JP2018519842A - 免疫細胞の有効性および増大を改善する方法 - Google Patents

免疫細胞の有効性および増大を改善する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように改変できる免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の製造方法、それを含む組成物および反応混合物およびそれを使用する処置方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１５年７月２１日出願の米国出願６２／１９５,０５６号に基づく優先権を主張し、その内容全体を引用により本明細書に包含させる。
配列表
本出願は配列表を含み、それはＡＳＣII形式で提出されており、その全体を引用することによりここに包含させる。２０１６年７月１８日に作成した該ＡＳＣIIコピーは、N2067-7081WO_SL.txtなる名称であり、サイズ２,０５３,０５５バイトである。
発明の背景
約１０年前まで、インビトロでのＴ細胞活性化は、主にフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)およびコンカナバリンＡ(Ｃｏｎ Ａ)のような分裂促進的レクチン類の使用により実施されていた。これらの分裂促進的分子は、細胞表面の糖タンパク質に結合する。Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)複合体特異的刺激を達成するために、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８およびＣＤ４５を含む表面分子特異的抗体が使用されている。これらの抗体は、培養におけるＴ細胞の完全活性化および増殖を起させるための必要な共刺激シグナルを提供した(Frauwirth and Thompson J Clin Invest (2002) Feb;109(3):295-9)。この分野は、Ｔリンパ球の強い増大(expansion)のためにこれらの抗体をアクセサリー細胞、ビーズまたは固体表面に固定する方向へ進んできた(Trickett and Kwan J Immunol Methods (2003) Apr 1;275(1-2):251-5)。
しかしながら、Ｔ細胞活性化および増大のための既存のプロトコールはなお限界がある。これらの限界には、次のような例が含まれる。例えば、既存のプロトコールは、Ｔ細胞表面の機能的ＴＣＲの存在に依存する。これは、Ｔ細胞活性化を、機能的ＴＣＲを有するこのような細胞に制限する。初代Ｔリンパ球は、機能的ＴＣＲを有しないＴ細胞を含み得る細胞の異種性プールであり、それ故に活性化され得るＴ細胞集団が制限される。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８およびＣＤ４５のような細胞表面分子に対する抗体の産生、獲得および使用は高価であり、このような抗体の利用可能性に依存する。さらに、完全Ｔ細胞活性化は２種の異なる抗体(抗ＣＤ３のような一次刺激因子および抗ＣＤ２８のような二次刺激因子)を必要とし得るため、費用はさらに高くなる。さらに、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激は一般に培地に長期間残るため、ＴＣＲは長期間、反復刺激に曝されれことになる。長期の高レベルのＴＣＲ刺激は、ナイーブＴ細胞に強い活性化シグナルと同時の記憶Ｔ細胞の活性化誘発細胞死(ＡＩＣＤ)をもたらす(Collette Y, et al. Blood (1998) Aug 15;92(4):1350-63; Kerstan A and Huenig T J Immunol (2004) Feb 1;172(3):1341-5; Noel, PJ et al. J Immunol. 1996 Jul 15;157(2):636-42)。
従って、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞のインビトロ増大および活性化の改善に対する要望が存在する。
発明の要約
本発明は、少なくとも一部、免疫細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)の増大および／または活性化(例えば、インビトロ増大および／または活性化)を改善する方法に関する。ここに記載するある実施態様は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子を一過性に発現させることによる免疫細胞の増大および／または活性化を提供する。該ＣＡＲ発現免疫細胞は、ＣＡＲ分子のリガンド、例えば、ＣＡＲ抗原結合ドメインのリガンド(例えば、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体分子)を介して活性化され得る。ある実施態様において、ここに開示する方法は、機能的Ｔ細胞受容体の存在を必要とすることなくおよび／または免疫細胞の表現型を実質的に変えることなく、免疫細胞の増大を可能とする。例えば、アネルギー化Ｔ細胞、造血幹細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞を含む免疫エフェクター細胞を、ここに記載する方法を使用して増大できる。さらに、免疫細胞は、未分化表現型を実質的に変えることなくおよび／またはＴ細胞受容体の長期、反復刺激なく、増大させ得る。ある実施態様において、ここに記載する方法は、慣用のＴＣＲ刺激増大と比較して、優れた増殖および細胞数収量を可能とする。それ故に、ここに開示する改善された方法および組成物(例えば、修飾免疫細胞集団、反応混合物)は、細胞療法、例えば、免疫療法に重大な利益を提供できる。
従って、ある態様において、本発明は、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を増大および／または活性化する方法に関する。方法は、ＣＡＲ分子の発現(例えば、一過性発現)に適当な条件下で免疫細胞集団にＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ分子をコードする核酸)を導入することを含む(例えば、それによりここでいう“第一ＣＡＲ発現細胞集団”または“一過性ＣＡＲ発現細胞集団”を産生する)。ある実施態様において、ＣＡＲ分子は抗原結合ドメイン(例えば、抗体分子の抗原結合ドメイン)を含む。方法は、第一または一過性ＣＡＲ発現細胞集団とＣＡＲ分子のリガンド、例えば、ＣＡＲ抗原結合ドメインのリガンド(例えば、同族抗原分子(例えば、組み換え抗原)または抗イディオタイプ抗体分子)を、免疫細胞増大および／または活性化が生じるような条件下接触させ、それにより“増大および／または活性化免疫細胞集団”を産生することを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子のリガンドは、基質、例えば、天然に存在しない基質中／基質上に存在する(例えば、固定化または結合されている)。方法は、さらに、免疫細胞の集団をＣＡＲ分子のリガンド存在下培養することを含み得る。
関連する態様において、本発明は、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を増大および／または活性化する方法に関する。方法は、ここに記載する第一ＣＡＲ発現細胞集団または一過性ＣＡＲ発現細胞集団を提供し、該ＣＡＲ発現細胞集団とＣＡＲ分子のリガンド、例えば、ＣＡＲ抗原結合ドメインのリガンド(例えば、同族抗原分子(例えば、組み換え抗原)または抗イディオタイプ抗体分子)を、免疫細胞増大および／または活性化が生じるような条件下接触させ、それにより“増大および／または活性化免疫細胞集団”を産生することを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子のリガンドは、基質、例えば、天然に存在しない基質中／基質上に存在する(例えば、固定化または結合されている)。方法は、さらに、免疫細胞の集団をＣＡＲ分子のリガンド存在下培養することを含み得る。
ある実施態様において、一過性に発現されたＣＡＲは、ＣＡＲの産生を可能とする条件下、細胞にＣＡＲをコードする核酸(例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ)を一過性に導入することにより産生される。
ある実施態様において、一過性に発現されたＣＡＲは、ソルターゼの使用により産生される。例えば、ソルターゼを使用して、細胞外ドメイン(例えば、抗原結合ドメインおよびソルターゼ認識モチーフを含む)を、ソルターゼアクセプターメンバー(例えば、ソルターゼアクセプターモチーフ、膜貫通ドメインおよび所望により細胞内シグナル伝達ドメインまたはスイッチドメインを含む)とカップリングさせ得る。ある実施態様において、一過性に発現されたＣＡＲは、例えば、ソルターゼ認識モチーフのソルターゼアクセプターモチーフへのカップリングに起因するソルターゼ伝達署名を含む。ある実施態様において、ソルターゼ、ＣＡＲまたはソルターゼアクセプターメンバーは２０１４年１１月６日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９０５０３号または２０１４年７月２１日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２６００号に記載のとおりであり、この各々をその全体を引用により本明細書に包含させる。
前記方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施できる。
ある実施態様において、ここに記載する方法で使用する免疫細胞の集団は、対象(例えば、癌患者)からの血液サンプルから獲得する、例えば、入手する。ある実施態様において、免疫細胞の集団をアフェレーシスにより得る。
ある実施態様において、免疫細胞集団は、例えば、ここに記載する、免疫エフェクター細胞を含む。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞、骨髄由来貪食細胞またはこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、免疫細胞集団は、例えば、アネルギー化Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、Ｔ制御性細胞、Ｔｈ−１７細胞、幹Ｔ細胞またはこれらの組み合わせを含む、初代Ｔ細胞またはリンパ球のサブセットを含む。
ある実施態様において、免疫細胞集団は末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)または臍帯血細胞またはこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、免疫細胞集団は、Ｔ細胞受容体(例えば、機能的Ｔ細胞受容体)を低レベルで発現するかまたはそれを有しない細胞を含む。他の実施態様において、免疫細胞集団は非機能的なまたは実質的に障害されたＴ細胞受容体を有する細胞を含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子(例えば、第一ＣＡＲ分子)をコードする核酸は、ＲＮＡ分子、例えば、インビトロ転写(ＩＶＴ)ＲＮＡである。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲコード化ＲＮＡ構築物を、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより免疫細胞集団に導入する。ある実施態様において、ＣＡＲ分子は一過性に発現される(例えば、ＣＡＲ分子は細胞ゲノムに統合されないまたは実質的に統合されない)。ある実施態様において、ＣＡＲ分子は、細胞複製のための限られた期間または数の免疫細胞で、例えば、５０日未満(例えば、４０日、３０日、２５日、２０日、１５日、１０日、５日以下)、発現される。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子は免疫細胞表面に一過性に発現され、単一リガンド(例えば、抗原)刺激後内在化する。ある実施態様において、免疫細胞は反復リガンド(例えば、抗原)刺激を受けない。
他の実施態様において、免疫細胞刺激の強度は、例えば、ＣＡＲ表面密度またはＣＡＲ抗原結合ドメインのリガンド、例えば、抗原への親和性の一方または両方の調節により、所望のレベルにカスタマイズできる。例えば、免疫細胞のＣＡＲ表面密度の増加またはＣＡＲ結合ドメインのリガンド(例えば、抗原)への親和性の増加は、免疫細胞刺激の強度を増加させ得る。
他の実施態様において、ＣＡＲ分子(例えば、第一ＣＡＲ分子)をコードする核酸はＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。ある実施態様において、ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、ベクターはレンチウイルスである。ある実施態様において、核酸は細胞ゲノムに安定に統合される。
ある実施態様において、コード化ＣＡＲ分子は、例えば、ここに記載する腫瘍抗原結合ＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ)である。
他の実施態様において、ＣＡＲ分子のリガンドは、癌関連抗原、例えば、ここに記載のＣＡＲ分子、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲにより認識される癌関連抗原である。
ある実施態様において、基質は非細胞性基質である。非細胞性基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリックス、チップまたはビーズから選択される固形支持体であり得る。ある実施態様において、ＣＡＲ分子のリガンドは基質に存在する(例えば、基質表面上)。リガンドは、基質に共有結合的または非共有結合的(例えば、架橋)に固定化、結合または会合され得る。ある実施態様において、リガンドはビーズに結合(例えば、共有結合)される。前記実施態様において、免疫細胞集団はインビトロまたはエクスビボで増大され得る。
他の実施態様において、基質は細胞、例えば、リガンドを発現する細胞、例えば、表面に同族抗原を発現する細胞である。ある実施態様において、同族抗原は細胞に対して異種である、例えば、細胞表面に発現される組み換え抗原である。他の実施態様において、同族抗原は、細胞、例えば、腫瘍細胞に内因性に発現される。前記実施態様において、免疫エフェクター細胞集団はインビトロ、エクスビボまたはインビボで増大され得る。ある実施態様において、Ｔ細胞は、例えば、リンパ節注射または腫瘍への腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)の注射によりインビボで増大される。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫細胞は、予定された時間(例えば、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間、２２時間、２３時間または２４時間)または(例えば、１日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日または５０日)ＣＡＲ分子のリガンド存在下で培養される。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、４〜９日の期間培養される。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間培養される。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫細胞集団は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２以上の集団倍加を示す。ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫細胞集団は計８〜１０または約９集団倍加を示す。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫細胞集団は、細胞あたり計２００倍、３００倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍以上増大する。ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫細胞集団は約５００倍増大する。ある実施態様において、平均１細胞は、４００〜６００細胞または約５００細胞を超えて増殖する。ある実施態様において、細胞増大は、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法によし、約５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日または５０日後に測定する。ある実施態様において、細胞増大をリガンドで刺激１０〜２５日後に測定する。ある実施態様において、増大をリガンドで刺激８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日または２５日後に測定する。
ある実施態様において、ここに記載する方法を使用する免疫細胞集団の増大および／または活性化は、免疫細胞のＴＣＲを実質的に刺激しない。ある実施態様において、ここに記載する方法は培養における免疫細胞のあまり速くない分化をもたらすおよび／または“より若い”Ｔ細胞表現型を促進する。ある実施態様において、増大および／または活性化免疫細胞集団は、あまり分化していない表現型を有する免疫エフェクター細胞、例えば、より若い細胞、例えば、幼若Ｔ細胞を含む。ある実施態様において、より若いＴ細胞はナイーブＴ細胞(ＴＮ)、記憶幹細胞(ＴＳＣＭ)、中央記憶Ｔ細胞(ＴＣＭ)またはこれらの組み合わせであり得る。
ある実施態様において、ここに開示する方法は、さらに、増大および／または活性化免疫細胞集団と第二ＣＡＲ分子をコードする核酸、例えば、第二ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを接触させ、それにより第二ＣＡＲ発現細胞集団を産生することを含む。
ある実施態様において、第二ＣＡＲ分子をコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、第二ＣＡＲ分子をコードする核酸ベクターはレンチウイルスである。
他の実施態様において、第二ＣＡＲ分子をコードする核酸はＩＶＴ ＲＮＡである。
ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は同じ抗原、例えば、同じ腫瘍細胞抗原を指向する。ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は同じＣＡＲ分子である。このような実施態様において、第一ＣＡＲを発現する(例えば、一過性に発現する)免疫細胞集団を、例えば、該免疫細胞集団とＣＡＲ結合抗体分子に対する腫瘍細胞抗原または抗イディオタイプ抗体(例えば、ここに記載する非細胞性または細胞性基質に固定化されたＣＤ１９抗原または抗ＣＤ１９イディオタイプ抗体)と接触させることにより、インビトロまたはエクスビボで増大および／または活性化させる。これとは別にまたはこれと組み合わせて、第二ＣＡＲを発現する(例えば、安定に発現する)免疫細胞集団を、例えば内因性腫瘍細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)と接触させることにより、インビボで増大および／または活性化させる。ある実施態様において、第二ＣＡＲ発現免疫細胞を、例えば、治療プロトコールの一部として、対象に投与する。
他の実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は異なる抗原、例えば、異なる腫瘍細胞抗原を指向する。ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は異なるＣＡＲ分子(例えば、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子)である。このような実施態様において、第一ＣＡＲを発現する(例えば、一過性に発現する)免疫細胞集団を、例えば、該免疫細胞集団と第一腫瘍細胞抗原またはＣＡＲの抗原結合ドメインに対する第一抗イディオタイプ抗体(例えば、ここに記載する非細胞性または細胞性基質に固定化したメソセリン抗原またはＣＡＲ分子のメソセリン結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体)と接触させることにより、インビトロまたはエクスビボで増大および／または活性化させる。これとは別にまたはこれと組み合わせて、第二ＣＡＲを発現する(例えば、安定に発現する)免疫細胞集団を、例えば内因性第二腫瘍細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)と接触させることにより、インビボで増大および／または活性化させる。ある実施態様において、第二ＣＡＲ発現免疫細胞を、例えば、治療プロトコールの一部として、対象に投与する。
ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲはＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲから選択される、例えば、ここに記載するＣＡＲである。ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲは同じである。他の実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲは異なる。第一ＣＡＲと第二ＣＡＲのあらゆる組み合わせをここに開示する方法において使用できる。
ある実施態様において、方法は、さらに、適切な増大期間後増大および／または活性化免疫細胞集団を貯蔵することをさらに含む。ある実施態様において、増大および／または活性化免疫細胞集団は、ここに記載する方法に従い凍結保存される。ある実施態様において、増大および／または活性化免疫細胞集団は、適切な媒体、例えば、注入可能媒体中で凍結保存される。
他の態様において、本発明は、対象における障害または状態(例えば、ここに記載する障害または状態)を処置する方法に関する。方法は、対象にここに記載する方法の１以上により製造した増大および／または活性化免疫細胞集団を投与することを含む。ある実施態様において、方法は、増大および／または活性化免疫細胞集団の獲得(例えば、入手)を含む。増大および／または活性化免疫細胞集団は、適当な貯蔵条件、例えば、凍結保存から得ることができる。
ある実施態様において、免疫細胞集団は、例えば、ここに記載する、免疫エフェクター細胞を含む。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞、造血幹細胞(ＨＳＣ)、骨髄由来貪食細胞またはこれらの組み合わせを含む。
ある実施態様において、免疫細胞集団は、例えば、アネルギー化Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、Ｔ制御性細胞、Ｔｈ−１７細胞、幹Ｔ細胞またはこれらの組み合わせを含む初代Ｔ細胞またはリンパ球のサブセットを含む。
ある実施態様において、免疫細胞集団は末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)または臍帯血細胞またはこれらの組み合わせを含む。
さらに他の態様において、本発明は、癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。方法は、対象にＣＡＲ分子(例えば、ここに記載する第一および／または第二ＣＡＲ分子)を発現する免疫エフェクター細胞集団(例えば、ここに記載する増大および／または活性化免疫細胞集団)の有効量を、単独でまたはさらなる治療、例えば、ここに記載する第二治療と組み合わせて投与することを含む。
ある実施態様において、処置方法は、ここに記載する方法の１以上を使用する増大および／または活性化免疫細胞集団の獲得(例えば、入手)を含む。例えば、増大および／または活性化免疫細胞集団は、第一ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載する第一ＣＡＲ分子をコードする核酸分子、例えば、第一ＣＡＲをコードするＩＶＴ ＲＮＡ)を、該ＣＡＲ分子の発現(例えば、一過性発現)に適当な条件下で導入し、そして免疫細胞増大および／または活性化が生じるような条件下、該ＣＡＲ発現細胞集団とＣＡＲ分子のリガンド、例えば、ＣＡＲ抗原結合ドメインのリガンド(例えば、同族抗原分子(例えば、組み換え抗原)または抗イディオタイプ抗体分子)を接触させることにより、先に得られていることもあり得る。ある実施態様において、ＣＡＲ分子のリガンドは、基質、例えば、ここに記載する天然に存在しない基質中／基質上に存在する(例えば、固定化または結合されている)。増大および／または活性化免疫細胞集団を、適当な条件下、例えば、ここに記載する凍結保存で保存できる。
ある実施態様において、ここに開示する処置方法は、さらに、第二ＣＡＲ発現細胞集団、例えば第二ＣＡＲ発現細胞集団の獲得(例えば、入手)を含む。例えば、増大および／または活性化免疫細胞集団は、第二ＣＡＲ分子をコードする核酸、例えば、第二ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターと先に接触されていることもあり得る。ある実施態様において、第二ＣＡＲ分子をコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、第二ＣＡＲ分子をコードする核酸ベクターはレンチウイルスである。
ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は同じ抗原分子、例えば、同じ癌関連抗原を指向する。ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は同じＣＡＲ分子である。このような実施態様において、第一ＣＡＲを発現する(例えば、一過性に発現する)免疫細胞集団は、例えば、該免疫細胞集団と癌関連抗原またはＣＡＲ結合抗体分子に対する抗イディオタイプ抗体(例えば、ここに記載する非細胞性または細胞性基質に固定化されたＣＤ１９抗原または抗ＣＤ１９イディオタイプ抗体)との接触により、先にインビトロまたはエクスビボで増大および／または活性化された。ある実施態様において、第二ＣＡＲ発現免疫細胞を、例えば、治療プロトコールの一部として対象に投与する。
他の実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は異なる抗原、例えば、異なる癌関連抗原を指向する。ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は異なるＣＡＲ分子(例えば、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子)である。このような実施態様において、第一ＣＡＲを発現する(例えば、一過性に発現する)免疫細胞集団は、例えば、該免疫細胞集団と第一癌関連抗原またはＣＡＲの抗原結合ドメインに対する第一抗イディオタイプ抗体分子(例えば、ここに記載する非細胞性または細胞性基質に固定化されたＣＡＲ分子の結合ドメインに対する抗原または抗イディオタイプ抗体)との接触により、先にインビトロまたはエクスビボで増大および／または活性化されたものである。ある実施態様において、第二ＣＡＲ発現免疫細胞を、例えば、治療プロトコールの一部として対象に投与する。
ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は各々独立してＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲから選択され、例えば、ここに記載するＣＡＲである。ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲは同じである。他の実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲは異なる。第一ＣＡＲと第二ＣＡＲのあらゆる組み合わせをここに開示する方法において使用できる。
ある例示的実施態様において、第一ＣＡＲはメソセリンを指向し、メソセリンＣＡＲ発現細胞をメソセリン抗原またはＣＡＲのメソセリン抗原結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体と接触させ、第二ＣＡＲはＣＤ１９を指向する(例えば、ここに開示するＣＤ１９ ＣＡＲ)。他の例示的実施態様において、第一ＣＡＲはＣＤ１９を指向し、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞をＣＤ１９抗原またはＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体と接触させ、第二ＣＡＲはメソセリンを指向する(例えば、ここに開示するメソセリンＣＡＲ)。
ある実施態様において、前記治療方法において使用する免疫細胞集団は、例えば、ここに記載する、免疫エフェクター細胞を含む。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞、造血幹細胞(ＨＳＣ)、骨髄由来貪食細胞またはこれらの組み合わせを含む。
さらに他の態様において、本発明は、例えば、ここに記載する方法に従い製造した、例えば、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、第一および／または第二ＣＡＲ分子または第一および／または第二ＣＡＲ分子をコードする核酸を含む)、免疫細胞調製物または反応混合物に関する。ある実施態様において、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子は同時に発現され(例えば、完全にまたは一部重複して発現)または逐次的に発現される。
前記方法、調製物および反応混合物の何れかのさらなる特性または実施態様は、次の１以上を含む。
免疫細胞増大および／または活性化
ある実施態様において、ここに開示する方法は、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の増大および／または活性化を含む。方法は、免疫細胞の集団を獲得し、該細胞とＣＡＲ分子をコードする核酸を、ＣＡＲ分子の発現(例えば、一過性発現)に適当な条件下接触させ(ここで、ＣＡＲ分子はリガンド、例えば、同族抗原分子(例えば、組み換え抗原)またはＣＡＲ分子の抗原結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体に結合する)、そして免疫細胞の集団を同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体存在下で培養することを含む。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、処置のために細胞を投与される対象に対して自己である。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、処置のために細胞を投与される対象に対して同種である。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は末梢血リンパ球から単離されるＴ細胞である。ある実施態様において、Ｔ細胞の集団は、赤血球溶解および／または単球枯渇により得る。ある実施態様において、Ｔ細胞の集団は、例えば、ここに記載する方法を使用して、末梢リンパ球から単離される。ある実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞を含む。さらなる実施態様において、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞を含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞は造血幹細胞(例えば、臍帯血細胞)を含む。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞はＢ細胞を含む。さらなる実施態様において、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞を含む。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞はＮＫＴ細胞を含む。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞はＴｈ−１７細胞を含む。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞のＴ細胞受容体レベルは減少しているかまたはＴ細胞受容体を有しない。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞非機能的なまたは実質的に障害されたＴ細胞受容体を有する。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、例えば、アフェレーシスにより得た、対象からの血液サンプルから得ることができる。ある実施態様において、アフェレーシスにより採取した免疫エフェクター細胞を洗浄して血漿画分を除去し、所望により、細胞は加工段階のために適切な緩衝液または培地中で提供される。ある実施態様において、細胞は、例えば、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)のような緩衝液で洗浄される。ある実施態様において、細胞は、カルシウムおよびマグネシウムのような１以上の二価カチオンを欠く洗浄溶液で洗浄される。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞は、実質的に二価カチオンを含まない緩衝液で洗浄される。
ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団からの外来性ＲＮＡを一過性に発現するＲＮＡ改変細胞の集団の産生を含む。方法は、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡの集団からの細胞への導入を含み、ここで、ＲＮＡはＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡはここに記載する方法(例えば、エレクトロポレーション)により免疫エフェクター細胞に導入される。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がＣＡＲ ｍＲＮＡを発現する。
他の実施態様において、免疫エフェクター細胞の少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がその細胞表面にＣＡＲを発現する。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞は、リガンド、例えば、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体存在下、免疫エフェクター細胞の培養により増大および／または活性化される。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞を、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体と、ＲＮＡが免疫エフェクター細胞に導入された後少なくとも２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間または４８時間接触させる。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞を、ＲＮＡが免疫エフェクター細胞に導入された後、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体と２４時間、１５時間、１２時間、１０時間または８時間より短く接触させる。
ある実施態様において、リガンドは、例えば、ＣＡＲ(例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ)を発現(例えば、一過性発現)する免疫エフェクター細胞の集団の細胞表面の、ＣＡＲに結合するおよび／またはそれを活性化する分子である。ある実施態様において、同族抗原分子は、ＣＡＲの同族抗原である。ある実施態様において、同族抗原分子は、ＣＡＲの抗原結合部分により認識される組み換え抗原である。ある実施態様において、同族抗原分子は、癌関連抗原、例えば、ここに記載する癌関連抗原、例えば、ＣＤ１９である。ある実施態様において、リガンドは抗イディオタイプ抗体(例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗体分子)、例えば、抗ＣＤ１９イディオタイプ抗体である。
ある実施態様において、リガンドは基質に結合される。ある実施態様において、基質は固形支持体である。ある実施態様において、基質はマイクロタイタープレート(例えば、ＥＬＩＳＡプレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ナイロン膜、酢酸誘導体およびこれらの組み合わせ)、繊維マトリックス、セファロースマトリックス、糖マトリックス、プラスチックチップ、ガラスチップまたはあらゆるタイプのビーズ(例えば、Luminexビーズ、ダイナビーズ、磁気ビーズ、フローサイトメトリービーズおよびこれらの組み合わせ)から選択される。ある実施態様において、基質はＥＬＩＳＡプレートである。他の実施態様において、基質はビーズ、例えば、ダイナビーズである。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を、リガンド被覆、例えば、抗原被覆ビーズと、免疫エフェクター細胞あたり１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１または１５：１ビーズの比で接触させる。ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を、抗原被覆ビーズと免疫エフェクター細胞あたり３：１ビーズの比で接触させる。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞を、所望により、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞の成長のための任意の他の添加物を含む増殖および／または生存能のための１以上の因子を含んでよい適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増大させる。ある実施態様において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)存在下増大させる。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞を、ＩＬ−２存在下増大させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を形質導入した免疫エフェクター細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約４０日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日または４０日)の時間培養により増大させる。ある実施態様において、細胞を４〜９日の期間増大させる。ある実施態様において、細胞を８日以下、例えば、７日、６日、５日、４日または３日の期間増大させる。
免疫エフェクター細胞の効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより規定できる。ある実施態様において、５日増大させた免疫エフェクター細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増大させた同じ細胞と比較して、抗原刺激により細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を５日の培養で増大させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増大させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある実施態様において、５日増大させた免疫エフェクター細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増大させた同じ細胞と比較して、pg／mlでの炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルで、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の増加を示す。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍または６５０倍)増加で増大される。ある実施態様において、細胞は約５００倍増大される。
ある実施態様において、細胞増大を、リガンド、例えば、同族抗原で刺激約５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日または５０日後に測定する分子。ある実施態様において、細胞増大をリガンド、例えば、同族抗原分子で刺激１０〜２５日後に測定する。ある実施態様において、増大をリガンド、例えば、同族抗原分子で刺激８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日または２５日後に測定する。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞を適切な増大期間後凍結保存する。ある実施態様において、細胞をここに記載する方法に従い凍結保存する。ある実施態様において、増大細胞は、適切な培地、例えば、ここに記載するような、例えば、不溶解性培地で凍結保存する。
ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞と第一ＣＡＲをコードする核酸(例えば、インビトロ転写ＲＮＡ)を、第一ＣＡＲの一過性発現に適当な条件下接触させ(ここで、第一ＣＡＲは同族抗原分子を標的とする)、そして同族抗原分子存在下の第一ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の培養により免疫エフェクター細胞の集団を増大させ、そしてさらに該細胞と第二ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを接触させることを含む。ある実施態様において、ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団からの細胞を、免疫エフェクター細胞の集団が、例えば、アフェレーシスにより得た、対象からの血液サンプルから得られた後に、例えば、１日以内にベクターで形質導入する。
ある実施態様において、第一ＣＡＲは同族抗原分子を標的とし、第二ＣＡＲは同じ同族抗原分子を標的とする。ある実施態様において、第一ＣＡＲは同族抗原分子を標的とし、第二ＣＡＲは異なる同族抗原分子を標的とする。ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載する癌関連抗原を標的とし、第二ＣＡＲはここに記載する同じ癌関連抗原を標的とする。ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載する癌関連抗原を標的とし、第二ＣＡＲはここに記載する異なる癌関連抗原を標的とする。ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載するＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲであり、第二核酸はここに記載するＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲをコードする。
他の態様において、本発明は免疫エフェクター細胞の集団を含む反応混合物に関し、ここで、反応混合物中の集団の複数の細胞は、ＣＡＲコード化配列、例えば、ここに記載の、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲコード化配列を含む核酸分子、例えば、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを含む。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がＣＡＲ ｍＲＮＡを発現する。
他の実施態様において、免疫エフェクター細胞の少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がその細胞表面にＣＡＲを発現する。
ある実施態様において、反応混合物は、さらにここに記載するリガンド(例えば、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体)を含み得る。ある実施態様において、リガンドは、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲを発現する、例えば、一過性に発現する、免疫エフェクター細胞の集団の細胞表面のＣＡＲに結合するおよび／またはそれを活性化する分子である。ある実施態様において、リガンドはＣＡＲの同族抗原である。ある実施態様において、同族抗原は癌関連抗原、例えば、ここに記載する癌関連抗原、例えば、ＣＤ１９である。他の実施態様において、リガンドは抗イディオタイプ抗体、例えば、抗ＣＤ１９イディオタイプ抗体である。
ある実施態様において、リガンド、例えば、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体は基質に結合される。ある実施態様において、基質は固形支持体である。ある実施態様において、基質は、マイクロタイタープレート(例えば、ＥＬＩＳＡプレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ナイロン膜、酢酸誘導体およびこれらの組み合わせ)、繊維マトリックス、セファロースマトリックス、糖マトリックス、プラスチックチップ、ガラスチップまたはあらゆるタイプのビーズ(例えば、Luminexビーズ、磁気ビーズ(例えば、ダイナビーズ)、フローサイトメトリービーズおよびこれらの組み合わせ)から選択される。ある実施態様において、基質はＥＬＩＳＡプレートである。他の実施態様において、基質は磁気ビーズ、例えば、ダイナビーズである。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞およびリガンド(例えば、抗原)被覆ビーズは、免疫エフェクター細胞あたり１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１または１５：１ビーズの比で存在する。ある実施態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞およびリガンド(例えば、抗原)被覆ビーズは、免疫エフェクター細胞あたり３：１ビーズの比で存在する。
ある実施態様において、反応混合物は、さらに、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、例えば、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞の成長のための任意の他の添加物の１種、２種、３種、４種、５種またはそれ以上を含む、増殖および／または生存能増強のための１以上の因子を含む。ある実施態様において、反応混合物は、さらにＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を含む。ある実施態様において、細胞を、ＩＬ−２存在下増大させる。
ある実施態様において、反応混合物中の集団の複数の細胞は、第一ＣＡＲをコードする核酸分子および第二ＣＡＲ分子をコードする核酸の一方または両方、例えば、ここに記載するＣＡＲを含む。
ある実施態様において、第一ＣＡＲをコードする核酸はここに記載するインビトロ転写ＲＮＡである。
ある実施態様において、第二ＣＡＲをコードする核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。
ある実施態様において、第一ＣＡＲは同族抗原分子を標的とし、第二ＣＡＲは同じ同族抗原分子を標的とする。
ある実施態様において、第一ＣＡＲは同族抗原分子を標的とし、第二ＣＡＲは異なる同族抗原分子を標的とする。
ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載する癌関連抗原を標的とし、第二ＣＡＲはここに記載する同じ癌関連抗原を標的とする。
ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載する癌関連抗原を標的とし、第二ＣＡＲはここに記載する異なる癌関連抗原を標的とする。
ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載するＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲから選択され、そして第二核酸はここに記載するＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲをコードする。
ある実施態様において、反応混合物はさらに、例えば、サッカライド、オリゴ糖、多糖およびポリオール(例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコースおよびデキストラン)、塩およびクラウンエーテルのような凍結保護剤または安定剤を含む。ある実施態様において、凍結保護剤はデキストランである。
方法のさらなる特性および実施態様を、“方法、調製物および反応混合物のさらなる実施態様”なる表題の章に記載する。
ＣＡＲ分子
ここに記載する方法、調製物および反応混合物によって、例えば、ここに記載する方法により得た、免疫エフェクター細胞を１以上の癌関連抗原を標的とするＣＡＲ分子(ここでは“ＣＡＲ”とも称する)を含むように改変できる。ある実施態様において、腫瘍抗原は、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号に記載の腫瘍抗原である。
ある実施態様において、癌関連抗原(腫瘍抗原)はＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１(ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９および１９Ａ２４とも称される)、Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、上皮細胞増殖因子受容体バリアントIII(ＥＧＦＲｖIII)、ガングリオシドＧ２(ＧＤ２)、ガングリオシドＧＤ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−８)ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟(ＢＣＭＡ)、Ｔｎ抗原((Ｔｎ Ａｇ)または(ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ))、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(ＲＯＲ１)、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ３)、腫瘍関連糖タンパク質７２(ＴＡＧ７２)、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、上皮性細胞接着分子(ＥＰＣＡＭ)、Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)、ＫＩＴ(ＣＤ１１７)、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２(ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２)、メソセリン、インターロイキン１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)、前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)、プロテアーゼセリン２１(テスティシンまたはＰＲＳＳ２１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、ルイス(Ｙ)抗原、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)、ステージ特異的胚抗原−４(ＳＳＥＡ−４)、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ムチン１、細胞表面関連(ＭＵＣ１)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ(ＰＡＰ)、伸長因子２変異(ＥＬＦ２Ｍ)、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(ＦＡＰ)、インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ−Ｉ受容体)、炭酸脱水酵素IX(ＣＡIX)、プロテアソーム(Ｐｒｏｓｏｍｅ、Ｍａｃｒｏｐａｉｎ)サブユニット、ベータタイプ、９(ＬＭＰ２)、糖タンパク質１００(ｇｐ１００)、易切断領域(ＢＣＲ)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体１(Ａｂｌ)からなる癌遺伝子融合タンパク質(ｂｃｒ−ａｂｌ)、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２(ＥｐｈＡ２)、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)、ガングリオシドＧＭ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)、トランスグルタミナーゼ５(ＴＧＳ５)、高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)、ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１／ＣＤ２４８)、腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)、クローディン６(ＣＬＤＮ６)、甲状腺刺激ホルモン受容体(ＴＳＨＲ)、プロテインＧ共役受容体クラスＣ群５、メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)、ポリシアル酸、胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドのヘキササッカライド部分(ＧｌｏｂｏＨ)、乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)、ウロプラキン２(ＵＰＫ２)、Ａ型肝炎ウイルス細胞性受容体１(ＨＡＶＣＲ１)、アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)、パネキシン３(ＰＡＮＸ３)、プロテインＧ共役受容体２０(ＧＰＲ２０)、リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ ９(ＬＹ６Ｋ)、嗅覚受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)、ＴＣＲガンマ交互リーディングフレームタンパク質(ＴＡＲＰ)、ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)、癌／精巣抗原１(ＮＹ−ＥＳＯ−１)、癌／精巣抗原２(ＬＡＧＥ−１ａ)、黒色腫関連抗原１(ＭＡＧＥ−Ａ１)、ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、染色体１２ｐに位置(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)、精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)、アンギオポエチン結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ ２)、黒色腫癌精巣抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)、黒色腫癌精巣抗原−２(ＭＡＤ−ＣＴ−２)、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３(ｐ５３)、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１(ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８)、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１(ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１)、ラット肉腫(Ｒａｓ)変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)、肉腫転座切断点、アポトーシスの黒色腫阻害因子(ＭＬ−ＩＡＰ)、ＥＲＧ(膜貫通プロテアーゼ、セリン２(ＴＭＰＲＳＳ２) ＥＴＳ融合遺伝子)、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３(ＰＡＸ３)、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ−ｍｙｃ鳥類骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来相同体(ＭＹＣＮ)、Ｒａｓ相同体ファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)、チロシナーゼ関連タンパク質２(ＴＲＰ−２)、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)、ＣＣＣＴＣ結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(ＢＯＲＩＳまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites)、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３(ＳＡＲＴ３)、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５(ＰＡＸ５)、プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)、Ａキナーゼアンカータンパク質４(ＡＫＡＰ−４)、滑膜肉腫、Ｘ切断点２(ＳＳＸ２)、終末糖化生産物用受容体(ＲＡＧＥ−１)、腎臓遍在１(ＲＵ１)、腎臓遍在２(ＲＵ２)、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６(ＨＰＶ Ｅ６)、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７(ＨＰＶ Ｅ７)、腸カルボキシルエステラーゼ、ヒートショックタンパク質７０−２変異(ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)、ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲまたはＣＤ８９)、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ(ＣＤ３００ＬＦ)、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)、骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)、リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)、グリピカン−３(ＧＰＣ３)、Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)から選択される１以上である。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子により標的とされる癌関連抗原は、ＣＤ１９、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ(例えば、ＣＴＬ０１９)である。ある実施態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、表４に示すアミノ酸を含むかまたはヌクレオチド配列を有する。
ある実施態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン分子は抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２、単一ドメイン抗体(ＳＤＡＢ)、ＶＨまたはＶＬドメインまたはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは配列番号６に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列を有するＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列に９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは配列番号６の配列を含む。
他の実施態様において、ＣＤ８膜貫通ドメインをコードする核酸配列は配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、膜貫通ドメインにヒンジ領域により接続される。ある実施態様において、ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ、例えば、配列番号２のアミノ酸配列またはＩｇＧ４ヒンジ、例えば、配列番号３６のアミノ酸配列または配列番号２または３６と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の実施態様において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、ＣＤ８ヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジに各々対応する配列番号１３または配列番号３７の配列または配列番号１３または３７と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の実施態様において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲIIａ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子の一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号９もしくは配列番号１０に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を有するアミノ酸配列を含み得る。ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、配列番号９または配列番号１０の配列を含む。他の実施態様において、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号２０または配列番号２１の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激シグナル伝達ドメインを含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ある実施態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６またはＮＫＧ２Ｄから選択される１以上のタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団は、２以上の細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ分子を含む細胞の混合物を含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む１以上のＣＡＲを含む。例えば、第一免疫エフェクター細胞はＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ分子を含み、第二免疫エフェクター細胞は４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ分子を含む。ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ分子の発現は一過性でも安定的でもよい。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７もしくは配列番号１６に少なくとも１、２または３修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７もしくは配列番号１６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性である配列を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７または配列番号１６の配列を含む。他の実施態様において、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８または配列番号１５の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の実施態様において、ＣＡＲ分子の細胞内ドメインは、配列番号９または配列番号１０の配列および配列番号７または配列番号１６の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列は、同じフレームにかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８または配列番号１５の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号２０または配列番号２１の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある実施態様において、ＣＡＲはさらにリーダー配列を含む。ある実施態様において、リーダー配列は、配列番号１の配列を含む。
ある実施態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン分子は、１０−４Ｍ〜１０−８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。
ある実施態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン分子は、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、上記標的のためのここに記載する抗原結合ドメインである。
ある実施態様において、ＣＡＲは、ここに記載するＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲを含む。ある実施態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、例えば、表１または４において、ここに記載する抗原結合ドメインを含む。
他の実施態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、メソセリンタンパク質の細胞外ドメインを認識し、それに結合する。メソセリンＣＡＲ配列の例は、例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる国際公開ＷＯ２０１３／０４０５５７Ａ２号に見ることができる。
処置／組み合わせ治療の方法
他の態様において、本発明は、癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。方法は、免疫エフェクター細胞集団の有効量を対象に投与することを含み、ここで、免疫エフェクター細胞集団は、ＣＡＲの一過性発現に適当な条件下、免疫エフェクター細胞集団とＣＡＲをコードする核酸と接触させ(ここで、ＣＡＲは同族抗原分子を標的とする)、そして免疫エフェクター細胞の集団をリガンド、例えば、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体分子存在下で培養することにより増大させるかまたは予め増大させられている。ある実施態様において、核酸はＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ＲＮＡである。他の実施態様において、同族抗原分子は癌関連抗原分子である。ある実施態様において、同族抗原分子または抗イディオタイプ抗体分子は基質、例えば、ビーズに結合されている。
ある実施態様において、方法は、さらに、第二ＣＡＲ(例えば、第二ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター)を含む免疫エフェクター細胞集団を対象に投与することを含み、ここで、免疫エフェクター細胞集団は、ここに記載するように増大させるかまたは予め増大させられている。ある実施態様において、ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団を、免疫エフェクター細胞の集団が、例えば、アフェレーシスにより得た、対象からの血液サンプルから得られた後に、例えば、１日以内に、ベクターで形質導入する。ある実施態様において、第一ＣＡＲは同族抗原分子を標的とし、第二ＣＡＲは同じ同族抗原分子を標的とする。ある実施態様において、第一ＣＡＲは同族抗原分子を標的とし、第二ＣＡＲは異なる同族抗原分子を標的とする。ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載する癌関連抗原を標的とし、第二ＣＡＲはここに記載する同じ癌関連抗原を標的とする。ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載する癌関連抗原を標的とし、第二ＣＡＲはここに記載する異なる癌関連抗原を標的とする。
ある実施態様において、第一ＣＡＲはここに記載するＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲであり、第二核酸はここに記載するＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲをコードする。
ここに記載する障害(例えば、癌)を処置するおよびここに記載する抗腫瘍免疫を提供する方法によって、ある実施態様において、方法は、対象にここに記載する方法により製造したＣＡＲ分子または免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲ分子、例えばここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように改変する。
またここに提供されるのは、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、ここに記載する障害を有する対象の処置に使用するための、ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するＣＡＲ分子)を含む免疫エフェクター細胞(例えば、ここに記載するとおり製造した免疫エフェクター細胞の集団)を含む組成物である。
ある実施態様において、癌は、例えば、ＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌である。ある実施態様において、癌は、例えば、白血病(例えば、ＡＬＬまたはＣＬＬ)のような、例えば、ここに記載する血液癌またはリンパ腫(例えば、ＭＣＬ、ＨＬまたはＮＨＬ)である。
ある実施態様において、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９と関連する疾患は、癌または悪性腫瘍または脊髄形成異常症、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患から選択されるかまたはここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する非癌関連徴候である。ある実施態様において、疾患は、ここに記載する癌、例えば、ここに記載する標的と関連するとしてここに記載する癌である。ある実施態様において、血液癌は白血病である。ある実施態様において、癌は、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、ＡＬＬを含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および／または“前白血病状態”(例えば、骨髄血液細胞の産生無効(または形成異常)により纏められる血液状態の雑多な集合)を含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液状態からなる群から選択される。ある実施態様において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、ここに記載する腫瘍抗原を発現する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患およびこれらのあらゆる組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、腫瘍抗原の発現と関連する増殖性疾患、前癌状態、癌および非癌関連徴候からなる群から選択される。
他の実施態様において、ここに記載する腫瘍抗原と関連する疾患は固形腫瘍である。ある実施態様において、癌は、結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発癌、これらの癌の組み合わせおよびそれらの転移病巣から選択される。
前記方法または使用の何れかのある実施態様において、疾患と関連する腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII 、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソセリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２ (Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１から選択される１以上である。
ある実施態様において、細胞の集団は、集団を投与される対象に対して自己である。ある実施態様において、細胞の集団は、集団を投与される対象に対して同種である。ある実施態様において、対象はヒトである。
ある実施態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を形質導入された免疫エフェクター細胞の集団は、例えば、ここに記載する方法により、増大される。ある実施態様において、細胞を８日以下、例えば、７日、６日、５日、４日または３日の期間増大させる。ある実施態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞を５日の培養で増大させ、得られた細胞は、例えば、ここに記載するとおり、同じ培養条件下で９日培養において増大された同じ細胞より強力である。
ある実施態様において、対象に対象の体重１kgあたり１０４〜１０６免疫エフェクター細胞を投与する。ある実施態様において、対象は、免疫エフェクター細胞の集団の初期投与(例えば、対象の体重１kgあたり１０４〜１０６免疫エフェクター細胞、例えば、対象の体重１kgあたり１０４〜１０５免疫エフェクター細胞の初期投与)(その複数がＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含む)、免疫エフェクター細胞の集団の１以上の続く投与(例えば、対象の体重１kgあたり１０４〜１０６免疫エフェクター細胞、例えば、対象の体重１kgあたり１０４〜１０５免疫エフェクター細胞の１以上の続く投与)(その複数がＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含む)を受ける。ある実施態様において、１以上の続く投与は先の投与後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内、例えば、先の投与後４日、３日、２日以内に行う。ある実施態様において、対象は、免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも３投与にわたり合計で対象の体重１kgあたり約１０６免疫エフェクター細胞の投与を受け、例えば、対象は、１×１０５免疫エフェクター細胞の初期投与、３×１０５免疫エフェクター細胞の第二投与および６×１０５免疫エフェクター細胞の第三投与を受け、例えば、各投与は先の投与後４日、３日、２日以内に行う。
ある実施態様において、方法または使用を、免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて行う。
例えば、ある実施態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータを含む。ある実施態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある実施態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦベータまたはこれらの何れかのフラグメント(例えば、これらの何れかの細胞外ドメインの少なくとも一部)のような阻害分子である第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)である第二ポリペプチドを含む。ある実施態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に付随する１以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を、Ｂ細胞阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を、１以上のさらなるＢ細胞阻害剤と組み合わせて投与する。ある実施態様において、Ｂ細胞阻害剤は第二ＣＤ１９阻害剤である。ある実施態様において、Ｂ細胞阻害剤はＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１以上の阻害剤である。
ある実施態様において、Ｂ細胞阻害剤は、小分子阻害剤、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１以上)に結合するポリペプチド、例えば、可溶性リガンド、抗体または抗原結合そのフラグメントまたは阻害性核酸(例えば、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)または低分子ヘアピン型ＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ))である。他の実施態様において、Ｂ細胞阻害剤はＢ細胞抗原(例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂまたはＣＤ７９ａの１以上)に結合するＣＡＲを発現する細胞(例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞)である。
ある態様において、ＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲ)は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載する任意のリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内刺激ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内刺激ドメイン)を含む。ある態様において、ＣＡＲ構築物の例は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内共刺激ドメイン)および細胞内刺激ドメインを含む。
対象
ある実施態様において、対象、例えば、免疫細胞を獲得した対象および／または処置する対象はヒト、例えば、癌患者である。
ある実施態様において、対象は、腫瘍または癌関連抗原の発現と関連する疾患、例えば、ここに記載する疾患を有する。ある実施態様において、対象は、癌、例えば、ここに記載する癌を有する。
ある実施態様において、対象は、血液癌、固形腫瘍またはその転移病巣から選択される癌を有する。癌の例は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、Ｂ細胞前骨髄球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、癌はＡＬＬである。他の実施態様において、癌はＣＬＬである。
ある実施態様において、対象は再発癌を有しない。他の実施態様において、対象は再発癌を有する。
ある実施態様において、免疫細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団)を、血液学的癌、例えば、白血病、例えば、ＣＬＬ、ＡＬＬまたはリンパ腫、例えば、ＭＣＬ、ＮＨＬまたはＨＬを有する対象から獲得、例えば、入手する。
方法、調製物および反応混合物のさらなる実施態様
処置および／またはここに記載する調製物および反応混合物の製造(例えば、増大および／または活性化)の方法によって、ある実施態様において、方法は、さらに、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を免疫細胞集団から除去し、例えば、それによりＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を提供することをさらに含む。
ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は、ＣＤ２５＋細胞を３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。
ある実施態様において、免疫細胞集団は、癌を有する対象、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)のような、例えば、ＣＤ２５発現癌を有する対象の細胞を含む。ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団はＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。
ある実施態様において、免疫細胞集団は、処置のために細胞を投与される対象に対して自己である。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、処置のために細胞を投与される対象に対して同種である。
ある実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、例えばＩＬ−２を使用して集団から除去される。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドは、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされるか他の方法で基質、例えば、ビーズに被覆される。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントをここに記載する基質にコンジュゲートする。
ある実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、ミルテニーＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。ある実施態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比率は、１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。
ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞は、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲの発現に適する。ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は、白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞、ＡＬＬ細胞またはリンパ腫細胞、例えば、ＭＣＬ細胞、ＮＨＬ細胞またはＨＬ細胞を３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団をＣＬＬを有する対象から得て、Ｔ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞は、白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含み、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲの発現に適する。ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団はＣＤ２５＋細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団はＣＤ２５＋細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。
ある実施態様において、製造方法は、さらに、細胞を腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する集団から除去し、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、細胞除去に使用できる同じ基質、例えば、ビーズに結合させてよくまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、別々のビーズに結合させてよく、その混合物を細胞除去に使用できる。他の実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも行い得る。ある実施態様において、製造方法は、さらに、チェックポイント阻害因子、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害因子を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上(例えば、１、２または３)を集団から除去し、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害因子枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、チェックポイント阻害因子発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害因子抗体またはそのフラグメントを細胞除去に使用できる同じビーズに結合させてよくまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害因子抗体またはそのフラグメントを、別々のビーズに結合させてよく、その混合物を細胞除去に使用できる。他の実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害因子発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも行い得る。
ある実施態様において、除去する細胞の集団は制御性Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもないが、ＣＡＲＴ細胞の増大および／または機能に他の点で負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または免疫抑制性細胞により発現される可能性のある他のマーカーを発現する細胞である。ある実施態様において、このような細胞は制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順番で除去されることが企図される。
ある実施態様において、方法は、さらに、ＣＤ１４を発現する細胞を集団から除去し、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびＣＤ１４＋枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、ＣＤ１４＋細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗ＣＤ１４抗体またはそのフラグメントを細胞除去に使用できる同じビーズに結合させてよく；または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよびｔｈｅ抗ＣＤ１４抗体またはそのフラグメントを、別々のビーズに結合させてよく、その混合物を細胞除去に使用できる。他の実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびＣＤ１４＋細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも行い得る。
ある実施態様において、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、１以上のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の発現に基づき選択されており、例えば、提供される免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞)はＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
ある実施態様において、方法は、さらに、１以上のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の発現について富化された、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を得ることを含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋細胞について富化される。例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズとのインキュベーションにより単離したＴ細胞が得られる。ある実施態様において、方法は、さらに、Ｔ制御性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの、１以上のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上を発現する細胞の選択を含む。
ある実施態様において、方法は、さらに、例えば、ここに記載する方法による、Ｔ制御性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団の活性化を含む。
ある実施態様において、製造方法は、さらに、Ｔ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの細胞にＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入することを含む。ある実施態様において、ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの細胞を、免疫エフェクター細胞の集団が、例えば、アフェレーシスにより得た、対象からの血液サンプルから得られた後に、例えば、１日以内にベクターで形質導入する。
ある実施態様において、方法は、さらに、Ｔ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの外来性ＲＮＡを一過性に発現するＲＮＡ改変細胞の集団を産生することを含む。方法は、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを集団からの細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡはＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含む。
ある実施態様において、細胞は、所望により、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および／または生存能のための１以上の因子を含み得る適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増大される。
