CN115612673A - 一种改善car-t细胞群的持久性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学领域，特别是涉及一种利用太空环境或模拟微重力环境改善CAR‑T细胞群（尤其是靶向前列腺癌特异性膜抗原PSMA的CAR‑T细胞群）的持久性的方法、及通过所述方法获得的CAR‑T细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种改善CAR-T细胞群的持久性的方法
技术领域
本发明涉及医学领域，特别是涉及一种利用太空环境或模拟微重力环境改善CAR-T细胞群（尤其是靶向前列腺癌特异性膜抗原PSMA 的CAR-T细胞群）的持久性的方法、及通过所述方法获得的CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的肿瘤之一。传统的前列腺癌治疗方法包括根治性前列腺切除、放疗、化疗和雄激素剥夺疗法。这些疗法虽然具有一定疗效，但对大部分患者的病情缓解作用仍十分有限。因此，对前列腺癌患者的治疗是长期以来未满足的医疗需求。
CAR是一种合成分子，由细胞外肿瘤抗原结合结构域、以及与之相连的铰链、跨膜和细胞内信号结构域组成，其通过特异性识别肿瘤细胞上表达的表面蛋白，诱导针对肿瘤细胞的T细胞反应，以根除肿瘤。表达CAR的T细胞（即，CAR-T细胞）可以通过CAR多肽胞外结构域的单链可变片段（single chain variable fragment, scFv）直接识别肿瘤相关抗原,然后被胞内信号转导激活,释放多种细胞因子、穿孔素、颗粒酶、干扰素等, 诱导肿瘤细胞凋亡。
与前列腺癌相关的一个抗原是前列腺特异性膜抗原 (PSMA)，其是一种已被充分描述的肿瘤相关抗原。 已经报道，PSMA 表达水平在正常和癌性前列腺组织之间存在显著区别。因此，PSMA被提出作为CAR-T细胞的一个理想靶抗原。该靶点的选择在一定程度上改进了基于 CAR 的疗法在前列腺癌治疗中的疗效。但已有的临床前和临床证据表明，CAR-T细胞易衰竭，持久性差，这限制了该免疫疗法的有效性。参见例如，doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-0436，“Targeted Elimination of Prostate Cancer by GeneticallyDirected Human T Lymphocytes”， 2005；和Robbins PF等，Cutting Edge: Persistenceof Transferred Lymphocyte Clonotypes Correlates With Cancer Regression inPatients Receiving Cell Transfer Therapy. J Immunol (2004) 173:7125–30. doi:10.4049/jimmunol.173.12.7125。
既往的研究已经指出，太空微重力环境能够影响生物的许多特征，例如生长速率、细胞形态、细胞代谢水平。因此，已经提出应用太空环境或模拟的微重力环境来开发新物种和新医药产品。然而，尚未有太空环境或模拟的微重力环境在CAR-T细胞上应用和相关应用效果的任何报道。
发明内容
干细胞样记忆性T细胞(stem like memory T cells, Tscm)和中央记忆T细胞(central memory T cells, Tcm)具有抗原特异性记忆、接触抗原后自我更新、和体内长期存活等特点。已经报道CAR-T细胞群中Tscm和Tcm记忆细胞亚群与CAR-T细胞的体内持久性相关，并提出增加Tscm和Tcm记忆细胞亚群比例在CAR-T细胞的临床应用中价值。参见，Chimeric antigen receptor T cell persistence and memory cell formation，Immunology & Cell Biology 2019; 97: 664–674。本发明人在探索太空环境对CAR-T细胞的细胞表型/功能的影响过程中，令人惊奇地发现，太空环境可以有效地促进靶向前列腺癌特异性膜抗原PSM的CAR-T细胞群中Tscm/Tcm样细胞亚群的占比，增强CAR-T细胞的持久性。考虑到太空环境干扰/降低宇航员免疫功能或来自其的淋巴细胞的免疫功能的已有报道，本发明人的上述发现是尤其令人惊奇的。
因此，在第一个方面，本发明提供了一种改善CAR-T细胞群（尤其是，靶向前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)的CAR-T细胞群）的持久性的方法，所述方法包括：在太空环境或模拟微重力环境中维持所述CAR-T细胞群，由此，相比于未接受所述处理的对照CAR-T细胞群，获得具有增加持久性的CAR-T细胞群（CAR-T-S细胞群）。在本文中，经太空环境或模拟微重力环境处理的CAR-T细胞群也简称“CAR-T-S细胞”，或在靶抗原为PSMA时，称作 “PSMA-CAR-T-S细胞群”。
在第二方面，本发明提供了一种增加CAR-T细胞群中的Tscm和/或Tcm比例或两者比例之和的方法，包括，
(a) 获得包含并表达嵌合抗原受体(CAR)多肽的CAR-T细胞群；
(b) 在太空环境或模拟微重力环境中维持所述CAR-T细胞群，
由此，相比于未接受所述处理的对照CAR-T细胞群，获得具有增加的Tscm和/或Tcm比例的CAR-T细胞群（CAR-T-S细胞群）。在一些实施方案中，除步骤(b)外，所述方法的其余步骤均在正常重力环境(即，具有地球等同重力的环境)中进行。
在第三方面，本发明也提供太空环境或模拟微重力用于改善CAR-T细胞群的持久性的用途、用于增加CAR-T细胞群的Tscm和/或Tcm比例或两者比例之和的用途、或用于提高CAR-T细胞群的存活率和/或逆转或延迟T细胞耗竭的用途。
在上述本发明方法或用途的一些实施方案中，优选地，通过轨道太空飞行，实现在太空环境中维持所述CAR-T细胞群。
在第四方面，本发明提供了通过本发明方法获得的CAR-T-S细胞群(尤其是，PSMA-CAR-T-S细胞群)。在一些实施方案中，所述CAR-T-S细胞群，相比于未接受太空环境或模拟微重力环境处理的对照CAR-T细胞群，具有增加的持久性。在一些实施方案中，所述CAR-T-S细胞群，相比于所述对照CAR-T细胞群，具有增加的Tscm比例和/或Tcm比例或两者比例之和。在一些实施方案中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群在靶抗原PSMA刺激下产生降低的IFNγ量。在一些实施方案中，通过细胞周期检测，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群具有更多处于细胞分裂期（S期）的细胞。在一些实施方案中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群具有提高的存活率；和/或延迟或逆转的T细胞耗竭。
