ8/Vδ1T细胞、Vγ8/Vδ2T细胞、Vγ8/Vδ3T细胞、Vγ9/Vδ1T细胞、Vγ9/Vδ2T细胞、Vγ9/Vδ3T细胞、Vγ10/Vδ1T细胞、Vγ10/Vδ2T细胞和/或Vγ10/Vδ3T细胞。在一些实例中，γδT细胞可以是Vγ9/Vδ2T细胞、Vγ10/Vδ2T细胞，和/或Vγ2/Vδ2T细胞。
如本文中所用，术语“激活”及其语法等同物可以指细胞从静止状态转变为活动状态的过程。该过程可包括对抗原的反应、迁移，和/或表型或遗传改变为功能活性状态。例如，术语“激活”可以指T细胞激活的逐步过程。在一些情况中，T细胞可能需要至少两个信号才能变得被完全激活。第一信号可以在抗原-MHC复合物与TCR结合后发生，并且第二信号可以通过共刺激分子的结合发生。在一些情况中，抗CD3可以模拟所述第一信号并且抗CD28可以体外模拟第二信号。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。例如，抗原可以是可以被选择性结合剂(诸如受体)结合的配体。在一些情况中，受体可以充当抗原，并且配体可以充当选择性结合剂。作为另一个实例，抗原可以是可以被选择性结合剂(诸如免疫蛋白(例如，抗体))结合的抗原分子。在一些情况中，免疫蛋白可以充当抗原，并且抗原分子可以充当选择性结合剂。抗原也可以指能够在动物中用于产生能够与该抗原结合的抗体的分子或其片段。
如本文所用，术语“表位”及其语法等同物可以指可被抗原结合结构域识别的抗原的一部分。抗原结合结构域可包含例如存在于表面，例如细胞(例如，B细胞、T细胞、CAR-T细胞或经工程化的细胞)的表面上的蛋白质(例如，抗体、抗体片段)。例如，表位可以是通过TCR识别的癌症表位。也可以识别抗原内的多个表位。表位也可以是突变的。
如本文所用，术语“抗原结合分子”是指与抗原或表位特异性结合的分子。抗原结合分子的实例包括但不限于抗体及其衍生物，例如其片段。“特异性结合”是指结合对抗原或表位具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。
如本文所用的术语“结合亲和力”是指结合对的成员(例如，抗原结合分子及其抗原、或受体及其配体)之间的结合相互作用的强度。
主题抗体对其配偶体的结合亲和力可以通过kon、koff或KD来表征。如本文所用，术语“kon”是指抗体与抗原缔合的速率常数。如本文所用，术语“koff”是指抗体从抗体/抗原复合物中解离的速率常数。如本文所用，术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。为了本公开的目的，将KD定义为两个动力学速率常数kon/koff的比率。平衡解离常数越小，则主题抗体及其配偶体彼此结合得越紧密。
如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆抗体和多克隆抗体)，以及其衍生物、变体和片段。抗体包括但不限于不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(诸如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。其衍生物、变体或片段可以指保留对应抗体的结合特异性(例如，完全和/或部分)的功能性衍生物或片段。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、微型抗体、双抗体和单结构域抗体(“sdAb”或“纳米体”或“骆驼科动物抗体(camelids)”或VHH)。术语抗体包括抗体和已经优化、工程化或化学缀合的抗体的抗原结合片段。已优化的抗体的实例包括亲和力成熟的抗体。已经工程化的抗体的实例包括Fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区域中优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指能够结合抗原或表位的蛋白质或其片段。作为一个实例，抗原结合结构域可以是细胞受体。作为一个实例，抗原结合结构域可以是经工程化的细胞受体。作为一个实例，抗原结合结构域可以是可溶性受体。在一些情况中，抗原结合结构域可以是与细胞受体、经工程化的细胞受体和/或可溶性受体结合的配体。
如本文中所用，术语“自体”及其语法等同物可以指源自相同来源。例如，自体样品(例如，细胞)可以指在稍后时间被取出、处理、然后再给予回同一受试者(例如，患者)的样品。就过程而言，自体可以与同种异体过程区分开，在同种异体过程中，样品的供体(例如，细胞)与样品的接受者不是同一受试者。
如本文所用，术语“癌症新抗原”、“新抗原”和“新表位”及其语法等同物可以指在正常的、未突变的宿主基因组中未编码的抗原。在一些情况中，“新抗原”可以代表致癌病毒蛋白或由于体细胞突变而产生的异常蛋白。例如，新抗原可以通过病毒蛋白的活性破坏细胞机制而产生。作为另一个实例，新抗原可由于暴露于致癌化合物而产生，暴露于致癌化合物在一些情况中可导致体细胞突变。这种体细胞突变可导致肿瘤/癌症的形成。
如本文所用，术语“细胞毒性”是指细胞的正常状态的意外或不期望的改变。细胞的正常状态可以指在细胞暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件之前显现或存在的状态。处于正常状态的细胞可以处于稳态。细胞的正常状态的意外或不期望的改变可以表现为例如以下形式：细胞死亡(例如，程序性细胞死亡)、复制潜能降低、细胞完整性(诸如膜完整性)降低、代谢活性降低、发育能力降低，或本文所公开的细胞毒性效应中的任何细胞毒性效应。
如本文所用，短语“减少细胞毒性”和“降低细胞毒性”是指在暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件时细胞的正常状态的意外或不期望改变的程度或频率降低。该短语可以指降低暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件的单个细胞的细胞毒性程度，或减少当细胞群体暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件时群体中表现出细胞毒性的细胞数量。
术语“表达”是指一个或多个从DNA模板转录多核苷酸的过程(诸如转录成mRNA或其他RNA转录物)和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和编码多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中剪接mRNA。
当在本文中针对多肽使用时，术语“衍生物”、“变体”和“片段”是指与野生型多肽相关的多肽，例如通过氨基酸序列、结构(例如，二级和/或或三级)、活性(例如，酶促活性)和/或功能与野生型多肽相关的多肽。与野生型多肽相比，多肽的衍生物、变体和片段可包含一种或多种氨基酸变体(例如，突变、插入和缺失)、截短、修饰或它们的组合。
如本文所用，术语“同一性百分比(％)”是指在比对序列并在必要时引入空位以实现最大同一性百分比(即，为了最佳比对，可以在候选序列和参考序列中的一者或两者中引入空位，并且为了比较目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核酸)残基与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。为了确定同一性百分比，可以以本领域技术范围内的各种方式来实现比对，例如，使用诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件之类的公开可得的计算机软件。可以通过以下方法来计算两个序列的同一性百分比：使用BLAST将测试序列与比较序列进行比对；确定比对的测试序列中与比较序列相同位置的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数量；以及将相同氨基酸或核苷酸的数量除以比较序列中的氨基酸或核苷酸的数量。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选地哺乳动物，诸如人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿猴、人、农场动物、竞赛动物和宠物。还包括在体内获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，术语“治疗”和“进行治疗”是指用于获得有益或期望的结果的方法，所述有益或期望的结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。例如，治疗可以包括施用本文公开的系统或细胞群体。治疗益处可以指对一种或多种处于治疗中的疾病、病症或症状的任何治疗上相关的改善或效应。为了预防有益，可以将组合物施用于有发展为特定疾病、病症或症状的风险的受试者，或施用于报告有疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使该疾病、病症或症状可能尚未显现也是如此。
如果所治疗的病症发生变化，可能会发生“治疗效应”。所述变化可以是正面的或负面的。例如，“正效应”可以对应于受试者中激活的T细胞的数目增加。在另一个实例中，“负效应”可以对应于受试者中肿瘤的数量或大小减少。所治疗病症的“变化”可指所述病症的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、25％、50％、75％或100％的变化。该变化可以基于所治疗的个体病症的严重程度的改善，或者有和没有施用疗法的个体群体中改善病症的频率的差异。类似地，本公开的方法可包括向受试者施用“治疗有效”量的细胞。术语“治疗有效”应被理解为具有对应于“具有疗效”的定义。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指在施用于有需要的受试者时足以产生所需活性的组合物的量，例如包含免疫细胞诸如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物的量。术语“治疗有效的”可以指足以延迟通过本公开的方法治疗的疾患的表现、阻止其进展、缓解或减轻其至少一种症状的组合物的量。
如本文所用，术语“TIL”或肿瘤浸润淋巴细胞及其语法等同物可以指从肿瘤分离的细胞。TIL可以是肿瘤内发现的任何细胞。例如，TIL可以是已经迁移到肿瘤的细胞。TIL可以是已经浸润肿瘤的细胞。TIL可以是T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞，或它们的任何组合。TIL可以是细胞的混合群体。TIL群体可以包含不同表型的细胞、不同分化程度的细胞、不同谱系的细胞，或它们的任何组合。
术语“B细胞成熟抗原(BCMA或BCM)”，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)，是指由人中的TNFRSF17基因编码的蛋白质。BCMA优先在成熟的B淋巴细胞中表达，并已被证明对B细胞发育和自体免疫应答具有重要作用。BCMA也被认为是肿瘤相关抗原，并且BCMA的异常表达也与许多癌症，以及自身免疫性疾患和传染性疾病有关。
在一个方面中，本文提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子。在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，并且所述A包含与选自由SEQID NO:47至SEQ ID NO:56组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，并且所述B包含与选自由SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:66组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，并且所述C包含与选自由SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:76组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，并且所述D包含与选自由SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:86组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，并且所述X包含与选自由SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:96组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，并且所述Y包含与选自由SEQ ID NO:97至SEQ ID NO:106组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，并且所述Z包含与选自由SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:116组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
表1抗原结合分子的A的序列
Figure BDA0002836582790000311
Figure BDA0002836582790000321
表2抗原结合分子的B的序列
SEQ ID NO B
57 WFRQTPGKEREGVA
58 WFREAPGKARTSVA
59 WYRQAPGNECELV
60 WFRQAPGKEREGVA
61 WFRQAPGKEREDVA
62 WFRQTPGKGREGVA
63 WVRQAPGKGLERVS
64 WGRQAPGQRLEWVS
65 WFRQTPGKEREGVA
66 WFRQTPGKEREGVA
表3抗原结合分子的C的序列
SEQ ID NO C
67 RFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAMYYCAA
68 RFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAA
69 RFTISQDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYSCAA
70 RFTISQDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCGA
71 RFTISQDTAQNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAA
72 RFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAMYYCAA
73 RFTASRDKAKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAA
74 RFTISRDNAKNTLYLQLNNLKSEDTAVYYCSE
75 RFTISRDNAKNTMYLQMSGLRPEDTALYYCAA
76 RFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAMYYCAA
表4抗原结合分子的D的序列
Figure BDA0002836582790000322
Figure BDA0002836582790000331
表5抗原结合分子的X的序列
SEQ ID NO X
87 GAIYDTNCMA
88 YSTYSNYYMG
89 GYTFDDSAMG
90 GYTYSSYCMA
91 GGTRSWNYMA
92 GAPYSSNCMA
93 GFTFSSYDMN
94 GFAFSNYAMT
95 GATYSSNCMA
96 GAIYDTNCMA
表6抗原结合分子的Y的序列
SEQ ID NO Y
97 TIDLGNPITYYADSVKG
98 IISSDTTITYKDAVKG
99 SISSDGSTYYSDSVKG
100 AIASDGSTYYTDSVKG
101 IIDNVGSTRYADSVKG
102 TIDLASHDTYYADSVKG
103 TTFNGDDGTNYADSVLG
104 TIDSGGGSTTYSDSVKG
105 TIDLASHGTYYADSVKG
106 TIDLGNPITYYADSVKG
表7抗原结合分子的Z的序列
Figure BDA0002836582790000332
Figure BDA0002836582790000341
在一些实施方案中，本公开提供了具有式A-X-B-Y-C-Z-D的抗原结合分子，其中A包含与选自由SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:56组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列，B包含与选自由SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:66组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列，C包含与选自由SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:76组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列，D包含与选自由SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:86组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列，X包含与选自由SEQ ID NO:87至SEQID NO:96组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列，Y包含与选自由SEQ IDNO:97至SEQ ID NO:106组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列，并且Z包含与选自由SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:116组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。
在一些实施方案中，抗原结合分子表现出对人BCMA的结合亲和力(KD)。在一些实施方案中，如在37℃下通过表面等离振子共振测定的，KD小于100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、或1nm或更小。
在一些实施方案中，抗原结合分子包含与选自由SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:23组成的组的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，抗原结合分子包含选自由SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:23组成的组的序列。
在一个方面中，本公开提供了一种经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，该经修饰的TCR复合物包含表现出与表位的特异性结合的抗原结合结构域，其中该抗原结合结构域连接至：(i)至少一条TCR链，该至少一条TCR链选自TCR的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。
在一些实施方案中，抗原结合结构域可包含相互作用对的一个成员。例如，抗原结合结构域可以是包含受体和配体的相互作用对的一个成员或其片段。受体或配体或其片段可以称为抗原结合结构域。未被称为抗原结合结构域的另一成员可包含抗原结合结构域特异性结合的表位。
TCR复合物的抗原结合结构域的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体或其功能性衍生物、变体或片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体和单结构域抗体(诸如骆驼科动物来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))。在一些实施方案中，TCR复合物的抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv中的至少一者。在一些实施方案中，TCR复合物的抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指可以以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子，并且包括单链结合分子、基于细胞色素b562的结合分子、纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架(例如，adnectin)、脂质运载蛋白(lipocalin)支架、杯芳烃骨架、A结构域和其他支架。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物、变体或片段。例如，抗原结合结构域可至少包含跨膜受体的配体结合结构域。
在一些实施方案中，本文提供了一种经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含一个或多个抗原结合结构域，其中所述一个或多个抗原结合结构域连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链；并且其中所述一个或多个抗原结合结构域中的至少一个或两个包含本文所述的抗原结合分子。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的至少一个抗原结合结构域包含与选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:46组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，TCR复合物的抗原结合结构域包含单结构域抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是本文所公开的抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，所述抗BCMAsdAb包含与选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗BCMAsdAb包含选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者的序列。
经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域可以连接至TCR复合物的任何成员。在一些实施方案中，抗原结合结构域可连接至TCR链、CD3链或CD3ζ链中的至少一者。在一些实施方案中，抗原结合结构域可连接至TCR的跨膜受体，例如TCR-ε、TCR-δ、TCR-γ、TCR-α或TCR-β。在一些实施方案中，抗原结合结构域可连接至CD3链，例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ。在一些实施方案中，抗原结合结构域可连接至CD3ζ链。
本公开的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物可包含表现出与第二表位的结合的第二抗原结合结构域。第二抗原结合结构域可包含能够结合表位的任何蛋白质或分子。TCR复合物的第二抗原结合结构域的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体或其功能性衍生物、变体或片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体和单结构域抗体(诸如骆驼科动物来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))。在一些实施方案中，TCR复合物的第二抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv中的至少一者。在一些实施方案中，TCR复合物的第二抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指可以以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子，并且包括单链结合分子、基于细胞色素b562的结合分子、纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架(例如，adnectin)、脂质运载蛋白支架、杯芳烃骨架、A结构域和其他支架。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物、变体或片段。例如，抗原结合结构域可至少包含跨膜受体的配体结合结构域。
在一些实施方案中，TCR复合物的第二抗原结合结构域包含本文公开的抗原结合分子。在一些实施方案中，TCR复合物的第二抗原结合结构域包含单结构域抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，所述抗BCMA sdAb包含与选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗BCMA sdAb包含选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者的序列。在一些实施方案中，TCR复合物的第二抗原结合结构域包含与选自由SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:46组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。
第二抗原结合结构域可以连接至TCR复合物的任何成员。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域可以连接至TCR链、分化3(CD3)链或CD3ζ链中的至少一者。第二抗原结合结构域可连接至TCR的跨膜受体，例如TCR-ε、TCR-δ、TCR-γ、TCR-α或TCR-β。第二抗原结合结构域可连接至CD3链，例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ。第二抗原结合结构域可连接至CD3ζ链。
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的分开的链。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的一条链。可以在本公开的经修饰的TCR复合物中使用任何数量的抗原结合结构域，并且抗原结合结构域的数量不限于一个、两个或三个。
在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域。例如，两个或更多个抗原结合结构域可以是能够结合相同配体的相同分子。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域。例如，两个或更多个抗原结合结构域可以是能够结合相同配体或不同配体的不同分子。