ある実施態様において、細胞１以上のインターロイキンを含む適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増大され、これにより、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日増大期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加がもたらされる。ある実施態様において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)存在下増大させる。
ある実施態様において、細胞を適切な増大期間後凍結保存する。ある実施態様において、細胞をここに記載する方法に従い凍結保存する。ある実施態様において、増大細胞は、適切な培地、例えば、ここに記載するような、例えば、不溶解性培地で凍結保存する。
ある実施態様において、製造方法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む。ある実施態様において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
ある実施態様において、方法は、さらに、増大前に、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を集団から除去し、それにより増大するＴ制御性枯渇細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞は、ここに記載する方法により除去される。
ある実施態様において、方法は、さらに、増大前に、集団からＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ１４＋細胞を除去し、それにより増大するＣＤ１４＋枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ１４＋細胞は、ここに記載する方法により除去される。
ある実施態様において、方法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む。ある実施態様において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能にする条件下で接触させることを含む。
ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＲＮＡである。他の実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はテロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
ある実施態様において、製造方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードするＲＮＡを、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下接触させることを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは同じ核酸分子の一部である。ある実施態様において、ＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは別々の核酸分子の一部である。
ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸およびテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを、実質的に同時に接触させることを含む。ある実施態様において、製造方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを接触させる前に接触させることを含む。ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを接触させた後に接触させることを含む。
ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡはｍＲＮＡである。ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡはポリ(Ａ)テイルを含む。ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡは５’キャップ構造を含む。
ある実施態様において、方法は、免疫エフェクター細胞をテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡでトランスフェクトすることを含む。ある実施態様において、製造方法は、免疫エフェクター細胞にテロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡを形質導入することを含む。ある実施態様において、製造方法は、免疫エフェクター細胞を、テロメラーゼサブユニットをコードするＲＮＡで、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下、電気穿孔することを含む。
ある実施態様において、方法は、ＣＡＲを発現するおよび／またはＣＡＲをコードする核酸を含む免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の集団を提供し、そして、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ｈＴＥＲＴ発現を可能とする条件下接触させることを含む。
ある実施態様において、方法は、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の集団を提供し、そして、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を、ＣＡＲ発現を可能にする条件下、接触させることを含む。
免疫エフェクター細胞調製物
ある実施態様において、ここに記載する免疫エフェクター細胞調製物(例えば、反応混合物または免疫エフェクター細胞の集団)はここに記載する方法により製造される。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞の集団は１以上のマーカー、例えば、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５の発現に基づき選択されており、例えば、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞)はＣＣＲ７＋およびＣＤ６２Ｌ＋である。
ある実施態様において、ナイーブＴ細胞はＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−の発現パターンに基づき同定され、ここで幹中央記憶Ｔ細胞はＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づき同定され、そして、中央記憶Ｔ細胞はＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋の発現パターンに基づき同定される。
ある実施態様において、ここに記載する免疫エフェクター細胞調製物は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲを含む。
ある実施態様において、ここに記載する免疫エフェクター細胞調製物は、外来性テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を含む。ある実施態様において、外来性テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。
ある実施態様において、ここに記載する免疫エフェクター細胞調製物はＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲおよび外来性テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴを含む。ある実施態様において、細胞は、外来性テロメラーゼサブユニットをコードするＤＮＡを含まない。例えば、細胞が外来性テロメラーゼサブユニットをコードするｍＲＮＡと接触されていてよい。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物は、ＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団である。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物は、ＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満およびＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団である。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物はＣＤ２５＋細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物はＣＤ２５＋細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物は、ＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満およびチェックポイント阻害因子発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞またはＴＩＭ３＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団である。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物は、ＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満およびＣＤ１４＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団である。
ある実施態様において、ここに記載する免疫エフェクター細胞調製物は自己免疫エフェクター細胞の集団を含み、例えば、その一部はＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入され、ここで、免疫エフェクター細胞調製物は、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞および５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物はＣＤ２５＋細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞調製物はＣＤ２５＋細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。
ある実施態様において、反応混合物は、さらに、集団の細胞を活性化するおよび／または増大する薬剤、例えば、ここに記載の、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤および／または細胞表面の共刺激分子を刺激するリガンドを含み得る。ある実施態様において、薬剤は抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである。
ある実施態様において、ここに記載する反応混合物は、ＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団を含む。ある実施態様において、反応混合物は、ＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満およびＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団を含む。ある実施態様において、細胞の集団はＣＤ２５＋細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。ある実施態様において、細胞の集団はＣＤ２５＋細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満および腫瘍細胞、例えば、ＣＤ２５発現腫瘍細胞、例えば、ＣＬＬ細胞を１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。
ある実施態様において、反応混合物はＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満およびチェックポイント阻害因子発現細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞またはＴＩＭ３＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団を含む。反応混合物はさらに緩衝液または他の試薬、例えば、ＰＢＳ含有溶液を含み得る。
ある実施態様において、反応混合物はＣＤ２５＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満およびＣＤ１４＋細胞を５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含むＴ制御性枯渇細胞の集団を含む。反応混合物はさらに緩衝液または他の試薬、例えば、ＰＢＳ含有溶液を含み得る。
ある実施態様において、反応混合物はさらに血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および／または生存能のための１以上の因子を含む。ある実施態様において、反応混合物は、さらにＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を含む。
ある実施態様において、反応混合物中の集団の複数の細胞は、ＣＡＲコード化配列、例えば、ここに記載の、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲコード化配列を含む、核酸分子、例えば、ここに記載の核酸分子を含む。
ある実施態様において、反応混合物中の集団の複数の細胞は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む。ある実施態様において、ベクターはここに記載するベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。
ある実施態様において、反応混合物はさらに、例えば、サッカライド、オリゴ糖、多糖およびポリオール(例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコースおよびデキストラン)、塩およびクラウンエーテルのような凍結保護剤または安定剤を含む。ある実施態様において、凍結保護剤はデキストランである。
ある実施態様において、反応混合物は免疫エフェクター細胞の集団を含み、ここで、反応混合物中の集団の複数の細胞はＣＡＲコード化配列、例えば、ここに記載の、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲコード化配列およびＩＬ−７および／またはＩＬ−１５を含む、核酸分子、例えば、ここに記載の核酸分子を含む。
ある実施態様において、反応混合物中の集団の複数の細胞は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む。ある実施態様において、ベクターはここに記載するベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。
本発明の他の特性、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
特に定義しない限り、ここに使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載するものに類似するまたは等価な方法および材料を本発明の実施または試験に際して使用できるが、適当な方法および材料は下に記載する。ここに記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用は、その全体を引用により本明細書に包含させる。さらに、材料、方法および例示は単なる説明であり、限定する意図はない。
図Ａ〜１Ｄは、ＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対するγｃサイトカインおよびＩＬ−１８の差次的効果を示す。図１ＡはＣ４−２７ｚ ＣＡＲベクターの模式図である。図１Ｂは、種々のサイトカイン曝露に応答したＣＡＲ−Ｔ細胞の総体的蓄積を示すグラフである。Ｔ細胞を、形質導入に、翌日(０日目)から最終濃度１０ng／mLで種々の外来性サイトカインに暴露した。ＣＡＲ−Ｔ細胞数をＴ細胞数およびＣＡＲ発現パーセントに基づき計算した。曲線は６ドナーのものである。＊Ｐ＜０.０５、＊＊＊Ｐ＜０.００１。ＮＣ、無サイトカイン。図１Ｃは、種々のサイトカインに応答したＴ細胞の増殖を示すヒストグラムである。レンチウイルス形質導入後７日目、ＮＣ群におけるＴ細胞をＣＦＳＥ(２.５μM)で標識し、その後種々のサイトカインに曝した。７日後、Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによるＣＦＳＥ希釈について分析した。図１Ｄは、レンチウイルス形質導入１５日後のＴ細胞の生存能を示すグラフである。種々のサイトカイン群からのＴ細胞をAnnexin Vおよび7-AADで染色し、次いで生存可能細胞の割合を分析する(Annexin Vおよび7-AADの両方陰性)。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１対ＩＬ−２群(ｎ＝６)。
図２Ａ〜２Ｆは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の記憶Ｔ細胞サブセットを示す。図２Ａは、形質導入前のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞サブセットおよび形質導入１５日後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ９５発現を示す。図２Ｂおよび２Ｃは、レンチウイルス形質導入後のＣＤ４＋(図２Ｂ)およびＣＤ８＋ Ｔ細胞(図２Ｃ)における記憶幹Ｔ細胞(Ｔｓｃｍ)の割合の増加を示すグラフである。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞サブセットとして規定する。図２Ｄは、形質導入前Ｔ細胞におけるナイーブＴ(Ｔｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５−亜集団)の量と形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍの割合の相関を示すグラフである(ｎ＝６)。左側の棒は形質導入前のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴｎのパーセンテージを表し、右側の棒はＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴｓｃｍのパーセンテージを表す。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１。図２Ｅは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの自己再生および分化を示すグラフである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ細胞をＩＬ−２(１０ng／mL)に３日間曝して培養し、次いでＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づく表現型を分析する(ｎ＝３)。図２Ｆは、ＩＬ−２に対する応答におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の種々のサブセットの増殖を示すヒストグラムプロットである。ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ＋ Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ細胞をＣＦＳＥ(２.５μM)で標識し、次いでＩＬ−２(１０ng／mL)に３日間曝して培養した。３日後、Ｔ細胞ＣＦＳＥ希釈について分析した。
図３Ａ〜３Ｂは、ＣＤ４５ ＲＡ発現とＣＦＳＥ強度の相関を示す。図３Ａは、ＣＤ４５ＲＡ発現がＣＦＳＥ強度と逆相関することを示す。図３Ｂは、全サイトカイン群(ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１)について、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ ｄｉｍおよび陰性Ｔ細胞よりはるかに低いＣＦＳＥレベルを示すことを示し、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ− Ｔ細胞より増殖活性が強いことを示す。
図４は、種々のサイトカインへの曝露に起因するＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を示す。図４は、挙げるサイトカイン群におけるＣＡＲ−Ｔ細胞表面のＦＡＣＳによるＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＬ７Ｒα発現の定量化を示す一連のグラフである。ヒストグラムは、６独立ドナーからの発現レベルの平均値±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１対ＩＬ−２群。
図５Ａ〜５Ｄは、種々のサイトカインに曝したＣＡＲ−Ｔ細胞の機能解析を示す。図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ＩＦＮγ(図５Ａ)、ＴＮＦ−α(図５Ｂ)およびＩＬ−２(図５Ｃ)の産生について種々のサイトカイン群(ｎ＝６)におけるサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージを示す定量的プロットである。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を、記載するサイトカインに１４日間曝し、次いでＳＫＯＶ３細胞と５時間共培養し、その後フローサイトメトリー分析のために採取する。図５Ｄは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的細胞毒性活性を示すグラフである。記載したサイトカイン暴露１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を示すＥ／Ｔ比率でＳＫＯＶ３と１８時間時間共培養後、ルシフェラーゼベースのアッセイを使用して細胞溶解能について評価した。非形質導入Ｔ細胞(ＵＮＴ)は陰性エフェクター対照として役立った。示すデータは６回の独立した細胞溶解アッセイの平均値±ＳＥＭである。
図６Ａ〜６Ｃは、図５に上記したＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型および機能を示す。図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ６２Ｌ− ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ)と比較したとき、ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｓｃｍおよびＴｃｍ)のサイトカイン産生活性が少なく(図６Ａおよび６Ｂ)、細胞溶解能が弱い(図６Ｃ)ことを示す。
図７Ａ〜７Ｂは、抗原チャレンジに曝されたＣＡＲ−Ｔ細胞の増大および表現型を示す。図７Ａは、先に記載したサイトカインに曝された、ＣＡＲ−Ｔの抗原チャレンジによる総体的蓄積および生存能を示す２つのグラフを記載する。記載するサイトカインに曝したＴ細胞を１５日目に採取し、次いでＳＫＯＶ３と５：１のＥ／Ｔ比率で７日間共培養する。７日目にＣＡＲ−Ｔ細胞の増大を計算し、Ｔ細胞の生存能を評価する。図７Ｂは、種々のサイトカイン群におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ−Ｔ細胞の記憶Ｔサブセットの分布を示す二つのグラフである。Ｎ.Ｓ.、統計的差異なし。
図８Ａ〜８Ｃは、先にサイトカインに曝した種々のＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。図８Ａは、種々のサイトカイン暴露Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ１９−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍増殖曲線である。データは平均値±ＳＥＭとして示す。矢印はＴ細胞注入の時点を示す。図８Ｂは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の最初の投与１５日後のマウス末梢血における循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数の定量化を示すグラフである。図８Ｃは、マウス血中の循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の定量化を示すグラフである。
図９はＣＤ３およびＣＤ１９集団を示す一連のＦＡＣＳプロット(上部)およびアフェレーシスからの細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で選択した細胞、ＣＤ２５枯渇細胞およびＣＤ２５富化細胞のＣＤ１４発現を示すヒストグラム(下部)である。
図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞とＣＤ２５枯渇細胞の増殖能比較を示す。図１０Ａは、記載した培養日数での総細胞数を示すグラフである。図１０Ｂは、記載した培養日数各々の定量化集団倍加を示すグラフである。図１０Ｃは、記載した培養日数での生存可能細胞のパーセンテージを示す。
図１１は、記載するサイトカイン添加、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−７およびＩＬ−１５との培養後未処理ＰＢＭＣおよびＣＤ２５枯渇ＰＢＭＣにおけるＣＤ３およびＣＤ１９の分布を示す一連のＦＡＣｓプロットである。
図１２は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズで刺激し、未処理のままであるか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９ ＣＡＲ(ＣＤ１９.ＢＢｚ)で形質導入され、脱ビーズ処理され、５日目および９日目に採取されたＰＢＭＣの集団倍加(図１７Ａ)および平均サイズ(ｆＬ)(図１７Ｂ)での増大プロファイルを示すグラフである。
図１３は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズで刺激し、未処理のままであるか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９ ＣＡＲ(ＣＤ１９.ＢＢｚ)で形質導入され、脱ビーズ処理され、５日目および９日目に採取されたＰＢＭＣで処理したＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞の溶解パーセントとしての細胞毒性を表すグラフである。
図１４は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズ(３ｘ２８ビーズ)、野生型Ｋ５６２細胞、ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞、ＡＬＬ細胞(Ｎａｌｍ６)またはＣＬＬ細胞(ＰＩ１４)で刺激されたＰＢＭＣの増殖を表すグラフである。ＰＢＭＣは未処理のままであるか(ＵＴＤ)またはＣＤ１９ ＣＡＲ(ＣＡＲＴ１９)で形質導入され、脱ビーズ処理され、５日目および９日目に採取されている。
図１５は、製造スキーム例の模式図である。
図１６は、製造スキーム例の模式図である。
図１７は、ＣＴＬ０１９ ＣＡＲ、ＣＨＰ９５９−１１５およびＣＨＰ９５９−１２１でトランスフェクトし、０〜９日間増大させたドナー細胞の２種の異なる製造バッチの細胞増殖レベルを表すグラフである。
図１８は、ＣＴＬ０１９ ＣＡＲ、すなわちＣＨＰ９５９−１１５またはｓｓ１−ｍｅｓｏＣＡＲ、すなわちＣＨＰ９５９−１２１の何れかでトランスフェクトし、アフェレーシス後０〜９日間増大させたドナー細胞の２種の異なる製造バッチの炎症誘発性サイトカイン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−４産生を示すグラフである。
図１９は、抗ＣＡＲ１９−イディオタイプ抗体ビーズまたは対照ビーズで刺激し、ＣＴＬ０１９ ＣＡＲでトランスフェクトし、５〜９日間増大させたドナー細胞におけるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４産生レベルを表すグラフである。無サイトカインまたは低サイトカインレベル(＜２００pg／ml)が対照ビーズで検出された。
図２０は、未処理のまま(ＵＴＤ)またはＣＤ１９ ＣＡＲ(ＣＡＲＴ１９)で形質導入し、脱ビーズ処理し、次いで５日目および９日目に採取したＰＢＭＣのＮａｌｍ６(ＡＬＬ)細胞のルシフェラーゼアッセイを使用する総ライセートに基づく細胞死滅を表すグラフである。ＰＭＢＣ対Ｎａｌｍ６細胞(エフェクター(Ｅ)：標的(Ｔ))を種々の比率で培養した。示されるとおり、５日目に採取したＣＡＲＴ１９細胞が良好な殺細胞力を有する。
図２１は、未処理のまま(ＵＴＤ)またはＣＤ１９ ＣＡＲ(ＣＡＲＴ１９)で形質導入し、脱ビーズ処理し、次いで５日目および９日目に採取したＰＢＭＣの長期インビボ殺細胞力を表すグラフである。ＰＢＭＣをＮａｌｍ６細胞を接種した非肥満糖尿病性／重症複合免疫不全マウスに導入した。
図２２は、細胞増大のためのメソセリン被覆ビーズとメソセリンＣＡＲＴの使用を表す模式図である。
図２３は実施例４の実験デザインの模式図である。
図２４Ａおよび２４Ｂは、図２３に示す細胞型の集団倍加(図２４Ａ)および細胞サイズ(図２４Ｂ)を表すグラフである。
図２５Ａおよび２５Ｂは、５日(図２５Ａ)および１１日(図２５Ｂ)後の形質導入効率表すグラフである。
図２６Ａおよび２６Ｂは、メソセリンＣＡＲ構築物および発現レベルを示す。図２６Ａは、実施例４において使用する種々のＣＡＲ構築物の模式図である。
図２７Ａ〜２７Ｃは、メソセリンＣＡＲ刺激を介する培養における末梢血Ｔ細胞および臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞の増大を示す。ＣＤ８ Ｔ細胞を図２７Ａに示す。ＣＤ４ Ｔ細胞を図２７Ｂに示す。臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞を図２７Ｃに示す。
図２８は、Ｔ細胞表面の一過性に発現されたキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を介する、その同族抗原による刺激の方法の模式図である。
図２９は、同族抗原で被覆されたビーズでの細胞増大のためのＣＡＲの使用の模式図である。
図３０Ａおよび３０Ｂは、メソセリン被覆ビーズ曝露後のメソセリンＣＡＲ発現細胞の集団倍加(図３０Ａ)および細胞サイズ(図３０Ｂ)を表すグラフである。
図３１Ａ〜３１Ｃは、培養においてメソセリンＣＡＲ(図３１Ａ)またはＣＤ１９ ＣＡＲ(図３１Ｂ)で刺激された末梢血Ｔ細胞およびメソセリンＣＡＲで刺激された臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞(図３１Ｃ)の増大を表すグラフである。
図３２Ａ〜３２Ｃは、実施例６のＣＡＲ構築物および実験デザインを示す。図３２Ａは、実施例６で比較されているＣＡＲ構築物の模式図である。ＣＡＲの両方とも、ヒトＣＤ１９を認識するＦＭＣ６３抗体またはヒトメソセリンに結合するＳＳ１ ｓｃＦｖの一本鎖可変フラグメントである。膜貫通(ＴＭ)ドメインおよび細胞内ドメインを示す。図３２Ｂは、無ＣＡＲエレクトロポレーションのみ(モック)対照と比較した、エレクトロポレーション１日後のＣＡＲの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を表すグラフである。右パネルは、抗イディオタイプ剤で検出したＣＡＲの平均蛍光強度(ＭＦＩ)である。データは２５名にわたる独立した健常ヒトドナーからの細胞で検証した独立した実験のものである。図３２Ｃは実験デザインの模式図である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞はインビトロ転写ＲＮＡで電気穿孔される。細胞を一夜休息させた後、ＣＡＲ発現を確認し、インビトロ培養を同族抗原被覆ビーズおよびサイトカイン存在下始める。
図３３Ａ〜３３Ｅは、ＢＢｚ ＩＣＤは、インビトロでＣＤ８ Ｔ細胞に生存および増殖優位性を提供する。図３３Ａは、同族抗原と共培養２４時間後に細胞表面で測定したＣＤ６９レベルを示す。図３３Ｂは、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞増殖を示し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞は図３３Ａにおけるとおりおよび実施例６に記載するとおり刺激された。データは少なくとも１０の異なる健常ドナーのものである。図３３Ｃは、バルクＣＤ８＋ Ｔ細胞(左)またはナイーブ(ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋) Ｔ細胞(右)のメソセリンＣＡＲ Ｔ細胞増殖を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞をメソセリン−Ｆｃ被覆ビーズを使用して刺激した。図３３Ｄは、培養中の特定の時点でのＣＡＲ Ｔ細胞の細胞表面発現ＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯの代表的プロット(少なくとも６ドナーから)を示す。示す細胞は、生存ＣＤ３＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対して予めゲーティングされている。記載する数は、各ゲートで検出される細胞のパーセンテージである。図３３Ｅは、種々の時点での２８ｚおよびＢＢｚＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞培養におけるＴｃｍおよびＴｅｍサブセットの相対的変化を示す。生存細胞の絶対数を、特定した時点で各集団について計算した。グラフは、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に対して正規化したＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴｃｍまたはＴｅｍの相対的倍率変化を示す。データは平均±ＳＥＭとしてプロットする(＊＊＊＊、ｐ＜０.０００１、＊＊、ｐ≦０.０１)。
図３４Ａ〜３４Ｍは、細胞性代謝に対するＣＡＲシグナル伝達ドメインの影響およびＣＡＲ Ｔ細胞による解糖または脂肪酸酸化に対する優先的依存を示す。図３４Ａ〜３４Ｄに示すとおり、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、酸素消費および予備呼吸器能のレベル上昇を示す。図３４Ａは、抗イディオタイプと共に２８ｚおよびＢＢｚシグナル伝達ドメインを発現するＣＤ１９ ＣＡＲ ＣＤ８＋ Ｔ細胞で刺激後の平均細胞体積に対する抗原刺激の影響を示す。この図に示されるとおり、２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、０日、７日および２０日に測定して同等な平均細胞サイズを有する。図３４Ｂは、０日のベースライン(ＣＡＲ ｍＲＮＡエレクトロポレーション後かつ刺激前)および基底条件および実施例６に特定するミトコンドリア阻害剤に応答する培養下７日および２１日刺激後の２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の酸素消費速度(ＯＣＲ)を示す。基底ＯＣＲレベル(図３４Ｃ)、基底ＯＣＲ／ＥＣＡＲ比率(図３４Ｄ)、最大呼吸器レベル(図３４Ｆ)および基底ＥＣＡＲレベル(図３４Ｇ)を７日目および２１日目に測定した(ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＯＸＰＨＯＳの優先的上昇を明らかにする)。データは、少なくとも５の健常ヒトドナーからの細胞で実施した少なくとも５個の独立した実験のものであり、平均±ＳＥＭとしてプロットした(＊、ｐ＜０.０５)。図３４Ｅは、２８ｚおよびＢＢｚ、ＣＡＲ Ｔ細胞で評価した解糖代謝および脂質酸化に関与する遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示す。プロットは、４の独立したドナーから得た細胞を用いる少なくとも３つの独立した実験からのデータを表す(＊＊、ｐ＜０.０１；＊、ｐ＜０.０５)。データは平均±ＳＥＭとして表す。図３４Ｈ〜３４Ｊは、異なる記憶表現型について餞別したＣＡＲ Ｔ細胞で測定した基底ＯＣＲレベルである、中央記憶(ＣＭ；図３４Ｈ)、ナイーブ(Ｎ；図３４Ｉ)およびエフェクター記憶(ＥＭ；図３４Ｊ)。データは少なくとも３の健常ヒトドナーから得た細胞で実施した少なくとも３つの独立した実験のものであり、平均±ＳＥＭとしてプロットする。図３４Ｋは、３つの異なって選別した記憶サブセットについて測定した基底ＥＣＡＲレベルを示す。データは少なくとも３の健常ヒトドナーから得た細胞で実施した少なくとも３つの独立した実験のものであり、平均±ＳＥＭとしてプロットする(＊、ｐ＜０.０５)。図３４Ｌは、４８時間にわたる細胞外培地からのグルコース取り込みおよび培地への乳酸放出の測定値を示す。図３４Ｍは、脂肪酸取り込みおよび分解を評価するための[１３Ｃ１６]パルミチン酸と培養したＴ細胞において測定した標識アセチル−ＣｏＡのパーセンテージを示す。
図３５Ａ〜３５Ｃは、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の予備呼吸器能(ＳＲＣ)が増強されていることを示す。図３５Ａは、細胞をＦＣＣＰで処理後の最大ＯＣＲレベル対培養中の定常状態での基底ＯＣＲレベルの比率として測定したＳＲＣを示す。データは試験した３の独立したドナーを表す(＊ｐ＜０.０５)。図３５Ｂは、３つの異なる時点で撮影した２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の透過型電子顕微鏡像を示す。スケールバーは２μmを現す。図３５Ｃは、細胞あたりの個々のミトコンドリアの計数を示す。データは２０の無作為に選択した細胞を示し(条件あたりに分析した少なくとも７５細胞中)、平均±ＳＥＭとして表す(＊＊＊、ｐ＜０.００１)。
図３６Ａ〜３６Ｄは、ＢＢｚ ＣＡＲシグナル伝達がミトコンドリア新生を増強するためにＴ細胞の遺伝子変化をインプリントすることを示す。図３６Ａは、Mitotracker(緑色)、ＤＡＰＩ(青色)および細胞膜色素ＤｉＩ(赤色)で染色した共焦点画像を示す。スケールバーは２μmを表す。図３６Ｂは、細胞膜(赤色)に包まれた領域内のMitotracker(緑色)のパーセンテージとして測定した、ミトコンドリアにより占拠される細胞質のパーセンテージの定量化を示す。データは、特定した時点の各々で少なくとも３つの独立した画像の平均±ＳＥＭを示し、少なくとも１５の独立した細胞を画像あたり採点した(＊＊＊＊、ｐ＜０.０００１)。図３６Ｃは、特定した時点での、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の発現レベルに対して正規化したＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼ１(ＭＴ−ＣＯ１)およびミトコンドリア転写因子Ａ(ＴＦＡＭ)の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。データは４の独立したドナーでの少なくとも３つの独立した実験から作成し(＊、ｐ＜０.０５)、平均±ＳＥＭとして表す。図３６Ｄは、特定した時点での２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較したＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞における核呼吸因子１(ＮＲＦ１)およびＧＡ結合タンパク質(ＮＲＦ２)の正規化ｍＲＮＡ発現レベルを示す。データは４の独立したドナーでの少なくとも３つの独立した実験から作成し(＊、ｐ＜０.０５)、平均±ＳＥＭとして表す。
図３７は、２つの他の独立したドナーについてのＣＤ１９−２８ｚおよびＣＤ１９−ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の増大プロファイルを示す。ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が培養において増殖し続け、長期に生存することが一貫して観察される。
図３８は、２つの他の独立したドナーについてのメソセリン特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の増大プロファイルを示す。ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が培養において増殖し続け、長期に生存することが一貫して観察される。
図３９は、刺激前(０日目)および基底条件および実施例６に特定するミトコンドリア阻害剤存在下、培養７日および２１日の２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞における酸素消費速度(ＯＣＲ)を示す。メソセリン特異的ＣＡＲで実施した代謝アッセイは、ＢＢｚ−ＣＡＲ刺激細胞における高い酸素消費速度を明らかにする。
図４０は、図３７および３８に示す、２ＣＡＲ構築物(ＣＤ１９ ＣＡＲ ｎ＝１０、ｐ＊＊＝＜０.０１、メソセリンＣＡＲ ｎ＝６、ｐ＊＝＜０.０５)間の総集団倍加を示す。ＣＤ１９またはＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、それぞれ、ＣＤ１９ ｓｃＦｖに対する抗イディオタイプ抗体またはビーズに固定化したメソセリン−Ｆｃで刺激した。
図４１は、抗原暴露後細胞表面のＣＡＲおよび主要サイトカイン受容体発現レベルを示す。上部パネルは、抗イディオタイプ抗体のビーズに固定化されたＣＤ１９ ｓｃＦｖへの結合後、Ｔ細胞表面に検出可能ＣＡＲ発現レベルが何も残っていないことを示す。これらのプロットは、抗原刺激前にＣＡＲを発現した、図３２Ｂでアッセイしたのと同じ細胞集団である。下部パネルは、フローサイトメトリーでアッセイした細胞表面のサイトカイン受容体、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１５Ｒαのレベルを示す。
図４２は、２１日目に測定した２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるミトコンドリア内容物の変化を示す。代表的２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の透過型電子顕微鏡画像は２１日目に撮像した。スケールバーは２μmを表す。
詳細な記載
ここに記載する方法は、少なくとも一部、免疫エフェクター細胞表面に発現される(例えば、一過性に発現される)ＣＡＲの活性化が、免疫エフェクター細胞の集団の増大および／または活性化の有効な手段を提供するとの発見に基づく。ここに記載するとおり同族抗原または抗イディオタイプ抗体による免疫エフェクター細胞の表面のＣＡＲの活性化は細胞増大をもたらし得る。ある実施態様において、このような細胞増大は、ＣＡＲの一過性発現(例えば、インビトロ転写ＲＮＡによる)による細胞の遺伝子型または表現型を実質的に変えることなく達成できる。ここに記載する方法は、免疫エフェクター細胞増大について先に使用されていた方法を越える顕著な利点を提供する。
初代ヒトＴ細胞の増大に使用できることに加えて、ここに記載する方法をナイーブ細胞、Ｔ制御性細胞、Ｔｈ−１７細胞、アネルギー化Ｔ細胞および幹細胞Ｔ細胞または臍帯血細胞を含むＴリンパ球の特異的サブセットの増大に使用できる。特定の理論に縛られることを望まないが、ここに記載する方法および組成物は、ＴＣＲを経る反復刺激が抗原無経験Ｔ細胞に致死的となり得るため、既存の実験系を超える改善である。一過性に発現された表面受容体を経る単一刺激はこの問題を避け得る。さらに、ここに提供される方法は、ＴＣＲを妨げることなくＴ細胞免疫療法を可能とし、培養におけるあまり速くない分化および“幼若”Ｔ細胞の促進をもたらす。他の実施態様において、ここに記載する方法は、レンチウイルスベクターのようなベクターを使用する高効率形質導入を可能とする。
有利に、Ｔ細胞受容体を欠くまたは機能が低下したＴ細胞受容体を有する他の細胞型を増大できる。例えば、あらゆるタイプの造血幹細胞が、表現型の改変なく増大でき、アネルギー化Ｔ細胞、ＴＨ１７、ＮＫ、ＮＫＴおよびＢ細胞が増大され得る。
ウイルス介在遺伝子伝達系は、前臨床および臨床免疫療法試験で広く使用されている。Ｔリンパ球へのウイルス介在遺伝子伝達のための現在の方法は、細胞活性化、続くウイルスベクターの天下を必要とする。この活性化は、また、伝統的にＴＣＲを経る刺激を介して達成される。ここに記載するＣＡＲベースの刺激の方法を使用して、レンチウイルスベクターのようなベクターでの高効率形質導入が達成できる。初期活性化を達成するための一過性に発現されたＣＡＲを経る刺激により、細胞を同じまたは異なるＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入できる。
ある実施態様において、ここに記載する方法は、免疫エフェクター細胞のインビトロ増大のために提供される。さらなる実施態様において、ここに記載する方法は、Ｔ細胞のインビボ増大に繋がるリンパ節注射またはＴＩＬのインビボ増大に続く腫瘍への注射がもたらされる。
従って、ある実施態様において、ここに開示する方法は、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を、ＣＡＲの一過性発現に適する条件下で接触させ(ここで、ＣＡＲは同族抗原分子を標的とする)、そして免疫エフェクター細胞の集団を同族抗原分子存在下で培養することによる、免疫エフェクター細胞の集団を増大する方法のために提供される。ある実施態様において、核酸はＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ＲＮＡである。他の実施態様において、同族抗原分子は癌関連抗原分子である。ある実施態様において、同族抗原分子は基質、例えば、ビーズに結合され、免疫エフェクター細胞集団はインビトロで増大される。他の実施態様において、同族抗原は細胞、例えば、腫瘍細胞で発現され、免疫エフェクター細胞集団はインビボで増大される。他の態様において、本発明は、免疫エフェクター細胞集団の有効量を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を提供する方法に関し、ここで、免疫エフェクター細胞集団はここに記載する方法により増大される。
定義
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解されているのと同じ意味を有する。
単数表現は、対象物の１または１超(すなわち、少なくとも１)を意味する。一例として、“要素”は１要素または１を超える要素を意味する。
用語“約”は、量、期間などの測定可能な値にかかるとき、特定した値からの±２０％またはある場合には±１０％またはある場合には±５％またはある場合には±１％またはある場合には±０.１％の逸脱を、このような逸脱が開示の方法に実質に適切である限り、包含することを意味する。
“獲得”または“獲得する”は、この用語がここで使用されている限り、物体(例えば、サンプル、細胞または細胞集団、ポリペプチド、核酸または配列)または値、例えば、数値の、該物体または値の“直接的獲得”または“間接的獲得”による取得をいう。ある実施態様において、獲得は、細胞または細胞集団(例えば、ここに記載する免疫エフェクター細胞または集団)の入手または採取をいう。“直接的獲得”は、物体または値を得るための方法の実施(例えば、合成または分析もしくは精製方法の実施)をいう。“間接的獲得”は、他の団体または起源(例えば、物体または値を直接獲得した第三者実験室)から得る物体または値をいう。物体の直接的獲得は、物質、例えば、出発物質の物理的変化を含む方法の実施を含む。変化の例は、２以上の出発物質からの物体の製造、物質の剪断または細分化、物質の分離または精製、２以上の物質の混合物への混合、共有結合または非共有結合の破壊または形成を含む化学反応の実施を含む。値の直接的獲得は、サンプルまたは他の物質の物理的変化を含む方法の実施、例えば、物質、例えば、サンプル、検体または試薬における物理的変化を含む分析工程の実施(ここでは“物理的分析”と呼ぶこともある)、分析方法、例えば、次の物質、例えば、検体またはそのフラグメントもしくは他の誘導体の他の物質からの分離または精製、検体またはそのフラグメントもしくは他の誘導体と他の物質、例えば、緩衝液、溶媒または反応物の混合または例えば、検体の第一原子と第二原子間の共有結合または非共有結合の破壊または形成による、検体またはそのフラグメントもしくは他の誘導体の構造変更または、例えば、試薬の第一原子と第二原子間の共有結合または非共有結合の破壊または形成による、試薬またはそのフラグメントもしくは他の誘導体の構造の変更の１以上を含む方法の実施を含む。
用語“生物学的同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により生じる効果と同等の効果を生じるのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量をいう。ある実施態様において、効果は、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害で測定して、例えば、インビボまたはインビトロアッセイで評価して、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイで測定したｍＴＯＲ阻害レベルまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定をいう。ある実施態様において、効果は、細胞選別により測定した、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率の改変である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率の改変を達成する量または用量である。
用語“キメラ抗原受容体”または“ＣＡＲ”は、一般に最も単純な実施態様においては２個のポリペプチドの一組をいい、これは、免疫エフェクター細胞にあるとき、細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性提供し、細胞内シグナル産生を伴う。ある実施態様において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義する刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも称する)を含む。ある実施態様において、一組のポリペプチドは同一ポリペプチド鎖内にある(例えば、キメラ融合タンパク質を含む)。ある実施態様において、一組のポリペプチドは互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。ある実施態様において、一組のポリペプチドは、二量体化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と結合するゼータ鎖である。ある態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、少なくとも一つの下に定義する共刺激分子由来の１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲの共刺激分子は、ここに記載する共刺激分子、例えば、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８から選択される。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激分子由来の２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激分子由来の少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意のリーダー配列を含む。ある態様において、ＣＡＲは、さらに、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞性膜への局在化中に所望により抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から開裂される。
“ＣＡＲ分子”は、文脈によって、ＣＡＲ(例えば、ＣＡＲポリペプチド)、ＣＡＲをコードする核酸または両方をいう。
ここに記載するもののような特異的腫瘍抗原Ｘを標的とする抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ)を含むＣＡＲはＸＣＡＲとも称する。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲはＣＤ１９ＣＡＲと称する。
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーの産生によりまたはこのようなメッセンジャーに応答するエフェクターとして機能することにより、規定されたシグナル伝達経路を経て細胞活動を制御するために細胞内で情報伝達することにより作用するタンパク質の機能的部分をいう。
ここで使用する用語“抗体”は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、複数鎖または一本鎖またはインタクト免疫グロブリンであってよく、天然源に由来しても組み換え起源でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による)能力を維持する、抗体の少なくとも一部分をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂのような単一ドメイン抗体(ＶＬまたはＶＨの何れか)、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成された多特異的抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントは、また単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも包含され得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントはまたフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づく骨格に移植もできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
用語“阻害”または“阻害剤”は、ある分子、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、メソセリンまたはＣＤ７９ａのあるパラメーター、例えば、活性の減少を含む。例えば、活性、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ−３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、メソセリンまたはＣＤ７９ａの活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上の阻害は本用語に包含される。それ故に、阻害は１００％である必要はない。阻害剤についての活性はここに記載するとおりまたは当分野で知られるアッセイにより決定できる。
ここで使用する用語“ＣＤ１０”は、白血病細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ１０のアミノ酸配列はAccession Nos. NP_009218.2; NP_000893.2; NP_009219.2; NP_009220.2に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はAccession Nos. NM_007287.2(バリアント１ｂｉｓ); NM_000902.3(バリアント１); NM_007288.2(バリアント２ａ); NM_007289.2(バリアント２ｂ)に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分はＣＤ１０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ１０タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ１０”は、完全長野生型ＣＤ１０の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＣＤ１９”は、白血病前駆体細胞で検出可能な抗原決定因子である表面抗原分類１９タンパク質をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列はUniProt／Swiss-Prot Accession No. P15391に見ることができ、ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列はAccession No. NM_001178098に見ることができる。ここで使用する、“ＣＤ１９”は、完全長野生型ＣＤ１９の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽細胞性白血病、慢性リンパ球白血病および非ホジキンリンパ腫を含む、大部分のＢ細胞系譜癌で発現される。ＣＤ１９を発現する他の細胞は、下の“ＣＤ１９の発現と関連する疾患”の定義に提供する。これはまたＢ細胞前駆細胞の早期マーカーである。Ｓｅｅ、例えば、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分ＴはＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ１９タンパク質は癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“ＣＤ２０”は、Ｂ細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトＣＤ２０はまた膜通過４−ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１(ＭＳ４Ａ１)とも呼ばれる。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列はAccession Nos. NP_690605.1およびNP_068769.2に見ることができ、ヒトＣＤ２０のトランスクリプトバリアント１および３をコードするヌクレオチド配列は、それぞれAccession No. NM_152866.2およびNM_021950.3に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分はＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ２０タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ２０”は、完全長野生型ＣＤ２０の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する、用語“ＣＤ２２”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、アイソフォーム１〜５ヒトＣＤ２２のアミノ酸配列は、それぞれAccession Nos. NP 001762.2、NP 001172028.1、NP 001172029.1、NP 001172030.1およびNP 001265346.1に見ることができ、ヒトＣＤ２２のバリアント１〜５をコードするヌクレオチド配列はそれぞれAccession No. NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM 001185101.1および NM 001278417.1に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分はＣＤ２２タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ２２タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ２２”は、完全長野生型ＣＤ２２の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＣＤ３４”は、造血幹細胞およびある癌細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ３４のアミノ酸配列はAccession Nos. NP_001020280.1(アイソフォームａ前駆体); NP_001764.1(アイソフォームｂ前駆体)に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はAccession Nos. NM_001025109.1(バリアント１); NM_001773.2(バリアント２)に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分はＣＤ３４タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ３４タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ３４”は、完全長野生型ＣＤ３４の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＣＤ１２３”は、ある悪性血液癌細胞、例えば、白血病細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ１２３のアミノ酸配列はAccession Nos. NP_002174.1(アイソフォーム１前駆体); NP_001254642.1(アイソフォーム２前駆体)に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はAccession Nos. NM_002183.3(バリアント１); NM_001267713.1(バリアント２)に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分はＣＤ１２３タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ１２３タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ１２３”は、完全長野生型ＣＤ１２３の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＣＤ７９ｂ”は、ある悪性血液癌細胞、例えば、白血病細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ７９ｂのアミノ酸配列はAccession Nos. NP_000617.1(アイソフォーム１前駆体)、NP_067613.1(アイソフォーム２前駆体)またはNP_001035022.1(アイソフォーム３前駆体)に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はAccession Nos. NM_000626.2(トランスクリプトバリアント１)、NM_021602.2(トランスクリプトバリアント２)またはNM_001039933.1(トランスクリプトバリアント３)に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分はＣＤ７９ｂタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ７９ｂタンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ７９ｂ”は、完全長野生型ＣＤ７９ｂの変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＣＤ７９ａ”は、ある悪性血液癌細胞、例えば、白血病細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ７９ａのアミノ酸配列はAccession Nos. NP_001774.1(アイソフォーム１前駆体)またはNP_067612.1(アイソフォーム２前駆体)に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はAccession Nos. NM_001783.3(トランスクリプトバリアント１)またはNM_021601.3(トランスクリプトバリアント２)に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分はＣＤ７９ａタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ７９ａタンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ７９ａ”は、完全長野生型ＣＤ７９ａの変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＣＤ１７９ｂ”は、ある悪性血液癌細胞、例えば、白血病細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＣＤ１７９ｂのアミノ酸配列はAccession Nos. NP_064455.1(アイソフォームａ前駆体)またはNP_690594.1(アイソフォームｂ前駆体)に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はAccession Nos. NM_020070.3(トランスクリプトバリアント１)またはNM_152855.2(トランスクリプトバリアント２)に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ１７９ｂタンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＣＤ１７９ｂタンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＣＤ１７９ｂ”は、完全長野生型ＣＤ１７９ｂの変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＦＬＴ−３”は、造血前駆細胞およびある癌細胞、例えば、白血病細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＦＬＴ−３のアミノ酸配列はAccession Nos. NP_004110.2に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はAccession Nos. NM_004119.2に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＦＬＴ−３タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＦＬＴ−３タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＦＬＴ−３”は、完全長野生型ＦＬＴ−３の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“ＲＯＲ１”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定因子である。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＲＯＲ１のアイソフォーム１および２前駆体のアミノ酸配列はそれぞれAccession Nos. NP_005003.2およびNP_001077061.1に見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列はそれぞれAccession Nos. NM_005012.3およびNM_001083592.1に見ることができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある態様において、ＲＯＲ１タンパク質は癌細胞に発現される。ここで使用する、“ＲＯＲ１”は、完全長野生型ＲＯＲ１の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
ここで使用する用語“メソセリン”は、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合および巨核球増強因子(ＭＰＦ)と呼ばれるアミノ末端３１kDaシェッドフラグメントにより細胞膜に固定される４０kDaタンパク質、メソセリンをいう。両方のフラグメントはＮ−グリコシル化部位を含む。本用語はまた“可溶性メソセリン／ＭＰＦ関連”とも称される４０kDaカルボキシル末端フラグメントの可溶性スプライスバリアントを含む。好ましくは、本用語は、GenBank accession number AAH03512.1のヒトメソセリンおよび、例えば、細胞膜、例えば、癌細胞膜に発現される、その天然開裂部分を含む。ここで使用する、“メソセリン”は、完全長野生型メソセリンの変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含むタンパク質を含む。
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、ここで、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクト抗体の特異性を保持する。断らない限り、ここで使用するｓｃＦｖはＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれの順序で含んでもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでもＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
抗体または抗体そのフラグメントを含むＣＡＲの部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)およびヒト化抗体を含む、抗原結合ドメインが隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される多様な形態で存在できる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある実施態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは抗体フラグメントを含む。さらなる実施態様において、ＣＡＲはｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも１免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は抗体および抗体フラグメントを包含する。ある実施態様において、抗体分子は多特異的抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数のうちの第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は第一エピトープに結合特異性を有し、複数のうちの第二免疫グロブリン可変ドメイン配列第二エピトープに結合特異性を有する。ある実施態様において、多特異的抗体分子は二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超えない抗原に特異性を有する。二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
ここで使用する用語“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”は、抗原特異性および結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列をいう。例えば、一般に、各重鎖可変領域に３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域に３ＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)がある。あるＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat”ナンバリングスキーム), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia”ナンバリングスキーム)に記載のものまたはこれらの組み合わせを含む、多数の周知スキームの何れかを使用して決定できる。Kabatナンバリングスキーム下、ある実施態様において、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けられ、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)のＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)と番号付けられる。Chothiaナンバリングスキーム下、ある実施態様において、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は２６〜３２(ＨＣＤＲ１)、５２〜５６(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けられ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は２６〜３２(ＬＣＤＲ１)、５０〜５２(ＬＣＤＲ２)および９１〜９６(ＬＣＤＲ３)と番号付けられる。複合KabatおよびChothiaナンバリングスキームにおいて、ある実施態様において、ＣＤＲは、Kabat ＣＤＲ、Chothia ＣＤＲまたは両方の部分であるアミノ酸残基に対応する。例えば、ある実施態様において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨにおいてアミノ酸残基２６〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)およびＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬにおいてアミノ酸残基２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)に対応する。
抗体または抗体そのフラグメントを含む本発明のＣＡＲの部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二特異的抗体を含む、抗原結合ドメインが隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲはｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
用語“抗体重鎖”は、抗体分子の天然に存在する立体構造に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいい、これは、通常抗体が属するクラスを決定する。
用語“抗体軽鎖”は、抗体分子の天然に存在する立体構造に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現される抗体のような、組み換えＤＮＡ技術を使用して産生される抗体をいう。本用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生され、そのＤＮＡ分子が抗体を特定する抗体タンパク質またはアミノ酸配列を発現する、抗体も意味すると解釈すべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、周知である組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
用語“抗原”、“Ａｇ”または“抗原分子”は、免疫応答を誘発する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫学的に適格細胞の活性化または両方が関与し得る。ある実施態様において、抗原は、全タンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子であり得る。他の実施態様において、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡ由来であり得る。免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡは、それゆえに、ここで使用する用語としての“抗原”をコードする。抗原は、必ずしも遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によりコードされる必要はない。ある実施態様において、抗原は、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を含み、これらのヌクレオチド配列は所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするために種々の組み合わせで配置される。ある実施態様において、抗原は、全く“遺伝子”によりコードされる必要はない。ある実施態様において、抗原は、合成により産生されても生物学的サンプルに由来してもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子であるかもしれない。このような生物学的サンプは、他の生物学的成分を伴う組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または流体を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗原は、例えば、炭水化物(例えば、単糖、二糖、オリゴ糖および多糖)を含む。
用語“同族抗原分子”は、ここに記載するあらゆる抗原を含む。ある実施態様において、それは、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲの何れかにより認識、例えば、標的とされる、抗原をいう。他の実施態様において、それは、ここに記載する癌関連抗原をいう。ある実施態様において、同族抗原分子は組み換え分子である。
用語“抗イディオタイプ(またはイディオタイプ)抗体分子”または“抗抗原イディオタイプ(イディオタイプ)抗体分子”は、抗体、例えば、抗体の抗原結合部位または可変領域に結合する抗体分子をいう。ある実施態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、抗原、例えば、ここに記載する抗原(例えば、ここに記載する同族抗原分子)と接触する抗体のエピトープと結合する。ある実施態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、ＣＡＲ抗原結合ドメイン、例えば、抗体または抗体フラグメントを含むＣＡＲの部分(例えば、ＣＡＲの抗原結合部分)と結合する。
ここで使用する用語“ＣＡＲ分子のリガンド”は、ＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子の部分に結合する分子をいう。ある実施態様において、リガンドは、ＣＡＲ抗原結合ドメイン、例えば、抗体または抗体フラグメントを含むＣＡＲの部分に結合する。ある実施態様において、リガンドは抗原分子、例えば、ここに記載する、例えば、同族抗原分子である。他の実施態様において、リガンドは、抗イディオタイプ抗体分子、例えば、ここに記載する抗抗原(例えば、ＣＤ１９)イディオタイプ抗体分子である。
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
用語“同種”は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のあらゆる物質をいう。２以上の個体は、１以上の座位の遺伝子が同一でないならば、互いに同種といえる。ある態様において、同じ種の個体からの同種物質は、抗原性に相互作用するのに十分遺伝的に十分異なり得る。
用語“異種”は、異なる種の動物由来のあらゆる物質をいう。
用語“癌”は、異常細胞の未制御の増殖により特徴付けられる疾患である。癌細胞は局所的にまたは血流およびリンパ系を介して、体の他の部分に広がり得る。種々の癌の例をここに記載し、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”はここでは相互交換可能に使用し、例えば、両用語とも固形および液性、例えば、汎発性または循環、腫瘍を包含する。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は前悪性ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
ここで使用する用語“由来する”は、第一分子と第二分子の関係を示す。一般に第一分子と第二分子の構造類似性をいい、第二分子に由来する第一分子への過程または起源への限定を暗示または包含しない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子由来細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを産生する能力を有するように十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。細胞内シグナル伝達ドメインを産生する特定の過程への限定を暗示または包含しない、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から出発し、望まない配列を削除するかまたは変異を課し、細胞内シグナル伝達ドメインに到達しなければならないことは意味しない。
ここに記載する用語“腫瘍抗原の発現と関連する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍または脊髄形成異常症、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態の増殖性疾患またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞と関連する非癌関連徴候を含む、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する疾患またはここに記載する腫瘍抗原を発現する発現と関連する状態を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する癌は血液癌である。ある実施態様において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する癌は固形癌である。さらにここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、例えば、非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性ここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植拒絶反応を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、いつかの時点で発現する。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは低レベルで存在し得る。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞はある時点で検出可能レベルの腫瘍抗原タンパク質を産生しており、その後実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しない。
用語“ＣＤ１９の発現と関連する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍または脊髄形成異常症、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患またはＣＤ１９を発現する細胞と関連する非癌関連徴候を含む、ＣＤ１９(例えば、野生型または変異体ＣＤ１９)を発現する細胞と関連する疾患またはＣＤ１９(例えば、野生型または変異体ＣＤ１９)を発現するまたはいつかの時点で発現する細胞と関連する状態をいう。疑いを避けるため、ＣＤ１９の発現と関連する疾患は、例えば、ＣＤ１９を標的とする分子、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲでの処置により、例えば、ＣＤ１９発現が下方制御されているために、現在ＣＤ１９を発現しないが、かつてＣＤ１９を発現した細胞と関連する状態を含み得る。ある態様において、ＣＤ１９の発現と関連する癌は血液癌である。ある態様において、血液癌は白血病またはリンパ腫である。ある態様において、ＣＤ１９の発現と関連する癌は、例えば、急性骨髄白血病(ＡＭＬ)、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(ＴＡＬＬ)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病を、例えば、含むが、これらに限定されない癌および悪性腫瘍を含む。ＣＤ１９の発現と関連するさらなる癌または血液状態は、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、骨髄増殖性新生物、組織球障害(例えば、肥満細胞障害または芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物)、肥満細胞障害、例えば、全身性肥満細胞症または肥満細胞白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、形質細胞骨髄腫および骨髄血液細胞の産生無効(または形成異常)により纏められる血液状態の雑多な集合である“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されない。
さらにＣＤ１９の発現と関連する疾患発現は、例えば、非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性ＣＤ１９の発現と関連する疾患を含むが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現と関連する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患、(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植拒絶反応を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９ ｍＲＮＡを発現するまたはいつかの時点で発現する。ある実施態様において、ＣＤ１９発現細胞はＣＤ１９タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、ＣＤ１９タンパク質は正常レベルまたは低レベルで存在し得る。ある実施態様において、ＣＤ１９発現細胞はある時点で検出可能レベルのＣＤ１９タンパク質を産生しており、その後実質的に検出可能なＣＤ１９タンパク質を産生しない。
ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するまたはいつかの時点で発現する。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは低レベルで存在し得る。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞はある時点で検出可能レベルの腫瘍抗原タンパク質を産生しており、その後実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しない。他の実施態様において、疾患はＣＤ１９陰性癌、例えば、ＣＤ１９陰性再発癌である。ある実施態様において、腫瘍抗原(例えば、ＣＤ１９)発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するまたはいつかの時点で発現する。ある実施態様において、腫瘍抗原(例えば、ＣＤ１９)発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは低レベルで存在し得る。ある実施態様において、腫瘍抗原(例えば、ＣＤ１９)発現細胞はある時点で検出可能レベルの腫瘍抗原タンパクを産生しており、その後実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しない。
ここで使用する用語“再発”は、応答性である初期期間後、例えば、先の治療剤、例えば、癌治療剤での処置後(例えば、完全応答または部分的応答)の疾患(例えば、癌)の再出現をいう。応答性である初期期間は、癌細胞のレベルのある閾値未満、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満への低下を含み得る。再出現は癌細胞のレベルのある閾値を越える、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％を超える上昇をいう。例えば、Ｂ−ＡＬＬにおいて、例えば、再出現は、例えば、完全応答後の、血液、骨髄(＞５％)または骨髄外部位のどこかへの芽細胞の再出現をいう。完全応答は、この文脈で、＜５％ＢＭ芽細胞を含み得る。より一般に、ある実施態様において、応答(例えば、完全応答または部分的応答)は、検出可能ＭＲＤの不存在を含み得る(最小残存疾患)。ある実施態様において、応答性である初期期間は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日または６日、少なくとも１週、２週、３週または４週、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１０ヶ月または１２ヶ月または少なくとも１年、２年、３年、４年または５年続く。
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある実施態様において、難治性癌は、処置前または当初に該処置に耐性であり得る。他の実施態様において、難治性癌は処置中に耐性となり得る。難治性癌は耐性癌とも称される。
用語“保存的配列修飾”は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特徴に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、本発明の抗体または抗体フラグメントに、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準技術により導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、ここに記載するＣＡＲ内の１以上アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に変えることができ、改変ＣＡＲを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。
用語“刺激”は、刺激分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)とその同族リガンド(例えば、抗原分子)の結合により誘発され、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を経るシグナル伝達または適切なＮＫ受容体またはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを経るシグナル伝達のような、しかし、これに限定されないシグナル伝達事象に介在する一次応答をいう。刺激は、ある分子の発現の改変に介在し得る。