在第五方面，本发明也提供了通过本发明方法获得的CAR-T-S细胞群在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。在一些实施方案中，所述CAR-T细胞群是靶向PSMA的CAR-T细胞群，且所述肿瘤为前列腺癌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示，在PSMA-CAR-T细胞与PSMA-CAR-T-S细胞分别与靶细胞培养七天后，用于检测T细胞亚群的细胞分选设门步骤。图a-f的每一小图中显示的水平黑色箭头，指示了其所对应的分选框（a-d：黑色框；e: Q4-1框；f: Q1-6框）中的细胞亚群用于下一分选步骤；图g的小图中显示了对应于Tscm细胞的分选框。
图2显示，流式细胞术分析PSMA-CAR-T细胞群中的T细胞亚群占比。上方图显示，在未经太空处理的地面对照PSMA-CAR-T细胞群中， CD3+ Tcm细胞亚群(CD45RO+ CCR7+)的占比为1.4%；且CD3+ Tscm细胞亚群(CD45RO- CCR7+ CD95+ CD27+)的占比为0.2%。下方图显示，在该对照PSMA-CAR-T细胞群中， CD3+ CD8+ Tcm细胞亚群的占比为1.0%；且CD3+ CD8+ Tscm细胞亚群的占比为0.3%。
图3显示，流式细胞术分析PSMA-CAR-T-S细胞群中的T细胞亚群占比。上方图显示，在经太空处理的PSMA-CAR-T-S细胞群中， CD3+ Tcm细胞亚群的占比为3.3%；且CD3+ Tscm细胞亚群的占比为0.5%。下方图显示，在该PSMA-CAR-T-S细胞群中，CD3+ CD8+ Tcm细胞亚群的占比为2.8%；且CD3+ CD8+ Tscm细胞亚群的占比为1.1%。
图4显示，PSMA-CAR-T-S细胞群与PSMA-CAR-T细胞群相比，在CD3+ T细胞亚群中以及在CD3+ CD8+ T细胞亚群中均具有增加的Tscm和Tcm比例之和。
图5显示，在接触靶抗原PSMA后，通过细胞周期测定，PSMA-CAR-T-S细胞群与PSMA-CAR-T细胞群中处于S期的细胞比例。
图6显示，与阴性对照相比，PSMA-CAR-T-S细胞群与PSMA-CAR-T细胞群在接触靶抗原(表达PSMA的K562细胞)后的细胞因子IFNγ分泌。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
定义
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中，“太空环境”也称作“空间环境”是指，由轨道太空飞行提供的太空环境。
在本文中，“微重力环境”也称作“零重力环境”是指，在重力作用下，系统表观重量远小于其实际重量的环境。已经开发了模拟微重力的地面设施，包括，快速旋转回转器(FRC)、旋转壁式容器(RWV)或随机定位机(RPM)等设备。
术语“嵌合受体”、“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中可互换使用，是指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及胞内信号结构域的重组多肽。在本文中，以小写字母“car”表示编码嵌合抗原受体的核酸。
术语CAR-T细胞是指包含且在细胞表面表达CAR的T细胞。在本文中，表述“PSMA-CAR-T-S”细胞或细胞群是指，经过太空环境或模拟微重力环境处理的靶向前列腺癌特异性膜抗原PSMA的CAR-T细胞或细胞群。在本文中，除非另行特别说明，否则“CAR-T细胞”与“CAR-T细胞群”可互换使用，“CAR-T-S细胞”与“CAR-T-S细胞群”可互换使用，是指包含多种T细胞亚群(例如，但不限于Tscm和Tcm)的CAR-T细胞群体。
术语“刺激分子”指由T细胞表达的分子，所述分子提供初级胞质信号传导序列，所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中，初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CAR的胞质结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3ζ的信号传导序列。
术语“CD3ζ”定义为UniProtKB - P20963登录号下提供的蛋白质或其等同物。在本文中，“CD3ζ信号传导结构域”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基区段，所述氨基酸残基区段足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个实施方案中，CD3ζ的胞质结构域包含UniProtKB - P20963登录号下氨基酸序列的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“共刺激分子”是指细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中，“共刺激分子”是CD28、4-1BB(即CD137)。在本文中，“共刺激结构域”是指共刺激分子的胞内部分。
术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，也称作CD137, 所述成员具有在UniProtKB -Q070113登录号下提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本文中，术语“4-1BB共刺激结构域”定义为来自4-1BB的胞质区，例如，UniProtKB- Q07011的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“CD28”是指在UniProtKB - P10747登录号下提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本文中，术语“CD28共刺激结构域”定义为来自CD28的胞质区，例如，UniProtKB - P10747的氨基酸残基180-220或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本文中，术语“CD28跨膜结构域”定义为来自CD28的跨膜区，例如，UniProtKB - P10747的氨基酸残基153-179或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“CD8”是指在UniProtKB -P01732登录号下提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本文中，术语“CD8铰链区”定义为来自CD8的跨膜区，例如，UniProtKB - P01732的氨基酸残基117-178或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。可用于CAR的CD8铰链区也参见EP3115373A1中的描述，此文献在此整体并入作为参考。