在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域串联连接至分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链中的至少一者。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域串联连接至TCR复合物的分开的链。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域串联连接至经修饰的TCR复合物的一条链。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域串联连接至经修饰的TCR复合物的两条或更多条链。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含两个或更多个sdAb，该两个或更多个sdAb连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含两个或更多个sdAb，该两个或更多个sdAb串联连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含串联连接至经修饰的TCR复合物的一条链的两个或更多个sdAb。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含串联连接至经修饰的TCR复合物的两条或更多条链的两个或更多个sdAb。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗BCMAsdAb，该两个或更多个抗BCMA sdAb串联连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗BCMA sdAb具有相同的序列。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗BCMA sdAb具有不同的序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含串联连接至经修饰的TCR复合物的一条链的两个或更多个抗BCMAsdAb。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含串联连接至该TCR复合物的两条或更多条链的两个或更多个抗BCMA sdAb。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含两个或更多个本文所公开的抗-BCMA抗原结合分子，该两个或更多个本文所公开的抗-BCMA抗原结合分子串联连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗BCMA sdAb，该两个或更多个抗BCMA sdAb串联连接至：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链，并且抗BCMA sdAb包含与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，该两个或更多个抗BCMA sdAb具有相同的序列，并且该序列与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，该两个或更多个抗BCMA sdAb具有不同的序列，并且该序列与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗BCMA sdAb，该两个或更多个抗BCMA sdAb串联连接至所述TCR复合物的一条链，并且该抗BCMA sdAb包含与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗BCMA sdAb，该两个或更多个抗BCMA sdAb串联连接至所述TCR复合物的两条或更多条链，并且该抗BCMA sdAb包含与选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域可以结合存在于不同抗原上的表位。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域可以结合存在于共同抗原上的表位。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域表现出对两个或更多个表位的特异性结合。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域表现出对相同表位的特异性结合。
因此，本文还提供了一种经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个表现出与两个或更多个表位的特异性结合的抗原结合结构域，其中所述两个或更多个抗原结合结构域连接至：(i)至少一条TCR链，该至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域中的至少一个或两个选自本文公开的抗原结合结构域或抗原结合分子。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的表位可以存在于一种或多种细胞表面抗原上。一种或多种细胞表面抗原可以是酪氨酸激酶受体、丝氨酸激酶受体、组氨酸激酶受体、G蛋白偶联受体(GPCR)等。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的表位可以存在于免疫检查点受体或免疫检查点受体配体上。在一些实施方案中，免疫检查点受体或免疫检查点受体配体可以是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、BLTA、CD47或CD40。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的表位可以存在于细胞因子或细胞因子受体上。细胞因子受体可以是例如CCR2b、CXCR2(CXCL1受体)、CCR4(CCL17受体)、Gro-a、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、乙酰肝素酶、CD137L、LEM、Bcl-2、CCL17、CCL19或CCL2。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的表位可以存在于肿瘤相关抗原上。该表位可以是例如肿瘤表位。肿瘤相关抗原可以选自由以下组成的组：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、BCMA、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CA-125、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、CLL-1、CTAG1B、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FAP、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、FR-α、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、GPC3、GPC-2、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、L1-CAM、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、生存素、生存素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFαRII、TGFβRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ轻链。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域结合的表位可以是EGFR、EGFRvIII、GPC3、GPC-2、DLL3、CD19、CD20、CD22、CD123、CLL-1、CD30、CD33、HER2、MSLN、PSMA、CEA、GD2、IL13Rα2、CAIX、L1-CAM、CA125、CD133、FAP、CTAG1B、MUC1、FR-α、CD70、CD171、ROR1，以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的至少一个抗原结合结构域与存在于BCMA上的表位结合。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域与存在于BCMA上的表位结合。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域与BCMA的相同表位结合。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域与BCMA的不同表位结合。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链，并且结合结构域中的至少一个可与BCMA结合。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链，并且结合结构域中的两个或更多个可与BCMA结合。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链，并且两个或多个抗原结合结构域可以与BCMA的相同表位结合。在一些实施方案中，TCR复合物的两个或更多个抗原结合结构域串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链，并且两个或多个抗原结合结构域可以与BCMA的不同表位结合。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的表位可以存在于新抗原上。例如，表位可以是新表位。
新抗原和新表位通常是指在一些情况中触发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤特异性突变。例如，可以使用全基因组测序方法来鉴定这些内源性突变。Tran E等人，“Cancerimmunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient withepithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。抗原结合结构域，例如主题CAR或经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域，可以表现出与肿瘤特异性新抗原的特异性结合。经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域所结合的新抗原可以在靶细胞上表达，并且例如，是由任何内源基因中的突变编码的新抗原和新表位。在一些情况下，两个或更多个抗原结合结构域结合由突变基因编码的新抗原或新表位。该基因可以选自由以下组成的组：ABL1、ACOl1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、NY-ESO、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白质、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL，以及XPOT。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域结合的表位可存在于基质上。基质通常是指尤其为生物细胞、组织或器官提供连接和功能支持的组织。基质可以是肿瘤微环境的基质。该表位可以存在于基质抗原上。此类抗原可以在肿瘤微环境的基质上。例如，新抗原和新表位可以存在于肿瘤内皮细胞、肿瘤脉管系统、肿瘤纤维母细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤间充质细胞上。示例性抗原包括但不限于CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4和腱生蛋白。
在一些实施方案中，表位可以存在于由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原上。MHC可以是I类或II类人白细胞抗原(HLA)。HLA可以是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DM或HLA-DO。在一些实施方案中，表位可以存在于HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*25、HLA-A*26、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、或HLA-A*24、HLA-B*27、HLA-B*35、HLA-B*48、HLA-B*55等上。
在一些实施方案中，表位可以是可溶的(例如，不与细胞结合)。在一些情况中，抗原可以是可溶的，例如可溶抗原。该表位可以存在于通用抗原上。在一些情况中，经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域可以结合多个表位，例如多重特异性。
在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物包含与CD3-ε链融合的抗原结合结构域，图2A。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物包含与CD3-δ链融合的抗原结合结构域，图2B。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物包含与CD3-γ链融合的抗原结合结构域，图2C。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物包含与TCR-α链融合的抗原结合结构域，图2D。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物包含与TCR-β链融合的抗原结合结构域，图2E。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物包含与TCR-γ链融合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，经修饰的TCR复合物包含与TCR-δ链融合的抗原结合结构域。
本文公开的经修饰的TCR复合物可包含多于一个抗原结合结构域，例如至少2个抗原结合结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个抗原结合结构域)。在一些实施方案中，主题系统的经修饰的TCR复合物包含至少两个抗原结合结构域。至少两个抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域。例如，两个抗原结合结构域可以是能够结合相同配体的相同分子。至少两个抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域。例如，两个抗原结合结构域可以是能够结合相同或不同配体的不同分子。在一些情况中，经修饰的TCR包含第三抗原结合结构域，所述第三抗原结合结构域连接至(i)第二抗原结合结构域，(ii)TCR的α链、β链、γ链和δ链中的任一者，(iii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或者(iv)CD3ζ链。
在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与TCR复合物的第一CD3-ε链融合，并且第二抗原结合结构域与TCR复合物的第二CD3-ε链融合，图2F。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与CD3-ε链融合，并且第二抗原结合结构域与CD3-γ链融合，图2G。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合结构域连接至同一链。例如，本文公开的经修饰的TCR复合物可包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与CD3-ε链融合，图2H。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与TCR-α链融合，并且第二抗原结合结构域与TCR-β链融合。第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域，如黑色椭圆和黑色和白色条纹椭圆所示(图2I)。第一和第二抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域，如由类似阴影化的椭圆所示(图2J)。
在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与CD3-δ链融合，图2K。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与CD3-γ链融合，图2L。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与TCR-α链融合，图2M。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与第二抗原结合结构域融合的第一抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域继而与TCR-β链融合，图2N。第一和第二抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域。第一和第二抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与CD3-ε链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-δ链融合的第二抗原结合结构域，图2O。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与CD3-δ链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-γ链融合的第二抗原结合结构域，图2P。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与TCR-α链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-ε链融合的第二抗原结合结构域，图2Q。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与TCR-β链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-ε链融合的第二抗原结合结构域，图2R。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与α链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-γ链融合的第二抗原结合结构域，图2S。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与TCR-β链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-γ链融合的第二抗原结合结构域，图2T。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与TCR-α链融合的第一抗原结合结构域和与CD3-δ链融合的第二抗原结合结构域，图2U。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的TCR复合物包含与β链融合的第一抗原结合结构域和与δ链融合的第二抗原结合结构域，图2V。
在本文各方面的各种实施方案中，经修饰的TCR复合物包含先前鉴定的TCR。在一些情况中，可以使用全基因组测序来鉴定TCR。例如，TCR可以靶向通过靶细胞的全基因组测序鉴定的新抗原或新表位。或者，可以从自体、同种异体或异种异体库中鉴定TCR。自体和同种异体鉴定可能需要多步骤过程。在自体和同种异体鉴定中，可以从CD14选择的单核细胞生成树突细胞(DC)，并在成熟后用特定的肽脉冲或转染。经肽脉冲的DC可用于刺激自体或同种异体的免疫细胞，诸如T细胞。可以通过有限稀释从这些经肽脉冲的T细胞系中分离出单细胞肽特异性T细胞克隆。感兴趣的主题TCR可以被鉴定出和分离。感兴趣的TCR的α、β、γ和δ链可以被克隆、密码子优化并编码到载体(例如慢病毒载体)中。在一些实施方案中，TCR的各部分可以被替换。例如，人TCR的恒定区可以被对应的鼠区替换。可以执行用对应的鼠区域替换人恒定区以增加TCR稳定性。TCR也可以在具有较高或超生理学的离体亲和力。在一些情况中，鉴定TCR的方法可包括用人肿瘤蛋白对表达人白细胞抗原(HLA)系统的转基因小鼠进行免疫，以产生表达针对人抗原的TCR的T细胞(参见例如，Stanislawski等人，Circumventing tolerance to a human MDM2-derived tumor antigen by TCR genetransfer,Nature Immunology 2,962-970(2001))。另一种方法可以是同种异体TCR基因转移，其中从经历肿瘤缓解的受试者中分离出肿瘤特异性T细胞，然后可以从共有该疾病但可能无反应的另一名受试者将反应性TCR序列转移至T细胞中(de Witte,M.A.等人，Targeting self-antigens through allogeneic TCR gene transfer,Blood 108,870–877(2006))。在一些情况中，可以采用体外技术来改变TCR的序列，通过增大弱反应性肿瘤特异性TCR与靶抗原的相互作用(亲和力)的强度来增强其肿瘤杀伤活性(Schmid,D.A.等人，Evidence for a TCR affinity threshold delimiting maximal CD8 T cellfunction.J.Immunol.184,4936-4946(2010))。
在另一方面中，本公开提供了一种用于诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的系统。该系统包含：(a)嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含表现出与第一表位的特异性结合的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)本文公开的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物。
在一些实施方案中，该系统包含(a)嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含表现出与第一表位的特异性结合的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含表现出与第二表位的特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域连接至以下中的至少一个：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自TCR的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。
主题系统的嵌合抗原受体(CAR)可包含表现出与第一表位的特异性结合的第一抗原结合结构域。第一抗原结合结构域可包含可以结合表位的任何蛋白质或分子。第一抗原结合结构域的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠抗体或其功能性衍生物、变体或片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体和单结构域抗体(诸如骆驼科动物来源的纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv中的至少一者。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指可以以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子，并且包括单链结合分子、基于细胞色素b562的结合分子、纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架(例如，adnectin)、脂质运载蛋白支架、杯芳烃骨架、A结构域和其他支架。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物、变体或片段。例如，抗原结合结构域可至少包含跨膜受体的配体结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域可包含scFv。scFv可以源自可变区序列已知的抗体。在一些实施方案中，scFv可以来源于从可用的小鼠杂交瘤获得的抗体序列。可以从肿瘤细胞或原代细胞的全外显子测序获得scFv。在一些实施方案中，scFv可以被改变。例如，可以以多种方式修饰scFv。在一些情况中，scFv可能会突变，使得scFv可具有更高的对其靶标的亲和力。在一些情况中，scFv与其靶标的亲和力可以针对正常组织上低水平表达的靶标进行优化。可以执行此优化以最小化潜在的毒性，诸如细胞因子释放综合征。在其他情况中，克隆对靶标的膜结合形式具有更高亲和力的scFv可能优于其可溶性形式对应物。如果还可以检测到不同水平的一些可溶形式的靶标并且它们的靶向可能导致意外的毒性(诸如细胞因子释放综合征)，则可以执行该修饰。
在一些实施方案中，CAR的第一抗原结合结构域包含本文公开的抗原结合分子。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含单结构域抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是抗BCMA sdAb。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含与选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:46组成的组中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗BCMA sdAb包含选自SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23的任一者的序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域可包含相互作用对的一个成员。例如，抗原结合结构域可以是包含受体和配体的相互作用对的一个成员或其片段。受体或配体或其片段可以称为抗原结合结构域。未被称为抗原结合结构域的另一成员可包含抗原结合结构域特异性结合的表位。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域包含与配体特异性结合的受体。受体可包括G蛋白偶联受体(GPCR)；整合素受体；钙粘蛋白受体；催化受体，包括具有酶促活性的受体和不具有内在酶促活性而是通过刺激非共价缔合的酶(例如，激酶)起作用的受体；死亡受体，诸如肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员；细胞因子受体；免疫受体；等等。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域包含与受体结合的配体。
主题系统的CAR的抗原结合结构域可以通过跨膜结构域连接至细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可以是跨膜区段。主题CAR的跨膜结构域可以将CAR锚定至细胞(例如免疫细胞)的质膜。在一些实施方案中，跨膜区段包含多肽。连接CAR的抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜多肽可以具有任何合适的多肽序列。在一些情况中，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与内源性或野生型跨膜蛋白的跨膜部分相比具有至少1个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)氨基酸取代、缺失和插入的多肽序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，诸如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方案中，跨膜多肽通过抗原结合结构域将信号从细胞的细胞外区域传递至细胞内区域。CD28的天然跨膜部分可用于CAR中。在其他情况中，CD8α的天然跨膜部分也可用于CAR中。
主题系统的CAR的细胞内信号传导结构域可包含参与免疫细胞信号传导的信号传导结构域或其任何衍生物、变体或片段。CAR的细胞内信号传导结构域可以诱导包含CAR的免疫细胞的活性。细胞内信号传导结构域可以转导效应子功能信号并指导细胞执行专门的功能。信号传导结构域可以包含其他分子的信号传导结构域。尽管通常可以在CAR中采用另一个分子的信号传导结构域，但在许多情况下并不需要使用整个链。在一些情况中，在CAR中使用信号传导结构域的截短部分。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫细胞信号传导所涉及的多个信号传导结构域，或其任何衍生物、变体或片段。例如，细胞内信号传导结构域可包含至少2个免疫细胞信号传导结构域，例如至少2、3、4、5、7、8、9或10个免疫细胞信号传导结构域。免疫细胞信号传导结构域可以以刺激方式或抑制方式参与调节TCR复合物的初级激活。细胞内信号传导结构域可以是T细胞受体(TCR)复合物的细胞内信号传导结构域。受试者CAR的细胞内信号传导结构域可以包含Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70的信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域包括基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。包含ITAM的信号传导结构域可包含由6-8个氨基酸分隔的氨基酸序列YxxL/I的两个重复，其中每个x独立地为任何氨基酸，从而产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。当抗原结合结构域结合至表位时，可以例如通过磷酸化来修饰包含ITAM的信号传导结构域。磷酸化的ITAM可以充当其他蛋白质(例如参与各种信号传导途径的蛋白质)的停泊位点。在一些实施方案中，主要信号传导结构域包括经修饰的ITAM结构域，例如，突变、截短和/或优化的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性。