用語“刺激分子”は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともある態様では、刺激方向に免疫細胞活性化を制御する細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞)により発言される分子をいう。ある態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドを積載したＭＨＣ分子の結合により開始される一次シグナルであり、これは、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の仲介に至る。刺激性に作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも称する)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明で特に有用なＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ,、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明の任意の１以上のＣＡＲＳにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０に提供する配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面に主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)と複合した外来抗原を提示する、アクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それをＴ細胞に提示する。
ここで使用する用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生できる。例えば、ＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特殊化された機能を実施するよう指示するタンパク質の部分である。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いてよいが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用する範囲で、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、それ故に、エフェクター機能シグナル伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断部分をいう。
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子由来のものを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含み得る。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例は、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子由来のものを含む。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含んでよく、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインはからの細胞質配列を含んでよい。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。
用語“ゼータ”または代替的に“ゼータ鎖”、“ＣＤ３−ゼータ”または“ＴＣＲ−ゼータ”は、GenBank Acc. No. BAG36664.1として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基として定義され、“ゼータ刺激ドメイン”または代替的に“ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン”または“ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な所期シグナルの機能的伝達に十分なゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。ある態様において、ゼータの細胞質ドメインは、GenBank Acc. No. BAG36664.1の残基５２〜１６４またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基を含む。ある態様において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン”は、配列番号９として提供される配列(変異体ＣＤ３ゼータ)である。ある態様において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン”は配列番号１０として提供される配列(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)である。
用語“共刺激分子”は、特異的に共刺激リガンドに結合し、それにより、増殖を含むが、それに限定されないＴ細胞による共刺激応答に介在する、Ｔ細胞の同族結合パートナーをいう。共刺激分子は、効率的免疫応答に必要な抗原受容体またはリガンド以外の細胞表面分子をいう。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ〜１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ〜６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ〜１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ〜１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定あれない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントを含み得る。
細胞内シグナル伝達ドメインは由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはその機能的フラグメントを含み得る。
用語“４−１ＢＢ”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2に提供されるアミノ酸配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーをいい、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”はGenBank Acc. No. AAA62478.2のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基として定義される。ある態様において、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、配列番号７として提供する配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
ここで使用する用語“免疫エフェクター細胞”は、例えば、免疫エフェクター応答の促進において、免疫応答に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。
ここで使用する用語“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅または成長もしくは増殖阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の性質をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は免疫エフェクター機能または応答の例である。
用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化された機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカイン分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。用語“コード化”は、ヌクレオチドの規定配列(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)またはアミノ酸の規定配列を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成の鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのような、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の性質およびそれ由来の生物学的性質をいう。それ故に、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質を＾コードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写用鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の生産物をコードするとしていうことができる。
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。用語タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはＲＮＡは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列があるバージョンにおいてイントロンを含み得る程度に、イントロンも含み得る。
用語“内因性”は、生物、細胞、組織または系内由来のまたは該系内で産生されるあらゆる物質をいう。
用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系の外から導入されるまたは該系外で産生されるあらゆる物質をいう。
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
用語“伝達ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞内部に送達するのに使用できる、組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。それ故に、用語“伝達ベクター”は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、さらに、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への伝達を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物も含むと解釈すべきである。ウイルス伝達ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
用語“発現ベクター”は、発現するヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞よりまたはインビトロ発現系おいて共有され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り組む、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれる)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス)を含む当分野で知られる全てを含む。
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できる点で、レトロウイルスの中で独特であり、宿主細胞のＤＮＡに相当量の遺伝情報を送達でき、それゆえに、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
用語“レンチウイルスベクター”は、特にMilone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に提供される自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部由来のベクターをいう。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達技術、LentigenのLENTIMAXTMベクター系などを含むが、これらに限定されない。非臨床的タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
用語“相同”または“同一性”は、２重合分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子のような２核酸分子間または２ポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性をいう。２分子両方のサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占拠されているとき、例えば、２ＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンで占拠されているならば、それらは、その位置で相同または同一である。２配列間の相同性は、適合または相同位置数の直接関数であり、例えば、２配列の位置の半分(例えば、ポリマー１０サブユニット長中５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同であり、位置の９０％(例えば、１０中９)が適合または相同であるならば、２配列は９０％相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)をいう。大部分、ヒト化抗体および抗体そのフラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置換されるヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでよい。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメント性能をさらに精緻化および最適化させる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、実質的に全てまたは少なくとも１、一般に２可変ドメインを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当部分はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、一般にヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部を含む。さらなる詳細について、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992参照。
“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源であるかまたは抗体または免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。
用語“単離”は、天然状態から変えられるまたは除かれることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その天然状態で並存する物質から一部または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞のような、非天然環境に存在できる。
本発明において、一般に存在する核酸塩基の次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンをいい、“Ｕ”はウリジンをいう。
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、制御性配列および異種核酸配列の、後者の発現をもたらす機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列は、第二核酸配列と機能的相関で配置されるとき、第一核酸配列は第二核酸配列と操作可能に連結する。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、コード配列と操作可能に連結する。操作可能に連結したＤＮＡ配列は互いに隣接でき、例えば、必要であれば、２タンパク質コード領域を連結するために、同じ読み枠内にある。
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)または胸骨内、腫瘍内注射または注入手法をいう。
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)またはそのＤＮＡまたはＲＮＡの組み合わせおよびそのポリマーをいう。用語“核酸”は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む。ある実施態様において、核酸分子は合成(例えば、化学合成)または組み換えである。特に断らない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合性質を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で代謝される、天然ヌクレオチドのアナログまたは誘導体を含む核酸を含む。特に断らない限り、特定の核酸配列はまたその保存的修飾バリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰｓおよび相補配列ならびに明示的に示す配列も含むことを含意する。特に、縮重コドン置換は、１以上の選択(または全)コドンの三番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は相互交換可能に使用され、ペプチド結合により共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチド配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限は設定されていない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合で結合された２以上アミノ酸を含む、あらゆるペプチドまたはタンパク質をいう。ここで使用する本用語は、例えば、当分野でペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも一般に称される短鎖から一般に当分野でタンパク質とも称され、多くのタイプが存在する長鎖の両方をいう。“ポリペプチド”は、とりわけ、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
用語“プロモーター”は、細胞の合成機構または導入合成機構により認識され、ポリヌクレオチド配列の特異的転写の開始に必要なＤＮＡ配列をいう。
用語“プロモーター／制御性配列”は、プロモーター／制御性配列に操作可能に連結した遺伝子生産物の発現に必要な核酸配列をいう。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の場合において、この配列はまたエンハンサー配列および遺伝子生産物の発現に必要な他の制御性要素を含み得る。プロモーター／制御性配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子生産物を発現するものであり得る。
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子生産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞の大部分または全ての生理学的条件下で細胞において遺伝子生産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子生産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在するときのみ、細胞において遺伝子生産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子生産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ、細胞において遺伝子生産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。
用語“癌関連抗原”または“腫瘍抗原”は、相互交換可能に、正常細胞と比較して、癌細胞表面に全体的にまたはフラグメントとして(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)優先的に発現され、薬剤の癌細胞への優先的ターゲティングに有用な分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいう。ある実施態様において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞両方に発現されるマーカー、例えば、細胞系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞のＣＤ１９である。ある実施態様において、癌関連抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現している、例えば、正常細胞と比較して１倍過発現、２倍過発現、３倍以上過発現している、細胞表面分子である。ある実施態様において、癌関連抗原は、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現される分子と比較して欠失、付加または変異を含む分子である。ある実施態様において、癌関連抗原は、癌細胞の細胞表面に、全体的にまたはフラグメントとして(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)排他的に発現され、正常細胞の表面に合成または発現されない。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質由来ペプチドは、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２と関連して、ウイルスまたは腫瘍抗原由来ペプチドをターゲティングするＴＣＲ様抗体が記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｃＦｖファージディスプレーライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングにより同定できる。
ｓｃＦｖの文脈で使用する用語“可動性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖および可変軽鎖領域を共に連結するために、単独でまたは組み合わせて使用される、グリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーである。ある実施態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(配列番号２２)を含み、ここで、ｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５,ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０。ある実施態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)を含むが、これらに限定されない。他の実施態様において、リンカーは(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号２９)の複数反復を含む。本発明の範囲にまた包含されるのは、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／１３８４７５号に記載のリンカーである。
ここで使用する、５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称する)は、転写開始直後、真核生物メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに連結する末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結びつき、互いに影響しあうように、共転写的に生じる。転写開始直後、合成されるｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分を修飾して、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節できる。
ここで使用する、“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されているＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡ産生に使用される鋳型を含む。
ここで使用する、“ポリ(Ａ)”は、ｍＲＮＡのポリアデニル化により結合した、連続アデノシンをいう。一過性発現用構築物のある実施態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３０)であり、例えば、６４超、例えば、１００超、例えば、３００または４００超のポリ(Ａ)配列が、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性調節のために化学的または酵素的に修飾され得る。
ここで使用する、“ポリアデニル化”は、ポリアデニリル部分またはその修飾バリアントのメッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合をいう。真核生物において、大部分のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニレートポリメラーゼの作用により、プレｍＲＮＡに付加された、アデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含むトランスクリプトに付加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合するタンパク質は、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼによる分解からの保護を助ける。ポリアデニル化はまた転写終結、ｍＲＮＡの核からの排出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写直後に核で生じるが、さらに後に細胞質でも生じ得る。転写が停止された後、ｍＲＮＡ鎖はＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は、通常開裂部位付近の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ｍＲＮＡが開裂されたら、アデノシン残基は開裂部位の遊離３’末端に付加される。
ここで使用する、“一過性”は、一定時間、日または週の間の非統合導入遺伝子の発現をいい、ここで、発現時間は、ゲノムに統合されるかまたは細胞の安定なプラスミドレプリコン内に含まれるときの遺伝子の発現時間より短い。ある実施態様において、ＣＡＲ分子は、細胞、例えば、宿主細胞で、限られた時間または細胞複製数、例えば、５０日未満(例えば、４０日、３０日、２５日、２０日、１５日、１０日、５日、４日、３日、２日またはそれ以下)、一過性に発現される。ある実施態様において、一過性発現はインビトロ転写ＲＮＡを使用して実施する。
ここで使用する、“安定な”は、一過性発現より長い時間の導入遺伝子の発現をいう。ある実施態様において、導入遺伝子は細胞、例えば、宿主細胞のゲノムに統合されるかまたは細胞の安定なプラスミドレプリコン内に含まれる。ある実施態様において、導入遺伝子を、遺伝子送達ベクター、例えば、レンチウイルスベクターのようなレトロウイルスベクターを使用して、細胞ゲノムに統合する。
アフェレーシスは、全血が個体から採取され、選択成分に分離され、残りが循環に戻される、操作である。一般に、血液成分の分離に２方法、遠心および非遠心がある。白血球除去は、患者の白血球の能動的選択および除去をもたらす。
ここで使用する、用語“処置”および“処置する”は、１以上の治療剤(例えば、本発明のＣＡＲのような１以上の治療剤)の投与に起因する、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の低減または改善または増殖性障害の１以上の症状(例えば、１以上の認識できる症状)の改善をいう。特定の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、患者が必ずしも認識できるものではない、腫瘍増殖のような、増殖性障害の少なくとも一つの測定可能な物理的パラメーターの改善をいう。他の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、例えば、認識できる症状の安定化により、身体的に、例えば、物理的パラメーターの安定化により生理学的にまたは両方による、増殖性障害の進行阻止をいう。他の実施態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化をいう。処置は１００％である必要はなく、ある実施態様において疾患または障害の少なくとも一つの症状の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の低減または遅延が、これらの用語の範囲内と見なされるのに十分である。
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達に役割を有する多様なシグナル伝達分子間の生化学的相互関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、細胞の膜を超えてシグナルを受け取り、シグナルを伝達できる分子および分子の複合体をいう。
用語“対象”は、免疫応答が惹起され得る生存生物(例えば、哺乳動物、例えば、ヒト)を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
用語、“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型が本質的にない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた通常その天然に存在する状態で結合している他の細胞型から分離されている細胞もいう。ある場合には、実質的に精製された細胞の集団は同種細胞の集団をいう。他の場合において、この用語は、単に天然状態で自然に結合している細胞から分離されている細胞をいう。ある態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
本発明において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関連する抗原”は、特異的過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある実施態様において、腫瘍抗原は、原発または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌のような腺癌などを含むが、これらに限定されない癌由来である。
用語“トランスフェクト”または“トランスフォーム”または“形質導入”は、外来性核酸が宿主細胞に伝達または導入される過程をいう。“トランスフェクト”または“トランスフォーム”または“形質導入”細胞は、外来性核酸がトランスフェクト、トランスフォームまたは形質導入されたものである。細胞は初代対象細胞およびその子孫を含む。
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する同族結合パートナータンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、その抗体またはリガンドはサンプルにおける他の分子を実質的に認識または結合しない。
範囲：本明細書をとおして、本発明の種々の態様が範囲の形で提供され得る。範囲の形での記載は単に利便性および簡潔性のためであり、本発明の範囲の確固たる制限として解釈してはならない。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値が特異的に開示されていると解釈されなければならない。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６が特異的に開示されていると解釈されなければならない。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を含むことがあり、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような部分範囲を含む。これは範囲の広さに関わらず適用される。
免疫エフェクター細胞の製造および製造方法
ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲならびにこのような細胞を含む反応混合物および組成物を用いて改変できる、免疫エフェクター細胞を製造する方法がここに提供される。
ある態様において、本発明は、ＣＡＲを発現するように改変した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に関し、ここで、改変免疫エフェクター細胞は抗腫瘍性質を発揮する。抗原の例は、ここに記載する癌関連抗原(すなわち、腫瘍抗原)である。ある態様において、細胞は、ＣＡＲでトランスフォームされ、ＣＡＲは細胞表面に発現される。ある実施態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)はＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある実施態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある実施態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような実施態様において、細胞は、ＣＡＲを安定に発現し得る。他の実施態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトする。あるこのような実施態様において、細胞はＣＡＲを一過性に発現し得る。
さらに、本発明は、ＣＡＲＴ組成物および数ある疾患の中で、癌またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍または自己免疫性疾患の処置のための医薬または方法におけるそれらの使用を提供する。
ある態様において、本発明のＣＡＲは、ここに記載する腫瘍抗原を発現する正常細胞を根絶するために使用でき、それにより細胞移植前の細胞コンディショニングとしての使用に適用可能である。
免疫エフェクター細胞の供給原
ある実施態様において、増大および遺伝子修飾または他の修飾前に、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の細胞集団の供給源を対象から獲得、例えば、入手できる。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。ある実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４ Ｔ細胞を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ８ Ｔ細胞を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞を含む。さらなる実施態様において、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞を含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞は、造血幹細胞(例えば、臍帯血細胞)を含む。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞はＢ細胞を含む。さらなる実施態様において、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞を含む。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞はＮＫＴ細胞を含む。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞はＴｈ−１７細胞を含む。ある実施態様において、免疫エフェクター細胞はＴ細胞受容体を有しない。他の実施態様において、免疫エフェクター細胞非機能的なまたは実質的に障害されたＴ細胞受容体を有する。
ある実施態様において、細胞集団、例えば、採取細胞集団は、例えば、種々の分化段階の、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団を含む。Ｔ細胞分化段階は、分化が低いほうから高いほうで、ナイーブＴ細胞、幹中央記憶Ｔ細胞、中央記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞および終端エフェクターＴ細胞を含む。抗原暴露後、ナイーブＴ細胞は、増殖し、記憶Ｔ細胞、例えば、幹中央記憶Ｔ細胞および中央記憶Ｔ細胞に分化し、次いで、これがエフェクター記憶Ｔ細胞に分化する。適切なＴ細胞受容体、共刺激および炎症性シグナルを受けると、記憶Ｔ細胞は、終端エフェクターＴ細胞へとさらに分化する。例えば、Restifo. Blood. 124.4(2014):476-77; and Joshi et al. J. Immunol. 180.3(2008):1309-15参照。
ナイーブＴ細胞(ＴＮ)は、細胞表面マーカーの次の発現パターンにより特徴付けられる。ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５−。幹中央記憶Ｔ細胞(ＴＳＣＭ)は、細胞表面マーカーの次の発現パターンにより特徴付けられる。ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋。中央記憶Ｔ細胞(ＴＣＭ)は、細胞表面マーカーの次の発現パターンにより特徴付けられる。ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋。エフェクター記憶Ｔ細胞(ＴＥＭ)は、細胞表面マーカーの次の発現パターンにより特徴付けられる。ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋。終端エフェクターＴ細胞(ＴＥｆｆ)は、細胞表面マーカーの次の発現パターンにより特徴付けられる。ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ９５＋。例えば、Gattinoni et al. Nat. Med. 17(2011):1290-7; and Flynn et al. Clin. Translat. Immunol. 3(2014):e20参照。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団)、例えば、Ｔ細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細胞または多能性幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)に由来(例えば、分化)する。ある実施態様において、細胞は自己または同種である。細胞が同種であるある実施態様において、例えば、幹細胞(例えば、ｉＰＳＣ)由来細胞を、修飾して、そのアロ反応性を低減する。例えば、細胞を、例えば、Ｔ細胞受容体の修飾(例えば、破壊)により、アロ反応性を低減するように修飾できる。ある実施態様において、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、例えば、Ｔ細胞分化後、Ｔ細胞受容体を破壊できる。他の例において、細胞、例えば、ＩＰＳＣ由来Ｔ細胞をウイルス特異的Ｔ細胞から産生でき、これは、病原体由来抗原の認識により、移植片対宿主病を引き起こす可能性が低い。さらに他の例において、アロ反応性を、適合、無関係レシピエント対象と組織適合性であるように、共通ＨＬＡハプロタイプからのｉＰＳＣの産生により、減少、例えば、最小化できる。さらに他の例において、アロ反応性を、遺伝子修飾によりＨＬＡ発現を抑制することより、減少、例えば、最小化できる。例えば、ＩＰＳＣ由来Ｔ細胞を、例えば、引用により本明細書に包含させるThemeli et al. Nat. Biotechnol. 31.10(2013):928-35に記載のとおり処理できる。ある例において、幹細胞由来免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１６５７０７号に記載音方法を使用して処理／産生できる。同種細胞が関係するさらなる実施態様は、本明細書に、例えば、本明細書の“同種ＣＡＲ免疫エフェクター細胞”セクションに記載される。
本明細書のある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＦｉｃｏｌｌTM分離のような当業者に知られる任意の数の手法を使用して、対象から採取した血液単位から得ることができる。ある態様において、個体の循環血からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス生産物は、一般にＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球および血小板を含む。ある態様において、アフェレーシスにより採取した細胞を洗浄して、血漿画分を除去してよく、所望により、細胞を続く加工段階に適切な緩衝液または培地に入れる。ある実施態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の実施態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよいかまたは全てではないにしても大部分の二価カチオンを欠いてよい。
カルシウム非存在下の初期活性化段階は、活性化を増大できる。当業者には容易に認識されるとおり、製造業者の指示に従う半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor, the Baxter CytoMate, or the Haemonetics Cell Saver 5)の使用によるなど、洗浄段階は当分野で知られる方法により達成できる。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、PlasmaLyte Aまたは緩衝剤を伴うまたは伴わない他の食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁してよい。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を直接培養培地に再懸濁できる。
ある態様において、Ｔ細胞を、赤血球を溶解し、単球を、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配または向流遠心洗浄により枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、陰性選択技法を使用する、Ｔ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である特異的免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の亜集団の、例えば、選択を含み得る。ある実施態様において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は、ＣＤ２５＋細胞を３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む。
ある実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、例えばＩＬ−２を使用して集団から除去される。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドは、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされるか他の方法で基質、例えば、ビーズに被覆される。ある実施態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントをここに記載する基質にコンジュゲートする。
ある実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、集団から、ＭｉｌｔｅｎｙｉＴＭのＣＤ２５枯渇試薬を使用して除去する。ある実施態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比率は、１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。ある実施態様において、例えば、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇について、５億細胞／mlを使用する。さらなる態様において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度を使用する。
ある実施態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞およびその間の任意の整数値を含む。ある実施態様において、得られた集団Ｔ制御性枯渇細胞は、２×１０９以下のＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７以下のＣＤ２５＋細胞)を含む。
ある実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、ｔｕｂｉng １６２−０１のような、枯渇チューブセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して、集団から除去する。ある実施態様において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を、例えば、DEPLETION2.1のような、枯渇設定で駆動させる。
特定の理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞生産物製造中の対象における免疫細胞陰性制御因子レベル減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象再発のリスクを顕著に減少させる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。ＴＲＥＧ細胞を減少する方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体)、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)生産物の製造前に、例えば、ＴＲＥＧ細胞枯渇のために、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させることを含む。
特定の理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはＣＡＲ発現細胞生産物の製造中の対象における免疫細胞の陰性制御因子のレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象の再発のリスクを減少できる。ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞生産物製造のための細胞の採取前にＴＲＥＧ細胞を減少させる１以上の治療剤で前処理され、それによりＣＡＲ発現細胞処置に対する対象再発のリスクが低減される。ある実施態様において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞生産物注入前、途中または後でよい。
ある実施態様において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)生産物製造前、例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)の接触を含む。ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞生産物製造のための細胞の採取前、シクロホスファミドで前処理され、それによりＣＡＲ発現細胞処置に対する対象再発のリスクが低減される(例えば、ＣＴＬ０１９処置)。ある実施態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)生産物製造のための細胞の採取前、抗ＧＩＴＲ抗体で前処理され、それによりＣＡＲ発現細胞処置に対する対象再発のリスクが低減される。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)生産物(例えば、ＣＴＬ０１９生産物)製造前、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)製造法を修飾して、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる。ある実施態様において、ＣＤ２５枯渇をＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)生産物(例えば、ＣＴＬ０１９生産物)製造前に使用して、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる。
ある実施態様において、除去する細胞の集団は制御性Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもないが、ＣＡＲＴ細胞の増大および／または機能に他の点で負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または免疫抑制性細胞により発現される可能性のある他のマーカーを発現する細胞である。ある実施態様において、このような細胞は制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順番で除去されることが企図される。
ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超える枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団富化は、例えば、陰性選択細胞に独特な表面マーカーに対する抗体の組み合わせにより達成される。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫粘着性またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
ここに記載する方法は、さらに細胞を腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する集団から除去し、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある実施態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、細胞除去に使用できる同じ基質、例えば、ビーズに結合させてよくまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、別々のビーズに結合させてよく、その混合物を細胞除去に使用できる。他の実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも行い得る。
また提供されるのは、チェックポイント阻害因子、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害因子、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上を発現する細胞を集団から除去し、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害因子枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法である。チェックポイント阻害因子の例は、例えば、ここに記載するとおり、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ(例えば、ＴＧＦベータ)を含む。ある実施態様において、チェックポイント阻害因子発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害因子抗体またはそのフラグメントを細胞除去に使用できる同じビーズに結合させてよくまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害因子抗体またはそのフラグメントを、別々のビーズに結合させてよく、その混合物を細胞除去に使用できる。他の実施態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害因子発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも行い得る。
ここに記載する方法は、陽性選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞を、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間、ダイナビーズ(登録商標)Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)コンジュゲートビーズとインキュベートすることにより、単離できる。ある実施態様において、時間は約３０分である。さらなる実施態様において、時間は、３０分〜３６時間またはそれより長い範囲およびその間の全整数値である。さらなる実施態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の実施態様において、時間は１０〜２４時間、例えば、２４時間である。長いインキュベーション時間を、腫瘍組織または免疫不全個体からの腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)の単離のような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞の単離に使用できる。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞捕捉効率を増加させ得る。それ故に、単に時間を長くまたは短くすることにより、Ｔ細胞はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合できおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比を増加または減少させることにより(ここにさらに記載する)、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または処理中の他の時点で優先的に選択される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率の増加または減少により、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時または他の所望の時点に優先的に選択され得る。
ある実施態様において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンの１以上または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法により決定できる。
陽性または陰性選択による所望の細胞の集団の単離のために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある態様において、細胞およびビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を顕著に減少させる(例えば、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。例えば、ある態様において、１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／mlまたは５０億／mlの濃度を使用する。ある態様において、１０億細胞／mlの濃度を使用する。ある態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。
高濃度の使用は、細胞収量増加、細胞活性化および細胞増大をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在する(例えば、白血球血、腫瘍組織など)サンプルからのより効率的な捕捉を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有する可能性があり、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能とする。
関連する態様において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を相当希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合させる所望の抗原を高量発現する細胞で選択される。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ２８を高レベルで発現し、希釈濃度でＣＤ８＋ Ｔ細胞より効率的に捕捉される。ある態様において、使用する細胞の濃度は５×１０６／mlである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間の任意の整数値であり得る。
他の態様において、細胞を、回転子で、種々の長さ、種々の速度で、２〜１０℃または室温でインキュベートし得る。
ある実施態様において、集団の多数の免疫エフェクター細胞がジアグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)を発現しない、例えば、ＤＧＫ欠損である。ある実施態様において、集団の多数の免疫エフェクター細胞がＩｋａｒｏｓを発現しない、例えば、Ｉｋａｒｏｓ欠損である。ある実施態様において、集団の多数の免疫エフェクター細胞がＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しない、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓの両者欠損である。
刺激用Ｔ細胞を、洗浄段階後にまた凍結できる。理論に縛られることを望まないが、凍結および続く融解工程は、細胞集団における顆粒球およびある程度単球の除去により、より均一な生産物を提供する。血漿および血小板を除く洗浄段階後、細胞を凍結溶液に懸濁してよい。多くの凍結溶液およびパラメーターが当分野で知られ、本状況で有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン含有ＰＢＳまたは１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Plasmalyte-A、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびPlasmaLyte Aを含む他の適当な細胞凍結培地の使用を含み、次いで細胞を−８０℃で１°／分の速度で凍結させ、液体窒素保存タンクの蒸気層に保存する。制御凍結の他の方法ならびに−２０℃または液体窒素で直ぐの未制御の凍結も使用できる。
ある態様において、凍結保存細胞を融解し、ここに記載するとおり洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前、室温で１時間急速させる。
本発明においてまた企図されるのは、ここに記載する増大細胞が必要となるときより前の時点での対象からの血液サンプルまたはアフェレーシス生産物の採取である。例えば、増大させる細胞の供給源を、必要な任意の時点で採取し、Ｔ細胞のような所望の細胞を単離し、ここに記載するような、免疫エフェクター細胞治療により利益を受けるあらゆる数の疾患または状態の免疫エフェクター細胞治療におけるその後の使用のために凍結する。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスを一般に健常対象から採取する。ある態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスを、一般に疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために単離および凍結する。ある態様において、Ｔ細胞を、増大、凍結および後の時点で使用できる。ある態様において、サンプルをここに記載する特定の疾患の診断直後、しかし、何らかの処置前に、患者から採取する。さらなる態様において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体または他の免疫枯渇剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような因子での処置を含むが、これらに限定されない任意の数の関連処置モダリティーの前に対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離する。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。これに関し、ある癌処置、特に免疫系を損傷させる処置後、患者が通常処置から回復する期間である処置後しばらく、エクスビボで増大する能力について、得られるＴ細胞の品質が最適であるかまたは改善されている可能性が観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、移植およびインビボ増大の増強に好ましい状態であり得る。それ故に、本発明において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、ある態様において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)およびコンディショニングレジメンを使用して、特に治療後規定時間枠内に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増大に好ましい状態を対象において作り得る。細胞型の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
ある実施態様において、免疫エフェクターＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けている対象から得る。ある実施態様において、ＣＡＲを発現するように改変する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、対象におけるまたは対象から採取された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比率が、少なくとも一過性に増加しているように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与後の十分な時間または十分量の投与後採取する。
他の実施態様において、ＣＡＲを発現するように改変されているまたは改変する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させるまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比率を増加させる、一定量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理し得る。
適用方法は、５％以下、例えば２％、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用し、既知培養培地条件および組成物、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることができる。
ある実施態様において、ここに開示する方法は、無血清培地を含む培養培地条件を利用できる。ある実施態様において、無血清培地は、OpTmizer CTS(LifeTech)、Immunocult XF(Stemcell technologies)、CellGro(CellGenix)、TexMacs(Miltenyi)、Stemline(Sigma)、Xvivo15(Lonza)、PrimeXV(Irvine Scientific)またはStemXVivo(RandD systems)である。無血清培地に、ＬｉｆｅＴｅｃｈからのＩＣＳＲ(免疫細胞血清置換)のような血清代替物を補い得る。血清代替物(例えば、ＩＣＳＲ)のレベルは、例えば、最大５％、例えば、約１,％、２％、３％、４％または５％である。ある実施態様において、Ｔ細胞集団はジアグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないまたはＤＧＫ活性が減少または阻害された細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝子手法、例えば、ＤＧＫ発現減少または阻止のためのＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ投与により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞を、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処理により産生できる。
ある実施態様において、Ｔ細胞集団はＩｋａｒｏｓ欠損である。Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないまたはＩｋａｒｏｓ活性が減少または阻害された細胞を含み、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、遺伝子手法、例えば、Ｉｋａｒｏｓ発現減少または阻止のためのＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ投与により産生できる。あるいは、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞を、Ｉｋａｒｏｓ阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処理により産生できる。
ある実施態様において、Ｔ細胞集団はＤＧＫ欠損およびＩｋａｒｏｓ欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しないか、またはＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ活性が減少または阻害されている。このようなＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかにより産生できる。
ある実施態様において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。他の実施態様において、ＮＫ細胞はＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Ｃｏｎｋｗｅｓｔ)である。
ある実施態様において、方法、例えば、製造方法は、さらにＩＬ−１５および／またはＩＬ−７、細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞のようなＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと予め接触されている細胞集団)との接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと予め接触されているもの)は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７存在下で増大させる。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５ Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、例えば、エクスビボで、ＣＡＲ発現細胞製造中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増大中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増大中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増大中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。ある実施態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。
同種ＣＡＲ
ここに記載するある実施態様において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように改変され、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように改変され(例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンおよび／またはＴＣＲゼータの発現をしない(または発現の減少を示す)ように改変され)またはその表面に極わずかな機能的ＴＣＲを産生するように改変される。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異または切断形態の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現できる。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが宿主で有害免疫反応を惹起しないことを意味する。
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように、改変され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように、改変される。ある実施態様において、ＨＬＡの下方制御は、ベータ−２ミクログロブリン(Ｂ２Ｍ)発現の減少または排除により達成され得る。ある実施態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠いてよい。
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含むあらゆる適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)のような転写−アクティベーターを使用するＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
ある実施態様において、同種細胞は、例えばここに記載する方法により、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、免疫エフェクター応答を開始するＣＡＲ発現細胞の能力を減少し得る、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ(例えば、ＴＧＦベータ)を含む。阻害分子の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある実施態様において、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)のような転写−アクティベーターを、例えば、ここに記載するとおり、を使用できる。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある実施態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ)をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、阻害できる。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現系およびｓｈＲＮＡの例は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６４９および６５０に記載されている。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、一連のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートまたはこのような反復のセットを含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、細胞、例えば、Ｔ細胞においてＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ)を沈黙または変異できるＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系をいう。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６５１〜６５８に記載されている。
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、細胞、例えば、Ｔ細胞においてＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ)の編集に使用できる、人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
ＴＡＬＥＮおよびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６５９〜６６５に記載されている。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、細胞、例えば、Ｔ細胞において、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子および／またはここに記載する阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ)の編集に使用できる、人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。
ＺＦＮおよびその使用は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６６６〜６７１に記載されている。
テロメラーゼ発現
テロメアは、体細胞残留性に有用な役割を有し、その長さはテロメラーゼ(ＴＥＲＴ)により維持される。ＣＬＬ細胞におけるテロメア長は極めて短いかもしれず(Roth et al., “Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia” British Journal of Haematology, 143, 383-386., August 28 2008)、製造されたＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ１９細胞ではさらに短く、患者への養子伝達後、増大する能力を制限し得る。テロメラーゼ発現は、複製的消耗からＣＡＲ発現細胞を助け得る。
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ある実施態様において、治療Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮テロメアにより、患者において短期残留性を有し、従って、テロメラーゼ遺伝子とのトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを伸ばし、患者におけるＴ細胞残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それ故に、ある実施態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、異所性にテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを発現する。ある態様において、本発明は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、この核酸と、ＣＡＲをコードする構築物との接触前に、同時にまたは後に接触さえてよい。
テロメラーゼ発現は安定(例えば、核酸は細胞のゲノムに統合され得る)でも、一過性(例えば、核酸は統合されず、発現は、一定期間、例えば、数日後に減少する)でもよい。安定な発現は、細胞にテロメラーゼサブユニットをコードするＤＮＡおよび選択可能マーカーをトランスフェクトまたは形質導入し、安定な組み込み体を選択することにより達成され得る。これとは別にまたはこれと組み合わせて、安定な発現は、例えば、Ｃｒｅ／ＬｏｘまたはＦＬＰ／ＦＲＴ系を使用する、部位特異的組換えにより達成され得る。
一過性発現は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＭＲＮＡのようなＲＮＡでのトランスフェクションまたは形質導入を含み得る。ある実施態様において、一過性ｍＲＮＡトランスフェクションは、ＴＥＲＴでの安定なトランスフェクションに時々付随する、遺伝子不安定性を避ける。外来性テロメラーゼ活性の一過性発現は、例えば、全体を引用により本明細書に包含させる国際出願ＷＯ２０１４／１３０９０９号に記載されている。ある実施態様において、テロメラーゼサブユニットのｍＲＮＡベースのトランスフェクションは、Moderna Therapeuticsにより市販されているメッセンジャーRNA TherapeuticsTMプラットホームに従い実施する。例えば、方法は、米国特許８７１０２００号、８８２２６６３号、８６８００６９号、８７５４０６２号、８６６４１９４号または８６８００６９号に記載されている方法であり得る。
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、ここに配列番号５として提供する。
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは配列番号５の配列を有する。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、ここに配列番号８として提供する。
ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸によりコードされる。ある実施態様において、ｈＴＥＲＴは配列番号８の核酸によりコードされる。
ＲＮＡトランスフェクション
ここに開示するのは、インビトロ転写ＲＮＡ ＣＡＲを産生する方法である。ここに記載する方法は、細胞に直接トランスフェクトできるＣＡＲコード化ＲＮＡ構築物の導入を含み得る。トランスフェクションに使用するｍＲＮＡを産生する方法は、特別に設計されたプライマーの鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、一般に５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現する核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生する(例えば、配列番号３０)。このように産生されたＲＮＡは、種々の細胞で効率的にトランスフェクトされ得る。ある態様において、鋳型は、ＣＡＲのための配列を含む。ＲＮＡ ＣＡＲおよびそれを用いる方法は、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ５５３〜５７０に記載される。
免疫エフェクター細胞は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされるＣＡＲを含み得る。ある態様において、ここに記載するＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ＣＡＲ発現細胞産生のために、例えば、ここに記載する方法により産生した、免疫エフェクター細胞に導入する。
ある実施態様において、インビトロ転写ＲＮＡ ＣＡＲを、細胞に一過性トランスフェクションの形態で導入できる。ＲＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生する。あらゆる供給源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロｍＲＮＡ合成用の鋳型にＰＣＲにより直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列またはＤＮＡの任意の他の適切な源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型はここに記載するＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲのための鋳型は、ここに記載する腫瘍関連抗原に対する抗体の一本鎖可変ドメインを含む細胞外領域、ヒンジ領域(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメインのようなここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域を含む。
ある実施態様において、ＰＣＲに使用するためのＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列に由来し得る。ある実施態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部または全てを含み得る。核酸はエキソンおよびイントロンを含み得る。ある実施態様において、ＰＣＲに使用するためのＤＮＡはヒト核酸配列である。他の実施態様において、ＰＣＲに使用するためのＤＮＡは、５’および３’ ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。人工ＤＮＡ配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように一緒にライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。ライゲートされるＤＮＡの部分は、単一生物由来でも１を超える生物由来でもよい。
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写の鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は当分野で周知である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＰＣＲで鋳型として使用するＤＮＡの領域と実質的に相補性である領域を有するように設計する。ここで使用する“実質的に相補性”は、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補性であるまたは１以上の塩基が非相補または不適正である、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補性の配列は、ＰＣＲで使用するアニーリング条件下、意図するＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分に実質的に相補性であるように設計され得る。例えば、プライマーは、５’および３’ ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される核酸の部分(オープンリーディングフレーム)を増幅するように設計され得る。プライマーはまた、特定の目的のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計され得る。ある実施態様において、プライマーは、５’および３’ ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成方法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型のヌクレオチドに実質的に相補性であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、ここでは、コード鎖に対して増幅するＤＮＡ配列の５'側をいう。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流である二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補性のヌクレオチドの領域を含むプライマーをいう。“下流”は、ここでは、コード鎖に対して増幅するＤＮＡ配列の３'側をいう。
ＰＣＲで有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼをここに開示する方法において使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の業者から商業的に入手可能である。
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用できる。ある実施態様において、ＲＮＡは５’および３’ ＵＴＲを有する。ある実施態様において、５’ ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加する５’および３’ ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの種々の領域にアニールするＰＣＲのプライマーの設計を含むが、これに限定されない種々の方法により異なる。この手法を使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後最適翻訳効率の達成に必要な５’および３’ ＵＴＲ長を修飾できる。
５’および３’ ＵＴＲは天然に存在する、目的の核酸の内因性５’および３’ ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に内因性ではないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列を順方向および逆方向プライマーに取り込むことによりまたは鋳型の任意の他の修飾により付加できる。目的の核酸に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率修飾に有用であり得る。例えば、３’ ＵＴＲ配列におけるＡＵに富む要素は、ｍＲＮＡの安定性を減少させ得ることが知られている。それ故に、３’ ＵＴＲを、当分野で周知であるＵＴＲの性質に基づき、転写ＲＮＡの安定性を増加させるために選択または設計できる。
ある実施態様において、５’ ＵＴＲは、内因性核酸のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、上記のとおりＰＣＲにより目的の核酸に内因性ではない５’ ＵＴＲが付加されたとき、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、５’ ＵＴＲ配列付加により再設計され得る。Ｋｏｚａｋ配列は、あるＲＮＡトランスクリプトの翻訳効率を増加させ得るが、全てのＲＮＡに効率的な翻訳をさせるのに必要であるようには見えない。多くのｍＲＮＡについてのＫｏｚａｋ配列の要求は当分野で知られる。他の実施態様において、５’ ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞において安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施態様において、種々のヌクレオチドアナログを３’または５’ ＵＴＲで使用して、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害し得る。
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を可能とするために、転写プロモーターを、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に付加すべきである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に付加したとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写するオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ生産物に取り込まれ始める。ある実施態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当分野で知られる。
ある実施態様において、ｍＲＮＡは、細胞におけるリボソーム結合、翻訳の開始および安定性ｍＲＮＡを決定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両方にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核生物細胞の発現に適しない長鎖状体生産物を産生する。３’ ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核生物トランスフェクションに有効ではない正常サイズに分類されるｍＲＮＡをもたらす。
直線状ＤＮＡ鋳型で、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を越えてトランスクリプトの３’末端を延長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
ポリＡ／ＴストレッチのＤＮＡ鋳型への組込みの慣用の方法は分子クローニングである。しかしながらプラスミドＤＮＡへのポリＡ／Ｔ配列統合はプラスミド不安定性を引き起こし得て、これが細菌細胞から得られるプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば欠失および他の異常に高度に汚染されているかの理由である。これにより、クローニング方法は骨が俺、時間がかかるだけでなく、しばしば信用できないものとなる。これが、クローニングせずにポリＡ／Ｔ ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築を可能とする方法が非常に望まれるかの理由である。
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔテイル(配列番号３１)(サイズは５０〜５０００Ｔであり得る(配列番号３２))のようなポリＴテイル含有逆方向プライマーの使用によりＰＣＲ中にまたはＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法によりＰＣＲ後に産生され得る。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を提供し、分解を減少させる。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写ＲＮＡの安定性と正に相関する。ある実施態様において、ポリ(Ａ)テイルは１００〜５０００アデノシン(例えば、配列番号３３)の間である。
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルを、さらに大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後延長できる。ある実施態様において、ポリ(Ａ)テイルの長さを１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチド(配列番号３４)に伸ばすと、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増加する。さらに、３’末端への種々の化学基の結合は、ｍＲＮＡ安定性を増加できる。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログをポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに統合できる。ＡＴＰアナログは、さらにＲＮＡの安定性を増加できる。
５’キャップも、ＲＮＡ分子に安定性を提供する。ある実施態様において、ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップを、当分野で知られ、ここに記載する手法を使用して提供する(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
ここに開示する方法により産生されたＲＮＡはまた配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始させ、翻訳の開始を促進する、あらゆるウイルスの、染色体のまたは人工的に設計された配列である。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞性透過性および生存能を促進する因子を含み得る細胞エレクトロポレーションに適するあらゆる溶質が含まれ得る。
ＲＮＡを、任意の数の種々の方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)または、リポフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系を使用するGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、カチオン性リポソーム介在トランスフェクション、を含むが、これらに限定されない、例えば、商業的に利用可能な方法を使用して、標的細胞に導入し得る(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)。