在本文中，术语“重组”，当涉及例如病毒或细胞或核酸或蛋白或载体时，指所述病毒、细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白、或通过改变自身已有的天然核酸或蛋白而被修饰、或指来自于由此修饰的病毒或细胞的物质。因此，在本发明中在哺乳动物细胞中引入的外源CAR编码核酸为重组核酸，引入了该核酸的宿主细胞为重组细胞。
描述核酸或蛋白质时所用的术语“外源的”或“异源的”可互换使用，是指相对于包含或待包含所述核酸或蛋白质的宿主细胞而言，该核酸或蛋白质是外来的，即其在所述宿主细胞中的存在位置并不是其在自然情况下的天然存在位置。异源核酸序列也指衍生自并引入（例如通过病毒载体感染而引入）相同宿主细胞或受试者而由此以非天然状态存在的序列，例如，所述序列位于不同的位置、以不同的拷贝数存在，或处于不同调控元件的控制下。
术语“表达盒”是指，编码并能够表达一个或多个目的基因(例如本发明CAR多肽)的DNA序列。在表达盒中，通常，编码目的基因的异源多核苷酸序列与表达控制序列功能性连接。例如，为实现CAR在引入的宿主细胞中的有效表达，在一些实施方案中，可以将编码CAR的核酸置于合适的表达盒中，与表达控制序列功能性连接。
术语“功能性连接”也称作“有效连接”，意指指定的各组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系中。
在本文中，术语 “连接子”或“连接肽”或“接头”可互换使用，是指由氨基酸组成的短氨基酸序列，例如单独或组合使用的丙氨酸(A)、甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)。在一个实施方案中，连接肽具有1-50个氨基酸长度，例如，1, 2, 3, 4, 5个氨基酸，或10,15,20,25,30个氨基酸长度。可以用于本发明CAR融合多肽的各组件之间的连接肽并不特定限制。可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构来合理地设计合适的连接肽。例如，短寡肽接头或多肽接头可以根据需要，在组件序列之间形成键接，例如，甘氨酸-丝氨酸双联体，或单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸可以用作接头。
术语“氨基酸变化”和“氨基酸修饰”可互换地使用，是指氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰。可以进行氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰的任意组合，条件是最终的多肽序列具有所需的特性。在一些实施方案中，氨基酸的取代是非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物（例如、4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸）的取代。例如，在一些实施方案中，可以考虑在本发明的CAR分子中引入氨基酸变化或氨基酸修饰并保留其所需的功能，这样的氨基酸变化或氨基酸修饰可以是非保守氨基酸取代，但在一些情况下，优选为保守氨基酸修饰或保守氨基酸变化。
术语“保守序列修饰”、 “保守序列变化”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的亲本多肽或其组成元件的特征的氨基酸修饰或变化。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的CAR多肽或其组成元件中引入保守修饰，尤其是保守性取代。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
氨基酸序列/核苷酸序列的“同一性百分数(%)”是指，将候选序列与所述及的具体氨基酸/核苷酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，且在氨基酸序列的情况下，不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与所述及的具体氨基酸/核苷酸序列的氨基酸残基/核苷酸残基相同的氨基酸/核苷酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明CAR多肽或核酸分子或其组成元件的变体，所述变体相对于所述及的具体CAR多肽或核酸分子或其组成元件的序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80%,85%,90%,95%, 97%, 98%或99%或更高。所述变体可以包含保守性修饰。根据本发明的目的，同一性百分数应用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov上公众可得的BLAST工具，采用默认参数进行确定。
在本文中，表述“变体”或“功能性变体”多肽或蛋白是指，所述的多肽或蛋白，与参照多肽或蛋白相比，具有实质上相同的序列或显著的序列同一性、并保持参照多肽或蛋白的期望生物学活性。
在本文中当谈及核酸时使用的术语“载体(vector)”是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453–1464(2009) 中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子，例如，包括但不限于，来自Oxford BioMedica的LENTIVECTOR®基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX™载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。在本发明的一些实施方案中，通过构建包含本发明CAR编码核酸的慢病毒表达载体，并将其引入宿主免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)等中，以产生本发明的CAR-T细胞。
术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/β T细胞和γ/δ T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“抗肿瘤免疫”是指，可以通过多种手段展示如下免疫学效果，包括但不限于例如，引起肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