在一些实施方案中，主题CAR的细胞内信号传导结构域包含FcγR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcγR信号传导结构域可选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括FcεR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcεR信号传导结构域可以选自FcεRI和FcεRII(CD23)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括FcαR信号传导结构域(例如，ITAM)。FcαR信号传导结构域可以选自FcαRI(CD89)和Fcα/μR。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，主要信号传导结构域包含CD3ζ的ITAM。
在一些实施方案中，主题CAR的细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序或ITIM。包含ITIM的信号传导结构域可以包含在免疫系统的一些抑制受体的胞质尾区中发现的氨基酸保守序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。可以通过诸如Src激酶家族成员(例如，Lck)的酶来修饰(例如磷酸化)包含ITIM的主要信号传导结构域。在磷酸化后，可以将其他蛋白质(包括酶)募集到ITIM。这些其他蛋白质包括但不限于酶(诸如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2、被称为SHIP的肌醇磷酸酶)和具有一个或多个SH2结构域的蛋白质(例如，ZAP70)。细胞内信号传导结构域可包含以下的信号传导结构域(例如，ITIM)：BTLA、CD5、CD31、CD66a、CD72、CMRF35H、DCIR、EPO-R、FcγRIIB(CD32)、Fc受体样蛋白2(FCRL2)、Fc受体样蛋白3(FCRL3)、Fc受体样蛋白4(FCRL4)、Fc受体样蛋白5(FCRL5)、Fc受体样蛋白6(FCRL6)、蛋白G6b(G6B)、白介素4受体(IL4R)、免疫球蛋白超家族受体转运相关1(IRTA1)、免疫球蛋白超家族受体转运相关2(IRTA2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(KIR2DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL2(KIR2DL2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL3(KIR2DL3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL5(KIR2DL5)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL1(KIR3DL1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体3DL2(KIR3DL2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1(LIR1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LIR2)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3(LIR3)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员5(LIR5)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员8(LIR8)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)、肥大细胞功能相关抗原(MAFA)、NKG2A、天然细胞毒性触发受体2(NKp44)、NTB-A、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、PILR、SIGLECL1、唾液酸结合Ig样凝集素2(SIGLEC2或CD22)、唾液酸结合Ig样凝集素3(SIGLEC3或CD33)、唾液酸结合Ig样凝集素5(SIGLEC5或CD170)、唾液酸结合Ig样凝集素6(SIGLEC6)、唾液酸结合Ig样凝集素7(SIGLEC7)、唾液酸结合Ig样凝集素10(SIGLEC10)、唾液酸结合Ig样凝集素11(SIGLEC11)、唾液酸结合Ig样凝集素4(SIGLEC4)、唾液酸结合Ig样凝集素8(SIGLEC8)、唾液酸结合Ig样凝集素9(SIGLEC9)、血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、信号调节蛋白(SIRP 2)，以及信号传导阈值调节跨膜衔接因子1(SIT)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括经修饰的ITIM结构域，例如突变、截短和/或优化的ITIM结构域，其与天然ITIM结构域相比具有改变的(例如，增加或降低的)活性。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含至少2个ITAM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITAM结构域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含至少2个ITIM结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个ITIM结构域)(例如，至少2个主要信号传导结构域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括ITAM结构域和ITIM结构域。
在一些情况中，主题CAR的细胞内信号传导结构域可包括共刺激结构域。在一些实施方案中，例如来自共刺激分子的共刺激结构域可以提供用于免疫细胞信号传导(诸如来自ITAM和/或ITIM结构域的信号传导)的共刺激信号，例如用于激活免疫细胞活性和/或使免疫细胞活性失活。在一些实施方案中，共刺激结构域可操作用于调节免疫细胞中的增殖和/或存活信号。在一些实施方案中，共刺激性信号传导结构域包括MHC I类蛋白、MHC II类蛋白、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA或Toll配体受体的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包含选自由以下组成的组的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括多个共刺激结构域，例如至少两个，例如至少3、4或5个共刺激结构域。共刺激信号传导区域可以提供与初级效应子激活信号协同的信号，并且可以完成激活T细胞的要求。在一些实施方案中，向CAR添加共刺激结构域可以增强本文提供的免疫细胞的功效和持久性。
在表8中提供了共刺激信号传导结构域的实例。
表8：细胞内共刺激信号传导结构域
Figure BDA0002836582790000531
Figure BDA0002836582790000541
Figure BDA0002836582790000551
作为一个实例，CAR可包含CD3ζ链(有时称为第一代CAR)。作为另一个实例，CAR可包含CD-3ζ链和单个共刺激结构域(例如，CD28或4-1BB)(有时称为第二代CAR)。作为另一个实例，CAR可包含CD-3ζ链和两个共刺激结构域(CD28/OX40或CD28/4-1BB)(有时称为第三代CAR)。这些信号传导部分可以与共受体(诸如CD8)一起产生激酶途径的下游激活，这支持基因转录和功能性细胞应答。
在一些实施方案中，主题CAR可包含铰链或间隔区。铰链或间隔区可以指抗原结合结构域与跨膜结构域之间的区段。在一些实施方案中，铰链可用于向抗原结合结构域(例如，scFv)提供柔性。在一些实施方案中，例如当用于检测scFv的抗体不起作用或不可用时，可使用铰链来检测CAR在细胞表面上的表达。在一些情况中，铰链来源于免疫球蛋白分子，并且可能取决于靶标上第一表位或第二表位的位置而需要进行优化。在一些情况中，铰链可能不属于免疫球蛋白分子，而是替代地属于另一种分子，诸如CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可含有半胱氨酸和脯氨酸残基，所述半胱氨酸和脯氨酸残基可在CD8共受体和MHC分子的相互作用中起作用。在一些实施方案中，半胱氨酸和脯氨酸残基可影响CAR的性能，因此可以经工程化以影响CAR的性能。
铰链可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，CAR的铰链可以是大小可调的，并且可以在归一化CAR表达细胞与靶细胞之间的正交突触距离时在一定程度上进行补偿。CAR表达细胞与靶细胞之间的免疫突触的这种拓扑结构还可以限定距离，该距离由于细胞表面靶分子上的膜远端表位而无法通过CAR功能地桥接，所述膜远端表位即使使用短铰链CAR，也无法使突触距离接近以进行信号传导。同样，已经描述了膜近端CAR靶抗原表位，其信号传导输出仅在长铰链CAR的情况下观察到。可以根据可以使用的单链可变片段区域来调谐本文公开的铰链。
作为一个实例，CAR可包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，在图3中示出。CAR通常可包含源自单链抗体的抗原结合结构域、铰链结构域(H)或间隔区、提供至质膜的锚定的跨膜结构域(TM)，以及负责T细胞激活的信号传导结构域。CAR可包含免疫细胞信号传导结构域，诸如CD3ζ链。CAR可包括免疫细胞信号传导结构域和第一共刺激结构域，诸如CD3ζ链和4-1BB。CAR可包含免疫细胞信号传导结构域和至少两个共刺激结构域，诸如CD3ζ链、4-1BB和OX40。在一些实施方案中，通用CAR也可被包含在系统中。通用CAR可包含与结合单克隆抗体上的标签(例如，异硫氰酸荧光素或生物素)的蛋白质结构域融合的细胞内信号传导结构域。免疫细胞信号传导结构域和共刺激结构域的各种组合可用于受试者CAR中。在一些实施方案中，免疫细胞信号传导结构域可以来自CD3、CD4和/或CD8。共刺激结构域可以来自4-1BB、OX40、CD28等。
在一些实施方案中，本公开的主题系统的CAR可包含一个或多个另外的抗原结合结构域，所述一个或多个另外的抗原结合结构域表现出与一个或多个另外的表位的特异性结合。例如，主题系统的CAR可包含至少两个抗原结合结构域(例如，至少3、4、5、6、7、8、9或10个抗原结合结构域)。在一些实施方案中，CAR的所述至少两个抗原结合结构域串联连接。在一些实施方案中，所述至少两个抗原结合结构域可以是相同的抗原结合结构域。例如，所述至少两个抗原结合结构域可以是能够结合相同表位的相同分子。在一些实施方案中，所述至少两个抗原结合结构域可以是不同的抗原结合结构域。例如，所述至少两个抗原结合结构域可以是能够结合一种或多种抗原上的不同表位的不同分子。
主题CAR的抗原结合结构域和主题系统的经修饰的TCR复合物可结合存在于不同抗原上的表位。在一些情况中，CAR的抗原结合结构域和主题系统的经修饰的TCR复合物结合共同抗原上存在的表位。在一些实施方案中，第一表位和第二表位可以是相同的表位。在一些实施方案中，第一表位和第二表位可以是不同的表位。
第一表位和/或第二表位可以存在于一个或多个细胞表面抗原上。一种或多种细胞表面抗原可以是酪氨酸激酶受体、丝氨酸激酶受体、组氨酸激酶受体、G蛋白偶联受体(GPCR)等。
第一表位和/或第二表位可以存在于免疫检查点受体或免疫检查点受体配体上。在一些实施方案中，免疫检查点受体或免疫检查点受体配体可以是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、BLTA、CD47或CD40。
第一表位和/或第二表位可以存在于细胞因子或细胞因子受体上。细胞因子受体可以是例如CCR2b、CXCR2(CXCL1受体)、CCR4(CCL17受体)、Gro-a、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、乙酰肝素酶、CD137L、LEM、Bcl-2、CCL17、CCL19或CCL2。
第一表位和/或第二表位可以存在于肿瘤相关抗原上。该表位可以是例如肿瘤表位。肿瘤相关抗原可以选自由以下组成的组：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、BCMA、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CA-125、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、CLL-1、CTAG1B、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FAP、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、FR-α、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、GPC3、GPC-2、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、L1-CAM、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、生存素、生存素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFαRII、TGFβRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ轻链。在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位可以是EGFR、EGFRvIII、GPC3、GPC-2、DLL3、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、CLL-1、CD30、CD33、HER2、MSLN、PSMA、CEA、GD2、IL13Rα2、CAIX、L1-CAM、CA125、CD133、FAP、CTAG1B、MUC1、FR-α、CD70、CD171、ROR1，以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，第一表位或第二表位存在于BCMA上。在一些实施方案中，第一表位和第二表位都存在于BCMA上。在一些实施方案中，第一表位和第二表位是BCMA的相同表位。在一些实施方案中，第一表位和第二表位是BCMA的不同表位。
第一表位和/或第二表位可以存在于新抗原上。第一表位和/或第二表位可以是新表位。
新抗原和新表位通常是指在一些情况中触发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤特异性突变。例如，可以使用全基因组测序方法来鉴定这些内源性突变。Tran E等人，“Cancerimmunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient withepithelial cancer,”Science 344:641-644(2014)。抗原结合结构域，例如主题CAR或经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域，可以表现出与肿瘤特异性新抗原的特异性结合。CAR或经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域所结合的新抗原可以在靶细胞上表达，并且例如，是由任何内源基因中的突变编码的新抗原和新表位。在一些情况中，第一和/或第二抗原结合结构域结合由突变基因编码的新抗原或新表位。该基因可以选自由以下组成的组：ABL1、ACOl 1997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2Μ、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM11 IB、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE 10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB 16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB 17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、NY-ESO、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白质、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B 1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL以及XPOT。
在一些实施方案中，可以被第一和/或第二抗原结合结构域结合的第一表位和/或第二表位可以存在于基质上。基质通常是指尤其为生物细胞、组织或器官提供连接和功能支持的组织。基质可以是肿瘤微环境的基质。第一表位和/或第二表位可以存在于基质抗原上。此类抗原可以在肿瘤微环境的基质上。例如，新抗原和新表位可以存在于肿瘤内皮细胞、肿瘤脉管系统、肿瘤纤维母细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤间充质细胞上。示例性抗原包括但不限于CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4和腱生蛋白。
在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位可以存在于由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原上。MHC可以是I类或II类人白细胞抗原(HLA)。HLA可以是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DM或HLA-DO。在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位可以存在于HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*11、HLA-A*23、HLA-A*24、HLA-A*25、HLA-A*26、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*32、HLA-A*33、或HLA-A*24、HLA-B*27、HLA-B*35、HLA-B*48、HLA-B*55等上。
在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位可以是可溶的(例如，不与细胞结合)。在一些情况中，抗原可以是可溶的，例如可溶抗原。第一表位和/或第二表位可以存在于通用抗原上。在一些情况下，主题CAR和/或经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域可各自结合多个表位，例如多重特异性。
在一些实施方案中，第一表位和第二表位可以是相同的表位。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合结构域与其表位的结合可以激活表达本公开的经修饰的TCR复合物的免疫细胞的免疫细胞活性。在一些实施方案中，两个或更多个抗原结合结构域与其表位的结合可以激活表达本公开的经修饰的TCR复合物的免疫细胞的免疫细胞活性。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与第一表位的结合或第二抗原结合结构域与第二表位的结合可以激活表达主题系统的免疫细胞的免疫细胞活性。在一些情况中，第一抗原结合结构域与第一表位的结合以及第二抗原结合结构域与第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
在一些实施方案中，用于诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的系统可包含多于两个抗原结合结构域。例如，系统可以包含第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十或更多个抗原结合结构域。在一些实施方案中，第三抗原结合结构域与第三表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与第一表位的结合、第二抗原结合结构域与第二表位的结合以及第三抗原结合结构域与第三表位的结合激活了表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。可以在本公开的系统中使用任何数量的抗原结合结构域，并且抗原结合结构域的数量不限于一个、两个或三个。
在一些实施方案中，主题系统的两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；(iii)CD3ζ链，并且其中所述两个或更多个抗原结合结构域与它们相应的表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。在需要时，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的分开的链。或者，所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的一条链。在主题系统的一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合结构域串联连接在分化簇3(CD3)的所述ε链、所述δ链和/或所述γ链上。在一些实施方案中，主题系统的两个或更多个抗原结合结构域连接至，任选地串联连接至主题系统的CAR。
在表达本公开的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞中激活的免疫细胞活性可以是多种细胞活性中的任一种。在一些实施方案中，所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
在一些实施方案中，免疫细胞活性包括免疫细胞的克隆扩增。克隆扩增可包括由免疫细胞生成子代细胞。在克隆扩增中，免疫细胞的后代可包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统。在克隆扩增中，免疫细胞的后代可包含本文提供的CAR。在克隆扩增中，免疫细胞的后代可包含本文提供的经修饰的TCR复合物。在克隆扩增中，免疫细胞的后代可包含本文提供的CAR和TCR。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的克隆扩增可以比缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的克隆扩增更大。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的克隆扩增可以是缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的克隆扩增的约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约300倍、约300倍至约400倍、约400倍至约500倍、约500倍至约600倍、约600倍至约700倍大。在一些实施方案中，克隆扩增可包括对免疫细胞的数量进行定量。对免疫细胞的数量进行定量可包括流式细胞术、台盼蓝排除法和/或血细胞计数法。
在一些实施方案中，免疫细胞活性包括由免疫细胞进行细胞因子释放。在一些实施方案中，免疫细胞活性包括细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合的释放。免疫细胞进行的细胞因子释放可包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、IFNγ、TNFα、CSF、TGFβ、颗粒酶等的释放。在一些实施方案中，可使用HTRF、流式细胞术、蛋白质印迹等来对细胞因子释放进行定量。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的细胞因子释放可以比缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的细胞因子释放更大。与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞可以生成约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、或超过300倍大的细胞因子释放。在一些实施方案中，可以在体外或体内对细胞因子释放进行定量。
在一些实施方案中，免疫细胞活性包括免疫细胞的细胞毒性。在一些实例中，当在免疫细胞中表达时，本公开的经修饰的TCR复合物、主题系统和组合物可用于杀伤靶细胞。表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的免疫细胞或免疫细胞群可诱导靶细胞的死亡。靶细胞的杀伤可用于多种应用，包括但不限于治疗期望消除细胞群或期望抑制细胞群的增殖的疾病或疾患。细胞毒性可指杀伤靶细胞。细胞毒性还可以指由免疫细胞释放细胞毒性细胞因子，例如IFNγ或颗粒酶。在一些情况中，在免疫细胞中表达的经修饰的TCR复合物和/或主题系统可以改变(i)诸如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素的细胞毒素的释放，和/或(ii)通过T细胞与靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用进行的凋亡诱导，从而触发对靶细胞的破坏。在一些实施方案中，可以通过细胞毒性测定来对细胞毒性进行定量，所述细胞毒性测定包括共培养测定、ELISPOT、铬释放细胞毒性测定等。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的细胞毒性可以比缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的细胞毒性更大。与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞可为对靶细胞具有约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％更大的细胞毒性。与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞可诱导至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％更大的靶细胞死亡。在一些实施方案中，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的免疫细胞可以诱导在其表面上展示靶表位的靶细胞的凋亡。在一些实施方案中，可以在体外或体内测定细胞毒性。在一些实施方案中，确定细胞毒性可以包括确定与施用之前的疾病水平相比，在施用包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的细胞后的疾病水平。在一些实施方案中，确定细胞毒性可包括确定在施用包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的细胞后的疾病水平，以及在施用缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞后的疾病水平。在一些实施方案中，靶病变上的疾病水平可以测量为完全应答(CR)；靶病变消失，部分应答(PR)；以基线LD总和作为基准，靶病变的最长直径(LD)的总和至少降低30％，进展(PD)；以自治疗开始或一种或多种新病变出现以来记录的最小LD总和作为基准，靶病变的LD总和至少增加20％，稳定疾病(SD)；或者，以最小LD总和为基准，既没有足够的收缩率来满足PR，也没有足够的增长来满足PD。在一些实施方案中，可以测量非靶标病变。非靶标病变的疾病水平可以是完全应答(CR)；所有非靶标病变消失并且肿瘤标志物水平正常化、不完全应答；持续存在一种或多种非靶标病变、进展(PD)；或出现一种或多种新病变。