免疫エフェクター細胞の活性化および／または増大
ある実施態様において、本発明は、ＣＡＲの発現、例えば、一過性発現に適当な条件下、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ(ここで、ＣＡＲは同族抗原分子を標的とする)、免疫エフェクター細胞の集団をリガンド、例えば、同族抗原分子存在下で培養することによる、免疫エフェクター細胞の集団を増大する方法を提供する。ある実施態様において、核酸はＲＮＡ、例えば、インビトロ転写ＲＮＡである。他の実施態様において、同族抗原分子は癌関連抗原分子である。
ここに提供する方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、免疫エフェクター細胞の表面のＣＡＲを刺激する、同族抗原分子が結合した表面と接触させることにより増大させる。ある態様において、同族抗原分子は溶液中でも表面に結合していてもよい。ある態様において、刺激シグナルを提供する同族抗原分子は細胞表面に結合する。ある態様において、同族抗原分子は溶液にあり得る。ある態様において、同族抗原分子は可溶性形態であり、その後表面に架橋することができる。
ある実施態様において、同族抗原分子は基質に結合する。ある実施態様において、基質は固形支持体である。ある実施態様において、基質は、マイクロタイタープレート(例えば、ＥＬＩＳＡプレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ナイロン膜、酢酸誘導体およびこれらの組み合わせ)、 繊維マトリックス、セファロースマトリックス、糖マトリックス、プラスチックチップ、ガラスチップまたはあらゆるタイプのビーズ(例えば、Luminexビーズ、ダイナビーズ、磁気ビーズ、フローサイトメトリービーズおよびこれらの組み合わせ)から選択される。ある実施態様において、基質はＥＬＩＳＡプレートである。他の実施態様において、基質はビーズ、例えば、ダイナビーズである。
１：５００〜５００：１およびその間のの整数値の粒子対細胞比を、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激に使用し得る。当業者には容易に認識され得るとおり、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞にしか結合できず、一方大型ビーズはたくさん結合できる。ある態様において、細胞対粒子の比は、１：１００〜１００：１およびその間のの整数値の範囲であり、さらなる態様において、１：９〜９：１およびその間のの整数値を含む比率もＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす同族抗原分子結合粒子対免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比は上記のとおり変わり得るが、しかしながらある好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、適当な比の一例は、少なくとも１：１ 粒子：Ｔ細胞である。ある態様において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。さらなる態様において、粒子対細胞比は刺激の日により変わり得る。例えば、ある態様において、粒子対細胞比は、一日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子がその後最大１０日間連日または隔日で付加され、最終比率は１：１〜１：１０である(付加した日の細胞数に基づく)。ある特定の態様において、粒子対細胞比は、刺激一日目１：１であり、刺激３日目および５日目１：５に調節する。ある態様において、粒子を一日目１：１および刺激３日目および５日目１：５の最終比率に基づき、連日または隔日で添加する。ある態様において、粒子対細胞比は、刺激一日目２：１であり、刺激３日目および５日目１：１０に調節される。ある態様において、粒子を、一日目１：１および刺激３日目および５日目１：１０の最終比率に基づき、連日または隔日で添加する。ある特定の態様において、適当な粒子：細胞比は１：３である。
さらなる態様において、Ｔ細胞のような細胞を、同族抗原分子被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、続いて細胞を培養する。別の態様において、培養前に、同族抗原分子被覆ビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。さらなる態様において、ビーズおよび細胞を、まず、磁気力のような力の適用により濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘発する。
一例として、細胞表面タンパク質を、同族抗原分子が結合した常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)をＴ細胞と接触させることによりライゲートし得る。ある態様において、細胞(例えば、１０４〜１０９ Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、ダイナビーズ(登録商標)Ｍ−４５０トシル活性化常磁性ビーズ、１：３比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中であわせる。他の細胞濃度が企図される。例えば、標的細胞がサンプル中で極めて稀であり、サンプルの０.０１％しか構成しないかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞を含み得る。従って、あらゆる細胞数が本発明において用いられる。ある態様において、細胞およびビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を顕著に減少させる(例えば、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。例えば、ある態様において、約１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／ml、５０億／mlまたは２０億細胞／mlの濃度を使用する。ある態様において、１億を超える細胞／mlを使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。ある態様において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度の使用は、細胞収量増加、細胞活性化および細胞増大をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＡＲを弱く発現し得る、例えば、一過性に発現する、細胞の効率的捕捉を可能とする。
ある実施態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸で形質導入された細胞は、例えば、ここに記載する方法により、増大される。ある実施態様において、細胞は、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約４０日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日または４０日)の期間の培養で増大される。ある実施態様において、細胞を４〜９日の期間増大させる。ある実施態様において、細胞は、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増大される。ある実施態様において、細胞を５日の培養で増大させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増大させた同じ細胞より強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより決定できる。ある実施態様において、５日増大させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増大させた同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある実施態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を５日の培養で増大させ、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増大させた同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある実施態様において、５日増大させた細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増大させた同じ細胞と比較して、pg／mlでの炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルで、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の増加を示す。
数サイクルの刺激が、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の培養期間が６０日またはそれ以上であるように望まれることもある。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞の成長のためのの他の添加物を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ １５(Lonza))を含む。細胞増殖のための他の添加物は、界面活性剤、プラスマネートならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加され、無血清または適切な量の血清(または血漿)が補われたまたはＴ細胞の増殖および増大に十分な規定されたホルモン群および／または量のサイトカインを含む、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５およびＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、添加を含むが、これらに限定されない。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験培養のみ包含され、対象に注入する細胞の培養には添加しない。標的細胞を、増殖の支持に必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)下、維持する。
ある実施態様において、細胞を、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日増大期間にわたり細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす、１以上のインターロイキンを含む適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増大させる。ある実施態様において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)存在下増大させる。ある実施態様において、細胞を、ＩＬ−２存在下増大させる。
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的血液またはアフェレーシスした末梢血単核細胞生産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より多いヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。刺激ＣＤ３およびＣＤ２８受容体によるＴ細胞のエクスビボ増大は、約８〜９日前は主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生じるが、約８〜９日後、Ｔ細胞の集団に含まれるＴＣ細胞集団が漸増する。従って、処置の目的によって、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入するのは、有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されるならば、このサブセットをかなり増大させるのは有益であり得る。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増大過程の間顕著に、しかし、大部分再現性よく変わる。それ故に、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞生産物をあつらえる能力を可能とする。
形質導入効率、ＣＡＲを発現する能力、抗原刺激後免疫エフェクター細胞を増大し、免疫エフェクター細胞増大を維持する能力を含むが、これらに限定されない、種々のアッセイを使用して、ここに記載する方法の有効性を評価できる。本発明の方法を評価するためのアッセイは下にさらに詳述される。
形質導入効率は、フローサイトメトリーにより測定され得る。例えば、ここに記載するとおり、ＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ)を発現する免疫エフェクター細胞上のＣＡＲの表面発現が測定され得る。ＣＡＲの表面発現は、細胞とビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２抗体(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)を、４℃で３０分インキュベートし、続いてＦＡＣｓ緩衝液(ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ)で２回洗浄し、フィコエリトリン標識ストレプトアビジン(BD Pharmingen, San Diego, CA)と結合させることにより試験する。サンプルデータをLSRII Fortessa(BD Biosciences)に集め、FlowJo software(Treestar)で分析できる。形質導入効率を、ＲＮＡレベル(例えば、ノーザン分析、定量的リアルタイムＰＣＲ)またはタンパク質レベル(例えば、ウェスタン分析)測定のための任意の他の当分野で知られる方法でも測定できる。
抗原刺激後の免疫エフェクター細胞増大は、フローサイトメトリーによっても測定できる。例えば、ここに記載するとおり同族抗原分子(例えば、抗イディオタイプＣＤ１９)で刺激したＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ)を発現する免疫エフェクター細胞の増大が測定され得る。生存細胞をLive/Dead Aqua陰性でゲーティングし、次いでＣＤ４(またはＣＤ８)陽性でゲーティングする。絶対Ｔ細胞数を、CountBright Absolute Countingビーズ(Life Technologies)を使用して、次の式：
(Ｔ細胞事象数／ビーズ事象数)×使用したビーズ数
を使用して決定できる。
再刺激非存在下の持続性ＣＡＲ＋ Ｔ細胞増大も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、１日目に記載するＣＡＲで形質導入した後、８日の培養でCoulter Multisizer III粒子カウンターを使用して測定する。
ここでの実施例の部分に記載するものを含む他のアッセイ、ならびに当分野で知られるものもここに記載するＣＡＲの評価に使用できる。
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、免疫エフェクター細胞を癌に向かわせる１以上のＣＡＲを含むように改変した免疫エフェクター細胞を提供する。これは、癌関連抗原特異的であるＣＡＲの抗原結合ドメインにより達成される。ここに記載するＣＡＲにより標的とされ得る２群の癌関連抗原(腫瘍抗原)がある。(１)癌細胞表面に発現される癌関連抗原および(２)それ自体は細胞内であるが、抗原のフラグメント(ペプチド)がＭＨＣ(主要組織適合性複合体)により癌細胞表面に提示される癌関連抗原。
従って、例えば、ここに記載する方法により得た、免疫エフェクター細胞は、次の癌関連抗原(腫瘍抗原)の一つを標的とするＣＡＲを含むように改変され得る。ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１(ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９および１９Ａ２４とも称される)、Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、上皮細胞増殖因子受容体バリアントIII(ＥＧＦＲｖIII)、ガングリオシドＧ２(ＧＤ２)、ガングリオシドＧＤ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−８)ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟(ＢＣＭＡ)、Ｔｎ抗原((Ｔｎ Ａｇ)または(ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ))、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(ＲＯＲ１)、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ３)、腫瘍関連糖タンパク質７２(ＴＡＧ７２)、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、上皮性細胞接着分子(ＥＰＣＡＭ)、Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)、ＫＩＴ(ＣＤ１１７)、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２(ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２)、メソセリン、インターロイキン１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)、前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)、プロテアーゼセリン２１(テスティシンまたはＰＲＳＳ２１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、ルイス(Ｙ)抗原、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)、ステージ特異的胚抗原−４(ＳＳＥＡ〜４)、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ムチン１、細胞表面関連(ＭＵＣ１)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ(ＰＡＰ)、伸長因子２変異(ＥＬＦ２Ｍ)、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(ＦＡＰ)、インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ−Ｉ受容体)、炭酸脱水酵素IX(ＣＡIX)、プロテアソーム(Ｐｒｏｓｏｍｅ、Ｍａｃｒｏｐａｉｎ)サブユニット、ベータタイプ、９(ＬＭＰ２)、糖タンパク質１００(ｇｐ１００)、易切断領域(ＢＣＲ)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体１(Ａｂｌ)からなる癌遺伝子融合タンパク質(ｂｃｒ−ａｂｌ)、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２(ＥｐｈＡ２)、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)、ガングリオシドＧＭ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)、トランスグルタミナーゼ５(ＴＧＳ５)、高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)、ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１／ＣＤ２４８)、腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)、クローディン６(ＣＬＤＮ６)、甲状腺刺激ホルモン受容体(ＴＳＨＲ)、プロテインＧ共役受容体クラスＣ群５、メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)、ポリシアル酸、胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドのヘキササッカライド部分(ＧｌｏｂｏＨ)、乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)、ウロプラキン２(ＵＰＫ２)、Ａ型肝炎ウイルス細胞性受容体１(ＨＡＶＣＲ１)、アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)、パネキシン３(ＰＡＮＸ３)、プロテインＧ共役受容体２０(ＧＰＲ２０)、リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ ９(ＬＹ６Ｋ)、嗅覚受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)、ＴＣＲガンマ交互リーディングフレームタンパク質(ＴＡＲＰ)、ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)、癌／精巣抗原１(ＮＹ−ＥＳＯ−１)、癌／精巣抗原２(ＬＡＧＥ−１ａ)、黒色腫関連抗原１(ＭＡＧＥ−Ａ１)、ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、染色体１２ｐに位置(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)、精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)、アンギオポエチン結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ ２)、黒色腫癌精巣抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)、黒色腫癌精巣抗原−２(ＭＡＤ−ＣＴ−２)、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３(ｐ５３)、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１(ＰＣＴＡ〜１またはガレクチン８)、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１(ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１)、ラット肉腫(Ｒａｓ)変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)、肉腫転座切断点、アポトーシスの黒色腫阻害因子(ＭＬ−ＩＡＰ)、ＥＲＧ(膜貫通プロテアーゼ、セリン２(ＴＭＰＲＳＳ２) ＥＴＳ融合遺伝子)、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３(ＰＡＸ３)、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ−ｍｙｃ鳥類骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来相同体(ＭＹＣＮ)、Ｒａｓ相同体ファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)、チロシナーゼ関連タンパク質２(ＴＲＰ−２)、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)、ＣＣＣＴＣ結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(ＢＯＲＩＳまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites)、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３(ＳＡＲＴ３)、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５(ＰＡＸ５)、プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)、Ａキナーゼアンカータンパク質４(ＡＫＡＰ−４)、滑膜肉腫、Ｘ切断点２(ＳＳＸ２)、終末糖化生産物用受容体(ＲＡＧＥ−１)、腎臓遍在１(ＲＵ１)、腎臓遍在２(ＲＵ２)、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６(ＨＰＶ Ｅ６)、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７(ＨＰＶ Ｅ７)、腸カルボキシルエステラーゼ、ヒートショックタンパク質７０−２変異(ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)、ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲまたはＣＤ８９)、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ(ＣＤ３００ＬＦ)、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)、骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)、リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)、グリピカン−３(ＧＰＣ３)、Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)。
二特異的ＣＡＲ
ある実施態様において、多特異的抗体分子は二特異的抗体分子である。二特異的抗体は、２を超えない抗原に特異性を有する。二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある実施態様において、第一および第二エピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)にある。ある実施態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある実施態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある実施態様において、第一および第二エピトープは異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、二特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
ある実施態様において、抗体分子は、多特異的(例えば、二特異的または三特異的)抗体分子である。二特異的またはヘテロ二量体抗体分子の産生のためのプロトコールおよび二特異的抗体分子のための種々の配置は、例えば、引用によりその全体を包含させる、２０１５年３月１３日出願のＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ４５５〜４５８に記載される。
ある態様において、二特異的抗体分子は、ＣＤ１９に結合特異性を有する、例えば、ここに記載するｓｃＦｖを含むまたはここに記載するｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲを含む、第一免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、ｓｃＦｖおよび異なる抗原上の第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
キメラＴＣＲ
ある態様において、本発明の抗体および抗体フラグメント(例えば、ＣＤ１９抗体およびフラグメント)は、キメラＴＣＲを作製するために、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)鎖、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖の１以上の定常ドメインに移植できる。理論に縛られないが、キメラＴＣＲは、抗原結合によりＴＣＲ複合体を介してシグナル伝達すると考えられる。例えば、ここに開示するｓｃＦｖを、定常ドメイン、例えば、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質および細胞ドメインの少なくとも一部に移植できる。他の例として、抗体フラグメント、例えばここに記載するＶＬドメインを、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインに移植でき、抗体フラグメント、例えばここに記載するＶＨドメインを、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植できる(または、これに替えて、ＶＬドメインをＴＣＲベータ鎖の定常ドメインに移植してよく、ＶＨドメインをＴＣＲアルファ鎖に移植してよい)。他の例として、抗体または抗体フラグメントのＣＤＲを、キメラＴＣＲを作製するために、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖に移植できる。例えば、ここに開示するＬＣＤＲを、ＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインに移植してよく、ここに開示するＨＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインに移植してよく、または逆も可能である。このようなキメラＴＣＲは、例えば、当分野で知られる方法により産生できる(例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74)。
非抗体足場
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、非抗体足場、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫医薬、マキシボディ、プロテインＡまたはアフィリンを含む。非抗体足場は、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、細胞に発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチドまたはそのフラグメントである。ある実施態様において、抗原結合ドメインは非抗体足場を含む。得られたポリペプチドが、標的細胞の標的抗原に特異的に結合する少なくとも一つの結合領域を含む限り、多種多様な非抗体足場を使用できる。
非抗体足場は、フィブロネクチン(Novartis, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MAおよびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュラー免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(ガンマ結晶またはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含む。
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面のカウンターリガンドに結合する、分子の細胞外ドメインまたはそのカウンターリガンド結合フラグメントを含む。免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする配列を含む組み換えＤＮＡ構築物を含み、ここで、ＣＡＲは、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。他の箇所に記載するとおり、ここに記載する方法は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸で、例えば、Ｔ制御性枯渇細胞の集団からの、細胞を形質導入することを含み得る。
特定の態様において、ＣＡＲはｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖの前に配列番号１に提供するような任意のリーダー配列があり、配列番号２または配列番号３６または配列番号２３に提供するような任意のヒンジ配列、配列番号６に提供するような膜貫通領域、配列番号７または配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号９または配列番号１０を含むＣＤ３ゼータ配列があってよく、例えば、ここで、これらドメインは単一融合タンパク質を形成するために隣接し、同じ読み枠にある。
ある態様において、ＣＡＲ構築物の例は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内刺激ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内刺激ドメイン)を含む。ある態様において、ＣＡＲ構築物の例は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメイン)および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン)を含む。
リーダー配列の例は、配列番号１として提供される。ヒンジ／スペーサー配列の例は、配列番号２または配列番号３６または配列番号２３として提供される。膜貫通ドメイン配列の例は、配列番号６として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号７として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号１６として提供される。ＣＤ３ゼータドメイン配列の例は、配列番号９または配列番号１０として提供される。
ある態様において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を含み、ここで、核酸分子は抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、これら配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に隣接し、同じ読み枠内にある。ＣＡＲにおいて使用できる細胞内シグナル伝達ドメインの例は、例えば、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢなどの１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある場合には、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準的手法を使用する、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの核酸分子の誘導またはそれを含む細胞および組織からの直接単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化ではなく、合成により産生できる。
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター構築物を使用して、免疫エフェクター細胞に導入できる。
ＣＡＲをコードする核酸はまた、細胞に直接トランスフェクトできる、例えば、ＲＮＡ構築物を使用して、免疫エフェクター細胞に導入できる。トランスフェクションに使用するｍＲＮＡを産生する方法は、特別に設計されたプライマーの鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、一般に５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)(例えば、ここに記載する３’および／または５’ ＵＴＲ)、５’キャップ(例えば、ここに記載する５’キャップ)および／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)(例えば、ここに記載するＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生する(例えば、ここに記載、例えば、配列番号３５)。このように産生されたＲＮＡは、種々の細胞で効率的にトランスフェクトされ得る。ある実施態様において、鋳型は、ＣＡＲのための配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡ ＣＡＲベクターを、エレクトロポレーションにより細胞、例えば、Ｔ細胞に形質導入する。
抗原結合ドメイン
ある態様において、複数の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は、抗原結合ドメインとも称する標的特異的結合要素を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。結合要素の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、標的細胞上の特定の疾患状態と関係する細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。それ故に、ここに記載するＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染症、自己免疫性疾患および癌細胞と関連するものを含む。
ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ類由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されないその機能的フラグメントおよび組み換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)または、例えば、一本鎖ＴＣＲのそのフラグメントなどのような抗原結合ドメインとして機能することが当分野で知られる代替的足場を含むが、これらに限定されない、抗原に結合するあらゆるドメインであり得る。ある場合には、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが最終的に使用される同じ種由来であることが有益である。例えば、ヒトでの使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合ドメインは、表１に挙げる可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖と可変軽鎖を連結するリンカー配列は、例えば、ここに記載するリンカー配列のいずれかあるいはＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号１０４)であってよい。
ヒト化抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲ構築物は、引用により本明細書に包含させるＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１５３２７０号に記載されている。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメインのマウスの配列およびヒト化ＣＤＲ配列を、重鎖可変ドメインについて表２および軽鎖可変ドメインについて表３に示す。“ＩＤ”は、各ＣＤＲの各配列番号を意味する。
当分野のあらゆる既知ＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば、あらゆる既知ＣＤ１９ ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインを、本開示に従い使用できる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許８,３９９,６４５号；米国特許７,４４６,１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); and 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10に記載のＣＤ１９ ＣＡＲ。
ＣＡＲ発現細胞を使用して標的とし得る標的抗原の例は、数ある中で、ＷＯ２０１４／１５３２７０号、ＷＯ２０１４／１３０６３５号、ＷＯ２０１６／０２８８９６号、ＷＯ２０１４／１３０６５７号、ＷＯ２０１６／０１４５７６号、ＷＯ２０１５／０９０２３０号、ＷＯ２０１６／０１４５６５号、ＷＯ２０１６／０１４５３５号およびＷＯ２０１６／０２５８８０号(この各々をその全体を引用により本明細書に包含させる)に記載の、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖIII、ＣＤ３３、メソセリン、ＢＣＭＡおよびＧＦＲアルファ−４を含む。
ある実施態様において、ＣＤ１９に特異的に結合するＣＡＲ Ｔ細胞は、ＵＳＡＮ命名ＴＩＳＡＧＥＮＬＥＣＬＥＵＣＥＬ−Ｔを有する。ＣＴＬ０１９は、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下にＣＴＬ０１９導入遺伝子を含む、自己不活性化、複製欠損レンチウイルス(ＬＶ)ベクターの形質導入による安定な挿入が介在するＴ細胞の遺伝子修飾により産生される。ＣＴＬ０１９は、導入遺伝子陽性Ｔ細胞パーセントに基づき送達される、導入遺伝子陽性および陰性Ｔ細胞の混合物であり得る。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ヒト化ＣＤ１９に特異的に結合できる、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１５３２７０号の表３による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメイン(例えば、ヒト化抗原結合ドメイン)を含み得る。ＷＯ２０１４／１５３２７０号に明記のＣＤ１９ ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaにより１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を表１およびここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列は、本明細書に特に包含させる。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合でき、例えば、引用によりここに包含させるＷＯ２０１４／１３０６３５号の表１〜２によるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ１〜ＣＡＲ８のいずれか)または抗原結合ドメインを含み得る。ＷＯ２０１４／１３０６３５号に明記されるＣＤ１２３ ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１４２〜１９３のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１４７(例えば、配列番号１４７のアミノ酸残基４５〜５９、７５〜８１、１１４〜１２２、１８３〜１８７、２０２〜２１８および／または２５１〜２５９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１５３(例えば、配列番号１５３のアミノ酸残基４５〜５９、７５〜８１、１１４〜１２２、１８３〜１８７、２０２〜２１８および／または２５１〜２５９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１５９(例えば、配列番号１５９のアミノ酸残基４５〜５９、７５〜８１、１１４〜１２２、１８３〜１８７、２０２〜２１８および／または２５１〜２５９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１６５(例えば、配列番号１６５のアミノ酸残基４５〜５９、７５〜８１、１１４〜１２２、１８３〜１８７、２０２〜２１８および／または２５１〜２５９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１７１(例えば、配列番号１７１のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２８、１８３〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１７７(例えば、配列番号１７７のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２８、１８３〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１８３(例えば、配列番号１８３のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２８、１８３〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１８９(例えば、配列番号１８９のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２８、１８３〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１９１(例えば、配列番号１９１のアミノ酸残基４７〜６１、７７〜８３、１１６〜１２４、１８０〜１８４、１９９〜２１５および／または２４８〜２５６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１９３(例えば、配列番号１９３のアミノ酸残基５４〜５８、７３〜８９、１２２〜１２７、１７７〜１８７、２０３〜２０９および／または２４２〜２５０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合でき、例えば、
引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１６／０２８８９６号の表２、６および９によるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ１２３−１〜ＣＡＲ１２３−４およびｈｚＣＡＲ１２３−１〜ｈｚＣＡＲ１２３−３２のいずれか)または抗原結合ドメインを含み得る。ＷＯ２０１６／０２８８９６号に明記のＣＤ１２３ ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号１９４〜４１３のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲｖIIIに特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１３０６５７号の表２または配列番号１１によるＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを含み得る。ＷＯ２０１４／１３０６５７号に明記のＥＧＦＲｖIII ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４１４〜４７４のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、リーダー配列、例えば、配列番号４１８、４２４、４３０、４３６、４４２、４４８、４５４、４６０、４６６または４７２のアミノ酸残基１〜２１を含む。他の実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、ポリヒスチジンタグ配列、例えば、配列番号４１８、４２４、４３０、４３６、４４２、４４８、４５４または４６０のアミノ酸残基２６８〜２７７、配列番号４６６のアミノ酸残基２６５〜２７４または配列番号４７２のアミノ酸残基２６２〜２６９を含み得る。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４２０(例えば、配列番号４２０のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２３、１７９〜１９４、２１０〜２１６および／または２４９〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４２６(例えば、配列番号４２６のアミノ酸残基４５〜６０、７６〜８２、１１５〜１２３、１８４〜１８８、２０３〜２１９および／または２５１〜２５６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４３２(例えば、配列番号４３２のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２４、１７９〜１９４、２１０〜２１６および／または２４９〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４３８(例えば、配列番号４３８のアミノ酸残基４５〜６０、７６〜８２、１１５〜１２３、１８４〜１８８、２０３〜２１９および／または２５２〜２５６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４４４(例えば、配列番号４４４のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２４、１７９〜１９４、２１０〜２１６および／または２４９〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４５０(例えば、配列番号４５０のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１２０〜１２４、１７９〜１９４、２１０〜２１６および／または２４９〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４５６(例えば、配列番号４５６のアミノ酸残基４５〜６０、７６〜８２、１１５〜１２３、１８４〜１８８、２０３〜２１９および／または２５２〜２５６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４６２(例えば、配列番号４６２のアミノ酸残基４５〜６０、７６〜８２、１１５〜１２３、１８４〜１８８、２０３〜２１９および／または２５２〜２５６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４６８(例えば、配列番号４６８のアミノ酸残基５２〜５６、７１〜８７、１１９〜１２４、１７６〜１９１、２０７〜２１３および／または２４６〜２５４)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ３３に特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１６／０１４５７６号の表２または９によるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ３３−１〜ＣＡＲ−３３−９のいずれか)または抗原結合ドメインを含み得る。ＷＯ２０１６／０１４５７６号に明記のＣＤ３３ ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号４７５〜５３３のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソセリンに特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１５／０９０２３０号の表２〜３のＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを含み得る。ＷＯ２０１５／０９０２３０号に明記のメソセリンＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５３４〜６２５のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５３４(例えば、配列番号５３４のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０６、１６１〜１７１、１８７〜１９３および／または２２６〜２３４)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５３５(例えば、配列番号５３５のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１２７、１８２〜１９２、２０８〜２１４および／または２４７〜２５５)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５３６(例えば、配列番号５３６のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１５、１７０〜１８０、１９６〜２０２および／または２３５〜２４３)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５３７(例えば、配列番号５３７のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３６、１９１〜２０１、２１７〜２２３および／または２５６〜２６４)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５３８(例えば、配列番号５３８のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０９、１６４〜１７４、１９０〜１９６および／または２２９〜２３６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５３９(例えば、配列番号５３９のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３０、１８５〜１９５、２１１〜２１７および／または２５０〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４０(例えば、配列番号５４０のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０３、１５８〜１６８、１８４〜１８９および／または２２３〜２３２)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４１(例えば、配列番号５４１のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１２４、１７９〜１８９、２０５〜２１０および／または２４４〜２５３)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４２(例えば、配列番号５４２のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６５、９９〜１０４、１５９〜１６９、１８５〜１９１および／または２２４〜２３１)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４３(例えば、配列番号５４３のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８６、１２０〜１２５、１８０〜１９０、２０６〜２１２および／または２４５〜２５２)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４４(例えば、配列番号５４４のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１５、１７０〜１８０、１９６〜２０２および／または２３５〜２４３)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４５(例えば、配列番号５４５のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３６、１９１〜２０１、２１７〜２２３および／または２５６〜２６４)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４６(例えば、配列番号５４６のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９８〜１１０、１６５〜１７６、１９２〜１９８および／または２３１〜２４０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４７(例えば、配列番号５４７のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３１、１８６〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６１)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４８(例えば、配列番号５４８のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０８、１６３〜１７３、１８９〜１９５および／または２２８〜２３６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５４９(例えば、配列番号５４９のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１２９、１８４〜１９４、２１０〜２１６および／または２４９〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５０(例えば、配列番号５５０のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１０、１６５〜１７５、１９１〜１９７および／または２３０〜２３８)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５１(例えば、配列番号５５１のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３１、１８６〜１９６、２１２〜２１８および／または２５１〜２５９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５２(例えば、配列番号５５２のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６５、９９〜１１１、１６６〜１８２、１９８〜２０４および／または２３７〜２４５)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５３(例えば、配列番号５５３のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８６、１２０〜１３２、１８７〜２０３、２１９〜２２５および／または２５８〜２６６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５４(例えば、配列番号５５４のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０４、１５９〜１６９、１８５〜１９１および／または２２４〜２３１)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５５(例えば、５５５のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１２５、１８０〜１９０、２０６〜２１２および／または２４５〜２５２配列番号)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５６(例えば、配列番号５５６のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０７、１６２〜１７２、１８８〜１９４および／または２２７〜２３６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５７(例えば、配列番号５５７のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１２８、１８３〜１９３、２０９〜２１５および／または２４８〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５８(例えば、配列番号５５８のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１０、１６５〜１７６、１９２〜１９８および／または２３１〜２３９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５５９(例えば、配列番号５５９のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３１、１８６〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６０(例えば、配列番号５６０のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１１、１６６〜１７６、１９２〜１９８および／または２３１〜２３９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６１(例えば、配列番号５６１のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３２、１８７〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６２(例えば、配列番号５６２のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６５、９９〜１１１、１６０〜１６９、１８６〜１９２および／または２２５〜２４４)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６３(例えば、配列番号５６３のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８６、１２０〜１３２、１８１〜１９１、２０７〜２１３および／または２４６〜２５５)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６４(例えば、配列番号５６４のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１２、１６１〜１７１、１８７〜１９３および／または２２６〜２３６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６５(例えば、配列番号５６５のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３３、１８２〜１９２、２０８〜２１４および／または２４７〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６６(例えば、配列番号５６６のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１２、１６１〜１７１、１８７〜１９３および／または２２６〜２３６)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６７(例えば、配列番号５６７のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３３、１８２〜１９２、２０８〜２１４および／または２４７〜２５７)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６８(例えば、配列番号５６８のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１１、１６６〜１７７、１９３〜１９９および／または２３２〜２４１)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５６９(例えば、配列番号５６９のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３２、１８７〜１９８、２１４〜２２０および／または２５３〜２６２)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４
、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５７０(例えば、配列番号５７０のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１０、１６５〜１７６、１９２〜１９８および／または２３１〜２４０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５７１(例えば、配列番号５７１のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３１、１８６〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６１)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５７２(例えば、配列番号５７２のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１１、１６６〜１７６、１９２〜１９８および／または２３１〜２３９)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５７３(例えば、配列番号５７３のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８７、１２０〜１３２、１８７〜１９７、２１３〜２１９および／または２５２〜２６０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５７４(例えば、配列番号５７４のアミノ酸残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０８、１５８〜１６７、１８３〜１９０および／または２２２〜２３０)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号５７５(例えば、配列番号５７５のアミノ酸残基４７〜５６、７１〜８６、１２０〜１２９、１７９〜１８８、２０４〜２１０および／または２４３〜２５１)の重および／または軽ＣＤＲ配列の１以上(例えば、２、３、４、５または全)を含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインはリンカー配列を含み得る(例えば、配列番号５３４のアミノ酸残基１１８〜１３７、配列番号５３５のアミノ酸残基１３９〜１５８、配列番号５３６のアミノ酸残基１２７〜１４６、配列番号５３７のアミノ酸残基１４８〜１６７、配列番号５３８のアミノ酸残基１２１〜１４０、配列番号５３９のアミノ酸残基１４２〜１６１、配列番号５４０のアミノ酸残基１１５〜１３４、配列番号５４１のアミノ酸残基１３６〜１５５、配列番号５４２のアミノ酸残基１１６〜１３５、配列番号５４３のアミノ酸残基１３７〜１５６、配列番号５４４のアミノ酸残基１２７〜１４６、配列番号５４５のアミノ酸残基１４８〜１６７、配列番号５４６のアミノ酸残基１２２〜１４１、配列番号５４７のアミノ酸残基１４３〜１６２、配列番号５４８のアミノ酸残基１２０〜１３９、配列番号５４９のアミノ酸残基１４１〜１６０、配列番号５５０のアミノ酸残基１２２〜１４１、配列番号５５１のアミノ酸残基１４３〜１６２、配列番号５５２のアミノ酸残基１２３〜１４２、配列番号５５３のアミノ酸残基１４４〜１６３、配列番号５５４のアミノ酸残基１１６〜１３５、配列番号５５５のアミノ酸残基１３７〜１５６、配列番号５５６のアミノ酸残基１１９〜１３８、配列番号５５７のアミノ酸残基１４０〜１５９、配列番号５５８のアミノ酸残基１３２〜１４１、配列番号５５９のアミノ酸残基１４３〜１６２、配列番号５６０のアミノ酸残基１２３〜１４２、配列番号５６１のアミノ酸残基１４４〜１６３、配列番号５６２のアミノ酸残基１２３〜１３７、配列番号５６３のアミノ酸残基１４４〜１５８、配列番号５６４のアミノ酸残基１２４〜１３８、配列番号５６５のアミノ酸残基１４５〜１５９、配列番号５６６のアミノ酸残基１２４〜１３８、配列番号５６７のアミノ酸残基１４５〜１５９、配列番号５６８のアミノ酸残基１２３〜１４２、配列番号５６９のアミノ酸残基１４４〜１６３、配列番号５７０のアミノ酸残基１２２〜１４１、配列番号５７１のアミノ酸残基１４３〜１６２、配列番号５７２のアミノ酸残基１２３〜１４２、配列番号５７３のアミノ酸残基１４４〜１６３または配列番号５７５のアミノ酸残基１４１〜１５５)。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、リーダー配列を含む(例えば、配列番号５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３または５７５のアミノ酸残基１〜２１または配列番号５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３または６２５のヌクレオチド残基１〜６３によりコードされる)。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＢＣＭＡに特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１６／０１４５６５号の表１または１６、配列番号２７１または配列番号２７３のＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを含み得る。ＷＯ２０１６／０１４５６５号に明記のＢＣＭＡ ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号６２６〜８５９のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＬＬ−１に特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１６／０１４５３５号の表２のＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを含み得る。ＷＯ２０１６／０１４５３５号に明記のＣＬＬ−１ ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号８６０〜９４１のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＧＦＲアルファ−４に特異的に結合でき、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１６／０２５８８０号の表２のＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを含む。ＷＯ２０１６／０２５８８０号に明記のＧＦＲアルファ−４ ＣＡＲ分子および抗原結合ドメインのアミノ酸およびコード化ヌクレオチド配列(例えば、KabatまたはChothiaによる１、２、３ＶＨ ＣＤＲおよび１、２、３ＶＬ ＣＤＲを含む)を、ここに添付する配列表に提供する。配列表に提供される前記配列と同一および実質的に同一のアミノおよびヌクレオチド配列を本明細書に特に包含させる。
ある実施態様において、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインは、配列番号９４２〜９８１のいずれかまたはそれと実質的に同一の配列によるアミノ酸配列を含むかまたはそのヌクレオチド配列によりコードされる。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ分子のいずれかの抗原結合ドメイン(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖIII、ＣＤ３３、メソセリン、ＢＣＭＡおよびＧＦＲアルファ−４のいずれか)は、上記抗体の１、２、３(例えば、全３)重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３および／または上記抗原結合ドメインの１、２、３(例えば、全３)軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３を含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、上に挙げられ、記載された抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。
ある態様において、抗腫瘍抗原結合ドメインはフラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある態様において、ここに記載する抗癌関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二機能的(例えば二特異的)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。ある態様において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、ここに記載する癌関連抗原タンパク質と、野生型のまたは増強された親和性で結合する。
ある場合には、ｓｃＦｖｓを、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子を、ＶＨ領域とＶＬ領域を、可動性ポリペプチドリンカーを使用して連結することにより製造できる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響する。実際、短ポリペプチドリンカー(例えば、５〜１０アミノ酸)を用いたとき、鎖内折りたたみが阻止される。鎖間折りたたみも、２可変領域を、機能的エピトープ結合部位を形成するように一緒にするために必要である。リンカー配向およびサイズの例について、例えば、引用により本明細書に包含させるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上アミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある実施態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の実施態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)(配列番号２６)のようなグリシンおよびセリンの反復セットを含む。ある実施態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２５)であり得る。リンカー長の変動は、活性を保持するか増強でき、活性試験で優れた有効性を生じさせる。
他の態様において、抗原結合ドメインはＴ細胞受容体(“ＴＣＲ”)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ(ｓｃＴＣＲ)である。このようなＴＣＲを製造する方法は当分野で知られる。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照(引用文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる)。例えば、ｓｃＴＣＲは、リンカー(例えば、可動性ペプチド)により連結されたＴ細胞クローンからのＶαおよびＶβ遺伝子を含む改変ができる。この手法は、それ自体細胞内であるが、このような抗原のフラグメント(ペプチド)がＭＨＣにより癌細胞の表面に提示される、癌関連標的に極めて有用である。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合した膜貫通ドメインを含むように、設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域と関連する１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)および／または膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域と関連する１以上のアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの一つと関連するものである。ある場合には、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換により選択または修飾して、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、このようなドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を避けることができる。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列を、同じＣＡＲＴに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように修飾または置換してよい。
膜貫通ドメインは、天然または組み換え源由来であり得る。供給源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合しているとき、細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明の特定の用途での膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ α、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの、少なくとも膜貫通領域を含み得る。
ある場合には、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジにより、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、ある実施態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む(例えば、それからなる)。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む(例えば、それからなる)。
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーはＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(配列番号３６)のヒンジを含む。ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(配列番号３７)のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(配列番号２３)のヒンジを含む。ある実施態様において、ヒンジまたはスペーサーは、AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(配列番号２４)のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
ある態様において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、この場合主にロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。ある態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、組み換え膜貫通ドメインの各末端に見られ得る。
所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある態様において、リンカーは、GGGGSGGGGS(配列番号１４)のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号１９)のヌクレオチド配列によりコードされる。
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーはＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般にＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも一つの活性化を担う。
ここに記載するＣＡＲで使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後協調してシグナル伝達開始に作用するＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列のあらゆる誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
ＴＣＲ単独により産生されたシグナルは、Ｔ細胞の完全活性化に不十分であり、二次および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。それ故に、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲにより抗原依存性初代活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)および二次または共刺激シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するために抗原非依存性様式で作用するものの二つの異なる群の細胞質シグナル伝達配列が介在すると言える。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激性方向または阻害性方向でＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激性様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明で特に有用であるＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(“ＩＣＯＳ”としても既知)、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄのものを含む。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載するＣＤ３−ゼータ配列を含む。
ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が改変(例えば、増加または減少)された変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
共刺激シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインをそれ自体で含んでよくまたは本発明のＣＡＲの設定において有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分をいう。ある実施態様において、細胞内ドメインを、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計する。ある態様において、細胞内ドメインを、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計する。
共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の増大、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣおよびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。
ＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列を、無作為にまたは特定の順番で互いに連結してよい。所望により例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長の、短オリゴ−またはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。ある実施態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある実施態様において、単一アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインを、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上、共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計する。ある実施態様において、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の、共刺激シグナル伝達ドメインがリンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により分離される。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは２共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある実施態様において、リンカーはアラニン残基である。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計する。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計する。ある態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号７のシグナル伝達ドメインである。ある態様において、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは配列番号９のシグナル伝達ドメインである。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計する。ある態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(配列番号１６)のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(配列番号１５)の核酸配列によりコードされる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的または異なる標的(例えば、ここに記載する癌関連抗原以外の標的またはここに記載する別の癌関連抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に対する、例えば異なる抗原結合ドメインを含む、第二ＣＡＲを含み得る。ある実施態様において、第二ＣＡＲは、癌関連抗原と同じ癌細胞型で発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の、異なる、抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。理論に縛られることを望まないが、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７またはＯＸ−４０の第一ＣＡＲへのおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、両標的が発現される細胞にＣＡＲ活性を制限できる。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一癌関連抗原ＣＡＲおよび異なる標的抗原(例えば、第一標的抗原と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第一標的抗原以外の抗原(例えば、第一標的抗原と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
他の態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団に関する。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する異なる癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される癌関連抗原と異なるここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載する癌関連抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
他の態様において、本発明は、集団における少なくとも１細胞がここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する、細胞の集団に関する。例えば、ある実施態様において、因子は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ−１は、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少し得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ(例えば、ＴＧＦベータ)を含む。ある実施態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある実施態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータのような阻害分子の、第一ポリペプチドまたはこれらのいずれかのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＣＤ２８、例えば、ここに記載するとおり)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む)である第二ポリペプチドを含む。ある実施態様において、薬剤は、ＰＤ−１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
ＣＡＲ分子の例
抗ＣＤ１９結合ドメインの配列を上の表１に提供する。完全ＣＡＲ構築物は、表１に記載する抗原結合ドメインのいずれかと下に提供する１以上のさらなるＣＡＲ要素を使用して産生できる。
・ リーダー(アミノ酸配列)(配列番号１)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
・ リーダー(核酸配列)(配列番号１２)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
・ ＣＤ８ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号２)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
・ ＣＤ８ヒンジ(核酸配列)(配列番号１３)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
・ ＣＤ８膜貫通(アミノ酸配列)(配列番号６)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
・ 膜貫通(核酸配列)(配列番号１７)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
・ ４−１ＢＢ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号７)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
・ ４−１ＢＢ細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号１８)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
・ ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号９)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・ ＣＤ３ゼータ(核酸配列)(配列番号２０)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
・ ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列；NCBI Reference Sequence NM_000734.3)(配列番号１０)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・ ＣＤ３ゼータ(核酸配列；NCBI Reference Sequence NM_000734.3)；(配列番号２１)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG
AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT
TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA
AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG
AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC
ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC
CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＩｇＧ４ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号３６)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG主要KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
ＩｇＧ４ヒンジ(ヌクレオチド配列)(配列番号３７)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
ＥＦ１アルファプロモーター
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(配列番号１１)。
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２５)
GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２６)：この配列は１〜６“Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ”反復単位を含み得る
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２７)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２８)
GGGGSGGGGS GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２９)
GGGS
ポリＡ(配列番号３０)、ポリＡ １−５０００
ポリＡ(配列番号３１)、ポリＴ １−１００
ポリＡ(配列番号３２)、ポリＴ １−５０００
ポリＡ(配列番号３３)、ポリＡ １−５０００
ポリＡ(配列番号３４)、ポリＡ １−４００
ポリＡ(配列番号３５)、ポリＡ １−２０００
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号３８)：この配列は１〜１０“Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ”反復単位を含み得る
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
ここに記載する方法において使用できるＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を表４に示す。
ＣＡＲと他の分子または薬剤の共発現
第二ＣＡＲの共発現
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的(例えば、ＣＤ１９)または異なる標的(例えば、ＣＤ１９以外の標的、例えば、ここに記載する標的)に対する異なる抗原結合ドメインを含む、例えば、第二ＣＡＲを含み得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の、異なる、抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０またはＩＣＯＳの第一ＣＡＲおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、両標的が発現される細胞にＣＡＲ活性を制限できる。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一ＣＡＲおよび他の抗原を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび他の抗原を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載するＸＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞に見られるが、癌細胞に見られない、例えば、Ｘもまた発現する正常細胞の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ(例えば、ＴＧＦベータ)の細胞内ドメインであり得る。
ある実施態様においてＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第一ＣＡＲと第二ＣＡＲを発現する細胞は、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとして、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを含み、これは、第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合せず、例えば、第二ＣＡＲの抗原結合ドメインはＶＨＨである。
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、天然に軽鎖がない結合分子、慣用の四鎖抗体由来単一ドメイン、改変ドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメイン足場を含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当分野で知られるまたは将来的に知られるであろうあらゆる単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないあらゆる種に由来し得る。この用語はまたラクダ科およびサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子を含み得る。
ある態様において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清で見られる新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるもののような、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ(“ＩｇＮＡＲ”)の可変領域に由来する単一ドメイン分子を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載される。
他の態様によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えばＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に記載されている。明確化のために、この天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来の可変ドメインは、ここでは、四鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコに由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖分子を産生でき、このようなＶＨＨも本発明の範囲内である。
ＳＤＡＢ分子は組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生(例えば、ファージディスプレイにより選択)であり得る。
複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、受容体の抗原結合ドメイン間の相互作用が、例えば、抗原結合ドメインの１以上がその同族抗原に結合する能力が阻害されるため、望ましくないことがある抗原結合ドメインを含むことも判明している。従って、ここでの開示は、このような相互作用が最小化された抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。またここに開示されるのは、このような相互作用が最小化された抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸、ならびにそのような細胞および核酸の製造および使用方法である。ある実施態様において、第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来単一ＶＨドメインを含む。
ある実施態様において、ここでの組成物は第一ＣＡＲと第二ＣＡＲを含み、ここで、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来単一ＶＨドメインを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはナノボディを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来単一ＶＨドメインを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
ある実施態様において、細胞の表面上に存在するとき、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲの存在により実質的に減少されない。ある実施態様において、第二ＣＡＲ存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲ非存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
ある実施態様において、細胞の表面上に存在するとき、第一および第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるならば、互いに結合する。ある実施態様において、第一および第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであるときより、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく互いに結合する。
ＣＡＲ活性を増強する薬剤の共発現
他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤を発現できる。
例えば、ある実施態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子を阻害する薬剤である。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御する分子は阻害分子である。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例はＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦベータを含む。
ある実施態様において、薬剤、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたは、例えば、ここに記載する、例えば、阻害性タンパク質または系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)のような転写アクティベーターを使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害できる。ある実施態様において、薬剤はｓｈＲＮＡ、例えば、ここに記載するｓｈＲＮＡである。ある実施態様において、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する薬剤がＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞機能を調節または制御、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの要素、例えば、全要素をコードする核酸に連結する。
ある実施態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある実施態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦベータのような阻害分子の第一ポリペプチドまたはこれらの何れかのフラグメント(例えば、これらの何れかの少なくとも細胞外ドメインの一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)。ある実施態様において、薬剤は、ＰＤ１の第一ポリペプチドまたはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１の２リガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌に多い(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により、逆転され得る。
ある実施態様において、薬剤は、阻害分子の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含み、例えば、計画死１(ＰＤ１)を、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと融合できる(ここではＰＤ１ ＣＡＲとも称する)。ある実施態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、ここに記載するＸＣＡＲと組み合わせて使用するとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。ある実施態様において、ＣＡＲは、配列番号１０５の下線により示されるＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１ ＣＡＲである。ある実施態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(配列番号１０５)。
ある実施態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは下記アミノ酸配列(配列番号１０６)を含む。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(配列番号１０６)。
ある実施態様において、薬剤は、ＰＤ１ ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１ ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＤ１ ＣＡＲの核酸配列 を下に示し、下記配列番号１０３においてＰＤ１ ＥＣＤに下線を付す。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(配列番号１０３)。
他の例において、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、共刺激分子または共刺激分子リガンドであり得る。共刺激分子の例は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)を含む。このような共刺激分子のさらなる例は、例えば、ここに記載する、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。共刺激分子リガンドの例は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬおよびＬＩＧＨＴを含む。ある実施態様において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと異なる共刺激分子のリガンドである。ある実施態様において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと同じ共刺激分子のリガンドである。ある実施態様において、共刺激分子リガンドは４−１ＢＢＬである。ある実施態様において、共刺激リガンドはＣＤ８０またはＣＤ８６である。ある実施態様において、共刺激分子リガンドはＣＤ７０である。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞をさらに改変して、１以上のさらなる共刺激分子または共刺激分子リガンドを発現させ得る。
ＣＡＲとケモカイン受容体の共発現
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞は、さらにケモカイン受容体分子を含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂまたはＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫および神経芽腫(を含むＣＣＬ２またはＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍への輸送を増強する(Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8およびKershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80)。それ故に、理論に縛られることを望まないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により発現されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞で発現されるケモカイン受容体は、腫瘍へのＣＡＲ発現細胞のホーミングを改善し、腫瘍へのＣＡＲ発現細胞の浸潤を促進し、ＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍有効性を増強することができると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在するまたは組み換えケモカイン受容体またはそのケモカイン結合フラグメントを含み得る。ここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ−Ｔｘ)での発現に適するケモカイン受容体分子は、ＣＸＣケモカイン受容体(例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６またはＣＸＣＲ７)、ＣＣケモカイン受容体(例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０またはＣＣＲ１１)、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体(例えば、ＣＸ３ＣＲ１)、ＸＣケモカイン受容体(例えば、ＸＣＲ１)またはそのケモカイン結合フラグメントを含む。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲと共に発現されるケモカイン受容体分子は、腫瘍により分泌されるケモカインに基づき選択する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに、ＣＣＲ２ｂ受容体またはＣＸＣＲ２受容体を含む、例えば、発現する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は同じベクターにあるかまたは２種の異なるベクターにある。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子が同じベクターにあるとき、ＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は各々２種の異なるプロモーターの制御下にあるかまたは同じプロモーターの制御下にある。
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまた、ここに記載する１以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を含む、例えば、ここに記載する方法により製造された、免疫エフェクター細胞も提供する。ある面において、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡトランスクリプトとして提供される。ある面において、核酸分子はＤＮＡ構築物として提供される。
ここに記載する核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはこれらの組み合わせであり得る。ある態様において、核酸分子は、ここに記載するＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。他の態様において、核酸分子は、前記核酸分子の何れかを含むベクターである。
ある面において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。コドン最適化は、コードＤＮＡにおける同義コドン(すなわち、同一アミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、種毎に偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮重は、同一ポリペプチドが多様なヌクレオチド配列によりコードされることを可能にする。多様なコドン最適化方法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号に開示された方法を含む。
したがって、ある面において、例えば、ここに記載する方法により製造された、免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする核酸分子を含み、ここで、ＣＡＲは、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および刺激性ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載するゼータ鎖)を含む細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。
本発明はまた、ＣＡＲをコードする核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子が挿入されたベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期にわたる、安定な組込みおよび娘細胞へのその遺伝を可能にするため、長期遺伝子導入の達成に適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖性細胞に形質導入できるため、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルスに由来するベクターを超える利点を有する。低免疫原性であるとのさらなる利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもあり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上(例えば、２)の末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造遺伝子を欠き得る。例示的ガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびこれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載されている。
他の態様において、所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターはアデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、sleeping beauty、crisper、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンの使用により達成できる。引用により本明細書に包含させるJune et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。
簡潔に概要を述べると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般にＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその部分をプロモーターと操作可能に連結させ、該構築物を発現ベクターに取り込ませることにより達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
核酸を、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシーケンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形で細胞に提供できる。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。当分野で知られる技術を使用して、選択遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。組み換えウイルスを、次いでインビボまたはエクスビボで単離し、対象の細胞に送達できる。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。ある実施態様において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。ある実施態様において、レンチウイルスベクターが使用される。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは、開始部位の３０〜１１０bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流に同様に機能的成分を含むことが示されている。プロモーター成分間のスペーシングは、プロモーター機能が、これら要素が互いに逆になったときまたは移動したときに保持されるように、しばしば可動性である。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間のスペーシングは、活性が低減し始める前に５０bp離れるまで増加し得る。プロモーターにより、個々の要素が、転写活性化のために協調的にまたは個々に機能できるように見える。例示的プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲコード化核酸分子を発現できるプロモーターの例は、ＥＦ１プロモーターである。天然ＥＦ１プロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的送達を担う伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１プロモーターは、哺乳動物発現プラスミドにおいて広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された核酸分子からのＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)参照。ある態様において、ＥＦ１プロモーターは、実施例に提供する配列を含む。
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)早期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターのようなしかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーター配列も使用してよい。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望ましいときにオンにするまたは発現が望ましくないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供できる。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
プロモーターの他の例は、ホスホグリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターである。ある態様において、切断ＰＧＫプロモーター(例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１以上、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００ヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター)が所望され得る。
ＷＴ ＰＧＫプロモーター：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(配列番号９８２)。
切断ＰＧＫプロモーター例：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(配列番号９８３)。
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(配列番号９８４)。
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(配列番号９８５)。
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(配列番号９８６)。
ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、原核生物におけるエピソーム複製および複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介する遺伝子導入または感染が探索される細胞集団から、発現細胞の特定および選択を容易にするために選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両方も含み得る。他の態様において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの異なる切片により運搬されてよく、共遺伝子導入法により使用される。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両者は、宿主細胞における発現を可能とするために、適切な調節性配列に隣接させ得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどのような抗生物質耐性遺伝子を含む。
レポーター遺伝子を、潜在的遺伝子導入細胞の同定および調節性配列の機能性の評価に使用する。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せずまたはそれらにより発現されず、その発現がある容易に検出可能な性質、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後適当な時間にアッセイされる。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造しても、商業的に得てもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用され得る。
ある実施態様において、ベクターは、２以上の核酸ＣＡＲをコードする配列、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲおよび第二ＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲまたはＣＤ１９以外の抗原に特異的に結合するＣＡＲを含み得る。このような実施態様において、ＣＡＲをコードする２以上の核酸配列は、同じフレーム内の単一核分子により、単一ポリペプチド鎖としてコードされる。この態様において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド開裂部位により分離され得る(例えば、自己開裂部位または細胞内プロテアーゼ用基質)。ペプチド開裂部位の例は、Ｔ２Ａ部位、Ｐ２Ａ部位、Ｅ２Ａ部位またはＦ２Ａ部位を含む。遺伝子を細胞に導入に、発現させる方法が当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターを、当分野のあらゆる方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的または生物学的手段により宿主細胞に導入できる。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を産生する方法は当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入のための適当な方法は、リン酸カルシウム遺伝子導入である。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子の哺乳動物、例えば、ヒト細胞への挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用する例示的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なミクロン未満のサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達のような他の最先端核酸標的化送達法が利用可能である。
非ウイルス送達系を利用する場合、例示的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用が、宿主細胞への核酸の導入に企図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の態様において、核酸を脂質と結合させ得る。脂質と結合した核酸をリポソームの水性内側に封入し、リポソームの脂質二重層内に分散させ、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両者と結合する結合分子を経てリポソームに結合させ、リポソームに封入し、リポソームと複合体化させ、脂質含有溶液に分散させ、脂質と混合し、脂質と組み合わせ、脂質中の懸濁液として包含させ、ミセルに包含させまたは複合体化させまたは他に脂質と結合させてよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液で何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは二重層構造、ミセルまたは“崩壊”(collapsed)構造で存在し得る。それらは単に溶液に分散していてもよく、おそらく、大きさまたは形が均一ではない凝集体を形成する。脂質は、天然に存在するまたは合成である脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に存在する脂肪滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素および脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのようなその誘導体を含む一群の化合物を含む。
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、ジセチルホスフェート(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories (Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入脂質二重層または凝集体の生成により形成される多様な単および多重膜脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体を伴う小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を含む。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は自己再構成され、その後閉構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層内に封入する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、溶液で通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造であるかまたは単に脂質分子の不均一な凝集体とみなし得る。またリポフェクタミン−核酸複合体も企図される。
外来核酸を宿主細胞に導入するまたは他に細胞を本発明の阻害物質に曝す方法と無関係に、宿主細胞における組み換え核酸配列の存在を確認するために、多様なアッセイを実施し得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ；例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)により、特定のペプチドの存在または不在を検出するまたは本発明の範囲内に入る物質を特定するためのここに記載するアッセイによるような、“生化学的”アッセイを含む。
ここに記載するＣＡＲが製造されたら、種々のアッセイを使用して、適切なインビトロおよび動物モデルにおいて、抗原刺激後Ｔ細胞を増大する能力、再刺激非存在下でのＴ細胞増大の維持および抗癌活性を含むが、これらに限定されない分子の活性を評価できる。本発明のＣＡＲの効果を評価するアッセイは、下にさらに詳述する。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を使用して、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６９５に記載のように、単量体および二量体の存在を検出できる。
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ拡張は、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ ａＡＰＣで刺激し、続いて、分析するプロモーターの制御下、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおける培養６日目に評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。あるいは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボゾームスキッピング配列を使用するｅＧＦＰと共にＣＡＲを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、ここに記載するような癌関連抗原＋Ｋ５６２細胞(ここに記載する癌関連抗原を発現するＫ５６２)、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)またはＨＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)存在下再刺激し、続いて洗浄する。外来ＩＬ−２を、１００ＩＵ／mlで隔日添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞を、ビーズベース計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
再刺激非存在下での持続的ＣＡＲ＋Ｔ細胞増大も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔にいうと、平均Ｔ細胞容積(ｆｌ)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目の記載するＣＡＲでの形質導入後、培養８日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
動物モデルを、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６９８に記載のように、ＣＡＲ発現細胞活性の測定にも使用できる。
用量依存的ＣＡＲ処置応答を、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ６９９に記載のように、アッセイできる。細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ７００に記載のとおり、先に記載されている。細胞毒性は、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ７０１に記載のように、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。細胞毒性をまた、例えば、xCELLigenceリアルタイム細胞分析器(ＲＴＣＡ)を使用する、付着細胞の電気インピーダンスの変化の測定によっても評価できる。ある実施態様において、細胞毒性を複数時点で測定する。
造影技術を使用して、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ７０２に記載のように、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。ここでの実施例部分に記載するものなおよび当分野で知られるものを含む他のアッセイもここに記載するＣＡＲの評価に使用できる。
キメラ抗原受容体制御のためのストラテジー
ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼ(例えば、Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を使用する、例えば、誘導性アポトーシスを、本発明のＣＡＲ治療における安全性スイッチとして使用できる。ある実施態様において、本発明のＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)はさらに誘導性アポトーシススイッチを含み、ここで、ヒトカスパーゼ(例えば、カスパーゼ９)または修飾バージョンが、条件的二量体化を可能にするヒトＦＫＢタンパク質の修飾に融合する。ラパログ(例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７)のような小分子存在下、誘導性カスパーゼ(例えば、カスパーゼ９)が活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の迅速なアポトーシスおよび死を生じる。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ(またはこのようなスイッチ１以上の局態様)の例は、例えば、ＵＳ２００４０４００４７号；ＵＳ２０１１０２８６９８０号；ＵＳ２０１４０２５５３６０号；ＷＯ１９９７０３１８９９号；ＷＯ２０１４１５１９６０号；ＷＯ２０１４１６４３４８号；ＷＯ２０１４１９７６３８号；ＷＯ２０１４１９７６３８号に記載されており；これら全てを引用により本明細書に包含させる。
他の例において、ＣＡＲ発現細胞はまた誘導性カスパーゼ−９(ｉカスパーゼ−９)分子も発現でき、これは、二量体化剤(例えば、rimiducid(別名AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)またはAP20187(Ariad))の投与により、細胞のカスパーゼ−９およびアポトーシスの活性化に至る。ｉカスパーゼ−９分子は、二量体化(ＣＩＤ)存在下二量体化に介在する、ＣＩＤ結合ドメインの化学的インデューサーを含む。これは、ＣＡＲ発現細胞の誘導的および選択的枯渇をもたらす。ある場合、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲコード化ベクターと離れた核酸分子によりコードされる。ある場合、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲコード化ベクターと同じ核酸分子によりコードされる。ｉカスパーゼ−９は、ＣＡＲ発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全性スイッチを提供できる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963;およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83参照。
本発明のＣＡＲ治療を制御するための代替的ストラテジーは、例えば、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)誘発による、例えば、ＣＡＲ発現細胞枯渇による、ＣＡＲ活性を不活性化またはオフにする小分子または抗体の利用を含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ治療は、Ｔ細胞枯渇剤の投与を含む。ある実施態様において、Ｔ細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)および／または補体誘発細胞死誘発により、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる薬剤である。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、細胞死、例えば、ＡＤＣＣまたは補体誘発細胞死が誘発できる分子により認識される抗原(例えば、標的抗原)を発現もし得る。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた抗体または抗体フラグメントにより標的とされることが可能である標的タンパク質(例えば、受容体)も発現し得る。このような標的タンパク質の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン(例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν)、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２)、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲおよびその切断バージョン(例えば、１以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１以上の領域を欠く)を含むが、これらに限定されない。
他の実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、シグナル伝達能を欠くが、ＡＤＣＣを誘発することができる分子、例えば、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))により認識されるエピトープを保持する切断上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)を、セツキシマブ投与がＡＤＣＣおよびＣＡＲ発現細胞のその後の枯渇も誘発するように、発現し得る(例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４号およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860参照)。他のストラテジーは、例えば、ＡＤＣＣによる、ＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブと結合する、ここに記載するＣＡＲ発現細胞においてＣＤ３２およびＣＤ２０抗原両者由来の標的エピトープを合わせる高度にコンパクトなマーカー／自殺遺伝子の発現を含む(例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287参照)。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ＡＤＣＣによる、破壊のために、成熟リンパ球、例えば、ＣＡＲ発現細胞と選択的に結合し、標的とする、モノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるキャンパスの投与を含む。他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。ある実施態様において、抗イディオタイプ抗体はエフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らし得る。他の実施態様において、ＣＡＲリガンド、例えば、抗イディオタイプ抗体を、細胞死滅を誘発する物質、例えば、トキシンと連結し、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らし得る。あるいは、ＣＡＲ分子それ自体が、下記のとおり、活性が制御され得るように、例えば、オンおよびオフとなるように操作できる。
他の実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、Ｔ細胞枯渇剤により認識される標的タンパク質も発現し得る。ある実施態様において、標的タンパク質はＣＤ２０であり、Ｔ細胞枯渇剤は抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。このような実施態様において、Ｔ細胞枯渇剤を、例えば、ＣＡＲ誘発毒性を軽減するために、ＣＡＲ発現細胞を減少または排除することが望ましいときに投与する。他の実施態様において、Ｔ細胞枯渇剤は、ここでの実施例に記載のような、抗ＣＤ５２抗体、例えば、アレムツズマブである。
ある実施態様において、ここに開示する方法は、さらに細胞(例えば、免疫エフェクター細胞ここに記載するとおり)での処置後Ｔ細胞枯渇剤を投与し、それによりＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞)を減少(例えば、枯渇)させることを含む。このようなＴ細胞枯渇剤を使用して、毒性を軽減するためにＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞)を効率的に枯渇できる。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する方法で製造され、例えば、ここに記載する方法で、アッセイされた(例えば、トランスフェクションまたは形質導入の前または後)。
ある実施態様において、Ｔ細胞枯渇剤を、ここに記載する、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の投与１週、２週、３週、４週または５週後に投与する。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲおよび標的タンパク質を共発現する、例えば、天然に標的タンパク質を発現するまたは標的タンパク質を発現するように改変される。例えば、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＡＲ核酸(例えば、ここに記載するＣＡＲ核酸)および標的タンパク質をコードする核酸を含む核酸(例えば、ベクター)を含み得る。
ある実施態様において、Ｔ細胞枯渇剤はＣＤ５２阻害剤、例えば、抗ＣＤ５２抗体分子、例えば、アレムツズマブである。
他の実施態様において、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、ここに記載のＣＡＲ分子(例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ)およびＴ細胞枯渇剤により認識される標的タンパク質を発現する。ある実施態様において、標的タンパク質はＣＤ２０である。ある実施態様において、標的タンパク質がＣＤ２０であるとき、Ｔ細胞枯渇剤は抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。
前記方法の何れかのさらなる実施態様において、方法は、さらに細胞、例えば、造血幹細胞または骨髄の対象への移植を含む。
他の態様において、本発明は、細胞移植前に対象をコンディショニングする方法に関する。方法は、対象に有効量のＣＡＲ核酸またはポリペプチド、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ核酸またはポリペプチドを含む細胞を投与することを含む。ある実施態様において、細胞移植は幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植または骨髄移植である。他の実施態様において、細胞移植前の対象のコンディショニングは、対象における標的発現細胞、例えば、ＣＤ１９発現正常細胞またはＣＤ１９発現癌細胞の数を減少させることを含む。
ＲＣＡＲ
他の実施態様において、ＣＡＲ活性が制御され得る制御可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)が、ＣＡＲ治療の安全性および有効性の最適化のために望まれることがある。ＲＣＡＲは、１組の、一般に最も単純な実施態様においては２ポリペプチドを含むことができ、ここで、ここに記載する標準的ＣＡＲの要素、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、別々のポリペプチドまたはメンバーに配置される。ある実施態様において、１組のポリペプチドは、二量体化分子存在下、互いにポリペプチドに結合し、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結させ得る、二量体化スイッチを含む。ある実施態様において、本発明のＣＡＲは、例えば、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４１２７２６１号に記載の二量体化スイッチを含む。
このような制御可能ＣＡＲのさらなる記載および配置例は、ここに、および、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際公開ＷＯ２０１５／０９０２２９号のパラグラフ５２７〜５５１に提供される。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、スイッチドメイン、例えば、配列番号１３１に示すＦＫＢＰスイッチドメインを含むかまたは、例えば、配列番号１３２に示す、ＦＲＢと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含む。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、例えば、配列番号１１６に示す、ＦＲＢ配列または、例えば、配列番号１３４〜１３９の何れかに示す、変異体ＦＲＢ配列を含む、スイッチドメインを含む。
ある態様において、ＲＣＡＲは、２ポリペプチドまたはメンバーを含む：１)例えば、ここに記載する初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン；２)例えば、ここに記載のようなＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバー。場合により、ＲＣＡＲは、ここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる。(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは要素がここに記載されるものであるとき、順序は記載したとおりであり得るが、他の順序も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順序は本書に記載のとおりであるが、他の態様において、順序は異なり得る。例えば、膜貫通領域の一端の要素の順序は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの配置は異なって、例えば逆でよい)。
ある実施態様において、第一および第二スイッチドメインは、細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある実施態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同一であるホモ二量体化スイッチでも、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるヘテロ二量体化スイッチでもよい。
ある実施態様において、ＲＣＡＲは、“多スイッチ”を含み得る。多スイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のスイッチドメインを、独立して、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバー上に含む。ある実施態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある実施態様において、第一メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
ある実施態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。ある実施態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２または３の、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、ある実施態様において、初代細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある実施態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の４１ＢＢ−ＣＤ２７、４１ＢＢ−ＣＤ２７、ＣＤ２７−４１ＢＢ、４１ＢＢ−ＣＤ２８、ＣＤ２８−４１ＢＢ、ＯＸ４０−ＣＤ２８、ＣＤ２８−ＯＸ４０、ＣＤ２８−４１ＢＢまたは４１ＢＢ−ＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。このような実施態様において、細胞内結合メンバーはＣＤ３ゼータドメインを含む。このような実施態様において、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２共刺激ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバーおよび(２)膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインおよび少なくとも一つの初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある実施態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞表面に繋留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、該細胞を、抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換する必要はなく、１以上の抗原結合ドメインと好都合に対合することを可能とする。このような実施態様において、ＲＣＡＲは１)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、初代細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインを含まず、場合により細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある実施態様において、ＲＣＡＲは、３)第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン；および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーをさらに含み得る。
またここで提供されるのは、抗原結合メンバーが二特異性活性化およびターゲティング能を含む、ＲＣＡＲである。この実施態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２、３、４または５抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原の同一または異なるエピトープに結合する。ある実施態様において、複数の抗原結合ドメインはタンデムであり、場合により、リンカーまたはヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域は、ここに記載される。
ある実施態様は、増殖のスイッチングが可能な配置を有するＲＣＡＲを提供する。この実施態様において、ＲＣＡＲは１)場合により、膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメイン；例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０およびスイッチドメインから選択される１以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まないまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある実施態様において、抗原結合メンバーは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような実施態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある実施態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
ここに記載するＲＣＡＲ配置の何れかにおいて、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するようなＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む
またここで提供されるのは、ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞である。ＲＣＡＲを発現するように操作したあらゆる細胞を、ＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある実施態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称する。ある実施態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称する。
またここで提供されるのは、ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターである。ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある実施態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えば、ベクターに存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別々のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写生産物(これは、単一翻訳生産物の開裂または２つの別々のタンパク質生産物の翻訳により２タンパク質の産生を生じ得る)の使用により、達成できる。ある実施態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。ある実施態様において、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１ ＩＲＥＳをコードする配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。これらの実施態様において、(ｉ)および(ii)は、単一ＲＮＡとして転写される。ある実施態様において、は、(ｉ)および(ii)が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターは(ｉ)に操作可能に連結し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に連結する。
あるいは、ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列を、種々の核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列を第一核酸、例えば、第一ベクターに配置でき、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、第二核酸、例えば、第二ベクターに存在できる。
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは非共有でも共有でもよい。非共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有相互作用を促進する。共有二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有相互作用を促進する。
ある実施態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然生産物免疫抑制剤、ラパマイシンのための最初の細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合のために十分であるＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)
ある実施態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを使用できる。
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y(配列番号１３１)
ある実施態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログ存在下で、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含むことができ、例えば、配列番号１３１の下線部分であり、次のものである。
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S(配列番号１３２)
ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(配列番号１３３)
ここで使用する用語“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号１３１または１３２のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第一スイッチドメイン；およびラパマイシンまたはラパログの存在下に、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＲＢフラグメントまたはそのアナログを含み配列番号１３３のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある実施態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号１３１(または配列番号１３２)に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインおよび配列番号１３３に開示するアミノ酸残基を含む１スイッチドメインを含む。
ある実施態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば、修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよび二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の間の複合体形成が変えられた、例えば、増強された、修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある実施態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８から選択される、１以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は、何れかの他の天然に存在するアミノ酸への変異されている。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は、フェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)、例えば、配列番号１３４またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)、例えば、配列番号１３５に変異されている。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８は、フェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)、例えば、配列番号１３６に変異されている。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は何れかのアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８は何れかのアミノ酸に変異され、例えば、配列番号１３７である。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号１３８である。ある実施態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号１３９である。
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供する手引きに従い、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合しているポリペプチドと、第二スイッチドメインに結合、例えば融合しているポリペプチドの間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載する系で測定して、１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと呼ぶこともある)、例えば、ＲＡＤ００１は、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある実施態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択できる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチで使用するのに適するさらなるラパマイシンアナログは、“組み合わせ治療”なる表題のセクションまたは“ＭＴＯＲ阻害剤例”なるサブセクションにさらに記載する。
ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ) ＣＡＲ
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ分子は、ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)の１以上の要素を含み、それによりＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ要素は、次のナチュラルキラー細胞受容体の何れかからの膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；およびＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ要素を含むＣＡＲ分子の例示的配置および配列は、内容を引用により本明細書に包含させる国際公開ＷＯ２０１４／１４５２５２号に記載されている。
スプリットＣＡＲ
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞はスプリットＣＡＲを含む。スプリットＣＡＲ手法は、公報ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号により詳細に記載される。簡潔にいうと、スプリットＣＡＲ系は、第一抗原結合ドメインおよび共刺激性ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、該細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲも発現する。細胞が第一抗原に遭遇したとき、共刺激性ドメインは活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインは活性化され、細胞−死滅活性が開始される。それゆえに、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全活性化される。
ＣＡＲリガンドおよびその使用
ここに開示する方法とは別にまたはこれと組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量化(例えば、インビトロまたはインビボ(例えば、臨床的モニタリング))；免疫細胞増大および／または活性化；および／またはＣＡＲリガンドの使用を含むＣＡＲ特異的選択の１以上のための方法および組成物が開示される。ある例示的実施態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体(例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体)である。他の実施態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子(例えば、ここに記載するＣＡＲ抗原分子)である。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量する方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドを使用して、インビトロまたはインビボでのＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量に使用できる(例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床的モニタリングまたは患者への投与)。方法は
ＣＡＲリガンド(所望により、標識ＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射性または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド)を提供し；
ＣＡＲ発現細胞を獲得し(例えば、製造サンプルまたは臨床的サンプルのようなＣＡＲ発現細胞含有サンプルを獲得し)；
結合が生じる条件下でＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドを接触させ、それにより存在するＣＡＲ発現細胞のレベル(例えば、量)を検出する
ことを含む。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどのような標準技術を使用して検出できる。
他の態様において、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を増大および／または活性化する方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞(例えば、第一ＣＡＲ発現細胞または一過性に発現するＣＡＲ細胞)を提供し；
該ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンド、例えば、ここに記載するＣＡＲリガンド)を、免疫細胞増大および／または増殖が生じる条件下で接触させ、それにより活性化および／または増大された細胞集団を産生する
ことを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲリガンドは基質上に存在する(例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化または結合している)。ある実施態様において、基質は非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリクス、チップまたはビーズから選択される、固体支持体であり得る。ある実施態様において、ＣＡＲリガンドは基質に存在する(例えば、基質表態様上)。ＣＡＲリガンドは、基質に共有結合または非共有結合(例えば、架橋)により固定化、結合または関係している。ある実施態様において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合(例えば、共有結合)している。前記実施態様において、免疫細胞集団をインビトロまたはエクスビボで増大させ得る。方法は、さらに、例えば、ここに記載する方法の何れかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンドの存在下、免疫細胞の集団を培養することを含む。
他の実施態様において、細胞を増大および／または活性化する方法は、さらに第二刺激性分子、例えば、ＣＤ２８の添加を含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二刺激性分子を基質、例えば、１以上のビーズに固定化し、それにより細胞増大および／または活性化を増加させ得る。
さらに他の態様において、ＣＡＲ発現細胞を選択または富化する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載するＣＡＲリガンドを接触させ、細胞をＣＡＲリガンドの結合に基づき選択することを含む。
さらに他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、低減および／または死滅させる方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞とここに記載するＣＡＲリガンドを接触させ、ＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞を標的化し、それにより、ＣＡＲ発現細胞の数を減らすおよび／または死滅させることを含む。ある実施態様において、ＣＡＲリガンドを毒性剤(例えば、トキシンまたは細胞除去剤)と連結させる。他の実施態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし得る。
ここに開示方法において使用できる抗ＣＡＲ抗体例は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838に記載され、これらの内容を引用により本明細書に包含させる。ある実施態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、抗ＣＤ１９抗体分子、例えば、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを認識する。例えば、抗イディオタイプ抗体分子は、Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838に記載のＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と結合について競合でき；ＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と同じＣＤＲ(例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せを使用して１以上の、例えば、全ての、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)を有し得て；ＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１のような１以上の(例えば、２)可変領域を有し得るかまたはＣＤ１９特異的ＣＡＲ ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１を含み得る。ある実施態様において、抗イディオタイプ抗体は、Jena et al.に記載の方法により製造した。他の実施態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗イディオタイプ抗体分子である。ある実施態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)を有し；ＷＯ２０１４／１９０２７３号の抗体分子の１以上の(例えば、２)可変領域を有してよくまたは１３６.２０.１のようなＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の抗体分子を含み得る。他の実施態様において、抗ＣＡＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載のようなＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域に結合する。ある実施態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域、例えば、重鎖定常領域(例えば、ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域)または軽鎖定常領域に結合する。例えば、ある実施態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載の２Ｄ３モノクローナル抗体と結合について競合し、２Ｄ３と同じＣＤＲ(例えば、１以上の、例えば、全ての、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)を有しまたは２Ｄ３の１以上の(例えば、２)可変領域を有しまたはＷＯ２０１４／１９０２７３に記載のような２Ｄ３を含む。
ある態様および実施態様において、ここでの組成物および方法は、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年７月３１日出願の米国出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４３２１９号に記載のとおり、Ｔ細胞の特異的サブセットについて最適化する。ある実施態様において、Ｔ細胞の最適化サブセットは、同じ構築物を発現する対照Ｔ細胞、例えば、異なるタイプのＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋)と比較して、残留性の増強を示す。
ある実施態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はここに記載するＣＡＲを含み、該ＣＡＲは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のための適当な(例えば、最適化された、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。ある実施態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞はここに記載するＣＡＲを含み、該ＣＡＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のための適当な(例えば、最適化された、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の他の共刺激性ドメインを含む。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む。
ある面において、ここに記載するのは、対象を処置する方法、例えば、癌を有する対象を処置する方法である。方法は、該対象に、有効量の
１)
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第一共刺激ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメイン
を含むＣＡＲを含むＣＤ４＋ Ｔ細胞(ＣＡＲＣＤ４＋)；および
２)
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第二共刺激ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の他の共刺激ドメイン
を含むＣＡＲを含むＣＤ８＋ Ｔ細胞(ＣＡＲＣＤ８＋)；
を投与することを含み、ここで、ＣＡＲＣＤ４＋とＣＡＲＣＤ８＋は互いに異なる。
所望により、方法は、さらに、
３)抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメインを含む
ＣＡＲを含む第二ＣＤ８＋Ｔ細胞(第二ＣＡＲＣＤ８＋)の投与を含み、ここで、第二ＣＡＲＣＤ８＋は、ＣＡＲＣＤ８＋に存在しない細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインを含み、所望により、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない。
非ウイルス送達方法
ある態様において、非ウイルス方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
ある実施態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位性要素とも呼ばれる)の使用を含む。ある実施態様において、トランスポゾンは、それ自体、ゲノムにおけるある位置に挿入され得るＤＮＡ片、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入できるＤＮＡ片または長い核酸からスプライスされ、ゲノムの他の位置に挿入され得るＤＮＡ片である。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む。
トランスポゾンを使用する核酸送達の例示的方法は、Sleeping beautyトランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびpiggyBac(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させるAronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65;およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83参照。
ＳＢＴＳは、１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポザーゼ酵素の源の２要素含む。トランスポザーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)からのトランスポゾンを、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡに転置できる。例えば、トランスポザーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Aronovich et al. supra.参照。
例示的トランスポゾンは、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させるGrabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。例示的トランスポザーゼは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポザーゼまたはＳＢ１１トランスポザーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る機能亢進トランスポザーゼ)を含む。例えば、全て引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al.; Kebriaei et al.;およびGrabundzija et al.参照。
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能とする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法である。
ここに記載する方法によって、ある実施態様において、ＳＢＴＳ要素を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドが、細胞(例えば、ＴまたはＮＫ細胞)に送達される。例えば、核酸は、標準的核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達法、例えば、ここに記載する方法、例えば、エレクトロポレーション、遺伝子導入またはリポフェクションにより送達される。ある実施態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある実施態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)ならびにトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む。他の実施態様において、２核酸を有する系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、例えば、デュアルプラスミド系が提供される。例えば、第一および第二核酸は宿主細胞に共送達される。
ある実施態様において、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入とヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する遺伝子編集の組み合わせの使用により、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞が産生される。
ある実施態様において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞の再プログラムおよび細胞の対象への直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、容易かつ比較的安価な患者集団の要求に見合う十分量の産生、貯蔵中の安定性および免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
バイオポリマー送達方法
ある実施態様において、１以上のここに開示するＣＡＲ発現細胞を、バイオポリマースキャフォールド、例えば、バイオポリマーインプラントを経て対象に投与または送達できる。バイオポリマースキャフォールドは、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の送達、増大および／または分散を支持または増強できる。バイオポリマースキャフォールドは、天然に存在するまたは合成であり得る生体適合性(例えば、実質的に炎症性または免疫応答を誘発しない)および／または生分解性ポリマーを含む。例示的バイオポリマーは、例えば、引用により全体を本明細書に包含させる２０１５年３月１３日出願の国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ１００４〜１００６に記載される。
医薬組成物および処置
ある態様において、本発明は、ここに記載するように産生したＣＡＲ発現細胞を、所望により１以上の他の治療と組み合わせて投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。ある態様において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望により１以上の他の治療と組み合わせて含む反応混合物を投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。ある態様において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を輸送または受容する方法を提供する。ある態様において、本発明は、ここに記載するように産生したＣＡＲ発現細胞を受容し、さらに該ＣＡＲ発現細胞を、患者に、所望により１以上の他の治療と組み合わせて投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。ある態様において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を産生し、さらに該ＣＡＲ発現細胞を、患者に、所望により１以上の他の治療と組み合わせて投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。他の治療は、例えば、化学療法のような癌治療であり得る。
ここに記載する方法は、さらにＣＡＲ発現細胞の医薬組成物への製剤を含む。医薬組成物は、ここに記載するように、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と共に含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。組成物は、例えば、静脈内投与用に製剤できる。