以下对本发明的多个方面分别进行描述。但应理解，这些描述仅是举例说明性的，而不应为对本发明的范围构成限制。
本发明的方法和用途
为了研究太空环境对基因构建的嵌合性抗原受体T 细胞（CAR-T）细胞功能的影响，本发明人比较了经过在太空停留三天的基因工程改造的靶向前列腺癌特异性膜抗原PSMA-CAR-T-S细胞和地面的同类细胞PSMA-CAR-T细胞, 结果首次在体外发现前者PSMA-CAR-T-S 保持更年轻和持久的细胞表型（Tscm和Tcm）。进一步，通过细胞周期检测，也发现PSMA-CAR-T-S有更多的细胞处于细胞分裂期（S期）。与靶抗原阳性的肿瘤细胞（K562-PSMA）培养后, PSMA-CAR-T-S与PSMA-CAR-T细胞在刺激下均产生更多的IFNγ释放，然而PSMA-CAR-T-S产生的IFNγ较少。这些实验结果证明了PSMA-CAR-T-S细胞处于更年轻和持久的状态。
效应CD8+ T细胞（TEFF）是体内抗肿瘤免疫和抗感染免疫的主要效应细胞。但肿瘤浸润效应CD8+T细胞易于凋亡，而肿瘤是一种慢性疾病，因此单纯依靠效应CD8+T细胞往往不足以诱导肿瘤消除，需要长期存活的记忆CD8+T细胞来维持持续的抗肿瘤免疫。
中枢记忆T细胞(Central memory T Cell，Tcm)和干细胞样记忆T细胞（Stem cellmemory T cell，Tscm）是低分化的，且具有自我更新能力的T细胞亚群；在体内的存活时间长，具有持久性。在和抗原再相遇时，Tcm细胞能够自我更新并分化为效应记忆T细胞(TEM)和效应T细胞(TEFF)；Tscm细胞能够在淋巴结中自我更新并分化为Tcm、TEM和TEFF。多项研究已经表明，相比效应记忆T细胞(TEM)和效应T细胞(TEFF)，干细胞样记忆T细胞(Tscm)和中央记忆T细胞(Tcm)细胞显示出体内持久性和更强的抗肿瘤免疫性。
在本文中，因此，与CAR-T细胞群相关的表述“持久性”，可以由所述CAR-T细胞群中的记忆细胞Tscm和/或Tcm亚群的比例来表征，或由Tscm亚群和Tcm亚群比例之和来表征。当提及根据本发明PSMA-CAR-T-S细胞或细胞群具有改善的“持久性”时，应当理解是指，相比于未经太空环境或模拟微重力环境处理的相应对照PSMA-CAR-T细胞或细胞群，根据本发明PSMA-CAR-T-S细胞群具有更高的记忆细胞Tscm和/或Tcm亚群比例，或更高的Tscm亚群和Tcm亚群比例之和。在一些实施方案中，可以按照实施例中所述的流式细胞术测定方法，确定在与表达PSMA靶抗原的肿瘤细胞接触后，CAR-T细胞群的CD3和/或CD8亚群中Tscm和Tcm亚群的比例，并由此确定所述CAR-T细胞群的“持久性”。在再一些实施方案中，可以进一步按照实施例中所述的细胞周期测定方法，确定所述CAR-T细胞群的S期细胞占比；和/或进一步按照实施例中所述的细胞因子测定方法，测定所述CAR-T细胞群的IFNγ分泌，以进一步表征所述CAR-T细胞的持久性。
因此，在第一个方面，本发明提供了一种改善CAR-T细胞群（尤其是，靶向前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)的CAR-T细胞群）的持久性的方法，所述方法包括：在太空环境或模拟微重力环境中维持所述CAR-T细胞群，由此，相比于未接受所述处理的对照CAR-T细胞群，获得具有增加持久性的CAR-T细胞群（CAR-T-S细胞群）。在本文中，经太空环境或模拟微重力环境处理的CAR-T细胞群也简称“CAR-T-S细胞”，或在靶抗原为PSMA时，称作 “PSMA-CAR-T-S细胞”。
在一个实施方案中，所述方法包括：将所述CAR-T细胞群置于太空环境或模拟微重力环境下，并维持足以增加CAR-T细胞群中Tscm和/或Tcm比例的时间，由此增加所述CAR-T细胞的持久性。在一个实施方案中，所述方法包括：在太空环境或模拟微重力环境下，维持所述CAR-T细胞群至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时，例如，大约1-5天，例如大约3天。
在一个实施方案中，通过本发明方法获得的CAR-T-S细胞群，相比于所述对照CAR-T细胞群，在接触靶抗原后，具有增加的Tscm比例和/或Tcm比例，优选地，具有增加的Tscm和Tcm比例之和，其中优选地，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述Tscm和TCM比例之和增加至少0.5倍、0.8倍、1倍、1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、或3倍。在一些实施方案中，所述Tscm和所述Tcm是CD3+ T细胞。在另一些实施方案中，所述TSCM和所述Tcm是CD3+CD8+ T细胞。
在一个实施方案中，所述CAR-T细胞群的CAR-T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中所述嵌合抗原受体多肽从N端到C端包含：胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、和胞内信号传导结构域，优选地，其中所述嵌合抗原受体多肽从N端到C端包含：任选地信号肽，特异性结合前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)的单链scFv抗体，CD28跨膜结构域，CD28和/或4-1BB共刺激结构域，和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述方法还包括：在CAR-T-S细胞群接触靶抗原后，通过流式细胞术检测CAR-T-S细胞群中的Tscm和Tcm细胞亚群比例。优选地，按照图1所示的细胞设门步骤，进行所述流式细胞术检测。
在第二方面，本发明提供了一种增加CAR-T细胞群中的Tscm和/或Tcm比例或两者比例之和的方法，包括，
(a) 获得包含并表达嵌合抗原受体(CAR)多肽的CAR-T细胞群；
(b) 在太空环境或模拟微重力环境中维持所述CAR-T细胞群，
由此，相比于未接受所述处理的对照CAR-T细胞群，获得具有增加Tscm和/或Tcm比例的CAR-T细胞群（CAR-T-S细胞群）。在一些实施方案中，除步骤(b)外，所述方法的其余步骤均在正常重力环境(即，具有地球等同重力的环境)中进行。
在一个实施方案中，所述方法包括：将所述CAR-T细胞群置于太空环境或模拟微重力环境下，并维持足以增加CAR-T细胞群中Tscm和/或Tcm比例的时间，由此获得具有增加的持久性的CAR-T-S细胞群。在一个实施方案中，所述方法包括：在太空环境或模拟微重力环境下，维持所述CAR-T细胞群至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时，例如，大约1-5天，例如大约3天。