在一些实施方案中，免疫细胞活性是免疫细胞的增殖。免疫细胞的增殖可以指免疫细胞的扩增。免疫细胞的增殖可以指免疫细胞的表型变化。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的增殖可以比缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的增殖更大。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的增殖可以是缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的增殖的约5倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约30倍、约30倍至约40倍、约40倍至约50倍、约50倍至约60倍、约60倍至约70倍、约70倍至约80倍、约80倍至约90倍、约90倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约300倍、约300倍至约400倍、约400倍至约500倍、约500倍至约600倍、约600倍至约700倍大。在一些实施方案中，增殖可以包括对免疫细胞的数量进行定量。对免疫细胞的数量进行定量可包括流式细胞术、台盼蓝排除法和/或血细胞计数法。增殖也可以通过免疫细胞的表型分析来确定。例如，与缺乏经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞相比，培养物中的免疫细胞的团块可以表示免疫细胞的增殖。
在一些实施方案中，免疫细胞活性可以是分化、去分化或转分化。免疫细胞的分化、去分化或转分化可以通过用流式细胞术评估细胞表面上的分化、去分化或转分化标志物的表型表达来确定。在一些实施方案中，与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞具有增强的分化能力。在一些实施方案中，与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞具有增强的去分化能力。在一些实施方案中，与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞具有更大的转分化能力。
在一些实施方案中，免疫细胞活性可以是包含经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的运动和/或运输。在一些实施方案中，可以通过对免疫细胞到靶位点的定位进行定量来确定运动。例如，包含经修饰的TCR复合物和/或主题系统的免疫细胞可以在施用后在靶位点处，例如在非靶位点的位点处进行定量。可以通过分离病变并对包含经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞)的数量进行定量来执行定量。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的运动和/或运输可以比缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的运动和/或运输更大。在一些实施方案中，在靶位点(例如肿瘤病变)处包含经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的数量可以是缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的数量的约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。也可以利用转板迁移测定法(transwell migration assay)在体外确定运输。在一些实施方案中，例如在转板迁移测定中，在靶位点处包含经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的数量可以是缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的数量的约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。
在一些实施方案中，免疫细胞活性可以是免疫细胞的耗尽和/或激活。免疫细胞的耗尽和/或激活可以使用流式细胞术或显微镜分析通过表型分析来确定。例如，耗尽标记物(例如程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)、2B4、CD160、Tim3，以及具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT))的表达水平可以定量地和/或定性地确定。在一些情况中，免疫细胞(诸如T细胞)可能会以分层方式失去效应子功能，并变得被耗尽。作为耗尽的结果，可能会丧失诸如IL-2产生和细胞因子表达以及高增殖能力的功能。耗尽还可能伴随着IFNγ、TNFα和趋化因子的产生中以及脱粒中的缺陷。包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞的耗尽和/或激活可以比缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞的耗尽和/或激活更大。在一些实施方案中，与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞可以经历至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、或超过300倍的耗尽或激活增长。在一些实施方案中，与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞可以经历至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、或超过300倍的耗尽或激活减少。
在一些实施方案中，第一抗原结合结构域与第一表位的结合以及第二抗原结构域与第二表位的结合激活表达所述系统的主题免疫细胞的细胞毒性。与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，可以提高细胞毒性。如通过细胞毒性测定中的杀伤百分比测量的，与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，可以提高细胞毒性。与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，接触后的杀伤百分比可以是约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或高达约100％的靶细胞。
在一些实施方案中，与(i)仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合，或(ii)仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且减少了与所述细胞毒性相关的副作用。在一些实施方案中，与细胞毒性相关的副作用是细胞因子释放综合征。与(i)仅第一抗原结合结构域与第一表位结合或(ii)仅第二抗原结合结构域与第二表位结合相比，副作用的减少，诸如细胞因子释放综合征的减少可以是约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或高达约100％的减少。
在一些实施方案中，与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性的持久性。与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比，当所述系统在受试者中的免疫细胞中表达时，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合可激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并增加所述细胞毒性的持久性。持久性的增加可以通过对施用后包含所述系统的免疫细胞的水平进行定量来确定。持久性增加可以指与缺乏所述系统的可比免疫细胞、缺乏所述系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞相比，包含本文提供的系统的免疫细胞在施用后存在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、35天、40天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年或更长时间。
在一个方面中，本公开提供了表达本文各个实施方案的任何经修饰的TCR复合物和/或系统(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的分离的宿主细胞。分离的宿主细胞可包括宿主细胞群。宿主细胞可以是用于表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的任何合适的细胞。在一些情况中，宿主细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是淋巴细胞，诸如T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况中，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、NKT和/或T辅助细胞。在一些情况中，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞，诸如KHYG-1细胞或其衍生物。
在一个方面中，本公开提供了一种抗原特异性免疫细胞，所述抗原特异性免疫细胞包含至少两个外源引入的抗原结合结构域，其中一个连接至T细胞受体(TCR)复合物，另一个连接至嵌合抗原受体(CAR)。抗原特异性免疫细胞可以与表达由至少两个外源引入的抗原结合结构域识别的一种或多种抗原的靶细胞特异性结合。免疫细胞可以是淋巴细胞，诸如T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况中，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、NKT和/或T辅助细胞。在一些情况中，表达主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞，诸如KHYG-1细胞或其衍生物。
在一个方面中，本公开提供了一种免疫细胞群，单独的免疫细胞表达本文各种实施方案的任何经修饰的TCR复合物和/或系统，并且其中所述免疫细胞群的特征在于：在使免疫细胞群暴露于受试者中的靶细胞群时，所述免疫细胞群诱导靶细胞的死亡。在暴露后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、35天、40天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年或更长时间内，免疫细胞群体可以诱导至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或高达约100％的靶细胞的死亡。
免疫细胞群可以包括多种免疫细胞中的任何一种。在一些情况中，免疫细胞群包括淋巴细胞。淋巴细胞可以是T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况中，淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、NKT和/或T辅助细胞。在一些实施方案中，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞，诸如KHYG-1细胞或其衍生物。
免疫细胞群可以包括任何合适数量的细胞。免疫细胞的数量可以确定为体外测定中使用的细胞的数量。免疫细胞的数量可以确定为施用于受试者的细胞的数量。免疫细胞的数量可以确定为激活任何免疫细胞活性(诸如增殖和/或扩增)之前的细胞数量。可以将可包括至少约1x106个细胞、至少约2x106个细胞、至少约3x106个细胞、至少约4x106个细胞、至少约5x106个细胞、至少约6x106个细胞、至少约7x106个细胞、至少约8x106个细胞、至少约9x106个细胞、1x107个细胞、至少约2x107个细胞、至少约3x107个细胞、至少约4x107个细胞、至少约5x107个细胞、至少约6x107个细胞、至少约7x107个细胞、至少约8x107个细胞、至少约9x107个细胞、至少约1x108个细胞、至少约2x108个细胞、至少约3x108个细胞、至少约4x108个细胞、至少约5x108个细胞、至少约6x108个细胞、至少约7x108个细胞、至少约8x108个细胞、至少约9x108个细胞、至少约1x109个细胞、至少约2x109个细胞、至少约3x109个细胞、至少约4x109个细胞、至少约5x109个细胞、至少约6x109个细胞、至少约7x109个细胞、至少约8x109个细胞、至少约9x109个细胞、至少约1x1010个细胞、至少约2x1010个细胞、至少约3x1010个细胞、至少约4x1010个细胞、至少约5x1010个细胞、至少约6x1010个细胞、至少约7x1010个细胞、至少约8x1010个细胞、至少约9x1010个细胞、至少约1x1011个细胞、至少约2x1011个细胞、至少约3x1011个细胞、至少约4x1011个细胞、至少约5x1011个细胞、至少约6x1011个细胞、至少约7x1011个细胞、至少约8x1011个细胞、至少约9x1011个细胞、或至少约1x1012个细胞的免疫细胞群施用于受试者。在一些实施方案中，免疫细胞群可包括至多约5x1010个细胞、至多约4x1010个细胞、至多约3x1010个细胞、至多约2x1010个细胞、至多约1x1010个细胞、至多约9x109个细胞、至多约8x109个细胞、至多约7x109个细胞、至多约6x109个细胞、至多约5x109个细胞、至多约4x109个细胞、至多约3x109个细胞、至多约2x109个细胞、至多约1x109个细胞、至多约9x108个细胞、至多约8x108个细胞、至多约7x108个细胞、至多约6x108个细胞、至多约5x108个细胞、至多约4x108个细胞、至多约3x108个细胞、至多约2x108个细胞、至多约1x108个细胞、至多约9x107个细胞、至多约8x107个细胞、至多约7x107个细胞、至多约6x107个细胞、至多约5x107个细胞、至多约4x107个细胞、至多约3x107个细胞、至多约2x107个细胞、至多约1x107个细胞、至多约9x106个细胞、至多约8x106个细胞、至多约7x106个细胞、至多约6x106个细胞、至多约5x106个细胞、至多约4x106个细胞、至多约3x106个细胞、至多约2x106个细胞、至多约1x106个细胞、至多约9x105个细胞、至多约8x105个细胞、至多约7x105个细胞、至多约6x105个细胞、至多约5x105个细胞、至多约4x105个细胞、至多约3x105个细胞、至多约2x105个细胞、或至多约1x105个细胞。可以向有需要的受试者施用免疫细胞群。例如，可以向受试者施用约5x1010个细胞。在一些情况中，可以将细胞群扩展至足以进行治疗的数量。例如，5x107个细胞可以进行快速扩增，以产生足够的数量用于治疗用途。可以例如通过输注将任意数量的细胞施用于受试者以用于治疗用途。例如，可以向患者输注介于约1x106个至5x1012个之间(包含端值)的数量的细胞。可以向患者输注尽可能多的可为其生成的细胞。
在本文各个方面的细胞中的任何细胞中，所述细胞可表现出与同时存在于靶细胞中的两种抗原的特异性结合。抗原可以存在于靶细胞表面上，或者在一些情况中可以是由另一细胞展示的靶细胞的胞内蛋白，诸如在MHC的情况下。
在本文各方面的各种实施方案中，连接至CAR的抗原结合结构域可主要介导免疫细胞与靶细胞之间的相互作用，并且连接至经修饰的TCR复合物的抗原结合结构域可主要介导当免疫细胞与靶细胞之间的相互作用发生时的免疫细胞活性。如本文先前所述，免疫细胞活性可包括所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
在一个方面中，本文提供了一种诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的方法，所述方法包括：(a)在免疫细胞中表达本文公开的经修饰的TCR复合物和/或系统；以及(b)在诱导免疫细胞和/或靶细胞活性的条件下使靶细胞与免疫细胞接触。在一些实施方案中，在免疫细胞中表达的系统包含经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗原结合结构域，所述两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自TCR的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，在免疫细胞中表达的系统包含嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域连接至以下中的至少一者：(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或(iii)CD3ζ链。
当使靶细胞与表达所述系统的免疫细胞接触时，第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域可以与它们相应的表位结合。这些表位例如存在于靶细胞上。第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域与它们相应的表位的结合可激活免疫细胞的细胞毒性。在一些情况中，与缺乏所述系统的可比免疫细胞、缺乏所述系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或表达所述系统并且其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与相应的表位结合的可比免疫细胞相比，当第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域时，免疫细胞中激活的细胞毒性得以增强。第一抗原结合结构域与其相应表位的结合和/或第二抗原结合结构域与其相应表位的结合可以激活免疫细胞的细胞毒性并减少与所述细胞毒性有关的副作用。在一些情况中，与缺乏所述系统的可比免疫细胞、缺乏所述系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或表达所述系统并且其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与相应的表位结合的可比免疫细胞相比，与细胞毒性相关的副作用的减少更大。在一些情况中，减少的副作用是细胞因子释放综合征。第一抗原结合结构域与其相应表位的结合和/或第二抗原结合结构域与其相应表位的结合可以激活免疫细胞的细胞毒性并增加所述细胞毒性的持久性。在一些情况中，与缺乏所述系统的可比免疫细胞、缺乏所述系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR复合物)的可比免疫细胞、和/或表达所述系统并且其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与相应的表位结合的可比免疫细胞相比，细胞毒性的持久性增加。在一些情况中，免疫细胞的细胞毒性诱导靶细胞的死亡。
在诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的方法的各种实施方案中，免疫细胞可以是多种免疫细胞中的任一种。在一些情况中，免疫细胞包括淋巴细胞。淋巴细胞可以是T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞、αβT细胞、γδT细胞、Vγ9δ2T细胞、Vδ1T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。在一些情况中，淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、NKT和/或T辅助细胞。在一些情况中，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞，诸如KHYG-1细胞或其衍生物。
在诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的方法的各种实施方案中，靶细胞可以是多种细胞类型中的任一种。靶细胞可以是例如癌细胞、造血细胞或实体瘤细胞。在一些情况中，靶细胞可以是在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜、软骨、韧带和肌腱中的一者或多者中鉴定出的细胞。靶细胞可以是患病细胞。
在一个方面中，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的经修饰的TCR复合物或系统的抗原特异性免疫细胞。在一些实施方案中，抗原特异性免疫细胞包含经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗原结合结构域，所述两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自TCR的α链、β链、γ链和δ链，(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，抗原特异性免疫细胞包含含有第一抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)和含有第二抗原结合结构域的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物。在一些实施方案中，所述方法包括(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，所述抗原特异性免疫细胞包含含有第一抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)和含有第二抗原结合结构域的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，其中所述受试者的癌症的靶细胞表达一种或多种由所述第一和/或第二抗原结合结构域识别的抗原，并且其中所述免疫细胞与所述靶细胞特异性结合，以及(b)在诱导所述免疫细胞针对所述靶细胞的免疫细胞活性的条件下，通过所述第一和/或第二抗原结合结构域使所述靶细胞与所述抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导所述癌症的所述靶细胞的死亡。
在一个方面中，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，其中所述抗原特异性免疫细胞是表达本文提供的实施方案的任何经修饰的TCR复合物和/或系统的经遗传修饰的免疫细胞；以及(b)在诱导所述免疫细胞针对所述受试者的癌症的靶细胞的免疫细胞活性的条件下使所述靶细胞与所述抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导所述癌症的所述靶细胞的死亡。
在一些实施方案中，治疗受试者的癌症的方法包括对免疫细胞进行遗传修饰以产生抗原特异性免疫细胞。
使靶细胞与抗原特异性免疫细胞接触后，针对受试者的癌症的靶细胞的免疫细胞活性可诱导靶细胞的死亡。免疫细胞活性可以选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。在一些情况中，免疫细胞活性是免疫细胞的细胞毒性。免疫细胞对靶细胞的细胞毒性可产生受试者的癌症的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或高达约100％的减少。在一些实施方案中，免疫细胞活性可以是免疫细胞进行的细胞因子释放。在一些情况中，细胞因子由免疫细胞释放。与缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的可比免疫细胞、缺乏所述经修饰的TCR复合物和/或系统的一个或多个组分(例如，CAR、经修饰的TCR)的可比免疫细胞、和/或其中第一和第二抗原结合结构域中的仅一者与它们相应的表位结合的可比免疫细胞释放的细胞因子的量相比，由所述免疫细胞释放的细胞因子的量可至少3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或高达约100％更少。在一些情况中，当所述第一和第二抗原结合结构域均与它们相应的表位结合时，所述免疫细胞活性的持久性与仅单独的所述第一抗原结合结构域的结合或仅所述第二抗原结合结构域的结合相比更大。
在治疗受试者的癌症的方法的各种实施方案中，免疫细胞可以是多种免疫细胞中的任何一种。在一些情况中，免疫细胞包括淋巴细胞。淋巴细胞可以是T细胞。T细胞的非限制性实例包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。在一些情况中，淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些情况中，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的淋巴细胞是KHYG细胞，诸如KHYG-1细胞或其衍生物。
在治疗受试者的癌症的方法的各种实施方案中，所述癌症可以是多种癌症中的任何一种。癌症是例如膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头颈癌、肾癌、白血病、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、睾丸癌、气管癌或外阴癌。在一个方面中，本公开提供了一种组合物。在一些实施方案中，组合物包含本文公开的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物和/或系统。在一些实施方案中，所述组合物包含经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个结合结构域，所述两个或更多个结合结构域表现出与两个或更多个表位的特异性结合，其中所述抗原结合结构域任选地串联连接至：(i)至少一条TCR链，该至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者(iii)CD3ζ链。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码：(a)嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含表现出与第二表位的特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域连接至：至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或CD3ζ链。所述组合物可以包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码(a)嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域连接至：T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或CD3ζ链。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸包含与其可操作连接的启动子。一种或多种多核苷酸可包含脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，由一种或多种多核苷酸编码的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物或系统的组分中的一种或多种组分通过分隔两个或更多个核酸编码区的接头连接。接头可以是2A序列、弗林蛋白酶-V5-SGSGF2A等。
在一个方面中，本公开提供了一种产生经修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括通过在免疫细胞中表达本文提供的组合物来对所述免疫细胞进行遗传修饰，从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在本文各方面的各种实施方案中，包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞可用于诱导靶细胞的死亡。使用本公开的经修饰的TCR复合物和/或系统和方法，可以杀伤多种靶细胞。可以应用此方法的靶细胞包括多种细胞类型。靶细胞可以是体外的。靶细胞可以是体内的。靶细胞可以是离体的。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养物中的细胞。靶细胞可以是细胞集合中的一个细胞。靶细胞可以是哺乳动物细胞或来源于哺乳动物细胞。靶细胞可以是啮齿动物细胞或来源于啮齿动物细胞。靶细胞可以是人细胞或来源于人细胞。靶细胞可以是原核细胞或来源于原核细胞。靶细胞可以是细菌细胞或可以来源于细菌细胞。靶细胞可以是古细菌细胞或来源于古细菌细胞。靶细胞可以是真核细胞或来源于真核细胞。靶细胞可以是多能干细胞。靶细胞可以是植物细胞或来源于植物细胞。靶细胞可以是动物细胞或来源于动物细胞。靶细胞可以是无脊椎动物细胞或来源于无脊椎动物细胞。靶细胞可以是脊椎动物细胞或来源于脊椎动物细胞。靶细胞可以是微生物细胞或来源于微生物细胞。靶细胞可以是真菌细胞或来源于真菌细胞。靶细胞可以来自特定的器官或组织。