ある実施態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残存抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯蔵ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド要素、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物を、実質的に含まない、例えば、検出可能レベルで存在しない。ある実施態様において、細菌は、アルカリゲネス・フェーカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザ、ナイセリア・メニンジタイディス、シュードモナス・アエルギノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエおよびスタフィロコッカス・ピオゲネシスＡ群からなる群から選択される、少なくとも１つである。
“免疫学的有効量”、“抗癌有効量”、“癌阻害有効量”または“治療的量”を記載するとき、組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者(対象)の状態の個々の差を考慮して医師が決定できる。一般に、ここに記載する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を含む医薬組成物は、これらの範囲内の全ての整数値を含む、１０４〜１０９細胞／kg体重、ある例において１０５〜１０６細胞／kg体重の用量で投与し得る。Ｔ細胞組成物はまたこれらの用量で複数回投与してよい。細胞は、免疫治療で一般的に知られる注入技術を使用して投与し得る(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞)の用量は約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８細胞／kg含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞)の用量は少なくとも約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８細胞／kg含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞)の用量は最大約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８細胞／kg含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞)の用量は約１.１×１０６〜１.８×１０７細胞／kg含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞)の用量は約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞)の用量は少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞含む。ある実施態様において、ＣＡＲ細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞)の用量は最大約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞含む。ある態様において、活性化免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を対象に投与し、次いでその後再び採血し(またはアフェレーシスを実施し)、そこからの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を活性化し、患者にこれらの活性化および増大免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を再点滴することが望ましいかもしれない。この工程を、数週毎に複数回実施し得る。ある態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、１０cc〜４００ccの採血した血液化から活性化する。ある態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血した血液から活性化する
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を複数の用量、例えば、第一用量、第二用量および所望により第三用量で投与する。ある実施態様において、方法は、対象に第一用量、第二用量および所望により１以上のさらなる用量を投与することを含み、各用量がＣＡＲ分子、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ分子、例えば、配列番号８９のＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞を含む、癌(例えば、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ))を有する対象(例えば、成体対象)を処置する方法を提供する。
ある実施態様において、方法は、２〜５×１０６生存可能ＣＡＲ発現細胞／kgの用量を投与することを含み、ここで、対象は５０kg未満の体重を有する；または
１.０〜２.５×１０８生存可能ＣＡＲ発現細胞の用量を投与することを含み、ここで、対象は少なくとも５０kgの体重を有する。
ある実施態様において、単一用量を、対象、例えば、小児科対象に投与する。
ある実施態様において、用量を連日投与し、例えば、第一用量を１日目に投与し、第二用量を２日目に投与し、そして任意の第三用量(投与するならば)を３日目に投与する。
ある実施態様において、第四、第五または第六用量またはそれ以上の用量が投与される。
ある実施態様において、第一用量は総用量の約１０％に相当し、第二用量は総用量の約３０％に相当し、第三用量は総用量の約６０％に相当し、ここで、これらのパーセンテージの合計は１００％である。ある実施態様において、第一用量は総用量の約９〜１１％、８〜１２％、７〜１３％または５〜１５％に相当する。ある実施態様において、第二用量は総用量の約２９〜３１％、２８〜３２％、２７〜３３％、２６〜３４％、２５〜３５％、２４〜３６％、２３〜３７％、２２〜３８％、２１〜３９％または２０〜４０％に相当する。ある実施態様において、第三用量は総用量の約５５〜６５％、５０〜７０％、４５〜７５％または４０〜８０％に相当する。ある実施態様において、総用量は、１週間、２週間、３週間または４週間にわたり投与される生存可能ＣＡＲ発現細胞の総数をいう。ある実施態様において、２用量が投与されるとき、総用量は、第一および第二用量で対象に投与される生存可能ＣＡＲ発現細胞の合計数に相当する。ある実施態様において、第三用量が投与されるとき、総用量は、第一、第二および第三用量で対象に投与される生存可能ＣＡＲ発現細胞の総数に相当する。
ある実施態様において、用量を、その中の生存可能ＣＡＲ発現細胞数によって定める。ＣＡＲ発現は、例えば、ＣＡＲ分子に結合する抗体分子および検出可能標識を使用するフローサイトメトリーにより測定できる。生存能は、例えば、Cellometerにより測定され得る。
ある実施態様において、生存可能ＣＡＲ発現細胞は漸増用量で投与される。ある実施態様において、第二用量は第一用量より多く、例えば、１０％、２０％、３０％または５０％多い。ある実施態様において、第二用量は、第一用量の２倍、３倍、４倍または５倍である。ある実施態様において、第三用量は第二用量より多く、例えば、１０％、２０％、３０％または５０％多い。ある実施態様において、第三用量は、第二用量の２倍、３倍、４倍または５倍である。
ある実施態様において、方法は、次のａ)〜ｈ)の１、２、３、４、５、６、７または全てを含む。
ａ)第一用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数は、第二用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数の１／３を超えない；
ｂ)第一用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数は、投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞の総数の１／Ｘを超えず、ここで、Ｘは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０である；
ｃ)第一用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数は、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８または５×１０８ ＣＡＲ発現、生存可能細胞を超えず、第二用量は第一用量より多い；
ｄ)第二用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数は第三用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数の１／２を超えない；
ｅ)第二用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数は投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞の総数の１／Ｙを超えず、ここで、Ｙは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０である；
ｆ)第二用量で投与されるＣＡＲ発現、生存可能細胞数は１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８または５×１０８ ＣＡＲ発現、生存可能細胞を超えず、第三用量は第二用量より多い；
ｈ)第一、第二および選択された用法により第三用量の投与の用量および時間は、対象が４、３、２または１を超えないレベルでＣＲＳを経験するように選択する。
ある実施態様において、総用量は約５×１０８ ＣＡＲ発現、生存可能細胞である。ある実施態様において、総用量は約５×１０７〜５×１０８ ＣＡＲ発現、生存可能細胞である。ある実施態様において、第一用量は約５×１０７(例えば、±１０％、２０％または３０％)ＣＡＲ発現、生存可能細胞であり、第二用量は約１.５×１０８(例えば、±１０％、２０％または３０％)ＣＡＲ発現、生存可能細胞であり、第三用量は約３×１０８(例えば、±１０％、２０％または３０％)ＣＡＲ発現、生存可能細胞である。
ある実施態様において、対象は一定用量を受けた後、例えば、第一用量、第二用量および／または第三用量を受けた後、ＣＲＳについて評価する。
ある実施態様において、対象は、ＣＲＳ処置、例えば、トシリズマブ、コルチコステロイド、エタネルセプトまたはシルツキシマブを受ける。ある実施態様において、ＣＲＳ処置を、第一用量のＣＡＲ分子を含む細胞の前または後に投与する。ある実施態様において、ＣＲＳ処置を、第二用量のＣＡＲ分子を含む細胞の前または後に投与する。ある実施態様において、ＣＲＳ処置を、第三用量のＣＡＲ分子を含む細胞の前または後に投与する。ある実施態様において、ＣＲＳ処置を、ＣＡＲ分子を含む細胞の第一および第二用量の間および／またはＣＡＲ分子を含む細胞の第二および第三用量の間に投与する。
対象への組成物の投与は、任意の簡便な方法で実施できる。ここに記載する組成物を、患者に頚動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内に、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に、例えば、皮内または皮下注射により投与できる。免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染の部位に直接注射し得る。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象にＴＲＥＧ細胞集団を低減する分子と組み合わせて投与する。ＴＲＥＧ細胞の数を減少させる(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与およびＧＩＴＲ機能調節を含む。理論に縛られることを望まないが、アフェレーシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞投与前の対象におけるＴＲＥＧ細胞の数の減少は、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)の数を減少させ、対象の再発のリスクを低減すると考えられる。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、制御性Ｔ細胞(ＴＲＥＧｓ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的化するおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞をシクロホスファミドと組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)をＣＡＲ発現細胞投与前に投与する。例えば、ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与してよい。ある実施態様において、シクロホスファミドを対象にＣＡＲ発現細胞投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある実施態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を対象にＣＡＲ発現細胞投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレーシス前に投与する。ある実施態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。ある実施態様において、対象はＡＬＬを有する。ある実施態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。ＧＩＴＲアゴニストの例は、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または、例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞をＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストをＣＡＲ発現細胞前に投与する。例えば、ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与してよい。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。
治療方法
ある態様において、本発明は、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する疾患を処置する方法を提供する。
ある態様において、本発明は、癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を提供する方法であって、免疫エフェクター細胞集団の有効量を対象に投与することを含み、ここで、免疫エフェクター細胞集団を、第一ＣＡＲを一過性に発現する免疫エフェクター細胞の集団と同族抗原を接触させることにより増大する、方法に関する。
他の態様において、本発明は、癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を提供する方法であって、第二ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞集団の有効量を対象に投与することを含み、ここで、免疫エフェクター細胞集団を、第一ＣＡＲを一過性に発現する免疫エフェクター細胞の集団と同族抗原を接触させることにより増大し、さらに、第二ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入する、方法に関する。
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲを発現するように改変される免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に提供することによる、癌(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)を処置する方法に関する。ある実施態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。ある実施態様において、処置する癌はＡＬＬ(急性リンパ芽球性白血病)、ＣＬＬ(慢性リンパ性白血病)、ＤＬＢＣＬ(汎発性大Ｂ細胞リンパ腫)、ＭＣＬ(マントル細胞リンパ腫)またはＭＭ(多発性骨髄腫)である。
ある態様において、本方法は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように改変される免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に提供することによる、癌(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)を処置する方法に関し、ここで、癌細胞はＣＤ１９を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。ある実施態様において、処置する癌はＡＬＬ(急性リンパ芽球性白血病)、ＣＬＬ(慢性リンパ性白血病)、ＤＬＢＣＬ(汎発性大Ｂ細胞リンパ腫)、ＭＣＬ(マントル細胞リンパ腫)、ホジキンリンパ腫またはＭＭ(多発性骨髄腫)である。
本発明は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)がＣＡＲを発現するように遺伝的修飾(例えば、レンチウイルスベクターの形質導入による)されており、ＣＡＲ発現細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法を含む。注入された細胞はレシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させ得る。抗体治療剤と異なり、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)はインビボで長期残留性をもたらす複製が可能であり、持続性腫瘍制御を導き得る。レンチウイルスベクターを使用して産生されたＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は安定なＣＡＲ発現を有する。種々の態様において、患者に投与された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)またはその子孫は、患者にＴ細胞投与後、患者に少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年維持される。
本発明はまた、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)が、一過性にＣＡＲを発現するように、例えば、インビトロ転写ＲＮＡにより修飾され、ＣＡＲ発現細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法も含む。ＣＡＲ ＲＮＡ(例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによる)の形質導入により産生されたＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、形質導入後４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日ＲＮＡ ＣＡＲを一過性に発現する。注入された細胞はレシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させ得る。それ故に、種々の態様において、患者に投与された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、患者にＴ細胞投与後、１ヶ月未満、例えば、３週、２週、１週存在する。
ある実施態様において、本発明は、ここに記載する腫瘍抗原(または癌関連抗原)を特異的に標的とし、結合する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に提供することによる、癌(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)を処置する方法を提供する。さらに他の実施態様において、処置方法は、例えば、ここに記載するナイーブＴ細胞を富化するためのＣＡＲ発現細胞の製造の改変を含む。
ある実施態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、癌を有する対象(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)の処置のためにＣＤ１９ ＣＡＲを発現するよう改変され、ここで、癌細胞はＣＤ１９を発現する。ある実施態様において、処置する癌はＡＬＬまたはＣＬＬである。免疫エフェクター細胞で発現されるＣＤ１９ ＣＡＲ分子は、完全ＣＡＲ構築物を産生するために、当分野のあらゆる抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン(例えば、表１または４に提供するもの)をここに記載するＣＡＲドメインの何れかと組み合わせて含み得る。例えば、完全ＣＡＲ構築物は表４に挙げるＣＡＲである。表４は、ここに記載する種々のＣＡＲドメイン(例えば、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメイン)および表１または４に挙げる抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを使用して産生する完全ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物の例を提供する。アミノ酸配列を(ａａ)と称し、核酸配列を(ｎｔ)と称する。
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)治療で癌、例えば、ＣＤ１９発現と関連する癌を処置する方法を提供する。癌の例は、例えば、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、ＡＬＬを含むが、これらに限定されない、例えば、１以上の急性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病を含む。
ここに記載する方法で処置し得るさらなる癌または血液学的状態は、例えば、Ｂ細胞前骨髄球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄血液細胞の産生無効(または形成異常)により纏められる血液状態の雑多な集合である“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されない。
前記血液学的状態はＣＤ１９の発現と関連し得る。さらに、ＣＤ１９発現と関連する疾患は、例えば、ＣＤ１９の発現と関連する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、本発明は、ＣＬＬの処置法を提供する。
他の実施態様において、本発明は、ＡＬＬの処置法を提供する。
他の実施態様において、本発明は、Ｂ細胞ＡＬＬの処置法を提供する。
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)(例えば、ＣＴＬ０１９のような例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞))で癌を有する対象(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)を処置する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、対象を、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)と他の治療剤、例えば、ここに記載する他の治療剤(例えば、他のＣＡＲ、例えば、他のここに記載するＣＡＲ、阻害性ＣＡＲ、例えば、阻害性ここに記載するＣＡＲ；化学療法；キナーゼ阻害剤(例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤)、チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤、標準治療療法など)の組み合わせで処置する方法を提供する。組み合わせは、例えば、ここに記載する薬剤のいずれとでもよい。
ある実施態様において、幹細胞移植は自己(autogeneic)幹細胞移植を含む。ある実施態様において、幹細胞移植は同種異系間幹細胞移植を含む。ある実施態様において、幹細胞移植は同種骨髄移植を含む。ある実施態様において、幹細胞移植は造血幹細胞移植(ＨＳＣＴ)を含む。ある実施態様において、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血液およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない種々の組織に由来する。
ある態様において、本発明は、ＣＤ１９発現と関連する疾患を処置する方法を提供する。ある態様において、本発明は、腫瘍の一部がＣＤ１９陰性であり、腫瘍の一部がＣＤ１９陽性である、疾患を処置する方法を提供する。例えば、提供される方法は、ＣＤ１９発現上昇と関連する疾患の処置を受けている対象の処置に有用であり、ここで、ＣＤ１９レベル上昇に対する処置を受けている対象は、ＣＤ１９レベル上昇と関連する疾患を示す。
ある態様において、提供される方法は、哺乳動物細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)における発現のためのプロモーターに操作可能に連結されたＣＤ１９ ＣＡＲを含むベクターを含む。ある態様において、提供される方法は、ＣＤ１９発現腫瘍の処置に使用するためのＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組み換え細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を含み、ここで、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組み換えＴ細胞はＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞と呼ばれる。ある態様において、提供される方法に従い投与されたＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ＣＡＲ発現細胞が腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の増殖が阻害されるように、表面に発現された少なくとも一つのＣＤ１９ ＣＡＲと腫瘍細胞の接触が可能である。
ある態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞が抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とするように、腫瘍細胞とここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を接触させることを含む、ＣＤ１９発現腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関し、ここで、腫瘍の増殖が阻害される。
ある態様において、本発明は、Ｔ細胞がＣＡＲを発現するように遺伝的修飾され、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法を含む。注入された細胞はレシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させ得る。抗体治療剤と異なり、ＣＡＲ修飾細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)はインビボで長期残留性をもたらす複製が可能であり、持続性腫瘍制御を導き得る。種々の態様において、患者に投与された細胞またはその子孫は、患者への細胞投与後、患者において少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年持続する。
本発明はまた、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)がキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、例えば、インビトロ転写ＲＮＡにより修飾され、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法も含む。注入された細胞はレシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させ得る。それ故に、種々の態様において、患者に投与された細胞は、患者への細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)投与後、１ヶ月未満、例えば、３週、２週、１週存在する。
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ＣＡＲ修飾細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)により誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であってよくあるいは直接対間接免疫応答であり得る。ある態様において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発現するヒト癌細胞に応答して特異的炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解活性を示し、可溶性ＣＤ１９阻害に抵抗し、バイスタンダー死滅に介在し、確立されたヒト腫瘍の寛解に介在する。例えば、ＣＤ１９発現腫瘍の不均質場内の低抗原腫瘍細胞は、隣接抗原陽性癌細胞に先に反応性であったＣＤ１９再指向Ｔ細胞の間接的破壊に感受性であり得る。
ある態様において、ここに記載する完全ヒトＣＡＲ修飾細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、エクスビボ免疫化および／または哺乳動物におけるインビボ治療のためのある種のワクチンであり得る。ある態様において、哺乳動物はヒトである。
エクスビボ免疫化について、対象に細胞を投与する前に、インビトロで次の少なくとも一つが生じる：ｉ)細胞の増大、ii)細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入またはiii)細胞の凍結保存。
エクスビボは当分野で知られ、下により詳細に記載する。簡潔には、細胞を対象(例えば、ヒト)から単離し、ここに開示するＣＡＲを発現するベクターで遺伝的修飾(すなわち、インビトロでの形質導入またはトランスフェクト)する。ＣＡＲ修飾細胞を、治療効果を提供するために哺乳動物レシピエントに投与し得る。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ修飾細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細胞はレシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。
血液癌
血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する白血病および悪性リンパ増殖性状態のようなある種の癌である。
白血病は急性白血病および慢性白血病に分類できる。急性白血病はさらに急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)として分類できる。慢性白血病は慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含む。他の関連状態は、骨髄血液細胞の産生無効(または形成異常)およびＡＭＬへの形質転換のリスクにより纏められる血液状態の雑多な集合である、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ、以前は“前白血病状態”として知られた)を含む。
本発明は、癌を処置するための組成物および方法を提供する。ある態様において、癌は、白血病またはリンパ腫を含むが、これらに限定されない血液癌である。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を使用して、例えば、Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、ＡＬＬを含むが、これらに限定されない、例えば、急性白血病、例えば、ＣＭＬ、ＣＬＬを含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病、例えば、Ｂ細胞前骨髄球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄血液細胞の産生無効(または形成異常)により纏められる血液状態の雑多な集合である“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液状態のような、しかし、これらに限定されない癌および悪性腫瘍を処置し得る。
本発明はまた、ＣＤ１９発現細胞を含む細胞の集団と、ＣＤ１９発現細胞に結合するここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を接触させることを含む、ＣＤ１９発現細胞集団の増殖を阻害するまたは低減する方法も提供する。具体的態様において、本発明は、ＣＤ１９発現癌細胞集団と、ＣＤ１９発現細胞に結合するここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を接触させることを含む
ＣＤ１９を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するまたは低減する方法を低児湯する。ある態様において、本発明は、ＣＤ１９発現癌細胞集団と、ＣＤ１９発現細胞に結合するここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を接触させることを含む、ＣＤ１９を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するまたは低減する方法を提供する。ある態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、細胞および／または癌細胞の含量、数、量またはパーセンテージを、陰性対照と比較して、骨髄白血病または他のＣＤ１９発現と関連する癌細胞を有する対象またはそのための動物モデルにおいて、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。ある態様において、対象はヒトである。
本発明はまた、処置を必要とする対象にＣＤ１９発現細胞に結合するここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を投与することを含む、ＣＤ１９発現細胞と関連する疾患(例えば、ＣＤ１９を発現する血液癌または非定型癌)を予防、処置および／または管理する方法も提供する。ある態様において、対象はヒトである。ＣＤ１９発現細胞と関連する障害の非限定的例は、自己免疫性障害(例えば狼瘡)、炎症性障害(例えばアレルギーおよび喘息)および癌(例えばＣＤ１９を発現する血液癌または非定型癌)を含む。
本発明はまた、処置を必要とする対象にＣＤ１９発現細胞に結合するここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を投与することを含む、ＣＤ１９発現細胞と関連する疾患を予防、処置および／または管理する方法も提供する。ある態様において、対象はヒトである。
本発明は、処置を必要とする対象にＣＤ１９発現細胞に結合するここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を投与することを含む、ＣＤ１９発現と関連する癌細胞(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)の再発を阻止する方法を提供する。ある態様において、方法は、処置を必要とする対象に、有効量のＣＤ１９発現細胞に結合するここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、有効量の他の治療と組み合わせて投与することを含む。
組み合わせ治療
上に、およびここに記載するあらゆる癌治療は、ここに記載する癌の症状の処置および／または軽減のための１以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与できることは認められる。医薬組成物を、１以上の他のさらなる治療剤または治療剤と同時に、前にまたは後に投与できる。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。ここで使用する“組み合わせて”投与するは２(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害に苦しんでいる過程の間に対象に送達することを意味し、例えば、２以上の処置を、対象が障害と診断された後にかつ障害が治癒または撲滅される前にまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある実施態様において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第二の処置の送達開始時にまだ行われている。これは、ここでは“同時の”または“一緒の送達”ということがある。他の実施態様において、他の実施態様において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。何れかの場合のある実施態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第二処置剤はより有効である、例えば、等しい効果が少ない第二処置剤で見られるまたは第二処置剤が、第二処置剤を第一処置剤非存在下で投与したときに見られるよりも大きな程度で症状を軽減するまたは第一処置剤で同様な状況が見られる。ある実施態様において、送達、障害と関係する症状または他のパラメータの減少が、他方の処置剤の非存在下で一方の処置剤の送達で観察されるより大きい。２処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第一処置の効果が、第二剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。
ここに記載するＣＡＲ発現細胞および少なくとも一つのさらなる治療剤を同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与できる。逐次投与について、ここに記載するＣＡＲ発現細胞をまず投与してよく、さらなる薬剤を次に投与してよくまたは投与の順序は逆でよい。
さらなる態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、Izumoto et al. 2008 J NEUROSURG 108:963-971に記載のように、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体または他の免疫枯渇剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療剤、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射ペプチドワクチンと組み合わせた処置レジメンで投与できる。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、化学療法剤と組み合わせて使用できる。化学療法剤の例は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、ベンダムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)を含む)、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤およびこれらの組み合わせを含む。
ＭＴＯＲ阻害剤例は、ＲＡＤ００１、テムシロリムス；リダフォロリムス(以前はデフェロリムスとして既知、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３号に記載)；エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９、シロリムス(登録商標))；セマピモド(ＣＡＳ １６４３０１−５１−３)；エムシロリムス、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ １０１３１０１−３６−４)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩(ＳＦ１１２６、ＣＡＳ ９３６４８７−６７−１)(配列番号１４０)、ＸＬ７６５およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
免疫調節剤の例は、例えば、アフツズマブ(Roche(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Ｎｅｕｌａｓｔａ(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブリミド(登録商標))；サリドマイド(サロミド(登録商標))、ａｃｔｉｍｉｄ(ＣＣ４０４７)、ＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、ＣＡＳ ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能)およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
アントラサイクリンの例は、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびＲｕｂｅｘ(登録商標))；ブレオマイシン(ｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、ノバントロン(登録商標))；エピルビシン(ＥｌｌｅｎｃｅＴＭ)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(ムタマイシン(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；デスアセチルラビドマイシンおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ビンカアルカロイドの例は、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Ｅｌｄｉｓｉｎｅ(登録商標)))；ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ(登録商標)およびＶｅｌｂａｎ(登録商標))；ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
プロテオソーム阻害剤の例は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カーフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；イキサゾミブクエン酸エステル(MLＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；Ｏ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ＧＩＴＲアゴニストの例は、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または、例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)、例えば、ＣＴＬ０１９のようなここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象、例えば、部分的レスポンダーまたは非レスポンダーとして同定された対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパマイシンシグナル伝達経路の標的と組み合わせて投与する。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤をＣＡＲ発現細胞前に投与する。例えば、ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を細胞のアフェレーシス前に投与してよい。ある実施態様において、対象は癌(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)を有する。ある実施態様において、対象はＡＬＬを有する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。
ある実施態様において、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)、例えば、ＣＴＬ０１９のようなここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象、例えば、部分的レスポンダーまたは非レスポンダーとして同定された対象に、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストをＣＡＲ発現細胞前に投与する。例えば、ある実施態様において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与してよい。ある実施態様において、対象は癌(例えば、ＡＬＬおよびＣＬＬのような血液癌)を有する。ある実施態様において、対象はＡＬＬを有する。ある実施態様において、対象はＣＬＬを有する。
ある実施態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を投与してよい。例えば、ある実施態様において、薬剤は阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、計画死１(ＰＤ１)は、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例はＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの、阻害による、阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある実施態様において、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)のような転写アクティベーターを、ＣＡＲ発現細胞における阻害分子の発現阻害に使用できる。ある実施態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある実施態様において、阻害分子はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの実施態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの要素、例えば、全要素をコードする核酸と連結される。ある実施態様において、阻害性シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４(例えば、イピリムマブ(ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１とも称し、ヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６としても知られる))に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。ある実施態様において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある実施態様において、薬剤はＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある実施態様において、薬剤はＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)に結合する抗体または抗体フラグメントである。
ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１の２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１との結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により、逆転され得る。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。
例えば、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも称される；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ１に特異的に結合するニボルマブ(クローン５Ｃ４)および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８,４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に記載されている。ピジリズマブ(ＣＴ−０１１；Cure Tech)は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピジリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体はＷＯ２００９／１０１６１１号に記載されている。ペンブロリズマブ(以前はランブロリズマブとしても知られ、キイトルーダ、ＭＫ０３４７５とも称される；Merck)は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示される。ＭＥＤＩ４７３６(Medimmune)は、ＰＤＬ１と結合し、該リガンドとＰＤ１の相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech／Roche)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７,９４３,７４３号および米国公開２０１２００３９９０６号に記載されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤はＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(重鎖および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および２１に示されｔいる)およびＭＤＸ−１ １０５(ＢＭＳ−９３６５５９とも称され、例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤)を含む。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体は、数ある中で、ＡＭＰ ５１４(Amplimmune)、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ１抗体を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体またはそのフラグメントは、“ＰＤ−１に対する抗体分子およびその使用”なる名称の、全体を引用により本明細書に包含させる、ＵＳ２０１５／０２１０７６９号に記載の抗ＰＤ−１抗体分子である。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−クローン−Ａ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｂ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｃ、ＢＡＰ０４９−クローン−ＤまたはＢＡＰ０４９−クローン−Ｅの何れかから選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的に全ＣＤＲ)；または表１に記載のまたは表１におけるヌクレオチド配列によりコードされるとおり；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)または密接に関連するＣＤＲ、例えば、同一または少なくとも１アミノ酸改変を有するが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲを含む。
さらに他の実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、ここに記載する抗体、例えば、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０４９−クローン−Ａ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｂ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｃ、ＢＡＰ０４９−クローン−ＤまたはＢＡＰ０４９−クローン−Ｅの何れかから選択される抗体からの少なくとも１、２、３または４可変領域；または表１に記載のまたは表１におけるヌクレオチド配列によりコードされるとおりを含む；またはＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載のとおり；または表１におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である。
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、
(ａ)配列番号４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)；および配列番号１３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)(各々ＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載)；
(ｂ)配列番号１から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号１０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３２のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ(各々ＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載)；
(ｃ)配列番号２２４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号１３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ(各々ＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載)；または
(ｄ)配列番号２２４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号１０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３２のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ(各々ＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載)
を含む。
下記組み合わせにおいて、他の実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子は、(ｉ)配列番号１から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４または配列番号２２４；配列番号２のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号５；および配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)；および(ii)配列番号１０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号１３、配列番号１１のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号１４および配列番号３２のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号３３を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)(各々ＵＳ２０１５／０２１０７６９号の表１に記載)を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約１〜３０mg／kg、例えば、約５〜２５mg／kg、約１０〜２０mg／kg、約１〜５mg／kgまたは約３mg／kgの用量の注射(例えば、皮下または静脈内)により投与する。投与スケジュールは、例えば、週に１回から２週、３週または４週に１回で変わり得る。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約１〜２０mg／kgの用量で隔週投与する。
ある実施態様において、ＰＤ−１阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体分子の用量は均一用量である。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約２００mg〜５００mg、例えば、約２５０mg〜４５０mg、約３００mg〜４００mg、約２５０mg〜３５０mg、約３５０mg〜４５０mgまたは約３００mgまたは約４００mgの用量(例えば、均一用量)の注射(例えば、皮下または静脈内)により投与す。投与スケジュール(例えば、均一投与スケジュール)は、例えば、週に１回から２週、３週、４週、５週または６週に１回で変わり得る。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約３００mg〜４００mgの用量で３週に１回または４週に１回投与する。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約３００mgの用量で３週に１回投与する。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約４００mgの用量で、４週に１回、例えば、ｉ.ｖ.注射により投与する。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約３００mgの用量で、４週に１回、例えば、ｉ.ｖ.注射により投与する。ある実施態様において、抗ＰＤ−１抗体分子を、約４００mgの用量で、３週に１回、例えば、ｉ.ｖ.注射により投与する。
他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−クローン−Ｋ、ＢＡＰ０５８−クローン−Ｌ、ＢＡＰ０５８−クローン−Ｍ、ＢＡＰ０５８−クローン−ＮまたはＢＡＰ０５８−クローン−Ｏの何れかの重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的に全ＣＤＲ)を含む；またはＵＳ−２０１６／０１０８１２３号の表１に記載するとおりまたは表１に示すヌクレオチド配列によりコードされる。ある実施態様において、ＣＤＲ(または集合的に全ＣＤＲ)の１以上は、表１に示すまたは表１に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の変化、例えば、アミノ酸置換または欠失を有する。
さらに他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８−クローン−Ｋ、ＢＡＰ０５８−クローン−Ｌ、ＢＡＰ０５８−クローン−Ｍ、ＢＡＰ０５８−クローン−ＮまたはＢＡＰ０５８−クローン−Ｏの何れかのアミノ酸配列を含む、少なくとも１または２重鎖可変ドメイン(所望により定常領域を含む)、少なくとも１または２軽鎖可変ドメイン(所望により定常領域)または両方を含む；またはＵＳ−２０１６／０１０８１２３号の表１に記載のとおりまたは表１におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は
(ｉ)配列番号１から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４または配列番号１９５；配列番号２のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)(各々ＵＳＳＮ１４／８８１,８８８号の表１に記載)；および
(ii)配列番号９のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号１１のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)(各々ＵＳ−２０１６／０１０８１２３号の表１に記載)
を含む。
他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は
(ｉ)配列番号１から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４または配列番号１９５；配列番号５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(ＶＨ)(各々ＵＳ−２０１６／０１０８１２３号の表１に記載)；および
(ii)配列番号１２のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列および配列番号１４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)(各々ＵＳ−２０１６／０１０８１２３号の表１に記載)
を含む。
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は配列番号１のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は配列番号４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。さらに他の実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は配列番号１９５のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列(各々ＵＳ−２０１６／０１０８１２３号の表１に記載)を含む。
ＴＩＭ３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)はまたＴ細胞機能を、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋ Ｔ ヘルパー１およびＣＤ８＋ Ｔ細胞毒性１細胞において負に制御し、Ｔ細胞消耗に重要な役割を有する。ＴＩＭ３およびそのリガンド、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用阻害は免疫応答を増強できる。ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載のＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用できる。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、ＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合し、そのリガンドとの相互作用を阻害する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドはＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示される。他の抗ＴＩＭ３抗体はＲＭＴ３−２３(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)のヒト化バージョンを含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異的抗体はＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示される。
ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体またはそのフラグメントは、“ＴＩＭ３に対する抗体分子およびその使用”なる名称の、全体を引用により全体を本明細書に包含させる、ＵＳ２０１５／０２１８２７４号に記載する抗ＴＩＭ３抗体分子である。ある実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３の何れかから選択された抗体からの重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的に全ＣＤＲ)を含む；またはＵＳ２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載のとおり；または表１〜４におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)または密接に関連するＣＤＲ、例えば、同一または少なくとも１アミノ酸改変を有するが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲである。
さらに他の実施態様において、抗ＴＩＭ３抗体分子は、ここに記載する抗体、例えば、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３の何れかから選択される抗体からの少なくとも１、２、３または４可変領域を含む；またはＵＳ２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載のとおり；または表１〜４におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である。
他の実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある実施態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体の例はＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１号およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に記載され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４；または、例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に記載の、その組み換え形態である。他の実施態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のとおり、ＣＥＡＣＡＭ−５に結合するか、例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のとおり、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
理論に縛られることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害に介在すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、そしてＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および枯渇に役割を有するとしてが記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038／nature13848)。ある実施態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の共遮断が、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の実施態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。それゆえに、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
ＬＡＧ−３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞枯渇に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ−３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ＬＡＧ３およびそのリガンドは当分野で入手可能であり、ここに記載のＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用できる。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、アンタゴニストＬＡＧ−３抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性ＬＡＧ−３抗体である。他のＬＡＧ−３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスII分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化するＩＭＰ３２１(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示されている。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、“ＬＡＧ３に対する抗体分子およびその使用”なる名称の、引用により全体を本明細書に包含させるＵＳ２０１５／０２５９４２０号に記載の抗ＬＡＧ３抗体分子である。ある実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体分子は、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０(Ｓｅｒ)(例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−ＳｅｒまたはＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ)、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｆ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｇ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｈ、ＢＡＰ０５０−クローン−ＩまたはＢＡＰ０５０−クローン−Ｊの何れかから選択される抗体からの重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲ(または集合的に全ＣＤＲ)；またはＵＳ２０１５／０２５９４２０号の表１に記載のとおり；または表１におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)または密接に関連するＣＤＲ、例えば、同一または少なくとも１アミノ酸改変を有するが、改変(例えば、置換、欠失または挿入、例えば、保存的置換)が２、３または４を超えないＣＤＲを含む。
さらに他の実施態様において、抗ＬＡＧ３抗体分子は、ここに記載する抗体、例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０(Ｓｅｒ)(例えば、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−ＳｅｒまたはＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ)、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｆ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｇ、ＢＡＰ０５０−クローン−Ｈ、ＢＡＰ０５０−クローン−ＩまたはＢＡＰ０５０−クローン−Ｊの何れかから選択される抗体の少なくとも１、２、３または４可変領域を含む；またはＵＳ２０１５／０２５９４２０号の表１に記載のとおり；または表１におけるヌクレオチド配列によりコードされる；または前記配列の何れかと実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一)である。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは正のシグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある実施態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、ここに記載する、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある実施態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の実施態様において、融合タンパク質は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞により発現される。
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はｍｉＲ−１７−９２である。
ＲＯＲ１阻害剤
ＲＯＲ１阻害剤および組み合わせ治療、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＲＯＲ１阻害剤の組み合わせもここで提供される。ＲＯＲ１阻害剤は、例えば、小分子、抗体またはそのフラグメント(例えば、単特異的または二特異的抗体またはそのフラグメント)；ＲＯＲ１に結合する組み換えタンパク質、例えば、融合タンパク質；阻害性核酸；またはＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある実施態様において、ＲＯＲ１阻害剤は抗ＲＯＲ１発現細胞、例えば、ＲＯＲ１ ＣＡＲＴまたはＲＯＲ１発現ＮＫ細胞である。ＲＯＲ１阻害剤の例を下にさらに詳述する。
ある実施態様において、本発明は、ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団はＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＲＯＲ１阻害剤は、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＲＯＲ抗体(例えば、抗ＲＯＲ１単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＲＯＲ１阻害剤は、ここに記載する疾患の処置に使用できる。
抗ＲＯＲ１阻害剤の例は、引用により本明細書に包含させるHudecek, et al. Clin. Cancer Res. 19.12(2013):3153-64に記載される。例えば、抗ＲＯＲ１阻害剤は、Hudecek, et al.に記載の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲＴを含む(例えば、引用により本明細書に包含させる、Hudecek, et al.の３１５５頁の最初の振るパラグラフに記載のとおり産生)。他の例において、抗ＲＯＲ１阻害剤は、引用により本明細書に包含させるHudecek et al. ３１５４〜５５にまたがるパラグラフ；Baskar et al. MAbs 4(2012):349-61;およびYang et al. PLoS ONE 6(2011):e21018に記載の２Ａ２およびＲ１２抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列を含む抗体またはそのフラグメントを含む。
他の実施態様において、ＲＯＲ１阻害剤は、引用により本明細書に包含させる、ＵＳ２０１３／０１０１６０７号に記載のもの、例えば、ＵＳ２０１３／０１０１６０７号の配列番号１または２を含む、ＲＯＲ１を標的とする抗体またはそのフラグメント(例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ))を含む。ある実施態様において、抗ＲＯＲ１抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖｓ)は、生物学的に活性な分子とコンジュゲートまたは融合して、例えば、ＲＯＲ１発現細胞に応答するよう、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に指示するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を形成する。
ある実施態様において、ＲＯＲ１阻害剤の例は、ＵＣ−９６１(Cirmtuzumab)と称される抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体を含む。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT02222688参照。Cirmtuzumabは、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、卵巣癌および黒色腫のような癌の処置に使用できる。例えば、Hojjat-Farsangi et al. PLoS One. 8(4): e61167;およびNCT02222688参照。ある実施態様において、Cirmtuzumabは静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある実施態様において、抗ＲＯＲ１抗体はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。
ある実施態様において、ＲＯＲ１阻害剤は、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ構築物を発現するまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＲＯＲ１結合ＣＡＲによりコードされる細胞を含む。例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＲＯＲ１−ＣＡＲ(ＲＯＲ１結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団が提供される。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＲＯＲ１ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲまたはＣＤ２２ ＣＡＲ)を発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲまたはＣＤ２２ ＣＡＲ)を発現する第二細胞を含む。
ＣＤ２０阻害剤
ここに提供されるのは、ＣＤ２０阻害剤および組み合わせ治療、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＣＤ２０阻害剤の組み合わせである。ＣＤ２０阻害剤は、例えば、小分子、抗体またはそのフラグメント(例えば、単特異的または二特異的抗体またはそのフラグメント)；ＣＤ２０に結合する組み換えタンパク質、例えば、融合タンパク質；阻害性核酸；またはＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。ある実施態様において、ＣＤ２０阻害剤は抗ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲＴまたはＣＤ２０ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞である。ＣＤ２０阻害剤の例を下にさらに詳述する。
ある実施態様において、本発明は、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団を提供する。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団はＣＤ２０ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
ある実施態様において、第二ＣＤ２０阻害剤は、抗ＣＤ２０抗体またはそのフラグメントである。ある実施態様において、抗体は単特異的抗体であり、他の実施態様において、抗体は二特異的抗体である。ある実施態様において、ＣＤ２０阻害剤はキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体、例えば、リツキシマブである。ある実施態様において、ＣＤ２０阻害剤はオファツムマブのようなヒトモノクローナル抗体である。ある実施態様において、ＣＤ２０阻害剤はオクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブまたはＰＲＯ１３１９２１(Genentech)のようなヒト化抗体である。ある実施態様において、ＣＤ２０阻害剤は、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)のような抗ＣＤ２０抗体の部分を含む融合タンパク質である。
例えば、抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブまたはＰｒｏ１３１９２１(Genentech)から選択される。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfに記載のとおり、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を引き起こすキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパである。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はオファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量約１４９kDaの抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマ技術を使用して産生され、組み換えマウス細胞株(ＮＳ０)から発現および精製される。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；およびClinical Trial Identifier number NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352およびNCT01397591参照。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はオクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、Clinical Trials Identifier Nos. NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570およびKappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87に記載されるヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。ある実施態様において、オクレリズマブは静脈内点滴により投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブを含む。ベルツズマブはＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。ある実施態様において、ベルツズマブは皮下または静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(別名オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９)はヒト化および糖改変抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Clinical Trial Identifier Numbers: NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422およびNCT01414205;およびwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf参照。ある実施態様において、ＧＡ１０１は静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ(別名ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブ)は、リツキシマブに比してＦｃγＲIIIａ受容体に対する親和性が増強され、抗体依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)活性が増強されたヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブに比してＦｃγＲIIIａに対して良好に結合し、ＡＤＣＣが増強されるように改変されたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46; Clinical Trial Identifier No. NCT00452127参照。ある実施態様において、ＰＲＯ１３１９２１は静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０抗体はＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメインに由来する抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５はモノクローナル抗体より小さいが、Ｆｃ介在エフェクター機能を保持する。Ｓｅｅ、例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25。ＴＲＵ−０１５ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結した抗ＣＤ２０一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含む。ある場合、ＴＲＵ−０１５は静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ２０ここに記載する抗体は、ここに記載する治療剤、例えば、化学療法剤(例えば、ここに記載する化学療法剤、例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または抗有糸分裂剤、ＣＤ２０抗体またはここに記載するＣＤ２０抗体薬物コンジュゲート)、抗アレルギー剤、抗悪心剤(または制吐剤)、鎮痛剤または細胞保護剤に、コンジュゲートまたは他の方法で結合する。
ある実施態様において、ＣＤ２０阻害剤は、ＣＤ２０結合ドメインを含み、ＣＤ１９ ＣＡＲＴと組み合わせて投与するために細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)内に改変されたＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲＴまたは例えば、ＣＤ２０−ＣＡＲおよび養子治療のためのその使用方法を提供する。ある実施態様において、ＣＤ２０阻害剤はＣＤ２０ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ２０ ＣＡＲによりコードされる。例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、ＣＤ２０−ＣＡＲ(ＣＤ２０結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)、例えば、ここに記載するＣＤ２０ ＣＡＲＴに、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。
他の態様において、本発明は、ＣＤ２０ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞の集団を提供する。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２０ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲまたはＣＤ１９ ＣＡＲ)を発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＤ２０ ＣＡＲまたはＣＤ１９ ＣＡＲ)を発現する第二細胞を含む。
ＣＤ１９阻害剤
ここに提供されるのは、ＣＤ１９阻害剤および組み合わせ治療、例えば、１以上のＣＤ１９阻害剤である。ある実施態様において、ここに記載する方法および組成物(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞)は、さらに第二ＣＤ１９阻害剤を含む。例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を第二ＣＤ１９阻害剤と組み合わせて投与する。ＣＤ１９阻害剤は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞または抗ＣＤ１９抗体(例えば、抗ＣＤ１９単または二特異的抗体)またはそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。
抗ＣＤ１９抗体もしくはそのフラグメントまたはコンジュゲートの例は、ブリナツモマブ、ＳＡＲ３４１９(Sanofi)、ＭＥＤＩ−５５１(Medimmune LLC)、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、ＤＴ２２１９ＡＲＬ(Masonic Cancer Center)、ＭＯＲ−２０８(別名ＸｍＡｂ−５５７４; MorphoSys)、ＸｍＡｂ−５８７１(Xencor)、ＭＤＸ−１３４２(Bristol-Myers Squibb)、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ(Seattle Genetics)およびＡＦＭ１１(Affimed Therapeutics)を含むが、これらに限定されない。例えば、Hammer. MAbs. 4.5(2012): 571-77参照。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体もしくはそのフラグメントまたはコンジュゲートは、ブリナツモマブを含む。ブリナツモマブは２ｓｃＦｖｓ含む二特異的抗体である − ＣＤ１９に結合するものおよびＣＤ３に結合するもの。ブリナツモマブは、Ｔ細胞の癌細胞攻撃を指示する。例えば、Hammer et al.; Clinical Trial Identifier No. NCT00274742およびNCT01209286参照。ある実施態様において、ブリナツモマブは、ＮＨＬ(例えば、ＤＬＢＣＬ)またはＡＬＬの処置に使用できる。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体はＭＥＤＩ−５５１を含む。ＭＥＤＩ−５５１は、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)が増強されるように改変されたＦｃを有するヒト化抗ＣＤ１９抗体である。例えば、Hammer et al.;およびClinical Trial Identifier No. NCT01957579参照。ある実施態様において、ＭＥＤＩ−５５１はＢ細胞悪性腫瘍(例えば、ＮＨＬ、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬおよび多発性骨髄腫)、多発性硬化症および強皮症の処置に使用できる。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体もしくはそのフラグメントまたはコンジュゲートはＣｏｍｂｏｔｏｘを含む。ＣｏｍｂｏｔｏｘはＣＤ１９およびＣＤ２２に結合する免疫毒素の混合物である。免疫毒素は、脱グリコシル化リシンＡ鎖に融合したｓｃＦｖ抗体フラグメントからなる。例えば、Hammer et al.;およびHerrera et al. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 31.12(2009):936-41; Schindler et al. Br. J. Haematol. 154.4(2011):471-6参照。ある実施態様において、Ｃｏｍｂｏｔｏｘは、Ｂ細胞白血病、例えば、ＡＬＬの処置に使用できる。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体もしくはそのフラグメントまたはコンジュゲートはＤＴ２２１９ＡＲＬを含む。ＤＴ２２１９ＡＲＬは、２ｓｃＦｖｓおよび切断ジフテリア毒素を含むＣＤ１９およびＣＤ２２をターゲティングする二特異的免疫毒素である。例えば、Hammer et al.;およびClinical Trial Identifier No. NCT00889408参照。ある実施態様において、ＤＴ２２１９ＡＲＬは、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫の処置に使用できる。