在一个实施方案中，通过本发明方法获得的CAR-T-S细胞群，相比于所述对照CAR-T细胞群，在接触靶抗原后，具有增加的Tscm比例和/或Tcm比例，优选地，具有增加的Tscm和Tcm比例之和，其中优选地，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述Tscm和TCM比例之和增加至少0.5倍、0.8倍、1倍、1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、或3倍。在一些实施方案中，所述Tscm和所述Tcm是CD3+ T细胞。在另一些实施方案中，所述TSCM和所述Tcm是CD3+CD8+ T细胞。
在一个实施方案中，所述CAR-T细胞群的CAR-T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中所述嵌合抗原受体多肽从N端到C端包含：胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、和胞内信号传导结构域，优选地，其中所述嵌合抗原受体多肽从N端到C端包含：任选地信号肽，特异性结合前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)的单链scFv抗体，CD28跨膜结构域，CD28和/或4-1BB共刺激结构域，和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述方法还包括：使来自步骤(b)的CAR-T-S细胞群与靶抗原接触，并测定所述CAR-T-S细胞群中的Tscm和Tcm亚群比例。在一些实施方案中，通过流式细胞术检测CAR-T-S细胞群中的Tscm和Tcm细胞亚群比例。优选地，按照图1所示的细胞设门步骤，进行所述流式细胞术检测。
在根据本发明上述第一和第二方面的一些实施方案中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群在靶抗原刺激下产生降低的IFNγ量。在根据本发明上述第一和第二方面的另一些实施方案中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群在接触靶抗原后具有更高的细胞增殖能力，优选地，通过细胞周期测定，在所述CAR-T细胞群中测定处于细胞分裂期（S期）的细胞比例，确定所述细胞增殖能力。在根据本发明上述第一和第二方面的再一些实施方案中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群具有提高的存活率；和/或延迟或逆转的T细胞耗竭表型。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括选自以下的一个或多个步骤，以进一步表征所获CAR-T-S细胞群的持久性：
(a) 测定CAR-T-S细胞群在靶抗原刺激下产生的IFNγ量;和/或
(b) 通过细胞周期测定，确定CAR-T-S细胞群中处于细胞分裂期（S期）的细胞比例。
在第三方面，本发明也提供太空环境或模拟微重力用于改善CAR-T细胞群的持久性的用途、或用于增加CAR-T细胞群的Tscm和/或Tcm比例或两者比例之和的用途、或用于提高CAR-T细胞群的存活率和/或逆转或延迟T细胞耗竭的用途。
在上述本发明方法或用途的一些实施方案中，优选地，通过轨道太空飞行，实施所述在太空环境中维持所述CAR-T细胞群的步骤。
本发明的CAR-T-S细胞
在第四方面，本发明提供了通过本发明方法获得的CAR-T-S细胞群(尤其是，PSMA-CAR-T-S细胞群)。在一些实施方案中，所述CAR-T-S细胞群，相比于未接受太空环境或模拟微重力环境处理的对照CAR-T细胞群，具有增加的持久性。在一些实施方案中，所述CAR-T-S细胞群，相比于所述对照CAR-T细胞群，具有增加的Tscm比例和/或Tcm比例或两者比例之和。在一些实施方案中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群在靶抗原PSMA刺激下产生降低的IFNγ量。在一些实施方案中，通过细胞周期检测，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群具有更多处于细胞分裂期（S期）的细胞。在一些实施方案中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述PSMA-CAR-T-S细胞群具有提高的存活率；和/或延迟或逆转的T细胞耗竭。
可用于本发明的CAR多肽并无特别限制。在一些方面，本发明的CAR多肽包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域，和胞质结构域。在一个实施方案中，本发明CAR多肽的胞质结构域包含胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本发明CAR多肽的胞质结构域包含共刺激结构域和胞质信号传导结构域。在一个实施方案中，根据本发明的嵌合抗原受体(CAR)分子从N端到C端包含： (a) 特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域；和(b) 铰链区或间隔区; (c) 跨膜结构域; 和(d) 胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，根据本发明的CAR分子从N端到C端包含：(a) 特异性结合肿瘤抗原的抗原结合结构域，(b) 铰链区或间隔区;(c) 跨膜结构域; (d)共刺激结构域；和(e)胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，用于本发明CAR多肽的靶抗原是靶细胞，尤其是肿瘤细胞上表面表达的膜抗原，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。可以提及的肿瘤包括血液性肿瘤和实体肿瘤，包括原发性和转移性肿瘤。在一些实施方案中，靶抗原是包含可以被源自哺乳动物的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)免疫识别的抗原性癌表位的肿瘤细胞表面抗原。在另一些实施方案中，靶抗原是包含一个或多个与恶性肿瘤相关的抗原性癌表位的肿瘤细胞表面抗原。在优选的实施方案中，本发明CAR分子的胞外抗原结合结构域靶向肿瘤抗原，优选地，所述肿瘤抗原选自：CD19, 肾上腺素A2受体 (EphA2), 叶酸受体(FRa), 间皮素，EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD33, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUC1, HER2 ，及其任何组合。更优选地，所述肿瘤抗原为前列腺癌特异性膜抗原PSMA。