靶细胞可以是干细胞或祖细胞。靶细胞可以包括干细胞(例如，成体干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干(iPS)细胞)和祖细胞(例如，心脏祖细胞、神经祖细胞等)。靶细胞可包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人干细胞、人祖细胞等。克隆细胞可包括细胞的子代。靶细胞可以在活生物体中。靶细胞可以是经遗传修饰的细胞。A
靶细胞可以是原代细胞。例如，原代细胞的培养物可以传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。细胞可以是单细胞生物体。细胞可以在培养中生长。
靶细胞可以是患病的细胞。患病的细胞可能具有改变的代谢、基因表达和/或形态特征。患病的细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞和/或凋亡细胞。患病的细胞可以是来自患病的受试者的细胞。示例性疾病可包括血液疾患、癌症、代谢疾病、眼睛疾患、器官疾患、肌肉骨骼疾患、心脏病等。
如果靶细胞是原代细胞，则例如在体外实验中，可以例如通过任何方法从个体中收获它们。例如，白细胞可以通过单采血液分离术、白细胞分离疗法(leukocytapheresis)/密度梯度分离等来收获。来自组织(诸如皮肤、肌肉、骨髓、脾脏、肝脏、胰腺、肺、肠、胃等)的细胞可以通过活检来收获。可以使用适当的溶液来分散或悬浮所收获的细胞。此类溶液通常可以是平衡盐溶液(例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克氏平衡盐溶液(Hank’sbalanced salt solution)等)，所述平衡盐溶液方便地补充有胎牛血清或其他天然存在的因子以及可接受的低浓度缓冲液。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸缓冲液等。细胞可以立即使用，或者可以将它们进行存储(例如，通过冷冻)。冷冻的细胞可以解冻复苏，并且可以能够被重复使用。可以将细胞冷冻在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如，10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基)和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其他此类常用溶液中。
靶细胞可以是在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜、软骨、韧带和肌腱中的一者或多者中鉴定出的。
可以作为靶细胞的细胞的非限制性实例包括但不限于造血细胞、淋巴样细胞(诸如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞))、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)；髓样细胞，诸如粒细胞(嗜碱性粒细胞(Basophil granulocyte)、嗜酸性粒细胞(Eosinophil granulocyte)、嗜中性粒细胞(Neutrophil granulocyte)/过度分叶型嗜中性粒细胞(Hypersegmentedneutrophil))、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统的细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(Boettcher cell)和垂体(促性腺激素细胞、促皮质激素细胞、促甲状腺素细胞、促生长激素细胞、促乳素细胞)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、噬尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周细胞；消化系统的细胞，包括胃(胃主要细胞、壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏(肝细胞、枯否氏细胞)、软骨/骨/肌肉；骨细胞(bone cell)，包括成骨细胞、骨细胞(Osteocyte)、破骨细胞，牙齿(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞(cartilage cell)，包括成软骨细胞、软骨细胞(Chondrocyte)；皮肤细胞，包括丝胞(Trichocyte)、角化细胞、黑素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足状突细胞(Podocyte)、近肾小球细胞、球内系膜细胞/球外系膜细胞、肾脏近端肾小管刷状缘细胞(Kidney proximal tubule brush border cell)、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、足细胞(Sertoli cell)、莱氏细胞、卵子；和其他细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌腱细胞、表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)、毛干髓质细胞(Medullary hairshaft cell)、皮质毛干细胞(Cortical hair shaft cell)、表皮毛干细胞(Cuticularhair shaft cell)、表皮毛根鞘细胞(Cuticular hair root sheath cell)、赫胥黎氏层的毛根鞘细胞(Hair root sheath cell of Huxley's layer)、亨勒层的毛根鞘细胞(Hairroot sheath cell of Henle's layer)、外毛根鞘细胞、毛母质细胞(干细胞)、湿分层屏障上皮细胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的分层鳞状上皮的表面上皮细胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)、泌尿上皮细胞(内衬膀胱和尿道)、外分泌上皮细胞、唾液腺粘液细胞(富含多糖的分泌物)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌物)、舌中的埃伯内腺(Von Ebner's gland)细胞(冲刷味蕾(washestaste buds))、乳腺细胞(乳汁分泌)、泪腺细胞(泪液分泌)、耳中的耵聍腺细胞(耳垢分泌)、外分泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外泌汗腺亮细胞(小分子分泌)、顶泌汗腺细胞(有气味的分泌物，对性激素敏感)、眼睑中的莫耳腺细胞(专门的汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌物)、鼻子中的鲍曼氏腺细胞(冲刷嗅觉上皮)、十二指肠中的十二指肠腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液组分，包括用于使精子游动的果糖)、前列腺细胞(分泌精液组分)、尿道球腺细胞(粘液分泌物)、前庭大腺细胞(阴道润滑分泌物)、利特雷腺细胞(粘液分泌物)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌物)、呼吸道和消化道分离的杯状细胞(粘液分泌物)、胃粘膜粘液细胞(粘液分泌物)、胃腺酶原细胞(胃蛋白酶原分泌物)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌物)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌物)、小肠潘氏细胞(溶菌酶分泌物)、肺的II型肺胞细胞(表面活性剂分泌物)、肺克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、促生长激素细胞、垂体催乳素细胞、促甲状腺素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质素细胞、垂体中叶细胞、大细胞神经分泌细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸莱氏细胞、卵泡内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、粒黄体细胞、膜黄体细胞、近肾小球细胞(肾素分泌物)、肾的致密斑细胞、代谢和储运细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾、I型肺胞细胞(肺的衬里空气间层)、胰管细胞(泡心细胞)、非脱落管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等的)、管细胞(精囊、前列腺等的)、内衬于封闭的内部体腔的上皮细胞(Epithelial cells lining closed internal body cavities)、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(红血细胞)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮郎格罕细胞、破骨细胞(在骨中)、树突细胞(在淋巴组织中)、小胶质细胞(在中枢神经系统中)、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、血液和免疫系统的干细胞和定向祖细胞(各种类型)、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、感觉转导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、滋养细胞(Nurse cell)、卵泡细胞、足细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。
特别令人感兴趣的是癌细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。癌症可以是实体瘤或血液肿瘤。癌症可以是转移性的。癌症可以是复发的癌症。癌细胞的非限制性实例包括癌症的细胞，所述癌症包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端黑素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性成髓细胞白血病伴成熟(Acute myeloblastic leukemia with maturation)、急性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、恶性腺瘤、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成体T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、与AIDS相关的癌症、与AIDS相关的淋巴瘤、肺泡样软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、间变性甲状腺癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤(Atypical teratoid rhabdoidtumor)、基底细胞癌、基底细胞样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、Bellini管癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、布伦纳瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、具有未知原发部位的癌症、类癌肿瘤、癌(Carcinoma)、原位癌、阴茎癌、具有未知原发部位的癌、癌肉瘤、卡斯特莱曼病(Castleman's Disease)、中枢神经系统胚胎肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增生性疾患、慢性中性粒细胞白血病、亮细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆突性皮纤维肉瘤、皮样囊肿、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、胚胎癌、内胚层窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜癌症、子宫内膜样瘤、肠病相关性T细胞淋巴瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤，红细胞白血病、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏家族肿瘤、尤文氏家族肉瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、乳腺佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节神经胶质瘤(Ganglioglioma)、神经节瘤(Ganglioneuroma)、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、胚组织瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、胶质瘤、脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺胚细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心癌、成血管细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管内皮瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肾癌、Klatskin瘤、库肯勃瘤(Krukenberg tumor)、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤(Lentigo maligna melanoma)、白血病、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性周围神经鞘膜瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鱗状颈癌(MetastaticSquamous Neck Cancer with Occult Primary)、转移性尿路上皮癌、苗勒型混合瘤、单核细胞白血病、口腔癌、粘液性肿瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常病、骨髓增生异常综合征、髓性白血病、髓性肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽肿瘤、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼部肿瘤、少突星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、大嗜酸粒细胞瘤(Oncocytoma)、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺佩吉特病、肺上沟瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体肿瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、腹膜假性粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及15号染色体上的NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性肿瘤(Secondary neoplasm)、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、睾丸支持-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索-间质肿瘤、塞扎里综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆形细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓肿瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层瘤、表面上皮-间质肿瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia)、畸胎瘤、终末淋巴癌(Terminallymphatic cancer)、睾丸癌、卵泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖器肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、弗纳-莫里森综合征(Verner Morrison syndrome)、疣状癌、视路胶质瘤、外阴癌、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、沃辛瘤(Warthin'stumor)、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)以及它们的组合。在一些实施方案中，所靶向的癌细胞代表癌细胞群内的亚群，诸如癌症干细胞。在一些实施方案中，癌症是造血谱系的，诸如淋巴瘤。第一和/或第二抗原结合结构域可以与存在于癌细胞的抗原上的表位结合。
在一些实施方案中，靶细胞可以形成肿瘤。用本文的方法治疗的肿瘤可导致稳定化的肿瘤生长(例如，一个或多个肿瘤的大小增加不超过1％、5％、10％、15％或20％，和/或不转移)。在一些实施方案中，将肿瘤稳定化至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周。在一些实施方案中，将肿瘤稳定化至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。在一些实施方案中，将肿瘤稳定化至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在一些实施方案中，作为根据本文提供的方法进行治疗的结果，肿瘤的大小或肿瘤细胞的数量减少至少约5％、10％、15％、20％、25、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，肿瘤被完全消除，或减少到低于检测水平。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周保持无肿瘤(例如缓解)。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月保持无肿瘤。在一些实施方案中，受试者在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年保持无肿瘤。
靶细胞的死亡可以通过任何合适的方法来确定，包括但不限于在治疗之前和之后对细胞进行计数，或者测量与活细胞或死细胞相关的标志物(例如活或死靶细胞)的水平。
细胞死亡程度可以通过任何合适的方法来确定。在一些实施方案中，关于起始条件确定细胞死亡程度。例如，个体可以具有已知的靶细胞起始量，诸如已知大小的起始细胞质量或已知浓度的循环靶细胞。在这种情况下，细胞死亡程度可以表示为处理后存活的细胞与起始细胞群的比率。在一些实施方案中，可以通过合适的细胞死亡测定法来确定细胞死亡程度。可以使用多种细胞死亡测定法，并且可以利用多种检测方法。检测方法的实例包括但不限于使用细胞染色、显微术、流式细胞术、细胞分选以及这些的组合。
当在治疗期完成后对肿瘤进行手术切除时，可以通过测量切除的坏死组织(即，死亡组织)的百分比来确定治疗减小肿瘤大小的功效。在一些实施方案中，如果切除的组织的坏死百分比大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)，则治疗是治疗有效的。在一些实施方案中，切除的组织的坏死百分比为100％，也就是说，活的肿瘤组织不存在或不可检测。
在本文提供的各方面的各种实施方案中，将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群或使靶细胞与免疫细胞或免疫细胞群接触可在体外或体内进行。将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群通常是指使靶细胞与免疫细胞接触和/或足够接近，使得靶细胞的抗原(例如，包含表位)(例如，膜结合的或非膜结合的抗原)可以结合至第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域的抗原结合结构域。可以通过将靶细胞与免疫细胞共培养来实现在体外将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群。靶细胞和免疫细胞可以共培养，例如作为贴壁细胞或另选地悬浮液。靶细胞和免疫细胞可以在各种合适类型的细胞培养基中共培养，例如在具有补充剂、生长因子、离子等的培养基中共培养。在一些情况中，可以通过以下来实现在体内将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群：将免疫细胞施用于受试者(例如人受试者)，以及使所述免疫细胞通过循环系统定位至靶细胞。在一些情况中，可以例如通过直接注射将免疫细胞递送至靶细胞所定位于的直接区域。
暴露或接触可以执行达任何合适的时长，例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长时间。
在本文各方面的各种实施方案中，本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统在宿主细胞(例如，免疫细胞，例如抗原特异性免疫细胞)中表达。宿主细胞可以是人细胞。宿主细胞可以是非人细胞。宿主细胞可以对于有需要的受试者是自体的或同种异体的。在一些情况中，宿主细胞可以是异种的。宿主细胞可以是免疫细胞，诸如淋巴细胞或骨髓细胞。宿主细胞可以是T细胞、B细胞、NK细胞等。在一些实施方案中，宿主细胞可以是CD3+细胞、CD3-细胞、CD5+细胞、CD5-细胞、CD7+细胞、CD7-细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD8+细胞、CD8-细胞、CD103+细胞、CD103-细胞、CD11b+细胞、CD11b-细胞、BDCA1+细胞、BDCA1-细胞、L-选择素+细胞、L-选择素-细胞、CD25+细胞、CD25-细胞、CD27+细胞、CD27-细胞、CD28+细胞、CD28-细胞、CD44+细胞、CD44-细胞、CD56+细胞、CD56-细胞、CD57+细胞、CD57-细胞、CD62L+细胞、CD62L-细胞、CD69+细胞、CD69-细胞、CD45RO+细胞、CD45RO-细胞、CD127+细胞、CD127-细胞、CD132+细胞、CD132-细胞、IL-7+细胞、IL-7-细胞、IL-15+细胞、IL-15-细胞、凝集素样受体G1阳性细胞、凝集素样受体G1阴性细胞、或它们的分化或去分化的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是对于两种或更多种因子阳性的。例如，宿主细胞可以是CD4+和CD8+。在一些实施方案中，宿主细胞可以是对于两种或更多种因子阴性的。例如，宿主细胞可以是CD25-、CD44-和CD69-。在一些实施方案中，宿主细胞可以是对于一种或多种因子阳性的，并且对于一种或多种因子阴性的。例如，细胞可以是CD4+并且CD8-。在一些实施方案中，可选择具有或不具有一种或多种给定因子的宿主细胞(例如，细胞可基于存在或不存在本文所述的一种或多种标记物而分开)。
在一些实施方案中，选定宿主细胞也可以在体外扩增。可以向有需要的受试者施用选定和/或经扩增的宿主细胞。应当理解的是，在本文公开的任何方法中使用的细胞可以是本文公开的任何细胞的混合物(例如，两种或更多种不同的细胞)。例如，组合物可包含不同细胞(例如T细胞和B细胞)的混合物。该混合物可包含例如包含CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+的干记忆TSCM细胞，干细胞还可表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并表现出干记忆细胞特有的许多功能特性。该混合物可以包括例如包含L-选择素和CCR7的中央型记忆TCM细胞，其中所述中央型记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。该混合物可以包含例如包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞，并且产生例如效应细胞因子，诸如IFNγ和IL-4。
宿主细胞可以从受试者获得。在一些情况中，宿主细胞可以是从受试者获得的T细胞、NK细胞、B细胞等的群体。T细胞可从包括PBMC、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织以及来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤在内的多种来源获得。在一些实施方案中，可以使用多种技术，诸如FicollTM分离，来从受试者收集的单位血液中获得T细胞。在一实施方案中，通过单采血液分离术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液分离术的产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过单采血液分离术收集的细胞以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以进行随后的处理步骤。
在一些实施方案中，本文所提供的免疫细胞群可为异质的。在一些实施方案中，所使用的细胞可由CD4 T细胞和CD8 T细胞的异质混合物组成。所述CD4细胞和CD8细胞可具有循环效应T细胞的表型特征。所述CD4和CD8细胞还可以具有效应记忆细胞的表型特征。在一些实施方案中，细胞可以是中央型记忆细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群，诸如但不限于T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、自然杀伤T细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。在一些情况中，细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞，诸如肿瘤浸润细胞(TIL)，诸如CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或任何其他类型的T细胞。T细胞还可以包括记忆T细胞、记忆干T细胞或效应T细胞。T细胞也可以选自大量群体，例如从全血中选择T细胞。T细胞也可从大量群体中扩增。T细胞也可偏向特定群体和表型。例如，可以使T细胞在表型上偏向包括以下：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。可以选择合适的细胞，所述合适的细胞包含选自包括以下的列表的一种或多种标记物：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。宿主细胞还包括干细胞，诸如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。宿主细胞可包含任何数量的原代细胞，诸如人细胞、非人细胞和/或小鼠细胞。宿主细胞可以是祖细胞。宿主细胞可以来源于待治疗的受试者(例如，患者)。宿主细胞可以来源于人供体。宿主细胞可以是包含CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+的干记忆TSCM细胞，所述干记忆细胞还可表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出所述干记忆细胞特有的许多功能属性。宿主细胞可以是包含L-选择素和CCR7的中央型记忆TCM细胞，所述中央型记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。宿主细胞也可以是包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞，并且产生例如效应细胞因子，诸如IFNγ和IL-4。