ある実施態様において、ＤＴ２２１９ＡＲＬは静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体もしくはそのフラグメントまたはコンジュゲートはＳＧＮ−ＣＤ１９Ａを含む。ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは、合成細胞毒性殺細胞剤、モノメチルオーリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)に連結した抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。例えば、Hammer et al.;およびClinical Trial Identifier Nos. NCT01786096およびNCT01786135参照。ある実施態様において、ＳＧＮ−ＣＤ１９ＡはＢ細胞ＡＬＬ、ＮＨＬ(例えば、ＤＬＢＣＬ、マントル細胞リンパ腫または濾胞性リンパ腫)、バーキットリンパ腫または白血病またはＢ細胞系譜リンパ芽球性リンパ腫(Ｂ−ＬＢＬ)の処置に使用できる。ある実施態様において、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａは静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体はＭＯＲ−２０８(別名ＸｍＡｂ−５５７４)を含む。ＭＯＲ−２０８は、ＡＤＣＣ活性の改善をもたらす、ＦｃγＲIIIＡ結合が増強されたＦｃ改変抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体である。例えば、Clinical Trials.gov Identifier Nos. NCT01685008、NCT01685021、NCT02005289およびNCT01161511; Hammer et al.; Woyach et al. Blood 124.24(2014)参照。
ある実施態様において、ＭＯＲ−２０８をＮＨＬ(例えば、ＦＬ、ＭＣＬ、ＤＬＢＣＬ)、ＣＬＬ、小リンパ性リンパ腫、前リンパ球性白血病またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)の処置に使用できる。ある実施態様において、ＭＯＲ−２０８は静脈内、例えば、静脈内点滴として投与される。
ある態様において、抗ＣＤ１９抗体もしくはそのフラグメントまたはコンジュゲートはＳＡＲ３４１９を含む。ＳＡＲ３４１９は、開裂可能リンカーを介してマイタンシン誘導体にコンジュゲートした抗ＣＤ１９ヒト化モノクローナル抗体を含む抗ＣＤ１９抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。例えば、Younes et al. J. Clin. Oncol. 30.2(2012): 2776-82; Hammer et al.; Clinical Trial Identifier No. NCT00549185;およびBlanc et al. Clin Cancer Res. 2011;17:6448-58参照。ある実施態様において、ＳＡＲ３４１９は、ＮＨＬ(汎発性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)および濾胞性小非正円形細胞リンパ腫)またはＢ細胞ＡＬＬの処置に使用できる。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体はＸｍＡｂ−５８７１を含む。ＸｍＡｂ−５８７１は、Ｆｃ改変、ヒト化抗ＣＤ１９抗体である。ある実施態様において、ＸｍＡｂ−５８７１は、狼瘡のような自己免疫性疾患の処置に使用できる。例えば、Hammer et al.参照。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体は、ＡＤＣＣが増強したヒトＦｃ改変抗ＣＤ１９抗体であるＭＤＸ−１３４２を含む。ある実施態様において、ＭＤＸ−１３４２は、ＣＬＬおよびリウマチ性関節炎の処置に使用できる。例えば、Hammer et al.参照。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９抗体はＡＦＭ１１を含む。ＡＦＭ１１は、ＣＤ１９およびＣＤ３を標的とする二特異的抗体である。ある実施態様において、ＡＦＭ１１は、ＮＨＬ(例えば、ＤＬＢＣＬ)、ＡＬＬまたはＣＬＬの処置に使用できる。例えば、Hammer et al.;およびClinical Trial Identifier No. NCT02106091参照。ある実施態様において、ＡＦＭ１１は静脈内点滴により投与される。
ある実施態様において、抗ＣＤ１９ここに記載する抗体は、治療剤、例えば、化学療法剤(例えば、ここに記載する化学療法剤)、ペプチドワクチン(例えばIzumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のもの)、免疫抑制性薬剤(例えば、免疫抑制性ここに記載する薬剤)または免疫枯渇剤(例えば、ここに記載する免疫枯渇剤)、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、ＦＫ５０６、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８またはサイトカインにコンジュゲートまたは他の方法で結合する。
ある実施態様において、ＣＤ１９阻害剤は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含む。ある実施態様において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物はマウスｓｃＦｖ配列を含む。例えば、マウスｓｃＦｖ配列を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／０７９０００号に提供するおよびここに提供するＣＡＲ１９構築物である。
例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＤ１９−ＣＡＲ(ＣＤ１９結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ２２ ＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ２２ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＣＤ１２３阻害剤
ここに提供されるのは、ＣＤ１２３阻害剤および組み合わせ治療である。ＣＤ１２３阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＣＤ１２３抗体(例えば、抗ＣＤ１２３単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＣＤ１２３阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＣＤ１２３阻害剤を、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ＣＤ１２３阻害剤は、例えば、ＣＤ１２３受容体の天然リガンド(またはフラグメント)を含む、組み換えタンパク質である。例えば、組み換えタンパク質は、切断ジフテリア毒素に融合したヒトＩＬ−３を含む融合タンパク質である、ＳＬ−４０１(別名ＤＴ３８８ＩＬ３；University of Texas Southwestern Medical Center)である。例えば、Testa et al. Biomark Res. 2014; 2: 4;およびClinical Trial Identifier No. NCT00397579参照。
他の実施態様において、ＣＤ１２３阻害剤は抗ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントである。ある実施態様において、抗ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントはモノクローナル抗体、例えば、単特異的もしくは二特異的抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメンはＣＳＬ３６０(CSL Limited)を含む。ＣＳＬ３６０は、ＣＤ１２３に結合する組み換えキメラモノクローナル抗体である。ある実施態様において、ＣＳＬ３６０を、静脈内、例えば、静脈内点滴により投与する。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT01632852;およびTesta et al.参照。
他の実施態様において、ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントはＣＳＬ３６２(CSL Limited)を含む。ＣＳＬ３６２は、ＣＤ１２３を標的とし、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)の活性化の増強のために最適化されたヒト化モノクローナル抗体である。ある実施態様において、ＣＳＬ３６２を、静脈内、例えば、静脈内点滴により投与する。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT01632852参照。
ある実施態様において、ＣＤ１２３抗体またはそのフラグメントは二特異的抗体、例えば、ＭＧＤ００６(MacroGenics)を含む。ＭＧＤ００６はＣＤ１２３およびＣＤ３を標的とする二特異的抗体である。例えば、Clinical Trial Identifier No. NCT02152956参照。
ある実施態様において、ＣＤ１２３阻害剤はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。
ある実施態様において、ＣＤ１２３阻害剤は抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ１２３結合ＣＡＲによりコードされる。例えば、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＤ１２３−ＣＡＲ(ＣＤ１２３結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。ある実施態様において、抗ＣＤ１２３ ＣＡＲ構築物は、ｓｃＦｖ配列、例えば、引用により本明細書に包含させるＵＳ２０１４／０３２２２１２Ａ１号に提供されるｓｃＦｖ配列を含む。ある実施態様において、抗ＣＤ１２３結合ドメインはＵＳ２０１４／０３２２２１２Ａ１号に記載されるｓｃＦｖである。ある実施態様において、抗ＣＤ１２３結合ドメインは、ＵＳ２０１４／０３２２２１２Ａ１号に提供されるＣＡＲ構築物の一部である。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１２３ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＣＤ１０阻害剤
またここに提供されるのは、ＣＤ１０阻害剤および組み合わせ治療である。ＣＤ１０阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＣＤ１０抗体(例えば、抗ＣＤ１０単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＣＤ１０阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤を、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞とともに投与する。
ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤は、サクビトリル(Novartis)、バルサルタン／サクビトリル(Novartis)、オマパトリラート(Bristol-Myers Squibb)、ＲＢ−１０１、ＵＫ−４１４,４９５(Pfizer)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体のような小分子を含む。
ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤はサクビトリル(ＡＨＵ−３７７；Novartis)(４−{[(２Ｓ,４Ｒ)−１−(４−ビフェニリル)−５−エトキシ−４−メチル−５−オキソ−２−ペンタニル]アミノ}−４−オキソブタン酸)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。
他の実施態様において、ＣＤ１０阻害剤はバルサルタン／サクビトリル(ＬＣＺ６９６；Novartis)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。バルサルタン／サクビトリルは、バルサルタンとサクビトリルの１：１混合物を含む組み合わせ薬物である。バルサルタンの構造は次の化学名を有する：((Ｓ)−３−メチル−２−(Ｎ−{[２’−(２Ｈ−１,２,３,４−テトラゾール−５−イル)ビフェニル−４−イル]メチル}ペンタンアミド)ブタン酸)。
ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤はオマパトリラート(Bristol-Myers Squibb)((４Ｓ,７Ｓ,１０ａＳ)−５−オキソ−４−{[(２Ｓ)−３−フェニル−２−スルファニルプロパノイル]アミノ}−２,３,４,７,８,９,１０,１０ａ−オクタヒドロピリド[６,１−ｂ][１,３]チアゼピン−７−カルボン酸)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。
ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤はＲＢ−１０１(ベンジルＮ−(３−{[(２Ｓ)−２−アミノ−４−(メチルチオ)ブチル]ジチオ}−２−ベンジルプロパノイル)−Ｌ−フェニルアラニナート)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。
ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤はＵＫ−４１４,４９５(Pfizer)((Ｒ)−２−({１−[(５−エチル−１,３,４−チアジアゾール−２−イル)カルバモイル]シクロペンチル}メチル)吉草酸)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。
ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。
ある実施態様において、ＣＤ１０阻害剤は抗ＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ１０ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ１０結合ＣＡＲによりコードされる。例えば、抗ＣＤ１０ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＤ１０−ＣＡＲ(ＣＤ１０結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１０ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団はＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１０ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＣＤ３４阻害剤
またここに提供されるのは、ＣＤ３４阻害剤および組み合わせ治療である。ＣＤ３４阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＣＤ３４抗体(例えば、抗ＣＤ３４単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＣＤ３４阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＣＤ３４阻害剤は、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与される。
ある実施態様において、ＣＤ３４阻害剤は、ＣＤ３４を標的とするモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントまたは抗ＣＤ３４モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを含む免疫リポソームを含む。
ある実施態様において、ＣＤ３４阻害剤は、Mercadal et al. Biochim. Biophys. Acta. 1371.1(1998):17-23に記載の、抗体またはそのフラグメント、例えば、Ｍｙ−１０モノクローナル抗体またはＭｙ−１０モノクローナル抗体を含む免疫リポソームを含む。他の実施態様において、ＣＤ３４阻害剤は、Carrion et al. Life Sci. 75.3(2004):313-28にきさいのとおり、ＣＤ３４発現細胞を標的とする、癌薬物、例えば、ドキソルビシンを含む、免疫リポソームである。ある実施態様において、ＣＤ３４阻害剤は、Maleki et al. Hum. Antibodies. 22(2013):1-8に記載のＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を含む。他の実施態様において、ＣＤ３４阻害剤は、Maleki et al. Cell J. 16.3(2014):361-66に記載の、ＣＤ３４を標的とするモノクローナル抗体を含む。
ある実施態様において、ＣＤ３４阻害剤はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。
ある実施態様において、ＣＤ３４阻害剤は、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ３４結合ＣＡＲによりコードされる。例えば、抗ＣＤ３４ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＤ３４−ＣＡＲ(ＣＤ３４結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ３４ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ３４ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＦＬＴ−３阻害剤
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ−３)は、表面抗原分類１３５(ＣＤ１３５)、受容体型チロシン−タンパク質キナーゼＦＬＴ３または胎児肝臓キナーゼ−２(Ｆｌｋ２)とも称され、受容体チロシンキナーゼである。ＦＬＴ−３は、リガンドである、サイトカインＦｌｔ３リガンド(ＦＬＴ３Ｌ)のためのサイトカイン受容体である。ＦＬＴ−３は、多くの造血前駆細胞表面に発現され、リンパ球発達に重要である。ＦＬＴ３遺伝子は、白血病、例えば、急性骨髄白血病(ＡＭＬ)で一般に変異している。
またここで提供されるのは、ＦＬＴ−３阻害剤および組み合わせ治療である。ＦＬＴ−３阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＦＬＴ−３ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＦＬＴ−３抗体(例えば、抗ＦＬＴ−３単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＦＬＴ−３阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤を、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤は、キザルチニブ(Ambit Biosciences)、ミドスタウリン(Technische Universitat Dresden)、ソラフェニブ(BayerオよびOnyx Pharmaceuticals)、スニチニブ(Pfizer)、レスタウルチニブ(Cephalon)のような小分子またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。
ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤は、キザルチニブ(ＡＣ２２０；Ambit Biosciences)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。キザルチニブは小分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。キザルチニブは次の化学名を有する：(１−(５−(ｔｅｒｔ−ブチル)イソキサゾール−３−イル)−３−(４−(７−(２−モルホリノエトキシ)ベンゾ[ｄ]イミダゾ[２,１−ｂ]チアゾール−２−イル)フェニル)尿素)。
ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤はミドスタウリン(ＰＫＣ４１２；Technische Universitaet Dresden)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。ミドスタウリンは、細菌Streptomyces staurosporeusからのアルカロイドであるスタウロスポリンの半合成誘導体であるタンパク質キナーゼ阻害剤である。ミドスタウリンの化学名は次のとおりである：((９Ｓ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｒ)−２,３,１０,１１,１２,１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１１−(メチルアミノ)−９,１３−エポキシ−１Ｈ,９Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｇｈ：３’,２’,１’−ｌｍ]ピロロ[３,４−ｊ][１,７]ベンゾジアムゾニン−１−オン)。
ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤はソラフェニブ(BayerオよびOnyx Pharmaceuticals)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。例えば、labeling.bayerhealthcare.com/html/products/pi/Nexavar_PI.pdf参照。ソラフェニブの化学名は(４−[４−[[４−クロロ−３−(トリフルオロメチル)フェニル]カルバモイルアミノ]フェノキシ]−Ｎ−メチル−ピリジン−２−カルボキサミド)である。
ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤は、スニチニブ(以前はＳＵ１１２４８として既知；Pfizer)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。スニチニブは次の化学名を有する：(Ｎ−(２−ジエチルアミノエチル)−５−[(Ｚ)−(５−フルオロ−２−オキソ−１Ｈ−インドール−３−イリデン)メチル]−２,４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド)。
ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤はレスタウルチニブ(ＣＥＰ−７０１；Cephalon)またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む。レスタウルチニブは次の化学名を有する：((９Ｓ,１０Ｓ,１２Ｒ)−２,３,９,１０,１１,１２−ヘキサヒドロ−１０−ヒドロキシ−１０−(ヒドロキシメチル)−９−メチル−９,１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ[１,２,３−ｆｇ：３’,２’,１’−ｋｌ]ピロロ[３,４−ｉ][１,６]ベンゾジアゾシン−１−オン)。
ある実施態様において、ＦＬＴ−３阻害剤は抗ＦＬＴ−３ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＦＬＴ−３ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＦＬＴ−３結合ＣＡＲによりコードされる。例えば、抗ＦＬＴ−３ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＦＬＴ−３−ＣＡＲ(ＦＬＴ−３結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＦＬＴ−３ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団はＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＦＬＴ−３ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＣＤ７９ｂ阻害剤
ここに提供されるのは、ＣＤ７９ｂ阻害剤および組み合わせ治療である。ＣＤ７９ｂ阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＣＤ７９ｂ抗体(例えば、抗ＣＤ７９ｂ単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＣＤ７９ｂ阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＣＤ７９ｂ阻害剤を、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ７９ｂ抗体またはそのフラグメントである。ある実施態様において、抗７９ｂ抗体またはそのフラグメントはモノクローナル抗体、例えば、単特異的もしくは二特異的抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗ＣＤ７９ｂ抗体またはそのフラグメントは、抗ＣＤ７９ｂ抗体薬物コンジュゲートである、ポラツズマブベドチン(Roche)を含む。ある実施態様において、ポラツズマブベドチンは、癌、例えば、ＮＨＬ、例えば、濾胞性リンパ腫またはＤＬＢＣＬ、例えば、再発または難治性濾胞性リンパ腫またはＤＬＢＣＬの処置に使用される。例えば、NCT02257567参照。ある実施態様において、抗ＣＤ７９ｂ抗体またはそのフラグメントは、ＣＤ３２ＢおよびＤ７９Ｂに結合する要素を含む二特異的抗体であるＭＧＤ０１０(MacroGenics)である。例えば、NCT02376036参照。
ある実施態様において、ＣＤ７９ｂ阻害剤はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。
ある実施態様において、ＣＤ７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ７９ｂ結合ＣＡＲによりコードされる。例えば、抗ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＤ７９ｂ−ＣＡＲ(ＣＤ７９ｂ結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ７９ｂ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＣＤ７９ａ阻害剤
ここに提供されるのは、ＣＤ７９ａ阻害剤および組み合わせ治療である。ＣＤ７９ａ阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＣＤ７９ａ抗体(例えば、抗ＣＤ７９ａ単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＣＤ７９ａ阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＣＤ７９ａ阻害剤を、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ＣＤ７９ａ阻害剤は、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントである。ある実施態様において、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントはモノクローナル抗体、例えば、単特異的もしくは二特異的抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントは、引用により本明細書に包含させる、Polson et al. Blood 110.2(2007):616-23に記載の抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントを含む。例えば、抗ＣＤ７９ａ抗体またはそのフラグメントは、Polson et al.に記載の７Ｈ７、１５Ｅ４または１６Ｃ１１抗体またはそのフラグメントを含む。上記参照。
ある実施態様において、ＣＤ７９ａ阻害剤はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。
ある実施態様において、ＣＤ７９ａ阻害剤は、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ７９結合ＣＡＲによりコードされる。例えば、抗ＣＤ７９ａ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＤ７９ａ−ＣＡＲ(ＣＤ７９ａ結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ７９ａ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ７９ａ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＣＤ１７９ｂ阻害剤
ここに提供されるのは、ＣＤ１７９ｂ阻害剤および組み合わせ治療である。ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＣＤ１７９ｂ抗体(例えば、抗ＣＤ１７９ｂ単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、抗ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤を、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ１７９ｂ抗体またはそのフラグメントである。ある実施態様において、抗１７９ｂ抗体またはそのフラグメントはモノクローナル抗体、例えば、単特異的もしくは二特異的抗体またはそのフラグメントを含む。
ある実施態様において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。
ある実施態様において、ＣＤ１７９ｂ阻害剤は、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ、例えば、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ構築物を発現する細胞を含むかまたはｓｃＦｖ、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬ鎖を含むＣＤ１７９ｂ結合ＣＡＲによりコードされる。例えば、抗ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＤ１７９ｂ−ＣＡＲ(ＣＤ１７９ｂ結合ドメインを含む)を、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞と組み合わせた投与のために操作することにより産生する。またここに提供されるのは、養子治療のためのここに記載するＣＡＲ発現細胞の使用方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ１７９ｂ ＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の集団である。例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１７９ｂ ＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。
ＣＤ２２阻害剤
ここに提供されるのは、ＣＤ２２阻害剤および組み合わせ治療である。ＣＤ２２阻害剤は、小分子、組み換えタンパク質、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴおよび抗ＣＤ２２抗体(例えば、抗ＣＤ２２単または二特異的抗体)およびそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗ＣＤ２２阻害剤は、ここに記載するＢ細胞悪性腫瘍の処置に使用できる。ある実施態様において、ＣＤ２２阻害剤を、ＣＤ１９阻害剤、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、マウス、ヒトまたはヒト化である抗体結合ドメインを含むＣＡＲを発現する細胞と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ＣＤ２２阻害剤は、ここに記載するＣＤ２２阻害剤である。ＣＤ２２阻害剤は、例えば、抗ＣＤ２２抗体(例えば、抗ＣＤ２２単または二特異的抗体)またはＣＤ２２ ＣＡＲＴであり得る。ある実施態様において、抗ＣＤ２２抗体はコンジュゲートであるかまたは他の方法で治療剤と結合している。治療剤の例は、例えば、微小管破壊剤(例えば、モノメチルオーリスタチンＥ)および毒素(例えば、ジフテリア毒素またはシュードモナス外毒素−Ａ、リシン)を含む。
ある実施態様において、抗ＣＤ２２抗体は、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−ＭＭＡＥコンジュゲート(例えば、ＤＣＤＴ２９８０Ｓ)である。ある実施態様において、抗体は、抗ＣＤ２２抗体のｓｃＦｖ、例えば、抗体ＲＦＢ４のｓｃＦｖである。このｓｃＦｖは、シュードモナス外毒素−Ａ全体またはフラグメントに融合され得る(例えば、ＢＬ２２)。ある実施態様において、抗体はヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体(例えば、エピラツズマブ)である。ある実施態様において、抗体またはそのフラグメントは、抗ＣＤ２２抗体のＦｖ部分を含み、これは、所望によりシュードモナス外毒素−Ａ全体またはフラグメント(例えば、３８KDaフラグメント)に共有結合性に融合する(例えば、モキセツモマブシュードトクス)。ある実施態様において、抗ＣＤ２２抗体は、所望により毒素にコンジュゲートした、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二特異的抗体である。例えば、ある実施態様において、抗ＣＤ２２抗体は、所望によりジフテリア毒素(ＤＴ)の全てまたは一部、例えば、ジフテリア毒素(ＤＴ)の最初の３８９アミノ酸、ＤＴ ３９０、例えば、ＤＴ２２１９ＡＲＬのようなリガンド配向毒素に連結した、抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二特異的部分(例えば、ヒトＣＤ１９およびＣＤ２２を認識する２ｓｃＦｖリガンド)を含む。他の実施態様において、二特異的部分(例えば、抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２)は、脱グリコシル化リシンＡ鎖のような毒素に連結される(例えば、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ)。
ある実施態様において、抗ＣＤ２２抗体は、
選択 ｆｒｏｍ 抗ＣＤ１９／ＣＤ２２二特異的リガンド配向毒素(例えば、ジフテリア毒素(ＤＴ)の最初の３８９アミノ酸、ＤＴ ３９０に連結した、ヒトＣＤ１９およびＣＤ２２を認識する２ｓｃＦｖリガンド、例えば、ＤＴ２２１９ＡＲＬ)；抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−ＭＭＡＥコンジュゲート(例えば、ＤＣＤＴ２９８０Ｓ)；シュードモナス外毒素−Ａのフラグメントに融合した抗ＣＤ２２抗体ＲＦＢ４のｓｃＦｖ(例えば、ＢＬ２２)；脱グリコシル化リシンＡ鎖コンジュゲート抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２(例えば、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ)；ヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体(例えば、エピラツズマブ)；またはシュードモナス外毒素−Ａの３８KDaフラグメントに共有結合性に融合した抗ＣＤ２２抗体のＦｖ部分(例えば、モキセツモマブシュードトクス)から選択される。
ある実施態様において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲまたはＦＬＴ−３ ＣＡＲ)を包含し、ここで、核酸分子は、例えば、ここに記載する、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と隣接し、かつ同じ読み枠内にある、抗原結合ドメインをコードする核酸配列である。ＣＡＲにおいて使用できる細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある場合には、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
ある実施態様において、抗原結合ドメイン(例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４またはＦＬＴ−３抗原結合ドメイン)は、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特性または性質により特徴付けられる。例えば、ある実施態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインを含む部分は、ヒトＢ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１０、ＣＤ３４またはＦＬＴ−３)またはそのフラグメントに特異的に結合する。ある実施態様において、ｓｃＦｖは、リーダー配列に隣接し、同じ読み枠内にある。ある態様において、リーダー配列は、配列番号１により提供されるポリペプチド配列である。
ある実施態様において、抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二機能的(例えば二特異的)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。ある態様において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、Ｂ細胞タンパク質またはそのフラグメントと、野生型のまたは増強された親和性で結合する。ある場合には、ヒトｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。
ある実施態様において、抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｃＦｖがＣＡＲ構築物の安定性を改善するように、少なくとも１変異を含む。他の実施態様において、抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｃＦｖがＣＡＲ構築物の安定性を改善するように、例えば、ヒト化工程に起因する、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０変異含む。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲまたはＦＬＴ−３ ＣＡＲ)を発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲまたはＦＬＴ−３ ＣＡＲ)を発現する第二細胞を含む。
キナーゼ阻害剤
ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＤＫ４阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＩＴＫ阻害剤などと組み合わせて処置レジメンで使用し得る。ある実施態様において、対象は完全レスポンダーであり、対象は、例えば、ここに記載する用量または投与スケジュールで、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤の組み合わせの投与を含む処置レジメンで投与される。ある実施態様において、対象は、部分的レスポンダーまたは非レスポンダーであり、対象は、例えば、ここに記載する用量または投与スケジュールで、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤の組み合わせの投与を含む処置レジメンで投与される。
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン塩酸塩(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも称される)のような、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤である。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ、フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン、クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)、１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)、インジスラム(Ｅ７０７０)、ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)、ディナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)、Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ３８７０３２)、４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)、５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)、４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)、４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)、およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択される、ＣＤＫ４阻害剤である。
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で、一定期間連日、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日連日または２１日サイクルの７〜１２日連日投与する。ある実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上サイクルのパルボシクリブが投与される。
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)であり、イブルチニブは、約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量で一定期間連日、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与される。ある実施態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上サイクルのイブルチニブが投与される。
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス、リダホロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート(ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られる)、エベロリムス(ＲＡＤ００１)、ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)、セマピモド、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)、２−ミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩(ＳＦ１１２６)(配列番号１４０)およびＸＬ７６５から選択される、ｍＴＯＲ阻害剤である。
ある実施態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８、４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)、セルコスポラミド、ＥＴＣ−１７８０４４５−２および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
ある実施態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％または３０％を超えない、少なくとも１０％であるが、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％または３０％を超えない、少なくとも１５％であるが、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％または３０％を超えない、少なくとも２０％であるが、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％または３０％を超えない、少なくとも３０％であるが、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％または４０％を超えない、少なくとも４０％であるが、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％または３０％を超えない、少なくとも５０％であるが、９０％、８０％、７０％または６０％を超えない、少なくとも６０％であるが、９０％、８０％または７０％または少なくとも７０％であるが、９０％または８０％を超えない、ｍＴＯＲ阻害と関連しまたはｍＴＯＲ阻害を提供する。
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１０％であるが、３０％を超えない、少なくとも１５％であるが、３０％を超えない、少なくとも２０％であるが、３０％または少なくとも２５％であるが、３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連しまたはｍＴＯＲ阻害を提供する。
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、２０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３５、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４０％または少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４５％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連しまたはｍＴＯＲ阻害を提供する。
ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関連しまたはｍＴＯＲ阻害を提供する。
ここに記載する、ｍＴＯＲ阻害の程度はＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性における減少、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化における減少のレベルにより決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、ここに記載する方法で、例えばＢｏｕｌａｙアッセイまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定により決定できる。
ｍＴＯＲ阻害剤例
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する、化合物またはそのリガンドもしくは薬学的に許容される塩をいう。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある実施態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は触媒阻害剤である。
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ(ラパログとも称される)およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンとの構造的および機能的類似性を有する化合物である、ラパマイシン関連化合物である、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)を含む。
ラパマイシンは、式Ａで示す構造を有する、Streptomyces hygroscopicusにより産生される既知マクロライド抗生物質である。
他の適当なラパマイシンアナログは、エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られ、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタノンを有するＲＡＤ００１、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９)およびリダホロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９とも称される)を含むが、これらに限定されない。アロステリックｍＴｏｒ阻害剤の他の例は、内容を引用により本明細書に包含させる、ＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。他の適当なｍＴＯＲ阻害剤は、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際公開ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ９４６〜９６４に記載される。低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、低用量のｍＴＯＲ阻害剤と関連する適当なｍＴＯＲ阻害のレベル、ｍＴＯＲ阻害のレベルを検出する方法およびその適当な医薬組成物は、全体を引用により本明細書に包含させる、２０１５年３月１３日出願の国際公開ＷＯ２０１５／１４２６７５号のパラグラフ９３６〜９４５および９６５〜１００３にさらに詳述される。
本発明を、さらに次の実験的実施例を参照して詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみの目的で提供し、特に断らない限り限定を意図するものではない。それゆえに、本発明は、如何なる態様においても次の実施例に限定されると解釈されてはならず、むしろ、ここに提供する教示の結果として明らかとなる任意かつ全てのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
実施例１：外来サイトカインでのＣＡＲＴ産生の最適化
サイトカインは、Ｔ細胞増大、分化、生存およびホメオスタシスに関する重要な機能を有する。臨床使用のための最も重要なサイトカインファミリーの一つは、共通γ鎖(γｃ)ファミリーサイトカインであり、これは、インターロイキン(ＩＬ)−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む(Liao et al., 2013, Immunity, 38:13-25)。ＩＬ−２は、癌の免疫治療剤として広く研究されている。ＩＬ−２の補充は、臨床試験における抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能を増強する(Xu et al., 2013, Lymphoma, 54:255-60)。しかしながら、ＩＬ−２の投与は、副作用および調節性Ｔ細胞を増大する傾向および誘発細胞死(ＡＩＣＤ)の活性化効果により制限される(Malek et al., 2010, Immunity, 33:153-65;およびLenardo et al., 1999, Annu Rev Immunol, 17:221-53)。ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１は、各々、養子免疫治療の有効性を増強でき、ＩＬ−２と比較して、毒性が低いようである(Alves et al., 2007, Immunol Lett, 108:113-20)。上記サイトカインの役割に関する広範な前臨床および臨床研究にもかかわらず、ＣＡＲ−Ｔ細胞養子治療に対する種々の外来γｃサイトカインの役割の多数値比較研究はない。
γ鎖サイトカインに加えて、ＩＬ−１８は、免疫応答を制御する他の免疫刺激性サイトカインであり、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生を増強し、ＣＴＬの細胞溶解活性を増強する(Srivastava et al., 2010, Curr Med Chem, 17:3353-7)。ＩＬ−１８の投与は、用量が１０００μg／kg程度に高くても、安全であり、良好に耐容性である(Robertson et al., 2006, Clin Cancer Res, 12:4265-73)。それゆえに、ＩＬ−１８は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍の押し上げに使用する他の候補であり得る。
本実施例において、種々の外来サイトカインの投与の効果を、Ｔ細胞および葉酸受容体アルファ(ＦＲα)ＣＡＲＴ細胞の増大、表現型、インビトロエフェクター機能およびインビボ抗腫瘍有効性について試験した。
次の物質および方法を、本実施例に記載する実験で使用した。
ＣＡＲ構築およびレンチウイルス調製
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲベクターを、先に記載のように構築した(原稿審査中)。要約すれば、tggtggagtctgggggaggc-3’(配列番号３)および5’-atagctagcacctaggacggtcagcttggtccc-3’(配列番号５)(ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩを下線で示す)をプライマーとするＣ４フラグメントのＰＣＲ増幅用鋳型として、抗ＦＲαＣ４／scＦｖを含むｐＨＥＮ２プラスミドを使用した。ＰＣＲ生産物および第三世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクターｐＥＬＮＳをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化ＰＣＲ生産物を、次いで導入遺伝子発現が伸長因子１α(ＥＦ−１α)プロモーターにより駆動される、ＣＤ２７−ＣＤ３ｚ Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン含有ｐＥＬＮＳベクターに挿入した。
高力価複製欠損レンチウイルスを、先に記載のようなExpress In(Open Biosystems)の使用により、４プラスミド(ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＲＳＶ.ＲＥＶ、ｐＭＤＬｇ／ｐ.ＲＲＥおよびｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ)を伴うヒト胚性腎臓細胞株２９３Ｔ(２９３Ｔ)細胞の遺伝子導入により産生した。上清を遺伝子導入２４時間および４８時間後に採取し、超遠心分離により濃縮した。ウイルス力価を、限外希釈方法の使用により、レンチウイルスのＳｕｐＴ１細胞への形質導入効率に基づき決定した。
Ｔ細胞および細胞株
末梢血リンパ球を、インフォームドコンセント後University Institutional Review Board at the University of Pennsylvaniaにより承認されたプロトコール下、健常ドナーから得た。一次Ｔ細胞を、陰性選択後、Human Immunology Coreから購入した。Ｔ細胞を完全培地(１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／mL ペニシリン、１００μg／mL硫酸ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ １６４０)培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂｓ被覆ビーズ(Invitrogen)で、指示に従い１：１比で刺激した。活性化２４時間後、細胞を、レンチウイルスで５のＭＯＩで形質導入した。記載するサイトカインを、１０ng／mLの最終濃度で翌日から形質導入Ｔ細胞に添加した。サイトカインを３日毎に取り替えた。
レンチウイルスパッケージングに使用した２９３Ｔ細胞およびレンチウイルス力価測定に使用したＳｕｐＴ１細胞をＡＴＣＣから得た。確立された卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３(ＦＲα＋)およびＣ３０(ＦＲα−)を、サイトカイン分泌および細胞毒性アッセイのための標的細胞として使用した。生物発光アッセイのために、ＳＫＯＶ３を、ホタルルシフェラーゼ(ｆＬｕｃ)を発現するようにレンチウイルスで形質導入した。
フローサイトメトリー分析および細胞選別
フローサイトメトリーを、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏで実施した。抗ヒトＣＤ４５(ＨＩ３０)、ＣＤ３(ＨＩＴ３ａ)、ＣＤ８(ＨＩＴ８ａ)、ＣＤ４５ＲＡ(ＨＩ１００)、ＣＤ６２Ｌ(ＤＲＥＧ−５６)、ＣＣＲ７(Ｇ０４３Ｈ７)、ＩＬ−７Ｒα(Ａ０１９Ｄ５)、ＣＤ２７(Ｍ−Ｔ２７１)、ＣＤ２８(ＣＤ２８.２)、ＣＤ９５(ＤＸ２)、ＴＮＦ−α(ＭＡｂ１１)、ＩＦＮ−γ(４Ｓ.Ｂ３)、ＩＬ−２(ＭＱ１−１７Ｈ１２)、パーフォリン(Ｂ−Ｄ４８)、グランザイム−Ｂ(ＧＢ１１)をBiolegendから得た。ビオチン−ＳＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)をJackson Immunoresearchから購入し、ＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンをBiolegandから購入した。抗ヒトＢｃｌ−ｘｌ(７Ｂ２.５)をSouhernBiotechから購入した。アポトーシスキットおよびTruCountチューブをBD Bioscienceから購入した。末梢血Ｔ細胞計数のために、血液を後眼窩採血により得て、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の存在について染色した。ヒトＣＤ４５＋ゲート化、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットを、製造業者の指示に従いTruCountチューブで定量した。
養子細胞治療のインビボ研究
雌非肥満糖尿病性／重症複合型免疫不全／γ鎖−／−(ＮＳＧ)マウス８〜１２週齢を、Stem Cell and Xenograft Core of the Abramson Cancer Center, University of Pennsylvaniaから得た。マウスに、３×１０６ ｆＬｕｃ＋ＳＫＯＶ３細胞を脇腹に０日目に皮下接種した。群あたり４匹または５匹のマウスを無作為化し、処置した。腫瘍が触診可能となったとき、ヒト一次Ｔ細胞を、先に記載のように活性化および形質導入した。Ｔ細胞を、約２週間、ＩＬ−２(５ng／mL)の存在下増大させた。腫瘍負荷が約２５０〜３００mm３となったとき、マウスに５×１０６ ＣＡＲ−Ｔ細胞または１００μl食塩水を静脈内注射し、次いで連日７日間ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１またはリン酸緩衝液(ＰＢＳ)５μgの腹腔内注射を受けた。腫瘍寸法をカリパスで測定し、腫瘍容積を次の式により計算した：腫瘍容積＝(長さ×幅２)／２。レシピエントマウス血液における導入Ｔ細胞の数および表現型を、後眼窩採血後フローサイトメトリーで決定した。腫瘍容積が２０００mm３を超えたときマウスを屠殺し、腫瘍をさらなる分析のためにすぐに摘出した。
統計的分析
統計的分析をPrism 5(GraphPad software)およびIBM SPSS Statistics 20.0 softwareで実施した。データを、明記しない限り平均±ＳＥＭで示した。対応サンプルｔ検定またはノンパラメトリックウィルコクソン順位検定を２群の比較に使用し、反復測定ＡＮＯＶＡまたはフリードマン検定を、３以上の群の統計的有意差の検定に試験した。Ｐ値が０.０５未満であるとき、測定値を統計的有意とした。
結果
１. 抗ＦＲαＣ４ ＣＡＲの構築および発現
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域に連結した抗ＦＲαＣ４、続くＣＤ３ζシグナル伝達部分をＣＤ２７細胞内シグナル伝達モチーフとタンデムで含んだ(図１Ａ)。一次ヒトＴ細胞は、形質導入４８時間後検出したとき、４３％〜６５％の形質導入効率で、Ｃ４ ＣＡＲレンチウイルスベクターで効率的に形質導入された。ＣＡＲ発現レベルはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で同等であった(５２.６±１０.２％対４９.５±１７.１％、Ｐ＝０.７１３)。
２. ＣＡＲ 形質導入Ｔ(ＣＡＲ−Ｔ)細胞の増大に対するサイトカインの効果
種々のγｃサイトカインおよびＩＬ−１８存在下のＣＡＲ−Ｔ細胞の発現および蓄積を試験した。培養で種々のサイトカイン曝露３週後、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−５存在下で培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、１０００〜２０００倍増大した。ＩＬ−１８、ＩＬ−２１存在下またはＮＣ(対照、無サイトカイン)で培養したＣＡＲ−Ｔ細胞は、２００倍未満の増大を示した(図１Ｂ)。
ＣＡＲ−Ｔ細胞の高い蓄積に寄与する理由を分析し、特に、Ｔ細胞の増殖およびアポトーシスを評価した。増殖性応答を、７日培養したＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の細胞分裂のモニタリングにより測定した。図１Ｃに示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１５と培養したＴ細胞が最高増殖性能を示し、続いてＩＬ−７であった；一方ＩＬ−２１およびＩＬ−１８は、あまり強力ではない分裂促進的刺激剤であった。種々のサイトカイン中で培養したＴ細胞のアポトーシスを、Annexin-V染色を使用して試験した。結果は、ＮＣ、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１群と比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５中で培養したＴ細胞の受けたアポトーシスが少ないことを示した(図１Ｄ)。これらの結果は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５存在下増大されたＴ細胞の蓄積増加は、Ｂｃｌ−ｘｌ抗アポトーシス経路の、例えば、活性化による増殖増加およびアポトーシス減少の両者により引き起こされ得る。
３. ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に対するサイトカインの影響
次に、外来サイトカイン存在下増大させたＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型を試験した。健常ドナーからの新鮮Ｔ細胞を、一般にＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づき４サブセットに分けた：１)ナイーブＴ細胞(ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、Ｔｎと称する)、２)中枢記憶Ｔ細胞(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋、Ｔｃｍと称する)、３)エフェクター記憶Ｔ細胞(ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−、Ｔｅｍと称する)および４)ＣＤ４５Ｒ陽性エフェクターＴ細胞(ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−、Ｔｅｍｒａと称する)。次いでＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＤ９５の発現を、さらに各サブセットで評価した。ＣＤ９５発現は、レンチウイルス形質導入により顕著に上昇した。後３者のＴ細胞サブセットはＣＤ９５に陽性であったが、Ｔｎはわずかな部分しかＣＤ９５を発現しなかった(ＣＤ４＋において３.６±１.４％およびＣＤ８＋Ｔ細胞において３.７±１.３％)。この小集団はまたＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＣＲ７を共発現し、記憶幹Ｔ細胞(Ｔｓｃｍ)と考えられた。しかしながら、ＣＡＲを有するレンチウイルス形質導入前後の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの刺激後、ＣＤ９５はこの集団で１００％近くまで大きく上方制御された(図２Ａ)。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋Ｔ細胞のパーセンテージは、新鮮Ｔ細胞と比較したとき、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴおよびＣＡＲ−Ｔ細胞の両者で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激後大きく増加した(図２Ｂおよび２Ｃ)。この集団は、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＣＲ７を同時に高度に発現し、Ｔｓｃｍとして定義され得ることを示した。さらに、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞は、最初のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴｎの高い比率と関係し得るであろう、Ｔｓｃｍ細胞の高いパーセンテージを有した(図２Ｄ)。
種々のサイトカインと共培養１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴ細胞サブセットの割合を、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ９５の発現の測定により試験した。ＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞で、ＩＬ−２群と比較して有意に高いパーセンテージのＴｓｃｍ細胞がＩＬ−７群に存在し、一方無サイトカイン(ＮＣ)およびＩＬ−１８群はＴｓｃｍで低いパーセンテージをシメたが、Ｔｃｍで高いパーセンテージであった。ＩＬ−１５群におけるＴ細胞サブセットの分布はＩＬ−２群と類似したが、ＩＬ−２１群は、Ｔｃｍの高いパーセンテージを提供し、一方ＴｓｃｍはＩＬ−２群と同等であった。ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞は、各サイトカイン投与群について４Ｔ細胞サブセットの分化および分布に対してＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞と同等な傾向を示し、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の対応する群におけるＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、Ｔｓｃｍが高い比率であった。
種々のＣＡＲ−Ｔ細胞亜集団が自己複製し、他の細胞型に分化する能力を、さらに試験した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の４サブセットをＣＡＲ、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づきソートし、ＩＬ−２含有培地で３日間別々に培養した。図２Ｅに示すように、Ｔｓｃｍサブセットは他の全３サブセットに分化でき、ＴｃｍおよびＴｅｍｒａサブセットはＴｅｍに分化できた。これらの結果は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞が、それぞれＣＤ６２Ｌ−およびＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞に分化できることを示す。４サブセットの増殖能をＣＦＳＥ希釈により評価し、次いで比較した。結果は、Ｔｓｃｍが、他のサブセットより強い増殖能を提供することを示した(図２Ｆ)。さらに、ＣＤ４５ＲＡ発現はＣＦＳＥ強度と逆相関するが、一方ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７発現は増殖と直接相関した。全サイトカイン群において、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ ｄｉｍおよび陰性Ｔ細胞よりはるかに低いＣＦＳＥレベルを示し(図３Ａー３Ｂ)、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞より強い増殖活性を有することを示した。それゆえに、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５存在下増殖させたＴ細胞の蓄積増加は、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞(増加した増殖能を有する)の割合の増加と関係し得る(図４)。
ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に関して、Ｔ細胞表面上に、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８の低い発現を示すが、ＣＣＲ７の発現は高かった。ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に対するサイトカインの影響を、さらに次の表面マーカーの発現に基づき評価した：ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７およびＩＬ−７Ｒα。ＩＬ−１８存在下増殖させたＣＡＲ−Ｔ細胞は、サイトカイン添加なしで増殖する、極めて類似した発現パターンを示した。ＩＬ−２は、ＮＣ対照と比較したとき、ＣＤ２７、ＣＤ２８ ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７およびＩＬＲ７αの発現を劇的に下方制御した。他のγｃサイトカインで、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−７曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞が高いＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示したが、ＣＣＲ７発現は顕著に減少した；ＩＬ−１５群ＣＡＲ−Ｔ細胞は高いＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示した；そしてＩＬ−２１曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は高いＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示し、Ｔ細胞のサブセットのＩＬ−２曝露が、全ての他の群よりはるかに成熟Ｔ細胞表現型を伴う発現を誘発したことを示した(図４)。
４. ＣＡＲ−Ｔ細胞のエフェクター機能に対するサイトカインの影響
ＣＡＲ−Ｔ細胞エフェクター機能に対するサイトカインの影響を試験するために、ＦＲα発現ＳＫＯＶ３細胞で刺激後のＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン産生能を評価した。５時間刺激後、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２はＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞質で検出可能であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞の４１.５〜５４.０％がＴＮＦ−αを産生し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の１２.４〜１５.３％がＩＦＮ−γを産生し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の４.３〜６.５％がＩＬ−２を産生した(図５Ａ−５Ｃ)。増大中のＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＴＮＦ−α産生を促進したが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生ＣＡＲ−Ｔ細胞数は、全サイトカイン群で同等であった(図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ)。次に、応答性ＣＡＲ−Ｔ細胞の画分およびその多機能性を比較した。増大中のＩＬ−２への曝露と比較して、増大中のＩＬ−１８、ＩＬ−２１への暴露または無サイトカイン曝露は、標的細胞で刺激したとき、誘発されたサイトカイン産生ＣＡＲ−Ｔ細胞が少なく、多サイトカインを産生する能力を有するＣＡＲ−Ｔ細胞が少なかった。これらの結果は、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびＮＣ群におけるＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＩＬ−２暴露群より低分化型である表現型と一致する。
次いで、抗原刺激後の細胞溶解分子パーフォリンおよびグランザイムＢの発現に対する増大中のサイトカイン曝露の効果を決定した。ＴＮＦ−α産生に類似して、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＣ、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１に曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、パーフォリン発現の増加を示した。しかしながら、ＩＬ−２１に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞はＴＮＦ−αおよびパーフォリンの産生が少なく、最高レベルのグランザイムＢを産生した。次に最高レベルのグランザイムＢ産生が増大中ＣＡＲ−ＩＬ−２およびＩＬ−１５に曝したＴ細胞で観察された。ＩＬ−１８群のＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原刺激後のパーフォリンおよびグランザイムＢ発現の両者で最低量を示した。
最後に、増大中の種々のサイトカインへのＣＡＲ−Ｔ細胞曝露による腫瘍溶解活性をルシフェラーゼアッセイにより数値化した。図５Ｄに示すとおり、ＩＬ−２およびＩＬ−１５と共培養したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＮＣおよびＩＬ−１８よりも効率的にＳＫＯＶ３を溶解した(両者ともＰ＜０.０５)。
ＣＡＲ−Ｔ細胞とその機能の関係をさらに確認した。Ｔ細胞１４日を、レンチウイルス形質導入後ＣＡＲおよびＣＤ６２Ｌ発現に基づきソートした。ＣＤ６２Ｌ＋ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｓｃｍおよびＴｃｍ)は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＡＲ−Ｔ細胞(ＴｅｍおよびＴｅｍｒａ)と比較して、低サイトカイン産生活性および弱細胞溶解能を示した(図６Ａ−６Ｃ)。この観点において、ＩＬ−２およびＩＬ−１５に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞は、多くのサイトカインを産生し、強い腫瘍溶解活性を示し、これは、一部、これらの群におけるＴｅｍおよびＴｅｍｒａの高い比率に起因するものである。
５. 抗原負荷後のＣＡＲ−Ｔ細胞の増大および表現型
特異的抗原負荷下のＣＡＲ−Ｔ細胞増大に対するサイトカインの影響を調べるために、２週間ＩＬ−２に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞をＳＫＯＶ３(ＦＲα＋)またはＣ３０(ＦＲα−)細胞と、記載するサイトカイン存在下、７日共培養した。無抗原状況に類似して、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞提示は、他のサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞より高倍率の増大を示した。増大中にＩＬ−２１に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞は、アポトーシスをより受けやすい可能性がある。しかしながら、２週間記載するサイトカインに曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞を、さらにサイトカイン補充することなく７日ＳＫＯＶ３またはＣ３０細胞と共培養したとき、ＣＡＲ−Ｔ細胞の蓄積は全群で同等であり、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８に曝露したものが、最小量のアポトーシスを受けた(図７Ａ)。ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型も分析した。記憶Ｔ細胞の４サブセットに関して、結果は無抗原試験と異なった：Ｔｓｃｍは稀であり、Ｔｅｍは無サイトカイン、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１全群で５０％を超えた。サイトカインは記憶Ｔサブセットの組成に顕著な影響を有さず、ＩＬ−７曝露はＴｓｃｍの増加を支えなかった(図７Ｂ)。
６. 動物モデルにおける種々のサイトカインの抗腫瘍有効性
インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性に対するＣＡＲ−Ｔ細胞のエクスビボ増大中の種々のサイトカインの効果を評価するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞の残留性および成果を、卵巣癌のＮＳＧマウス異種移植モデルを使用して試験した。皮下ＳＫＯＶ３腫瘍担持マウスに、エクスビボで予め記載するサイトカインに２週されている２用量の５×１０６ Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞を静脈内注射した。Ｃ４−２７ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞注入を受けた全マウスは、非形質導入Ｔ細胞および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射されたものと比較して、腫瘍負荷が低かった(図８Ａ)。種々のサイトカイン群で、先のＩＬ−２曝露と共にＣＡＲ−Ｔ細胞を注射されたマウスが、最高腫瘍負荷を示し、これらのマウスにおける循環ヒトＴ細胞の最小量と矛盾しなかった。ＮＣ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１群の腫瘍は、全て顕著に抑制され、または消失しており、腫瘍サイズの統計的差異はいずれもなかった。末梢血における導入Ｔ細胞の残留性を、養子移入１５日および３２日後に決定した。ＩＬ−７およびＩＬ−２１処理ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、＋１５日目に末梢血において他の群より高量のヒトＴ細胞を揺するように見えたが、ＩＬ−２処理ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、ヒトＴ細胞が最小数であった(図８Ｂー８Ｃ)。種々のＣＡＲ−Ｔ細胞集団のパーセンテージに関して、ＮＣ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１暴露群は全てＩＬ−２群と比較したとき高いＣＤ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を示し、一方ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージは全群で同等であった。Ｔ細胞表現型で、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８は、Ｔ細胞の約５〜１０％にしか発現されず、ＩＬ−２およびＮＣ群より高いＣＤ２８を発現したＩＬ−２１群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞を除いて、全群で同等であった(両方Ｐ＜０.０５)。＋３２日目に、全ＣＡＲ−Ｔ細胞群における循環ヒトＴ細胞は、ＩＬ−２群以外顕著に増大され、平均Ｔ細胞数１４９０７／μl〜１９６５１／μlであった(そして、ＩＬ−２群はわずか２４２／μl)。２匹のマウスが死亡したが、腫瘍は退行していた。
考察
ＩＬ−２は、養子免疫治療用リンパ球産生に最もしばしば使用されるサイトカインである。これはＴ細胞生存および増大を促進し、Ｔ細胞の腫瘍死滅能を増強する。しかしながら、ＩＬ−２の作用は、Ｔ細胞の活性化誘発細胞死(ＡＩＣＤ)および調節性Ｔ細胞発達をもたらすため、限定されている(Malek et al., Immunity, 2010, 33:153-65;およびLenardo et al., Annu Rev Immunol, 1999, 17:221-53)。本実施例において、ＩＬ−２はＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積およびその細胞毒性能を顕著に増加させたが、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は養子移入後インビボで優れた抗腫瘍免疫を示した。この発見は、インビトロ腫瘍溶解とインビボ腫瘍根絶の逆の関係を示す。ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８の発現が低く、比較的成熟表現型を示し、インビボで永続性が低い(Yang et al., Cancer Immunol Immunother, 2013, 62:727-36)。最近の研究は、あまり分化されていないＴ細胞の養子移入は優れた腫瘍後退と相関し、これは、ＩＬ−２曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞が他の群より有効ではないとの発見を支持する(Gattinoni et al., Nat Med, 2011, 17:1290-7;およびMarkley et al., Blood, 2010, 115:3508-19)。
ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と同程度の刺激ＣＡＲ−Ｔ細胞増大および腫瘍溶解機能を示すが、あまり分化されていない表現型を誘発した(ＣＤ２７およびＣＤ２８の高発現)。それゆえに、ＩＬ−１５はインビボでＣＡＲ−Ｔ細胞の残留性を支持し、動物モデルで良好な抗腫瘍免疫を示す。
ＩＬ−２およびＩＬ−１５と比較して、ＩＬ−７は、ＣＡＲ−Ｔ細胞増大を促進する能力は同等であるが、高レベルのＣＤ６２Ｌ発現を誘発し、無抗原状況でＣＡＲ−Ｔｓｃｍ細胞の最高の割合を示す。それゆえに、ＩＬ−２に曝したＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、抗原負荷を伴わないＩＬ−７のエクスビボ曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を増強した。ＩＬ−７曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原負荷下のＣＡＲ−Ｔ細胞の低増大により、ＩＬ−２より良好なインビボ抗腫瘍有効性をもたらさず、有効性はＩＬ−１５より劣った。
ＩＬ−２１は、例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ発現により、抗アポトーシス能を増強できなかったような、ＣＡＲ−Ｔ細胞蓄積に対してほとんど効果を発揮しなかった。しかしながら、ＩＬ−２１は、あまり分化されていないＣＡＲ−Ｔ細胞の発現を誘発し、抗原負荷の状況下での、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８の高発現の表現型を有した。それゆえに、ＩＬ−２１曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビボで動物モデルおよびＩＬ−２１注射において最良の残留性を示し、ＩＬ−１５以外の他のサイトカイン群より腫瘍根絶促進の良好な有効性を提供した。これらの結果は、あまり分化されていないＣＡＲ−Ｔ細胞が優れた腫瘍後退と相関するという先の発見と一致する。
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１ファミリーに属する炎症誘発性サイトカインであり、インビボでの活性化単球、ＮＫ細胞およびＴ細胞およびＩＦＮ−γ産生ならびに他のサイトカインによる自然および獲得免疫応答両者を制御する(Srivastava et al., Curr Med Chem, 2010, 17:3353-7)。ここに提供する結果は、ＩＬ−１８が、ＩＬ−１８群での結果のほとんどがＮＣ群と類似するか同等であるため、エクスビボ実験でＣＡＲ−Ｔ細胞増大、表現型および機能にほとんど影響しないことを示す。ＩＬ−１８は、対照(ＮＣ)群と比較して、抗原負荷下、Ｔ細胞の増殖をほとんど促進せず、多くのＴ細胞生存を維持した。インビボ試験は、サイトカイン補充なしのマウスと比較したとき、ＩＬ−１８はＣＡＲ−Ｔ細胞有効性に顕著な影響を有しないことを示す。
要約すると、これらの実験からの知見は、ＣＡＲ−Ｔ細胞増大のためのエクスビボでのＩＬ−２補充は、広く使用されているものの、最適のストラテジーではないことを示す。ＩＬ−１８、ＩＬ−２１または無サイトカイン補充について、比較的有効なＣＡＲ−Ｔ細胞を誘発し得るが、十分なＣＡＲ−Ｔ細胞が限定された増大時間で臨床使用用に製造できるほど、ＣＡＲ−Ｔ細胞増大を十分効率的に誘発しない。それゆえに、ＩＬ−１５およびＩＬ−７は、ＣＡＲ−Ｔ細胞増大に対して良好であり得る。さらに、ＩＬ−７とＩＬ−１５補充の組み合わせは、Ｔｓｃｍの生成を指示し、これは、より“若い”ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に有利である。インビボサイトカイン注射に関して、全γｃサイトカイン補充は、これらの多くがＣＡＲ−Ｔ細胞発現を指示したため、抗腫瘍有効性を増強し、ＩＬ−１５が最良の効果を示した。注射によりＩＬ−１５曝露ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けたマウスは、一部、腫瘍処置中のＣＡＲ−Ｔ細胞の増大能増加および残留性増加により、有効性が増加した。それゆえに、これらの実験の結果は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５が、ＣＡＲ−Ｔ細胞増大の促進および治療的処置に最も有効であるＴ細胞表現型の誘発に有効である有望性を示す。
実施例２：細胞成長および形質導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果
ＣＤ２５としても知られるインターロイキン−２ａ鎖は、調節性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)により発現されるが、慢性Ｂ細胞白血病(ＣＬＬ)細胞でも見られる(８５％を超えるＣＬＬ患者で)。Ｔｒｅｇは、免疫抑制性機能を有し、例えば、Ｔ細胞増殖阻害により、免疫治療の有効性を妨害し得る。アフェレーシスによるＣＬＬ患者からのＴ細胞の現在の単離または富化は、通常、顕著に増加した割合でＴｒｅｇならびにＣＬＬ細胞を含む。ＣＤ２５枯渇方法による出発物質におけるＴｒｅｇおよびＣＬＬ細胞の枯渇が、エフェクターＴ細胞の純度を顕著に改善し、それによりＣＡＲ１９発現Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲＴ１９細胞の効力を増加させる。
ＣＤ２５枯渇最適化
検証実験を実施して、CliniMACS SystemにおけるMiltenyiからのCD25 Reagentを使用して、２患者のアフェレーシスからのＣＤ２５枯渇について最適条件を同定した。ＣＤ２５枯渇剤を、同じ枯渇効率が少ない試薬の使用で得られるか否かを毒亭するために、製造業者の推奨量の１００％、７０％および３０％で使用した。Miltenyiからの異なる２つのチューブセットも試験した。枯渇を製造業者の指示に従い実施した。実験結果を下表に示す。対照として、抗ＣＤ３／ＣＤ２８免疫磁気ビーズを使用する選択を実施した。
予測ＣＤ２５−(ＣＤ２５陰性)Ｔ細胞収量は、各操作における１００％効率を仮定して計算した計算ＣＤ２５−Ｔ細胞収量を表す。ＣＤ２５−Ｔ細胞の観察収量は、各操作後のＣＤ２５−Ｔ細胞数を表す。表２に示すとおり、製造業者の推奨より少ない量の試薬の使用は、ＣＤ２５枯渇の同じ効率をもたらさなかった。異なるチューブを使用して、Ｔ細胞富化の１ログの増加をもたらした。
図９は、アフェレーシス、対照ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞、ＣＤ２５枯渇細胞およびＣＤ２５富化細胞からの総細胞と比較した、ＣＤ２５枯渇の効率を示す代表的フローサイトメトリー分析プロットを示す。ＣＤ３−ＣＤ１９−サブセットのＣＤ１４発現により決定した、細胞集団の単球含量。これらの結果は、効率的ＣＤ２５枯渇およびＣＤ２５枯渇はまた顕著な単球含量をもたらすことも示す(アフェレーシス、対照およびＣＤ２５富化細胞からの総細胞における２％未満と比較して６１.１％ＣＤ１４発現細胞)。
Ｔ細胞集団および増殖に対するＣＤ２５枯渇の効果
次に、ＣＤ２５枯渇後のＴ細胞生産物の品質を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合および増殖能の決定により評価した。
特異的Ｔ細胞集団の割合を決定するために、細胞を、上記のとおり抗ＣＤ３／ＣＤ２８またはＣＤ２５枯渇による選択後９日にフローサイトメトリーにより分析した。結果は、ＣＤ３／ＣＤ２８−選択Ｔ細胞が、ＣＤ２５枯渇細胞と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞で大きな割合を有することを示す(８４.６％対４６.８％ＣＤ４＋Ｔ細胞)。逆に、ＣＤ２５枯渇細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８−選択細胞と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな割合を有した(４７.２％対１１.５％ＣＤ８＋Ｔ細胞)。それゆえに、ＣＤ２５枯渇は、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の割合が大きいＴ細胞をもたらす。