根据所要靶向的抗原，本发明的CAR可被构建以包括对所需抗原靶标特异的适当的抗原结合结构域，以赋予CAR分子以及包含所述CAR分子的CAR-T细胞特异性识别并结合靶抗原的能力。在一个实施方案中，根据本发明的CAR分子的胞外抗原结合结构域是，对靶抗原具有结合亲和力的多肽分子。在一个实施方案中，根据本发明的CAR包含来源于抗体或抗体片段的抗原结合结构域。在再一实施方案中，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在优选的实施方案中， 所述抗原结合结构域包含由VL和VH经由接头连接而成的scFv。
scFv可以根据本领域已知的方法，通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起而产生。在一些实施方案中，scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的柔性多肽接头。在一些实施方案中，scFv包含位于其VL和VH区之间的接头，其中所述接头包含至少5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50个或更多个氨基酸残基。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，scFv的肽接头由单独或组合使用的氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成，以将可变重链和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并且例如包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n=1, n=2, n=3.n=4, n=5，n=6, n=7, n=8, n=9 或n=10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4 或 (Gly4 Ser)3。在另一个实施方案中，接头包括 (Gly2Ser), (GlySer) 或(Gly3Ser) 的多个重复。在再一实施方案中，接头包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG氨基酸序列。在一个实施方案中，用于本发明的scFv从N端到C端包含：VL-接头-VH；或VH-接头-VL。
本发明的CAR多肽包含至少一个跨膜结构域，其可以衍生自天然来源或合成来源。例如，跨膜结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白，例如来自CD3ζ、CD4、CD28、CD8 (例如，CD8α，CD8β)的跨膜结构域。在本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，跨膜结构域赋予本发明的CAR多肽的膜附着性质。在一些实施方案中，本发明CAR多肽中的跨膜结构域可以借助铰链区/间隔区与CAR的胞外区连接。关于可用于CAR多肽中的跨膜区和铰链区/间隔区，可以参见例如，Kento Fujiwara等，Cells 2020, 9, 1182; doi:10.3390/cells9051182。
本发明的CAR多肽中包含的胞质结构域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能够活化引入了本发明CAR的免疫细胞的至少一个免疫效应功能。所述的免疫效应功能包括但不限于，例如增强或促进免疫细胞攻击靶细胞的功能或应答。在免疫效应细胞是T细胞的情况下，这样的免疫效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
用于本发明CAR多肽中的胞质结构域的例子包括，可以发挥作用以在胞外结构域结合靶抗原后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和/或共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能或性质的任何重组序列。T细胞的活化由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(即，初级胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供共刺激信号的那些序列(即，次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。在一个实施方案中，本发明的CAR多肽包含提供初级胞内信号结构域的胞质结构域，例如，CD3ζ的胞内信号传导结构域。在另一实施方案中，本发明CAR多肽的胞质结构域还包含次级信号结构域，例如，来自共刺激分子的共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明CAR多肽的胞质区包含与CD3ζ胞内信号传导结构域串联的一个或多个共刺激结构域，如4-1BB(也称为CD137)和CD28的共刺激结构域。
在一些实施方案中，本发明的CAR多肽可以包含位于胞外抗原结合结构域N端的信号肽或前导序列。通过信号肽/前导序列，新生的CAR多肽可以被引导到细胞的内质网，并之后锚定在细胞膜上。可以使用任何真核来源的信号肽/前导序列，例如哺乳动物或人分泌蛋白来源的信号肽/前导序列。
在根据本发明的方法进行太空环境或模拟微重力处理前，可以通过本领域任何已知的CAR-T制备方法，产生用于本发明的CAR-T细胞。
已经开发了众多基于病毒的系统，可用于转移基因至哺乳动物细胞中。这些系统可用于本发明CAR-T细胞构建。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将编码本发明CAR的核酸构建体插入病毒载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其离体递送至T细胞（例如，来自受试者的T细胞）中。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。
逆转录病毒载体可以例如是慢病毒载体。衍生自慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子并无特别限制。例如，这样的启动子可以是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如，Milone等人,Mol. Ther. 17(8): 1453–1464 (2009)。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。