已经开发了许多基于病毒的系统来将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒、慢病毒和腺病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将主题系统插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。来源于逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合并且其在子代细胞中增殖。慢病毒载体与来源于肿瘤逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体相比所具有的增加的优势在于它们可以转导非增殖细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
在一个方面中，编码包含经修饰的TCR复合物和/或CAR的系统的核酸可以病毒地或非病毒地递送。可以通过直接注射、立体定向注射、脑室内地、通过微型泵输注系统、通过对流、导管，静脉内、肠胃外、腹膜内和/或皮下注射至有需要的受试者的细胞、组织或器官来施用病毒递送系统(例如，包含本公开的药物组合物的病毒)。在一些情况中，可用病毒递送系统在体外或离体转导细胞。可以将转导的细胞施用于患有疾病的受试者。例如，可以用包含药物组合物的病毒递送系统来转导干细胞，并且可以将所述干细胞植入患者体内以治疗疾病。在一些情况中，给予受试者的转导细胞剂量可以是一个单次剂量中约1×105个细胞/kg、约5×105个细胞/kg、约1×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约5×107个细胞/kg、约1×108个细胞/kg，或更多。
包装细胞系可用于生成包含本文提供的经修饰的TCR复合物和/或主题系统的病毒颗粒。包装细胞系也可以用于执行本文提供的方法。可以使用的包装细胞包括但不限于HEK 293细胞、HeLa细胞和Vero细胞等。在一些情况中，通过PEG沉淀处理包装细胞系的上清液以浓缩病毒颗粒。在其他情况中，可以使用离心步骤来浓缩病毒颗粒。例如，可以在离心期间使用柱来浓缩病毒。在一些情况中，沉淀在不超过约4℃(例如约3℃、约2℃、约1℃或约1℃)下发生至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时或至少约24小时。在一些情况中，可通过进行低速离心，之后用CsCl梯度来从PEG沉淀的上清液中分离出病毒颗粒。低速离心可以为约4000rpm、约4500rpm、约5000rpm或约6000rpm持续约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况中，通过以约5000rpm离心约30分钟，之后进行CsCl梯度，来从PEG沉淀的上清液中分离出病毒颗粒。
可以在刺激或激活步骤(例如抗CD3、抗CD28或它们的组合)后的约、大致、至少约或至多约1-3小时、3-6小时、6-9小时、9-12小时、12-15小时、15-18小时、18-21小时、21-23小时、23-26小时、26-29小时、29-31小时、31-33小时、33-35小时、35-37小时、37-39小时、39-41小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、16天、20天、或长于20天将病毒(例如，慢病毒)引入受试者细胞或受试者细胞群。在一些情况中，病毒载体编码经修饰的TCR复合物和/或系统，例如CAR-T、经修饰的TCR复合物或它们的组合。在一些情况中，病毒载体编码CAR-T。在一些情况中，病毒载体编码经修饰的TCR复合物。可以用编码CAR和经修饰的TCR复合物两者的病毒颗粒来转导免疫细胞。可以用编码CAR的病毒颗粒来转导免疫细胞。可以用编码经修饰的TCR复合物的病毒颗粒来转导免疫细胞。可以将编码经修饰的TCR复合物和/或主题系统的核酸随机插入细胞的基因组中。编码经修饰的TCR复合物和/或系统的核酸可编码其自身的启动子，或可插入其处于细胞内源性启动子控制下的位置。或者，可以将编码经修饰的TCR复合物和/或系统的核酸插入基因，诸如基因的内含子、基因的外显子、启动子或非编码区。经修饰的TCR复合物和/或系统的表达可以通过表达测定法(例如qPCR)或通过测量转导细胞中RNA的水平来验证。表达水平也可以指示拷贝数。例如，如果表达水平高，则这可以表明在细胞的基因组中整合了编码经修饰的TCR复合物和/或系统的核酸的多于一个拷贝。或者，高表达可以表明编码经修饰的TCR复合物和/或系统的核酸整合在高度转录的区域中，例如在高度表达的启动子附近。也可以通过测量蛋白质水平(诸如通过蛋白质印迹法)来验证表达。
可以通过荧光激活细胞分选(FACS)来测量主题细胞或主题群体的细胞活力。在一些情况中，在将包含编码经修饰的TCR复合物和/或主题系统的核酸的病毒或非病毒载体引入细胞或细胞群后，测量细胞活力。在一些情况中，在将病毒载体引入细胞或细胞群后，细胞群中至少约或至多约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％的细胞是有活力的。在一些情况中，细胞活力是在将病毒载体引入细胞和/或细胞群后的约、至少约或至多约4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时、或长于240小时测量的。在一些情况下，细胞活力是在将病毒载体引入细胞和/或细胞群后的约、至少约或至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、50天、60天、70天、90天、或长于90天测量的。在一些情况中，在将病毒载体引入细胞或细胞群后的约、至少约或至多约4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时、96小时、102小时、108小时、114小时、120小时、126小时、132小时、138小时、144小时、150小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时或长于240小时测量细胞毒性。
在一些实施方案中，可以通过病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、颗粒枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等来递送一种或多种编码经修饰的TCR复合物和/或包含经修饰的TCR复合物和/或CAR的系统的核酸。
在一些实施方案中，施用表达本文提供的经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞。免疫细胞可以在疾病或病症发生之前、期间或之后施用，并且施用免疫细胞的时序可以变化。例如，表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的免疫细胞可以用作预防剂，并且可以连续施用于具有病症或疾病倾向的受试者，以预防所述疾病或病症的发生。可以在症状发作期间或之后尽可能快地将免疫细胞施用于受试者。施用可以在症状发作的前48小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前6小时内、或症状发作的3小时内开始。初始施用可以使用本文所述的任何制剂，通过任何合适的途径，诸如通过本文所述的任何途径进行。切实可行的是在检测到或怀疑有疾病或病症的发作后，可以尽快施用免疫细胞达治疗所述疾病所需的时长，例如约1个月至约3个月。每个受试者的治疗时长可能会有所不同。
本文提供的包含表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的免疫细胞的组合物可以使用已知模式和技术施用于受试者。示例性模式包括但不限于静脉内注射。其他模式包括但不限于瘤内、皮内、皮下(S.C.、s.q.、sub-Q、Hypo)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。可用于制剂的肠胃外注射或输注的任何已知设备可用于实现这种施用。可以以有效治疗和/或预防特定适应症或疾病的量向受试者施用包含主题组合物的制剂。医生可以确定要使用的适当剂量。包含表达经修饰的TCR复合物和/或主题系统的免疫细胞的组合物可以独立地每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每八天、每九天、每十天、每两周、每月和每两月施用4次、3次、2次或一次。
本文提供的组合物和方法可以与包含细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂的辅助疗法组合。细胞毒性/抗肿瘤剂可以被定义为攻击和杀伤癌细胞的剂。一些细胞毒性/抗肿瘤剂可以是烷化剂，所述烷化剂可使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，为例如顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、乌拉莫司汀(uracil mustard)、chlomaphazin和达卡巴嗪。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可以是肿瘤细胞的抗代谢物，例如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可以是抗生素，例如阿霉素、博来霉素、放线菌素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。其他细胞毒性/抗肿瘤剂可以是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些有丝分裂抑制剂包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。其他细胞毒性/抗肿瘤剂包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。也可以使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物中的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化抗体和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸，以及金属蛋白酶-1和金属蛋白酶-2的组织抑制剂。(TIMP-1和TIMP-2)。也可以使用小分子，包括拓扑异构酶，诸如雷佐生，一种具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
可以联合使用的其他抗癌剂包括但不限于阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿可达佐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；安维汀；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托克星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林；米托马星；丝裂霉素C；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼氮芥；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲菌素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑羧胺核苷(tiazofurin)；替拉扎明；枸橼酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替哌；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春苷酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其他抗癌药包括但不限于：20-表-1,25-二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；二氯苯氧乙酸(amidox)；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizingmorphogenetic protein-1)；抗雄激素；前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；素克林(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀；海洋环肽(axinastatin)1；海洋环肽2；海洋环肽3；阿扎司琼；阿扎霉素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；CAR/ABL拮抗剂；苯并二氢扑酚；苯甲酰基星状孢菌素；β内酰胺衍生物；β-阿里辛(β-alethine)；贝塔克拉霉素(betaclamycin)B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈法德；双曲群A(bistratene A)；比折来新；比弗利(breflate)；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜亚胺；卡泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克力霉素(collismycin)A；克力霉素B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；康瑞宁(conagenin)；克贝西定(crambescidin)816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；克拉辛(euracin)A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；塞匹霉素(cypemycin)；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；迪多(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢泰素；二氧杂霉菌素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；廿二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；度卡霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法曲唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；夫阿斯通(fluasterone)；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；海素吩(hepsulfam)；调节蛋白；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘代多柔比星；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；异邦格唑(isobengazole)；异高软海绵素B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼；加斯普拉诺利得(jasplakinolide)；卡哈拉里德F(kahalalide F)；三乙酸片螺素-N；兰瑞肽；雷那霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；雷波斯他汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；利克酰胺7(lissoclinamide 7)；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；德克萨斯卟啉镏(lutetium texaphyrin)；利索灵(lysofylline)；溶解肽；美坦新；曼诺他汀A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙(merbarone)；阿伏瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普安；MIF抑制剂；米非司酮；米替福星；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多药耐药性基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的疗法；氮芥抗癌剂；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；迈普隆(myriaporone)；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；那法利奇(nagrestip)；纳洛酮+喷他佐辛；纳帕吩(napavin)；纳帕平(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；尼萨霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；尼舒林(nitrullyn)；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥康斯恩(okicenone)；寡核苷酸；奥纳司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉辛(oracin)；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；奥沙霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺(palauamine)；棕榈酰根霉素；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副细菌素(parabactin)；泊泽尼普定；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他丁；喷曲唑；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；吩肼霉素(phenazinomycin)；苯乙酸酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；普西汀(placetin)A；普西汀B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆基化血红蛋白聚氧化乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII异维A酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；罗比酮(rubiginone)B1；罗比西(ruboxyl)；沙芬戈；沙脱平(saintopin)；SarCNU；肌植醇A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；索菲醇(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵抑素1(spongistatin 1)；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；史比酰胺胺(stipiamide)；溶基质蛋白酶抑制剂；舒活辛(sulfinosine)；强效血管活性肠肽拮抗剂；色地塔(suradista)；苏拉明；苦马豆素；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；它莫西芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；特弗林(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；特索明(tetrazomine)；菌体胚素；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基初紫红素锡；替拉扎明；二氯化二茂钛；妥生汀(topsentin)；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维A酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；瓦洛林B(variolin B)；红细胞基因疗法载体系统；维拉雷琐；藜芦胺；菲啶(verdins)；维替泊芬；长春瑞宾；威科萨汀(vinxaltine)；整合蛋白抗体(vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；和净司他丁斯酯。
包含本文提供的任何经修饰的TCR复合物和/或系统的免疫细胞可以与任何数量的相关治疗方式(包括但不限于用诸如抗病毒疗法、西多福韦和白介素-2或阿糖胞苷(也称为ARA-C)的剂进行治疗)联合(例如在所述相关治疗方式之前、同时或之后)施用于受试者。在一些情况中，主题免疫细胞可与化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消融剂(诸如CAMPATH、抗CD3抗体)或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸(mycoplienolic acid)、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射联合使用。经工程化的细胞组合物还可以与骨髓移植、使用任何化学治疗剂(诸如氟达拉滨)的T细胞消融疗法、外部射束放射疗法(XRT)、环磷酰胺、或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)联合(例如，在其之前、同时或之后)施用于患者。在一些情况中，可以在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗)后施用主题免疫细胞组合物。例如，受试者可以经历用高剂量化学疗法进行标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植之后，受试者可以接受免疫细胞(例如，包含经修饰的TCR复合物和/或主题系统的经扩增的免疫细胞)的输注。另外，可以在手术之前或之后施用经扩增的免疫细胞。
在一些情况中，例如，在用于治疗癌症的组合物、制剂和方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。在一些情况中，所施用的组合物或制剂的总量可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100g。
实施例
下面的实施例仅旨在为本发明的实例，并且因此不应被视为以任何方式限制本发明。通过举例而非限制的方式提供以下实施例和详细描述。
通过以下非限制性实施例进一步说明本公开的各个方面。
实施例1：抗BCMA sdAb的产生
免疫
根据所有现行动物福利法规用重组BCMA ECD蛋白(ACRO Biosystems，目录号：BCA-H522y，SEQ ID NO：1)对两匹骆驼进行免疫。为了进行免疫，将抗原配制为具有CFA(初次免疫)或IFA(加强免疫)的乳液。通过在颈部双点注射而肌内施用抗原。以每周间隔使每只动物接受两次含有100μg的BCMA ECD的乳剂的注射，以及随后的4次含有50μg抗原的注射。在免疫期间的不同时间点，从动物收集10ml血液样品并制备血清。在使用固定化的BCMAECD蛋白的基于ELISA的实验中，使用血清样品验证抗原特异性体液免疫应答的诱导。在最后一次免疫后五天，从每只动物中收集150ml血液样品。使用Ficoll-Paque梯度(AmershamBiosciences)从300ml血液样品中分离出外周血淋巴细胞(PBL)作为骆驼重链免疫球蛋白(HCAb)遗传来源，从而得到约1×109个PBL。抗体的最大多样性预计等于所采样的B淋巴细胞的数量，其为PBL数量的约10％(1×108)。骆驼中重链抗体的分数为B淋巴细胞数量的至多20％。因此，估计300ml血液样品中HCAb的最大多样性为约2×107个不同分子。
文库构建
将从PBL中提取的RNA用作RT-PCR的起始材料，以扩增编码sdAb的基因片段。将这些片段克隆到自制(in-house)噬菌粒载体中。在具有sdAb编码序列的框中，载体还编码C末端(His)6标签。文库大小大于1×109。根据标准方案制备文库噬菌体，并将其在过滤器灭菌后于4℃保存以备将来使用。
结合剂分离和高通量筛选
使用固相淘选以及基于细胞的淘选，用上述文库分离结合剂。在这两种情况下均执行一轮淘选。分析每个选择输出的总输出克隆数、BCMA阳性克隆百分比(通过ELISA)和BCMA特异性结合剂的序列多样性。基于这些参数，选择最佳淘选输出来进行高通量筛选。为此，使用选定的输出噬菌体来感染指数生长的大肠杆菌(E.coli)细胞。提取输出的双链DNA库，从噬菌粒载体切出sdAb插入物，并插入到可溶性表达载体中以进行高通量筛选。在具有sdAb编码序列的框中，载体还编码C末端(His)6标签。挑取菌落并使其在含有1ml 2YT培养基的96深孔板中生长。通过在上清液中添加1mM IPTG诱导sdAb的表达。
通过ELISA分析上清液中的sdAb结合BCMA ECD蛋白的能力，以及通过FACS分析其结合BCMA稳定细胞系的能力。对所有结合剂进行测序，并对一些结合剂进行进一步表征，所述进一步表征包括通过在BIAcore T200仪器上进行表面等离振子共振(SPR)来对亲和力进行排名。实验如下进行：通过亲和标签将粗sdAb蛋白捕获到传感器芯片(sensorchip)上。捕获的抗体量取决于上清液中粗蛋白的浓度。使高浓度(100nM)的抗原蛋白，即His标记的人BCMA(ACRO Biosystems，目录号：BCA-H522y)和Fc融合的食蟹猴BCMA(ACRO Biosystems，目录号：BCA-C5253，SEQ ID NO:2)流过传感器芯片表面，并使它们与sdAb结合。将缔合速率(kon)和解离速率(koff)基于抗原浓度为100nM时的缔合和解离粗略地计算，并用于估计平衡解离常数(KD)。
Figure BDA0002836582790001001
实施例2：病毒转染和病毒颗粒生成
为了生成包含编码本文公开的任何系统的多核酸的病毒颗粒，将包含pMDLg/pRRE(Addgene编号12251)、pRSV-Rev(Addgene编号12253)和pMD2.G(Addgene编号12259)的慢病毒包装质粒混合物以预优化的比率与PLVX-EF1A(包括靶标系统)载体以及聚醚酰亚胺(PEI)适当地预先混合，并在室温下孵育5分钟。将转染混合物滴加到293-T细胞中，然后与所述细胞轻轻混合。将转染的293-T细胞在37℃和5％CO2下孵育过夜。在转染后24小时，收集上清液，并在4℃、500g下离心10分钟以去除任何细胞碎片，之后进行超速离心步骤。在超速离心后，将经离心的上清液滤过0.45μm的PES过滤器，以浓缩病毒上清液。在离心后，小心弃去上清液，并用预冷的DPBS冲洗病毒沉淀。测量病毒的浓度。将病毒等分并将储存在-80℃下。通过在T细胞系上的功能转导来测定病毒滴度。
简而言之，通过用人延伸因子1α启动子(hEF1α)替换原始启动子并通过GenScript用EcoRI和BamHI去除嘌呤霉素抗性基因，而使用pLVX-Puro(Clontech编号632164)修饰慢病毒载体。
使PLVX-EF1A进一步经受如上所述的慢病毒包装工序。
实施例3：免疫细胞制备
将白细胞收集在R10培养基中，然后以1:1(v/v)的比率与0.9％NaCl溶液混合。将3mL lymphoprep培养基(lymphoprep medium)加入到15mL离心管中。Lymphoprep培养基缓慢分层以形成6mL稀释的淋巴细胞混合物。将所述淋巴细胞混合物在20℃下在无减速(brake)的情况下以800g离心30分钟。然后用200μL移液管收集淋巴细胞血沉棕黄层(buffycoat)。将收获的级分用0.9％NaCl或R10稀释至少6倍，以降低溶液的密度。然后将收获的级分在20℃下以250g离心10分钟。完全吸出上清液，然后向细胞沉淀中加入10mL R10。将混合物在20℃下以250g进一步离心10分钟。然后吸出上清液。将含有100IU/mL IL-2的2mL预热到37℃的R10加入细胞沉淀，然后将细胞沉淀轻轻重悬。对细胞进行定量，并且PBMC样品准备好用于实验。使用Miltenyi Pan T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)从PBMC中纯化人T细胞。
随后，通过每两个细胞使用一个负载的抗生物素MACSiBead颗粒(珠粒与细胞的比率为1:2)，用人T细胞激活/扩增试剂盒(Milteny编号130-091-441)将准备的T细胞预激活48小时。
实施例4：T细胞转染
收集预激活的T细胞，并将其悬浮并重悬于含有300IU/mL IL-2的1640培养基中。用相同培养基将编码该系统的慢病毒载体稀释至MOI＝5，并用1E+06激活的T细胞进行感染。通过在32℃下以1000g离心1小时，在8μg/ml聚凝胺存在下用慢病毒原种转导预激活的T细胞。然后将转导的细胞转移至细胞培养箱中以在合适的条件下进行表达基因。在第二天，将转导的细胞离心并更换新鲜培养基，每2天测量一次细胞浓度，并添加新鲜培养基以继续扩增。