増殖能および細胞生存能を、対照(ＣＤ３／ＣＤ２８選択細胞)およびＣＤ２５枯渇細胞でも評価した。対照およびＣＤ２５枯渇細胞からの１.６×１０７細胞を播種し、細胞数および生存能を１０〜１３日にわたり測定した。図１０Ａは、経時的総細胞数を示し、図１０Ｂは、計算集団倍加を示す(細胞総数から計算)。結果は、ＣＤ２５枯渇細胞が、対照細胞と類似の成長特徴を示すことを示す。図１０Ｃは、生存可能細胞のパーセンテージを示し、結果は、生存能も対照とＣＤ２５枯渇細胞で類似することを示す。
レンチウイルス形質導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果
レンチウイルス形質導入効率に対するＣＤ２５枯渇の効果を、形質導入後ＣＡＲの発現の決定により評価した。患者アフェレーシスは、上記のとおりＣＤ２５細胞が枯渇した。ＣＤ２５枯渇の効率を、ＣＤ２５枯渇前(アフェレーシスサンプル)および後(ＣＤ２５枯渇フラクション)のＣＤ２５発現集団を比較するフローサイトメトリー分析プロットで示す。ＣＤ２５枯渇後、ＣＤ２５枯渇フラクションは約５９.２％のＣＤ２５陰性細胞およびわずか１０.３％ＣＤ２５陽性細胞を含んだ。
ＣＤ２５枯渇フラクションをレンチウイルス構築物コード化ＣＡＲ１９で形質導入した。１１日の培養後、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーで評価した。形質導入していない細胞および形質導入ＣＤ３選択細胞を対照として使用した。ＣＡＲ１９発現は、ＣＤ３選択細胞と比較して、ＣＤ２５枯渇細胞が有意に高かった(５１.４％対１２.８％)。この結果は、ＣＤ２５枯渇細胞のレンチウイルス形質導入効率が改善されていることを示し、これは、ＣＡＲＴ治療の治療効果改善に重要であり得る。
実施例３：サイトカインとＣＤ２５枯渇細胞の使用
本実施例において、増大培養においてサイトカイン補充するＣＤ２５枯渇の効果を試験した。末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を患者から単離し、未操作のままであるか、または実施例２に記載のようにＣＤ２５発現細胞を枯渇した。Ｔ細胞富化を、抗ＣＤ３およびＣＤ２８被覆ビーズでの刺激により達成した。Ｔ細胞を、１０ng／ml ＩＬ−７、１０ng／ml ＩＬ−１５または１０ng／ml ＩＬ−７と１０ng／ml ＩＬ−１５の組み合わせを補充した培地ですぐに培養した。３日目、培地を同じサイトカインを添加して交換した。５日目、１００ＩＵ ＩＬ−２／ml含有培地を添加し、細胞を計１０日増殖させた。
フローサイトメトリー分析は、未操作のＰＢＭＣ(標準ＣＤ３／ＣＤ２８選択)と比較して、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−７およびＩＬ−１５存在下での培養後のＣＤ２５枯渇細胞におけるＣＤ３およびＣＤ１９細胞の分布の変化を示した。出発集団(例えば、ＣＤ２５枯渇前およびサイトカイン補充培養前)におけるＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ２５発現細胞の分布を評価した。出発集団は、ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞の割合が高く(〜９７.２％)、ＣＤ２５発現細胞の割合が高かった(〜９４.５％ＣＤ２５＋ＣＤ３−；および〜９３.８％ＣＤ２５＋ＣＤ１９＋)。操作(ＣＤ２５枯渇)およびサイトカインと培養後、分布は図１１に示すように変化した。ＣＤ２５枯渇細胞は、全体的に未操作細胞と比較して、ＣＤ１９発現細胞の大きな減少を示した。
増殖能も、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズで刺激１０日後に、培養における細胞総数決定により同じ細胞サンプルで評価した。各細胞サンプルの細胞数を下に示す。
これらの結果は、ＣＤ２５枯渇Ｔ細胞培養中のＩＬ−１５補充は、未操作細胞と比較して、増大を増加させる。培養中の培地へのＩＬ−７およびＩＬ−１５添加は、未操作細胞およびサイトカインＩＬ−７またはＩＬ−１５個々の添加と比較して、増大を増加させる。それゆえに、ＩＬ−７とＩＬ−１５の組み合わせの補充は、最も増殖能が増加したＴ細胞をもたらした。
実施例４：メソセリンＣＡＲ Ｔ細胞の刺激および増大
ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を末梢または臍帯血から得る。エレクトロポレーションの手段により、インビトロ転写ＲＮＡを細胞に導入する。最大ＣＡＲ表面発現を可能にするための一夜インキュベーション後、細胞を、サイトカイン添加培地においてトシル活性化磁気ビーズ(Invitrogen Cat 14013)に固定化された同族抗原とインキュベートする。細胞を、４８時間毎の新鮮培地の定期的供給を用いてインビトロで増大させる(図２２)。
培養を、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の５０：５０混合物で開始した。細胞を、偽電気穿孔またはＳＳ１−ＢＢｚ ＲＮＡで電気穿孔した。８時間後、細胞をメソセリンコンジュゲートビーズ(培養に残すかまたは１日)または培養に残すＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに曝した。翌日、細胞を偽トランスフェクトまたはレンチウイルスでトランスフェクトした(図２３)。増殖速度および細胞サイズを測定した。ＣＤ３／２８ビーズで刺激した細胞は最高集団倍加を示した。しかしながら、レンチウイルスでの形質導入は、集団を２まで減少させる(深赤色)(図２４Ａ)。ＳＳ１−ＢＢｚ ＲＮＡで前電気穿孔した細胞は、メソビーズで１日以上刺激しようが、レンチウイルスでの形質導入がなかろうが、集団倍加および細胞サイズに差を示さなかった(図２４Ａおよび２４Ｂ)。ＣＤ３／２８ビーズで刺激した細胞およびメソセリン被覆ビーズで刺激したＳＳ１−ＢＢｚ ＣＡＲＴ細胞は、類似の形質導入効率を示した(図２５Ａおよび２５Ｂ)。
腫瘍標的タンパク質に対する抗体特異的の重鎖および軽鎖の一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)からなるメソセリンＣＡＲを図２６Ａに示す。本発明は何らかの個々のｓｃＦｖに制限されないが、ここで示す結果は、一部、メソセリン特異的ｓｃＦｖの使用により得られている。これらのＣＡＲは、ＣＤ８ｚヒンジによりタンデムで結合した共刺激ドメインおよび膜貫通ドメインを有する(模式的図２６Ａに示す)。ヒトＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞上のメソセリンＣＡＲの表面発現レベルを図２６Ｂに示す。
メソセリンＣＡＲ刺激による培養における末梢血ＣＤ８ Ｔ細胞(図２７Ａ)、ＣＤ４ Ｔ細胞(図２７Ｂ)および臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞(図２７Ｃ)の増大を試験した。示すメソセリンＣＡＲ発現ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞は、サイトカイン存在下、磁気ビーズ上に固定化したメソセリンと共培養した。ＣＤ４ Ｔ細胞はＩＬ２(３０単位／mL)受けた。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＩＬ２(１００単位／mL)またはＩＬ７＋ＩＬ１５(各１０ng／mL)存在下で培養した。細胞数を４８時間毎にカウントし(Multisizer 3 Coulter counter使用)、新鮮培地(対応するサイトカイン添加)に０.７５ｅ６／mLで再播種した。ＣＡＲを有する全Ｔ細胞はＣＡＲ特異的刺激を受け、培養で増大した。異なるＣＡＲ共刺激ドメインは、培養におけるＴ細胞増大に異なる効果を有しており、最良の組み合わせは、ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＢＢｚ ＣＡＲ構築物である。これらの数は、ＣＤ３／２８刺激条件を使用して見られる増大と同等である。
実施例５：一過性に発現されたキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)によるＴ細胞の活性化および増大
図２８は、Ｔ細胞表面上の一過性に発現されたキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)の、その同族抗原による刺激のための方法の模式図を示す。ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を末梢または臍帯血から得る。エレクトロポレーションの手段により、インビトロ転写ＲＮＡを細胞に導入する。最大ＣＡＲ表面発現を可能にするための一夜インキュベーション後、細胞をサイトカイン添加培地においてトシル活性化磁気ビーズ(Invitrogen Cat 14013)に固定化された同族抗原とインキュベートする。細胞を、４８時間毎の新鮮培地の定期的供給を用いてインビトロで増大させる(図２９)。
メソセリン被覆ビーズへの曝露後のメソセリンＣＡＲ発現細胞の集団倍加(図３０Ａ)および細胞サイズ(図３０Ｂ)ならびに培養におけるメソセリンＣＡＲ(図３１Ａ)またはＣＤ１９ ＣＡＲで刺激した末梢血Ｔ細胞(図３１Ｂ)およびメソセリンＣＡＲで刺激した臍帯血ＣＤ８ Ｔ細胞(図３１Ｃ)の増大を測定した。ＣＡＲ発現Ｔ細胞をサイトカイン存在下、磁気ビーズに固定化したＣＡＲ特異的抗原と共培養した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＩＬ７＋ＩＬ１５(各１０ng／mL)存在下培養した。細胞数を４８時間毎にカウントし(Multisizer 3 Coulter counter使用)、新鮮培地に０.７５ｅ６／mLで再播種した(対応するサイトカイン添加)。
ＣＡＲを有する全Ｔ細胞はＣＡＲ特異的刺激を受け、培養で増大した。異なるＣＡＲ共刺激ドメインは、培養におけるＴ細胞増大に異なる効果を有しており、最良の組み合わせは、ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＢＢｚ ＣＡＲ構築物である。これらの数は、ＣＤ３／２８刺激条件を使用して見られる増大と同等(およびある場合高い)である。
実施例６：キメラ抗原受容体における異なるシグナル伝達ドメインによるＴ細胞の代謝運命の再プログラミング
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、癌細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を再指示し、癌免疫療法への有望な新規手法を提供する。広範な臨床使用にも関わらず、ＣＡＲ−Ｔ細胞の残留性および機能(例えば、消耗に対する耐性)に影響するＣＡＲ共刺激ドメインの特質は大部分不明確なままである。この実施例は、ＣＡＲ移植ヒトＴ細胞の増殖、細胞長命、記憶分化および代謝特徴に対する共受容体ＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの影響を報告する。ＣＡＲアーキテクチャにおける、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである４−１ＢＢの包含は、顕著な呼吸器能増強、脂肪酸酸化増加およびミトコンドリア新生増強を有するＣＤ８中央記憶Ｔ細胞への帰結を促進する。対照的に、ＣＤ２８ドメインを有するＣＡＲ Ｔ細胞は、解糖増大と一致する遺伝子シグネチャーを有するエフェクター記憶細胞を生じた。これらの結果は、少なくとも一部、臨床試験における４−１ＢＢまたはＣＤ２８シグナル伝達ドメインを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞の差次的残留性の推定機構および将来のＣＡＲ Ｔ細胞治療剤の設計の情報を提供する。
遺伝的再指向自己Ｔ細胞注入に基づく養子免疫療法は、血液系腫瘍および固形腫瘍両方の処置について有望であることが示されている。従って、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)またはキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に基づき、Ｔ細胞に所望の抗原受容体を授ける複数機能獲得型ストラテジーが記載されている(June et al., Sci. Transl. Med. 7, 280ps7, 2015)。多数のストラテジーが提案されている中で、ＣＡＲの使用は、癌、特にＢ細胞悪性腫瘍に対する免疫応答増強における強力な効果が示されている(Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38, 2013; Grupp et al., N. Engl. J. Med. 368, 1509-1518, 2013; Kalos et al., Sci. Transl. Med. 3, 95ra73, 2011)。ＣＡＲ Ｔ細胞治療は疾患クリアランスに顕著な影響を有しているが、ＣＡＲが臨床的に成功するための必須要素およびそれらがどのように治療有効性に影響するかは大部分不明確なままである(Kalos and June, Immunity 39, 49-60, 2013)。
ＣＡＲは、Ｔ細胞のエフェクター機能と抗体結合ドメインの精巧な特異性を組み合わせた合成分子である。最も単純な形態で、これらの受容体は抗体の細胞外可変領域に移植されたＴＣＲを有する(Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724, 1993; Kuwana et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 960-968, 1987)。抗体ベースの受容体の一つの優位性は、それらが抗原プロセシングおよび主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)制限提示と無関係に予定した腫瘍標的を認識でき、広範な患者に適用可能な単一デザインを与えることである。Ｆｃ受容体−ガンマ鎖(ｇ鎖)の細胞質ドメインまたはＣＤ３ｚシグナル伝達モジュールのみからなる第一世代ＣＡＲはしばしば反応不顕性となり、強力なＴ細胞抗腫瘍効果を誘発しない(Brocker, Blood 96, 1999-2001, 2000; Kershaw et al., Clin. Cancer Res. 12, 6106-6115, 2006; Lamers et al., J. Clin. Oncol. 24, e20-e22, 2006)。これにより、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０のようなさらなる共刺激細胞質ドメインが、個々にまたは組み合わせて取り込まれた第二および第三世代ＣＡＲの開発に至った(Dotti et al., Immunol. Rev. 257, 107-126, 2014; Sadelain et al., Cancer Discov. 3, 388-398, 2013)。このモジュラーデザインは、天然共刺激の多くの態様の完全再現およびＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および機能増強に成功する(Maus et al., Cancer Immunol. Res. 1, 26-31, 2014)。
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞は、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)および汎発性大Ｂ細胞リンパ腫を含む種々の血液系腫瘍に対する臨床応答の促進が示されている。しかしながら、成功率は、研究デザインにおける数変動ならびに、とりわけ、一本鎖可変抗体フラグメント(ｓｃＦｖ)、共刺激ドメイン、遺伝子−伝達プロトコールおよびＣＡＲ Ｔ細胞注入後の差異のため、比較が困難である。ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインが組み込まれたＣＡＲで実施された治験は、ＡＬＬを有する患者で類似の初期応答率を示している(Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38, 2013; Lee et al., Lancet 385, 517-528, 2015; Maude et al. N. Engl. J. Med. 371, 1507-1517, 2014)。しかしながら、ＣＬＬでは、４−１ＢＢ共刺激ドメイン(Porter et al., Sci. Transl. Med. 7, 303ra139, 2015)を有するＣＡＲ Ｔ細胞の臨床的有効性は、ＣＤ２８ドメインを有するものより優れるように見える(Brentjens et al., Blood 118, 4817-4828, 2011Porter et al., Sci. Transl. Med. 7, 303ra139, 2015)。ＣＤ２８ベースのＣＡＲ Ｔ細胞インビボの残留性は約３０日と報告され(Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38, 2013; Lee et al., Lancet 385, 517-528, 2015)、４年を超える患者もいる４−１ＢＢ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続発現およびエフェクター機能と対照的である(Porter et al., Sci. Transl. Med. 7, 303ra139, 2015)。さらに、あるＣＡＲへの４−１ＢＢシグナル伝達ドメインの取り込みは消耗を軽減する(Long et al., 2015)。他の重要な考察は、内因性ＣＤ２８および４−１ＢＢのような腫瘍壊死因子受容体ファミリー(ＴＮＦＲ)のメンバーが、Ｔ細胞で種々のシグナル伝達カスケードを誘発することである。ＣＤ２８は、グルコース代謝への下流効果を伴うＰ１３Ｋ−Ａｋｔ経路の活性化および解糖増加に至る(Frauwirth et al., Immunity 16, 769-777, 2002)。対照的に、内因性４−１ＢＢシグナル伝達は、Ｔ細胞への長期生存利益付与と関連付けられており(Sabbagh et al., J. Immunol. 180, 8093-8101, 2008)、４−１ＢＢにより使用されるシグナル伝達経路はＣＤ２８と異なる(Martinez-Forero et al., J. Immunol. 190, 6694-6706, 2013)。それ故に、ＣＡＲの分子シグナル伝達効果の徹底的な理解は、ＣＬＬについての臨床的有効性の観察される差異を一部説明するであろう。
最適ＣＡＲデザイン同定のための課題は、ＣＡＲベースの刺激の影響を調査する生理学的インビトロモデルの欠如である。さらに、レトロウイルスでの現在の遺伝子伝達プロトコールは、その内因性ＴＣＲによるＴ細胞の同時の活性化を必要とし、ＣＡＲ自体によるシグナル伝達のため、効果を不明確とする可能性がある。本実施例において、内因性ＴＣＲ活性化の必要なしに、９０％を超えるＴ細胞におけるＣＡＲ発現を可能とする手法を記載する。同族抗原でのＣＡＲ Ｔ細胞の刺激は、初代ヒトＴ細胞の分化および代謝に対する種々の効果の同定を可能とした。ＣＡＲシグナル伝達ドメインが代謝再プログラミングに介在でき、同時に生体エネルギーおよびミトコンドリア新生を修飾することが判明した。４−１ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、中央記憶Ｔ(Ｔｃｍ)細胞頻度、ミトコンドリア新生および大きな酸化的代謝の増加と関連する生存増強を示すことが判明した。対照的に、ＣＤ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗原刺激は、エフェクター記憶分化を促進し、好気性解糖を増強した。
本実施例に記載するとおり、共受容体の種々のシグナル伝達は、ＣＡＲ Ｔ細胞における特定の代謝経路を制御し、記憶発達に影響を与えることができる。
実験方法
インビトロ転写(ＩＶＴ)ＲＮＡをコードするＣＡＲのＣＡＲ構築物および産生
これらの試験のために、ヒトＣＤ１９またはメソセリン抗原に特異的なＣＡＲを使用した。図３２Ａは、本試験に使用したＣＡＲの模式図を示す。全てのＣＡＲは、ヒトＣＤ１９(クローンＦＭＣ−６３)に対する一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)またはヒトメソセリンタンパク質に対するＳＳ１ ｓｃＦｖの、示すほうを含んだ(Hassan et al., Clin. Cancer Res. 8, 3520-3526, 2002; Nicholson et al., Mol. Immunol. 34, 1157-1165, 1997)。メソセリンＣＡＲは先に記載された(Carpenito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 3360-3365, 2009)。ＣＤ２８ｚ ＣＡＲは、先に記載のとおり、ＣＤ８ａヒンジによりＣＤ２８およびＣＤ３ｚの細胞内ドメインにｃｉｓで連結されたｓｃＦｖおよびＣＤ２８膜貫通ドメインを含んだ(Milone et al., Mol. Ther. 17, 1453-1464, 2009)。同様に、ＢＢｚ ＣＡＲは、ＣＤ８ａヒンジにより４−１ＢＢ細胞内部分およびＣＤ３ｚドメインに連結されたｓｃＦｖおよび膜貫通ドメインを含んだ(Milone et al., Mol. Ther. 17, 1453-1464, 2009)。インビトロ転写(ＩＶＴ)ＲＮＡの調製物について、ＣＡＲコード化遺伝子構築物を、先に記載のとおりｐＧＥＭ.６４Ａベースのベクターにサブクローン化した(Zhao et al., Cancer Res. 70, 9053-9061, 2010)。
ＣＡＲ ＲＮＡ調製
インビトロ転写(ＩＶＴ)ＲＮＡについて、T7 mScriptＴＭ RNA系(Cellscript, Madison WI)を製造業者の指示に従い、かつ先に記載のとおり使用した(Zhao et al., Cancer Res. 70, 9053-9061, 2010)。ＩＶＴ生産物をRNeasy Mini Kit(Qiagen Inc., Valencia, CA)で精製し、精製ＲＮＡを無ＲＮａｓｅ水に１μg／μLで溶出させた。
初代ヒトＴリンパ球の単離、エレクトロポレーションおよび増大
初代ヒトＴリンパ球University of Pennsylvania Apheresis Unitで匿名健常ドナーから得た。BTX CM380(Harvard Apparatus BTX)エレクトロポレーション装置を使用して、ＩＶＴ ＲＮＡを、１μg ＲＮＡ／１０６細胞の比率でＴ細胞に導入した。この技術は、細胞表面上の均一ＣＡＲ発現の促進のために最適化された(図３２Ｂ)。Ｔ細胞を、組み換え抗ＣＤ１９イディオタイプまたはメソセリン−Ｆｃで被覆された磁気ビーズで刺激した。
刺激ビーズの調製
ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ刺激のために、組み換え抗ＣＤ１９イディオタイプ抗体またはメソセリン−Ｆｃ融合タンパク質をダイナビーズＭ−４５０トシル活性化(Invitrogen, USA)とカップリングさせた。カップリングについて、全ての４×１０８ビーズを１回洗浄し、１mLの無菌ホウ酸溶液(０.１Ｍホウ酸、ｐＨ９.５)に再懸濁させた。このために、１mLのホウ酸溶液中の１５０μgのタンパク質を添加し、規則的混合しながら、３７℃で一夜(１６〜２４時間)インキュベートした。磁気ビーズ捕捉後、溶液を傾捨し、ビーズをビーズ洗浄溶液(３％ヒトアルブミン、０.１％ナトリウムアジドおよび０.４％０.５Ｍ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液)で、各１０分、３回洗浄し、さらに一夜、新鮮ビーズ洗浄溶液で連続的振盪により洗浄した。被覆ビーズをＲ１０(１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μg／ml硫酸ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ)で３回洗浄後、インビトロ刺激に使用した。刺激のために、ＣＡＲ ＲＮＡ電気穿孔細胞を、ビーズ：細胞比３：１でビーズと共培養した。
Ｔ細胞培養
細胞を、Ｒ１０で３７℃に、培養全体を維持し、新鮮培地を４８時間毎に供給した。細胞をCoulter Multisizer III粒子カウンターを使用してカウントした。各時点での集団倍加を、その日の総細胞対前測定時点の比として測定した。累積的集団倍加をプロットした。培地に、ＣＤ４＋Ｔ細胞について３０Ｕ／mLヒトＩＬ２(Chiron)およびＤ８＋Ｔ細胞についてＣ１０ng／mL ＩＬ７＋１０ng／mL ＩＬ１５(R&D systems)のとおり、サイトカインを添加した。
フローサイトメトリー分析のための表面染色
細胞生存能を、Live/Dead Fixable Aqua amine反応性生存能色素(Life Technologies)で、１５分、室温での染色により測定した。次の蛍光プローブコンジュゲート抗体をBD Biosciencesから購入した。αＣＤ４−ＢＶ７１１、αＣＤ８−ＡＰＣＨ７、αＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ、αＣＤ６９−ＰＥＣＦ５９４、αＣＣＲ７−ＰＥ−Ｃｙ７、αＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、αＣＤ１２７−ＦＩＴＣおよびαＣＤ２１５−ＰＥ。表面染色を、４℃で３０分、３％ウシ胎児血清添加リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中で行った。ＣＡＲの表面発現を、細胞とビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２抗体(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)を、４℃で３０分インキュベートし、ＦＡＣｓ緩衝液(ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ)で２回洗浄し、フィコエリトリン標識ストレプトアビジン(BD Pharmingen, San Diego, CA)で検出することにより試験した。サンプルデータをLSRII Fortessa(BD Biosciences)に集め、FlowJoソフトウェア(Treestar)で分析した。
フローサイトメトリー分析
生存細胞を、Live/Dead Aqua陰性でゲーティングし、次いでＣＤ３−、ＣＤ４−およびＣＤ８陽性事象についてゲーティングした。記憶、ＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯのマーカーを使用して、我々は、培養における細胞を分析し、次いで、BD FACSCaliburアナライザーを使用して３つの異なる記憶表現型についてソートした。絶対Ｔ細胞数を、CountBright Absolute Countingビーズ(Life Technologies)の助けを借りて、次の式(Ｔ細胞事象数／ビーズ事象数)×使用したビーズ数
を使用して決定した。
代謝パラメーターの分析
ミトコンドリア機能を、細胞外流動アナライザー(Seahorse Bioscience)で評価した。ＸＦ２４(図３４Ｂ−３４Ｃおよび３４Ｆ−３４Ｇ)またはＸＦ９６(図３４Ｈ−３４Ｋ)細胞培養マイクロプレートの個々のウェルを、製造業者の指示に従いCellTakで被覆した。マトリックスを一夜、３７℃で吸着させ、吸引し、空気乾燥させ、使用するまで４℃で保存した。ミトコンドリア機能を０日、７日および２１日に評価した。ミトコンドリア機能アッセイのために、Ｔ細胞を、１２００×ｇで５分遠心分離した。細胞ペレットを、５.５mMグルコース、２mM Ｌ−グルタミン、１mM ピルビン酸ナトリウム含有ＸＦアッセイ培地(非緩衝化ＲＰＭＩ １６４０)に再懸濁し、ウェルあたり１×１０６細胞で播種した。マイクロプレートを、１０００×ｇで５分遠心分離し、標準培養条件で６０分インキュベートした。装置較正中(３０分)、細胞を無ＣＯ２(３７℃)インキュベーターに移した。ＸＦ２４およびＸＦ９６アッセイカートリッジを、製造業者の指示に従い較正した。細胞性酸素消費速度(ＯＣＲ)を基底条件および１mMアンチマイシンＡを伴う、５mMオリゴマイシン、５mMフルオロ−カルボニルフェニルヒドラゾン(ＦＣＣＰ)および４０nMロテノンでの処理後、測定した(XF Cell Mito Stress kit、Seahorse Bioscience)。
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ｑＲＴ−ＰＣＲ)を使用して、ある候補遺伝子の発現レベルを定量した。細胞からの総ＲＮＡを、High Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems)でｃＤＮＡを合成するための鋳型として髭右した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、ViiA 7 Real Time PCR System上のTaqman Universal Master Mixで、製造業者の指示に従いトリプリケートで実施した。ＰＣＲ系で定量された各候補遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨに対して正規化した。使用した全プローブは市販されている(Applied Biosystems)。
グルコース取り込みアッセイ
刺激７日後の細胞を、室温で３０分、ＰＢＳで飢餓状態にし、続いて、３７℃で通常の１１mMグルコース、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／mlペニシリン、１００mg／ml硫酸ストレプトマイシンおよび２mM ｇｌｕｔａｍａｘ添加ＲＰＭＩ培養培地でインキュベートした。細胞培養の５００μL量を意図した時点で採取し、遠沈させ、上清を、Nova BioProfile Analyzer(Nova Biomedical)でグルコースおよび乳酸濃度について分析した。
パルミチン酸取り込みアッセイ
[１３Ｃ１６]パルミチン酸をSigma-Aldrichから購入した。液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー用の全溶媒はＯｐｔｉｍａグレードであり、Fisher Scientificから購入した。パルミチン酸標識同位体実験について、細胞を、Ｄ−グルコースまたはＬ−グルタミン非存在下(Biological Industries)、１０％活性炭処理済みＦＢＳ(GIBCO)、２mM Ｌグルタミン(Life Technologies)、５.０mMグルコースおよび１００mM [１３Ｃ１６]パルミチン酸を添加したＲＰＭＩ １,６４０で一夜培養した。
短鎖アシル−ＣｏＡ伸長
抽出を、先に記載のとおり実施した(Basu and Blair, Nat. Protoc. 7, 1-12, 2012; Worth et al., J. Biol. Chem. 289, 26895-26903, 2014)。簡潔に言うと、リンパ球を、１,２００rcfで５分遠心分離した。細胞ペレットを、７５０mlの氷冷１０％トリクロロ酢酸に再懸濁し、超音波ディスメンブレータ(Fisher Scientific)でパルス音波処理した。サンプルを１５,０００rcfで１５分遠心分離し、上清を固相伸長により精製した。簡潔に言うと、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ １ml(３０mg)固相伸長カラムを１ml メタノール、続いて１mlのＨ２Ｏでコンディショニングした。上清をカラムに適用し、１mlのＨ２Ｏで洗浄した。検体を、２５mM 酢酸アンモニウム含有メタノールで流し、一夜、Ｎ２ガスで乾燥させ、５０mlの５％５−スルホサリチル酸に再懸濁した。ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析で１０ml注入を適用した。
アシル−ＣｏＡチオエステルのＬＣ／ＭＳ分析
アシル−ＣｏＡを、先に記載されたとおり、Phenomenex Luna C18逆相高速液体クロマトグラフィーカラム(２.０ ３ １５０mm、５mm孔径)を用い、５mM酢酸アンモニウムの水溶液を溶媒Ａ、５mM酢酸アンモニウムのアセトニトリル(ＡＣＮ)／水(９５：５、ｖ／ｖ)溶液を溶媒Ｂ、ＡＣＮ／水／ギ酸(８０：２０：０.１、ｖ／ｖ)を溶媒Ｃとして用いて、分離した(Basu et al., Anal. Chem. 83, 1363-1369, 2011; Worth et al., J. Biol. Chem. 289, 26895-26903, 2014)。直線状勾配を次のとおり流した。２％溶媒Ｂを１.５分、２５％まで３.５分かけて上昇、１００％まで０.５分かけて上昇、８.５分維持および１００％溶媒Ｃで５分洗浄後、平衡化を５分。流速は２００ml／分であった。サンプルをＡＰＩ ４０００三連四重極型質量分析計(Applied Biosystems)で、正のエレクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)モードで分析した。サンプル(１０ml)をＬＥＡＰオートサンプラー(CTC Analytics AG)で注入し、４℃に維持した。データをAnalyst Version 1.4.1ソフトウェア(AB SCIEX)で分析した。カラム流出を、８〜２３分質量分析計に転用し、流した残りを廃棄した。質量分析計操作条件は次のとおりであった。イオンスプレー電位(５.０kV)、カーテンガスとしての窒素(１５Ｕ)、イオン源ガス１(８Ｕ)、イオン源ガス２(１５Ｕ)および衝突誘起解離ガス(５Ｕ)。ＥＳＩプローブ温度は４５０℃であり、デクラスタリング電位は１０５Ｖであり、エントランス電位は１０Ｖであり、衝突エネルギーは４５Ｖであり、衝突出口電位は１５Ｖであった。５０７Daの喪失が、各アシル−ＣｏＡでモニターされた。
顕微鏡
異なる時点での細胞をＤｉＩ、Mitotracker緑およびＤＡＰＩ(Life Technologies)で染色し、４％ＰＦＡで固定し、その後Leica TSC SP8共焦点顕微鏡で撮像した。捕捉画像をFiji(ImageJ)で分析し、蛍光発光を平均蛍光強度(ＭＦＩ)として定量した。透過型電子顕微鏡について、細胞は、Penn’s Electron Microscopy Resource Laboratoryにより調製され、Jeol-1010顕微鏡を使用して撮像された。
統計分析
示す限り、全ての結果は平均±平均値の標準誤差(ＳＥＭ)または標準偏差(ＳＤ)として表す。統計比較をスチューデントのｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡモデルで、ＣＡＲ群およびサンプル採取時点を因子として、Ｐｒｉｓｍ(GraphPadソフトウェア)を使用して実施した。ウィルコクソン符号順位検定(両側)を、２ＣＡＲ Ｔ細胞群間の集団倍加で実施した。
結果
ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、増大および生存エクスビボの増加を示した
この実験は、まずＣＤ１９またはメソセリンに特異的なＣＤ１９ ＣＡＲデザイン(図３２Ａ)を比較した。ＣＡＲは、ＣＤ２８(Kochenderfer et al., J. Immunother. 32, 689-702, 2009)または４−１ＢＢ(Milone et al., Mol. Ther. 17, 1453-1464, 2009)の何れかを含むシグナル伝達ドメインを含んだ。これらのＣＡＲを、臨床試験で広範に試験されているため、選択した(Beatty et al., Cancer Immunol. Res. 2, 112-120, 2014; Kochenderfer et al., Blood 119, 2709-2720, 2012; Lee et al., Lancet 385, 517-528, 2015; Maude et al., N. Engl. J. Med. 371, 1507-1517, 2014; Maus et al., Cancer Immunol. Res. 1, 26-31, 2013; Porter et al., Sci. Transl. Med. 7, 303ra139, 2015)。ＣＡＲ構築物の両方とも＞９０％のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、同等な平均蛍光強度(ＭＦＩ)で発現した(図３２Ｂ)。試験デザインの模式図を図３２Ｃに示す。Ｔ細胞の分化および代謝運命に対するＣＤ２８および４−１ＢＢ(２８ｚおよびＢＢｚと称する)シグナル伝達ドメインの影響。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、３０Ｕ／mlのヒトＩＬ２添加培地で培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、実験方法に示すとおり、１００Ｕ／mlのヒトＩＬ２または１０ng／ml ＩＬ７および１０ng／ml ＩＬ１５添加培地で培養した。エレクトロポレーション約２４時間後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を同族ＣＤ１９抗原のサロゲートとして役立つＦＭＣ−６３ ｓｃＦｖに対するビーズ結合抗イディオタイプ−Ｆｃで刺激した。ＣＡＲ Ｔ細胞が均一な刺激を受けることを確実にするために、活性化分子ＣＤ６９の表面発現を活性化後１日目に分析した。ＣＤ６９は、リンパ系活性化の高感度指標である誘導性細胞表面糖タンパク質である(Hara et al., J. Exp. Med. 164, 1988-2005, 1986)。ＣＡＲ特異的刺激を受けた細胞は、１日目にＣＤ６９発現増加を示し、これは２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で類似した(図３３Ａ)。しかしながら、ＢＢｚ ＣＡＲを担持するＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞療法の増殖能は、少なくとも２０日を超えて延長した。対照的に、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖期は１４日が限度であった(図３３Ｂおよび３７、ｐ＜０.０１)。ＣＡＲ表面発現は、同族抗原での刺激後、急速に減少した(図４１)。重要なことに、サイトカイン受容体発現は両ＣＡＲ群で同等であり(図４１)、異なるＣＡＲ Ｔ細胞間の増殖性差異はサイトカイン受容体発現差異によるものではないことを示す。あるドナーにおいて、４週未満で、出発培養４×１０６細胞から５×１０９を超える計算収量の増大である、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞培養における１０を超える集団倍加が観察された(表５)。ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、単一刺激後、サイトカイン添加培地で４週を超えて培養が持続した。対照的に、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および／または生存は低かった。増殖能はドナー間で異なったが、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して増殖能および残留性が高いという、傾向は同じままであった(図４０、ｐ＜０.０１)。類似の結果が、メソセリンに対するＣＡＲでも示された(図３３Ｃ、図３８、表５および７)。この実施例の残りは、主に、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＡＲデザインの高価に商店を搾る。
ＢＢζ ＣＡＲシグナル伝達は、中央記憶Ｔ細胞(ＴＣＭ)サブセット増強を促進する
ＢＢｚ Ｔ細胞の残留性増強は、より広範な増殖能を有する細胞の相対的保存によるものであると仮説立てられた。ＢＢｚおよび２８ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞の分化状態を試験するために、Ｔ細胞分化関連細胞表面マーカーの標準パネルを使用した。Ｔｃｍ細胞と関連するＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の発現を評価した。全培養は、同じ異種性Ｔ細胞の集団サブセットを０日目に含んだ。ＣＡＲによる刺激後、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋細胞の割合が進行性に富化された(図３３Ｄ)。顕著なことに、このＴｃｍ細胞集団の富化は、２８ｚ群よりＢＢｚ ＣＡＲ群で高く(ｐ＜０.０１)、培養の最後まで持続した(図３３Ｅ)。対照的に、２８ｚ ＣＡＲ培養は、 ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７細胞として同定される、高い割合のエフェクター−記憶表現型(Ｔｅｍ)を一貫して産生した。細胞の記憶表現型プールへの分配／分化は、ＢＢｚ ＣＡＲ対２８ｚ ＣＡＲで刺激された細胞の長命の差に起因する可能性がある。
ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞代謝を再プログラムする(ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は異なる酸化的特性を示す)
刺激により、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、増殖およびエフェクターおよび記憶細胞への分化を含む、秩序あるプロセスを受ける。活性化は、Ｔ細胞増殖および機能を支持するのに必要な生合成および生体エネルギー流動と関連する(Pearce and Pearce, Immunity 38, 633-643, 2013; Wang and Green, Nat. Immunol. 13, 907-915, 2012)。例えば、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞は、発達および残留性について、主に遊離脂肪酸のミトコンドリア酸化に医師恩する(Pearce et al., Nature 460, 103-107, 2009; van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。対照的に、活性化エフェクターＴ細胞は解糖(または同時の酸化的リン酸化および好気性解糖上方制御)にシフトして、増殖の代謝要求を満たす(van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。Ｔ細胞分化および生存を制御するシグナル伝達事象、細胞死および免疫学的機能を含む数ある他の因子の中で、本実施例は、上に観察される細胞性代謝の相互接続を試験する。
２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の異なる増殖速度および分化に基づき、我々は、細胞性代謝とＣＡＲシグナル伝達の相互接続の調査を探索した。まず、刺激後異なる時点の２ＣＡＲを発現するＴ細胞の代謝プロファイルを試験した。細胞質量のサロゲートである細胞体積は、同族抗原刺激後同等であることが判明した(図３４Ａ)。抗原刺激前および対数増殖期中の抗原刺激７日および２１日後の２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の酸素消費速度(ＯＣＲ)を測定した。基底ＯＣＲ、その後オリゴマイシン(ＡＴＰ合成阻害剤)、カルボニルシアニド−ｐトリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(ＦＣＣＰ；カップリングしていないイオノフォア)およびロテノンとアンチマイシンＡ(それぞれ電子伝達系の複合体ＩおよびIIIの遮断剤)の連続付加を測定した(van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。ＯＣＲプロファイルは、０日の抗原刺激前同等であった(図３４Ｂ)。抗原刺激後、７日および２１日の両群のＴ細胞で基底ＯＣＲの約１０倍増加があった(図３４Ｃ)。しかしながら、７日および２１日の両方に、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に特異的な最大呼吸器能の強い増加と、続くＦＣＣＰを使用するミトコンドリア膜の分離があった(図３４Ｆ)。対照的に、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の７日および２１日の最大呼吸器能は０日と同等であった。ＯＣＲにおけるこれらの差異が受容体のシグナル伝達ドメインによるものであるかを確認するために、類似の実験をメソセリン特異的ＣＡＲ Ｔ細胞で実施した。メソセリン−ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、メソセリンで刺激７日および２１日後、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、基底および最大呼吸器能上昇を示した(図３９)。細胞外酸性化速度(ＥＣＡＲ)も、解糖中の乳酸産生の測定可能なサロゲートとして測定した。解糖は、乳酸産生をもたらす、一連の酵素触媒反応である。生理的ｐＨで、乳酸は乳酸イオンとＨ＋に解離し、これは細胞外に排出される。ＥＣＡＲレベルは、７日および２１日にＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、２８ｚ細胞で増加した(図３４Ｄおよび３４Ｇ)。
天然中央記憶分化Ｔ細胞が、エフェクター記憶および高分化エフェクター細胞と比較して、基底ＯＣＲおよびＳＲＣが高いことを示すいくつかの報告がある。これらの酸化的特性は、脂肪酸酸化(ＦＡＯ)依存の増加が、中央記憶分化および生存に必要であり得ることを示唆する(Pearce et al., Nature 460, 103-107, 2009; van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。記憶表現型の示差的富化が培養における２ＣＡＲ Ｔ細胞群で見られたため、個々の記憶サブセットがどのようにＣＡＲＴ細胞の代謝性質に貢献するかの発見のために分析を広げた。同様に、ＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯを表現型マーカーとして使用して、集団をＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ＋でソートして、ナイーブ様、Ｔｃｍ細胞およびＴｅｍ細胞亜集団をそれぞれソートした。代謝流量は、２８ｚ ＣＡＲＴ細胞と比較して、ＴｃｍおよびＴｎ記憶サブタイプにおけるＢＢｚの高い基底ＯＣＲおよび最大呼吸器能を確認した(図３４Ｈおよび３４Ｉ)。エフェクター細胞に関する過去の報告で見られたとおり、基底ＯＣＲならびに最大呼吸器レベルは、両ＣＡＲ群についてＴｅｍ細胞亜集団で低いままであった(図３４Ｊ)。他方で、ＥＣＡＲレベルは、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞培養から得られたＴｃｍおよびＴｅｍ細胞の亜集団細胞で高位ままであった(図３４Ｋ)。まとめて、これらの試験は、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と代謝が異なり、前者がＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の中央記憶分化および残留性増強に貢献しているはずである酸化的代謝高い能力を示す。
２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は異なる解糖および脂肪酸代謝を有する
基底ＯＣＲ ｉｎ ＣＡＲ Ｔ細胞の差異が、これらの細胞が生体エネルギー食欲を満たす燃料源を変えるか否かを調査するために、グルコース取り込みおよび脂肪酸利用速度をＣＡＲ Ｔ細胞で試験した。刺激７日後、細胞を新鮮培地に再播種した。異なる時点で(図３４Ｌに示す)、培地の残存グルコースおよび産生された乳酸の量を測定した。２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、グルコースを乳酸産生と共に比較的速い速度で消費した。これは、我々が２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で観察した大きなＥＣＡＲと一致する(図３４Ｇおよび３４Ｋ)。
ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の増加したＯＣＲは、これらの細胞における脂肪酸消費速度の試験へと我々を鼓舞した。重炭素標識長鎖脂肪酸(パルミチン酸)を使用して、その取り込み速度を重炭素標識アセチル−ＣｏＡレベルの測定により分析した。ｂ酸化の異化過程は、ミトコンドリアで脂肪酸分子をアセチル−ＣｏＡに分解し、クエン酸サイクルに給餌する。ＢＢｚは、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して高い標識アセチル−ＣｏＡプールのパーセンテージを示した(図３４Ｍ)。このデータは、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔｃｍ細胞に類似して、生体エネルギー要求を満たすために、ＦＡＯのような異化経路に極めて依存することを示唆する。
異なるＣＡＲシグナル伝達ドメインによりもたらされるこの見識を代謝差異に至る機構への拡大するために、解糖および脂質代謝に関与する候補遺伝子の発現を測定した。グルコース代謝に関与する２つの主要酵素であるＧｌｕｔ１およびＰＤＫ１にまず焦点を絞った。グルコース取り込みに関与するトランスポーターであるＧｌｕｔ１の細胞表面発現を、ＣＤ２８活性化後誘発した(Frauwirth et al., Immunity 16, 769-777, 2002)。低酸素症を含むある状況において、ＰＤＫ１はピルビン酸の脱カルボキシル化およびグルコース誘導体の三カルボン酸(ＴＣＡ)サイクルへの進入を阻害する(Duvel et al., Mol. Cell 39, 171-183, 2010)。Ｇｌｕｔ１およびＰＤＫ１の両方とも、７日目にＢＢｚ細胞と比較して、２８ｚ細胞で有意に高いレベルで誘発される(図３４Ｅ)。Ｇｌｕｔ１およびＰＤＫ１の発現レベル増加は、先に発見したＥＣＡＲ増加と結びつき、ＢＢｚカウンターパートと比較した２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の解糖増強と一致する。
解糖経路のＡＴＰ産生過程中のグルコース分解に関与する二つの重要な酵素は、ホスホグリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(Ｇ６ＰＤ)である。ＰＧＫは、ＡＴＰ産生のためにリン酸基をＡＤＰに伝達し、一方ＮＡＤＰ＋依存性酵素であるＧ６ＰＤは、ペントースリン酸経路(ＰＰＰ)の酸化相を触媒する。これらの酵素が解糖に重要な役割を有することを考慮して、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるこれらの発現レベルを７日日目に調べた。それらのレベルは２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で上昇した。最後に、解糖副生産物、乳酸およびピルビン酸の排出輸送体である溶質輸送体ファミリー１６(ＳＬＣ１６Ａ３)のレベルも試験した。２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＢＢｚ Ｔ細胞と比較してＳＬＣ１６Ａ３ ｍＲＮＡの高いレベルを示し、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、代謝要求を満たす手段として解糖の使用を増加させるとの仮説と合う。低酸素症誘導性因子(ＨＩＦ)の確立された標的であるＶＥＧＦＡの発現増加も２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で検出された。Ｇｌｕｔ１およびＰＦＫを含む、解糖に関与する数遺伝子がＨＩＦ１ａの標的である(Finlay et al., J. Exp. Med. 209, 2441-2453、2012。ＨＩＦ１Ａ−／− Ｔ細胞が自己反応性障害を示すことを示しているものもある(Dang et al., Cell 146, 772-784, 2011)。本実施例で示した知見は、エフェクター分化におけるＣＤ２８および解糖再プログラミングを介する共刺激に関与する増え続ける証拠を追加する。次に、ミトコンドリアＦＡＯと関連する遺伝子を試験した。ＣＤ８＋細胞における酸化的代謝制御におけるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(ＣＰＴ１Ａ)の役割を示す証拠が増え続けている(van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。ＣＰＴ１Ａは、ミトコンドリアＦＡＯの律速段階を制御し、ミトコンドリア新生を促進する代謝酵素である。２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、有意に高いレベルのＣＰＴ１Ａ ｍＲＮＡが、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で観察された。さらに、長鎖脂肪酸取り込み、輸送および代謝に重要な役割を有する脂肪酸結合タンパク質(ＦＡＢＰ５)のｍＲＮＡレベルが、２８ｚと比較してＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で有意に上方制御された(図３４Ｅ)。これらの知見は、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が解糖ベースの代謝に多く依存し、一方ＢＢｚはＴ細胞を、主要エネルギー源として脂肪酸として使用するようにプログラムし、これは、それぞれ天然エフェクターおよび記憶Ｔ細胞の特徴である。
ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞は増加した予備呼吸器能を有する
ミトコンドリア予備呼吸器能(ＳＲＣ)は、細胞性またはミトコンドリアストレスにより、どのように効率的にプロトンがミトコンドリア膜間腔に往復され得るかの指標である(Mookerjee et al., Mech. Ageing Dev. 131, 463-472, 2010; Nicholls, Biochem. Soc. Trans. 37, 1385-1388, 2009)。ＳＲＣは、栄養素枯渇、酸素欠乏または細胞活動条件下を含む、代謝ストレスに曝された細胞の偶発的源を提供することにより記憶Ｔ細胞の生存および機能を増強させる。ＳＲＣ増加は、敵対腫瘍環境におけるＴ細胞機能を支持する可能性がある(Ferrick et al., Drug Discov. Today 13, 268-274, 2008; Nicholls, Biochem. Soc. Trans. 37, 1385-1388, 2009; Yadava and Nicholls, J. Neurosci. 27, 7310-7317, 2007)。記憶ＣＤ８ Ｔ細胞は、エフェクターと異なり、実質的ＳＲＣを維持する(van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。２ＣＡＲ群のＳＲＣを比較したとき、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、刺激後７日目および２１日目に２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して高レベルのＳＲＣを維持することが観察された(図３５Ａ)。これは、長期生存ＣＤ８＋記憶細胞の代謝特徴と一致し、ＢＢｚシグナルが長期生存記憶様Ｔ細胞に貢献する代謝再プログラミングを支持との仮説をさらに支持する。
酸化的代謝におけるミトコンドリア密度の役割を考慮して(van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＳＲＣ増加がミトコンドリア質量増加と関連する可能性を探索した。電子顕微鏡を死油して、７日目に２８ｚおよびＢＢｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞で類似のミトコンドリア密度が測定された(図３５Ｂおよび３５Ｃ)。しかしながら、抗原刺激後１４日(図３５Ｂ)および２１日(図４２)に、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞でミトコンドリアの相当な増加があった。細胞体積が類似するにもかかわらず(図３４Ａ)、ＢＢｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるミトコンドリア密度は有意に(ｐ＜０.００１)増加した。ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が増強されたミトコンドリア含量を有することを確認するために、我々は、ミトコンドリア密度を共焦点顕微鏡も使用して測定した(図３６Ａ)。ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、１４日および２１日に、ミトコンドリア質量対総細胞質量比率の増加を示した(図３６Ｂ)。
ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔはミトコンドリア新生増強を示す
ＣＡＲ構造における４−１ＢＢシグナル伝達ドメインからの特定のシグナルがミトコンドリア新生を支持し、それ故にこれらの細胞がミトコンドリア質量を増加させると考えられた。しかしながら、ミトコンドリア含量の定量的差異に加えて、ミトコンドリアの質的差異がこれらのＣＡＲ細胞間の代謝プロファイルの差異に貢献するか否かを試験した。核およびミトコンドリアゲノムでコードされるあるミトコンドリア遺伝子、すなわち、それぞれミトコンドリア転写因子Ａ(ＴＦＡＭ)およびＭＴＣＯ−１のレベルを試験した。顕著なことに、ＢＢｚ細胞は、ミトコンドリアＴＦＡＭおよびシトクロムｃオキシダーゼ複合体の主サブユニットであるミトコンドリアコードシトクロムｃオキシダーゼ１のｍＲＮＡ発現が有意に増加した(図３６Ｃ)。
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるミトコンドリア機能に対する２８ｚおよびＢＢｚ共刺激ドメインの役割を探索するために、我々は、ミトコンドリア遺伝子の２転写因子、すなわち核呼吸因子１(ＮＲＦ１)およびＧＡ結合タンパク質(ＮＲＦ２としても知られる)の遺伝子発現を測定した。ＮＲＦ１はＴＦＡＭの発現を制御し、ｍｔＤＮＡ複製および発現を強調させ、ＮＲＦ２はＯＸＰＨＯＳ要素転写、ミトコンドリア移入およびＴＦＡＭに役割を有する。代謝流量分析およびミトコンドリア密度で見られたその増強された酸化的特性に一致して、我々は、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞群と比較して、ＮＲＦ１およびＮＲＦ２の発現が有意に高いことを発見した(図３６Ｄ)。
まとめて、これらの知見は、２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるミトコンドリア含量の増加を示唆し、これは、これらの細胞で観察されたＳＲＣ増加と強く相関する。これらの知見は、ＢＢｚシグナル伝達がミトコンドリア新生および酸化的代謝を支持する転写ネットワークを再プログラムするモデルと一致する。Ｔ細胞記憶およびエフェクター機能を可能にするための代謝順応を考慮して、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞における前記酸化的特性は、中央記憶分化およびＴ細胞残留性を支持する可能性が高い。
考察
これらの試験は、ＣＤ２８または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを使用するＣＡＲ Ｔ細胞の分化および代謝プロファイルの有意な差を明らかにする。２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞における支配的代謝プログラムは好気性解糖であり、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞では、脂肪酸の酸化的分解である。本試験は、Ｔ細胞代謝再プログラミングにおける可塑性、さらに、ＣＡＲシグナル伝達ドメインの選択がその後のＴ細胞の運命に影響し得ることの証拠を提供する。本試験で観察された２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞を超えるＢＢｚの増殖および残留性増強は、臨床試験で観察されたＣＡＲ残留性の結果を反映する(Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38, 2013; Brentjens et al., Blood 118, 4817-4828, 2011; Lee et al., Lancet 385, 517-528, 2015; Porter et al., Sci. Transl. Med. 7, 303ra139, 2015)。本試験は、差次的残留性の機序の一つが、記憶細胞の特徴である酸化的リン酸化またはエフェクター細胞の特徴である好気性解糖を増強するＣＡＲＴ細胞の代謝再プログラミングであり得る(MacIver et al., Annu. Rev. Immunol. 31, 259-283, 2013; van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。
先の試験は、ＣＤ２８シグナル伝達がＧｌｕｔ１の表面発現増加および好気性解糖への依存増加に至るカスケードを開始することを示している(Frauwirth et al., Immunity 16, 769-777, 2002)。対照的に、ＴＮＦＲ経路は、ミトコンドリアＦＡＯ開始およびＴ細胞記憶発達に必要である(Pearce et al., Nature 460, 103-107, 2009)。ＩＬ２はＣＤ８＋Ｔ細胞におけるエフェクター分化および解糖を促進するが(Finlay et al., J. Exp. Med. 209, 2441-2453、2012; Liao et al., Immunity 38, 13-25, 2013; Pipkin et al., Immunity 32, 79-90, 2010)、ＩＬ７およびＩＬ１５は記憶Ｔ細胞維持およびミトコンドリア新生と関連付けられている(Ku et al., 2000; Schluns and Lefrancois, 2003; van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。ヒトＣＤ８＋Ｔ生存が外来性サイトカイン存在下で障害されることを考慮して、ＩＬ７およびＩＬ１５は培養系で存在する必要がある。これらの外因性因子はＴ細胞代謝プロファイルの安定化に重要な役割を有するが、本実施例に記載する系は、２つの独特な細胞内ＣＡＲシグナル伝達ドメインに影響される細胞−内因性因子に主に支配されていると仮説立てられた。これは、さらにこれらのサイトカイン受容体の細胞表面発現に差がないことにより実証され、２ＣＡＲ間の代謝再プログラミングにおける相対的再は、単に添加サイトカインが介在するものではないことが示唆され得る。それ故に、本試験は、ＣＡＲにおけるＣＤ２８または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインの異所的発現が、天然Ｔ細胞活性化過程の表現型模写に至ることを示唆する。拡大として、本試験は、種々のシグナル伝達モジュールの取り込みが、Ｔ細胞を、所望のエフェクターまたは制御性機能へ生合成的に再プログラムし得ることを示唆する。例えば、ＣＡＲへのＩＣＯＳシグナル伝達ドメインの取り込みはＴｈ１７細胞分化プログラムを促進することが判明した(Guedan et al., Blood 124, 1070-1080, 2014)。
本知見の一つの臨床的適用は、短期生存または長期生存ＣＡＲ Ｔ細胞が“意図的に”作ることができることである。これは、長期ＣＡＲ効果が腫瘍外毒性の可能性により耐用性ではないかもしれない、ある表面分子に応じて、標的の範囲を広げる。この場合、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインが優れていると予測される。本試験からの他の暗示は、４−１ＢＢおよびＣＤ２８ドメインを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の混合物が、何れかのＣＡＲの単一集団より優れているかもしれないことである。これは、ＣＡＲ Ｔ細胞の組み合わせが、細胞質における好気性解糖が増強されたＣＤ２８ ＣＡＲで達成されるＴエフェクター細胞およびミトコンドリア酸化的リン酸化が増強された４−１ＢＢ ＣＡＲで達成されるＴ記憶細胞の早期優位を含む天然免疫応答をより完全に模倣すると予測されるためである。
細胞内因性因子とは別に、腫瘍微小環境におけるＴ細胞生存の栄養素消費への影響についての理解が相当興味深い。Ｔ細胞は、生存し、エフェクター機能を実施するのに相当な生体エネルギーおよび生合成課題がある。結果は、ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞がミトコンドリア質量を産生するための能力が増加していることである。このミトコンドリア質量の増加は生存優位性を提供する(van der Windt et al., 2013)。高いＳＲＣがＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で一貫して見られ、このミトコンドリア呼吸器能は、天然ＣＤ８＋Ｔ細胞記憶発達の重要な特徴であることが示されている(van der Windt et al., Immunity 36, 68-78, 2012)。ＢＢｚ細胞の基底酸素消費増加も、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖増加に必要な代謝要求に合う、支配的エネルギー産生機構として酸化的リン酸化に優先的に依存する。さらに、データは、代謝がＣＡＲ Ｔ細胞生存の重要なメディエーターであり、ＣＡＲに含まれる共刺激ドメインによるシグナル伝達誘発により影響されることを示唆する。要約すると、これらの結果は、Ｔ細胞エフェクターおよび記憶応答の主要決定因子としてＴ細胞代謝の制御のために改変される、ＣＡＲ Ｔ細胞の新規な役割を明らかにする。合成生物学を使用して、免疫応答を、長期生存記憶細胞および短期生存エフェクター細胞の所望のバランスに形作ることが可能である。拡大として、本試験は、消耗に耐性であるまたは敵対腫瘍および炎症性微小環境で生存が増強された改変Ｔエフェクターまたは改変Ｔ制御性細胞のデザインに影響する。
実施例７：一過性に発現されたＣＡＲによるＴ細胞の活性化および増大
本プロトコールにおいて、Ｔ細胞の完全活性化および強い増大が細胞表面の一過性に発現されたキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)の刺激により達成される。刺激は、抗体の使用ではなく、抗原組み換えタンパク質により行われる。ＣＡＲの抗原特異性は、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)としても知られる抗体フラグメントにより付与される。このｓｃＦｖは、ヒンジによりＴ細胞表面に連結され、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達ドメインに連結される。シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚシグナル伝達尾(第一世代ＣＡＲ)またはＣＤ３ｚに加えてＣＤ２８、４−１ＢＢおよび／またはＩＣＯＳｚの細胞内セグメントであり得る。これは、ＴＣＲが細胞を刺激する必要性を除く。組み換えタンパク質は研究室で製造でき、培養プレート上に被覆されるかまたはマイクロビーズに架橋されて、リンパ球を刺激する。また、ＣＡＲが細胞表面に一過性に発現され、その後単一抗原結合後に内在化されるため、細胞は反復刺激を受けない。このプロトコールは、あらゆるＣＡＲモデルにカスタマイズできる。ＣＡＲ表面密度ならびにｓｃＦｖドメインの親和性を調節することにより、刺激強度を所望のレベルに微調整できる。慣用のＴＣＲ刺激増大プロトコールの警告の切り込みとして、この新規プロトコールは、同等なそして多くの場合、より優れた増殖プロファイルおよび細胞数収量を示す。
ＲＮＡ製造および発現
ＣＡＲのためのインビトロ転写(ＩＶＴ)ＲＮコーディングは、製造業者の指示に従い、先に記載のとおりT7 mScriptＴＭ RNA系(Cellscript, Madison WI)を使用して社内で製造する(Zhao et al., Cancer Res. 70, 9053-9061, 2010)。ＩＶＴ生産物をRNeasy(登録商標)Mini Kit(Qiagen Inc, Valencia, CA)を使用して精製し、精製ＲＮＡを無ＲＮａｓｅ水に溶出する。
細胞表面へのＣＡＲの高発現を得るために、ＩＶＴ ＲＮＡを初代ヒトＴ細胞に電気穿孔する(Zhao et al., Cancer Res. 70, 9053-9061, 2010)。細胞を一夜休息させ、ＣＡＲタンパク質翻訳を可能とした後、ＣＡＲの表面発現をフローサイトメトリーにより試験する。エレクトロポレーションベースの遺伝子伝達技術は９５％＋ＣＡＲ陽性Ｔ細胞を可能にする。
ＣＡＲ Ｔ細胞刺激
ＣＡＲ発現確認後、Ｔ細胞をダイナビーズＭ−４５０(Invitrogen, USA)にカップリングした組み換え抗原タンパク質で刺激する。タンパク質−ビーズカップリングは製造業者のプロトコールに従い実施する。簡潔には、１mLあたり４００ｅ６ビーズを１５０μgのタンパク質と、一夜無菌ホウ酸溶液(０.１Ｍホウ酸、ｐＨ９.５)中でインキュベートする。少なくとも３回洗浄後、これらのビーズを最後にＲ１０培地(１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／mL ペニシリン、１００μg／mL硫酸ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ)に再懸濁する。これらのビーズを、次いでビーズ対細胞比３：１で培地中のＣＡＲ Ｔ細胞刺激に使用する。
培養維持
細胞培養を、ＩＬ２(１００ 単位／mL)またはＩＬ７およびＩＬ１５(各１０ng／mL)を添加した、Ｒ１０培地中７.５×１０５細胞／mLの濃度で開始する。細胞数を４８時間毎に計数し、そのとき新鮮培地を供給し、７.５×１０５細胞／mLで再播種する。この培養を、細胞集団倍加の２連続下降が観察されるまで維持する。
同族抗原とインキュベートされたＣＡＲ Ｔ細胞は、培養においてＴ細胞活性化および増殖のための初期刺激を受ける。異なるＣＡＲ共刺激ドメインの使用は、培養において増大するとき、Ｔ細胞の増殖プロファイルおよび分化に異なる効果を有する。最大９総集団倍加が記録されており、これは、全細胞が５００細胞を超えて複製することに対応する。これらの収量は、伝統的ＣＤ３／２８ベースの刺激系で得られるものと同等であり、ある場合、優れる。
均等物
ここに引用する各々のおよび全ての特許、特許出願および刊行物の発明は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は具体的面を参照して開示しているが、本発明の他の面および改変が、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく、当業者により考案され得る。添付する特許請求の範囲は、このような面および等価な改変物を含むことを意図する。

Claims (72)

  1. 第一キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子をコードする核酸を、ＣＡＲ分子の一過性発現に適する条件下で免疫細胞集団に導入し、それにより第一ＣＡＲ発現細胞集団を産生し、ここで、ＣＡＲ分子は抗体分子の抗原結合ドメインを含んでおり；そして
    第一ＣＡＲ発現細胞集団と同族抗原分子(例えば、組み換え抗原分子)または抗抗原イディオタイプ抗体分子から選択されるＣＡＲ抗原結合ドメインのリガンドを、免疫細胞増大および／または活性化が生じるような条件下で接触させ、それにより増大および／または活性化免疫細胞集団を産生する
    ことを含む、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を増大および／または活性化する方法。
  2. 第一ＣＡＲ発現細胞集団を提供し、該第一ＣＡＲ発現細胞集団は一過性に発現された第一ＣＡＲ分子を含み、該ＣＡＲ分子は抗体分子の抗原結合ドメインを含み；そして
    該ＣＡＲ発現細胞集団と同族抗原分子(例えば、組み換え抗原分子)または抗抗原イディオタイプ抗体分子から選択されるＣＡＲ分子のリガンドを、免疫細胞増大および／または活性化が生じるような条件下接触させ、それにより増大および／または活性化免疫細胞集団を産生する
    ことを含む、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団を増大および／または活性化する方法。
  3. 免疫細胞の集団の増大および／または活性化がインビトロ、エクスビボまたはインビボで実施される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 免疫細胞の集団を、対象(例えば、癌患者)からの血液サンプルから、例えば、アフェレーシスにより獲得する、例えば得る、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
  5. 免疫細胞の集団がＴ細胞(例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞)、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞、骨髄由来貪食細胞またはこれらの組み合わせから選択される免疫エフェクター細胞を含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
  6. 免疫細胞の集団が、初代Ｔ細胞またはアネルギー化Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、Ｔ制御性細胞、Ｔｈ−１７細胞、幹Ｔ細胞またはこれらの組み合わせから選択されるリンパ球のサブセットを含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
  7. 免疫細胞の集団が末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、臍帯血細胞またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
  8. 免疫細胞の集団が、低レベルの機能的Ｔ細胞受容体を発現するか、実質的に障害された機能的Ｔ細胞受容体を発現するかまたは機能的Ｔ細胞受容体を有しない細胞を含む、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
  9. リガンドが同族抗原分子である、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
  10. リガンドが抗抗原イディオタイプ抗体分子である、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
  11. ＣＡＲ分子のリガンドが天然に存在しない基質、例えば、基質表面に、固定化または結合される、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
  12. 天然に存在しない基質がプレート、膜、マトリックス、チップまたはビーズ(例えば、磁気ビーズ)から選択される固形支持体である、請求項１１に記載の方法。
  13. ＣＡＲ分子のリガンドが、細胞の表面、例えば、その表面に異種同族抗原を発現する細胞の表面に存在する、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
  14. Ｔ細胞が、例えば、リンパ節注射または腫瘍への腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)の注射によりインビボで増大される、請求項１３に記載の方法。
  15. 第一ＣＡＲをコードする核酸分子がＲＮＡ分子、例えば、インビトロ転写(ＩＶＴ)ＲＮＡである、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。
  16. 第一ＣＡＲ分子が、限られた時間または細胞複製数、例えば、５０日未満(例えば、４０日、３０日、２５日、２０日、１５日、１０日、５日以下)で免疫細胞集団に一過性に発現される、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
  17. 第一ＣＡＲ分子が単一リガンド(例えば、抗原)刺激後内在化される、請求項１〜１６の何れかに記載の方法。
  18. 免疫細胞がリガンド(例えば、抗原)の反復刺激を受けない、請求項１〜１６の何れかに記載の方法。
  19. 免疫細胞刺激の強度が、第一ＣＡＲ表面密度またはリガンドに対するＣＡＲ抗原結合ドメインの親和性の一方または両方の調節により所望のレベルにカスタマイズされる、請求項１〜１６の何れかに記載の方法。
  20. 第一ＣＡＲ発現免疫細胞が、ＣＡＲ分子のリガンド存在下、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間、２２時間、２３時間または２４時間または約１日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日または５０日間、培養される、請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
  21. 第一ＣＡＲ発現細胞が、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間、培養される、請求項２０に記載の方法。
  22. ＣＡＲ発現細胞が少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２またはそれ以上の集団倍加(例えば、計８〜１０または約９集団倍加)を示す、請求項１〜２１の何れかに記載の方法。
  23. 第一ＣＡＲ発現免疫細胞集団が計４００〜６００または約５００細胞まで増大し、ここで、細胞増大をリガンド刺激の１０〜２５日後に測定する、請求項１〜２１の何れかに記載の方法。
  24. 増大および／または活性化免疫細胞集団があまり分化していない表現型を有する免疫エフェクター細胞、例えば、より若い細胞、例えば、より若いＴ細胞を含む、請求項１〜２３の何れかに記載の方法。
  25. より若いＴ細胞がナイーブＴ細胞(ＴＮ)、記憶幹細胞(ＴＳＣＭ)、中央記憶Ｔ細胞(ＴＣＭ)またはこれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 増大および／または活性化免疫細胞集団と第二ＣＡＲ分子をコードする核酸をさらに接触させ、それにより第二ＣＡＲ発現細胞集団を産生する、請求項１〜２５の何れかに記載の方法。
  27. 第二ＣＡＲ分子をコードする核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子が同じ抗原、例えば、同じ癌関連抗原または異なる抗原、例えば、異なる癌関連抗原に指向される、請求項１〜２７の何れかに記載の方法。
  29. 癌関連抗原がＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソセリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ〜４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ〜１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５またはＩＧＬＬ１から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 癌関連抗原がＣＤ１９である、請求項２８に記載の方法。
  31. 第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子が同じまたは異なるＣＡＲ分子である、請求項１〜３０の何れかに記載の方法。
  32. 第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子が互いに独立してＣＤ１９ ＣＡＲ、ＢＣＭＡ ＣＡＲ、ＣＤ３３ ＣＡＲ、ＣＬＬ−１ ＣＡＲ、ＥＧＦＲｖIII ＣＡＲ、ＧＦＲアルファ４ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲまたはこれらの何れかの組み合わせである、請求項１〜３１の何れかに記載の方法。
  33. 第一ＣＡＲを一過性に発現する免疫細胞集団がインビトロまたはエクスビボで増大および／または活性化され、第二ＣＡＲを発現する免疫細胞集団が治療プロトコールの一部として対象に投与される、請求項１〜３２の何れかに記載の方法。
  34. 第一ＣＡＲを一過性に発現する免疫細胞集団が、該免疫細胞集団を、癌関連抗原またはＣＡＲ結合抗体分子(例えば、ここに記載する非細胞性または細胞性基質に固定化されたＣＤ１９抗原または抗ＣＤ１９イディオタイプ抗体)に対する抗抗原イディオタイプ抗体と接触させることによりインビトロまたはエクスビボで増大および／または活性化される、請求項３３に記載の方法。
  35. 増大および／または活性化免疫細胞集団を適切な増大期間の後保存する、例えば、増大および／または活性化免疫細胞集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１〜３４の何れかに記載の方法。
  36. 対象に請求項１〜３５の何れかに記載の増大および／または活性化免疫細胞集団を、単独でまたはさらなる治療と組み合わせて投与し、それにより対象における抗腫瘍免疫を処理または提供することを含む、対象における癌を処置するまたは抗腫瘍免疫を該対象に提供する、方法。
  37. 癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を該対象に提供する方法において使用するための請求項１〜３５の何れかに記載の方法により産生された第一および／または第二ＣＡＲ分子を発現する増大および／または活性化免疫細胞集団であって、該該増大および／または活性化免疫細胞集団を対象に単独でまたはさらなる治療と組み合わせて投与する、細胞集団。
  38. 対象に第一ＣＡＲ分子および第二ＣＡＲ分子を発現する免疫細胞集団の有効量を同時にまたは逐次的に投与することを含み、ここで、第一ＣＡＲ分子が一過性に発現され、第二ＣＡＲ分子が安定して発現される、
    癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を該対象に提供する方法。
  39. 対象に第二ＣＡＲ分子を発現する免疫細胞集団の有効量を投与することを含み、ここで、免疫細胞集団は予め第一ＣＡＲ分子を一過性に発現する免疫細胞集団のインビトロまたはエクスビボでの増大および／または活性化により得られており、該第一ＣＡＲ分子は抗体分子の抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインを含む、
    癌を有する対象を処置するまたは抗腫瘍免疫を該対象に提供する方法。
  40. インビトロまたはエクスビボ免疫細胞集団の増大および／または活性化が、該免疫細胞集団と、第一ＣＡＲ分子により認識される癌関連抗原または第一ＣＡＲ結合ドメインに対する抗抗原イディオタイプ抗体の接触を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 癌関連抗原またはＣＡＲ分子の結合ドメインに対する抗抗原イディオタイプ抗体が非細胞性、例えば、ビーズ(例えば、磁気ビーズ)に固定化される、請求項４０に記載の方法。
  42. 第二ＣＡＲ発現細胞集団がＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される第二ＣＡＲ分子をコードする核酸を含む、請求項３６〜４１の何れかに記載の方法。
  43. 第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子が同じまたは異なる癌関連抗原に指向される、請求項３６〜４２の何れかに記載の方法。
  44. 癌関連抗原がＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソセリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ〜４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡIX、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ〜１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５またはＩＧＬＬ１から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子が同じＣＡＲ分子であるまたは異なるＣＡＲ分子である、請求項３６〜４４の何れかに記載の方法。
  46. 第一および／または第二ＣＡＲ分子が各々独立してＣＤ１９ ＣＡＲ、ＢＣＭＡ ＣＡＲ、ＣＤ３３ ＣＡＲ、ＣＬＬ−１ ＣＡＲ、ＥＧＦＲｖIII ＣＡＲ、ＧＦＲアルファ４ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲから選択されるまたはこれらの何れかの組み合わせである、請求項４５に記載の方法。
  47. 第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子がそれぞれメソセリンＣＡＲおよびＣＤ１９ ＣＡＲ分子である、請求項４５に記載の方法。
  48. 第一および／または第二ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞がＣＤ１９ ＣＡＲ、ＢＣＭＡ ＣＡＲ、ＣＤ３３ ＣＡＲ、ＣＬＬ−１ ＣＡＲ、ＥＧＦＲｖIII ＣＡＲ、ＧＦＲアルファ４ ＣＡＲ、ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲ、ＣＤ１２３ ＣＡＲ、ＣＤ１０ ＣＡＲ、ＣＤ３４ ＣＡＲ、ＦＬＴ−３ ＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ ＣＡＲ、ＣＤ１７９ｂ ＣＡＲ、メソセリンＣＡＲまたはＣＤ７９ａ ＣＡＲを含む、請求項１〜４７に記載の方法。
  49. 第一および／または第二ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞がＣＤ１９ ＣＡＲを含む、請求項１〜４８の何れかに記載の方法。
  50. ＣＤ１９ ＣＡＲが表１または表４の配列を含む、請求項１〜４９の何れかに記載の方法。
  51. ＣＤ１９ ＣＡＲがＣＴＬ０１９の抗原結合ドメインのアミノ酸配列、例えば、配列番号５１またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５０の何れかに記載の方法。
  52. ＣＤ１９ ＣＡＲがＣＴＬ０１９のアミノ酸配列、例えば、配列番号８９(シグナル配列を含む)またはシグナル配列がない配列またはそれらに実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５１の何れかに記載の方法。
  53. 免疫エフェクター細胞集団における免疫エフェクター細胞の少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が細胞表面に第一および／または第二ＣＡＲ分子を発現する、請求項１〜５２の何れかに記載の方法。
  54. 免疫エフェクター細胞が取得された対象および／または処置する対象がヒト癌患者である、請求項１〜５３の何れかに記載の方法。
  55. 癌がＢ細胞急性リンパ性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、Ｂ細胞前骨髄球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症の１以上から選択される血液癌である、請求項１〜５４の何れかに記載の方法。
  56. 免疫エフェクター細胞の集団が白血病、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)またはリンパ腫、例えば、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)から選択される血液癌を有する対象に由来する、請求項１〜５５の何れかに記載の方法。
  57. 細胞の集団がサイトカイン、例えば、ＩＬ２またはＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下で増大される、請求項１〜５６の何れかに記載の方法。
  58. さらにＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を免疫細胞集団から除去し、それによりＴ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞を提供することを含む、請求項１〜５７の何れかに記載の方法。
  59. Ｔ制御性枯渇細胞の集団がＣＤ２５＋細胞を３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 取得された免疫エフェクター細胞集団が癌を有する対象、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)のような、例えば、ＣＤ２５発現癌を有する対象の細胞である、請求項１〜５９の何れかに記載の方法。
  61. Ｔ制御性枯渇細胞の集団が、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の白血病細胞、例えば、ＣＬＬ細胞、ＡＬＬ細胞またはリンパ腫細胞、例えば、ＭＣＬ細胞、ＨＬ細胞を含む、請求項５９に記載の方法。
  62. さらに免疫エフェクター細胞集団から腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去し、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含む、請求項１〜６１の何れかに記載の方法。
  63. さらに獲得免疫エフェクター細胞集団からチェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上を発現する細胞を除去し、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することを含む、請求項１〜６２の何れかに記載の方法。
  64. 取得した免疫エフェクター細胞集団が１以上のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現に基づき選択される、例えば、提供される免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の集団がＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である、請求項１〜６２の何れかに記載の方法。
  65. さらにＴ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞を、例えば、ここに記載する方法で活性化することを含む、請求項１〜６４の何れかに記載の方法。
  66. さらにＴ制御性枯渇細胞の集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞の集団からの細胞にＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入することを含む、請求項１〜６５の何れかに記載の方法。
  67. さらに、例えば、ＣＡＲ、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように改変された、Ｔ制御性枯渇細胞の集団を、例えば、ここに記載する方法により増大することを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 細胞の集団が８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増大される、請求項６７に記載の方法。
  69. 免疫細胞の集団が適切な増大期間後凍結保存される、請求項１〜６８の何れかに記載の方法。
  70. さらに免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸の接触を含む、請求項１〜６９の何れかに記載の方法。
  71. ここに記載する方法の何れかにより製造した免疫エフェクター細胞の集団を含む、免疫細胞調製物または反応混合物。
  72. 第一ＣＡＲと第二ＣＡＲ分子を、同時にまたは逐次的に発現し、ここで、第一ＣＡＲ分子が一過性に発現され、第二ＣＡＲ分子が安定して発現される、免疫エフェクター細胞調製物または反応混合物。
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