用于构建CAR-T细胞的细胞来源可以是分离或保藏的T细胞、或是从受试者获得的T细胞。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如Ficoll™分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。
在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)温育一段时间，自来自受试者的外周血单个核细胞中分离T细胞。
在获得包含CAR多肽的T细胞后，可以根据如上所述本发明的方法，将所述的CAR-T细胞维持在太空环境或模拟微重力环境中，足够增强Tscm和Tcm亚群比例的时间，以获得根据本发明的CAR-T-S细胞群。
本发明CAR-T-S细胞群的用途
在第五方面，本发明也提供了通过本发明方法获得的CAR-T-S细胞群在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明也提供了在受试者中治疗癌症的方法，其包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明CAR-T-S细胞群。本发明也提供了前述的本发明CAR-T-S细胞群在制备用于治疗癌症的药物中的用途。所述癌症包括血液学癌症(例如白血病)或者实体瘤(例如，胶质瘤)，包括原发性和转移性癌症。
在一些实施方案中，本发明的CAR-T-S细胞群用于过继细胞治疗(ACT)，或用于制备用于所述ACT治疗的细胞治疗产品中的用途。在一些实施方案中，所述CAR-T-细胞群可以是来自自体或同种异体的T细胞群。在一个实施方案中，本发明的细胞群用于在受试者中治疗癌症，并且能够减轻癌症的至少一种症状或指征的严重性或抑制癌细胞生长。在一些实施方案中，所述CAR-T细胞群是靶向PSMA的CAR-T细胞群，且所述肿瘤为前列腺癌。
本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
实施例
材料和方法
1、实验材料
细胞系：人K562细胞系和逆转录病毒包装细胞系PG13购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。K562-PSMA肿瘤细胞为通过逆转录病毒感染产生稳定表达人PSMA的K562细胞。所有这些细胞均保存在含有10%胎牛血清（Biosera）和10,000IU/ml青霉素/10,00微克/毫升链霉素（EallBio Life Sciences）的RPMI-1640(Lonza)或DMEM(Lonza)中。所有细胞在5%CO2,95%空气,37℃加湿培养箱中培养。
编码PSMA特异性 CAR 的逆转录病毒载体：基本按照先前描述(M C Gong等，Cancer patient T cells genetically targeted to prostate-specific membraneantigen specifically lyse prostate cancer cells and release cytokines inresponse to prostate-specific membrane antigen，Neoplasia v Vol. 1, No. 2,June 1999, pp. 123–127 123)构建该逆转录病毒载体，其中包含具有特异性结合PSMA的单链抗体片段(scFv)、CD8铰链区和跨膜区、CD3ζ胞质结构域的CAR多肽。合成含有所述CAR编码序列的多核苷酸，然后亚克隆到 SFG 逆转录病毒载体（addgene）中。通过测序验证CAR的克隆。在瞬时转染48小时后，应用逆转录病毒包装细胞系PG13，产生逆转录病毒颗粒。
2、实验方法
CAR-T细胞的产生
用梯度离心法分离健康供者外周血单个核细胞（PBMCs）。用抗CD3和抗CD28颗粒刺激外周血单个核细胞中的T细胞，然后用逆转录病毒感染。具体为：0.5 ml Retronectin（15 ug/ml） 加入12孔板，室温避光孵育2 h。弃掉上清，加入0.5% human AB血清（PBS配制），培养30min, 弃掉上清。加入0.5 ml T细胞（1.6×106/ml ）与0.5ml病毒液体，用封口膜封闭孔板，700g，离心1h后，放入37℃培养箱培养，获得抗原特异性的基因修饰T细胞。
7天后，CAR-T细胞在含0.5%正常人AB血清的X-VIVOTM15无血清培养基(Lonza)中孵育24h，然后在含5% GemCellTM人血清AB的X-VIVOTM15培养基中扩增，加入IL-2(138 U/ml）或IL-15(10 ng/ml）以及靶肿瘤细胞培养7天后，对CAR-T细胞表达标志物进行流式检测，鉴定表达CAR的T细胞亚群的比例。本研究获得了北京世纪坛医院机构评审委员会的批准，并获得了所有参与者的知情同意。
CAR-T细胞的太空飞行处理和对照地面处理
在实验的前三天，太空CAR-T细胞处理组与地面CAR-T 细胞处理组，按照上述相同的方式和程序，进行T 细胞的提取、活化、和转导。之后，太空CAR-T 细胞处理组通过轨道飞行在太空中培养另外三天（即，实验的第四，五，六天），返回地面后停留一天（即，实验第七天）。由此，在实验开始7天后，太空CAR-T 细胞处理组与地面CAR-T对照处理组并行进行上述培养、扩增和流式细胞检测。
流式细胞术
流式细胞术在FACSCanto Plus仪器（BD Biosciences）上进行，数据分析使用FlowJo V.10 (FlowJo，LLC)。所使用的荧光标记抗体包括：APC-Cy7标记的小鼠抗人CD3抗体（BD Biosciences）、FITC标记的小鼠抗人CD8抗体（BD Biosciences）、BV421标记的小鼠抗人CD4抗体（BD Biosciences）、BV605标记的小鼠抗人CD45RO（BD Biosciences）、PE-Cy7标记的小鼠抗人CCR7（BD Biosciences）、Alexa Fluo 700标记的小鼠抗人CD27（BDBiosciences）、和PE-Cy5标记的小鼠抗人CD95（BD Biosciences）。
细胞周期测定
将CAR-T细胞(1×106)重新悬浮于300µL PBS中，然后用体积为1 ml的70%乙醇固定。10分钟后，用PBS洗涤细胞3次，室温下用PI/RNase染色缓冲液（BD Biosciences）染色15分钟，再用流式细胞仪分析。
细胞因子检测（IFNγ）
CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养（10:1）24小时后，获得上清，根据试剂盒（ELISA检测IFN-γ（R&D systeme DY285B））实验步骤检测IFNγ的浓度。
结果