实施例5：受体表达的定量
在转导后第3天及以后(通常第3天至第8天)，通过流式细胞术评估细胞对所述系统的表达。从培养物中收集细胞的等分试样，洗涤，沉淀，并在补充有0.5％FBS和稀释的结合抗体或抗原蛋白1/100的100ul PBS中重悬。将细胞在约100ul的Ab中重悬。将细胞在4℃下孵育30分钟。还根据制造商的使用说明添加了活力染料eFluor780或SYTOX Blue活力染色剂。在孵育后，将细胞在PBS中洗涤两次，并在100至200ul PBS中重悬以用于进行分析。通过流式细胞术对系统的平均荧光进行定量。
对于抗BCMA染色，将细胞用多克隆生物素标记的山羊抗人BCMA抗体(R&D，目录号BAF 193)染色，之后用链霉亲和素(BD)染色。通过使用FlowJo(Tree Star,Inc.)执行所有实验的流式细胞术分析。
实施例6：细胞毒性测定
εTCR平台上的BCMA抗体筛选
将抗BCMA抗体(BCMA1-12)单独与ε-TCR融合，以评估对RPMI-8226细胞的细胞毒性作用。在转导后第3天或第6天，将效应细胞以不同的效应子与靶标比率(0.5:1、1.5:1和3:1)在37℃下在96孔板中共培养20小时。其他孔含有仅测定缓冲液(1640无酚红培养基加2％hiFBS)、仅靶细胞(T)、仅效应细胞(E)和靶细胞的最大释放(使用triton-X 100的1％溶液的靶细胞)。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果表明，表达不同BCMA sdAb的效应细胞具有不同的细胞杀伤作用，如BCMA 1、BCMA 2、BCMA 5、BCMA 6、BCMA 8、BCMA 9和BCMA 12等抗体表现出更好的细胞杀伤作用，如在图8A、图8B和图8C中所看出的。
通过HTRF测定IFN-γ表达，如在图8D、图8E和图8F中所看出的。在测定中使用384孔低体积的白色板来进行IFN-γ检测(人IFNγ试剂盒，Gisbio)。细胞毒性测定中分泌的IFN-γ的量显示出与细胞杀伤效应相似的趋势。
多组分系统
在20小时共培养测定中确定抗BCMA3-ε-TCR(BCMA3 eTCR)、抗BCMA2-ε-TCR(BCMA2eTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3-εTCR(串联BCMA2&3 eTCR)和抗BCMA1-抗BCMA2-抗BCMA3-γTCR(串联BCMA 1&2&3gTCR)以及对照未转导的细胞的细胞毒性，其中将RPMI-8226细胞(BCMA+)以0.33:1的效应子与靶细胞比率(E:T)共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与单抗体融合的eTCR相比，TCR亚基上的串联BCMA抗体提供了显著更好的细胞杀伤效应，表明TCR上的串联BCMA抗体是用于细胞杀伤效应的更好选择(如图9所示)。
在20小时共培养测定中确定抗BCMA1-抗BCMA2-抗BCMA3ε-TCR(串联BCMA 1-2-3eTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3ε-TCR(串联BCMA 2-3 eTCR)、抗BCMA4-抗BCMA5ε-TCR(串联BCMA4-5 eTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3-抗BCMA4ε-TCR(串联BCMA 2-3-4 eTCR)、抗BCMA1-抗BCMA4-抗BCMA5ε-TCR(串联BCMA 1-4-5 eTCR)以及对照未转导的细胞的细胞毒性，其中将CHO/BCMA/CD19细胞(BCMA+CD19+)以0.5:1和1.5:1的效应子与靶细胞比率(E:T)共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，具有五种组合串联连接到eTCR的选定BCMA抗体的构建体均具有优异的体外细胞杀伤效应(如图10所示)。
在20小时共培养测定中确定抗BCMA1ε-TCR(BCMA1 eTCR)、抗BCMA1 4-1BB-CD3ζ-CAR(BCMA1 BBzCAR)、抗CD19ε-TCR(CD19 eTCR)和抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19eTCR)以及未转导的对照免疫细胞的细胞毒性。在实验中，离心收集效应细胞，然后用补充有2％热灭活的FBS(Invitrogen)的1640无酚红培养基(Invitrogen)稀释至所需浓度。靶细胞NCI-H929表现出靶抗原BCMA的强表达。将效应细胞以不同的效应子与靶标比率(E:T＝5:1和10:1)在37℃下于96孔板中共培养20小时。其他孔含有仅测定缓冲液(1640无酚红培养基加2％hiFBS)、仅靶细胞(T)、仅效应细胞(E)和靶细胞的最大释放(使用triton-X 100的1％溶液的靶细胞)。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与未转导的细胞对照和CD19 eTCR相比，表达BCMA结合结构域(例如，抗BCMA1)的效应细胞，诸如BCMA1 eTCR、BCMA1 BBzCAR和串联BCMA1/CD19 eTCR具有更大的细胞杀伤活性。与BCMA1 eTCR或BCMA1 BBzCAR相比，串联BCMA1/CD19 eTCR显示出更大的细胞杀伤活性(如图11A所示，转染后第11天)。
如图11B所示，通过HTRF测定IFN-γ的表达。在测定中使用384孔低体积的白色板来进行IFN-γ检测(人IFNγ试剂盒，Gisbio)。
在第二多组分细胞毒性测定中，将抗BCMA1-ε-TCR(BCMA1 eTCR)、抗BCMA1-4-1BB-CD3ζ-CAR(BCMA1 BBzCAR)、抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 BBzCAR)、抗CD19-εTCR(CD19eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)和抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)以及对照未转导的细胞与CHO-BCMA-CD19细胞(BCMA+和CD19+)以5:1、10:1和20:1的效应子与靶细胞比率共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果表明，与未转导的对照细胞相比，E:T比率为20:1的抗BCMA和/或抗CD-19系统：抗BCMA1ε-TCR(BCMA eTCR)、抗BCMA1-4-1BB-CD3ζ-CAR(BCMA BBzCAR)、抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 BBzCAR)、抗CD19-εTCR(CD19 eTCR)、抗CD19-εTCR-抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA BBzCAR)、抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA eTCR/CD19BBzCAR)具有更大的细胞杀伤活性。与单抗体融合的CAR或TCR相比，当在较低的E:T比(尤其是5:1)时，抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA BBzCAR)、抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA eTCR/CD19 BBzCAR)显示出更大的细胞杀伤活性(如图12A所示)。
如图12B所示，通过HTRF测定IFN-γ的表达。在测定中使用384孔低体积的白色板来进行IFN-γ检测(人IFNγ试剂盒，Gisbio)。
在第三多组分细胞毒性测定中，将抗CD19ε-TCR(CD19 eTCR)、抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1 dTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)和抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)以及对照未转导的细胞与CHO-BCMA-CD19细胞(BCMA+和CD19+)以10:1和5:1的效应子与靶细胞比率共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(MolecularDevices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与未转导的对照细胞相比，抗BCMA和抗CD19系统：抗CD19ε-TCR(CD19eTCR)、抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19eTCR/BCMA1 dTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)、抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)具有抗肿瘤活性。在较高的E:T比(10:1)下，抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19 eTCR)、抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)表现出大于抗CD19ε-TCR(CD19eTCR)和抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1 dTCR)的相似细胞杀伤活性。在较低的E:T比(5:1)下，抗CD19ε-TCR(CD19 eTCR)和抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1 dTCR)显示几乎没有细胞杀伤活性，而抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19 eTCR)、抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)仍显示出细胞杀伤效应并且裂解约40％的靶细胞(如图13A所示)。
在第四多组分细胞毒性测定中，将抗BCMA和/或抗CD19系统：抗BCMA1-εTCR(BCMA1eTCR)、抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 BBzCAR)、抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)、抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)与NCI-H929细胞(BCMA+)以2.5:1和5:1的效应子与靶细胞比率共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与未转导的对照相比，抗BCMA和抗CD19系统：抗BCMA1-εTCR(BCMA1eTCR)、抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 BBzCAR)、抗BCMA1-抗CD19-εTCR(串联BCMA1/CD19eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)、抗BCMA1-εTCR/抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA1 eTCR/CD19 BBzCAR)具有更大的细胞杀伤活性(如图13B所示)。
在第五多组分细胞毒性测定中，将抗BCMA和抗CD19系统：抗BCMA1ε-TCR(BCMA1eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-γTCR(CD19 eTCR/BCMA1 gTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1 dTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1BBzCAR)以及未转导的对照细胞与CHO-BCMA-CD19细胞(BCMA+CD19+)以1.3:1的效应子与靶细胞比率共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与未转导的对照相比，抗BCMA1ε-TCR(BCMA1 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-γTCR(CD19 eTCR/BCMA1 gTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1dTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)具有更大的细胞杀伤活性。与抗BCMA1ε-TCR(BCMA1 eTCR)相比，抗CD19-εTCR/抗BCMA1-γTCR(CD19 eTCR/BCMA1 gTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1 dTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)具有更大的细胞杀伤活性。与抗CD19-εTCR/抗BCMA1-γTCR(CD19 eTCR/BCMA1 gTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-δTCR(CD19 eTCR/BCMA1 dTCR)相比，抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)具有更大的细胞杀伤活性(如图14A所示)。图14B和图14C的结果显示，在共培养系统中从T细胞分泌的IFNγ和TNFα的量具有与细胞杀伤效应相似的趋势。
在第六多组分细胞毒性测定中，将抗BCMA和抗CD19系统：抗BCMA1ε-TCR(BCMA1eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)、抗BCMA1和抗CD19-ε-TCR(串联BCMA1/CD19 dTCR)以及对照未转导的细胞与CHO-BCMA-CD19细胞(BCMA+和CD19+)以1.3:1的效应子与靶细胞比率共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与未转导的对照相比，抗BCMA1ε-TCR(BCMA1 eTCR)、抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)和抗BCMA1-抗CD19-ε-TCR(串联BCMA1/CD19 dTCR)具有更大的细胞杀伤活性。与抗BCMA1ε-TCR(BCMA1 eTCR)相比，抗CD19-εTCR/抗BCMA1-4-1BB-CD3ζCAR(CD19 eTCR/BCMA1 BBzCAR)和抗BCMA1-抗CD19-ε-TCR(串联BCMA1/CD19 dTCR)具有更大的细胞杀伤活性(如图15A所示)。图15B和图15C的结果显示，在共培养系统中从T细胞分泌的IFNγ和TNFα的量具有与细胞杀伤效应相似的趋势。
在第七多组分细胞毒性测定中，将抗BCMA系统：抗BCMA2ε-TCR(BCMA eTCR)、抗BCMA2-εTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 eTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-γTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 gTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-δTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 dTCR/BCMA3 BBzCAR)以及对照未转导的细胞与RPMI-8226细胞(BCMA+)以0.5:1的效应子与靶细胞比率共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，并将上清液收集到新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与未转导的对照相比，抗BCMA2ε-TCR(BCMA2 eTCR)、抗BCMA2-εTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 eTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-γTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 gTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-δTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 dTCR/BCMA3 BBzCAR)具有更大的细胞杀伤活性。与抗BCMA2ε-TCR(BCMA2 eTCR)相比，抗BCMA2-εTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 eTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-γTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2 gTCR/BCMA3 BBzCAR)、抗BCMA2-δTCR/抗BCMA3-4-1BB-CD3ζCAR(BCMA2dTCR/BCMA3 BBzCAR)具有显著更大的细胞杀伤活性，如图16A所示。图16B示出了在共培养系统中从T细胞分泌的IFNγ的量。
在第八多组分细胞毒性测定中，将抗BCMA系统：抗BCMA2-抗BCMA3ε-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR(串联BCMA2&3 eTCR/gTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3 4-1BB-CD3ζCAR(串联BCMA2&3 gTCR/BBzCAR)以及对照未转导的细胞与RPMI-8226细胞(BCMA+)以0.33:1的效应子与靶细胞比率共培养。每种条件以一式三份执行，并通过LDH测定试剂盒(Roche)检测效应细胞的细胞毒性。在共培养20小时后，将测定板离心，收集上清液并转移至新的96孔板中。根据制造商的手册，用等体积的LDH测定试剂稀释上清液板。将测定板在15℃至25℃下孵育约30分钟。使用Flexstation读取器(Molecular Devices)测量板在492nm和650nm处的吸光度，并进行计算。
结果显示，与未转导的对照相比，抗BCMA2-抗BCMA3ε-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR(串联BCMA2&3 eTCR/gTCR)、抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3 4-1BB-CD3ζCAR(串联BCMA2&3 gTCR/BBzCAR)具有更大的细胞杀伤活性。与抗BCMA2-抗BCMA3ε-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR(串联BCMA2&3 eTCR/gTCR)相比，抗BCMA2-抗BCMA3γ-TCR/抗BCMA2-抗BCMA3 4-1BB-CD3ζCAR(串联BCMA2&3 gTCR/BBzCAR)具有明显更大的细胞杀伤活性，如图17A所示。图17B示出了在共培养系统中从T细胞分泌的IFNγ的量。
实施例7：细胞毒性测定(荧光素酶测定)
为了评估表达本文提供的任何系统的经修饰的免疫细胞的细胞毒性，将CAR-T细胞、TCR-T细胞和未转染的T细胞(UnT)离心收集并利用补充有2％热灭活的FBS(Invitrogen)的1640无酚红培养基(Invitrogen)稀释至所需浓度。将表现出BCMA和荧光素酶的强表达的肿瘤细胞用作靶细胞。将TCR-T细胞或CAR-T细胞与靶细胞以不同的效应子与靶标比率(E:T)在37℃下在96孔板中共培养20小时。其他孔包含对照条件：仅靶细胞(T)和靶细胞的最大释放(triton-X 100的1％溶液)。每种条件以一式三份执行，并使用One-Glo测定试剂盒(Promega)检测CAR-T细胞的细胞毒性。
在共培养20小时后，将测定板离心，并根据制造商的使用说明添加等体积的One-Glo测定试剂。将该板在室温下孵育约3分钟。孵育后，使用PheraStarplus读取器(BMGlabtech)测量荧光素酶信号。使用以下公式计算肿瘤细胞裂解的百分比：
靶细胞裂解％＝(1-(RLUE:T-RLUMax释放)/(RLUT-RLUMax释放))*100。
实施例8：细胞因子释放检测(IFNγ&TNFα)
收集细胞毒性测定板的上清液以进行细胞因子释放分析(人IFNγ试剂盒，Cisbio，目录号62HIFNGPEH；人TNFα试剂盒，Cisbio，目录号62HTNFAPEH)；人IL6试剂盒，Cisbio，目录号62HIL06PEG，以及人IL2试剂盒，Cisbio，目录号62HIL02PEH)。将细胞上清液和标准品直接分配到测定板中，以利用
Figure BDA0002836582790001111
试剂进行细胞因子检测。将用HTRF供体和受体标记的抗体预先混合，并在单个分配步骤中添加。使用4参数Logistic(4PL)曲线生成HTRF标准曲线。与线性分析相比，标准曲线回归使得能够在更宽的浓度范围内准确测量未知样品的浓度，从而使标准曲线回归适用于分析生物系统，诸如细胞因子释放。适用的测定试剂盒包括人IFNγ试剂盒，Cisbio，目录号62HIFNGPEH；人TNFα试剂盒，Cisbio，目录号62HTNFAPEH；人IL6试剂盒，Cisbio，目录号62HIL06PEG；和人IL2试剂盒，Cisbio，目录号62HIL02PEH。
实施例9：体内功效
通过多发性骨髓瘤肿瘤异种移植进行的BCMA CAR-TCR-T的体内功效
在具有多发性骨髓瘤肿瘤异种移植物的NCG小鼠模型(NOD_Prkdcem26Cd52/NjuCrl)中评估CAR-TCR-T细胞的体内抗肿瘤功效。
NCG小鼠模型是通过对NOD/Nju小鼠中的Prkdc和I12rg基因座进行顺序CRISPR/Cas9编辑，从而提供与NOD/Nju同源的小鼠而生成的。NOD/Nju小鼠在Sirpa(SIRPα)基因中携带允许移植外来造血干细胞的突变。Prkdc基因敲除生成缺乏适当的T细胞和B细胞形成的SCID样表型。I12rg基因的敲除进一步加剧了SCID样表型，同时另外导致NK细胞产生的减少。因此，NCG小鼠是一种“三重免疫缺陷”小鼠品系，其比包括SCID小鼠和裸小鼠在内的常用免疫缺陷小鼠品系更免疫受损。Prkdc和Il2rg是影响T细胞、B细胞、NK细胞的成熟和形成并且较小程度地影响树突细胞的成熟和形成的基因的SCID(严重联合免疫缺陷)家族的一部分。Prkdc编码DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基，该DNA依赖性蛋白激酶是V(D)J重组所必需的，V(D)J重组是在成熟的T细胞和B细胞中传播抗体多样性的必要过程。Il2rg编码在IL-2受体和多种IL受体(IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21)中发现的常见γ亚基，这些受体是诱导用于未成熟淋巴细胞(例如T细胞、B细胞和NK细胞)和其他白细胞的成熟的细胞因子介导的信号传导所必需的。使用来自各种供体的T细胞来制备BCMA CAR-T细胞，以筛选T细胞源，从而产生具有最高的体外杀伤RPMI8226-Luc细胞的功效的CAR-T。使用选定供体的T细胞制备CAR-T细胞，以用于体内动物测定。为了产生肿瘤异种移植物，向NCG小鼠静脉内注射RPMI8226-Luc细胞。在十四天后，用BCMA CAR-T细胞(1.5e5阳性细胞)或未转导的T细胞治疗经肿瘤移植的小鼠，之后进行体内生物发光成像(BLI)。
在具有多发性骨髓瘤肿瘤异种移植物的NCG小鼠模型(NOD_Prkdcem26Cd52/NjuCrl)中评估抗BCMA1-抗BCMA2-抗BCMA3 BBzCAR(三重特异性BCMA CAR-T)细胞、抗BCMA1-抗BCMA2-抗BCMA3 eTCR(三重特异性BCMA TCR-T)细胞和抗BCMA2 eTCR/抗BCMA1-抗BCMA3BBzCAR(三重特异性BCMA CAR-TCR-T)细胞。抗BCMA2 eTCR/抗BCMA1-抗BCMA3 BBzCAR(三重特异性BCMA CAR-TCR-T)在低剂量下显示出很大的抗肿瘤活性，如图18所示。
通过NSG小鼠中的OVCAR-8异种移植模型获得MSLN FSHR CAR-TCR-T的体内功效
在OVCAR-8异种移植模型中，体内评定抗间皮素CAR-T的抗肿瘤活性。在第0天将10×106个OVCAR-8细胞皮下植入NOD scidγ(NSG)小鼠中。一旦肿瘤为150-200mm3，就将小鼠随机分入治疗组。以200μl剂量静脉内施用1e5 CAR阳性T细胞。在肿瘤细胞植入后监测小鼠和肿瘤约60天。
结果显示，抗MSLN/FSHR双CAR-T(MSLN CAR+FSHR CAR)、抗MSLN/FSHR双eTCR-T(MSLN eTCR+FSHR eTCR)和抗FSHR eTCR/MSLN CAR-T(FSHR eTCR+MSLN CAR)具有不同的体内抗肿瘤活性，并且在低剂量时，与抗MSLN/FSHR双CAR-T(MSLN CAR+FSHR CAR)、抗MSLN/FSHR双eTCR-T(MSLN eTCR+FSHR eTCR)相比，抗FSHR eTCR/MSLN CAR-T(FSHR eTCR+MSLNCAR)显示出更大的抗肿瘤活性(如图19所示)。
实施例10：快速扩增方案
为了产生大量转导的细胞，通过使用快速扩增方案(REP)来诱导T细胞增殖。在用于REP中之前，在开始时先将T细胞与抗CD3、抗CD28和IL-2一起培养，并在第二天进行转导。将细胞在75cm2烧瓶中于37℃和5％CO2下培养。每两天对细胞进行计数并以0.5×106个细胞/mL的浓度在补充有300IU/mL IL-2的新鲜T细胞培养基中悬浮，并且在剩余时间中，细胞将被保持在培养中。
多种抗原结合结构域序列可用于构建本文公开的载体构建体和系统，参见例如WO2017/025038，该专利的全部内容以引用方式并入本文(BCMA2至BCMA4，BCMA 14至BCMA21)。
非限制性示例性序列在如下表10和表11中示出：
表10示例性序列
Figure BDA0002836582790001131
Figure BDA0002836582790001141
Figure BDA0002836582790001151
Figure BDA0002836582790001161
Figure BDA0002836582790001171
Figure BDA0002836582790001181
表11抗CD19 VHH的序列
Figure BDA0002836582790001182
表12抗MSLN scFv和FSHβ33-53的序列
Figure BDA0002836582790001183
Figure BDA0002836582790001191
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅为通过举例方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解的是，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (124)

1.一种诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的系统，所述系统包含：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含表现出与第一表位特异性结合的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含表现出与第二表位特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域连接至：
(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，
(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或者
(iii)CD3ζ链。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合和/或所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
3.如权利要求1所述的系统，其中两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；(iii)CD3ζ链，并且其中所述两个或更多个抗原结合结构域与它们相应的表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的免疫细胞活性。
4.如权利要求2或3所述的系统，其中所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
5.如权利要求1所述的系统，其中所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，所述细胞毒性与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比得到增强。
6.如权利要求1所述的系统，其中与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性的持久性。
7.如权利要求3所述的系统，其中当所述系统在受试者的免疫细胞中表达时，与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合相比，所述两个或更多个抗原结合结构域与它们相应的表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性的持久性。
8.如权利要求1所述的系统，其中所述经修饰的TCR包含第三抗原结合结构域，所述第三抗原结合结构域连接至：
(i)所述第二抗原结合结构域，
(ii)所述至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，
(iii)所述分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或者
(iv)所述CD3ζ链。
9.如权利要求1所述的系统，其中所述CAR包含一个或多个另外的抗原结合结构域。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述一个或多个另外的抗原结合结构域表现出与一个或多个另外的表位的特异性结合。
11.如权利要求10所述的系统，其中所述一个或多个另外的表位与所述第一表位或所述第二表位相同。
12.如权利要求10所述的系统，其中所述一个或多个另外的表位与所述第一表位和所述第二表位不同。
13.如权利要求9所述的系统，其中所述一个或多个另外的抗原结合结构域和所述第一抗原结合结构域串联连接。
14.如权利要求1所述的系统，其中所述CAR的所述细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
15.如权利要求1所述的系统，其中所述CAR的所述细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
16.如权利要求1所述的系统，其中所述CAR的所述细胞内信号传导结构域包括Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70的信号传导结构域。
17.如权利要求16所述的系统，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的信号传导结构域。
18.如权利要求1所述的系统，其中所述CAR还包含共刺激结构域。
19.如权利要求18所述的系统，其中所述共刺激结构域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体的信号传导结构域。
20.如权利要求18所述的系统，其中所述共刺激结构域包括选自以下的分子的信号传导结构域：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF-R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLP R、VLA1和VLA-6。
21.如权利要求1所述的系统，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、微型抗体、双抗体、单结构域抗体、骆驼科动物抗体的轻链可变结构域(VL)或可变结构域(VHH)。
22.如权利要求1所述的系统，其中所述抗原结合结构域中的至少一者包含受体。
23.如权利要求1所述的系统，其中所述抗原结合结构域中的至少一者包含受体的配体。
24.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和所述第二表位存在于不同的抗原上。
25.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和所述第二表位存在于共同的抗原上。
26.如权利要求1或10所述的系统，其中至少一个表位存在于一个或多个细胞表面抗原上。
27.如权利要求26所述的系统，其中所述一种或多种细胞表面抗原是肿瘤相关抗原、酪氨酸激酶受体、丝氨酸激酶受体和G蛋白偶联受体。
28.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于通用抗原上。
29.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于新抗原上。
30.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位是新表位。
31.如权利要求1所述的系统，其中所述第一表位和/或所述第二表位存在于肿瘤相关抗原上。
32.如权利要求31所述的系统，其中所述肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：707-AP、生物素化的分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、BCMA、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-ablp190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CA-125、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD4、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CD70、CD123、CD133、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、CLL-1、CTAG1B、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FAP、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、FR-α、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、GPC3、GPC-2、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、L1-CAM、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、生存素、生存素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFαRII、TGFβRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ轻链。
33.如权利要求1或10所述的系统，其中至少一个表位存在于免疫检查点受体或免疫检查点受体配体上。
34.如权利要求33所述的系统，其中所述免疫检查点受体或免疫检查点受体配体是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、TIGIT、BLTA、CD47或CD40。
35.如权利要求1或10所述的系统，其中至少一个表位存在于细胞因子或细胞因子受体上。
36.如权利要求35所述的系统，其中所述细胞因子或细胞因子受体是CCR2b、CXCR2(CXCL1受体)、CCR4(CCL17受体)、Gro-a、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、乙酰肝素酶、CD137L、LEM、Bcl-2、CCL17、CCL19或CCL2。
37.如权利要求1或10所述的系统，其中至少一个表位存在于由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原上。
38.如权利要求37所述的系统，其中所述MHC是HLA 1类。
39.如权利要求37所述的系统，其中所述MHC是HLA 2类。
40.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞表达如权利要求1至39中任一项所述的系统。
41.如权利要求40所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是免疫细胞。
42.如权利要求41所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
43.如权利要求42所述的宿主细胞，其中所述淋巴细胞是T细胞。
44.如权利要求42所述的宿主细胞，其中所述淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。
45.如权利要求43所述的宿主细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
46.如权利要求43所述的宿主细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
47.如权利要求42所述的宿主细胞，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
48.如权利要求40至47中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表现出与同时存在于靶细胞中的两种抗原的特异性结合。
49.一种抗原特异性免疫细胞，所述抗原特异性免疫细胞包含至少两个外源引入的抗原结合结构域，所述至少两个外源引入的抗原结合结构域中的一个连接至T细胞受体(TCR)复合物，另一个连接至嵌合抗原受体(CAR)，其中所述免疫细胞与表达由所述至少两个外源引入的抗原结合结构域识别的一种或多种抗原的靶细胞特异性结合。
50.如权利要求49所述的免疫细胞，其中连接至所述CAR的所述抗原结合结构域主要介导所述免疫细胞与所述靶细胞之间的相互作用，并且当所述免疫细胞与所述靶细胞之间的所述相互作用发生时，连接至所述TCR复合物的所述抗原结合结构域主要介导免疫细胞活性。
51.如权利要求50所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
52.如权利要求49至51中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
53.如权利要求52所述的免疫细胞，其中所述淋巴细胞是T细胞。
54.如权利要求52所述的免疫细胞，其中所述淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。
55.如权利要求53所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
56.如权利要求49所述的免疫细胞，两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；(iii)CD3ζ链。
57.如权利要求52所述的免疫细胞，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
58.一种免疫细胞群，单个免疫细胞表达如权利要求1至39中任一项所述的系统，其中所述免疫细胞群的特征在于：在将所述免疫细胞群暴露于受试者中的靶细胞群后，所述免疫细胞群约在2天内诱导所述靶细胞的至少5％的死亡。
59.如权利要求58所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞群包括至多约1011个细胞。
60.如权利要求58所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞包括淋巴细胞。
61.如权利要求60所述的免疫细胞群，其中所述淋巴细胞是T细胞。
62.如权利要求60所述的免疫细胞群，其中所述淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。
63.如权利要求61所述的免疫细胞群，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
64.如权利要求61所述的免疫细胞群，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
65.如权利要求60所述的免疫细胞群，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
66.一种诱导免疫细胞和/或靶细胞的活性的方法，所述方法包括：
(a)在免疫细胞中表达系统；以及
(b)在诱导所述免疫细胞和/或所述靶细胞的所述活性的条件下使所述靶细胞与所述免疫细胞接触，
其中在所述免疫细胞中表达的所述系统包含：
嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域连接至：
(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，
(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或者
(iii)CD3ζ链。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合和/或所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活所述免疫细胞的细胞毒性。
68.如权利要求66所述的方法，其中两个或更多个抗原结合结构域任选地串联连接至(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；(iii)CD3ζ链。
69.如权利要求66所述的方法，其中所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合以及所述第二抗原结合结构域与所述第二表位的结合激活所述免疫细胞的细胞毒性，所述细胞毒性与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比得到增强。
70.如权利要求66所述的方法，其中与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合或仅所述第二抗原结合结构域与所述第二表位结合相比，所述第一抗原结合结构域与所述第一表位的结合或所述第二抗原结合结构域的结合激活所述免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性的持久性。
71.如权利要求67至70中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞的细胞毒性诱导所述靶细胞的死亡。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述靶细胞是造血细胞。
74.如权利要求71所述的方法，其中所述靶细胞是实体瘤细胞。
75.如权利要求71所述的方法，其中所述靶细胞是在心脏、血管、唾液腺、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、肛门、内分泌腺、肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜、软骨、韧带和肌腱中的一者或多者中鉴定出的细胞。
76.如权利要求66至75中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
80.如权利要求62所述的方法，当所述系统在受试者的免疫细胞中表达时，与仅所述第一抗原结合结构域与所述第一表位结合相比，所述两个或更多个抗原结合结构域与它们相应的表位的结合激活表达所述系统的免疫细胞的细胞毒性，并且增加所述细胞毒性持久性。
81.如权利要求76所述的方法，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
82.一种组合物，所述组合物包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含对第一表位具有结合特异性的第一抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
(b)经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含表现出与第二表位的特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域连接至：
(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链，
(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链，或者
(iii)CD3ζ链。
83.如权利要求82所述的组合物，其中所述一种或多种多核苷酸包含与其可操作连接的启动子。
84.一种产生经修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括：
通过在所述免疫细胞中表达如权利要求77或78所述的组合物来对所述免疫细胞进行遗传修饰，从而产生所述经修饰的免疫细胞。
85.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，所述抗原特异性免疫细胞包含含有第一抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)和含有第二抗原结合结构域的经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，其中所述受试者的癌症的靶细胞表达一种或多种由所述第一和/或第二抗原结合结构域识别的抗原，并且其中所述免疫细胞与所述靶细胞特异性结合，以及
(b)在诱导所述免疫细胞针对所述靶细胞的免疫细胞活性的条件下，通过所述第一和/或第二抗原结合结构域使所述靶细胞与所述抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导所述癌症的所述靶细胞的死亡。
86.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向受试者施用抗原特异性免疫细胞，其中所述抗原特异性免疫细胞是表达如权利要求1至36中任一项所述的系统的经遗传修饰的免疫细胞；以及
(b)在诱导所述免疫细胞针对所述受试者的癌症的靶细胞的免疫细胞活性的条件下使所述靶细胞与所述抗原特异性免疫细胞接触，从而诱导所述癌症的所述靶细胞的死亡。
87.如权利要求86所述的方法，所述方法还包括对所述免疫细胞进行遗传修饰以产生所述抗原特异性免疫细胞。
88.如权利要求85或86所述的方法，其中所述免疫细胞活性选自由以下组成的组：所述免疫细胞的克隆扩增；由所述免疫细胞的细胞因子释放；所述免疫细胞的细胞毒性；所述免疫细胞的增殖；所述免疫细胞的分化、去分化或转分化；所述免疫细胞的运动和/或运输；所述免疫细胞的耗尽和/或重新激活；以及由所述免疫细胞释放其他细胞间分子、代谢物、化合物或它们的组合。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述免疫细胞活性是所述免疫细胞的细胞毒性。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述免疫细胞针对所述靶细胞的所述细胞毒性导致所述受试者的所述癌症的至少减少10％。
91.如权利要求88所述的方法，其中所述免疫细胞活性是由所述免疫细胞的细胞因子释放。
92.如权利要求85至91中任一项所述的方法，其中当所述第一和第二抗原结合结构域均与它们相应的表位结合时，所述免疫细胞活性的持久性与仅单独的所述第一抗原结合结构域的结合或仅所述第二抗原结合结构域的结合相比得以增加。
93.如权利要求85至92中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头颈癌、肾癌、白血病、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、睾丸癌、气管癌和外阴癌。
94.如权利要求85至93中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述淋巴细胞是α/βT细胞和/或γ/δT细胞。
97.如权利要求95所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
98.如权利要求95所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
99.如权利要求94所述的方法，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
100.一种抗原结合分子，所述抗原结合分子具有下式：
A-X-B-Y-C-Z-D；
其中：
A包含与选自由SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:56组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；
B包含与选自由SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:66组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；
C包含与选自由SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:76组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；
D包含与选自由SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:86组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；
X包含与选自由SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:96组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；
Y包含与选自由SEQ ID NO:97至SEQ ID NO:106组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列；并且
Z包含与选自由SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:116组成的组中的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。
101.如权利要求100所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子表现出如在37℃下通过表面等离振子共振测定的为100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm或1nm或更小的对人BCMA的结合亲和力(KD)。
102.如权利要求100所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含与选自由SEQID NO:14至SEQ ID NO:23组成的组的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。
103.如权利要求100所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含选自由SEQ IDNO:14至SEQ ID NO:23组成的组的序列。
104.一种经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含一个或多个抗原结合结构域，其中所述一个或多个抗原结合结构域连接至：
(iv)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；
(v)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者
(vi)CD3ζ链；并且
其中所述一个或多个抗原结合结构域中的至少一个或两个包含如权利要求100至103中任一项的抗原结合分子。
105.如权利要求104所述的经修饰的TCR复合物，其中所述一个或多个抗原结合结构域中的至少一个或两个包含与选自由SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:38至SEQ IDNO:46组成的组的任一者具有至少80％或90％同一性的序列。
106.如权利要求104所述的经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个抗原结合结构域。
107.如权利要求104所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的分开的链。
108.如权利要求104所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的一条链。
109.如权利要求104所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域串联连接至所述TCR复合物的一条链。
110.如权利要求109所述的经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物还包含一个或多个连接至所述TCR复合物的另一条链的抗原结合结构域。
111.一种经修饰的T细胞受体(TCR)复合物，所述经修饰的TCR复合物包含两个或更多个表现出与两个或更多个表位的特异性结合的抗原结合结构域，其中所述两个或更多个抗原结合结构域连接至：
(i)至少一条TCR链，所述至少一条TCR链选自T细胞受体的α链、β链、γ链和δ链；
(ii)分化簇3(CD3)的ε链、δ链和/或γ链；或者
(iii)CD3ζ链。
112.如权利要求111所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的分开的链。
113.如权利要求111所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域连接至所述TCR复合物的一条链。
114.如权利要求113所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域串联连接至所述TCR复合物的一条链。
115.如权利要求114所述的经修饰的TCR复合物，所述经修饰的TCR复合物还包含一个或多个连接至所述TCR复合物的另一条链的抗原结合结构域。
116.如权利要求111所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域与BCMA结合。
117.如权利要求116所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结构域与BCMA的相同表位结合。
118.如权利要求111所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域是抗BCMA sdAb。
119.如权利要求111所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域选自与SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:23中的任一者具有至少80％的序列同一性的序列。
120.如权利要求111所述的经修饰的TCR复合物，其中所述两个或更多个抗原结合结构域串联连接在分化簇3(CD3)的所述ε链、所述δ链和/或所述γ链上。
121.一种抗原特异性免疫细胞，所述抗原特异性免疫细胞包含如权利要求104至120中任一项所述的经修饰的TCR复合物。
122.如权利要求121所述的免疫细胞，所述免疫细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含一个或多个表现出与它们的相应表位的特异性结合的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
123.如权利要求121所述的免疫细胞，其中CAR的所述一个或多个抗原结合结构域串联排列。
124.如权利要求121所述的免疫细胞，所述免疫细胞还包含两个或更多个嵌合抗原受体(CAR)，每个嵌合抗原受体包含一个或多个表现出与它们的相应表位的特异性结合的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
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