用逆转录病毒转染PBMCs产生PSMA-CAR-T细胞。将经太空飞行处理3天的PSMA-CAR-T-S细胞群或未经该处理的地面PSMA-CAR-T细胞群，与K562-PSMA肿瘤细胞共培养24小时后，获取上清，检测细胞因子浓度；并在共培养7天后，获取细胞，分别检测T亚群和细胞周期。
PSMA-CAR-T细胞与PSMA-CAR-T-S细胞分别与靶细胞培养七天后，根据图1显示的细胞分选设门步骤，检测T细胞亚群。结果发现，与PSMA-CAR-T相比，PSMA-CAR-T-S细胞有更多的Tscm和Tcm（图2至图4）,包括在CD3细胞亚群中以及在CD8细胞亚群中都有更大比例的Tscm和Tcm，说明PSMA-CAR-T-S细胞具有更年轻的细胞表型。
通过细胞周期检测发现，在与K562-PSMA肿瘤细胞共培养七天后，大约17.71%的PSMA-CAR-T-S细胞处于细胞S期，而大约12.13%的PSMA-CAR-T细胞处于细胞S期（图5），证明PSMA-CAR-T-S细胞具有更强的细胞增殖能力。
除此之外，获取细胞上清，通过检测IFNγ释放发现，在抗原刺激下，PSMA-CAR-T细胞与PSMA-CAR-T-S细胞都会有更多的IFNγ释放（图6）。然而，相对于PSMA-CAR-T细胞，PSMA-CAR-T-S细胞有较少的IFNγ释放，进一步证明经太空飞行处理后的CAR对细胞的影响是使细胞处于更年轻的状态，有利于CAR-T细胞在体内的长期存活。

Claims (21)

1.一种改善CAR-T细胞群的持久性的方法，其特征在于，所述方法包括：在太空环境或模拟微重力环境中维持所述CAR-T细胞群，
由此，相比于未接受所述处理的对照CAR-T细胞群，获得具有增加持久性的CAR-T-S细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在太空环境或模拟微重力环境下维持所述CAR-T细胞群至少24小时、至少48小时或至少72小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在太空环境或模拟微重力环境下维持所述CAR-T细胞群1-5天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在太空环境或模拟微重力环境下维持所述CAR-T细胞群3天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CAR-T-S细胞群，相比于所述对照CAR-T细胞群，在接触靶抗原后，具有增加的Tscm比例和/或Tcm比例。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CAR-T-S细胞群，相比于所述对照CAR-T细胞群，在接触靶抗原后，具有增加的Tscm和Tcm比例之和，其中，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述Tscm和Tcm比例之和增加至少0.5倍、1倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍或3倍。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Tscm和所述Tcm是CD3+ T细胞。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Tscm和所述Tcm是CD3+ CD8+ T细胞。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在接触靶抗原后，通过流式细胞术检测CAR-T-S细胞群中的Tscm和Tcm细胞亚群比例。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞群中的CAR-T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中所述嵌合抗原受体多肽从N端到C端包含：
-任选的，信号肽，
-特异性结合前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)的单链scFv抗体，
-CD8或CD28跨膜结构域，
-任选的，CD28和/或4-1BB共刺激结构域，和
-CD3ζ信号传导结构域。
11.一种增加CAR-T细胞群中的Tscm和/或Tcm比例或两者比例之和的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a) 获得包含并表达嵌合抗原受体(CAR)多肽的CAR-T细胞群；
(b) 在太空环境或模拟微重力环境中维持所述CAR-T细胞群；
由此，相比于未接受所述处理的对照CAR-T细胞群，获得具有增加Tscm和/或Tcm比例的CAR-T-S细胞群。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述CAR-T细胞群在太空环境或模拟微重力环境中维持3天。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤(b)后，使获得的CAR-T-S细胞群与靶抗原接触，并测定所述CAR-T-S细胞群中的Tscm和Tcm亚群比例。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群在靶抗原刺激下产生降低的IFNγ量。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群在接触靶抗原后具有更高的细胞增殖能力，其中，通过细胞周期测定，在所述CAR-T细胞群中测定处于S期的细胞比例，确定所述细胞增殖能力。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，相比于所述对照CAR-T细胞群，所述CAR-T-S细胞群具有提高的存活率；和/或延迟或逆转的T细胞耗竭表型。
17.太空环境或模拟微重力用于改善CAR-T细胞群的持久性的用途、或用于增加CAR-T细胞群的Tscm和/或Tcm比例或两者比例之和的用途、或用于提高CAR-T细胞群的存活率和/或逆转或延迟T细胞耗竭的用途。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，通过轨道太空飞行，实现在太空环境中维持所述CAR-T细胞群的步骤。
19.通过权利要求1-16中任一项所述的方法产生的CAR-T细胞群。
20.根据权利要求19所述的CAR-T细胞群在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于，所述CAR-T细胞群是靶向PSMA的CAR-T细胞群，且所述肿瘤为前列腺癌。
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